Brevet FR2795820A1 — publié le 20010105

La présente invention concerne un monoréactif et une trousse de diagnostic le comprenant destinés à la détection et à la quantification des microparticules d'origine endothéliale dans un échantillon plasmatique par cytométrie de flux. Le monoréactif comporte un mélange d'anticorps monoclonaux spécifiques des molécules membranaires des cellules endothéliales, ledit mélange comprenant un anticorps (1) marqué avec un fluorochrome 1 et un anticorps (2) marqué avec un fluorochrome 2, lesdits anticorps (1) et (2) n'ayant pas la même spécificité et quatre populations de microsphères servant respectivement à définir la région d'analyse, le seuil d'intensité minimum et permettant le comptage des microparticules L'invention porte également sur un procédé de quantification des microparticules d'origine endothéliale mettant en #uvre le monoréactif et la trousse. Sous l'action de certains stimuli, tels que des cytokines, des interleukines ou des agents infectieux, la membrane plasmique des cellules endothéliales produit des microvésicules. Ce phénomène de bourgeonnement de la membrane pourrait exposer une plus grande surface catalytique pour l'assemblage du complexe enzymatique prothrombinasique qui est une étape essentielle de la cascade de la coagulation génératrice de thrombine, l'enzyme clé de la fibrinoformation L'existence de microvésicules d'origine endothéliale, et donc de marqueurs d'une activation ou d'une souffrance endothéliale, pourrait être une cause ou une conséquence de lésions vasculaires aiguës ou chroniques Une étude, à la base de laquelle la présente invention a été accomplie, a démontré que des microparticules endothéliales (EMP) sont présentes dans le sang périphérique humain (Combes V. et al. le juillet 1999. Endothelial microparticules : induction by TNF in vitro and possible implications for dissémination for prothrombotic activity in patients with lupus anticoagulant ; The Journal of Clmical Investigation ; vol 104, n 1, cité dans la description par référence) Pour la première fois en effet, des EMP ont été détectées en forte proportion dans le plasma de patients présentant un lupus anticoagulant (LA). Chez ces patients, la coagulation anormale a été reconnue comme étant fortement associée aux risques de thromboses (Harris E , Pierangeli S , Gharavi A. E. 1998. Diagnosis of the antiphospholipid syndrome : a proposai for use of laboratory tests. Lupus 7 : S144-S148 ; et Whal, D. G., Guillemin F., de Maistre E, Perret C., Lecompte T and Thibaut G. 1997. Risk for venous thrombosis related to antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus - A meto-analysis Lupus 6 : 467-473 ; cité dans la description par référence) Dans Combes et al , 1999, la quantification des EMP a été effectuée par cytométrie de flux comme suit Des suspensions contenant 105 cellules ou des microparticules produites par 106 cellules ont été analysées par CoulterTM Epix XL (Coultronics France, Margency). Les microparticules ont été définies comme étant des éléments de diamètre inférieur à 1,5 m et marqués avec des anticorps spécifiques. Le nombre de particules est évalué en utilisant des anticorps marqués avec FITC-annexine V, comme précédemment décrit dans Jy, W., Horstman L. L, Arce M, and Ahn U. S.. 1992. Clinical significance of platelet microparticles in autoimune thrombocytopenias. J. Lab. Clin. Med 119 : 334-345, cité dans la description par référence Des billes de latex calibrées (Sigma) ont été utilisées comme standard et un nombre connu de billes a été ajouté à chaque échantillon. La publication Combes et al montre qu'il existe dans le plasma de patients présentant les symptômes de la thrombose un nombre significativement plus important d'EMP que dans le plasma de patients asymptômatiques. La technique de cytométrie de flux est bien connue de l'homme du métier et est couramment utilisée pour la quantification et la discrimination des cellules et des microvésicules. On peut citer par exemple la méthode visant à quantifier les microvésicules dérivées des plaquettes dans le plasma telle que décrite dans Combes et al, 1997. A new flow cytometry method of platelet-derived microvesicule quantitation in plasma Thrombosis and Haemostasis 77 (1) page 8 Toutefois, cette publication ne décrit pas un procédé de détection