Brevet FR2786199A1 — publié le 20000526

La présente invention est relative au domaine de la génétique et, plus particulièrement, à l'identification de mutations du gène de la parkine. Elle concerne également des compositions et méthodes pour l'identification de ces mutations dans des échantillons, des formes mutées ou tronquées de la parkine, et leurs utilisations à des fins de diagnostique, dépistage ou thérapeutique, par exemple. La maladie de Parkinson est une affection neurodégénérative fréquente dont la prévalence est proche de 2% après l'âge de 65 ans [de Rijk et al., 1997]. Les signes cardinaux de la maladie sont rigidité, bradykinésie, tremblement de repos et bonne réactivité, au moins initiale à la lévodopa. Les troubles sont dus à une perte massive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra. Les causes de la maladie restent inconnues mais l'intervention de facteurs de susceptibilité génétique est fortement suspectée [Wood, 1997]. De nombreuses formes familiales avec une transmission dominante ont été rapportées. Des mutations du gène codant pour la synucléine alpha, localisé en 4q21-q23, ont été décrites dans un petit nombre de familles avec un début précoce et une aggravation rapide [Polymeropoulos et al., 1997; Krüger et al., 1998]. Un second locus est situé en 2p 13 [Gasser et al., 1998]. Un syndrome parkinsonien de transmission autosomique récessive (AR-JP) a été décrit au Japon [Yamamura et al., 1973 ; Ishikawa and Tsuji, 1996]. Il se manifeste avec les signes cardinaux de la maladie de Parkinson avec certaines particularités : début précoce, en règle avant l'âge de 40 ans; ii) présence d'une dystonie, souvent aux membres inférieurs; iii) fluctuations au cours de la journée ; iv) évolution lentement progressive mais toujours associée à des dyskinésies sous lévodopa. L'examen neuropathologique révèle une perte massive des neurones de la substantia nigra pars compacta mais sans corps de Lewy, stigmate histopathologique de la maladie de Parkinson idiopathique [Yamamura et al., 1973 ; et al., 1994]. Une liaison génétique entre la maladie dans des familles japonaises et des marqueurs en 6q25. 2-27 a été démontrée qui définit le locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. Deux équipes ont ensuite décrit des familles PARK2 hors du Japon, en particulier aux Etats Unis, en Europe et au Moyen Orient [Jones et al., 1998 ; Tassin et al., 1998]. Très récemment, Kitada et al [Kitada et al., 1998] ont mis en evidence des délétions des exons (3-7) ou de l'exon 4 d'un nouveau gène, appelé parkine, dans 4 familles japonaises. La présente demande décrit maintenant la mise en évidence et la caractérisation, dans 38 familles principalement européennes avec un syndrome parkinsonien de début précoce, de la présence de nouvelles altérations génétiques affectant le gène de la parkine. En outre, la présente demande montre que ces altérations génétiques sont présentent non seulement dans les syndromes parkinsoniens de début précoce, mais également dans les syndromes parkinsoniens plus tardifs ou atypiques. Ces nouvelles altérations offrent donc de nouveaux outils, à la fois pour le diagnostique et le traitement de la maladie de parkinson. Un objet plus particulier de l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs altérations génétiques choisies parmi: a) une délétion de l'exon 3, b) une délétion des exons 8 et 9 c) une délétion de 1 ou 2 paires de bases contigües entraînant un décalage du cadre de lecture, d) une insertion de 1 ou plusieurs paires de bases contigües, et e) une mutation ponctuelle. Le terme acide nucléique tel que défini dans la présente demande désigne les acides désoxyribonucléiques (ADN) et ribonucléiques (ARN). En outre, parmi les ADN, il peut s'agir d'ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Les acides nucléiques de l'invention peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Il sont généralement préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire, incluant le criblage de banques, la synthèse artificielle, la ligature, la restriction, etc. Les positions données dans la présente demande sont calculées par rapport à la séquence de la parkine humaine représentée sur la Figure 1. Cette séquence représente la séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Par rapport à la séquence décrite par Kitada et al., elle comporte une modification au niveau du nucléotide 768 (C->T). Plus préférentiellement, les altérations génétiques c), d) et e) telles que définies ci-dessus sont des altération exoniques, c'est-à-dire affectent la région codante du gène de la parkine humaine. Le gène de la parkine humaine comprend 12 exons, dont les positions nucléotidiques sont données ci-après : Exon 1: nucléotides 1 à 108 Exon 2 : 109 à 272 Exon 3 : 273 à 513 Exon 4 : 514 à 635 Exon 5 : 636 à 719 Exon 6 : 720 à 835 Exon 7 : 836 à 972 Exon 8: nucléotides 973 à 1034 Exon 9: nucléotides 1035 à 1184 Exon 10: nucléotides 1185 à 1268 Exon 11: nucléotides 1269 à 1386 Exon 12: nucléotides 1387 à 2960 Dans un premier mode de mise en oeuvre particulier, l'invention concerne donc un acide nucléique codant pour la parkine, contenant une délétion de l'exon 3. Plus particulièrement, cette délétion affecte les nucléotides 273 à 513 sur la Figure 1. Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine, comprenant une délétion des exons 8 et 9. Plus particulièrement, cette délétion affecte les nucléotides 973 à 1184 sur la Figure 1. Dans un autre mode particulier, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine, comprenant une mutation ponctuelle, c'est-à-dire le remplacement d'une paire de bases par une autre. La présente demande montre en effet, pour la première fois, l'existence de mutants ponctuels de la parkine et le caractère causal de certains d'entre eux dans l'apparition et le développement de la maladie de parkinson. Plus particulièrement, la ou les mutations ponctuelles selon l'invention sont des mutations ponctuelles non-sens ou faux-sens. Une mutation non-sens est une mutation introduisant dans la séquence un codon stop. Une telle mutation conduit à l'arrêt prématuré de la traduction, et donc à la synthèse d'une protéine tronquée. Une telle mutation est donc également désignée dans ce qui suit par le terme "tronquante". Plus préférentiellement, selon la