Brevet FR2792336A1 — publié le 20001020

Cassette de régulation de l'expression d'un acide nucléique hétérologue dans unc cellule cucaryotc, en particulier musculaire. La présente invention concerne une cassette de régulation de l'expression d'un acide nucléique hétérologue dans une cellule eucaryote, en particulier musculaire, un vecteur d'expression recombinant comprenant une telle cassette de régulation ainsi qu'un hôte cellulaire recombinant ou un animal transgénique contenant ladite cassette de régulation ou ledit vecteur recombinant. L'invention concerne aussi une composition, notamment une composition pharmaceutique, comprenant la cassette de régulation d'un acide nucléique hétérologue dans une cellule musculaire ou le vecteur recombinant ainsi que l'utilisation de la cassette de régulation ou du vecteur recombinant pour la fabrication d'un médicament. Le recherche de l'expression sélective d'un gène d'intérêt dans un tissu particulier nécessite l'identification, puis l'utilisation d'éléments régulateurs de l'expression de ce gène dans le tissu cible. C'est un but essentiel dans la mise au point de procédés de thérapie génique somatique que d'identifier de nouveaux éléments régulateurs capables de diriger l'expression d'un gène déterminé d'intérêt thérapeutique dans un tissu ou organe spécifique, éventuellement choisi en fonction de la nature de la pathologie à prévenir ou à traiter. Le tissu musculaire, plus particulièrement le tissu musculaire strié, constitue une cible de choix en vue de l'expression d'un gène hétérologue. La masse musculaire représente en effet environ 70 % du poids total du corps, chez l'homme. En particulier, le muscle est constitué d'une masse tissulaire stable dans laquelle les cellules participant à la contraction se renouvellent très lentement, et donc dans laquelle des cellules génétiquement modifiées exprimant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique ou vaccinal sont susceptibles de rester vivantes et physiologiquement actives pendant une longue durée, et dans tous les cas pendant une durée d'au moins plusieurs mois. Du fait de son fort niveau de vascularisation, le muscle squelettique représente un tissu idéal pour la diffusion systémique de molécules d'intérêt thérapeutique ou vaccinal. Lorsque l'expression d'un gène d'intérêt dans le muscle est recherchée, un premier problème à résoudre consiste en l'identification de polynucléotides possédant une activité promotrice préférentiellement dans les cellules musculaires. Un tel polynucléotide à activité promotrice spécifique des cellules musculaires est représenté, par exemple, par le promoteur du gène de la desmine, ou encore un promoteur de l'un des gènes de l'actine, de la troponine ou de la tropomyosine. Un second problème technique consiste en l'identification de polynucléotides susceptibles de réguler positivement l'activité promotrice spécifique de tissu d'un polynucléotide placé à proximité du gène hétérologue dont on recherche l'expression En d'autres termes, il est souhaitable d'obtenir un haut niveau d'expression de l'acide nucléique hétérologue d'intérêt, par la mise en évidence et l'isolement de séquences dites activatrices , capables d'augmenter le niveau d'expression du gène d'intérêt dans le muscle. Un exemple de tels éléments régulateurs peut être ceux du gène de la desmine, il a été identifié dans l'état de la technique une séquence de 280 paires de bases localisée, dans le génome, en amont de ce gène et qui a un effet amplificateur de l'expression de la desmine in vivo. L'identification d'une telle séquence activatrice a permis la réalisation de constructions d'ADN comprenant cette séquence activatrice en association avec un gène hétérologue, par exemple des cytokines ou encore des protéines antigéniques (demande PCT N WO 96/26284 - Paulin et al.). De telles constructions d'ADN ont permis la mise au point de différents vecteurs utilisables dans des procédés de thérapie génique somatique à visée préventive ou curative. Plus récemment, ont été isolés des éléments régulateurs de l'expression d'un gène codant pour deux protéines musculaires, les chaînes légères de la myosine dans la fibre rapide, ces protéines étant codées par le locus MLCIF/3F chez la souris et chez l'homme. Les analyses de l'expression des gènes appartenant à la famille des chaînes légères alcalines de la myosine (MLC) ont permis d'observer des profils d'expression variés des gènes spécifiques du muscle in vivo (Barton et al , 1989). Chez les oiseaux et les mammifères, le gène MLC1F/3F code deux isoformes de la MLC retrouvées dans les fibres musculaires en développement et les fibres rapides chez l'adulte. Les isoformes MLC IF et MLC3F diffèrent à leur extrémité N-terminale du fait de l'existence de deux exons distincts et d'un événement d'épissage alternatif (Nabeshima et al., 1984 ; Periasamy et al., 1984 ; Robert et al., 1984). Les régions régulatrices de l'expression du promoteur MLC IF ont été étudiées par Donoghue et al (1988), Rosenthal et al. (1989) et Rao et al. (1996) Les transcrits du gène MLC3F sont également retrouvés dans le muscle cardiaque (Kelly et al., 1995). Le premier des éléments régulateurs du gène MLC 1 F/3F à avoir été identifié est localisé dans le génome en aval du gène MLC1F/3F. Il s'agit d'une séquence, dite séquence activatrice 3' , qui a été décrite pour conférer un haut niveau d'expression du promoteur MLC IF in vitro dans les cellules musculaires en culture et dans les souris transgéniques, où il est actif dans les embryons dès 9,5 jours (E9,5) dans le myotomc, et dans les muscles des pattes en formation dès les embryons de 11,5 jours (CI 1,5), semblable à l'accumulation des transcrits endogènes de MLCIF (Donoghuc et al , 1988 , Rosenthal et al., 1989 ; Grieshammcr et al., 1992) La séquence activatrice 3' active de manière précoce la transcription du gène MLC3F dans le muscle squelettique, au moment de l'activation du promoteur du gène MLCIF, et ne confère donc pas une spécificité d'expresssion attendue in vivo du gène MLC3F au cours du développement embryonnaire, cette spécificité d'expression n'étant pas conférée non plus par le promoteur MLC3F lui-même (Kelly et al., 1995). Une seconde séquence activatrice du gène MLC1F/3F, d'une longueur de 800 paires de bases, a été localisée dans le premier intron de ce gène. Cette séquence sera désignée dans la description comme la séquence activatrice intronique (Kelly et al., 1997). Dans les souris transgéniques, la séquence activatrice 3' et la séquence activatrice intronique sont actives seules dans le muscle squelettique adulte. En revanche, la séquence activatrice intronique n'est pas fonctionnelle dans les cellules musculaires embryonnaires (E9-E 13,5), et active l'expression d'un transgène durant la myogénèse foetale (E13,5-naissance), ce qui coïncide avec un haut niveau d'accumulation des transcrits MLC3F endogènes. De manière générale, les interactions entre différents modules activateurs de la transcription ont été étudiées, dans l'état de la technique, sur la base d'études de transgénèse, pour quelques gènes d'oursin et de drosophile. Ces études ont révélé la remarquable complexité des systèmes de régulation agissant en cis (Arnone et al , 1997). Par ailleurs, d'autres gènes spécifiques du muscle contiennent plus d'une séquence activatrice, chacune des séquences activatrices pouvant réguler des sousensembles distincts de spécificités transcriptionnelles (Johnson et al., 1989 ; Gremke et al., 1993 ; Biben et al., 1994 ; Zhu et al., 1995). Un effet de coopération in vivo entre une séquence activatrice et une seconde région polynucléotidique a été observé dans le muscle strié, chez des souris transgéniques ayant reçu une construction d'ADN (MCK-CAT) contenant les régions régulatrices du gène de la créatine kinase du muscle (MCK) placées en amont du gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Les résultats d'expression du gène CAT ont permis d'observer qu'une séquence activatrice localisée à l'extrémité 5' du gène MCK interagit avec une région polynucléotidique située immédiatement en amont du promoteur, afin de diriger l'activité transcriptionnelle à la fois dans le muscle squelettique et dans le muscle cardiaque, et ceci à un niveau plus important que le niveau d'activité observé chez des souris transgéniques hébergeant une construction d'ADN ne contenant que l'une de ces deux séquences (Donovicl et al., 1996). La région polynucléotidique située immédiatement en amont du promoteur a une longueur d'environ )I kilobasc, au sein de laquelle il a été isolé une séquence proximale, d'une longueur de 358 paires de bases, dans laquelle les caractéristiques d'une séquence activatrice n'ont pas été retrouvées, située en amont du site d'initiation de la transcription du gène MCK. Cette séquence de 358 pb est, du moins en partie, responsable de l'effet de coopération observé (Shield et al., 1996). Ces auteurs ont envisagé l'utilisation de telles séquences régulatrices dans des constructions de vecteurs destinés à la thérapie génique. En revanche, l'effet de coopération entre ces séquences régulatrices n'a pas été observé in vitro dans les cellules du muscle squelettique (Donoviel et al., 1996). Un effet de synergie entre deux séquences activatrices a été observé, mais uniquement in vitro, dans des lignées de cellules B, au niveau du locus codant pour la chaîne légère d'immunoglobuline de type kappa (Blasquez et al., 1992 ; Fulton et al., 1993) : un haut niveau de transcription à partir du promoteur de la région variable de la chaîne de type kappa est dépendant d'un effet de synergie entre deux séquences activatrices qui sont activées de manière différentielle dans les lignées cellulaires, représentant des différents stades de maturation des cellules B (Fulton et al., 1993). Au vu de l'état de la technique ci-avant présenté, une activité de synergie in vivo entre plusieurs séquences à fonction activateur de la transcription (ou enhancer ) n'a jamais été décrite dans l'état de la technique, et en particulier s'agissant d'activation spécifique de la trancription dans des cellules musculaires. Les inventeurs se sont donc attachés à mettre au point des constructions d'ADN destinées à l'expression d'un transgène dans des cellules musculaires, en particulier de souris, lesdites constructions permettant un très haut niveau d'expression non-transitoire du transgène considéré au sein des cellules hôtes, ledit niveau d'expression du transgène étant compatible avec une production suffisante du produit de transcription ou du produit de traduction dans la cellule hôte, de nature à induire un effet thérapeutique autant que vaccinal lorsque l'expression du transgène est recherchée chez un patient à traiter. De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3', situées respectivement en amont et en aval de la séquence du gène MLC3F, étaient capables de coopérer fonctionnellement et d'induire un effet synergique sur l'activité du promoteur MLC3F in vivo. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que l'effet de synergie induisait, dans des constructions recombinantes, un niveau d'activité in vivo du promoteur MLC3F du même ordre que le niveau d'activité observé naturellement au locus MLC3F endogène. C'est la première fois qu'un tel effet de synergie entre deux séquences activatrices a été observé in vivo sur le niveau d'expression d'un gène spécifique du muscle. Plus particulièrement, le demandeur a mis en évidence un effet de synergie d'activité entre la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' sur le niveau de la transcription d'un acide nucléique hétérologue, initiée par le promoteur MLC3F, cet effet étant détecté à la fois par une quantification de l'abondance des transcrits de MLC3F et par le niveau d'activité enzymatique du produit de traduction dudit acide nucléique hétérologue. Par acide nucléique ou polynucléotide hétérologue au sens de la présente invention, on entend un acide nucléique ou un polynucléotide qui a été introduit artificiellement, par un procédé technique, dans un hôte cellulaire procaryote ou eucaryote, ledit acide nucléique ou polynucléotide hétérologue étant présent dans ledit hôte cellulaire sous une forme intégrée au génome ou sous la forme d'un élément génétique additionnel, tel qu'un plasmide non présent naturellement chez ledit hôte cellulaire. Répond notamment à la définition ci-avant, un polynucléotide ayant une séquence identique à la séquence d'un acide nucléique présent naturellement chez l'hôte cellulaire considéré, ayant été introduit de manière artificielle chez ledit hôte cellulaire. A titre illustratif d'un acide nucléique hétérologue tel que ci-dessus, les inventeurs ont utilisé un gène rapporteur, le gène de la beta-galactosidase. Lorsque le niveau d'activité d'un gène rapporteur donné (CAT ou betagalactosidase) est comparé entre des constructions de l'état de le technique, incluant la séquence activatrice du gène de la créatine phosphatase, et les constructions réalisées par le demandeur, il est observé que les constructions selon l'invention, en particulier le plasmide 3F-iilacZ-21E, sont capables d'induire un niveau d'expression du gène rapporteur considéré environ 50 fois plus important que les constructions actuellement utilisées, y compris des constructions contenant la séquence activatrice 3' décrite ciaprès (estimations calculées d'après Rao et al., 1996). Les deux séquences activatrices mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont respectivement : a) la séquence activatrice intronique du gène MLC3F, de séquence SEQ ID N 1 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après ; cette séquence activatrice intronique est également présente et très conservée chez l'homme , b) la séquence activatrice 3' du gène MLC3F, de la séquence SEQ ID N 2 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après. La séquence activatrice 3' est retrouvée en aval des gènes MLCIF/3F, par exemple de la souris, du rat (Donoghue et al., 1988) ou de l'homme (Rosenthal et al., 1990), et cette séquence apparaît extrêmement conservée au sein de l'arbre philogénétique. A titre illustratif, la séquence activatrice 3' de souris, de séquence nucléotidique SEQ ID N 2, possède 83 % d'identité avec sa contrepartie dans le génome humain et 93,8 % d'identité avec sa contrepartie dans le génome du rat (cf. Fig. 5). En conséquence, constitue un objet de la présente invention une cassette de régulation de l'expression d'un acide nucléique hétérologue dans une cellule eucaryote, caractérisée en ce que ladite cassette comprend : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides ; b) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 2, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides. Un polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2 comprendra, par rapport au polynucléotide initial, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, étant entendu que répondent à la définition de polynucléotides dérivés uniquement les polynucléotides dont la fonction d'activation de la transcription à partir du promoteur MLC3F ainsi que la fonction de coopération pour l'obtention d'un effet de synergie d'activation de la transcription à partir de ce promoteur sont maintenues Il vivo. Le maintien des fonctions activatrices initiales et de l'induction de l'effet de synergie peut être aisément vérifié par l'homme du métier, notamment en procédant selon l'enseignement des exemples ci-après. Répondent notamment à la définition ci-dessus de polynucléotide dérivé, les polynucléotides ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID N 2. Préférentiellement, une cassette de régulation telle que définie précédemment contiendra également un polynucléotide comprenant tout ou une partie du promoteur du gène MLC3F, ledit promoteur étant décrit notamment par Nabeshima et al (1984 ; poulet), par Periasamy et al. ( 1984 ; rat), par Robert et al. ( 1984 ; souris) et par Scidel et al. (1989 ; homme), ledit polynucléotide constituant une cible pour la fonction d'activatcur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2. Ainsi, un plasmide contenant la séquence activatrice intronique SEQ ID N 2 de 800 paires de bases, le promoteur du gène MLC3F, le gène nlacZ et la séquence activatrice 3', est capable d'induire un niveau d'expression de la beta-galactosidase plus important, par rapport au niveau d'expression d'un plasmide de construction similaire mais qui ne comporte que l'une des deux séquences activatrices. Un tel plasmide est par exemple le plasmide 3F-nlacZ-9E, le plasmide 3F-Il/acZ-E9 ou encore le plasmide 3FIlln'CZ-2IE, ces plasmides étant décrits dans les exemples ci-après. Les inventeurs ont montré que la localisation de la séquence activatrice 3' dans les constructions plasmidiques selon l'invention, par rapport à la fois au promoteur et à l'acide nucléique hétérologue d'intérêt était indifférente. A titre d'exemple, la séquence activatrice 3' est localisée du côté 3', par rapport au gène rapporteur nlacZ, dans les plasmides 3F-nlacZ-9E, et 3F-nlacZ-2IE alors que cette même séquence est placée du côté 5', par rapport à la séquence activatrice intronique, dans le plasmide 3F-tilac7.-E9. Les résultats présentés sur la Figure 1C montrent que les niveaux d'expression de la beta-galactosidase sont pratiquement identiques dans les cellules myogéniques contenant l'un quelconque de ces trois plasmides. Par ailleurs, la distance nucléotidique entre la séquence activatrice intronique et le site d'initiation de la transcription, dans la cassette de régulation selon l'invention, peut être de longueur très variée. Cette distance est d'environ 2 kilobases pour le plasmide 3F-nlacZ-2IE, alors qu'elle est d'environ 4,2 kilobases pour les plasmides 3F-nlacZ-9E et 3F-tilac7-E9. La région promotrice utilisée dans les expériences ci-dessus est représentée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N 3 telle que décrite dans la liste des séquences ciaprès. L'utilisation d'autres séquences plus courtes provenant de la région promotrice - 2kb en combinaison avec ces activateurs a également démontré une activité maximale en présence des deux éléments activateurs. Une telle région à l'intérieur de la séquence promotrice est représentée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette selon l'invention, caractérisée en ce que le polynucléotide comprenant une partie du promoteur MLC3F est choisi dans le groupe d'acides nucléiques constitué de : a) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 3 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 3, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2, ou de b) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 4, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2. Plus généralement, le choix d'un promoteur adéquat par l'homme du métier pourra aussi être guidé par l'ouvrage de Sambrook de 1989. A titre d'exemple, un promoteur musculaire utilisable dans une cassette de régulation selon l'invention est le promoteur de la desmine, tel que décrit par Bolmont et al. (1990) ou par Li et al. (1989). L'invention concerne également une cassette de régulation selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle contient un acide nucléique hétérologue d'intérêt choisie dans le groupe constitué de : a) un acide nucléique hétérologue codant pour un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique hétérologue codant un un ARN sens ou antisens. Dans un mode de réalisation particulier d'une cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide à fonction de promoteur décrit ci-dessus, est placé en amont de l'acide nucléique hétérologue. Selon un autre aspect de la cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide comprenant tout ou partie du promoteur MLC3F. Selon encore un autre aspect de la cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide à fonction de promoteur et de la partie du promoteur MLC3F. Une caractéristique additionnelle de la cassette de régulation selon la présente invention réside dans le fait que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 est placé indifféremment en amont ou en aval de l'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Fait également partie de l'invention un vecteur d'expression recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de régulation selon l'invention. Un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé dans le but de produire un polypeptide ou un acide nucléique hétérologue d'intérêt in vitro ou in vivo. Dans cette dernière application, un vecteur recombinant selon l'invention est mis en oeuvre dans le cadre d'un procédé de thérapie cellulaire somatique chez l'homme ou l'animal. La thérapie génique somatique implique la mise en oeuvre de moyens destinés à corriger un défaut ou une anomalie génétique (mutation, expression déficiente d'un gène etc. ) ou encore à permettre la production in vivo d'un polypeptide (par exemple un antigène) ou d'un ARN non synthétisé naturellement par l'organisme hôte, ces moyens permettant l'introduction d'un polynucléotide contenant au moins une copie du polynucléotide dont l'expression est recherchée chez ledit organisme hôte. Ledit polynucléotide dit thérapeutique peut être introduit in vitro dans une cellule prélablement prélevée chez l'organisme hôte à traiter, la cellule modifiée étant ensuite réintroduite dans ledit organisme hôte, directement in vivo, en général dans le tissu cible