Brevet FR2795739A1 — publié le 20010105

GENE SYNTHETIQUE crylC ET PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT LEDIT GENE L'invention est relative à la construction d'un gène synthétique crylC de Bacillus thuringiensis et à son expression dans les plantes pour les rendre résistantes aux attaques des insectes. Bacillus thuringiensis (Bt) produit lors de sa sporulation, différentes toxines insecticides (protéines Cry). Ces protéines sont produites sous forme de protoxines cristallines, qui sont solubilisées après ingestion par les insectes et subissent dans l'intestin de ceux-ci une protéolyse qui libère la toxine active. On connaît actuellement plus d'une centaine de protéines de la famille Cry, regroupées selon leurs homologies de séquence et leur spécificité d'action. L'utilisation des toxines insecticides de Bacillus thuringiensis dans le cadre de la lutte contre les insectes ravageurs fait l'objet d'un grand intérêt, en particulier du fait de l'innocuité de ces toxines pour l'environnement. Notamment, on a construit des plantes transgéniques exprimant des gènes bactériens (gènes cry), dans le but d'augmenter leur résistances aux attaques des insectes phytophages. Il a toutefois été constaté que le niveau d'expression des gènes bactériens cry natifs dans les plantes était trop faible pour conférer une résistance efficace. Pour augmenter l'expression des gènes cry, il a été proposé de modifier leurs séquences, notamment en éliminant diverses séquences qui peuvent interférer avec l'expression dans les cellules eucaryotes, et en remplaçant les codons utilisés chez les procaryotes pour codons préférentiellement utilisés chez les plantes. Les gènes synthétiques créés de la sorte peuvent avoir une expression jusqu'à 500 fois plus élevée que celle observée pour les gènes cry natifs ; il en résulte une protection beaucoup plus efficace des plantes transformées par lesdits gènes [pour revue, voir. MAZIER et al, Biotechnol. Ann. Rev., 3 : (1997)]. B. thuringiensis subsp. aizawai produit une protéine, dénommée CryIC, toxique envers les lépidoptères du genre Spodoptera, et notamment Spodoptera littoralis, qui est un ravageur du coton. Le gène correspondant (crylC) a été cloné et séquence [SANCHIS et al. Mol. Microbiol., 3 : (1989)]. Le transfert du gène natif crylC dans des plantes permet de conférer à celles-ci un certain niveau de résistance envers S. littoralis. Néanmoins, le transgène ne s'exprime pas à un niveau assez élevé pour procurer une protection efficace à la plante ; par exemple, dans le cas de plants de tabac transgéniques, le nombre de plantes montrant une résistance à cet insecte reste faible (2 plantes sur une trentaine de plantes testées montrent >80% de mortalité en 7 jours vis-à-vis de larves au stade L1-L2 pré-mue), et la mortalité observée décroît au fur et à mesure que la plante testée vieillit [MAZIER et al. Plant Sci., 127 : 179-190, (1997)]. VAN DER SALM et al. [Plant Mol. Biol., 26 : 51-59,(1994)] décrivent l'expression dans des plants transgéniques de tabac et de tomate d'un gène crylC synthétique ; les modifications apportées, limitées à 45 nucléotides dans 9 régions du gène crylC permettent une expression du transgène à un niveau suffisant pour pouvoir détecter les ARNm, mais ne permettant pas la détection des protéines correspondantes. Cette amélioration du niveau d'expression s'accompagne cependant d'une certaine augmentation de la protection contre des larves de Manduca sexta et Spodoptera exigua. STRIZHOV et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 15012-15017, (1996) ] décrivent l'expression d'un gène crylC synthétique dans des plants transgéniques de luzerne et de tabac. Ce gène code un fragment N-terminal de 630 acides aminés de la protoxine. Les modifications apportées par rapport à la séquence native codant le même fragment concernent 286 bases sur un total de 1890, soit 15% des bases, et touchent 249 codons sur 630, soit 39,5% des codons. Ce gène synthétique, associé à la séquence de tête (leader séquence) du TMV, a été placé sous contrôle du promoteur 35S de CaMV, renforcé par la présence de 4 copies