Brevet FR2790765A1 — publié le 20000915

La présente invention concerne un nouveau milieu chromogène destiné à mettre en évidence Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus est une bactérie dont la détection se révèle de plus en plus intéressante car il s'agit de bactéries qui sont souvent portées par des patients devant subir des soins traumatiques, seringues, cathéter, ou opérations diverses. Dans ce cas, il existe un très grand danger d'infection à terme dès que ces patients entrent en soin. Il s'agit donc d'une bactérie pathogène mais qui, de plus en plus, est impliquée dans des infections nocosomiales en milieux hospitaliers par exemple. De fait, la surveillance épidémiologique des Staphylococcus aureus devient de plus en plus nécessaire et se généralise. Le milieu classique de détection de Staphylococcus aureus dans le domaine clinique est un milieu mannitol-sel qui repose sur les caractéristiques de résistance au sel et d'acidification en présence du mannitol. Ce test n'est pas très satisfaisant, notamment pour ce qui concerne la sensibilité et la spécificité, ce milieu très sélectif conduit à un nombre trop élevé de faux négatifs et, par ailleurs, donne également des faux positifs. De plus, la coloration des colonies provenant de l'acidification diffuse dans le milieu, ce qui ne facilite pas la lecture lorsque l'échantillon n'est pas une culture pure et que les colonies isolées sont proches les unes des autres. La technique antérieure a déjà suggéré l'utilisation de milieux alternatifs, notamment utilisant la phosphatase comme caractère de détection de Staphylococcus aureus (Stevens DL et Jones C : Use of trehalose-mannitol-phosphatase agar to differentiate Staphylococcus aureus and Staphylococcus saprophyticus. J. Clin. Microbiol. 20 :977-980, 1984) avec par exemple un milieu contenant l'indicateur phénolphtaléine phosphate. Cependant, ce milieu présente le défaut de donner une coloration diffusible qui pose problème lorsque l'échantillon n'est pas une culture pure et, comme dans le cas précédent, lorsque les colonies isolées sont proches les unes des autres. La présente invention repose sur l'utilisation d'un milieu chromogène contenant deux agents chromogènes permettant d'obtenir un milieu sensible ne donnant pratiquement pas de faux négatifs pour S. aureus et permettant, en outre, de différencier S. aureus des autres espèces telles que Streptococcus. Lorsque l'on indique qu'un milieu "ne donne pas" ou "pratiquement pas" de faux positifs ou de faux négatifs, il faut toujours entendre que c'est par rapport aux souches qui ont été testées, il n'est pas possible d'être totalement affirmatif car des souches atypiques ou mutantes peuvent apparaître tous les jours. Plus particulièrement, l'invention concerne un milieu de détection de Staphylococcus aureus contenant à titre d'agent chromogène au moins un composé choisi parmi : - le 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et - le 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside dans un milieu de culture. De préférence, on utilisera les deux composés chromogènes. Lorsque l'on utilise le 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate sans le dérivé 5-bromo 4-chloro 3indoxyl glucoside, alors on utilisera de préférence une combinaison avec un substrat chromogène de la glucosidase, en général de type indoxyl glucoside. Lorsque l'on utilise le 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside sans le 5bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate, on utilisera de préférence une combinaison avec un substrat chromogène de la phosphatase, en général de type indoxyl phosphate. Les milieux de culture de S. aureus sont connus et décrits notamment dans le manuel "Oxoïd Unipath Limited", Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 OPW, Angleterre. Il peut s'agir, par exemple de "Nutrient Agar Oxoïd CM3", milieu essentiellement à base d'extraits de levure, de peptone et d'agar. Par "agent chromogène", on entend désigner un composé qui change de couleur en présence d'une souche déterminée, notamment sous l'action du système enzymatique de ladite souche. L'utilisation du milieu selon l'invention permet d'observer une coloration mauve du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate en présence de S. aureus alors que le 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside colore en bleu un grande nombre de souches de Streptococcus sans colorer Staphylococcus aureus. Ceci est tout à fait inattendu car la littérature indique que S. aureus est ssglucosidase positive, comme de nombreuses souches de Streptococcus, ceci peut être vérifié en utilisant par exemple du para-nitrophényle (3-glucoside. Or, on a fait l'observation surprenante que le 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside colorait en bleu les souches de Streptococcus sans colorer les souches de Staphylococcus aureus, ceci a été vérifié sur un grande nombre de souches hospitalières de S. aureus. Le milieu selon la présente invention peut également être amélioré en ajoutant l'un ou les deux chromogènes suivants : - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside et - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide qui sont deux caractères négatifs pour Staphylococcus aureus et permettent donc de le différencier des souches positives pour ces chromogènes. Les milieux selon la présente invention contiendront, de préférence, de 0,01 à 0,500 g/1, notamment de 0,050 à 0,150 g/l de 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate, de préférence de 0,010 à 0,200 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, de préférence de 0,010 à 0,200 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside, de préférence de 0,010 à 0,200 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide. Enfin, on peut ajouter de la déféroxamine qui permet d'inhiber Staphylococcus epidermis sans inhiber Staphylococcus aureus, la concentration mise en oeuvre sera de préférence comprise entre 0,010 et 0,100 g/l. Un milieu préféré selon l'invention, qui permet de différencier les Staphylococcus aureus par la coloration mauve des colonies, tandis que d'autres souches sont inhibées ou donnent des colonies incolores ou bleues, est le suivant : - Peptone et extrait de levure 50 g/1 - 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate 0,100 gl - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside 0,050 g/1 - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside 0,050 g/1 - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide 0,050 g/1 - Déféroxamine 0,050 g/1 - Agar 15 g/1 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après : EXEMPLES Afin de mettre en évidence l'intérêt de l'utilisation de 5-bromo 6-chloro 3indoxyl phosphate pour la mise en évidence de S. aureus on le compare ci-après avec un même type de chromogène phosphate, mais cette fois le 5-bromo 4-chloro 3indoxyl phosphate. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant Couleur des colonies après 24 heures à 37 C ~~~~~~ Milieu A Milieu B S. aureus AR 3916 bleu mauve S. aureus AR 3917 incolore mauve S. aureus AR 3918 bleu mauve Milieu ANutrient Agar Oxoïd CM3 28 g/l, 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl phosphate 0,050 g/l Milieu B Nutrient Agar Oxoïd CM3 28 g/l, 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate 0,050 g/1 On constate que bien que les deux chromogènes soient excessivement voisins, le substrat 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate permet d'écarter des faux négatifs sur la souche AR 3917 par rapport au dérivé correspondant 5-bromo 4-chloro. REVENDICATIONS 1) Milieu de détection de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comporte dans un milieu de culture de Staphylococcus aureus au moins un des deux agents chromogènes suivants : - 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside. 2) Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient les deux agents chromogènes. 3) Milieu selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, au moins l'un des deux agents chromogènes suivants : - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside et - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide. 4) Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, de la déféroxamine. 5) Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient : - Peptone et extrait de levure 50 g/1 - 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate 0,100 gl - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside 0,050 g/1 - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside 0,050 g/1 - 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide 0,050 g/1 - Déféroxamine 0,050 g/1 - Agar 15 g/1