Brevet FR2785620A1 — publié le 20000512

DESCRIPTION La présente invention concerne un composé nitro-aromatique capable d'être réduit en un produit amino-aromatique par des micro-organismes. L'invention propose également l'utilisation d'un composé dans un test de détection et/ou de diagnostic de micro-organismes. Ladite invention a encore pour objet un procédé de mise en évidence d'une activité nitroaryl-réductase dans un milieu de culture de micro-organismes. L'invention a enfin trait à un procédé de détection d'un micro-organisme ou d'un groupe de micro-organismes dans un échantillon susceptible de les contenir. La capacité de certaines bactéries à réduire les composés nitro-aromatiques est connue depuis de nombreuses années. Asnis (1957) a rapporté l'isolation d'une flavoprotéine à partir d'extraits d'E. coli qui était capable de réduire l'acide p- nitrobenzoïque. Depuis ce rapport, l'activité nitroaryl-réductase a été identifiée dans diverses variétés d'organismes. Ceci inclut des aérobies strictes tels que Pseudomonas spp. (Won et al. 1974) et Nocardia spp. (Villanueva 1964), des anaérobies strictes tels que Clostridium spp. (Ancermaier & Simon 1983) et Veillonella spp. (McCormick et al. 1976), ou encore des champignons (Masuda & Ozaki 1993) et des parasites eucaryotes (Douch 1975). Il existe une gamme de substrats qui ont été désignés comme étant susceptibles d'être réduitspar des nitroaryl-réductases bactériennes. Il s'agit surtout de composés nitro-aromatiques tels que l'acide p-nitrobenzoïque, le p-nitrophénol, la pnitroaniline et le 2, 4, 6-trinitrotoluène (McCormick et al. 1976). Bien qu'une grande diversité de substrats soit disponible, aucun ne permet la détection directe de nitroaryl-réductases, en donnant un produit fluorescent. La détection de l'activité enzymatique doit donc être réalisée par des méthodes indirectes telles que le suivi de la disparition du substrat ou d'un cofacteur. Kitamura et al. (1983) ont étudié la réduction du méthyl p-nitrobenzoate et d'une gamme d'autres composés aromatiques nitrés avec des extraits d'E. coli. Ils ont montré que trois activités enzymatiques distinctes pouvaient être isolées en utilisant la chromatographie avec une colonne DEAE-cellulose et que les trois fractions bien définies avaient des besoins différents en cofacteur pour leur activité. La première est liée à la présence de NADH, la seconde à la présence de NADPH, et la troisième à la présence d'un des deux. La réactivité de ces enzymes a été mesurée en contrôlant la diminution de densité optique (D.O.) à 340 nanomètre (nm), corrélée à la disparition de NADH et/ou de NADPH. La diminution de NADH et/ou NADPH a été associée à la formation de deux produits de réaction, le méthyl p-aminobenzoate et le méthyl p-hydroxylaminobenzoate. Bryant et al. (1981) ont également étudié les nitroaryl-réductases de E. coli en utilisant la nitrofurazone comme substrat. Pour mesurer l'activité enzymatique, ils ont pu contrôler la diminution de D. O. à 375 nm, qui correspond à la longueur d'onde maximale (# max. ) de la nitrofurazone. En utilisant cette méthode, ils ont pu mettre en évidence trois activités enzymatiques distinctes capables de réduire la nitrofurazone. La capacité qu'ont les bactéries de réduire les nitrofuranes est d'un intérêt considérable en chimiothérapie antimicrobienne (Peterson et al. 1979, Wentzell & McCalla 1980). En effet, il a été montré que l'activité nitroaryl-réductase majeure chez E. coli, qui est uniquement dépendante de la présence de NADPH comme cofacteur, est absente chez les mutants résistants à la nitrofurazone (Bryant et al. 1981). La présente invention a pour objet un substrat fluorogène à base de nitrocoumarine pour la détection directe des activités nitroaryl-réductases. Ce type de composé nitro-aromatique est capable de produire, après réduction, un composé très fluorescent qui est donc facilement détectable. Cette réaction I est la suivante : Dérivé 7-nitrocoumarine Dérivé 7-aminocoumarine De façon très surprenante, il a été constaté que la très grande majorité des micro-organismes sont capables, grâce à leurs activités nitroréductases, de réduire les dérivés de la 7-nitrocoumarine en composés fluorescents, ce qui n'est pas le cas avec les substrats connus à ce jour. Avec ces dérivés, il existe maintenant une famille d'indicateurs universels permettant la détection de la présence ou de l'absence de micro-organismes dans un échantillon donné. A cet effet, la présente invention concerne un composé de détection de la présence ou de l'absence d'au moins un micro-organisme, caractérisé par le fait que le composé est constitué par une molécule de nitrocoumarine ou un des ses dérivés, qui est fluorescent à l'état réduit. Préférentiellement, ledit composé est constitué par une molécule de 7nitrocoumarine ou un de ses dérivés. Le composé a la caractéristique d'être constitué par une molécule ayant la formule générale suivante : dans laquelle R3 est choisi parmi : H ou COZ, où Z permet la formation d'une cétone, d'un acide, d'un ester ou de tout autre composé aliphatique, et dans laquelle R4 est choisi parmi : H ou tout composé aliphatique. Selon une variante, R3 est constitué par : COOCH3, COOC2H5, COOH, COC3H7, CONC4H4O ou COCH3, et R4 est constitué par : H ou CH3. Selon une autre variante, le composé est constitué par de l'acide 7nitrocoumarine-3-carboxylique. La concentration en acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique est comprise entre 0,05 et 0,3 mmol/1. Selon un mode de réalisation intéressant, le composé décrit ci-dessus peut être utilisé dans une composition en combinaison avec au moins une autre molécule de nitrocoumarine ou un des ses dérivés. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé, tel que défini cidessus, dans un test de détection et/ou de diagnostic de la présence ou de l'absence de micro-organismes. L'invention concerne encore un premier procédé de détection d'un microorganisme ou d'un groupe de micro-organismes dans un échantillon susceptible de les contenir, comprenant les étapes consistant à : - ajouter à un milieu de culture, contenant l'échantillon, au moins un composé, à base de nitrocoumarine et préférentiellement de 7-nitrocoumarine ou un de leurs dérivés, et - rechercher la formation d'un produit fluorescent, la présence ou l'absence de cette fluorescence permet de conclure respectivement à la présence ou à l'absence du microorganisme ou du groupe de micro-organismes recherché. L'invention concerne aussi un second procédé d'identification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon susceptible de les contenir comprenant les étapes suivantes : - ajouter dans différents puits d'identification un milieu de culture, contenant chacun une seule source de carbone, telle que lactose, glucose, saccharose... , une fraction de l'échantillon à analyser et au moins un composé, à base de nitrocoumarine et préférentiellement de 7-nitrocoumarine ou un de leurs dérivés, et - rechercher la formation d'un produit fluorescent, dans chaque puits, la présence ou l'absence de cette fluorescence sur l'ensemble des puits permet d'identifier le microorganisme. Ce second procédé est également appelé test d'assimilation. Enfin, l'invention concerne différentes applications associées à la détection de la croissance microbienne à l'aide d'au moins un composé, tel que défini ci-dessus, pour : - effectuer un contrôle de stérilité, - effectuer une numération des micro-organismes présents dans l'échantillon, - déterminer la sensibilité d'un micro-organisme aux agents antimicrobiens, et - détecter la présence d'au moins un micro-organisme. Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 représente un graphique montrant l'effet d'une gamme de nitrocoumarines à 0,105mmol/l sur la croissance d'E. coli (NCTC 10418) dans un bouillon Mueller-Hinton. La figure 2 représente un graphique montrant la fluorescence générée par E. coli (NCTC 10418) en présence de différents dérivés de nitrocoumarines à 0,105 mmol/1 dans un bouillon Mueller-Hinton. La figure 3 représente un graphique montrant la croissance d'E. coli (NCTC 10418) en présence de concentrations variables d'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique dans un bouillon Mueller-Hinton. La figure 4 représente un graphique montrant la fluorescence générée par E. coli (NCTC 10418) en présence de différentes concentrations d'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique dans un bouillon Mueller-Hinton. La figure 5 représente un graphique montrant la croissance de différents souches sauvages d'Enterobacteriaceae dans un bouillon Mueller-Hinton en présence d'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique à 0,17 mmol/1. La figure 6 représente un graphique montrant la réduction de l'acide 7- nitrocoumarine-3-carboxylique à 0,17 mmol/l par les souches sauvages d'Enterobacteriaceae de la figure 5. La présente invention concerne une gamme de composés basés sur la 7nitrocoumarine, qui constitue un substrat fluorogène pour la détection directe des activités nitroaryl-réductases. La structure générale des nitrocoumarines est représentée par la formule II : La liste des dérivés substitués est assez importante. Ainsi les expérimentations ont portées sur chacune des substitution et sur les différentes possibles. Cette liste est représentée dans le tableau 1 ci-après. R3 R4 R8 7-nitrocoumarine H H H 4-méthyl-7-nitrocoumarine H CH3 H méthyl7-nitrocoumarine-3- COOCH3 H H carboxylate éthyl 7-nitrocoumarine-3- COOC2H5 H H carboxylate acide 7-nitrocoumarine-3- COOH H H carboxylique 3-butyryl-7-nitrocoumarine COC3H7 H H 3-acétyl-4-methyl-7- COCH3 CH3 H nitrocoumarine 7-nitrocoumarine-3-carboxy- CONCHO H H morpholide Tableau 1 : Substitutions sur la base des nitrocoumarines et composés obtenus 1 ) Matériels : A - Milieu de croissance : Les milieux utilisés sont constitués par des bouillons et géloses Mueller-Hinton et Trypticase Soja, qui ont été obtenus chez Unipath Ltd, Basingstoke, Grande Bretagne. B - Substrats et produits chimiques : Les substrats suivants ont été synthétisés : 7-nitrocoumarine, 4-méthyl-7nitrocoumarine, méthyl 7-nitrocoumarine-3-carboxylate, éthyl 7-nitrocoumarine-3carboxylate, acide 7-nitrocoumarine 3-carboxylique, 3-butyryl-7-nitrocoumarine, 3acétyl-4-methyl-7-nitrocoumarine, 7-nitrocoumarine-3-carboxy-morpholide. C - Equipement : L'équipement utilisé a été le suivant : - lecteur spectrophotométrique de plaques de microtitration Anthos 2001, en provenance de chez Labtech International Limited, Uckfield, Grande Bretagne, et - lecteur à fluorescence de plaques de microtitration Labtech Biolite FI, en