Brevet FR2793496A1 — publié le 20001117

CULTURES DE CELLULES D'INSECTE SE MULTIPLIANT À 37 C, LEUR PROCÉDÉ D'OBTENTION, ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention est relative à des cultures de cellules d'insecte capables de croître à 37 C, et permettant la multiplication de baculovirus, ainsi qu'à l'utilisation de ces lignées cellulaires pour l'expression de gènes d'intérêt clonés dans des baculovirus. L'expression, dans des cultures de cellules d'insectes, de gènes d'intérêt clonés dans des vecteurs dérivés de baculovirus, est une des méthodes de production de protéines recombinantes les plus utilisées à l'heure actuelle. L'optimum de température pour les cellules d'insecte en culture est compris entre 26 et 28 C. A des températures supérieures à 30 C, leur croissance ralentit considérablement, et elles meurent rapidement si elles sont maintenues à des températures supérieures à 35 C. Dans le cas de cellules de Spodoptera frugiperda en culture, il a été constaté qu'un choc thermique de courte durée (30 min.) à 42 C ne diminuait pas leur viabilité [CLEM et MILLER, Mol. Cell. Biol., 14, 5212-5222 (1994)].. Cependant, lorsque ces cellules sont maintenues à des températures supra-optimales pendant une plus longue durée, leur croissance est affectée ; HARA et al. [Biosc. Biotech. Biochem., 57 (6), 996-997, (1993)] rapportent par exemple que l'on n'observe aucune croissance des cultures de cellules Sf21 à 37 C. Lorsque ces cellules sont infectées par un baculovirus recombinant exprimant le gène de la P-galactosidase sous contrôle du promoteur de la polyédrine, l'expression de ce gène est maximale pour des températures de l'ordre de 30 C, décroît considérablement à 33 C, et devient nulle à 35 C. La production de protéines recombinantes dans des systèmes baculovirus/cellules d'insectes est donc classiquement effectuée à des températures avoisinant les 27 C. Ceci peut présenter des inconvénients, particulièrement lorsque l'on souhaite exprimer certaines protéines qui sont naturellement synthétisées à une température plus élevée (par exemple des protéines d'animaux à sang chaud, et en particulier de mammifères) ; en effet, il est connu que la température peut avoir une influence directe sur le repliement des chaînes polypeptidiques, et que pour certaines protéines, une variation de quelques degrés C de la température à laquelle elles sont synthétisées peut modifier leur activité de manière notable. De plus, on sait que la composition lipidique des membranes est différente à 27 C et à 37 C, ce qui est important pour l'environnement de certaines protéines et en particulier des protéines membranaires. C'est pourquoi il est souhaitable de pouvoir maintenir en culture et multiplier des cellules d'insectes permettant la multiplication de baculovirus et l'expression de gènes d'intérêt clonés dans ceux-ci, à une température la plus proche possible de la température corporelle des mammifères. La demande japonaise au nom de NORINSUISANSHO KAJU SHIKEN publiée le 19/04/91 sous le numéro J03094074 mentionne l'obtention d'une lignée de cellules dérivées de larves d'Agrotis segetum, et capables de survivre à 37 C. Ces cellules sont obtenues en procédant à une mutagenèse aléatoire par rayons ultraviolets, puis à une sélection des mutants par acclimatation à une alternance de températures (30 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 4 à 7 jours, 33 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 5 à 7 jours, 35 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 5 à 7 jours, 37 C pendant 2 à 5 jours, 25 C pendant 4 à 7 jours). Les cellules obtenues ainsi permettent, lorsqu'elles sont cultivées à des températures de 33 à 37 C, la multiplication de baculovirus pathogènes pour des insectes du genre Agrotis. Toutefois, la demande J03094674 ne donne aucune indication sur la stabilité de ces lignées cellulaires, ni sur leur capacité à se multiplier indéfiniment à 37 C, ou sur la possibilité de