Brevet FR2785804A1 — publié le 20000519

Aussi loin que l'on puisse remonter, de l'origine de l'humanité à nos jours, l'étude des civilisations successives démontre que les hommes ont rivalisé d'imagination et d'ingéniosité pour lutter contre le vieillissement lui mme et contre ses manifestations physiologiques ou purement esthétiques. De nos jours, ce souci permanent est exacerbé par la mode et par la publicité qui font toujours référence à la jeunesse, spécialement dans son apparence cutanée souple, lisse et élastique. Notre mode de vie actuel (agressions physiques et chimiques de la pollution, consommation d'alcool et de tabac,...) favorise et aggrave les processus de vieillissement. II en est de meme pour la perpétuelle quete du bronzage par les LTV naturels ou artificiels. L'industrie cosmétique est en permanence à la recherche de nouveaux ingrédients capables"de reparer des ans l'irreparable outrage", et donc, d'en minimiser les principales stigmates que sont les rides, le dessèchement et la perte de souplesse. Jusqu'à maintenant, le discours tenu, tant scientifique que marketing, était basé sur le fait que pour supprimer les traces cutanées du vieillissement, il fallait en supprimer les manifestations visibles. Une grande partie des solutions proposées a consisté à favoriser (facteurs de croissance, vitamines, oligo-élèments, vitamines...) la multiplication des cellules cutanées. De par leur jeunesse, ces nouvelles cellules, repoussant et remplaçant les cellules plus âgées, devaient donner un aspect jeune à la peau concernée. D'autres approches, sous-tendues par le meme type de raisonnement ont été développées. C'est ainsi que l'on a vu apparaître le peeling qui consiste à enlever, par abrasion chimique ou mécanique, les couches superficielles de la peau que constituent les cellules mortes ou sénescentes. Un autre artifice proposé consiste à injecter des composants biochimiques de la peau, comme du collagène) pour en combler les espaces vides. Diverses crèmes ont également été proposées pour hydrater la peau et lui rendre ainsi un aspect lisse et souple, en accord avec les critères actuels de beauté et de jeunesse. L'idée qui est à la base de ce brevet est diamétralement opposée. Elle découle d'un raisonnement basé sur une théorie scientifique, connue sous le nom de Hayflick limit (Hayflick L. & Moorhead P. S., (1961), Exp. Cell Res. 25 : 5585-621 ; Hayflick L. (1973) Amer. Journ. Med. Sci. 265 : 433-445) qui repose sur le postulat suivant : une cellule animale est programmée pour un certain nombre de multiplication. Sans rentrer dans des détails théoriques, au cours de ses multiplications successives, on constate une perte successive d'information génétique sur 1'ADN situé aux extrémités chromosomiques (Olovnikov (1996) Exp. GerontoL31 : 443-448). Ainsi, chaque cellule posséderait une sorte d'horloge moléculaire interne qui égrènerait le nombre de ses réplications possibles. II a été constaté que la synthèse du collagène de type I et d'enzymes par exemple, diminue progressivement en relation avec l'évolution des cellules productrices vers le stade de sénescence (Kassem & al. (1997) Osteoporosis int. 7 : 514-524). Quand on sait que le collagène de type I comble les vides tissulaires, cette théorie, appliquée au niveau cutané, prend une importance cruciale qui, à elle seule, peut expliquer les manifestations cutanées du vieillissement que sont les rides et la perte de souplesse de la peau. II en résulte donc une approche totalement opposée à la précédente. Pour prévenir les manifestations cutanées du vieillissement, il ne faut pas accélérer la prolifération cellulaire mais, au contraire la ralentir, tout comme dans la dormance des cellules végétales, phénomène qui permet à certaines plantes de résister aux épisodes climatiques extremes rencontrées dans certains déserts. Ainsi, une cellule rendue quesciente par un quelconque système, se multipliera moins rapidement qu'une cellule dont l'activité est normale, voire stimulée comme dans les approches précédentes décrites au début ce document ; ralentissant ainsi le vieillissement physiologique propre à tout organisme vivant. L'objet de ce brevet réside donc dans l'application industrielle de cette hypothèse et dans la solution pratique que nous y apportons car, après de nombreuses études, nous avons élaboré un extrait végétal qui est capable de répondre à ce dessein, mme lorsqu'il est utilise de manière topique ; ce qui rend donc possible son utilisation en Cosmétique et en Dermopharmacie. La plante utilisée, Larrea divaricata ou de Larrea tridentata pousse en Amérique, dans le sud des Etats-Unis, au Mexique et au Pérou. Nous avons découvert que le principal principe actif présent dans les extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata faisant l'objet de ce brevet, est l'acide nordihydroguiairétique (NDGA). Le NGDA est un produit connu pour différents effets inhibiteurs tels que sur la sécrétion de prolactine (Tagaya M. et al. (1993) FEBSLett. 