Brevet FR2795092A1 — publié le 20001222

Gène 421 du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea indispensable à la pathogénie du champignon La présente invention concerne un nouveau fragment d'acide nucléique du génome du champignon pathogène du riz Magnaporthe grisea comprenant un gène codant pour une protéine (désignée ci-après protéine 421) dont la présence et l'intégrité sont indispensables à la pathogénie de ce champignon vis-à-vis du riz et de l'orge. Elle concerne également le promoteur de ce gène, la séquence codante pour la protéine 421, la protéine 421 et leurs utilisations pour la recherche de cibles biologiques potentielles pour de nouvelles molécules fongicides et la mise en évidence de gènes codants pour des protéines qui contrôlent des fonctions biochimiques essentielles à la pathogénie du champignon Magnaporthe grisea vis-à-vis du riz et de l'orge. Le principe d'employer des gènes de champignons pathogènes, entièrement ou en partie, dans des tests pour identifier de nouvelles molécules actives contre ces champignons est connu en soi (in Antifungal Agents : and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG and Hollomon DW eds, BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, UK). Dans ce but, la connaissance du génome d'un champignon pathogène donné constitue une étape importante pour la réalisation de tels tests. Toutefois, la simple connaissance d'un gène donné n'est pas suffisante pour atteindre cet objectif, encore faut-il que le gène choisi comme cible de molécules fongicides potentielles soit essentiel à la vie du champignon, son inhibition par la molécule fongicide entraînant la mort du champignon, ou essentiel à la pathogénie du champignon, son inhibition n'étant pas létale pour le champignon mais inhibant simplement son pouvoir pathogène. Cette deuxième catégorie de gènes cibles potentielles de molécules fongicides est particulièrement importante pour le développement d'une nouvelle génération de produits fongicides plus respectueux de l'environnement, s'attaquant de manière spécifique au seul pouvoir pathogène des champignons pathogènes. La présente invention concerne donc un nouveau fragment d'acide nucléique, ou polynucléotide, en particulier un fragment d'acide nucléique isolé, ledit fragment comprenant un gène codant pour la protéine 421. La présente invention concerne également un fragment d'acide nucléique, ou polynucléotide, en particulier un fragment d'acide nucléique isolé, comprenant le promoteur du gène codant pour la protéine 421 (ci-après gène 421). La présente invention concerne également un fragment d'acide nucléique, ou polynucléotide, en particulier un fragment d'acide nucléique isolé, comprenant la séquence d'acide nucléique codant pour @la protéine 421. Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique comprend le promoteur du gène 421 (ci-après promoteur 421) associé de manière fonctionnelle à une séquence codant pour une protéine marqueur (ou séquence codante d'un gène marqueur), permettant l'expression de ladite protéine marqueur dans un champignon. Par séquence codant pour une protéine marqueur on entend selon l'invention une séquence codant pour une protéine différente de la protéine 421. La séquence codante d'un gène marqueur est généralement choisie parmi les séquences codantes d'un gène rapporteur, en particulier GUS (US 5 268 463, US 5 599 670) ou GFP (US 5 491 084, US 5 741 668), les séquences codantes pour un gène de tolérance à un antibiotique ou un herbicide, comme les gènes de résistance à l'hygromycine (hph : Punt et al., 1987), à la phléomycine (ble : Drocourt, 1990), à l'herbicide bialaphos (Bar : Pall et Brunelli, 1993), ou un gène de résistance aux sulfonylurées (Sweigard et al., 1997). De manière préférentielle, le fragment selon l'invention est constitué par une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription le promoteur 421, la séquence codante pour la protéine marqueur et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les champignons. Selon un deuxième mode particulier de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique comprend un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, associé de manière fonctionnelle à la séquence codante de la protéine 421. De manière préférentielle, le fragment d'acide nucléique est une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, la séquence codante pour la protéine 421 et une séquence terminatrice pour fonctionnel dans ledit organisme hôte. Le fragment d'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre associé de manière fonctionnelle au promoteur fonctionnel dans un organisme hôte et à la séquence codant pour la protéine 421, une séquence codant pour un signal d'adressage membranaire de la protéine 421 fonctionnel dans ledit organisme hôte, permettant d'adresser la protéine 421 dans les membranes de l'organisme hôte dans lequel elle est exprimée. Par organisme hôte, on entend selon l'invention les bactéries, les levures, les champignons ou les insectes. De manière avantageuse, les bactéries sont choisies parmi Escherichia coli, les levures sont choisies parmi Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisae, les champignons sont choisis parmi Aspergillus niger, et les insectes sont choisis parmi Spodoptera frugiperda (Baculôvirus) et Drosophila melanogaster. La présente invention concerne également un fragment d'acide nucléique comprenant une séquence d'acide nucléique antisens de la séquence codante de la protéine 421. Par séquence antisens on entend selon l'invention une séquence d'acide nucléique codant pour une séquence antisens totale ou partielle de la séquence codante de la protéine 421. L'expression de cette séquence dans un champignon, et en particulier Magnaporthe grisea permet d'inhiber l'expression de la protéine 421 et la pathogénicité du champignon. Les techniques d'inhibition de l'expression d'une protéine par un antisens sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature, notamment Judelson et al. (1993, Gene 133 :63-69) ainsi que Prokish et al. (1997, Mol. Gen. Genet. 256:104-114). De manière préférentielle, le fragment d'acide nucléique est une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un champignon, en particulier Magnaporthe grisea, la séquence antisens de la séquence codante de la protéine 421 et une séquence terminatrice pour fonctionnel dans ledit champignon. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les champignons, on citera notamment celui de glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase d'Aspergillus nidulans (Roberts et al. 1989. Current Genet. 15:177-180). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les bactéries, on citera notamment celui de la RNA polymérase du bacteriophage T7 (Studier et al. 1990. Methods in enzymology 185:60- 89).. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les levures, on citera notamment celui du gène Gall (Elledge et al, 1991,. Proc ntl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les insectes, on citera notamment le promoteur de la polyhédrine de baculovirus AcMNPV (Weyer et al. 1991. J. Gene. Virol. 72:2967-2974). Comme signal d'adressage membranaire dans les organismes hôtes on citera notamment celui de la protéine A chez les bactéries (Nilsson et al. 1991. Methods in Enzymology 198:3). La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou de transformation et/ou d'expression comprenant le fragment d'acide nucléique selon l'invention. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. La présente invention concerne également un organisme hôte transformé comprenant un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus, ledit fragment d'acide nucléique étant hétérologue de l'organisme hôte. Par fragment hétérologue de l'organisme hôte on entend selon l'invention un fragment ne se trouvant pas naturellement dans le génome de l'organisme hôte dans le locus ou le plasmide dans lequel il a été introduit dans ledit organisme hôte. Il peut s'agir du gène 421, ou de tout fragment selon l'invention introduit de manière artificielle dans Magnaporthe grisea ou dans tout organisme hôte défini ci-dessus, ou issu de la descendance de l'organisme hôte transformé. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature (bactéries: Inoue et al. 1990. Gene 96:23-28 ; Champignons et levures : 1989. Microbiological Reviews 53:148-170). La présente invention concerne également un procédé de transformation d'un organisme hôte défini ci-dessus, dans lequel on introduit dans ledit organisme hôte le fragment d'acide nucléique selon l'invention, notamment au moyen du vecteur ci-dessus. La présente invention concerne également la protéine 421, notamment la protéine 421 produite par un organisme hôte ci-dessus, isolée, purifiée totalement ou en partie. De manière avantageuse, le gène 421 est constitué par la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n 1 (SEQ ID NO 1). Le promoteur 421 est de préférence constitué par la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n 2 (SEQ ID NO 2). La séquence codante pour la protéine 421 est constituée par la séquence d'ADN génomique représentée par l'identificateur de séquence n 3 (SEQ ID NO 3) ou par la séquence d'ADNc représentée par l'identificateur de séquence n 4 (SEQ ID NO 4), ou par l'identificateur de séquence n 5 (SEQ ID NO 5). La protéine 421 est de préférence constituée par la séquence protéique représentée par l'identificateur de séquence n 6 (SEQ ID NO 6). La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec les séquences ci-dessus, les séquences homologues aux séquences cidessus, les fragments des dites séquences, et pour le cas des séquences codant pour la protéine 421, les séquences qui diffèrent des séquences ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la même protéine. Selon la présente invention, on entend par fragment d'acide nucléique une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin. Par séquence capable de s'hybridiser de manière sélective , on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les séquences ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50 C-60 C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : Labratory Manual). Par homologue , on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n 1, 2,3 ou 4 et codant pour la protéine 421. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n 1, 2, 3 ou 4 et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 50 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 70 %, plus préférentiellement d'au moins 80 %, encore plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine 421. Cette définition s'applique également à la séquence protéique de la protéine 421, les mutations étant dans ce cas au niveau des acides aminés et les degrés d'homologie étant définis par rapport à la séquence primaire de la protéine décrite par l'identificateur de séquence n 5. La distribution du gêne 421 au sein de l'espèce M. grisea a été analysée par hybridation. L'ADN génomique de cinq isolats pathogènes du riz de différentes régions du monde (mali, Cameroun, Brésil, Japon, Chine), ainsi que celui de six isolats provenant d'autres plantes hôtes que le riz (blé, éleusine, mil, gingembre, Cyperus) a été hybridée avec une sonde correspondant à la phase codante du gène 421 en conditions d'hybridation hétérologue (55 C, 2 SSC). Un signal d'hybridation correspondant à un gène en copie unique a été détecté chez tous les isolats analysés, dont celui d'une espèce apparentée à M. grisea (PH54, Pyricularia higginsii) pathogène des Cypéracées. Ce résultat montre que le gène 421 est fortement conservé au sein de l'espèce M. grisea. Une recherche dans les bases de données d'EST fongiques du domaine public a également été effectuée. Deux séquences homologues du gène 421 ont été détectées chez Botrytis cinerea qui ont de fortes identités de séquence au niveau nucléotidique (50%) et protéique (50%) (WOAA019ZD10C1 et WOAA063ZD05Cl, Base de donnée du Génoscope, Evry, France ; figure 7). Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme dumétier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290- 300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10). Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395). Par fragments , on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN définies par les séquences ID ci-dessus, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, comme par exemple la fonction de régulation promotrice pour la SEQ ID No 2. La présente invention concerne également l'utilisation des fragments d'acide nucléique et de la protéine 421 selon l'invention définis ci-dessus, pour l'identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons ou pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons. Identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons Le gène 421 contrôle différentes fonctions biologiques de l'appressorium comme la différenciation de l'aiguille d'infection et une croissance dans la plante infectée. La diversité des fonctions contrôlées par le gène 421 suggère qu'il agit soit dans une voie de signalisation contrôlant l'activité d'autres gènes, soit dans un processus de différenciation dont le bloccage entraine de nombreux effets secondaires. Il est possible d'identifier les gènes dont l'expression dépend du gène 421 par l'étude comparative des gènes exprimés chez un mutant de M. grisea dont l'expression de la protéine aura été inhibée, notamment au moyen d'un antisens selon l'invention défini auparavant, et la souche sauvage de M. grisea. Identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons Identification d'inhibiteurs se fixant sur la protéine 421 La protéine 421 sur-exprimée dans les membranes d'une cellule d'un système d'expression hétérologue (bactérie, levure ou insecte) au moyen du fragment d'acide nucléique selon l'invention défini ci-dessus, puis la purification simplifiée des membranes des organismes recombinés exprimant la protéine 421 permet d'identifier de nouvelles molécules se fixant sur la protéine 421. L'identification des dites molécules se fait par des méthodes bien connues de l'homme du métier, notamment des méthodes de détection physique de la fixation des composés testés sur la protéine 421 (système BIACORE; Karlson & al., J. of Biomolecular Interaction Analysis, spécial issue Drug Discovery : Identification d'inhibiteurs interagissant avec les complexes membranaires contenant la protéine 421 Les protéines de la famille des tétraspanines auxquelles appartient la protéine 421, interagissent avec d'autres protéines membranaires (Maecker et al. 1997. FASEB J., 11 :428- 442). La première étape consiste à identifier les protéines formant un complexe membranaire avec la protéine 421 par des méthodes moléculaires comme la méthode du double hybride (Van Aeist et al. 1993. PNAS. 90 : ou le clonage des gènes de M. grisea homologues des genes codant les protéines de ces complexes connues chez les animaux comme les intégrines (Hemler 1998. Current Opinion in Cell Biology 10 :578-585), des méthodes biochimiques (immuno précipitation des complexes membranaires auquel appartiendrait la protéine 421 et caractérisation des protéines de ce complexe comme cela a été réalisé dans le cas des tétraspanines animales : et al. 1998. J. Biological Chem. 273 :30537-30543). La connaissance des protéines interagissant avec la protéine 421 permet de construire un système de détection de molécules capables d'inhiber l'interaction entre ces protéines et la protéine 421. De tels systèmes de détection sont bien connus de l'homme du métier, notamment le système double hybride de la levure (Van Aeist et al. 1993. PNAS. 90: 6213-6217) avec des fragments de la protéine 421 et de celles interagissant avec 421, ou un système de mesure de la fixation d'une des protéines du complexe à la protéine 421 présente dans une préparation membranaire en utilisant un couple Europium-allophycocyanine, chaque élément du dispositif de fluorescence par transfert étant greffé aux protéines testées (Mathis 1993. Clin. Chem. 39:1953-1959). Identification d'inhibiteurs des régulateurs de l'expression du gène 421 L'utilisation d'un fragment d'acide nucléique selon l'invention défini ci-dessus comprenant le promoteur 421 associé à la séquence codante d'un gène reporteur permet de visualiser l'expression du gène 421 dans une cellule fongique. Une souche recombinée comprenant le gène ci-dessus est ensuite utilisée pour identifier des molécules inhibant l'expression du gène 421, ce qui se manifeste par une inhibition de la protéine rapporteur de la souche recombinée dans les conditions d'expression du gène 421. Ce type de test est bien connu de l'homme du métier et décrit dans la littérature, notamment Axiotis et al. (1995. pp. 1-7 in Antifungal Agents : and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG and Hollomon DW eds, BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, UK). La présente invention concerne donc un procédé pour identifier des composés inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421, ledit procédé consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de ladite pathogénie des champignons et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier. De manière préférentielle, le test approprié est un test tel que défini ci-dessus. Par composé on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines. Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia) stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc. ) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire. La présente invention concerne enfin de nouveaux composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421, notamment les composés identifiées par le procédé selon l'invention et/ou les composés dérivés des composés identifiés par le procédé selon l'invention. De manière préférentielle, les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421 ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle les composés selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité fongicide et/ou une activité sur la pathogénie des champignons. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421 par le procédé d'identification selon l'invention, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique. L'étape de préparation du composé peut être précédée le cas échéant par une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon l'invention, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles. Les exemples ci-après permettre d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J. Sambrook (1982). Les méthodes spécifiques des champignons sont décrites dans Sweigard et al. 1997 Fungal Genetics Newletter. 44:52-53 pour les vecteurs de transformation fongiques utilisés, dans Orbach 1994. Gene 150 :159-162 pour la construction d'une banque cosmidique, dans Sweigard et al. 1990 Fungal Genetics Newletter. 37 :4-5 pour la préparation d'ADN génomiques fongiques). L'homme du métier sera à même de reproduire l'invention, isoler et cloner le fragment d'acide nucléique selon l'invention, totalement ou en partie, notamment le promoteur 421 ou la séquence codante de la protéine 421 sur la base des informations et séquences contenues dans la présente demande brevet, notamment au moyen des techniques de biologie moléculaire usuelles dans le domaine technique comme la PCR (revue sur l'utilisation de ces techniques chez les champignons : et al. 1997. Fungal Genetics and Biology 21 :292- 301). Exemple 1 : Identification et caractérisation du gène 421 La stratégie employée pour parvenir à l'identification et la caractérisation du gène 421 essentiel à la pathogénie de M. grisea comporte deux points principaux: 1) L'inactivation d'un gène essentiel à la pathogénie par l'insertion de manière aléatoire dans sa séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN étranger (mutagenèse insertionnelle). 2) La récupération et la caractérisation de la séquence nucléotidique fongique ainsi modifiée, puis la démonstration de son implication dans la pathogénie du champignon vis-àvis du riz et de l'orge. Les étapes méthodologiques à franchir successivement sont les suivantes: 1) L'obtention d'une collection d'isolats du champignon ayant intégré de manière aléatoire un fragment d'ADN étranger dans leur génome (transformants). En l'occurence, l'ADN étranger est un plasmide comportant le gène hph d'Escherichia coli, ce qui permet leur sélection sur la base de la résistance à l'hygromycine. Il est introduit dans le génome du champignon par transformation de protoplastes. 2) La recherche de transformants non pathogènes vis-à-vis du riz et de l'orge parmi la collection (mutants de pathogénie). Le critère retenu pour la non pathogénie d'un transformant est l'incapacité à provoquer des lésions foliaires suite à l'inoculation de spores de ce transformant à des plants de riz et d'orge. 3) La démonstration génétique de l'inactivation d'un gène de pathogénie par le plasmide chez les mutants incapables d'infecter le riz et l'orge. Il s'agit d'établir une liaison génétique complète entre le caractère de résistance à l'hygromycine, qui traduit la présence du plasmide dans le génome du mutant, et celui de la non pathogénie, qui traduit l'inactivation d'un gène essentiel à la capacité infectieuse du champignon. Ce degré de liaison est évalué par l'analyse de la ségrégation des caractères de résistance à l'hygromycine et de non pathogénie chez les descendants d'un croisement entre le mutant étudié et une souche sauvage, pathogène vis-à-vis du riz et de l'orge et de signe sexuel compatible avec celui du mutant. 4) La récupération de la région génomique du champignon où s'est produite l'insertion du plasmide mutateur. Le principe consiste à isoler un fragment d'ADN du mutant comportant à la fois des séquences plasmidiques et génomiques, repérable grâce à une expérience d'hybridation avec une sonde d'origine plasmidique. La partie génomique incluse dans ce fragment peut ensuite servir à isoler la région génomique sauvage complète selon le même principe. 5) La démonstration que la région génomique avoisinant le point d'insertion du plasmide contient le gène de pathogénie. Si le gène de pathogénie recherché se trouve dans la région génomique avoisinant le point d'insertion du plasmide, son introduction dans le génôme de l'isolat mutant, à l'aide d'un vecteur plasmidique comportant un autre marqueur de sélection, doit permettre de restaurer la pathogénie par complémentation de la fonction rendue déficiente par l'insertion du premier plasmide. La preuve en est donnée si les spores d'au moins un transformant obtenu par cette expérience sont capables de provoquer autant de lésions foliaires que la souche sauvage. 6) La caractérisation de la séquence génomique du champignon à proximité du point d'insertion du plasmide. Le produit du séquençage de la région génomique avoisinante au point d'insertion du plasmide est analysé avec des logiciels de traitement de séquences, de manière à tenter d'y mettre en évidence une séquence nucléotidique susceptible d'être traduite en séquence protéique (cadre de lecture ouvert). Cette recherche se fait sur la base de la recherche des signaux consensus d'initiation et de terminaison de la traduction en protéine. La preuve de l'existence d'un cadre de lecture ouvert (et donc d'un gène) dans cette région est apportée par le clonage de l'unité transcriptionnelle correspondante, grâce au criblage d'une banque d'ADN complémentaires des ARN messagers (ADNc) avec une sonde produite à partir d'un fragment de cette région. La séquence de cet ADNc permet de déterminer avec précision la taille et la séquence primaire de la protéine correspondante, ainsi que la position d'éventuels introns dans la séquence génomique du gène. 7) La démonstration que le cadre de lecture ouvert localisé au niveau du point d'insertion du plasmide est celui du gène de pathogénie. Elle est faite grâce à une expérience de remplacement, qui consiste à provoquer au moyen d'une transformation la substitution de la séquence du gène étudié par un marqueur de sélection. Elle fait intervenir, au niveau des séquences génomiques situées de par et d'autre du gène, un double événement de recombinaison homologue entre le génome de la souche sauvage et un vecteur de remplacement. Ce vecteur est constitué d'un grand fragment d'ADN de séquence homologue à celle de la région contenant le gène de pathogénie supposé, à l'exception du gène lui-même, qui a été supprimé par restriction et remplacé par le gène de résistance à l'hygromycine. Les spores des transformants résistants à l'hygromycine pour lesquels il est possible de montrer par une expérience d'hybridation qu'ils ont perdu la séquence du gène étudié et qu'ils n'ont qu'une copie du gène de résistance à l'hygromycine, sont inoculés à des plants de riz et d'orge. S'ils sont tous incapables de provoquer la moindre lésion foliaire, la séquence nucléotidique étudiée est bien celle du gène de pathogénie. Expérience 1 : mutagenèse insertionnelle (fabrication du mutant) Les conditions de culture, d'obtention des protoplastes, de transformation ainsi que de purification et de stockage des transformants de Magnaporthe grisea sont décrites par Silué et al. (1998, Physiol. Mol. plant Pathol., 53,239-251). La transformation a été réalisée avec 1 g de plasmide pAN7.1 (Punt et al., 1987 Gene 78 : 147-156) et 107 protoplastes de la souche P 1.2 de M grisea. Cette souche provient de la collection du laboratoire de Phytopathologie du CIRAD de Montpellier. La sélection des transformants a été réalisée par incorporation d'hygromycine dans les milieux de culture gélosés, aux concentrations de 240 ppm pour le milieu de sélection