Brevet FR2795734A1 — publié le 20010105

CONJUGUES D'ERYTHROPOÏETINE, COMPOSITIONS LES COMPRENANT ET PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ARRIERE PLAN DE L'INVENTION L'érythropoïèse est la production d'hématies qui s'effectue pour s'opposer à la destruction des cellules. L'érythropoïèse est un mécanisme physiologique régulé qui permet de disposer d'un nombre suffisant d'hématies pour oxygéner convenablement les tissus. L'érythropoïèse humaine (hEPO) est produite dans le rein et est le facteur plasmatique humoral qui stimule la production d'érythrocytes (Carnot, P et Deflandre, C (1906), C. R. Acad. Sci. 143 :432, Erslev, AJ (1953 Blood 8 : 349 ; Reissmann, KR (1950) Blood 5 : 372 ; Jacobson, LO, Goldwasser, E. Freid, W et Plzak LF (1957) Nature 179 : 6331-4).L'EPO stimule la division et la différenciation des progéniteurs érythroïdes spécialisés dans la moelle osseuse et exerce son activité biologique en se liant aux récepteurs sur les précurseurs d'érythroïdes (Krantz, BS (1991) Blood 77:419) . On a produit l'érythropoïétine par biosynthèse en utilisant la technologie de l'ADN recombinant (Egrie, J. C. Strickland, TW, Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72 : 213-224) et elle est le produit d'un gène d'EPO humain cloné inséré dans et exprimé dans les cellules tissulaires ovariennes du hamster chinois (CHO). La structure primaire de la forme prédominante, pleinement traitée de hEPO est présentée dans SEQ ID N l. Il y a deux ponts disulfure entre Cys7-Cys161 et Cys29-Cys33. Le poids moléculaire de la chaîne polypeptidique d'EPO sans les fractions sucres est de 18 236 Da. Dans la molécule d'EPO intacte, environ 40 % du poids moléculaire sont représentés par les groupes hydrocarbonés qui glycosylent la protéine aux sites de glycosylation sur la protéine (Sasaki, H. Bothner, B. Dell, A et Fukuda, M (1987), J. Biol. Chem. 262: 12059) . Comme l'érythropoïétine humaine est essentielle dans la formation des hématies, l'hormone est utile dans le traitement des maladies sanguines caractérisées par une production faible ou défectueuse d'érythrocytes. Cliniquement, l'EPO est utilisée dans le traitement de l'anémie chez les malades atteints de déficience rénale chronique (CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316 : Eschbach, JW Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111:992 ; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33 : Lim. VS, Degowin, RL, Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) et chez les malades atteints de SIDA et de cancer qui subissent une chimiothérapie (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI dans MB, Garnick, dir. publ. Erythropoietin dans Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY : Marcel Dekker 1990 : p. 301-324). Cependant, la biodisponibilité de la thérapeutique protéique commercialement disponible comme la thérapeutique à EPO est limitée par la courte demi-vie plasmatique de ces protéines et leur sensibilité à la dégradation par une protéase. Ces inconvénients les empêchent d'atteindre une efficacité clinique maximale. RESUME DE L'INVENTION L'invention fournit un conjugué d'érythropoïétine, ledit conjugué comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libre et ayant l'activité biologique in vivo consistant à faire déclencher par les cellules de moelle osseuse une augmentation de la production de réticulocytes et d'érythrocytes, et choisis dans le groupe constitué par l'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par l'addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou le réarrangement d'au moins un site de glycosylation ; ladite glycoprotéine étant liée de façon covalente à "n" groupes poly(éthylène glycol) de formule CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, le -CO (c' est-à-dire carbonyle) de chaque groupe poly(éthylène glycol) formant une liaison amide avec l'un desdits groupes amino ; R est un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; vaut d'environ 450 à environ 900 ; vaut de 1 à 3 et n et m sont choisis de manière que le poids moléculaire du conjugué diminué de celui de la glycoprotéine de l'érythropoïétine est compris entre 20 kDaltons et 100 kDaltons. L'invention fournit en outre des compositions contenant des conjugués ici décrits dans lesquels le pourcentage de conjugués dans la composition dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 90 %. Par comparaison avec l'EPO non modifiée (c'est-à- dire l'EPO sans PEG attaché) et les conjugués PEG-EPO classiques, les présents conjugués ont une demi-vie de circulation et un temps de séjour dans le plasma accrus, une baisse de la clairance et une activité clinique in vivo accrues. Les conjugués de l'invention ont les mêmes utilisations que l'EPO. En particulier les conjugués de l'invention sont utiles pour traiter les malades en stimulant da division et la différenciation des précurseurs d'érythroïdes spécialisés dans la moelle osseuse de la même manière que l'on utilise l'EPO pour traiter les malades. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention fournit des conjugués, lesdits conjugués comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libre et ayant l'activité biologique in vivo consistant à déclencher, sous l'action des cellules de moelle osseuse, l'augmentation de la production de réticulocytes et d'érythrocytes, et choisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou une transposition d'au moins un site de glycosylation ; glycoprotéine étant liée de façon covalente à "n" groupes poly(éthylène glycol) de formule -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, le -CO (carbonyle) de chaque groupe poly(éthylène glycol) formant une liaison amide avec l'un desdits groupes amino ; R est un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; vaut d'environ 450 à environ 900 ; vaut de 1 à 3 ; n et m sont choisis de manière que le poids moléculaire du conjugué diminué de celui de la glycoprotéine d'érythropoïétine est compris entre 20 kD à 100 kD. On a trouvé que les conjugués de l'invention peuvent être utilisés de la même manière que l'EPO non modifiée. Cependant, les conjugués de l'invention présentent une diminution de la demi-vie de circulation et du temps de séjour plasmatique, une baisse de la clairance, et une augmentation de l'activité clinique in vivo. Etant donné ces propriétés améliorées, les conjugués de l'invention peuvent être améliorés une fois par semaine au lieu de trois fois par semaine pour l'EPO non modifiée. On s'attend à ce qu'une baisse de la fréquence d'administration aboutisse à une coopération accrue chez le malade, menant à un meilleur succès dans le traitement ainsi qu'à une amélioration dans la qualité de vie des malades. Par comparaison avec les conjugués classiques d'EPO liés au poly(éthylène glycol) on a trouvé que les conjugués ayant les poids moléculaire et la structure de lieur des conjugués de l'invention -présentent une amélioration de leur puissance, de leur stabilité, de leur AUC, de leur demi-vie de circulation et de leur profil économique. Les conjugués selon l'invention peuvent être administrés en une quantité thérapeutiquement efficace à des malades de la même manière que l'on administre l'EPO. La quantité