Brevet FR2790957A1 — publié le 20000922

La présente invention concerne la détermination, la détection et la quantification dans un échantillon biologique, de protéines associés à un cancer mammaire. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'une protéine constituant un marqueur ou d'un anticorps spécifique de la dite protéine pour obtenir une composition diagnostique, destinée à détecter un état pathologique associé à une maladie telle que précédemment citée. L'invention concerne également des méthodes et des préparations de kits ou trousses ou compositions de diagnostique pour la détection de cancer mammaire, incluant comme marqueurs cellulaires des protéines indiquant la probabilité de la présence de cancer mammaire. Par "échantillon biologique" on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement. Le cancer mammaire est une cause de mortalité majeure chez la femme. Alors que la pathogénèse du cancer mammaire est mal définie, la transformation de l'épithélium de la glande mammaire normale vers un phénotype malin peut être le résultat de facteurs génétiques, spécialement chez les femmes de plus de 30 ans (Miki, et ai., Science 1994, 266, 66-71). Toutefois, il existe entre autre, des facteurs non- génétiques qui ont également un effet significatif sur le développement de la maladie. En dépit de ses origines, la mortalité due au cancer mammaire augmente significativement s'il n'est pas détecté suffisamment tôt dans son développement. Aussi, un effort considérable a été fait pour déterminer les événements cellulaires précoces entourant la transformation dans le tissu mammaire. De tels efforts ont conduit à l'identification de plusieurs marqueurs potentiels de cancer mammaire. Par exemple, les allèles des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été liés à l'hérédité et au cancer mammaire (Wooster et ai., Science 1994, 265, 2088- 2090). Le type sauvage de l'allèle BRCA1 code pour une protéine suppressive de tumeur. Les délétions et/ou d'autres altérations de cet allèle ont été reliées à la transformation de l'épithélium mammaire. En conséquence, la détection d'allèles mutés BRCA1 ou leurs produits génétiques ont été proposés comme moyens de détection de cancers mammaires. Toutefois, l'utilisation de BRCA1 est limitée comme marqueur de cancer car les mutations BRCA1 ne prennent pas en compte la majorité des cancers mammaires (Ford et ai., British J. Cancer, 1995, 72, 805-812). De nombreux autres gènes ont été reliés au cancer mammaire et peuvent servir comme marqueurs de la maladie, directement ou via leurs produits génétiques. De tels marqueurs potentiels inclus le gène TP53 et son produit génétique, la protéine suppressive de tumeur ou p53 (Malkin, et aL., Science 1990, 250, 1233-1238). La perte de l'hétérozygotie de tels gènes comme le gène ataxia telangiectasia a également été liée à un risque élevé de développement de cancer mammaire (Swift, et al, N. Engl. J. Med. 1991, 325, 1831-1836). Un problème associé à de nombreux marqueurs proposé à ce jour est que le phénotype oncogénique est souvent le résultat d'une délétion génétique, donc nécessitant la détection de l'absence de la forme de type sauvage comme prédicteur de la transformation. Ainsi, un des avantages selon la présente invention, est d'utiliser de nouveaux marqueurs constitués par une protéine comme marqueur immunohistochimique. Les protéines ou marqueurs immunohistochimiques utilisés selon l'invention sont respectivement le récepteur sigma 1 (SRBP) et la stérol isomérase humaine (HSI). Ces deux marqueurs sont liés à la prolifération cellulaire. Les structures des protéines sont décrites dans Jbilo O. et ai., Journal of Biological Chemistry, 1997, 272, 27107- 27115 et Hanner M. et ai., Journal of Biological Chemistry; 1995, 270(13), 7551-7557. Selon la présente invention, la répartition de ces deux marqueurs a été étudiée et corrélée avec une série de facteurs anatomocliniques et immunocytochimiques, prédictifs de la réponse au traitement. Les facteurs prédictifs sont d'une importance cruciale pour caractériser d'une part les patientes atteintes d'un cancer mammaire avec des risques plus ou moins élevés de rechute et d'autre part des patientes qui ne peuvent bénéficier d'un traitement auxiliaire. Le statut des ganglions lymphatiques est l'un des meilleurs facteurs prédictifs utilisable (Hawkins et al., Br. J. Cancer 1996, 74, 1469-1478); (Mink etal., Eur. J. Gynaec. Oncol. 