Brevet FR2794648A1 — publié le 20001215

La présente invention a trait à des vaccins ADN améliorés pour les animaux de compagnie ou de sport, en particulier chiens, chats et chevaux. L'utilisation de molécules d'acide désoxyribonucléique (ADN) pour la vaccination est connue depuis le début des années 90 (Wolf et al. Science 1990. 247.1465-1468). Cette technique de vaccination induit une immunité cellulaire et humorale après la transfection in vivo de cellules du sujet à vacciner par des molécules d'ADN ou d'ARN codant et exprimant des protéines immunologiquement actives. Un vaccin ADN se compose d'au moins un plasmide pouvant être exprimé par la machinerie cellulaire du sujet à vacciner et d'un véhicule ou d'un excipient pharmaceutiquement acceptable. La séquence nucléotidique de ce plasmide code et exprime, entre autres, un ou plusieurs immunogènes, tels que des protéines ou glycoprotéines capables d'induire, chez le sujet à vacciner, une réponse immunitaire cellulaire (mobilisation des lymphocytes T) et humorale (stimulation de la production d'anticorps spécifiquement dirigés contre l'immunogène) (Davis H. L. Current Opinion Biotech. 1997. 8. 635-640). Tous les immunogènes provenant d'un pathogène ne sont pas des antigènes assez efficaces naturellement pour induire une réponse immunitaire protectrice optimale chez l'animal à vacciner. Il est donc nécessaire d'améliorer la réponse immunitaire. Chaque voie d'administration comporte ses propres contraintes et difficultés ; ainsi un vaccin ADN efficace par une voie d'administration peut être inefficace par une autre. Le choix de la voie d'administration doit tenir compte des besoins des praticiens et des éleveurs, des difficultés liées à la contention des animaux ou à la nature du produit. Bien que la voie intramusculaire puisse être utilisée, la voie sous-cutanée présente un grand intérêt pour la vaccination des animaux de compagnie, surtout pour les animaux de petite taille et de manipulation difficile. Les vaccins ADN doivent donc être améliorés pour permettre leur administration efficace par des voies différentes. Des vaccins ADN ont déjà été utilisés expérimentalement, notamment un vaccin ADN codant pour l'hémagglutinine (HA) du virus de la rougeole (Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997.78. 1577-1580) dont l'administration intranasale chez la souris s'est révélée être plus efficace qu'une administration orale. Autre exemple, un vaccin ADN codant pour la protéine d'enveloppe (Env) du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) dont l'administration sous-cutanée n'a pas été efficace en comparaison de l'administration par la voie intramusculaire (Ishii et al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997.13. 1421-1428). Les vaccins ADN ont également été utilisés expérimentalement contre des virus d'animaux, notamment contre les virus de la maladie de Carré (CDV). Certains immunogènes de CDV sont connus, notamment la protéine de nucléocapside (N), la protéine de matrice (M), la protéine de fusion (F) et l'hemagglutinine (HA) (WO-A-9741236). Cependant, l'administration souscutanée d'un vaccin ADN codant pour l'hémagglutinine et la protéine de fusion de CDV n'a pas permis de détecter la production d'anticorps chez la souris, et uniquement une faible production d'anticorps après l'administration intramusculaire de ce vaccin ADN (Sixt et al. J. Virol. 1998.72. 8472-8476). L'induction d'une réponse immunitaire et les relations entre les différents éléments du système immunitaire intervenant lors de cette réponse peuvent être différentes d'une espèce animale à une autre. Les nombreux enseignements tirés des expériences menées sur le modèle souris ont permis de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez la souris, mais ces enseignements ne sont pas directement transposables aux autres espèces, notamment car il est plus facile d'induire une réponse immunitaire chez la souris que chez les autres espèces (van Drunen Little-van den Hurk et al. J. Gen. Virol. 1998.79. 831-839 ; Böhm et al. Vaccine 1998. 16. 949-954). Différentes voies d'administration du vaccin ADN ont été proposées (intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, muqueuse, etc. ). Différents moyens d'administration ont également été proposés, notamment des particules d'or enrobées d'ADN et projetées de façon à pénétrer dans les cellules de la peau du sujet à vacciner (Tang et al. Nature 1992.356. 152-154) et les injecteurs par jet liquide permettant de transfecter à la fois des cellules de la peau et des cellules des tissus sous-jacents (Furth et al. Analytical Bioch. 1992.205. 365-368). Des composés chimiques ont été utilisés pour la transfection in vitro d'ADN : A/ - les lipides cationiques. Les lipides cationiques sont eux-mêmes divisés en quatre sous-groupes. 1) les lipides cationiques contenant des sels d'ammonium quaternaire, comme par exemple le DOTMA (dioléoyloxypropyl-triméthylammonium, produit par Gibco sous le nom de Lipofectine), le DOTAP (triméthyl-2,3-(octadéc-9-èneoyloxy)-1-propanammonium ; Gregoriadis et al. FEBS Letters 1997.402. 107- 110), le DMRIE (N-(2-hydroxyéthyl)-N,N-diméthyl-2,3-bis(tetradécyloxy)-1- propanammonium; WO-A-9634109), le DLRIE (N-(2-hydroxyéthyl)-N,Ndiméthyl-2,3-bis(dodécyloxy)-1-propanammonium ; Felgner et al. Ann. N Y Acad. Sci. 1995. 772. 126-139). Ces lipides cationiques contenant des sels d'ammonium quaternaire peuvent être associés ou non avec un lipide neutre supplémentaire, tel que le DOPC (dioléoyl-phosphatidyl-choline) ou le DOPE (dioléoyl-phosphatidyl-éthanolamine) (J. P. Behr, Bioconjugate Chemistry 1994.5. 382-389). 2) les lipoamines, comme par exemple le DOGS (dioctadécylamidoglycylspermine, produit par Promega sous le nom de Transfectam; Abdallah et al. Biol. Cell. 1995.85. 1-7), le DC-Chol (diméthylaminoéthane-carbamoyl-cholestérol ; Gao et Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991.179. 280-285), le BGSC (bis-guanidine-spermidinecholestérol), le BGTC (bis-guanidine-tren-cholestérol) (Vigneron et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996.93. 9682-9686). 3) les lipides cationiques contenant des sels d'ammonium quaternaire et des lipoamines, comme par exemple le DOSPA (N,N-diméthyl-N-(2- (sperminecarboxamido)éthyl)-2,3-bis(dioléoyloxy)-1-propanimidium pentahydrochloride, commercialisé par Gibco sous le nom de LipofectAmine ; Hawley-Nelson et al. Focus 1993.15. 73-79), le GAP-DLRIE (N-(3-aminopropyl)N,N-diméthyl-2,3-bis(dodécyloxy)-1-propanaminium ; Wheeler et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996.93. 11454-11459 ; Norman et al. Vacine 1997.15. 801- 803). 4) les lipides contenant des sels d'amidine, comme par exemple l'ADPDE, l'ADODE (Ruysschaert étal. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.203. 1622- 1628). B/ - les polymères, comme par exemple le SuperFectTM (molécules de dendrimères activés, produits par Qiagen ; Xuet al. Mol. Genet. Metab. 1998. 64.193-197), et CI - les agents biochimiques, comme par exemple les toxines, notamment les toxines cholériques. Certains de ces composés ont aussi été utilisés dans la formulation de vaccins ADN avec des résultats plus que mitigés. Les connaissances en matière de transfection in vitro ne sont pas transposables à la vaccination ADN où l'objectif final est d'assurer une réaction immunitaire protectrice. Des effets négatifs sur l'induction d'une protection immunitaire efficace ont même été constatés avec des composés connus pour favoriser la transfection in vitro. Certains composés chimiques de formulation sont toxiques à hautes doses pour les cellules transfectées. Dans les travaux de Etchart déjà cités (Etchart et al. ,J. Gen. Virol. 1997. 78. 1577-1580), l'utilisation du DOTAP n'a pas eu d'effet adjuvant lors de l'administration du vaccin ADN par la voie intranasale, alors qu'il en a eu par la voie orale. Le DOTAP a également été utilisé dans des vaccins ADN codant pour l'hémagglutinine (HA) du virus de la grippe sur le modèle souris administrés par la voie intranasale (Ban étal. Vaccine 1997. 15. 811-813), mais l'addition de DOTAP a inhibé la réponse immunitaire. L'utilisation de DC-Chol ou de DOTAP/DOPE dans des vaccins ADN codant pour la protéine de surface (S) du virus de l'hépatite B sur le modèle souris administrés par la voie intramusculaire a permis d'augmenter la réponse en anticorps, alors que l'utilisation de la Lipofectine (ou DOTMA) n'a pas augmenté cette réponse (Gregoriadis et al. FEBS Letters 1997.402. 107-110). Le DC-Chol/DOPE a également été utilisé dans des vaccins ADN contre le virus de l'immunodéficience humaine ( HIV, protéine Env) sur le modèle souris, dont l'administration par la voie intramusculaire a induit une réponse immunitaire plus efficace, alors que l'administration par la voie sous-cutanée ou intradermique ne l'a pas augmentée (Ishii et al. AIDS Res. Hum. Retro. 1997.13. 1421-1428). L'addition de certaines cytokines, notamment d'interleukines ou d'interférons, peut permettre d'améliorer la réponse immunitaire induite en particulier par les vaccins ADN. Chaque cytokine déclenche une réaction qui lui est propre et oriente plus ou moins la réponse immunitaire vers une réponse cellulaire ou vers une réponse humorale (Pasquini et al. Immunol. Cell. Biol. 1997.75. 397-401 ; Kim et al. J. Interféron Cytokine Res. 1999.19. 77-84). Les effets adjuvants d'une cytokine provenant d'une espèce donnée ne sont pas nécessairement les mêmes si le contexte immunitaire varie, notamment si cette cytokine est administrée à une autre espèce, donc dans un système immunitaire hétérologue. L'addition de cytokine peut également n'avoir aucun effet adjuvant, voire aboutir à une inversion de l'effet recherché, c'est-à-dire une diminution ou une inhibition de la réponse immunitaire. Ainsi, un vaccin ADN codant pour une chaîne simple d'une immunoglobuline fusionnée avec le GM-CSF n'augmente pas la réponse immunitaire, alors que l'administration directe chez la souris de cette protéine de fusion est efficace, tout comme l'est l'administration d'une protéine de fusion formée de Fv et de la cytokine IL-1bêta ou l'administration d'un vaccin ADN codant pour cette dernière protéine de fusion (Hakim et aL J. Immunol 1996.157. 5503-5511). L'utilisation de plasmides co-exprimant la cytokine IL-2 et la protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B dans une conformation fusionnée ou non fusionnée résulte dans l'augmentation des réponses immunitaires humorales et cellulaires (Chow et al. J. Virol. 1997.71. 169-78). Mais l'utilisation d'un plasmide bicistronique codant pour la glycoprotéine gp120 du virus de l'immunodéficience acquise humaine (HIV-1) et la cytokine IL-2 a induit une réponse immunitaire spécifique anti-gp120 plus faible que celle obtenue par l'utilisation d'un plasmide monocistronique codant uniquement pour gp120 (Barouch et al. J. Immunol 1998.161. 1875-1882). La co-injection chez la souris de deux vecteurs d'expression, l'un codant pour la glycoprotéine G du virus de la rage, l'autre pour le GM-CSF murin stimule l'activité des lymphocytes B et T, alors que la co-injection avec un plasmide codant pour l'interféron gamma (à la place du GM-CSF murin) a pour résultat une diminution de la réponse immunitaire (Xiang et al. Immunity 1995.2. 129- 135). Certaines modifications au niveau des antigènes, telles que les délétions d'une partie de la séquence nucléotidique codant pour l'antigène, les insertions d'un fragment d'ADN dans la séquence nucléotidique codant pour l'antigène ou dans les régions non traduites en amont ou en aval, peuvent également améliorer l'efficacité des vaccins ADN, notamment en améliorant le niveau d'expression de l'antigène ou sa présentation. Mais en pratique, les manipulations au niveau de la séquence nucléotidique codant pour l'antigène peuvent entraîner une diminution ou la perte de l'activité immunologique initiale. Ainsi, la délétion du domaine transmembranaire dans le gène codant pour l'antigène G du virus de la rage a diminué le niveau de protection induit chez le modèle souris après administration par la voie intramusculaire d'un vaccin ADN codant pour cet antigène modifié (Xiang et al. Virol. 