Brevet FR2791998A1 — publié le 20001013

LACTOCOQUES MODIFIES EXPRIMANT UNE CATALASE ET LEURS UTILISATIONS La présente invention est relative à des bactéries probiotiques modifiées exprimant des molécules anti-oxydantes. Des radicaux libres dérivés de l'oxygène sont continuellement produits par le métabolisme cellulaire normal, et notamment lors de la réduction de l'oxygène moléculaire en H20 par la chaîne respiratoire. On désigne sous le terme de : " radicaux libres dérivés de l'oxygène " un ensemble d'espèces chimiques regroupant notamment l' anion superoxyde O2-#, les radicaux hydroxyle OH., l'oxygène singulet 1O2#, les radicaux peroxyles ROO , ainsi que l'eau oxygénée, H2O2. Ces espèces sont extrêmement réactives et capables d'endommager des constituants cellulaires tels que l'ADN, les protéines, et les phospholipides membranaires [FRIDOVICH, Science, 201,875-880, (1978) ; PRYOR, Photochem. Photobiol., 28,787-801, (1978) ; CERUTTI, Science, 227,375-381, (1985) ; BOREK, Br. J. Cancer, 55,74-86, (1987) ]. Les radicaux oxygénés sont donc potentiellement toxiques et mutagènes, et ils interviennent notamment dans le développement des réactions inflammatoires et la carcinogenèse. Cependant, ils participent également au bon fonctionnement de la cellule : ils sont par exemple impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire [REMACLE et al., Mutation Res., 316,103-122, (1995)], ainsi que dans la résistance aux agents infectieux. Pour contrôler le niveau des radicaux libres oxygénés produits en conditions physiologiques, les cellules disposent d'enzymes antioxydantes (superoxyde dismutase, catalase, glutathion peroxydase, etc...), et de molécules piégeuses de radicaux (glutathion, vitamine E,...) [RICE-EVANS et BURDON, New Comprehensive Biochemistry, 28, (1994)]. Ces mécanismes naturels de protection sont toutefois insuffisants en cas de stress oxydant résultant de la surproduction de radicaux libres oxygénés, notamment lors de l' exposition à des radiations ionisantes ou à certaines substances chimiques. Plusieurs études réalisées sur des modèles animaux, ont ainsi montré des modifications du métabolisme antioxydant dans différents organes après exposition à des radiations ionisantes [PELTOLA et al., J. Androl., 14,267-274, (1993) ; HARDMEIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7572-7576, (1997) ]. Dans la muqueuse intestinale, une étude ancienne met en évidence une baisse importante de l'activité antioxydante (BARBER et WILBUR, Radiation Res., 10,167-175, (1959)] ; plus récemment, une baisse de vitamine B12 (molécule antioxydante) a été décrite [DANNIELSSON et al., Gut, 32, 1180-1187, (1991) ]. Chez l'homme, le traitement par radiothérapie des tumeurs abdominales induit une toxicité intestinale qui entraîne l'interruption du traitement chez 20% des patients [BLAIR et al., J. Surg. Res., 65, 165-168, (1996) ]. Au niveau de l'épithélium intestinal, cette toxicité se traduit par une réduction du nombre et de la taille des villosités et par l'apparition de zones nécrosées [FRIBERG, Thesis, University of Lund, Sweden, (1980) ; HAUER-JENSEN, Acta Oncol., 29,401-415, (1990) ; POTTEN, Nature, 269,518-529, (1977) ; POTTEN, Int. J. Radiat. Biol., 58, 925-973, (1990) ]. Cet effet direct sur la muqueuse gastrointestinale est en outre aggravé par une translocation de la microflore intestinale [DANNIELSSON et al., Gut, 32, 1180-1187, (1991) ], résultant de la destruction d'une grande partie de celle-ci, composée de bactéries anaérobies présentant une très grande sensibilité aux stress oxydants [WELLS, Antonie van Leeuwenhoek, 58,87- 93, (1990) ; BENNO et MITSUOKA, J. Vet. Med. Sci., 54, 1039-1041, (1992) ], et du développement de bactéries pathogènes se traduisant par l'apparition d'infections. Des études ont mis en évidence l'efficacité des antioxydants contre les effets mutagènes et toxiques des radiations ionisantes. Certains dérivés sulfhydryle s'avèrent très efficaces in vitro ; malheureusement leur forte toxicité in vivo limite leur utilisation chez l'homme [DELANEY et al., Cancer, 74,2379-2384, (1994) ; PRASAD, Handbook of Radiobiology, 2nd edition, 61-84, (1995) ]. L'effet protecteur d'autres molécules antioxydantes (telle que la vitamine E) a été observé après irradiation ex vivo du tractus digestif [MAISIN et LAMBIET-COLLIER, Int. J. Radiat. Biol., 13,35-43, (1967) ] ; FELEMOVICIUS