Brevet FR2792638A1 — publié le 20001027

La présente invention se rapporte à des peptides dérivés de la vasostatine I et à leur utilisation comme antifongiques. La vasostatine I est un peptide naturel dérivé de la chromogranine A (CGA), laquelle appartient à la famille des glycophosphoprotéines sécrétoires acides, protéines largement exprimées dans de nombreuses cellules endocrines, neuroendocrines et dans les neurones (Simon, J. P. et al. (1989) Biochem. J 262,1-13, Helle, K. B. (1990) Neurochem. Int. 17,165-175, Huttner, W. B. et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 16,27-30, Winkler, H. et al. (1992) Neuroscience 49,497-528). Les chromogranines, notamment les chromogranines A et B, sont considérées comme des précurseurs qui sont dégradés en peptides à l'intérieur des granules de sécrétion des cellules chromaffines de la médullo-surrénale (Simon, J. P. et al. (1989) déjà cité ; Dillen, L. et al. (1993) Neurochem. Int. 22, 315-352 ; Metz-Boutigue, M. H. et al. (1993) Eur. J Biochem. 217,247-257 ; Strub J. M. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 229, 356-368 ; Soszynski, D. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 655-662). La vasostatine I, hautement conservée pendant l'évolution, est composée de 76 résidus qui correspondent au fragment N-terminal de la CGA et présente un pont disulfure entre les cystéines C17 et C38. Ce fragment correspond à CGA1-76 (SEQ ID N 1 à SEQ ID N 4). CGA1-76 présente une grande stabilité face aux enzymes protéolytiques de la matrice intragranulaire comme par exemple les pro-hormone convertases, la trypsine et les carboxypeptidases. Elle est essentiellement localisée dans la matrice des granules de sécrétion des cellules chromaffines de la médullo-surrénale et libérée avec les catécholamines dans le milieu extracellulaire après stimulation (Metz-Boutigue, M. H., et al. (1993) déjà cité ; Helle, K. B,. et al. (1993) J. Neuroendocrinol. 5, 413-420). Elle est également libérée par les terminaisons nerveuses en réponse à une stimulation (Liang, F., et al. (1995) Acta Physiol. Scand. 155,23-30), ce qui suggère que la vasostatine I pourrait jouer un rôle important in vivo. Dès 1992 il a été établi que la vasostatine I exerce un effet relaxant sur la veine saphène humaine en inhibant la vasoconstriction induite par l'endothéline-1 (Aardal, S. et al. (1992) Regul. Pept. 41,9-18 ; Aardal, S. et al. (1993) J Neuroendocrinol. 5, 405-412). Différentes études ont ensuite montré que la vasostatine I possède d'autres activités biologiques ; ainsi elle est capable d'inhiber la sécrétion de l'hormone parathyroïdienne (Russel, J., et al. (1994) Endocrinology 133,337-342), de réguler l'adhésion des cellules (Gasparri, A., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272,20835- 20843) et d'induire la neurotoxicité observée dans les cocultures de neurones et de cellules microgliales (Ciesielski-Treska, J. et al. (1998) J Biol. Chem. 273,14339- 14346). Plus récemment, les Inventeurs ont montré que la vasostatine 1 et d'autres peptides naturels dérivés des chromogranines A et B, qui sont libérés pendant la sécrétion, possèdent une puissante activité antibactérienne vis-à-vis de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif (Strub, J. M., et al. (1995) Eur. J Biochem. 229,356- 368 ; Strub, J. M., et al. (1996) FEBS Lett. 379,273-278 ; Strub, J. M., et al. (1996) J Biol. Chem. 271, 28533-28540 ; Goumon, Y., et al. (1996) Eur. J Biochem. 235, 516-525 ; Metz-Boutigue, M. H., et al. (1998) Cell. Mol. Neurobiol. 18, 249-266). Les mycoses représentent encore à l'heure actuelle une cause importante de morbidité et de mortalité chez l'homme et chez l'animal, malgré la présence dans leur organisme de substances naturelles capables de développer des mécanismes de défense et malgré l'existence de nombreuses substances synthétiques à activité antifongique. L'incidence des infections fongiques a connu une nette progression au cours de ces dernières années, d'une part par l'augmentation des localisations mycosiques profondes viscérales et septicémiques et d'autre part par l'importation fréquente de mycoses viscérales exotiques. Les premières sont dues à des champignons très répandus dans la nature, habituellement saprophytes, ne devenant pathogènes que dans certaines conditions : usage croissant des antibiotiques à large spectre, corticothérapie, chimiothérapie, thérapeutiques immunosuppressives, patients atteints du SIDA, greffes et abords cardiovasculaires ; on parle de mycoses iatrogènes. Elles sont causées par des champignons opportunistes qui sont soit levuriformes (Candida, Cryptococcus, Torulopsis), soit filamenteux (Aspergillus, Cephalosporum, Mucor). Les secondes