1995.209. 569). La délétion du domaine transmembranaire dans le gène codant pour la glycoprotéine gD du virus herpès bovin (BHV) n'a pas permis d'augmenter la réponse en anticorps et n'a induit qu'une protection partielle chez les bovins vaccinés par la voie intramusculaire (van Drunen Littlevan den Hurk étal. J. Gen. Virol. 1998.79. 831-839). Les réponses immunitaires humorales et cellulaires et la protection conférée sont identiques chez des cobayes éprouvés après avoir été immunisés à l'aide soit d'un vaccin ADN codant pour la glycoprotéine GP du virus Ebola, soit d'un vaccin ADN codant pour cette glycoprotéine GP mais sous une forme sécrétée (Xu et al. Nature Medicine 1998. 4. 37-42). L'insertion de la séquence signal de l'activateur plasminogène tissulaire humain (en anglais human tissue Plasminogen Activator ou human tPA) dans le gène codant pour l'antigène Pf332 de la malaria n'a pas permis d'augmenter la réponse en anticorps chez la souris vaccinée par voie intramusculaire (Haddad et al. FEMS 1997.18. 193-202). L'addition en phase d'une séquence tPA au gène codant pour l'antigène VP7 du rotavirus murin n'a pas également permis d'augmenter la réponse en anticorps chez la souris vaccinée par voie intradermique, alors que la protéine de fusion formée de l'antigène VP4 et du tPA a permis cette augmentation, mais sans induire une protection efficace (Choi étal. Virology 1998.250. 230-240). Les modifications effectuées sur la séquence nucléotidique d'un antigène ne peuvent pas en général être directement transposées à un autre antigène, car les antigènes n'ont pas toujours les mêmes agencements structuraux. La déposante a pour objectif l'amélioration de l'efficacité de la vaccination ADN. Elle a en particulier pour objectif d'obtenir une meilleure réponse immunitaire et notamment une protection efficace chez les animaux de compagnie et de sport, notamment chez le chien, le chat et le cheval, par la vaccination ADN, pour différentes voies d'administration, et en particulier pour la voie sous-cutanée. La déposante a pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés induisant une réponse immunitaire efficace et protectrice contre le virus de la maladie de Carré (CDV), le virus du complexe respiratoire ou toux des chenils (virus parainfluenza-2 ou CPI-2), le virus herpès canin (CHV-1) chez le chien. La déposante a pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés induisant une réponse immunitaire efficace et protectrice contre le virus herpès félin (FHV-1) chez le chat. La déposante a pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés induisant une réponse immunitaire efficace et protectrice contre le virus herpès équin de type 1(EHV-1), le virus herpès équin de type 4 (EHV-4) chez le cheval. La déposante a également pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le chien, comprenant au moins une valence choisie parmi le groupe formé du virus CDV, du virus CPI- 2, du virus CHV-1, du virus de la rage (rhabdovirus), du parvovirus canin (CPV), du coronavirus canin (CCV) et de Borrelia burgdorferi. La déposante a également pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le chat comprenant au moins une valence choisie dans le groupe formé du virus herpès félin (FHV- 1), du calicivirus félin (FCV), du virus de la rage (rhabdovirus), du parvovirus félin (FPV), du virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV), du virus de la leucémie féline (FeLV), et du virus du syndrome de l'immunodéficience acquise féline (FIV). La déposante a également pour objectif l'élaboration de vaccins ADN améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le cheval, comprenant au moins une valence choisie parmi le groupe formé du virus herpès équin de type 1 (EHV-1), du virus herpès équin de type 4 (EHV-4), du virus de la grippe équine, du virus de l'encéphalite équine de l'Est, du virus de l'encéphalite équine de l'Ouest, du virus de l'encéphalite équine du Venezuela, du virus de la rage, de Clostridium tetani, et de Borrelia burgdorferi. L'invention a pour objet des vaccins ADN améliorés permettant d'obtenir une protection efficace contre au moins un pathogène infectant les animaux de compagnie ou les animaux de sport, notamment les chiens, les chats et les chevaux. Le vaccin ADN est amélioré : soit par sa formulation, soit par l'addition de GM-CSF, soit par l'optimisation du ou des antigènes, soit par des combinaisons de ces propositions. De préférence, le vaccin ADN est amélioré par sa formulation, et facultativement soit par l'addition de GM-CSF, soit par l'optimisation du ou des antigènes, enfin soit par l'addition de GM-CSF et par l'optimisation du ou des antigènes. Par définition, le vaccin ADN comprend comme principe actif un plasmide codant pour et exprimant un gène ou fragment de gène. Le terme plasmide recouvre une unité de transcription ADN comprenant une séquence polynucléotidique comprenant la séquence du gène à exprimer et les éléments nécessaires à son expression in vivo. On préfère la forme plasmide circulaire, superenroulée ou non. La forme linéaire entre également dans le cadre de cette invention. Chaque plasmide comprend un promoteur apte à assurer, dans les cellules hôtes, l'expression du gène inséré sous sa dépendance. Il s'agit en général d'un promoteur eucaryote fort et en particulier d'un promoteur précoce du cytomégalovirus CMV-IE, d'origine humaine ou murine, ou encore éventuellement d'une autre origine telle que rat, cobaye. De manière plus générale, le promoteur est soit d'origine virale, soit d'origine cellulaire. Comme promoteur viral autre que CMV-IE, on peut citer le promoteur précoce ou tardif du virus SV40 ou le promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous. Il peut aussi s'agir d'un promoteur de virus dont provient le gène, par exemple le promoteur propre du gène. Comme promoteur cellulaire, on peut citer le promoteur d'un gène du cytosquelette, tel que par exemple le promoteur de la desmine, ou encore le promoteur de l'actine. Lorsque plusieurs gènes sont présents dans le même plasmide, ceux-ci peuvent être présentés dans la même unité de transcription ou dans deux unités différentes. Suivant une première modalité, les vaccins ADN selon l'invention sont formulés par addition à titre d'adjuvant, de lipides cationiques contenant un sel d'ammonium quaternaire, notamment le DMRIE, de préférence associé avec un lipide neutre, notamment le DOPE, pour former préférentiellement le DMRIE- DOPE. La présente invention a donc pour objet un vaccin ADN contre au moins un pathogène touchant les animaux de compagnie ou de sport, notamment les chiens, chats ou chevaux, comprenant au moins un plasmide contenant au moins une séquence nucléotidique codant pour un immunogène d'un pathogène de l'espèce animale considérée, dans des conditions permettent l'expression in vivo de cette séquence, et un lipide cationique contenant un sel d'ammonium quaternaire, notamment le DMRIE, de préférence associé au DOPE. De préférence, le mélange vecteur recombinant avec cet adjuvant se fait de manière extemporanée et l'on préfère, avant son administration à l'animal, laisser le temps au mélange ainsi constitué de se complexer, par exemple pendant une durée allant de 10 à 60 minutes, notamment de l'ordre de 30 minutes. Lorsque du DOPE est présent, le ratio molaire DMRIE : DOPE va de préférence de 95 : à 5 : 95,plus particulièrement de 1 : Le ratio pondéral plasmide : adjuvant DMRIE ou DMRIE-DOPE peut aller notamment de 50 : à 1 : notamment de 10 : 1 à 1 : de préférence de 1 : 1à1:2. Suivant une deuxième modalité , on ajoute aux vaccins selon l'invention le GM-CSF (en anglais Granulocyte macrophage - colony stimulating factor ; Clark S. C. étal. Science 1987.230. 1229 ; Grant S. M. et al. Drugs 1992.53. 516), ce qui peut se faire par l'incorporation de protéine GM-CSF directement dans la composition vaccinale ou de préférence par l'insertion de la séquence codant pour le GM-CSF dans un vecteur d'expression dans des conditions permettant son expression in vivo. Comme vecteur d'expression, on préfère utiliser un plasmide, e. g. le plasmide contenant la séquence nucléotidique codant pour le (ou les) antigène (s) d'intérêt ou un autre plasmide. Le choix du GM-CSF se fait en fonction de l'espèce animale à vacciner, ainsi pour les chiens le GM-CSF canin est utilisé, pour les chats il s'agit du GM-CSF félin, et du GM-CSF équin pour les chevaux. Suivant une troisième modalité, la (ou les) séquence nucléotidique codant pour l'immunogène sont sous une forme optimisée. Par optimisation, on entend toute modification de la séquence nucléotidique, notamment se manifestant au moins par un niveau d'expression plus élevé de cette séquence nucléotidique, par une augmentation de la stabilité de l'ARN messager codant pour cet antigène, par la sécrétion provoquée de cet antigène dans le milieu extracellulaire, et ayant pour conséquence directe ou indirecte une augmentation de la réponse immunitaire induite. Dans la présente invention, l'optimisation de l'antigène d'intérêt consiste de préférence en la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire de l'antigène d'intérêt (par délétion, on entend la délétion totale ou une délétion partielle suffisante pour que le domaine transmembranaire ne soit plus, ou substantiellement plus, fonctionnel), et/ou en l'addition en phase d'une séquence nucléotidique codant pour le signal tPA (en anglais tissue plasminogen activator ; Montgomery et al. Cell. Mol. Biol. 1997. 43.285-292 ; Harris et al. Mol. Biol. Med 1986.3. 279-292), et/ou en l'insertion d'intron stabilisateur en amont du gène à exprimer. La délétion du fragment d'ADN codant pour le domaine transmembranaire de l'antigène d'intérêt favorise la sécrétion vers le milieu extracellulaire des antigènes ainsi tronqués et ainsi augmente leurs possibilités de contact avec les cellules du système immunitaire. L'insertion de la séquence nucléotidique codant pour le signal tPA facilite la traductibilité de l'ARN messager auquel le signal tPA est joint, et augmente ainsi le niveau d'expression de cet ARN messager et donc la production d'antigènes. Le signal tPA joue aussi un rôle dans la sécrétion de l'antigène synthétisé. L'insertion d'un intron stabilisateur dans le gène codant pour l'antigène d'intérêt évite les épissages aberrants de son ARN messager et maintient l'intégrité physique de ce dernier. De préférence le signal tPA est d'origine humaine. La séquence nucléotidique du signal tPA humain est accessible auprès de la base de données Genbank sous le numéro d'accès NM~000930. De préférence, l'intron est l'intron II du gène de la bêta-globine du lapin (van Ooyen et al. Science 1979.206. 337-344), dont la séquence nucléotidique est accessible auprès de la base de données GenBank sous le numéro d'accès V00882 et référencée sous intron n 2. La présente invention a pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le chien contre la maladie de Carré (en anglais Canine Distemper Virus ou CDV). Le virus de la maladie de Carré est un Morbillivirus, membre de la famille des Paramyxoviridae. Ce virus infecte l'espèce canine, mais aussi les félins sauvages (Harder et al. J. Gen. Virol. 1996.77. 397-405). La présente invention permet d'obtenir un vaccin ADN efficace et protecteur contre la maladie de Carré chez le chien, en particulier par la voie sous-cutanée qui demeurait jusqu'à ce jour une voie induisant un niveau de protection marginal (Sixt et al. J. Virol. 1998.72. 8472-8476). Selon l'invention, le vaccin ADN contre CDV est de préférence amélioré par sa formulation avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOP. Facultativement, cela peut être combiné avec soit l'addition de GM-CSF canin (Nash et al. Blood 1991.78. 