des éléments amplificateurs. L'expression de cette construction dans des plants transgéniques de luzerne et de tabac aboutit à la production de protéines CryIC à un niveau détectable, variant, selon le plant concerné, entre 0,01 et 0,2% des protéines solubles totales, et permet d'obtenir une protection contre des larves de Spodoptera littoralis et Spodoptera exigua issues de souches sensibles à CryIC. L'expression de la même construction chez le brocoli a permis d'obtenir une production de CryIC plus importante que celle obtenue chez la luzerne et le tabac, et allant jusqu'à 0,4% des protéines totales solubles [CAO et al., Mol. Breed., 5, 131-141, (1999) ] ; les plants de brocolis transgéniques produisant la plus grande quantité de protéine CryIC sont protégés contre des larves d'une souche de Plutella xylostella sensible à CryIC, et également contre des larves d'une souche de Plutella xylostella 100 fois plus résistante à CryIC que la précédente. Les Inventeurs ont recherché s'il était possible d'augmenter encore, par l'apport de modifications supplémentaires dans la séquence du gène crylC, le niveau d'expression de la toxine CryIC dans des plantes transgéniques et d'améliorer la protection conférée à ces plantes. Ils sont ainsi parvenus à obtenir un gène crylC synthétique s'exprimant à un niveau très élevé dans des plantes transgéniques, et conférant une protection plus efficace que les gènes crylC synthétiques précédemment décrits dans l'art antérieur, notamment vis- à vis de larves de Spodoptera à des stades tardifs de leur développement. En outre, ils ont constaté que l'expression de ce gène permettait de protéger les plantes contre des insectes ayant développé une résistance à la toxine CryIC. La présente invention a pour objet tout acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique de ce gène crylC synthétique. Cette séquence est représentée dans la liste de séquences en annexe par le numéro SEQ ID NO: 1. Par rapport à la séquence nucléotidique de la portion correspondante du gène bactérien, 25,5% des bases ont été remplacées, et 65% des codons modifiés dans le gène crylC synthétique conforme à l'invention. La séquence peptidique diffère essentiellement de la séquence publiée par SANCHIS et al. (1989) par le remplacement des huit premiers acides aminés de la séquence sauvage (M-E-E-N-N-Q-N-Q) par la séquence M-A-QI-P-P-Q, et le remplacement de la séquence en acides aminés C375-Q-R-H-H379 par la séquence W375-P-A-P-P379,, et des acides aminés 1365 et G385 par N365 et V385, afin de corriger une erreur signalée [STRIZHOV et al. Mol. Gen. Genet., 253 : 11-19, (1996) ] dans la séquence initialement publiée par SANCHIS et al. Les modifications apportées permettent d'obtenir dans les plantes transgéniques un taux d'expression très élevé. Dans des plants de tabac transgénique on observe ainsi un niveau d'expression de CryIC, variant, selon le plant concerné, entre 0,15 et 1% des protéines solubles totales. La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants comprenant une séquence d'ADN conforme à l'invention, et utilisables notamment pour le transfert de ladite séquence et/ou son expression dans des cellules de plantes hôtes. Pour l'expression dans des plantes ou des cellules de plantes, ladite séquence d'acide nucléique sera placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. A titre d'exemples non limitatifs 'de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera : le promoteur CaMV35S [BENFEY et al, Science, 250, pp. 959-966, (1990) ] ; les promoteurs Agrobacterium tumefaciens T-DNA : nopaline synthase, octopine synthase, mannopine synthase, l', 2' [SANDERS et al., Nucleic Acid Res., 15, pp. 1543-1558, (1987) ; HOOYKAAS and SCHILPEROORT, Plant. Mol. Biol., 19, pp. 15- 38, (1992)]. La présente Invention a en outre pour objet des cellules, organes, ou tissus végétaux, transformés par au moins une séquence d'ADN conforme à l'invention, ainsi que des plantes transgéniques dont le génome comprend au moins une séquence d'ADN conforme à l'invention. Ces cellules, organes, tissus végétaux, ou plantes peuvent être obtenus par