et de quantification de microparticulcs endothéliales consistant en un double marquage et mettant en oeuvre la population distincte de microsphères. Description La présente invention concerne un perfectionnement et une adaptation de la technique utilisée dans Combes et al pour quantifier les EMP dans le plasma. Le procédé, objet de l'invention, consiste en un double marquage qui permet non seulement d'amplifier le signal mais également de calculer le ratio entre deux marqueurs et ainsi, de suivre l'état physiologique des patients. Un premier aspect de l'invention porte sur un monoréactif pour la détection et la quantification des microparticules d'origine endothéliale dans un échantillon plasmatique par cytométrie de flux caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'anticorps monoclonaux spécifiques des molécules membranaires des cellules endothéliales, ledit mélange comprenant un anticorps (1) marqué avec un fluorochrome 1 et un anticorps (2) marqué avec un fluorochrome 2, lesdits anticorps (1) et (2) n'ayant pas la même spécificité et un mélange de microsphères comprenant . - Une population A de microsphères (étalon) marquée par un fluorochrome servant à définir la région d'analyse des microparticules en terme de taille (paramètres de diffusion lumineuse) et permettant leur différenciation, - une population de microsphères B (étalon) dont le nombre est connu servant au comptage des microparticules, - une population de microsphères C marquée uniquement par le fluorochrome 1, servant à définir sur le paramètre de fluorescence du fluorochrome 1 le seuil d'intensité minimum caractérisant. les microparticules marquées par les anticorps- fluorochrome 1, - et une population de microsphères D, de diamètre identique à C, et marquée uniquement par le fluorochrome 2, servant à définir la région d'analyse des événements considérés positifs pour le fluorochrome 2. Un tel monoréactif permet le marquage en double couleur des microparticules endothéliales de telle sorte que la différenciation entre lesdites microparticules et leur équivalent, notamment leur équivalent plaqucttairc, est optimisée. Il permet également la standardisation des seuils de discrimination des microparticulcs endothéliales des autres particules et débris susceptibles d'êtres responsables d'un bruit de fond, et la standardisation du comptage des microparticules endothéliales par rapport aux microsphères étalons mentionnées ci-dessus. Avantageusement le monoréactif comprend un mélange d'anticorps monoclonaux sélectionnés notamment parmi CD51-PE (marqueur de la vitronectine, désigné également par alpha V beta 3, clone AMF7, Immunotech, Marseille, France), CD9-PE (Clone SN4/C3-3A2 Alexis Corporation), CD34-PE (clone 43.Al, Alexis Corporation), CD146-FITC (clone S-Endo 1, COM2F6 ou COM3D9, Biocytex). Bien entendu, tout anticorps équivalent provenant d'une autre source peut être utilisé pour mettre en #uvre l'invention. De préférence, les anticorps anti-CD51 et anti-CD146 sont utilisés. Dans un mode avantageux d'exécution, les microsphères A ont un diamètre compris entre 0,5 et 1 m, préférentiellement 0,8 (.un, et les microsphères B et C ont un diamètre compris entre 2 et 10 m, préférentiellement 3 m. Le diamètre des microsphères C et D peut être différent de celui des billes B de manière à dissocier de façon simple par les paramètres de diffusion lumineuse les populations C + D de la population B. Le diamètre des microsphères B, C et D peut aussi être identique. Les populations C et D peuvent être présentes dans une proportion relative de 1/3 à 2/3, préférentiellement 1/2. Les matériaux suivants peuvent être utilisés comme support solide : Les polymères organiques, tels que les polysaccharides, les polymères de styrène, les polyacrylates, la polyacrylamide, l'hydroxyethyl polyméthacrylates, les polyvinyles, les polystyrènes et les polymères contenant des groupes aromatiques. Le support solide préféré est à base de latex. De préférence, les fluorochromes sont choisis notamment parmi la phycoérythrine et le FITC (fluoresceine isothiocyanate). Néanmoins, on peut également citer le duochrome, l'allophycocyanine, le PE Tandem, l'ultralite 700 et le Texas red (ces flurochromes sont disponibles dans le commerce). Un deuxième aspect de l'invention a pour objet une trousse de diagnostic comprenant