50-56), soit l'optimisation d'au moins un antigène de CDV, enfin soit l'addition de GM-CSF canin et l'optimisation d'au moins un antigène de CDV. Une séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF canin est accessible auprès de la base de données GenBank sous le numéro d'accès S49738. L'addition de GM-CSF canin peut se faire par l'incorporation du polypeptide GM-CSF canin dans la composition vaccinale ou de préférence par l'insertion de la séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF canin dans un vecteur d'expression in vivo, de préférence un plasmide. De préférence, la séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF canin est insérée dans un second plasmide d'expression, différent de celui (ou de ceux) dans lequel est inséré le ou les gènes codant pour le ou les antigènes de CDV. L'optimisation des antigènes issus de CDV se fait par substitution, par une séquence signal ", notamment celle du signal tPA d'origine humaine (GenBank numéro d'accès NM~000930), de la séquence du peptide signal de l'hémagglutinine (HA) et/ou de la protéine de fusion (F), et/ou par la délétion du fragment d'ADN codant pour le domaine transmembranaire de HA et/ou de F, et/ou par l'insertion d'un intron, notamment de l'intron Il du gène de la bêtaglobine du lapin (dont la séquence nucléotidique, notée intron n 2, est accessible auprès de la base de données GenBank sous le numéro d'accès V00882) en amont de la séquence nucléotidique codant pour HA et/ou F. Le vaccin ADN contre CDV selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de CDV optimisé (HA ou F) ou les deux, c'est-à-dire HA optimisé et F optimisé. Optionnellement, la séquence codant pour la protéine de matrice (M) de CDV sous sa forme native (sans modification) et/ou la séquence nucléotidique codant pour la nucléoprotéine (N) de CDV sous sa forme native (sans modification) peuvent être également insérées et exprimées dans un plasmide et associées aux plasmides contenant HA optimisé et/ou F optimisé. Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de CDV utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont illustrées dans les exemples annexés et dans WO-A-9803199, en particulier dans les exemples 8 et 9 et les figures 2 et 3. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CDV en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIEDOPE, et se compose d'un plasmide d'expression (e. g. pNS024, Figure 4) codant pour l'antigène HA de CDV optimisé par substitution de la séquence signal de HA par la séquence peptide signal tPA humain, par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire de HA et par l'insertion de l'intron II du gène de la bêtaglobine du lapin en amont du gène HA, et d'un second plasmide d'expression (e. g. pNS021, Figure 3) codant pour l'antigène F de CDV optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire et par l'insertion de l'intron Il du gène de la bêta-globine du lapin en amont du gène F. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CDV en vue d'une administration par la voie sous-cutanée est formulé avec du DMRIEDOPE, et se compose d'un plasmide d'expression codant pour le GM-CSF canin et des deux plasmides précédemment définis (e. g. pNS024 et pNS021). La présente invention a aussi pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le chien contre le complexe respiratoire ou toux de chenil (virus parainfluenza-2 canin ou CPI-2). Le virus CPI-2 est un Paramyxovirus, membre également de la famille des Paramyxoviridae (Bittle et al. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1970.156. 1771-1773 ; Moloney et al. Aust Vet J. 1985. 62. 285-286). Le vaccin ADN contre CPI-2 est de préférence formulé avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné avec soit l'addition de GM-CSF canin, soit l'optimisation d'au moins un antigène de CPI-2, enfin soit l'addition de GM-CSF canin et l'optimisation d'au moins un antigène de CPI-2. L'addition de GM-CSF canin peut se faire comme cela est décrit pour CDV. L'optimisation des antigènes issus de CPI-2 se fait par substitution, par 'une séquence " signal ", notamment celle du tPA d'origine humaine, de la séquence signal de l'hémagglutinine-neuraminidase (HN) de CPI-2 et/ou de la protéine de fusion (F) de CPI-2, et par la délétion du fragment d'ADN codant pour le domaine transmembranaire de HN et/ou de F, et par l'insertion d'un intron, notamment de l'intron Il du gène de la bêta-globine du lapin en amont de la séquence nucléotidique codant pour HN et/ou pour F. Le vaccin ADN contre CPI-2 selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de CPI-2 optimisé (HN ou F) ou les deux (HN et F). Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de CPI-2 utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont données dans les exemples annexés. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CPI-2 en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIEDOPE, et est composé d'un plasmide d'expression (e. g. pSB034, Figure 6) codant pour l'antigène HN de CPI-2 optimisé par l'insertion de la séquence signal du tPA humain à la place de la séquence signal de HN, par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique de HN codant pour le domaine transmembranaire et par l'insertion de l'intron II du gène de la bêta-globine du lapin en amont de HN, et d'un second plasmide d'expression (e. g. pSB032, Figure 5) codant pour l'antigène F de CPI-2 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire de F et par l'insertion de l'intron Il du gène de la bêta-globine du lapin en amont de F. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CPI-2 en vue d'une administration par la voie sous-cutanée est formulé avec du DMRIEDOPE, et est composé d'un plasmide d'expression codant pour le GM-CSF canin, et des deux plasmides précédemment définis (e. g. pSB034 et pSB032).. La présente invention a aussi pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le chien contre le virus herpès canin de type 1 (CHV-1). Le virus CHV-1 est un membre de la famille des Alphaherpesvirinae. Ce virus est responsable de la rhinotrachéite virale canine. Des séquences nucléotidiques codant pour les glycoprotéines gB, gC et gD, sont connues (Limbach étal. J. Gen. Virol. 1994.75. 2029-2039). Le vaccin ADN contre CHV-1 est de préférence formulé avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné avec soit l'addition de GM-CSF canin, soit l'optimisation d'au moins un antigène de CHV-1, enfin soit l'addition de GM-CSF canin et l'optimisation d'au moins un antigène de CHV-1. L'addition de GM-CSF canin peut se faire comme cela est décrit pour CDV. L'optimisation des antigènes issus de CHV-1 se fait par la délétion du fragment d'ADN codant pour le domaine transmembranaire de la glycoprotéine gB et/ou de la glycoprotéine gC et/ou de la glycoprotéine gD de CHV-1. Le vaccin ADN contre CHV-1 amélioré selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de CHV-1 optimisé (gB, gC ou gD) ou deux d'entre eux ou les trois. Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de CHV-1 utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont données dans les exemples annexés et dans WO-A-98/03199, notamment dans les exemples 7 et 8, et dans les figures 13 et 14. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CHV-1 en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression (e.g. pSB016, Figure 7) codant pour l'antigène gB de CHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire, d'un second plasmide d'expression (e.g. pSB019, Figure 8) codant pour l'antigène gC de CHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire et d'un troisième plasmide d'expression (e.g. pSB017, Figure 9) codant pour l'antigène gD de CHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre CHV-1 en vue d'une administration par la voie sous-cutanée est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression codant pour le GMCSF canin, et des trois plasmides précédemment définis (e.g. pSB016, pSB019 et pSB017). La présente invention a pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le chat contre le virus herpès félin de type 1 (FHV-1). Le virus FHV-1 est un membre de la famille des Alphaherpesvirinae, ce virus est responsable de la rhinotrachéite virale féline (Fargeaud et al. Arch. Virol. 1984. 80. 69-82). Le vaccin ADN contre FHV-1 est de préférence formulé avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné avec soit l'addition de GM-CSF félin, soit l'optimisation d'au moins un antigène de FHV-1, enfin soit l'addition de GM-CSF félin et l'optimisation d'au moins un antigène de FHV-1. L'addition de GM-CSF félin peut se faire par l'incorporation du polypeptide GM-CSF félin dans la composition vaccinale ou par l'insertion d'une séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF félin (e. g. accessible auprès de la base de données GenBank sous le numéro d'accès AF053007) dans un vecteur d'expression in vivo, de préférence un plasmide. De préférence, la séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF félin est insérée dans un second plasmide d'expression, différent de celui (ou de ceux) dans lequel est inséré le ou les gènes codant pour le ou les antigènes de FHV-1. L'optimisation des antigènes issus de FHV-1 se fait par la délétion du fragment d'ADN codant pour les domaines transmembranaires de la glycoprotéine gB et/ou de la glycoprotéine gC et/ou de la glycoprotéine gD de FHV-1. Le vaccin ADN contre FHV-1 amélioré selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de FHV-1 optimisé (gB, gC ou gD) ou deux d'entre eux ou les trois. Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de FHV-1 utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont données dans les exemples annexés et dans WO-A-98/03660, notamment dans les exemples 14 et 15 et dans les figures 11 et 12. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre FHV-1 en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression (e. g. pSB021, Figure 10) codant pour l'antigène gB de FHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire, d'un second plasmide d'expression (e. g. pSB023, Figure 11) codant pour l'antigène gC de FHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire et d'un troisième plasmide d'expression (e. g. pSB024, Figure 12) codant pour l'antigène gD de FHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre FHV-1 en vue d'une administration par la voie sous-cutanée est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression codant pour le GMCSF félin, et des trois plasmides précédemment définis (e. g. pSB021, pSB023 et pSB024). La présente invention a pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le cheval contre le virus herpès équin de type 1 (EHV-1). Le virus EHV-1 est un membre de la famille des Alphaherpesvirinae. Le virus EHV-1 est responsable de l'avortement viral équin (Crabb et al. Adv. Virus Res. 1995.45. 153-190). Le génome complet de ce virus a été déterminé (Telford étal. Virology 1992. 189. 304-316). Le vaccin ADN contre EHV-1 est de préférence formulé avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné avec soit l'addition de GM-CSF équin, soit l'optimisation d'au moins un antigène de EHV-1, enfin soit l'addition de GM-CSF équin et l'optimisation d'au moins un antigène de EHV-1. L'addition de GM-CSF équin peut se faire par l'incorporation du polypeptide GM-CSF équin dans la composition vaccinale ou par l'insertion de la séquence nucléotidique (e. g. SEQ ID N 69, figure 26) codant pour le GM-CSF équin dans un vecteur d'expression in vivo, de préférence un plasmide. De préférence, la séquence nucléotidique codant pour le GM-CSF équin est insérée dans un second plasmide d'expression, différent de celui (ou de ceux) dans lequel est inséré le ou les gènes codant pour le ou les antigènes de EHV-1. L'optimisation des antigènes issus de EHV-1 se fait par la délétion du fragment d'ADN codant pour les domaines transmembranaires de la glycoprotéine gB et/ou de la glycoprotéine gC et/ou de la glycoprotéine gD de EHV-1. Le vaccin ADN contre EHV-1 amélioré selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de EHV-1 optimisé (gB, gC ou gD) ou deux d'entre eux ou les trois. Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de EHV-1 utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont données dans les exemples annexés et dans WO-A-98/03198, notamment dans les exemples 8 et 10, et dans les figures 2 et 4. La voie intramusculaire est préférée pour le cheval. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre EHV-1 en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression (e. g. pSB028, Figure 13) codant pour l'antigène gB de EHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire, d'un second plasmide d'expression (e. g. pSB029, Figure 14) codant pour l'antigène gC de EHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire et d'un troisième plasmide d'expression (e.g. pSB030, Figure 15) codant pour l'antigène gD de EHV-1 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire. On peut cependant utiliser le voie sous-cutanée. Dans ce cas, le vaccin ADN contre EHV-1 est de préférence formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression codant pour le GM-CSF équin, et des trois plasmides précédemment définis (e. g. pSB028, pSB029, et pSB030). La présente invention a pour objet un vaccin ADN amélioré capable d'induire une réponse immunitaire efficace et protectrice chez le cheval contre le virus herpès équin de type 4 (EHV-4). Le virus EHV-4 est un membre de la famille des Alphaherpesvirinae. Le virus EHV-4 est responsable de la rhinopneumonie viral équine (Crabb et al. Adv. Virus Res. 1995.45. 153-190). Le génome complet de ce virus a été déterminé (Telford et al. J. Gen. Virol. 1998.79. 1197-1203). Le vaccin ADN contre EHV-4 est de préférence formulé avec un adjuvant selon l'invention, notamment le DMRIE, de préférence le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné avec soit l'addition de GM-CSF équin, soit l'optimisation d'au moins un antigène de EHV-4, enfin soit l'addition de GM-CSF équin et l'optimisation d'au moins un antigène de EHV-4. L'addition de GM-CSF équin peut se faire comme cela est décrit pour EHV-1. L'optimisation des antigènes issus de EHV-4 se fait par la délétion du fragment d'ADN codant pour le domaine transmembranaire de la glycoprotéine gB et/ou de la glycoprotéine gC et/ou de la glycoprotéine gD de EHV-4. Le vaccin ADN contre EHV-4 amélioré selon l'invention peut donc coder et exprimer un seul antigène de EHV-4 optimisé (gB, gC ou gD) ou deux d'entre eux ou les trois. Des séquences nucléotidiques codant pour les antigènes de EHV-4 utilisables dans la présente invention et différentes constructions de vecteurs d'expression sont données dans les exemples annexés et dans WO-A-98/03198, notamment dans les exemples 9 et 11, et dans les figures 3 et 5. De manière préférentielle selon l'invention, le vaccin ADN contre EHV-4 en vue d'une administration par la voie intramusculaire est formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression (e. g. pSB025, Figure 16) codant pour l'antigène gB de EHV-4 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire, d'un second plasmide d'expression (e. g. pSB026, Figure 17) codant pour l'antigène gC de EHV-4 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire et d'un troisième plasmide d'expression (e. g. pSB027, Figure 18) codant pour l'antigène gD de EHV-4 optimisé par la délétion du fragment de la séquence nucléotidique codant pour le domaine transmembranaire. Pour la voie sous-cutanée, vaccin ADN contre EHV-4 est de préférence formulé avec du DMRIE-DOPE, et est composé d'un plasmide d'expression codant pour le GM-CSF équin, et des trois plasmides précédemment définis (e.g. pSB025, pSB026, et pSB027). Bien que l'invention soit décrite en liaison avec des vaccins ADN particuliers, l'invention s'applique aussi à des vaccins ADN dirigés contre d'autres pathogènes de ces espèces animales. Ainsi, les différentes valences décrites dans cette demande peuvent faire l'objet d'un vaccin amélioré, notamment par l'addition de l'adjuvant de l'invention, ou de GM-CSF, ou éventuellement optimisation de gène, ou les combinaisons de ces propositions, comme cela est décrit ici en détail pour certaines valences. Dans le même ordre d'idée, les vaccins selon l'invention peuvent être, pour une espèce animale, combinés entre eux et/ou avec des vaccins ADN dirigés contre d'autres pathogènes de la même espèce. Ainsi, la présente invention a également pour objet des vaccins ADN multivalents améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le chien contre au moins deux pathogènes canins choisis parmi le groupe formé de : CDV, CPI-2, CHV-1, virus de la rage (rhabdovirus), parvovirus canin (CPV), coronavirus canin (CCV), Borrelia burgdorferi. La présente invention a également pour objet des vaccins ADN multivalents améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le chat contre au moins deux pathogènes félins choisis parmi le groupe formé de : 1, calicivirus félin (FCV), virus de la rage (rhabdovirus), parvovirus félin (FPV), virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV), virus de la leucémie féline (FeLV), virus du syndrome de l'immunodéficience acquise féline (FIV). La présente invention a également pour objet des vaccins ADN multivalents améliorés permettant d'obtenir une protection efficace chez le cheval contre au moins deux pathogènes équins choisis parmi le groupe formé de : EHV-1, EHV-4, virus de la grippe équine, virus de l'encéphalite équine de l'Est, virus de l'encéphalite équine de l'Ouest, virus de l'encéphalite équine du Venezuela, virus de la rage, Clostridium tetani, Borrelia burgdorferi. Les vaccins ADN multivalents peuvent être améliorés par leur formulation avec un adjuvant selon l'invention, notamment avec le DMRIE, de préférence avec le DMRIE-DOPE. Ceci peut être facultativement combiné soit avec l'addition de GM-CSF comme cela est précédemment décrit, soit avec l'optimisation d'au moins un antigène d'intérêt comme cela est précédemment décrit, enfin soit par l'addition de GM-CSF et l'optimisation d'au moins un antigène d'intérêt. Les vaccins ADN multivalents améliorés selon l'invention se composent d'un ou plusieurs plasmides d'expression, de telle façon que ces vaccins conduisent à l'expression in vivo d'au moins un immunogène d'un premier pathogène et d'au moins un immunogène d'au moins un autre pathogène, infectant la même espèce animale. L'un au moins de ces immunogènes est de préférence choisi parmi les membres du groupe suivant : - F de CDV, HA de CDV, F de CPI-2, HN de CPI-2 gB de CHV-1, gC de CHV-1 et gD de CHV-1 pour les chiens, - gB de FHV-1, gC de FHV-1 et gD de FHV-1 pour les chats, et - gB de EHV-1, gC de EHV-1, gD de EHV-1, gB de EHV-4, gC de EHV-4 et gD de EHV-4 pour les chevaux. Les vaccins ADN monovalents ou multivalents améliorés selon l'invention peuvent être également associés avec au moins un vaccin classique (inactivé, vivant atténué, sous-unités) ou vaccin recombiné utilisant un vecteur d'expression in vivo (e. g. poxvirus, adénovirus, herpèsvirus) dirigé contre au moins un pathogène différent infectant la même espèce. L'homme de l'art peut se reporter à WO-A-9803198 pour les méthodes pour construire les plasmides contenant ces valences équines, à WO-A- 9803660 pour les valences félines et à WO-A-9803199 pour les valences canines. La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination des animaux de compagnie ou de sport, notamment des chiens, des chats ou des chevaux. Cette méthode de vaccination comprend l'administration d'un des vaccins ADN améliorés monovalents ou multivalents tels que décrits précédemment. Cette méthode de vaccination comprend l'administration d'une ou plusieurs doses du vaccin ADN amélioré. La quantité d'ADN utilisée dans les vaccins selon la présente invention est comprise entre environ 10 g et environ 1000 g, et préférentiellement entre environ 50 g et environ 500 g, pour un plasmide donné. L'homme de l'art possède les compétences nécessaires pour définir précisément la dose efficace d'ADN à utiliser pour chaque protocole de vaccination. Les volumes de dose peuvent être de préférence compris entre 0,5 et 5 ml, de préférence entre 1 et 3 ml. Les vaccins ADN améliorés selon l'invention peuvent être administrés, dans le cadre de cette méthode de vaccination, par les différentes voies d'administration proposées dans l'art antérieur pour la vaccination polynucléotidique et au moyen des techniques d'administration connues. Suivant les deux modalités préférées de l'invention, les méthodes de vaccination comprennent l'administration par la voie intramusculaire ou par la voie sous-cutanée des vaccins ADN améliorés selon l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel : Figure N 1 : Plasmide pAB110 Figure N 2 : Plasmide pVR1012 Figure N 3 : Plasmide pNS021 Figure N 4 : Plasmide pNS024 Figure N 5 : Plasmide pSB032 Figure N 6 : Plasmide pSB034 Figure N 7 : Plasmide pSB016 Figure N 8 : Plasmide pSB019 Figure N 9 : Plasmide pSB017 Figure N 10 : Plasmide pSB021 Figure N 11 : Plasmide pSB023 Figure N 12 : Plasmide pSB024 Figure N 13 : Plasmide pSB028 Figure N 14 : Plasmide pSB029 Figure N 15 : Plasmide pSB030 Figure N 16 : Plasmide pSB025 Figure N 17 : Plasmide pSB026 Figure N 18 : Plasmide pSB027 Figure N 19 : Plasmide pJP084 Figure N 20 : séquence du gène GM-CSF canin Figure N 21 : Plasmide pJP089 Figure N 22 : séquence du gène GM-CSF félin 3R3 Figure N 23 : Plasmide pJP090 Figure N 24 : séquence du gène GM-CSF félin 3R4 Figure N 25 : Plasmide pJP097 Figure N 26 : séquence du gène GM-CSF équin Figure N 27 : séquence du gène CPI-2 F Figure N 28 : séquence du gène CPI-2 HN Listes des séquences: SEQ ID N01 : oligonucléotide NS030 SEQ ID N 2 : oligonucléotide NS031 SEQ ID N 3 : oligonucléotide NS034 SEQ ID N 4 : oligonucléotide NS035 SEQ ID N 5 : oligonucléotide NS036 SEQ ID N 6 : oligonucléotide NS037 SEQ ID N 7 : oligonucléotide SB090 SEQ ID N 8 : oligonucléotide SB091 SEQ ID N 9 : oligonucléotide PB326 SEQ ID N 10 : oligonucléotide PB329 SEQ ID N 11 : oligonucléotide PB381 SEQ ID NO 12 : oligonucléotide PB382 SEQ ID NO 13 : oligonucléotide PB383 SEQ ID NO 14 : oligonucléotide PB384 SEQ ID NO 15: oligonucléotide SB101 SEQ ID NO 16 : oligonucléotide SB102 SEQ ID NO 17 : oligonucléotide SB103 SEQ ID NO 18 : oligonucléotide SB104 SEQ ID NO 19 : oligonucléotide SB105 SEQ ID NO 20 : oligonucléotide SB106 SEQ ID NO 21 : oligonucléotide SB107 SEQ ID NO 22 : oligonucléotide SB108 SEQ ID NO 23 : oligonucléotide SB109 SEQ ID NO 24 : oligonucléotide SB110 SEQ ID NO 25 : oligonucléotide SB111 SEQ ID NO 26 : oligonucléotide SB112 SEQ ID NO 27 : oligonucléotide SB113 SEQ ID NO 28 : oligonucléotide SB114 SEQ ID NO 29 : oligonucléotide SB115 SEQ ID NO 30 : oligonucléotide SB116 SEQ ID NO 31 : oligonucléotide SB117 SEQ ID NO 32 : oligonucléotide SB118 SEQ ID NO 33 : oligonucléotide AB325 SEQ ID NO 34 : oligonucléotide AB326 SEQ ID NO 35 : oligonucléotide AB327 SEQ ID NO 36 : oligonucléotide AB328 SEQ ID NO 37 : oligonucléotide AB329 SEQ ID NO 38 : oligonucléotide AB330 SEQ ID NO 39 : oligonucléotide NS003 SEQ ID NO 40 : oligonucléotide NS004 SEQ ID NO 41 : oligonucléotide NS005 SEQ ID NO 42 : oligonucléotide NS006 SEQ ID NO 43 : oligonucléotide NS007 SEQ ID NO 44 : oligonucléotide NS008 SEQ ID NO 45 : oligonucléotide SB119 SEQ ID NO 46 : oligonucléotide SB120 SEQ ID NO 47 : oligonucléotide SB121 SEQ ID NO 48 : oligonucléotide SB122 SEQ ID NO 49 : oligonucléotide SB123 SEQ ID NO 50 : oligonucléotide SB124 SEQ ID NO 51 : oligonucléotide SB125 SEQ ID NO 52 : oligonucléotide SB126 SEQ ID NO 53 : oligonucléotide SB127 SEQ ID NO 54 : oligonucléotide SB128 SEQ ID NO 55 : oligonucléotide SB129 SEQ ID NO 56 : oligonucléotide SB130 SEQ ID NO 57 : oligonucléotide SB131 SEQ ID NO 58 : oligonucléotide SB132 SEQ ID NO 59 : oligonucléotide SB133 SEQ ID NO 60 : oligonucléotide