Brevet FR2784688A1 — publié le 20000421

L'invention concerne une séquence d'ADN (acide désoxyribonucléique) décrite par SEQ ID N 1, transcrivant un ARNm (acide desoxy ribonucléique messager), lui-même codant pour l'enzyme OTBC ( Oxydase Terminale associée à la Biosynthèse des Caroténoides) décrite par SEQ ID N 2, ainsi que des vecteurs de transformations de cellule, de plante ou fragment de plante, et le procédé pour modifier la production de caroténoides dans une plante. Les caroténoides sont des pigments lipophiles synthétisés chez les plantes, les champignons et les bactéries. Dans les tissus photosynthétiques, les caroténoides ont une fonction de pigment accessoire d'absorption de la lumière et surtout de photoprotection contre les radicaux libres, tels que l'oxygène singulet. Chez les plantes et certains micro-organismes, la voie biosynthétique des caroténoides produit des carotènes, des xanthophylles et leurs dérivés. Ces composés sont synthétisés à partir du phytoene qui est modifié par des réactions de déshydrogénation successives pour produire du phytofluène, du zéta-carotène, du neurosporène puis du lycopène. Le lycopène s'accumule dans certain cas, donnant par exemple le pigment rouge de la tomate, ou plus généralement se retrouve sous forme modifiée par cyclisation, pour former de l'alpha- ou du béta-carotène. Ces caroténoides cyclisés sont les précurseurs de la vitamine A, et peuvent s'accumuler ou donner, par des réactions d'oxydation, les xanthophylles, qui sont des pigments jaunes, roses, oranges ou rouges. Les étapes de déshydrogénation successives du phytoene sont catalysées chez la plupart des microorganismes par une enzyme unique appelée phytoene désaturase CRTI. Chez les plantes et les cyanobactéries, deux enzymes apparentées existent. La première, appelée phytoene désaturase (PDS), catalyse la conversion du phytoene en phytofluène puis en zéta-carotène. La seconde, appelée zéta-carotène désaturase (ZDS), catalyse la conversion du zéta-carotène en neurosporène puis en lycopène. Chacune de ces réactions de déshydrogénation nécessite le transfert de deux électrons et deux protons du substrat vers un accepteur. Ces réactions de déshydrogénation nécessitent donc des enzymes, dites structurales, et des cofacteurs, qui sont des intermédiaires dans les réactions d'oxydoréductions. Les inventeurs de la présente invention ont découvert un nouveau gène codant pour une enzyme appelée OTBC (Oxydase Terminale associée à la Biosynthèse des Caroténoides), impliquée dans la biosynthèse des caroténoides. Il semble que cette enzyme soit placée dans les membranes des chloroplastes et soit indispensable au bon fonctionnement de la PDS. Un premier objet selon l'invention concerne donc une séquence d'ADN, comprenant au moins une région codante constituée par: - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID N 1, transcrivant un ARNm, cet ARNm codant pour l'enzyme OTBC (Oxydase Terminale associée à la Biosynthèse des Caroténoides) décrite par SEQ ID N 2, - la séquence nucléotidique modifiée de la séquence SEQ ID N 1, telle que décrite ci-dessus, particulièrement par mutation et/ou addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou de plusieurs nucléotide(s), cette séquence modifiée transcrivant un ARNm lui-même codant pour l'OTBC décrite par SEQ ID N 2, ou codant pour une protéine modifiée de ladite OTBC, ladite protéine modifiée ayant une activité enzymatique équivalente à celle de l'OTBC représentée par SEQ ID N 2. Le gène codant pour l'OTBC est une double hélice d'ADN, comprenant des introns et des exons. La séquence SEQ ID N 1 est le brin complémentaire (sans les introns) ou ADNc, correspondant au brin d'ADN transcrivant l'ARNm codant pour l'OTBC. Par activité enzymatique équivalente, on entend que l'enzyme, bien que pouvant être modifiée structurellement dans certaines de ses parties, est néanmoins capable de modifier son substrat. Son activité est sensiblement la même que celle de l'enzyme native. On comprendra que cette enzyme ne peut pas être modifiée au niveau de son site actif. De ce fait, toute modification apportée à la séquence native, par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, s'entend comme engendrant une activité enzymatique équivalente dans la mesure où l'activité de la protéine native n'est pas affectée par ces modifications. Un second objet selon l'invention concerne une séquence d'ADN comprenant au moins une région codante constituée par: - la séquence nucléotidique complémentaire représentée par SEQ ID N 1, cette séquence transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'apparier avec l'ARNm transcrit par la séquence complémentaire de SEQ ID N 1, - la séquence nucléotidique modifiée de la séquence décrite ci-dessus, par mutation et/ou addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotide(s), cette séquence modifiée transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'apparier avec un ARNm mentionné ci-dessus, - un fragment de l'une des séquences nucléotidiques mentionnées ci-dessus, ledit fragment transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'apparier avec l'ARNm codé par la séquence complémentaire de SEQ ID N 1. Par ADN, on peut entendre ADN complémentaire (ou ADNc), c'est à dire la copie de l'ARNm sous sa forme d'ADN grâce à l'action d'une transcriptase inverse. L'ADNc ne comprend pas les introns des séquences d'ADN. On entend par " capable de s'apparier" dans la présente invention, le fait que dans des conditions d'hybridations données, les séquences nucléotidiques complémentaires s'apparient. L'homme du métier connaît bien, selon les conditions d'hybridation utilisées, quel est le pourcentage d'identité que les séquences doivent présenter pour qu'un appariemment ou une hybridation puisse se réaliser. Les conditions de stringence pour obtenir un appariement de séquences voisines sont par exemple une hybridation dans 50% de formamide à 35 C. Pour ce qui concerne les conditions d'hybridation, on se référera notamment à l'article " Molecular Cloning, a laboratory manual, second édition, Sambrook, Fritch & Maniatis, 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA ". On entend par " séquence nucléotidique modifiée dans la présente invention, toute séquence nucléotidique présentant avec la séquence de référence un degré d'identité inférieur à 100%. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, les séquences nucléotidiques modifiées selon la présente invention comprennent approximativement au moins 70%, et mieux encore au moins 80% de nucléotides identiques à ceux de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID N 1, ou de sa séquence complémentaire. On entend par " identité de nucléotide ", la comparaison, lorsque les deux brins sont alignés , de la séquence des nucléotides identiques présents sur les deux brins. On obtient de ce fait, en ramenant au nombre de nucléotides totaux, le pourcentage de nucléotides identiques, c'est à dire l'identité de nucléotide. Un troisième objet selon l'invention concerne un ARNm transcrit à partir de la séquence d'ADN selon la définition du premier objet, et plus particulièrement transcrit à partir de la séquence d'ADN représentée par SEQ ID N 1, ledit ARNm codant pour l'enzyme OTBC décrite par SEQ ID N 2, ou pour un fragment ou une protéine modifiée de l'enzyme, et présentant une activité qui est équivalente à ladite enzyme dans la plante. Un quatrième objet selon l'invention concerne un ARNm anti-sens transcrit à partir de la séquence d'ADN selon le second objet de l'invention, comprenant des nucléotides qui sont complémentaires de la totalité ou d'une partie des nucléotides constituant l'ARNm natif, et capables de s'apparier avec ledit ARNm. Par " ARNm anti-sens ", on entend une séquence d'ARN qui est complémentaire d'une séquence de bases d'un ARNm correspondant, complémentaire dans le sens que chaque base (ou la majorité des bases) dans la séquence anti-sens (se lisant dans le sens 3' vers 5') est capable de s'apparier avec la base correspondante (G avec C, A avec U) dans la séquence d'ARNm se lisant dans le sens 5' vers 3'. Un cinquième objet selon l'invention concerne une protéine ayant l'activité de l'enzyme OTBC décrite par SEQ ID N 2, ou toute protéine modifiée deladite enzyme OTBC, particulièrement par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou tout fragment provenant de l'enzyme OTBC ou d'une séquence modifiée de l'enzyme, ledit fragment ou séquence modifiée présentant une activité enzymatique équivalente à celle de l'enzyme OTBC. Un sixième objet selon l'invention concerne un complexe formé entre un ARNm anti-sens défini dans le quatrième objet selon l'invention, et un ARNm codant pour une enzyme OTBC dans la plante. Un septième objet selon l'invention est un ADN recombiné comprenant une séquence d'ADN définie dans le premier objet selon l'invention, ladite séquence étant insérée dans une séquence hétérologue, lesdites séquences transcrivant tout ou partie d'une séquence ARNm codant pour tout ou partie de l'enzyme OTBC, cette dernière ayant une activité enzymatique équivalente à l'enzyme OTBC de la plante. Par " séquence hétérologue " on entend, selon la présente invention, toute séquence pouvant être coupée par des enzymes, et servant de ce fait à insérer d'autres séquences présentant des activités diverses. Un huitième objet selon l'invention est un ADN recombiné comprenant une séquence d'ADN définie dans le second objet selon l'invention, ladite séquence étant insérée dans une séquence hétérologue, lesdites séquences transcrivant tout ou partie d'une séquence ARNm anti-sens capable de s'apparier avec un ARNm codant pour une enzyme OTBC dans la plante. Un neuvième objet selon l'invention est un ADN recombiné défini dans le septième ou huitième objet selon l'invention comprenant les éléments nécessaires pour contrôler l'expression de la séquence insérée, particulièrement une séquence promotrice et une séquence de terminaison de transcription desdites séquences. Un dixième objet selon l'invention concerne un vecteur de transformation de plantes, adapté pour augmenter la biosynthèse des caroténoides, comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique de SEQ ID N 1 comme définie dans le premier objet selon l'invention, codant pour tout ou partie d'une enzyme impliquée dans la synthèse des caroténoides, représentée par SEQ ID N 2, précédé par une origine de réplication de la transcription des plantes, de manière à ce que le vecteur puisse générer de l'ARNm dans les cellules des plantes. Un onzième objet selon l'invention concerne un vecteur de transformation de plantes, adapté pour diminuer ou arrêter la biosynthèse des caroténoides, comprenant tout ou partie du brin de la séquence nucléotidique complémentaire de SEQ ID N 1 comme définie dans le second objet selon l'invention, précédé par une origine de réplication de la transcription des plantes, de manière à ce que le brin complémentaire transcrit puisse s'apparier à l'ARNm codant pour l'enzyme OTBC de la plante impliquée dans la synthèse des caroténoides. L'invention peut donc être utilisée pour modifier la synthèse des caroténoides, par exemple augmenter ou diminuer, voire arrêter, la production des couleurs associées à la déshydrogénation du phytoene. Par exemple, l' inhibition de la couleur rouge dans les fruits tels que les tomates, par transformation avec un vecteur comprenant une séquence anti-sens, donne un fruit d'une couleur attrayante se rapprochant du jaune, comme celle de certains poivrons. Il existe déjà des tomates