provenance de chez Labtech International Limited, Uckfield, Grande Bretagne. D - Synthèse des nitrocoumarines : Les produits chimiques impliqués dans la synthèse des nitrocoumarines ont tous été obtenus auprès de Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Grande-Bretagne. La synthèse de la 7-nitrocoumarine a été décrite par LIEBERMANN, M, et al. (1951) Académie des Sciences 232,2027-2029. Elle consiste à chauffer à reflux, pendant 3 h, 12 g d'aldéhyde nitro-4-salicylique, 18 g d'acétate de sodium anhydre et 27 g d'anhydride acétique. On coule dans un mortier et on réduit la masse en pâte, puis on essore et on lave avec de petites quantités d'anhydride acétique, et ensuite à l'eau. Le produit est chauffé 2 h à reflux en présence de 13 g de C03Na2 et 320 cm3 d'eau. On filtre à chaud et on précipite également à chaud par l'acide chlorhydrique. On essore après refroidissement et on recristallise dans 300 cm' d'acide acétique à 50%. Une nouvelle cristallisation donne un produit fondant à 198-200 C. La synthèse de différents dérivés de nitrocoumarine nécessite tout d'abord la synthèse de 4-nitrosalicylaldéhyde, qui a été produit en utilisant une modification de la méthode décrite par SEGESSER, J. R., et CALVIN, M. (1942) J Am. Chem. Soc. 64, 825-826. Ceci implique une acétylation initiale de la 2-méthyl-5-nitrophénol suivie par deux étapes d'ajout de brome, utilisant du N-bromosuccinimide et un catalyseur de péroxyde de benzoyle dans un solvant de tétrachlorure de carbone pour obtenir du 2acétoxy-4-nitrobenzale bromure. Le dibromure brut est recristallisé à partir de 1butanol et converti en du nitrosalicylaldéhyde par la procédure suivante. Un échantillon de 11grammes (g) de dibromure purifié est dissout dans 50 millilitres (ml) de méthanol sec et l'ensemble est ajouté graduellement à 250 ml d'une solution en ébullition de sodium dans du méthanol (1% w/v). Après reflux pendant 45 minutes (mn), la solution orange foncée est refroidie et une quantité de 100 ml d'eau est ajoutée. Après ébullition pendant encore 15 mn, la solution est refroidie et son pH est amené à une valeur de 3. Le méthanol est retiré par une évaporation rotative et le précipité de 4-nitrosalicylaldéhyde est séparé par filtration aspirante. Le restant est alors recristallisé dans de l'éthanol dilué. Trois des dérivés de nitrocoumarine ont été synthétisés par la même méthode qui implique une condensation de Knoevenagel avec du 4-nitrosalicylaldéhyde. Du diméthylmalonate (1,45 g, 11 mM) et 4-nitrosalicylaldéhyde (1,67 g, 10 mM) sont dissous dans 15 ml d'éthanol. Une masse de 100 mg de piperidine et un volume de 100 l de d'acide acétique froid sont alors ajoutés et le mélange est reflué pendant 2 h. Le méthyl-7-nitrocoumarine-3-carboxylate est formé soit par séparation pendant la réaction soit par cristallisation pendant le refroidissement. Le produit est retiré par filtration aspirante et recristallisé dans de l'éthanol liquide. Pour la synthèse de l'éthyl- 7-nitrocoumarine-3-carboxylate et du 3-butyryl-7-nitrocoumarine, le diméthyl malonate est remplacé respectivement soit par du diéthyl malonate, soit par de l'éthyl butyrylacétate. L'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique est obtenu par refluage de l'éthyl 7nitrocoumarine-3-carboxylate (2,63 g, 10 mM) avec un excès de solution d'hydroxyde de potassium et d'éthanol aqueux pendant 1 h. La solution de couleur jaune profonde du sel de potassium est alors acidifiée à l'aide d'acide chlorydrique et le produit récolté, lavé avec une petite quantité d'eau, est ensuite recristallisé à partir d'eau en ébullition. La 7-nitrocoumarine-3-carboxymorpholide est préparée comme suit. L'acide 7nitrocoumarine-3-carboxylique (1,17 g, 5 mM) est dissout dans un mélange de 25 ml de tétrahydrofurane anhydre et de 10 ml de diméthylformamide. A cette solution, préalablement mélangée, est ajouté 5 mmol de N-méthylmorpholine (0,5 g, 5 mM) et, après refroidissement à une température - 12 degrés Celsius ( C), est ajouté de l'isobutyle chloroformate (0,68 g, 5 mM). Après 10 mn, le morpholide (0,64 g, 7,5 mM) est ajouté. La réaction peut être réalisée pendant 30 mn, au 0 absolu de température, suivie par une étape de 5 h à la température ambiante. L'hydrochlorure de N-méthylmorpholine est retiré par filtration et le filtrat est versé dans 10 ml d'un mélange eau/glace. Le solide, qui est séparé, est recristallisé dans du méthanol liquide. La synthèse à la fois du 4-méthyl-7-nitrocoumarine et du 3-acétyl-4-méthyl-7nitrocoumarine est effectuée par une procédure alternative qui implique l'oxydation de la 7-aminocoumarine. La 7-amino-4-méthylcoumarine (1,75 g, 10 mM) est suspendue dans 10 ml d'acide sulfurique (75 % w/w) et l'ensemble est mélangé efficacement. Une quantité de 2,5 ml de solution de nitrite de sodium (7 M) est ajouté graduellement à - 5 C, au moyen d'une longue colonne de refoulement qui atteint le fond du tube de réaction. La solution de diazonium est mélangée pendant 15 mn à - 2 C jusqu'à atteindre 5 C. Un échantillon de 51 d'eau glacée contenant 2,4 g de tétrafluoroborate de sodium est ajouté lentement à la solution de diazonium froid. L'eau glacée est ajoutée lentement à 0 C jusqu'à ce que le volume forme une masse de cristaux de tétrafluoroborate. Cette substance est retirée par filtration aspirante et