primaire et de 120 ppm pour celui de sélection secondaire. Expérience 2: criblage de la collection de transformants (isolement du mutant non pathogène 421) A) Essais de pathogénie sur feuilles en survie Les essais de pathogénie ont été réalisés sur deux variétés de riz, Maratelli et Sariceltick, et une variété d'orge, Express. Maratelli sont des variétés très sensibles à la pyriculariose et qui ne possèdent pas de gènes de résistance à la souche P1.2. Les variétés d'orge sont extrêmement sensibles à la pyriculariose. Le riz a été cultivé à 25 C le jour, 15 C la nuit avec une hygrométrie supérieure à 70%, l'orge en conditions froides (20-22 C). Des fragments de feuilles (2,5 cm) de riz et d'orge ont été prélevés dans la partie médiane de la plus jeune feuille de plants âgés d'une vingtaine de jours. Ces fragments ont été déposés dans des boîtes multicompartimentées contenant de l'eau gélosé à 1% additionné de 2 mg/ 1 de kinétine, milieu permettant leur survie durant 14 jours. Il est important de noter que le riz développe une forte résistance physiologique à la pyriculariose durant les périodes de fortes chaleurs. Cette résistance peut être atténuée par un apport de fertilisant azoté aux plants : arrosages avec une solution de sulfate d'ammonium 5g/ m2 à une semaine d'intervalle. Le deuxième arrosage a lieu 2 à 3 jours avant l'inoculation. Les conditions de sporulation et de la préparation d'inoculum de spores de M. grisea sont décrites par Silué et al. (op. cit.). L'inoculation a été réalisée à l'aide d'un coton tige humide trempé dans une suspehsion de spores et passé sur les fragments de feuilles en survie. La quantité de spores déposée a été estimée en déposant une goutte de la suspension sur une lame de verre. Les symptômes ont été observés après 4-7 jours d'incubation à 24 C, 100 % d'hygrométrie. Chaque transformant a été testé sur quatre fragments de feuille de riz de chaque variété et quatre d'orge lors du criblage primaire. Le transformant 421 ne présentant aucun symptôme de la maladie sur riz et sur orge a été inoculé une seconde fois afin de confirmer son phénotype avec une suspension de spores de concentration ajustée à 105 spores par ml. B) Essais de pathogénie sur plantes entières De manière à confirmer le phénotype du mutant non pathogène 421 détecté par l'inoculation de feuilles en survie, le département de Phytopathologie du CIRAD de Montpellier a réalisé des inoculations de plantes entières avec les spores de ce mutant. Les deux cultivars de riz sensibles à la souche P1.2, Maratelli et Sariceltick ont été semés et cultivés en serre. Trois applications d'azote ont été effectuées durant les trois premières semaines de culture (à 5,10 et 20 jours après le semis). L'inoculation par pulvérisation d'une suspension de spores a lieu 10 à 15 jours après le dernier apport d'azote, selon le degré de maturité des plantes. La concentration en spores a été déterminée par comptage avec une cellule de Thoma et ajustée à une valeur 20000 spores/ml. Les suspensions de spores du mutant 421 et de la souche P1.2 non transformée ont été pulvérisées sur trente plantes à raison de 1 ml de suspension de spores par plante avec un aérographe. Une feuille de chacune de ces plantes a été collectée pour comptage du nombre de lésions après développement de celles-ci (5 à 7 jours). Aucune lésion typique de la maladie n'est apparue sur les plantes inoculées avec les spores du mutant 421. Expérience 3: Analyse phénotypique des descendants d'un croisement entre le mutant 421 et la souche sauvage M4 (confirmation de l'existence de la liaison génétique entre la mutation d'un gène de pathogénie et l'insertion du plasmide conférant la résistance à l'hygromycine). Les conditions de croisement et d'isolement des ascospores produites sont décrites par Silué et al. (op. cit.). Les cultures issues de chacune des ascospores ont été repiquées sur milieu complet avec 120 mg/1 d'hygromycine et leurs spores inoculées à des feuilles d'orge et de riz en survie. Les descendants de ce croisement étaient disponibles sous la forme de cinq tétrades (7 à 8 descendants issus d'un même asque). Les résultats de l'analyse phénotypique de ces descendants et de leur interprétation figurent dans les tableaux 1 et 2. En plus des phénotypes liés à la pathogéniè et à la résistance à l'hygromycine, un troisième caractère ayant trait à la morphologie du mycélium a été clairement mis en évidence chez les descendants sous la forme de deux allèles : allèle conférant un mycélium gris et aérien (GA, théoriquement le phénotype sauvage de morphologie mycélienne des deux souches de M. grisea utilisées, P1.2 et M4) et un allèle conférant un mycélium clair et ras (rc). Cette observation s'est révélée être très précieuse pour l'interprétation des résultats de ce croisement. En effet, si aucun descendant n'a le phénotype HygR et Path+, de nombreux descendants ont le phénotype HygS et Path-. Mais par ailleurs, ce double phénotype coségrège avec rc, alors que HygS et Path+ coségrège avec GA. Cette observation, couplée au fait que l'analyse des descendants en tétrades permet de reconstituer les génotypes des parents et des descendants (voir tableau 2), permet de mettre en évidence la ségrégation de deux gènes de pathogénie indépendants. L'un, A, est étiqueté par le plasmide (son allèle muté est lié à HygR) et l'autre, B, est lié au gène contrôlant la morphologie du mycélium (phénotypes GA et rc). Il a été possible de montrer par la suite que l'allèle muté de B provenait du parent M4 utilisé lors du croisement et qui avait dérivé lors de sa multiplication végétative. Le gène A est donc étiqueté par le plasmide pAN7. 1 chez le mutant 421. Expérience 4 : de la séquence génomique de M. grisea cible de l'insertion du plasmide chez le mutant 421. A) Préparation d'ADN génomique de M. grisea Le protocole d'extraction et de purification employé est celui décrit par Sweigard et al. (1990 Fungal Genet. Newsl 37 :4) B) Cartographie de la région d'insertion du plasmide chez le mutant 421 par hybridation L'ADN génomique a été quantifié au transilluminateur UV (310 nm) en comparaison avec une gamme étalon de concentration, après électrophorèse dans un gel de tampon TAE (40 mM Tris ; mM acétate; 1mM EDTA; pH8,3) à 0,7% d'agarose et 0,2 mg/1 de bromure d'éthidium. Des aliquots de 5 g d'ADN ont été digérés pendant une nuit à 37 C avec les enzymes de restriction EcoRI, Sspl, BglII, SacI et HindIII (Boehringer Mannheim) dans au moins 20 (il d'eau avec le tampon approprié. Une digestion témoin du plasmide pAN7. 1 par l'enzyme EcoRI a également été réalisée. Les fragments de restriction obtenus ont été séparés par une électrophorèse d'une nuit, sous une tension de 35 V et dans un gel TAE à 0,7% d'agarose et 0,2 mg/1 de BET. Après migration, le gel d'électrophorèse est placé sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham), l'ensemble reposant sur un plateau poreux relié à une pompe à vide (réglée à 35mm d'Hg). Le transfert des fragments d'ADN génomique sur la membrane est précédé d'un traitement du gel par une solution de 0,25 M HCl (deux fois 4mn), une solution dénaturante (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M ; mn) puis une solution neutralisante (Tris-HCl 0,5M, EDTA ImM, NaCl 1,5 M, pH 7,2 ; fois 4mn). Le transfert sous vide a été réalisé dans un tampon SSC 20X pendant 20 mn. La membrane a été séchée à 37 C puis enveloppée dans un film de Saran-wrap. L'ADN a été fixé de façon covalente à la membrane par une exposition de 5 mn aux UV (310 nm). Les fragments de restriction de l'ADN génomique du mutant comportant des séquences plasmidiques ont ensuite été repérés par une expérience d'hybridation avec une sonde radioactive synthétisée à partir du plasmide pAN7.1. Le marquage de l'ADN plasmidique a été réalisé par la méthode d'amorçage aléatoire (random priming) conformément aux instructions du kit Megaprime (Pharmacia), avec du dCTP marqué au phosphore 32 (Amersham). La préhybridation de la membrane a été effectuée dans une solution SDS 0,5%, SSC 6X (NaCI et citrate trisodique 0,9M), Denhardt's 5X (Ficoll 0,1%, polyvinylpyrolidone 0,1%, sérum d'albumine bovine fraction V 0,1%), durant 30 mn à lh à 65 C (four à hybridation Appligène). La sonde radioactive a été dénaturée par chauffage 5 mn à 95 C puis ajoutée au tampon de préhybridation. Le mélange a été placé 15 h à 65 C. La membrane a été lavée à 65 C une première fois dans un tampon SSC 2X SDS 0,1% (deux fois 30 mn), puis dans un tampon SSC 0,2x, SDS 0,1%. (lh). La membrane a été enveloppée dans un film de Saran-wrap puis