les utiliser comme cellules-hôte pour l'expression de gènes recombinants clonés dans des baculovirus. Les Inventeurs ont maintenant constaté que de manière surprenante, des cellules des lignées Sf9 et Sf21 de Spodoptera frugiperda (qui sont classiquement utilisées pour la production de baculovirus recombinants), pouvaient lorsqu'elles étaient placées dans certaines conditions, donner naissance à des cultures capables de pousser et de se multiplier normalement et indéfiniment à 37 C et convenant parfaitement pour la multiplication de baculovirus et l'expression dans ceux-ci de protéines recombinantes actives. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de cultures de cellules d'insectes, et en particulier de lépidoptères, capables de se multiplier à 37 C ; ce procédé comprend les étapes suivantes a) la mise en culture desdites cellules d'insecte à une température d'environ 27 2 C ; b) l'augmentation de la température de culture jusqu'à environ 37 1 C, c) le maintien en culture desdites cellules à cette température pendant 4 à 6 jours environ ; d) la récupération des cellules issues de l'étape c) et leur remise en culture à une température d'environ 37 1 C. L'augmentation de température de l'étape b) peut être effectuée en une seule étape, en élevant la température de la culture directement de 28 C à 37 C. Elle peut également être effectuée en plusieurs étapes, par exemple une première élévation de température de 27 à 30 C environ, suivie du maintien à la température de 30 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 30 C, de l'élévation de la température de cette culture de 30 à 33 C environ, suivie du maintien à la température de 33 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 33 C, de l'élévation de la température de cette culture de 33 à 35 C environ, suivie du maintien à la température de 35 C pendant 2 à 3 jours, de la récupération des cellules, de leur mise en culture à 35 C, et de l'élévation de la température de cette culture de 35 à 37 C environ. Chacune des étapes d'élévation de la température de la culture peut s'effectuer simplement par passage d'une étuve maintenue à la température la plus basse à une étuve maintenue à la température la plus élevée. Contrairement au procédé décrit dans la demande japonaise J03094674, le procédé conforme à l'invention ne nécessite aucune étape de mutagenèse. Des cellules d'insectes qui peuvent avantageusement être utilisées, conformément à l'invention, pour l'obtention de cultures de cellules capables de se multiplier à 37'C sont en particulier des cellules de Spodoptera frugiperda, par exemple celles de la lignée Sf21 ou de la lignée Sf9. Les milieux de culture classiquement utilisés pour la culture des cellules d'insecte conviennent pour la mise en ceuvre du procédé conforme à l'invention, et pour le maintien des cultures en résultant ; par exemple, dans le cas des lignées Sf9 ou Sf21, on peut utiliser l'un des milieux décrits par 0'REILLY et al. [Baculovirus Expression Vectors . A Laboratory Manual ; Freeman and Cie, New York, (1992)], tels que le milieu de GRACE, le milieu IPL-41, le milieu TC-100, etc... ou tout autre milieu. La présente Invention a également pour objet les cultures de cellules d'insecte susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus, et les lignées issues de ces cultures. Ces lignées seront dénommées ci-après lignées HT , et désignées par la dénomination de la lignée d'origine, suivie des lettres HT . Par exemple, ou dénommera Sf9-HT et Sf21-HT les lignées respectivement issues, conformément à l'invention, des cellules Sf9 et Sf21. Les lignées ainsi obtenues diffèrent des lignées-mères dont elles sont issues par leur nombre de chromosomes, qui est 2 fois plus élevé (endodiploïdie). Elles peuvent être maintenues en culture à 37 C, et se multiplier indéfiniment à cette température ; elles peuvent également être conservées sous forme congelée, et être remises en culture directement à 37 C. Elles