Dans le cas où le polynucléotide thérapeutique code pour un polypeptide, ledit polypeptide peut être indifféremment un polypeptide destiné à une diffusion systémique ou un polypeptide dont l'action biologique est recherchée au niveau du muscle lui-même. Dans le cas d'une libération systémique, le polypeptide peut être de toute nature et en particulier de nature immunogène, lorsqu'une immunisation de l'individu hôte est désirée. Dans le cas d'une action locale, le polypeptide sera de préférence un polypeptide destiné à corriger un défaut génétique s'exprimant principalement, voire exclusivement au niveau du muscle. Dans ce dernier cas, le polypeptide d'intérêt thérapeutique peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, la dystrophine ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le collagène ou l'élastine. De manière générale, ledit polypeptide peut être une ou plusieurs protéines présentant un intérêt thérapeutique ou immunothérapeutique, telles que des protéines d'intérêt immunothérapeutique, par exemple des interleukines, les facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs) ou le NGF ( Nerve Growth Factor ). Parmi les polypeptides d'intérêt, on peut aussi citer l'interféron alpha, l'interféron beta, l'interféron gamma, les interleukines (IL-1à IL-16), le facteur stimulant les colonies de monocytes/macrophages (CSF-1 ou MCSF), le facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes (GCSF), le facteur stimulant la formation de colonies mixtes granulocytes/macrophages (GM-CSF), le facteur inhibiteur de leucémie (LIF), le facteur de nécrose tumorale (TNF alpha), la lymphotoxine (LT ou TNF beta), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires (VEC-GF), l'érythropoïétine, le TGF beta (pour Transforming growth factor bela ), le TGF alpha, le facteur de croissance des cellules B (BCGF), le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF) ou encore la protéine-1 chemoattractive pour les monocytes ( Monocyte Chemoattractant Protem-1 ou MCP-1). D'autres protéines d'intérêt sont également l'insuline, le Facteur IX et l'hormone de croissance, préférentiellement d'origine humaine. Le polypeptide d'intérêt thérapeutique peut également être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90/11092, et en particulier un antigène viral telle que la glycoprotéine gp 120 ou la protéine Nef du VIH (virus de l'immunodéficience humaine). Parmi les antigènes d'intérêt vaccinal susceptibles d'être produits par recombinaison génétique en utilisant une cassette de régulation selon l'invention, sont compris les antigènes suivants : a) l'antigène ESAT-6 qui est considéré comme un antigène majeur de M. luberculosis, décrit notamment par Sorensen et al. (1995) ; b) la protéine de 45/45 kD de M. iuberculosis, décrite dans la demande PCT/FR 96/0166 ; c) l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (Ag Hbs) décrit dans le brevet français N 79 21 811 ; d) tout ou une partie de certaines glycoprotéines de HIV-1 ou HIV-2. Les séquences génomiques du virus HIV-1 sont décrites dans les demandes de brevet GB 8324800, EP 84401834 ou encore EP 85905513 ; les séquences génomiques du virus HIV-2 sont décrites dans la demande de brevet EP 87400151. L'acide nucléique hétérologue contenu dans une cassette de régulation selon l'invention peut également coder pour un polynucléotide, en particulier un ARN d'intérêt thérapeutique, tel qu'un ARN sens ou antisens. Par exemple, un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90/11092, au nom de la société VICAL ou encore décrit par Sczakiel et al. (1995). De préférence, les polynucléotides antisens sont choisis parmi des polynucléotides d'une longueur d'environ 15à 1000 paires de bases, en particulier de 15 à 200 paires de bases, lesdits polynucléotides étant avantageusement choisis parmi les polynucléotides complémentaires de l'extrémité 5' de la séquence codante du gène dont l'inhibition de l'expression est recherchée. A titre illustratif, un autre ARN antisens codé par l'acide nucléique hétérologue constitutif d'une cassette de régulation selon l'invention est un ARN hybridant avec l'extrémité 5' de la séquence codante du gène de l'Insulin-like Growth Factor II (IGFH), comme décrit par Montarras et al. (1996). Un autre objet de l'invention concerne un vecteur d'expression recombinant destiné à la production in vitro d'un polypeptide d'intérêt, notamment d'intérêt thérapeutique ou vaccinal tel que défini ci-dessus, à partir d'une culture de cellules eucaryotes ledit vecteur recombinant comprenant une cassette de régulation selon l'invention. Avantageusement, un tel vecteur comprendra, en outre, les signaux de régulation de la traduction nécessaires à une expression optimale du polypeptide de fusion dans l'hôte cellulaire choisi, ces signaux de régulation devant être, au sein du vecteur recombinant, liés de manière fonctionnelle au polynucléotide codant pour le polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur comprendra un signal de début de traduction et un site de liaison aux ribosomes (séquence Shine-Dalgarno). En outre, un site de terminaison de la transcription fonctionnel chez l'hôte cellulaire recombinant choisi peut être, si nécessaire, inséré en aval du codon d'arrêt de la traduction de la séquence codante, afin d'obtenir des transcrits de la taille la plus réduite possible et ainsi favoriser l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention. Les vecteurs d'expression suivants peuvent être utilisés : - vecteurs pour cellules eucaryotes : pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (commercialisés par Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (commercialisés par Pharmacia), pCDNA3 (commercialisé par Invitrogen) ; - un vecteur adénoviral ; - un vecteur d'adénovirus associé ; - un vecteur pseudo-adénoviral ; - un vecteur rétroviral. Un vecteur recombinant contenant une cassette de régulation selon l'invention est le plasmide pMLC3F-rrlacZ-2IE contenu dans la souche de E. coli déposée le 13/02/1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le N 1-1983. L'invention concerne en outre tout hôte cellulaire recombinant, procaryote ou cucaryotc, comprenant une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention. A titre illustratif, un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche recombinante de E coli contenant le plasmide pMLC3FnlacZ-2IE déposée le 13/02/1998 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le N 1-1983. Les cellules recombinantes de l'invention peuvent être préparées en utilisant les techniques connues de l'homme du métier permettant l'introduction d'un acide nucléique dans une cellule. Il peut s'agir par exemple de techniques physiques (électroporation, biolistique, etc. ), de techniques chimiques (précipitation au phosphate de calcium, utilisation d'agents de transfert chimiques : lipides cationiques, polymères, etc. ) ou d'autres méthodes telles que la fusion de cellules, la conjugaison, etc. Préférentiellement, des hôtes cellulaires recombinants selon l'invention sont des cellules musculaires, soit des cellules issues de culture primaire, soit des lignées cellulaires. L'obtention de cellules myogéniques en culture primaire, en particulier l'obtention des cellules C57P21, dérivées d'une population de cellules musculaires d'une souris adulte, qui gardent au fil des passages leurs capacités de prolifération et de différenciation est par exemple décrite par Pinset et Montarras (1998). Des lignées cellulaires dérivées du muscle utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple les lignées cellulaires suivantes : C2 : Lignée de cellules murines dérivée d'un muscle de souris C3H adulte selon la méthode décrite par D. Yaffé & O. Saxel (1997). Il s'agit de la lignée de cellules musculaires la plus largement répandue, disponible à l'ATCC ; C2TB : Cellules de la lignée C2 transfectées de manière stable avec un plasmide conférant la résistance à un agent de sélection l'hygromycine (Montarras et al., 1996) ; C2/7 : Lignée de cellules de myotube (Kelly et al., 1995) ; Sol 8 : Lignée de cellules murines dérivées d'un muscle soléaire de souris adulte établie par Pinset et al. (1991) ; BC3H1 :Lignée de cellules musculaires dérivée d'une tumeur cérébrale de rat selon la méthode décrite par D. Schubert et al. (1974). Un hôte cellulaire recombinant eucaryote selon l'invention est particulièrement préféré lorsque le polypeptide dont la production est recherchée possède un ou plusieurs sites de glycosylation et où ce(ces) site(s) de glycosylation est(sont) importants) pour le maintien de ses caractéristiques fonctionnelles, telles que par exemple la capacité dudit polypeptide à se lier spécifiquement à un récepteur, notamment un récepteur hormonal ou un récepteur de médiateur endogène, par exemple un récepteur de cytokine ou encore lorsque ledit polypeptide est un antigène d'intérêt vaccinal. L'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide recombinant tel que défini dans l'invention. Un procédé particulier de production d'un polypeptide selon l'invention comprend la culture d'un hôte cellulaire recombinant tel que précédemment décrit, la récupération, et, le cas échéant, la purification dudit polypeptide à partir du surnageant de culture ou du lysat cellulaire de l'hôte recombinant. De préférence, le procédé de production d'un polypeptide selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation d'un hôte cellulaire par un vecteur d'expression recombinant selon l'invention ; b) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à l'étape b) ; c) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucléotide porté par le vecteur recombinant. Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus selon un procédé de l'invention, font également partie de l'invention. Lorsque l'hôte recombinant est une cellule musculaire, en particulier myogénique, transfectée par un vecteur recombinant selon l'invention, le polypeptide recombinant sera purifié à partir du surnageant de culture où d'un extrait cellulaire. Un tel extrait cellulaire sera par exemple obtenu par un choc osmotique et/ou une sonication d'un culot cellulaire préparé à partir de la culture des cellules transfectées. Les polypeptides recombinants selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier dans lequel ils porteront à l'une de leurs extrémités un segment de polyhistidine, par exemple une queue de six résidus histidine, peuvent en outre être purifiés sur une colonne de chromatographie contenant une résine à base de nickel, comme par exemple la résine NiNTA (Porath et al., 1975 ; demande internationale N PCTIFR 96/01801, publiée sous le N WO 97/18311 [Deubel et al.]). Selon un autre aspect de l'invention, la cassette de régulation contenant un acide nucléique hétérologue codant pour un polypeptide ou un ARN d'intérêt thérapeutique peut être utilisée dans des systèmes de transfert et/ou d'introduction de gènes utilisables en thérapie génique somatique. Un procédé de thérapie cellulaire somatique mettant en oeuvre une cassette de régulation selon l'invention comprend une étape d'introduction d'une préparation comprenant un support injectable pharmaceutiquement compatible et un ADN contenant une cassette de régulation selon l'invention de manière à ce que l'ADN soit incorporé à l'intérieur de la cellule et que ledit ADN puisse être exprimé à l'intérieur de la cellule hôte cible. Un vecteur recombinant ou la cassette de régulation selon l'invention peuvent être également mis en oeuvre en vue d'une expression in vivo de l'acide nucléique hétérologue contenu dans la cassette de régulation selon l'invention. Un tel vecteur sera avantageusement contenu dans une composition d'intérêt thérapeutique, ladite composition thérapeutique constituant un nouvel objet de la présente invention. De manière générale, un tel vecteur est constitué d'une molécule d'ADN linéaire ou circulaire. Avantageusement, un tel vecteur comprendra une origine de réplication permettant sa réplication dans les cellules de l'organisme hôte, telle que par exemple une origine de réplication d'un papillomavirus bovin. Une telle composition thérapeutique peut comprendre un polynucléotide nu , comme par exemple un ADN double brin comprenant une cassette de régulation selon l'invention. L'utilisation d'ADN nu à visée thérapeutique ou vaccinale chez l'homme ou l'animal est par exemple décrie dans la demande N WO 90/11092 (VICAL Inc. ), dans la demande N WO 95/11307 (Intitut Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa), ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) ou encore Huygen et al. (1996). De telles compositions thérapeutiques sont préférentiellement administrées par voie locale, principalement intra-musculaire. Un polynucléotide thérapeutique nu tel que défini ci-dessus peut être injecté dans l'hôte après couplage avec des composés capables de faciliter la pénétration de celui-ci dans les cellules ou encore son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les produits conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules, comme décrit dans la demande N WO 94/27238 (Medisorb Technologies International). Selon un autre aspect des compositions thérapeutiques selon l'invention, l'ADN nu ou polynucléotide thérapeutique est introduit dans les cellules de l'hôte après complexation avec du DEAE-dextran (Pagano et al., 1967) ou avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., 1989), avec des lipides (Felgner et al., 1987) ou encore encapsulés dans des liposomes (Fralcy et al., 1980). Dans un autre mode de réalisation d'une composition thérapeutique selon l'invention, le polynucléotide thérapeutique peut être inclus dans un système de transfection comprenant des polypeptides facilitant sa pénétration dans les cellules hôtes, comme décrit dans la demande N WO 95/10534 (Seikagaku Corporation). Le polynucléotide thérapeutique ou le vecteur recombinant de l'invention peut avantageusement être administré sous la forme d'un gel qui facilite sa transfection dans les cellules. Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-Llysine et de lactose, tel que décrit par Midoux et al. (1993) ou encore le Poloxamer 407TM, tel que décrit par Pastore et al. (1994). Le polynucléotide thérapeutique selon l'invention peut également se présenter en suspension dans une solution tampon pharmaceutiquement compatible ou encore associé à des liposomes. Ainsi, le polynucléotide thérapeutique et le vecteur recombinant sont utiles pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à apporter une cassette de régulation selon l'invention au niveau du site de l'injection. La quantité de vecteur ou de polynucléotide thérapeutique à injecter peut varier en fonction du site de l'injection. A titre illustratif d'une dose thérapeutiquement efficace, il sera injecté une quantité variant de 0,1à 100 g de polynucléotide thérapeutique ou de vecteur recombinant chez l'homme ou l'animal Dans un autre mode de réalisation du polynucléotide thérapeutique de l'invention, ledit polynucléotide peut être introduit in vitro dans une cellule hôte, de préférence une cellule musculaire, et préférentiellement une cellule hôte préalablement prélevée chez le patient à traiter. Dans une étape ultérieure du procédé, les cellules ayant été transformées avec le polynucléotide thérapeutique selon l'invention sont réimplantées dans le corps du patient de manière à ce que le polypeptide ou l'ARN d'intérêt soit produit dans le corps du patient, soit localement, soit de manière systémique. Dans encore un autre mode de réalisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, ce dernier peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène à remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la cassette de régulation selon l'invention. Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité, sera remplacé par le gène porté par le vecteur recombinant où la cassette de régulation dont on recherche l'expression dans l'organisme hôte. Une telle méthode de recombinaison homologue peut être du type de celle décrite par Le Mouellic et al. (1990) ou encore dans la demande PCT N WO 91/06667. Selon un autre aspect d'un vecteur recombinant selon l'invention, ledit vecteur peut être un vecteur dérivé d'un adénovirus. Des adénovirus adaptés à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux décrits par Feldman et al. (1996), Ohno et al. (1994) ou encore dans la demande de brevet français N 94 03 151 (Institut Pasteur, INSERM). Un autre adénovirus recombinant utilisable dans la préparation d'une composition thérapeutique est l'adénovirus décrit par Ohwada et al. (1996) ou l'adénovirus humain de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou encore un adénovirus d'origine animale, tel que décrit dans la demande de brevet français N 93 05 954 (Danos et al.). Parmi les adénovirus d'origine animale, peuvent être cités les adénovirus d'origine canine (CAV2, souche Manhattan ; adénovirus A26/61 [ATCC N VR-800] ), d'origine bovine, d'origine murine (tel que Mavl ; Beard et al., 1980) ou encore d'origine simienne (SAV). D'autres adénovirus recombinants de l'invention consistent en des adénovirus défectifs qui peuvent être préparés selon une technique bien connue de l'homme du métier, par exemple la technique décrite par Levrero et al. (1991) ou par Graham (1984) ou encore dans la demande de brevet européen N 0 185 573 ou dans la demande N WO 95/14785. Les vecteurs adénoviraux classiquement utilisés conservent plus de 80 % du matériel génétique viral parental. Les systèmes vecteurs dits de seconde génération contiennent les séquences minimales de régulation, d'empaquetage et de réplication adénovirale et peuvent être utilisés avantageusement dans le cadre de l'invention pour l'expression de polynucléotides hétérologues de grande taille. Ces vecteurs sont appelés pseudo-adénovirus (PAV) et ont été décrits notamment dans la demande PCT N WO 94/12649. D'autres vecteurs recombinants utilisables dans le cadre de la présente invention sont les adénovirus associés ou AAV, qui sont des virus naturellement défectifs nécessitant, pour leur réplication, la présence d'un autre virus dit virus auxilliaire tel qu'un adnéovirus ou un virus de l'Herpès. De tels adénovirus associés sont par exemple décrits par Muzyczka et al. (1992), Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), McLaughlin et al. (1989) ou encore par Halbert et al. (1995). Selon un autre aspect de l'invention, un vecteur recombinant de l'invention utilisable dans un procédé de thérapie cellulaire somatique consiste en un vecteur rétroviral, par exemple le vecteur décrit dans la demande N WO 92/15676, un vecteur dérivé du rétrovirus Mo-MuLV, tel que décrit par Roth et al. (1996), ou celui décrit dans la demande N WO 94/24298 (Institut Pasteur). Selon un mode avantageux de la présente invention, un vecteur recombinant rétroviral selon l'invention est utilisé pour transformer des cellules de mammifères, préférentiellement des cellules musculaires. Les cellules musculaires du patient à traiter peuvent être transfectées in vitro, puis réimplantées chez le patient, dans le muscle ou dans un autre compartiment ou tissu de l'organisme selon la maladie à traiter. Dans ce cas, les cellules musculaires transfectées //; vilro peuvent, préalablement à leur réimplantation chez le patient, être ensemencées sur un support ou implant que ces cellules vont d'abord coloniser avant introduction de l'implant dans le corps du patient. Un implant pouvant avantageusement être utilisé peut être constitué d'un support biocompatible destiné à l'ancrage des cellules transfectées, associé à un composé permettant la gélification des cellules sur cet implant. Un tel support biocompatible est avantageusement constitué de corail ou de poudre d'os ou encore de fibres polymères synthétiques, par exemple des fibres de polytétrafluoroéthylène (demande de brevet français N 97 04 700 - Danos et al.). En conséquence, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une cassette, d'un vecteur ou d'un hôte cellulaire selon l'invention, éventuellement associé à un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement compatibles. L'invention vise aussi l'utilisation d'une cassette, d'un vecteur ou d'un hôte cellulaire selon l'invention pour la fabrication d'un médicament à usage humain ou vétérinaire. La cassette de régulation selon l'invention a permis aux inventeurs de réaliser des animaux transgéniques contenant une telle cassette de régulation. En particulier, les inventeurs ont mis au point des souris transgéniques contenant dans leurs cellules une cassette de régulation comprenant à la fois la séquence de régulation intronique, la séquence de régulation 3' et le promoteur MLC3F, ces éléments régulateurs contrôlant l'expression d'un acide nucléique hétérologue A titre illustratif d'animaux transgéniques entrant dans la portée de la présente invention, les inventeurs ont réalisé des souris transgéniques comprenant une cassette de régulation dans laquelle l'acide nucléique hétérologue code pour un gène rapporteur, en l'occurence le gène de la beta-galactosidase associé avec une séquence de localisation nucléaire (nLacZ). Des animaux transgéniques tels que décrits ci-dessus peuvent avantageusement être utiles comme modèles expérimentaux destinés à l'étude de pathologics particulières liées à une déficience ou une aberration de l'expression d'un gène endogène, par exemple d'un gène