les techniques habituelles de transformation et de transgénèse végétale, qui sont connues en elles-mêmes. Bien entendu, l'invention englobe également les descendants, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes conformes à l'invention obtenues par transgénèse, dans la mesure où ces descendants contiennent également dans leur génome au moins une copie d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. Le gène synthétique crylC conforme à l'invention peut notamment être utilisé pour transformer les plantes telles que le tabac, le coton, le maïs, le trèfle, la tomate, la luzerne, le chou, afin d'augmenter leur résistance aux insectes ravageurs, et notamment leur résistance vis-à-vis des larves de lépidoptères de la famille des noctuelles, notamment du genre Spodoptera, en particulier S. littoralis, S. exigua, S. frugiperda, S. cosmioides, ou vis à vis des larves de lépidoptères du genre Mamestra, notamment Mamestra brassicae. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention 'et d'utilisation d'un gène synthétique conforme à l'invention. EXEMPLE 1- CONSTRUCTION D'UN GÈNE SYNTHÉTIQUE cryIC: L'assemblage du gène crylC synthétique a été effectué selon la technique décrite par SARDANA et al. Plant Cell Rep., 15 : 677-681, (1996), avec les modifications suivantes : La séquence du gène crylC, représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 est divisée en quatre " blocs " (" A " à " D ") qui sont clonés séparément puis liguaturés entre eux pour couvrir la totalité de la séquence. Chacun des blocs est synthétisé selon le protocole suivant : Les oligonucléotides qui constituent le bloc sont mélangés en concentration équimolaire, puis soumis à une réaction de PCR. Le mélange réactionnel (100 l) est le suivant : - 1 pmole de chacun des oligonucléotides - 6 mM MgS04 - 250 M dATP, dTTP, dCTP, dGTP - 2 unités de polymérase VENTR# - IX Tampon de réaction pour polymérase VENTR# Le profil de la réaction de PCR est le suivant : 1) - 95 3mns - 95 # 42 en 120 mns 1 cycle - 42 2 mn - 72 30 secondes 2) - 95 lmn - 95 # 42 en 120 mns 1 cycle - 42 30 secondes - 72 30 secondes 3) - 95 1 mn - 42 30 secondes 15 cycles - 72 30 secondes 4) - 95 1 mn - 44 30 secondes 15 cycles - 72 30 secondes 5) - 72 5 mns A la fin de la réaction, le mélange est soumis à une extraction au phénol:chloroforme (1:1), puis à une extraction au chloroforme. Une aliquote de la première réaction de PCR est ensuite soumise à une nouvelle réaction d'amplification par PCR. Dans ce cas, les amorces utilisées (oligonucléotides " externes ") correspondent aux séquences des deux extrémités du bloc, auxquelles des séquences correspondant à des sites d'enzymes de restriction (en l'occurrence, le site Kpnl à l'extrémité 5', et le site HindIII à l'extrémité 3') ont été ajoutées pour faciliter le clonage des produits de PCR ainsi obtenus. Le mélange réactionnel (100 l) est le suivant : - 30 pmoles chacun des oligonucléotides externes - 6 mM MgS04 - 250 M dATP, dTTP, dCTP, dGTP - 2 unités de polymérase VentR - 5 l du produit de PCR de la première réaction Les conditions de PCR sont les suivantes : 1) - 93 3 mns - 50 30 secondes 1 cycle - 72 1 mn 30 secondes 2) - 95 30 secondes - 50 30 secondes 30 cycles - 72 1 mn 30 secondes 3) - 72 3 mns A la fin de la réaction, le mélange est soumis à une extraction au phénol:chloroforme (1:1), puis à une extraction au chloroforme. Une aliquote du produit de la réaction (25 fil) est soumise à une électrophorèse en gel d'agarose, et la bande correspondant à l'ADN de taille attendue est isolée. Après hydrolyse à l'aide des enzymes de restriction adéquates, dont le site de reconnaissance a été incorporé lors de cette réaction de PCR, l'ADN est cloné dans le vecteur pGem7Zf(-) (PROMEGA) hydrolysé par les enzymes de restriction Kpnl et HindIII. Le vecteur pGem7Zf(-), outre un gène de résistance à l'ampiciline, comporte un site de clonage multiple où sont présents des sites de restriction pour les enzymes suivantes : Apal, AatII, SphI, Xbal, Xhol, EcoRI, Kpnl, Smal, Csp45I, ClaI, HindIII, BamHI, Sacl (= SstI), BstXI, et NsiI. Les produits de synthèse sont