Brevet FR2794755A1 — publié le 20001215

PROCEDE DE CI RCULARI SATION D' OLIGONUCLEOTIDE S AUTOUR D'UN ACIDE NUCLEIQUE EN DOUBLE BRIN, LES STRUCTURES OBTENUES ET LEURS APPLICATIONS L'invention a pour objet un procédé de ci rcula ris ati on d'oligonucléotides autour d'un acide nucléique en double brin, les structures obtenues et leurs applications. On a déjà décrit des oligonucléotides à courte chaîne pouvant se fixer spécifiquement à de l' ADN en double hélice pour former une structure en triple hélice ou triplex. La fixation s'effectue au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN avec établissement d'interactions non covalentes. De tels oligonucléotides ont été développés dans le but de contrôler artificiellement l'expression de gènes spécifiques au niveau de la transcription, mais peuvent être uti lis és pour d'autres appli cati ons , comme par exemple la purification de plasmides. On a également proposé de modifier chimiquement les oligonucléotides formant des triplex pour induire des modifications irréversibles des acides nucléiques cibles. Le clivage de la cible peut être obtenu avec un oligonucléotide lié de manière covalente à un complexe Fe-EDTA ou Cu-phénanthroline, tandis que des conjugués psoralène-oligonucléotides peuvent être réticulés à leur cible après irradiation UV. L'intérêt s'est porté, ces dernières années, sur des oligonucléotides ci rculai res en raison de leurs propriétés topologiques et de reconnaissance d' acides nucléiques. Par rapport aux oligonucléotides linéai res, les oligonucléotides ci rculai res permettent de concevoir des outils d'analyse génétique améli o rés , en particulier grâce à leur amplification efficace par réplication en boucle. La li ais on d'un oli gonucléoti de ci rculai re préformé à un court fragment d' ADN en double brin peut être effectuée selon deux voies topologi quement distinctes. Dans l'une de ces voies, l'oligonucléotide se fixe dans le grand sillon de l' ADN tout en restant à l'extérieur de ce duplex. Dans l'autre voie, l'oligonucléotide ci rculai re encercle le duplex après que l' une des extrémités de celui-ci se soit glissée dans le ce rcle oli gonucléoti di que. Cette deuxième structure peut être insérée dans un fragment d'ADN en double brin ci rculai re plus long, mais cette procédure nécessite l' i nte rventi on d'étapes de li gati on dont le rendement et l' e f fi caci té peuvent être limités. L'invention vise un nouveau procédé permettant la ci rcula ris ati on d'un oli gonucléoti de directement autour d'un acide nucléique en double brin, quels que soient sa longueur et son état topologi que et, sans qu'il soit nécessaire de modifier enzymati quement ou chimiquement la cible d'acide nucléique. Ce procédé repose sur l' élaboration d'un complexe à trois brins, comportant un oligonucléotide pouvant s'enrouler autour du double brin d'acide nucléi que, et pouvant être ci rcula ris é. Le procédé de ci rcula ris ati on selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l' incubation d'un acide nucléique double brin comprenant une séquence cible, avec . soit un oligonucléotide simple brin a) comprenant une partie centrale capable de se fixer sur ladi te séquence cible, reliée par des séquences espaceurs à des séquences terminales en 5' et 3', complémentai res ellesmêmes de la séquence d'une matrice oli gonucléoti di que, soit un oligonucléotide simple brin b) dont les séquences te rmi nales en 5' et 3' peuvent se fixer de façon adjacente sur la séquence cible, ladite étape d'incubation étant réalisée dans des conditions permettant la fixation de l'oligonucléotide simple brin a) ou b) au niveau de la séquence cible par formation de li ais ons réve rs i bles , ce qui conduit à l' enroulement de l' oligonucléotide autour de sa cible, - dans le premiercas a), la mise en contact du complexe formé avec ladi te matrice oli gonucléotidi que, dans des conditions permettant l' hyb ri dati on des extrémités 5' et 3' , de manière adjacente, à la matrice, - la li gati on des extrémités hybridées, de manière à ci rculariser l'oligonucléotide autour de l'acide nucléique double brin et, si on le souhaite, - l' isolement de la structure circularisée, où l' acide nucléique cible est cadenassé par l'oligonucléotide circulaire, suivi le cas échéant de sa purification. On observera que de manière avantageuse, cette technique de ci rcula ris ati on est réalis able sans modification chimique ou enzymatique de l'acide nucléi que cible et n' implique qu'une courte séquence sur la cible. L'acide nucléique double brin mis en oeuvre selon l' i nventi on est constitué, selon un mode de réalisation, par un ADN en double hélice. On notera qu'un tel ADN en double hélice peut être un plasmide linéai re ou ci rculai re, et notamment un plasmide ci rculai re surenroulé. En ce qui concerne l'oligonucléotide simple brin a), qui doit être ci rcularisé, conformément à l' invention, autour de la cible d'acide nucléique, cet oligonucléotide doit avoir une longueur suffisante pour se lier d'une part à la cible et d'autre part à la matrice oligonucléotidique. Il peut ainsi comporter plus de 30 nucléotides, notamment de 30 à plusieurs centaines de nucléoti des . On uti lis e avantageusement un oligonucléotide comportant de 30 à 300 nucléotides, notamment de 30 à 100, avec comme partie centrale, destinée à se fixer sur la cible d'acide nucléique, une séquence de 10 à 25 nucléoti des . Selon une disposition de l' inventi on, on peut utiliser des oligonucléotides simple brin dans lesquels l' enchaînement comportant des bases nucléi ques n'est pas constitué que de li ais ons i nte rnucléos i di ques natu re l les de type phosphodi es te r, mais peut comporter par exemple des liaisons de type phosphorothiate, phosphoramidate, méthylphos phonate ou acide nucléi que peptidique, ou des mélanges de ces li ais ons . Selon une autre disposition, l' oli