Brevet FR2789393A1 — publié le 20000811

La présente invention concerne de nouveaux dérivés stéroïdes comprenant un groupement tétrahydrofurane, leur procédé de préparation, leur application comme médicaments et les compositions les comprenant. Il ressort de l'étude de l'art antérieur que de nombreux dérivés stéroïdes présentant le squelette suivant R3 R4 R1 12 R 2 14 1 5 31 4 6 io ont été synthétisés et que certains de ces dérivés présentent des propriétés pharmacologiques intéressantes. Ainsi les brevets EP 57115, EP 156284 et EP 97572 décrivent des familles de dérivés stéroïdes qui déclinent de nombreuses possibilités dans le choix des groupes R1, R2, R3 et R4. Ces brevets constituent l'art antérieur i5 de la présente invention. Le brevet EP 262 188 décrit des dérivés stéroiïdes comportant un cycle spirannique en position 17, néanmoins ce brevet ne décrit ni ne suggère la préparation des dérivés selon la présente invention. L'objet de la présente invention est la synthèse de composés antagonistes de la progestérone. La présente invention concerne les dérivés stéroïdes de formule: CH3 RO CH,N Formule I dans laquelle OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle (OH), les fonctions éthers dans lesquelles R, contenant de 1 à 8 atomes de carbone, est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique, les fonctions esters dans lesquelles R est un radical acyle COR', dans lequel R' contenant de 1 à 8 atomes de carbone est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, o alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. La présente invention a pour objet les dérivés stéroiïdes de formule I dans laquelle OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle (OH), le radical méthoxyle et le radical O-acétyle soit respectivement la (1 7R)4',5'-dihydro-5'hydroxy 11 3/4(diméthylamino)phényl/spiro(estra4, 9- dien-17,2'(3H)furan)3one, la (17R)4',5'-dihydro-5'méthoxy 1113/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2'(3H)furan)3one et la (17R)4',5'-dihydro-5'acétoxy 11 3/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4, 9- dien-l 7,2'(3H)furan)3one. La présente invention a aussi pour objet les dérivés stéroiïdes de formule A comprenant deux sites protégés par des groupements protecteurs de la fonction carbonyle. Le premier site correspond au groupement - C(OR1)(OR2), le deuxième correspond au groupement -C(OR3)(0R4) avec R1, R2, R3, R4 choisis parmi les groupes méthyle et éthyle ou encore R1 et R2 d'une part et R3 et R4 d'autre part forment ensemble un cycle comprenant 3 ou 4 atomes de carbone. De manière préférée R1 et R2 forment un cycle 1,3 dioxanne (à 4 atomes de carbone), R3 et R4 forment un cycle 1,3 dioxolanne(à 3 atomes de carbone). CH3 /R1 N OH O R2 CH3 j \. R3 /0, R4/O OH Dérivé A La présente invention concerne encore les procédés de synthèse de io ces dérivés stéroïdes. Le dérivé stéroïde A pour lequel -C(OR3)(0R4) est tel que R3 et R4 forment ensemble un cycle dioxolanne est obtenu par réaction dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé O/R1 BrMg./,-%O/ R2 sur la cétone P. P est alors le précurseur chimique de A CH3 C'3H CH' H OL OH Dérivé P Parmi plusieurs voies de synthèse possibles du spirolactol B, la condensation du dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé, sur la cétone en 17 du dérivé P a été retenue. L'hydrolyse acide permet ensuite en libérant les protections, 1) de générer la cétone conjuguée 3 one- 4 ène par déshydratation, 2) de cycliser l'aldéhyde libéré, sur l'alcool tertiaire 17j3, ce qui conduit au spirolactol B ( 2 anomères) Le dérivé B est le lactol: (17R)4',5'-dihydro-5' hydroxy 11 /4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4, 9-dien-17,2'(3H)furan)3one, de formule développée: CH3 HO CH3 D0riv B Dérivé B Pour illustrer les dérivés de formule I selon la présente invention dans laquelle OR est une fonction éther, il a été choisi de synthétiser le dérivé dans lequel R est un groupe méthyle. s Le dérivé stéroïde C (17R)4',5'-dihydro-5' méthoxy 11 /4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2' (3H)furan)3one est obtenu par réaction en milieu acide du méthanol sur le dérivé stéroïde B. CH3 OMe CH3 Dérivé C Pour illustrer les dérivés de formule I selon la présente invention dans laquelle OR est une fonction ester, la synthèse du dérivé pour lequel R est un groupe acétyle a été choisie. Le dérivé stéroïde D (17R)4',5'-dihydro-5' acétoxy 11l3/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2' (3H)furan)3one est obtenu par réaction de l'anhydride acétique sur le dérivé stéroïde B. CH3 OAc CH3 DNiv CH3 O/) Dérivé D Les dérivés B, C, D exercent une activité antagoniste sur le récepteur de la progestérone. Ainsi, ces dérivés peuvent être utilisés en tant que médicaments dans les domaines suivants: utilisation contraceptive, déclencheur de l'accouchement, dilatateur du col de l'utérus, modulation de la mobilité des spermatozoïdes, traitement de certaines maladies gynécologiques dont I'endométriose, les fibromes, les