1994, 6, 424-436), et le statut des récepteurs aux oestrogènes (RE) et des récepteurs à la progestérone (RP) des tumeurs primaires du sein ont une forte corrélation avec la réponse thérapeutique à un traitement hormonal (Robertson et al., Br. J. Cancer 1996, 73, 5-12; Br. J. Cancer 1996, 73,1545-1551). L'expression immunohistochimique de ces deux marqueurs dans la tumeur primitive du sein a été étudiée, selon l'invention, chez les patientes en pré et post ménopause. Ces expressions ont été corrélées avec des facteurs bien établis, comme les critères classiques histopathologiques (grade, taille tumorale, statut ganglionnaire), et les marqueurs immunohistochimiques de prolifération cellulaire (Ki67: Mibl), d'apoptose (au moyen du proto-oncogène Bc12 dont la surexpression correspond à la présence des récepteurs aux oestrogènes et souvent avec un pronostique favorable). L'étude qui a été réalisée dans le cadre de la présente invention a permis d'examiner les facteurs anatomopathologiques chez les patientes ayant un cancer mammaire opérable, leur fraction proliférante, et l'expression de la protéine Bcl-2. Ces résultats ont été comparés avec la présence ou non des deux nouveaux marqueurs récemment identifiés, la protéine SRBP et la protéine HSI. Leur expression par immunohistochimie a été étudiée dans les carcinomes mammaires humains opérables, leur impact dans l'issue de la maladie et leur éventuelle modulation de la réponse au traitement hormonal. Les études ont montré que parmi les paramètres cliniques et morphologiques examinés (âge, état hormonal, grade selon Scarff, Bloom et Richardson ou SBR, taille tumorale et statut ganglionnaire) par des analyses statistiques multivariables, seul le grade SBR a été corrélé avec la survie en l'absence de maladie ou "disease free survival" (DFS) dans toute la population analysée (n=95). Toutefois dans le sous-groupe de patientes ayant un traitement hormonal adjuvant (n=58), deux autres facteurs: âge et statut ménopausal sont également liés de façon significative à la survie en l'absence de maladie. Le grade histopathologique de la tumeur dans les carcinomes mammaires reste un facteur pronostique indépendant. L'état des récepteurs aux oestrogènes (RE) et à la progestérone (RP), est avec l'âge et le statut ménopausal, des facteurs indicatifs qui ont permis, selon la présente étude, de déterminer l'intérêt d'un traitement hormonal adjuvant. Le statut de RP et de RE a été étudié chez les patientes et comparé avec les facteurs prédictifs bien établis, comme la taille de la tumeur, le statut ganglionnaire et la présence de métastases et le grade histologique. L'intérêt majeur de ces études réside dans l'établissement de protocoles pour les sous-groupes de patientes atteintes de carcinomes mammaires. Les récepteurs hormonaux RE et RP sont à l'heure actuelle les paramètres biologiques essentiels dans ce choix. Les résultats de l'étude ont montré une corrélation significative entre l'expression de la protéine SRBP et de RP. L'expression de la protéine SRBP est observée essentiellement avec des tumeurs RP positives, alors que l'expression de la protéine HSI a une relation statistiquement significative inverse avec RE. Il existe également une corrélation entre l'expression de la protéine Bcl-2 et l'expression de la protéine SRBP et une corrélation inverse avec l'expression de la protéine HSI. Une corrélation significativement élevée a été observée entre la présence ou pas de la protéine Bcl-2 et l'expression des récepteurs hormonaux. La surexpression de Bc12 est observée quand RE et/ou RP sont positifs. Il a été constaté selon l'invention, que ces interactions entre états des récepteurs, protéine Bcl-2 et les protéines SRBP et HSI peuvent suggérer une liaison possible entre ces protéines. Les résultats de l'étude décrite confirment ces données, et pourraient mener, en fonction de l'expression de la protéine SRBP, comparativement à l'état du RP, au choix de patientes qui pourraient bénéficier d'un traitement hormonal adjuvant. L'influence de l'expression de la protéine SRBP et de la la protéine HSI, seule ou combinée, a été également recherchée chez les patientes DFS. La perte de l'expression de la protéine HSI et l'expression positive de la protéine SRBP est associée avec l'allongement du DFS, alors que la présence de la protéine HSI et l'absence d'expression de la protéine SRBP est associée avec un DFS plus faible. Quand elles sont combinées, la perte de l'expression de SRBP avec la présence de l'expression de la protéine HSI, sont fortement associées à DFS plus faible. Ces résultats permettent de dire que les marqueurs, protéine SRBP et protéine HSI, dans les carcinomes primaires du sein, peuvent avoir une application dans le choix des patientes qui peuvent bénéficier d'un traitement hormonal adjuvant, en association à l'évaluation des récepteurs hormonaux. Un traitement hormonal adjuvant pourrait être recommandé pour les patientes avec une expression positive de la protéine SRBP et une perte de l'expression de la protéine HSI; par contre pour le groupe de patientes qui montrent une perte de l'expression de la protéine HSI en dépit de la positivité des récepteurs hormonaux, un autre traitement (chimiothérapie adjuvante, par exemple) pourrait être plus bénéfique. Rien avant la réalisation de cette étude ne permettait de prévoir un intérêt dans l'utilisation des protéines SRBP et HSI dans la prise en charge du cancer du sein. La fonction nouvelle de ces deux protéines était inconnue et l'activité biologique de celles-ci n'avait jamais été évoquée dans le cadre de dosages enzymatiques. Ces protéines constituent ainsi des marqueurs, présents dans les liquides biologiques comme dans la tumeur elle-même et permettent de révéler un phénotype pouvant avoir un impact direct dans la prise en charge thérapeutique du cancer du sein. Une composition