Brevet FR2787112A1 — publié le 20000616

La présente invention concerne des fragments peptidiques dérivés de la protéine CWPM23 qui est une protéine membranaire du blé d'hiver qui joue un rôle dans la résistance au gel, des fragments d'ADN codant ces fragments peptidiques, et l'utilisation de ces fragments peptidiques comme marqueurs pour la protéine CWPM23. En particulier, la présente invention concerne la purification, la détermination de la séquence d'acides aminés partielle de la protéine CWPM23 et son utilisation. On considère que les dégâts des plantes dus au gel sont causés principalement par des lésions irréversibles des membranes plasmiques au cours I0 de la déshydratation et du rétrécissement des cellules provoqués par le gel, avec formation de cristaux de glace extracellulaires. On suppose que, de l'automne à l'hiver, par acquisition d'une résistance au gel, une protéine spécifique pourrait être induite pour stabiliser la membrane plasmique afin d'éviter les dégâts dus au gel. Dans le but d'obtenir des organismes présentant une résistance contre les dégâts dus au gel, des efforts ont été faits pour incorporer et exprimer un gène végétal codant une protéine induite dans des conditions de basse température. Toutefois, la plupart des protéines induites dans des conditions de basse température sont hydrophiles et ne sont pas localisées dans la membrane plasmique o se produisent les dégâts dus au gel. Il a été établi que l'effet obtenu en incorporant un gène codant une protéine hydrophile n'est pas suffisant pour conférer une résistance au gel. D'autre part, des difficultés de purification ont empêché l'analyse fonctionnelle et l'utilisation de protéines hydrophobes. De ce fait, l'identification et la purification de protéines membranaires induites dans des conditions de basse température sont indispensables. La protéine CWPM23 est une protéine située dans la membrane plasmique du blé d'hiver qui est induite spécifiquement pendant le processus d'accoutumance au froid. Cette protéine s'accumule dans la membrane plasmique, parallèlement au développement d'une tolérance au gel. Du fait que l'induction de la protéine CWPM23 est significative dans le blé d'hiver alors qu'elle n'est pas induite dans des conditions de basse température dans le blé de printemps qui est sensible au gel, on peut en déduire qu'il existe une relation étroite entre la résistance marquée au gel observée dans le blé d'hiver et l'expression de la protéine CWPM23. On peut donc supposer que l'incorporation du gène de CWPM23 dans d'autres plantes peut permettre la production de cultures présentant une grande résistance au gel et à la sécheresse. C'est pourquoi la demanderesse a préparé une fraction de membrane plasmique de blé d'hiver, a purifié la protéine IlI I. CWPM23 à partir de cette fraction et a réalisé un traitement avec une protéase dans le but d'obtenir des fragments peptidiques de la protéine. De plus, elle a analysé la séquence d'acides aminés de la protéine pour obtenir une détermination partielle de cette séquence. Il est possible d'isoler un gène codant la protéine CWPM23 par polymérisation en chaine par polymérase (PCR) au moyen d'amorces oligonucléotidiques conçues en fonction de la séquence d'acides aminés partielle ainsi déterminée. Le gène de CWPM23 isolé est très utile pour l'obtention de différentes cultures. En effet, il est possible de produire des cultures présentant une grande résistance au gel et à la sécheresse en introduisant dans celles-ci le gène de CWPM23. Par ailleurs, il est aussi possible d'obtenir des microorganismes ou des animaux transgéniques dans lesquels ce gène a été incorporé. Cette technique permet d'améliorer la viabilité cellulaire en cas de gel. Quand il est incorporé dans des animaux, ce gène peut permettre d'améliorer la fraîcheur des aliments comme la viande congelée ou le poisson congelé. De plus, quand il est incorporé dans un microorganisme, ce gène peut permettre le stockage d'un produit intermédiaire fermenté, comme la pâte à pain, à l'état congelé. En outre, comme la protéine CWPM23 est induite de manière sensible dans les variétés de blé d'hiver à haute résistance contre le gel comme les variétés Chihokukomugi et Norstar, le gène de CWPM23 peut être utilisé comme marqueur de cultures ayant une haute résistance au gel. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture détaillée qui suit et se réfère au dessin annexé dans lequel la figure unique est une photographie montrant le résultat de l'électro- phorèse de la protéine CWPM23 isolée. Préparation d'une fraction microsomiale brute. La préparation d'une fraction microsomiale brute et d'une fraction de membrane plasmique à partir du blé d'hiver a été réalisée selon le procédé décrit par Zhou et al. (Zhou et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:175-182). Les parties aériennes (tige) d'un blé d'hiver adapté aux basses températures (Triticum aestivum L.cv. Chihokukomugi) ont été découpées en tronçons d'une longueur de 3 mm qui ont ensuite été plongés dans du tampon d'extraction glacé [MOPS-KOH mM, (pH 7,6), saccharose 330 mM, EGTA 5 mM, EDTA 3 mM, NaCI 30 mM, NaF 10 mM, hydrolysat de caséine 0,2 % (m/v), K2P205 2,5 mM, PVPP i % (m/v), PMSF 2 mM, 10 pg/ml de BHT]. 10 ml de tampon d'extraction ont été utilisés pour 30 g (masse sèche à l'état frais) d'échantillon de blé. Immédiatement après, l'échantillon de blé étant dans le tampon d'extraction a été homogénéisé au moyen d'un appareil Polytron PT 10-35, et l'homogénat a été filtré sur 5 couches de gaze. Le filtrat a été centrifugé à 10 000 g pendant 20 min pour recueillir le surnageant qui a été centrifugé à 142 000 g pendant 40 min, et le culot ainsi obtenu a été mis en suspension dans un volume approprié (environ 30-50 ml) de tampon SKP [phosphate de K 10 mM (pH 7,6), saccharose 330 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM]. La suspension a été centrifugée de nouveau à 10 000 g pendant 20 min pour recueillir le surnageant qui a été centrifugé une fois encore à 000 g pendant 20 min après quoi le culot a été recueilli. Ce culot était 1o constitué par la fraction microsomiale qui a été mise en suspension dans un petit volume de tampon SKP. Préparation d'une fraction de membrane plasmique La suspension de fraction microsomiale brute préparée par le procédé décrit ci-dessus a été ajoutée à une solution de polymère glacée utilisée pour un système de partage en deux phases aqueuses [concentration finale 6 % (m/m) de dextrane T-50, 6 % (m/m) de polyéthylèneglycol 3350, NaCI 30 mM, tampon SKP] (Zhou et al.(1994) Plant cell Physiol.35:175-182). A ce stade, 10 g de ladite solution de polymère ont été ajoutés à 30 g de matériel végétal. Le mélange a été agité vigoureusement puis centrifugé à 1 000 g pendant 5 min. La phase supérieure de cette solution de polymère séparée (phase de polyéthylèneglycol dans laquelle la fraction de membrane plasmique est concentrée) a été recueillie. Sous forme d'un échantillon indépendant, un partage en deux phases aqueuses a été réalisé de la même manière pour obtenir une phase inférieure (phase de dextrane). Pour la préparation de la phase de dextrane fraîche, du tampon SKP seul a été ajouté à la solution de polymère à la place de la fraction microsomiale brute. La phase de polyéthylèneglycol contenant la fraction de membrane plasmique a été ajoutée à la phase de dextrane fraîche ainsi préparée. Un partage en deux phases aqueuses a été réalisé une fois encore d'après le procédé décrit ci- dessus. La phase de polyéthylèneglycol ainsi récupérée a été diluée à plus de deux fois son volume avec du tampon SKP puis centrifugée à 200 000 g pendant 20 min pour récupérer une fraction de membrane à haute teneur en membrane plasmique. La fraction de membrane a été mise en suspension dans du tampon SKP et centrifugée de nouveau. Le culot ainsi obtenu était constitué par la fraction de membrane plasmique qui a été remise en suspension dans du tampon SKP. Solubilisation de la protéine CWPM23 La suspension de fraction de membrane plasmique ainsi préparée (correspondant à 1 mg de protéine) a été centrifugée à 260 000 g pour obtenir un culot qui a été mis en suspension dans 300 pil de solution de Tris-NaCI [Tris- HCI 10 mM (pH 7,4), NaCI 150 mM]. 