Brevet FR2793805A1 — publié le 20001124

PROMOTEUR DE LA THIORÉDOXINE TaTrxh2 DE BLE L'invention est relative au clonage et à la caractérisation d'un promoteur de thiorédoxine de blé. Les thiorédoxines sont des protéines de faible poids moléculaire, qui ont été mises en évidence chez un grand nombre d'organismes, où elles catalysent différentes réactions d'oxydoréduction impliquant des échanges dithiolsulfhydryles. Leur site catalytique comprend la séquence conservée : -Trp-Cys-Gly/Pro/AlaPro-Cys-. Les thiorédoxines sous forme oxydée comprennent un pont disulfure, dont la réduction en groupes-SH, par la ferrédoxine réduite ou par le NADPH, est catalysée par l'intermédiaire d'un système spécifique. Chez les plantes, on a mis en évidence 3 types de thiorédoxine : les 2 premières (thiorédoxines m et f), sont des thiorédoxines ferrédoxine-dépendantes, localisées dans les chloroplastes, où elles interviennent dans la régulation de la photosynthèse. Un troisième type, dénommé thiorédoxine h, a été mis en évidence dans le cytosol. La thiorédoxine h fait partie d'un système thiorédoxine NADP-dépendant (NTS), où elle est associée au NADPH et à une enzyme dénommée NADP-thiorédoxine réductase (NTR) . Initialement, 2 thiorédoxines h ont été extraites et partiellement purifiées à partir du grain de blé (VOGT et FOLLMANN, Biochem. Biophys. Acta 873,415- 418,1986). Récemment, l'équipe des Inventeurs a isolé et caractérisé 2 clones d'ADNc codant une thiorédoxine h de blé tendre (TaTrxhl), et une thiorédoxine h de blé dur (TdTrxhl) (GAUTIER et al., Eur. J. Biochem. 252,314-324, 1998). Les structures primaires déduites des clones d'ADNc des thiorédoxines h TaTrxhl et TdTrxhl sont très conservées (96% d'identité entre elles). Elles possèdent une extension N-terminale très riche en résidus Ala, dont l'analyse révèle un domaine transmembranaire putatif de 20 résidus. Elles présentent de fortes homologies avec les thiorédoxines h de céréales (70 à 80%) et les thiorédoxines h de dicotylédones (60%). Les thiorédoxines h interviennent au cours de la germination du grain de blé, où elles participent, au niveau de l'albumen, à la mobilisation des réserves nécessaires à la croissance de l'embryon. Elles agissent notamment : - en réduisant les ponts disulfure de certaines protéines de réserve, telles que les gliadines et les gluténines (KOBREHEL et al., Plant Physiol. 99, 919-924,1992), ce qui augmente leur sensibilité à la protéolyse ; - en réduisant des enzymes impliquées dans la mobilisation des réserves, ou des inhibiteurs de ces enzymes, ce qui entraîne l'activation des premières, et la désactivation des seconds. Il a également été proposé d'utiliser les thiorédoxines h pour améliorer la qualité d'aliments, notamment à base de céréales ; il a en effet été constaté qu'elles favorisaient la formation de la pâte lors de la fabrication du pain (WONG et al., Cereal Chem. 70,113- 114,1993), et qu'en outre elles diminuaient l'allergénicité de certains aliments. Les Inventeurs ont entrepris l'étude de l'expression des thiorédoxines h dans les graines de céréales, notamment dans le blé, afin de fournir des moyens de contrôle de cette expression. Dans le cadre de ces travaux, ils ont isolé un gène dénommé ci-après TaTrxh2, codant une thiorédoxine h de blé tendre (Triticum aestivum), dénommée ci-après TaTrxh2, dont la structure primaire présente 97% de similarité avec celle de la thiorédoxine h TaTrxhl de blé tendre (GAUTIER et al., 1998, publication précitée). Les Inventeurs ont également isolé le promoteur du gène TaTrxh2, et ont exprimé, chez le riz, le gène rapporteur gus sous contrôle de ce promoteur. Ils ont ainsi observé que l'expression du gène rapporteur était localisée exclusivement dans le grain de riz et plus particulièrement dans l'albumen amylacé. Ils ont en outre mis en évidence des régions impliquées dans la régulation spatiale et temporelle de ce promoteur. La séquence du gène TaTrxh2 et de la région en 5' comprenant le promoteur sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La présente invention a pour objet un promoteur constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène TaTrxh2. On entend par promoteur une séquence d'ADN double-brin comprenant au moins les séquences nécessaires à l'initiation de la transcription d'un gène, éventuellement associées à des séquences de contrôle en cis de ladite transcription ; on entend par : domaine fonctionnel spécifique d'un promoteur , une séquence dudit promoteur comprenant un ou plusieurs motifs d'ADN intervenant dans l'initiation de la transcription, ou bien une séquence d'ADN double-brin constituant un domaine de régulation comprenant un ou plusieurs des motifs d'ADN intervenant dans le contrôle en cis de la transcription par ledit promoteur. Des promoteurs conformes à l'invention peuvent comprendre en particulier : a) le fragment d'acide nucléique représenté dans la liste de séquences en annexe par la séquence SEQ ID NO : 2, ainsi que sur la figure 1, et qui correspond à la région 5' non codante du gène TaTrxh2 s'étendant de la position-1 à la position-1111 par rapport au codon d'initiation ATG, ou des portions dudit fragment, notamment : * le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-83 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend les séquences intervenant dans l'initiation de la transcription, et nécessaires à l'activité de base du promoteur ; * des fragments d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels intervenant dans la régulation de la transcription du gène TaTrxh2, et en particulier dans sa spécificité tissulaire et/ou dans son expression à différents stades du développement de la plante ; il s'agit en particulier : - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-591 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'inhibition de l'expression du gène TaTrxh2 dans l'épithélium du scutellum ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-228 à la position-451 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène TaTrxh2 en début de maturation du grain ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend un domaine de régulation intervenant dans l'induction de l'expression du gène TaTrxh2 dans l'épithélium du scutellum ; - du fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-83 à la position-228 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; ce fragment comprend des séquences intervenant dans l'induction de l'expression au niveau de l'albumen amylacé. b) du fragment d'acide nucléique constituant le premier intron (positions 1232-2203 sur la séquence SEQ ID NO: 1) du gène TaTrxh2 ; ce fragment pourrait comprendre un domaine de régulation de type amplificateur, augmentant le niveau d'expression du gène Ta Trxh2 . L'homme du métier peut, à partir des fragments comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène TaTrxh2 spécifiés ci-dessus, identifier plus précisément les limites de ces domaines fonctionnels, ainsi que les motifs d'ADN impliqués dans la fonction de chacun d'entre eux, par des techniques connues en ellesmêmes, par exemple par la technique des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant ces fragments avec des extraits nucléaires de cellules de l'albumen du grain, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules dans lesquels le promoteur du gène TaTrxh2 est inactif. L'invention englobe en particulier tout promoteur pouvant être obtenu à partir d'un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel du promoteur du gène TaTrxh2, par les techniques classiques du génie génétique, notamment par mutagénèse et/ou recombinaison génétique. Il est ainsi possible de produire des promoteurs artificiels possédant le niveau d'activité, et le degré de spécificité souhaité. On peut ainsi par exemple inactiver un ou plusieurs des domaines fonctionnels de régulation localisés dans la région 5' non codante du gène TaTrxh2, par exemple en procédant à la délétion d'au moins un nucléotide ou d'une séquence de nucléotides des motifs d'ADN impliqués dans la fonction du ou des domaines concernés. On peut également associer les molécules d'acide nucléique comprenant des domaines fonctionnels du promoteur du gène TaTrxh2 entre elles, et/ou avec des domaines fonctionnels provenant de promoteurs autres que celui du gène TaTrxh2. L'invention englobe également : - les cassettes d'expression, comprenant, outre un promoteur conforme à l'invention, un gène d'intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un site permettant l'insertion dudit gène d'intérêt ; - les vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conformes à l'invention dans un vecteur hôte. Les promoteurs conformes à la présente invention peuvent être utilisés pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules de plantes, notamment de monocotylédones. Ledit gène d'intérêt peut par exemple être soit le gène TaTrxh2, placé sous contrôle d'un promoteur artificiel, tel que défini ci-dessus, dérivé du promoteur TaTrxh2, soit un gène hétérologue codant une thiorédoxine autre que TaTrxh2, ou toute autre protéine d'intérêt. On peut par exemple introduire un gène d'intérêt sous contrôle du promoteur du gène TaTrxh2, ou d'un promoteur artificiel construit à partir des éléments de régulation de celui-ci qui confèrent la spécificité d'expression dans les cellules de l'albumen, afin d'exprimer ledit gène d'intérêt uniquement dans les cellules de l'albumen du grain. On peut également procéder à la délétion sélective des séquences du promoteur du gène TaTrxh2 responsables de la spécificité d'expression, afin de construire un promoteur artificiel permettant d'assurer une expression ubiquitaire d'une thiorédoxine h, ou d'une autre protéine d'intérêt. L'invention a en outre pour objet des cellules végétales et des plantes transgéniques, en particulier des monocotylédones, et notamment des céréales, transformées par au moins une molécule d'acide nucléique comprenant un promoteur conforme à l'invention. Les Inventeurs ont ainsi obtenu des riz transgéniques, dans lesquelles un gène hétérologue a été placé sous contrôle transcriptionnel du promoteur du gène TaTrxh2 et ont observé chez ces plantes une expression spécifique dans les cellules de l'albumen du grain. Les cellules transformées et les plantes transgéniques conformes à l'invention sont également utilisables comme modèles pour étudier et/ou modifier l'expression de différents gènes dans les cellules de l'albumen du grain. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant le clonage et la caractérisation du gène TaTrxh2 et de son promoteur. EXEMPLE 1 :ISOLEMENT ET CARACTÉRISATION DU GÈNE TaTrxh2 1.