diagnostique selon l'invention comprend notamment une protéine telle que définie ci-dessus pour détecter et/ou quantifier des anticorps spécifiques de ladite protéine dans un échantillon biologique. La composition diagnostique peut également comprendre les anticorps spécifiques des protéines SRBP ou HSI. Les anticorps spécifiques de la protéine SRBP sont décrits dans Jbilo O. et ai. cité précédemment et les anticorps spécifiques de la protéine HSI sont décrits dans Duchossoy D. et al., Eur. Journ. Biochem. (sous presse). Ainsi, la présente invention a également pour objet un anticorps spécifique d'une protéine telle que définie précédemment et son utilisation pour obtenir une composition diagnostique, destinée à détecter un cancer mammaire. Par anticorps spécifique selon l'invention, on entend un anticorps monoclonal ou polyclonal susceptible de former avec ladite protéine un complexe immunologique. Un tel anticorps monoclonal ou polyclonal peut être obtenu par des techniques bien connues, telles que I'immunisation d'un animal ou les techniques de recombinaison génétique. Ainsi, une composition diagnostique comprend notamment un anticorps polyclonal ou monoclonal pour détecter et/ou quantifier une protéine ou marqueur immunohistochimique présent naturellement dans un échantillon biologique. Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les anticorps sont dirigés contre la forme soluble du récepteur (SRBP ou HSI). L'invention concerne également un procédé pour détecter une protéine associée à un cancer mammaire dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec un anticorps, tel que défini précédemment, spécifique d'une protéine selon l'invention. L'invention concerne également un procédé pour détecter un anticorps associé à un cancer mammaire dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec une protéine, telle que définie en premier objet selon l'invention. EXEMPLE Une étude clinique à consisté à recruter 850 nouveaux cas de cancer mammaire diagnostiqués. Parmi ces patientes, celles ayant des maladies opérables ont été sélectionnées. L'étude a été réalisée sur 95 femmes. Ont été exclues: - les patientes avec antécédents de cancer (sein ou autre), maladie bilatérale, ou cancer non-invasif (dans les tumeurs in situ). - les patientes qui ont subi un traitement préopératoire par irradiation en chimiothérapie. - les patientes pour lesquelles un dosage tumoral des récepteurs hormonaux (RE, RP) n'a pu être fait, généralement quand la tumeur a un diamètre inférieur à 1 cm. - les cas o les patientes ont des petites tumeurs qui ne permettent pas de procéder à tous les tests immunohistochimiques. L'âge, le statut ménopausal (établi en utilisant des dosages sérique de gonadotrophines, d'estradiol et de progestérone), la taille des tumeurs, le statut ganglionnaire et la présence de métastases ont été établis. La tumeur a été enlevée par chirurgie. Un fragment a été congelé dans de l'azote liquide à -80 C pour les analyses des récepteurs oestrogène et progestérone. Une autre partie de la tumeur a été fixée pendant 24 heures dans une solution alcool-formol, puis inclue en paraffine. On a procédé successivement aux techniques de routine et d'analyse immunohistochimique. Des coupes de tumeur de p d'épaisseur ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour l'étude histopathologique. Le grade de la tumeur a été établi selon la méthode de Scarff, Bloom et Richardson Br. (J. Cancer 1957, 11, 359-377) modifiée par Elston et Ellis (Histopathology 1991, 19, 403-410). Le comptage des mitoses a été fait sur 10 champs consécutifs au grossissment 400, sur un microscope Leica (Leitz DMRB). La taille de la tumeur a été mesurée au diamètre maximum de la masse de la tumeur enlevée par chirurgie. Le statut ganglionnaire axillaire a été établi pour chaque cas par examen histopathologique pour un minimum de 7 ganglions axillaires. Les échantillons de carcinomes invasifs ont été examinés pour l'expression de la protéine SRBP, de la protéine HSI, de la protéine Bc12 et de Ki 67 (Mib 1) comme marqueur de la prolifération cellulaire, par immunohistochimie. L'étude immunohistochimique a été effectuée sur des sections de 2pm d'épaisseur inclues en paraffine pour chaque tumeur, suivant les anticorps primaires et les systèmes de révélation détaillés dans la procédure suivante. Les échantillons de tumeurs fixés au formol, inclus en paraffine ont été coupés et montés sur des lames silanisées DAKO , et la réaction immunohistochimique a été effectuée selon la méthode classique peroxydase-antiperoxydase utilisant le kit DAKO LSAB, décrit comme suit: après avoir entièrement retiré le milieu de protection par du xylène puis réhydraté avec des séries décroissantes en éthanol, une procédure de recouvrement par un antigène avec restauration antigénique par chaleur (micro-ondes) dans un tampon citrate 10mM pendant 5 minutes, répétées 3 fois ont été faites pour chaque réaction immunohistochimique, excepté pour la détection de la protéine SRBP. Puis, I'activité peroxydase endogbne a été bloquée avec du peroxyde d'hydrogène et le réactif bloquant DAKO comme indiqué dans le kit DAKO LSAB , puis incubé