un monoréactif tel que mentionné ci-dessus destinée à la détection et à la quantification de microparticules endothéliales dans le plasma humain Cette trousse de diagnostic peut comprendre en outre un échantillon contrôle négatif de référence provenant d'un pool de plasmas humains normaux déplétés en plaquettes, ledit échantillon étant sous la forme liquide ou lyophilisé Un aspect complémentaire de l'invention a trait à un procédé de quantification des microparticules endothéliales dans le sang caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) Préparation de plasma déplété en plaquettes par centrifugation et microfiltration, b) Incubation du plasma avec un monoréactif selon l'invention de sorte à obtenir un marquage en double couleur desdites microparticules, c) Discrimination et comptage des microparticules par cytométrie de flux Les articles et brevets suivants reprennent l'ensemble des données concernant la technique de l'analyse par cytométrie de flux et sont cités dans la description par référence - McHugh, T M., "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays", Immunochemica, vol 5 (1991) - Shapiro, H M , Practical Flow Cytometry, Ch. 7, pp Il 5-198 (1988) - Gosling, "A Decade of Development in Innunoassay Methodology", Clin. Chem , vol. 36, pp 1408-1427 (1990). - Sigma, Immunochemicals Catalog, p. 285 (1992) - Cappel Product Guide (1991) - Bangs, "Latex Agglutination Tests", Am. Climcal Lab. News Edition (1988) Cantarero et al., "The Adsorptive Characteristics of Proteins for Polystyrène and Thcir Significance in solid-Phasc Immunoassays". Analylical Binc!u':l11i.\lfY, vol. 105, pp. 375-382 (1980). - Wilson et al., "A New Microsphcrc-bascd Immunofluorescence Assay using Flow Cytometry", .l. 1111111f1no. Melh, vol. 107, pp. 225-230 (1988). Bangs, "Microsphere-Based Tests and Immunoassays for Fun and Profit", Bangs I aboralorica Seminar (199 1). Rhone-Poulenc, "Estapor-brand Microspheres", Bangs Laboratories Technical Reference #21. - Walker et al., (Eds).7fc/w// in Molecnlar Biology, pp. 113-135 and 273-283 (1982). - Fulwyler et al., "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", Methods in Cell Biology, vol. 33, pp. 613-619 (1990). - US 4,499,052 ; US 4,526,276 ; US 4,717,655 ; US 4,859,584 ; US 4,783,401 et US 4,762,701, WO 98/21593 et US 5,567,627 en particulier de la page 8 à la page 14. Le plasma déplété en plaquettes peut être obtenu par double centrifugation et filtration sur Millipore 1 m ou par toute méthode équivalente. De préférence, on effectue un première centrifugation pendant 10 à 15 min, entre 2 et 18 C et à 1500 G environ, on reprend le surnageant décanté, puis on réalise une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions. Un aspect supplémentaire de l'invention porte sur l'utilisation d'un monoréactif ou d'une trousse explicité ci-dessus pour la détection des activités procoagulantes au cours des maladies thrombotiques ou prothrombotiques telles que les lupus anticoagulants et/ou pour la détection de lésions vasculaires aiguës ou chroniques. Exemples 1 : Caractéristiques préférées des microsphères. Le monoréactif comporte, en plus des anticorps marqués, pour les uns par un fluorochrome 1 (ex. FITC) et pour les autres par fluorochrome 2 (ex. phycoérythrine), 4 populations de microsphères. Ces 4 populations de microsphères jouent dans l'analyse cytométrique de l'échantillon les rôles spécifiques suivants : a) Une population de microsphères A (ys A), de diamètre compris entre 0,5 et 1 lIll, préférentiellement 0,8 m, sert à définir la région d'analyse des microparticulcs en terme de taille (paramètres de diffusion lumineuse / scatters ). Préférentiellement, ces microsphères A sont porteuses d'un fluorochrome permettant leur différenciation simple au sein de l'échantillon biologique. b) Une population de microsphères B ( S B), de diamètre compris entre 2 et 10 m, préférentiellement 3 m, et dont le nombre absolu dans le test est parfaitement connu, sert au comptage absolu des microparticules contenues dans l'échantillon. c) Une population de microsphères C (S C), de diamètre compris entre 2 et 10 m et marquée uniquement par le fluorochrome 1, sert à définir sur le paramètre de fluorescence 1 le seuil d'intensité minimum caractérisant les microparticules marquées par les anticorps- fluorochrome 