présente invention, l'acide nucléique comprend une mutation non-sens localisée dans une région correspondant au domaine N- ou C-terminal de la Parkine humaine. La présente invention montre en effet que ce type de mutation se recontre chez des patients plus fréquemment dans les régions terminales du gène (et donc de la protéine). Plus préférentiellement encore, la présente invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant une mutation ponctuelle tronquante dans une région correspondant aux exons 2,3, 11 ou 12. Il s'agit encore plus préférentiellement d'une mutation dans l'exon 12 du gène de la parkine, préférentiellement conduisant à l'inactivation du site de myristoylation (résidus 450- 455 de la protéine). A titre illustratif, on peut citer la mutation ponctuelle G->A sur le nucléotidue 1459, introduisant un codon stop à la place du résidu Trp453. Ce mutant code donc pour une protéine tronquée comprenant les 452 premiers acides aminés de la protéine sauvage. De manière surprenante, la demanderesse a montré que ce mutant Parkine 1-452, qui est dépourvu seulement des 12 derniers résidus de la protéine sauvage, cause la maladie de parkinson. Un autre type de mutation ponctuelle selon l'invention est une mutation fauxsens. Une mutation faux-sens comprend le remplacement d'une paire de bases dans un codon, conduisant à un codon codant pour un acide aminé différent de l'acide aminé naturel, sans interruption de la séquence. Une telle mutation, isolée, conduit donc à une protéine ayant un nombre inchangé de résidus, mais dont l'un des résidus diffère de la protéine sauvage. La présente demande a maintenant montré que des mutants ponctuels faux-sens de la parkine existent chez des sujets atteints de syndromes parkinsoniens, et que ces mutants peuvent avoir un caractère causal. Plus préférentiellement, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant une mutation ponctuelle faux-sens localisée dans une partie correspondant à la région centrale de la protéine, notamment dans une région correspondant aux exons 4-11. Un premier type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au sens de l'invention comprend les mutations qui entrainent un changement nonconservatif d'acide aminé dans la protéine codée. De telles mutations sont en effet plus spécifiquement associées au phénotype de la maladie de parkinson. On entend par changement non-conservatif le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant des propriétés structurales, physicochimiques et/ou biologiques différentes du premier. Ainsi, le changement d'un acide aminé basique par un acide aminé non-basique est dit non-conservatif. Ce type de changements comprend plus particulièrement le changement des acides aminés de l'une ou l'autre des catégories suivantes : acide, basique, neutre polaire, neutre non polaire. Des exemples particuliers de mutants de ce type selon l'invention sont notamment les acides nucléiques comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison : - une mutation A->T sur le nucléotide 584 (Lys161Asp), - une mutation C->T sur le nucléotide 867 (Arg256Cys) et/ou - une mutation C->T sur le nucléotide 924 (Arg275Trp). Un deuxième type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au sens de l'invention comprend les mutations qui affectent un site potentiel de phosphorylation dans la protéine codée. La présente demande montre en effet que des mutants de ce type apparaissent chez certains sujets atteints de la maladie de parkinson, et constituent donc des événements qui participent au développement de la pathologie, en raison des fonctions biologiques connues des événements de phosphorylation. Des mutations particulières sont donc celles qui modifient un acide aminé phosphorylable en un résidu non-phosphorylable. A cet égard, les résidus susceptibles d'être phosphorylés sont par exemple les résidus sérine, thréonine et tyrosine. Des exemples particuliers de mutants de ce type selon l'invention sont notamment les acides nucléiques comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison : - mutation C->A sur le nucléotide 1345 (Thr415Asn). Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également un acide nucléique comprenant une ou plusieurs altérations génétiques, telles que notamment une insertion de une ou plusieurs paires de bases contigües (voir d)). La présente demande démontre en effet pour la première fois l'existence de mutants d'insertion de la parkine, et leur implication dans l'apparition et le développement de la maladie de parkinson. Plus préférentiellement, l'insertion selon l'invention est telle qu'elle entraîne un décalage du cadre de lecture. De ce fait, l'insertion entraîne un changement des résidus situés en aval (du coté C-terminal) de la mutation. En outre, cette insertion conduit le plus généralement à la création d'un codon stop prématuré, et donc à la synthèse d'une protéine (i) tronquée et (ii) dont la séquence C-terminale est différente de la protéine sauvage. Comme indiqué plus loin, cette protéine (ou le domaine original) constitue un autre objet de la présente demande, et peut être utilisée comme outil diagnostique ou thérapeutique. Plus préférentiellement, l'invention concerne les acides nucléiques comprenant une insertion de 1 à 5 paires de bases contigües, de préférence de 1 ou 2. A titre d'exemple spécifique, on peut citer un acide nucléique comportant une insertion GT entre les nucléotides 321 et 322. Cette insertion introduit un changement du cadre de lecture débutant au niveau du résidu d'acide aminé 74 (Trp->Cys), et se terminant par un codon stop (81). Cette protéine est donc tronquée et comprend une région C-terminale de 8 acides aminés originale. Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également tout acide nucléique comprenant une délétion de une ou deux paires de bases contigües et entraînant un décalage du cadre de lecture (voir c). Comme précédemment, la présente demande démontre également pour la première fois l'existence de mutants de délétion restreinte de la parkine, et leur implication dans l'apparition et le développement de la maladie de parkinson. Plus préférentiellement, les délétions restreintes selon l'invention conduisent, en raison du décalage du cadre de lecture, à la synthèse de protéines (i) tronquées et (ii) ayant une séquence Cterminale originale. Comme indiqué ci-avant, cette protéine (ou le domaine original) constitue un autre objet de la présente demande. Plus préférentiellement, l'invention concerne les acides nucléiques comprenant une délétion de 1 à 2 paires de bases contigües, localisée dans une région terminale, de préférence correspondant à la partie N-terminale de la protéine. Encore plus particulièrement, les insertions selon l'invention sont localisées dans une région de l'acide nucléique correspondant aux exons 2 ou 3, par exemple à l'exon 2. A titre d'exemple spécifique, on peut citer un acide nucléique comportant : - une délétion des nucléotides AG aux positions 202 et 203. Cette délétion introduit un changement du cadre de lecture débutant au niveau du résidu d'acide aminé 34 (Gln->Arg), et se terminant par un codon stop (37). Cette protéine est donc tronquée et comprend une région C-terminale de 4 acides aminés originale. - une délétion du nucléotide A en position 255. Cette délétion introduit un changement du cadre de lecture débutant au niveau du résidu d'acide aminé 52 (Asn- >Met), et se terminant par un codon stop (81). Cette protéine est donc tronquée et comprend une région C-terminale de 30 acides aminés originale. Bien entendu, les altérations génétiques a) à e) décrites ci-dessus peuvent être isolées ou combinées entre elles, telles que notamment une mutation faux-sens et une mutation non-sens en N-terminal. L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence présentée sur la figure 1. Cette séquence comporte, par rapport à la séquence isolée par Kitada et al, une T en position 768, à la place d'une C, résultant, dans la protéine codée, en un acide aminé sérine en position 223, à la place d'une proline. Cet acide nucléique code pour la parkine sauvage rencontrée dans les populations européennes. L'invention a également pour objet les variants polymorphiques de l'acide nucléique présenté sur la figure 1. La présente demande montre en effet que le gène de la parkine humaine présente un certain polymorphisme, et décrit plus particulièrement certains variants, présentant plus spécifiquement une des modifications de séquence suivantes: - mutation G->A sur le nucléotide 601 de l'exon 4 (Serl67Asn) - mutation G->C sur le nucléotide 1239 de l'exon 10 (Val380Leu) - mutation G->A sur le nucléotide 1281 de l'exon 11(Asp394Asn). L'invention concerne aussi tout vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un vecteur plasmidique, d'un cosmide, vecteur viral, episome, chromosome artificiel, etc. Dans un mode particulier, un tel vecteur comprend aussi une région promotrice permettant l'expression dudit acide nucléique. De tels vecteurs peuvent être utilisés pour produire en quantités importantes les acides nucléiques de l'invention, ou pour produire les polypeptides correspondants, dans un hôte cellulaire approprié (cellule procaryote, eucaryote, animale ou végétale, par exemple). Des hôtes cellulaires préférés sont notamment des cellules de bactérie (E. coli par exemple) ou des cellules de levure, ou encore des cellules mammifère, animales ou humaines. A cet égard, l'invention concerne aussi toute cellule recombinante comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. L'invention concerne aussi toute cellule mammifère, notamment humaine, comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant, en remplacement du gène sauvage de la parkine. Les cellules de l'invention peuvent être utilisées notamment pour l'étude des propriétés de la parkine, ainsi que comme modèles pour la recherche de composés susceptibles de compenser les altérations génétiques du gène de la parkine. L'invention concerne en outre tout mammifère non-humain comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant dans ses cellules. Avantageusement, ces mammifères sont obtenus par "knock-in" des altérations identifiées ci-avant, par recombinaison homologue, ou également par "knock-out" du gène sauvage, substitué par la version altérée de l'invention. De tels mammifères (rongeurs, canins, lapins, etc. ) sont notamment utilisables pour l'étude des propriétés de la parkine et l'identification de composés à visée thérapeutique, par exemple. L'invention concerne également tout polypeptide codé par un acide nucléique tel que décrit ci-avant. Ces polypeptides sont donc la parkine humaine, ses variants polymorphes, et des variants mutés et/ou tronqués impliqués dans l'apparition et/ou le développement de la maladie de Parkinson. L'invention concerne en particulier les variants tronqués de la parkine tels que décrits ci-avant, ou une partie de ceux-ci correspondant à la séquence créée par le décalage de cadre de lecture. De tels polypeptides ou fragments, ou les acides nucléiques correspondants, sont utilisables pour identifier et/ou étudier des composés susceptibles de restaurer un phénotype normal à des cellules les exprimant. En particulier, les acides nucléiques décrits cidessus peuvent être transférés dans des cellules hôtes appropriées, de préférence des cellules eucaryotes (mammifère, levure par exemple), pour être utilisés dans un test de screening de composés capables de contrecarrer leur activité, qu'il s'agisse de composés chimiques, biochimiques ou génétiques. De tels polypeptides ou fragments sont également utilisables à titre d'antigènes, pour la préparation d'anticorps spécifiques, utilisables pour la détection des variants. En particulier, les régions polypeptidiques spécifiques des formes tronquées (en particulier les extrémités) peuvent être utilisées pour la préparation d'anticorps, selon les techniques classiques de l'immunologie, lesquels anticorps constituent alors des outils de détection de la présence de ces formes dans des échantillons biologiques issus de sujets. De tels anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux (préparés par exemple par fusion de cellules de rate d'animaux immunisés avec les antigènes, avec des cellules de myelome, puis sélection de clones producteurs d'anticorps monoclonaux). A cet égard, l'invention concerne également tout anticorps spécifique d'un polypeptide tel que décrit ci-avant, ou d'une région spécifique d'un tel polypeptide. Le terme "anticorps spécifique" désigne un anticorps ayant une affinité particulièrement supérieure pour l'antigène donné, par rapport à tout autre