avec I'anticorps primaire, lavé dans une solution de rinçage, placé dans un bain de tampon, incubé avec un agent de couplage pendant 10 minutes, lavé à nouveau, incubé pendant minutes dans une solution de streptavidine peroxydase, lavé et incubé 10 minutes dans une solution de substrat chromogène (DAKO AEC Substrat System ). Ensuite les lames ont été rincées et surcolorées avec une solution de 20% d'hématoxyline. Finalement, les lames ont été fixées dans un milieu de fixation (DAKO Glycergel ) pour l'examen. Pour chaque lame, des contr1ôles négatifs ont été effectués en omettant l'anticorps primaire et en appliquant un réactif de substitution (IgG monoclonal de souris anti-humain DAKO ) à la même dilution. Le tissu mammaire normal entourant la tumeur sur la lame a été considéré comme contrôle positif. Pour l'expression immunohistochimique de la protéine SRBP, I'anticorps de la protéine SRBP a été utilisé à une dilution de 1/400. Les lames ont été incubées pendant 1 heure à température ambiante sans prétraitement aux micro-ondes. Pour la détection immunohistochimique de la protéine HSI, I'anticorps de la protéine HSI a été utilisé à une dilution de 1/100 pendant deux heures à température ambiante. L'immunohistochimie pour Bc12 et Ki-67 a été réalisée par coloration pour Bc12, déterminée en utilisant l'oncoprotéine anti-humaine Bc12 (DAKO Bc12, clone 124) à une dilution de 1/50 pendant deux heures. Pour Ki-67, la réaction a été déterminée en utilisant l'anticorps Mib-1 (Immunotech) à une dilution de 1/100 de deux heures. L'immunomarquage cytoplasmique des cellules tumorales contenant les protéines Bc12, SRBP et HSI a été évalué par une méthode semiquantitative en tenant compte de l'intensité de la coloration et du nombre de cellules colorées dans différents champs pris au hasard, en utilisant des objectifs de haute résolution (400x). Le marquage nucléaire par l'anticorps Mib-1 a été également évalué par une méthode semiquantitative. On a pris en compte le nombre de noyaux colorés de 300 cellules tumorales adjacentes, et exprimée comme valeur égale à 1 ( à 3 (> 20%). La quantification des récepteurs hormonaux RE et RP a été réalisée comme suit. Les valeurs des récepteurs RE et RP ont été déterminées dans les échantillons congelés en utilisant un test liant le cytosol à un ligand. Les résultats ont été 'exprimés en fentomole/mg de tissu (fmol mg'). Les valeurs supérieures à 10 fmol mg-' ont été considérées comme significativement positives. Une analyse statistique a ensuite été effectuée. Les comparaisons des données anatomocliniques avec l'expression des quatre marqueurs immunohistochimiques analysés, la protéine SRBP, la protéine HSI ou leurs anticorps spécifiques, ont été menées en utilisant des tests d'analyses du x2. Les valeurs moyennes de différentes variables ont été comparées en utilisant un test de Krustall- Wallis. Les courbes de survie à la maladie ont été établies à partir de la date de la chirurgie en utilisant la méthode de Kaplan et Meier. Leur signification statistique a été calculée en utilisant le test de Log-rank. Les métastases à distance et/ou les rechutes de la maladie locorégionale, ou la mort due au cancer, sont considérées comme les points finaux de la courbe. Pour toutes les analyses statistiques, une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les résultats obtenus sont décrits ci-après. Les caractéristiques des patientes sont les suivantes. L'âge moyen à l'opération est de 61 ans (compris entre 26 et 83 ans). 79% des patientes (75 cas) sont en post ménopause, cas sont en préménopause, dont 13 patientes ayant moins de 45 ans. Les patientes ont été traitées par chirurgie conservatrice avec curage axillaire (42%) ou par mastectomie radicale avec curage axillaire (58%). La plupart de ces patientes (72 cas) ont subi une radiothérapie postopératoire, dans tous les cas de chirurgie conservatrice et dans 60% des cas de chirurgie radicale. 80% des patientes (76 cas) ont reçu un traitement adjuvant (chimique ou hormonal), dépendant de l'âge, du statut ménopausal, du statut des récepteurs hormonaux, de la taille et du grade de la tumeur, et de l'état des ganglions axillaires. 16 cas ont été soumis à une chimiothérapie, 58 cas ont reçu un traitement hormonal (le tamoxifène en général) et 127 patientes n'ont reçu aucun traitement systémique complémentaire. Le temps moyen d'observation de ces patientes a été de 64 mois. 8 patientes ont eu une rechute (3 locorégionales et 5 controlatérales) après un suivi moyen de 38 mois, et 18 ont eu des métastases à distance après un temps moyen de 44 mois (entre 23 et 73). 4 patientes sont décédées d'un cancer mammaire disséminé après un temps moyen de 44 mois (échelle de 41 à 72 mois) (TABLEAU 1). Les données histopathologiques qui ont été obtenues sont les suivantes. Un total de 54 cas (57%) présentait une tumeur de taille inférieure à 20mm, 37 cas (39%) entre 20 et 50 mm (dont 4 cas seulement de plus de 35mm) et 4 cas (4%) de plus de 50 mm. Les types histologiques ont été répartis selon: 81 carcinomes canalaires invasifs, 11 carcinomes lobulaires invasifs et 3 cancers du sein de types différents. En tout, 24% sont SBR I, 41% sont SBR II, et 35% sont SBR III. L'envahissement ganglionnaire est présent dans 42% de la population totale. L'état des récepteurs hormonaux est le suivant. Des RE positifs ont été observés dans 65% des tumeurs avec une concentration moyenne de 59 fmol/mg (échelle entre 10-441 fmol/mg). 