léïomyomes, les traitements des tumeurs dépendantes de la progestérone dont tumeurs du sein, des ovaires, des méninges, et d'une façon générale toutes les situations pathologiques liées à l'activité de la progestérone, comme par 0o exemple certaines pathologies immunitaires. Les dérivés B, C, D selon la présente invention exercent aussi une activité anti-glucocorticoiïde et peuvent ainsi être utilisés en tant que médicament dans les situations suivantes: traitement et prévention des i complications induites par corticothérapie, stress et sevrage morphinique, traitement destinés à contrecarrer certains effets du cortisol, traitement des symptômes liés à l'hypersécrétion de cortisol, étude de l'axe hypothalamo- hypophyso-surrénalien. De façon plus détaillée, ces dérivés peuvent ainsi être utilisés en tant que médicaments dans les applications suivantes: Blocage du cortisol exogène, ce qui présente un intérêt dans la prévention et le traitement des complications induites par la corticothérapie: troubles cutanés, musculaires, osseux, ophtalmologiques. - Blocage du cortisol endogène, lorsque celui-ci est présent à des taux trop élevés comme dans les situations de stress et de sevrage morphinique, dans ce cas un anti-glucocorticoiïde peut être intéressant pour traiter ou prévenir les conséquences de cette élévation, comme par exemple les pathologies immunitaires, les hypercatabolismes protidiques, les troubles neuromusculaires, le cortisol endogène peut aussi être normal, dans ce cas un anti-glucocorticoïde peut être intéressant pour contrecarrer certains effets du cortisol, comme par exemple la baisse de la pression artérielle ou des résistances vasculaires. - Blocage du cortisol dans le cas de tumeurs sécrétant du cortisol: dans ce cas, un anti-glucocorticoïde permet de traiter les symptômes liés à l'hypersécrétion de cortisol (syndrome de Cushing). Un anticortisol peut être intéressant comme test de diagnostic lorsque l'on veut étudier l'axe hypotalomo-hypophyso-surrénalien. EXEMPLES 1o EXEMPLE 1: Synthèse du produit intermédiaire A Le produit intermédiaire A est synthétisé à partir de la cétone correspondante P. La synthèse de la cétone correspondante P est effectuée conformément au mode opératoire détaillé à l'exemple 7 (stade A) du brevet EP 0 057 115. Préparation du produit intermédiaire A: 1) Réaction de Griqnard: Magnésien: Sous atmosphère d'argon anhydre, 30g (154 mmoles) de 2-(2Bromoéthyl)-1-3-dioxanne (96% Aldrich) en solution dans 70 ml de THF anhydre, sont additionnés à 4g (166 mmoles) de magnésium activé en 30 minutes, en maintenant sous agitation à 30-35 C dans un bain d'eau. On agite le milieu maintenu à 30 C pendant 3 heures. On refroidit à - 10 C et on introduit sous agitation, en 30 minutes: 5g (11 mmoles) de 17-céto-stéroïde P (Ex: 7 de EP 0 057 115) en solution dans 40 ml de THF anhydre à -10 C. On agite 1 heure à température ambiante. On refroidit dans un bain de glace, traité avec précautions par une solution aqueuse saturée de NH4CI, extrait par de l'éther, lave à l'eau, sèche sur Na2SO4 anhydre et on distille à siccité. Poids de l'extrait sec: 15g. La chromatographie sur 600g de silice, gradient d'élution: CH2CI2- Acetone (de 95-5 à 70-30 VN/), livre 3,4g (6mmoles) du produit A sous forme d'une mousse de couleur crème. Analyse du produit A Spectre de masse: M+.567 Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule du dérivé A. io Exemple 2: Synthèse du produit B (Lactol) (17R)4',5'-dihydro-5' hydroxy 11 3/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2'(3H)furan)3one Le lactol B est obtenu par hydrolyse acide du produit intermédiaire A. Dans un mélange: HCI 0,2N-THF 50-50 VN, on dissout sous argon 3,4g (6 mmoles) de 17-hydroxy-stéroïde A; on agite à 50 C durant 4 H 30 (on suit l'évolution de la réaction au moyen de la chromatographie en couche mince). On neutralise dans un bain de glace par ajouts successifs d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3. L'extraction par du CH2CI2 donne, après distillation à siccité, 2,83g d'une gomme beige. La chromatographie sur 130g de silice, éluant: CH2CI2 à 10% d'acétone, livre 2,3g (5,15 mmoles) de lactol B (mousse solide de couleur paille). Analyse du produit B Spectre de masse: M+.447 La formule brute du produit B est C29H37NO3, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute. Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé B. Synthèse du chlorhydrate du dérivé B mg de lactol A sont mis sous agitation dans 20ml d'eau à 25% VN d'acétonitrile. Sous agitation, on ajoute goutte par goutte de l'HCI 2N: on amène à pH 2,9 (pH-mètre), ce qui est suffisant pour obtenir une solution limpide. On amène à sec sous vide, au bain éviter les mousses. On reprend ensuite par 20ml d'eau et filtre sur "Millipore". On concentre à 10ml et lyophilise. On isole 100mg de poudre beige. II est à noter que le sel est très soluble dans l'eau, mais aussi dans les solvants chlorés. Exemple 3: Synthèse du produit C (éther méthylique du lactol) (17R)4',5'- dihydro-5' méthoxy 11/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17.2' i (3H)furan)3one Ethérification: mg de lactol B sont mis sous agitation dans lml de méthanol en milieu acide. Au bout d'une nuit, on amène à sec sous vide et triture sous agitation magnétique durant 1 heure dans 3ml d'amoniaque 0,1 N. On essore, lave à I'eau et sèche sous vide pour obtenir une poudre. Analyse du produit C Spectre de masse: M+.461 La formule brute du produit C est C31H39NO3, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute. Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé C. EXEMPLE 4: Synthèse du produit D (dérivé acétylé du lactol) (17R)4',5'- dihydro-5' acétoxy 11l B/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17, 2' (3H)furan)3one Acétylation: 100mg de lactol B sont mis sous agitation dans Iml de pyridine + lml d'anhydride acétique. Au bout d'une nuit, on amène à sec sous vide et triture sous agitation magnétique durant 1 heure dans 3ml d'eau, on essore, lave à l'eau et sèche sous vide pour obtenir une poudre crème: 1 00mg. On ne peut pas analyser la pureté en Chromatographie Couche Mince io (CCM), le produit s'hydrolyse sur silice ou sur alumine. Le seul contrôle est la RMN'H. Le spectre RMN'H de ce produit acétylé permet de conclure qu'il est pur. Analyse du produit D Spectre de masse: M+.489 La formule brute du produit D est C29H37NO4, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute. Les spectres RMN (RMN1H et RMN13C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé D. ETUDE DE L'ACTIVITE DES PRODUITS SELON L'INVENTION SUR LES RECEPTEURS STEROIDIENS I Récepteur.lucocorticoïde humain Matériel - Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet - Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) II - Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 - Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs - Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1%o HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 2 mM de DTT et 20 mN de Molybdate de sodium Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) DTT = DL Dithiotreitol (Sigma) Molybdate de sodium 2H20 (Merck) - Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit " SX " (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) - Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) - Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) - RU 28362 tritié, préparé par le sevice des radiomolécules RU (activité spécifique: 2,75 TBq/mmole-activité volumique: 18,5 MBq/ml). Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule. Produits à tester * Véhicule: Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol. * Concentration(s): variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1: 1-2, 5-5-10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2: 10-25-50-100-2501000-2500-10000-25 000 nM Produit de référence * Dexamethasone: Courbe référence: 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur s Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant: Le récepteur glucocorticoïde entier humain cloné dans le Baculovirus est exprimé dans des cellules SF9 d'insecte. Après infection par le Baculovirus recombinant, les cellules SF9 sont 0o recueillies dans un tampon contenant 50 mM de Phosphate de Potassium, 5 mM de DTT, 20% de Glycérol et 20 mM de Molybdate de sodium. Puis les cellules sont lysées pour obtenir le récepteur. Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, l'extrait protéique est conservé dans azote liquide. La dilution de travail de l'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard. 2. Incubation Des aliquots de 125 pIlI de l'extrait protéique des cellules SF9 (dilué de façon à obtenir 1 site de liaison, en tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, Gélatine 1%& HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 2 mM de DTT et 20 mM de Molybdate de sodium), sont incubées 24 heures à 0 C (en plaques polypropylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 pl de RU 28362 tritié à une concentration constante de 2,5 nM et 10 pl de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000, soit de Dexaméthasone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2). Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans l'éthanol absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec l'automate Biomek 1000. La concentration de RU 28362 tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran: A 100 tlI d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 Ktl de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm. Un aliquot de 100 ptl de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 jtl de Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia. Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 o0 minutes. 