et al., Ann. Surg. 222,504-508, (1995) ]. De plus, une étude récente de BLAIR et al., (1996) suggère un effet protecteur in vivo L-2-oxo-4thiazolidine, précurseur du glutathion, qui permettrait de limiter le syndrome gastro-intestinal en diminuant, entre autres, la translocation bactérienne. Pour protéger l'épithélium intestinal et réduire la translocation de la microflore intestinale, il a également été proposé d'utiliser des bactéries probiotiques. Les organismes probiotiques sont définis comme des : "organismes vivants qui après ingestion en certaines quantités exercent des effets bénéfiques pour la santé allant au-delà des vertus nutritives inhérentes de base" [F. A.O., (1992)]. Les bactéries probiotiques sont des bactéries non-pathogènes pouvant influer de manière bénéfique sur la santé de leur hôte. Il s'agit généralement de bactéries lactiques des genres Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus et Lactococcus, couramment utilisés dans l'industrie laitière. Ces bactéries sont capable de survivre dans le tractus digestif où elles restent métaboliquement actives sans supplanter la microflore intestinale [SALMINEN et al., Antonie van Leeuwenhoek, 70,347-358, (1996) ]. Leur durée de transit dans le tractus digestif est variable et va d'une journée pour Lactococcus lactis, à neuf jours pour Lactobacillus plantarum [WELLS et al., Antonie van Leeuwenhoek, 70, 317-330, (1996)]. Au cours des dernières années, de nombreuses études, parfois contradictoires, sur les effets de l'ingestion d'aliments fonctionnels (tel que les yaourts) ou de bactéries ont été publiées. Certaines d'entre elles décrivent un effet positif de l'ajout de probiotiques dans l'alimentation vis-à-vis des conséquences d'un stress oxydant, induit par exemple par une radiothérapie. Ainsi, des laits fermentés par des lactobacilles ou des lactocoques permettraient : a) d'augmenter la survie de souris après irradiation ; b) de diminuer les diarrhées de patients survenant à la suite de traitement par rayonnements [SALMINEN et al., Clinic. Radiol., 39,435-437, (1988) ; HENRIKSSON et al., Supp. Care Cancer, 3,81-83, (1995) ], et c) de favoriser la réimplantation de la microflore autochtone [CUZZOLIN et al., J Chemother, 4, 176-179 (1992)]. L'ingestion de bactéries probiotiques (principalement des lactobacilles) aurait également un effet contre le développement des pathogènes ; ainsi, elle limiterait les infections par Salmonella typhimurium [ALM, Prg. Fd. Nutr. Sci., 7,13-17, (1983) ] ; HUDAULT et al., Appl. Environ. Microbiol., 63,513-518, (1997) ], Listeria monocytogenes [SATO, Infect Immun., 44,445-451, (1984) ], Escherichia coli [UNDERDAHL, Prog. Fd. Nutr. Sci., 7,5-12, (1983)] et protégerait des souris immunodéprimées contre le développement de candidioses [WAGNER et al., Infect Immun. 65,4165-4172, (1997)]. La mobilité intestinale semble également être augmentée par l'ingestion de lait fermenté avec des bifidobactéries [SEKI et al., Nutr. Food, 4,379-387, (1978) ]. Cependant, les bactéries lactiques utilisées en tant que probiotiques ne possèdent que de très faibles capacités de détoxication des radicaux oxygénés. En effet, la plupart d'entre elles ne possède pas l'ensemble de l'équipement enzymatique nécessaire à la neutralisation de ces radicaux [CODON, FEMS Microbiol. Rev., 46,269-280, (1987)]. Les Inventeurs ont recherché s'il était possible d'exprimer chez ces bactéries probiotiques des enzymes antioxydantes actives, sans pour autant interférer avec leur métabolisme naturel. Dans ce but, ils ont entrepris le clonage chez Lactococcus lactis d'un gène codant pour une catalase (EC 1.11.1.6).Lactococcus lactis ne possède aucune activité catalase naturelle, et ne fournit donc pas a priori l'environnement nécessaire à l'expression de cette activité ; notamment, ne fabrique pas l'hème constituant le groupe prosthétique des catalases. Les Inventeurs sont toutefois parvenus à exprimer la catalase hétérologue sous forme active, en ajoutant de l'hème au milieu de culture de L. lactis ; ils ont en effet constaté que l'hème était importée dans la bactérie et normalement intégrée dans la catalase synthétisée, et que l'expression de cette catalase active ne nuisait pas à la croissance et à la survie de L. lactis. En outre, les Inventeurs ont constaté que l'expression de la catalase hétérologue protégeait contre un stress oxydant non