69% des tumeurs sont RP positives avec une concentration moyenne de 76 fmol/mg (échelle entre 10-576 fmol/mg). La positivité pour les deux récepteurs a été observée dans 55% des tumeurs (52 cas). Seulement un des récepteurs RE ou RP était positif dans 25% des tumeurs (24 cas) et ils étaient tous deux négatifs (RE et RP) dans 19 cas (20%). La distribution immunohistochimique et l'expression de la protéine SRBP ont été étudiées comme suit. Un immunomarquage positif a été observé dans 72 carcinomes mammaires primaires (76%). L'immunomarquage de la protéine SRBP pour les cellules tumorales est toujours cytoplasmique et granulaire, avec différents degrés d'intensité et d'hétérogénéité. Les cellules tumorales positives apparaissent fortement colorées. Toutes les cellules d'une région sont généralement colorées. La protéine SRBP est présente dans les sections de glande mammaire normale, et est distribuée dans l'épithélium de revêtement des structures canalaires et des acinies. Toutes les cellules d'une même structure n'expriment pas la protéine SRBP, et l'intensité de la coloration est hétérogène et jamais très intense. Les cellules épithéliales apocrine en métaplasie des structures microkystiques sont également colorées. L'expression immunohistochimique de l'anticorps HSI a été observée dans 65 cancers mammaires (68% des tumeurs). La réactivité à Bc12 a été observée chez 75 patientes (79%). Comme décrit précédemment, le marquage est toujours cytoplasmique. Le marquage nucléaire par MIB-1 est faible pour 29 patientes (31%), intermédiaire pour 23 patientes (24%) et élevée 43 patientes (45%). Les relations entre les expressions des protéines SRBP et HSI avec des pathologies cliniques différentes sont montrées dans les TABLEAUX 2 et 3. Une relation significative existe entre l'expression de la protéine SRBP et le statut des récepteurs hormonaux (p = 0,03). Les récepteurs RE et RP sont le plus souvent négatifs en absence d'immunomarquage de la protéine SRBP (39%) qu'en présence d'immunomarquage de la protéine SRBP (14%) (p = 0,008). Un relation significative a été trouvée entre l'immunomarquage de la protéine SRBP et l'état de RP. Parmi les patientes n'exprimant pas le RP, la protéine SRBP est positive chez 59% des patientes alors que parmi les patientes RP positive, la protéine SRBP est positive chez 83% des patientes (p = 0,01). Pour l'immunomarquage de la protéine HSI, aucune relation n'est observé selon l'âge, le statut ménopausal, la taille et le grade de la tumeur ni l'état des ganglions (TABLEAU 2). Une corrélation significative a été trouvée entre l'expression de la protéine HSI et le statut des récepteurs hormonaux (p = 0,027). L'absence d'immunomarquage a été essentiellement associée avec une positivité du récepteur RE et/ou RP (p = 0,098). Il existe une corrélation non significative entre l'expression de la protéine HSI et l'expression de RE (p = 0,11) avec une tendance pour l'absence d'immunomarquage de la protéine HSI associée à un RE positif. Néanmoins, parmi les patientes RE positives, les valeurs moyennes de RE sont plus importantes avec l'immunomarquage de la protéine HSI (40 fmol/mg) qu'en absence de son expression (102 fmol/mg) ( p = 0,004). Cela est également observé dans le sous-groupe traité au tamoxifène (p = 0,015) (TABLEAU 3). Dans les sous-groupes traités par le tamoxifène ayant des RP positifs, les valeurs moyennes de RP sont plus élevées dans le groupe avec un immunomarquage de la protéine HSI positive (292 fmol/mg), que dans le groupe n'ayant pas ou ayant une faible expression de la protéine HSI (73 fmol/mg) (p = 0,056). La relation entre les expressions de la protéine SRBP, de la protéine HSI, et des immunomarquages de Bcl-2 et Ki-67 est décrite dans le TABLEAU 4. Le suivi clinique des patients a été étudié. Comparativement aux autres facteurs anatomocliniques, I'expression de la protéine SRBP et de la protéine HSI a été associée aux patientes ayant survécu à la maladie. Dans la population totale, une relation positive a été observée entre la positivité de l'immunomarquage de la protéine SRBP et le DFS (5 ans DFS = 81%; contre 60%; p = 0,09). Une relation plus significative a été trouvée entre le DFS et la coexpression inverse de la protéine SRBP et de la protéine HSI, avec plus d'échecs survenus chez les patientes qui expriment la protéine HSI sans expression de la protéine SRBP (5 ans DFS = 48%; p = 0,007; Figure 2). Dans le groupe de patientes qui ont reçu le tamoxifène, ces résultats sont plus significatifs. En effet, il a été trouvé une forte relation entre la positivité de la protéine SRBP et un plus long DFS (DFS = 84% contre 58%; p = 0,045) (Figure 3). Le plus court DFS a été observé avec une absence simultanée de l'expression de la protéine SRBP et un immunomarquage positif des anticorps à la protéine HSI (DFS = 45% contre 85%; p = 