324 : 210-214) ou sur la 5-lipoxygénase exemple (Morris HR & al. (1979) Br. J. Pharmacol. 66 : 452-465) utilisable dans certaines pathologies mettant en jeu des réactions allergiques telle que l'asthme. Enfin, le brevet WO 95/05156 décrit l'utilisation du NDGA, sous des concentrations de 2 à 64%, dans des compositions à usage topique, dans le traitement des durillons, des cors, des verrues et des hyperkératoses en général. Plus récemment, Fijiwara T et al. (R Biol. Chem. (1998) 273 : 3068-3075) a mis en évidence un effet inhibiteur réversible du NDGA sur le transport des protéines dans l'appareil de Golgi, système intracellulaire impliqué dans la sécrétion de protéines. Ceci pourrait, au moins partiellement, expliquer 1'effet de mise en quiescence cellulaire que nous avons découvert car ainsi la cellule pourra s'économiser, sans toutefois arrter son fonctionnement physiologique normal. Cette hypothèse est confortée par une autre découverte, que nous avons réalisé au cours de la mise au point des extraits faisant l'objet de ce brevet est qu'effectivement, en présence de nos extraits, le taux d'ATP intracellulaire est réduit, traduisant ainsi un ralentissement de son métabolisme énergétique. Pour obtenir les résultats attendus, il est possible d'utiliser aussi bien la tige que la feuille ou les racines de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata ; avec toutefois une préférence pour les feuilles. Les extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata peuvent tre obtenus selon le protocole suivant. Une quantité de 4,0 grammes de feuilles séchées et broyées de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata est ajoutée dans 100 ml de butylène glycol. L'extraction est alors réalisée à 60 C pendant une heure. Naturellement, à condition de respecter cette proportion, il est possible d'utiliser tous les multiples des valeurs données ici. Après filtration et/ou tamisage, 1'extrait obtenu est décolore par le charbon actif puis, après élimination de ce dernier, 1'extrait peut tre utilisé tel quel ou peut tre concentré sous vide jusqu'à obtention d'une poudre brun clair. Selon les origines des plantes et les méthodes d'extraction utilisées, les analyses réalisées par chromatographie liquide haute performance (CLHP) démontrent la présence de NDGA à des concentrations variant entre 0,5 et 5,0 % (p/p). Les solvants d'extraction cités ci-dessus ne sont pas limitatifs et peuvent tre choisis parmi l'eau, le propylène glycol, le butylène glycol, la glycérine, le polyéthylène glycol, les éthers méthyliques et/ou éthyliques des diglycols, les polyols cycliques, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les alcools (méthanol, éthanol, propanol, butanol), ou tout mélange de ces solvants. Par ailleurs, il est possible de réaliser des extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata par d'autres procédés comme, par exemple, la simple décoction, la lixiviation, I'extraction sous reflux, 1'extraction au moyen d'ultrasons ou de microondes ou enfin au moyen de techniques à contre courant, sans que cette liste soit limitative. L'incorporation des extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata dans les compositions cosmétiques est réalisée par tout type de procédé classiquement utilisé en Cosmétologie et en Dermopharmacie. Sans tre limitatifs, les trois exemples suivants donnent des utilisations possibles des extraits obtenus. Exemple 1 : Crème de jour CarbopolR 940 0.3 Triéthanolamine 0.3 Sipol C16/C18 S3 0 5 Amphisol 2.0 Tegin 5 1.5 Céraphil 494 6.5 Silicone DC 344 3.0 Glycérine 3.0 Extrait de Larrea divaricata 5.0 Parfum, conservateurs qsp. 100 ml Exemple 2 : Crème antirides Polysorbate 60 3.8 Stéarate de sorbitan 2.0 Alcool cétylique 1.5 Huile de vaseline 13 Extrait de Larrea tridentata 2.5 Eau & conservateurs QSP 100g Exemple 