gonucléoti de simple brin est modifié chimiquement de manière à être relié covalemment à une ou plusieurs molécules de faible masse moléculai re. Il s'agit par exemple de marqueurs, comme la biotine, ou de molécules stabilisant les triple hé li ces , qui peuvent être liées de manière covalente, comme les benzo-indolo-quinolines, les benzo-quinoquinoxalines, les benzo-pyrido-indoles, et les benzo- py ri do-qui noxa li nes . De manière générale, l'oligonucléotide simple brin se lie à la séquence cible d'acide nucléi que et s' enroule autour du double brin constitué, le cas échéant, comme indiqué plus haut, par un ADN en double héli ce. On observera que l' o li gonucléoti de peut se fixer simultanément sur deux séquences en double brin portées pardeux acides nucléi ques différents, notamment deux ADN différents, qui peuvent être en double hélice, et par exemple des plasmides. Dans un mode de réalisation de l'invention, la fixation de la partie centrale sur une séquence cible d'ADN en double hélice conduit à la formation d'une triple hélice. La séquence cible sur l'ADN double brin est alo rs avantageusement une séquence oligopurine. oligopyrimidine. La liaison de l'oligonucléotide à l'acide nucléique en double brin, notamment la formation d'une triple hélice, peut être induite en ajoutant au mi li eu réactionnel un ligand de faible poids moléculai re. En diminuant la quantité de ligand, ou même en supprimant le ligand, il est possible de désolidariser l'anneau de sa cible et de contrôler son mouvement le long de la cible. Dans un mode préféré de l'invention, l' oli gonucléoti de se fixe au niveau d'une séquence oligopurine de la cible. La li ais on de l' oli gonucléoti de peut se faire parallèlement au brin oligopurine de la séquence oligopurine. oligopyrimidine ou, en variante, antiparallèlement par rapport au brin oligopurine de ladi te séquence selon les t riplets engagés. La matrice oligonucléotidique sur laquelle vont s'hybrider les extrémités de l' oligonucléotide simple brin a) renferme 10 à 36 nucléotides. Les extrémités qui s'hybrident avec une tel le matrice comportent alo rs géné ralement, chacune 5 à 18 nucléoti des . Pour la réalisation de l'incubation, les conditions notamment de pH, température, force ionique, sont choisies de manière à obtenir la fixation recherchée. De manière géné rale, on opère à un pH de 5 à 8,5, en particulier de 6 à 8, avec ou sans chauffage. Les étapes d'hybridation et de ligation, sont effectuées après l'étape d'incubation, dans le même tampon que pour l'incubation. La température dépend de l'agent de ligation uti lis é. Il peut s'agir d'une enzyme. On opérera alo rs avantageusement à une température de 16 à 45 C avec une li gas e de E.coli, ou encore de 35 à 65 C avec une li gas e the rmos table comme celle comme rci alis ée sous la marque Ampli gas e. En variante, on uti lis e un agent chimique pour la circularisation de l'oligonucléotide. On citera par exemple le N- (3-diméthylaminopropyl) -N' -éthylcarbodiimide (EDC) , le bromure de cyanogène, ou le cyanoimidazole. Avec de tels agents, la ligation peut être effectuée à des températures inférieures à 10 C, notamment de l'ordre de 4 C. Les concentrations ioniques peuvent varier de 0 à 20mM environ, pour des ions tels que Mg++, et de 0 à 1M pour des ions tels que Na+ ou K+. Lorsqu'on uti lis e une matrice oligonucléotidique, celle-ci est ajoutée après l' i ncubati on et juste avant l' addi ti on de l'agent de li gati on. Aux fins d' isolement de la structure complexe, on procède à l'inactivation de la ligase, et avantageusement à la purification du complexe. Cette étape de purification peut s'effectuer en chargeant l' échanti llon sur un gel, par exemple un gel d'agarose 1%, par chromatographie, colonne d' exclusion, ou à l'aide de billes portant un récepteur pour un ligand fixé sur l'oligonucléotide simple brin. L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les structures intermédiaires et les structures ci rcula ris ées formées. Entrent ainsi dans le champ de l'invention des structures intermédiaires d'acides nucléiques caractérisées en ce qu' elles comprennent un oligonucléotide simple brin tel que défini plus haut, fixé par liaisons réversibles sur la séquence cible d'acide nucléique. Plus spécialement, l'invention vise de telles structures dans lesquelles la cible d'acide nucléique est un ADN en double hélice, et notamment un plasmide, en particulier un plasmide surenroulé. Dans de tel les structures, l' oli gonucléoti de est fixé à la cible d'acide nucléique, enroulé autour de cette cible. En pa rti culi e r, l' oli gonucléoti de est fixé à un ADN en double hélice et forme une triple hélice. Dans une telle structure, la séquence cible de l'ADN double brin est avantageusement une séquence oligopurine. oligopyrimidine. Ces structures comprennent notamment une séquence à 10 à 25 triplets, formée par la séquence oligopurineoligopyrimidine de la cible sur laquelle est fixée l' oli gonucléoti de. Dans ces triple hélices, l' oligonucléotide est fixé parallèlement au brin contenant la séquence oligopurine, les triplets formés étant par exemple T.A x T; C. G x C; C. G x G. En variante, l' oli gonucléoti de est fixé antiparallèlement par rapport à la séquence oligopurine, les triplets formés étant T. A x T ; T. A x A ; C.G x G. Dans d'autres structures selon l' i nventi on, l'oligonucléotide se fixe simultanément sur deux séquences d'acides nucléi ques différentes, portées par deux acides nucléi ques différents, notamment deux ADN en double hélice, en particulier deux plasmides. Dans encore d'autres structures intermédiaires, les 2 extrémités de l'oligonucléotide sont en outre hybridées sur la matrice oli gonucléoti di que et avantageusement reli ées enzymatiquement ou chimiquement. Les structures correspondantes comportent donc une séquence à triplets impli quant l'acide nucléi que