les cristaux sont nettoyés avec un peu d'eau glacée, nettoyage qui se poursuit avec du méthanol et finalement avec de l'éther. Le produit est rapidement séché à l'air sec générant ainsi 2,2 g de produit. Une masse de 3 g d'échantillon de poudre de cuivre et une suspension d'oxyde cuivreux (préparé par réduction glucosée de sulfate cuivreux) sont ajoutées à une solution refroidie de nitrite de sodium (4,1M). Un échantillon de 2,2 g de sel de diazonium est suspendu dans 10 ml d'eau et ajouté en plusieurs aliquotes durant 20 mn à une température comprise entre 5 et 15 C sous agitation. L'azote est retiré ce qui nécessite l'addition d'une petite quantité d'éther pour prévenir l'apparition de mousse. Le mélange se poursuit pendant 5 h. La suspension est filtrée, nettoyée avec de l'eau et ensuite extraite avec de l'acétate d'éthyl chaud. La solution acqueuse est pareillement extraite. Les extraits combinés sont nettoyés avec de l'eau et séchés avec du sulfate de magnésium anhydre. Un solvant est retiré par évaporation rotative pour donner une résidu jaune. La recristallisation à partir d'acide acétique chaud, donne 0,62 g de produit jaune citron, c'est-à-dire de 4-méthyl-7-nitrocoumarine. La 3-acétyl-4-méthyl-7-nitrocoumarine est préparée par une méthode similaire utilisant le 3-acétyl-4-méthyl-aminocoumarine. Le dernier composé est préparé par une modification de la méthode de synthèse du 7-amino-4-méthylcoumarine, qui consiste en une substitution de l'éthyle diacétoacétate par de l'éthyle acétoacétate. E - Préparation des solutions de substrat : Un échantillon de dérivé de 7-nitrocoumarine est dissout à chaud dans 4 ml d'eau distillée. La quantité dissoute est déterminée de façon à obtenir une concentration finale de 0,105 mmol/1 lors de l'essai. Cette solution est ensuite ajoutée à 96 ml de bouillon Mueller-Hinton, et le mélange est filtré de manière stérile. F - Micro-organismes étudiés : Les micro-organismes utilisés sont soit des souches sauvages, soit des souches provenant de collections internationales (NCTC, ATCC) 2 ) Méthodes et résultats : A - Evaluation de la valeur de différents dérivés de nitrocoumarine comme indicateurs de croissance de souches d'Escherichia coli (NCTC 10418) : 1 ) Méthode : Une première étude a été réalisée à l'aide de la souche d' Escherichia coli (NCTC 10418) et les huit nitrocoumarines décrites structurellement dans le tableau 1, pour mémoire, il s'agit de : # 7-nitrocoumarine, # 4-méthyl-7-nitrocoumarine, méthyl7-nitrocoumarine-3-carboxylate, éthyl7-nitrocoumarine-3-carboxylate, # acide 7-nitrocoumarine 3-carboxylique, # 3-butyryl-7-nitrocoumarine, # 3-acétyl-4-methyl-7-nitrocoumarine, et # 7-nitrocoumarine-3-carboxymorpholide. La souche d' E.coli est cultivée à 35 C sur gélose Columbia au sang de mouton pendant 24 h. Une suspension est ensuite réalisée dans de l'eau distillée stérile et ajustée au point 0,5 de l'échelle de Mac Farland, soit environ 108 cellules par millilitre (cellules/ml), puis diluée au centième dans du bouillon Mueller-Hinton stérile, soit environ 106 (cellules/ml). Cinquante microlitres de chaque solution de nitrocoumarines et cinquante microlitres de suspension microbienne sont ajoutés dans les puits d'une plaque de microtitration. Les plaques ainsi préparées sont mises à incuber à 35 C et lues toutes les 30 mn pendant 4 h - en densité optique (690 nm), à l'aide du spectrophotomètre Anthos 2001 (Labtech International Limited), et en fluorescence (excitation : 365 nm et émission : 440 nm), à l'aide du fluorimètre Biolite FI 2001 (Labtech International Limited). 2 ) Résultats : La figure 1 montre l'effet de chaqcune des huit nitrocoumarines (à 0,105 mmol/1) sur la croissance d'E. coli (NCTC 10418). On voit clairement sur cette figure que la substitution chimique du noyau coumarine a un effet significatif sur les caractéristiques inhibitrices de la 7-nitrocoumarine. Par exemple, en présence de 0,105 mmol/l d'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique, il n'y a pas de mise en évidence d'inhibition de croissance. Toutefois, en présence de 0,105 mmol/l de méthyl-7nitrocoumarine-3-carboxylate, la D. O. globale est réduite de 92% par comparaison avec le contrôle de croissance.Ces effets inhibiteurs reflètent largement le taux de réduction de substrat tel qu'il a été mesuré par production de fluorescence. On voit clairement sur la figure 2, que les deux composés les plus inhibiteurs, le méthyl-7-nitrocoumarine-3-carboxylate et la 3-butyryl-7-nitrocoumarine, sont les moins réduits après la période de quatre heures. De plus, la réduction de l'acide 7nitrocoumarine-3-carboxylique, seul composé non inhibiteur, a largement dépassé celle des autres nitrocoumarines et la fluorescence générée est plus de deux fois supérieure à celle produite par n'importe quel autre substrat. Pour faciliter la lecture des figures 1 et 2, les deux tableaux 2 et 3 qui suivent énumèrent les valeurs associées à ces figures. Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 7-nitrocoumarine 0. 