3 : Lait corporel déodorant Polysorbate 60 2.5 Acide oléique 0.9 Huile de lanoline 2.5 Carbopol 940 0.3 Cire d'abeille 2.0 Triéthanolamine 0.1 Glycérine 5.0 Extrait de Larrea tridentata 4.5 Eau & conservateurs QSP I 00g Seuls, trois effets biochimiques et physiologiques bénéfiques mis en évidence au cours du développement des extraits de Larrea divaricata ou de tridentata, seront illustrés dans les exemples suivants, sans que cette liste soit pour autant limitative. Exemple Effet anti IL-6 in vitro L'effet des extraits de Larrea tridentata sur la réduction de la néo-synthèse d'interleukine 6 (IL-6) a été évalué sur des fibroblastes (FH) et sur des kératinocytes (KH) humains normaux en culture, après irradiations par différentes doses d'UV-B. Schématiquement, les cellules sont mise en culture, dans un milieu de culture classique DMEMc + 10% SVF pendant des périodes de 24 heures pour le FH et d'une semaine pour les KH. Après élimination du tampon et deux rinçages successifs par une solution tampon phosphate, les cellules sont irradiées avec des UV-B sous deux niveaux d'énergie standardisés : 35 et 50 mJ. cm2. Le tampon est alors rapidement éliminé et remplacé par un milieu de culture identique à celui utilisé en début d'expérience mais contenant les extraits à tester aux concentrations pré-requises ou du DMSO pour la série contrôle. Après 24 heures, le milieu de culture est récolté et la détermination de sa concentration en IL-6 est réalisé, après congélation ou non, au moyen d'une méthode Elisa standard. Une série supplémentaire est réalisée selon le mme protocole si ce n'est l'absence d'irradiation UV-B, afin de déterminer le taux de base et de contrôle la stabilité du système étudié. Enfin, les essais sont réalisés en triplicate. Dans ces conditions, en l'absence de notre extrait de Larrea tridentata, on observe chez le kératinocytes, une augmentation de la libération d'IL-6 dans le milieu extérieur égale à respectivement 212 7% et 439 + 11% après irradiation avec 35 et 50 mJ. cm2. Dans les memes conditions, les augmentations de la libération d'IL- 6 observées ne sont plus respectivement que de 155 3% et 313 7% lorsque notre extrait est dilué au 1/100 et de respectivement 51 4% et 117 5% en présence de notre extrait dilué au 1/10. Dans les mmes conditions, des résultats semblables ont été observés sur les cultures de fibroblastes. Enfin, les résultats précédents sont sensiblement reproduits à l'identique si l'on utilise, dans les mmes conditions, notre extrait de Larrea divaricata. Cet exemple démontre d'une part que le système cellulaire étudié est correct puisqu'on y retrouve bien l'effet dose d'irradiation/augmentation de la libération d'IL-6 attendue et que, d'autre part, les extraits testés présentent, sur les deux types cellulaires testés, une efficacité réelle qui est dose-dépendante. Exemple 5 : Effet antiproliférateur, in vitro La méthode utilisée ici repose sur le principe suivant. Comme la quantité d'ADN est fixe d'une cellule à l'autre, la mesure de la quantité globale d'ADN correspond à mesurer le nombre de cellule utilisées pour cette mesure. Ce principe permet de ne pas utiliser en routine des méthodologies plus fines mais très lourdes. Différentes techniques ont été développées sur la base de ce protocole dont notamment celle utilisée ici : en se liant à I'ADN, selon une stoechiométrie constante et connu, le fluorophore Hoescht 33258 présente d'une part une fluorescence augmentée mais également un décalage de son spectre d'émission de 492 nm à 458 nm. Par comparaison à des gammes de calibration préalablement établies, le suivi combiné de ces deux paramètres permet de quantifier la quantité d'ADN présente dans les échantillons cellulaires étudiés. Les cultures cellulaires (FH ou KH) utilisées sont les mmes quelles décrites dans l'exemple précédent. Le fluorophore Hoescht 33258 est ajouté en fin de manipulation, avant le prélèvement des aliquotes de cellules pour le dosage. Une série contrôle est réalisée (absence d'extrait dans le milieu de culture), afin de déterminer la prolifération cellulaire de base dans le système étudié. Enfin, les essais sont réalisés en triplicate. Dans ces conditions, lorsque des fibroblastes sont mis en présence de notre extrait de Larrea tridentata dilué au 1/100 ou au 1/10, on constate une diminution de la quantité d'ADN (et donc du nombre de cellules présentes) égale à respectivement 5,9 