Brevet FR2796280A1 — publié le 20010119

La présente invention concerne l'utilisation d'un peptide, le peptide intestinal vasoactif, généralement nommé VIP (vasoactive intestinal peptide) pour induire la maturation des cellules dendritiques et ainsi favoriser le développement d'une réponse immune spécifique. Dans la suite de la présente description, l'expression VIP sera utilisée pour nommer le peptide intestinal vasoactif. Le VIP est un peptide de 28 acides aminés largement distribué dans le système nerveux périphérique et central (Goetzl EJ et al, Ann N Y Acad Sci (1998) 840, 540 & Calvo JR et al, Adv Neurosci (1996) 6, 39). Des fibres nerveuses contenant du VIP ont été mises en évidence dans les organes lymphoïdes primaires et secondaires, les vaisseaux, les tractus respiratoires et intestinaux ainsi qu'au niveau de la peau. Le VIP est libéré à des concentrations fonctionnelles dans de nombreuses réponses immune et inflammatoire. Les concentrations de VIP sont augmentées dans les sérums de patients atteints de choc septique, et dans les sécrétions nasales et dans le lavage bronchoalvéolaire de sujet allergique après contact avec un allergène Des taux élevés de VIP sont également trouvés dans la peau de patients atteints de dermatite atopique ou de psoriasis comparativement à des sujets sains. Le VIP, agit en utilisant deux types de récepteurs couplés à des protéines G (VIP-RI et VIP-RII) exprimées sur les cellules du système immunitaire (Harmar AJ et al, Pharmacological Reviews (1998) 50,265). Le VIP est un puissant vasodilatateur qui augmente la perméabilité venulecapillaire et donc participe au processus inflammatoire Le VIP module aussi la réponse immune et en particulier le recrutement et l'activation des leucocytes Le VIP module la production des lymphokines par les lymphocytes T (Ganea D et al, J Neurosci (1993) 48,59), inhibe la production d'IL-6, d'IL-12 et de TNFa par les monocytes et macrophages induite par le lipopolysaccharide (LPS) (Delgado M et al, J leukocyte Biol (1998) 63,591 ; Xin Z et al J Neuroimmunol (1998) 89, 206 ; Dewit D et al Immunol Lett (1998) 60,57) et protège des souris d'un choc induit par le LPS en inhibant la production de TNFa et d'IL-6 (Delgado M et al J Immunol (1999) 162,1200). Le VIP module également la production d'immunoglobulines par les lymphocytes B (Kimata H et al J Immunol (1993) 150,4630), induit la dégranulation des mastocytes et est mitogénique pour le tissu conjonctif, les cellules épithéliales et les kératinocytes (Pincelli C et al, J Invest Dermatol (1997) 98, 421). Dès 1996, Bellinger et al. dans The significance of VIP in immunomodulation (Advances In Neuroimmunology (Adv. Neuroimmunol), 1996, vol : 6(1), p. 5-27) note qu'il découle de plusieurs études que le VIP a une influence sur les fonctions immunitaires mais que son moyen d'action n'est pas expliqué De par ces propriétés, le VIP et les agonistes de ses récepteurs sont proposés en tant que vasodilatateurs mais également dans l'allergie et bronchospasme en tant que bronchodilatateurs (WO 9735561 & JP 56128721) Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse lymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156,25 & Sella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9,10). Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoïdes. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis l'intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les organes tels que le poumon, le foie, l'intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des cellules dendritiques de molécules impliquées dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe I/II), la production de cytokines (telles que TNFa et IL-12) et l'induction de l'expression en surface de molécule telle que CD83 (pour les cellules humaines) Ces cellules dendritiques matures présentent les antigènes aux lymphocytes T et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules. Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer l'antigène. Dans les zones thymo-dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétés immunostimulatrices et vont donc activer de façon très efficace les lymphocytes T naïfs circulants. Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence que le VIP induit la maturation des cellules dendritiques humaines permettant ainsi le développement d'une réponse lymphocytaire T spécifique La présente invention concerne l'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP, les agonistes des récepteurs du VIP, les antagonistes des récepteurs du VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à moduler la maturation des cellules dendritiques Ce médicament peut être appliqué au niveau de la peau notamment par voie cutanée, sous-cutanée, transdermique, intra-épidermique ou au niveau des muqueuses, il agit alors de façon systémique par la maturation des cellules dendritiques et localement par la maturation des cellules de Langerhans. Ce médicament peut servir à favoriser la génération et la maturation des cellules dendritiques in vitro après mise en contact avec un agent biologique, les cellules matures étant ensuite réinjectées in vivo. Les cellules dendritiques sont modifiées de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux Ledit médicament pourra être mis en #uvre in vitro, afin de favoriser la maturation des cellules dendritiques avant de les réinjecter, ou ce médicament pourra être injecté en même temps que les cellules dendritiques Cet agent biologique est alors choisi dans le groupe formé par l'acide nucléique, les protéines, les lipides, les lipopeptides, les polysaccharides. Une utilisation de ce médicament est le traitement ou la prévention du psoriasis La maturation des cellules dendritiques a pour conséquence d'amplifier le développement d'une réponse immune spécifique. Il a été mis en évidence que le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP peuvent être utilisés pour amplifier le développement d'une réponse immune spécifique alors que l'utilisation des antagonistes des récepteurs du VIP peuvent être utilisés pour empêcher l'initiation ou ralentir le développement d'une réponse immune spécifique indésirable. Différentes utilisations du VIP et des agonistes des récepteurs du VIP ont été envisagées, ces utilisations sont présentées ci-dessous. L'utilisation de VIP et des agonistes des récepteurs du VIP en tant qu'adjuvant ou immunostimulant en vaccinologie dans les vaccins anti- infectieux et anti-cancereux et ce en combinaison avec des antigènes vaccinants et/ou d'autres composés qui peuvent être une bactérie, un virus, une levure, un champignon afin de produire des vaccins thérapeutiques. L'administration de VIP en même temps que l'antigène permettra d'augmenter la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques et par là même l'efficacité du vaccin. L'utilisation de VIP et des agonistes des récepteurs du VIP en tant qu'immunostimulant dans le traitement des immunodéficiences congénitales acquises ou d'origine pathologique. Il peut s'agir notamment du traitement des déficits immunitaires congénitaux ou acquis, mais également des traitements chez des patients ayant une réponse immune absente ou déficiente vis-à-vis par exemple d'une tumeur ou d'un pathogène. Le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP pourront être utilisés notamment pour le traitement : - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associées au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus : par exemple le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasites et levures), - des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, par exemple. Dans les vaccins anti-cancéreux et anti-infectieux en particulier, il est maintenant proposé en immunothérapie cellulaire de générer in vitro des cellules dendritiques autologues, d'y introduire un antigène tumoral et de les réinjecter L'exposition des cellules dendritiques in vitro à la molécule VIP ou à des agonistes des récepteurs à VIP permettra d'augmenter la maturation des cellules dendritiques et donc d'augmenter l'efficacité du vaccin. Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique Ce médicament peut être un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale -comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le paraifluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par est une levure ou un parasite. La présente invention est encore l'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particulièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabncation d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les kératinomes et les carcinomes. En effet, dans les cancers de la peau tels que les mélanomes et les kératinomes, les cellules cancéreuses sont en contact direct avec les cellules de Langerhans, situées dans l'épiderme, l'utilisation selon la présente invention par application cutanée permet d'agir directement, localement sur les cellules de Langerhans. Un avantage de la présente invention est que l'association VIP (ou agoniste des