seulement les bactéries-hôte, mais également les autres bactéries présentes dans la même culture. De plus, ils ont également constaté que les lactocoques transformés exprimant la catalase hétérologue protégeaient in vitro des cellules d'épithélium intestinal en culture contre les effets d'un stress oxydant induit notamment par un rayonnement ionisant, et possédaient également in vivo des effets protecteurs sur des souris irradiées, en présence ou en absence de bactéries pathogènes. La présente invention a pour objet une souche de lactocoque, en particulier une souche de Lactococcus lactis, transformée par un gène codant pour une catalase hétérologue. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit gène code pour une catalase procaryote. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit gène est le gène katB de B. subtilis. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une catalase par une souche de lactocoque conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de ladite souche en présence d'hème. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une souche de lactocoque conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament destiné à protéger des cellules contre un stress oxydant. Lesdites cellules sont notamment des cellules de la paroi intestinale, en particulier de l'épithélium intestinal. Il peut également s'agir des bactéries de la flore intestinale ; l'administration d'une souche de lactocoque conforme à l'invention permet de protéger, en cas de stress oxydant, les espèces bactériennes sensibles au stress, et ainsi de maintenir l'équilibre de la flore intestinale. Selon un mode de mise en #uvre préféré de la présente invention, ledit médicament permet de protéger lesdites cellules contre un stress oxydant induit par un rayonnement, et est donc particulièrement approprié pour le traitement des affections gastrointestinales consécutives à une radiothérapie. Il peut toutefois également être utilisé dans toute autre pathologie gastro-intestinale dans laquelle intervient une production excessive de radicaux libres oxygénés, et notamment toutes les pathologies inflammatoires. La présente invention permet d'acheminer de façon simple, et à faible coût, les molécules d'intérêt thérapeutique directement au voisinage des cellules sensibles ou exposées aux stress oxydants sans affecter l'organisme dans sa totalité. La présente invention a en outre pour objet un procédé pour protéger in vitro des cellules contre un stress oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence des cellules à protéger et d'au moins une souche de lactocoque conforme à l'invention, dans les conditions définies ci-dessus, de production de catalase par ladite souche. Selon un mode de mise en #uvre préféré de ce procédé, lesdites cellules sont des bactéries probiotiques, notamment des bactéries lactiques. Le procédé conforme à l'invention peut ainsi être mis en #uvre pour la préparation d'un aliment fermenté associant au moins une souche de lactocoque conforme à l'invention à d'autres bactéries probiotiques. La présente invention englobe également tout aliment fermenté comprenant au moins une souche de lactocoque conforme à l'invention, éventuellement associée à d'autres bactéries probiotiques. Des aliments fermentés conformes à l'invention agissent à deux niveaux : d'une part, de par la présence des lactocoques conformes à l'invention, ils ont un effet direct de détoxication des radicaux libres ce qui permet de protéger l'épithélium intestinal et la microflore ; d'autre part, de par l'action probiotique des lactocoques conformes à l'invention, ainsi que des autres bactéries qui y sont éventuellement associées, ces aliments agissent en tant que protecteur de l'épithélium intestinal et de barrière contre les pathogènes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant l'obtention et l'utilisation d'une souche bactérienne conforme à l'invention. EXEMPLE 1 : OBTENTION D'UNE SOUCHE DE L. LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B. SUBTILIS Le gène katB de Bacillus subtilis code une catalase (Numéro d'accès SWISS-PROT : P42234) dont la synthèse est induite chez Bacillus subtilis lors d'un stress thermique ou salin, de l'addition d'éthanol ou de la privation en glucose. Le gène katB a été amplifié par PCR à partir du chromosome de la souche 168 de B. subtilis [ANAGNOSTOPOULOS et