conservent la possibilité de pousser et de se multiplier à 27 C (bien que plus lentement que les cellules dont elles sont issues), ainsi que la capacité de supporter la décongélation. Les cellules conformes à l'invention sont permissives pour les mêmes baculovirus que les cellules mères dont elles sont issues. Dans des cultures de cellules conformes à l'invention, ces baculovirus se multiplient à 37 C et produisent des particules infectieuses. Les Inventeurs ont en outre constaté que des gènes d'intérêt insérés dans des baculovirus recombinants peuvent être exprimés à 37 C dans les cultures de cellules conformes à l'invention, et permettent d'obtenir des protéines fonctionnelles. Les cultures de cellules conformes à l'invention sont donc utilisables, de la même manière que des cultures des cellules dont elles sont issues, pour exprimer des gènes d'intérêt clonés dans des baculovirus. La présente invention a pour objet un procédé d'expression d'au moins une protéine recombinante dans des cellules d'insecte, lequel procédé est caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée dans les cellules d'une culture conforme à l'invention. Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé conforme à l'invention, ladite protéine recombinante est exprimée à une température supérieure à 35 C, de préférence comprise entre 35 et 39 C. Tous les vecteurs d'expression habituellement utilisables dans les lignées Sf21 et Sf9 peuvent également être utilisés pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules Sf21-HT et Sf9-HT conformes à l'invention. On peut notamment utiliser des vecteurs dans lesquels le gène d'intérêt à exprimer est placé sous contrôle d'un promoteur très précoce, comme le promoteur IE-I, d'un promoteur précoce, comme le promoteur 39K, d'un promoteur tardif, comme le promoteur gp 67 ou celui de la protéine de capside, ou d'un promoteur très tardif, comme celui de la polyédrine ou de la protéine P10. On peut également utiliser des promoteurs cellulaires capables de fonctionner à 37 C, tels que par exemple le promoteur Actine 3 de Bombyx mori (ver à soie) ou des promoteurs de cellules de mammifères. On peut également utiliser des vecteurs du type multi-recombinant , dans lesquels 2 ou plusieurs gènes d'intérêt sont placés sous contrôle de 2 ou plusieurs promoteurs. Dans des cultures de cellules conformes à l'invention dérivées de la lignée monoclonale Sf9-HT, les promoteurs très précoces, précoces ou tardifs apparaissent comme plus actifs à 37 C que les promoteurs très tardifs (polyédrine ou P10) ; on pourra donc choisir le promoteur utilisé selon le niveau d'expression que l'on souhaite obtenir. Pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cultures de cellules conformes à l'invention, on peut également utiliser des vecteurs dérivés de baculovirus, tels que ceux décrits par exemple dans la Demande EP 0 638 647 aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE et du CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de cultures de cellules conformes à l'invention, et d'utilisation de ces cultures pour l'expression de gènes clonés dans des baculovirus. EXEMPLE 1 : OBTENTION DE CULTURES DE CELLULES SE MULTIPLIANT À 37 C Les lignées cellulaires utilisées sont d'une part, les lignées Sf21(IPLB-SF-21) et Sf9(ATCC CRL 1711) issues du lépidoptère Spodoptera frugiperda, et d'autre part, à titre comparatif, la lignée S2 issue de la mouche Drosophila melanogaster, la lignée CB 1225 issue du moustique Aedes albopictus, et la lignée Mb, issue du lépidoptère Mamestra brassicae. Les cellules des lignées de lépidoptères Sf21, Sf9, et Mb, et de la lignée S2 de Drosophile sont repiquées en milieu TC-100 (LIFE TECHNOLOGIES, INC.), supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal. Les cellules de moustique CB 1225 sont entretenues dans le milieu de MITSUHASHI-MARAMOROSCH [Contrib. Boyce Thompson Inst., 22, 435-460 (1964)]. Des cultures de cellules Sf9 ou Sf21, ainsi que des cultures