0,003) (Figure 4). Un dosage immunologique de la protéine HSI et de la protéine SRBP peutêtre réalisé comme décrit ci-après. Il a été conçu un dosage de ces deux paramètres dans le plasma, le sérum, ou dans les tumeurs et autres liquides biologiques. Étant donné que la protéine HSI et la protéine SRBP sont de même nature protéique l'approche méthodologique a été considérée identique pour les deux protéines. Compte tenu des sensibilités requises pour le dosage (du nanogramme au picogramme) il est nécessaire d'utiliser des dosages de type immunochimique seuls garants de haute sensibilité. De tels systèmes basés sur la réaction antigène-anticorps, nécessitent la disponibilité des antigènes purifiés (substances à doser) et des anticorps (polyclonaux oumonoclonaux) reconnaissant de manière spécifique les protéines à doser. Dans ces systèmes une marque est fixée sur l'antigène (substance à doser) o sur un anticorps spécifique de l'antigène. La marque utilisée peut être physique (radioactivité, fluorescence, luminescence) ou enzymatique (peroxydase, phophatase alcaline). On connaît schématiquement deux grands principes de dosage immunologique: - ceux qui se déroulent par capture de l'antigène avec un anticorps et révélation par un deuxième anticorps portant un marqueur ou apte à être marqué (biotine, digoxine ou anticorps anti- espèce conjugué a un enzyme), ces dosages sont de type "immunométrique ou sandwich" le signal détecté est proportionnel à la quantité d'antigène présent dans le milieu de réaction du dosage, ou - les dosages o l'antigène est marqué (traceur) et se trouve en quantité limitante avec I'anticorps de capture. Le complexe antigène- anticorps marqué est déplacé en présence d'antigène provenant de l'échantillon à doser. Ces dosages sont de type par "déplacement ou compétition" le signal mesuré est inversement proportionnel à la quantité d'antigène. Ces dosages sont théoriquement plus sensibles que les premiers, mais leur mise au point demeure plus délicate, en effet les propriétés physiques entre le traceur (antigène modifié chimiquement) et la substance à doser (native) sont rarement identiques, c'est la raison pour laquelle nous avons choisi la première approche. Les réactifs nécessaires aux dosages sont les suivants: * Phase solide: L'utilisation de phase solide sur lesquelles peuvent être fixé de manière physique ou chimique (greffage) soit l'antigène, soit un anticorps, a permis la séparation du complexe antigène-anticorps avec une grande simplicité. Centrifugation dans le cas de poudres ou de phase magnétique, décantation dans le cas ou le récipient d'analyse sert lui même de support, tubes, puits de microplaques de titration sont les plus utilisés. * Couplage du traceur: Plusieurs méthodes sont disponibles pour synthétiser le traceur. La méthodologie peut varier en fonction de la nature de l'antigène ou de l'anticorps. la plus classique est le radiomarquage avec un isotope radioactif, mais actuellement il existe dans le commerce des réactifs de couplage permettant la préparation de conjugué enzymatique. * Anticorps: Le point clé de tous les dosages immunologiques est que l'on doit disposer d'un antisérum absolument spécifique, ou d'anticorps monoclonaux dirigé vers des épitopes différents de la molécule à doser. Dans le cas de l'utilisation d'antisérum une purification des fractions IgG (par filtration sur proteine A par exemple) peut être réalisée. L'usage d'un conjugué à partir d'anticorps pur abaisse notablement le bruit de fond de la méthode. * Antigène: Il est nécessaire de disposer de l'antigène purifié, en particulier pour valider les courbes d'étalonnage et vérifier la spécificité du dosage entre l'antigène purifié et celui présenté en mélange. Un dosage immunométrique à deux sites de type sandwich utilisant des anticorps monoclonaux dirigés vers des épitopes indépendants de la protéine HSI ou de la protéine SRBP a été mis au point. Le premier anticorps de capture est fixé par adsorbtion physique dans les puits d'une plaque de microtitration (Maxisorb de Nunc). Le deuxième anticorps traceur est couplé à la peroxydase après oxydation au périodate de cette dernière. Lors du dosage l'incubation en présence de l'échantillon ou de la gamme étalon, la protéine à doser est retenue sur la phase solide grâce au premier anticorps. La protéine est ensuite révélée par incubation avec le deuxième anticorps traceur couplé à la peroxydase. Après élimination de l'excès de réactifs libres, la détermination de l'activité enzymatique (orthophénylènediamine/H202) permet d'accéder à la mesure de la concentration de la protéine en se référant à une gamme étalon, réalisée dans les mêmes conditions de dosage. Il est à noter qu'un tel dosage peut être réalisé de le même manière en utilisant un antisérurn polyclonal adsorbé et un monoclonal traceur (ou l'inverse), dans ce cas les révélations enzymatiques seront réalisées avec des anticorps anti-espèce conjugués à la peroxydase (disponibles commercialement). Un dosage de l'expression de la protéine HSI et de la protéine SRBP a été réalisé. Cette étude a permis de concevoir une méthode de mesure de l'expression de ces deux