sont dues à des champignons pathogènes se développant dans des pays chauds et qui sont importés à la faveur du tourisme et des brassages de populations. Ces mycoses exotiques sont l'histoplasmose, la coccidioïdomycose, les blastomycoses et les mycétomes. Si le traitement des mycoses superficielles cutanées ou touchant les muqueuses ne présente pas de réelles difficultés, il en est tout autrement des mycoses profondes ; celles-ci présentent toujours un caractère de gravité et sont rapidement évolutives car elles surviennent sur un terrain affaibli ou immunodéprimé. De plus chez les patients immunodéficients, on constate souvent soit un échec du traitement antifongique, soit l'apparition de souches résistantes aux différents antifongiques utilisés, notamment Candida albicans. Ces échecs thérapeutiques ont donné récemment un regain d'intérêt à la recherche dans le domaine des antifongiques. De nombreux peptides naturels antifongiques ont été décrits dans les plantes (Tailor R .H. et al. (1997), J. Biol. Chem., 272,24480-24487), les insectes (notamment les cécropines, Boman H. G. et al. (1972) Nature, 237,232-235 ; Boman H. G. et al. (1994) in Phylogenetic perspectives in immunity : the insect host defense Hoffmann J. A., Janeway C.A., Natori S. Eds., 3-17, R. G. Landes Company, Austin) et les invertébrés (WO 98/07440). Le développement d'antifongiques se heurtent à trois obstacles : - une faible activité in vivo au regard de l'activité in vitro, - une mauvaise diffusion à travers la paroi des champignons qui est composée de chitine, de phospholipides et de stérols ; ces constituants, absents de la paroi des bactéries, expliquent pourquoi la plupart des antibactériens ne sont pas des antifongiques ; en effet, pour pouvoir pénétrer dans la membrane, les antifongiques doivent présenter une forte hydrophobie et - une toxicité importante, obstacles qui rendent nécessaire le développement de nouveaux peptides antifongiques qui soient actifs in vivo, aptes à agir efficacement sur les cellules et peu toxiques. Or les Inventeurs ont montré de manière surprenante que la vasostatine I et des peptides dérivés de la vasostatine I présentent une activité antifongique remarquable, en l'absence d'activité lytique sur les érythrocytes. Aussi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des peptides antifongiques qui soient actifs in vivo, aptes à agir efficacement sur les cellules et peu toxiques. La présente invention concerne des peptides représentant un fragment de la séquence de la vasostatine I et répondant : - soit à la séquence de formule (I) a-(SEQ ID N 14)-b (I) dans laquelle a est soit nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 15) de formule X,LPVNSPMXZKGDTX3VMKCX4EVISDXSLSKPSPMPVSX6ECX,ETLX$GDE où X, est nul ou représente une séquence comprenant de 1 à 10 acides aminés, X2 représente N ou T, X3 représente E ou K, X4 représente IV ou VL, X5 représente T ou S, X6 représente K, P ou Q, X7 représente F ou L, X8 représente R ou Q, et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, SEQ ID N 14 représente RX9LSILRHQNLLKE, où X9 représente 1 ou V, et b soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 16) de formule LQDLALQGAKERXIOXI1QQX,Z où X,o représente T, A ou S, XII représente H ou Q et X12 est nul ou représente KK ou polyQ, pourvu que a-(SEQ ID N 14)-b soit différent de SEQ ID N 1, de SEQ ID N 2, de SEQ ID N 3, de SEQ ID N 4 et de SEQ ID N 5, - soit à la séquence de formule (II) : c-(SEQ ID N 17)-d (II) dans laquelle, c soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 18) de formule, X,LPVNSPMX2KGDTX3 où X1, X2 et X3sont tels que définis précédemment, SEQ ID N 17 représente VMKCX4EVISDXsLSKPSPMPVSX6ECX7E, où X4, X5, X6 et X7 sont tels que définis précédemment et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, et d est soit nul, soit représente la SEQ ID N 19 de formule TLXgGDELSILRHQNLLKELQDLALQGAKERXIOXIQQX1z où Xg, X9, XIO, XII et X12 sont tels que définis précédemment, pourvu que c-(SEQ ID N 17) -d soit différent de SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ED N 6, ainsi que leurs équivalents fonctionnels. Au sens de la présente invention, on entend par peptides représentant un fragment'de la séquence de la vasostatine I, aussi bien les fragments naturels obtenus par digestion enzymatique ou par coupure chimique de la vasostatine I, que les fragments synthétiques obtenus par les techniques classiques de synthèse peptidique, et notamment par la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield R. B. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 ou par des techniques d'ADN recombinant (Corti, A., et al. (1997) Eur. J. Biochem. 