récepteurs du VIP ou antagoniste des récepteurs du VIP) agent biologique peut se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhésive : emplâtre, patch . Cependant, le traitement de ces cancers, peut aussi être envisagé en injectant des cellules dendritiques autologues, et notamment des cellules de Langerhans autologues qui ont été modifiées afin d'exprimer des antigènes tumoraux. La maturation des cellules dendritiques sera assurée par le VIP et ses analogues. L'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP avec au moins un agent biologique associé au TNF a peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T. Par conséquent, la présente invention couvre aussi l'utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP avec au moins un agent biologique qui est un agent biologique tumoral pour la fabrication d'un médicament pour favoriser une réponse immune spécifique anti-tumorale. Les antagonistes des récepteurs du VIP seront utilisables pour prévenir le développement d'une réponse immune spécifique indésirable vis- à-vis d'un antigène endogène ou exogène. Les antagonistes des récepteurs du VIP pourront notamment être utilisés par exemple dans les maladies autoimmunes (type arthrite rhumatoide et diabète de type 1) et les pathologies d'origine allergique (type asthme allergique et dermatite atopique) L'utilisation des molécules antagonistes des récepteurs du VIP pourra se faire par différentes voies d'introduction en fonction de la voie d'entrée de l'antigène (exogène) ou de son site de production (endogène) et ceci afin d'agir localement en prévenant le développement d'une réponse immune (en cosmétique dans le cas des dermatites atopiques et allergies cutanées). Par conséquent, la présente invention vise encore l'utilisation d'au moins un antagoniste des récepteurs du VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à diminuer l'intensité d'une réponse immune spécifique, notamment pour diminuer l'intensité d'une maladie autoimmune, par exemple de type arthrite rhumatoïde ou diabète de type 1 ou pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les pathologies d'origine allergique telles que l'asthme allergique et les dermatites atopiques. Les exemples qui suivent démontrent l'action du VIP sur les cellules dendritiques : le VIP induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur confère de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrices d'antigène. Exemple 1 Cet exemple démontre l'action du VIP en tant que modulateur de l'expression des molécules exprimées à la surface des cellules dendritiques humaines immatures par : - induction de l'expression de la molécule CD83 qui est un marqueur d'activation pour les cellules dendritiques humaines (figure 1), - induction de l'expression de la molécule CD86 qui est une puissante molécule de costimulation (tableau 1), - augmentation de l'expression de molécules impliquées dans l'activation du lymphocyte T telles que : CD40, CD54, CD80 et HLA-Dr (tableau 1). L'ensemble de ces modifications montrent que les cellules dendritiques traitées par le VIP acquièrent un phénotype de cellules dendritiques matures. Cet exemple montre que le VIP induit l'expression de la molécule CD83 dont l'expression est restreinte aux cellules dendritiques matures. Méthodologie - Génération in vitro de cellules dendritiques humaines immatures. Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=1,077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède). Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACSTM; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabricant Brièvement, les CMN sont incubées pendant 20 minutes à 4 C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal antiCD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n'est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%. Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (chauffage à 56 C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humain recombinant (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 6 jours de culture (37 C, 5% CO2 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie Brièvement, un aliquot de la suspension cellulaire est prélevé Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc) à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 l de tampon FACS Dans chaque puits est ajouté soit un anticorps antiCD1 a humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué (Becton Dickinson) révélé par un anticorps anti-souris marqué à la fluorescéine (Silenus, Hauworth, Australie) Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 l de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 (il de ce même tampon L'analyse de l'expression de CD1 a versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendritiques immatures caractérisées par une expression de la molécules CD1a (intensité moyenne de fluorescence (IMF>100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisées Les résultats de cette culture sont consignés à la figure 1 qui représente le pourcentage de cellules exprimant la molécule CD83 (dont l'expression est restreinte aux cellules dendritiques matures) en fonction de la concentration en VIP dans la culture. La courbe de la figure 1 montre que - la molécule CD83 n'est pas exprimée par les cellules dendritiques humaines immatures, - le VIP induit l'expression de la molécule CD83 de manière dépendante de la concentration (significative à 10-8 M et maximale à 10-6 M) sur une fraction des cellules dendritiques immatures (46% après 4 jours de stimulation). - Analyse par cytofluorométrie de l'expression des marqueurs de différenciation induite par le VIP sur des cellules dendritiques humaines. Les cellules dendritiques immatures de six jours présentées ci-dessus ont été collectées, lavées puis remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 l dans des plaques de culture 96 puits à fond plat (Costar, Cambridge, USA). Les cellules sont activées avec le VIP (Sigma, Saint Louis, USA). Après quatre jours de culture, l'expression des molécules CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 et HLA-Dr est évaluée par cytofluorométrie à l'aide des anticorps monoclonaux suivants : anticorps anti-CD40, anti-CD54, anti-CD80, anti-CD86 et anti-HLADr marqués à la fluorescéine (Becton Dickinson) et anticorps anti-CD83 révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Silenus, Hauworth, Australie). Les anticorps isotypiques contrôles utilisés proviennent de Becton Dickinson. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 l de tampon FACS. Dans chaque puits est ajouté un anticorps Après 20 minutes d'incubation à 4 C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 l de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 l de ce même tampon L'analyse de l'expression des marqueurs de surface est évaluée par FACS. Les résultats montrent que le VIP augmente l'expression des CD40, CD54, CD80 et HLA-DR sur les cellules dendritiques immatures et induit l'expression de CD83 sur une fraction des cellules dendritiques (tableau 1) Exemple 2: Le TNFa potentialise les effets du VIP sur les cellules dendritiques humaines Cet exemple montre que le TNFa, un médiateur proinflammatoire induisant la différentiation des cellules dendritiques, potentialise les effets du VIP sur l'activation et la différentiation des cellules dendritiques humaines Méthodologie : Des cellules dendritiques humaines immatures ont été générées comme décrit dans l'exemple 1. Les cellules dendritiques immatures ont été collectées, lavées puis remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 l dans des plaques de culture 96 puits à fond plat (Costar, Cabridge, USA) Les cellules sont activées avec le VIP (Sigma, Saint Louis, USA) en l'absence ou en présence de 0,2 ng/ml de TNFa humain recombinant (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni) ou de 10 ng/ml de lipopolysaccharide (LPS) (purifé à partir de la souche Escherichia coli isotype 0111:B4; Sigma). Après quatre jours de culture, l'expression des molécules CD40, CD54, CD80, CD83, CD86 et HLA-Dr est évaluée par cytofluorométrie à l'aide des anticorps monoclonaux suivants : anticorps anti-CD40, anti-CD54, anti-CD80, anti-CD86 et anti-HLADr marqués à la fluorescéine (Becton Dickinson) et anticorps anti-CD83 révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Silenus, Hauworth, Australie). Le marquage des cellules ainsi que l'analyse par cytofluorométrie ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 1. La figure 2 présente le pourcentage de cellules exprimant la molécule CD83 en fonction de la concentration en VIP avec un ajout de 0,2 ng/ml (courbe1) de TNFa dans le milieu de culture et sans cet ajout (courbe 2) Les résultats sur ces cellules après 4 jours de culture sont consignés dans le tableau 1. TABLEAU Stimulus CD40a CD54a CD80 CD83b CD86b HLA-DR Aucun 55 50 14 26 -39 178 -NF[alpha] (0,2 ng/ml) 54 49 15 27 -42 170 VIP (10-6 M) 90 82 20 46 % - 114 52 % - 154 210 VIP (10-6 M) + 210 819 44 95% - 110 100% - 179 460 -NF[alpha] (0,2 