cible, reliée de chaque côté, par des séquences espaceurs, à une séquence à doublets impliquant la matrice oligonucléotidique. Des structures avantageuses comportent d'une part une cible comportant 10 à 25 triplets et d'autre part une matrice comportant 10 à 36 doublets, de préférence de 14 à 20 . L'invention vise notamment les structures telles que définies ci-dessus mais libérées de la matrice, comprenant un acide nucléique double brin encerclé par un anneau formé par un oligonucléotide simple brin. Dans les structures ci rcularis ées obtenues l'anneau est fixé de façon non covalente à la cible d'acide nucléique. En variante, il est libre de se déplacer le long de l'acide nucléique cible. Comme indiqué plus haut, le mouvement de l'anneau par rapport à la cible peut être cont rôl é par addition ou suppression d'un li gand spécifique du complexe formé entre la séquence de l' oli gonucléoti de impli quée dans la li ais on et celle de la cible. Dans ces différentes structures, l'oligonucléotide peut contenir des li ais ons autres que phos phodi. es te r, ou être chimiquement lié à d'autres molécules, comme défini plus haut. Comme indiqué ci-dessus en rapport avec le procédé, la cible est avantageusement de l'ADN en double hélice. En particulier, la cible est un plasmide linéai re ou ci rculai re, notamment un plasmide ci rculai re surenroulé. La structure correspondante est alors constituée de 2 molécules d'ADN ci rculai res , l'une en double brin, l'autre en simple brin, qui sont accrochées l' une à l'autre et peuvent être séparées, si on le souhaite, par rupture de la li ais on covalente. Dans les structures où l'oligonucléotide est fixé simultanément sur deux séquences différentes d'acides nucléiques, portées par exemple par deux plasmides différents, les deux plasmides sont reliés après la circularisation de manière covalente. On observera que l' oligonucléotide simple brin ci rcularisé autour de l' acide nucléique double brin permet le marquage de cet acide nucléique et constitue ainsi un outil de grand intérêt pour des appli cati ons de détection ou pour la purification des acides nucléiques. L'invention vise donc l'application du procédé de circularisation défini plus haut pour le marquage ou la détection d'acides nucléiques en double brin, notamment de plasmides , comprenant l' uti lis ati on d'un oligonucléotide simple brin relié covalemment à une molécule d'intérêt. Un tel marquage, qui ne nécessite aucune modification chimique ou enzymatique de la cible, est particulièrement intéressant dans le cas de plasmides et plus spécialement de plasmides surenroulés. L'oligonucléotide simple brin peut être marqué radioactivement ou chimiquement, par exemple par des groupements fluorescents. Un marquage indirect, à l' ai de de biotine par exemple, peut être révélé par l' utilisation de streptavidine couplée à de la fluorescéine. L'intensité du marquage peut être améliorée par utilisation d'anticorps anti-streptavidine couplés à la biotine, suivi d'une deuxième couche de s t reptavi di ne- f luo res céi ne. Alte rnativement, le marquage peut être effectué par l' intermédiai re d'une autre molécule d'acide nucléique capable de s'hybrider avec l'oligonucléotide simple brin. La détection peut être également réalisée par un mécanisme de réplication en boucle qui permet d' ampli fier la séquence de l'oligonucléotide ci rculai re simple brin. Des structures ci rcularis ées réalis ées avec de tels oligonucléotides permettent avantageusement de dénombrer les plasmides dans les cellules, même présents en faible nombre, ce qui constitue un avantage par rapport aux techniques FISH qui ne permettent la mesure d'une transfection de manière efficace que lorsque le plasmide est présent avec un nombre de copies très élevé. Elles permettent également de différencier deux séquences différant par seulement 1 ou 2 mutations, en détectant l'oligonucléotide fixé sur l'une de ces deux séquences grâce à la mmolécule portée sur cet oligonucléotide ou par un procédé de réplication en boucle. Selon une autre application, on notera que le procédé de ci rcula ris ati on selon l' i nventi on peut être mis en oeuvre pour sélectionner, par exemple parmi des séquences d'acides nucléiques simple brin dégénérées, des séquences d'acides nucléi ques capables de se fixer sur un acide nucléique double brin, et notamment des séquences capables de favoriser la pénétration d'acides nucléi ques en double brin dans des cellules, ou le ciblage de ces acides nucléiques vers des compartiments cellulai res spécifiques, en particulier vers le noyau. Grâce à ce procédé, on forme en effet des structures où l' oligonucléotide est fixé de manière irréversible à sa cible, qui peuvent être isolées, par exemple, par chromatographie, purification sur gel, colonnes d' exclusion. En utilisant des oligonucléotides contenant une séquence parti ellement aléatoi re, il est possible d'isoleret, si on le souhaite, d'ampli fier'les séquences qui confèrent à l'oligonucléotide la capacité de se fixer sur la cible d'acide nucléique en s' enroulant autour de lui. L'invention vise également les appli cati ons des di tes structures, notamment en détection et en thérapie génique. Conformément à l'invention, l'oligonucléotide simple brin peut comporter un résidu de composé chimique choisi pour améliorer par exemple des protocoles de purification de plasmides, la délivrance intracellulai re de plasmides vers un compartiment cellulaire spécifique (noyau, mitochondries, par exemple) , ou le ciblage dans des app li cati ons de thérapie génique. Il est ainsi possible de vectoriser des acides nucléiques double brin, avantageusement des ADN, et en particulier des plasmides, à l'aide de structures dans lesquelles l' oligonucléotide simple brin est couplé, de manière covalente, à des molécules susceptibles de favoriser sa pénétration à travers la membrane cel lulai