248,692-699) ou par combinaison de ces deux types de techniques. Au sens de la présente invention, on entend par équivalents fonctionnels, des séquences d'aminoacides comprenant des délétions, ou des additions, des modifications ou des substitutions conservatives ou une combinaison de celles-ci, au niveau de un ou plusieurs aminoacides, de manière à ce que la structure tertiaire et l'activité antifongique ne soient pas altérées. Les modifications comprennent notamment celles résultant des processus posttraductionnels ou des modifications chimiques réalisées par des techniques classiques connues de l'homme du métier (acylation, fixation de lipides, de nucléotides, cyclisation ...). Les modifications comprennent également celles résultant d'un couplage des peptides, par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter leur affinité pour un type de cellule particulier, notamment des couplages avec des peptides vecteurs. Les substitutions conservatives bien connues de l'homme du métier, comprennent notamment la substitution d'un aminoacide par un autre aminoacide ayant même charge (aminoacides acides : Asp et Glu ; aminoacidesbasiques : Lys, Arg et ornithine ; aminoacides polaires neutres : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, His et Trp), même taille, même caractère hydrophile (aminoacides hydrophobes : Ala, Val, Leu Ile, Pro, Phe et Met), même aromaticité (Phe et Tyr) et/ou même capacité à former des hélices. Il est bien entendu que les équivalents fonctionnels comprennent également comme aminoacides, ceux qui sont des énantiomères et des diastéréoisomères des aminoacides naturels de conformation D, les aminoacides rares, notamment l'hydroxyproline, la méthyllysine et la diméthyllysine et les aminoacides synthétiques, notamment l'ornithine, la norleucine, la cyclohexylalanine et les omégaaminoacides. Les équivalents fonctionnels recouvrent également les rétropeptides. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les peptides de formule (I) et (II) sont constitués par des aminoacides non oxydés. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences suivantes : SEQ ID N 7 qui correspond au fragment CGA47-60 d'origine bovine, humaine et porcine, SEQ ID N 8 qui correspond au fragment CGA47-60 de rat , SEQ ID N 9 qui correspond au fragment CGA41-70 d'origine bovine, humaine et porcine, SEQ ID N 10 qui correspond au fragment CGA41-70 de rat, SEQ ID N 11 qui correspond au fragment CGAI4-4o d'origine bovine, SEQ ID N 12 qui correspond au fragment CGAI4-40 d'origine humaine et porcine, SEQ ID N 13 qui correspond au fragment CGA14-40 de rat. La présente invention concerne également l'utilisation des peptides dérivés de la vasostatine I de formules (I) ou (II) comme antifongiques. La présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques antifongiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide dérivé de la vasostatine I, de formule (I) ou de formule (II), associé à au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent au moins un peptide dont la séquence est choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12 et SEQ ID N 13. La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide dont la séquence est choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6, pour la préparation d'un médicament utile comme antifongique. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont adaptées à l'administration systémique, notamment par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale, à l'administration orale notamment sous forme de comprimés, de gélules et de capsules, à l'administration topique, notamment sous forme de gel, de lotion et de crème, à l'administration rectale, notamment sous forme de suppositoires ou de pommade, à l'administration vaginale, notamment sous forme de capsule ou de gelée, à l'administration pulmonaire, notamment sous forme d'aérosol, à l'administration nasale, notamment sous forme de gouttes ou de pommade nasale, à l'administration oculaire, notamment sous forme de collyre ou de pommade ophtalmique et à l'administration buccale, notamment sous forme de bain de bouche ou de pâte dentifrice. Les peptides selon l'invention, la vasostatine 1 et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés dans le traitement ou la prévention de maladies causées par différents types de champignons filamenteux, notamment par Neurospora crassa, Aspergillus sp, notamment Aspergillus fumigatus, Alternaria sp, notamment Alternaria brassicola, Trichoderma sp, notamment Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium culmorum et Fusarium oxyporum ou par des levures, notamment par Candida sp et par Saccharomyces cerevisiae. Selon un mode préféré d'utilisation selon l'invention, dans le traitement ou la prévention des maladies causées par différents types de champignons filamenteux ou par des levures, on utilisera les peptides de SEQ ID N 1 à 4. Les peptides selon l'invention, la vasostatine 1 et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés dans le traitement ou la prévention des mycoses superficielles à localisation cutanée, des mycoses cutanéomuqueuses qu'elles soient cutanées, oropharyngées ou digestives et des mycoses profondes, notamment dans les cas de candidoses disséminées au niveau oculaire, ostéoarticulaire, cardiaque, urinaire, génital, pulmonaire, cérébral ou septicémique, et dans tous les cas de mycoses au niveau oculaire, ostéoarticulaire, cardiaque, urinaire, pulmonaire, cérébral ou septicémique. Les peptides selon l'invention, la vasostatine I et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6 peuvent être utilisés de manière avantageuse chez des patients immunodéprimés, notamment chez les malades atteints du SIDA ou chez des patients traités par immunothérapie ou par chimiothérapie, ou chez des patients soumis à une antibiothérapie prolongée ainsi qu'en néonatologie. Les peptides selon l'invention, la vasostatine I et les peptides de SEQ ID N 5 et de SEQ ID N 6, peuvent être utilisés seuls ou en association avec d'autres principes actifs, notamment avec des antibiotiques. Les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'un traitement ciblé, notamment lorsqu'ils ont été préalablement modifiés par couplage, par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter leur affinité pour un type de cellule particulier. Les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'une thérapie génique, notamment par injection d'une cellule préalablement modifiée pour exprimer un peptide selon l'invention in vivo. La présente invention concerne également les acides nucléiques codant pour les peptides de formule (I) et de formule (II) telles que définies précédemment. Selon un mode préféré de réalisation, les acides nucléiques codent pour les séquences choisies dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13. La présente invention concerne également des anticorps immunospécifiques des peptides de formule (I) et de formule (II). Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils consistent en anticorps polyclonaux. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits anticorps, ils consistent en anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclonaux sont avantageusement obtenus par immunisation d'un animal approprié (notamment un mammifère ou un gallinacé) avec un peptide selon l'invention, éventuellement couplé à une protéine convenablement choisie telle que la sérum albumine bovine (SAB) ou la KLH (Keyhole limpet hemocyanin) notamment selon les techniques décrites par Goumon Y. et. al. (1998), J. Biol. Chem., 273,29847-29856 et par El-Majdoubi M., (1996), J. Neuro. Cytol., 25, 405-416. Les anticorps monoclonaux anti-fragments peptidiques peuvent être avantageusement obtenus de manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris immunisées avec un antigène consistant en un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, éventuellement couplé à une protéine convenable telle que SAB ou KLH avec des cellules myélomateuses appropriées. La présente invention a également pour objet un réactif pour le la détection d'un peptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps antipeptidique selon l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit réactif, il est constitué d'anticorps polyclonaux. La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'un peptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un réactif conforme à l'invention et une étape dans laquelle on détecte une interaction spécifique entre ledit réactif et une ou plusieurs des séquences peptidiques telles que définies ci-dessus et présentes dans l'échantillon. Un tel procédé permet notamment de mettre en évidence l'absence de ces peptides chez les patients immunodéprimés et de mettre en oeuvre une thérapie adaptée, notamment l'administration d'une composition selon l'invention. La détection de l'interaction entre ledit réactif et une ou plusieurs des séquences peptidiques selon l'invention, en particulier la détection du complexe antigène-anticorps peut être réalisée par des méthodes connues de l'homme du métier, notamment grâce à des tests immunoenzymatiques, immunofluorescents, radioimmunologiques ou par des tests d'immunoprécipitation. La présente invention a en outre pour objet une trousse ou un coffret ou un ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en #uvre de ladite détection, des doses appropriées d'un ou plusieurs anticorps conformes à l'invention et un échantillon biologique de référence. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre la purification par chromatographie liquide haute pression (HPLC) du peptide naturel CGA1-76 de bovin (SEQ ID N 1). Les peptides sont isolés selon la technique décrite dans l'exemple 1. Le système de solvant utilisé comprend de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'eau (solvant A) et de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'acétonitrile (solvant B). L'absorption est mesurée à 214 nm et l'élution est réalisée selon le gradient linéaire représenté sur l'échelle de droite. La flèche indique la fraction contenant la vasostatine 1 de bovin. - la figure 2 illustre l'analyse en spectrométrie de masse selon la technique MALDI-TOF (mesure du temps de vol après désorption laser assistée par matrice) des peptides dérivés des fragments N-terminaux. (A) CGA1-76 de bovin ; (B) recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5) ; (C) peptide synthétique CGA7-57 de rat (SEQ ID N 6), - la figure 3 illustre l'activité antifongique du peptide naturel vasostatine 1 de bovin (SEQ ID N 1), du recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5), du peptide synthétique CGA7-57 de rat (SEQ ID N 6) avec ou sans pont disulfure, du peptide synthétique CGA4,~bo de bovin (SEQ ID N 7) et du peptide synthétique CGA4,~,o de bovin (SEQ ID N 9). L'activité antifongique est mesurée selon la technique décrite dans l'exemple 2. MIC (jM) représente la concentration minimale efficace capable d'inhiber la croissance des champignons et des levures ; - signifie que le peptide est inactif à une concentration de 50 M ; NT signifie que le peptide n'a pas été testé sur cette souche. EXEMPLE 1: Matériel et méthodes utilisées pour la purification et l'identification des peptides 1. Purification du peptide naturel vasostatine 1 de bovin (SEQ ID N 1) Les granules de sécrétion sont isolés de la glande surrénale de bovin selon la technique décrite par Smith, A. D., et al. (1967) Biochem. J. 103,483-492. Les protéines solubles sont séparées après lyse des membranes et centrifugation, selon la technique décrite par Aunis, D., et al. (1977) J. Neurochem. 29,439-447. CGA1-76 est purifié par chromatographie liquide haute pression, sur une colonne Macherey Nagel Nucleosil 300-5C18 (4x250 mm ; des particules 5 m et taille des pores 100 nm) en utilisant le système Applied Biosystems HPLC 140 B. L'absorption est mesurée à 214 nm et le système de solvant utilisé comprend de l'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'eau (solvant A) et de l'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'acétonitrile (solvant B). L'élution est réalisée à une vitesse de 0,7 ml/min en utilisant successivement un gradient 0-30 % de B dans A pendant 15 minutes, puis un gradient 30-50 % pendant 40 minutes puis finalement un gradient 50-100 % pendant 10 minutes. Les fractions sont collectées manuellement et évaporées à sec. 2. Synthèse dupeptide recombinant humain VS-1 (SE ID N 5) : Le peptide recombinant humain VS-1 est cloné, purifié et caractérisé selon la technique décrite par Corti, A., et al. (1997) Eur. J Biochem. 248,692-699. Ce peptide correspond à la séquence CGA1-78 humaine et comporte le tripeptide STA à l'extrêmité N-terminale. 3. Synthèse peptidique : a) mode opératoire ~général : Les peptides synthétiques sont préparés selon la technique décrite par Atherton, E. et al. (1989) in "Solid phase peptide synthesis : a practical approach." (Rickwood, D and Hames, B. D., eds) IRL press en utilisant un synthétiseur de peptides ABI 431A (Applied Biosystems). b) formation des ponts disulfiires : La formation des ponts disulfures entre les résidus cystéine est obtenue en présence de N-éthyl-diisopropylamine à pH 8,5, en laissant le mélange réactionnel pendant 24 heures à l'air libre, jusqu'à ce que la réaction, mesurée selon le test d'Ellman décrit par Deakin, H. et al. (1963) Biochem. J. 89,296-304 soit complète. c) ablation des résidus cystéine : L'alkylation (S-pyridylation) des résidus cystéine est obtenue en traitant les peptides par de la 4-vinylpyridine, selon la technique décrite par Tarr, G. E. (1986) in "Methods of protein microcharacterization" 162, Shively, J. E. ed (Humana press, Clifton, NJ), après réduction du pont disulfure en présence de guanidine-HCl 8 M, dans du tampon Tris-HCl à pH 8,5 contenant de l'EDTA 4 mM suivi d'une élimination des réactifs en excès, par chromatographie liquide haute pression avec un gradient tel que celui décrit dans l'exemple 1 paragraphe 1. d) oxydation des peptides : Pour réaliser l'oxydation de la vasostatine I de bovin et celle du peptide recombinant humain VS-1, un agent oxydant est préparé par addition d'acide formique à du peroxyde d'hydrogène à 30 % (v/v ; 9/1) suivie d'une agitation du mélange pendant 45 minutes à la température ambiante. L'acide performique résultant est refroidi sur de la glace à 0 C. 100 l d'agent oxydé ainsi préparé, sont ajoutés à la protéine à traiter. Le milieu réactionnel est laissé pendant 30 minutes à 0 C, dilué par 500 l d'eau, évaporé et concentré à sec. Cette étape de lavage est réalisée trois fois de suite, afin d'éliminer l'excès des réactifs. 4. Analyse des séquences : Les séquences des peptides sont déterminées par dégradation d'Edman à l'aide d'un séquenceur Applied Biosystems 473A. Les échantillons préalablement purifiés par chromatographie liquide haute pression sont analysés selon la technique décrite par Metz-Boutigue, M. H., et al.. (1993) Eur. J. Biochem. 217, 247-257. 5. Analyse par spectrométrie de masse : Elle est réalisée selon la technique MALDI-TOF (mesure du temps de vol après désorption laser assistée par matrice) telle que décrite par Vorm, O. et al. (1994) J. Am. Soc. Mass. Spec. 5,955-958 et Vorm, O. et al. (1994) Anal. Chem. 66, 3281-3287, en utilisant un spectrographe de masse Bruker BIFLEX TM. EXEMPLE 2: Matériel et méthodes utilisés pour mesurer l'activité antifongique 1. Culture des champignons filamenteux : Ils sont cultivés sur un milieu de culture comprenant un milieu à cinq céréales et les spores sont collectés selon la technique décrite par Broekaert, W. F. et al. (1990) FEMSMicrobiol. Lett. 69, 55-60. Les souches suivantes ont été utilisées : Alternaria brassicola, (MUCL 20297 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Trichoderma viride, (MUCL 29724 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Nectria haematococca, (160.2.2), Fusarium culmorum (MUCL 30162), Fusarium oxyporum, (MUCL 909 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Botrytis cinerea (MUCL 30158 déposée à la Mycothèque de l'Université catholique de Louvain), Neurospora crassa (CBS 327-54 déposée au Centraalbureau voor Schimmelcultures) et Aspergillus fumigatus. 2. Cultures de levures : Les cellules sont précultivées sur un milieu de Sabouraud. Les souches suivantes ont été utilisées : Saccharomyces cerevisiae (TGY481 pJM600) et Candida albicans. 3. Mesure de l'activité antifongique : Les spores sont mis en suspension de manière à avoir une concentration finale de 104 spores/ml, dans un milieu de culture contenant du dextrose de pomme de terre. Les levures sont suspendues dans un milieu de Sabouraud, à une concentration telle qu'on obtienne une absorption de 0,001 à 620 nm. On ajoute à ces milieux de culture de la tétracycline (10 g/ml) et de la céfotaxime (0,1 g/ml). La croissance des champignons est évaluée après un temps d'incubation approprié, spécifique de chaque champignon (24 à 48 heures à 30 C). Des fractions aliquotes de 20 l des peptides purifiés sont incubées sur des plaques de microtitration avec 80 l de spores de champignons ou des levures. Les concentrations finales en peptides sont comprises entre 1 pM et 10 M. EXEMPLE 3: Caractérisation structurale et biologique de l'activité antifongique de la vasostatine 1 (SEQ ID N 1) 1. Purification et caractérisation de la vasostatine 1 (SEO ID N 1) a) Purification Après séparation par chromatographie liquide haute pression selon la technique décrite dans l'exemple 1, on observe un pic élué par un solvant contenant 47 % de solvant B (figure 1). b) caractérisation --.Jj.9.g Le séquençage du peptide contenu dans cette fraction selon la technique décrite dans l'exemple 1, révèle une séquence unique qui correspond à la séquence N-terminale de la chromogranine A de bovin. L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 3 pics correspondant à des masses de 8583,9 Da, 4289,8 Da et 2860,3 Da (Figure 2A). Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide CGA1-76 égale à 8584,9 Da. 2. Activité antifongique de la vasostatine 1 (SEO ID N 1) Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) sffét sur les champignons Slamenteux : Ce peptide inhibe la croissance de Nectria haematococca et de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 1 M ; il inhibe la croissance de Neurospora crassa, Alternaria brassicola et de Trichoderma viride avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Aspergillus fumigatus avec une concentration active minimale de 5 M et il inhibe la croissance de Fusarium oxyporum avec une concentration active minimale de 10 M. Il est sans effet sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b) effet sur les levures : Ce peptide inhibe la croissance de Saccharomyces cerevisiae et de Candida albicans avec une concentration active minimale de 10 M. 3) Activité antifongique de la forme alkylée (S-pvridvlatedform) de la vasostatine 1 (SEO ID N 1) Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 3 M. Ces résultats montrent que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. 4) Activité antifongique de la forme oxydée de la vasostatine 1 (SEO ID N 1) Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. Après oxydation par l'acide performique selon la technique décrite dans l'exemple 1, tous les résidus cystéine et les résidus méthionine sont oxydés, ainsi que le révèlent les analyses de spectrométrie de masse. Ce peptide oxydé inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 30 M. Ces résultats montrent que l'oxydation par l'acide performique induit une diminution significative de l'activité antifongique. EXEMPLE 4: Caractérisation structurale et biologique de l'activité antifongique du peptide recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5) 1. Caractérisation du peptide recombinant humain VS-1 (SEQ ID N 5) L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 3 pics correspondant à des masses de 9069,7 Da, 4536,1 Da et 3024,1 Da (Figure 2B). Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide égale à 9069,5 Da. 2. Activité antifongique du peptide recombinant humain VS-1 Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux : Ce peptide inhibe la croissance de Alternaria brassicola avec une concentration active minimale de 1 M ; il inhibe la croissance de Nectria haematococca avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 5 M et il inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 10 M. Il est sans effet sur Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b effet sur les levures : b) ff.L.l~J!.- : Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. 3) Activité antifongique de la forme alkylée (S-pyrLdylated form) du peptide recombinant humain VS-1 Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 5 M. Ces résultats confirment que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. 3) Activité antifongique de la forme oxydée du peptide recombinant humain VS-1 : Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. Ce peptide oxydé inhibe la croissance de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 20 M. Ces résultats confirment que l'oxydation par l'acide performique diminue l' activité antifongique. EXEMPLE 5: Caractérisation structurale et biologique de l'activité antifongique du peptide synthétique CGA,~5, de rat (SEQ ID N 6) 1. Caractérisation du peptide synthétique CGA,~S de rat L'analyse de ce fragment selon la technique MALDI-TOF décrite dans l'exemple 1, permet de définir 2 pics correspondant à des masses de 5654,4 Da, et de 2827,1 Da (Figure 2C). Ces résultats sont en accord avec la masse théorique du peptide égale à 5655,7 Da. 2. Activité antifongique du peptide synthétique CGA7-57 de rat avant un pont disulfure Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux : Ce peptide inhibe la croissance de Nectria haematococca et de Neurospora crassa avec une concentration active minimale de 20 M ; il inhibe la croissance de Alternaria brassicola, Fusarium culmorum et de Trichoderma viride avec une concentration active minimale de 30 M. Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l' expérience. b) effet sur les levures : Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. 3) Activité antifongique de la forme alkylée du peptide synthétique CGA7-57 derat Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) effet sur les champignons filamenteux : Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa et de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 50 M. Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Alternaria brassicola, Trichoderma viride, Nectria haematococca, Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. Ces résultats confirment que la présence du pont disulfure n'est pas obligatoire pour l'activité antifongique. b) effet sur les~levures : Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. EXEMPLE 6: Mesure de l'activité antifongique du peptide CGA47-60 Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) .ff!.rJ~hp.i.Ic1:JU! : Ce peptide inhibe la croissance de Neurospora crassa, de Alternaria brassicola, et de Nectria haematococca avec une concentration active minimale de 7 M et il inhibe la croissance de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 20 M. Il est sans effet sur Aspergillus fumigatus, Trichoderma viride, , Fusarium oxyporum et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b) effet sur les levures : Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. EXEMPLE 7: Mesure de l'activité antifongique du peptide CGA41-70 Les résultats sont rassemblés dans la figure 3. a) .ff!.rJ.hp.~l1.fJ!!! : Ce peptide inhibe la croissance Nectria haematococca et de Fusarium culmorum avec une concentration active minimale de 3 M ; il inhibe la croissance de Alternaria brassicola avec une concentration active minimale de 5 M ; il inhibe la croissance de Neurospora crassa, avec une concentration active minimale de 7 M ; il inhibe la croissance de Aspergillus fumigatus, avec une concentration active minimale de 10 M et il inhibe la croissance de Fusarium oxyporum avec une concentration active minimale de 30 M. Il est sans effet sur Trichoderma viride et sur Botrytis cinerea dans les conditions de l'expérience. b effet sur les levures : ) les levures Ce peptide n'inhibe ni la croissance de Saccharomyces cerevisiae, ni celle de Candida albicans dans les conditions de l'expérience. L'ensemble de ces résultats confirment que les peptides selon l'invention pourraient être utiles comme antifongiques dans le traitement ou la prévention de mycoses profondes ou superficielles causées par des champignons filamenteux et des levures. REVENDICATIONS 1. Peptides représentant un fragment de la séquence de la vasostatine I et répondant : @ - soit à la séquence de formule (I) a-(SEQ ID N 14)-b (I) dans laquelle a est soit nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 15) de formule XiLPVNSPMX2KGDTX3VMKCX4EVISDX5LSKPSPMPVSX6ECX7ETLX8GDE où X1 est nul ou représente une séquence comprenant de 1 à 10 acides aminés, X2 représente N ou T, X3 représente E ou K, X4 représente IV ou VL, X5 représente T ou S, X6 représente K, P ou Q, X7 représente F ou L, X8 représente R ou Q, et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, SEQ ID N 14 représente RX9LSILRHQNLLKE, où X9 représente I ou V, et b soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 16) de formule LQDLALQGAKERXioXuQQX12 où Xio représente T, A ou S, Xii représente H ou Q et X12 est nul ou représente KK ou polyQ, pourvu que a-(SEQ ID N 14) -b soit différent de SEQ ID N 1, de SEQ ID N 2, de SEQ ID N 3, de SEQ ID N 4 et de SEQ ID N 5, - soit à la séquence de formule (II) : c-(SEQ ID N 17)-d (II) dans laquelle, c soit est nul, soit représente la séquence (SEQ ID N 18) de formule XILPVNSPMX2KGDTX3 où XI, X2 et X3 sont tels que définis précédemment, SEQ ID N 17 représente VMKCX4EVISDX5LSKPSPMPVSX6ECX7E, où X4, X5, X6 et X7 sont tels que définis précédemment et où les deux résidus cystéine (C) sont éventuellement reliés par un pont disulfure, et d est soit nul, soit représente la SEQ ID N 19 de formule TLXsGDERX9LSILRHQNLLKELQDLALQGAKERXIOXIlQQX12 où X8e X9, X105 X11et X12 sont tels que définis précédemment, pourvu que c-(SEQ ID N 17) -d soit différent de SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6, ainsi que leurs équivalents fonctionnels. 2. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des aminoacides non oxydés. 3. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, et SEQ ID N 13. '4. Utilisation des peptides dérivés de la vasostatine I selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament utile comme antifongique. 5. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide dérivé de la vasostatine I selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, associé à au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 6. Utilisation d'un peptide dont la séquence est choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6, pour la préparation d'un médicament utile comme antifongique. 7. Acides nucléiques, caractérisés en ce qu'ils codent pour les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Anticorps immunospécifiques, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre les peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 9. Anticorps selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'ils sont polyclonaux ou monoclonaux. 10. Réactif pour la détection d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps antipeptidique selon la revendication 8. 11. Réactif selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est constitué d'anticorps polyclonaux. 12. Procédé de détection d'un peptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on met en contact l'échantillon biologique avec un réactif conforme à l'une quelconque des revendications 10 et 11et une étape dans laquelle on détecte une interaction spécifique entre ledit réactif et une ou plusieurs des séquences peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans ledit l'échantillon. 13. Trousse ou coffret ou ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en #uvre de ladite détection, des doses appropriées d'un ou plusieurs anticorps selon l'une quelconque des revendications 8 et 9 et un échantillon biologique de référence.