SB134 SEQ ID NO 61 : oligonucléotide SB135 SEQ ID NO 62 : oligonucléotide SB136 SEQ ID NO 63 : oligonucléotide SB137 SEQ ID NO 64 : oligonucléotide JP578 SEQ ID NO 65 : oligonucléotide JP579 SEQ ID NO 66 : séquence du gène GM-CSF canin SEQ ID NO 67 : séquence du gène GM-CSF félin 3R3 SEQ ID NO 68 : séquence du gène GM-CSF félin 3R4 SEQ ID NO 69 : séquence du gène GM-CSF équin SEQ ID NO 70 : oligonucléotide JP734 SEQ ID NO 71 : oligonucléotide JP735 SEQ ID NO 72 : séquence du gène CPI-2 F SEQ ID NO 73 : séquence du gène CPI-2 HN EXEMPLES : Pour chacun des pathogènes considérés, chaque gène codant pour les principaux antigènes de surface (forme native et forme modifiée) a fait l'objet d'une construction particulière dans un plasmide d'expression eucaryote. Les formes secrétées des antigènes de surface ont été obtenues par délétion des fragments de gènes codant pour les domaines trans-membranaires et cytoplasmiques. Dans tous les cas, les domaines trans-membranaires des glycoprotéines ont été identifiés sur la base des profils d'hydropathie des séquences protéiques correspondantes. Le tableau donné dans l'exemple 11 résume les tailles des protéines sauvages (en acides aminés), les positions identifiées des domaines trans-membranaires, les tailles des protéines tronquées, ainsi que les désignations des plasmides d'expression correspondants. Exemple 1 : Constructions plasmidiques de base Le plasmide d'expression eucaryote pVR1020 (C. J. Luke et al. J. of Infectious Diseases 1997,175 : 95-97), dérivé du plasmide pVR1012 (figure 1, exemple 7 de WO-A-9803199, repris en figure 2 de la présente demande), contient la phase codante de la séquence-signal de l'activateur du plasminogène tissulaire humain (tPA). Le plasmide pVR1020 a été modifié par digestion BamHI-BglII et insertion d'une séquence contenant plusieurs sites de clonage (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) et résultant de l'appariement des oligonucléotides suivants : PB326 (40 mer) (SEQ ID NO 9) 5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' et PB329 (40 mer) (SEQ ID NO 10) 5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'. Le vecteur résultant, pAB110 (Figure N 1), a été utilisé pour la construction des plasmides contenant les formes tronquées des gènes codant pour l'hémagglutinine (HA) du virus de la maladie de Carré (CDV) et pour l'hémagglutinine-neuraminidase (HN) du virus parainfluenza de type 2 (CPI-2). L'intron Il du gène de la ss-globine de lapin a été cloné dans le vecteur pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) après obtention du fragment d'ADN correspondant par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB090 (20 mer) (SEQ ID NO 7) 5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' et SB091 (21 mer) (SEQ ID NO 8) 5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' en utilisant comme matrice l'ADN génomique de cellules du sang périphérique de lapin. Le plasmide résultant a été désigné pNS050. Exemple 2 : Plasmides codant pour les différentes formes des antigènes de CDV Les gènes codant pour la protéine de fusion (F) et l'hémagglutinine (HA) de CDV souche Snyder Hill (SH) ont été obtenus par RT-PCR à partir de l'ARN viral de la souche SH (accessible auprès de la souchothèque American Tissue Culture Collection sous le numéro ATCC VR-526). 2. 1. Plasmides codant pour les différentes formes de CDV-F 2. 1.1. pPB229 : gène F (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 L'ADNc du gène F de CDV a été synthétisé à l'aide de l'amorce PB383 et amplifié par une réaction de PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides suivant : PB383 (26 mer) (SEQ ID NO 13) 5' TTTCTAGACAGCCGAGCCCCATGCAC 3' et PB384 (30 mer) (SEQ ID NO 14) 5' TTGGATCCGATATATGACCAGAATACTTCA 3'. Le produit de PCR a été digéré par BamHi et Xbal et cloné dans le vecteur d'expression pVR1012 (exemple 1) préalablement digéré par BamHl et Xbal, générant le plasmide pPB229 (6925 paires de bases ou pb). Le gène F sauvage de CDV code pour une protéine de 662 résidus. 2. 1.2. pNS021 : gène F (forme 0-globine F ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Le plasmide pNS013 (6735 pb) contenant le gène F tronqué du domaine trans-membranaire et C-terminal a été obtenu par la ligation d'un fragment Bsu361-BamHl (6593 pb) issu du plasmide pPB229 (exemple 2. 1.1), et d'un fragment de 142 pb obtenu par PCR à partir de la matrice pPB229 à l'aide des oligonucléotides suivants : NS030 (21 mer) (SEQ ID NO 1) 5' ATGAGCCCACTCTTACAACAA 3' et NS031 (35 mer) (SEQ ID NO 2) 5' TTTCGCGGATCCATTAAAGGAAGAGCGCCTAACCG 3' et digéré Bsu361-BamHI. Le gène F tronqué de CDV code pour une protéine de 605 résidus. Dans un deuxième temps, une séquence correspondant à l'intron Il du gène de la (3-globine du lapin a été insérée en amont de la séquence codante du gène F tronqué, dans le site Sali du plasmide pNS013. Le fragment d'ADN correspondant à l'intron (573 pb) a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : NS036 (34 mer) (SEQ ID NO 5) 5' TTTACGCGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' et NS037 (36 mer) (SEQ ID NO 6) 5' TTTACGCGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAAGGCAT 3' sur la matrice pNS050 (exemple 1), suivie par une digestion Sali pour libérer des extrémités compatibles Sali. Le dérivé du plasmide pNS013 contenant l'intron Il du gène de la (3-globine est désigné pNS021 (7308 pb) (Figure N 3). 2. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de CDV-HA 2. 2.1. pNS018 : gène HA (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 L'ADNc du gène HA de CDV a été synthétisé à l'aide de l'amorce PB381 et amplifié par réaction PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides suivant : PB381 (30 mer) (SEQ ID NO 11) 5' TTCTGCAGATGCTCTCCTACCAAGAYAAGG 3' et PB382 (28 mer) (SEQ ID NO 12) 5' TTGTCGACATGTGTATCATCATMCTGTC 3'. Le produit PCR a été cloné dans le vecteur pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), générant le plasmide pPB235. Le fragment Pstl-Sall de 1846 pb du plasmide pPB235 contenant le gène HA a été ensuite cloné dans le vecteur d'expression pVR1012 (exemple 1) digéré Pstl-Sall, générant le plasmide pNS018 (6748 pb). Le gène HA sauvage de CDV code pour une protéine de 607 résidus. 2. 2.2. pNS024 : gène HA (forme (3-globine tPA ATM HA) clone dans le vecteur pVR1012 La forme tronquée du gène HA de CDV a été obtenue par délétion du fragment d'ADN codant pour les 60 premiers résidus de la protéine HA. La séquencesignal et trans-membranaire de cette protéine étant confondues, la sécrétion du produit tronqué est assurée par l'obtention d'une fusion en phase entre la séquence signal de l'activateur du plasminogène tissulaire humain (tPA) et le gène HA tronqué. Le plasmide pNS019, le dérivé de pNS018 codant pour un produit de fusion avec le signal tPA, a été obtenu par la ligation des 3 fragments d'ADN suivants: -Le fragment A a été obtenu par digestion BamHI-EcoRV de pAB110 (exemple 1). -Le fragment B a été obtenu par réaction PCR sur la matrice pNS018 (exemple 2. 2.1) à l'aide des oligonucléotides suivants : NS034 (30 mer) (SEQ ID NO 3) 5' TTTCGCGGATCCCACAAAGTATCAACTAGC 3' et NS035 (23 mer) (SEQ ID NO 4) 5' GGGATTTGCTGCCGATGCAATAG 3' , suivie par une digestion BamHI-Sapl du produit PCR. -Le fragment C est un fragment de digestion Sapl-EcoRV de pNS018. Le gène hybride tPA ATM HA code pour une protéine de 574 résidus (1725 pb). L'intron Il du gène de la p-globine de lapin (exemple 2. 1.2) a été inséré en amont de la phase codante du gène HA dans le site Sali de pNS019 pour générer le plasmide pNS024 (Figure N 4). Exemple 3 : Plasmides codant pour les différentes formes des antigènes du virus parainfluenza canin de type 2 (CPI-2) Les gènes F et HN de CPI-2 souche D008 (MERIAL) ont été obtenus par RT-PCR à partir de l'ARN viral. 3. 1. Plasmides codant pour les différentes formes de CPI-2 F 3. 1.1. pAB115: gène F (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 L'ADNc du gène F de CPI-2 a été synthétisé et amplifié par RT-PCR à l'aide du couple d'oligonucléotides suivant : SB131 (38 mer) (SEQ ID NO 57) 5' AAAAACGCGTCGACATGGGTACTATAATTCAATTTCTG 3' SB132 (38 mer) (SEQ ID NO 58) 5' TTTTCTAGTCTAGATTATTTATGATAAACAAAATTCTC 3'. Le produit de PCR a été digéré par Sali et Xbal, générant un fragment de 1594 pb, et cloné dans le vecteur d'expression pVR1012 (exemple 1) préalablement digéré par les mêmes enzymes, générant le plasmide pAB115 (6479 pb). Le gène F sauvage de CPI-2 (SEQ ID N072) (figure 27) cloné sur ce plasmide code pour une protéine de 529 résidus. 3. 1.2. pSB032 : gène F (forme (3-globine F ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Le plasmide pSB031 contenant le gène F tronqué des domaines transmembranaire et cytoplasmique C-terminal été obtenu de la façon suivante. Une réaction PCR a été réalisée avec la matrice pAB115 (exemple 3. 1.1.) à l'aide des oligonucléotides suivants : SB131 (SEQ ID NO 57) et SB133 (41 mer) (SEQ ID NO 59) 5' TTTTCTAGTCTAGATTAGTATGTGTCACTTTGTGCTAAGTG 3' pour générer un fragment PCR d'environ 1450 pb. Ce fragment a été digéré par par Sali et Xbal pour isoler le fragment de restriction Sall-Xbal de 1436 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 1) préalablement digéré par Sali et Xbal pour donner le plasmide pSB031. Le gène F tronqué de CPI-2 code pour une protéine de 473 résidus. Dans un deuxième temps, une séquence correspondant à l'intron II du gène de la 0-globine du lapin a été insérée en amont de la séquence codante du gène F tronqué de CPI-2, dans le site Sali du plasmide pSB031. Le fragment d'ADN correspondant à l'intron (573 pb) a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides NS036 (SEQ ID NO 5) et NS037 (SEQ ID NO 6) sur la matrice pNS050 (exemple 1), suivie par une digestion Sali pour libérer des extrémités compatibles Sali. Ce fragment de restriction Sall-Sall a été ligaturé avec le plasmide pSB031 préalablement digéré par Sali, puis déphosphorylé pour donner le plasmide pSB032 (6884 pb) (Figure N 5). 3. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de CPI-2 HN 3. 2.1. pAB114 : gène HN (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 L'ADNc du gène HN de CPI-2 a été synthétisé et amplifié l'aide des oligonucléotides suivants : SB134 (41 mer) (SEQ ID NO 60) 5' AAAAACGCGTCGACATGGTTGCAGAAGATGCCCCTGTTAGG 3' SB135 (35 mer) (SEQ ID NO 61) 5' TTTTGGAAGATCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3'. pour générer un fragment PCR d'environ 1720 pb. Ce fragment a été digéré par Sali et Bglll pour idoler le fragment Sall-Bgll de 1704 pb. Ce fragment a alors été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 1), préalablement digéré par Sali et Bglll, pour donner le plasmide pAB114 (6566 pb). Le gène HN sauvage de CPI-2 (SEQ ID N073) (figure 28) cloné sur ce plasmide code pour une protéine de 565 résidus. 3. 2.2. pSB034 : gène HN (forme p-globine HN tPA ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 La forme tronquée du gène HN de CPI-2 a été obtenue par délétion du fragment d'ADN codant pour les 40 premiers résidus de la protéine HN. Les séquences signal et trans-membranaire de cette protéine étant confondues, la secrétion du produit tronqué est assurée par l'obtention d'une fusion en phase entre la séquence signal de l'activateur du plasminogène tissulaire humain (tPA) et le gène HN tronqué. Le plasmide pSB033, dérivé de pAB114 (exemple 3.2.1.), codant pour un produit de fusion avec le tPA, a été obtenu par la ligation du fragment EcoRI-Pmll de pAB110 (exemple 1), un dérivé de pVR1012 contenant une phase ouverte de lecture codant pour la séquence signal tPA et d'un fragment de (1599 pb) obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB136 (37 mer) (SEQ ID NO 62) 5' TTAAAAGAATTCGACCCAAAAGCAAATCATGAGCCAC 3' SB 137 (33 mer) (SEQ ID NO 63) 5' TTAAAAGGCCTTTAGGATAGTGTCACCTGACGG 3' sur la matrice pAB114 et digéré par EcoRI et EcoRV. L'intron Il du gène de la p-globine de lapin a été inséré en amont de la phase codante du gène HN dans le site Sali de pBS033 pour générer le plasmide pSB034 (Figure N 6). Le fragment Sali contenant l'intron a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides NS036 (SEQ ID NO 5) et NS037 (SEQ ID NO 6) sur la matrice pNS050 (exemple 1). Exemple 4: Plasmides codant pour les différentes formes des glycoprotéines du virus CHV-1 Les gènes codant pour les glycoprotéines gB, gC et gD de la souche Carmichael du virus herpès canin de type 1 (CHV-1) ont été isolés par PCR à partir du génome viral. Le clonage des gènes codant pour gB et gD dans le vecteur pVR1012 a été précédemment décrit dans la demande de brevet WO-A- 9803199 (plasmides pAB037 et pAB038, respectivement aux figures 7 et 8 et aux exemples 13 et 14). En revanche, le clonage du gène codant pour gC est décrit dans ce document. 