Brevet FR2791891A1 — publié le 20001013

La présente invention concerne l'utilisation de la Tianeptine, de ses isomères et de ses sels pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des pathologies de la neurodégénerescence. La Tianeptine, composé de formule (I) : a été décrite dans le brevet français FR 2 104 728 en tant que nouveau médicament utile dans le traitement des troubles psychonévrotiques, de la douleur et de la toux. D'autre part, le brevet français FR 2 635 461 décrit l'utilisation de la Tianeptine et de ses dérivés dans le traitement du stress. Des travaux récents ont montré que la Tianeptine avait des effets significatifs sur la mémoire. Ce sont ceux décrits par : - S.E. FILE et coll. dans Drug Development Research, 1991, 23, 47-56 ; - R. Jaffard et coll. dans Journal de Psychiatrie Biologique et Thérapeutique, 1989, n spécial mars, 37-39 ; - R. Jaffard et coll. dans : Abstracts of the XVIth CINP Congress, Munich (Germany), 15- 19, August 1988 ; Psychopharmacology, 1988,96 (suppl), 31. 02.32, p. 275 ; - R Jaffard et coll. dans : Behavioural Pharmacology, 1991, 2, 37-46 ; - C Lebrun et coll. dans : European Psychiatry, 1993,8 (suppl 2), 81 s-88s , - R Jaffard et coll. dans : Presse Médicale, 1991, 20, 37, 1812-1816 Enfin, le brevet français FR 2 716 623 décrit l'utilisation de l'isomère (+) de la Tianeptine pour l'obtention de médicaments destinés aux troubles mnémo-cognitifs. La demanderesse a maintenant découvert que, de façon surprenante, la Tianeptine est un modulateur des récepteurs au glutamate de type AMPA/Kainate et peut donc être utilisée pour le traitement des pathologies de la neurodégénérescence. L'acide L-glutamique et l'acide L-aspartique ont la capacité d'activer les neurones du système nerveux central et de nombreux travaux ont démontré que ces aminoacides excitateurs (AAE) répondent aux critères définissant un neurotransmetteur. C'est pourquoi la modulation des événements neuronaux liés à ces AAE apparait être une cible intéressante pour le traitement des maladies neurologiques. En effet, il a été prouvé que la libération exagérée des AAE et l'hyperstimulation de leurs récepteurs seraient une des causes de la dégénérescence neuronale que l'on observe dans l'épilepsie, la démence sénile ou les accidents vasculaires cérébraux Actuellement, le nombre de maladies neurodégénératives dans lesquelles les AAE sont étroitement impliqués ne cesse de grandir (chorée de Huntington, schizophrénie, sclérose amyotrophique latérale) (Mc GEER E. G. et al., Nature, 263, 517-519, 1976; SIMON R. et al , Science, 226, 850-852,1984). De plus, s'il est certain que l'hyperactivation de la neurotransmission aux AAE exerce des effets neurotoxiques, l'activation normale de celle-ci facilite les performances mnésiques et cognitives (LYNCH G. & BAUDRY M., Science, 224, 1057-1063,1984 , ROTHMAN S. M & OLNEY J. W., Trends in Neuro Sci., 10, 299-302,1987) Du point de vue pharmacologique et thérapeutique, il convient donc de ne s'opposer qu'aux stimulations pathologiques tout en respectant le niveau d'activation physiologique Les récepteurs aux AAE à localisation post- et présynaptique ont été classés en 4 groupes en fonction de l'affinité et des effets électrophysiologiques et/ou neurochimiques de ligands spécifiques # récepteur NMDA (N-méthyl-D-aspartate) associé à un canal ionique perméable aux cations mono- et divalents (dont le calcium) mais qui est bloqué par le magnésium L'accumulation du calcium et du zinc dans la cellule serait une des causes de la mort neuronale. L'ouverture du canal NMDA est régulée par plusieurs sites associés au récepteur et en particulier est favorisée par la glycine dont l'effet est strychnine-insensible. Ce site glycine constitue l'une des cibles importantes pour moduler l'activation du récepteur NMDA. # récepteur AMPA (acide a-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazole-propionique) associé à un canal ionique perméable aux cations monovalents dont le sodium. L'activation de ce canal entrainerait une dépolarisation membranaire. récepteur kainate dont les caractéristiques ioniques sont proches du récepteur AMPA mais qui s'en diffère par les niveaux de conductance et de désensibilisation Toutefois, de nombreuses études tendent à prouver que le récepteur AMPA et le récepteur kainate ont d'étroites analogies structurales et fonctionnelles et constituent une même famille réceptorielle (KEINANEN K. et al., Science, 249, 556-560,1990). récepteur ACPD (acide-trans-l-aminocyclopentane-l,3-dicarboxylique) appelé