Brevet FR2793495A1 — publié le 20001117

"Dilueur pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins" L'invention se rapporte à un dilueur pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins. Plus précisément, l'invention concerne un milieu dilueur aqueux ne contenant pas de substances d'origine animale et susceptible d'être conservé prêt à l'emploi sur des périodes prolongées. On connaît des dilueurs pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins. Le FR-B-2 720 407 de la Demanderesse décrit un tel dilueur qui contient des agents de nutrition, des tampons et des sels minéraux ainsi qu'un produit protecteur constitué de lécithine de soja. Le dilueur décrit dans le brevet précité est destiné à diluer de la semence bovine et à la congeler pour une utilisation ultérieure. C'est une démarche essentiellement "sanitaire". Ce dilueur donne une relative satisfaction. Il est facile à préparer, et est très clair. L'absence de produits d'origine animale garantit l'absence de tout agent d'infection. Cependant, la question de l'efficacité biologique du produit n'avait pas été soulevée. L'efficacité dans les gammes de concentration utilisées auparavant ne permet pas de travailler avec la souplesse que l'on doit avoir dans un centre d'insémination. En effet, à présent on désire optimiser la production de semence, c'està-dire, on souhaite produire un nombre important de doses avec une concentration minimale de spermatozoïdes dans une paillette. Dans des tests in vivo, avec une concentration très basse de spermatozoïdes dans la paillette, la performance du dilueur du FR-B-2 720 407 n'a pas été excellente. Un objet de la présente invention est de fournir un dilueur pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins ayant des résultats in vivo améliorés. Un autre objet de l'invention est de fournir un tel dilueur conduisant à une survie des spermatozoïdes satisfaisante à basse concentration. La présente invention fournit un dilueur répondant aux objets ci-dessus. Le dilueur pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins de la présente invention comprend au moins un phospholipide, au moins une vitamine liposoluble accompagnée d'un émulsifiant, au moins un agent antioxydant et au moins un polyol. La vitamine est par exemple la vitamine A. La vitamine est accompagnée d'un émulsifiant, par exemple le monooléate de sorbitane commercialisé sous l'appellation Tween 80. L'agent antioxydant peut être un acide aminé ayant des propriétés antioxydantes, par exemple, la taurine et la glycine. L'agent antioxydant peut aussi être un peptide antioxydant, par exemple du glutation réduit. Le dilueur de la présente invention peut contenir en outre un stérol, notamment du cholestérol. Dans le cas o un stérol est présent dans le dilueur, celui-ci contiendra avantageusement des cyclodextrines qui le solubilisent en milieu aqueux. Le dilueur de la présente invention peut également contenir en outre des sels et des carbohydrates. Les carbohydrates sont par exemple le glucose, le fructose, le lactose. Les sels sont notamment des tampons, par exemple la triméthylolméthylamine, ce tampon étant dénommé habituellement Tampon Tris ou, simplement, Tris. Le dilueur de l'invention contient une dose efficace d'au moins un polyol apte à inhiber la formation de cristaux de glace. Le polyol sera avantageusement du glycérol. Pour la préparation des dilueurs selon l'invention, on effectue les étapes suivantes: a) préparation d'une dispersion d'au moins un phospholipide sous forme de particules dans au moins un polyol à une température suffisante; b) agitation de la dispersion de l'étape a) de façon à microniser lesdites particules de phospholipide; c) repos de la dispersion obtenue dans l'étape b) pendant une durée d'au moins environ 12 heures de façon à atteindre une stabilité de l'émulsion obtenue, c'est-à-dire sans séparation de phases, conduisant à une préparation, dénommée préparation de l'étape c); d) préparation d'une phase aqueuse comprenant au moins un acide aminé ayant des propriétés antioxydantes, au moins un peptide antioxydant et au moins une vitamine, conduisant à une phase, dénommée phase aqueuse de l'étape d); e) réunion de la préparation de l'étape c) et de la phase aqueuse de l'étape d), conduisant à une préparation, dénommée préparation de l'étape e); f) stérilisation de la préparation de l'étape e). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la stérilisation de l'étape f) est effectuée par rayonnement ionisant dans une fourchette de dose d'irradiation d'environ 15 à environ 25 Kgy, de préférence d'environ 15 à environ 20 Kgy. Parmi les techniques pour obtenir la dispersion de l'étape a), on peut utiliser des disperseurs mécaniques et des émulsionneurs qui agissent par voie de pression. Pour obtenir une émulsion stable dans l'étape c), il est nécessaire de laisser reposer la dispersion pendant au moins 12 heures. De préférence, le dilueur de l'invention est formulé avec une quantité d'eau réduite, et on le dilue pour l'emploi avec de l'eau stérile. Au moment de son utilisation, le dilueur contient avantageusement un agent antibiotique. Toutefois, si l'agent antibiotique est ajouté au dilueur lors de sa préparation, il peut perdre son efficacité lors de l'étape de stérilisation. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'agent antibiotique est ajouté extratemporanément au dilueur au moment de l'utilisation. Dans ce mode de réalisation, le dilueur sans antibiotique est avantageusement contenu dans un récipient fermé par un bouchon. Par exemple, l'agent antibiotique sous forme de poudre est présent dans le bouchon et est libéré dans le dilueur en exerçant une pression sur ledit bouchon. L'agent antibiotique est par exemple de la gentamycine sous forme de sulfate. Typiquement, le dilueur de l'invention contiendra les phospholipides suivants dans les proportions pondérales indiquées ci-dessous: "Lécithine 100" ayant les proportions pondérales indiquées des phospholipides suivants: - phosphatidylcholine 20-24 % - phosphadyléthanolamine 18-22 % phosphatidylinisitol 12-15 % "Lécithine 130" ayant les proportions pondérales indiquées des phospholipides suivants: - phosphadyléthanolamine 14-20 % - phosphatidylinisitol 7-13 % - phosphatidylcholine 30-35 % La Lécithine 130 est en fait une lécithine enrichie en phosphatidylcholine. Il faut noter que le dilueur de l'invention est destiné exclusivement à la cryoconservation de spermatozdoïdes de bovins. Il n'est pas adapté pour la cryoconservation de spermatozoïdes d'autres espèces animales ou de l'espèce humaine. En disposition préférée, un dilueur selon l'invention comprend pour 100 ml d'eau: Tris 1 à2g citrate trisodique dihydraté 5 à 10 g chlorure de potassium 0,2 à 0,5 g fructose 0,6 à 1,0 g lactose monohydraté 0,18 à 0,30 g glycine 2,0 à 3,0 g glucose anhydre 0,25 à 0,40 g taurine 0,0030 à 0,0040 g sulfate de gentamycine 0,20 g à 0,30 g tartrate de tylosine 0,028 à 0,040 g lincospectine 100 0,30 à 0,35 g glycérol 30 à 45 g lactate de calcium hydraté 0,03 à 0,05 g lécithine 1 00 2,0 à 3,0 g lécithine 130 0,80 à 1,10 g acide citrique monohydraté 0,5 à 2 g eau ultra pure qsp L'exemple suivant illustre l'invention de façon non limitative. Exemple (voir page suivante) Exemple En suivant le mode opératoire décrit ci-dessus, on a formulé un dilueur ayant la composition suivante: Tris 1, 8490 g citrate trisodique dihydraté 7,3965 g chlorure de potassium 0,2955 g fructose 0,8875 g lactose monohydraté 0,2220 g glycine 2,7735 g glucose anhydre 0,3695 g taurine 0,0037 g sulfate de gentamycine 0,2400 g tartrate de tylosine 0,0330 g lincospectine 100 0,3830 g glycérol 40,2240 g lactate de calcium hydraté 0,0455 g lécithine 100 2, 6000 g lécithine 130 1,0400 g acide citrique monohydraté 1,0400 g eau ultra pure 0,0650 I La formulation ci-dessus est effectuée pour obtenir 100 ml de dilueur concentré, ce dernier étant dilué à 500 ml pour l'utilisation. Bien que l'invention ait été décrite pour des modes de réalisation particuliers, on comprendra qu'elle embrasse toutes les variantes d'exécution dans le cadre des revendications. REVENDICATIONS 1. Dilueur pour la cryoconservation de spermatozoïdes de bovins comprenant au moins un phospholipide, au moins une vitamine liposoluble accompagnée d'un émulsifiant, au moins un agent antioxydant et au moins un polyol. 2. Dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la vitamine est la vitamine A. 3. Dilueur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'agent antioxydant est un acide aminé ayant des propriétés antioxydantes. 4. Dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent antioxydant est un peptide antioxydant. 5. Dilueur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'acide aminé ayant des propriétés antioxydantes est la taurine. 6. Dilueur selon la revendication 4, caractérisé en ce que le peptide antioxydant est du glutation réduit. 7. Dilueur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il contient en outre un 1 5 stérol. 8. Dilueur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le stérol est le cholestérol. 9. Dilueur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient en outre des cyclodextrines pour solubiliser le stérol. 10. Dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polyol est du glycérol. 11. Dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient en outre des sels et des carbohydrates. 12. Dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polyol est le glycérol. 13. Procédé de préparation du dilueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes suivantes: a) préparation d'une dispersion d'au moins un phospholipide sous forme de particules dans au moins un polyol à une température suffisante, b) agitation de la dispersion de l'étape a) de façon à microniser lesdites particules de phospholipide, c) repos de la dispersion obtenue dans l'étape b) pendant une durée d'au moins environ 12 heures de façon à atteindre une stabilité de l'émulsion obtenue, c'est-à-dire sans séparation de phases, conduisant à une préparation, dénommée préparation de l'étape c), d) préparation d'une phase aqueuse comprenant au moins un acide aminé ayant des propriétés antioxydantes, au moins un peptide antioxydant et au moins une vitamine, conduisant à une phase, dénommée phase aqueuse de l'étape d), e) réunion de la préparation de l'étape c) et de la phase aqueuse de l'étape d), conduisant à une préparation, dénommée préparation de l'étape e), f) stérilisation de la préparation de l'étape e). 14. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la stérilisation de l'étape f) est effectuée par rayonnement ionisant dans une fourchette de dose d'irradiation d'environ 15 à environ 25 Kgy. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la fourchette de dose d'irradiation est d'environ 15 à environ 20 Kgy. 16. Procédé selon la revendication 14 pour la préparation du dilueur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'un stérol est ajouté à la préparation de l'étape d). 17. Procédé selon la revendication 14 pour la préparation du dilueur selon la revendication 11, caractérisé en ce que des carbohydrates sont ajoutés à la préparation de l'étape d).