thérapeutiquement efficace est la quantité de conjugué nécessaire pour l'activité biologique in vivo consistant à faire déclencher par les cellules de moelle osseuse l'augmentation de la production de réticulocytes et d'érythrocytes. La quantité exacte de conjugué est une question de préférence par rapport à des facteurs tels que le type exact de maladie traitée, l'état du malade traité, ainsi que les autres ingrédients de la composition. Ainsi, on peut administrer de 0,01 à 10 pg par kg de poids corporel, de préférence de 0,1 à 1 ug/kg de poids corporel, par exemple une fois par semaine. Les compositions pharmaceutiques contenant le conjugué peuvent être formulées à une concentration efficace pour l'administration par divers moyens à un malade humain subissant des maladies sanguines caractérisées par une baisse ou une défectuosité dans la production des érythrocytes. Les quantités thérapeutiquement efficaces moyennes du conjugué peuvent varier, et en particulier doivent être fondées sur les recommandations et la prescription d'un médecin qualifié. Les produits glycoprotéiques d'érythropoiétine obtenus selon l'invention peuvent être préparés dans des compositions pharmaceutiques appropriées pour l'injection avec un support ou véhicule pharmaceutiquement acceptable par des procédés connus des spécialistes. Ainsi, des compositions appropriées ont été décrites dans les documents W097/09996, W097/40850, W098/58660 et W099/07401. Parmi les supports pharmaceutiquement acceptables préférés pour formuler les produits de l'invention, il faut citer la sérum albumine humaine, les protéines plasmatiques humaines, etc. Les composés de l'invention peuvent être formulés dans un tampon phosphate de sodium/potassium 10 mM à pH 7 contenant un agent de tonicité, par exemple le chlorure de sodium 132 mM. Facultativement, la composition pharmaceutique peut contenir un agent de conservation. La composition pharmaceutique peut contenir différentes quantités d'érythropolétine, par exemple 10 à 1000 ug/ml, par exemple 50 ug ou 400 ug. Le terme d'"érythropoïétine" ou EPO se réfère à une glycoprotéine ayant la séquence d'acides aminés exposée dans (SEQ ID NO:1) ou (SEQ ID NO:2) ou une séquence d'acides aminés qui y est sensiblement homologue, dont les propriétés biologiques concernent la stimulation de la production d'érythrocytes et la stimulation de la division et de la différenciation de précurseurs d'érythrocytes spécialisés dans la moelle osseuse. Tels qu'utilisés ici, ces termes comprennent de telles protéines modifiées délibérément, par exemple par une mutagenèse dirigée ou accidentellement par des mutations. Ces termes incluent également les analogues ayant de 1 à 6 sites additionnels de glycosylation, les analogues ayant au moins un acide aminé additionnel à l'extrémité carboxy-terminale de la glycoprotéine, l'acide aminé additionnel incluant au moins un site de glycosylation, et les analogues ayant une séquence d'acide aminés qui incluent une transposition d'au moins un site pour la glycosylation. Ces termes comprennent l'érythropoïétine humaine tant naturelle que produite par voie recombinante. Les conjugués d'érythropoïétine de l'invention peuvent être représentés par la formule--I : P- [NHCO- (CH2) x- (OCH2CH2) .-OR] n ( I ) dans laquelle x, m, n et R sont tels que ci-dessus. Dans la formule i, P est le résidu d'une glycoprotéine d'érythropoïétine ici décrite (c'est-à-dire sans le ou les groupes amino qui forment une liaison amide avec le carbonyle représenté dans la formule I), ayant l'activité biologique in vivo consistant à faire déclencher par les cellules de moelle osseuse l'augmentation de la production des réticulocytes et des érythrocytes. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, R est un méthyle. De préférence, m vaut d'environ 650 à environ 750 et n vaut de préférence 1. Dans le mode de réalisation le plus préféré de l'invention, R est un méthyle, n vaut d'environ 650 à environ 750 et n vaut 1, c'est-à-dire le conjugué tel que défini ci-dessus répondant à la formule [CH3O (CH2CH20)mCH2CH2CH2CO-NH] n-P dans laquelle m vaut de 650 à 750, n vaut 1 et P est tel que défini ci-dessus. De préférence, m a une moyenne d'environ 680. De préférence, la glycoprotéine des conjugués définis ci-dessus est une érythropoïétine humaine. L'érythropoïétine humaine et les protéines analogues telles que définies ci-dessus peuvent être exprimées par une activation génique endogène. Les glycoprotéines d'érythropoïétine humaine sont celles de SEQ ID NO:1 et de SEQ ID NO:2, de préférence celles de SEQ ID NO:1. En outre, P peut être choisi dans le groupe constitué par les résidus d'érythropoïétine humaine et leurs analogues ayant de 1 à 6 sites de glycosylation additionnels. Comme il est exposé en détail ci-dessous, la préparation et la purification de l'EPO sont bien connus des spécialistes. L'EPO désigne la protéine naturelle ou recombinante, de préférence humaine, obtenue à partir de n'importe quelle source classique comme les tissus, la synthèse des protéines, la culture cellulaire avec des cellules naturelles ou recombinantes. Ceci comprend toute protéine ayant l'activité d'EPO, comme les mutéines ou des protéines modifiées d'une autre manière. On peut préparer l'EPO recombinante par expression dans des lignées cellulaires CHO, BHK ou HeLa, par la technologique de l'ADN recombinant ou par une activation génique endogène. L'expression de protéines, y compris l'EPO, par activation génique endogène est bien connue des spécialistes et est décrite, par exemple, dans les brevets américains N 5 733 761,5 641 670 et 5 733 746 et les publications de brevets internationaux N WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 et WO 91/09955, la teneur de chacun de ces documents étant ici incorporée à titre de référence. Les espèces d'EPO préférées pour la préparation des produits glycoprotéiques d'érythropoïétine sont les espèces d'EPO humaines. De préférence, l'espèce d'EPO est l'EPO humaine ayant la séquence d'acides aminés représentée dans SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, de préférence la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO:1. Dans un mode de réalisation, P peut être le résidu d'un analogue de glycoprotéine ayant de 1 à 6 additionnels pour la glycosylation. La glycosylation d'une protéine, avec un ou plusieurs groupes oligosaccharides, s'effectue en des endroits spécifiques le long d'une ossature polypeptidique, et affecte grandement les propriétés physiques de la protéine comme la stabilité de la protéine, la sécrétion, la localisation infracellulaire et l'activité biologique. La glycosylation est généralement de deux types. Les oligosaccharides liés à l'oxygène sont attachés à des résidus sérine ou thréonine et les oligosaccharides liés à l'azote sont attachés à des résidus asparagine. Un type d'oligosaccharide que l'on trouve tant sur les oligosaccharides liés à l'azote que sur ceux qui sont liés à l'oxygène est l'acide N-acétyl neuraminique (acide sialique), qui est une famille de sucres aminés contenant 9 atomes de carbone ou plus. L'acide sialique est généralement le résidu terminal sur les oligosaccharides liés à l'azote comme sur ceux qui sont liés à l'oxydène et, étant donné