vérifiés par séquençage des deux brins d'ADN. Si aucun des clones analysés ne contient de séquence sans erreurs, on répare celles-ci par mutagenèse dirigée. Les différents blocs ainsi obtenus sont ligaturés entre eux pour produire le gène entier selon le protocole suivant : Le bloc B ", cloné dans le vecteur pGem7Zf(-), est hydrolysé par les enzymes de restriction StuI et HindIII, et l'insert de ca. 580 pb isolé sur gel. Cet insert est cloné en aval du bloc " A entre les sites de restriction StuI et HindIII. La construction ainsi obtenue, est nommée A+B " . Le bloc C " est digéré par les enzymes de restriction EcoRV et HindIII, et l'insert de ca. 420 pb est cloné en aval du bloc " A+B ", entre les sites de restriction EcoRV et HindIII, pour donner la construction " A+B+C " . Finalement, le bloc " D " est hydrolysé par les enzymes BglII et HindIII. L'insert de ca.610 pb est ensuite cloné en aval du bloc " A+B+C " entre les sites de restriction BglII et HindIII. La construction ainsi obtenue (" A+B+C+D ") correspond au gène crylC dans son entier. Afin de s'assurer de l'intégrité de la séquence, les deux brins d'ADN sont séquences. La figure 1 représente la séquence du gène synthétique crylC, indiquant les oligonucléotides utilisés pour sa construction. Chacune des flèches représente un oligonucléotide dont la séquence est indiquée. Les sites de restriction délimitant les quatre blocs (A, B, C, et D) sont encadrés : le bloc A s'étend du début du gène jusqu'au site St:ul, le bloc B, du site Stul au site EcoRV, le bloc C est compris entre les sites EcoRV et BglII, tandis que le bloc D s'étend du site BglII jusqu'à la fin de la séquence. Le bloc A a été construit à l'aide des oligonucléotides Al à A4, le bloc B à l'aide des oligonucléotides Bl à B8, le bloc C à l'aide des oligonucléotides Cl à C6, et le bloc D à l'aide des oligonucléotides Dl à D8. Pour les oligonucléotides identifiés par des numéros impairs (flèches pleines), la séquence de l'oligonucléotide utilisé correspond à la séquence indiquée sur la figure 1, tandis que pour les oligonucléotides identifiés par des numéros pairs (flèches en pointillés), la séquence de l'oligonucléotide utilisé est le complément de la séquence indiquée sur la figure 1. Le sens de la flèche indique la polarité de l'oligonucléotide (de 5' en 3'). EXEMPLE 2 : TOXICITÉ DE LA PROTÉINE CryIC VIS-À-VIS 'DE DIFFÉRENTES ESPÈCES DE SPODOPTERA Des essais biologiques ont été effectués par ingestion libre de milieu artificiel traité en surface selon la technique décrite par MÜLLER-COHN et al. [(J. Econ. Entomol., 89,4 : 791-797, (1996) ]. La protéine CryIC a été distribuée à l'aide d'une micropipette à la dose de 750ng/cm2 à la surface du milieu artificiel. L'expérimentation a été effectuée sur des lots de 30 larves de différentes espèces de Spodoptera au stade larvaire Ll pré-mue (L1PM). La mortalité larvaire à 5 jours a été déterminée par calcul du pourcentage de larves mortes dans chaque lot. Pour tenir compte de la mortalité dans le lot témoin, les résultats sont corrigés selon la formule d'ABBOT ci-dessous. Mortalité ABBOTT = (% de mortalité du lot traité - % de mortalité témoin) x 100 (100 - % de mortalité témoin ) Les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau IV ci-dessous: TABLEAU IV Espèce Stade larvaire % de mortalité à 7 jours* S. littoralis L1 77 S. exigua L1 100 S. frugiperda L1 50 S. cosmioïdes L1 98 Ces résultats montrent que la protéine CryIC est active sur différentes espèces de Spodoptera. EXEMPLE 3 : OBTENTION DE PLANTES TRANSGÉNIQUES ET EXPRESSION DU GÈNE SYNTHÉTIQUE crylC DANS CES PLANTES Le gène synthétique obtenu comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus a été cloné dans le vecteur binaire pKYLX71-35S2 [MAÏTI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp. 6110-6114, (1993)]. Ce vecteur comprend un site de clonage multiple (comportant des sites uniques pour les enzymes de restriction HindIII, XhoI, Sacl = SstI et Xbal) permettant le clonage du gène d'intérêt entre le promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chôufleur (CaMV), dont la partie amplificateur a