ng/ml) #NF[alpha] (20 ng/ml) 214 825 43 98% - 102 100% - 175 473 Les mesures portant la mention a sont exprimées en intensité moyenne de fluorescence IMF après soustraction de la valeur obtenue avec l'anticorps témoin. Les mesures portant la mention b sont exprimées en pourcentage et valeur de l'IMF des cellules positives. Les résultats présentés dans la figure 2 et le tableau 1 montrent que : - le TNFa à la concentration de 20 ng/ml induit la maturation des cellules dendritiques (induction de l'expression de la molécule CD83 sur toutes les cellules dendritiques, IMF=110) ainsi que l'activation des cellules dendritiques objectivée par l'augmentation de l'expression des molécules CD40 (IMF=214), CD54 (IMF=825), CD80 (IMF=43) et HLA-Dr (IMF=473) ainsi que l'induction de l'expression de la molécule CD86 (IMF=175) (tableau 1) - le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml ne module pas l'expression des molécules analysées (tableau 1). - le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml potentialise l'induction de la molécule CD83 induite par le VIP sur les cellules dendritiques . l'expression de CD83 est significativement induite à 10-10 M (16% de cellules expriment la molécule CD83) et maximale à 10-6 M (95% de cellules expriment la molécule CD83) (figure 2). - le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml potentialise l'expression des molécules CD40 (IMF=210), CD54 (IMF=819), CD80 (IMF=44) et HLA-Dr (IMF=460) en présence de 10-6 M VIP.(tableau 1) Exemple 3: Le VIP induit la production d'interleukine 12 par les cellules dendritiques humaines Effet potentiateur du TNFa. Cet exemple montre que le VIP induit la production d'interleukine 12 (IL 12) par les cellules dendritiques humaines et que cet effet est potentialisé par le TNFa. Le VIP induit la production d'IL-12 par les cellules dendritiques L'IL- 12 est une cytokine qui joue un rôle crucial dans le développement d'une réponse lymphocytaire T puisqu'elle va amplifier la production d'interféron gamma (IFNy) par les lymphocytes T Nous montrons que le VIP induit une production dépendante de la dose d'IFNy par les cellules dendritiques immatures. Cette production est potentialisée en présence d'une dose suboptimale de TNFa. La production d'IL-12 par les cellules dendritiques étant associée au phénomène de maturation, ces observations confirment que le VIP favorise la maturation de cellules dendritiques humaines. Méthodologie : Des cellules dendritiques humaines immatures ont été générées comme décrit dans l'exemple 1. Après 6 jours de culture, les cellules sont remises en culture en milieu complet à la concentration de 105 cellules dans un volume de 200 l dans des plaques de culture 96 puits à fond plat. Les cellules sont activées avec le VIP (10-10-10-6 M) en l'absence ou en présence de 0,2 ng/ml de TNFa humain recombinant. Après 48 heures de culture, les surnageants de culture sont centrifugés à 10000 rpm pendant 15 minutes à 4 C. Les surnageants sont collectés. L'IL-12 bioactive (également nommée hétérodimère p40/p75) est quantifiée à l'aide d'un kit de dosage commercial type ELISA (R&D Systems) selon les instructions du fabricant. Les résultats sont exprimés en pg/ml Les dosages sont réalisés en duplicat La figure 3 présente la production d'IL-12 par les cellules dendritiques humaines en fonction de la concentration en VIP avec un ajout de 0,2 ng/ml de TNFa dans le milieu de culture (courbe 1) et sans cet ajout (courbe 2). Les résultats présentés dans la figure 3 montrent que : - le VIP induit une production modérée d'IL-12 par les cellules dendritiques humaines (3 1 et 9 2 pg/ml en présence de VIP à la concentration de 10-7 et 10-6 M, respectivement) - le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml n'induit pas la production d'IL-12 par les cellules dendritiques - le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml potentialise la production d'IL-12 induite par le VIP : la production d'IL-12 est significative à 10-8 M (8 3 pg/ml) et maximale à 10-6 M de VIP (22 ~ 2,5 pg/ml). Exemple 4 : VIP et TNFa coopèrent pour conférer aux cellules dendritiques humaines des propriétés de costimulation Cet exemple montre que la maturation des cellules dendritiques humaines induites par le VIP en présence d'une concentration suboptimale de TNFa leur confère des propriétés de costimulation. Méthodologie : Réaction lymphocytaire mixte. Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées comme décrit dans l'exemple 1 Après 6 jours de culture, les cellules sont lavées en milieu RPMI 1640 puis remises en culture dans le milieu complet à la concentration de 2,5x105 cellules/puits dans une plaque de culture 6 puits (5 ml/puits) Les cellules ne sont pas stimulées ou elles sont stimulées en présence de 0,2 ng/ml TNFa ; 10-6 M VIP , 0,2 ng/ml TNFa et 10-6 M VIP ou 20 ng/ml TNFa. Après trois jours de culture, les cellules sont collectées et lavées trois fois en milieu RPMI 1640. Les cellules sont ensuite irradiées à 3000 rad Les lymphocytes T humains fraîchement isolés du sang périphérique ont été préparés par la technique des rosettes avec des érythrocytes de mouton. Brièvement, les cellules mononucléées sont isolées sur gradient de Ficoll-Hypaque, comme décrit dans l'exemple 1 Les cellules mononucléées sont remises en suspension dans du milieu complet à la concentration de 200x106 cellules/ml et mélangées avec 1 ml d'une suspension à 50% d'érythrocytes de mouton (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France) La suspension cellulaire est incubée à 4 C pendant une nuit Après remise en suspension douce, les cellules T sont isolées par centnfugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante). Les complexes cellules T/érythrocytes sont collectés au fond du tube. Les globules rouges sont lysés par deux chocs hypotoniques successifs. La pureté des cellules ainsi isolées est évaluée par cytofluorométrie à l'aide d'un anticorps anti-CD3 humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). La pureté est supérieure à 95% Après lavage, les cellules sont remises en suspension dans le milieu de culture complet à la concentration de 2,5x105 cellules/ml. Les cellules dendritiques activées et irradiées sont mises en culture à la concentration de 104 cellules/200 l dans une plaque de culture 96 puits en présence ou non de 5x104 lymphocytes allogéniques Après 5 jours de culture, la prolifération des cellules T est évaluée par mesure de l'incorporation de thymidine tritiée (3H-Thy) (Amersham, Amersham, Royaume Uni). Brièvement, 0,25 Ci de 3H-Thy sont ajoutés dans chaque puits de culture. L'incorporation de 3H-Thy est mesurée par un compteur à scintillation liquide (Packard Instruments, Australie). Les résultats sont présentés en coups par minute (cpm). Les réactions lymphocytaires mixtes sont réalisées avec les lymphocytes T provenant de deux donneurs sains différents La figure 4 présente le taux de prolifération des cellules en cpm de ces deux donneurs en présence des stimuli suivants : (1 ) aucun stimulus , (2) VIP (10-6 M) ; (3) TNFa (0,2 ng/ml) ; (4) VIP (10-6 M) + TNFa (0,2 ng/ml) ,(5) TNFa 20ng/ml. Les résultats présentés dans la figure 4 montrent que : - les cellules dendritiques stimulées par le VIP seul induisent une faible prolifération des cellules T - les cellules dendritiques immatures stimulées avec le TNFa à la concentration de 0,2 ng/ml n'induisent pas de prolifération cellulaire T - les cellules dendritiques stimulées par le TNFa (0,2 ng/ml) + VIP (10-6 M) induisent une forte prolifération des cellules T provenant des deux donneurs (28x103 et 22x1 0 3 cpm) - la prolifération induite par les cellules dendritiques stimulées par 0,2 ng/ml TNFa plus 10-6 M VIP est équivalente à celle induite par des cellules dendritiques stimulées avec une dose optimale de TNFa de 20 ng/ml Exemple 5 Des antagonistes des récepteurs de VIP préviennent l'effet du VIP sur la maturation des CD Cet exemple montre que la maturation des cellules dendritiques humaines induites par le VIP est inhibée par des antagonistes du VIP Méthodologie : Les cellules dendritiques humaines immatures sont générées comme décrit dans l'exemple 1 Après 6 jours de culture, les cellules sont lavées en milieu RPMI 1640 puis remises en culture dans le milieu complet à la concentration de 2,5x105 cellules/puits dans une plaque de culture 6 puits (5 ml/puits) Les cellules sont stimulées par 0,2 ng/ml TNFa, 10-6 M VIP, 0,2 ng/ml TNFa et 10-6 M VIP ou 100 pg/ml de LPS en absence (colonne claire, située à gauche) ou en présence (colonne grisée, située au centre) de 5 g/ml polymixine B ou de 10-6 M d'un antagoniste du VIP récepteur (VIP 6-28, référence V4508) (Sigma) (Fishbein et al, Peptide (1994) 15, 95) (colonne noircie, située à droite). Après 4 jours, les cellules sont marquées avec un anticorps anti-CD83 révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Silenus, Hauworth, Australie). Le marquage des cellules ainsi que l'analyse par cytofluorométrie ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 1. La figure 