re et/ou nucléai re. On citera notamment des peptides, comme la Séquence de Localisation Nucléai re (NLS) du produit du grand antigène T du virus SV4 0 (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys- Val), des molécules synthétiques d'une nature autre que peptidique, ou des fragments d'acides nucléi ques (ADN ou A RN) qui peuvent être intégrés dans la séquence de l'oligonucléotide simple brin. Des séquences dotées de ces propriétés peuvent être isolées par des expériences de sélection-amplification à partir de minicercles contenant une séquence aléatoi re. La formation de structures triplex selon l' invention présente également un intérêt pour réprimer spécifiquement l' expression d'un gène. Cette répression peut être inductible, notamment en uti lis ant un li gand spécifique des triple hélices. Il est ainsi possible d'éliminer l' expression du transgène en traitant les patients avec ledit li gand. Ils permettent également de relier de manière covalente, 2 molécules d'acide nucléique double brin différentes, et notamment 2 séquences portées par 2 plasmides différents, ce qui permet d'augmenter par exemple des rendements de co-t rans fecti on de bactéries ou de co-transformation de cellules, en assurant la présence concomittante de 2 plasmides différents. On notera que la formation de structures triplex de l'invention sont en outre utilisables pour effectuer des analyses génétiques par exemple pour détecter des mutations dans des échanti llons cytologi ques , ou encore pour étudier la distribution de certaines séquences. Selon une autre application, on notera que le procédé de ci rcula ris ati on selon l' i nventi on peut être mis en oeuvre pour sélectionner, par exemple parmi des séquences d'acides nucléiques simple brin dégénérées, des séquences d'acides nucléiques capables de se fixer sur un acide nucléique double brin, et notamment des séquences capables de favoriser la pénétration d'acides nucléi ques en double brin dans des cellules, ou le ciblage de ces acides nucléi ques vers des compartiments cellulai res spécifiques, en particulier vers le noyau. Grâce à ce procédé, on forme en effet des structures où l' oli gonucléoti de est fixé de manière irréversible à sa cible, qui peuvent être isolées, par exemple, par chromatographie, purification sur gel, colonnes d' exclusion. En utilisant des oligonucléotides contenant une séquence pa rti ellement aléatoi re, il est possible d' isoler et, si on le souhaite, d' amplifier les séquences qui confèrent à l'oligonucléotide la capacité de se fixer sur la cible d'acide nucléique en s' enroulant autour de lui. D'autres caractéristiques et avantages de l' invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans la description de ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 9, qui représentent respectivement : - la figure 1, un diagramme schématique du procédé de ci rcularisation d'un oligonucléotide autour d'un plasmide et autour d'un ADN en double hélice, - la figure 2, une séquence cible de la construction plasmidique pARl avec insertion du promoteur du récepteur aux androgènes (-146, +131), un oligonucléotide monobrin à circulariser et une matrice oligonucléotidique, - la figure 3, les résultats d'essais montrant la formation d'une triple hélice, - la figure 4, une photo d'un gel d' élect ropho rès e en conditions dénaturantes, avec les produits de li gati on et de clivage, - la figure 5, une photo d'un gel non dénaturant montrant la dissociation de triple hélices en l' absence de magnésium, - la figure 6, une séquence cible de la construction plasmidique pGAl, constituée de l'insertion d'un duplex synthétique entre les sites Eco RI et Ps t 1 du plas mi de pBluescript SK+ , comme rci alis é par Proméga, la séquence de la partie centrale de l'oligonucléotide à circulariser pour les constructions 2 et 3, et les ligands utilisés pour la construction 1, - la figure 7, une photo d'un gel en conditions dénaturantes, avec les produits de li gati on et de cli vage, - la figure 8, une photo d'un gel d'électrophorèse en agarose, avec les produits de li gati on, vis ualis é soit par éclai rage avec une lampe UV en présence de bromure d'éthidium (à droite), soit par autoradiographie après séchage du gel (à gauche), et - la figure 9, une photo d'un gel d' électrophorès e en conditions dénaturantes, avec les produits de li gati on. Exemple 1 : Constructions de triple hélice Le schéma du procédé de ci rcularis ation utilisé dans les exemples est donné sur la figure 1 dont l' examen montre la partie centrale (1) de l' oligonucléotide linéai re qui se lie au grand sillon d'une séquence spécifique à l' intérieur du plasmide (2) (partie gauche) ou d'un ADN double brin (3) (partie droite), pour former un complexe à triple hélice. Ses extrémités 5' et 3' (4) et (5) s'hybrident l' une à côté de l' aut re, à une matrice oligonucléotidique (6) et sont reliées par un agent de ligation (7) pour former un oligonucléotide ci rculai re (8) cadenassé à l' ADN plasmidique (partie gauche) ou à un fragment d'ADN (partie droite) Conformément à ce schéma, 3 types de triple hélices différents ont été réalisés. Construction 1, entre les sites BamH I et Xho I : Cette construction est i llus t rée par la figure 2 qui représente le plasmide pARl construit par insertion du promoteur du récepteur androgène de souris (-146,+131) entre le site BamH I et Xho I du plasmide p BL - CAT (dans le plasmide pAR4, les paires de bases G. C. indiquées par un * ont été mutées en T. A. ) SEQ ID N 1 représente la séquence-119, -70 du promoteur et SEQ ID N 2, la séquence complémentai re. SEQ ID N 1 : 5'AGGGGAGAAAAGGAAAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAGAGAAAGGAGGT 3' SEQ ID N 2 : 5' ACCTCCTTTCTCTCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTTCCTTTTCTCCCCT 3' La séquence d'ADN cible pour la formation de la triple hélice est localisée