des cellules Mb, S2, et CB 1225 sont placées dans une étuve à 28 C ; la température est augmentée graduellement pendant quatre jours, jusqu'à 37 C. Les cellules sont maintenues à cette température et leur croissance est surveillée quotidiennement. Après une semaine à 37 C, seules les cellules issues des cultures Sf9 et Sf21 sont capables de survivre. Les cellules issues des lignées Mb, S2 et CB 1225 cessent toute croissance à partir d'une température de 30 C, et meurent à partir de 35 C. Des prélèvements des cultures issues des lignées Sf9 et Sf21 sont diluées dans du milieu frais à raison de 1/5e", et remis en culture à 37 C. Les lignées stables obtenues après plusieurs passages en culture dans ces conditions sont dénommées Sf9-HT et Sf21-HT. La croissance de la lignée Sf9-HT à 37 C et 28 C a été comparée à celle de la lignée mère Sf-9 à 28 C. Les courbes de croissance, qui sont représentées sur la figure 1, montrent qu'à 28 C, les cellules Sf9-HT (O) poussent moins vite (temps de doublement 33,6 heures) que les cellules Sf9 (0) (temps de doublement 26,4 heures). En revanche les cellules Sf9-HT à 37 C (A) poussent plus vite (temps de doublement 19,2 heures) que les cellules Sf9 à 28 C. La phase stationnaire est atteinte plus rapidement (4 jours) et correspond à une densité cellulaire plus faible (1,2.106 cellules) dans le cas des cellules Sf9-HT que dans celui des cellules Sf9 (8 jours, et 2,7.106 cellules). L'examen des cellules Sf9-HT au microscope montre qu'elles ont une morphologie normale ; cependant leur diamètre moyen est plus important que celui des cellules Sf9. L'analyse en@cytométrie de flux montre que le contenu en ADN des cellules Sf9-HT est 2 fois plus important que celui des cellules Sf9. L'analyse comparative des lipides membranaires des cellules Sf9 et Sf9-HT a été effectuée. Les résultats de cette analyse sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous. Dans la lignée Sf9-HT, on observe une augmentation de la sphingomyéline et du phosphatidylinositol, et une diminution de la phosphatidylcholine et de la phosphatidyléthanolamine, ce qui entraîne une augmentation du rapport sphingomyéline/phosphatidylcholine. On observe également une augmentation globale du pourcentage d'acides gras saturés, principalement due à une augmentation de l'acide palmitique. EXEMPLE 2 : MULTIPLICATION DU BACULOVIRUS ACMNPV, ET EXPRESSION DES PROMOTEURS DANS DES CELLULES SF9-HT CULTIVÉES À 37 C Des cultures de la lignée Sf9-HT ont été infectées par le baculovirus AcMNPV, à 28 C ou à 37 C, selon le protocole suivant Les cellules Sf9-HT sont reprises dans le milieu TC-100 utilisé à l'Exemple 1, sans sérum de veau foetal et réparties dans des boîtes neuves. Une heure après, lorsque les cellules adhérent au fond des boîtes de culture, le milieu de culture est éliminé et on ajoute l'inoculum viral, produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C, à raison de 10 unités virales infectieuses par cellule. Après une heure d'incubation à température ambiante, on ajoute du milieu complet, et l'on place les cultures à 28 C, ou à 37 C. Le cycle viral est observé en microscopie électronique. 72 heures après l'infection, on observe, dans les cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, des particules virales présentes en grand nombre dans le noyau, ainsi que des polyèdres et des structures fibrillaires correspondant à la protéine P10. Dans les cellules à 37 C, en revanche, on ne distingue clairement que les particules virales intranucléaires. Dans les 2 cas, les cellules Sf9-HT sécrètent des particules virales infectieuses dans le milieu de culture ; dans le cas des cellules infectées cultivées à 37 C, le titre en particules virales infectieuses produites est 10 fois moindre qu'à 28 C. Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées à 37 C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d'infection virale dans des cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique à celui observé avec l'inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C. La Figure 2 représente l'évolution du titre viral dans les cellules SF9-HT et Sf9 au cours des différents passages, à partir d'un même inoculum initial (10 unités virales infectieuses par cellule) obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C (#) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9 à 28 C, puis 4 passages successifs à 28 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 28 C ; (1) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9-HT à 37 C, puis 4 passages successifs à 37 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 37 C ; (0) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9-HT cultivées à 28 C, puis 4 passages successifs à 28 C avec l'inoculum du passage précédent obtenu à 28 C ; (#) (témoin) inoculum initial obtenu sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C ; passage sur des cellules Sf9 cultivées à 37 C puis 4 passages successifs à 37 C avec l'inoculum du passage précédent. Dans ce cas, on n'observe aucune réplication virale. Lorsque des particules virales sécrétées par les cellules Sf9-HT infectées cultivées à 37 C, sont utilisées comme inoculum pour un nouveau cycle d'infection virale dans des cellules Sf9-HT ou Sf9 cultivées à 28 C, on observe dans ces dernières la formation de polyèdres et de structures fibrillaires ; en outre, le titre en particules virales infectieuses est identique à celui observé avec l'inoculum viral produit sur des cellules Sf9 cultivées à 28 C. Le profil d'expression des gènes des baculovirus infectant ces cultures de cellules est différent à 28 C et à 37 C, comme le montrent les Figures 3a à 3f, qui illustrent la comparaison des cinétiques d'expression dans les cellules Sf9 à 28 C () , et à 37 C (-) ou dans les cellules Sf9-HT à 28 C (M) , et à 37 C des ARN messagers correspondant à des protéines très précoces (IE1), précoces (39K), tardives (gp67 et vp39) ou très tardives (polyédrine et P10). En abscisse, le temps de culture après infection (heures) ; en ordonnée, la quantité d'ARNm (exprimée en cpm) pour les gènes des protéines IE1 (3a), 39K (3b), gp67 (3c), vp39 (3d), P10 (3e), et polyédrine (ph) (3f), à 28 C et 37 C. Ces ARNm sont extraits et dosés en utilisant des sondes spécifiques d'ARNc marquées au 32P sur les résidus C, obtenues à l'aide du KIT RIBOPROBE PROMEGA. Dans le cas des cellules Sf9 : à 28 C, 24 heures après l'infection, les ARN messagers principalement présents sont ceux des gènes gp 67, ie1, vp39 et 39k ; à partir de 48 heures après l'infection, les ARN messagers les plus exprimés sont ceux des gènes très tardifs (polyédrine et P10) ; à 37 C on n'observe aucune expression des ARNm, à l'exception d'une faible expression de l'ARNm 39k. Dans le cas des cellules Sf9-HT infectées à 37 C, l'expression des gènes ie1, 39K, gp67 et Vp39 est diminuée, avec seulement 6, 20, 20 et 30% d'expression à 24 h post-infection, par rapport à ce que l'on observe à 28 C avec les cellules Sf9. Quant à l'expression des gènes très tardifs polyédrine et P10, elle est seulement de 15 à 20% (à 24 heures). Bien que les productions des ARNm des gènes polyédrine et P10 apparaissent faibles en valeurs relatives (surtout à 48 h), elles sont cependant du même ordre de grandeur que ce que l'on observe pour les gènes iel et 39K. En effet, les sondes utilisées pour mesurer la synthèse des ARN exprimés sous le contrôle des promoteurs P10 et iel sont de taille comparable (ie1 278bp/P10 233bp). Cependant, leur contenu en résidus C est cependant plus faible pour P10 (70 pour iel et 44 pour P10). De même, les sondes polyédrine et 39K sont de taille comparable (513bp pour la sonde 39K et 460 pour la sonde polyédrine), mais le contenu en résidus C est respectivement de 104 pour la sonde 39K et de 125 pour la sonde polyédrine). Ainsi, à 24 heures post-infection, les gènes !e1, P10 et polyédrine sont transcrits avec la même efficacité ; et le gène 39K est le