Brevet FR2786773A1 — publié le 20000609

La présente invention concerne de nouvelles protéines et compositions utilisables pour la production de virus, notamment rétrovirus recombinants. Elle concerne également des acides nucléiques, vecteurs et cellules modifiées, ainsi que leurs utilisations. L'invention est plus particulièrement relative à de nouvelles protéines dérivées du virus GALV et leurs utilisations. Les rétrovirus recombinants sont utilisés dans de nombreuses applications de la biologie, à la fois sur la plan expérimental, diagnostic, vaccinal et thérapeutique. Ainsi, les rétrovirus sont utilisés comme vecteur pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules, essentiellement les cellules en division, in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, les rétrovirus permettent ainsi, par exemple, d'insérer de manière stable un acide nucléique d'intérêt dans le génome d'une cellule, de manière à produire une protéine ou un peptide recombinant, à étudier la régulation d'un gène, à étudier des composés antiviraux, etc. In vivo et ex vivo, les rétrovirus ont été utilisés dans des protocoles cliniques de transfert de gènes à visée thérapeutique et/ou vaccinale. Pour revue, voir notamment Human Gene Therapy, Décembre 1997. Les rétrovirus sont également utilisables pour le transfert de gènes chez des mammifères non-humains, par exemple dans des buts thérapeutiques, vaccinaux, ou expérimentaux (modèles de pathologies, étude de biodisponibilité, etc. ). En raison de leur large spectre d'applications évoqué ci-avant, il est important de pouvoir disposer de méthodes efficaces et présentant un caractère sécuritaire élevé pour produire des rétrovirus recombinants ayant de bonnes capacités de transfert de gènes. A cet égard, les vecteurs rétroviraux recombinants utilisés comportent généralement, dans une capside rétrovirale, un génome rétroviral défectif. Plus précisément, le génome rétroviral défectif est un vecteur rétroviral recombinant comprenant généralement les séquences cis indispensables à la production et l'encapsidation du génome, c'est-à-dire : - les séquences "Long Terminal Repeat" (LTR), localisées à chaque extrémité du génome rétroviral. Ces séquences servent notamment d'origine de transcription et de promoteur transcriptionnel. Les séquences LTR se composent plus précisément d'éléments désignés U3, R et U5 ; - une séquence d'encapsidation (Psi ou #), impliquée dans l'encapsidation du génome rétroviral dans l'enveloppe protéique. La séquence d'encapsidation peut par ailleurs comporter une région étendue à certains éléments du gène gag, qui ont été décrits comme améliorant l'efficacité d'encapsidation ; - la région PB, également impliquée dans la réplication virale. En général, le génome rétroviral défectif est en revanche défectif pour tout ou partie des gènes viraux gag, pol et/ou env. L'absence de tout ou partie des gènes viraux rend en effet le virus défectif, c'est-à-dire incapable de réplication autonome dans une cellule. Plus préférentiellement, l'ensemble des gènes viraux gag, pol et env sont délétés. Le génome rétroviral défectif comprend par ailleurs, en substitution des séquences virales délétées, tout acide nucléique d'intérêt dont le transfert dans une cellule est recherché. Pour la construction de rétrovirus défectifs, le génome rétroviral peut provenir de différents types de rétrovirus, tels que des virus écotropes et/ou amphotropes. Il peut s'agir notamment de rétrovirus appartenant à la famille des oncovirus, des lentivirus ou des spumavirus. Dans la famille des oncovirus, on peut citer notamment les oncovirus lents, non porteur d'oncogène, tels que par exemple MoMLV, ALV, BLV, ou MMTV et les oncovirus rapides, tels que RSV par exemple. Dans la famille des lentivirus, on peut citer par exemple HIV, SIV, FIV, BIV ou CAEV. Un type de rétrovirus particulièrement utilisé est le virus de Moloney, notamment murin (MoMLV). Pour la production des rétrovirus recombinants, le vecteur rétroviral (génome rétroviral défectif ou toute construction le comprenant) est généralement introduit dans une cellule dite de "packaging", exprimant de manière stable les fonctions de complémentation déficientes du génome recombinant (i.e., gag, pol et/ou env). De telles lignées sont par exemples les lignées PSICRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) p. 6460), PA317 (Miller et Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6 (1986) p. 2895), ou GP + Env AM12 (Markowitz et al. Virology 167 (1988) p. 400). D'autres lignées ont par exemple été décrites dans les publications EP 243 204, W089/07150, W090/02806, US5,766,945, EP476,953, W093/04167 et W093/10218. En outre, d'autres approches ont été envisagées pour la production de rétrovirus recombinants, reposant sur la cotransfection transitoire de lignées cellulaires avec des virus (ou plasmides) helper et le vecteur rétroviral recombinant (voir par exemple W094/29438) L'une des particularités des rétrovirus réside dans leur sélectivité pour les cellules en division. Ainsi, dans les conditions naturelles, les rétrovirus ne sont pas capables d'infecter efficacement les cellules quiescentes. Par ailleurs, le tropisme des rétrovirus est essentiellement déterminé par la protéine d'enveloppe présente dans la capside. Ainsi, il est possible de construire des rétrovirus écotropes (c'est-à-dire dont le tropisme est restreint à l'espèce dont provient l'enveloppe) ou amphotropes (c'est-à-dire dont le tropisme croise les barrières d'espèces). Des enveloppes particulièrement utilisées pour la construction de rétrovirus sont par exemple les enveloppes des virus 4070A, 10A1, VSV, VIH, du virus de la rage, du virus GALV, ou également des enveloppes cellulaires, codant par exemple pour une protéine membranaire permettant le ciblage de la particule virale sur un