3. Expression des résultats de méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes: pourcentage de l'hormone tritiée liée xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. On détermine la droite d'équation suivante: Iso = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 ( 1 + Bmin/BO)/2 = 50 (I + Bmin/BO). BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid. B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM). Les intersections de la droite Io50 et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous. Il Récepteur progestérone humain Matériel - Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet - Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) io Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 - Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs - Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1"% HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) Gélatine from swine skin Type 1 (Sigma) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) - Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1%oo,HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit " SX " (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) - Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) - Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) - RU 5020 tritié, préparé par le sevice des radiomolécules RU (activité spécifique: 2,07 TBq/mmole-activité volumique: 18,5 MBq/ml). Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule. Produits à tester * Véhicule: Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol. *Concentration(s): variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1: 1-2,5-5-10-2550-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2: 10-25-50-100-250-1000-250010000-25000 nM Produit de référence * Progestérone: Courbe référence: 0-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant: Le récepteur progestérone entier humain cloné dans le Baculovirus, est exprimé dans des cellules SF9 d'insecte. Après infection par le Baculovirus recombinant, les cellules SF9 sont recueillies dans un tampon contenant une concentration élevée en sel (Tris mM-HCI pH 8, EDTA 0,5 mM, DTT 2mM, glycérol 20%, KCI 400 mM), puis lysées pour obtenir le récepteur. Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, I'extrait protéique est conservé dans l'azote liquide. La dilution de travail de l'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard. 2. Incubation Des aliquots de 1,25 gl de l'extrait protéique des cellules SF9 (dilué en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1/%o,HCI pH 7,4 de façon à obtenir 1 site de liaison), sont incubées 24 heures à 0 C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 WI de RU 5020 tritié à une concentration constante de 2,5 mM et 10 gl de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit de progestérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2). Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans I'éthanol absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec l'automate Biomek 1000. La concentration de RU 5020 tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran: A 100 il d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 gl de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm. Un aliquot de 100.li de sumrnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 pil de Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez o0 Pharmacia. Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes. 3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) s15 On trace les 2 courbes suivantes: pourcentage de l'hormone tritiée liée xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. On détermine la droite d'équation suivante: Io = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit I50 = 100 ( 1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO). BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid. B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM). Les intersections de la droite I50o et des courbes permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci-dessus. 11I Récepteur estrogène humain s Matériel - Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet - Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) - Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifu- geuse Jouan io GR4.1 1 Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs - Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1%o HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) Gélatine from swine skin Type 1 (Sigma) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) - Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1%o,HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit " SX " (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) - Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) - Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) - Estradiol tritié, préparé par le service des radiomolécules RU (activité spécifique: 1,48 TBq/mmole-activité volumique: 37 MBq/ml). Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule. Produits à tester * Véhicule: Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol. *Concentration(s): variables de I nM à 25 000 nM Courbe 1 1-2,5-5-10-2550-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2: 10-25-50-100-250-1000-250010000-25000 nM Produit de référence * Estradiol: Courbe référence: 0-1-2, 5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant: Le récepteur estrogène entier humain cloné dans le Baculovirus est o0 exprimé dans des cellules SF9 d'insecte. Après infection par Baculovirus, les cellules SF9 sont recueillies dans un tampon contenant une concentration élevée en sel (Tris 20mM-HCI pH 8, EDTA 0,5 mM, DTT 2mM, glycérol 20%, KCI 400 mM), puis lysées pour obtenir le récepteur. i5 Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, I'extrait protéique est conservé dans l'azote liquide. La dilution de travail de l'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard. 2. Incubation Des aliquots de 1,25 p.I de l'extrait protéique des cellules SF9 (dilué en tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, Gélatine 1%,,HCI pH 7,4 de façon à obtenir I site de liaison), sont incubées 24 heures à 0 C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 p.l d'estradiol tritié à une concentration constante de 2,5 mM et 10 pI de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit d'estradiol froid (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2). Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans l'éthanol absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec l'automate Biomek 1000. La concentration d'estradiol tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran: A 100 Kit d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 pil de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm. Un aliquot de 100 il de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 pit de Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez o0 Pharmacia. Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes. 3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes: pourcentage de l'hormone tritiée liée xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. On détermine la droite d'équation suivante: 150 = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit I50o = 100 ( 1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO). BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid. B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM). Les intersections de la droite Iso50 et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous. IV Récepteur androgqène Ce récepteur à été testé sur des animaux: Espèce: Rats castrés de 24 heures Souche: Sprague-Dawley Eleveur: IffaCredo- Les Oncins (France) Sexe: Mâle Poids: 180-200 g Nbre d'animaux/dose: 20 à 30/expérience Tissu: Prostate Matériel - Broyeur potter Heidolph type 201 (verre/téflon)/moteur d'agitation Heidolph Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet - Ultracentrifugeuse Beckman L8-70 ou ultracentrifugeuse Kontron Centrikon T-2070 - Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) - Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 - Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs - Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 0,1 mM de PMSF, 20 mM de Molybdate de sodium et 2 mM de DTT Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) DTT = DL Dithiotréitol (Sigma) PMSF = Phénylméthansulfonylfluorid (Fluka) Molybdate de sodium 2H20 (Merck) Solution de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit " SX " (Roussel- Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) - Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) o0 - Ethanol 99,9% (Roussel- Uclaf) Testostérone tritiée, préparée par le service des radiomolécules RU (activité spécifique: 2 TBq/mmole-activité volumique: 18,5 MBq/ml). Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule. Produits à tester * Véhicule: Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol. * Concentration(s): variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1: 1-2,5-5-1025-50-100-250-1000-2500-10000- 25 000 nM Courbe 2: 10-25-50-100250-1000-2500-10000-25000 nM Produit de référence * Testostérone: Courbe référence: 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du tissu 1. Préparation du tissu Les animaux sont sacrifiés et les prostates sont prélevées, pesées et homogénéisées à 0 C par un potter Kontes Dwall verre-verre, à l'aide du broyeur, à raison de 1 g de tissu pour 8 ml de tampon. L'homogénat est ensuite ultracentrifugé à 4 C, 30 minutes à 209000 g. En fin de centrifugation, le surnageant (cytosol) est récupéré. 2. Incubation Des aliquots de 1,25 t.l de cytosol sont incubés 24 heures à 0 C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 p.l de Testostérone tritiée à une concentration constante de 5 mM et 10 kil de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit de testostérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2). Les produits froids sont solubilisés dans l'éthanol à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de cette solution mère sont réalisées avec un Biomek 1000. La concentration de testostérone tritiée liée est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran: A 100 l d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 pl de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2500 rpm. Un aliquot de 100 pIl de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 pl de Scintillant Optiphase 'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia. Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes. 3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes: pourcentage de l'hormone tritiée liée 100 xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. On détermine la droite d'équation suivante: I5o = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit I50 = 100 ( 1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO). BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid. B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM). Les intersections de la droite s150 et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le io récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous. V Récepteur minéralcorticoïde Ce récepteur à été testé sur des animaux: Espèce: Rats surrénalectomisés de 5 à 8 jours Souche: Sprague-Dawley Eleveur: Iffa Credo- Les Oncins (France) Sexe: Mâle Poids: 140-160 g Nbre d'animaux/dose: 10/expérience (100 à 150 points) Tissu: Rein Matériel Broyeur potter Heidolph type 201 (verre/téflon)/moteur d'agitation Heidolph - Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet - Ultracentrifugeuse Beckman L8-70 ou ultracentrifugeuse Kontron Centrikon T-2070 - Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) - Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 - Scintillateur Beckman LS 1801 ou Scintillateur Beckman LS 5000 td Réactifs - Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) - Solution de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, io saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit " SX " (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) - Aqualite (JT Baker) - Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) - Aldostérone tritiée, préparée par le service des radiomolécules RU (activité spécifique: 1,85 TBq/mmole-activité volumique: 37 MBq/ml). Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule. Produits à tester * Véhicule: Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol. * Concentration(s): variables de I nM à 25 000 nM Courbe 1: 1-2,5-10-25100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2: 10-25-100-250-1000-2500-1000025000 nM Produit de référence * Aldostérone: Courbe référence: 0-1-2,55-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du tissu 1. Préparation du tissu Les animaux sont sacrifiés par décapitation et les reins sont prélevés après perfusion in situ avec 50 ml de tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4, pesés et homogénéisés à 0 C par un potter Thomas Téflon- verre, à l'aide du broyeur, à raison de 1 g de tissu pour 3 ml de tampon. L'homogénat centrifugé à 0 C, 10 minutes à 800 g, puis du RU 28362 (stéroïde se fixant uniquement sur le récepteur glucocorticoïde), est ajouté S au surnageant à la concentration finale de 10'6M afin d'éliminer la fixation de l'aldostérone tritiée sur le récepteur glucocorticoïde. Ce surnageant est ensuite ultracentrifugé à 0 C, 30 minutes à 209 000 g. En fin de centrifugation, le surnageant (cytosol) est récupéré. 2. Incubation Des aliquots de 1,25 pIl de cytosol sont incubés - 1 heure à 0 C dans le cas de molécules non stéroiïdes - 24 heures à 0 C dans le cas de molécules stéroïdes avec 10 gl d'aldostérone tritiée à une concentration constante de 5 nM et 10 jal de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit d'aldostérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2). Les produits froids sont solubilisés dans l'éthanol à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de cette solution mère sont réalisées avec un Biomek 1000. La concentration d'aldostérone tritiée liée est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran * A 100 gl d'incubat, on ajoute 100.l de la suspension de charbon-dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm. Un aliquot de 125 pl de sumrnageant est mise dans un flacon à scintillation Packard, auquel on ajoute 5 ml de scintillant Aqualite. Le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes. 3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes: pourcentage de l'hormone tritiée liée xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. On détermine la droite d'équation suivante: = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit 150 = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50(1 + Bmin/BO). BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid. Io B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid. Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM). Les intersections de la droite 50o et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur. L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation: ARL = 100 (CH)/(CX). Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous. Tableau Affinité des produits pour les récepteurs hormonaux Produit testé Produit B Produit B' Produit C Témoin sous Ether mifépristone, Récepteur \(lactol forme de méthylique sel soluble (en % du produit base) sel (sel de référence) soluble) Glucocorticoïde 75 23 15 63 (dexamethasone) Progestérone 303 92 104 140 Estrogène 0 NT NT NT (Estradiol) Androgène 32 NT NT (Testostérone) Mineralcorticoïde 40 NT NT NT (Aldostérone) 40_ NT signifie que le dérivé n'a pas été testé sur le récepteur considéré. Activités abortives: Produit B (lactol): 3mg/kg p.o. =0%; 10mg/kg = 75% Produit B' (sel soluble): 3mg/kg i.v.=75%; 3mg/kg p.o. = 25% Produit C(Ether méthylique, sel soluble): 3mg/kg i v. =50%; 3mg/kg p.o. = 0% 1o Produit D (Ether acétyl base): 3mg/kg p.o. = 0% Témoin mifépristone, sel soluble: 3mg/kg i.v.=100%; lmg/kg i.v. = 33%; 3mg/kg p.o.= 25% Témoin mifépristone lmg/kg i.v.=25%; 3mg/kg i.v. = 100%; l mg/kg p.o.= 0%, 10Omg/kg p.o.= 100% Les dérivés étudiés présentent une affinité pour le récepteur progestérone, I'effet abortif du lactol permet de conclure que cette activité est de nature antagoniste. Ces dérivés, et notamment le lactol peut donc être i utilisé en tant que médicament anti-progestérone. Ces dérivés exercent en outre une affinité pour le récepteur glucocorticoïde. Dans la mesure o un dérivé anti-progestérone est aussi un anti- glucocorticoïide, on peut prévoir ces dérivés exercent une activité anti- glucocorticoïde. REVENDICATIONS 1. Dérivés stéroïdes de formule générale: CH3 RO CHN Formule I dans laquelle OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle 1o (OH), les fonctions éthers dans lesquelles R, contenant de 1 à 8 atomes de carbone, est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique, les fonctions esters dans lesquelles R est un radical acyle COR', dans lequel R' contenant de 1 à 8 atomes de carbone est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides. 2. Dérivés stéroïdes selon la revendication 1 tels que OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle (OH), le radical méthoxyle et le radical O-acétyle soit respectivement la (17R)4',5'- dihydro5'hydroxy 11 3/4(diméthylamino)phényl/ spiro(estra4,9-dien- 17,2'(3H)furan)3one, la (17R)4',5'-dihydro-5'méthoxy 113/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2'(3H)furan)3one et la (17R)4',5'-dihydro-5'acétoxy 11/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9- dien-17,2'(3H)furan)3one. 3. Dérivés stéroïdes de formule: CH3 R1 -. ' 'rOH O/ CH' R2 H3 I R3/'/ R4/O OH Dérivé A dans laquelle R1, R2, R3, R4 sont choisis parmi les groupes méthyle et éthyle ou encore RI et R2 d'une part et R3 et R4 d'autre part forment ensemble un cycle comprenant 3 ou 4 atomes de carbone. 4. Procédé de synthèse du dérivé selon la revendication 3 dans lequel - C(OR3)(0R4) est tel que R3 et R4 forment ensemble un cycle dioxolanne, par réaction dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé R1 O Br- Mg/,o R2 sur la cétone P: CH3 N CH3 CH3 ILO OH Dérivé P 5. Procédé de synthèse du dérivé (1 7R)4',5'-dihydro- 5'hydroxy 1113/4(diméthylamino)phényl/spiro(estra4,9-dien-17, 2'(3H)furan)3one selon la revendication 2 par condensation du dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé, sur la cétone en 17 du dérivé P CH3 CH3 CH3 O QO OH dérivé P suivie d'une hydrolyse acide. 6. Procédé de synthèse du dérivé (17R)4',5'-dihydro-5'méthoxy 11l3/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2'(3H)furan)3one selon la revendication 2 par réaction en milieu acide du méthanol sur la (17R)4',5'- dihydro-5'hydroxy 1 113/4(diméthylamino)phényl/spiro(estra4,9-dien- 17,2'(3H)furan)3one. 7. Procédé de synthèse du dérivé (1 7R)4',5'dihydro-5'acétoxy 113/4(diméthylamino)phényl/spiro (estra 4,9-dien-17, 2'(3H)furan)3one selon la revendication 2 par réaction de l'anhydride acétique sur la (17R)4', 5'- dihydro-5'hydroxy 11 3/4(diméthylamino)phényl/spiro(estra4,9-dien- 17,2'(3H)furan)3one. 8. Dérivés stéroïdes selon les revendications 1 ou 2 ou dérivés préparés selon l'une des revendications 5 à 7 en tant que médicament. 9. Dérivés stéroïdes selon la revendication 8 en tant que médicament antiprogestérone. 10. Dérivés stéroïdes selon la revendication 8 en tant que médicament pour au moins un traitement choisi dans le groupe formé par les contraceptifs, les déclencheurs de l'accouchement, les dilatateurs du col de l'utérus, la modulation de la mobilité des spermatozoïdes, le traitement de certaines maladies gynécologiques, les traitements des tumeurs dépendantes de la progestérone. 11. Dérivés stéroïdes selon la revendication 8 en tant que médicament antiglucocorticoïde. 12. Dérivés stéroïdes selon la revendication 8 en tant que médicament pour au moins un traitement choisi dans le groupe formé par le traitement et la prévention des complications induites par corticothérapie, le traitement des stress et sevrage morphiniques, les traitements destinés à contrecarrer certains effets du cortisol, les traitements des symptômes liés à l'hypersécrétion de cortisol, les études de l'axe hypothalamo-hypophyso- surrénalien.