entre les positions -102 et -88 sur SEQ ID N 1. Elle correspond à SEQ ID N 4. La figure 2 donne également la séquence complète de l' oligonucléotide 89-mère ( SEQ ID N 3) sur laquelle on a indiqué le site se fixant sur la cible ("site triplex") et qui correspond à SEQ ID N 4, et la séquence de la matrice de 20 nucléotides (SEQ ID N 5). SEQ ID N 3 : 5' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGGGAGGGGAGGGTTT TTTTTTTTTTTTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3' L' oligonucléotide 89-mère comporte - une séquence centrale (SEQ ID N 4) capable de former une triple hélice : SEQ ID N 4 : GAGGGGAGGGGAGGG - deux linkers reliant SEQ ID N 4 à des séquences terminales de dix bases chacune, situées aux extrémités, pouvant former respectivement dix paires de bases avec la matrice de 20nucléotides (SEQ ID N 5), SEQ ID N 5 : CGACCGTACGGGATCCGAGC On ajoute un groupe phosphate à l'extrémité 5' de l' oligonucléotide pour l' étape suivante de ci rcula ris ati on enzymatique. En uti lis ant 32P-ATP, on obtient l' oli gonucléoti de radiomarqué. La position du site de restriction pour BsiW 1 à l'intérieur de la matrice oligonucléotidique de 20 pb est également indiquée. Deux autres séquences de matrice ont été utilisées, à savoir SEQ ID N 6, 36-mère: 5' GCTAGCGTCGACCGTACGGGATCCGAGCTCCACGTG 3' SEQ ID N 7, 14-mère : 5' CCGTACGGGATCCG 3' . Constructions 2 et 3, entre Hind III et Pst I : La figure 6 comprend les séquences du duplex synthétique entre les sites Eco RI et Ps t I (SEQ ID N 8et SEQ ID N 9) du plasmide pGAl. SEQ ID N 8 : 5 ' AG CTT CGTACGG CG CCCGAGTTAAGGGAGAAGAGGAAAGAGATTGAG CGAG CCCT AGGGACGTCCCGGGCTAGCGAATTCCTGCA 3' SEQ ID N 9 : 5' GGAATTCGCTAGCCCGGGACGTCCCTAGGGCTCGCTCAATCTCTTTCCTCTTCTC CCTTAACTCGGGCGCCGTACAG 3' La séquence cible est une séquence oligopurine. oligopyrimidine de 20 pb (SEQ ID N 10). SEQ ID N 10: 5'AAGGGAGAAGAGGAAAGAGA 3' Deux types de nucléotides ont été élaborés de manière à pouvoir être ci rcula ris és autour de cette séquence cible. . Cons t ructi on 2 : Ceux de la construction 2 comportent une partie centrale de 18 nucléotides composée de G et de T ( SEQ ID N ll). leur longueur totale peut varier de 43 à 89 nucléotides. SEQ ID N 11 : 5' TGTTTGGTGTTGTGGGTT 3' Les oligonucléotides simple brin correspondants suivants ont été élaborés : 5'CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTT TTTTTTTTTTTTT CACGTGGAGCT CGGAT CC 31 ( SEQ ID N 12, 89mère) , 5' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTTTTTTCACG TGGAGCTCGGATCC3' (SEQ ID N 13, 69-mère), 5' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTCACGTGGAGCTCGG ATCC3' (SEQ ID N 14 , 59-mère), 5' CGTACGGTCGACGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTGGAGCTCGGATCC3' (49-mère) (SEQ ID N 15, 49-mère), et 5' CGTACGGTCGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTGCTCGGATCC3' (SEQ ID N 16, 43-mère) . Cons t ructi on 3 : Les oligonucléotides de la construction 3 comportent une partie centrale de 15 nucléoti des composée de T et de C (SEQ ID N 17). SEQ ID N 17 : 5' CTCTTCTCCTTTCTCT 3' L'oligonucléotide simple brin répondant à la séquence suivante a été élaboré : 5' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTCTCTTCTCCTTTCTCTTTTTCACGTGGAGCTCG GATCC 3' (SEQ ID N 18) . Exemple 2 : Analyse de la formation d'une triple hélice par essai de co-migration On vérifie la formation d'une triple hélice dans la première construction, entre l' o li gonuc léoti de 89-mère et sa séquence cible sur le plasmide, en procédant à l'essai de co-migration suivant dont les résultats sont donnés sur la figure 3 : l' oligonucléotide 89-mère (10 fmol) est mis à incuber dans 10 l de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl lOmM, dithiothréitol 10 mM, ATP 1 mM, 25 ug/ml d'albumine de sérum bovin, en l' absence de plasmide (piste 1 sur la figure 3), en présence de 60 fmol de pARl surenroulé (piste 2), 60 fmol de pARl digéré par BamHI et Xho I (piste 3), et 60 fmol de pAR4 (piste 4). Les échantillons sont chauffés à 75 C, puis refroidis à 37 C et chargés sur un gel de polyacrylamide à 6 %. La migration est effectuée à 37 C dans un tampon T BE contenant 10 mM de MgCl2. La coloration du gel avec du bromure d'éthidium montre que le plasmide surenroulé pénètre entièrement dans le gel (piste 2) et la comparaison avec la mobi li té électrophorétique de marqueurs de poids moléculai res indique que la bande de la piste 3 migre comme un duplex de 700 pb. Lorsque l'oligonucléotide et le plasmide pARl sont incubés ensemble, l'oligonucléotide marqué migre en même temps que le plasmide. Cette migration ne se produit pas avec le plasmide pAR4, dans lequel la formation de la triple hélice ne peut se produire par suite de 6 mutations de G en T dans la séquence cible (ces mutations sont représentées sur la figure 2, et désignées par un astérisque) . Lorsque pARl est digéré à la fois par Xho I et BamH I, l' oligonucléotide marqué migre en même temps que le fragment de 700 pb qui contient la séquence cible. Exemple 3 : Analys e des produits de la li gati on et du clivage par électrophorèse sur gel dans des condi ti ons dénatu rantes avec la cons t ructi on 1 a - étude des produits de li gati on L' oligonucléotide marqué 89-mère est incubé comme décrit ci-dessus en rapport avec la figure 3 lorqu'on uti lis e, comme li gas e, pour l' étape ulté ri eure de li gati on, l'ADN li gas e du phage T4. Avec l'Ampligase, on utilise un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 8,3),KC1 25 mM, MgCl2 10mM, NAD 0,5mM, 0,01% Triton X100 et, avec la ligase de E. coli, un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), MgC12 10mM, DTT 10 mM, NAD 26 uM, albumine de sérum bovin 25 pg/ml. La réaction de li gati on est effectuée à 45 C, pendant 1 heure, en utilisant 40 U de T4 ADN ligase (New England, BLolabs). La réalisation de la réaction à cette température permet de réduire la formation de