antigène. L'invention concerne en outre toute composition comprenant un polypeptide ou un anticorps tels que décrits ci-avant. Ces composition peuvent être conditionnées dans différents types de milieux (solutions salines, isotoniques, etc. ) en présence de stabilisants ou de conservateurs, par exemple. Ces compositions peuvent être conservées au froid ou congelées, dans tout dispositif approprié (tube, boite, flacon, fiole, poche, etc.). D'autre part, en plus des altérations génétiques exoniques décrites ci-avant, l'invention décrit également des altérations génétiques introniques du gène de la parkine. Ces altérations n'induisent pas de changement dans la séquence de la protéine codée, et constituent essentiellement des variants polymorphiques. Ces variants sont plus particulièrement décrits dans le Tableau 2. L'une des applications de l'invention réside dans la détection de la présence de mutations dans le gène de la parkine, et leur corrélation avec la susceptibilité à la maladie de parkinson, par exemple. A cet égard, l'invention concerne également différents outils (sondes, amorces, anticorps, etc. ), utiles à la mise en oeuvre de telles méthodes de détection. En particulier, l'invention concerne toute sonde ou oligonucléotide hybridant spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini ci-avant. Les sondes ou oligonucléotides spécifiques de l'invention comprennent généralement moins de 500 pb, plus préférentiellement moins de 300 pb. Typiquement un oligonucléotide spécifique de l'invention comprend de 5 à 100 pb, avantageusement de 5 à 50 pb. La longueur de l'oligonucléotide peut bien entendu être ajustée par l'homme du métier. Les sondes ou oligonucléotides de l'invention sont par ailleurs généralement marqués, de manière à permettre leur détection. Différents types de marquages connus de l'homme du métier peuvent être utilisés (marquage radioactif, fluorescent, enzymatique, chimique, terminal ou interne, etc. ). Enfin, les sondes ou oligonucléotides de l'invention ont la capacité d'hybrider spécifiquement avec les acides nucléiques tels que définis ci-avant, c'est-à-dire avec les différentes formes altérées du gène de la parkine. L'hybridation est dite spécifique lorsque la sonde ou l'oligonucléotide hybrident, dans des conditions de stringence élevée, avec l'acide nucléique portant l'altération recherchée, et pas ou peu avec le même acide nucléique ne portant pas ladite altération. L'hybridation est donc dite spécifique lorsque le différentiel signal spécifique/bruit de fond est suffisamment grand pour pouvoir être détecté. Les sondes ou oligonucléotides de l'invention sont donc généralement complémentaires d'un région au moins du gène de la parkine portant les altérations génétiques a) à e) décrites ci-avant. La complémentarité est généralement parfaite, de manière à assurer une meilleure sélectivité d'hybridation. Ces sondes ou oligonucléotides peuvent être synthétisés par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par clivage à partir des acides nucléiques décrits ci-avant, ou par synthèse artificielle, ou en combinant ces techniques. Ces sondes ou oligonucléotides sont utilisables pour l'identification, sur des échantillons biologiques, de la présence d'altérations génétiques du gène de la parkine. Des exemples de tels oligonucléotides sont donnés dans le Tableau 1. L'invention concerne aussi un couple d'amorce pour l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend : - une première amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 5' d'une altération génétique, et - une deuxième amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 3' de ladite altération génétique. Les amorces de l'invention sont généralement complémentaires d'une région du gène de la parkine, et comprennent avantageusement moins de 30 pb. L'invention concerne encore un procédé pour l'identification d'une altération génétique dans le gène de la parkine, comprenant: i) la mise a disposition d'un échantillon test comprenant le gène de la parkine, ii) l'amplification d'une partie au moins dudit gène, ladite partie comprenant une altération génétiquetelle que définie ci-avant, et iii) la mise en évidence de la présence de l'altération génétique. Avantageusement, dans le procédé de l'invention, l'échantillon est un échantillon de sang, tissu, plasma ou une culture de cellules, provenant d'un sujet, notamment d'un mammifère, en particulier d'un humain. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, l'échantillon est prétraité de manière à rendre le gène de la parkine, ou une partie de celui-ci, accessible pour l'amplification. Ce prétraitement peut comprendre la lyse des cellules, un traitement enzymatique, une dénaturation, etc. Avantageusement, l'amplification est réalisée au moyen d'un couple d'amorces tel que décrit plus haut. La mise en évidence de la présence d'une altération génétique peut être réalisée par différentes techniques, et notamment par séquençage, PCR/restriction, ASO ou PAGE, comme détaillé dans la partie expérimentale. L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces tels que décrits ci-avant. Les kits de l'invention comprennent avantageusement les réactifs appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et, éventuellement, un support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.). La présente invention est particulièrement adaptée au diagnostique d'une susceptibilité à la maladie de parkinson, par la recherche d'une altération génétique telle que décrite plus haut dans le gène de la parkine. La présente invention est également relative à l'utilisation des outils décrits ci-avant (acides nucléiques, sondes, polypeptides, anticorps, cellules, animaux) pour l'identification de composés capables de contrecarrer, au moins en partie, les effets d'une altération génétique du gène de la parkine, notamment dans un but thérapeutique. Ainsi, de tels composés peuvent être mis en évidence par mise en contact d'une composition (ou d'un produit) test en présence d'une cellule ou d'un animal tel que décrit ci-avant, et détection d'un effet phénotypique ou génotypique. La méthode de l'invention peut notamment permettre l'identification de composés susceptibles d'être utilisés, seule ou en combinaison avec d'autres produits ou traitemens, pour le traitement (i. e., la diminution) de