récepteur métabotropique car non couplé à un canal ionique. L'activation des récepteurs ionotropiques par les AAE ouvre les canaux ioniques et notamment permet l'entrée de sodium qui dépolarise la cellule. Cette première phase qui implique le récepteur AMPA, conduit alors à la desinhibition puis à l'hyperactivation du récepteur NMDA et à l'accumulation massive de calcium (BLAKE J. F et al., Neurosci Letters, 89,182-186,1988, BASHIRZ.I. et al., Nature, 349, 156-158, 1991). Il a plus particulièrement été montré que la Tianeptine, de manière originale, interagissait avec les récepteurs glutamatergiques de type AMPA/Kainate et pouvait donc être utilisée pour le traitement des pathologies de la neurodégénerescence. Plus spécifiquement, la présente invention concerne l'utilisation de la Tianeptine, de ses énantiomères ainsi que de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinées aux traitements des pathologies de la neurodégénerescence, telles que l'ischémie cérébrale, le traumatisme et le vieillissement cérébral, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la sclérose latérale amyotrophique, les pathologies de démyélinisation, les encéphalopathies, le syndrome de fatigue chronique, l'encéphalomyélite myalgique, le syndrome de fatigue post-viral, l'état de fatigue et de dépression consécutif à une infection bactérienne ou virale et le syndrome de démence du SIDA. La Tianeptine et ses énantiomères éventuellement sous forme de sels pharmaceutiquement acceptables seront présentés sous des formes pharmaceutiques convenant pour l'administration par voie orale, parentérale, per ou transcutanée, nasale, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les préparations injectables, les aérosols, les gouttes oculaires, ou nasales, les comprimés sublinguaux, les glossettes, les gélules, les capsules, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, pommades, gels dermiques, etc..., ces formes permettant la libération immédiate ou retardée et contrôlée du principe actif. La posologie varie selon l'âge et le poids du patient, la voie d'administration, la nature de l'indication thérapeutique et des traitements associés et s'échelonne de 12,5 mg à 300 mg par prise ou par application. Comme base pouvant salifier la Tianeptine ou ses énantiomères, on pourra utiliser à titre non limitatif l'hydroxyde de sodium, potassium, calcium ou d'aluminium, des carbonates de métaux alcalins ou alcalino-terreux ou des bases organiques comme la triéthylamine, la benzylamine, la diéthanolamine, la tert-butylamine, la dicyclohexylamine, l'arginine, etc .. Comme acide pouvant salifier la Tianeptine ou ses isomères, on peut citer à titre non limitatif les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, tartrique, malique, maléique, fumarique, oxalique, méthane-sulfonique, éthane-sulfonique, camphorique, citrique, etc .. Le sel préféré de Tianeptine est le sel de sodium. 1 A- Eftets de h Tianentine sur les récepteurs AMPA/Kainate Cette expérience montre l'effet de la Tianeptine à des concentrations de 4, 10 et 25 M sur le courant induit par le kainate (250 M) dans les cellules télencéphaliques, en culture primaire Pm1.(gJ)k exp.édmJmtJll Les cellules télencéphaliques de f#tus de rats Wistar âgés de 16,5 jours, ont été mises en culture pendant 12 jours Puis, les expériences de patch clamp ont été réalisées à température ambiante dans le milieu suivant : 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 et 10 mM D-glucose (pH = 7,3), et les micropipettes ont été remplies avec 140 mM KCI, 4 mM NaCl, 10 mM Hepes, 5 mM EGTA et 0,5 mM CaCl2 (pH = 7,2). La Tianeptine (sous forme de sel de sodium) a été testée aux concentrations de 4, 10 et 25 M Résultats Dans cette expérience, le kainate, agoniste des récepteurs glutamatergiques de type AMPA/kainate, en culture dans des cellules télencéphaliques, augmente le courant entrant dans les cellules. Cet effet est mesuré par la technique de patch-clamp La Tianeptine seule (10 M) n'a pas d'effet dans ces conditions, elle n'est donc pas un agoniste direct Cependant, la Tianeptine (4, 10 et 25 M) augmente le courant induit par le kainate (250 M) comme indiqué dans la figure ci-dessous : L'effet du kainate est bloqué par le GYKI 52466 (50 M), un antagoniste des récepteurs AMPA/kainate, comme indiqué dans la figure suivante. En conséquence, la Tianeptine est un modulateur des récepteurs AMPA/kainate # B - Effet de la Tianentine sur la neurotoxicité in vitro dans deux modèles prédictifs de neurotoxicité Ces expériences montrent les