qu'ils portent une charge négative, ils confèrent des propriétés acides à la glycoprotéine. L'érythropoéïétine humaine, ayant 165 acides aminés, contient trois chaînes oligosaccharidiques liées à l'azote et une chaîne liée à l'oxygène qui constitue environ 40 % du poids moléculaire total de la glycoprotéine. La glycosylation liée à l'azote s'effectue aux résidus asparagine localisés dans les positions 24,38 et 83, et la localisation liée à l'oxygène s'effectue en un résidu sérine localisé en la position 126. Les chaînes oligosaccharidiques sont modifiées par des résidus acides sialiques terminaux. L'élimination enzymatique de tous les résidus acide sialique de l'érythropoîétine glycosylée aboutit à une perte d'activité in vivo, mais non d'activité in vitro car la sialylation de l'érythropoïétine empêche sa liaison, et sa clairance ultérieure, par la protéine de liaison hépatique. Les glycoprotéines de l'invention comprennent des analogues d'érythropoïétine humaine comportant une ou plusieurs modifications de la séquence d'acides aminés de l'érythropoïétine humaine aboutissant à une augmentation du nombre de sites de fixation de l'acide sialique. On peut engendrer ces analogues de glycoprotéine par une mutagenèse dirigée ayant des additions, des délétions et/ou des substitutions de résidus acides aminés qui augmentent ou modifient les sites qui sont disponibles pour la glycosylation. On engendre les analogues de glycoprotéine ayant des niveaux d'acide sialique supérieurs à ceux que l'on trouve dans l'érythropoïétine humaine en ajoutant des sites de glycosylation qui ne perturbent pas la conformation secondaire ou tertiaire requise pour l'activité biologique. Les glycoprotéines de l'invention incluent également des analogues ayant des niveaux accrus de fixation d'hydrates de carbone en un site de glycosylation qui comporte généralement la substitution d'un ou plusieurs acides aminés à proximité étroite d'un site de liaison à l'azote ou à l'oxygène. Les glycoprotéines de l'invention comprennent généralement les analogues ayant un ou plusieurs acides aminés s'étendant à partir de l'extrémité carboxy-terminale de l'érythropoïétine et fournissant au moins un site hydrate de carbone additionnel. Les glycoprotéines de l'invention incluent également des analogues ayant une séquence d'acides aminés incluant une transposition d'au moins un site pour la glycosylation. Une telle transposition de site de glycosylation implique la délétion d'un ou plusieurs sites de glycosylation dans l'érythropoïétine humaine et l'addition d'un ou plusieurs sites de glycosylation que l'on ne trouve pas dans la nature. L'augmentation du nombre de chaînes hydrocarbonées sur l'érythropoïétine, et par conséquent du nombre d'acides sialiques par molécule d'érythropoïétine, peut conférer des propriétés avantageuses comme une~.~~augmentation de la solubilité, une augmentation de la résistance à la protéolyse, une réduction de l'immunogénicité, un accroissement de la durée de vie dans le sérum et une augmentation de l'activité biologique. Des analogues d'érythropoïétine comportant des sites de glycosylation additionnels sont décrits plus en détail dans la demande de brevet européen N 640 619, d'Elliot, publiée le 1er mars 1995. Dans un mode de réalisation préféré, les glycoprotéines de l'invention comprennent une séquence d'acides aminés incluant au moins un site additionnel pour la glycosylation comme, sans s'y limiter, les érythropoïétines comprenant la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par une modification choisie parmi les suivantes : Asn30Thr32 ; Asn51Thr53 ; Asn57Thr59 ; Asn69 ; Asn69Thr71 ; Ser68Asn69Thr71 ; Val87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Gly89Thr90 ; Ser87Asn88Thr90Thr92 ; Ser87Asn88Thr90Ala162 ; Asn67Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ; Asn89Ile90Thr91 ; Ser87Asn89Ile90Thr91 ; Asn136Thr138 ; Asn138Thr140 ; Thr125 ; et Pro124Thr125. La notation utilisée pour la modification de la séquence d'acides aminés signifie que la ou les positions de la protéine non modifiée correspondante (par exemple hEPO de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID N0:2) indiquée par le ou les nombres en indices hauts est changé en le ou les indices aminés précédents immédiatement le ou les nombres mis en indices hauts respectifs. La glycoprotéine peut également être un analogue ayant au moins un indice aminé additionnel à l'extrémité carboxy-terminale de la glycoprotéine, l'acide aminé additionnel incluant au moins un site de glycosylation, c'est-à-dire que le conjugué tel que défini ci-dessus se réfère également à un composé dans lequel la glycoprotéine comporte une séquence comprenant la séquence de l'érythropoïétine humaine et une seconde séquence à l'extrémité carboxy-terminale de la séquence d'érythropoïétine humaine, la seconde séquence contenant au moins un site de glycosylation. L'acide aminé additionnel peut comprendre un fragment peptidique dérivé de l'extrémité carboxy-terminal de la gonadotropine chorionique humaine. De préférence, la glycoprotéine est un analogue choisi dans le groupe constitué par (a) l'érythropoiétine humaine ayant la séquence d'acides aminés Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID B0:3), s'étendant à partir de l'extrémité carboxy-terminale ; (b) l' analogue dans (a) comprenant en outre Sera' Asn88 Thr90 EPO ; et (c) l'analogue en (a) comprenant en outre Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO. La glycoprotéine peut également être un analogue ayant une séquence d'acides aminés qui inclut une transposition d'au moins un site pour la glycosylation. La transposition peut comprendre une -délétion de l'un quelconque des sites hydrates de carbone lié à l'azote dans l'érythropoïétine humaine et une addition d'un site hydrate de carbone lié à l'azote en position 88 de la séquence d'acides aminés de l'érythropoïétine humaine. De préférence, la glycoprotéine est un analogue choisi dans le groupe constitué par Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO ; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO ; et Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO. Tel qu'utilisé ici, le terme "alkyle inférieur" désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone. Comme exemple de groupes alkyle inférieur, on peut citer méthyle, éthyle et isopropyle. Selon l'invention, R représente n'importe quel alkyle inférieur. On préfère les conjugués dans lesquels R est un méthyle. Le symbole "m" représente le nombre de résidus oxyde d'éthylène (OCH2CH2) dans le groupe poly(oxyde d'éthylène). Une seule sous-unité PEG d'oxyde d'éthylène a un poids moléculaire d'environ 44 daltons. Ainsi, le poids moléculaire du conjugué (excluant le poids moléculaire de l'EPO) dépend du nombre "m". Dans les conjugués de l'invention, "m" est d'environ 450 à environ 900 (ce qui correspond à un poids moléculaire à environ 20 kDa à environ 40 kDa), de préférence à environ 60 à environ 750 (ce qui correspond à un poids moléculaire d'environ 30 kDa). Le nombre m est choisi de manière que le conjugué de l'invention résultant ait une activité physiologique comparable à celle de l'EPO non modifiée, laquelle activité peut représenter la même activité, une activité