4. 1. Plasmide codant pour la forme tronquée de CHV-gB 4. 1.1. pSB016: gène gB (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gB de CHV-1 (878 acides aminés) est positionné entre les résidus 702 et 769. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gB a été obtenu par la ligature des trois fragments d'ADN suivants : (a) le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par une double digestion Pstl-Xbal, (b) un fragment de 1997 pb obtenu par la digestion Pstl-Nsil de pAB037 (exemple 4) et (c) un fragment de 225 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB101 (22 mer) (SEQ ID NO 15) 5'TATATTGAAGGACAACTTGGGG 3'et SB102 (36 mer) (SEQ ID NO 16) 5'CTAGTCTAGATTAATTATTATCAACTTTTACAACAC 3' en utilisant le plasmide pAB037 comme matrice et digéré par Nsil et Xbal. Le plasmide résultant, pSB016 (6983 pb) (Figure N 7) contient un gène gB tronqué codant pour une protéine de 701 résidus. 4. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de CHV-gC 4. 2.1. pSB018: gène gC (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gC de CHV-1 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB105 (32 mer) (SEQ ID NO 19) 5'AAAACTGCAGATGAGTTTTAAAAATTTTTATC 3' et SB106 (30 mer) (SEQ ID NO 20) 5'CTAGTCTAGATTAGATCTTATTATTTTTTG 3' en utilisant l'ADN viral comme matrice. Ce produit PCR a été digéré par Pstl et Xbal générant un fragment de 1400 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pSB018 (6253 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gC de 459 résidus. 4. 2.2. pSB019: gène gC (forme #TM) clone dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gC est compris entre les résidus 422 et 452. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gD a été obtenu par la ligature des trois fragments d'ADN suivants : (a) le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par une double digestion Pstl-Xbal, (b) un fragment de 934 pb obtenu par la digestion Pstl-Stul de pSB018 (exemple précédent) et (c) un fragment de 335 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB107 (24 mer) (SEQ ID NO 21) 5'TGGATTGACGGTCTTATAACACGC 3' et SB108 (37 mer) (SEQ ID NO 22) 5'CTAGTCTAGATTAATTTTCATCCGATGCATCAAACAC 3' en utilisant le plasmide pSB018 comme matrice et digéré par Stul et Xbal. Le plasmide résultant, pSB019 (6139 pb) (Figure N 8), contient un gène gC tronqué codant pour une protéine de 421 résidus. 4. 3. Plasmide codant pour la forme tronquée de CHV-gD 4. 3.1 pSB017: gène gD (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Le domaine trans-membranaire de la protéine gD de CHV-1 (345 acides aminés) est compris entre les résidus 310 et 328. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gD a été obtenu par la ligature des trois fragments d'ADN suivants : (a) le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par une double digestion Pstl-Notl, (b) un fragment de 663 pb obtenu par la digestion Pstl-Avall de pAB038 (exemple 4) et (c) un fragment de 415 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB103 (25 mer) (SEQ ID NO 17) 5'CGAGAAACTTGTTATTTTTCTAAAG 3' et SB104 (51 mer) (SEQ ID NO 18) 5'ATAAGAATGCGGCCGCAAAGGCTATATATTTTTTGGGGTATTATTTATTGG 3' en utilisant le plasmide pAB038 comme matrice et digéré par Aval! et Notl. Le plasmide résultant, pSB017 (5819 pb) (Figure N 9), contient un gène gD tronqué codant pour une protéine de 309 résidus. Exemple 5: Plasmides codant pour les différentes formes des glycoprotéines de FHV-1 Les gènes codant pour les glycoprotéines gB, gC et gD de la souche CO du virus herpès félin de type 1 ( FHV-1) ont été isolés par PCR à partir du génome viral. Dans le cas particulier du gène codant pour gD, dont la séquence nucléotidique est identique à celle de la souche C-27, nous avons utilisé le plasmide pAB029, dérivé de pVR1012 contenant le gène correspondant cloné à partir de la souche C-27 et décrit dans la demande de brevet WO-A-9803660 (plasmide pAB029, figure 12 et exemple 15). 5. 1. Plasmides codant pour les différentes formes de FHV-gB 5. 1.1. pSB020 : gène gB (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gB de FHV-1 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB113 (34 mer) (SEQ ID NO 27) 5'TTTTCTGCAGATGTCCACTCGTGGCGATCTTGGG 3' et SB114 (40 mer) (SEQ ID NO 28) 5'ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAAGATTTGTTTCAGTATC 3' en utilisant l'ADN viral comme matrice. Le produit PCR a été digéré par Pstl et Notl, générant un fragment de 2849 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pSB020 (7728 pb), contient le gène codant pour la glycoprotéine gB de 949 résidus. 5. 1.2. pSB021 : gène gB (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gB de FHV-1 est situé entre les résidus 761 et 834. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gB a été obtenu par la ligature des trois fragments d'ADN suivants : (a) le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par une double digestion Pstl-Notl, (b) un fragment de 1839 pb obtenu par la digestion Pstl-Hindll de pSB020 (exemple précédent) et (c) un fragment de 447 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB109 (24 mer) (SEQ ID NO 23) 5' CTGTGGACAGAGACCCTAAAACTC 3' et SB110 (50 mer) (SEQ ID NO 24) 5' TTTCCTTTTGCGGCCGCTTATATGCTGTCTATATCATAAAATTTTAAGGC 3' en utilisant le plasmide pSB020 comme matrice et digéré par Hindll et Notl. Le plasmide résultant, pSB021 (7164 pb) (Figure N 10), contient un gène gB tronqué codant pour une protéine de 760 résidus. 5. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de FHV-gC 5. 2.1. pSB022 : gène gC (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gC de FHV-1 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB115 (34 mer) (SEQ ID NO 29) 5'TTTTCTGCAGATGAGACGATATAGGATGGGACGC 3' et SB116 (34 mer) (SEQ ID NO 30) 5'AGTTTAGCGGCCGCTTATAATCGCCGGGGATGAG 3' en utilisant l'ADN viral comme matrice. Ce produit PCR a été digéré par Pstl et Notl, générant un fragment de 1605 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pSB022 (6483 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gC de 534 résidus. 5. 2.2. pSB023 : gène gC (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gC de FHV-1 est compris entre les résidus 495 et 526. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gC a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) un fragment de 6198 pb obtenu par la digestion Bcll-Notl de pSB022 (exemple précédent) et (b) un fragment de 168 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB117 (24 mer) (SEQ ID NO 31) 5'GTTAAATGTGTACCACGGGACGGG 3' et SB118 (41 mer) (SEQ ID NO 32) 5'AGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGGGGACGCGTCGTAGACTTG 3' en utilisant le plasmide pSB022 comme matrice et digéré par Bell et Notl. Le plasmide résultant, pSB023 (6366 pb) (Figure N 11), contient un gène gC tronqué codant pour une protéine de 494 résidus. 5. 3. Plasmide codant pour la forme tronquée de FHV-gD 5.3.1. pSB024: gène gD (forme ATM) clone dans le vecteur pVR1012 Le domaine trans-membranaire de la protéine gD de FHV-1 (374 acides aminés) est compris entre les résidus 328 et 353. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gD a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) un fragment de 5712 pb obtenu par la digestion Xbal-Bglll de pAB029 (exemple 5) et (b) un fragment de 129 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB111 (24 mer) (SEQ ID NO 25) 5'GATCGTCCCGCCATACCGTCTGGG 3' et SB112 (39 mer) (SEQ ID NO 26) 5'TTTGGAAGATCTTTACTGATTATTCATGCCCTTGGGAGG 3' en utilisant le plasmide pAB029 comme matrice et digéré par Xbal et Bglll. Le plasmide résultant, pSB024 (5841 pb) (Figure N 12), contient un gène gD tronqué codant pour une protéine de 327 résidus. Exemple 6: Plasmides codant pour les différentes formes des glycoprotéines de EHV-1 Les gènes codant pour les glycoprotéines gB, gC et gD de la souche 2234/88-2 de EHV-1 ont été isolés par PCR à partir de l'ADN viral purifié. 6. 1. Plasmides codant pour les différentes formes de EHV-1 gB 6. 1.1. pAB127: gène gB (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 La phase codante du gène gB de EHV-1 a été amplifiée par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : NS003 (30 mer) (SEQ ID NO 39) 5' TTCTGCAGATGTCCTCTGGTTGCCGTTCGT 3'et NS004 (30 mer) (SEQ ID NO 40) 5' TTTCTAGATTAAACCATTTTTTCATTTTCC 3', le fragment d'ADN obtenu a été digéré par Pstl et Xbal et ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par Pstl et Xbal, générant le plasmide pAB127 (7818 pb). Le gène gB code pour une protéine de 980 acides aminés. 6. 1.2. pSB028 : gène gB (forme ATM) clone dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gB de EHV-1 est positionné entre les résidus 801 et 875. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gB a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) le plasmide pAB127 (exemple 6. 1.1.) digéré par Afel et Xbal, et (b) un fragment de 276 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB125 (24 mer) (SEQ ID NO 51) 5' AACAACAGAG G GTC GATAGAAG G C 3' et SB126 (39 mer) (SED ID NO 52) 5' AATTTTTCTAGATTACACGTTGACCACGCTGTCGATGTC 3' en utilisant le plasmide pAB127 comme matrice et digéré par Afel et Xbal. Le plasmide résultant, pSB028 (7279 pb) contient un gène gB de EHV-1 tronqué codant pour une protéine de 800 résidus. 6. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de EHV-1 gC 6. 2.1. pAB129: gène gC (forme native) clone dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gC de EHV-1 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : NS005 (31 mer) (SEQ ID NO 41) 5' TTGTCGACATGTGGTTGCCTAATCTCGTGAG 3' et NS006 (33 mer) (SEQ ID NO 42) 5' TTGGATCCCTAAAAGTCAGACTTCTTGTACGGC 3'. Ce produit PCR a été digéré par Sali et BamHI générant un fragment de 1412 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pAB129 (6281 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gC de EHV-1 et ayant une taille de 468 résidus. 6. 2.2. pSB029 : gène gC (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gC de EHV-1 est compris entre les résidus 429 et 455. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gC a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) le plasmide pAB129 (exemple 6. 2.1.) linéarisé par une double digestion Aspl-BamHl et (b) un fragment de 287 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB127 (24 mer) (SEQ ID NO 53) 5' GATCCGGAGGAGGAATACACACCC 3' et SB128 (39 mer) (SEQ ID NO 54) 5' AATTTTGGATCCCTAAACCGGCCTGTCCTCAACAATCGG 3' en utilisant le plasmide pAB129 comme matrice et digéré par Aspl et BamHl. Le plasmide résultant, pSB029 (6161 pb), contient un gène gC tronqué codant pour une protéine de 428 résidus. 6. 3. Plasmides codant pour la forme tronquée de EHV-1 gD 6. 3.1. pAB131 : gène gD (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gD de EHV-1 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : NS007 (33 mer) (SEQ ID NO 43) 5' TTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCTTATGATGG 3' et NS008 (32 mer) (SEQ ID NO 44) 5' TTGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAAC 3'. Ce produit PCR a été digéré par Sali et BamHl générant un fragment de 1214 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pAB138 (6083 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gD de 402 résidus. 