- Criblage d'une banque d'ADN génomique de blé Une banque d'ADN génomique a été réalisée à partir de l'ADN extrait de feuilles de blé tendre (Triticum aestivum) de la variété Andain. Après digestion partielle de l'ADN génomique par MboI, les fragments de taille moyenne 15 kb ont été clonés au site BamHI du phage EMBL3 SP6/T7, qui a été propagé dans la bactérie hôte K802-K 802 (galK2, galT22, HsdR2, (rk-, mk+), mcrA , - + mcrB , metBl, mrr , supE44). 6 6. 10 clones de la banque d'ADN génomique ont été étalés et criblés avec une sonde de 669 pb (TRX) contenant la totalité de la séquence codant la thiorédoxine h de blé tendre TaTrxhl (GAUTIER et al., 1998, publication précitée), et les clones positifs ont ensuite été criblés par ACP (amplification en chaine par polymérase) à l'aide d'un couple d'amorces (THP2 et THM2) dérivées de la même séquence. L'un des clones sélectionnés (#4), qui contient un fragment d'ADN génomique de blé de 10 kb environ, a été digéré par PstI, libérant deux fragments, l'un de 1,5 kb et l'autre de 3,8 kb, tous les deux reconnus par la sonde TRX. Ces deux fragments ont été clonés dans le vecteur pLITMUS 29 (BIOLAB) au site de restriction PstI. Les deux clones obtenus sont dénommés CTRX3 et CTRX4. Le clone CTRX3 correspond au fragment de 1,5 kb et le clone CTRX4 au fragment de 3,8 kb. L'analyse des séquences nucléotidiques des clones CTRX4 et CTRX3 montre qu'ils contiennent chacun une partie d'un même gène codant une thiorédoxine h de blé, tronqué lors de la digestion par PstI. A partir des séquences nucléotidiques de ces 2 clones, les Inventeurs ont choisi deux amorces (THP8 et THM8) permettant d'amplifier un gène de thiorédoxine h sur une longueur d'environ 2,6 kb. L'ACP a été réalisée sur l'ADN non digéré du clone #4, et un fragment de la taille attendue a été cloné dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA). Le clone obtenu contient le gène TaTrxh2 codant une thiorédoxine h de blé tendre. Il comprend une région promotrice de 1111 pb, une région codante de 1447 pb, et une région 3' non codante de 131 pb. La région codante du gène TaTrxh2 comprend trois exons de 120,123 et 135 pb séparés par deux introns, de 972 pb et de 93 pb. Le premier exon code un polypeptide de 40 acides aminés, le deuxième exon code un polypeptide de 41 acides aminés contenant le site actif, et le troisième exon code un polypeptide de 45 acides aminés. La séquence nucléotidique du gène TaTrxh2 code une thiorédoxine h de blé tendre, nommée TaTrxh2, de 126 acides aminés, de masse moléculaire calculée 13435 Da et de pI calculé 5,0. La comparaison des séquences des produits de traduction du gène TaTrxh2 et des gènes TaTrxhl précédemment décrite par GAUTIER et al. (1998, publication précitée) et TdTrxhl (thiorédoxine h de blé dur) montre qu'elles sont très conservées. En effet, la séquence peptidique de TaTrxh2 présente 97% de similarité et 94% d'identité avec celle de TaTrxhl et 95% de similarité et 90% d'identité avec celle de TdTrxhl. Le domaine N-terminal de TaTrxh2 est plus court que celui de TaTrxhl et TdTrxhl. La structure primaire de TaTrxh2 ne contient pas de peptide signal, suggérant que la protéine est localisée dans le cytoplasme. Cependant, elle présente une extension Nterminale déjà mise en évidence dans la structure primaire de TaTrxhl et TdTrxhl, pouvant correspondre à un domaine transmembranaire. L'analyse de l'extension Nterminale de TaTrxh2 avec le programme RAO ARGOS (PC/gene, RAO et al., Biochem. Biophys. Acta 869,197- 214,1986) révèle un domaine transmembranaire putatif entre les résidus 2 et 19. Le site actif, formé des 5 acides aminés suivants : WCGPC, est conservé entre les 3 thiorédoxines h de blé TaTrxh2, TaTrxhl et TdTrxhl. Les introns ont des tailles différentes de celles des introns des gènes de thiorédoxines h de blé précédemment mis en évidence par ROBERT (1994) indiquant que le gène TaTrxh2 est différent de ceux-ci. Les introns du gène TaTrxh2 sont du type 0 et sont limités en 5' par la séquence GTA et en 3' par la séquence CAG, qui correspondent à des séquences consensus des limites intron-exon. La région 3' non codante du gène TaTrxh2 présente le signal de polyadénylation AATAAA commun aux gènes transcrits par l'ARN polymérase II. EXEMPLE 2 : ANALYSE STRUCTURELLE DU PROMOTEUR DU GÈNE TaTrxh2 Le promoteur du gène TaTrxh2 a été analysé pour rechercher des motifs de régulation putatifs susceptibles d'intervenir dans le contrôle de l'expression, et a notamment été comparé à celui des gènes de thiorédoxines h de C. reinhardtii (STEIN et al., Plant Mol. Biol. 28,487-503, 1995), de tabac (BRUGIDOU et al., Mol. Gen. Genet 238,285-293, 1993) et de riz (ISHIWATARI et al., 1995), de la thiorédoxine m de C. reinhardtii (STEIN et al., 1995), et des thiorédoxines murine (MATSUI et al., Gene 152,165-171, 1995) et humaine (TONISSEN et al., Gene 102,221-228, 1992 ; KAGHAD et al., Gene 140,6643-6653, 1994). La séquence du promoteur du gène TaTrxh2 est représentée sur la figure 1. Le site d'initiation de la transcription (représenté sur la figure 1 en gras et souligné d'un double trait) est une adénine située à-65 pb de l'ATG. Le promoteur du gène TaTrxh2 ne contient aucune séquence consensus correspondant à une boite TATAn ou à une