supérieure ou une fraction de l'activité correspondante de l'EPO non modifiée. Un poids moléculaire "d'environ" un certain nombre signifie qu'il est dans un intervalle raisonnable par rapport à ce nombre, déterminé par des techniques d'analyse classiques. Le nombre "m"--est choisi de manière que le poids moléculaire de chaque groupe poly(éthylène glycol) lié de façon covalente à la glycoprotéine érythropoïétine soit d'environ 20 kDa à environ 40 kDa, et soit de préférence d'environ 30kDa. Dans les conjugués de l'invention, le nombre "n" est le nombre de groupes polyéthylène glycol liés de façon covalente à des groupes amino libres (y compris les groupes E-amino d'un acide aminé lysine et/ou le groupe amino terminal) d'une protéine d'érythropoïétine via une ou plusieurs liaisons amides. Un conjugué de l'invention peut avoir 1,2 ou 3 molécules de PEG par groupe d'EPO. "n" est un nombre entier compris entre 1 et 3, de préférence "n" vaut 1 ou 2 ou de préférence "n" vaut 1. On peut préparer le composé de formule I à partir du matériau polymérique connu dans lequel R et m sont tels que décrits ci-dessus, en composant le composé de formule II avec la glycoprotéine d'érythropoïétine. Les- composés de formule 1 dans lesquels x vaut 3 sont les esters succinimidyliques d'acide alpha-alcoxy inférieur butyrique de poly(éthylène glycol) (alcoxy inférieurPEG-SPA). Les composés de formule II dans laquelle x vaut 2 sont les esters succinimidyliques d'acide alphaalcoxy inférieur propionique de poly(éthylène glycol)(alcoxy inférieur-PEG-SPA). On peut utiliser n'importe quel procédé classique pour faire réagir un ester activé avec une amine afin de former un amide. La réaction décrite ci-dessus, l'ester succinimidylique donné en exemple est un groupe sortant causant la formation d'un amide. L'utilisation d'esters succinimidyliques comme les composés de formule II pour produire des conjugués avec les protéines est décrite dans le brevet américain N 5 672 662 publié le 30 septembre 1997 (Harris et al.). L'EPO humaine contient neuf groupes amino libres, le groupe amino terminal auquel s'ajoute les groupes Eamino de 8 résidus lysine. Lorsqu'on combine le réactif de pégylation avec un composé SBA de formule II, on a trouvé qu'à un pH de 7,5 un rapport protéine:PEG de 1:3 et une température réactionnelle comprise entre 20 et 25 C, on produit un mélange de mono-, di- et de traces d'espèces tripégylées. Lorsque le réacteur de pégylation est un composé SPA de formule II, dans des conditions similaires sauf que le rapport protéine:PEG est de 1:2, on produit principalement l'espèce monopégylée. On peut administrer l'EPO pégylée sous la forme d'un mélange, ou bien sous la forme d'espèces pégylées différentes séparées par chromatographie échangeuse de cations. En manipulant les conditions de la réaction (par exemple le rapport des réactifs, le pH, la température, la concentration de protéine, la durée de réaction, etc), on peut faire varier les quantités relatives des différentes espèces pégylées. L'érythropoïétine humaine (EPO) est une glycoprotéine humaine qui stimule la formation d'érythrocytes. Sa préparation et son application thérapeutiques sont décrites en détail par exemple dans les brevets américains N 5 547 933 et 5 621 080, EP-B 0 148 605, Huang, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 et EPB 0 411 678 ainsi que Lai P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121 et Sasaki H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 10259-12076. L'érythropoiétine pour utilisations thérapeutiques peut être produite par un moyen recombinant (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 et Egrie, J. C., Strickland, T. W. Lane, J. et al. (1986) Immunobiol 72:213-224). Des procédés pour l'expression et la préparation de l'érythropoïétine dans un milieu dépourvu de sérum sont décrits par exemple dans le document XO 96/35718, de Burg, publié le 14 novembre 1996, et dans la publication de brevet européen 513 738, de Koch, publiée le 12 juin 1992. Outre les publications mentionnées ci-dessus, il est connu que l'on réaliser une fermentation sans sérum de cellules CHO recombinantes qui contiennent un gène EPO. Ces procédés 5 10 15 20 25 30 35 sont décrits par exemple dans les documents EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 et sous une forme générale par Kawamoto, T. et al. Analytical Biochem. 130 (1983) 445- 453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. et Franek, F. Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B. Expcology 271 (1981) 42-51n EP-A 0 481 791 EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967. Dans le document EP-A 0 267 678, il est décrit une chromatographie échangeuse d'ions sur S-Sepharose, une HPLC (chromatographie en phase liquide haute performance) à phases inversées préparative sur une colonne en C8 et une chromatographie -de filtration sur gel pour la purification de l'EPO produit dans une culture dépourvue de sérum après dialyse. A ce propos, on peut remplacer l'étape de chromatographie par filtration sur gel par une chromatographie d'échange d'ions, sur débit rapide de S-Sepharose. Il est également proposé de réaliser une chromatographie colorante sur colonne de bleu tris-acrylique avant la chromatographie échangeuse d'ions. Un procédé de purification d'EPO recombinante est décrit par Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 359. Dans ce procédé, on traite cependant l'EPO avec une solution de Tween 20, de fluorure de phénylméthyl sulfonyle, d'éthyl maléimide, le pepstatine A, de sulfate de cuivre et d'acide oxamique avant les étapes de purification. Certaines publications, y compris le document WO 96/35718, de Burg, publiée le 14 novembre 1996, décrit un procédé de préparation d'érythropoïétine dans un procédé de fermentation sans sérum (EPOsf). On peut déterminer l'activité spécifique de l'EPO ou de conjugués d'EPO selon l'invention par divers essais connus des spécialistes. L'activité biologique des protéines d'EPO purifiées de l'invention est telle que l'administration de la protéine EPO par injection à des malades humains aboutit à une augmentation de la production de réticulocytes et d'hématies par les cellules de moelle osseuse, par comparaison avec un groupe témoin de sujets n'ayant pas reçu d'injection. On peut tester l'activité biologique des protéines d'EPO, ou de certains de leurs fragments, obtenus et purifiés selon l'invention en ayant recours à des procédés selon Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47 :99-112 Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Un autre essai biologique pour déterminer l'activité--de la protéine d'EPO, l'essai de la souris normocythémique, est décrit dans l'exemple 4. L'invention fournit une composition constituée de conjugués tels que décrits ci-dessus. Une composition contenant au moins 90 % de conjugués mono-PEG, c'est-àdire dans lesquels n vaut 1 peut être préparée comme on le voit dans l'exemple 5. Généralement les composés monoPEG de glycoprotéines d'érythropoiétine sont souhaitables, car ils tendent à avoir une activité plus élevée que les conjugués di-PEG. On peut réguler le pourcentage de conjugués mono-PEG ainsi que le rapport d'espèces mono-PEG et d'espèces