été doublée (P35S2), et le terminateur de la petite sous-unité de la Rubisco (tRbcS), ainsi qu'un marqueur de sélection (nptll) conférant une résistance à la kanamycine, sous le contrôle du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase. Pour ce faire, le vecteur pGem7Zf(-) portant le gène synthétique crylC entre les sites de restriction Kpnl et HindIII est digéré par les enzymes de restriction Xhol et Sstl. L'insert de ca. 1900 pb est purifié sur gel d'agarose, et cloné dans le vecteur pKYLX71-35S2 hydrolysé par les enzymes de restriction Xhol et SstI. La construction ainsi obtenue est nommée pKYcryIC. Après vérification de son intégrité, la construction pKYcryIC est transférée dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58 : pGV2260 [DEBLAERE et al, Nucleic Acids Res. 13 : 383-396 (1985)] Construction de tabacs transgéniques Des plants de tabac ont été transformés avec la construction pKYcryIC décrite ci-dessus, par transfert de gènes via Agrobacterium tumefaciens selon la méthode décrite par HORSCH et al. [Science 227 : 1229-1231, (1985)]. La quantité de toxine synthétisée par les plantes transgéniques, a été évaluée par transfert de protéines (Western blot), selon le protocole suivant : Les protéines solubles totales sont extraites par broyage d'un fragment de feuille dans du tampon d'extraction (50 mM Tris-HCl pH 9,150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Triton-XlOO). Le broyat est centrifugé, et le surnageant contenant les protéines est prélevé. La quantification des protéines est réalisée suivant la méthode de BRADFORD, [Anal. Biochem., 72 : 248-254, (1976)]. Les protéines (10 g) sont soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE), et transférées sur une membrane de nitrocellulose suivant le protocole standard [SAMBROOK et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)]. La détection de la toxine CryIC est réalisée à l'aide d'anticorps issus de jaune d'#uf (IgY) dirigés contre cette protéine, et d'un anticorps secondaire antiIgY marqué à la phosphatase alcaline, suivant les techniques classiques [SAMBROOK et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Second édition. Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)]. Le témoin négatif est constitué d'un extrait protéique provenant d'une plante témoin (transformée avec un vecteur similaire à celui des plantes résistantes mais ne portant pas le gène crylC). Pour estimer la quantité de toxine CryIC produite par les plantes analysées, des échantillons constitués d'un extrait de plante témoin, auquel on ajoute une quantité croissante (de 1 à 200 ng) de toxine purifiée (gamme témoin), sont déposés sur le même gel que les extraits à analyser. Une comparaison des intensités des bandes obtenues pour les échantillons à analyser avec la gamme témoin permet d'estimer la quantité de toxine CryIC présente dans les échantillons. Les résultats de ces expériences montrent que, suivant les lignées testées, le taux d'expression du gène synthétique crylC se situe entre 0,15 et 1% des protéines totales solubles. EXEMPLE 4 : PROTECTION CONFÉRÉE PAR LE GÈNE SYNTHÉTIQUE DANS DES PLANTES TRANSGÉNIQUES Les plants de tabac régénérés obtenus comme indiqué à l'exemple 3 ci-dessus sont utilisés pour effectuer des bioessais sur fragments de feuilles en utilisant des larves de S. littoralis à différents stades. Ll, L2 et L3 PM = stade larvaire Ll, L2, L3 prémue) . Le protocole de ces essais est le suivant : Les morceaux de feuilles de tabac sont découpés et déposés dans des boîtes en plastique, rondes, de 28 mm de diamètre. Le fond des boîtes est garni d'une rondelle de papier filtre humidifié, le couvercle est aéré. Dans chaque boîte, on dépose deux morceaux de feuille de tabac, puis on introduit 6 larves, de stade défini à l'avance. Cinq répétitions sont réalisées pour une plante (5 fois 6 larves par plante) Les 5 boîtes contenant une même plante sont rassemblées dans une cellule plastique. L'ensemble de l'essai est maintenu en pièce en conditions contrôlées (25 C, 16 heures de photophase) pendant 7 jours. Des contrôles intermédiaires de la mortalité sont