000 -0,002 0,000 0,002 0,009 0,025 0,072 0,133 0,211 4-méthyl-7- 0,000 0,000 0,002 0,004 0,010 0,024 0,055 0,113 0,175 nitrocoumarine méthyl-7= 0,000-0,001 -0,001 0,000 0,000 0,002 0,006 0,014 0,032 nitrocoumarine-3carboxylate éthyl-7- 0,000-0,005 -0,008 -0,008 -0,006 0,000 0,018 0,046 0,116 nitrocoumarine-3carboxylate acide 7- 0,000 0,000 0,002 0,008 0,026 0,068 0,164 0,227 0,416 nitrocoumarine 3carboxylique 3-butyryl-7- 0,000 0,001 0,005 0,007 0,009 0,012 0,015 0,039 0,096 nitrocoumarine 3-acétyl-4-methyl-7- 0,000 -0,003 -0,002 -0,001 0,002 0,008 0,023 0,051 0, I 10 nitrocoumarine 7-nitrocoumarine-3- 0,000 -0,002 -0,001 0,001 0,005 0,014 0,037 0,068 0,109 carboxymorpholide Contrôle 0.000 -0,002 0,000 0,005 0,019 0,085 0, t 69 0,246 0,400 Tableau 2 : numériques associées à la figure 1 Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 7-nitrocoumarine 0 77 S19 1447 2915 4713 7160 10182 14189 4-méthyl-7- 0 15 302 974 2008 3299 5097 7545 11125 nitrocoumarine méthyl-7- 0 174 702 Ï297 2035 29ÔT" ~3946 5ÔÔ1 6668~ nitrocoumarine-3carboxylate éthyl-7- 0 173 814 1703 2813 4126 5646 7370 10859 nitrocoumarine-3carboxylate acide 7- 0 -67 4 181 5 Î694~ ~672l [7495" "3Ï3Î4~ nitrocoumarine 3carboxylique 3-butyryl-7- 0 64 387 894 IS38 2344 3329 4642 6845 nitrocoumarine 3-acétyl-4-methyl-7- 0 40 39Ô 992 Î8Ô4 28TT Ô9Ô 5576 SÔIT" nitrocoumarine 7-nitrocoumarine-3- 0 180 665 1376 2414 3796 5817 8454 12263 carboiymorpholide Contrôle 0 -214 -IS9 -205 -174 -177 -131 -104 -101 Tableau 3 : numériques associées à la figure 2 B - Etude de la valeur de l'acide 7-nitrocoumarine 3-carboxylique à différentes concentrations pour le contrôle de la croissance de la souche d'Escherichia coli (NCTC 10418) : 1 ) Méthode: L'influence de la concentration en acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique sur la sensibilité de la détection de la souche d' E.coli NCTC 10418 a été étudiée en faisant varier la gamme de concentration de l'indicateur de 0 à 0,262 mmol/1. Les autres conditions de l'essai étaient les mêmes que celles décrites dans le paragraphe A précédent. 2 ) Résultats : On voit clairement sur la figure 3 que la concentration d'acide 7-nitrocoumarine 3-carboxylique n'a pas d'effet significatif sur la croissance d'E. coli comme l'indique la superposition des cinétiques obtenues avec les différentes concentrations en substrat et ce même par rapport au contrôle. Le fait que ce composé ne soit pas du tout inhibiteur, est reflété par le taux de fluorescence généré par la nitro-réduction. La figure 4 montre que la production de fluorescence augmente avec la concentration de substrat jusqu'à saturation du substrat autour de 0,157 mmol/1 (36,9 g/ml). Au-delà de cette concentration, la sensibilité de la réaction fluorescente n'est plus augmentée. Pour faciliter la lecture des figures 3 et 4, les deux tableaux 4 et 5 qui suivent énumèrent les valeurs associées à ces figures. Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0,262 mmol/l 0,000 0,000 0,002 0,009 0,027 0,069 0,144 0,213 0,346 0,210 mmol/l 0,000 0,000 0,003 0,010 0,027 0,072 0,138 0,187 0,346 0,157 mmol/l 0,000 -0,001 0,002 0,009 0,027 0,073 0,151 0,205 0,372 0,105 mmol/l 0,000 0,000 0,002 0,008 0,026 0,068 0,164 0. 227 0,416 0,052 mmol/l 0,000 0,001 0,003 0,0 Il 0,031 0,082 0,153 0,225 0,408 0,026 mmol/l 0,000 0,001 0,004 0,011 0,032 0,079 0,201 0.290 0,436 0,013 mmol/l 0.000 0,000 0.003 0.011 0,032 0,088 0,149 0,233 0,371 0,005 mmoUl 0.000 0,000 0,003 0,01 11 0,034 0,090 0, I 55 0,246 0,411 Contrôle 0.000 0,002 0,005 0,011 0,025 0,061 0,174 0,241 0,332 Tableau 4 : numériques associées à la figure 3 Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0,262 mmol/l 0 3 l31 446 1190 3037 9721 22066 37949 0,210 mmolll 0 -6 88 354 979 2588 9000 21589 37823 0,157 mmol/l 0 -74 48 280 811 2231 8264 21022 36517 0,105 mmol/l 0 -67 4 181 586 1694 6724 17495 31314 0,052 mmol/l 0 -83 -76 33 241 861 4004 10584 19530 0,026 mmol/l 0 -91 -110 -39 71 467 2311 6028 11387 0,013 mmol/l 0 -113 -141 -76 -22 174 1068 3073 5902 0,005 mmol/l 0 -134 -164 -122 -94 -9 406 1307 2466 Contrôle 0 -296 -159 -168 -149 -156 -131 -110 -119 Tableau 5 : Valeurs numériques associées à la figure 4 C - Etude de la valeur de l'acide 7-nitrocoumarine 3-carboxylique comme indicateur de croissance de différentes souches d'entérobactéries : 1 ) Méthode: Dans cette expérience, il a été vérifié s'il était possible de détecter d'autres souches d'entérobactéries que celle d' E.coli à l'aide de l'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique. Les conditions de cette étude étaient similaires à celles de la première expérience (paragraphe A). Cinq souches sauvages appartenant aux espèces Citrobacter diversus, Enterobacter agglomerans, Hafnia alvei, Morganella morganii et Shigella sonnei ont été testées 2 ) Résultats : La figure 6 montre la réduction de l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique par des souches sauvages appartenant à cinq espèces différentes d'entérobactéries. Toutes les souches testées ont été capables de réduire ce composé. Une comparaison des cinétiques de fluorescence de la figure 6 avec les cinétiques de croissance de la figure 5 montre une excellente corrélation entre croissance et fluorescence, indiquant ainsi que l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique est un très bon indicateur de croissance. Pour faciliter la lecture des figures 5 et 6, les deux tableaux 6 et 7 qui suivent énumèrent les valeurs associées à ces figures. Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 C. diversus 0,000 0,000 0,005 0,011 0,020 0,050 0,092 0,143 0,250 E. agglomerans 0,000 -0,002 0,002 0,006 0,027 0,057 0,155 0,225 0,323 H. alvei 0,000-0,001 0,004 0,009 0,016 0,034 0,092 0,149 0,246 M.morganii 0,000-0,010 -0,010-0,005 0,003 0,020 0,064 0,116 0,187 S.sonnei 0,000 -0,001 0,000 0,002 0,013 0,042 0,097 0,159 0,246 Contrôle 0,000-,0002 -0,002 0,003 -0,002 0,005-0,003 -0,001 0,003 Tableau 6 : numériques associées à la figure 5 Composé\Temps(mn) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 C. diversus 0 3 3 34 92 281 546 1209 5393 E.agglomerans 0 -15 -3 9 74 199 501 1246 4099 H.alvei 0 -24 -30 0 40 122 260 775 2048 M.morganii 0 -42 -24 -15 31 95 403 2170 8128 S.sonnei 0 -9 15 52 162 434 1108 3095 8567 Contrôle 0 9 0 24 21 34 43 24 61 Tableau 7 : numériques associées à la figure 6 Bien que les résultats ne soient pas présentés ici, il a été vérifié que l'on obtenait le même genre de cinétiques avec la plupart des micro-organismes, autres que les entérobactéries, par exemple les bacilles à Gram négatif non fermentants, les staphylocoques, les streptocoques, les Listeria et les levures. Tous étaient capables de réduire les dérivés nitrocoumariniques, en particulier l'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique, pour donner un signal fluorescent, montrant l'universalité de cette méthode de détection de la croissance, comme cela est illustré par les résultats de l'étude suivante. D- Etude de la valeur de l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique comme indicateur de croissance pour une large variétés de micro-organismes : 1 ) Méthode: Cette étude a été réalisée en utilisant l'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique et en testant seize (16) souches de micro-organismes, représentant une large variété de bactéries et incluant une levure. La liste des souches étudiées est énumérée dans le tableau 8 défini ci-après. Un échantillon de 10 mg de l'indicateur est dissout à chaud dans 4 ml d'eau distillée. Cette solution est ensuite ajoutée à 96 ml de bouillon Trypticase-Soja, et le mélange est filtré de manière stérile. Les souches sont cultivées à 35 C en bouillon Trypticase-Soja pendant 24 h. Chaque culture est alors diluée au 1/1000 dans du bouillon Trypticase-Soja, puis des dilutions successives au 1/10 sont effectuées jusqu'à ne plus avoir de cellules microbiennes dans la prise d'essai. On réalise ainsi une gamme de dilutions allant de 10-3à10-13. Cinquante microlitres de chaque dilution et cinquante microlitres de solution de bouillon Trypticase-Soja, avec ou sans acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique, sont ajoutés dans les puits d'une plaque de microtitration. Les plaques ainsi préparées sont mises à incuber à 35 C et lues, d'une part, à instant de départ (T zéro) et, d'autre part, après 24 h : - en densité optique (690 nm), à l'aide du spectrophotomètre Anthos 2001 (Labtech International Limited), pour les puits ne contenant pas l'acide 7- nitrocoumarine-3-carboxylique, et - en fluorescence (excitation : 365 nm et émission : 440 nm), à l'aide du fluorimètre Biolite FI2001 (Labtech International Limited), pour les puits contenant l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique. Afin de vérifier la correspondance entre croissance et fluorescence, ainsi que l'absence de toxicité de l'indicateur, tous les puits ont été repiqués sur gélose Columbia au sang de mouton. 2 ) Résultats : L'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique a été utilisé pour tester seize souches de micro-organismes, représentant une large variété de bactéries et incluant une levure, comme cela est bien indiqué dans le tableau 8 ci-dessous. Les mesures de fluorescence (première ligne pour chaque souche) et de densité optique (deuxième ligne pour chaque souche) obtenues après 24 h d'incubation sont notées dans le tableau 8. Afin de vérifier la correspondance entre croissance et fluorescence, ainsi que l'absence de toxicité de l'indicateur, tous les puits ont été repiqués sur gélose Columbia au sang de mouton, et ceux qui ont donné des colonies ont été indiqués dans le tableau par des cases en italiques. Les résultats présentés dans le tableau montrent qu'il existe une très grande corrélation entre la fluorescence due à la réduction de l'indicateur et la croissance microbienne, et cela quel que soit le type de micro-organisme. Les rares différences mineures observées peuvent s'expliquer par de faibles variations possibles au niveau du nombre de cellules vivantes présentes dans les puits des plaques de microtitration, notamment pour les dilutions limites pour lesquelles l'inoculum peut contenir une seule cellule microbienne. La détection de la fluorescence peut donc se substituer à la mise en évidence de la croissance. L'utilisation de l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique comme indicateur fluorescent de croissance apparaît extrêmement sensible puisqu'il est possible de détecter un très petit nombre de micro-organismes, qui peut être estimé à une seule cellule vivante, lorsque l'on utilise la méthode des dilutions limites pratiquée lors de cette expérimentation. Il est à noter que dans cet essai, la souche de levure testée (Candida albicans) a généré un faible niveau de fluorescence, comparativement aux bactéries. Cela est dû en fait à l'utilisation du bouillon Tryptycase-Soja qui n'est pas un milieu bien adapté à la