protéines à partir de différentes sources (cellules, organes). La problématique étant identique pour ces deux cibles, la stratégie restera la même quelque soit la protéine. L'homme du métier sait que l'activité biologique d'une cellule est liée à la régulation de ses gènes, de cette fonction découle la synthèse d'ARN messager (ARNm) copie conforme de l'ADN constituant le gène cible. Pour développer un tel dosage la condition de départ est de connaître la séquence du gène cible ou mieux sa séquence codante. A partir de cette donnée il a été possible de réaliser un dosage en utilisant la technique de la Polymerase Chain Reaction (PCR). Cette amplification se faisant avec de l'ADN, il est nécessaire de réaliser au préalable une reverse transcription de l'ARNm cellulaire en ADN complémentaire (ADNc) avant la PCR proprement dite, on parle alors de RT-PCR. La PCR permet d'accroître la sensibilité et la spécificité de l'analyse des acides nucléiques. Cependant son utilisation dans une analyse quantitative de l'expression des gènes demeure délicate, ceci est lié à sa propriété d'amplification exponentielle. L'analyse directe de la structure de l'ADN et de son expression en ARNm est possible grâce en particulier à la PCR, cette réaction enzymatique conduit à l'amplification spécifique, de plusieurs millions de fois, d'une séquence nucléotidique précise que l'on désire rechercher ou doser. Dans la réaction de PCR de courtes séquences d'ADN (oligonucléotides) sont utilisées comme amorces par l'enzyme de réplication de l'ADN, I'ADN polymérase. Ces amorces sont positionnées de part et d'autre de la zone d'intérêt (portion de gène). Le produit d'amplification final correspond donc à un segment d'ADN double brin dont les extrémités 5' sont constituées par les amorces. Cependant la quantité de produit obtenu lors d'une PCR n'est pas directement lié à la quantité de matrice soumise initialement à l'amplification, celle ci est exponentielle dans la limite o cette concentration en matrice est faible. Au bout d'un grand nombre de cycles l'efficacité de l'amplification diminue et on aboutit à une phase de saturation. On peut, en principe éviter le problème associé à l'effet plateau de la PCR lors d'une analyse quantitative. Des ARNm exprimés à partir de gènes endogènes susceptibles de peu de variations sont utilisés comme témoins internes de la réaction d'amplification (aldolase, béta-globine, béta-actine, béta-2microglobuline). La quantification relative par rapport à un gène endogène est possible. Dans le cas présent, la béta2-microglobuline a été réalisée (standard interne). La détection des produits d'amplification a été réalisée comme décrit ciaprès. L'amplification peut générer diverses quantités, d'une part de produits issus d'amorçages non spécifiques, d'autre part des dimères d'amorces. Il convient donc d'inclure à l'analyse une démarche spécifique de détection. Pour répondre à ce problème d'une manière simple, il a été élaboré une méthode d'hybridation analogue au Southern. Le produit d'amplification est capturé sur une phase solide (plaque de microtitration) par le biais d'une sonde nucléotidique fixée sur sa surface. Puis une révélation peut se faire en hybridant une deuxième sonde dite de détection, portant une marque enzymatique ou apte à être marqué (biotine/avidine-peroxydase, digoxine/anti-Digphosphatase alcaline). Les sondes de capture et de détection sont complémentaires du gène d'intérêt et sont spécifiques de régions comprises entre les deux amorces. Il existe de nombreuses approches de détection des produits d'amplification: utilisation de nucléotides modifiés (dUTP, d6Biotine ou Digoxine) intégrés lors de la réaction d'amplification, d'amorces ou de sonde biotinylées. Le système a été utilisé de préférence avec l'oligoplaque décrit plus haut car celui ci amène une spécificité supplémentaire par l'utilisation simultanée des deux sondes; capture et détection. Les dosage des ARNm ont été réalisés comme suit: 1) Purification des ARNm et conversion en ADNc: L'extraction du messager se fait d'une manière conventionnelle (extraction au thioisocyanate de guanidine puis purification par ultracentrifugation sur chlorure de césium) ou avec des microméthodes d'extraction du commerce (Clontech, Promega, Perkin-Elmer). La réverse transcription est réalisée au choix, avec la superscript RNase II Reverse h Transcriptase (GibcoBRL), le kit Ready-to- Go de Pharmacia ou avec la technique de Promega. 2) La PCR se déroule dans le format microplaque 96 puits, en utilisant les amorces spécifiques, les produits et l'appareillage Perkin-Elmer. Le gène d'intérêt est amplifié ainsi que le gène de la béta-2-microglobuline (standard interne). 