fortement et/ou exclusivement exprimé naturellement dans les cellules musculaires, et encore plus particulièrement dans les cellules des fibres rapides des muscles. L'invention a donc aussi pour objet un animal transgénique caractérisé en ce que ses cellules somatiques et/ou ses cellules germinales comprennent une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, l'animal transgénique peut être obtenu par introduction dans les cellules de l'animal à un stade de développement précoce embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules (stade blastocyte), d'une cassette de régulation de l'invention, dans des conditions permettant l'expression des propriétés fonctionnelles de ladite cassette de régulation. L'intégration dans des cellules de la cassette de régulation de l'invention est avantageusement réalisée dans les premiers stades de développement embryonnaire, et ce afin d'assurer chez l'animal développé la transformation de l'ensemble ou de la presque totalité de ces cellules, y compris de ses cellules germinales. Différentes techniques sont disponibles pour réaliser l'insertion d'une cassette de régulation selon l'invention au niveau des cellules d'un embryon animal. A cet égard, on fait notamment référence à la description donnée dans les exemples de la présente description ou à la publication de Brinster et al. (1985) ou encore au brevet européen N 0 419 621 (Institut Pasteur). Un animal intéressant dans le cadre de l'invention peut être l'animal résultant du développement de l'embryon que l'on a transformé pour y introduire la cassette de régulation d'intérêt. Il peut s'agir également d'un descendant d'un tel animal. Des animaux intéressants dans le cadre de l'invention sont, par exemple, des mammifères et en particulier des rongeurs tels que des souris ou des rats. On pourra également avoir recours à des animaux appartenant aux espèces bovines, ovines ou porcines. L'invention a pour objet également un procédé d'obtention d'un animal transgénique comprenant dans ses cellules somatiques et/ou dans ses cellules germinales une cassette de régulation selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'introduction d'une cassette de régulation ou d'un vecteur selon l'invention, dans les cellules de l'animal, à un stade précoce du développement embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules (stade blastocyte). Fait aussi partie de l'invention un animal transgénique tel qu'obtenu par introduction dans les cellules de l'animal à un stade de développement précoce embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules, une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention. L'invention concerne également un procédé d'utilisation d'une cassette de régulation selon l'invention, caractérisé en ce que : a) on insère facultativement ladite cassette de régulation dans un vecteur d'expression ; b) on introduit la cassette de régulation ou le vecteur recombinant obtenu à l'étape a) dans une cellule eucaryote, telle qu'une cellule embryonnaire ou encore une cellule musculaire de mammifère. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants : FIGURES Figure 1 (a) Structure du locus MLCIF/3F murin, montrant la structure exon-intron, les profils d'épissage de MLC1F (ligne ombrée) et MLC3F (ligne discontinue), ainsi que les positions respectives de la séquence activatrice intronique (boîte ombrée) et de la séquence activatrice 3' (boîte vide). (b) Constructions d'ADN contenant une séquence codant pour la protéine de fusion MLC3F-nlacZ contenant différentes associations entre la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3'. La séquence nlacZ est clonée en phase avec l'exon 2 spécifique de MLC3F (Kelly et al., 1995). (c) Valeurs de l'activité beta-galactosidase dans des cellules de myotube C2/7 (moyenne et écart-type) observées avec les constructions 3F-rrlacZ présentées figure 1 b après transfection transitoire. Les valeurs d'activité beta-galactosidase sont exprimées par rapport au niveau d'activité observée avec la construction 3F-nlacZ-9 (fixé arbitrairement à la valeur 100). Figure 2 (a) L'effet de synergie requiert des séquences du promoteur MLC3F. Valeurs d'activité beta-galactosidase dans des myotubes C2/7 transfectés avec des constructions MLC1F-rrlacZ. Les valeurs sont exprimées par rapport au niveau d'activité observée avec la construction 1 F-nlacZ-1.6 (arbitrairement fixé à la valeur 1). Les valeurs absolues d'activité beta-galactosidase des cultures de cellules transfectées avec les constructions 1F-nlacZ sont plus faibles que celles des cultures de cellules transfectées avec les constructions 3F-nlncZ représentées à la figure 1 (b) Activité de la séquence activatricc intronique et de la séquence activatrice 3' sur la transcription partir du promoteur hétérologue TK. Les valeurs d'activité CAT sont représentées par rapport à l'activité observée avec la construction TK-CAT (arbitrairement fixée à 1). Sont représentées les valeurs moyennes de plusieurs expériences ainsi que la valeur de l'écart-type. Figure 3 : Analyse quantitative de l'expression du transgène dans les tissus adultes des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9. (a) Les valeurs moyennes et l'écart-type (SEM) des valeurs d'activité betagalactosidase sont indiquées pour différents tissus adultes des lignées de souris transgéniques à E9-8 et E9-13. Les activités sont exprimées, en ordonnées, sur une échelle logarithmique des unités lumineuses relatives (rlu) par g d'extrait protéique purifié à partir du muscle squelettique (exlcensor digitorum fongus (EDL), soleus (SOL), masseter superficiel (MASS), rein (KID) et muscle venticulaire gauche cardiaque (LV). Au moins quatre adultes (2-6 mois) hétérozygotes ont été testés par lignée de souris transgénique. Les valeurs d'activités dans les muscles EDL et SOL ont été déterminées pour deux muscles pour chaque animal testé et sont représentées comme la moyenne +/l'écart-type (SEM) d'au moins huit muscles. Les valeurs de bruit de fond d'activité betagalactosidase dans les souris adultes non transgéniques sont indiquées par des lignes brisées et représentent les extrêmes supérieur et inférieur (pour KID et EDL, respectivement). (b) Analyse northern de l'accumulation des ARNm de MLC3F endogène et transgénique dans les muscles EDL de souris transgéniques de différentes lignées ayant reçu une construction contenant le promoteur MLC3F et respectivement : - la séquence activatrice 3' (2E) ; - la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' (E9) , - aucune des deux séquences activatrices. Piste 1 : lignée 1 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2E ; Piste 2 : lignée 2 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2E ; Piste 3 : lignée 8 de souris contenant la construction MLC3F-n/acZ-E9 ; Piste 4 : lignée 13 de souris contenant la construction MLC3F-ulacZ-E9 , Piste 5 lignée 5 de souris contenant la construction MLC3F-/;tocZ-2 ; Piste 6 : lignée 8 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2 ; Piste 7 : lignée 1 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2 ; Piste 8 : lignée de souris non transgénique témoin négatif; Piste 9 : acides nucléiques marqueurs. La sonde nucléique 5'UTR hybride de façon équivalente avec les transcrits MLC3F provenant du transgène (Tg) et avec les transcrits endogènes (endog). (c) Comparaison des valeurs d'activité beta-galactosidase dans différentes lignées de souris 3F-nlacZ, ces valeurs étant exprimées par nombre de copies du transgène dans les muscles EDL (C) ; et (d) dans les muscles cardiaques du ventricule gauche. Figure 4 : Analyse quantitative de l'expression du transgène dans les embryons à 12,5 jours (E12,5). (a) Les valeurs moyennes d'activité beta-galactosidase (+/- SEM) sont exprimées, en ordonnées, comme le nombre d'unités lumineuses relatives (rlu) par g d'extrait protéique des pattes antérieures (FL), des pattes postérieures (HL), du tronc sans tube neural (T) et des ventricules (H). Au moins 7 embryons provenant de deux génitrices différentes ont été testés, à l'exception des embryons de la lignée 8 3F-nlacZE9 et de la lignée 9-a 3F-nlacZ-E9 (analyse de 5 embryons provenant d'une génitrice unique pour ces lignées). Les valeurs de bruit de fond d'activité beta-galactosidase dans les embryons non transgéniques sont indiquées par des lignes brisées et représentent les extrêmes supérieur et inférieur (respectivement T et H). (b) Niveaux d'expression exprimés par nombre de copies du transgène, montrant que le niveau d'activité dans le muscle squelettique par nombre de copies du transgène est approximativement équivalent dans les embryons 3F-nlacZ-2E et 3F-nlacZ-E9. (c) Comparaison des activités du transgène dans les extraits protéiques obtenus à partir de pattes postérieures d'embryons à 12,5 jours (HL - E12,5) et de muscle EDL provenant de souris adulte. Figure 5 : Comparaison des séquences activatrices 3' de la souris, du rat et de l'homme. Les deux flèches en gras placées au-dessus de la séquence de souris désignent respectivement les extrémités 5' et 3' de la séquence activatrice 3' comprise dans les plasmides de l'invention. Les cadres délimitent des séquences qui sont la cible des facteurs de transcription spécifiques du muscle. La séquence du rat est décrite par Donoghue et al., 1988. La séquence de l'homme est décrite par Rosenthal et al., 1990. Figure 6 Carte de la construction de la cassette de régulation contenue dans le plasmide pMLC3F-rrlacZ-2IE, déposé à la CNCM le 13/02/1998, sous le numéro d'accès 1-1983. Matériels et Méthodes 1. Contruction des plasmidcs Les plasmides p3F-rrlacZ-2, p3F-rrlacZ-9, p3F-nlacZ-2I et p3F-/// Plasmide p3F-nlacZ-E9 : une séquence activatrice 3' de 260 paires de bases (Kelly et al., 1995) a été sous-clonée dans le plasmide p3F-tilac7.