1. d) Une population de microsphères D ( S D), de diamètre identique à C et marquée uniquement par le fluorochrome 2, sert à définir la région d'analyse des événements considérés positifs pour le fluorochrome 2. Préférentiellement, le diamètre des microsphères C et D est choisi différent de celui des billes B pour dissocier de façon simple par les scatters les populations C + D de la population B (par ex. C et D = 5 m et B = 3 m). Mais on peut aussi préférer associer B, C et D à une même taille (par exemple B = C = D = 3 m) et utiliser l'ensemble (B + C + D), homogène en taille, pour les fonctions de comptage et de réglage des fluorescences. Les populations C et D sont représentées dans le mélange dans une proportion relative de 1/3 à 2/3, préférentiellement 1/2. Les caractéristiques de fluorescence des microsphères C et D sont les suivantes : L'intensité de la fluorescence moyenne est comprise entre 3 et 100 fois, préférentiellement 10 à 30 fois l'intensité des microparticules d'un échantillon contrôle négatif traité selon l'invention. L'échantillon contrôle négatif de référence est réalisé à partir d'un pool de plasma humaine normaux, pauvres en plaquettes, filtré sur filtre de 1 m, congelé en aliquots. Un aliquot est marqué avec les rnonoréactifs et dans les conditions du test, en présence d'un excès 10 x molaire de chacun des anticorps constituant les monoréactifs (inhibition du marquage fluorescent). L'intensité de fluorescence moyenne des microsphères C (resp. D) est prise comme référence stable pour établir la position du seuil de positivité des microparticules pour le fluorochrome 1 De même, les microsphères D sont prises comme référence stable pour établir la position du seuil de positivité des microparticules pour le fluorochrome 2. Ces seuils sont définis, lot par lot, pour qu'une majorité (70 % à 99,999 %, préférentiellement 98 %) des microparticules de l'échantillon contrôle négatif de référence, défini ci-dessus, soit située dans la région d'intensité de fluorescences inférieur aux valeurs seuils (figure 1, région Q3). Le coefficient multiplicateur (alpha) reliant l'intensité de fluorescence moyenne de la bille (référence stable) et la valeur d'intensité de fluorescence du seuil correspondant est un paramètre caractéristique de lot. Il permet de positionner chaque seuil de façon reproductible selon la formule : Intensité de fluol du seuil = alpha x MFI S C. Exemple 2 : Illustration du procédé selon l'invention en trois étapes Etape 1 Cette étape consiste à sélectionner les microsphères C et D ( S C+D) correspondant aux valeurs de fluorescence dans la région RI de la figure 1. Les paramètres de fluorescence (PMTv, compensations) et les niveaux seuils (figure 1, SI et S2) sont réglés. Etape 2 : Les fluorescences sont analysées sans conditionnement. Les microsphères A sont sélectionnées sur LFL1 (figure 2, région R4). La région R3 définissant les microparticules endothéliales ( P endoth) qui contient les microsphères A ( S A) est réglée. Etape 3: Les échantillons sont analysés en sélectionnant les microparticules dans la région R3 (figure 3). Un nombre donné de microsphcrcs I3 (ItS B) (région R2) est déterminé et on compte les microparticulcs (région Q2). Exemple 3: Quantification des EMP chez un patient atteint d'un lupus anticoagulant Les cytogrammes présentés aux figures 4,A à 4.H sont une visualisation du test utilisant le monoréactif selon l'invention, suivant les étapes du procédé de l'exemple précédent. Les expériences ont été réalisées en utilisant un anti-CD51 marqué à la PE (Immunotech) et un anti-CD146 marqué au FITC (Biocytex). L'échantillon négatif est un plasma normal citraté. L'échantillon positif est un plasma déplété en plaquettes provenant d'un patient atteint d'un lupus anticoagulant. La lecture cytométique a été réalisée en comptant 20 000 billes étalon interne. Le nombre de microvésicules doublement marquées, localisées dans la région Q2 du cytogramme est déduit du comptage des billes. REVENDICATIONS 1Monoréactif pour la détection et la quantification des microparticules d'origine endothéliale dans un échantillon plasmatique par cytométrie de flux caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'anticorps monoclonaux spécifiques des molécules membranaires des cellules endothéliales, ledit mélange comprenant