ligand spécifique, notamment pour un récepteur de type CD4. L'enveloppe du virus GALV présente un intérêt particulier. En effet, il a été décrit dans la littérature que le virus de la leucémie du gibbon (GALV ; "Gibbon Ape Leukemia Virus"), notamment son enveloppe, avait un tropisme particulièrement important pour les cellules humaines, notamment hématopoiétiques (cellules souches, lymphocytes, dendritiques, etc. ). Il a donc été envisagé, dans l'art antérieur, d'utiliser des rétrovirus recombinants pseudotypés avec l'enveloppe GALV, c'est-à-dire des rétrovirus recombinants de type Moloney par exemple, comprenant une enveloppe GALV, afin d'améliorer les propriétés d'infection des cellules humaines, notamment hématopoiétiques. (Bunnel et al., PNAS 92 (1995) 7739). Certains résultats particulièrement encourageants ont été obtenus avec ces rétrovirus. Néanmoins, les demandeurs ont maintenant montré que la protéine d'enveloppe GALV ne pouvait être utilisée efficacement, pour la production de rétrovirus recombinants, que dans certains types limités de cellules de packaging. Ainsi, alors que la protéine GALV peut être utilisée pour produire des rétrovirus dans les cellules de fibroblastes murins (NIH 3T3) par exemple, cette même enveloppe ne peut être mise en oeuvre efficacement dans des lignées de packaging établies à partir de cellules humaines, notamment. En particulier, les inventeurs de la présente demande ont mis en évidence que la protéine env du virus GALV, exprimée dans différents types cellulaires, produit un effet fusogénique important, conduisant à une fusion des cellules en culture, empêchant toute production de rétrovirus recombinants. La présente invention apporte à présent une solution à ce problème. En particulier, la présente invention décrit de nouvelles constructions permettant la production d'une enveloppe de type GALV fonctionnelle, non fusogénique dans les cellules. L'invention réside à cet égard dans des constructions chimériques, tronquées et/ou étendues de l'enveloppe GALV, permettant de réduire, voire supprimer les propriétés fusogéniques de cette protéine dans les cellules. L'invention réside également dans des variants de ces enveloppes, les acides nucléiques et vecteurs correspondants, et leurs utilisations, notamment pour la production de particules rétrovirales recombinantes. L'invention est également relative aux cellules modifiées, notamment des cellules de packaging, comprenant les constructions génétiques de l'invention, ainsi qu'à des rétrovirus recombinants et des méthodes pour leur production. La présente invention découle notamment de la mise en évidence que des constructions génétiques peuvent être préparées permettant la production d'enveloppes de type GALV sans effet fusogénique. Ainsi, un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans une protéine d'enveloppe chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie du domaine extracellulaire de l'enveloppe du virus GALV ou d'un variant fonctionnel de celui-ci. Au sens de l'invention, le terme "chimérique" désigne une protéine comprenant deux éléments au moins ayant une origine distincte. Il peut s'agir par exemple de deux éléments provenant de protéines d'espèces différentes ou ayant des propriétés différentes. Généralement, il s'agit d'une protéine hybride entre deux régions au moins de deux protéines d'enveloppe hétérologues. La protéine chimérique peut être le résultat d'une association chimique, génétique ou biologique. Généralement, il s'agit d'un couplage génétique, donnant lieu à une protéine de fusion, par expression dans une cellule appropriée. Les protéines d'enveloppe selon l'invention sont généralement composées de trois domaines fonctionnels principaux, un domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique. Comme indiqué ci-avant, les protéines chimériques de l'invention comprennent de préférence tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe de GALV ou d'un variant fonctionnel de celui-ci. De manière surprenante, les demandeurs ont en effet montré que le caractère fusogénique de GALV pouvait être supprimé (ou réduit), tout en conservant le domaine extracellulaire de cette enveloppe. Ce résultat est d'autant plus surprenant que le domaine extracellulaire, de part sa localisation (exposé à la surface des membranes des cellules qui le produisent, et également des particules rétrovirales), pouvait a priori être supposé jouer un rôle essentiel dans le phénomène de fusion. Les résultats présentés dans la présente demande de brevet montrent maintenant que des enveloppes chimériques de GALV peuvent être construites, fonctionnelles, conservant le tropisme du GALV, et non fusogéniques. Ces constructions permettent donc de produire des rétrovirus recombinants dans des conditions avantageuses, comme il sera explicité plus loin. La séquence de la partie 3' du génome du virus GALV (incluant le gène de l'enveloppe) est représentée sur la séquence SEQ ID NO:1 (Figure 1). La phase codant pour la protéine d'enveloppe s'étend du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 2004 de cette séquence. Le codon TAA aux positions 2002-2004 correspond au codon stop. Ces positions correspondent respectivement aux nucléotides 5552 à 7555 du génome du virus GALV (Delassus S. et al., Virology 173,205-213 (1989)) et codent pour une protéine d'enveloppe de 668 acides aminés. Le domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe correspond essentiellement aux résidus d'acides aminés 1 à 490 (correspondant aux nucléotides 1 à 1468) de la séquence SEQ ID NO: 1. Les résidus aux positions 491 à 655 (correspondant aux nucléotides 1469 à 1963) représentent le domaine transmembranaire de la protéine, et les résidus aux positions 656 à 668 (correspondant aux nucléotides 1964 à 2004) représentent le domaine (intra)cytoplasmique