6. 3.2. pSB030: gène gD (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gD de EHV-1 est compris entre les résidus 348 et 371. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gD a été obtenu par la ligature des trois fragments d'ADN suivants : (a) le plasmide pVR1012 (exemple 1) linéarisé par une double digestion Sall-BamHl, (b) le fragment de 825 pb issu de la digestion de pAB131 (exemple 6. 3.1.) par Sali et Bsml et (c) un fragment de 239 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB129 (24 mer) (SEQ ID NO 55) 5' CGGTTTCTTGGTGAATTCAACTTC 3' et SB130 (42 mer) (SEQ ID NO 56) 5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTCTTAGACGTTTTTGG 3' en utilisant le plasmide pAB131 comme matrice et digéré par Bsml et BamHl. Le plasmide résultant, pSB030 (5921 pb), contient un gène gD tronqué codant pour une protéine de 347 résidus. Exemple 7: Plasmides codant pour les différentes formes des glycoprotéines de EHV-4 Les gènes codant pour les glycoprotéines gB, gC et gD de la souche KYT445/2 de EHV-4 ont été isolés par PCR à partir de l'ADN viral purifié. 7. 1. Plasmides codant pour les différentes formes de EHV-4 gB 7. 1.1. pAB136: gène gB (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 La phase codante du gène gB de EHV-4 a été amplifiée par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : AB325 (35 mer) (SEQ ID NO 33) 5' TTTCTGCAGATGTCCACTTGTTGCCGTGCTATTTG 3' et AB326 (31 mer) (SEQ ID NO 34) 5' TTTTCTAGATTAAACCATTTTTTCGCTTTCC 3', le fragment d'ADN obtenu a été digéré par Pstl et Xbal et ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par Pstl et Xbal, générant le plasmide pAB136 (7801 pb). Le gène gB de EHV-4 code pour une protéine de 975 acides aminés. 7. 1.2. pSB025 : gène gB (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gB de EHV-4 est positionné entre les résidus 797 et 867. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gB a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) le plasmide pAB136 (exemple 7. 1.1.) digéré par Spll et Xbal, et (b) un fragment de 231 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB119 (36 mer) (SEQ ID NO 45) 5' TTTTGGTCTAGATTAGTCCACGTTGACAACGCTGTC 3' et SB120 (23 mer) (SEQ ID NO 46) 5' CGCAAGCTTATCGAGCCGTGCGC 3' en utilisant le plasmide pAB136 comme matrice et digéré par Spll et Xbal. Le plasmide résultant, pSB025 (7264 pb) contient un gène gB tronqué codant pour une protéine de 796 résidus. 7. 2. Plasmides codant pour les différentes formes de EHV-4 gC 7. 2.1. pAB137: gène gC (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gC de EHV-4 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : AB327 (32 mer) (SEQ ID N0 35) 5' TTTGTCGACATGGGTTTGGTAAATATAATGCG 3' et AB328 (33 mer) (SEQ ID NO 36) 5' TTTGGATCCTTAGAAGTCTGCTTTCTTGTAGGG 3'. Ce produit PCR a été digéré par Sali et BamHI générant un fragment de 1463 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pAB137 (6330 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gC de 485 résidus. 7. 2.2. pSB026 : gène gC (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gC de EHV-4 est compris entre les résidus 425 et 472. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gC a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a) le plasmide pAB137 (exemple 7. 2.1.) linéarisé par une double digestion Acll-BamHI et (b) un fragment de 237 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB121 (24 mer) (SEQ ID NO 47) 5' GTATCAATCCCAGCTGACCCCGAC 3' et SB122 (41 mer) (SEQ ID NO 48) 5' AATTTTGGATCCTTAGCCGTCCGGGTAACCCTCTATGATGC 3' en utilisant le plasmide pAB137 comme matrice et digéré par Acll et BamHl. Le plasmide résultant, pSB026 (6147 pb), contient un gène gC tronqué codant pour une protéine de 424 résidus. 7. 3. Plasmides codant pour la forme tronquée de EHV-4 gD 7. 3.1. pAB138 : gène gD (forme native) cloné dans le vecteur pVR1012 Le fragment d'ADN contenant la phase ouverte de lecture du gène gD de EHV-4 a été obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : AB329 (33 mer) (SEQ ID NO 37) 5' TTTGTCGACATGTCTACCTTCAAGCCTATGATG 3' et AB330 (33 mer) (SEQ ID NO 38) 5' TTTGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3'. Ce produit PCR a été digéré par Sali et BamHI générant un fragment de 1214 pb, qui a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 1) linéarisé par la même double digestion. Le plasmide résultant, pAB138 (6081 pb) contient le gène codant pour la glycoprotéine gD de 402 résidus. 7. 3.2. pSB027 : gène gD (forme ATM) cloné dans le vecteur pVR1012 Selon le profil d'hydropathie, le domaine trans-membranaire de la protéine gD de EHV-4 est compris entre les résidus 348 et 371. Le plasmide contenant la forme tronquée du gène codant pour gD a été obtenu par la ligature des deux fragments d'ADN suivants : (a)le plasmide pAB138 (exemple 7. 3.1.) linéarisé par une double digestion EcoRI-BamHI et (b) un fragment de 310 pb obtenu par PCR à l'aide des oligonucléotides suivants : SB123 (24 mer) (SEQ ID NO 49) 5' TTTTCCGTAACAATTCCGAGCAGC 3' et SB124 (39 mer) (SEQ ID NO 50) 5' AATTTTGGATCCTTACGTAGAGTTGCTATTAGACGCTGG 3' en utilisant le plasmide pAB138 comme matrice et digéré par EcoRI et BamHl. Le plasmide résultant, pSB027 (5919 pb), contient un gène gD tronqué codant pour une protéine de 347 résidus. Exemple 8 : Plasmide codant pour le GM-CSF canin 8. 1. Préparation de l'ARN total de lymphocytes de chien stimulés in vitro par des mitogènes Du sang de chien a été récolté sur un tube contenant de l'EDTA par une prise de sang réalisée sur une chienne Beagle. Les cellules mononucléées ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll, puis mises en culture en boîte de Petri de 60 mm de diamètre. Les cellules mononuclées de chien ont alors été stimulés avec de la concanavaline A (conA) (concentration finale d'environ 4 g/ml) et avec de la phyto-hémagglutinine (PHA) (concentration finale d'environ 10 g/ml). Après stimulation, les lymphoblastes "ConA" et " PHA " ont été récoltés par grattage des boîtes de culture, et l'ARN total de ces cellules a été extrait en utilisant le kit " mRNA isolation kit for White Blood Cells " (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325). 8. 2. Isolement du gène codant pour le GM-CSF canin et construction du plasmide pJP074 L'ARN total extrait des lymphoblastes de chien stimulés par la ConA ou par la PHA (exemple 8. 1.) a servi de matrice pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire. Ce premier brin d'ADN complémentaire a été produit par élongation de l'oligonucléotide p (dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). L'ADN complémentaire simple brin obtenu a été ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'ACP avec les oligonucléotides suivants : JP578 (SEQ ID NO 64) (33 mer) 5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' et JP579 (SEQ ID NO 65) (36 mer) 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 450 paires de bases (pb). Ce fragment a été purifié par électrophorèse en gel d'agarose, puis ligaturé avec le vecteur pCR2. 1 (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) pour donner le plasmide pJP074. La séquence du gène GM-CSF canin cloné dans le plasmide pJP074 a été trouvée équivalente à celle de la séquence du GM-CSF canin disponible sur GenBank (n d'accès # S49738). 8. 3. Construction du plasmide pJP084 et séquence du gène GM-CSF canin Le plasmide pJP074 (exemple 8. 2.) a été digéré par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Notl-Notl d'environ 450 pb contenant le gène GM-CSF canin. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pVR1012 (exemple 1). Le clone contenant la séquence GM-CSF canin (SEQ ID N066, Figure N 20) dans la bonne orientation par rapport au promoteur hCMV/IE a été identifié pJP084. Ce plasmide a une taille de 5364 pb (Figure N 19). Exemple 9 : Plasmide codant pour le GM-CSF félin 9. 1. Préparation de l'ARN total de lymphocytes de chat stimulés in vitro par des mitogènes Du sang de chat a été récolté par prise de sang sur un tube contenant de l'EDTA. Les cellules mononucléées ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll, puis mises en culture en boîte de Petri de 60 mm de diamètre. Les cellules mononuclées de chat ont alors été stimulés avec de la concanavaline A (ConA) (concentration finale d'environ 4 g/ml) et avec de la phyto-hémagglutinine (PHA) (concentration finale d'environ 10 g/ml). Après stimulation, les lymphoblastes " ConA " et " PHA " ont été récoltés par grattage des boîtes de culture, et l'ARN total de ces cellules a été extrait en utilisant le kit " mRNA isolation kit for White Blood Cells " (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325). 9. 2. Isolement du gène codant pour le GM-CSF félin et construction des plasmides pJ089 et pJP090 L'ARN total extrait des lymphoblastes de chat stimulés par la ConA et la PHA (exemple 9. 1.) a servi de matrice pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire. Ce premier brin d'ADN complémentaire a été produit par élongation de l'oligonucléotide p (dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). L'ADN complémentaire simple brin obtenu a été ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'ACP avec les oligonucléotides suivants : JP578 (SEQ ID NO 64) (33 mer) 5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' et JP579 (SEQ ID NO 65) (36 mer) 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 450 paires de bases (pb). Ce fragment a été digéré par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Notl-Notl de 450 pb. Ce fragment a été alors ligaturé avec le plasmide pVR1012 (exemple 1). Deux clones contenant la séquence GM-CSF félin (SEQ ID NO 67 et SEQ ID NO 68), dans la bonne orientation par rapport au promoteur hCMV/lE ont été identifiés respectivement pJP089 et pJP090. Ces deux plasmide ont une taille de 5364 pb (Figures N 21 et 23). La séquence du gène GM-CSF félin cloné dans le plasmide pJP089 contient 13 différences au niveau nucléotidique avec la séquence GM-CSF félin disponible sur GenBank (n d'accès AF053007). Le changement le plus important est une changement C # T qui entraîne un changement Leucine # Phenylalanine pour l'acide aminé (première base du codon de l'acide aminé # 107 ; Figure N 22). La séquence du gène GM-CSF félin cloné dans le plasmide pJP090 est équivalent à celle contenue dans le plasmide pJP089, sauf que le changement Leucine -7 Phenylalanine au n'existe pas pour l'acide aminé # 107 (Figure N 24). La vérification de la séquence 3' du gène GM-CSF félin au moyen du kit 3' RACE a montré que, à cette position 107, on peut avoir chez le même chat, l'acide aminé Leucine ou l'acide aminé Phenylalanine. Exemple 10 : Plasmide codant pour le GM-CSF équin 10. 1. Préparation de l'ARN total de lymphocytes de cheval stimulés in vitro par des mitogènes Du sang de cheval a été récolté sur un tube contenant de l'EDTA par une prise de sang à la veine jugulaire. Les cellules mononucléées ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll, puis mises en culture en boîte de Petri de 60 mm de diamètre. Les cellules mononuclées de cheval ont alors été stimulés soit avec de la concanavaline A (ConA) (concentration finale d'environ 5 g/ml) soit avec de la phyto-hémagglutinine (PHA) (concentration finale d'environ 10 g/ml). Après stimulation, les lymphoblastes " ConA" et " PHA"ont été récoltées par grattage des boîtes de culture, et l'ARN total de ces cellules a été extrait en utilisant le kit " mRNA isolation kit for White Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325). 10. 2. Isolement du gène codant pour le GM-CSF équin L'ARN total extrait des lymphoblastes de cheval stimulés par la ConA ou par la PHA (exemple 10. 