jaunes de cette sorte, mais la présente invention fournit un moyen de transférer la caractéristique couleur dans des lignées, sans qu'un programme de reproduction prolongé ne soit nécessaire et puisse de ce fait engendrer l'altération d'autres caractéristiques de la plante. L'augmentation de la synthèse des caroténoides, par transformation avec un vecteur comprenant une séquence sens, peut permettre de produire des tomates de couleur plus rouge, ce qui peut apparaître plus appétissant au consommateur. L'invention peut également servir à introduire une couleur rouge à l'intérieur d'une plante, ailleurs que dans le fruit. L'augmentation de la synthèse des caroténoides dans une plante peut être effectuée en insérant une ou plusieurs copies fonctionnelles du gène d'ADN complémentaire, ou le gène complet, sous contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les cellules de plantes. Les vecteurs de transformation des plantes pour diminuer ou arrêter la synthèse des caroténoides, c'est à dire les vecteurs anti-sens, peuvent être très courts. Dans un mode de réalisation préférentiel, on choisira des séquences de bases homologues ayant une longueur d'au moins 10 bases. Il n'existe pas de limite supérieure théorique à la séquence de base, elle peut être aussi longue que l'ARNm produit par la plante. Dans un mode de réalisation très préférentiel, on utilisera cependant des séquences de longueur comprise entre 100 et 1000 bases. Nous savons que les plantes mutantes chez qui le gène OTBC est inactif présentent un aspect panaché, les plantes sont vertes et blanches. Nous proposons une application de la stratégie antisens, qui vise à éliminer la production d'ARNm et donc de protéine OTBC, qui viserait à produire des plantes au feuillage panaché comme par exemple des plantes ornementales, de type Nicotiana ou Pétunia ou toute autre plante ornementale, qui se prête à la transformation génétique et qui pourrait reçevoir une construction anti-sens dans le but d'empêcher la production de la protéine OTBC. Les produits de recombinaison d'ADN peuvent être fabriqués en utilisant des techniques standards. Par exemple, la séquence d'ADN à transcrire peut être obtenue en traitant un vecteur contenant ladite séquence avec des enzymes de restriction pour couper le segment approprié. La séquence d'ADN de transcription peut également être engendrée en cyclisant et liant des oligonucléotides synthétiques ou en utilisant des oligonucléotides synthétiques dans une PCR (polymerase chain reaction) pour engendrer des sites de restriction à chaque extrémité. La séquence d'ADN est alors clonée à l'intérieur d'un vecteur contenant une séquence promotrice d'initiation et une séquence de terminaison. Si l'on désire obtenir une séquence d'ADN anti-sens, le clonage sera effectué de manière à ce que la séquence d'ADN coupée soit inversée par rapport à son orientaion dans le brin duquel elle a été coupée. Dans un produit de recombinaison exprimant un ARN anti-sens, le brin qui était initialement le brin matrice devient le brin codant, et vice versa. Le produit de recombinaison transcrira de ce fait un ARNm dont la séquence de base est complémentaire de tout ou partie de la séquence de l'ARNm de l'enzyme. De ce fait, les deux brins d'ARN sont complémentaires non seulement dans leurs séquences de bases mais également dans leur orientation (5' vers 3'). Dans un produit de recombinaison exprimant un ARN sens, la matrice et les brins transcrits gardent l'orientation du gène initial de la plante. Les produits de recombinaison exprimant de l'ARN sens transcrivent un ARNm ayant une séquence de base qui est homologue en tout ou partie avec la séquence de l'ARNm. Dans les produits de recombinaison exprimant l'enzyme fonctionnelle, la région codante complète du gène est reliée à des séquences de contrôle de la transcription capables de s'exprimer dans la plante. Par exemple, les produits de recombinaison selon la présente invention peuvent être fabriqués comme décrit ci-après. Un vecteur adapté contenant la séquence de base souhaitée pour la transcription, tel que notamment un clone d'ADN complémentaire d'OTBC, est traité avec des enzymes de restriction pour couper la séquence. On clone alors l'ADN ainsi obtenu, dans une orientation inversée si on le souhaite, dans un second vecteur contenant la séquence promotrice souhaitée et la séquence de terminaison souhaitée. Comme promoteurs adaptés on peut citer le promoteur nommé 35S du virus du CaMV comme exemple de promoteur considéré comme étant constitutif, le promoteur du gène de la polygalacturonase de tomate (voir Bird et al., 1998, Plant Molecular Biology, 11:651-662) comme exemple de promoteur impliqué dans la régulation des fruits, ou encore le promoteur du gène de la petite sousunité de la ribulose bis-phosphate carboxylase comme exemple de promoteur exprimé dans les tissus verts. Les séquences de terminaison comprennent le terminateur NOS du gène nopaline synthase. Il peut être intéressant de modifier l'activité enzymatique de la plante durant seulement le développement et/ou le mûrissement des fruits. L'utilisation d'un promoteur constitutif tendra à modifier le taux et l'activité des enzymes dans toutes les parties de la plante transformée, alors que l'utilisation d'un promoteur spécifique à un tissu contrôlera de manière plus sélective l'expression du gène et modifiera l'activité, par exemple la coloration des fruits. De ce fait, en mettant en oeuvre l'invention, par exemple dans des poivrons, il sera adapté d'utiliser un promoteur qui permettra l'expression spécifique au cours du développement et/ou le mûrissement des fruits. Enfin, l'ARN sens ou anti-sens sera alors produit seulement dans les organes de la plante où l'on souhaite qu'il y ait une action. Comme promoteurs