la maladie de Parkinson. De tels composés constituent un autre objet de la présente invention. D'autres avantages et applications de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES A - Légende des Figures Figure 1 : Séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Figure 2 : présentant des mutations ponctuelles dans le gène de la parkine. La coségrégation complète de la mutation avec la maladie est représentée. Les carrés (homme) et ronds (femmes) noirs représentent les individus affectés avec l'âge d'apparition (en années) indiqué sous le symbole des patients. Les symboles barrés indiquent des patients décédés. Le nombre de frères et soeurs non affectés, non analysés est donné en losange. Pour chaque mutation (changement d'acide aminé), le génotype du membre de la famille est indiqué (+/+ homozygote sauvage, +/hétérozygote pour la mutation ; -/- homozygote pour la mutation). Sous chaque génotype, les résultats de détection sont donnés. PAGE : électrophoregrammes avec la taille de l'allèle en pb ; ASO : autoradiogrammes des allèles mutés et sauvages ; PCR/restriction : produits PCR après digestion avec les enzymes de restriction appropriées. La longueur des fragments en pb est donnée. Mut : muté ; nd : âge d'apparition non déterminé, puisque patient n'est pas conscient des symptômes. Figure 3 : Représentation et localisation des mutations ponctuelles du gène de la parkine. La séquence codante du gène, avec ses 12 exons, est représentée (barre). Les exons sont numérotés 1 à 12. Les 8 mutations ponctuelles causales sont positionnées selon leur effet sur la protéine (troncation vs faux-sens). Le domaine ubiquitine-like et le motif en anneau ("Ring Finger") sont hachurés. Pour les mutations Thr415Asn et Trp453Stop, les sites de phosphorylation (P) et de myristoylation (M) sont indiqués. UTR ; région non traduite. Tableau 1 : Oligonucléotides utilisés pour la technique ASO. Les changements de nucléotide dans la séquence des oligonucléotides sont représentés en gras et soulignés. WT = type sauvage ; V = variant. Tableau 2 : du gène de la Parkine : numérotation des nucléotides est effectuée selon la séquence de l'ADNc qui figure dans la DNA Data Bank of Japan (DDBJ; accession number :AB009973) dans la Figure 1; ASO = allele spécifique oligonucleotide; les mutations causales sont présentées en gras et italique. Tableau 3 : cliniques des patients en fonction du type d'altération génétique. Les patients de la famille IT-020 qui sont hétérozygotes composites pour une mutation faux sens et une mutation tronquante ne figurent pas dans le tableau. a : p B - Matériel et méthodes 1. Familles et patients Trente-huit familles ont été sélectionnées selon les critères suivants: syndrome parkinsonien réactif à la lévodopa, ii) âge de début au plus de 45 ans pour au moins un des membres atteints, et iii) transmission compatible avec une hérédité autosomique récessive. Tous les patients ont été évalués selon un protocole standardisé. Le consentement éclairé de tous les participants a été recueilli par écrit. 2. Analyse du gène de la parkine L'ADN des 12 exons codants du gène de la parkine a été amplifié par PCR à partir de leucocytes du sang périphérique, pour chaque cas index, selon les conditions décrites dans Kitada et al. Brièvement, l'amplification a été réalisée sur 100 ng d'ADN, en présence de 350 M de chaque dNTP, 350 M de chaque amorce, et de la polymérase Taq. Les conditions d'amplification sont de 35 cycles à 94 C pendant 30sec., à 55-61 C pendant 30sec., puis à 68 C pendant 30 sec. Pour les exons 4 et 7, seul le couple d'amorces introniques a été utilisé. La séquence des 12 exons a été réalisée sur les deux brins avec les amorces utilisées pour l'amplification par PCR, avec le kit de séquençage "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (ABI PRISM) et analysée après électrophorèse sur séquenceur ABI 377 avec le logiciel "Séquence Analysis 3. 0" (ABI PRISM). La détection des mutations dans les échantillons et l'analyse d'une population de 45 individus controle a été effectuée par trois techniques, qui peuvent être utilisées seules ou en combinaison (s) : avec l'enzyme de restriction appropriée ; technique ASO ("Allele Spécifie Oligonucleotide"), et électrophorèse sur gel de polyacrylamide ("PAGE"), comme illustré dans le Tableau 2. Plus particulièrement, ces techniques ont été mises en oeuvre comme décrit ci-après. La technique ASO : Cette approche consiste à hybrider deux sondes oligonucléotidiques sur un échantillon amplifié (par exemple par PCR), la première spécifique de et recouvrant une altération génétique, la seconde spécifique de et recouvrant la région correspondante sauvage. Ainsi, en présence d'un gène muté, seule la première sonde permet l'hybridation avec le fragment d'ADN, alors que en présence d'un gène non-muté, seule la seconde sonde permet l'hybridation avec le fragment d'ADN. Dans le cas d'un gène hétérozygote, une hybridation est obtenue avec chacune des sondes. Cette technique peut également être réalisée de manière concomitante à l'amplification, en utilisant deux couples d'amorces, le premier comprenant une amorce spécifique de et recouvrant la région correspondante sauvage. Dans ce mode de réalisation, en présence d'un gène muté, seul le premier couple permet l'amplification d'un fragment d'ADN, alors que en présence d'un gène nonmuté, seul le second couple d'amorce permet l'amplification d'un fragment d'ADN. Dans le cas d'un gène hétérozygote, un produit d'amplification est obtenu avec chacun des couples d'amorces. Pour la mise en oeuvre de cette technique, 10 l de produit PCR ont été dénaturés à 95 C pendant 5 min, déposés sur des membranes nylon Hybond N+ (Amersham), puis fixés au microonde à 600W pendant 2 min. Les amorces spécifiques (ou oligonucléotides) utilisées pour la détection (ou, le cas échéant, pour l'amplification) sont décrites dans les exemples (voir Tableau 1). Pour l'exon 3, les amorces exoniques Ex3iFor (avant) et Ex3iRev (arrière) ont été utilisées. La séquence de ces amorces est la suivante : Ex3iFor : 5'-AATTGTGACCTGGATCAGC-3' Ex3iRev : 5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' Ces oligonucléotides (y compris les amorces, dans le cas d'une amplification simultanée), marqués au dCTP32 au moyen du kit Terminal Transferase (Boehringer Mannheim) ont été hybridés aux membranes à 44 C pendant la nuit dans un tampon consistant en 5 X SSC, 5 X Denhardts et 0,1% SDS. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois pendant 30 min dans un milieu 2 X SSC à 59 C et exposées à un film MP (Amersham) pendant 3-6 heures. Technique de PCR/restriction : technique est basée sur l'utilisation d'enzymes de restriction dont le profil de digestion se trouve modifié du fait de l'altération génétique. Préférentiellement, cette technique met donc en oeuvre des enzymes de restriction dont le site est modifié (détruit ou créé) par l'altération génétique. Ainsi, selon le profil de digestion de l'acide nucléique (généralement du produit d'amplification), il est possible de distinguer la présence ou non de l'altération génétique recherchée. Bien entendu, cette technique est tout particulièrement adaptée à la recherche d'altérations génétiques caractérisées, entraînant une modification dans un site de coupure enzymatique. Pour sa mise en oeuvre, 15 l de produit d'amplification est mis à digérer en présence de ou des enzymes de restriction appropriées, selon les recommandations du fabricant. Les enzymes particulières utilisées dans les exemples et la taille des fragments de restriction attendue sont donnés dans le Tableau 2. Technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide ("PAGE") : Cette technique permet de détecter la présence de mutations par mesure de la taille des produits d'amplification. Elle est donc tout particulièrement adaptée à la détection d'altérations génétiques de type insertion ou délétion. Pour sa mise en oeuvre, une amorce avant marquée (5'-fluorescente, Hex) a été utilisée pour amplifier l'exon 2 du gène de la parkine. La présence de l'altération 202-203delAG, résultant en un produit PCR plus court (306 vs 308 pb) a été établie par mesure de la taille du fragment amplifié en utilisant un séquenceur automatique ABI377 équipé des logiciels "Genescan 2. 0.2" et "Genotyper 1.1.1"(ABI PRISM). La numérotation des nucléotides utilisée dans la présente demande est donnée par référence à la séquence de l'ADNc qui figure dans la DNA Data Bank of Japan (DDBJ; accession number: AB009973). La séquence est représentée sur la figure 1. Cette séquence diffère de la séquence décrite par Kitada et al. au niveau du nucléotide 768. La séquence présentée sur la figure 1 correspond à la protéine sauvage rencontrée dans les populations européennes. C - Résultats L'analyse du gène de la parkine a été réalisée chez le cas index de 38 familles avec AR-JP qui comportent 87 patients. 1. Détection de délétions d'exons L'amplification des exons a révélé la présence d'une délétion à l'état homozygote dans trois familles: délétion de l'exon 3 dans une famille française (SAL- 024) et une portugaise (SAL-711), et des exons 8 et 9 dans une famille algérienne (DEL-001). Ces délétions se transmettent avec la maladie car elles sont détectées dans chaque famille à l'état homozygote chez tous patients mais pas chez les apparentés sains prélevés (figure 2). 2. Détection de mutations ponctuelles L'analyse de séquence dans les familles sans délétion homozygote a révélé la présence de 16 variants de la séquence nucléique : dans les exons et 4 dans les introns (tableaux 2 et 3, figure 3). Trois variants entrainent un décalage du cadre de lecture et la synthèse d'une protéine tronquée. Il s'agit des mutations 202-203delAG (Gln34Arg(Stop37)) et 255deiA (Asn52Met(Stop81)) dans l'exon 2 et 321-322insGT (Trp74Cys(Stop81)) dans l'exon 3 trouvées respectivement dans les familles IT-020 et UK-086, TOU-096, LYO-119. Ces mutations, à l'exception de 202-203delAG sont à l'état homozygote. Une mutation non sens 1459G>A (Trp453Stop) dans l'exon 12 est présente à l'état homozygote dans la famille IT-006. Huit des variants sont de type faux sens. Dans l'exon 4,584A>T (Lysl6lAsp) et 601G>A (Serl67Asn) sont à l'état hétérozygote chez les patients des familles IT-020 et SAL-730, respectivement. Dans l'exon 7, les variants 867C>T (Arg256Cys) et 924C>T (Arg275Trp) sont trouvés à l'état hétérozygote dans les familles DE-012 et IT-015, respectivement. Dans l'exon 10, le variant 1239G>C (Val380Leu) est trouvé à l'état hétérozygote et homozygote dans 11 familles (IT-014, IT-020, IT-058, SAL-017, GRE-029, SAL-038, TOU-096, SAL-431,UK-006, UK-086, DE-022). Dans l'exon 11, le variant 1281G>A (Asp394Asn) est détecté à l'état hétérozygote dans la famille UK-046 et 1345C>A (Thr415Asn) à l'état homozygote dans la famille IT-014. Enfin, le variant 768C>T (Pro223Ser) n'est pas pathogène, car il est détecté à l'état homozygote chez tous les individus séquences suggèrant qu'il s'agit d'une erreur typographique dans la séquence de la parkine [Kitada et al., 1998]. La recherche de ces variants dans la population témoin révèle que trois d'entre eux représentent des polymorphismes (tableau 2) : Serl67Asn, Val380Leu et Asp394Asn. Les autres variants constituent très probablement des mutations causales car ils entraînent la synthèse de parkine tronquée ou des substitutions non conservatives ou des substitutions portant sur un des acides aminés susceptible d'être phosphorylés. De plus, ils ségrègent avec la maladie dans les familles et ne sont pas détectés dans 90 chromosomes de témoins. Les variants identifiés dans les introns 2,3, 6 et 7 (IVS2+25T>C (272+25T>C), IVS3-20C>T (514-20C>T), IVS6+19T>C (835+19T>C) et IVS7- 35A>G (973-35A>G)) constituent des polymorphismes (tableau 2). Ils ne sont pas localisés à proximité des sites d'épissage et sont détectés dans les chromosomes de témoins. 3. Domaines fonctionnels de la Parkine Une étude des domaines fonctionnels de la parkine a été entreprise par analyse et comparaison de séquences. Cette étude montre que le changement conservatif d'acide aminé Thr415Asn est localisé dans la séquence consensus d'une protéine kinase cAMP- et cGMP-dépendante (KKTT) et dans le site de phosphorylation d'une protéine kinase C (TTK). Cette étude montre en outre que la mutation non-sens Trp453Stop est localisée dans un site N-terminal de myristoylation (GCEWNR). 