di-PEG en mettant ensemble des fractions plus larges autour du pic d'élution pour diminuer le pourcentage de mono-PEG, ou des fractions plus étroites pour augmenter le pourcentage de mono-PEG dans la composition. Environ 90 % de conjugués mono-PEG est un bon équilibre de rendement et d'activité. On peut souhaiter quelques fois des compositions dans lesquelles, par exemple, au moins 92 % et au moins 96 % des conjugués sont des espèces mono-PEG (n = 1). Dans un mode de réalisation de l'invention, le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est de 90 % à 96 %. L'invention se réfère également aux compositions pharmaceutiques correspondantes comprenant un conjugué ou une composition telle que décrite ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Les conjugués et compositions de l'invention sont particulièrement utiles pour la préparation de médicaments pour le traitement ou la prophylaxie des maladies corrélées à l'anémie chez les malades atteints de déficience rénale chronique (CRL), de SIDA, et pour le traitement des malades cancéreux qui subissent une chimiothérapie. Un mode de réalisation additionne-1- de l'invention se réfère à un procédé de traitement prophylactique et/ou thérapeutique de maladies faisant intervenir une anémie chez des malades atteints de déficience rénale chronique (CRF), de SIDA et des malades cancéreux subissant une chimiothérapie, comprenant l'étape d'administration à un malade d'une composition telle que décrite ci-dessus. En outre, l'invention concerne un procédé de préparation de composés tels que décrits ci-dessus, ce procédé comprenant la condensation du composé de formule II avec une glycoprotéine d'érythropoïétine et où r, m et x sont tels que définis ci-dessus. L'invention se réfère également aux composés tels que définis ci-dessus pour le traitement de maladies qui sont associées à l'anémie chez les malades atteints de déficience rénale chronique (CRF), de SIDA, et les malades cancéreux subissant une chimiothérapie. L'invention sera mieux comprise en se référant aux exemples suivants qui précisent mais ne limitent pas l'invention ici décrite. EXEMPLES Exemple 1 Fermentation et purification de l'EPO humaine a) Préparation et fermentation de l'inoculum On prélève un flacon de la bande cellulaire de travail, provenant d'une lignée ---cellulaire CHO productrice d'EPO (ATCC CRL 8695, décrite dans le document EPO 411 678 (Genetics Institute)) dans la phase gazeuse de la cuve de stockage à azote liquide. On transfère les cellules dans des ballons de centrifugation en verre et on cultive dans un milieu tamponné au carbonate acide dans un incubateur de CO2 modifié. Les milieux dépourvus de sérum typiques utilisés pour la préparation et la fermentation de l'inoculum sont décrits dans le demande de brevet européen N 513 738 de Koch publiée le 12 juin 1992, ou le document WO 96/35718 de Burg publiée le 15 novembre 1996, et ils contiennent par exemple comme milieu de DMEM/F12 (par exemple JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, Etats-Unis, commande N 57-736) ainsi que du carbonate acide de sodium, de la L+glutamine, du D+glucose, de l'insuline recombinante, du sélénite de sodium, du diamino butane, de l'hydrocortisone, du sulfate de fer (II), de l'asparagine, de l'acide aspartique, de la sérine et un stabilisateur des cellules de mammifère comme par exemple l'alcool polyvinylique, la méthyl cellulose, le polydextrane, le polyéthylène glycol, le Pluronic F68, 5 10 15 20 25 30 un dilatateur plasmatique polygéline (HEMACCEL) ou de la polyvinyl pyrrolidone (document WO 96/35718). On vérifie au microscope l'absence dans les cellules de microorganismes contaminants, et on détermine des densités cellulaires. Ces tests sont effectués à chaque étape de division. Après la période de croissance, initiale, on dilue la culture cellulaire avec du milieu frais à la densité cellulaire de départ, et elle connaît un autre cycle de croissance. On répète ce procédé jusqu'à obtention d'un volume de culture d'environ 2 litres par ballon de centrifugation en verre. Après environ~-12 doublements, on obtient de 1 à 5 litres de cette culture que l'on emploie alors comme inoculum pour le fermenteur d'inoculum de 10 litres. Au bout de 3 à 5 jours, on peut utiliser la culture dans le fermenteur de 10 litres comme inoculum pour le fermenteur à inoculum de 100 litres. Au bout de 3 à 5 jours additionnels de culture, on peut utiliser la culture dans le fermenteur de 100 litres pour le fermenteur de production de 1000 litres. b) Récolte et séparation des cellules On utilise un procédé de réalimentation discontinu, c'est-à-dire que lorsqu'on atteint la densité cellulaire désirée, on récolte environ 80 % de la cellule. On complète la cellule restante avec du milieu de culture frais et on cultive jusqu'à la récolte suivante. Un tour de production consiste en un maximum de 10 récoltes successives : 9 récoltes partielles et une récolte globale à la fin de la fermentation. La récolte s'effectue tous les trois à quatre jours. On transfère le volume de récolte déterminé dans un récipient refroidi. On retire les cellules par en ligne le surnageant de l'étape de centrifugation contenant l'EPO et on le recueille dans un second récipient refroidi. On traite séparément chaque récolte au cours de la purification. Un procédé typique pour la purification de la protéine EPO est décrit dans le document WO 96/35718, de Burg, publié le 14 novembre 1987. Le procédé de purification est expliqué ci-dessous. a) Chromatographie sur bleu de Sepharose Le bleu de Sepharose (Pharmacia) consiste en perles de Sepharose à la surface desquelles le colorant bleu Cibacron est lié de façon covalen-te. Etant donné que l'EPO se lie plus fortement au bleu de Sepharose que la plupart des impuretés non protéiques, certaines impuretés protéiques et le PVA, on peut enrichir le PVO dans cette étape. On procède à l'élution de la colonne de Sepharose bleu en augmentant la concentration de sel ainsi que le pH. On remplit la colonne avec de 80 à 100 litres de bleu de Sepharose, on la régénère avec NaOH et on l'équilibre avec un tampon d'équilibrage (chlorure de sodium/calcium et acétate de sodium). On charge le surnageant du fermenteur acidifié et filtré. Après la fin du chargement, on lave la colonne tout d'abord la colonne avec un tampon semblable au tampon d'équilibrage contenant une concentration plus élevée de chlorure de sodium, et ensuite avec un tampon de base Tris. On élue le produit avec un tampon de base Tris et on le recueille en une seule fraction selon le profil d'élution directeur. b) Chromatographie sur butyl Toyopearl Le butyl Toyopearl 650C (Toso Haas) est une matrice à base de polystyrène à laquelle des résidus butyle aliphatiques sont couplés de façon covalente. Etant donné que l'EPO se lie plus fortement à ce gel que la plupart des impuretés et le PVA, il faut l'éluer avec un tampon contenant de l'isopropanol. On remplit la colonne avec de 30 à 40 litres de butyl Toyopearl 650 C, on régénère avec NaOH, on lave avec un tampon de base Tris et on équilibre avec un tampon de base Tris contenant de l'isopropanol. On ajuste l'éluat de bleu de Sepharose à la concentration d'isopropanol dans le tampon d'équilibrage de la colonne