-9 préalablement partiellement digéré par l'enzyme BamHI, pour donner naissance au plasmide p3F- nlacZ-E9 contenant la séquence activatrice en position 3' à l'extrémité 5' de l'insert du plasmide p3F-nlacZ-9. Plasmide p3F-nlacZ-9E : la séquence activatrice 3' (Kelly et al., 1995) a été sous-clonée dans le plasmide p3F-nlacZ-9 linéarisé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ-9E, ce plasmide contenant la séquence activatrice en 3' localisée à l'extrémité 3' de l'insert du plasmide p3F-nlacZ-9. Plasmide p3F=nlacZ-5 : la séquence activatrice 3' (Kelly et al , 1995) a été sousclonée dans le plasmide p3F-nlacZ-5 linéarisé par l'enzyme BamHI pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ-5E, ce plasmide contenant les éléments régulateurs placés dans une orientation identique à celle qu'ils ont initialement dans le génome. Plasmides p3F-nlacZ-21 et p3F-iilacZ-21E : la séquence activatrice intronique de 800 paires de bases (contenue dans le plasmide p800, décrit par Kelly et al., 1997) a été placée en position 5' par rapport aux promoteurs MLCIF et MLC3F, dans des constructions contenant ou ne contenant pas la séquence activatrice 3' : - l'insert de 7 kb du plasmide p3F-nlacZ-2 a été isolé et sous-cloné dans le plasmide p800 clivé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ- 21; - l'insert de 7,3 kb du plasmide p3F-nlacZ-2E a été isolé et sous-cloné dans le plasmide p800 clivé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ- 2IE (Fig. 6). Plasmide plF-n/ocZ-1.6 : les oligonucléotides 1 et 2 contenant un site Hpal et le premier exon du gène MLC1F ont été annelés et introduits dans le plasmide pBluescript digéré par les enzymes BamHI et Ncol, pour donner naissance au plasmide pIFBN. Le plasmide pIFBN a été digéré par les enzymes Hpal et BamHI et fusionné au fragment BamHl-Hpal de 1,7 kb du plasmide pB3 contenant le promoteur et le premier exon du gène MLC 1 F (Daubas et al., 1988), pour donner naissance au plasmide p 1 FBN- 1.6 contenant le polynucléotide de 1,6 kb situé en amont du site de début de transcription du gène MLCIF. Le plasmide plFBN-1.6 a été digéré par l'enzyme KpnI et partiellement digéré par l'enzyme Ncol, puis fusionné à un fragment Ncol-Kpnl contenant la séquence tilacZ-SV40poly(A), afin de donner naissance au plasmide pl FnlacZ-1.6. Dans le plasmide p\V-n/acZ-\ .6, le codon ATG du gène nlacZ suit, en phase, la séquence codant pour les trois premiers acides aminés de MLC1F. - Oligonucléotide 1 : (5'-GATCCGATCCTTCTTTTGTTAACCCATCCTTTTAATCAAAATGGCACC-3') - Oligonucléotide 2 : (5'-CATGGGTGCCATTTTGATTAAAAGGATGGGTTAACAAAAGAAGGATCG-3') Plasmides plF-nlacZ-1.6I et pIF-nlacZ-1.6IE : la séquence activatrice 3' de 260 pb a été sous-clonée, dans la même orientation que dans la séquence génomique, dans le plasmide pIF-nlacZ-1.6 préalablement partiellement digéré par l'enzyme BamHI, pour donner naissance au plasmide pl F-nlacZ-1.6I. Le plasmide pl F-lIlacZ-I.6I a été soumis à une digestion par les enzymes SacII et HindIII, et le fragment de 2 kb résultant a été sous-cloné dans le plasmide pIF-nlacZ- 1.6E pour donner naissance au plasmide p 1 F-nlacZ-l .6IE. Plasmides pTK-CAT-IE, pTK-CAT-IrcvE et pTK-CAT-E : la construction des plasmides pTK-CAT-I et pTK-CAT-Irev a été décite par Kelly et al. (1997). Un fragment de 260 pb contenant la séquence activatrice 3' a été sous-cloné au niveau du site Kpnl localisé en 3' par rapport à la séquence poly(A) de SV40, pour donner respectivement naissance aux plasmides pTK-CAT-IE, pTK-CAT-IrevE et pTK-CAT-E, dans lesquels la séquence activatrice 3' se retrouve dans la même orientation, par raport au promoteur, que dans la séquence génomique. 2. Cultures cellulaires et transfections Des cellules de la lignée C2/7 ont été cultivées et transfectées au stade myoblaste, comme décrit par Kelly et al. (1995). Les myoblastes ont été récupérés 24 heures après l'étape de transfection et les myotubes 2 à 3 jours après incubation des cellules dans le mlieu de culture de différentiation (2 % de sérum de veau foetal). Les cellules de la lignée de fibroblastes NIH 3T3 ont été cultivées dans du milieu de culture DMEM en présence de 7 % de sérum de veau foetal et transfectées selon le même mode opératoire que les cellules C2/7, mais à un degré de confluence élevé (approximativement 75 % de confluence). Les tests de détection de l'activité beta-galactosidase ont été réalisés comme décrit dans l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou en utilisant le test de marquage fluorescent Galactolight (Tropix, Bcdford, Massachusctts) scion les indications du fabricant (Jain et Magrath, 1991), à partir de 0,2 à 7 % d'un extrait cellulaire préparé à partir d'une boîte de culture de 6 cm de diamètre. Les tests de détection de l'activité CAT ont été réalisés sur 0,2 à 5 % d'extraits cellulaires (Biben et al., 1994). Les valeurs d'activités beta-galactosidase et CAT ont été normalisées, pour la détermination de l'efficacité de transfection, en évaluant l'activité luciférase à partir d'un vecteur RSV-luciférase co-transfecté (à partir de 10 à 20 % d'extrait cellulaire). Les valeurs représentées correspondent à la moyenne accompagnée de l'écart-type ( standard error of the mean ou SEM) d'au moins quatre expériences réalisées avec plus d'une préparation de plasmide de chacune des constructions. Le test de Student a été utilisé afin de déterminer si les différences entre les différentes valeurs moyennes sont significatives. 3. Obtention des souris transgéniques Les souris transgéniques 3F-nlacZ-2E et 3F-n/acZ-9 ont été décrites par Kelly et al. (1995, 1997). L'insert du plasmide p3F-nlacZ-E9 a été excisé en tant que fragment SacII-SmaI et purifié par électrophorèse sur gel puis passage sur une colonne de chromatographie ElutipTM (Schleicher et Schuell), avant micro-injection. Les souris transgéniques ont été obtenues par micro-injection des fragments d'ADN purifiés, à une concentration de 700 à 1 000 copies de plasmide par pl, dans des oeufs fertilisés de souris de la génération F2 issues d'un croisement C57BL/6J x SJL, selon les techniques conventionnelles (Hogan et al., 1994). Les oeufs injectés ont été réimplantés dans des femelles dans des mères adoptives pseudo-gestantes (C57BL/6 x CBA) de génération FI. 4. Identification et analyse des souris transgéniques Les souris transgéniques ont été identifiées et analysées comme décrit par Kelly et al. (1995 et 1997). Le nombre de copies du transgène a été déterminé à l'aide d'un PhosphorimagerTM (Molecular Dynamics). Deux lignées indépendantes de souris 3F- nlacZ-E9 (E9-8 et E9-13) ont été obtenues ; ces deux lignées de souris hemizygotes ont des nombres de copies du transgène respectivement de 2 et 1 copies. L'activité beta-galactosidase dans les souris transgéniques a été quantifiée selon la technique décrite par Kelly et al. (1997), à l'aide d'un test chimiluminescent (Galactolight, Tropix). L'activité beta-galactosidase est exprimée en unités lumineuses relatives ( relative light units ou rlu) / 60 min/ug d'extrait. Des témoins de contrôle de concentrations de beta-galactosidase purifiée (714 U/mg, Sigma) ont été systématiquement inclus dans les tests afin d'évaluer la linéarité et la reproductibilité de ces derniers. En vue d'obtenir les extraits d'embryons de souris au stade E 12.5, les régions embryonnaires ont été disséquées dans un volume de 100 l de milieu TGD (Biben et al., 1994) désagrégées par pipetage répété à l'aide d'un embout de pipette de 200 l, puis lysées par trois cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été centrifugés à 1 500 t/min pendant 5 min et le surnageant a été traité selon la même méthode que pour les tissus adultes. L'ARN EDL total a été isolé selon la technique décrite par Chomezynski et Sacchi (1987). Une quantité de 10 g d'ARN EDL total a été analysé par analyse northern blot, comme décrit par Mason et al. (1993), en utilisant une sonde oligonucléotidique de la région 5' UTR du gène MLC3F de souris ; les filtres ont été analysés à l'aide d'un appareil Phosphorimager#. Exemples Exemple 1 : Démonstration que la séquence activatricc intronique et la séquence activatrice 3' agissent de manière synergique importante dans le muscle squelettique de la souris transgénique adulte. Les rôles individuels des séquences activatrice 3' et intronique sur la transcription du promoteur MLC3F ont été étudiés chez les souris transgéniques (Kelly et al , 1995 ; McGrew et al., 1996 ; Kelly et al., 1997). En vue de rechercher les interactions entre les deux séquences activatrices in vivo, deux lignées de souris transgéniques ont été réalisées, contenant les deux séquences activatrices (construction 3F-nlacZ-E9). Deux aspects de l'activité du transgène ont été recherchés : (i) le profil d'expression temporel et spatial de l'activité du transgène a été suivi durant le développement embryonaire et foetal, et (ii) les niveaux d'activité du gène rapporteur ont été quantifiés dans différents tissus adultes en utilisant un test chimioluminescent d'activité beta-galactosidase. Dans les souris transgéniques 3F-nlacZ-E9, comme dans les souris contenant chacune des séquences activatrices seules (constructions 3F-nlacZ-2E et 3F-rrlacZ-9), de hauts niveaux d'expression du transgène sont observés dans les muscles striés squelettiques (EDL et masseter) et cardiaque (ventricule gauche), et un niveau identique au niveau basal dans les reins (Fig. 3a). L'activité du transgène dans le muscle squelettique des souris transgéniques ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 est extrêmement forte, équivalente à 1,5 - 2 x 10-3 unités d'activités enzymatiques (ou 2- 3 ng de protéine beta-galactosidase à 714 U/mg de la société Sigma) par microgramme d'extrait total. Le niveau d'activité beta-galactosidasc, exprimée par nombre de copies du transgène, est au moins 10 fois plus grand que dans les souris transgéniques ayant reçu l'une quelconque parmi les constructions 3F-II/acZ-2 ou 3F-ulacZ-9 (Fig 3c). Les éléments activateurs 3' et intronique ont donc un effet synergique et induisent un niveau de transcription maximal à partir du promoteur MLC3F dans le muscle squelettique adulte. Le niveau des transcrits dans le muscle EDL adulte a été déterminé par analyse northern blot en utilisant une sonde 5'UTR commune aux transcrits endogènes et du transgène : le niveau de l'ARNm du transgène dans les deux lignées de souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (contenant respectivement une et deux copies du transgène) est comparable, exprimé par nombre de copies du transgène, au niveau des transcrits MLC3F endogènes (Fig. 3b). Une analyse à l'aide d'un appareil Phosphorimager a révélé que la quantité d'ARNm originaire du transgène présent dans les muscles EDL des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (exprimée par copie du transgène) est en fait le double de la quantité d'ARNm MLC3F endogène (exprimée par allèle), comparée à l/8ème de la quantité d'ARNm endogène dans les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2e - lignée 1 (qui contient approximativement 7 copies du transgène ; résultats non représentés). Ces résultats suggèrent que l'association des deux éléments régulateurs inclus dans la construction du transgène comprend tous les éléments nécessaires pour l'expression du promoteur MLC3F endogène dans le muscle squelettique. En revanche, dans le muscle strié cardiaque, la présence des deux séquences activatrices n'induit pas l'augmentation de l'expression du gène rapporteur au-delà du niveau observé chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2, c'est-à-dire contenant le promoteur MLC2F seul (Fig. 3d). Ce