SPITZIZEN, J. Bacteriol., 81,741-746, (1961) ] en utilisant des amorces permettant d'obtenir la séquence codante du gène avec le site de fixation des ribosomes et son terminateur, et modifiées pour contenir des sites de restriction : amorce sens : 5'-AATGTGCTCTAGAATGTTTCGTTTTAAA-3', contenant un site XbaI ; amorce anti-sens : 5'-TTTTCCTCGAGTTCGTAAGCTTCAGTGAGC-3', contenant un site XhoI. L'amplification [5 mn 96 C, (15 s. à 96 C, 15 s. à 50 C, 2min 50 s. à 72 C) 30fois] a été faite avec 5 unités de Vent Polymérase [NEW ENGLAND BIOLABS] en présence de 4 mM de MgS04. Un fragment de la taille attendue (2180 pb) a été obtenu. Ce fragment a ensuite été cloné, sous contrôle du promoteur du gène de la P-galactosidase aux sites XbaI-XhoI de pBSKS+ (STRATAGENE) dans la souche E. coli TG1. Le plasmide obtenu, dénommé pBSKSkatB a ensuite été transféré dans la souche MG1655 katE katG de E. coli [DUKAN et TOUATI, J. Bacteriol., 178,6145-6150, (1996)] dépourvue d'activité catalase. Après avoir vérifié la présence du plasmide pBSKSkatB dans les bactéries transformées, l'activité catalase a été recherchée selon le protocole décrit par AERI, [Methods in Enzymology, 105,121-127, (1984) ]. Aucune activité catalase n'a été observée dans ces conditions. Le promoteur p23 [VAN DER VOSSEN et al., Appl. Environ. Microbiol., 53,2452-2457, (1987) ] de L. lactis a ensuite été cloné dans les sites NotI-XbaI du plasmide pBSKSkatB. Le plasmide obtenu, dénommé pBSKSp23katB, comprenant le gène katB sous contrôle du promoteur p23, a été introduit dans la souche MG1655 katE katG de E. coli. On observe dans la souche transformée une activité catalase, déterminée selon le protocole indiqué cidessus. Le fragment NotI-XhoI contenant le promoteur p23 et le gène katB a ensuite été transféré sur le plasmide pILNewl3 [RENAULT et al., Gene, 183,175-182, (1996) ]. Le plasmide résultant est dénommé pILN13p23KatB. Plusieurs essais effectués sur différentes souches de L. lactis n'ayant pas permis d'introduire directement ce plasmide chez cette bactérie, le plasmide pILN13p23KatB a été introduit dans la souche 168 de B. subtilis, et un dérivé à bas nombre de copies de ce plasmide a été fabriqué par délétion d'un fragment KpnI. Le plasmide résultant, dénommé pILN5p23KatB a ensuite été introduit dans la souche MG1363 de L. lactis [GASSON, J. Bacteriol., 154,1-9, (1983) ]. Après avoir vérifié la présence du plasmide pILN5p23KatB dans les bactéries transformées, l'activité catalase a été recherchée selon le protocole indiqué cidessus. Aucune activité catalase n'a été observée. De l'hème (sous forme d'hémine) a été ajoutée au milieu de culture à une concentration de 0,5 mg par litre de milieu. Dans ces conditions de culture, aucune activité catalase n'a été observée lors de la phase de croissance exponentielle. En revanche, une forte activité catalase apparaît au cours de la phase stationnaire. Le fragment NotI-XhoI contenant le promoteur p23 et le gène katB a également été cloné sur les plasmides pGhost4, pG+host9, pGK12 [KOK et al., Appl. Environ. Microbiol. 48,726-731, (1984)] (plasmides à haut nombre de copies se répliquant par un mécanisme dit de cercle roulant dans E. coli et de nombreuses bactéries à Gram-positif, notamment B. subtilis et L. lactis) et introduit dans plusieurs souches de E. coli et de L. lactis où une activité catalase a pu être observée dans les conditions précédemment décrites. Un cointégrat pBSKS+ (plasmide réplicatif de E. coli) et pVS41 [VON WRIGHT et SAARELA, Plasmid, 31, 106-110, (1994) ] (plasmide à haut nombre de copies se répliquant par un mécanisme dit de cercle roulant dans E. coli et L. lactis) contenant le promoteur p23 et le gène katB a également été introduit dans plusieurs souches de E. coli et L. lactis où une activité catalase a pu être observée dans les conditions précédemment décrites. EXEMPLE 2 : EFFETS ANTI-OXYDANTS IN VITRO D'UNE SOUCHE DE L. LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B. SUBTILIS 1) Effet sur la survie de souches bactériennes après un stress oxydant L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène katB introduit dans Lactococcus lactis a été testé sur la bactérie hôte, ainsi que sur d'autres bactéries (Lactococcus lactis, Escherichia coli Lactobacillus fermentum) soumises à un stress oxydant. Matériels et méthodes : Cultures bactériennes Les cultures ont été effectuées dans