molécules de dimères linéaires qui se forment par suite de la ligation de deux oligonucléotides différents 89-mère s'hybridant à la matrice 20-mère. La li gas e est inactivée par la chaleur pendant 15 minutes à 65 C avant traitement par des endonucl éas es de restriction. Les rés ultats des différents essais sont donnés sur la figure 4. Dans les pistes 3 à 6 et 8, le plasmide est présent durant la réaction de li gati on. Dans la piste 7, le plasmide est ajouté après la ci rcularisation de l'oligonucléotide 89-mère, suivie d'une dénaturation par la chaleur de l'ADN ligase, comme indiqué par l' as té ris que. Les échanti llons sont précipités par addition d' éthanol et remis en suspension dans du formamide à 80 %, NaOH 10 mM, EDTA 1 mM comme tampon de charge. Le mélange réactionnel est chauffé à 90 C pendant 5 minutes, puis chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 %. On constate à l' examen de la figure 4 qu'en présence de la matrice de 20 oligonucléotides, l' oligonucléotide linéaire 89-mère est transformé en une molécule ci rculai re. La vitesse de migration dans un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 % apparaît plus faible. Comme indiqué ci-dessus, la li gati on est également effectuée en présence du plasmide pARl, dans des conditions permettant la formation de la triple héli ce. L' oligonucléotide marqué est transformé en une espèce ayant une très faible vitesse de migration, similai re à celle du plasmide lui-même, comme le révèle la coloration au bromure d'éthidium (figure 4, piste 4). La nature de cette espèce a été identifiée selon deux approches différentes. b - étude des produits de c li vage L' échanti llon a été traité avec l'endonucléase de restriction Xho I, ce qui permet de linéariser le plasmide pARl. Ce traitement libère l'oligonucléotide ci rculai re comme le montre la mobi li té électrophorétique (figure 4, piste 6) . En variante, l' échanti llon a été traité avec l'endonucléase de restriction BsiW I. Cet enzyme ne clive pas pARl, mais peut cliver l'oligonucléotide ci rculai re en présence de la matrice de 20 oligonucléotide. Le produit de clivage migre exactement comme l'oligonucléotide linéaire de 89-mère (figure 4, piste 5). L'espèce à faible migration ne peut pas être détectée dans les essais suivants : - lorsqu' on utilise, à la place de pARl, pAR4 qui ne forme pas de triplex avec l' oligonucléotide de 89-mère (piste 8 ) , - lorsqu' on ajoute le plasmide pARl après la circularisation de l'oligonucléotide de 89-mère et la dénaturation par la chaleur de la T4 ADN ligase (piste 7), et également - lorsqu'on uti lis e pour la ci rcula ris ati on un autre oligonucléotide linéai re qui ne peut pas former de triple hélice. Ces expériences montrent que l' oli gonucléoti de a été ci rcularisé autour de la cible d'ADN double brin et par conséquent a été cadenassé au plasmide. Les deux molécules restent associées dans des conditions fortement dénaturantes et ne peuvent être séparées qu'en rompant les li ais ons chimiques. Toutefois dans ce complexe, l' oligonucléotide ci rculai re, capable de former une triple hélice, peut diffuser dans une dimension le long de la double hélice. Exemple 4 : Dissociation des triple hélices en l' absence de magnésium dans un gel non dénaturant Les échanti l lons sont préparés comme décrits ci-dessus en présence de magnésium et chargés sur un gel de polyacrylamide à 6 % dépourvu de magnésium. La migration est réalis ée à 37 C dans un tampon TEE en l' abs ence de MgCl2. Les résultats des essais sont donnés sur la figure 5. On ne détecte pas de formation de triple hélice entre l' oligonucléotide de 89-mère linéai re et le plasmide pARl lorsqu' on fait migrer les échantillons incubés dans un tampon contenant du magnésium dans un gel non dénaturant, sans magnésium. (figure 5, piste 2). L' oligonucléotide radiomarqué ne reste associé avec le plasmide que lorsqu' il a été ci rcularisé en présence du plasmide et de magnésium avant de charger le gel (piste 4 ) . Lorsque le plasmide est digéré par Xho I, l'oligonucléotide ci rculai re reste associé au plasmide linéaire lorsque le gel contient du magnésium, mais se dissocie en l' abs ence de magnésium, bien que le site de clivage soit localisé à 200 pb du site cible de la triple héli ce. Dans la piste 6, le plasmide est ajouté après ci rcularisation de l' oligonucléotide de 89-mère, suivie d'une dénaturation parla chaleur de l'ADN li gas e. L'absence de magnésium (ou de tout autre cation divalent) apparaît donc suffisante pour empêcher la formation de la triple hélice et permettre à l' oligonucléotide ci rculai re de se déplacer autour du plasmide. D'autres stratégies peuvent être uti lis ées pour marquer le plasmide de manière à perdre l' interaction de la triple hélice après la ligation, par exemple en formant une triple hélice induite par un ligand ou une valeur donnée de pH. Exemple 5 :Analyse des produits de li gati on et de clivage par électrophorèse sur gel , en conditions dénaturantes avec la construction 2 Les rés ul tats obtenus sont représentés sur la figure 7. L' oli gonucléoti de, qui peut être un 59-mère (pistes 1 à 6) , un 69-mère (pistes 7 à 12), ou un 89-mère (pistes 13 à 18) (lOfmol) est mis à incuber dans le milieu décrit en rapport avec la figure 3 dans l' exemple 2, en l' absence de plasmide (pistes 1,2,7,8,13,14), en présence de pGAl (lug) (pistes 4,5,6,10,11,12,16,17,18), ou en présence de plasmide pBLuescript qui ne contient pas la cible pour la formation de la triple hélice (lug) (pistes 3,9 et 15) et dans certains cas en présence de li gand SD46 (4uM) (pistes 3,5,6,9,11,12,15,17,18). Les échantillons sont chauffés à 70 C, puis refroidis à 37 C. La réaction de ci rcula ris ati on est effectuée à 37 C pendant lh, en utilisant 40 U de T4 ADN ligase. La matrice n'a pas été ajoutée dans les pistes 1,7 et 13. La li gas e est inactivée par la chaleur. 