spécifiques de développement et ou de mûrissement des fruits qui peuvent être utilisés, on peut citer le promoteur de stimulation de la polygalacturonase (Demande de brevet internationnale publiée sous le numéro WO 92/08798), le promoteur E8 (Dieckman & Fiscer, 1998, EMBO, 7 :3315-3320) et le promoteur spécifique des fruits 2A11 (Pear et al., 1989, Plant Molecular biology, 13 : Un douzième objet selon l'invention concerne une cellule de plante transformée par un vecteur défini dans le dixième ou le onzième objet selon l'invention. L'homme de l'art dans la technique du génie génétique végétal connait bien aujourd'hui les différentes techniques d'obtention de plantes génétiquement modifiées. On sait que la paroi végétale constitue une barrière mécanique naturelle particulièrement efficace à la pénétration de tout matériel étranger dans la cellule et, en particulier, à celle d'ADN. Les différents techniques spécifiques d'introduction de l'ADN dans la cellule végétale sont par exemple l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, l'électroporation de protoplastes, la micro-injection d'ADN nu, l'utilisation de canon à particules ou biolistique, ou la transformation de protoplastes. Afin de pouvoir sélectionner les cellules effectivement transformées, on introduit, en plus du gène codant pour le caractère que l'on recherche, un gène marqueur. On choisira préférentiellement un gène conférant une résistance à un antibiotique. Les cellules sont alors sélectionnées par culture sur un milieu contenant cet antibiotique. Seules les cellules possédant le gène de résistance pourront se multiplier. La présence du gène d'intérêt peut également être vérifiée par hybridation avec de l'ADN complémentaire de l'ADN introduit. Le produit de recombinaison selon l'invention est transféré à l'intérieur d'une cellule de plante cible. La cellule de plante cible peut être une partie d'une plante complète ou peut être une cellule isolée ou partie d'un tissu qui peut être régénéré à l'intérieur d'une plante complète. La cellule de plante cible peut être choisie parmi toute espèce de plante monocotylédone ou dicotylédone. Les plantes adaptées comprennent toute plante portant des fruits, telles que notamment les tomates, les mangues, les pêches, les pommes, les poires, les fraises, les bananes, les melons, les poivrons, les piments, le paprika, les plantes ayant des feuilles, des fleurs ou tout autre organe dans lesquels on souhaite modifier le contenu en caroténoides. Les produits de recombinaison selon l'invention peuvent être utilisés pour transformer toute plante, en utilisant toute technique adaptée pour transformer des plantes selon l'invention. Les cellules des plantes monocotylédones et dicotylédones peuvent être transformées de différentes manières connues par l'homme de l'art. Dans la plupart des cas, les cellules de ces plantes, particulièrement lorsque ce sont des cellules de plantes dicotylédones, peuvent être mise en culture pour générer une plante entière qui se reproduit par la suite en engendrant des générations successives de plantes modifiées génétiquement. Tout procédé adapté pour la transformation des plantes peut être utilisé. Par exemple, les plantes dicotylédones, telles que la tomate et le melon, peuvent être transformées en utilisant le plasmide Ti Agrobacterium. De telles plantes transformées peuvent se reproduire par croisement, ou par culture de cellule ou de tissu. Un treizième objet selon l'invention concerne une plante, ou fragment de plante, particulièrement fruit, graine, pétale, feuille, comprenant des cellules définies selon le douzième objet de l'invention. Les plantes ou fragments de plantes, génétiquement modifiées selon l'invention avec un vecteur comprenant une séquence sens, notamment pour augmenter la production de caroténoides, comprennent un taux élevé en précurseur de la vitamine A par rapport au taux normal produit par la plante. Les caroténoides, outre leur rôle dans la couleur de la plante, ont également un rôle de protection des plantes contre les dommages que peut produire une haute intensité lumineuse. De ce fait, les plantes, contenant par modification génétique un taux plus élevé de ces caroténoides, peuvent présenter un grand intérêt pour les régions où la culture s'effectue avec des changements de température importants. Les plantes modifiées génétiquement peuvent présenter des couleurs différentes, selon que l'on ait augmenté ou diminué la synthèse des caroténoides. Plus particulièrement, les produits de recombinaison de l'OTBC peuvent être utilisés pour stimuler ou inhiber la production des couleurs associées aux caroténoides produits lors des réactions de désaturation, par exemple le lycopène rouge, ou dérivés de produits comme la couleur jaune/orange associée au béta-carotène. La stimulation de la production des béta-carotènes, avec un produit de recombinaison sens de sur-expression, peut permettre de produire des poivrons de couleur jaune/orange, ou bien une couleur déterminée par un dérivé des béta-carotènes tel qu'un rouge plus intense, du fait de la biosynthèse de capsorubine ou de capsanthine, ayant comme conséquence que le consommateur trouvera ces poivrons plus appétissants. Comme exemple de plantes génétiquement modifiées selon la présente invention, on citera plus particulièrement les plantes portant des fruits. Les fruits de ces plantes peuvent donc être rendues plus attirantes pour le consommateur, en stimulant ou intensifiant à l'intérieur une couleur spécifique. Comme autres plantes qui peuvent être modifiées génétiquement, on peut citer les tubercules tels que les radis, les navets et les pommes de terre, de même que les céréales tels que le maïs, le blé, l'orge et le riz. Les plantes modifiées génétiquement selon l'invention, peuvent