de l'enveloppe GALV. Les protéines chimériques de l'invention comprennent donc tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe GALV ou d'un variant fonctionnel de celui-ci. L'expression "tout ou partie" indique que les chimères de l'invention peuvent comprendre soit l'intégralité du domaine, soit une partie seulement de celui-ci. Au sens de l'invention, la partie du domaine extracellulaire peut comprendre avantageusement 50% au moins des résidus du domaine, de préférence 60% au moins, encore plus préférentiellement 75% au moins. Cette partie peut être obtenue par les techniques classiques de biologie moléculaire, impliquant par exemple la coupure enzymatique, la ligature, l'amplification, le clonage, etc, comme illustré dans la partie expérimentale. Avantageusement, il s'agit d'une partie fonctionnelle du domaine considéré. A cet égard, le terme "variant fonctionnel" ou "partie fonctionnelle" du domaine extracellulaire, désigne plus spécifiquement toute partie ou variant conservant la capacité d'interagir avec le récepteur Glvr-1. Le récepteur Glvr-1 (également désigné PiT-1) est en effet le récepteur naturel de l'enveloppe GALV. Lorsque ce récepteur est présent à la surface des cellules, ces cellules sont permissives au virus GALV. Une propriété avantageuse des enveloppes chimériques selon l'invention est qu'elles présentent préférentiellement la capacité de liaison au récepteur Glvr-1. La capacité de liaison au récepteur Glvr-1 des domaines extracellulaires (variants ou fragments de GALV) ou des enveloppes chimériques de l'invention peut être testée dans différentes conditions, et notamment par : - incubation dudit domaine ou de l'enveloppe entière en présence du récepteur Glvr-1, et mise en évidence d'une fixation par les techniques classiques (marquage, compétition, etc. ). Le récepteur utilisé peut être sous forme purifiée, le cas échéant fixé sur un support. Il peut également s'agir d'une cellule ou membrane cellulaire exprimant ledit récepteur ; - par production de rétrovirus recombinants comprenant ladite enveloppe chimérique, et mise en évidence de la capacité desdits rétrovirus d'infecter une cellule porteuse du récepteur ; ouencore - par toute autre technique connue de l'homme du métier. En outre, le terme variant indique tout polypeptide comportant une ou plusieurs modifications de structure primaire, en particulier une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions et/ou additions de résidus d'acides aminés, de préférence de moins de 30 acides aminés. Plus préférentiellement, les protéines chimères de l'invention comprennent tout ou partie du domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe GALV représenté par les acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1ou d'un variant fonctionnel de celui-ci. Une variante particulière de l'invention consiste en une protéine chimère comprenant le domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe GALV représenté par les acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1. Dans un premier mode particulier de mise en oeuvre, les protéines chimériques selon l'invention comprennent au moins une partie ou un variant fonctionnel du domaine extracellulaire et du domaine transmembranaire de la protéine d'enveloppe GALV et un domaine cytoplasmique hétérologue. Une variante plus particulière réside dans une protéine d'enveloppe comprenant un domaine extracellulaire et un domaine transmembranaire représenté par les acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1, plus un domaine cytoplasmique hétérologue. Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre, les protéines chimériques selon l'invention comprennent au moins une partie du domaine extracellulaire et du domaine transmembranaire de l'enveloppe du virus GALV ou d'un variant fonctionnel de ceux-ci. Avantageusement, les protéines chimères de l'invention comprennent tout ou partie des domaines extracellulaire et transmembranaire de la protéine d'enveloppe GALV représentés par les acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1 ou d'un variant fonctionnel de ceux-ci. Le terme variant fonctionnel est défini comme ci-avant. Dans le cas d'un domaine transmembranaire, il s'agit de tout variant conservant la capacité de s'insérer dans la membrane cellulaire. Préférentiellement, les protéines chimères de l'invention comprennent l'intégralité du domaine extracellulaire de la protéine d'enveloppe GALV. Dans un autre mode préféré, les protéines chimères de l'invention comprennent l'intégralité du domaine transmembranaire de la protéine d'enveloppe GALV. Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par une protéine d'enveloppe chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend une région de l'enveloppe GALV consistant en la séquence correspondant aux résidus d'acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1. Les protéines d'enveloppe selon la présente invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elle comprennent un domaine cytoplasmique d'une enveloppe hétérologue. Le terme "enveloppe hétérologue" désigne toute protéine d'enveloppe autre que la protéine d'enveloppe du virus GALV dont la séquence est représentée sur la SEQ ID NO:1. En particulier, il peut s'agir d'une enveloppe provenant d'un variant de GALV ayant une séquence différente de la séquence SEQ ID NO:1, d'une enveloppe d'un rétrovirus d'un autre type que GALV, d'une enveloppe cellulaire ou synthétique. Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, les protéines chimériques selon la présente invention peuvent également comporter un domaine transmembranaire hétérologue, c'est-à-dire tout domaine protéique ayant la capacité de s'insérer dans la membrane cellulaire, autre que le domaine transmembranaire de la protéine d'enveloppe du virus GALV dont la séquence est représentée sur la SEQ ID NO:1. Il peut s'agir du domaine transmembranaire d'une enveloppe hétérologue, ou également d'un domaine transmembranaire artificiel ou dérivé de toute protéine membranaire (récepteur, canal ionique, etc.). Préférentiellement, le domaine transmembranaire est un domaine de protéine d'enveloppe rétrovirale, notamment de GALV ou d'une enveloppe hétérologue. La protéine d'enveloppe hétérologue peut être toute protéine d'enveloppe connue de l'homme de l'art, telle que par exemple la protéine d'enveloppe des virus 4070A, 10A1, VSV, VIH, du virus de la rage, du virus GALV, ou également une protéine d'enveloppe cellulaire. Préférentiellement, la protéine d'enveloppe hétérologue est une protéine d'enveloppe d'un rétrovirus ayant un tropisme pour les cellules humaines, notamment un rétrovirus amphotrope. A cet égard, on peut citer la protéine d'enveloppe des rétrovirus 4070A, 10A1, etc. Une protéine d'enveloppe hétérologue particulièrement préférée au sens de l'invention est la protéine d'enveloppe du rétrovirus 4070A. Cette protéine d'enveloppe a été décrite dans la littérature et est couramment utilisée pour la construction de rétrovirus recombinants (voir notamment Ott et al., J. Virol. Vol. 64, p757-766, 1990). La séquence du domaine cytoplasmique de cette protéine est représentée sur la séquence SEQ ID NO: 2 : la partie cytoplasmique s'étend des acides aminés 635 à 667 (Figure 2) de la séquence SEQ ID NO: 2. Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne donc une protéine d'enveloppe chimérique, comprenant tout ou partie des domaines extracellulaire et transmembranaire de la protéine d'enveloppe GALV et le domaine cytoplasmique de l'enveloppe du rétrovirus 4070A, plus spécifiquement la séquence d'acides aminés du domaine cytoplasmique représenté de l'acide aminé 635 à l'acide aminé 667 dans la séquence SEQ ID NO: 2. Dans un mode de réalisation spécifique, l'invention concerne une protéine d'enveloppe chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend, en Nterminal, les résidus d'acides aminés 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO:1 fusionnés aux résidus d'acides aminés 635 à 667 de la séquence SEQ ID NO: 2 (en C-terminal). Les protéines d'enveloppe chimères selon l'invention comprennent donc avantageusement un domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique. Ces différents domaines sont liés de manière fonctionnelle les uns aux autres, c'est-à-dire de sorte que chaque domaine conserve une activité dans la protéine chimérique. Généralement, les domaines sont directement liés les uns aux autres, sans l'intervention d'une molécule (peptide) espaceur. Néanmoins, il est possible que des régions neutres sur le plan fonctionnel soient intercalées entre les/des domaines, notamment du fait des techniques de synthèse utilisées. Ainsi, lorsque les acides nucléiques sont préparés, il est possible que des résidus nouveaux apparaissent, codés par exemple par des sites de restriction. Préférentiellement, de tels peptides espaceurs sont de taille très réduite, en particulier de 1 à 3 résidus. L'invention concerne en outre toute composition comprenant une protéine ou un polypeptide de l'invention. Un autre objet de l'invention réside également dans un acide nucléique codant pour une protéine telle que définie ci-avant. Il peut s'agir notamment d'un ADN (notamment ADNc) ou d'un ARN. Il peut en outre s'agir d'un acide nucléique de nature synthétique ou semi-synthétique, optimisé pour un usage de codons particulier, ou comprenant un ou plusieurs introns artificiels en vue de favoriser l'expression, etc. L'acide nucléique peut être préparé par les techniques classiques de la biologie moléculaire (criblage de banques, synthèse artificielle, amplification, coupures/ligations, clonages, etc. ). Généralement, pour la constitution des acides nucléiques de l'invention, la région codant pour le ou les domaines de l'enveloppe GALV est préparée, puis assemblée à la région codant pour le(s) domaine(s) de l'enveloppe hétérologue. Par ailleurs, en plus de la construction et la mise en évidence de propriétés avantageuses de protéines chimériques, la présente invention résulte également de la découverte que des protéines d'enveloppe de type GALV non fusogéniques peuvent être produites lorsqu'elles sont exprimées à partir d'acides nucléiques particuliers. Notamment, les demandeurs ont maintenant montré de manière surprenante que le caractère fusogénique de l'enveloppe GALV n'est pas exprimé (ou est fortement atténué) lorsque cette protéine est produite à partir d'une construction génétique comprenant une région 3' s'étendant au delà du codon STOP. Cette absence de caractère fusogénique pourrait s'expliquer par une particularité de la transcription de la séquence codant pour la protéine d'enveloppe, conduisant à l'expression d'une protéine d'enveloppe étendue par rapport au résidu terminal correspondant au codon STOP (position 2004). La protéine d'enveloppe comporterait donc au delà du résidu correspondant à l'acide aminé 668, les résidus KILVLRQ, voire KILVLRQKYQAL. La particularité de la transcription pourrait être liée à un mécanisme de suppression de codon STOP, accompagné d'un changement et d'un décalage de cadre de lecture. L'invention résulte de la découverte inattendue de l'existence d'un polypeptide dont la présence supprime ou atténue le caractère fusogénique des enveloppes rétrovirales, notamment de l'enveloppe GALV. L'invention a donc également pour objet des constructions génétiques permettant l'expression d'une enveloppe GALV fonctionnelle ainsi que ces polypeptides nouveaux. Ainsi, un objet particulier de l'invention réside également dans un acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'à un nucléotide compris entre les positions 2037 et 2129 inclus de la séquence SEQ ID NO: 