effectués après 2 et 4 jours. Chaque essai comporte un lot témoin réalisé dans les mêmes conditions avec du tabac témoin (transformée avec un vecteur similaire à celui des plantes résistantes mais ne portant pas le gène crylC). On détermine la mortalité ABBOT comme indiqué à l'exemple 2 ci-dessus. Les résultats de ces expériences sont présentés dans le tableau III suivant: TABLEAU III L1PM L2PM L3PM LIGNÉE ~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1j 2j 4j 7j 2j 3j 2j 3j 4j FL2- 69 100 100- - 76 84 84 FL17- 93 100 100- - 72 96 96 FL35 3- 100 100- - - - FL43- 79 100 100 100 100 - - FL50 - 89 100 100 100 100- - Protection conférée vis-à vis d'une souche de S. littoralis résistante à la toxine CryIC Certains tabacs transgéniques ont été testés en utilisant une souche de S. littoralis résistante à la toxine CryIC, sélectionnée en laboratoire [MÜLLER-COHN et al., (J. Econ. Entomol., 89, 4 : 791-797, (1996). Cette souche (44ème génération après sélection) résistante est homozygote pour le facteur de résistance à la protéine CryIC, et au moment du bioessai, sa DL50 envers la protéine CryIC est 367 fois plus élevée que celle de la souche sensible. Les bioessais ont été effectués dans les conditions décrites ci-dessus, en utilisant des larves au stade larvaire Ll pré-mue (L1PM). La mortalité ABBOT a été déterminée comme décrit ci-dessus. Les résultats de ces bioessais (mortalité ABBOT) sont donnés dans le tableau IV ci-dessous: TABLEAU IV L1PM RR Lignée n 2j 3j 4j 7j FL2 41 79 90 97 FL17 79 100 100 100 Les expériences menées montrent que, contrairement au gène natif crylC, le gène synthétique s'exprime à un taux très élevé, et permet de conférer une protection efficace contre des larves de S. littoralis à divers stades de développement. Le gène synthétique induit une mortalité rapide : (100% de mortalité sur des larves au stade Ll PM dans un bioessai de 4 jours) pour toutes les plantes testées. La protection conférée est également efficace contre des larves plus âgées, et par conséquence moins sensibles aux toxines (100% de mortalité sur des larves L2PM, >80% de mortalité sur des larves L3PM). En outre, les tabacs ayant intégré le gène synthétique crylC montrent une protection efficace (>97% de mortalité dans un bioessai de 7 jours) contre des larves Ll PM d'une souche résistante (DL50 souche résistante 367 x DL50 souche sensible). Des bioessais ont également été réalisés sur des larves de Spodoptera frugiperda avec la lignée FL17 de tabac exprimant le gène synthétique crylC et qui entraîne 100% de mortalité sur les larves de S. littoralis (au stade Ll) à 3 jours. Pour des larves de l'espèce frugiperda (au même stade larvaire Ll), on observe également 100% de mortalité à 3 jours. On constate donc une très grande efficacité du gène synthétique crylC, exprimé dans une plante, sur deux espèces du genre Spodoptera. LISTE DE SEQUENCES INRA CIRAD GENE SYNTHETIQUE CRYIC ET PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT LEDIT GENE MJPcb539/88 2 1 1890 ADN Séquence artificielle CDS (1)..(1890) Description de la séquence artificielle : synthétique cryIC 1 atg gct caa att ccc cet caa tgc ata cct tac aat tgt tta agt aat 48 Met Ala Gln Ile Pro Pro Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn 1 5 10 15 cct gaa gaa gta ctg ctt gac gga gag cgt atc tcc acc gga aac tcc 96 Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn Ser 20 25 30 tcc atc gac atc tcc ttg tcc ctt gtt cag ttc ttg gtg tcc aac ttc 144 Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser Asn Phe 35 40 45 gtt cca ggt gga gga ttc ctt gtg gga ctt atc gat ttc gtg tgg gga 192 Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val TrpGly 50 55 60 atc gtg gga cca tcc cag tgg gac gcc ttc ttg gtt caa atc gag caa 240 Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln 65 70 75 80 ttg atc aac gag agg atc gct gag ttc gct cgt aac gct gct atc gct 288 Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala Ile Ala 85 90 95 aac ttg gag gga ttg gga aac aac ttc aac atc tac gtg gag gcc ttc 336 Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala Phe 100 105 110 aag gag tgg gag gaa gat ccc