également contenir d'autres produits de recombinaison, par exemple des produits de recombinaison ayant d'autres effets, notamment sur le mûrissement des fruits. Par exemple, des fruits ayant une couleur plus intense, modifiés selon la présente invention, peuvent également contenir des produits de recombinaison, soit qui inhibent la production de certaines enzymes telles que la polygalacturonase et la pectinestérase, soit qui interfèrent avec la production d'éthylène. Les fruits qui contiennent ces deux types de produits de recombinaison peuvent être engendrés, soit par des transformations successives, soit en croisant deux variétés qui contiennent chacune un des produits de recombinaison, puis en sélectionnant parmi la descendance ceux qui contiennent les deux produits de recombinaison. Un quatorzième objet selon l'invention concerne un procédé pour modifier la production de caroténoides dans une plante, soit en augmentant la production de caroténoides, soit en abaissant ou inhibant la production de caroténoides par la plante, relativement au contenu normal de caroténoides produits par la plante, ledit procédé comprenant la transformation de cellules desdites plantes à transformer avec un vecteur défini dans le dixième et le onzième objet selon l'invention. Un quinzième objet selon l'invention concerne un procédé pour produire des caroténoides dans une cellule de plante, ou eucaryote ou procaryote, ledit procédé comprenant la transformation de cellules desdites plantes, des cellules eucaryotes ou procaryotes à transformer avec un vecteur défini dans le dixième objet selon l'invention. Les béta-carotènes, produits par un organisme eucaryote ou procaryote exprimant un produit de recombinaison codant pour l'enzyme OTBC, peuvent être extraits pour être utilisés en tant que colorant, antioxydant ou précurseur de la vitamine A. La figure 1 présente la séquence d'ADNc et la séquence d'acides aminés correspondante de OTBC. Le potentiel peptide N-terminal de transit du chloroplaste est souligné. Le point probable de clivage est indiqué par une étoile (*). Les triangles ouverts indiquent la position des introns. La figure 2 montre la comparaison entre la protéine OTBC et la protéine AOX de la graine de soja. (+) indique les acides aminés similaires. Les acides aminés présentés dans une boite font partie des domaines en hélice transmambranaire prédits. Les motifs de liaison du fer sont surlignés. Exemple 1 : du clonage du locus codant pour la protéine OTBC 1- Isolement du mutant. On a provoqué la mutation par l'utilisation d'un transposon introduit dans le génome de la plante Arabidopsis thaliana cultivar landsberg-erecta. Cette technique est largement décrite dans une référence (Long, D., Martin, M., Sundberg, E., Swinburne, J., Puangsomlee P., and Coupland, G. (1993) The maize transposable element system Ac/ Ds as a mutagen in Arabidosis :Identification of an albino mutation induced by Ds insertion. Pro. Natl. Science USA, 10,10370-10374) et a été effectuée par d'autres au laboratoire de George Coupland au John Innes Centre for Plant Science, Colney, Norwich, NR4 7UH, Nordwich, Grande-Bretagne. La transposition de l'élément transposable Dissociator (Ds) utilisé ici a été déclenchée par la production de la protéine transposase (ou Transposase de l'élément Activator, Ac). Parmi la descendance d'une plante ayant subi la transposition de l'élément Ds, on a identifié plusieurs plantes à l'aspect mutant albinos, différent du sauvage par l'absence de pigmentation verte (chlorophylle). On a également identifié des plantes d'aspect sauvage mais qui transmettent la mutation a leur descendance. Ces plantes sont identifiées comme hétérozygotes, portant la mutation sur un seul chromosome. Les plantes homozygotes ont un phénotype mutant et portent la mutation sur les deux chromosomes homologues. 2-Test de Liaison de la mutation a l'élément transposable Ds. Cette expérience a été faite dans le but de prouver que la mutation observée est causée par l'insertion de l'élément Ds dans un gène nécessaire au bon fonctionnement de la plante et à son aspect sauvage. L'élément transposable, ou transposon, Ds est construit de façon a porter un gène de résistance a l'antibiotique hygromycine (décrit dans les références précédentes). On a fait pousser la descendance de 35 plantes hétérozygotes qui portent la mutation albinos sur un milieu gélosé contenant une dose létale d'hygromycine, toutes les plantes qui portent la mutation sont aussi résistantes à l'hygromycine. On en tire la conclusion que la mutation est liée au gène de résistance porté par le transposon. On a isolé une portion d'ADN de plante résistante à l'antibiotique hygromycine, jouxtant le transposon. Ceci a été fait selon la méthode IPCR ou PCR-inverse décrite dans les références précédentes. Par expérience dite de "Southern blot", on a remarqué que les lignées qui portent la mutation ont une altération de l'ADN génomique. Cette altération est révélée lorsque l'on utilise comme "sonde" la portion d'ADN isolée jouxtant le transposon. 3- Isolement du gène On a, en utilisant une méthode de criblage de banque d'ADN génomique, isolé un clone contenant un fragment d'ADN génomique pouvant contenir la version sauvage inaltérée du gène interrompu chez le mutant. La banque d'ADN criblée a été construite par d'autres, elle est decrite dans publication de Whitelam, G. C., Johnson, E., Peng, J., Carol P., Anderson, M. L., Cowl, J. S. & Harberd, N. P. (1993) Phytochrome A null mutants of Arabidopsis display a wild-type phenotype in white light. The Plant Cell 5,757-768. Nous avons déterminé la séquence totale d'un fragment de restriction obtenu par digestion enzymatique du clone d'ADN génomique par l'enzyme EcoR I. La séquence obtenue couvre 3000 paires de bases. Parmi ces 3000 paires de base, on trouve une partie identique à la séquence du fragment bordure préalablement isolé, confirmant l'identité entre l'ADN isolé et le gène interrompu par le transposon. 