et on charge sur la colonne. On lave ensuite la colonne avec un tampon d'équilibrage avec une concentration accrue d'isopropanol. On élue le produit ~.avec un tampon d'élution (tampon de base Tris à haute teneur en isopropanol) et on recueille en une seule fraction selon le profil d'élution directeur. c) Chromatographie sur Ultrogel d'hydroxyapatite L'Ultrogel d'hydroxyapatite (Biosepra) consiste en hydroxyapatite qui est incorporée dans une matrice d'agarose pour améliorer ses propriétés mécaniques. L'EPO a une affinité à l'hydroxyapatite et peut donc être élevé à de plus faibles concentrations de phosphate que les impuretés protéiques. On remplit la colonne avec de 30 à 40 litres d'Ultrogel d'hydroxyapatite et on la régénère avec un tampon phosphate de potassium/chlorure de calcium et NaOH suivi par un tampon de base Tris. On l'équilibre alors avec un tampon de base Tris contenant un faible quantité d'isopropanol et de chlorure de sodium. On charge l'EPO contenant l'éluat de la chromatographie sur butyl Toyopearl dans la colonne. Ensuite, on lave la colonne avec un tampon d'équilibrage et un tampon de base Tris sans isopropanol ni chlorure de sodium. On élue le produit avec un tampon de base Tris contenant un faible concentration de phosphate de potassium et on le recueille en une seule fraction selon le profil d'élution directeur. d) HPLC à phases inversées sur Vydac C4 Le matériau de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste en particules de gel de silice dont les surfaces portent des chaînes alkyle en C4. La séparation de l'EPO d'avec les impuretés protéiques se fonde sur des différences de forces d'interactions hydrophobes. On procède à l'élution avec un gradient d'acétonitrile dans l'acide trifluoroacétique dilué. On conduit l'HPLC préparative en utilisant une colonne d'acier inoxydable (remplie de~2,8 à 3,2 litres (gel de silice Vydac C4). On acidifie l'éluat d'Ultrogel d'hydroxyapatite en ajoutant de l'acide trifluoroacétique et on l'introduit dans la colonne de Vydac C4. Pour le lavage et l'élution, on utilise un gradient d'acétonitrile dans l'acide trifluoroacétique dilué. On recueille les fractions et on les neutralise immédiatement avec un tampon phosphaté. On rassemble les fractions d'EPO qui sont dans les limites de l'IPC. e) Chromatographie sur DEAE Sepharose Le matériau DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste en groupes diéthyl aminoéthyle (DEAE) qui sont liés de façon covalente à la surface de perles de Sepharose. La liaison de l'EPO aux groupes DEAE se fait par la médiation d'interactions ioniques. L'acétonitrile et l'acide trifluoroacétique passent à travers la colonne sans être retenus. Après que ces substances aient été enlevées par lavage, on retire les traces d'impuretés en lavant la colonne avec un tampon d'acétate à un faible pH. Ensuite, on lave la colonne avec un tampon phosphaté neutre et on élue l'EPO avec un tampon de force ionique croissante. On remplit la colonne de DEAE Sepharose à écoulement rapide. On ajuste le volume de colonne pour assurer une charge d'EPO comprise entre 3 et 10 mg/ml d'EPO/ml de gel. On lave la colonne avec de l'eau et un tampon d'équilibrage (phosphate de sodium/potassium). On introduit la fraction rassemblée de l'éluat d'HPLC et on lave la colonne avec un tampon d'équilibrage. On lave ensuite la colonne avec un tampon de lavage (tampon d'acétate de sodium) puis on lave avec un tampon d'équilibrage. Ensuite, on dilue l'EPO de la colonne avec un tampon d'élution (chlorure de sodium, phosphate de sodium/potassium), et on le recueille en une seule fraction selon le profil d'élution directeur. On ajuste l'éluat de la colonne de DEAE Sepharose à la conductivité spécifiée. On filtre de façon stérile la substance médicamenteuse résultante dans des flacons de Teflon et on la conserve à -70 C. EXEMPLE 2 : Pégylation de l'EPO avec mPEG-SBA L'EPO purifié selon les produits dépourvus de sérum de l'exemple 1 (EPOsf) est homogène comme on le détermine par des procédés d'analyse et comme on le voit dans le schéma d'isoformes typiques constitué de 8 isoformes. Il a une activité biologique spécifique de 190 000 UI/mg comme on le détermine par le dosage de la souris normocythémique. Le réactif de pégylation utilisé est un méthoxy-PEG-SBA, qui est un composé de formule II dans laquelle R est un méthyle ; x vaut 3 ; m vaut de 650 à 750 (moyenne environ 680, correspondant à un poids moléculaire moyen d'environ 30 kDa). Réaction de pégylation A 100 mg d'EPOsf (9,71 ml d'une réserve de 10,3 mg/ml d'EPOsf, 5,48 umole, on ajoute 10 ml de tampon de phosphate de potassium 0,1 M, pH 7,5, contenant 506 mg de méthoxy-PEG-SBA à 30 kDa (16,5 umole) (commercialisé par Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama, Etats-U) et on mélange pendant 2 heures à la température ambiante (20 à 23 C). La concentration finale de protéine est de 5 mg/ml et le rapport protéine:réactif PEG est de 1 :3. bout de 2 heures, on arrête la réaction en ajustant le pH à 4,5 avec de l'acide acétique glacial et on conserve à -20 C jusqu'à ce que l'ensemble soit prêt pour la purification. Purification 1. Mélange conjugué : On introduit environ 28 ml de SPSEHAROSE FF (résine échangeuse de cations sulfopropyle) dans une colonne de verre AMICON (2, 2 x 7, 5 cm) et on équilibre avec un tampon d'acétate 20 mM, pH 4,5 à un débit de 150 ml/heure. On dilue 5 fois avec un tampon d'équilibrage 6 ml du mélange réactionnel contenant 30 mg de protéine et on l'applique dans la colonne. On enlève par lavage les matériaux non adsorbés et on élue de la colonne le mélange PEG-conjugué adsorbé avec NaCl 0,175 M dans le tampon d'équilibrage. On élue l'EPOsf non modifié restant encore dans la colonne avec NaCl 750 mM. On rééquilibre la colonne dans le tampon de départ. On analyse les échantillons par SDS-PAGE et on détermine leur degré de pégylation. On trouve que l'éluat de NaCl 0,175 M contient des espèces monopégylées ainsi que des espèces dipégylées et des traces d'espèces tripégylées, tandis que l'éluat de NaCl 750 mM contient de l'EPOsf non modifié. 2. EPOsf di-PEG et mono-PEG : dilue quatre fois avec le tampon le mélange de conjugués purifiés élués à partir de la colonne dans l'étape suivante et on l'applique à nouveau dans la colonne puis on le lave comme il est dit. On élue séparément de la colonne le di-PEG-EPOsf et le mono-PEG-EPOsf avec NaCl 0,1 M et NaCl 0,175 M, respectivement. On procède à l'élution avec Nacl 750 mM pour éluer tout EPOsf non modifié éventuellement restant. On peut également diluer cinq fois le mélange réactionnel avec le tampon d'acétate et l'appliquer sur la colonne de SP-Sepharose (environ 0, 5 mg de protéine par ml de gel). On lave la colonne et on élue le mono- PEG-EPOsf, le di-PEG-EPOsf et l'EPOsf non modifié adsorbés comme il est dit dans la section précédente. Résultats On synthétise le PEG EPOsf en conjuguant chimiquement une molécule de PEG linéaire ayant un poids moléculaire moyen en nombre de 34 kDa. Le PEG- EPOsf dérive de la réaction entre les groupes amino primaires d'EPOsf et le dérivé ester succinimidylique d'un acide PEG butyrique à 30 kDa aboutissant à une liaison amide. Les résultats sont résumés au tableau 1. Le mélange conjugué purifié