placée à -80 C au contact d'un film photographique (Hyperfilm MP, Amersham) entre deux écrans amplificateurs. Les deux bandes d'hybridation avec la sonde plasmidique obtenues par la digestion EcoRI (figure 1) ne correspondent à aucun des fragments d'une digestion témoin du plasmide: il s'agit donc de l'insertion d'une copie unique du plasmide, avec perte du site EcoRI situé à l'extrémité du promoteur gpdA (l'autre site, situé dans le gène de structure hph, ne pouvant être perdu car siyué dans la séquence nécessaire pour la sélection du transformant). L'hybridation de la digestion SspI donne également deux bandes, dont l'une correspond au fragment de 4 kb de la digestion témoin du plasmide. Les deux sites Sspl sont donc conservés et l'intégration a eu lieu dans le fragment de 2,75 kb situé entre ces deux sites (soit la région comprenant AmpR, ORI et le début du promoteur gpdA). La digestion par BglII donne une bande unique d'hybridation de très haut poids moléculaire, témoignant de la perte de ce site. La jonction gauche de l'insertion serait donc située entre le site BglII et le site SspI du promoteur gpdA. La double digestion EcoRI-HindIII donne trois bandes d'hybridation, dont l'une était présente sur le profil de la digestion EcoRI (la plus petite, située vers 3 kb). Le site HindIII est donc conservé et situé dans le grand fragment visible sur le profil d'hybridation de la digestion EcoRI. Par ailleurs, il est possible, en mesurant les tailles des fragments obtenus grâce à cette double digestion, de voir que la somme des tailles des deux plus petits fragments est inférieure à la taille du grand fragment du profil d'hybridation de la digestion EcoRI, mais également de celle du fragment de 4,25 kb, produit de la digestion témoin du plasmide. Cela signifie que le premier site HindIII rencontré dans la séquence de l'ADN génomique, en partant de la jonction droite de l'insertion, se trouve plus proche de cette jonction que le premier site EcoRI, mais surtout que le fragment de plasmide compris entre le site HindIII et la jonction droite est plus court que le fragment témoin d'une double digestion EcoRI-HindIII du plasmide. Une bonne partie de cette région plasmidique (2,75 kb au maximum) a donc été perdue lors de l'intégration du plasmide, et, vraisemblablement avec elle la séquence codant pour la résistance à l'ampicilline et l'origine de réplication (voir schéma figure 1). Le fragment de digestion EcoRI de 3 kb chevauchant une extrémité plasmidique, constitué d'un morceau du promoteur gpdA d'au moins 1,86 kb et d'un morceau d'ADN génomique est sensé appartenir au gène de pathogénie muté. Par ailleurs, l'hybridation par une sonde plasmidique de la double digestion EcoRI/SacI a permis de montrer qu'il n'existait dans ce fragment que deux sites SacI très proches, situés à peu près au milieu de la région plasmidique (voir la figure 2). La stratégie d'Inverse-PCR est donc envisageable pour le clonage de ce fragment. C) Récupération et clonage d'un fragment d'ADN génomique du mutant 421 contenant une partie génomique et une partie plasmidique par Inverse-PCR Le principe de cette expérience est décrit par Ochmann et al. (1988 Genetics 120 : 621- 623). L'ADN génomique du mutant 421 est digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. Les fragments de restriction ont été séparés selon leur taille par une électrophorèse en gel d'agarose. Après migration, la zone du gel contenant les fragments de restriction d'une taille voisine de 3 kb a été découpée au scalpel. Les fragments d'ADN qu'elle contenait ont été récupérés par désorption. Ces fragments ont fait l'objet d'une ligature dans un grand volume (DNA Ligation System, Amersham dans 100 l), de manière à ne favoriser que le circularisation des fragments par autoligature. L'ADN a été précipité avec 300 )il d'éthanol absolu et resuspendu dans 20 l d'eau. Les fragments circularisés ont été digérés pendant 1 heure à 37 C par l'enzyme de restriction SacI. La totalité du produit de digestion a fait l'objet d'une PCR (PTE 100 MJ research) en conditions moyennement stringentes (30 cycles de l' à 95 C; l' à 50 C; 1'30" à 72 C) à l'aide des amorces oligonucléotidiques 421 (+) et421(-) (voir la figure 2). Ces amorces ont été définies à partir de leur position sur la séquence du promoteur gpdA et avec une structure secondaire compatible avec une réaction de PCR performante (programme OLIGO). La taille attendue du fragment de PCR correspondant à la bordure du point d'insertion, déduite de la cartographie faite par hybridation, était de 1,6 kb. Les produits d'amplification ont été séparés par électrophorèse. Deux bandes très ténues étaient visibles, l'une d'une taille de 1 kb, l'autre de 1,6 kb. Une deuxième amplification dans les mêmes conditions et en prenant comme matrice ce premier produit de PCR a permis d'augmenter la quantité de ces deux fragments de PCR. Le transfert sur membrane de nylon de ces deux fragments séparés par électrophorèse, suivi de l'hybridation par une sonde synthétisée à partir du fragment de restriction BgIII-SacI du promoteur du gène gpdA, ont pu démontrer qu'ils portent tous les deux des séquences homologues à cette sonde (conditions d'hybridation : op. cit.). Ils ont alors été extraits du gel et ont fait l'objet d'une ligature dans un vecteur de clonage des produits de PCR (pGEM-T Easy, Promega). Les produits de ligation ont été utilisé pour transformer des bactéries compétentes selon le protocole décrit par Inoue et al. (1990 Gène 96 : 23-28). Des minipréparations d'ADN plasmidique et des digestions de contrôle ont permis de confirmer que le fragment amplifié de 1,6 kb était bien celui déduit de la cartographie. Une expérience d'hybridation avec une sonde plasmidique du fragment de PCR transféré sur membrane de nylon après électrophrèse en gel d'agarose, a permis de montrer qu'une partie de sa.séquence est homologue à celle du plasmide pAN7.1(conditions de transfert et d'hybridation : op.cit.). D) Clonage de la région génomique cible de l'insertion du plasmide chez le mutant 421 Cette région a été isolée sous la forme d'un cosmide par hybridation d'une réplique sur membrane de nylon de la banque cosmidique de la souche 96/0/76 de M. grisea construite par Dioh et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25 (24): 5130-5131). La sonde utilisée a été préparée à partir d'un fragment de 350 bp, produit d'une double digestion par les enzymes de restriction EcoRI et Sali du fragment d'IPCR cloné lors de l'étape précédente (voir figure 2 et 3: 421C1), de manière à ne conserver qu'une séquence strictement génomique et homologue à celle recherchée dans la banque cosmidique. Le site Sali de la portion génomique du fragment d'IPCR a été identifié lors de digestions de contrôle sur ce fragment (conditions d'hybridation op. cit.). La colonie bactérienne du cosmide 32H7 de cette banque hybridant avec cette sonde a été multipliée et l'ADN cosmidique extrait et purifié grâce au Plasmid Midi Kit (QIAGEN). Après quantification de l'ADN extrait par spectrophotométrie dans l'UV (260 nm), le cosmide a été cartographié par restriction. L'ADN du cosmide a été digéré par plusieurs enzymes de restriction, les produits de digestion séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur membrane de nylon. Cette membrane a été hybridée avec le fragment génomique EcoRI- SalI de.350 bp cloné suite à l'expérience d'Inverse-PCR (conditions de digestion, séparation et transfert des fragments de restriction et hybridation : op.cit.). Deux sous-clones de ce cosmide ont été réalisés suite au résultat de cette hybridation : fragments de restriction chevauchants (Notl de 15 kb et BamHI de 8,5 kb ; la figure 3) hybridant avec la sonde utilisée ont été ligaturés dans le vecteur pCB1265 (Sweigard et al. (1997) Fungal Genet. Newsl. 