4- Isolement et caractérisation de la séquence codante. Nous avons utilisé une banque d'ADNc, qui est une banque commerciale vendue par CLONTECH Laboratories, Inc.. Il s'agit d'une banque d'ADNc faite à partir d'ARNm extrait d'Arabidopsis thaliana, transformés en ADNc, puis clonés dans le vecteur plasmidique pGADIO. A partir de cette banque de données d'ADNc, et selon les techniques habituelles, utilisant le gène identifié précédemment comme sonde, nous avons isolé plusieurs clones contenant un ADNc d'une taille d'environ 1400 paires de bases. Nous avons déterminé la séquence totale de l'ADNc et avons montré qu'il est entièrement compris dans le fragment d'ADN génomique préalablement identifié. Nous avons placé la partie codante (ou exons) et la partie non codante (introns) du gène sur la séquence du gène. Le gène porte 9 exons et 8 introns. L'insertion du transposon Ds est identifiée au début du deuxième exon et vient donc interrompre la partie codante du gène. La séquence de l'ADNc présente un potentiel codon de départ suivi par un cadre de lecture ouvert de 350 acides aminés, codant pour une protéine potentielle de 39 kDa que nous avons nommé OTBC. Une recherche d'homologie en utilisant le programme blastp Altshul et al. (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs Nucleics Acids Res. 25,3389- 3402) a révélé une homologie faible mais significative avec des polypeptides appartenant à la famille des protéines oxydase alternative ou terminale oxydase de mitochondries (AOX). Aucune autre homologie significative n'a été trouvée. L'homologie commence à l'acide aminé 111 et présente 29% d'identité (45% de similarité) avec l'oxydase de soja. Malgré la faible identité avec la protéine AOX, une recherche par ordinateur de structures secondaires et des domaines potentiels de la signification biologique ont révélé une similarité structurale entre la protéine OTBC et AOX. Des domaines en hélice transmembranaire trouvés dans AOX sont situés à des positions similaires sur la séquence peptidique de l'OTBC, suggérant une localisation membranaire de OTBC et également une configuration similaire à AOX dans la membrane. De plus, un motif de liaison du fer se trouve conservé entre OTBC et AOX. L'alignement des séquences entre les protéines OTBC et AOX montre une insertion de 19 acides aminés dans la protéine OTBC qui correspond à une partie des exons 7 et 8. La séquence N-terminale de la protéine OTBC présente les caractéristiques d'un peptide de transit du chloroplaste, qui est riche en leucine, arginine et sérine/thréonine. Une analyse par ordinateur du potentiel peptide de transit (psort software, Nakai and Kanehisa, 1992) a suggéré une cible possible de OTBC au niveau des compartiments des thylakoides du chloroplaste. 5- Identification de la mutation. L'aspect du mutant est proche de celui d'un mutant déjà décrit dans la littérature : mutant "immutans", Wetzel C.M., Jiang C-Z., Meehan L. J., Voytas D.L., Rodermel S.R. (1994) Nuclear-organelle interactions: the immutans variegation mutant of Arabidopsis is plastid autonomous and impaired in carotenoid biosynthesis, Plant Journal 6,161-175. Nous avons croisé le mutant "immutans" (allèle spotty, référence précédente) avec celui que nous avons isolé. La descendance du croisement est d'aspect mutant, ce qui est un résultat attendu si les deux mutations affectent le même gène. Nous pouvons affirmer que le gène identifié correspond à la version sauvage du locus IMMUTANS et que le mutant obtenu porte une version interrompue du gène dont le produit est alors inactif. Exemple 2 : Construction d'un vecteur de l'invention par introduction d'ADNc codant pour l'OTBC de poivron dans un vecteur d'expression de plantes Le vecteur pBI121 (commercialisé par Clontech laboratories, Inc) est un vecteur adapté à cette construction. Il comporte une région T-DNA que la bactérie Agrobacterium tumefaciens peut transférer dans le génome des plantes. Cette région T-DNA comporte entre autre un promoteur constitutif (le promoteur nommé 35S du virus CaMV), le gène GUS suivi du terminateur NOS (du gène nopaline synthase). Le gène GUS ne présentant aucun intérêt dans l'invention est remplacé par un ADNc codant pour l'OTBC. Cet ADNc sera donc placé sous le contrôle du promoteur 35S et du terminateur NOS. Tout autre promoteur constitutif ou non (dans ce dernier cas, il devra être spécifique de l'organe dont on souhaite modifier les propriétés) et tout autre terminateur sont également utilisables. Un ADNc codant pour l'OTBC a été sous-clonés originellement dans le site de restriction Notl du plasmide bactérien pBluescriptKS : il a ainsi été flanqué de sites de coupures BamHl en 5' et Sacl en 3'. Cet ADNc est excisé du plasmide pBluescriptKS par les enzymes de restriction BamHl et Sacl. Ce fragment BamHI-Sacl est inséré dans le vecteur pBI121 lui-même coupé par ces enzymes : le site BamHl se trouve en 3' du promoteur 35S et en 5' du gène GUS, le site Sacl se trouve en 3' du gène GUS et en 5' du terminateur NOS. Après ligation, sont sélectionnés les dérivés du vecteur pBI121 dans lequel l'ADNc codant pour l'OTBC (c'est-à-dire sans intron) a remplacé le gène GUS. Exemple 3 : d'une cellule de plante pour obtenir une cellule transformée de l'invention. Le vecteur de transformation de plante dérivé de pBI121 obtenu à l'exemple 2 est introduit dans la souche d'Agrobacterium LBA4404 par électroporation. La souche recombinante est sélectionnée en présence de 50 g/ml de kanamycine. Cette souche transformée d'Agrobacterium est utilisée pour la transformation de cellules de plantes, par