4. Corrélations phénotype génotype Les délétions homozygotes et les mutations ponctuelles ont été détectées dans 12 familles qui comportent 26 patients. L'âge moyen de début est de 36,7 ans avec des extrêmes de 7 à 56 ans (tableau 3). La comparaison entre les familles selon les conséquences fonctionnelles des mutations (délétion homozygote, mutation tronquante et mutation faux sens) ne révèle pas de différences significative de l'âge de début, de la sévérité ou de la fréquence des signes associés, sauf pour le tremblement qui est significativement moins fréquent dans les familles avec une délétion homozygote, comparé aux familles avec des mutations tronquantes (tableau 3). D - Discussion La mise en évidence dans 3 familles de délétions homozygotes et dans 9 de mutations ponctuelles causales sur un échantillon de 38 familles démontre que les anomalies du gène de la parkine constituent une cause fréquente d'AR-JP en Europe. Il reste à évaluer la fréquence de ces mutations dans les cas isolés de syndrome parkinsonien de début précoce. Le rôle pathogène des délétions homozygotes parait facile a établir. Dans les 2 mutations décrites, délétions de l'exon 3 et des exons 8-9, la perte de l'exon s'accompagne d'un décalage du cadre de lecture conduisant à l'apparition d'un codon de terminaison prématuré. En l'absence d'épissage alternatif, il en résultera un protéine tronquée. Huit des variants exoniques constituent des mutations causales. Premièrement, ces mutations ségrègent avec la maladie dans les familles. Deuxièmement, ces variants ne sont pas détectés par ASO, PAGE ou PCR/restriction dans 90 chromosomes de témoins. Troisièmement, les conséquences fonctionnelles des mutations apparaissent délétères. Il est facile de concevoir que les 4 mutations ponctuelles tronquantes (Gln34Arg(Stop37), Asn52Met (Stop81), Trp74Cys(Stop81), Trp453Stop), détectées à l'état homozygotes chez les patients de 3 des 5 familles, vont causer une perte de fonction de la parkine en accord avec la transmission autosomique récessive de la maladie. Trois des quatre mutations faux sens entraînent des changements non conservatifs d'acides aminés. L'un d'entre eux (Lys 161 Asp) est associé à une mutation tronquante sur l'autre allèle qui renforce l'hypothèse d'un rôle pathogène. Une mutation faux sens est conservative (Thr415Asn), mais affecte un site potentiel de phosphorylation. Trois des mutations faux sens sont présentes à l'état hétérozygote chez des patients dont l'autre mutation n'a pas été caractérisée. Il est probable qu'il s'agit de délétions d'un ou plusieurs exons à l'état hétérozygote qui ne peuvent être visualisées avec les techniques utilisées pour cette étude. Les anomalies du gène de la parkine mises en évidence sont variées et il n'existe pas de hot spot de mutations. Il faut noter que les mutations ponctuelles tronquantes correspondent préférentiellement aux régions N- et C-terminales de la parkine (comprenant en particulier les motifs ubiquitine-like et en anneau "RING- finger", respectivement) alors que les mutations de type faux sens affectent la région centrale. Seules deux des 11 mutations décrites sont rencontrées dans plusieurs familles. La délétion homozygote de l'exon 3 est détectée dans les familles française SAL-024 et portugaise SAL-711. La mutation avec décalage du cadre de lecture 202- 203deIAG (Gln34Arg(Stop37)) est visualisée à l'état hétérozygote dans les familles italiennes IT-020 et anglaise UK-086. L'origine différente des familles est en faveur de l'hypothèse de la survenue indépendante de ces mutations. Les mutations décrites affectent des familles provenant de 6 pays : Allemagne, Angleterre, France, Italie et Portugal. L'étude du phénotype dans les familles avec une mutation montre que le spectre clinique associé aux anomalies de la parkine est plus étendu que dans les familles japonaises [Kitada et al., 1998]. Ces résultats confirment les observations faites dans des familles Européennes et d'Afrique du Nord étudiées par liaisons génétiques [Tassin et al., 1998]. L'age de début est supérieur à 50 ans chez plusieurs patients, allant jusqu'à 56 ans. Certains signes cliniques tels que la dystonie ou les signes pyramidaux aux membres inférieurs ne sont pas toujours présents chez les porteurs de mutation même après des durées d'évolution de plusieurs décennies. Globalement le phénotype reste très similaire entre les groupes de patients classés selon les conséquences fonctionnelles des mutations. Cependant, la présence d'épisodes de dystonie douloureuse semble rencontrée exclusivement chez les patients porteurs de délétions homozygotes. L'absence de différence significative pour l'âge de début, la sévérité et la fréquence des signes associés entre les mutations ponctuelles tronquantes et les faux sens suggère que les acides aminés modifiés dans ces dernières jouent un rôle important dans la physiologie de la parkine. En conclusion, cette étude souligne la fréquence des mutations du gène de la parkine dans les syndromes parkinsoniens familiaux de début précoce en Europe. Des anomalies de ce gène sont aussi à l'origine de syndromes parkinsoniens plus tardifs ou atypiques. Il reste à déterminer le rôle de mutations de la parkine ou de ses polymorphismes dans les cas isolés. Les mutations détectées sont très diverses tant par leur nature que par leur localisation. L'étude de leur localisation dans la parkine suggère que de nombreuses régions de la protéine concourent à sa fonction, encore inconnue. Références Bibliographiques de Rijk MC, Tzourio C, Breteler MM, Dartigues JF, Amaducci L, Lopez-Pousa S, Manubens-Bertran JM, Alperovitch A and Rocca WA. Prevalence of parkinsonism and Parkinson's disease in Europe: the EUROPARKINSON Collaborative Study. European Community Concerted Action on the Epidemiology of Parkinson's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry (1997), 62: 10-5 Gasser T, M#ller-Myhsok B, Wszolek ZK, Oehlmann R, Calne DB, Bonifati V, Bereznai B, Fabrizio E, Vieregge P and Horstmann RD. A susceptibility locus for Parkinson's disease maps to chromosome 2pl3. Nature Genetics (1998), Ishikawa A and Tsuji S. Clinical analysis of 17 patients in 12 Japanese families with autosomal- recessive type juvenile parkinsonism. Neurology (1996), 47 : 160-6Jones AC, Yamamura Y, Almasy L, Bohlega S, Elibol B, Hubble J, Kuzuhara S, Uchida M, Yanagi T, Weeks DE and Nygaard TG. 