44 : 52-53) pour donner les plasmides pCM421-15 et pCM421-8,5. Ces deux plasmides ont été clonés et extraits en vue de transformations fongiques. Expérience 5 : Complémentation de la mutation avec un fragment d'ADN de la région génomique cible de l'insertion chez le mutant 421. Le vecteur pCB1256 contient le gène bar sous contrôle de séquences régulatrices fongiques qui permet la sélection de transformants de M. grisea résistants à la phosphinothricine. Les sous-clones génomiques isolés par hybridation avec la séquence jouxtant le plasmide dans le génôme du mutant 421 peuvent donc être introduits par transformation chez ce mutant pour savoir s'ils contiennent la séquence complète nécessaire à la complémentation fonctionnelle de la mutation. Des protoplates du mutant 421 ont été transformés avec les plasmides pCM421-15 et pCM421-8,5 et les spores des transformants purifiés obtenus ont été inoculés à des feuilles de riz et d'orge en survie, puis à des plantes entières de riz (conditions de préparation des protoplastes, de transformation, de sélection et de purification des transformants et d'essais de pathogénie : op.cit.). Dans les deux cas, au moins un transformant présentait un niveau de pathogénie semblable à celui de la souche sauvage (voir le tableau 3), ce qui indique que la séquence complète du gène de pathogénie altéré chez le mutant 421 est contenue dans ces deux fragments. Expérience 6 : Localisation et caractérisation de la séquence nucléotidique du gène de pathogénie muté A) Séquençage de l'ADN génomique au voisinage du point d'insertion du plasmide chez le mutant 421 Le fragment cloné suite à l'expérience d'Inverse-PCR a été entièrement séquence à partir des amorces Ml 3 et Reverse des bordures du polylinker du plasmide pGEM-T Easy. Des amorces de réactions de séquençage ont ensuite été désignées sur les deux brins de la séquence génomique du fragment d'Inverse-PCR pour étendre les données de séquences de part et d'autre du point d'insertion du plasmide pAN7.1 chez le mutant 421 grâce au plasmide pCM421-8,5. La synthèse des oligonucléotides ainsi que les réactions de séquençage ont été réalisées par la société Génôme Express S. A. (Grenoble, France). B) Isolement et séquençage de l'ADN complémentaire Une banque d'ADN complémentaires des ARN messagers de M. grisea a été construite et criblée pour localiser une unité transcriptionnelle correspondant à un gène dans la région de l'ADN génomique isolée par Inverse-PCR. Un inoculum de M. grisea préparé par broyage dans de l'eau stérile de petits fragments de culture sur milieu riz gélosé a été ajouté à 200 ml de milieu complet liquide en erlenmeyer de 11 (composition: voir Silué et al. (op. cit.). Le champignon a ensuite été cultivé à 26 C avec une agitation de 150 tpm pendant une nuit. Le mycélium a été alors récupéré par centrifugation puis à nouveau broyé dans de l'eau stérile. La moitié du broyat a été ajouté à 200 ml de milieu complet et cultivé dans les mêmes conditions. Le lendemain, le mycélium a été recueilli et lavé à l'eau stérile sur de la toile à bluter, partiellement essoré et finement broyé avec un mortier en porcelaine dans de l'azote liquide. La poudre obtenue a été répartie en tubes de polypropylène à vis de 15 ml à raison de 3 ml de poudre par tube. Les tubes avaient préalablement été remplis d'un mélange de 2 ml de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et de 3 ml de tampon d'homogénéisation (50 mM TrisHCl pH8,0 ; 0,25 M EDTA pH8,0 ; SDS). Les tubes ont été agités énergiquement pendant au moins 15', puis centrifugés pendant 20' à 4000 tpm à température ambiante. La phase aqueuse a été récupérée et mélangée dans de nouveaux tubes avec 2 ml de chloroforme. La phase aqueuse a été extraite deux fois avec 2 ml de chloroforme par agitation pendant 10'. Elle a été récupérée après séparation par centrifugation (mêmes conditions), puis transférée dans un tube à centrifugation traité contre les RNase par autoclavage contenant le même volume de 6 M LiCI traité au DEPC. Les ARN totaux ont été précipités une nuit à 4 C. Les tubes ont été ensuite centrifugés 20' à 10000 tpm à 4 C. Le surnageant éliminé a été et les culots resuspendus dans 50-100 l de TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH8,0) traité au DEPC. Les ARN totaux ont été quantifiés par spectrophotométrie dans l'UV (260 et 280 nm). Les ARN messagers poly A(+) ont été ensuite extraits au moyen du kit Dynabeads mRNA Direct Purification Kit (Dynal) par affinité avec des billes greffées avec une séquence oligo (dT)2s. 5 g d'ARNm ont été utilisés pour la synthèse des ADN complémentaires et leur ligature dans un vecteur d'encapsidation avec le kit Zap Express cDNA Synthesis Kit (Stratagene) selon les recommandations du fabricant. La banque d'ADNc a été encapsidée grâce au kit Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene), amplifiée et stabilisée selon les recommandations du fabricant. Le criblage de la banque a été réalisée par l'hybridation d'une réplique transférée sur membrane de nylon de 1 million de plages de lyse. La sonde radioactive utilisée pour le criblage a été synthétisée à partir d'un fragment de restriction Stul-Clal de 1 kb du cosmide 32H7 (figure 4) hybridant avec la partie génomique du fragment récupéré par Inverse-PCR (conditions d'hybridation: op. cit). L'ADNc isolé (d'une taille de 1,9 kb) a ensuite été également séquence. C) Analyse informatique des séquences nucléotidiques L'analyse des séquences de l'ADN génomique et de l'ADN complémentaire figurant en annexe 1 grâce au programme DNA Strider 1.2 ont permis de localiser le cadre ouvert de lecture d'un gène de 675 bp interrompu par deux introns de 77 et 96 bp (figure 4). Les programmes BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-410 ; Gish et al. (1993) Nat. Genet 3 : 266-272 ; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402) et FASTA (Pearson et Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444-2448) n'ont pas permis de trouver de séquences de gènes déjà caratérisés présentant des homologies significatives au niveau nucléotidique avec celui-ci. La traduction in silico du gène prédit l'existence d'une protéine de 225 acides aminés (figure 5). Les programmes de prédiction de la topologie des protéines (Profil d'hydropathie selon Kytes et Doolittle de DNA Strider 1.2 ; Predict-Protein(Rost et al. (1993) J. Mol. Biol. 232 : 584-599); PSORT ; ScanProsite du serveur internet ExPASy) indiquent l'existence probable de quatre domaines transmembranaires et d'au moins un site de N-glycosylation pour cette protéine. Le programme Profile Scan (serveur internet de l'ISREC) l'inclut dans la superfamille de protéines TM4 (ou tétraspanines). De même, parmi les protéines identifiées grâce au programmes blastp et fasta3, figurent plusieurs protéines de cette superfamille, bien que les degrés d'identité et de similarité des séquences en acides aminés soient faibles . Un alignement de plusieurs protéines de cette famille avec le programme Clustal X (annexe 2) montre cependant qu'il s'agit de la seule famille de protéines présentant des éléments de séquences identiques ou similaires à celle prédite pour la protéine de pathogénie de M. grisea qui ont une taille et une topologie comparables à celles de cette protéine. Cette superfamille de protéines n'a pas de fonction biochimique clairement établie. Ses membres n'ont jusqu'alors été identifiés que dans le Règne Animal (chez les Mammifères et le Schisostome), le plus souvent comme marqueurs immunologiques de la différenciation cellulaire ou tissulaire (Horejsi et Vlcek (1991) FEBS Letters 288 (1,2): 1-4. Le seul autre mutant connu pour un gène codant pour l'une de ces protéines est un mutant de la drosophile affecté dans la différenciation des synapses (Kpoczynski et al. (1996) Science 271 (5257): 1867-1870). Une protéine de''cette famille pour laquelle les données expérimentales sont un peu plus complètes est l'uroplakine 1 des Mammifères : protéine est associée avec au moins deux autres types de protéines au niveau de la membrane plasmique de l'épithélium de la vessie (Wu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (18) : 13716-13724). Ces complexes tapissent la paroi de vésicules membranaires (Severs et Hicks (1979) J Ultrastruct. Res. 69 : 279-296), en réserve dans le cytoplasme lorsque la vessie est vide. Ces vésicules sont tractées passivement vers la membrane plasmique par un réseau de microfilaments qui se tend lorsque la vessie se gonfle (Sarikas et Chlapowski (1989) Cell Tissue Res. 258 : 393-401). Ces vésicules auraient à la fois pour rôle d'augmenter la surface de l'épithélium et de le renforcer, grâce aux complexes protéiques qui les tapissent (Wu et al. (1994) : op. cit.). D'une manière plus générale, une hypothèse biochimique avancée dans plusieurs autres publications attribuerait à ce type de protéine le rôle de faciliter l'intégration et la stabilisation au niveau de la membrane plasmique d'autres protéines impliquées dans la signalisation pour un grand nombre de processus cellulaires, comme l'activation, la prolifération, l'adhésion, la mobilité, la différenciation et le cancer (Maecker et al. (1997 Mai) FASEB J 11 (6): 428-442). Expérience 7 : du gène interrompu par le plasmide pAN7. 