exemple de tabac. La technique utilisée à cet effet et qui peut être remplacée par toute autre technique de transformation, est celle de l'infection de disques foliaires de plantules de tabac cultivées in vitro. Les cellules transformées de plantes sont sélectionnées en présence de kanamycine. Agrobacterium est éliminé par l'antibiotique céfotaxime. Les disques foliaires sont cultivés sur milieu de culture végétale en présence d'hormones végétales (auxine et cytokinines) favorisant la croissance de cal. Les cals issus de la croissance des cellules transformées sont utilisés pour la régénération de plantes entières par les techniques classiques. Par exemple, les cals sont transférés sur milieu de culture végétale en présence de cytokinine pour induire la formation de pousses. Celles-ci sont ensuite coupées et transférées sur milieu de culture végétale sans hormone afin de régénérer des racines. les antibiotiques kanamycine (afin de sélectionner la croissance de tissus transformés) et céfotaxime (afin d'éliminer complètement Agrobacterium) sont maintenus pendant toutes ces phases de culture. Les plantes transformées sont mises en culture stérilement en présence de kanamycine et céfotaxime puis sont transférées en terre et cultivées en serre jusqu'à la récolte des graines. La présence du transgène a été confirmée par hybridation de l'ADN génomique de ces plantes avec une sonde spécifique issue du vecteur de transformation utilisé. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT : (A) NOM : UNIVERSITE JOSEPH FOURIER (Grenoble 1) (B) RUE : CERMO - 460, RUE DE LA PISCINE - Domaine Universitaire (C) VILLE : SAINT MARTIN D'HERES - GRENOBLE (E) PAYS : FRANCE (F) CODE POSTAL : 38400 (ii) TITRE DE L'INVENTION : ADN et ARNm correspondant, codant pour l'enzyme oxydase terminale associée a la biosynthèse des caroténoides (OTBC) (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR . (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR . IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL : Patentln Release #1.0, Version #1 30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO 1 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR : 1396 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS . simple (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc (iv) ANTI-SENS : NON (vi) ORIGINE : (B) SOUCHE : Arabidopsis thaliana (xi)DESCRIPTIONDELA SEQUENCE : SEQID NO : 1 : CCGCTCACAT TGGGATTCGT CATTCTTCTT CTAAAACCCG CAAAATTTCT CCATTTCTAC 60 CAAAAATATC CAACTTTTACTTTTCTTTCC TGTGAAATTA TCTGCTCAAA TCTTTGGTTC 120 CTGACGGAGA TGGCGGCGAT TTCAGGCATC TCCTCTGGTA CGTTGACGAT TTCACGGCCT 180 TTGGTTACTC TTCGACGCTC TAGAGCCGCC GTTTCGTACA GCTCCTCTCA CCGATTGCTT 240 CATCATCTTC CTCTCTCTTC TCGTCGTCTG CTATTAAGGA ACAATCATCG AGTCCAAGCA 300 ACGATTTTGC AAGACGATGA AGAGAAAGTG GTGGTGGAGG AATCGTTTAA AGCCGAGACT 360 TCTACTGGTA CAGAACCACT TGAGGAGCCA AATATGAGTT CTTCTTCAAC TAGTGCTTTT 420 GAGACATGGA TCATCAAGCT TGAGCAAGGA GTGAATGTTT TCCTTACAGA CTCGGTTATT 480 AAGATACTTG ACACTTTGTA TCGTGACCGA ACATATGCAA GGTTCTTTGT TCTTGAGACA 540 ATTGCTAGAG TGCCTTATTTTGCGTTTATG TCTGTGCTAC ATATGTATGA GACCTTTGGT 600 TGGTGGAGGA GAGCAGATTA TTTGAAAGTA CACTTTGCTGAGAGCTGGAA TGAAATGCAT 660 CACTTGCTCA TAATGGAAGA ATTGGGTGGA AATTCTTGGT GGTTTGATCG TTTTCTGGCT 720 CAGCACATAG CAACCTTCTA CTACTTCATG ACAGTGTTCT TGTATATCTT AAGCCCTAGA 780 ATGGCATATC ACTTTTCGGA ATGTGTGGAG AGTCATGCAT ATGAGACTTA TGATAAATTT 840 CTCAAGGCCA GTGGAGAGGA GTTGAAGAAT ATGCCTGCAC CGGATATCGC AGTAAAATAC 900 TATACGGGAG GTGACTTGTA CTTATTTGAT GAGTTCCAAA CATCAAGAAC TCCCAATACT 960 CGAAGACCAG TAATAGAAAA TCTATACGAT GTGTTTGTGA ACATAAGAGA TGATGAAGCA 1020 GAACACTGCA AGACAATGAG AGCTTGTCAG ACTCTAGGCA GTCTGCGTTC TCCACACTCC 1080 ATTTTAGATG ATGATGATAC TGAAGAAGAA TCAGGGTGTG TTGTTCCTGA GGAGGCTCAT 1140 TGCGAAGGTA TTGTAGACTG CCTCAAGAAA TCCATTACAA GTTAATAAAT TAGAAAGTAA 1200 ACTAAAAAAG ATTATTTGTA TCAGCTCATG AACAATAGAT ATAATCCCAT ATACTTGGGA 1260 ATAAAGGAAT AATGTGAAAT TCCCATCGTT GTGCTAGTGT GTGAGAGAAT CAAATACCCT 1320 AATGATGTAA ATGTACTTTG ATGAGCTTAA GTCGTTGTAG ACCATTTTAT CAAAAAAAAA 1380 AAAAAAAAAA AAAAAA 1396 (2)INFORMATIONS POUR LA SEQIDNO : 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 351 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS : simple (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (iv) ANTI-SENS : NON (v) TYPE DE FRAGMENT : interne (vi) ORIGINE : (B) SOUCHE : Arabidopsis thaliana (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO 2 : Met Ala Ala Ile Ser Gly Ile Ser Ser Gly Thr Leu Thr Ile Ser Arg 1 5 10 15 Pro Leu Val Thr Leu Arg Arg Ser Arg Ala Ala Val Ser Tyr Ser Ser 20 25 30 SerHis Arg Leu Leu His HisLeu Pro Leu Ser Ser Arg Arg Leu Leu 35 40 45 Leu Arg Asn Asn His Arg Val Gln Ala Thr Ile Leu Gln Asp Asp Glu 50 55 60 Glu Lys Val Val Val Glu Glu SerPhe Lys Ala Glu Thr Ser Thr Gly 65 70 75 80 Thr Glu Pro Leu Glu GluPro Asn Met Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala 85 90 95 Phe Glu Thr Trp Ile Ile Lys Leu Glu Gin Gly Val Asn Val Phe Leu 100 105 110 Thr Asp Ser Val Ile Lys Ile Leu Asp ThrLeu Tyr Arg Asp Arg Thr 115 120 125 Tyr Ala Arg Phe Phe Val Leu Glu Thr Ile Ala Arg Val Pro Tyr Phe 130 135 140 Ala Phe Met Ser Val Leu HisMet Tyr Glu ThrPhe Gly Trp Trp Arg 145 150 155 160 Arg Ala Asp TyrLeu Lys Val His Phe Ala Glu Ser Trp Asn Glu Met 165 170 175 His His LeuLeu Ile Met Glu GluLeu Gly Gly Asn Ser Trp Trp Phe 180 185 190 Asp Arg Phe Leu Ala Gln His Ile Ala ThrPhe Tyr Tyr Plie Met Thr 195 200 205 Val Phe Leu Tyr Ile Leu SerPro Arg Met Ala Tyr His Phe Ser Glu 210 215 220 Cys Val Glu SerHis Ala Tyr Glu Thr Tyr Asp Lys Phe Leu Lys Ala 225 230 235 240 Ser Gly Glu Glu Leu Lys Asn Met Pro Ala Pro Asp Ile Ala Val Lys 245 250 255 Tyr Tyr Thr Gly Gly Asp Leu TyrLeu Phe Asp Glu Phe Gln Thr Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Asn Thr Arg Arg Pro