boîte CAAT aux positions attendues pour les gènes transcrits par l'ARN polymérase II. En revanche, il contient une boîte TATA-like (AATTTAT, soulignée d'un double trait sur la figure 1) à -105 pb de l'ATG. Il contient également une boîte GC (GGGCCGGG, soulignée en pointillés sur la figure 1) située à-84 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Les boites GC sont reconnues par des facteurs de transcription de type Spl (DYNAN et al. Nature 316,774-778, 1985), et interviennent dans l'expression constitutive des gènes. Des boîtes GC sont présentes dans tous les promoteurs connus de gènes de thiorédoxines. Une séquence riche en adénine, interrompue par un résidu G (AAAAAAAGAAAAAAAAA, en caractères gras soulignés d'un trait simple sur la figure 1), est située à-227 pb de l'ATG du gène TaTrxh2 ; des séquences de ce type ont également été identifiées précédemment dans les promoteurs des gènes de thiorédoxine h de tabac et de riz. Des séquences bHLH (CANNTG), reconnues par des facteurs de transcription de la famille hélice/boucle/hélice, sont localisées à-206 pb et -411 pb de l'ATG du gène TaTrxh2 ; elles sont représentées sur la figure 1 en lettres minuscules. Des séquences bzip (ACGT, soulignées d'un trait simple sur la figure 1) reconnues par des facteurs de transcription de la famille des fermetures éclair à leucine (bZIP), sont localisées à-251 pb et-184 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Les protéines bZIP ont été décrites dans l'activation de l'expression de gènes codant des protéines de réserve du grain. Des motifs ACGT, ont également été décrits dans des séquences consensus ABRE (ABA-responsive element) des promoteurs de gènes dont l'expression est régulée par l'acide abscissique (ABA) (MUNDY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1406-1410, 1990). Deux boîtes pyrimidine (CCTTTCTCT et TCTTTCTTC, encadrées sur la figure 1) sont respectivement localisées à-553 pb et-541 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Les boîtes pyrimidine (CCTTTT) interviennent dans la régulation de l'expression par l'acide gibérellique, généralement en association avec des séquences GARE (GAresponsive element) (TAACAAA) (HUANG et al., Plant Mol. Biol. 14,115-121, 1990), et des séquences 02S (opaque-2binding séquence) ou boîte I (TATCCAT) (GUBLER et al., Plant Cell 4,1435-1441, 1992 ; LANAHAN et al., Plant Cell, 4,203-211, 1992), avec lesquelles elles s'organisent en un complexe appelé GARC (GA-responsive complex) (BETHKE et al., Bot. 48,1337-1356, 1997). Aucune séquence GARE ou 02S n'a été mise en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2. Un motif TGTGTGAGCA (en caractères gras, et souligné d'un trait en pointillés sur la figure 1) est situé à-403 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Ce motif ne diffère que par la présence d'un résidu G supplémentaire, de la séquence consensus GCN4-like (TGTGTGACA) de la boîte albumen impliquée dans l'expression albumenspécifique de gènes de gluténines de blé (HAMMOND-KOSACK et al., EMBO J. 12,545-554, 1993). Cependant, l'autre motif de la boîte albumen, dénommé EM (TGTAAAAGT), et dont la présence est également nécessaire pour l'expression albumen-spécifique (ALBANI et al., Plant Cell 9,171-184, 1997), n'a pas été mis en évidence dans les 1111 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2. Des diades trimériques CAA et TTG (en italique sur la figure 1) séparées par 10 bases, sont présentes respectivement à-107 pb et-97 pb de l'ATG du gène TaTrxh2. Ces motifs sont associés à une expression spécifique dans la couche à aleurone (THOMAS et al., Plant Cell 2,1171-1180, 1990). EXEMPLE 3 : ANALYSE FONCTIONNELLE DU PROMOTEUR DU GÈNE TaTrxh2 . La séquence de 1111 pb en 5' de l'ATG du gène TaTrxh2, ou différents fragments de cette séquence ont été clonés en amont de la séquence codante du gène rapporteur gus dans le vecteur pSPORTl-GUS. Le vecteur pSPORTl-GUS (DIGEON, 1997) contient la séquence codante du gène gus (P-glucuronidase d'E. coli) et le terminateur nos-ter du gène de la nopaline synthase, insérés au site EcoRI-HindIII du vecteur pSPORTl (GIBCO BRL). Les constructions réalisées sont les suivantes : - P1 : cette construction comprend la totalité de la séquence de 1111 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P2 : cette construction comprend la séquence de 589 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2 ; - P3 : cette construction comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2 ; - P4 : cette construction comprend la séquence de 228pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2 ; - P5 : cette construction comprend la séquence de 83pb en amont de l'ATG du gène Ta Trxh2. Les limites des régions du promoteur du gène TaTrxh2 utilisées dans les constructions sont indiquées sur la figure 1. A titre de témoin positif, on a utilisé le vecteur pUGCl (CHAIR et al., 1996), qui permet l'expression constitutive et ubiquitaire du gène gus sous le contrôle du promoteur, du premier exon et du premier intron du gène codant l'ubiquitine du mais. Le vecteur pSPORTl-GUS a été utilisé comme contrôle négatif. Ces différentes constructions ont été transférées par bombardement selon le protocole décrit par FAUQUET et al. (Proc. Third. Int. Rice Genet. Symp., Ed. G.S. Khush, 153-165,1996), dans