1 chez le mutant 421 A) Construction du vecteur de remplacement Le vecteur pCB1003 (Sweigard et al. (1997) : op. cit.) a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI pour en libérer la cassette de résistance à l'hygromycine (1 kb), constituée du cadre ouvert de lecture du gène hph (op. cit.) et du promoteur du gène trpC D'A. nidulans. Ce fragment a été ligaturé au site EcoRI du polylinker du plasmide pBL pour donner le plasmide pBLHYG. Ce plasmide a été cloné et l'orientation de la cassette de résistance à l'hygromycine contrôlée par restriction : de pBLHYG est telle que le début du promoteur de la cassette se trouve du côté du site SmaI. Cette cassette a été extraite de ce nouveau plasmide par une double digestion SamI-ClaI. Le plasmide pCM421-8,5 a été digéré par les enzymes StuI et ClaI. Le fragment StuIClaI de 1 kb a été éliminé et les deux autres récupérés. Le plus grand (StuI-ClaI de 7,3 kb) a été ligaturé avec le fragment Smal-ClaI de 1 kb contenant la cassette de résistance à l'hygromycine (voir ci-dessus). Après clonage et extraction, ce plasmide a été digéré par ClaI, déphosphorylé par la Shrimp Alkaline Phosphatase (Amersham) selon les recommandations du fabricant et ligaturé avec le troisième fragment (Clal de 3,5 kb) issu de la double digestion Stul-Clal de pCM421-8,5. Le plasmide obtenu pRM421 (figure 6) a été cloné et l'orientation du fragment ClaI de 3,5 kb contrôlée par une réaction de PCR à l'aide des amorces hphl (5'CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3' SEQ ID NO 6), située au début du gène hph et pos421 (5'-TCAAGACGCTCACAGAGTGC-3' SEQ ID NO 7), située sur le fragment ClaI de 3,5 kb, au niveau du signal de terminaison de la traduction du cadre ouvert de lecture du gène de pathogénie supposé (programme de 30 cycles déjà cité avec une température d'hybridation de 60 C). 10 g de ce plasmide ont été digérés par l'enzyme BamHI. Après séparation par électrophorèse dans un gel d'agarose LMP (Sea Plaque GTG, Tebu) à 1 % dans du tampon TAE, le fragment de 8,5 kb de région génomique contenant le gène de pathogénie remplacé par la cassette de résistance à l'hygromycine a été extrait avec le kit GELase (Tebu) selon le protocole du fabricant. Le produit d'extraction a été quantifié par spectrophotométrie dans l'UV. B) Transformation et sélection d'un mutant de pathogénie par remplacement du gène interrompu par le plasmide pAN7.1chez le mutant 421 107 protoplastes de la souche sauvage pi. 2 ont été transformés avec 1 g de vecteur de remplacement pRM421 préparé selon le protocole décrit ci-dessus. 47 transformants résistants à l'hygromycine obtenus ont été analysés par un test de pathogénie ; d'entre eux, qui n'étaient pas pathogènes, ont ensuite été analysés par hybridation de digestions BamHI de l'ADN génomique à l'aide de sondes synthétisées à partir des fragments génomiques BamHl de 8,5 kb et Stul-Clal de 0,7 kb. Il a pu être démontré par ces deux expériences que 24 des transformants non pathogènes obtenus étaient dépourvus du fragment Stul-Clal de 0,7 kb et ne comportaient qu'un seul fragment BamHI hybridant avec le fragment d'ADN génomique de même taille ayant servi à la construction du vecteur pRM421 : phénotype de non pathogènie résulte donc bien de la délétion de la quasi-totalité de la séquence du gène interrompu par le plasmide pAN7. 1 chez le mutant 421 et non de l'intégration ectopique du vecteur de remplacement pRM421 dans la séquence d'un autre gène de pathogénie. Expérience 8 : Caractérisation phénotypique du mutant Les preuves que la région de l'ADN génomique de Magnaporthe grisea cible de l'insertion du plasmide pAN7. 1 chez le mutant 421 est bien celle d'un gène indispensable à la pathogénie du champignon vis-à-vis du riz et de l'orge sont établies. Cependant, la séquence de la protéine pour laquelle coderait ce gène ne renseigne pas sur la fonction biochimique qu'elle contrôlerait. Une analyse phénotypique à la fois plus large et plus complète du mutant de ce gène est donc indispensable si l'on veut pouvoir préciser ce point. A) Phénotypes de mycologie générale La morphologie du mutant a été comparée à celle de la souche sauvage selon les critères suivants : morphologie mycélienne et morphologie des conidies. Aucune différence particulière n'a été relevée. Le rythme de croissance radiale a été mesuré sur milieu gélosé complet ou minimum. Le mutant est prototrophe et n'a pas un rythme de croissance différent de celui de la souche sauvage. B) Phénotypes en relation avec l'infection Les taux de germination des conidies et de différenciation des appressoria ont été mesurés pour le mutant et la souche sauvage suite à des dépôts sur lames de verre et de PVC (Rinzl) de gouttelettes de suspensions de spores à 5.105 spores/ml et observées toutes les trois heures jusqu'à 9 heures après dépôt. Les taux de germination sont similaires. Ceux de différenciation des appressoria le sont 9 heures après dépôt, mais le rythme de différenciation semble plus rapide chez le mutant. La pression de turgescence des appressoria a été évaluée selon la méthode de de Jong et al. (1997 Nature 389 : 244-245). Elle est réduite de manière significative chez le mutant. Un test de pathogénie sur feuilles de riz et d'orge en survie préalablement abrasées selon le protocole de Surieux (1998, Rapport de Maîtrise de Sciences de la Vie de L'Université de Lyon) a été réalisé avec des suspensions de spores du mutant et de la souche sauvage à 105 spores/ml. Aucune lésion typique de la maladie ne se sont développées sur les feuilles infectées par les spores du mutant, contrairement à la souche sauvage. Un test de pénétration de cellules épidermiques de la face inférieure de feuilles d'orge (cultivar Baraka) a été réalisé comme suit : gouttelettes de suspension de spores à 5.105 spores/ml ont été déposées sur la face inférieure de feuilles d'orge récoltées sur des plants au stade 3 feuilles cultivées en conditions identiques à celles des plantes utilisées pour les tests de pathogénie sur feuilles en survie). Ces feuilles ont été déposées sur de le gélose à 1% et incubées à 23 C et une humidité relative de 75% pendant 1-6 jours. L'épiderme infecté a été décollé en incisant la face supérieure juste au dessus du niveau de l'infection avec une lame de rasoir en prenant garde de ne pas trancher complètement la feuille, en collant la partie de la face supérieure correspondante à la zone infectée sur un morceau de ruban adhésif à double face, puis en tirant très délicatement sur la partie encore libre au dessus de la ligne d'incision. L'épiderme a été monté sur une lame de verre dans une goutte d'eau et, éventuellement, du bleu de lactophénol avant d'être observé au microscope. La colonisation des cellules épidermiques par les hyphes infectieux du champignon est visible entre 24 et 48 heures après le dépôt des gouttelettes chez la souche sauvage. Dans le cas du mutant, les observations faites jusqu'à 6 jours après le dépôt des gouttelettes de spores n'ont pas permis de mettre en évidence d'autres structures infectieuses que les appressoria à la surface des feuilles. La formation de l'aiguille d'infection a été recherchée sur des coupes de feuilles d'orge infectées dans les mêmes conditions que celles de test de pénétration des cellules épidermiques. Les fragments de feuilles infectés ont été prélevés 24 heures après le dépôt des gouttelettes de spores. La fixation du matériel biologique et l'inclusion dans la résine durcissante LR White ont été réalisées selon le protocole suivant : Matériel biologique : Les plantes hôtes sont constituées par des segments de feuilles d'orge en survie sur milieu gélosé infecté par dépôt de gouttes de suspension de spores de M. grisea (sauvage ou mutant). Les prélèvements sont faits 24 heures après dépôt des gouttes. Un contrôle est fait au microspcope au moment du prélèvement. Les 2 souches ont développé de très abondants appressoria. Un disque comportant toute l'épaisseur du segment de feuille est découpé dans la zone du dépôt et fixé pour une étude cytologique fine. Préparation des échantillons : Les disques de feuilles de quelques milimètres sont fixés dans un mélange de glutaraldéhyde à 2% et de paraformaldéhyde à 0,5 % dans un tampon de McIlvaine 0,1 M à pH 7 pendant 4 heures à température ambiante (environ 20 C). Les échantillons sont ensuite rincés dans le tampon McIlvaine 0,2M puis une partie est post fixée pat le tétroxyde d'osmium à 0,5 % dans le tampon pendant 15 heures et incluse à l'épon. Des coupes d'une épaisseur de 0,4 m sont effectuées puis collées sur lames de verre et la résine est extraite au méthoxyde de sodium saturé dilué au 1/3 pendant 3 minutes. Elles sont colorées selon la technique de Richardson (bleu de méthylène-Azur 2) à 80 C. Les coupes ont été faites avec un ultramicrotome à des épaisseurs comprises entre 1 et 0,4 m. Elles ont été observées avec un microscope NIKKON Optipot sur des coupes débarassées de la résine par un trempage dans de la soude méthanolique et une coloration par un mélange de Bleu Azur et de Bleu de Méthylène. 