se compose de mono- et de di- PEG EPOsf et est dépourvu d'EPOsf non modifié, comme on le détermine par une analyse SDS-PAGE. Le mélange conjugué représente 23,4 mg, soit 78 %, du produit de départ. La séparation par chromatographie échangeuse de cations du mono- d'avec le di-PEG-EPOsf indique que le rapport du mono- au di-PEG dans le mélange conjugué est d'environ 1 :1. la fin de la réaction, le rapport des composants individuels de mono :di modifié est de 40:38:20 (%). Le rendement global est presque quantitatif. Tableau 1. Résumé des résultats de la pégylation d'EPOsf Echantillon Protéine (mg) Rendement (%) Mélange de rxn 30 100 Mono- 12,0 40 di- 11,4 38 Non mod. 6,0 20 Mélange de 23,4 78 conjugués EXEMPLE 3 : Pégylation d'EPO avec mPEG-SPA On fait réagir une fraction différente de l'EPOsf diffusée dans l'exemple 2 avec 30 kDa de méthoxy-PEGSPA (Shearwaters Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, Etats-Unis). On conduit la réaction avec un rapport protéine:réactif de 1 :2, les techniques de purification sont conformes à l'exemple 2. On produit principalement l'espèce monopégylée. EXEMPLE 4 : Activité in vivo de l'EPO pégylé déterminée par le dosage chez la souris normocythémique Le dosage chez la souris normocythémique est connu chez le spécialiste (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) et un procédé dans la monographie de l'érythropoïétine du BRP de la Pharmacopée européenne. On dilue les échantillons avec SAB-STP. On administre par voie sous-cutanée à des souris normales en bonne santé âgées de 7 à 15 semaines 0,2 ml de la fraction d'EPO contenant l'EPO non pégylé ou l'EPO tri-, di- ou monopégylée de l'exemple 2 ou 3. Pendant une période de 6 jours, on prélève le sang en ponctionnant la veine caudale et on le dilue de manière qu'un l de sang soit présent dans 1 ml d'une solution de coloration à l'orange d'acridine à 0,15 umole. La durée de coloration est de 3 à 10 minutes. On effectue les décomptes de réticulocytes par microfluorométrie dans un cytomètre à flux par analyse de l'histogramme de fluorescence rouge. On donne les décomptes de réticulocytes en termes de chiffres absolus (pour 30 000 cellules sanguines analysées). Pour les données présentées, chaque groupe consiste en 5 souris par jour, et l'on ne saigne chaque souris qu'une fois. Dans des expériences séparées, on administre à des souris une seule dose d'EPO non modifié (25 ng d'EPO), le mélange PEG (SBA)-EPO l'exemple 2 (10 ng de conjugué), les EPO mono- et dipégylés de l'exemple 2 (10 ng de conjugué), le PEG (SPA)-EPO del'exemple 3 (10 ng de conjugué), et une solution tampon. Ces résultats sont représentés au tableau 2. Ces résultats montrent l'activité supérieure et la demi-vie prolongée de l'espèce EPO pégylée indiquée par des quantités significativement accrues de réticulocytes et par le déplacement du décompte maximum de réticulocytes en utilisant la même dose par souris (10 ng), par comparaison avec une dose de 25 ng pour l'EPO non modifiée. TABLEAU 2 EPO 30 kDa Mono 30 Di 30 Mélange Tampon (non de SPA K SBA SBA conju- témoin modifié PEG gué ) PEG-EPO ~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ SBA ~~~~~~~~~ 72 h 1000 1393 1411 994 1328 1857 96 h 500 1406 1501 926 1338 697 120 h 200 1100 1182 791 944 701 144 h #0 535 607 665 660 708 EXEMPLE 5 : Préparation de mono-PEG-EPO prédominant Réaction de pégylation En commençant avec 100 mg (5,48 umole) d'EPOsf dans un tampon de phosphate de potassium 100 mM à pH 5,5 préparé selon l'exemple 1, on ajoute 329 mg (10,96 pmole) de réactif PEG-SBA à 30 kDa dissous dans 3 ml d'HCl 1 N. On ajoute suffisamment de tampon de phosphate de potassium 100 mM à pH 7,5 pour compléter le volume de la réaction à.20 ml. La concentration finale de protéines est de 5 mg/ml et le rapport protéine:réactif de PEG est de 1 :2. malaxe le mélange réactionnel pendant 2 heures à la température ambiante (20-22 C). Au bout de 2 heures, on arrête la réaction en ajustant le pH à 4,5 avec de l'acide acétique glacial et on conserve à l'état congelé à -20 C jusqu'à ce qu'elle soit prête pour la purification. Purification On dilue le mélange réactionnel de l'étape précédente à 1 :5 de l'acétate de sodium 10 mM, pH 7,5, et on l'applique à 300 ml de SP-Sepharose FF (résine échangeuse de cations sulfopropyle) versé dans une colonne de 4,2 x 19 cm. On équilibre au préalable la colonne avec le même tampon. On suit les effluents de la colonne à 200 nm avec un moniteu-Gilson UV et on enregistre avec un appareil Kipp et Zonen. On lave la colonne avec 300 ml ou un volume de lit de tampon d'équilibrage pour enlever l'excès de réactifs, de sous-produits de réaction et de PEG-EPO oligomères. Ensuite, on lave avec 2 volumes de NaCl 100 mM pour retirer le di-PEG-EPO. On élue alors le mono-PEG-EPO avec 200 ml de NaCl. Au cours de l'élution du mono-PEGEPO, on jette les 50 premiers ml du pic protéique et on recueille le mono-PEG-EPO sous la forme d'une fraction de 150 ml. On élue l'EPOsf non modifié restant sur la colonne avec NaCl 750 mM. Tous les tampons d'élution sont préparés dans le tampon d'équilibrage. On analyse tous les échantillons élus par SDS-PAGE et par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) haute performance. On concentre alors la masse de mono-PEG EPO obtenue à partir de la fraction de 150 ml, qui n'a pas d'EPOsf non modifié détectable, à environ 4,5 à 7,5 mg/ml et on effectue une diafiltration dans le tampon de stockage, phosphate de potassium 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. On effectue une concentration/diafiltration avec un système Millipore LabscaleTM TFF équipé d'une membrane Millipore Pellicon XL Biomax 50 d'un seuil de 50 kDa à la température ambiante. On filtre de façon stérile le mono-PEG-EPO concentré et on le concentre congelé à -20 C. On pégyle environ 75 % d'EPOsf. Après purification, le rendement total est d'environ 30 % de mono-PEG-EPO sans EPOsf non modifié détectable, et d'environ 25 % de di-PEG-EPO. Les oligomères et l'EPOsf non pégylé représentent la protéine restante. La masse de mono-PEG-EPO obtenue à partir de la fraction de 150 ml contient environ 90 % de mono-PEG-EPO et environ 10 % de di-PEG-EPO. LISTES DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES (i) TITULAIRE : (A) NOM : F. Hoffmann-La Roche AG (B) RUE : 124 Grenzacherstrasse (C) VILLE : Bâle (E) PAYS : Suisse (F) CODE POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G)TELEPHONE . (61) 688 11 11 (H) TELEFAX : (61) 688 13 95 (I)TELEX : 962 292 hlr ch (ii) TITRE DE L'INVENTION : Conjugués d'érythropoïétine (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Disquette (B) ORDINATEUR : Compatible IBM PC (C) SYSTEME D'EXPLOITATION : WORD (D) LOGICIEL : PatentIn Release 2.0 PatentIn Ver. 2.0 1 165 PRT Homo sapiens 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 2 166 PRT Homo sapiens 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 @ 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 3 28 PRT Homo sapiens 3 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 REVENDICATIONS 1. Conjugué, ledit conjugué comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libre et ayant l'activité biologique in vivo consistant à déclencher, sous l'action des cellules de moelle osseuse, l'augmentation de la production de réticulocytes et d'érythrocytes, et choisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont -.la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou une transposition d'au moins un site de glycosylation ; glycoprotéine étant liée de façon covalente à "n" groupes poly(éthylène glycol) de formule -CO- (CH2) x- (OCH2CH2) ,-OR le -CO de chaque groupe poly(éthylène glycol) formant une liaison amide avec l'un desdits groupes amino ; R est un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; m vaut d'environ 450 à environ 900 ; n vaut de 1 à 3 ; n et m sont choisis de manière que le poids moléculaire du conjugué diminué de celui de la glycoprotéine érythropoiétine soit compris entre 20 kD et 100 kD. 2. Conjugué de la revendication 1 de formule : P- [NHCO- (CH2) x- (OCH2CH2) .