croissance des levures. Bien que les résultats ne soient pas présentés, si le milieu Tryptycase-Soja est remplacé par un bouillon RPMI recommandé pour les levures, le niveau de fluorescence obtenu est alors comparable à celui observé avec les bactéries. Les résultats sont présentés sur le tableau 8 ci-après. Le nombre de dilutions étant important (onze dilutions entre 10-3 et 10-13 plus une douzième valeur concernant un blanc faisant office de témoin), et afin de faciliter la compréhension et la lecture de ce tableau, celui-ci a été divisé en deux parties. Une première partie concerne les dilutions comprises entre 10-13 et 10-9. Une seconde partie concerne les dilutions comprises entre 10-10 et 10-13 et le témoin. Facteur de dilution des suspensions 10' 10-1 ] 0' 100 10' 10 10 .9crnetnbacterbaumami(ATCC 19606) 27016 11695 72525 891-' 6953 1651 1705 4cmetobacterbaumami(ATCC 19606) 0.447 0.307 0.240 0.08s 0.07/ 0.017 0.002 ACÍnetobactercalcoaceticus(ATCC7844) 29657 18288 la3l! 72227 11635 14858 13353 ,4cineiobacter calcoacetieus (ATCC 7844) O.S1?. 0.714, 0.669 0.565 0.290 0.404 0.208 Acinetobacter haemolytrcus (ATCC 17906) 199231 17403 12614 972 4236 1981 1938 Acinetobacter haemolyrreus (ATCC 17906) 0.063 0.055 0.061 0.04' 0.016 -0 003 -0.001 BrevundimonasvesÍcularÍs{ATCCI1426) 2543 1962 1861 1941 1928 1889 1929 Brevundimonas vesicularis (ATCC 11426) 0.112 0. 037 0. 006 -0. 012 -0.001 0.005 -0. 002 Burkholderia cepacia (ATCC 25416) 16978 16719 16808 15800 11973 1969 1996 Burkholderia cepacia (ATCC 25416) 0.594 0.637 0.536 0.602 0.57/ -0.001 0.000 Listeria ivanovii (wild strain) 16246 44910 13185 44865 9251 8137 44425 Gistena ivanovü (wild strain) 0.312 0.269 0.384 0.295 0 298 0.178 0.001 .%4oraxella nonliquefaciens (ATCC 19975) 28160 27889 28439 27648 27385 27196 1974 Moraxella nonliguefaciens (ATCC 19975) 0.828 0.693 0.666 0.693 0.708 0.697 0.000 Aforarella osloensis (ATCC 19976) 11426 9949 7700 5875 1925 1941 1977 Moraxellaosloensis(ATCC 19976) 0.056 0.044 0.051 0.059 0.000 0.001 0.000 Pseudomonas fluorescent (ATCC 13525) 8985 1774 1657 1625 1716 1690 1736 Pseudomonasfluorescens (ATCC 13525) 0.005 -0. 002 -0. 002 -0. 004 -0.001 -0. 003 -0. 002 Pseudomonas putida (ATCC ) 12633) 12589 9810 7670 6806 5714 1715 1664 Pseudomonas putida (ATCC 12633) 0.567 0.483 0.431 0.465 0.483 -0.002 0.000 SerratÍamarcescens(NCrcI0211) 47178 494 70 45804 45454 45637 43088 48320 Serratia marcescens (NCTC 10211) 0.543 1.001 0. 464 0. 487 1.240 0.549 TOIT Shewanella putrefaciens (ATCC 8071) 40277 37262 34890 32034 31793 1911 1902 Shewanella putrejaciens (ATCC 8071 ) 0.364 0.267 0.139 0.106 0.108 -0.003 -0.001 Shigella sonnei (NCTC 8586) 51755 50254 50166 50278 49882 47370 1816 Shigella sonnei (NCTC 8586) 0.183 0.209 0.207 0.269 0.215 0.050 0.000 Staphylococcus aureus (NCTC 46607 45207 44544 43SS9 41437 1678 1666 6571) Staphylococcus aureus (NCTC 0.507 0.484 0. 497 0.507 0. 444 -0. 003 -0. 001 6571) Strepiococcus mitis (NCTC 20988 21541 19899 19619 17228 1682 1676 12261) Streptococcus mitis (NCTC 0.209 0367 0.325 0. 300 0.257 -0. 002 0.000 12261) Candida albicans (ATCC 2847 2609 2335 2041 1693 1745 1693 90028) Candida albicans (ATCC 0. 49 0.419 0. 308 0.403 -0. 003 0. 001 0. 000 90028) Contrôle sans microorganisme 1785 1727 1779 1755 1786 1724 1712 Contrôle sans microorganisme 0.003 0.001 0.000 -0.003 -0.005 -0. 002 -0.001 Facteur de dilution des suspensions 1010 1011 10-12 1013 "blanc" Acinetobacter baumanu (ATCC 19606) 1718 1678 1687 1660 1671 Acinetobacter baumanu (ATCC 19606) -0.001 0. 000 -0. 001 0.002 0. 000 Acinetobacter calcoaceliclis (ATCC 7844) 10862 1712 1654 1699 1704 .4cinerobacter calcoacetrcus (ATCC 7844) O..?00 -0.001 -0.001 -0.001 0.000 Acinetobacier haemolylicus (ATCC 17906) 2005 1947 1904 1938 1907 Acinetobacter haemolytrcus (ATCC 17906) -0.002 0.000 -0 001 -0.002 -0.001 Brevundrmonas vesicularts (ATCC 1 1426) 1910 1938 1919 1877 1840 Brevundlmonas vesicularzs (ATCC 11426) 0.000 -0.001 -0.001 -0.003 0.006 Burkholderia cepacia (ATCC 25416) 1950 1925 1965 1914 1874 Burkholderia cepacia (ATCC 25416) -0 002 0. 002 -0. 002 -0. 002 -0.001 Listeria ivanovii (wild strain) 1663 1651 1691 1682 1680 Listeria ivanovii (wild strain) -0.001 0. 000 0.000 0. 000 -0.001 Moraxella nonliquefaciens (ATCC 19975) 2057 2002 1956 1907 1969 Moraxella nonliquefaciens (ATCC 19975) -0. 002 0.000 -0.001 0.001 0. 000 Moraxella osloensis (ATCC 19976) 2039 1938 1907 1945 1880 Moraxella osloensis (ATCC 19976) 0.001 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 Pseudomonasfluorescens (ATCC 13525) 1666 1691 1666 1624 1596 Pseudomonas,Jluorescens (ATCC 13525) -0.004 -0.002 0.000 -0.002 0.000 Pseudomonas putida (ATCC 12633) 1660 1651 1660 1657 1648 Pseudomonas putida (ATCC 12633)-0.002 0. 001 0. 001 0.001 0. 001 Serratia marcescens (NCTC 10211) 1678 1641 1636 1621 1630 Serratia marcescens (NCTC 10211) -0.002 -0.001 0.001 -0.001 -0.001 Shewanella putrejaciens (ATCC 8071) 1972 1917 1935 1990 ' 1905 Shewanella putrefaciens (ATCC 8071) -0. 002 0.001 -0. 001 -0. 002 0. 000 Shigella sonner (NCTC 8586) 1990 1960 1956 1911 1778 Shigella sonner (NCTC 8586)-0.003 0. 003 -0 001 -0. 004 0. 000 Staphylococcus aureus (NCTC 6571) 1666 1620 1706 1669 1746 Staphylococcus aureus (NCTC 6571) -0. 001 0.001 0. 003 0. 000 0. 000 Streptococcus mills (NCTC 12261) 1691 1636 1644 1669 1682 Streptococcus mitis (NCTC 12261) -0.002 0.001 -0. 