1.) a servi de matrice pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire. Ce premier brin d'ADN complémentaire a été produit par élongation de l'oligonucléotide p (dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). L'ADN complémentaire simple brin obtenu a été ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d'ACP avec les oligonucléotides suivants : JP734 (SEQ ID NO 70) (44 mer) 5' CATCATCATGTCGACGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCT 3' et JP735 (SEQ ID NO 71) (41 mer) 5' CATCATCATGCGGCCGCTACTTCTGGGCTGCTGGCTTCCAG 3' pour amplifier un fragment ACP d'environ 500 paires de bases (pb). Ce fragment a été purifié par électrophorèse en gel d'agarose. 10. 3. Construction du plasmide pJP097 et séquence du gène GM-CSF équin Le fragment ACP purifié obtenu à l'exemple 10. 2. a été digéré par Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Notl-Notl d'environ 450 pb contenant le gène GM-CSF équin. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pVR1012 (exemple 1). Le clone contenant la séquence GMCSF équin (SEQ ID NO 69, Figure N 26) dans la bonne orientation par rapport au promoteur hCMV/IE a été identifié pJP097. Ce plasmide a une taille de 5334 pb (Figure N 25). Exemple 11 : Tableau récapitulatif des plasmides Nb. de Nb de Pathogène Antigène résidus Domaine TM résidus Plasmides d'expression forme forme native tronquée .............................................................................................................................................................................................................................................................................CDV F 662 606-626 605 pPB229 et pNS021* HA 607 1-60** 574 pNS018 et pNS024* CPI-2 F 529 474-517 473 pAB115 et pSB032* HN 565 1-40** 557 pAB114 et pSB034* CHV-1 gB 878 702-769 701 pAB037 et pSB016* gC 459 422-452 421 pSB018 et pSB019* gD 345 310-328 309 pAB038 et pSB017* FHV-1 gB 949 761-834 760 pSB020 et pSB021* gC 534 495-526 494 pSB022 et pSB023* gD 374 328-353 327 pAB029 et pSB024* EHV-1 gB 980 801-875 800 pAB127 et pSB028* gC 468 429-455 428 pAB129 et pSB029* gD 402 348-371 347 pAB131 et pSB030* EHV-4 gB 975 797-867 796 pAB136 et pSB025* gC 485 425-472 424 pAB137 et pSB026* gD 402 348-371 347 pAB138 et pSB027* * Plasmides codant pour les formes tronquées des antigènes ** Cas particulier des gènes HA de CDV et HN de CPI-2 : domaine transmembranaire et séquence signal confondus Exemple 12 : Méthodes de biologie moléculaire Culture et purification des virus Les virus ont été cultivés sur des systèmes cellulaires appropriés jusqu'à obtention d'un effet cythopathique. Les systèmes cellulaires à utiliser pour chaque virus sont bien connus de l'homme du métier. Brièvement, les cellules appropriées ont été infectées par la souche virale étudiée à une multiplicité d'infection de 1 et ont été incubées à 37 C pendant le temps nécessaire à l'obtention d'un effet cythopathique (en moyenne 36 heures). Dans le cas des virus à ADN, après la culture, le surnageant et les cellules lysées ont été récoltés et les débris cellulaires ont été éliminés par une centrifugation à 1000 g et à 4 C pendant 10 minutes. Les particules virales ont été récoltées par ultracentrifugation à 400 000 g et 4 C pendant 1 heure. Les culots ont été repris dans un volume minimum de tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Les virus à ARN ont été purifiés selon les techniques standard de purification bien connues de l'homme du métier. Extraction d'ADN génomique viral Les suspensions virales concentrées ont été traitées par la protéinase K (100 mg/ml final) en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS) (0.5% final) pendant 2 heures à 37 C. L'ADN viral a ensuite été extrait à l'aide d'un mélange phénollchlorophorme, puis précipité avec deux volumes d'éthanol absolu à -20 C pendant 16 heures et ensuite centrifugé à 10 000 g pendant 15 minutes à 4 C. Les culots d'ADN ont été séchés, puis repris dans un volume minimum d'eau ultrapure stérile. Isolement d'ARN génomique viral L'ARN génomique de chaque virus a été extrait en utilisant la technique du " thiocyanate de guanidinium/phénol-chlorophorme " décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). Techniques de biologie moléculaire Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standard de biologie moléculaire décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd Edition . Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés à l'aide du kit " Geneclean " (BIO101 Inc., La Jolla, CA). Pour toutes les constructions, les fragments d'ADN clonés, ainsi que les jonctions avec le vecteur d'expression, ont été séquences par la méthode de Sanger (Sambrook et al., 1989). PCR et RT-PCR Les oligonucléotides spécifiques des gènes ou des fragments de gènes clonés ont été synthétisés, certains d'entre eux comportant dans certains cas à leur extrémité 5' des sites de restriction facilitant le clonage des fragments amplifiés. Les réactions de transription inverse (RT) et l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont été effectuées selon des techniques standard (Sambrook étal., 1989). Purification de plasmides à grande échelle La production, à l'échelle de la dizaine de mg, de plasmides purifiés entrant dans les compositions vaccinales a été effectuée par la méthode des gradients de chlorure de césium-bromure d'éthidium (Sambrook et al, 1989). Exemple 13 : Formulation des plasmides vaccinaux La solution d'ADN contenant un ou plusieurs plasmides selon les exemples 2 à 10 est concentrée par précipitation éthanolique comme décrit dans Sambrook et al (1989). Le culot d'ADN est repris par une solution de NaCI 0. 9% de façon à obtenir une concentration de 1 mg/ml. Une solution de DMRIE-DOPE à 0,75mM est préparée par reprise d'un lyophilisât de DMRIE-DOPE par un volume adapté d'H20 stérile. La formation des complexes ADN plasmidique-lipide est réalisée par dilution à parties égales de la solution de DMRIE-DOPE 0. 75 mM par la solution d'ADN à 1 mg/ml dans NaCI 0. 9%. La solution d'ADN est introduire progressivement à l'aide d'une aiguille sertie 26G le long de la paroi du flacon contenant la solution de lipide cationique de façon à éviter la formation de mousse. On procède à une agitation douce dès que les deux solutions ont été mélangées. On obtient en final une composition comprenant 0,375 mM de DMRIE-DOPE et 500 g/ml de plasmide. Il est souhaitable que l'ensemble des solutions utilisées soient à température ambiante pour l'ensemble des opérations décrites ci-dessus. On laisse la complexation ADN/DMRIE-DOPE se mettre en place à température ambiante pendant 30 minutes avant de procéder à l'immunisation des animaux. Exemple 14 : Immunisation des chiens contre CDV Une injection de 2 ml par voie sous-cutanée ou intramusculaire répétée à 28 jours plus tard. La masse totale de plasmide utilisée lors de chaque immunisation est de 100 ou de 1000 g selon les vaccins. L'homme de l'art possède les connaissances nécessaires pour adapter le volume ou la concentration en fonction de la dose de plasmide requise. 14. 1. Epreuve virulente La souche d'épreuve utilisée correspond à un broyat de rate prélevée sur un chien infecté par le virus de la maladie de Carré, souche Snyder Hill et diluée au centième en tampon PBS. La dilution est conservée sur de la glace pilée jusqu'à utilisation. Après anesthésie générale, on administre la souche d'épreuve diluée au centième par voie intracraniale sous un volume de 0,5 ml. 14. 2. Suivi clinique post-épreuve Ce suivi clinique quotidien a été réalisé pendant les 21 jours suivant l'épreuve et a compris pour chaque chien un examen clinique pour détecter d'éventuels signes cliniques de la maladie de Carré et une prise de la température rectale. L'examen clinique comprend : - Une observation de l'état général de l'animal sur une échelle à 4 niveaux : " bon " avec un score de 0, " apathie avec un score de 1, " dépression " avec un score de 2 et " prostration " avec un score de 3. La mort de l'animal équivaut à un score clinique de 10. - Une évaluation des symptômes oculo-nasaux (recherche d'écoulement séreux ou purulent, de rhinite et/ou conjonctivite). Une conjonctivite/rhinite avec un écoulement nasal séreux équivaut à un score de 1, celle avec un écoulement nasal purulent équivaut à un score de 2. - Une évaluation des symptômes digestifs (recherche de signes de gastroentérite). Une gastroentérite légère équivaut à un score de 1, une sévère à un score de 2. - Une évaluation des symptômes nerveux (recherche de myoclonies, convulsions et/ou paralysie). Une myoclonie équivaut à un score de 1, une convulsion à un score de 2 et une paralysie à un score de 3. * - Le suivi de la température corporelle de l'animal. Une température inférieure ou égale à 37,5 C équivaut à un score de 3, une température comprise entre 37,5 C et 39,5 C équivaut à un score de 0, une température égale à 39,5 C ou comprise entre 39,5 C et 40 C équivaut à un score de 1, une température égale à 40 C ou comprise entre 40 C et 40,5 C équivaut à un score de 2, et enfin une température supérieure à 40,5 C équivaut à un score de 3. Sur les animaux ayant succombé à l'épreuve, un prélèvement de rate est réalisé pour la mise en évidence du virus de Carré par immunofluorescence. Un score clinique global a été calculé de la manière suivante : pour chaque signe clinique a été établi un score moyen par groupe d'animaux sur la période d'observation et le score totale est la somme des scores moyens pour les cinq signes cliniques considérés. Résultats des expériences d'épreuves après immunisation des chiens par la voie intramusculaire : Plasmide Formulation Antigènes Dose Cytokine Mortalité Score Réponse en clinique anticorps contrôle -- - 4/4 26,1 0,3 +/- 0,3 pNS018 -- HA natif 50 g --- 4/5 21,6 0,3+/-0,2 pPB229 F natif 50 g pNS018 DMRIE- HA natif 50 g - 1/5 7,8 0,8 +/- 0,3 pPB229 DOPE F natif 50 g pNS024 DMRIE- HA optimisé 50 g - 1/5 7,2 1,9 +/- 0,8 pNS021 DOPE F optimisé 50 g pNS024 DMRIE- HA optimisé 500 g - 0/5 0,6 1,5 +/- 0,3 pNS021 DOPE F optimisé 500 g Résultats des expériences d'épreuves après immunisation des chiens par la voie sous-cutanée : Plasmide Formulation Antigènes Dose Cytokine Mortalité Score Réponse en clinique anticorps contrôle 4/4 25,0 0,2 +/- 0,0 pNS018 DMRIE- HA natif 50 g --- 5/5 24,4 0,2 +/- 0,0 pPB229 DOPE F natif 50 g pNS018 DMRIE- HA natif 500 g 3/5 19,0 0,4 +/- 0,2 pPB229 DOPE F natif 500 g pNS024 DMRIE- HA optimisé 500 g 1/5 9,2 0,6 +/- 0,7 pNS021 DOPE F optimisé 500 g pNS024 DMRIE- HA optimisé 500 g 0/5 2,4 1,7 +/0 0,9 pNS021 DOPE F optimisé 500 g pJP084 200 g GM-CSF Il doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention. Revendications 1. Vaccin ADN contre un pathogène touchant les animaux de compagnie ou de sport, notamment les chiens, chats ou chevaux, comprenant un plasmide contenant une séquence nucléotidique codant pour un immunogène d'un pathogène de l'espèce animale considérée, dans des conditions permettent l'expression in vivo de cette séquence, et un lipide cationique contenant un sel d'ammonium quaternaire, le DMRIE. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend aussi du DOPE. 3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une protéine GM-CSF de l'espèce animale considérée. 4. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine GMCSF de l'espèce animale considérée, dans des conditions permettant l'expression in vivo de cette séquence. 5. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce que le vecteur d'expression est un plasmide. 6. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour un immunogène de pathogène est la séquence d'un gène dont on a délété la partie codant pour le domaine transmembranaire. 7. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le plasmide comportant la séquence nucléotidique codant pour un immunogène de pathogène comporte aussi une séquence nucléotidique codant pour le tPA. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le plasmide comportant la séquence nucléotidique codant pour un immunogène de pathogène comporte aussi un intron stabilisateur. 9. Vaccin selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'intron est l'intron Il du gène de la bêta-globine du lapin.