dernier résultat confirme que l'effet synergique induit par les deux séquences activatrices, en plus de leur effet activateur de base, est spécifique du muscle squelettique. D'autres caractéristiques de l'expression du transgène 3F-nlacZ-E9 sont communes avec l'expression des transgènes 3F-filacZ-2E et 3F-ulacZ-9 : la comparaison de l'activité du transgène dans les muscles contenant des fibres rapides de type IIB (EDL) et de type IIA ou des fibres lentes de type I (soleus) démontre que les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 conserve un profil d'expression du transgène spécifique des fibres rapides. Exempte 2 : Expression de la synergie dans l'embryon et citez l'adulte Dans le muscle squelettique adulte, l'activité de la séquence activatrice intronique et de la séquence activatrice 3' est tout à fait comparable. A titre d'exemple, ces deux séquences induisent un haut niveau d'expression spécifique du muscle d'un gène rapporteur, et confèrent un profil d'expression ciblé sur les fibres musculaires rapides (Kelly et al., 1997). La différence principale observée dans l'expression du gène rapporteur entre les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-9 et les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E réside dans leur réponse au programme de développement myogénique squelettique embryonnaire. Les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ- 2E ont une expression activée de nlacZ dans l'embryon à 9 jours (E9), alors que les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-9 ne présentent pas d'activation de l'expression du transgène dans le muscle squelettique avant le jour 13,5 (E13,5). Les souris transgéniques contenant les deux séquences activatrices ont une expression du gène rapporteur activée dès les embryons à 9 jours (E9), ce qui suggère que la séquence activatrice 3' constitue un élément d'activation dominant régulant l'expression génique dans le muscle squelettique embryonnaire. De plus, aux stades précédant la régulation positive de la transcription du gène MLC3F endogène pendant le développement foetal, on observe un faible niveau de transcription à partir de ce promoteur dès les embryons à 9 jours (E9). Les inventeurs ont cherché à déterminer si l'effet de synergie entre la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' avait lieu, dans le muscle de l'embryon, avant l'activation des transgènes ne contenant que la séquence activatrice intronique. Dans ce but, l'expression de l'activité beta-galactosidase a été quantifiée dans des extraits de pattes antérieures, de pattes postérieures, de la région du tronc (en excluant les structures axiales) et du coeur d'embryons à 12,5 jours (El 2,5 - Fig 4a). Dans le muscle squelettique des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9, les valeurs d'activité beta-galactosidase, exprimées par nombre de copies du transgène, sont approximativement de 1,5 fois les valeurs retrouvées dans les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E, alors que le transgène n'est pas activé à ce stade dans le muscle squelettique des souris contenant la construction 3F-nlacZ-9 (Fig 4b). Au jour 12,5, les deux séquences activatrices n'agissent donc pas de manière synergique au niveau du muscle squelettique. Les valeurs d'activité beta-galactosidase, exprimées par nombre de copies du transgène, dans le muscle EDL adulte sont comparées sur la figure 4c avec les valeurs d'activité retrouvées dans les pattes postérieures de l'embryon. L'augmentation de l'expression du transgène de la construction 3F-nlacZ-2E entre les différents temps pourraient refléter à la fois une régulation positive de l'activité du transgène et le fait que le muscle squelettique différencie comprend seulement une souspopulation de cellules de patte postérieure à 12,5 jours, comparé avec une représentation de presque toutes les cellules dans le muscle EDL adulte. Il y a cependant un rapport d'expression du transgène 10 fois plus grand chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (rapport approximatif EDL/E12,5 de 100), comparé au rapport observé chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E (rapport approximatif EDITE 12,de 10). Ce rapport d'expression dans la patte postérieure entre le muscle EDL adulte et l'embryon à 12,5 jours est indépendant du nombre de copies du transgène. Les résultats des inventeurs obtenus avec les souris transgéniques démontrent que la différence entre l'activité beta-galactosidase de la patte postérieure embryonnaire et adulte est 10 fois plus grande lorsque les deux séquences activatrices sont présentes que lorsque seule la séquence activatrice 3' est présente dans le transgène, ce qui suggère que l'augmentation substantielle du niveau de transcription de MLC3F endogène est le résultat d'une activation tardive de la séquence activatrice intronique à El 3,5. Exemple 3 : Evaluation de l'action synergique in vitro de la séquence activatrice intronique et de la séquence activatrice 3' sur la transcription à partir du promoteur MLC3F. Il a été montré que le haut niveau de transcription du gène MLC 1 F/3F à partir du promoteur MLC3F est dépendant indifféremment de l'une quelconque des deux séquences activatrices situées respectivement 4,2 kb en amont et 15kb en aval du site de début de transcription du promoteur MLC3F (Kelly et al., 1995 ; McGrew et al., 1996 ; Kelly et al., 1997). L'addition d'une séquence activatrice 3' de 260 pb ou d'une séquence activatrice intronique de 800 pb accroît le niveau de transcription d'une région de 4 kb contenant deux segments de 2 kb situés respectivemnt du côté 5' et du côté 3' du site de début de transcription du gène MLC3F dans les myotubes différenciés ; dans les myoblastes, ces constructions ont des niveaux d'activités faibles (Kelly et al., 1997). L'activité du promoteur MLC3F dans des constructions plasmidiques contenant les deux séquences activatrices a été évaluée. En présence de la séquence activatrice 3', le promoteur MLC3F de 2 kb (construction 3F-nlacZ-2E) a approximativement 2-3 fois l'activité d'une construction contenant le premier intron MLC1F/3F (construction 3F-nlacZ-9 ; Fig. 1b) Cependant, dans les constructions contenant les deux séquences activatrices, dans lesquelles la séquence activatrice 3' de 260 pb est présente indifféremment du côté 5' ou du côté 3' de l'insert 3F-nlacZ-9 (constructions 3F- /acZ-C9 et 3f-nlacZ-9C), un accroissement de 7 fois de l'activité est observé, par rapport à l'activité des myotubcs C2/7 transfectés par 3P- lacZ-9 (Fig. 1b). Ce niveau d'activité est 2 fois supérieur à celui observé avec une construction contenant le promoteur MLC3F en présence de la séquence activatrice 3' seule, indiquant que même en culture la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' agissent de manière synergique pour augmenter la transcription du gène MLC3F ; effet beaucoup plus important in vivo. Afin de délimiter les séquences du premier intron responsables de l'effet synergique observé, la séquence activatrice 3' a été placée du côté 3' dans des constructions contenant également la séquence activatrice intronique dans la position qu'elle occuppe initialement dans le génome par rapport au promoteur MLC3F (construction 3F-nlacZ-5E), ou juxtaposée au promoteur MLC3F de 2 kb (construction 3F-nlacZ-2IE). L'augmentation synergique a été observée dans les deux cas (Fig. 1 b), démontrant que l'effet observé en présence de la séquence activatrice 3' est médié par la séquence activatrice intronique de 800 pb au sein du premier intron. De plus, l'effet synergique observé est indépendant de la distance entre les deux séquences activatrices puisque l'effet de synergie est observé indifféremment avec la séquence activatrice intronique localisée à-4,2 kb ou à-2 kb du site de début de transcription de MLC3F. La synergie d'activité en présence des deux séquences activatrices n'est pas observée dans les myoblastes C2/7 ou dans la lignée de fibroblastes NIH 3T3, dans lesquels une construction contenant les deux séquences activatrices (construction 3F- nlacZ-2IE) est active seulement à des niveaux faibles, comparables aux niveaux d'activités du promoteur MLC3F seul (construction 3F-nlacZ-2 ; données non représentées). Une activité maximale du promoteur MLC3F dans des cellules en culture nécessite donc une interaction synergique spécifique des myotubes entre la séquence activatrice 3' et la séquence activatrice intronique. La séquence activatrice intronique étant équidistante des promoteurs MLC1F et MLC3F (Fig. la), l'activité de la séquence activatrice intronique sur le promoteur amont MLC1F a-t-elle été recherchée. La séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' activent toutes les deux une construction promoteur MLC1F-nlacZ de 1,6 kb, spécifiquement dans les myotubes (Fig. 2a). L'activité de la séquence activatrice 3' (construction IF-tilacZ-1.6E) est approximativement de 3 fois supérieure à celle de la séquence activatrice intronique de 800 pb (construction \T-nlacZ-\.6\), bien que l'activité absolue du gène marqueur, par rapport à RSV/acZ soit inférieure que celle observée avec le promoteur MLC3F. Même lorsque les séquences activatrice 3' et intronique sont présentes toutes les deux (construction lF-///acZ-I.6EI), l'effet synergique sur le promoteur MLC3F n'est pas observé. La séquence activatrice intronique de 800 pb a également été testée pour son activité sur la transcription d'un promoteur hétérologue, le promoteur de la thymidine kinase (TK) de HSV (virus de l'Herpès simplex), placé en amont du gène rapporteur CAT (Chloramphénicol acétyl transférase). La séquence activatrice intronique (I-TKCAT) augmente l'activité CAT approximativement de 10 fois par rapport à la construction TK-CAT. La séquence activatrice 3' (TK-CAT-E) augmente l'activité CAT approximativement de 90 à 100 fois par rapport à la construction TK-CAT (Fig. 2b ; Kelly et al., 1997). Lorsque les deux séquences activatrices sont présentes, une augmentation de l'activité CAT de l'ordre de 50 à 60 fois est observée, suggérant que les deux séquences activatrices n'agissent pas de manière synergique sur le promoteur TK. En conclusion, alors que la séquence activatrice intronique de 800 pb est capable d'augmenter la transcription spécifique du muscle des promoteurs MLC3F, MLCIF et TK, cette séquence induit un effet synergique, en combinaison avec la séquence activatrice 3' seulement sur le promoteur MLC3F, suggérant que l'effet synergique entre les deux séquences activatrices du muscle nécessite des séquences agissant en cis contenues dans la région promotrice MLC3F de 2 kb. Références Arnonc, M I., and Davidson, E. H., 1997. The hardwiring of dcvclopmcnt. organisation and function ofgcnornic rcgulatory systcms. Dcvclopmcnl 124.1851-1864. Barton P.J.R. et al , 1989. Myosin light chain gène expression in dcvcloping and denervated foetal muscle in the mouse. Development, 107 : 819-824. Barton, P. J., Harris, A. J., and Buckingham, M. E., 1989. Myosin light chain gène expression in developing and denervated fetal muscle in the mouse. Development 107: 819-824. Beard et al., 1980, Virology, 75 : 81. 