Val Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val 275 280 285 Phe Val Asn Ile Arg Asp Asp Glu Ala Glu His Cys Lys Thr Met Arg 290 295 300 Ala Cys Gln Thr Leu Gly SerLeu Arg Ser ProHis Ser Ile Leu Asp 305 310 315 320 Asp Asp Asp Thr Glu Glu Glu Ser Gly Cys Val Val Pro Glu Glu Ala 325 330 335 His Cys Glu Gly Ile Val Asp Cys Leu Lys Lys Ser Ile Thr Ser 340 345 350 REVENDICATIONS 1. Séquence d'ADN, comprenant au moins une région codante constituée par: - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID N 1, transcrivant un ARNm, cet ARNm codant pour l'enzyme Oxydase Terminale associée à la Biosynthèse des Caroténoides (OTBC) décrite par SEQ ID N 2, - la séquence nucléotidique modifiée de la séquence SEQ ID N 1, telle que décrite ci-dessus, particulièrement par mutation et/ou addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou de plusieurs nucléotide(s), cette séquence modifiée transcrivant un ARNm lui-même codant pour l'OTBC décrite par SEQ ID N 2, ou codant pour une protéine modifiée de ladite OTBC, ladite protéine modifiée ayant une activité enzymatique équivalente à celle de l'OTBC décrite par SEQ ID N 2. 2. Séquence d'ADN comprenant au moins une région codante constituée par: - la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID N 1, cette séquence transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'hybridrer avec l'ARNm codé par la séquence SEQ ID N 1, - la séquence nucléotidique modifiée de la séquence décrite ci-dessus, par mutation et/ou addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotide(s), cette séquence modifiée transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'hybrider avec un ARNm mentionné ci-dessus, - un fragment de l'une des séquences nucléotidiques mentionnées ci-dessus, ledit fragment transcrivant un ARNm anti-sens capable de s'apparier avec l'ARNm codé par la séquence complémentaire de SEQ ID N 1. 3. ARNm transcrit à partir de la séquence d'ADN selon la revendication 1, et plus particulièrement transcrit à partir de la séquence d'ADN complémentaire représentée par SEQ ID N 1, ledit ARNm codant pour l'enzyme OTBC décrite par SEQ ID N 2, ou pour un fragment ou une protéine modifiée de l'enzyme, et présentant une activité qui est équivalente à ladite enzyme dans la plante. 4. ARNm anti-sens transcrit à partir de la séquence d'ADN complémentaire selon la revendication 2, comprenant des nucléotides qui sont complémentaires de la totalité ou d'une partie des nucléotides constituant l'ARNm natif, et capables de s'hybrider avec ledit ARNm. 5. Protéine ayant l'activité de l'enzyme OTBC native décrite par SEQ ID N 2, ou toute protéine modifiée de ladite enzyme OTBC, particulièrement par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou tout fragment provenant de l'enzyme OTBC ou d'une séquence modifiée de l'enzyme, ladite protéine modifiée ou fragment présentant une activité enzymatique équivalente à celle de l'enzyme OTBC. 6. Complexe formé entre un ARNm anti-sens selon la revendication 4, et un ARNm codant pour une enzyme OTBC dans la plante. 7. ADN recombiné caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN selon la revendication 1, ladite séquence étant insérée dans une séquence hétérologue, lesdites séquences transcrivant tout ou partie d'une séquence ARNm codant pour tout ou partie de l'enzyme OTBC, cette dernière ayant une activité enzymatique équivalente à l'enzyme OTBC de la plante. 8. ADN recombiné caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence d'ADN selon la revendication 2, ladite séquence étant insérée dans une séquence hétérologue, lesdites séquences transcrivant tout ou partie d'une séquence ARNm anti-sens capable de s'apparier avec un ARNm codant pour une enzyme OTBC dans la plante. 9. ADN recombiné selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments nécessaires pour contrôler l'expression de la séquence nucléotidique insérée, particulièrement une séquence promotrice et une séquence de terminaison de transcription. 10. Vecteur de transformation de plantes, adapté pour augmenter la biosynthèse des caroténoides, comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 selon la revendication 1, codant pour tout ou partie d'une enzyme impliquée dans la synthèse des caroténoides, décrite par SEQ ID N 2, précédé par une origine de réplication de la transcription des plantes, de manière à ce que le vecteur puisse générer de l'ARNm dans les cellules des plantes. 11. Vecteur de transformation de plantes, adapté pour diminuer ou arrêter la biosynthèse des caroténoides, comprenant tout ou partie du brin de la séquence nucléotidique complémentaire de SEQ ID N 1 selon la revendication 2, précédé par une origine de réplication de la transcription des plantes, de manière à ce que le brin complémentaire transcrit puisse s'apparier à l'ARNm codant pour l'enzyme OTBC de la plante impliquée dans la synthèse des caroténoides. 12. Cellule de plante transformée par un vecteur selon la revendication 10 ou 11. 13. Plante, ou fragment de plante, particulièrement fruit, graine, pétale, feuille, comprenant des cellules selon la revendication 12. 14. Procédé pour modifier la production de caroténoides dans une plante, soit en augmentant la production de caroténoides, soit en abaissant ou inhibant la production de caroténoides par la plante, relativement au contenu normal de caroténoides produits par la plante, ledit procédé comprenant la transformation de cellules desdites plantes à transformer avec un vecteur selon la revendication 10 ou 11. 15. Procédé pour produire des caroténoides dans une cellule de plante, ou eucaryote ou procaryote, ledit procédé comprenant la transformation de cellules desdites plantes, des cellules eucaryotes ou procaryotes à transformer avec un vecteur selon la revendication 10.