1. Un objet plus particulier de l'invention réside dans un acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'à un nucléotide compris entre les positions 2046 et 2129 inclus de la séquence SEQ ID NO: 1. Des modes de réalisation plus spécifiques de l'invention sont représentés par: - un acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'à un nucléotide compris entre les positions 2046 et 2112 inclus de la séquence SEQ ID NO: 1. - un acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide 2055 de la séquence SEQ ID NO: 1; - un acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide 2046 de la séquence SEQ ID NO: 1. L'invention concerne également les variants des séquences ci-dessus, tels que notamment les séquences résultant de la dégénérescence du code génétique et codant pour une protéine de même structure primaire, les variants résultant du polymorphisme du virus GALV, les variants présentant des altérations génétiques et codant pour une protéine d'enveloppe de type GALV fonctionnelle, c'est-à-dire essentiellement non-fusogénique et capable de lier le récepteur Glvr-1. L'invention concerne en outre toute séquence hybridant avec les séquences ci-dessus, de préférence dans des conditions de stringence élevée, et codant pour une protéine d'enveloppe de type GALV fonctionnelle. Par ailleurs, comme indiqué ci-dessus, l'invention décrit également de nouveaux polypeptides, ayant la capacité de modifier la fusogénicité de protéines, notamment de protéines d'enveloppe. Ainsi, le demandeur a maintenant identifié, essentiellement en 3' du gène de l'enveloppe de GALV, la présence d'une phase ouverte de lecture dont la présence dans une cellule permet d'éviter le caractère fusogénique de l'enveloppe exprimée. Ainsi, l'invention concerne un nouveau polypeptide comprenant la séquence Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg Glu Arg Arg (SEQ ID NO: 3) ou un fragment de celle-ci comprenant au moins 5 résidus consécutifs. Ce polypeptide et ses fragments peuvent être produits par synthèse selon les techniques classiques, ou exprimés à partir d'un hôte cellulaire recombinant. Des fragments particuliers de ce polypeptide sont par exemple les polypeptides de séquence Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg Glu et Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg, correspondant à la séquence SEQ ID NO:3 dans laquelle 2 ou 3 résidus Cterminaux ont été supprimés, respectivement. L'invention concerne aussi tout polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO:3 ou d'un variant de celle-ci, et ayant une activité anti-fusogénique. Plus particulièrement, l'activité anti-fusogénique peut être mise en évidence par co expression de ce polypeptide dans une cellule (notamment humaine) en présence de l'enveloppe GALV, et vérification de l'absence de fusion des cellules, comme détaillé dans les exemples. Le terme "variant" désigne tout polypeptide comprenant, par rapport à la séquence SEQ ID NO:3, une ou des délétions, mutations, substitutions ou additions de résidus d'acides aminés. De préférence, les variants comportent moins de 20% de variation dans les acides aminés, encore plus préférentiellement moins de 10%. L'invention a également pour objet tout acide nucléique constitué par une séquence codant pour un polypeptide tel que décrit cidessus. La présente invention est également relative à tout vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus. Un vecteur selon l'invention peut être de nature plasmidique, épisomique, chromosomique, virale, etc. Il s'agit plus particulièrement d'un vecteur plasmidique, par exemple construit à partir de plasmides connus tels que pBR, pUC, pBS, pCI, etc. Avantageusement, dans les vecteurs, les acides nucléiques de l'invention sont placés sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel. Il peut s'agir à cet effet d'un promoteur transcriptionnel fort ou faible, constitutif ou sélectif, régulé ou non, d'origine cellulaire (procaryote, eucaryote, y compris mammifère, dont humain), virale ou artificielle. Des promoteurs utilisables à cet effet sont par exemple les promoteurs CMV, PGK, TK, SV40, etc. Le choix du promoteur peut être aisément réalisé par l'homme de l'art en fonction des applications recherchées. Préférentiellement, le vecteur de l'invention comprend en outre une origine de réplication, notamment une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules procaryotes, permettant une manipulation et une production aisées des vecteurs dans ce type d'hôtes (par exemple dans les bactéries, notamment E. coli). Par ailleurs, le vecteur peut également comprendre un gène marqueur, permettant de sélectionner les cellules dans lesquelles le vecteur a été introduit. Il peut s'agir notamment d'un gène de résistance à un composé (par exemple à un antibiotique). Un autre objet de l'invention concerne toute cellule comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. Une telle cellule peut être procaryote ou eucaryote. En outre parmi les eucaryotes, il peut s'agir d'un eucaryote inférieur (par exemple une levure) ou d'un eucaryote supérieur (cellule végétale, animale, humaine, etc.). Avantageusement, l'invention concerne toute cellule de packaging de rétrovirus, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant et un acide nucléique codant pour les protéines rétrovirales gag et pol. Une telle cellule de packaging est préférentiellement une cellule de mammifère, telle qu'un fibroblaste, d'insecte, ou bien, de préférence, humaine (cellule embryonaire par exemple). Pour cet objet plus particulier, on utilise avantageusement des cellules cultivables, nonpathogènes, et transfectables par des acides nucléiques. Des exemples particuliers sont des cellules embryonaires de rein ou de rétine humaine, ou de lignées cancéreuses humaines. Pour la préparation des