3) Analyse des produits de PCR: Après dénaturation par chauffage les produits de PCR sont hybrides dans des puits de microplaque portant la sonde de capture immobilisée et en présence de la sonde de détection couplée à la biotine. Après lavages et incubation avec un conjugué avidine-peroxydase, la mesure de l'activité enzymatique pour le gène cible et le standard a permis d'évaluer la quantité relative d'ARNm de départ de chaque échantillon. Un grand nombre de protocoles différents pour la détection et la mesure de l'expression des protéines SRBP et HSI, utilisant soit les anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques de ces protéines, sont bien connus dans la littérature. Ces protocoles sont notamment décrits par Hampton R. et aL., Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn., 1990 et Maddox D.E. et aL., J. Exp. Med. 1983, 158, 1211-1216. L'homme du métier pourra ainsi, en utilisant les techniques bien connues de l'art antérieur, réaliser et mettre en ceuvre des kits ou trousses ou compositions de dosage diagnostique contenant les protéines SRBP et/ou HSI et/ou leurs anticorps respectifs. Ces trousses dosages sont utiles dans la détermination, la détection et la quantification d'un cancer mammaire. TABLEAU 1: caractéristiques de la population CARACTERISTIQUES NOMBRE DE PATIENTES % Population totale 95 Age (ans): Moyenne 61 Echelle (min-max) 32-83Ménopausée: Pré 20 21 Post 75 79Thérapie adjuvante: Aucune 17 18 Traitement hormonal 58 61 Chimiothérapie 16 16 Calibration de la tumeur: I 22 24 II 38 41 III 32 35Taille de la tumeur: T1 54 57 T2 37 39 T3 4 4État du ganglion lymphatique: NO 55 58 N1 40 42 TNM stage: I 37 38 lIA 34 35 IIB 21 22 IIIA 3 5État de ER: positif 62 65 négatif 33 35État de RP positif 66 69 négatif 29 31 TABLEAU 2: Relation entre les expressions de la protéine SRBP et de la protéine HSI dans les cancers mammaires opérables et paramètres anatomocliniques FACTEURS Immunomarquaqe SRBP valeur de p Immunomarquaqe de la HSI valeur de p négative positive négative positive Age: NS NS -54 4 (17%) 20 (28%) 7 (23%) 17 (26%) T1 13 (57%) 41 (57 %) 19 (64%) 35 (54%) T2 9 (39%) 28 (39%) 10 (33%) 25 (41%) T3 1 (4%) 3 (4%) 1 (3%) 3 (5%) Calibration de la tumeur NS NS 1 3 (14%) 19 (27%) 8 (29%) 14 (22%) 2 8 (36%) 30 (43%) 11 (39%) 27 (42%) M 3 11 (50%) 21 (30%) 9 (32%) 23 (36%) C (o État du ganglion lymphatique NS NS en 0 11 (48%) 44 (61%) 18 (60%) 33 (54%) 1 12 (52%) 28 (39%) 12 (40%) 28 (46%) TABLEAU 3: Relation entre l'expression globale des anticorps de la protéine SRBP et de la protéine HSI avec l'état des récepteurs dans les cancers mammaires primaires opérables FACTEURS ImmunomarquaRe SRBP valeur de p Immunomarquaqe de la HSI valeur de p (0/1,2,3) (0/1,2.3) négative positive négative positive association RE, RP: 0,034 0,027 RE-, RP- 9 (39%) 10 (14%) 3 (10%) 16 (36%) RE-, RP+ 1 (4,3%) 13(18%) 4 (13%) 10 (23%) RE+, RP- 3 (13%) 7 (10%) 5 (17%) 5 (11%) RE+, RP+ 10 (44%) 42 (58%) 18 (60%) 18 (40%) Association RE, RP: 0,008 0,098 RE-, RP- 9 (39%) 10 (14%) 3 (10%) 16 (25%) RE + ou RP + 14 (61%) 62 (86%) 27 (90%) 49 (75%) RE: * état: - 10 (44%) 23 (32%) NS 7 (23%) 26 (40%) 0,11 + 13 (56,5%) 49 (68%) 23 (77%) 39 (60%) * valeurs 119 (13-214) 55 (10-441) NS 40 (10- 326) 102 (11-441) 0,004 RP M Co * état: - 12 (52%) 17 (24%) 0,01 8 (27%) 21 (32%) NS o (o + 11 (48%) 55 (76%) 22 (73%) 44 (68%) en * valeurs 40 510-346 82 510-576 NS 55 (10-576) 82 (10-448) NS TABLEAU 4: Corrélations entre les marqueurs immunohistochimiques MARQUEURS ÉTAT Expression SRBP valeur de Expression HSI valeur de p négative positive p négative positive HSI négative 7 (30%) 23 (32%) NS - NS positive 16 (70%) 49 (68%) SRBP négative - - 7 (23,3%) 16 (24,6%) NS positive - - 23 (76,7%) 49 (75,4%) Bc12 négative 9 (39%) 11 (15%) 0,017 5 (17%) 15 (23%) 0,035 + 5 (22%) 10 (14%) 1 (3%) 14 (22%) ++/+++ 9 (39%) 51 (71%) 24 (80%) 36 (55%) taux Mib 1 faible 6 (26%) 23 (32%) NS 9 (30%) 20 (31%) NS élevé 17 (74%) 49 (68%) 21 (70%) 45 (69%) --j (o o (n (j REVENDICATIONS 1. Utilisation de la protéine SRBP pour obtenir une composition diagnostique destinée à détecter un état pathologique associé à un cancer mammaire. 2. Utilisation d'un anticorps polyclonal ou monoclonal d'une protéine pour obtenir une composition diagnostique destinée à détecter un état pathologique associé à un cancer mammaire caractérisée en ce que les anticorps sont obtenus à partir de la protéine SRBP. 3. Procédé pour détecter une protéine associée à un cancer mammaire, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec un anticorps obtenu à partir de la protéine SRBP. 4. Procédé pour détecter un anticorps associé à un cancer mammaire dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en contact l'échantillon biologique avec la protéine SRBP. 5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que le cancer mammaire est hormono-dépendant. 6. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que le cancer mammaire est non hormono-dépendant. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi un échantillon de carcinome mammaire. 8. Composition diagnostique pour la détection de cancer mammaire, incluant comme marqueur cellulaire la protéine SRBP. 9. Composition diagnostique pour la détection de cancer mammaire, incluant comme marqueur cellulaire les protéines SRBP et HSI. 10. Composition diagnostique pour la détection de cancer mammaire, incluant comme marqueur cellulaire un anticorps spécifique de la protéine SRBP. 11. Composition diagnostique pour la détection de cancer mammaire, incluant comme marqueur cellulaire des anticorps spécifiques des protéines SRBP et HSI.