de jeunes cals embryogènes de riz (var. japonica IRAT 349) dérivant de la prolifération du scutellum de l'embryon mature. Toutes les constructions testées ont été co-transférées avec le vecteur pILTAB227 (FAUQUET et al., 1997), qui confère la résistance à l'hygromycine et qui permet la sélection des cellules transformées. Un mélange du vecteur portant la construction à tester, et du vecteur pILTAB227 (rapport molaire : vecteur à tester/pILTAB227 = 4/1) est utilisé pour enrober des microparticules d'or, à raison de 5 ug d'ADN total (3 ug d'ADN à tester + 2 ug de pILTAB227) à une concentration de 1 ug/ul, pour 3 mg d'un mélange en quantité égale de microparticules d'or de diamètres 1,0 um et 1,6 um, en suspension dans 50 ul d'eau distillée. Le bombardement est effectué à l'aide d'un canon à particules PDS-1000/He (PARTICULE DELIVERY SYSTEM, BIORAD). Les cals embryogènes bombardés sont ensuite criblés sur un milieu de sélection contenant de l'hygromycine. Les cals résistants à l'hygromycine sont sélectionnés et placés sur milieu de régénération dépourvu d'hygromycine. Les plants régénérés (génération FO) ont ensuite été transférés dans des pots, et, après acclimatation en phytotron, sont cultivés en serre. L'expression du gène gus a été recherchée dans les organes végétatifs et dans les graines des riz des générations TO et Tl. Seules les plantes fertiles et présentant un phénotype normal, ont été retenues pour l'analyse. L'intégration du transgène dans les plantes analysées a été vérifiée par ACP et transfert de Southern. La détection de l'activité -glucuronidase a été effectuée par test histochimique, en détectant la coloration bleue résultant de l'hydrolyse de l'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl P-D-glucuronique (X-GLU), et sa quantification a été effectuée par test fluorométrique, en mesurant la 4-méthylumbélliférone (MU) formée à partir d'acide 4-méthylumbélliréfyl ssglucuronique, selon les protocoles décrits par JEFFERSON et al. (Plant Mol. Biol. Report 5,387-405, 1987). 1. Expression du gène gus dans les organes végétatifs L'analyse a été effectuée sur les racines, les chaumes, et les feuilles. Dans le cas des plants de riz non-transformés, ou de ceux transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS, l'analyse histochimique ne révèle pas d'activité GUS, et les mesures fluorimétriques ne font apparaître qu'une activité très faible voire nulle. Dans le cas des plants de riz transformés avec le vecteur pUGCI, on observe une activité GUS élevée (supérieure à 500 pmol MU/min/mg de protéine) dans tous les organes végétatifs testés. Dans le cas des plants de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5, on n'observe aucune coloration dans les organes végétatifs incubés en présence de X-GLU, et l'activité GUS mesurée par fluorométrie n'est pas significativement différente de celles mesurée pour les plantes transformées avec le vecteur pSPORTl-GUS ou les plantes non transformées. Ces résultats montrent que le promoteur du gène TaTrxh2 ne permet pas l'expression du gène gus dans les organes végétatifs. 2. Expression du gène gus dans les grains Analyse histochimique Au niveau des grains entiers Les grains de riz, prélevés à 35 JAF (jours après fécondation) ont été coupés dans le sens longitudinal puis incubés en présence de X-GLU. Aucune coloration n'est détectée dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS. On détecte au contraire une coloration intense de la totalité du grain pour les grains de riz transformés avec le vecteur pUGCl. Dans le cas des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4, une coloration bleue est détectée dans l'albumen des grains, mais pas dans l'embryon (axe cotylédonaire et scutellum), les enveloppes ou les épillets. Au niveau de l'albumen, cette coloration apparaît notamment à la périphérie de l'embryon, au dessus de l'épithélium du scutellum, et dans une zone médiane de l' albumen sur toute la longueur du grain. Cette coloration est moins intense, et apparaît moins rapidement que celle observée dans les grains de riz transformés avec pUGCl. L'intensité de la coloration semble varier selon la construction (P1, P2, P3 ou P4) concernée. L'intensité la plus élevée est observée dans les grains de riz transformés avec la construction P2, et la plus faible dans ceux transformés avec la construction P4. Ces résultats sont confirmés par l'analyse des grains Tl, où la coloration apparaît plus rapidement que dans les grains TO et est plus intense. Dans le cas des grains de riz transformés avec la construction P5, aucune coloration n'est détectée, ni dans l'embryon, ni dans l'albumen, ni dans les enveloppes. Au niveau des différents tissus du grain Pour déterminer précisément la localisation de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène Ta Trxh2, des coupes histologiques ont été réalisées et observées au microscope photonique. Ces observations montrent que, pour les constructions Pl, P2, P3 ou P4, le marquage est localisé dans un petit nombre de cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale de l'albumen amylacé. Les cellules de l'embryon, de la couche à aleurone et des enveloppes, ne sont pas marquées. Pour la construction P5, aucun marquage n'est visible. Analyse fluorimétrique L'activité GUS a été mesurée