Brevet FR2786499A1 — publié le 20000602

APPAREIL DE LECTURE AUTOMATIQUE D'UN ANTIBIOGRAMME A CONTRASTE AMÉLIORÉ La présente invention concerne un appareil de lecture automatique d'un antibiogramme. De façon connue, un antibiogramme est réalisé de la façon suivante pour déterminer quels sont les antibiotiques susceptibles de bloquer la multiplication d'un germe. On effectue un prélèvement liquide contenant le germe ou la souche de bactéries à tester, on prépare des boîtes de Petri contenant différents milieux de culture et on ensemence avec le liquide infectieux ; puis on fait incuber et l'on détermine ainsi quels sont les milieux de culture qui ont permis le développement du germe, donc quelle est la famille à laquelle appartiennent les germes du prélèvement, après quoi, pour aller plus loin dans l'identification, on reprend une ou plusieurs colonie (s) que l'on ensemence sur des milieux de culture ou en galerie en vue de trouver l'espèce. Parallèlement à cette identification, on effectue un antibiogramme en ensemençant le germe sur une boite de Petri contenant la gélose adaptée, l'ensemencement se faisant de façon régulière sur toute la surface de la gélose par une quelconque des techniques connues. On positionne alors des pastilles de différents antibiotiques à la surface de la gélose en des points régulièrement espacés, étant entendu qu'on choisit un panel d'antibiotiques dont on sait qu'il est généralement efficace pour les germes de la famille déterminée ; on passe alors la boîte de Petri à l'étuve et on incube pendant 18 heures. Les germes se développent à la surface de la gélose sauf dans les zones où l'antibiotique a bloqué le développement ; de la sorte autour de chaque pastille, il se forme un disque où l'on voit la gélose exempte de germe, c'est-à-dire brillante, alors qu'entre les disques afférents aux différentes pastilles, le développement des germes donne naissance à une surface mate. On relève le diamètre du cercle extérieur du disque afférent à chaque pastille et en déduit par calcul la concentration minimale inhibitrice CMI pour chaque antibiotique (la CMI est la concentration minimale d'antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance d'un germe) : plus le diamètre du cercle est grand, plus l'antibiotique est efficace et, par conséquent, plus la CMI est petite. Si, pour un antibiotique, la CMI est trop élevée, cela veut dire que l'antibiotique est inutilisable ; donc au-dessous d'un certain diamètre D1 du cercle d'inhibition, on sait que l'antibiotique de la pastille est inutilisable pour la lutte contre le germe. Au-dessus d'un certain diamètre D2, il est clair que l'antibiotique est actif in vitro. En revanche, entre les diamètres Dl et D2, il y a une zone d'incertitude. Il existe déjà des appareils destinés à effectuer la lecture automatique des boîtes de Petri permettant la définition des antibiogrammes. Ces boîtes de Petri peuvent tre rondes ou carrées. Dans les équipements actuels, on met en place la boîte de Petri dans une zone que l'on éclaire au moyen d'un tube fluorescent de forme annulaire placé derrière un cylindrique en verre translucide permettant d'avoir un éclairement sensiblement uniforme sur l'ensemble de la boîte de Petri que l'on place au centre dudit cylindre. La difficulté, lorsque l'on effectue une acquisition informatique de l'image de la boîte de Petri, provient du fait qu'il est nécessaire d'avoir des contrastes aussi forts que possible entre le cercle d'inhibition qui entoure la pastille d'antibiotique, d'une part, et 1'environnement autour de ce cercle qui correspond à la zone où le germe s'est développé. L'acquisition de l'image est, de façon connue, faite au moyen d'une caméra électronique matricielle à couplage de charge, dite"CCD", dont le champ d'observation englobe la totalité de la boîte de Petri. Il existe souvent autour du cercle d'inhibition une zone annulaire de transition dont l'aspect est intermédiaire entre celle du cercle d'inhibition et celle de l'environnement où le germe s'est développé librement, et cette zone de transition a un aspect qui varie radialement de façon continue depuis l'un des bords jusqu'à l'autre bord de la zone annulaire de transition. Il est clair que cette circonstance rend particulièrement difficile la détermination informatique, à partir de 1'image captée par la caméra CCD, du diamètre à prendre en considération pour le calcul de la CMI. Mais indépendamment de ce phénomène, une autre circonstance rend parfois particulièrement difficile la lecture de l'image de la boîte de Petri ; cela arrive notamment lorsque la gélose sur laquelle s'est développé le germe est une gélose opaque ou de couleur sombre, par exemple un milieu rouge à base de sang de mouton ou un milieu marron 4 base de sang chauffé, sur laquelle il est très difficile de voir le contraste entre le disque d'inhibition et la zone environnante ; cela arrive notamment pour des supports de gélose contenant du sang. La lecture de l'antibiogramme est également difficile lorsque la pousse du germe sur le milieu de culture est faible, ce qui rend difficile de distinguer les disques d'inhibition du reste de 1'environnement où le germe s'est développé librement. On connaît également par le brevet US n 4 701 850 un appareil de lecture pour antibiogramme comportant une source d'éclairage diffus pour éclairer la surface de la boîte de Petri et un pied à coulisse électronique ou numérique pour mesurer à distance le diamètre des cercles d'inhibition autour des pastilles d'antibiotique. Toutefois, cet appareil ne permet pas une lecture automatique, et présente également les problèmes précités liés au contraste. L'invention a pour but de proposer un appareil de lecture automatique d'un antibiogramme, qui permette d'améliorer les