10 l d'une solution de formamide contenant des colo rants de charge est alo rs directement ajoutée aux échanti llons . Le mélange réacti onnel est chauffé à 90 C pendant 5 min, puis chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 5 %. On constate à l'examen de la figure 7 que, en présence de la matrice de 20 nucléotides , les oligonucléotides de 59,69 et 89-mère sont transformés en des molécules ci rculai res de migration plus faible. L'apparition de produits de migration très lente n'est observée que si l'oligonucléotide a été préalablement incubé avec le plasmide pGAl contenant la séquence cible et le ligand SD4 6 . Cette espèce a été traitée avec l'endonucléase de restriction Hind III, ce qui permet de linéariser le plasmide pGAl. Ce traitement libère l'oligonucléotide ci rculai re. Ces expériences démontrent que les oligonucléotides ont été circularisées autour du plasmide par formation d'une triple hélice inductible par le li gand SD4 6. Exemple 6: Radiomarquage d'un plasmide surenroulé à l'aide de l'oligonuclétotide 89-mère Les résultats sont donnés sur la figure 8. L' oli gonucléoti de 89-mère est incubé comme indiqué cidessus, en présence de plasmide pGAl (lug) (pistes 1,2,4 et 5) ou p Bluescript (pistes 3 et 6), en présence de 2uM de ligand SD27 (pistes 1 à 3) ou SD46 (pistes 4 à 6) . Dans les pistes 1 et 4, la matrice est omise. Après réaction de ci rcula ris ati on et inactivation de la li gas e, 2ul de glycérol ont été ajoutés aux échantillons qui ont été chargés sur un gel d'agarose 1% et migré pendant 30 min à 50V dans du tampon TEE. Le gel a été visualisé sous lampe UV. La présence de bromure d'éthidium dans le gel révèle la présence de plasmide surenroulé dans l'ensemble des puits (à droite) (les pui ts 7 et 8 contiennent respectivement les plasmides p Bluescrpit et pGAl n'ayant subi aucun traitement). Le gel a été ensuite séché et autoradiographié. Un signal radioactif important est détecté au niveau du plasmide lorsque la circularisation a été effectuée en présence de pGAl et de ligand SD27 ou SD4 6. Cette expérience démontre que l'état topologi que du plasmide n'est pas affecté par les traitements effectués et qu'un oligonucléotide radiomarqué cadenassé à un plasmide permet de radiomarquer ce plasmide. Exemple 7: Analys e des produits de li gati on par électrophorèse sur gel , en conditions dénaturantes avec la cons t ructi on 3 Les résultats sont donnés sur la figure 9. L'oligonucléotide 59-mère (10 fmol) est mis à incuber dans 10 pl de ME S 50 mM (pH 6,0), MgCi2 20 mM, DTT 3 mM, ATP 1 mM, en l'absence de plasmide (pistes 1 et 2), en présence de pGAl (5 ug) (piste 4) ou p Bluescript (piste 3). Les échanti llons sont chauffés à 70 C, puis refroidis à 4 C. Après 14 h environ au minimum, la réaction de ci rcularisation est effectuée à température ambiante, pendant 2 h, en uti lis ant 40 U de T4 ADN li gas e. La li gas e est inactivée parla chaleu r. 10 l d'une s oluti on de formamide contenant des colo rants de charge est alo rs directement ajoutée aux échantillons. Le mélange réacti onnel est traité comme indiqué plus haut avec la figure 4. Dans ces conditions, l'oligonucléotide peut être circularisé par l'ADN ligase du phage T4 (piste 2). Il est circularisé autour du plasmide lorsque celui-ci contient la séquence cible pour la formation de la triple hélice (puits 4) . REVENDCATIONS 1/ Procédé de circularisation d'un oligonucléotide caractérisé en ce qu' il comprend - l' incubation d'un acide nucléique double brin comprenant une séquence cible, avec . soit un oligonucléotide simple brin a) comprenant une partie centrale capable de se fixer sur ladite séquence cible, reliée par des séquences espaceurs à des séquences terminales en 5' et 3' , complémentai res ellesmêmes de la séquence d'une matrice oli gonucléoti di que, soit un oligonucléotide simple brin b) dont les séquences te rmi nales en 5' et 3' peuvent se fixer de façon adjacente sur la séquence cible, ladi te étape d'incubation étant réalis ée dans des conditions permettant la fixation de l' oligonucléotide simple brin a) ou b) au niveau de la séquence cible par formation de liaisons réversibles, ce qui conduit à l' enroulement de l'oligonucléotide autour de sa cible, - dans le premier cas a), la mise en contact du complexe formé avec ladite matrice oligonucléotidique, dans des conditions permettant l' hybridation des extrémités 5' et 3' , de manière adjacente, à la matrice, la li gati on des extrémités hybridées, de manière à ci rculariser l'oligonucléotide autour de l'acide nucléique double brin et, si on le souhaite, - l' isolement de la structure ci rcularisée, où l'acide nucléique cible est cadenassé par l'oligonucléotide ci rculai re, suivi le cas échéant de sa purification. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l' acide nucléique mis en ouvre est un ADN en double héli ce. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l' acide nucléique est un plasmide, notamment un plasmide surenroulé. 4/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'oligonucléotide simple brin comporte plus de 30 nucléotides , en particulier de 30 à 300 nucléotides, notamment de 30 à 100, avec comme partie centrale, destinée à se lier à la cible d'acide nucléi que, une séquence de 10 à 25 nucléoti des . 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise des oligonucléotides simple brin dans lesquels l' enchaînement de bases nucléi ques comporte, en plus des li ais ons de type phos phodi es te r, des liaisons de type phosphorothiate, phos pho rami date, méthylphos phonate ou acide nucléique peptidique, ou des mélanges de ces li ais ons ou, en variante, est modifié chimiquement de manière à être relié covalemment à une ou plusieurs molécules de faible masse moléculai re. 6/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l' oli gonucléoti de simple brin se lie à la séquence cible d'acide nucléique et s' enroule autour du double brin d'acide nucléique constitué, le cas échéant, parun ADN en double hélice. 