effets de la tianeptine dans des modèles de neurotoxicité prédictifs d'un effet neuroprotecteur pour des principes actifs dans l'ischémie, le traumatisme cérébral et la neurodégénerescence. La neurotoxicité du glutamate joue un rôle important dans la pathogénèse des pertes neuronales rencontrée dans plusieurs états pathologiques (Choi, D. W. Trends Neurosci, 11, 465, 1988) B-1 Effet de la Tianeptine sur la neurotoxicité induite par l'hypoxie Protocole expérimental Les cellules corticales sont extraites de f#tus de rats Sprague-Dawley et cultivées dans le MEM (minimum essential medium) contenant 5 % de sérum de cheval et 5 % de sérum de f#tus de veau Les cultures sont maintenues à 37 C dans une atmosphère de 93 % d'air et de 7 % de CO2. Juste avant l'hypoxie, le milieu de culture est remplacé par 300 l de solution saline tamponnée par l'HEPES (HCSS). Les cellules sont incubées 10 minutes dans ces conditions à température ambiante. La Tianeptine (sous forme de sel de sodium) et le MK-801 sont ajoutés à différentes concentrations et les cellules sont incubées 10 minutes Les milieux de cultures sont ensuite remplacés par 300 l de tampon PIPES désoxygéné à pH 7,4. Les cellules sont ensuite incubées pendant 3 heures dans une atmosphère hypoxique contenant 95 % N2 et 5 % O2 à 37 C. Les milieux de culture sont ensuite remplacés par 200 l de MEM dépourvu de sérum et les cellules sont incubées à nouveau pendant 24 heures à 37 C dans des conditions standards. Après examen morphologique des cellules, les surnageants des cultures sont collectés et l'activité lactate déshydrogénase (LDH) y est mesurée Résultats La Tianeptine, aux concentrations de 1,10 et 100 M réduit de façon significative la neurotoxicité induite par l'hypoxie, comme indiqué dans la figure ci-dessous La réduction d'activité est respectivement de 98. 8, 91. 7 et 91.4 %. Dans ces conditions, le MK-801 (20 M) utilisé comme agent neuroprotecteur de référence, entraîne une protection presque totale (86. 3 %) contre les effets de l'hypoxie. Conclusion Des concentrations micromolaires de Tianeptine protègent complètement des neurones corticaux en culture des dommages cellulaires induits par l'hypoxie. B-2 Effet de la Tianeptine sur la neurotoxicité induite par le,glutamate Protocole expérimentai Les cellules corticales sont extraites de f#tus de rats Sprague Dawley et cultivées dans le MEM (minimium essential medium) contenant 5% de sérum de cheval et 5% de serum de f#tus de veau. Les cultures sont maintenues à 37 C dans une atmosphère de 93% air et 7% de CO2. Juste avant le traitement par le glutamate, le milieu de culture est remplacé par 300 l de solution saline tamponnée par l'HEPES. Les cellules sont incubées pendant 15 minutes avec 1 mM de glutamate. Les milieux de culture sont ensuite remplacés par 200 l de MEM dépourvu de sérum et les cellules sont incubées à 37 C pendant 24 heures Après examen morphologique des cellules, les surnageants des cultures sont collectés et l'activité lactate déshydrogénase (LDH) y est mesurée. Résultats La Tianeptine aux concentrations de 1,10,100 nM et 1,10,100 M réduit de façon significative la toxicité induite par le glutamate, comme indiqué dans la figure ci-dessous La réduction d'activité est comprise entre 59 et 94%. Dans ces conditions, le MK-801 (20 M) utilisé comme agent protecteur de référence entraîne une protection totale contre les effets de l'hypoxie. Conclusion Des concentrations nanomolaires de Tianeptine sont capables de protéger des neurones de cortex en culture contre les effets dégénératifs induits par le glutamate. Ces résultats indiquent que la Tianeptine peut agir directement au niveau des neurones pour réduire leur vulnérabilité à des agressions induites par les pathologies dégénératives. #C - Effet de la Tianentine sur les taux d'adénosine trinhosnhate (ATP) lies à une hypoxie dans les astrocvtes maintenus en culture Protocole expérimental Les cultures d'astrocytes sont obtenues à partir de rats nouveaux-nés d'après la technique décrite par Booher J. et Sensenbrenner M. (Neurobiology 2, 97-105, 1992) Elles sont utilisées trois semaines après la mise en culture. Après addition de milieu de culture (DMEM) dégazé en 02 et contenant des concentrations variables de Tianeptine, l'hypoxie est réalisée dans un caisson anaérobie pour une durée de 24 heures. La concentration en ATP est déterminée en luminescence et exprimée en picomoles d'ATP par mg de protéines cellulaires. Les expériences sont réalisées en triplicate. Résultats La Tianeptine (0,1 - 1- 10 M) protège de façon dose-dépendante les astrocytes en culture Le pourcentage de protection est maximal à la dose de 10 M et atteint 68% Conclusion Des concentrations micromolaires de Tianeptine sont capables de protéger des astrocytes en culture contre les effets dégénératifs induits par l'hypoxie. ID- Effet de la Tianentine in vivo sur l'exnre.'