cellules de l'invention, les acides nucléiques ou vecteurs peuvent être introduits dans les cellules par toute technique connue de l'homme du métier (ADN "nu", électroporation, précipitation au phosphate de calcium, "gene gun", vecteur lipidique, cationique, polymérique, etc. ). Après incubation, les cellules sont sélectionnées, soit sur la base de l'expression de l'enveloppe, soit sur la base de l'expression du gène marqueur (par exemple par culture en milieu antibiotique). Ces cellules peuvent alors être maintenues en culture, ou clonées et/ou conservées sous forme congelée, par exemple. L'invention réside également dans l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un vecteur tels que définis ci-avant pour la production d'une cellule de packaging de rétrovirus. L'invention réside en outre dans une méthode de production d'une cellule de packaging de rétrovirus, comprenant l'introduction, dans une cellule compétente, d'un acide nucléique ou d'un vecteur tels que définis ci-avant et d'un ou plusieurs acides nucléiques codant pour les protéines rétrovirales gag et pol. Les différents acides nucléiques peuvent être introduits de manière simultanée ou séquentielle, dans un ordre indifférent. Les cellules compétentes sont toutes cellules telles que définies ci-avant. Comme indiqué ci-avant, les protéines chimériques préférées de l'invention présentent des propriétés fonctionnelles avantageuses, telles que notamment une absence de fusogénicité. Ainsi, alors que les protéines GALV connues jusqu'à présent induisent une fusion de cellules humaines les produisant, les protéines d'enveloppe chimériques de l'invention sont préférentiellement dépourvues de cet inconvénient. Ces enveloppes peuvent donc être utilisées avantageusement pour la production de rétrovirus recombinants dans des cellules humaines. Ceci représente un avantage important par rapport à l'art antérieur, puisque les rétrovirus produits dans les lignées classiques (fibroblastes murins) possèdent des déterminants antigéniques murins et sont donc potentiellement immunogènes. L'invention a aussi pour objet un procédé de production de rétrovirus recombinants défectifs, comprenant l'introduction, dans une cellule de packaging selon l'invention, d'un vecteur rétroviral, et la récupération des virus recombinants produits. Les virus produits peuvent être récupérés par toute technique classique, telle que récolte du surnageant, éventuellement purification des rétrovirus par des étapes de centrifugation et/ou chromatographie. L'invention a également pour objet tout rétrovirus comprenant, dans sa structure, une protéine d'enveloppe telle que décrite ciavant. Il s'agit plus particulièrement d'un rétrovirus recombinant, en particulier défectif, par exemple produit selon le procédé décrit ci-dessus. L'invention concerne en outre l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, notamment de séquence SEQ ID NO: 3 ou d'un variant ou acide nucléique correspondant, pour réduire la fusogénicité d'une protéine d'enveloppe. Compte tenu des propriétés fusogéniques de la protéine d'enveloppe native de GALV et de ce fait de sa toxicité vis-à-vis des cellules possédant le récepteur Glvr-1 de GALV, la protéine fusogénique pourrait être exprimée dans un rétrovirus produit par des cellules de packaging qui sont dépourvues du récepteur Glvr-1, par exemple des cellules murines. Le vecteur rétroviral ainsi produit, introduit dans des cellules humaines cibles (par exemple des cellules cancéreuses, des cellules infectées par un virus ou produites dans le cas de maladies autoimmunes) conduirait à une réaction toxique pour ladite cellule, résultant du caractère fusogénique. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des Figures FIGURE 1 : Séquence de la partie 3' du génome du virus GALV (incluant le gène d'enveloppe et le codon STOP à la position 668 de la protéine (SEQ ID NO: 1). FIGURE 2 : Séquence de la protéine d'enveloppe du rétrovirus 4070A. Le domaine cytoplasmique s'étend des résidus 635 à 667. Exemples Exemple 1 Constructions génétiques codant pour une enveloppe GALV non fusogénique. 1.1. Plasmides et constructions. Le plasmide CMV-GALV (Chapel-Fernandes et al., 1998) exprime le gène env codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus GALV (gibbon ape leukemia virus). Les sites Nsil et Clal sont uniques à l'extrémité 3' du gène env et servent à cloner les fragments suivants : - CT1, dont l'extrémité 3' (nt 7663) est dans le LTR (long terminal repeat, début: nt 7651) de GALV, - CT2, CT3, et CT4 dont les extrémités 3' (respectivement aux positions 7606,7588 et 7552) sont dans la région située entre le gène env et le LTR. Les positions ci-dessus sont données par référence à la séquence génomique de GALV. Ces fragments sont obtenus par PCR au moyen d'un oligonucleotide "upper" commun (OUGalv5'Nsi), et d'oligonucléotides "lower" uniques pour chaque fragment (OLCT1 Cla, OLCT2Cla, OLCT3Cla, et CLCT4Cla), apportant un codon stop dans les trois cadres de lecture et en particulier celui propre au gène env, suivis d'un site Clal. Les séquences des oligonucléotides, obtenus à partir de la séquence du GALV (Delassus et al, Virology 173 (1989) 205), sont : OUGalv5'Nsi (SEQ ID NO: 4) : 5'-GAGCGCCAGAAAAGCCAAAACTGGTATGAAGG OLCT1 Cla (SEQ ID NO: 5) : 5'- GATCATCGATTATTTATTTACACTTCTTTCATTCCCCCATTTCTCTTGTG OLCT2Cla (SEQ ID NO: 6) : 5'-GATCATCGATTATTTATTTAAAGGTTACCTTCGTTCTCTAGGGCCTGA OLCT3CIa (SEQ ID NO: 7) : 5'-GATCATCGATTATTTATTTATAGGGCCTGATATTTTGTCTAAGGACCA GAA OLCT4Cla (SEQ ID NO: 8) : 5'- GATCATCGATTATTTATTTAACATGCACTTATCCTATCATTGATGAAT TGA Les fragments d'ADN obtenus par PCR ont été ensuite purifiés, digérés par les enzymes Nsil et Clal, et clonés dans le plasmide CMV-GALV ouvert aux sites Nsil et Clal. Les quatre plasmides résultants codent pour les enveloppes dénommées GALV-CT1, GALV-CT2, GALV-CT3 et CMV-GALVCT4. Les plasmides FBASALF (Cosset et al., J. Virol. 