7/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fixation de l'oligonucléotide simple brin s'effectue sur une séquence cible d'ADN en double hélice et conduit à la formation d'une triple hélice. 8/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence cible sur l' ADN double brin est une séquence oligopurine. oligopyrimidine. 9/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la li ais on de l' oligonucléotide sur l' acide nucléique en double brin, notamment la formation d'une triple hélice, est induite en ajoutant au milieu réactionnel un ligand de faible poids moléculai re. 10/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice oligonucléotidique sur laquelle vont s'hybrider les extrémités de l' oligonucléotide simple brin renferme 10 à 36 nucléotides. 11/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l' étape d'incubation de l' acide nucléique avec l' oligonucléotide est réalisée à un pH de 5 à 8,5, en particulier de 6 à 8, avec ou sans chauffage. 12/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l' étape d'hybridation et la ligation sont effectuées après l'étape d'incubation, dans le même tampon que pourl'incubation. 13/ Procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les extrémités de l' oligonucléotide simple brin hybridées sont reliées par un procédé enzymatique. 14/ Procédé selon l' une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les extrémités de l' oligonucléotide simple brin hybridées sont reliées par un procédé chimique. 15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l' isolement et la purification de la structure circularisée sont effectués sur gel, par chromatographie, colonne d' exclusion, ou à l' ai de de bi l les portant un récepteur pour un li gand fixé sur l'oligonucléotide simple brin. 16/ Structure complexe d'acides nucléi ques caractérisée en ce qu' elle comprend un oligonucléotide simple brin tel que mis en oeuvre dans le procédé selon l' une quelconque des revendications précédentes, fixé par li ais ons réversibles sur la séquence cible d'acide nucléique, notamment sur un ADN en double hélice. 17/ Structure selon la revendication 16, caractérisée en ce que , l'oligonucléotide est fixé à la cible d'acide nucléique, enroulé autour de cette cible. 18/ Structure selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'oligonucléotide est fixé à un ADN en double hélice, en formant une triple hélice. 19/ Structure selon la revendication 18, caractérisée en ce que la séquence cible de l'ADN double brin est une séquence oligopurine. oligopyrimidine. 20/ Structure selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence à 10 à 25 triplets, formée par la séquence oligopurineoligopyrimidine de la cible sur laquelle est fixé l'oligonucléotide. 21/ Structure selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisée en ce que les 2 extrémités de l'oligonucléotide sont hybridées sur la matrice oligonucléotidique, et le cas échéant reliées entre elles par voie enzymatique ou chimique. 22/ Structure complexe d'acides nucléiques comprenant un acide nucléique double brin encerclé par un anneau formé par un oligonucléotide simple brin, l' anneau étant le cas échéant libre de se déplacer le long de l'acide nucléique cible. 23/ Structure selon la revendication 22, caractérisée en ce que le mouvement de l'anneau est contrôlé par l'addition ou la suppression d'un ligand spécifique du complexe formé entre la séquence de l'oligonucléotide et celle de la séquence cible. 24/ Structure selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que l'acide nucléi que est un ADN en double hélice, notamment un plasmi de, en particulier un plasmide surenroulé. 25/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 , pourle marquage ou la détection d'acides nucléiques en double brin, notamment de plasmides, comprenant l' uti lis ati on d'un oligonucléotide simple brin relié covalemment à une molécule d'intérêt. 26/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour la détection d'une séquence spécifique présente sur l'acide nucléi que cible en double brin, comprenant l'utilisation de molécules couplées à l'oligonucléotide, ou la mise en ouvre d'uun procédé de réplication en boucle. 27/ Application du procédé de circularisation selon l'une que lconque des revendications 1 à 15 , pour différencier deux séquences différant parseulement 1 ou 2 mutations, en détectant l'oligonucléotide fixé sur l'une de ces deux séquences grâce à la molécule portée sur cet oligonucléotide ou par un procédé de réplication en boucle. 28/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour sélectionner, par exemple parmi des séquences d'acides nucléiques simple brin dégénérées, des séquences d'acides nucléiques capables de se fixer sur un acide nucléique double brin, et notamment des séquences capables de favoriser la pénétration d'acides nucléi ques en double brin dans des cellules, ou le ciblage de ces acides nucléiques vers des compartiments ce llulai res spécifiques, en particulier vers le noyau. 29/ Application des structures selon l'une quelconque des revendications 16 à 24, en thérapie génique, pour l' i nhi bi ti on spécifique d'un gène porté par un acide nucléique en double brin, en particulier par un plasmide, par fixation de l' oligonucléotide ci rculai re sur l' acide nucléique, et coontrôle de cette fixation par des molécules de faible masse moléculaire, notamment par un ligand spécifique des triple hélices. 30/ Application des structures selon l'une quelconque des revendications 16 à 25, dans laquelle l'oligonucléotide est couplé à une molécule permettant de faire pénétrer un acide nucléique dans une cellule , ou encore permettant le ciblage de la structure vers un compartiment cellulaire et/ou nucléaire.