!1sion de pênes impliqués dans le stress oxydatif La technique récente de biologie moléculaire d'analyse différentielle par transcription inverse puis réaction d'amplification par polymérisation en chaîne (RT-PCR) a permis d'étudier in vivo les effets d'un traitement chronique de la Tianeptine sur la modulation génétique au niveau central, dans l'amygdale, chez le rat. Matériel et méthodes Deux groupes de rats (n=6) sont traités par le sel de sodium de la Tianeptine (15 mg/kg; i p.) ou du sérum physiologique pendant 21 jours. Après sacrifice des animaux et prélèvements du cerveau, les ARN totaux de la région de l'amygdale sont extraits, puis soumis à une étude RT-PCR Brièvement, une transcription inverse est réalisée sur les ARN extraits, les produits de transcription sont ensuite amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR) puis soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à haute résolution. Les bandes d'intérêt sont prélevées du gel, réamplifiées, séquencées et analysées. Résultats Les résultats montrent que la cible privilégiée de la Tianeptine est le génome mitochondrial, qui est constitué d'une molécule d'ADN circulaire de 16 kilobases codant pour les 13 sousunités des complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire ainsi que pour toute une série d'ARN ribosomaux et de transfert. En effet, l'administration chronique de Tianeptine provoque la surexpression des gènes mitochondriaux de la NADH ubiquinone réductase (sous-unités 2 et 5) ainsi que des gènes codant pour l'ARNr 16S, l'ARNt-leu et l'ARNt-val. La NADH ubiquinone réductase est le premier des trois complexes enzymatiques de transfert d'énergie au sein de la chaîne respiratoire mitochondriale et représente le point d'entrée de la majorité des électrons traversant cette chaîne De plus, les mutations de l'ADN mitochondrial sont associées à un certain nombre de maladies neurodégénératives connues sous le nom global d'encéphalomyopathie mitochondriales (K. Chandrasekaran et coll., Mol Brain Res., 1994, 24.336-340 ,S.J. Kish et coll., J. Neurochem , 1992,59.776- 779 , E M Mutisaya et coll., J. Neurochem., 1994, 63. 2179-2184) Par ailleurs, il a été montré sur des cultures de fibroblastes que le stress provoque une régulation négative des taux de transcrits codant pour les gènes de la sous-unité 4 de la NADH, le cytochrome b et la sous-unité 165S de l'ARNr (D.R Crawford et coll , Free Radic Biol Med., 1997,22 (3):551-559). Conclusion La surexpression des gènes mitochondriaux de l'amygdale, induite par l'administration chronique de Tianeptine, indique que ce composé augmente le niveau de la respiration cellulaire et le métabolisme oxydatif central. Un tel effet central implique une activité neuroprotectrice in vivo de la Tianeptine 1- Utilisation de la Tianeptine ou de ses énantiomères éventuellement sous forme de sel d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable pour l'obtention de médicaments utiles comme modulateurs des récepteurs au glutamate de type AMPA/Kainate dans le traitement des pathologies de la neurodégénérescence. 2- Utilisation selon la revendication 1 caractérisé en ce que les médicaments sont destinés au traitement de l'ischémie cérébrale, le traumatisme et le vieillissement cérébral, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la sclérose latérale amyotrophique, les pathologies de démyélinisation, les encéphalopathies, le syndrome de fatigue chronique, l'encéphalomyélite myalgique, le syndrome de fatigue post-viral, l'état de fatigue et de dépression consécutif à une infection bactérienne ou virale et le syndrome de démence du SIDA. 3- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que la Tianeptine est sous forme de sel de sodium. 4- Composition pharmaceutique utilisable selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3 contenant comme principe actif, la Tianeptine ou ses énantiomères éventuellement sous forme de sel d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable ainsi qu'un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. 5- Composition pharmaceutique selon la revendication 4 caractérisé en ce que le principe actif est la Tianeptine sous forme de sel de sodium.