aac aat cca gct aca cgt acc aga gtc 384 Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg Val 115 120 125 att gat cgc ttt cgt atc ctt gac ggt ctc ctt gag cgt gac att ccc 432 Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile Pro 130 135 140 tcc ttt cgc atc agt ggg ttc gaa gtt cca ctt ctc tca gtc tac gcc 480 Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala 145 150 155 160 caa gct gcc aac ctt cat ctt gcc atc ttg cgt gac tct gtc atc ttt 528 Gin Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile Phe 165 170 175 gga gag agg tgg ggc ctg acc act atc aac gtg aat gag aac tac aac 576 Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr Asn 180 185 190 aga ctc att cgc cac att gac gag tat gca gat cac tgc gct aac acc 624 Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn Thr 195 200 205 tac aat cgt ggc ttg aac aat ctt ccc aag tct ace tat caa gac tgg 672 Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gin Asp Trp 210 215 220 atc acc tac aac agg ctt cgt cgc gac ttg aca ttg acc gtt ctc gac 720 Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 att gca gcc ttc ttt ccc aac tac gac aac cgt agg tat ccc att caa 768 Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 cca gtt ggt caa ctc act aga gag gtc tac act gac cca ctt atc aac 816 Pro Val Gly Gin Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn 260 265 270 ttc aac cca cag ttg cag tca gtt gcc cag ctt ccg acc ttc aac gtt 864 Phe Asn Pro Gin Leu Gin Ser Val Ala Gin Leu Pro Thr Phe Asn Val 275 280 285 atg gag tca tcc gcc atc agg aat cca cac ctc ttt gat atc ttg aac 912 Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu Asn 290 295 300 aat ctt acc atc ttc act gac tgg ttc agc gtt ggc cgc aac ttc tac 960 Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe Tyr 305 310 315 320 tgg gga ggt cat cgt gtc atc tct agc ctc att ggc ggt gga aac atc 1008 Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly Asn Ile 325 330 335 act tca ccc atc tat ggt aga gaa gcc aat cag gag cet cca cgc age 1056 Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gin Glu Pro Pro Arg Ser 340 345 350 ttc acc ttc aac gga cet gtc ttt cgc acc ttg agc aac cet act ctt 1104 Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr Leu 355 360 365 cgc ctg ctc cag caa cca tgg cca gct cet ccc ttc aac ttg aga ggc 1152 Arg Leu Leu Gin Gin Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg Gly 370 375 380 gtc gaa ggt gtt gag ttt agc act ccc acc aac tca ttc acc tac cgt 1200 Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr Arg 385 390 395 400 ggc aga ggt aca gtt gac agc ttg act gag ctt cca cet gag gac aac 1248 Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp Asn 405 410 415 tcc gtt cca cet cgc gaa ggt tac agc cac cgt ctc tgt cac gct acc 1296 Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr 420 425 430 ttt gtg caa aga tct ggt act ccc ttc ttg acc aca ggt gtt gtg ttc 1344 Phe Val Gin Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val Phe 435 440 445 tct tgg aca cac aga tca gcc act ctt acc aac act atc gac cca gaa 1392 Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu 450 455 460 cgc atc aat cag att ccg ttg gtg aaa ggc ttc aga gtc tgg gga ggc 1440 Arg !le Asn Gin Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly Gly 465 470 475 480 act tct gtc atc act ggg cca ggc ttc acc gga ggt gac att ctt cgt 1488 Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg 485 490 495 agg aac acc ttt ggt gac ttt gtc tct ctc caa gtg aac atc aac tct 1536 Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gin Val Asn Ile Asn Ser 500 505 510 ccg atc acc caa cgc tac aga ctg agg ttt cgt tac gcc tct agc aga 1584 Pro Ile Thr Gin Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser Arg 515 520 525 gat gct cgt gtg att gtc ttg aca ggc gct gcc agc act gga gtt gga 1632 Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly Val Gly 530 535 540 ggt caa gtt agc gtg aac atg cet ctg cag aag act atg gag att gga 1680 Gly Gin Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gin Lys Thr Met Glu Ile Gly 545 550 555 560 gag aac ctc aca tct cgc acc ttt cgt tac act gac ttc tcc aat ccc 1728 Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn Pro 565 570 575 ttc tcc ttt cgt gct aac cca gac atc att ggc atc tca gaa caa cet 1776 Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gin Pro 580 585 590 ctc ttt ggt gca gga tct atc age tcc ggt gaa ctc tac atc gac aag 1824 Leu Phe Gly Ala Gly Ser !le Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp Lys 595 600 605 att gag atc att ctg gcc gat gct acc ttt gag gct gaa tcc gat ctc 1872 Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu 610 615 620 gag cgt gct cag aag tag 1890 Glu Arg Ala Gln Lys 625 630 2 629 PRT Séquence artificielle Description de la séquence artificielle : Gènesynthétique CrylC 2 Met Ala Gin Ile Pro Pro Gin Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn Ser 20 25 30 Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gin Phe Leu Val Ser Asn Phe 35 40 45 Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp Gly 50 55 60 Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu Gin 65 70 75 80 Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala Ile Ala 85 90 95 Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala Phe 100 105 110 Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg Val 115 120 125 Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile Pro 130 135 140 Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala 145 150 155 160 Gin Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile Phe 165 170 175 Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr Asn 180 185 190 Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn Thr 195 200 205 Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp Trp 210 215 220 Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp 225 230 235 240 Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile Gln 245 250 255 Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn 260 265 270 Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn Val 275 280 285 Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu Asn 290 295 300 Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe Tyr 305 310 315 320 Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly Asn Ile 325 330 335 Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg Ser 340 345 350 Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr Leu 355 360 365 Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg Gly 370 375 380 Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr Arg 385 390 395 400 Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp Asn 405 410 415 Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr 420 425 430 Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val Phe 435 440 445 Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu 450 455 460 Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly Gly 465 470 475 480 Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg 485 490 495 Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn Ser 500 505 510 Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser Arg 515 520 525 Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly Val Gly 530 535 540 Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile Gly 545 550 555 560 Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn Pro 565 570 575 Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gln Pro 580 585 590 Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp Lys 595 600 605 Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu 610 615 620 Glu Arg Ala Gln Lys 625 REVENDICATIONS 1) Acide nucléique comprenant la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe par le numéro SEQ ID NO: 1. 2) Vecteur recombinant comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1. 3) Plante transgénique comprenant au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1. 4) Plante transgénique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle appartient à une espèce choisie parmi le tabac, le coton, le maïs, le trèfle, la tomate, la luzerne, et le chou. 5) Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, pour la lutte contre des insectes phytophages. 6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdits insectes appartiennent au genre Spodoptera.