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Neurology (1973), 23 : 239-44TABLEAU 1 Position Changement de nucléotide Séquence oligonucléotidique Ex3 321-322insGT WT:T'-TGCAGAGACC--GTGGAGAAAA-3' V : 5'-GCAGAGACCGTGTGGAGAAA-3' Ex4 584A>T WT: 5'-GCCGGGAAAACTCAGGGTA-3' V : 5'-GCCGGGAAATCTCAGGGTA-3' Ex7 867C>T WT : V: 5'-TGCAACTCCTGCCACGTGA-3' Ex10 1239G>C WT: 5'-TGCAGTGCCGTATTTGAAG-3' V : 5'-TGCAGTGCCCTATTTGAAG-3' Exil 1345 C>A WT : 5'-AGAAAACCACCAAGCCCTG- 3' V : 5'-AGAAAACCAACAAGCCCTG-3' TABLEAU 2 VARIANTS DU GENE DE LA PARKINE: exon/ changement changement protéique type de mutation technique de longueur nombre de fréquence intron nucléotidique (position du codon stop) détection attendue (pb) témoins du variant exonique Ex2 202-203delAG Gln34Arg(Stop37) décalage du PAGE WT: 308 55 0% cadre de lecture V:306 Ex2 255delA Asn52Met(Stop81) décalage du Fok l WT : 278+30 83 0% cadre de lecture création du V:222+57+30 ~~~~~ site Ex3 321-322insGT Trp74Cys(Stop81) décalage du ASO 83 0% cadre de lecture Ex4 584A>T Lys161Asp faux sens ASO 83 0% Ex4 601 G>A Ser167Asn faux sens Alw Nl perte WT:164+97 83 1% du site V: 261 Ex7 867C>T Arg256Cys faux sens ASO 83 0% Ex7 924C>T Arg275Trp faux sens Sali 3A perte WT : 142+97 83 0% du site V:239 Ex 10 1239G>C Val380Leu faux sens ASO 45 16% Exil 1281G>A Asp394Asn faux sens Taq 1 perte WT : 221 +84 90 7% du site V : 303 Exil 1345C>A Thr415Asn faux sens ASO 83 0% Ex12 1459G>A Trp453Stop non sens Nla IV perte WT:142+17+3 83 0% du site 5+61 V:159+35+61 intronique Intron2 IVS2+25T>C Bst Nl 45 19% (272+25T>C) création du @ site Intron3 1VS3-20C>T Mnil pC11e -##########45#####0.## (514-20C>T) du site Intron7 IVS7-35A>G Maelll 36 27% (973-35A>G) création du 36 27% @ site TABLEAU 3 CARACTÉRISTIQUES CLINIQUES DES FAMILLES AVEC MUTATIONS DU GÈNE DE LA PARKINE Délétions Mutations faux sens Mutations tronquantes Total ~~~~~~~~~~ homozygotes Familles (Patients) 3(8) 3(8) 4(9) 10(25) Age moyen de début 30 ~ 16 (7-55) 44 ~ 9 (30-56) 37~6 (29-45) 37~12 (7-56) (extrêmes) Durée moyenne d'évolution 13 ~6 (3-20) 13 + 7 (0.5-27) 16~10 (3-29) 14~8(0,5-29) (extrêmes) Echelle de Hoehn et Yahr 3.1 ~ 1.2 2.6 0. 8 2.00.6 2,50,98 Akinésie 8/8 8/8 8/9 96% Rigidité 8/8 8/8 9/9 100% Tremblement 3/8 4/8 8/9 60% Dystonie 4/8 0/5 1/7 25% Bonne réactivité à la 7/7 (1) 6/6 (2) 7/7 100% levodopa (cas de novo) Dyskinésies 4/7 5/6 6/9 68% Fluctuations'* Np Fluctuations' 7/7 ND 2/6 62% Réflexes vifs aux MI 2/8 3/4 0/6 28% REVENDICATIONS 1. Acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs altérations génétiques choisies parmi: a) une délétion de l'exon 3, b) une délétion des exons 8 et 9 c) une délétion de 1 ou 2 paires de bases contigües entraînant un décalage du cadre de lecture, d) une insertion de 1 ou plusieurs paires de bases contigües, et e) une mutation ponctuelle. 2. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mutation ponctuelle e) est une mutation non-sens. 3. Acide nucléique selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comporte une mutation ponctuelle 1459G->A, introduisant un codon stop à la place du résidu Trp453. 4. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce que la mutation ponctuelle e) est une mutation faux-sens. 5. Acide nucléique selon la revendication 4 caractérisé en ce que la mutation faux-sens entraine un changement non-conservatif d'acide aminé dans la protéine codée. 6. Acide nucléique selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comporte une mutation Lys161Asp, Arg256Cys et/ou Arg275Trp. 7. Acide nucléique selon la revendication 4 caractérisé en ce que la mutation faux-sens affecte un site potentiel de phosphorylation dans la protéine codée. 8. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comporte une mutation Thr415Asn. 9. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'insertion d) entraîne un décalage du cadre de lecture. 10. Acide nucléique selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'insertion est une insertion de 1 à 5 paires de bases contigües, de préférence de 1 ou 2. 11. Acide nucléique selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comporte une insertion GT entre les positions 321 et 322. 12. Acide nucléique codant pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence présentée sur la figure 1. 13. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12. 14. Anticorps spécifique d'un polypeptide selon la revendication 13. 15. Composition comprenant un polypeptide selon la revendication 13 ou un anticorps selon la revendication 14. 16. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12. 17. Couple d'amorce pour l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend: - une première amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 5' d'une altération génétique, et - une deuxième amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine située en 3' de ladite altération génétique. 18. Procédé pour l'identification d'une altération génétique dans le gène de la parkine comprenant: i) la mise a disposition d'un échantillon test comprenant le gène de la parkine, ii) l'amplification d'une partie au moins dudit gène comprenant une altération génétique selon la revendication 1, et iii) la mise en évidence de la présence de l'altération génétique. 19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'échantillon est un échantillon de sang, tissu, plasma ou une culture de cellules. 20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que l'échantillon est prétraité de manière à rendre le gène de la parkine, ou une partie de celui-ci, accessible pour l'amplification. 21. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'amplification est réalisée au moyen d'un couple d'amorces selon la revendication 17. 22. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que la mise en évidence est réalisée par séquençage, PCR/restriction, ASO ou PAGE. 23. Procédé de diagnostique d'une susceptibilité à la maladie de parkinson comprenant la recherche d'une altération génétique dans le gène de la parkine selon la revendication 1. 24. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 25. Cellule comprenant un vecteur selon la revendication 24. 26. Mammifère non-humain comprenant, dans ses cellules, un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12. 27. Utilisation d'une cellule selon la revendication 25 ou d'un mammifère selon la revendication 26 pour l'identification de composés capables de contrecarrer les effets d'une altération génétique du gène de la parkine.