d'une part sur les embryons et d'autre part sur l'albumen des grains de riz. L'activité GUS est nulle ou très faible dans les grains de riz transformés avec le vecteur pSPORTlGUS, comme dans les grains de riz non-transformés. En revanche, elle est très forte (>500 pmol/MU/min/mg de protéine) dans l'embryon et l'albumen des grains de riz transformés avec le vecteur pUGCl. L'activité GUS mesurée dans les embryons des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2 P3, P4 ou P5 n'est pas significativement différente de celle mesurée dans les grains de riz non-transformés ou de riz transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS. En revanche, l'activité mesurée dans l'albumen des grains de riz transformés avec les constructions Pl, P2, P3 ou P4, est 25 à 40 fois plus élevée que celle mesurée dans l'albumen des grains de riz non-transformés ou transformés avec le vecteur pSPORTl-GUS. Elle varie de 40 pmol/MU/min/mg de protéine pour les grains de riz transformés avec la construction P2, à 25 pmol/MU/min/mg de protéine pour ceux transformés avec la construction P4. Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée dans les grains. Ces résultats montrent que la région (-1111 pb à -83 pb) du promoteur du gène Ta Trxh2 permet l'expression du gène gus uniquement dans les cellules de l'albumen amylacé, et que seule la délétion ne laissant subsister que 83 pb en amont de l'ATG a supprimé les séquences responsables de l'expression spatiale, dont certaines sont probablement localisées dans la région du promoteur comprise entre-228 pb et-83 pb. Le motif GCN4-like identifié lors de l'analyse de la structure du promoteur du gène TaTrxh2 n'est donc apparemment pas le seul responsable de la spécificité tissulaire de l'expression ; en effet, malgré sa délétion dans les constructions P3 et P4, l'expression du gène gus demeure spécifique de l'albumen du grain. Deux séquences : AACAAATCC, et AACAAAGTG (représentées en caractères gras sur la figure 1), sont respectivement présentes à-51 pb et-381 pb par rapport à l'ATG du gène TaTrxh2. Ces séquences présentent une similitude avec des motifs AACA (AACAAACTCTATC) récemment mis en évidence dans les promoteurs de 6 gènes codant des glutélines de riz, et intervenant dans l'expression albumen-spécifique de ces gènes. EXEMPLE 4 : EVOLUTION DE L'EXPRESSION DU GÈNE GUS AU COURS DU DÉVELOPPEMENT DES GRAINS DES RIZ TRANSGÉNIQUES L'expression du gène gus a été suivie au cours de la maturation et de la germination de grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. 1. Au cours de la maturation Trois stades ont été analysés : 10 JAF, 25 JAF et 35 JAF. L'expression du gène gus a été évaluée, soit par localisation histochimique de l'activité GUS, soit par détection des transcrits par transfert de Northern. Activité GUS L'analyse histochimique montre que pour les trois stades de maturation étudiés, 10,25, et 35 JAF, une activité GUS est toujours détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4. Par contre pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée. A 10 JAF, l'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé, à la périphérie de l'embryon. A 25 JAF, l'activité GUS progresse vers la zone médiane de l'albumen amylacé. A 35 JAF, l'activité GUS est détectée sur toute la surface de l'albumen amylacé. L'intensité de la coloration varie avec la nature de la construction et le stade de maturation, en particulier dans le cas de la construction P4, pour laquelle la coloration est très difficile à détecter en début de maturation. Ces résultats sont confirmés par les observations plus détaillées au niveau de chaque tissu du grain, qui montrent que : - A 10 JAF : pour les constructions P1, P2 ou P3, l'activité GUS est très forte dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon, et elle n'est pas détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé. Pour la construction P4, l'activité GUS dans les cellules de l'albumen amylacé est très faible, voire non détectable. En outre, dans les grains de riz transformés avec la construction P2, une activité GUS est également détectée dans les cellules de l'épithélium du scutellum. - A 25 JAF : pour les constructions P1, P2 ou P3, l'activité GUS a diminué dans les cellules de l'albumen amylacé à la périphérie de l'embryon et augmente dans celles de la zone centrale de l'albumen amylacé ; pour les grains de riz transformés avec la construction P2, on ne détecte plus d'activité GUS dans les cellules de l'épithélium du scutellum. Dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS a augmenté dans les cellules de l'albumen amylacé situées à la périphérie de l'embryon et dans la zone centrale. - A 35 JAF : l'activité GUS est beaucoup plus faible qu'à 25 JAF dans toutes les cellules de l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec P1, P2 ou P3 ; dans les grains de riz transformés avec la construction P4, l'activité GUS est détectée dans les cellules de la zone médiane de l'albumen amylacé. Pour la construction P5, aucune activité GUS n'est détectée quel que soit le stade de maturation ou le tissu du grain analysé. Quelle que soit la construction utilisée, aucune activité GUS n'est détectée au cours de la maturation, dans les cellules de l'axe embryonnaire, de la couche à aleurone, ou des