Brevet FR2793261A1 — publié le 20001110

PROCEDE ET DISPOSITIF POUR L'EXTRACTION D'ADN, D'ARN ET DE PROTEINES A PARTIR DE PRELEVEMENTS BIOLOGIQUES. La présente invention concerne le domaine de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à haut débit, à partir de prélèvements biologiques non liquides ou de cellules en suspension, à l'état naturel ou entrant dans des préparations par exemple alimentaires. On connaît dans l'état de la technique différents procédés d'extraction d'acides nucléiques et de protéines à partir de prélèvements mettent en jeu une première étape de broyage de l'échantillon, par des procédés divers tels pilage, ultrasons, haute pression... Il est intéressant, pour des échantillons mous, de les broyer à très basse température. En effet, cela diminue les risques de dégradation des macromolécules et facilite l'éclatement des cellules et donc améliore le rendement des extractions. Il s'en suit différents traitements de l'échantillon, qui visent à le laver, à supprimer les membranes cellulaires et à éliminer les produits non voulus. La première étape n'étant pas systématiquement mise en oeuvre. Le procédé faisant l'objet de la demande de brevet comporte les étapes suivantes: Il consiste, après broyage à basse température, (température inférieure à la température ambiante) par des procédés divers, simultanément, d'un nombre d'échantillons, à ajouter automatiquement et avec un temps d'attente minimal, un volume suffisamment précis de liquide, à chaque échantillon broyé, tout en contrôlant la température du broyat, du/des liquide/s et du mélange et à homogénéiser chaque mélange. L'un des liquides peut de préférence être un tampon de lyse des parois cellulaires et plus précisément, un tampon de lyse dénaturant. Il s'agit en particulier d'éviter que les agents de dégradation des macro-molécules puissent agir, tout en permettant l'écoulement du/des liquide/s, même si le broyage a eu lieu à très basse température (inférieure à 0 C) 2 2793261 Il s'agit de limiter les risques de contamination des personnes, par des virus, par exemple et de diminuer la perte de matériel biologique qui adhérerait aux pièces de broyage. Il permet le traitement de plusieurs échantillons simultanément, et l'enchaînement des opérations et leur automatisation. L'invention concerne en particulier le dispositif pour le broyage d'échantillons biologiques en vue de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines caractérisé en ce qu'il comporte une pluralité de pilons rotatifs supportés par un bloc porte-pilons et un plateau mobile inférieur, mobile entre une position de travail rapprochée du bloc porte-pilons et une position de repos écartée du bloc porte-pilons, chacun des pilons comprenant au moins un conduit pour la distribution de liquide. Avantageusement, le plateau inférieur présente des moyens pour recevoir des tubes, disposés selon un arrangement conforme à celui des pilons ou une pluralité de cupules, disposés selon un arrangement conforme à celui des pilons. Selon une variante, le dispositif comprend en outre des moyens pour permettre l'écoulement du ou des liquides par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes. Le dispositif préféré, décrit à titre d'exemple est constitué des éléments suivants: * L'équipement de broyage de base, qui est dédié aux échantillons végétaux, pour lesquels seules les protéines comptent, auquel est ajouté: * Un dispositif constitué d'un réseau de buses, chacune étant située au voisinage de la tige de chaque pilon, communicant par des cathéters avec le/les réservoir/s du/des liquide/s à distribuer. Les réservoirs peuvent être maintenus à des températures définies. Le/les liquides peuvent s'écouler par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes et le volume distribué réglé grâce à des cathéters de longueur et de diamètre précis, en jouant sur la durée d'ouverture des électrovannes. Une autre solution est par exemple d'aspirer et 3 2793261 de refouler le/les liquides au moyen de pompes de précision. Dans ce cas il est facile de purger les cathéters. Les tiges de pilons peuvent servir de guide à l'écoulement du/des liquides vers les échantillons. Dans tous les cas, la distribution du liquide s'effectue sur un ou plusieurs sous-ensembles de tubes. Si l'on choisit des sous ensembles de 24 tubes parmi l'ensemble de 96 tubes, ou si une partie seulement des positions de broyage est occupée, il est possible de traiter seulement 24 échantillons de plus gros volume et d'éviter le gaspillage de liquide. * Des dispositifs de chauffage régulés, qui peuvent être des résistances noyées dans le plateau porte tubes du Équipement de broyage et/ou des rampes à infrarouge disposées autour de l'espace de travail. * Accessoirement, une plaque rigide, traversée par les tiges des pilons peut être rajoutée au dispositif préféré, pour couvrir chaque échantillon dans son conteneur, pendant le broyage, afin d'éviter des contaminations croisées. Cette plaque, grâce aux fraisages de chaque passage de tige de pilon sur la partie supérieure, favorise l'écoulement uniforme du/des liquides dans chaque conteneur d'échantillon, autour des pilons et contribue à les débarrasser des fragments adhérents. L'automate programmable qui contrôle l'équipement de broyage contrôle également les écoulements de liquide, les températures et le verrouillage de la plaque rigide. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, se référant à un exemple non limitatif de réalisation et aux figures annexées o: - la figure 1 représente une vue agrandie partielle d'un dispositif selon l'invention. Le dispositif est constitué par un automate formé par un châssis comportant deux blocs mobiles. Le bloc supérieur est un plateau supportant une pluralité de porte- pilons (1) rotatifs, arrangés pour former une matrice de 96 têtes par exemple. Les pilons sont interchangeables et peuvent présenter une variété de taille ou de forme. La vitesse de rotation des pilons est comprise entre et 1100 tours par minutes. Un programme de commande permet de déterminer le temps, la vitesse, le sens de rotation, la pression et les différents paramètres du processus de broyage souhaité. L'équipement comporte une mémoire pour l'enregistrement de plusieurs profils de broyage. L'automate réalise les fonctions suivantes: - prise de pilons - lavage et décontamination des pilons - mise en température des pilons - broyage d'échantillons mous - broyage de grains - broyages spéciaux - extraction des pilons. Il comporte également un détecteur inactivant le dispositif lorsque l'opérateur accède à l'espace de travail comprenant les plateaux supérieur et inférieur. Le bloc inférieur (5) est un plateau mobile qui supporte des racks interchangeables, présentant des moyens pour recevoir des tubes remplis d'échantillons à broyer, ou des cupules pour recevoir directement des matériaux biologiques tels que des graines. Les tubes sont maintenus dans des supports transparents de 6 tubes. Quatre supports de 6 tubes occupent chacun la surface d'une microplaque, ce qui permet de centrifuger 96 tubes à la fois sur un rotor approprié. Dans le cas du broyage de graines, le plateau se présente sous la forme d'un ensemble de cupules en acier inoxydable dur dont le fond peut être ouvert ou fermé, et les pilons présentent plusieurs facettes. Le produit du broyage est alors récupéré dans des tubes placés sous les cupules. Le bloc inférieur est mobile verticalement pour assurer la pénétration des pilons dans les tubes (6) ou cupules, ou au contraire écarter les pilons pour charger ou décharger l'équipement. Le plateau inférieur (5) est thermostaté, par exemple par des conduits (7) pour la circulation d'un fluide de refroidissement. 2793261 Un plateau couvercle additionnel peut être disposé sur le plateau porte-tube. Les différents blocs sont amovibles et peuvent être extraits de l'équipement par un simple glissement vers l'avant. Le porte-pilon (1) présente un conduit (2) d'arrivée de liquide. Le liquide vient ruisseler le long de la tige (3) du pilon jusqu'à la tête du pilon. Les pilons peuvent être lavés et essorés automatiquement, par l'injection de liquides grâce aux conduits (2) ou en les faisant tourner à grande vitesse. Lorsque les pilons sortent des tubes (6), ils sont parfaitement immobiles car c'est le plateau porte-tube qui s'écarte en descendant. Ce mode de fonctionnement évite la dissémination de matériel biologique servant de substrat à une analyse par PCR. 6 2793261 REVENDICATIONS 1 - Dispositif pour le broyage d'échantillons biologiques en vue de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines caractérisé en ce qu'il comporte une pluralité de pilons rotatifs supportés par un bloc porte- pilons (1) et un plateau mobile inférieur (5), mobile entre une position de travail rapprochée du bloc porte-pilons (1) et une position de repos écartée du bloc porte-pilons (1), chacun des pilons comprenant au moins un conduit pour la distribution de liquide. 2 - Dispositif pour le broyage d'échantillons biologiques en vue de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plateau inférieur (5) présente des moyens pour recevoir des tubes (6), disposés selon un arrangement conforme à celui des pilons. 3 - Dispositif pour le broyage d'échantillons biologiques en vue de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines selon la revendication 1 caractérisé en ce que le plateau inférieur (5) présente une pluralité de cupules, disposés selon un arrangement conforme à celui des pilons. 4 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour permettre l'écoulement du ou des liquides par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes. - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend des pompes et des moyens de purge des cathéters. 6 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques selon la revendication 3, caractérisé en ce que le plateau inférieur (5) comporte des dispositifs de chauffage régulés. 7 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il en outre une plaque 7 2793261 rigide, traversée par les tiges des pilons pour couvrir chaque échantillon dans son conteneur, pendant le broyage, afin d'éviter des contaminations croisées.