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LISTE DE SEQUENCES INSTITUT PASTEUR CASSETTE DE REGULATION DE L'EXPRESSION D'UN ACIDE NUCLEIQUE HETEROLOGUE DANS UNE CELLULE EUCARYOTE, EN PARTICULIER MUSCULAIRE D18141 4 Patentln Vers. 2.0 1 798 ADN Souris 1 gatcttaggg aagaaataaa aacgtatttc cctatgggtc agcatcagta atgtcttttg 60 tctgttacat tgtctatact gtgggagaac acagcagctg aaatggaatg gagaaacgtt 120 gaggggtaaa ggctggaact ctccccatag cgacattttg aagtgtatat aactgaacaa 180 gggtctttgc aaagtatcac acagtttgca aagaaagaca cgcctttacc gactaaaatg 240 tgaaaactgc ttttcatcta aagataatta aatctgtgcc agacgaggag accataaagt 300 gacagggctg gatttagccc ttgacctttc agttctgcaa atgaaacccc tggcaagttg 360 tctgtagaag tcattccata attgcccagc cttaagcacc acctgacggg tgggaattgt 420 gggaagggtt atatttagtc tgctgagact gcacattctt ctcttccaac tgagcggcct 480 tttgtatgaa gataggatgt cacctacttt actccttcat caatgctacc acttctgttt 540 tctcgcccaa ccagaatccc gacaacaaaa cccgctgtat aaaagtatca gtggcttcag 600 aatatgctag ttaaatttta aatcatgtgg gtgataagtc catttgttct agtcagaaac 660 taataatagt gacttgaagc 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gtcagtttcc ttgcttgcta agaatttcag 1320 aaataaaata tacaatagtc agtctctgta aagaaaatgg gagagaaggt tgtcctcaaa 1380 caaatgctag gagcgaaggg ggggagatag aaagggaggc gccaaaccat tctcactttt 1440 tttaagctta gattataccc ctgctaatac tgattataaa gactattctt taatggcgat 1500 ttgggaacct gatcaggttg ccatgtgggt gtatcctaag aaatacccag agcactcaat 1560 gccttttcaa gacctcagaa ctttaccata aggggccaag aattggagag tgttctttct 1620 ataacagtta ctatttcaaa cttcaaccca gtcgcatcca tgaagttcca ttaataccca 1680 gtcttgctga ctagacactt gcaaggtcca taattatata tcagaagccc gagccctaga 1740 tgaccccaag ttttccacga gcaaagaaat gtcttaagga ggacagttgc agggaacatc 1800 tcagagataa agaccataaa agtactgaca ggcttcagtc tcaccagggc tgttcacgtc 1860 tagatgctgg tttcctaaaa atagccccag ggtacatgtc tctctttccc tttgccctaa 1920 gaaagctaaa gaactcctcc aggaggagtg gcaactgccc tgtgaaatct gatgctagat 1980 atgaggtcag tttgcccaga aataaaagga agccagagag aggttaagac tccactcagg 2040 gattggagct gccttcagtt tatcctccag ctccactgct gtttcgcagc ctagaactcc 2100 atcatggtgg gtcctacaag acaacgacga 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gcctatgcca tgcctgaact cagaataagt 3000 gggctgactc ctggagctta ttctgaagag aactcgagga atgagctgga cgtgctcata 3060 aatcaggaca cttgtttctg gttaaaatat tctttatgat taatttcttt ccaacagatc 3120 gagttctcta aggagcaaca ggagggtaag tttaaaagct gtagccattc atatgtgcgg 3180 actcagaggt gacaagtgag aaaaccaagt cccttgggat gagctaagtg ctgtctaatt 3240 atccacactg gtgctgctac cctaaatata aattgctttc aatcactcta aatataaacc 3300 tgcataactg aagcccttgg ttagagtcag taatcaaagc tttaaggaaa ttaaaattag 3360 agctttaata agtccttata gccactgatt tccaaataag atg 3403 4 1960 ADN Souris 4 aagcttagat tatacccctg ctaatactga ttataaagac tattctttaa tggcgatttg 60 ggaacctgat caggttgcca tgtgggtgta tcctaagaaa tacccagagc actcaatgcc 120 ttttcaagac ctcagaactt taccataagg ggccaagaat tggagagtgt tctttctata 180 acagttacta tttcaaactt caacccagtc gcatccatga agttccatta atacccagtc 240 ttgctgacta gacacttgca aggtccataa ttatatatca gaagcccgag ccctagatga 300 ccccaagttt tccacgagca aagaaatgtc ttaaggagga cagttgcagg gaacatctca 360 gagataaaga ccataaaagt actgacaggc ttcagtctca 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attttatgct 1260 cctaggttct aaaatttccc tcgacaccac ctcttcctgt gccattgtac ctacctggtt 1320 ccctaaaggc ctcagagcaa agagcactct ttctgtcaat gcattttgaa agtcctctct 1380 ttctctctct ctcttgccac cacagtcctt cagtgctgac cagattgccg gtaagtgact 1440 gagcagctct accctaggaa gagctctgtc tgtctttgag atttccctaa ctccacagca 1500 tgttcctttg tgactcagac tgttcgtgcc tatgccatgc ctgaactcag aataagtggg 1560 ctgactcctg gagcttattc tgaagagaac tcgaggaatg agctggacgt gctcataaat 1620 caggacactt gtttctggtt aaaatattct ttatgattaa tttctttcca acagatcgag 1680 ttctctaagg agcaacagga gggtaagttt aaaagctgta gccattcata tgtgcggact 1740 cagaggtgac aagtgagaaa accaagtccc ttgggatgag ctaagtgctg tctaattatc 1800 cacactggtg ctgctaccct aaatataaat tgctttcaat cactctaaat ataaacctgc 1860 ataactgaag cccttggtta gagtcagtaa tcaaagcttt aaggaaatta aaattagagc 1920 tttaataagt ccttatagcc actgatttcc aaataagatg 1960 REVENDICATIONS 1. Cassette de régulation de l'expression d'un acide nucléique hétérologuc dans une cellule eucaryote, caractérisée en ce que ladite cassette comprend : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides ; b) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 2, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides. 2. Cassette selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide comprenant tout ou une partie du promoteur MLC3F, ledit polynucléotide constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2. 3. Cassette selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polynucléotide comprenant une partie du promoteur MLC3F est choisi dans le groupe d'acides nucléiques constitué de : a) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 3 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 3, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2, ou de b) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 4, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2. 4. Cassette selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide à fonction de promoteur, distinct du promoteur MLC3F. 5. Cassette selon l'une quelconque des revendications 1à 4, caractérisée en ce qu'elle contient un acide nucléique hétérologue d'intérêt choisi dans le groupe constitué de : a) un acide nucléique hétérologuc codant pour un polypeptide hétérologue b) un acide nucléique hétérologue codant pour un ARN sens ou antiscns. 6. Cassette selon la revendication 5, caractérisée en ce que le polynucléotide à fonction de promoteur est placé en amont de l'acide nucléique hétérologue d'intérêt. 7. Cassette selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide comprenant tout ou une partie du promoteur MLC3F. 8. Cassette selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide à fonction de promoteur et de la partie du promoteur MLC3F. 9. Cassette selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 2 est placé indifféremment en amont ou en aval de l'acide nucléique hétérologue d'intérêt. 10. Vecteur d'expression recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de régulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 11. Vecteur d'expression selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué des vecteurs suivants : - pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, pCDNA3 ; - un vecteur adénoviral ; - un vecteur d'adénovirus associé ; - un vecteur pseudo-adénoviral ; - un vecteur rétroviral. 12. Vecteur d'expression selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pMLC3F-nlacZ-2IE, contenu dans la souche de E coli déposée le 13/02/1998 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le N I-1983. 13. Hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il contient une cassette d'expression selon l'une des revendications1à 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12. 14. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les hôtes cellulaires suivants : a) une cellule musculaire en culture primaire ; b) une lignée cellulaire d'origine musculaire. 15. Hôte cellulaire recombinant selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il s'agit de la souche recombinante de E. coli contenant le plasmide pMLC3F-nlacZ-2IE déposée le 13/02/1998 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le N 1-1983. 16. Composition caractérisée en ce qu'elle contient une cassette selon l'une des revendications 1 à 9, un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12 ou un hôte cellulaire selon l'une des revendications 13 à 15. 17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une cassette selon l'une des revendications 1à 9, d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12 ou d'un hôte cellulaire selon l'une des revendications 13 à 15, ainsi qu'un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement compatibles. 18. Utilisation d'une cassette selon l'une des revendications 1 à 9, d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12 ou d'un hôte cellulaire selon l'une des revendications 13 à 15 pour la fabrication d'un médicament. 19. Animal transgénique caractérisé en ce que ses cellules somatiques et/ou ses cellules germinales comprennent une cassette selon l'une des revendications1à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12. 20. Animal transgénique selon la revendication 19 tel qu'obtenu par introduction dans les cellules de l'animal à un stade de développement précoce embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules, une cassette selon l'une des revendications 1 à 9 ou un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12. 21. Animal transgénique caractérisé en ce qu'il s'agit d'un descendant d'un animal transgénique selon la revendication 19 ou la revendication 20. 22. Animal transgénique selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère. 23. Procédé d'obtention d'un animal transgénique comprenant dans ses cellules somatiques et/ou dans ses cellules germinales une cassette de régulation selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'introduction d'une cassette selon l'une des revendications 1à 9 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12, dans les cellules de l'animal, à un stade précoce du développement embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules. 24. Procédé de production d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformation d'un hôte cellulaire par un vecteur d'expression recombinant selon l'une des revendications 10 à 12 ; b) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à l'étape b) ; c) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucléotide porté par le vecteur recombinant. 25. Polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu 'il est obtenu selon le procédé de la revendication 24. 26. Procédé d'utilisation d'une cassette de régulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 pour la préparation de médicament ou pour l'obtention d'animaux transgéniques, caractérisé en ce que : a) on insère facultativement ladite cassette de régulation dans un vecteur d'expression ; b) on introduit la cassette de régulation ou le vecteur recombinant obtenu à l'étape a) dans une cellule eucaryote, telle qu'une cellule embryonnaire ou encore une cellule musculaire de mammifère.