24 heures après le dépôt des gouttelettes, la souche sauvage a déjà pénétré la cuticule et la paroi des cellules épidermiques et commencé à former un hyphe infectieux à l'intérieur. Dans le cas du mutant, aucune aiguille de pénétration, ni aucun hyphe infectieux n'a pu être mis en évidence. Aucun signe d'une perforation de la cuticule et de la paroi, pourtant nettement visible avec la souche sauvage, n'est observable. La mélanisation de la paroi des appressoria du mutant ne semblait pas être affectée, mais plus de 50% d'entre eux étaient aplatis et écrasés à la surface de la feuille. Le mutant 421 ne semble affecté dans aucune fonction végétative, mais plutôt dans un aspect du développement strictement restreint à la formation et au fonctionnement de l'appressorium : celui semble se développer normalement, mais il est en fait incapable de différencier la structure nécessaire à perforer la cuticule et la paroi des cellules épidermiques de la feuille d'orge. Exemple 2: Préparation d'une cassette d'expression d'un gène rapporteur GFP sous le contrôle du promoteur du gène 421 et son introduction dans le génome d'une souche sauvage et pathogène de Magnaporthe grisea Le fragment PstI de 3 kb du cosmide 32H7 portant la totalité de la phase codante du gène 421 a été cloné dans le vecteur pCB1265 (Sweigard et al., op. cit.). Son orientation a été contrôlée par restriction, de manière à ce que la phase codante du gène 421 se trouve orienté dans le sens positif d'orientation du plasmide. Le fragment d'ADN génomique de M. grisea se trouvant immédiatement en 5' de la phase codante du gène 421 a été amplifié par PCR avec les amorces Pr et GFP421, permettant l'introduction d'un site de restriction NcoI dans la séquence de ce fragment située immédiatement en amont du signal de démarrage de la traduction (ATG) de la phase codante du gène 421. Le fragment d'amplification obtenu a été digéré par PstI et Ncol, puis cloné dans le vecteur pE-GFP (Clontech, USA; Haas et al., 1996, Current Biology, 6 : 315-324), préalablement digéré les mêmes enzymes. Le plasmide obtenu a été digéré par les enzymes Pstl et EcoRI. Le fragment d'ADN comprenant le morceau de séquence promotrice du gène 421 fusionné à la phase codante du gène GFP a été cloné dans le vecteur pCB1265, préalablement digéré par les mêmes enzymes. Le fragment PstI de 3 kb du cosmide 32H7 situé immédiatement en 5' de celui ayant servi à réaliser la construction précédente a été cloné au site Pstl de cette construction. Son orientation a été contrôlée de manière à maintenir la continuité entre la séquence de ce fragment et celle du fragment de PCR cloné devant le gène GFP telle qu'elle existe dans le cosmide 32H7. Cette séquence de 3,65 kb comporte la région promotrice de l'expression du gène 421 (région allant du site BamHl en amont de l'ATG du gène 421 à l'ATG du gène 421). Le plasmide qui résulte de ce clonage a été appelé pEM421-GFP. Il a été introduit par transformation de protoplastes dans le génôme d'une souche sauvage P12 et pathogène de M. grisea (Mutant 421). La sélection des transformants a été réalisée pour la résistance à la phosphinothricine conférée par le plasmide pCB 1265 et les spores des transformants purifiés obtenus ont été analysés pour leur fluorescence en microscopie photonique (conditions de préparation des protoplastes, de transformation, de sélection et de purification des transformants: op. cit.). REVENDICATIONS 1. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour la protéine 421 (gène 421). 2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène 421 est constitué par la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n 1 (SEQ ID NO 1) ou une séquence homologue. 3. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend le promoteur du gène 421 (promoteur 421). 4. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le fragment d'acide nucléique comprend le promoteur 421 associé de manière fonctionnelle à une séquence codant pour une protéine rapporteur, permettant l'expression de ladite protéine rapporteur dans un champignon. 5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription le promoteur 421, la séquence codante pour une protéine marqueur et une séquence terminatrice fonctionnelle dans les champignons. 6. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le promoteur 421 est constitué par la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n 2 (SEQ ID NO 2) ou une séquence homologue. 7. Fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine 421. 8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, associé de manière fonctionnelle à la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine 421. 9. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, la séquence codante pour la protéine 421 et une séquence terminatrice fonctionnelle dans ledit organisme hôte. 10. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend associé de manière fonctionnelle au promoteur fonctionnel dans un organisme hôte et à la séquence codant pour la protéine 421, une séquence codant pour un signal d'adressage membranaire de la protéine 421 fonctionnel dans ledit organisme hôte, permettant d'adresser la protéine 421 dans les membranes de l'organisme hôte dans lequel elle est exprimée. 11. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les insectes. 12. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la séquence codante de la protéine 421 est constituée par la séquence d'ADN génomique représentée par l'identificateur de séquence n 3 (SEQ ID NO 3) ou une séquence homologue ou par la séquence d'ADNc représentée par l'identificateur de séquence n 4 (SEQ ID NO 4) ou une séquence homologue, et plus particulièrement par la séquence allant des bases X à Y de ladite SEQ ID NO 4. 13. Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique antisens de la séquence codante de la protéine 421. 14. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription un promoteur fonctionnel dans un champignon, en particulier Magnaporthe grisea, la séquence antisens de la séquence codante de la protéine 421 et une séquence terminatrice pour fonctionnel dans ledit champignon. 15. ' Vecteur de clonage et/ou de transformation et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend le fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14. 16. Organisme hôte transformé, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14, ledit fragment d'acide nucléique étant hétérologue de l'organisme hôte. 17. Organisme hôte selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons ou les insectes. 18. Procédé de transformation d'un organisme hôte selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'on introduit dans ledit organisme hôte le fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14. 19. Protéine 421, isolée, purifiée totalement ou en partie. 20. Protéine 421, caractérisée en ce qu'elle est produite par un organisme hôte selon l'une des revendications 16 ou 17. 21. Protéine 421 selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence protéique représentée par l'identificateur de séquence n 5 (SEQ ID NO 5) ou une séquence homologue. 22. Utilisation d'un fragments d'acide nucléique, d'un organisme hôte ou et de la protéine 421 selon l'une des revendications 1 à 14,16 ou 17, 19 à 21, pour l'identification des gènes impliqués dans la pathogénie des champignons ou pour l'identification de nouvelles molécules fongicides inhibitrices de la pathogénie des champignons. 23. Procédé pour identifier des composés inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421, ledit procédé consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de ladite pathogénie des champignons et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier. 24. composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421, notamment les composés identifiés par le procédé selon la revendication 23. 25. Procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons liée à l'expression du gène 421 par le procédé d'identification selon la revendication 23, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon la revendication 23, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles.