Brevet FR2789074A1 — publié le 20000804

i PRODUITS DE DEGRADATION DE CAROTENOIDES A ACTION ANTITUMORALE L'invention est relative à des composés à activité antitumorale, ces composés étant des produits de dégradation de caroténoïdes. La découverte de nouvelles molécules présentant des potentialités thérapeutiques est l'un des axes de recherche de l'industrie pharmaceutique. Dans ce but, l'étude de substances naturelles d'origine végétale constitue une stratégie de choix. En effet, moins de 10 % des espèces de la flore terrestre ont été étudiées à ce jour et fournissent 25 à 50 % des molécules utilisées dans les médicaments actuels. Dans le domaine marin, la proportion de substances nouvelles ayant une activité biologique potentiellement intéressante serait au moins 100 fois supérieure à celle rencontrée chez les végétaux terrestres (Biofutur, octobre 1995, 24-28). Ainsi, plus de 6000 nouveaux métabolites marins ont été identifiés. Le nombre de ceux présentant des potentialités thérapeutiques (molécules antitumorales, antibiotiques, antifongiques, antivirales, anti-inflammatoires ou immunomodulatrices) ne cesse de croître. Par exemple, entre 1987 et 1993, le nombre de composés marins à activité cytotoxique décrits dans la littérature est passé de 185 à 434 (Munro et al., Bioorganic. Marine Chemistry, 1, 93-176, 1987; Schmitz et al., Mar. Biotechnol., 1, 197-308, 1993). Des travaux précédents de l'équipe des Inventeurs ont démontré l'effet antiprolifératif d'un extrait organique de la diatomée Skeletonema costatum (Bergé et al., Anticancer Research, 17, 2115-2120, 1997). Les Inventeurs sont maintenant parvenus à identifier et à purifier des constituants actifs de cet extrait. Ces composés sont des produits de dégradation de caroténoides (pigments rouges, orangés ou jaunes comprenant les carotènes et les xanthophylles). La présente invention a pour objet un composé de formule générale (I) R2 Ri1 R3 R4 (0) R8 R5 R7 R6 dans laquelle: - R1 représente un hydroxyle, un groupe RO-, un groupe RCOO- ou un groupe RCONH-, R étant un groupe alkyle en Cl à C6; R2 et R8 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C6, un hydroxyle ou un groupe RO-, R ayant la même signification que ci-dessus; - R3 représente un groupe alkyle en Ci à C6; - R6 et R7 représentent chacun un groupe alkyle en C1 à C6, identique ou différent, ou forment ensemble, avec le carbone du cycle auquel ils sont rattachés, un groupe carbonyle; - R4 représente un hydroxyle ou un groupe RO-, R ayant la même signification que ci-dessus; et - R5 représente un chaine carbonée linéaire en C3 à C6 comprenant au moins une insaturation et substituée par un ou plusieurs groupements sélectionnés dans le groupe constitué par les hydroxyles et les groupes RO-, R ayant la même signification que ci-dessus. On entend par " groupes alkyles en C1 à C6 " des groupes saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, par exemple et de façon non limitative un méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, tertiobutyle, pentyle, hexyle, vinyle, allyle, butènyle, pentènyle, éthynyle, propynyle ou butynyle. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, les substituants du composé de formule générale (I) sont les suivants: - R1 représente un groupe RO-, un groupe RCOO- ou un groupe RCONH-, R étant un groupe alkyle en C1 à C4; - R2 et R8 représentent chacun un atome d'hydrogène; - R3 représente un groupe alkyle en Ci à C4; - R6 et R7 représentent chacun un groupe alkyle en C1 à C4, identique ou différent, ou forment ensemble, avec le carbone du cycle auquel ils sont rattachés, un groupe carbonyle; - R4 représente un hydroxyle; et - R5 représente une chaine carbonée linéaire en C3 à C6 comprenant au moins une insaturation et substituée par un ou plusieurs hydroxyles. On entend par groupe alkyle en C1 à C4 des groupes saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, par exemple, et de façon non limitative, un méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tertiobutyle, vinyle, allyle, butènyle, éthynyle, propynyle ou butynyle. Selon une disposition préférée de la présente invention, le composé de formule générale (I) telle que décrit précédemment est le 4-(2-hydroxy-4-acétoxy-2,6,6- triméthylcyclohexylidène)-2,4-dihydroxy-2-butène de formule (I') ci-dessous: Me CH3COO OH Me MeOH OH La présente invention a, en outre, pour objet un composé de formule générale (I) telle que décrite ci- dessus pour l'utilisation comme médicament. Il s'agit avantageusement d'une utilisation en tant que médicament à activité antiproliférative et/ou antitumorale. Un tel médicament à activité antiproliférative et/ou antitumorale est par exemple destiné à être utilisé pour le traitement de désordres de la prolifération cellulaire tels que des tumeurs bénignes ou cancéreuses, ou de maladies telles que les cataractes secondaires ou les glaucomes à angle ouvert. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique pour le traitement des tumeurs, caractérisé en ce qu'elle comprend, en tant que principe actif, au moins un composé tel que défini ci- dessus, et éventuellement des excipients ou additifs pris parmi ceux dont on se sert classiquement en pharmacie. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite composition pharmaceutique est formulée pour l'administration par voie entérale, telle que la voie orale (composition se présentant sous forme de comprimés, de gélules, de suspension buvable...), par voie parentérale (telle que par injection intra- musculaire, intra-veineuse ou sous-cutanée) ou par toute autre voie, par exemple la voie topique (composition formulée sous forme de patch ou autre). La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation des composés conformes à l'invention et de démonstration de leur activité antitumorale, ainsi qu'à la figure 1 annexée, qui représente la croissance de cellules NSCLC- N6 en absence (courbe - * -) ou en présence d'un composé selon l'invention à différentes concentrations (courbe - M -: pg/ml; courbe - A -: 120 pg/ml; courbe - X -: pg/ml). Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: OBTENTION DU COMPOSÉ DE FORMULE (I'). a) Préparation d'un extrait de Skeletonema costatum. La production de Skeletonema costatum est réalisée sur eaux salées, dans la station IFREMER de Bouin (Vendée, France). La microalgue Skeletonema costatum est récupérée du milieu de culture par centrifugation à une faible vitesse, lors de sa phase de croissance exponentielle. Le culot d'algues obtenu est immédiatement lyophilisé avant d'être mélangé à de l'éthanol à 95 (6 ml/g de poids sec d'algue), pendant 15 minutes. L'extrait alcoolique est ensuite centrifugé à 4500 g pendant 20 minutes pour éliminer les matériaux cellulaires. Le culot résultant est de nouveau extrait 3 fois à l'éthanol selon le procédé décrit ci-dessus. Les extraits alcooliques sont réunis, évaporés sous vide à basse température ( suspendue dans de l'eau distillée (2 ml/g de poudre). L'extrait final de Skeletonema costatum est ensuite obtenu après 4 étapes d'extraction au dichlorométhane (2 ml/g de poudre) et une évaporation sous vide à basse température ( b) Obtention du composé de formule (I'). L'extrait de Skeletonema costatum obtenu selon le protocole décrit ci-dessus est purifié par chromatographie de haute performance (HPLC), sur une colonne semi-préparative Vydac-C18 de 7,8 x 300 mm. Le débit d'élution est de 5 ml/min et l'élution s'effectue grâce à un gradient linéaire d'un mélange H20/MeCN de 75/25 à 55/45, pendant 40 minutes. Le composé (I'), dont le temps de rétention est de 21 minutes, est analysé par RMN du proton et du carbone 13. L'analyse des spectres RMN permet d'attribuer les déplacements chimiques suivants aux différents atomes d'hydrogène et de carbone (tableau 1): CH3COO OH 2 6 8 10 11 12 OH OH Tableau 1 position 8H (ppm) bc (ppm) 1 2,03-1,5 46,2 2 5,41 69,0 3 2,28-1,6 46,1 4 36,9 119,7 6 72,3 7 211,0 8 5,89 101,3 9 200,0 2,23 26,7 11 1,46 29,3 12 1,19 32,0 13 1,42 30,7 CH3CO 2,07 26,7 1 CH3CO __ _ _ _ _I 172,3 EXEMPLE 2: ACTIVITÉ ANTITUMORALE IN VITRO DU COMPOSÉ DE FORMULE (I') SUR LA LIGNÉE CELLULAIRE NSCLC-N6. a) Lignée NSCLC-N6. La NSCLC-N6 est une lignée chimiorésistante mais très proche des cancers humains. Cette lignée est issue de la mise en culture in vitro d'une tumeur primitive d'un carcinome bronchopulmonaire "non-à- petites-cellules" d'origine humaine. L'examen histologique a révélé un carcinome épidermoide modérément différencié, rarement kératinisé, classé T2NoMo (Roussakis et al., Anticancer. Res., 11, 2239-2244, 1991): T2: tumeur > 3 cm à plus de 2 cm de la carène, ou atteinte de la plèvre viscérale, ou atélectasie inférieure à 1 poumon. No: pas d'adénopathie envahie histologiquement. Mo: absence de métastase. La lignée NSCLC-N6 est cultivée dans un milieu de culture RPMI 1640 (Intermed, France) complété par 2 mM de glutamine, 100 IU de pénicilline.ml-1, 100 pg de streptomycine.ml-1 et 5 % de sérum de veau foetal. Les cellules, à raison de 4.104.ml-1, sont cultivées en atmosphère humide enrichie à 5 % (V/V) de CO2 et à 37 C. Les cellules sont repiquées à confluence deux fois par semaine. b) Tests d'exposition continue au principe actif. Les tests sont réalisés dans dans des plaques à 96 puits dans lesquelles le milieu de culture et le produit à tester sont distribués, avant l'incorporation de la suspension cellulaire (2 x 105 cellules de NSCLC- N6/ml). Les plaques sont ensuite placées dans l'incubateur (37 C, 5 % (V/V) de CO2 dans l'air humide) pendant 0, 24, 48 et 72 heures. La croissance des cellules est mesurée par dosage spectrophotométrique à l'aide d'un système automatisé (spectrophotomètre ELISA Titertek Multiskan MKII). Ce dosage est basé sur la réduction du sel de tétrazolium M.T.T. (bromure de 1-(4,5-diméthylthiazol-2- yl)-3,5- diphényl-tétrazolium, Sigma, France) par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en cristaux de formazan. La dissolution des cristaux dans l'isopropanol acide donne une coloration proportionnelle à l'activité mitochondriale. Après 0, 24, 48 et 72 heures d'incubation, pl de solution de M.T.T. (4 mg.ml-1 dans le tampon Phosphate Buffered Saline P.B.S) sont déposés dans chaque puits (blanc inclus). La réduction du sel de tétrazolium est révélée 4 heures plus tard en ajoutant à chaque puits pl d'isopropanol acide (HCl 0,04N). L'acide permet le virage du rouge de phénol utilisé comme indicateur coloré dans le milieu de culture: à pH neutre, celui-ci est susceptible d'absorber à la longueur d'onde utilisée. L'agitation vigoureuse de la solution dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux assure l'homogénéité de la coloration. La lecture au spectrophotomètre permet alors l'obtention des densités optiques (D.O.) de chaque puits à 570 nm. La D.O. moyenne du témoin aux différents temps, ainsi que la D.O. moyenne correspondant à chacun des produits à tester sont calculées. La valeur de la D.O. étant proportionnelle au nombre de cellules vivantes, le pourcentage d'inhibition de croissance au temps t par rapport au témoin est calculé à l'aide de la formule suivante: % inhibition = [D.O. (témoin t) - D.O. (cellules traitées)] / [D.O. (témoin t) - D.O. (témoin 0 h)]. La concentration du produit qui provoque 50 % d'inhibition de croissance par rapport au témoin est extrapolée à partir de valeurs expérimentales grâce à la relation: % inhibition = f(log C), C étant la concentration du produit à tester. L'extrapolation est possible car la relation est linéaire. c) Résultats. La concentration du composé (I') qui provoque % d'inhibition de croissance des cellules IC50 est de 81 pg/ml après 72 heures de traitement. La figure 1 représente la croissance des cellules NSCLC-N6 en absence (courbe - * -) ou en présence du composé (I') à différentes concentrations (courbe - -: 80 pg/ml; courbe - A -: 120 pg/ml; courbe - X -: 160 pg/ml), à 0, 24, 48 et 72 heures. Le temps est représenté en abscisse et le pourcentage de croissance cellulaire figure en ordonnée. Il ressort ainsi que l'action antiproliférative de cellules dépend de la dose en principe actif: la croissance cellulaire est d'autant plus faible que la dose en principe actif est élevée. Les résultats ci-dessus montrent que le composé (I') constitue bien un principe actif de l'extrait Skeletonema costatum, responsable d'une activité antiproliférative. REVENDICATIONS 1. Composé de formule générale (I) R2 R1R3 R4 (I) R8 R5 R7 R6 dans laquelle: - R1 représente un hydroxyle, un groupe RO-, un groupe RCOO- ou un groupe RCONH-, R étant un groupe alkyle en C1 à C6; R2 et R8 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C6, un hydroxyle ou un groupe RO-, R ayant la même signification que ci-dessus; - R3 représente un groupe alkyle en C1 à C6; - R6 et R7 représentent chacun un groupe alkyle en C1 à C6, identique ou différent, ou forment ensemble, avec le carbone du cycle auquel ils sont rattachés, un groupe carbonyle; - R4 représente un hydroxyle ou un groupe RO-, R ayant la même signification que ci-dessus; et - R5 représente un chaine carbonée linéaire en C3 à C6 comprenant au moins une insaturation et substituée par un ou plusieurs groupements sélectionnés dans le groupe constitué par les hydroxyles et les groupes RO-, R ayant la même signification que ci-dessus. 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel: - R1 représente un groupe RO-, un groupe RCOO- ou un groupe RCONH-, R étant un groupe alkyle en C1 à C4; - R2 et R8 représentent chacun un atome d'hydrogène; - R3 représente un groupe alkyle en C1 à C4; - R6 et R7 représentent chacun un groupe alkyle en C1 à C4, identique ou différent, ou forment ensemble, avec le carbone du cycle auquel ils sont rattachés, un groupe carbonyle; - R4 représente un hydroxyle; et - R5 représente une chaine carbonée linéaire en C3 à C6 comprenant au moins une insaturation et substituée par un ou plusieurs hydroxyles. 3. Composé selon la revendication 1 ou la revendication 2 répondant à la formule (I') ci-dessous: Me CH3COO OH MeMe OH OH 4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'utilisation comme médicament. 5. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'un médicament à activité antitumorale. 6. Composition pharmaceutique pour le traitement des tumeurs, caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant que principe actif, au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.