les conditions suivantes : - souche de Lactococcus lactis productrice de catalase : Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu M17 supplémenté avec 1% de glucose (M17glu) puis incubées à 30 C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu M17glu, supplémenté avec de l'hémine à la concentration de 50 mg/ml, puis incubée à 30 C pendant 24 heures. Préalablement au test, les bactéries sont centrifugées et resuspendues en M17, à la concentration de 108 cellules/ml. - souches non productrices de catalase : *Lactococcus lactis : Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu M17glu puis incubées à 30 C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu M17glu, puis incubée à 30 C jusqu'au moment du test. *Escherichia coli: Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu LB puis incubées à 30 C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu LB, puis incubée à 37 C avec agitation jusqu'au moment du test. *Lactobacillus fermentum . Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu MRS puis incubées à 37 C pendant 18 heures dans une jarre d'anaérobiose. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu MRS, puis incubée à 37 C jusqu'au moment du test. Induction du stress Lorsque la culture a atteint une D0600 de 0,1, un stress oxydant est induit par addition de 10 mM de H202 au milieu de culture, et incubation pendant 30 minutes à 30 C pour et 37 C pour Escherichia coli et Lactobacillus fermentum. Le pourcentage de bactéries survivantes est estimé par étalement sur boîte de dilutions successives des prélèvements effectués dans les cultures avant et à l'issue du traitement, et comptage des colonies. Des expérimentations sont effectuées en présence de Lactococcus lactis transformé producteur de catalase, ou de Lactococcus lactis non transformé ; dans les 2 cas l'ajout des lactocoques est effectué, à raison de 107 ou 108 cellules/ml, juste avant l'addition du peroxyde d'hydrogène. Résultats Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 1 : A - Survie des cellules de lactocoques sauvages (CAT-) ou productrices de catalase (CAT+) ; B - Survie de lactocoques sauvages (CAT-) incubés avec 107 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+) ; C - Survie des cellules d'Escherichia coli (E. coli) incubés avec 107 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+). D - Survie des cellules de Lactobacillus fermentum (L. fermentum) incubés avec 107 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+). Ces résultats montrent que : 1) La survie de la souche de Lactococcus lactis productrice de catalase est augmentée d'environ 1000 fois (survie de la souche sans catalase =10 , avec catalase =5 x 10-1). 2) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche de L. lactis non productrice de catalase : la survie de 108 lactocoques catalase moins est de 10-4; elle augmente de 50 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 100% en présence de 108 lactocoques catalase plus. 3) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche d'Escherichia coli non productrice de catalase : la survie de 108 E. coli est de 10-3; elle augmente de 50 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 100% en présence de 108 lactocoques catalase plus. Par contre la survie n'est pas améliorée en présence de lactocoques catalase moins (résultats non représentés). 4) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche de Lactobacillus fermentum non productrice de catalase : la survie de 108 L. fermentum est de 5 x 10-6; elle augmente de 200 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 3 x 10-2 en présence de 108 lactocoques catalase plus. Par contre la survie n'est pas améliorée en présence de lactocoques catalase moins (résultats non représentés). Conclusions: L'introduction du gène catalase augmente la résistance de L. lactis à un stress oxydant. La présence de L. lactis produisant la catalase augmente la résistance à un stress oxydant de souches bactériennes n'exprimant pas de catalase. 