1,2 et 16,3 1,5% par rapport à la série contrôle, donc sans notre extrait de Larrea tridentata. Dans les mmes conditions, des résultats semblables ont été observés sur les cultures de fibroblastes. Enfin, les résultats précédents sont sensiblement reproduits à l'identique si l'on utilise, dans les mmes conditions, notre extrait de Larrea divaricata. Cet exemple démontre qu'en présence de nos extraits, la multiplication cellulaire est ralentie, sur les deux types cellulaires étudiés. Nos extraits possèdent donc une réelle efficacité anti-proliférative qui est dose-dépendante. Exemple 6 Diminution du taux intracellulaire d'ATP in vitro La mesure de la concentration d'ATP intracellulaire (ou [ATP] s) est réalisée sur des cellules, fibroblastes ou kératinocytes, en culture, au moyen de la méthode classique de luminométrie qui utilise la propriété du couple luciférine/luciférase d'émettre une quantité de photons proportionnelle à la quantité d'ATP du milieu (par exemple : Doctor et al. Am. J Physiol. 266 : C1803-1811). Chacun des puits des plaques 96 trous utilisées sont ensemencés avec 20.000 cellules puis, après une période de 24 heures pour le FH ou d'une semaine pour les KH, les cellules sont recouvertes du milieu de culture contenant ou non les extraits de Larrea tridentata aux concentrations utilisées dans 1'exemple N 4. Après 24 heures d'incubation, élimination du milieu de culture et rinçage du tapis cellulaire, un aliquote de cellules est prélevé pour effectuer la mesure de 1'ATP avec la réaction luciférine/luciférase, au moyen d'un luminomètre (Lumistar BMG dans ces expériences). Une série contrôle est réalisée par l'ajout de tampon de culture sans produit à tester, afin de déterminer le taux de d'ATP intracellulaire de base. Enfin, les essais sont réalisés en triplicate. Dans ces conditions, lorsque des fibroblastes sont mis en présence de notre extrait de Larrea tridentata dilué au 1/100 ou au 1/10, on constate une diminution de 1' [ATP] i de respectivement 5,3 0,7 et 18,2 1,1% par rapport à la série témoin réalisée sans notre extrait de Larrea tridentata. Dans les mmes conditions, des résultats semblables ont été observés sur les cultures de fibroblastes. Enfin, les résultats précédents sont sensiblement reproduits à l'identique si l'on utilise, dans les mmes conditions, notre extrait de Larrea divaricata. Cet exemple démontre que les extraits testés présentent, sur les deux types cellulaires étudiés, une efficacité réelle de mise en état de quiescence, qui est dose-dépendante. En conclusion, les exemples ci-dessus démontrent que les extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata, possèdent un réel effet sur la mise en quiescence des cellules cutanée, leur permettant ainsi un cycle de vie plus long aboutissant ainsi à retarder le vieillissement cutané.. De par leurs activités démontrées ci-dessus, de telles préparations présentent des effets, anti-vieillissement et antirides, de ralentissement de la chute des cheveux ainsi que de la pousse des poils et des cheveux ; protègent la peau des agressions des UV solaires ou artificiels, prolongeant ainsi la souplesse et la fonction protectrice de la peau. La concentration de NDGA dans les extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata (dénommés Extraits dans la suite de cette description) peut varier entre 0.05 % et 10 % (p/p), préférentiellement entre 0,5 % et 5,0 % (p/p). La concentration des Extraits peut varier entre 0.01 % et 50 % (p/p), préférentiellement entre 0,1 % et 10 % (p/p) dans la composition cosmétique ou dermopharmaceutique fini. Les Extraits peuvent tre utilisés dans toute forme galénique employée en cosmétique ou dermopharmacie : émulsions H/E et E/H, laits, lotions, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, pommades, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks et crayons, sprays, huiles corporelles, sans que cette liste soit limitative. II est possible d'incorporer les Extraits dans des vecteurs cosmétiques comme les liposomes, les chylomicrons, les macro-, micro-et nanoparticules ainsi que les macro-, micro-et nanocapsules, de les absorber sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Les Extraits peuvent tre combinés dans les compositions cosmétiques avec tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique : lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, principes actifs hydro-ou liposolubles, extraits d'autres plantes, extraits tissulaires, extraits marins. Les Extraits sont utilisés tels quels, dans des compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques en tant que telles ou pour la préparation d'un médicament pour les soins de la peau, y compris contre les manifestations cutanées du vieillissement quel qu'en soit l'origine (physiologique, exposition aux UV solaires naturels ou artificiels) ; ainsi que pour tous les soins de la peau, des muqueuses, des phanères ou du cuir chevelu. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'extraits de Larrea divaricata ou de Larrea tridentata dans des compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques pour éliminer, réduire ou prévenir les manifestations cutanées du vieillissement quel qu'en soit l'origine (physiologique, exposition aux UV solaires naturels ou artificiels), pour ralentir la chute des cheveux ainsi que la pousse des poils et des cheveux ; ainsi que pour tous les soins de la peau, des muqueuses, des phanères ou du cuir chevelu. 2. Extraits selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils contiennent entre 0.05 % et 10 %, préférentiellement entre 0,5 % et 5,0 % (p/p) d'acide nordihydroguaiarétique (NDGA). 3. Procédé d'obtention des compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les solvants d'extraction utilisés sont choisis parmi 1'eau, le propylène glycol, le butylène glycol, la glycérine, le polyéthylène glycol, les éthers méthyliques ou éthyliques des diglycols, les polyols cycliques, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les alcools (méthanol, éthanol, propanol, butanol), ou tout mélange de ces solvants. 4. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'extrait est obtenu par extraction éthanolique puis, qu'après séchage, I'extrait sec est repris dans du butylène glycol. 5. Procédé d'obtention des compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 1'extraction peut tre remplacée par des techniques de macération ou par d'autres procédés comme, par exemple, la simple décoction, la lixiviation, 1'extraction sous reflux, I'extraction au moyen d'ultrasons ou de micro-ondes ou enfin des techniques à contre courant. 6. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que 1'extrait est obtenu à partir de la plante entière ou, de préférence à partir de la partie aérienne fleurie et sèche. 7. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon la revendication 6 caractérisées en ce que 1'extrait est utilisé soit sous forme liquide, soit sous forme sèche obtenue par les techniques classiques de précipitation, de séchage, d'évaporation, d'atomisation ou de lyophilisation. 8. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 6 à 7 caractérisées en ce que la concentration de 1'extrait peut varier entre 0,1% et 50 % (p/p), préférentiellement entre 0,1 % et 10 % (p/p) dans le produit fini. 9. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisées en ce qu'elles se présentent sous toute forme galénique employée en cosmétique ou dermopharmacie : émulsions H/E et E/H, laits, lotions, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, pommades, lotions capillaires, shampooings, savons, sticks et crayons, sprays, huiles corporelles. 10. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisées en ce que 1'extrait est incorporé dans des vecteurs cosmétiques comme les liposomes, les chylomicrons, les macro-, micro-et nanoparticules ainsi que les macro-, micro-et nanocapsules, de les absorber sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. 11. Compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisées en ce que 1'extrait est utilisé avec tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique : lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensioactifs et émulsifiants, principes actifs hydro-ou liposolubles, extraits d'autres plantes, extraits tissulaires, extraits marins. 12. Utilisation de 1'extrait selon l'une des revendication 1 à 5 ou d'une composition selon l'une des revendications 6 à 11 pour la préparation d'un médicament pour les soins de la peau, y compris contre les manifestations cutanées du vieillissement quel qu'en soit l'origine (physiologique, exposition aux UV solaires naturels ou artificiels), pour ralentir la chute des cheveux ainsi que la pousse des poils et des cheveux ; ainsi que pour tous les soins de la peau, des muqueuses, des phanères ou du cuir chevelu.