69 (1995) 7430) et FBARIessSALF (Lavillette et al., J. Virol. 1998, In press) codent pour des enveloppes amphotropes, non fusogéniques (enveloppe A) et fusogéniques (enveloppe Arless), respectivement. Ces plasmides sont utilisés comme contrôles négatifs et positifs dans les tests de syncytium. 1.2 Cellules et tests de fusion. Les cellules humaines TE671 sont issues d'un rhabdomyosarcome humain (ATCC CRL8805), et les cellules NIH-3T3 sont des fibroblastes de souris. Les tests de fusions sont réalisés comme publié antérieurement (Lavillette et al., 1998). Les cellules TE671 ensemencées à 5x106 cellules dans des boîtes de 35 mm de diamètre sont transfectées avec 2 g des divers plasmides par la technique de phosphate de calcium. 48 hrs post-transfection, les cellules sont trypsinées et ré-ensemencées dans des boîtes de 35 mm de diamètre à une densité de 2x106 cellules par boîte. Après adhésion de ces cellules productrices de glycoprotéines d'enveloppes, des cellules indicatrices (soit TE671, soit 3T3) sont ajoutées, à une densité de 2x106 cellules par boîte. Les cocultures sont alors maintenues pendant 24-48 hrs et les syncytium sont comptés après fixation au May-Grunwald-Giemsa. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 Enveloppea Fusogénicité (Syncytia)b 3T3 TE671 A Arless + + GALV-CT1- GALV-CT2- GALV-CT3- +/GALV-CT4- + a : Enveloppe exprimée dans les TE671 transfectées. b : Formation de syncytium dans les cocultures des cellules productrices d'enveloppes avec les 3T3 ou avec les TE671 1. 3. Conclusions Les résultats présentés dans le Tableau 1 ci-dessus montrent que l'enveloppe GALV de type sauvage, exprimée à partir d'une construction génétique constituée essentiellement de la séquence codante (i.e., jusqu'au codon stop) présente une phénotype fusogénique important dans les cellules humaines (GALV-CT4). En revanche, de manière surprenante, l'enveloppe GALV codée par un vecteur d'expression dans lequel la séquence issue de GALV contient le gène env et une partie au moins de la région située entre ce gène et le LTR3' (ainsi que, le cas échéant, un morceau de LTR3') n'est pas fusogénique en test de syncytium (GALV-CT1, GALV-CT2, voir SEQ ID NO: 1). Quand on étend cette séquence à partir de l'extrémité 3' (enveloppe CT4 à CT1), on révèle donc progressivement un phénotype non-fusogénique. On en déduit qu'il existe, en 3' de la séquence publiée du gène env, une séquence qui contrôle négativement la fusogénicité de l'enveloppe. Cette fusogénicité semble être spécifique du résultat d'une interaction avec le récepteur du GALV (PiT-1) car seules les cellules PiT-1 positives (les TE671) sont capables de former des syncytia. Exemple 2 : Constructions génétiques codant pour une enveloppe GALV nonfusogénique. 2. 1. Constructions génétiques . Plasmide pGALV-1 L'ADNc de l'enveloppe de GALV a été cloné par PCR à partir du vecteur d'expression pMOV GALV (Miller et al., J. Virol. 65 (1991) 2220) dans le plasmide commercial pCI (Stratagène) aux sites Nhe1 et Xbal. L'ADNc cloné à une taille de 2004 paires de bases (nt 5552 (ATG du gène) au nt 7555 (codon stop), Delassus et al. J. Virol. 1989) (voir SEQ ID NO: 1). Oligonucléotide 5' Nhe1 (SEQ ID NO: 9) 5'-GCTAGCATGGTATTGCTGCCTGGGTCCATGCTTCTCACCT-3' Oligonucléotide 3' Xba1 (SEQ ID NO: 10) 5'-TCTAGATTAACATGCACTTATCCTATCATTG . Plasmide pGALV-2 L'ADNc du gène de l'enveloppe GALV est obtenu par PCR, la partie 3' du gène est prolongée jusqu'au site Fst1 qui se situe dans le long terminal repeat (LTR). L'ADNc cloné dans le plasmide pC1 aux sites Nhe1-Xba1 a une taille de 2118 paires de bases (nt 5552 au nt 7670, Delassus, 1989) (voir SEQ ID NO: 1). Oligonucléotide 5' Nhe1 (SEQ ID NO: 9) 5'-GCTAGCATGGTATTGCTGCCTGGGTCCATGCTTCTCACCT-3' Oligonucleotide 3' Xba1 (SEQ ID NO: 11 ) 5'-TCTAGAAGTTGGCTAAAAAAAAACACTTCTTTCATTCC-3' . Plasmide témoin Le plasmide pCMV-4070A est le plasmide pCI dans lequel est cloné dans les sites Nhe1-Xba1, l'ADNc du gène de l'enveloppe amphotrope 4070A (nt 37 au nt 2001, Ott et al. 1990). 2. 2. Lignées cellulaires La lignée cellulaire humaine H293 est une lignée cellulaire embryonaire de rein (ATCC CRL-1573). Les cellules NIH-3T3 sont des fibroblastes de souris. Les cellules TelCeb6 sont des cellules dérivées de la lignée humaine TE671 issues d'un rhabdomyosarcome humain (ATCC CRL 8805) (Cosset FL, Lyon). 2. 3. Etude de fusogénicité Les plasmides p-GALV-1 et p-GALV-2 ont été transfectés dans les cellules H293, NIH-3T3 et TelCeb6 par la méthode de phosphate de calcium. 5 g de plasmides ont été transfectés dans chaque lignée cellulaire en boite de petri de 60 mm. 24 h après la transfection le milieu est changé. La présence ou l'apparition de fusion cellulaire sont observées dans les 48 h à 72 h post transfection, selon la méthode décrite dans l'exemple 1. 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Plasmides fusogénicité Fusogénicité Fusogénicité sur NIH-3T3 sur Telceb6 sur H293 pas de plasmide 0 0 0 pCMV-4070a 0 0 0 pGALV-1 0 ++ ++ pGALV-2 0 0 0 2. 