300 pl de solution de Tris-NaCI contenant 2 % (m/m) de Triton X-114 ont été ajoutés à la solution. Après avoir été suffisamment mélangée, la solution a été refroidie sur la glace pendant 30 min pour solubiliser la protéine puis elle a été centrifugée à 260 000 g et la fraction surnageante a été recueillie (fraction solubilisée par le Triton X-114). Puis, la séparation de la phase de Triton X-114 a été réalisée sensiblement selon le protocole de Brusca, Radolf et ai. (Brusca et Radolf (1994) Methods Enzymol 228:182- 193). La fraction solubilisée par le Triton X-114 a été décantée dans un incubateur maintenu à 30 C pendant 5 min pour séparer la phase de Triton X-114. L'échantillon obtenu a été centrifugé à 6 400 g pendant 10 min et la phase supérieure (phase aqueuse) a été recueillie. Simultanément, la solution de Tris- NaCI contenant 1 % (m/m) de Triton X-114 a été séparée de la même manière et la phase inférieure fraîche (phase de détergent) a été recueillie. La phase aqueuse dans laquelle la protéine CWPM23 était concentrée a été ajoutée à la phase inférieure fraîche (phase de détergent) ainsi récupérée. Le mélange obtenu a été refroidi suffisamment sur la glace et mélangé jusqu'à la dissolution du détergent. Une séparation des phases a été réalisée de nouveau de la même manière que ci- dessus pour la séparation de la phase aqueuse. Quatre volumes d'acétone ont été ajoutés à la phase aqueuse ainsi recueillie qui a été ensuite mélangée puis mise à décanter à -80 C pendant 2 h. L'échantillon obtenu a été centrifugé à 10 000 g pendant 10 min et du tampon d'échantillon au SDS a été ajouté au culot formé pour solubiliser la protéine. SDS-PAGE de la protéine CWPM23 Environ 2,5 gg de protéine solubilisée, obtenue par le procédé décrit ci-dessus, ont été utilisés comme échantillon pour l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (SDSPAGE), pour la séparation de la protéine cible (Laemmli (1970) Nature 227-680-685). La concentration d'acrylamide utilisée pour la SDS-PAGE était de 13 %. Après l'électrophorèse, le gel a été plongé dans une solution de bleu brillant de Coomassie (CBB) pour colorer les bandes protéiques. La bande correspondant à la protéine CWPM23 a été découpée sur le gel au moyen d'un rasoir et plongée dans un volume de tampon suffisant pour -l 17 r l'électroélution. La protéine cible a été électroéluée du gel au moyen d'un appareil d'électroélution (Bio-Rad; modèle 422). La fraction ainsi obtenue a été utilisée pour une électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS-tricine (TricineSDS- PAGE), avec une concentration d'acrylamide de 16,2 % pour séparer la protéine cible (Schagger et Von Jagow (1987) Anal Biochem. 166:368- 379). Une partie de la fraction de CWPM23 obtenue par électroélution de la protéine cible par le procédé décrit ci-dessus au moyen du gel après électrophorèse a été utilisée pour la SDS-PAGE pour confirmer sa pureté (figure 1). Détermination de la séquence d'acides aminés partielle de la protéine CWPM23 Les fragments peptidiques ont été obtenus par traitement avec la lysil- endopeptidase (Wako Junyaku) de la protéine CWPM23, et ces fragments ont été séparés par tricine-SDS-PAGE, puis ils ont été transférés sur une membrane de poly(fluorure de vinylidène) (PVDF) par électrotransfert et ils ont été détectés par coloration au CBB. Les bandes détectées ont été découpées et une analyse de la séquence d'acides aminés a été réalisée au moyen d'un séquenceur en phase gazeuse (Shimazu:PPSQ-10) sur trois peptides (CP23F1,2,3). Les séquences d'acides aminés partielles de ces trois peptides dérivés de la protéine CWPM23 ont été déterminées et sont les suivantes: CP23F1I: IGVAAE CP23F2: ILLLKL CP23F3: LKVKFYVPPFLPIIPVVG Ainsi, selon la présente invention, la protéine CWPM23 qui joue un rôle dans la résistance au gel du blé d'hiver a été purifiée et des séquences d'acides aminés partielles de cette protéine ont été déterminées. Des amorces oligonucléotidiques conçues en fonction de ces séquences d'acides aminés partielles ont été déterminées et peuvent être utilisées comme amorces pour la PCR. De ce fait, la PCR utilisant l'une de ces amorces permet d'isoler un gel codant la protéine CWPM23. En outre, il est possible de conférer à des animaux, des plantes ou des microorganismes une résistance au gel par incorporation du gène de cette protéine. Liste de séquences Nom du demandeur: Président de l'université de Kyushu Titre de l'invention: Fragments peptidiques dérivés de la protéine de résistance au gel CWPM23, fragments d'ADN les codant et leur utilisation comme marqueurs pour la protéine CWPM23. Numéro de la séquence: 1 Longueur de la séquence: 6 Composition de la séquence: acides aminés Topologie: linéaire Type de séquence: peptide Source: protéine CWPM23 de Triticum aestivum L.cv.Chihokukomugi Séquence: Ile Gly Val Ala Ala Glu 1 5 Numéro de la séquence: 2 Longueur de la séquence: 6 Composition de la séquence: acides aminés Topologie: linéaire Type de séquence: peptide Source: protéine CWPM23 de Triticum aestivum L.cv.Chihokukomugi Séquence: Hle Leu Leu Leu Lys Leu Numéro de la séquence: 3 Longueur de la séquence: 18 Composition de la séquence: acides aminés Topologie: linéaire Type de séquence: peptide Source: protéine CWPM23 de Triticum aestivum L.cv.Chihokukomugi Séquence: Leu Lys Val Lys Phe Tyr Val Pro Pro Phe 1 5 10 Leu Pro Ile Ile Pro Val Val Gly REVENDICATIONS 1. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence Ile-Gly-Val-Ala-Ala-Glu. 2. Fragment peptidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est dérivé de la protéine membranaire CWPM23 du blé d'hiver qui joue un rôle dans la résistance au gel du blé d'hiver. 3. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il code le fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2. 4. Marqueur peptidique pour la protéine CWPM23 qui joue un rôle dans la résistance au gel caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2. 5. Utilisation du fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 comme marqueur pour la protéine CWPM23. 6. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu. 7. Fragment peptidique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est dérivé de la protéine membranaire CWPM23 du blé d'hiver qui joue un rôle dans la résistance au gel du blé d'hiver. 8. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il code le fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 6 et 7. 9. Marqueur peptidique pour la protéine CWPM23 qui joue un rôle dans la résistance au gel, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 6 et 7. 10. Utilisation du fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 6 et 7 comme marqueur pour la protéine CWPM23. 11. Fragment peptidique caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence Leu-Lys-Val-Lys-Phe-Tyr-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Pro-Ile-Ile-Pro-Val-Val-Gly. 12. Fragment peptidique selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est dérivé de la protéine membranaire CWPM23 du blé d'hiver qui joue un rôle dans la résistance au gel du blé d'hiver. 13. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il code le fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 11 et 12. 14. Marqueur peptidique pour la protéine CWPM23 qui joue un rôle dans la résistance au gel, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 1 et 12. 15. Utilisation du fragment peptidique selon l'une quelconque des revendications 1 1 et 12 comme marqueur pour la protéine CWPM23. -a I ^T'