un anticorps (1) marqué avec un fluorochrome 1 et un anticorps (2) marqué avec un fluorochrome 2, lesdits anticorps (1) et (2) n'ayant pas la même spécificité et un mélange de microsphères comprenant - Une population A de microsphères (étalon) marquée par un fluorochrome servant à définir la région d'analyse des microparticules en terme de taille (paramètres de diffusion lumineuse) et permettant leur différenciation, - une population de microsphères B (étalon) dont le nombre est connu servant au comptage des microparticules, - une population de microsphères C marquée uniquement par le fluorochrome 1, servant à définir sur le paramètre de fluorescence du fluorochrome 1 le seuil d'intensité minimum caractérisant les microparticules marquées par les anticorps- fluorochrome 1, - et une population de microsphères D, de diamètre identique à C, et marquée uniquement par le fluorochrome 2, servant à définir la région d'analyse des événements considérés positifs pour le fluorochrome 2 2 Utilisation d'un monoréactif selon la revendication 1 pour le marquage en double couleur des microparticules endothéliales de telle sorte que la différenciation entre lesdites microparticules et leur équivalent, notamment leur équivalent plaquettaire, est optimisée. 3 Utilisation d'un monoréactif selon la revendication 1 pour la standardisation des seuils de discrimination des microparticules endothéliales des autres particules et débris susceptibles d'êtres responsables d'un bruit de fond. 4 Utilisation d'un monoréactif selon la revendication 1 pour la standardisation du comptage des microparticules endothéliales par rapport aux microsphères étalons. 5. Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les anticorps sont sélectionnés notamment parmi les anti-CD51, anti-CD34, anti-CD9, et anti- CD146, 6 Monoréactif selon la revendication 5 caractérisé en ce que les anticorps sont un anti-CD51 et anti-CDI46. 7. Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que les microsphères A ont un diamètre compris entre 0,5 et 1 m, préférentiellement 0,8 m, et les microsphères B et C ont un diamètre compris entre 2 et 10 m, préférentiellement 3 m 8. Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le diamètre des microsphères C et D est différent de celui des billes B de manière à dissocier de façon simple par les paramètres de diffusion lumineuse les populations C + D de la population B. 9. Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le diamètre des microsphères B, C et D est identique 10 Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que les populations C et D sont présentes dans une proportion relative de 1/3 à 2/3, préférentiellement 1/2 11 Monoréactif selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que les fluorochromes sont choisis notamment parmi la phycoérythrine et le FITC. 12 Trousse de diagnostique comprenant un monoréactif selon l'une des revendications 1 à 11destinée à la détection et à la quantification de microparticules endothéliales dans le plasma humain 13. Trousse de diagnostique selon la revendication 12 comprenant en outre un échantillon contrôle négatif de référence provenant d'un pool de plasmas humains normaux déplétés en plaquettes, ledit échantillon étant sous la forme liquide ou lyophilisé. 14. Procédé de quantification des microparticules endothéliales dans le sang caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Préparation de plasma déplété en plaquettes par centrifugation et microfiltration, b) Incubation du plasma avec un mbnoréactif selon l'une des revendications 1à 10 de sorte à obtenir un marquage en double couleur desdites microparticules, c) Discrimination et comptage des microparticules par cytométrie de flux. 15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le plasma déplété en plaquettes est obtenu par double centrifugation et filtration sur Millipore 1 m. 16. Utilisation d'un monoréactif selon l'une des revendications 1 à 11ou d'une trousse selon l'une des revendications 12 et 13 pour la détection des activités procoagulantes au cours des maladies thrombotiques ou prothrombotiques telles que les lupus anti-coagulants. 17. Utilisation d'un monoréactif selon l'une des revendications 1 à 11ou d'une trousse selon l'une des revendications 12 et 13 pour la détection de lésions vasculaires aiguës ou chroniques.