enveloppes des grains. Détection des transcrits du gène gus La présence des transcrits du gène gus a été recherchée dans les ARN totaux extraits, aux différents stades de maturation, des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. La détection a été réalisée par transfert de Northern, en utilisant la sonde P3+GUS. Cette sonde de 2,6 kb comprend la séquence de 481 pb en amont de l'ATG du gène TaTrxh2, la séquence codante du gène gus et le terminateur du gène nos. Pour chacune des constructions Pl, P2, P3, P4 ou P5, cette sonde permet de détecter la présence de transcrits dont la taille attendue est comprise entre 1,9 et 2,4 kb, selon la construction. La présence de ces transcrits varie en fonction de la construction utilisée pour la transformation, et du stade de maturation. Pour les riz transformés avec la construction Pl, les transcrits sont détectés aux 3 stades de la maturation avec un maximum à mi-maturation. Pour les riz transformés avec la construction P2, les transcrits sont détectés au début de la maturation. Pour les riz transformés avec la construction P3, les transcrits sont détectés au début et à la fin de la maturation du grain. Pour les riz transformés avec la construction P4, les transcrits sont détectés à mi-maturation et en fin de maturation du grain. Pour les riz transformés avec la construction P5, aucun transcrit du gène gus n'est détecté quel que soit le stade de maturation analysé. 2. Au cours de la germination Pour l'étude de l'expression du gène gus au cours de la germination, l'activité GUS a été analysée par histochimie dans des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3, P4 ou P5. Pour chaque construction, 10 grains ont été mis à germer à l'obscurité et prélevés à différents temps après imbibition : 0,12, 24,48 et 72 heures. L'activité GUS est détectée dans l'albumen amylacé des grains de riz transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4 quel que soit le stade de germination. Par contre pour les grains de riz transformés avec la construction P5 aucune activité GUS n'est détectée. L'étude de l'accumulation des transcrits du gène gus dans les grains transformés avec les constructions P1, P2, P3 ou P4 montre que ceux-ci ne sont pas accumulés au cours de la germination quelle que soit la construction. Ces résultats indiquent que le promoteur (1111 pb en amont de l'ATG) du gène TaTrxh2 ne permet pas l'expression du gène gus au cours de la germination. L'activité GUS détectée dans les grains germés est certainement une activité résiduelle due à la très grande stabilité de la P-glucoronidase dans le grain. Conclusion L'analyse de l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur du gène TaTrxh2 au cours du développement des grains de riz transformés avec les constructions Pl, P2, P3, P4 ou P5 met en évidence un effet des délétions du promoteur du gène TaTrxh2 sur l'expression temporelle et spatiale du gène gus dans les grains des riz transformés. Les constructions Pl, P2, P3 permettent une expression du gène gus plus précoce que la construction P4 au cours de la maturation. La construction P5 ne permet pas l'expression du gène gus puisqu'aucun transcrit n'est détecté. En effet, des transcrits du gène gus sont détectés à 10 JAF pour les 3 constructions P1, P2, P3, et seulement 25 JAF pour la construction P4. Ceci suggère que les différences de niveau d'expression précédemment signalées entre les constructions P2 et P4, résultent probablement d'un retard dans l'expression du gène gus sous le contrôle du promoteur P4, plutôt que d'un niveau d'expression plus faible. La région du promoteur du gène TaTrxh2 comprise entre-1111 pb et - 228 pb contient certainement des séquences de régulation qui permettent une expression du gène gus dans les premiers stades de la maturation. Concernant l'expression spatiale, la région du promoteur du gène TaTrxh2 comprise entre-1111 pb et -591 pb contient probablement une séquence inhibant l'expression du gène dans l'épithélium du scutellum. En effet, lorsqu'elle est délétée (construction P2) l'expression du gène gus est observée dans ce tissu. A l'inverse, la région comprise entre-591 pb et-451 pb contiendrait une séquence activant l'expression dans l'épithélium du scutellum, car lorsqu'elle est délétée (construction P3) il n'y a plus d'expression du gène gus dans ce tissu. Les résultats montrent qu'au cours de la maturation des grains de riz, le promoteur du gène TaTrxh2 permet une expression du gène gus spécifique de l'albumen amylacé. Cette expression est détectée dans un nombre restreint de cellules réparties dans une zone centrale de l'albumen et à la périphérie de l'embryon. LISTAGE DE SEQUENCES INRA Promoteur du gène TaTrxh2 MJPcb539/87 2 PatentIn Vers. 2.0 1 2687 ADN Triticum aestivum exon (1112)..(1231) intron (1232)..(2203) exon (2204)..(2326) intron (2327)..(2420) exon (2421)..(2558) CDS (1112)..(1231) CDS (2204)..(2326) CDS (2421)..