5 présente le pourcentage de cellules exprimant la molécule CD83 en présence des stimuli suivants :aucun stimulus , VIP (10-6 M) , TNFa (0,2 ng/ml); VIP (10-6 M) + TNFa (0,2 ng/ml), LPS (100 pg/ml) en l'absence et en présence de polymixine B (5 g/ml) - antagoniste du VIP récepteur (10 M). Ces résultats montrent que : - l'effet du VIP sur l'expression de la molécule CD83 n'est pas inhibé par la polymixine B ce qui montre que l'effet du VIP n'est pas dû à la présence de trace d'endotoxine contaminante présente dans la préparation - l'effet du VIP est inhibé par un antagoniste du VIP récepteur ce qui montre que VIP agit en se fixant sur ses récepteurs. Nous avons observé que des cellules dendritiques humaines immatures expriment les récepteurs à VIP de type 1 et II. De plus, nous décrivons également que l'effet du VIP sur la maturation des cellules dendritiques, est inhibé par des antagonistes des récepteurs à VIP :sont inhibées (i) l'induction de l'expression CD83, (il) l'augmentation de l'expression des molécules impliquées dans l'activation du lymphocyte T telles que :CD40, CD54, CD80 et HLA-Dr, (iii) l'induction de la production d'IL-12 et (iiii) la capacité accrue des cellules dendritiques à induire une réaction lymphocytaires mixte (comparativement à ces cellules dendritiques immatures). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP, les agonistes des récepteurs du VIP, les antagonistes des récepteurs du VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à moduler la maturation des cellules dendritiques. 2. Utilisation selon la revendication 1 pour la fabrication d'un médicament destiné à moduler la maturation des cellules dendritiques par application cutanée, sous-cutanée, transdermique, intra-épidermique ou par application au niveau des muqueuses. 3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisé en ce que la génération et la maturation des cellules dendritiques est effectuée in vitro après mise en contact avec un agent biologique, les cellules matures étant ensuite réinjectées in vivo. 4 Utilisation selon l'une des revendication précédentes d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP et d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique. 5 Utilisation selon la revendication 4 pour la fabrication d'un médicament qui est un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale, bactérienne, fongique ou provoquée par une levure, ou un parasite. 6. Utilisation selon la revendication 5 pour la fabrication d'un vaccin pour lutter contre un virus choisi parmi le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus. 7 Utilisation selon la revendication 4 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers 8 Utilisation selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'agent biologique est un agent biologique tumoral pour la fabrication d'un médicament pour favoriser une réponse immune spécifique anti-tumorale 9 Utilisation selon l'une des revendications 7 ou 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'un cancer parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon. 10 Utilisation selon la revendication 7 ou 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'un cancer cutané choisi parmi les kératinomes et les carcinomes. 11 Utilisation selon l'une des revendications précédentes d'au moins un composé choisi dans le groupe formé par le VIP et les agonistes des récepteurs du VIP, associé au TNF a pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T 12 Utilisation selon l'une revendications 1 ou 2 d'au moins un antagoniste des récepteurs du VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à diminuer l'intensité d'une réponse immune spécifique 13 Utilisation selon la revendication 12 pour la fabrication d'un médicament destiné à diminuer l'intensité d'une maladie autoimmune 14 Utilisation selon la revendication 12 ou 13 pour la fabrication d'un médicament destiné à diminuer l'intensité d'une maladie autoimmune de type arthrite rhumatoïde ou diabète de type I. 15 Utilisation selon la revendication 12 d'un antagoniste des récepteurs de la VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les pathologies d'origine allergique 16 Utilisation selon la revendication 15 d'un antagoniste des récepteurs du VIP pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les pathologies d'origine allergique telle que l'asthme allergique et les dermatites atopiques 17 Utilisation selon la revendication 1 ou 2 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention du psoriasis.