4. Conclusion Nous avons montré que l'enveloppe GALV (exprimée à partir du plasmide pGALV-1) pouvait entraîner une forte fusogénicité des cellules qui possèdent le récepteur PiT-1 du GALV (cellules Telceb6 et H293). Les résultats obtenus montrent que cette fusogénicité est abolie quand on prolonge la partie 3' de la séquence exprimée, notamment de 100 pb environ (pGALV2). La séquence du virus GALV, entre le codon stop de l'enveloppe et la région LTR 3' a été analysée, dans les 6 cadres de lecture possibles. De manière surprenante, cette analyse a permis de mettre en évidence, dans un cadre de lecture différent de celui de l'enveloppe, un phase de lecture codant pour une protéine de 17 acides aminés. La séquence de cette protéine est la suivante : Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg Glu Arg Arg (SEQ ID NO: 3) En outre, une recherche d'homologie a pu montrer que cette séquence est conservée dans un autre virus simien, ce qui renforce le rôle fonctionnel de cette protéine. Cette protéine est codée par les résidus de nucléotides aux positions 1998 à 2046 de la séquence SEQ ID NO: 1. Cette séquence est donc présente dans les constructions génétiques, pGALV-2, GALV-CT1, et GALV-CT2, qui expriment une enveloppe non fusogénique (cf. Tableaux 1 et 2). Cette séquence est également présente partiellement (à l'exception des 9 nucléotides en 3') dans la construction génétique GALV-CT3, qui exprime une enveloppe faiblement fusogénique (cf. Tableau 1). En revanche, cette protéine est absente des constructions GALV-CT4 et pGALV1, qui expriment une enveloppe GALV fusogénique (cf. Tableaux 1 et 2). Cette protéine, et ses variants fonctionnels, ont donc la capacité d'inhiber la fusogénicité de l'enveloppe rétrovirale GALV. Exemple 3 Constructions génétiques codant pour une enveloppe chimérique. 3. 1. Construction du plasmide pGALV-3 La partie cytoplasmique du gène de l'enveloppe GALV (nt 7501 au nt 7555, Delassus, 1989) a été remplacée par la partie cytoplasmique du gène de l'enveloppe du virus amphotrope 4070A (nt 1903 au nt 2001), SEQ ID NO: 2. L'ADNc cloné dans le plasmide pCI a donc une taille de 2061 paires de bases. Cet ADN chimérique a été construit comme suit : 1) par PCR on a obtenu un fragment s'entendant de l'acide aminé 635 à l'acide aminé 667 de la séquence SEQ ID NO: 2. 2) on a remplacé les acides aminés 655 à 668 de la séquence SEQ ID NO: 1 par le fragment obtenu dans l'étape 1) ci-dessus. 3. 2. Etude de fusogénicité Les plasmides p-GALV-1 et p-GALV-3 ont été transfectés dans les cellules H293, NIH-3T3 et TelCeb6 par la méthode de phosphate de calcium. 5 g de plasmides ont été transfectés dans chaque lignée cellulaire en boite de petri de 60 mm. 24 h après la transfection le milieu est changé. La présence ou l'apparition de fusion cellulaire sont observées dans les 48 h à 72 h post transfection, selon la méthode décrite dans l'exemple 1. 2. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Plasmides fusogénicité Fusogénicité Fusogénicité sur NIH-3T3 sur Telceb6 sur H293 pas de plasmide 0 0 0 pCMV-4070a 0 0 0 pGALV-1 0 ++ ++ pGALV-3 0 0 0 Ces résultats montrent de manière surprenante qu'une enveloppe chimérique, comprenant un domaine extracellulaire et transmembranaire fonctionnel de type GALV, et un domaine cytoplasmique hétérologue, est dépourvue de phénotype fusogénique, lorsqu'elle est exprimée dans une cellule humaine exprimant le récepteur PiT-1. Ces résultats illustrent les propriétés avantageuses des méthodes et compositions selon la présente invention. REVENDICATIONS 1. Protéine d'enveloppe chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie du domaine extracellulaire de l'enveloppe du virus GALV ou d'un variant fonctionnel de celui-ci. 2. Protéine d'enveloppe chimérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie du domaine extracellulaire et du domaine transmembranaire de l'enveloppe du virus GALV. 3. Protéine d'enveloppe chimérique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend un domaine cytoplasmique d'une enveloppe hétérologue. 4. Protéine d'enveloppe chimérique selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'enveloppe hétérologue est une enveloppe amphotrope. 5. Protéine d'enveloppe chimérique selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'enveloppe amphotrope est l'enveloppe 4070A. 6. Protéine d'enveloppe chimérique, caractérisée en ce qu'elle comprend une région de l'enveloppe GALV consistant en tout ou partie de la séquence correspondant aux résidus 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO: 1. 7. Protéine d'enveloppe chimérique caractérisée en ce qu'elle comprend une région consistant en la séquence correspondant aux résidus 1 à 655 de la séquence SEQ ID NO: 1 et une région consistant en la séquence correspondant aux résidus 635 à 667 de la séquence SEQ ID NO: 2. 8. Acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'à un nucléotide compris entre les positions 2037 et 2129 inclus de la séquence SEQ ID NO: 1. 10. Acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'à un nucléotide compris entre les positions 2046 et 2129 inclus de la séquence SEQ ID NO: 1. 11. Acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide 2055 de la séquence SEQ ID NO: 1. 12. Acide nucléique codant pour une protéine d'enveloppe GALV, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide 2046 de la séquence SEQ ID NO: 1. 13. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 12. 14. Cellule comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13. 15. Cellule de packaging de rétrovirus, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13 et un acide nucléique codant pour les protéines gag et pol d'un rétrovirus. 16. Cellule selon les revendications 14 ou 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de mammifère, de préférence humaine. 17. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 8 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13 pour la production d'une cellule de packaging de rétrovirus. 18. Procédé de production de rétrovirus recombinants défectifs, comprenant l'introduction, dans une cellule selon la revendication 15, d'un vecteur rétroviral, et la récupération des virus recombinants produits. 19. Polypeptide comprenant la séquence Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg Glu Arg Arg ou un fragment de celle-ci comprenant au moins 5 résidus consécutifs. 20. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence Met Leu Lys Phe Trp Ser Leu Asp Lys Ile Ser Gly Pro Arg Glu Arg Arg ou d'un variant de celle-ci, ayant une activité anti-fusogénique.