(2558) 1 gaagtcagaa ggccgttcag aattgttgga ggactcgaaa aaaagaaggg gagcccaggc 60 agacgacggg gcggcatgtg cctgttcctt ggcgaggcgt ctagctttgg cagccgccgc 120 cgcttttctc cttgggtggg cgcgcgagct ccccgagttt gagccgcaat ttttttacat 180 tttatggcga tggcgtcagg cgtttatcta ggcgtctggg agggtacatt tgaagatgtg 240 ccaccaactc caaaccgaca accctgtatc tgagcatgcc tcatgcctct ccttcatgcc 300 tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga g atg gcg gcg tcg gcg gcg acg 1132 Met Ala Ala Ser Ala Ala Thr 1 5 gca acg gcg gcg gcg gtg ggg gcg ggg gag gtg atc tcc gtc cac acc 1180 Ala Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Gly Glu Val Ile Ser Val His Thr 10 15 20 ctg gag cag tgg acc atg cag atc gag gag gcc aac gcc gcc aag aag 1228 Leu Glu Gln Trp Thr Met Gln Ile Glu Glu Ala Asn Ala Ala Lys Lys 25 30 35 ctg gtacgcatct ttccggatcg atctctccct cccccctcgt cttctcccgc 1281 Leu 40 aaggcggcac gggccgggcg aggatgctct tgtttcagat tggttggtga agttaagacc 1341 tggctcgtgc atgcggtggc cgcccgagga cgaatctgcg gttggtctgg ttgaattttg 1401 atggcttgga gagcatgtta cggtcggttt cttttccccg tcttattagg gctgccgtgg 1461 atatcatctt ctcatgttaa aaaggagaca gtttcagaac cgcgtgtacc gctacttcct 1521 cggtttctaa atatagatct tctaagattg caccacggac tatgtactga tgtatgtata 1581 tatatacata cttcagagta tagatcactc gttttgctcc gtatgtagta tgcagttcac 1641 ggggggcaca tctgtttgta tggtcttttt gtctgaaaac agtgttggtt atgctgtaat 1701 gtcatggcat ctttctgcga tgcagggggc atggctcttt acattaccct tgcagcattt 1761 tattgtttcc gcatcgtgct gcctcacatg cttttttaga ttgtatagga attgctattg 1821 cacgcaatta tccccttatc cgtggctgct gcagatttgc accaatattc cgtatgtaga 1881 tcccaaacgt ctcctcaagt ttggcatagt aagatcgatt gtgctaactc cactaaaaac 1941 actgtaccag gaatttatat gatgatcatc ttgttgtttg tatatatttt tttgcggggg 2001 agtttataac tttccgtgga ttttcatctc tgaaattgtg gaacatcata aaattccagt 2061 gctattctct tcacgtgaat tataacctgg attgattgta agctctggta ggtgtttatg 2121 gtgttgaact agcagtagca ttattgaccc atgctttgca catttgtgtc aaggtcctgt 2181 taaccttgtc gtttgtaaca g gtg gtg gtt gac ttc act gca tca tgg tgt 2232 Val Val Val Asp Phe Thr Ala Ser Trp Cys 45 50 gga cca tgc cgc atc atg gct cca gtt ttc gct gat ctc gcc aag aag 2280 Gly Pro Cys Arg Ile Met Ala Pro Val Phe Ala Asp Leu Ala Lys Lys 55 60 65 ttc cca aat gct gtt ttc ctc aag gtc gat gtc gat gaa ctg aag 2325 Phe Pro Asn Ala Val Phe Leu Lys Val Asp Val Asp Glu Leu Lys 70 75 80 gtaatggaac cgatggcgct gtttacagag cacagagtat catcgtgcga tttcagagct 2385 gtgttactaa caaggtttta tgttgtatga acagcccatt gcg gag caa ttc agc 2440 Glu Gln Phe Ser 85 gtt gag gcc atg cca acc ttc ctg ttc att aag gaa gga gat gtc aag 2488 Val Glu Ala Met Pro Thr Phe Leu Phe Ile Lys Glu Gly Asp Val Lys 90 95 100 gac agg gtt gtg gga gct atc aag gag gaa ctg acg aac aag gtt ggg 2536 Asp Arg Val Val Gly Ala Ile Lys Glu Glu Leu Thr Asn Lys Val Gly 105 110 115 cta cac gcg gcg gcc cag taatcaccta gcggagtagt attcgcctaa 2584 Leu His Ala Ala Ala Gln 120 ataaaattgt ggctcaagaa gcggtgcctc taatggcacc ttatatcctg tgtactgctt 2644 gttacttgtt ggttggatga tggtgaatca agtgtgactt tat 2687 2 1111 ADN Triticum aestivum 2 gaagtcagaa ggccgttcag aattgttgga ggactcgaaa aaaagaaggg gagcccaggc 60 agacgacggg gcggcatgtg cctgttcctt ggcgaggcgt ctagctttgg cagccgccgc 120 cgcttttctc cttgggtggg cgcgcgagct ccccgagttt gagccgcaat ttttttacat 180 tttatggcga tggcgtcagg cgtttatcta ggcgtctggg agggtacatt tgaagatgtg 240 ccaccaactc caaaccgaca accctgtatc tgagcatgcc tcatgcctct ccttcatgcc 300 tccctttggg tgaggtcatg tgcccttggc ggcgagtggc ttcccgttta gagcaagtat 360 aataagtcct agtcagctgg ctataagatg ttccacatca gcaaatcctt aaactggagg 420 agaaagaaag taggagtgag aagggcgtcg gcgcttcgtc aatcgctagc gatagcacaa 480 gctcccatgg aatcgagcca acatgcaacc cgcacaatga ctaaaggcaa acgccagcca 540 atcagtatgc ctttctctgc atctttcttc atgcaagcat taaatactat agctaatcta 600 cagccagttt attatataaa caggctatat agctgacctg gcagtgctat agagccggca 660 gccggctctt ctattagctt tgctcttatg gctacatctg tgtgagcagt cgattgattc 720 aaacaacaaa tccgggcgtt cagcaagtcg gaatgaattt cggctcatca ctcattgtcg 780 tgggcctcac gcgtattcgc ctaaccgtgt ttgaatcaga ccctcacgaa gccacggctc 840 cagcgacccg ttcaccacgt cagcctaaaa aaagaaaaaa aaactgttca atcacacgcc 900 catctgaacc gttcaacagc cccacgtaat ttcgcgcacc agcaaagggc atatccgtca 960 tagcgagcgc ataaattctg attcctgcct gcctgccgga caatttatct ttggggaggc 1020 gggccgggat tggagacaga gcccacaagg caacaacaaa gtgcgcgtga gaaatcaaca 1080 agcggtgctt gccgagaaga gagagagaga g 1111 REVENDICATIONS 1) Promoteur caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un domaine fonctionnel spécifique du promoteur du gène Ta Trxh2. 2) Promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment d'acide nucléique est choisi dans le groupe constitué par : - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-1 à la position-83 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à la position-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-591 à la position-1111 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-228 à la position-451 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-451 à-591 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence s'étend de la position-83 à la position-228 par rapport au codon ATG du gène TaTrxh2 ; - le fragment d'acide nucléique dont la séquence est celle du premier intron du gène TaTrxh2. 3) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 5) Cellule végétale transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 6) Plante transgénique transformée par au moins un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 7) Plante transgénique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une monocotylédone. 8) Utilisation d'un promoteur selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour contrôler l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule végétale.