2) Effet sur la survie de cellules coliques humaines après un stress oxydant. L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène katB introduit dans Lactococcus lactis a été testé sur des cellules coliques humaines en culture exposées à un stress induit par un produit oxydant (H202). Matériels et méthodes : Cellules humaines : cellules de la lignée épithéliale colique humaine HT29 Protocole expérimental : les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits (2000 cellules par puits). Au moins 8 puits différents sont réalisés pour chaque condition expérimentale. Après 3 jours de culture, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du milieu de culture de cellules eucaryotes contenant les bactéries à tester (5 x 108 par ml de culture), préalablement cultivées comme indiqué en 1) ci-dessus. Après 1 heure de contact cellules-bactéries, on ajoute du peroxyde d'hydrogène à différentes concentrations (0,100, 200 et 400 uM) . Après 2 heures d'incubation, le milieu contenant les bactéries est éliminé et remplacé par du milieu de culture normal. La mesure de la prolifération cellulaire est effectuée 24 heures après, par deux techniques couramment utilisées pour les tests de toxicité : 1) test au rouge neutre, 2) test au MTT (sel de tétrazolium). L'analyse statistique des résultats est réalisée par un test t. Résultats : Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 2 qui montre l'effet de L. lactis non modifié (CAT-) ou produisant la catalase (CAT+) sur la survie de cellules HT29 après incubation avec 0,100, 200 ou 400 uM d'H202. Les différences statistiquement significatives par rapport aux cellules incubées sans bactéries (témoin) sont indiquées : * = p A : test au rouge neutre ; B : test au MTT. Ces résultats montrent que : 1) La présence de bactéries ne modifie pas la prolifération des cellules HT29, en l'absence de peroxyde d'hydrogène, 2) que les différentes concentrations en H202 testées ont un effet toxique sur les cellules HT29, 3) que les bactéries modifiées pour surproduire la catalase protègent efficacement les cellules HT29 contre les différentes concentrations d'H202 utilisées, 4) qu'à la concentration de 200 uM, les bactéries non modifiées ont également un effet protecteur. Conclusion : La présence de L. lactis n'altère pas la croissance des cellules HT29. La présence de L. lactis non modifiés peut apporter une certaine protection contre un stress oxydant mais la protection est beaucoup plus efficace en présence de L. lactis produisant la catalase. 3) Effet sur la survie de cellules coliques humaines après un stress oxydant induit par irradiation L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène katB introduit dans Lactococcus lactis a été testé sur des cellules coliques humaines en culture exposées à un stress induit par des radiations ionisantes. Matériels et méthodes Les cellules HT29 sont ensemencées à 2000 cellules par puits en plaque 96 puits. Au moins 8 puits différents sont réalisés pour chaque condition expérimentale. Après 3 jours de culture, les plaques sont irradiées à 2 Gy à l' aide d'une source de cobalt 60. Les bactéries à deux concentrations différentes (107 et 108 / 0,2 ml) sont ajoutées soit 1 heure avant l'irradiation, soit 24 ou 48 heures après et laissées en contact des cellules pendant 3 heures. L'effet de l'irradiation sur la croissance cellulaire est estimé après 5 jours de culture par la technique du MTT. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 3 qui montre l'effet de L. lactis non modifié ou L. lactis produisant la catalase (L. lactis CAT) sur la prolifération de cellules HT29 après une irradiation de 2 Gy. Les bactéries ont été rajoutées soit 1 heure avant l'irradiation (#) ; soit 24 heures après (#) ; soit 48 heures après (#). Les valeurs (n=8) sont exprimées en % de survie par rapport au témoin correspondant non irradié. Les différences statistiquement significatives (test t) par rapport aux cellules incubées sans bactéries sont indiquées : * = p 0,05 ; ** = p0,01 et *** p0,001 Ces résultats confirment que la présence des lactocoques, modifiés ou non, n'altère pas la croissance des cellules HT29. On n'observe pas d'effet protecteur des bactéries lorsque celles ci sont rajoutées au moment de l'irradiation ; par contre un effet protecteur est obtenu lorsqu'elles sont rajoutées 24 heures ou 48 heures après l'irradiation. L'effet protecteur le plus marqué est obtenu en présence de 108 L. lactis produisant la catalase. Conclusion : La présence de L. lactis protège les cellules HT29 contre les effets des radiations ionisantes. Cet effet protecteur est renforcé avec L. lactis produisant la catalase. EXEMPLE 3 : EFFETS ANTI-OXYDANTS IN VIVO D'UNE SOUCHE DE L. LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B. SUBTILIS L'effet de l'ingestion de L. lactis exprimant la catalase sur la toxicité intestinale radioinduite a été testé comme suit : 1) Irradiation abdominale en 1 fois Matériels et méthodes : Animaux : souris mâles C3H/He âgées de 9 semaines au moment de l'irradiation Alimentation : la veille de l'irradiation, les animaux sont nourris de croquettes standard broyées auxquelles sont ajoutées les cultures de bactéries ou le milieu de culture pour les témoins (1 ml /g de croquettes). Les aliments sont renouvelés chaque jour pendant toute la durée de l'expérience. les animaux sont divisés en 6 groupes de 5 individus: 5 irradiés ingérant du milieu de culture sans bactérie et 5 témoins non irradiés nourris de la même façon ; irradiés ingérant L. lactis non modifié et 5 témoins non irradiés nourris de la même façon, 5 irradiés ingérant L. lactis produisant la catalase et 5 témoins non irradiés nourris de la même façon. Irradiation : après anesthésie, les animaux sont exposés à une irradiation abdominale de 10 Gy à l'aide d'une source de cobalt 60. Suivi pondéral : animaux sont pesés chaque jour à la même heure pendant toute la durée de l'expérience. Résultats : Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 4, qui montre l'effet de L. lactis non modifié (-*-)et de L. lactis produisant la catalase (--O--) , par rapport au milieu de culture sans bactérie (-#-) sur la perte pondérale des souris C3H/He après une irradiation abdominale de 10 Gy. Les différences statistiquement significatives (test t) par rapport au témoin (milieu sans bactérie) sont indiquées : * = p Ces résultats montrent qu'une alimentation supplémentée en L. lactis diminue de façon significative la perte pondérale entraînée par l'irradiation. Pour les animaux ingérant L. lactis produisant la catalase, la perte de poids est interrompue plus tôt et la reprise semble s'amorcer plus rapidement que pour ceux ingérant L. lactis non modifié. 2) Irradiation fractionnée Matériels et méthodes: Le protocole d'alimentation est le même que celui suivi pour l'irradiation abdominale. Les animaux, placés dans des tubes plexiglas, sont irradiés tous les matins pendant 5 jours à une dose de 3Gy à l'aide d'une source de Cobalt 60. Suivi pondéral : animaux sont pesés chaque jour à la même heure pendant toute la durée de l'expérience. Résultats : Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 5, qui montre l'effet de L. lactis non modifié (-#-) et de L. lactis produisant la catalase (--O--) par rapport au milieu de culture sans bactérie (-#-) sur la perte pondérale des souris C3H/He après une irradiation totale de 5 X 3 Gy. La différence entre L. lactis modifié et milieu de culture est significative (test t) à p Ces résultats montrent qu'une alimentation supplémentée en L. lactis diminue la perte pondérale après irradiation. La différence par rapport au témoin est statistiquement significative dans le cas de L. lactis produisant la catalase (p REVENDICATIONS 1) Souche de lactocoque, notamment de L. lactis, transformée par un gène codant pour une catalase hétérologue. 2) Souche selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit gène est un gène procaryote. 3) Souche selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit gène est le gène katB de B. subtilis. 4) Procédé de production d'une catalase par une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de ladite souche en présence d'hème. 5) Utilisation d'une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné à protéger des cellules contre un stress oxydant. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des bactéries de la flore intestinale. 7) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules de la paroi intestinale. 8) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit stress oxydant est induit par un rayonnement. 9) Procédé pour protéger in vitro des cellules contre un stress oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence des cellules à protéger et d'au moins une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans les conditions de production de catalase par ladite souche de lactocoque. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des bactéries probiotiques. 11) Aliment fermenté comprenant au moins une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, éventuellement associée à d'autres bactéries probiotiques.