-OR] n ( I ) dans laquelle x, m, n et R sont tels que définis dans la revendication 1 et P est le résidu d'une glycoprotéine sans le ou les groupes n amino qui forment une ou plusieurs liaison(s) amide avec le ou les groupe(s) polyéthylène glycol. 3. Conjugué de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel R est un méthyle. 4. Conjugué de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel m vaut d'environ 650 à environ 750. 5. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel n vaut 1. 6. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel R est un -méthyle, m vaut d'environ 650 à environ 750 et n vaut 1. 7. Conjugué de l'une quelconque des revendications précédentes ayant la formule [CH30 (CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH] n-P dans laquelle m vaut de 650 à 750, n vaut 1 et P est tel que défini dans la revendication 1. 8. Conjugué de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la glycoprotéine est une érythropoïétine humaine. 9. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la glycoprotéine d'érythropoïétine humaine est exprimée par activation de gènes endogènes. 10. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la glycoprotéine a la séquence SEQ ID NO:1. 11. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la glycoprotéine a la séquence de l'érythropoiétine humaine modifiée par addition de 1 à 6 sites de glycosylation. 12. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la glycoprotéine a la séquence d'érythropoïétine humaine modifiée par une modification choisie dans un groupe comprenant : Asn30Thr32 ; Asn51Thr53 ; Asn57Thr59 ; Asn69 ; Asn69Thr71 ; Ser68Asn69Thr71 ; Val87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Gly89Thr90 ; Ser87Asn88Thr90Thr92 ; Ser87Asn88Thr90Ala162 ; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 . Asn89Ile90Thr91 ; Ser87Asn89Ile90Thr91 ; Asn136Thr138 ; Asn138Thr140 ; Thr125 ; et Pro124Thr125. 13. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel la glycoprotéine a la séquence comprenant la séquence d'érythropoïétine humaine et une seconde séquence à la terminaison carboxy de la séquence d'érythropoïétine humaine, dans laquelle la seconde séquence contient au moins un site de glycosylation. 14. Conjugué de la revendication 13, dans lequel les secondes séquences comprennent une séquence dérivée de la séquence carboxy terminale de gonadotropine chorionique humaine. 15. Conjugué de la revendication 13, dans lequel la glycoprotéine a la séquence choisie dans le groupe comprenant : (a) La séquence d'érythropoïétine humaine et la séquence SEQ ID NO: 3 à la terminaison carboxy de la séquence d'érythropoïétine humaine ; (b) la séquence de (a) modifiée par Ser87 Asn88 Thr90 ; et (c) la séquence en (a) modifiée par Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr9o . 16. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la glycoprotéine a.- la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par une transposition d'au moins un site de glycosylation. 17. Conjugué de la revendication 16, dans lequel le réarrangement comprend une délétion de l'un quelconque des sites de glycosylation à liaison N dans l'érythropoïétine humaine et l'addition d'un site de glycosylation liés à l'azote en position 88 de la séquence d'érythropoïétine humaine. 18. Conjugué de la revendication 17, dans lequel la glycoprotéine a la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par une modification choisie dans le groupe comprenant : Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 ; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 ; et Gln83 Ser87 Asn88 Thr90. 19. Composition comprenant des conjugués, chacun desdits conjugués comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libre et ayant l'activité biologique in vivo consistant à faire déclencher par les cellules de moelle osseuse une augmentation de la production de réticulocytes et d'érythrocytes, et choisis dans le groupe constitué par l'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont la séquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par l'addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou une transposition d'au moins un site de glycosylation ; ladite glycoprotéine étant liée de façon covalente à "n" groupes poly (éthylène glycol) de formule CO-(CH2)x- (OCH2CH2)m-OR, le -CO (c'est-à-dire carbonyle) de chaque groupe poly(éthylène glycol) formant une liaison amide avec l'un desdits groupes amino ; où R est un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; vaut environ 450 à environ 900 ; vaut de 1 à 3 et n et m sont choisis de manière que le poids moléculaire de~-chaque conjugué diminué de celui de la glycoprotéine érythropoïétine soit compris entre 20 kDaltons et 100 kDaltons ; le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 90 %. 20. Composition comprenant des conjugués tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 90 %. 21. Composition selon les revendications 19 ou 20 dans laquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 92 %. 22. Composition de la revendication 21, dans laquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 96 %. 23. Composition de la revendication 19 ou 20, dans laquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est compris entre 90 % et 96 %. 24. Composition pharmaceutique comprenant un conjugué ou une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 et un excipient pharmaceutiquement acceptable. 25. Utilisation d'un conjugué ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, pour la préparation de médicaments pour le traitement ou la prophylaxie des maladies liées à une anémie chez les malades souffrant d'insuffisance rénale chronique (CRF), du SIDA et pour le traitement des cancéreux en cours de chimiothérapie. 26. Procédé de préparation de composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 qui comprend la condensation du composé de formule II avec une glycoprotéine d'érythropoïétine et dans laquelle R, m et x sont tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 6. 27. Conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, préparés par le procédé de la revendication 27. 28. Conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour le traitement des maladies associées à une anémie pour les patients souffrant d'insuffisance rénale chronique (CRF), du SIDA, et de cancers traités par chimiothérapie.