mieux exprimé dans ces conditions. EXEMPLE 3 : MULTIPLICATION DU BACULOVIRUS ACMNPV DANS DES CELLULES SF21-HT CULTIVÉES À 37 C Une culture de cellules Sf21-HT capables de se multiplier à 37 C, a été infectée par le baculovirus AcMNPV selon le protocole indiqué à l'Exemple 2 ci- dessus. Le cycle viral a été observé en microscopie électronique dans les cellules cultivées à 27 C, et celles cultivées à 37 C. 72 heures après l'infection, l'aspect des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 27 C est identique à celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions, décrit à l'exemple 2. La majeure partie des cellules Sf21-HT infectées cultivées à 37 C a également le même aspect que celui des cellules Sf9-HT cultivées dans les mêmes conditions. Cependant, on observe en outre la présence de polyèdres dans 1 à 2% environ des cellules Sf21-HT. EXEMPLE 4 : EXPRESSION DANS DES CELLULES SF9-HT CULTIVÉES À 37 C D'UN GÈNE HÉTÉROLOGUE CLONÉ DANS UN BACULOVIRUS. Le gène lacZ codant pour la (3-galactosidase a été placé sous contrôle du promoteur du gène de la protéine P10, ou bien sous contrôle du promoteur du gène de la polyédrine, dans des baculovirus recombinants issus du virus AcMNPV. Des cultures de cellules Sf9-HT capables de se multiplier à 37 C, ont été infectées par l'un ou l'autre de ces baculovirus recombinants, selon le même protocole que celui indiqué ci-dessus pour le baculovirus AcMNPV. Après 3 jours de culture à 37 C, l'activité (3- galactosidase est révélée dans les cellules, en utilisant comme substrat chromogène, le X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- indoyl-(3-D-galactopyranoside) et les cultures sont observées au microscope. Dans le cas du promoteur du gène de la protéine P10, une proportion importante des cellules (environ 95%) présente une coloration bleue, indiquant l'expression de (3-galactosidase active. Dans le cas du promoteur du gène de la polyédrine environ 5% des cellules présentent une coloration bleue. - Immunoglobulines Un baculovirus recombinant exprimant les chaînes lourdes et légères d'une immunoglobuline humaine [POUL et al., Eur. J. Immunol., 25, 2005-2009, (1995)] a été utilisée pour infecter une culture de cellules conformes à l'invention. Au bout de 4 jours de culture à 37 C, on récupère dans le surnageant des cultures jusqu'à 2mg/1 d'anticorps fonctionnels (soit environ 2mg d'anticorps pour 5.10$ cellules). REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention de cultures de cellules d'insecte capables de se multiplier à 37 C, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) la mise en culture desdites cellules d'insecte à une température d'environ 27 2 C ; b) l'augmentation de la température de culture jusqu'à environ 37 1 C, c) le maintien en culture desdites cellules à cette température pendant 4 à 6 jours ; d) la récupération des cellules issues de l'étape c) et leur remise en culture à une température d'environ 37 1 C. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules mises en culture sont des cellules de Spodoptera frugiperda. 3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que lesdites cellules de Spodoptera frugiperda appartiennent à la lignée Sf9 ou à la lignée Sf21. 4) Culture de cellules d'insecte, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3. 5) Procédé de culture de cellules d'insecte, caractérisé en ce que l'on met en culture à 37 C des cellules issues d'une culture selon la revendication 4. 6) Procédé d'expression d'une protéine recombinante en cellules d'insecte, lequel procédé est caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée dans les cellules d'une culture selon la revendication 4. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante est exprimée à une température supérieure à 35 C, de préférence comprise entre 35 et 39 C. 8) Utilisation des lignées cellulaires Sf9 et Sf2l de Spodoptera frugiperda, pour l'obtention de cultures de cellules capables de se multiplier à 37 C.