003 -0. 003 -0. 003 Candida albicans (ATCC 90028) 1751 1666 1702 1666 1672 Candida albicans (ATCC 90028)-0.005 -0.002 0. 005 0.000 0. 000 Contrôle sans microorganisme 1730 1734 1700 1639 1734 Contrôle sans microorganisme-0.001 -0. 001 0. 001 -0. 001 -0.001 Tableau 8 : après 24 h en présence d'acide 7-nitrocoumarine-3- carboxylique des mesures de fluorescence (1ère ligne) et de densité optique (2ème ligne) pour des dilutions successives des suspensions de différents micro-organismes 3 ) Conclusion : Les dérivés de la 7-nitrocoumarine, et notamment l'acide 7-nitrocoumarine-3carboxylique, constituent une famille d'indicateurs fluorescents universels de la croissance des micro-organismes. Les applications de ces nouveaux indicateurs sont nombreuses en microbiologie et concernent toutes les méthodes faisant appel à la détection de la croissance microbienne. Parmi ces applications, on peut citer : - les méthodes d'antibiogramme et d'antifongigramme (recherche de la sensibilité des micro-organismes aux antibiotiques et antifongiques), - les méthodes d'identification faisant appel à des tests d'assimilation (mise en évidence de la croissance en présence de substrats utilisés comme seules sources de carbone), - la mise en évidence de la stérilité d'un échantillon (absence de micro-organismes), - toute détection de la présence de micro-organismes dans des échantillons susceptibles de les contenir, qu'ils soient cliniques, industriels (alimentaires, pharmaceutiques, cosmétiques...) ou de l'environnement, et - tout dénombrement de micro-organismes dans un échantillon, en particulier les numérations basées sur la détermination de nombre le plus probable (NPP), bien connue dans le domaine de l'agro-alimentaire. 1. Composé de détection de la présence ou de l'absence d'au moins un microorganisme, caractérisé par le fait qu'il est constitué par une molécule de nitrocoumarine ou un des ses dérivés, qui est fluorescent à l'état réduit. 2. Composé, selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est constitué par une molécule de 7-nitrocoumarine ou un de ses dérivés. 3. Composé, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il est constitué par une molécule ayant la formule générale suivante : dans laquelle R3 est choisi parmi : H ou COZ, où Z permet la formation d'une cétone, d'un acide, d'un ester ou de tout autre composé aliphatique, dans laquelle R4 est choisi parmi : H ou tout composé aliphatique. 4. Composé, selon la revendication 3, caractérisé par le fait que R3 est constitué par : COOCH3, COOC2H5, COOH, COC3H7, CONC4H4O ou COCH3, et R4 est constitué par : H ou CH3. 5. Composé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il est constitué par de l'acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique. 6. Composé, selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la concentration en acide 7-nitrocoumarine-3-carboxylique est comprise entre 0,05 et 0,3 mmol/l. 7. Composé, selon l'une quelconque des revendications 1à 6, caractérisé par le fait qu'il est utilisé dans une composition en combinaison avec au moins une autre molécule de nitrocoumarine ou un des ses dérivés. 8. Utilisation d'un composé ou d'une combinaison d'au moins deux composés, selon l'une quelconque 1 à 7, dans un test de détection et'ou de diagnostic de la présence ou de l'absence de micro-organismes. 9. Procédé de détection d'un micro-organisme ou d'un groupe de microorganismes dans un échantillon susceptible de les contenir, comprenant les étapes consistant à : - ajouter à un milieu de culture, contenant l'échantillon, au moins un composé, à base de nitrocoumarine et préférentiellement de 7-nitrocoumarine ou un de leurs dérivés, et - rechercher la formation d'un produit fluorescent, la présence ou l'absence de cette fluorescence permet de conclure respectivement à la présence ou à l'absence du microorganisme ou du groupe de micro-organismes recherché. 10. Procédé d'identification d'au moins un micro-organisme dans un échantillon susceptible de les contenir comprenant les étapes suivantes : - ajouter dans différents puits d'identification un milieu de culture, contenant chacun une seule source de carbone, une fraction de l'échantillon à analyser et au moins un composé, à base de nitrocoumarine et préférentiellement de 7-nitrocoumarine ou un de leurs dérivés, et - rechercher la formation d'un produit fluorescent, dans chaque puits, la présence ou l'absence de cette fluorescence sur l'ensemble des puits permet d'identifier le microorganisme. 11. Application d'au moins un composé, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection de la croissance microbienne pour effectuer un contrôle de stérilité. 12. Application d'au moins un composé, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection de la croissance microbienne pour effectuer une numération des micro-organismes présents dans l'échantillon. 13. Application d'au moins un composé, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection de la croissance microbienne pour déterminer la sensibilité d'un micro-organisme aux agents antimicrobiens. 14. Application d'au moins un composé, tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection de la croissance microbienne pour détecter la présence d'au moins un micro-organisme.