contrastes à la surface d'une boîte de Petri, pour faciliter la lecture par une caméra CCD. A cet effet, l'invention a pour objet un appareil de lecture automatique d'un antibiogramme, ledit appareil comportant un système d'éclairage pour éclairer une boite de Petri contenant des pastilles d'antibiotiques positionnées sur un milieu de culture ensemencé avec un germe, et une caméra électronique CCD pour l'acquisition de l'image de l'antibiogramme, ledit appareil étant de préférence équipé d'une unité de calcul pour déterminer sur ladite image les cercles d'inhibition autour de chaque pastille et calculer ainsi la concentration minimale inhibitrice de chaque pastille d'antibiotique, caractérisé par le fait qu'il est équipé, pour un milieu de culture donné et un germe donné, d'au moins un filtre optique adapté pour que la caméra puisse acquérir l'image de l'antibiogramme dans une plage de longueurs d'onde déterminée, ladite plage étant déterminée de façon à maximiser le rapport Q défini par la formule suivante : Q = Rs (O-Rg (O Rs (X) où Rs (X) est le coefficient en réflexion du milieu de culture sans germe, en fonction de la longueur d'onde X et Rg (X) est le coefficient en réflexion du mme milieu, mais ensemencé avec le germe, en fonction de la longueur k. Pour un milieu de culture du type Mailler Hinton, la plage de longueurs d'onde peut tre comprise entre environ 0,5 et 0,6 hum, et de préférence, inférieure à 0,55 um. En variante, la plage peut tre comprise dans l'infrarouge proche, de préférence, entre 1 et 1,3/mi. Selon une autre caractéristique de l'invention, la plage précitée est déterminée de façon à maximiser à la fois le rapport Q précité et le rapport Q'défini par la formule suivante : Q'= Ts (-Tg) . Ts (X) où Ts (X) est le coefficient en transmission du milieu de culture sans germe en fonction de la longueur d'onde k et Tg (X) est le coefficient en transmission du mme milieu, mais ensemencé avec le germe, en fonction de la longueur d'onde .. Avantageusement, le ou les filtres sont des filtres interférentiels intercalés sur le champ d'observation de la caméra. Dans une forme de réalisation particulière, la caméra est une caméra électronique CCD matricielle ou linéaire. Dans ce cas, le système d'éclairage peut comporter un moyen d'éclairage pour focaliser des rayons lumineux vers la surface de la boîte, les rayons incidents formant un angle oblique par rapport à la surface à éclairer de la boîte, de façon que les rayons réfléchis passent au voisinage de l'objectif de la caméra, sans toutefois y pénétrer. Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, on va en décrire maintenant, à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs, un mode de réalisation représenté sur le dessin annexé. Sur ce dessin : -la figure 1 est une vue schématique partielle et en élévation verticale d'un mode de réalisation particulier de 1'appareil de l'invention ; -la figure 2 est un graphique représentant la courbe de réponse d'un filtre interférentiel passe-bas, en fonction du coefficient en transmission de l'intensité lumineuse et de la longueur d'onde ; -la figure 3A est un graphique représentant les courbes de réponse d'un milieu de culture transparent avec et sans germe, en fonction du coefficient en réflexion de l'intensité lumineuse et du nombre d'onde ; -les figures 3B et 3C sont des graphiques analogues à la figure 3A, mais respectivement pour un milieu de culture additionné de sang et pour un milieu de culture additionné avec un enzyme de pigmentation ; -la figure 4A est un graphique représentant les courbes de réponse d'un milieu de culture transparent avec et sans germe, en fonction du coefficient en transmission de l'intensité lumineuse et du nombre d'onde ; et -la figure 4B est un graphique analogue à la figure 4A, mais pour un milieu de culture additionné d'un enzyme de pigmentation. Sur la figure I, l'appareil de l'invention comporte une caméra électronique CCD linéaire 1 dont le plan d'observation 2 est oblique par rapport à la surface d'une boîte de Petri B. Un filtre 3 est intercalé sur le plan d'observation 2 de la caméra 1. Un moyen d'éclairage constitué d'une barrette rectiligne 4 envoie un pinceau lumineux 5 vers une portion de la boîte B, la ligne moyenne du pinceau lumineux 5 étant oblique par rapport à la surface de la boite. La barrette rectiligne 4 peut tre adaptée pour recevoir un faisceau de fibres optiques dont les extrémités aval sont réparties tout au long de la barrette, de façon à définir une ligne de points lumineux qui envoie un pinceau d'éclairement en forme de dièdre sur la portion de surface à éclairer de la boîte. Des moyens d'entraînement en translation sont prévus pour déplacer la boîte B dans la direction de la double flèche F, afin que la caméra 1 puisse acquérir l'image de la totalité de la surface de la gélose contenue dans le boîte B. En variante, on pourrait remplacer la caméra 1 par une caméra électronique CCD matricielle dont l'axe d'observation est confondu avec l'axe de la boîte B, et la barrette rectiligne 4 pourrait tre remplacée par un anneau circonscrit à la boîte B, en projection axiale, pour éclairer la totalité de la surface de la boîte. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire de déplacer la boîte B, pour acquérir l'image de la totalité de sa surface. Les figures 3 et 4 montrent les résultats de mesures spectrométriques en réflexion et en transmission réalisées à l'aide d'un spectromètre à transformée de Fourier, sur des milieux de culture avec et sans germe. Pour chaque boîte contenant un milieu de culture donné, deux mesures ont été effectuées. une première mesure porte sur un échantillon du milieu de culture sans germe ; une deuxième mesure porte sur un échantillon du milieu de culture où un germe a poussé. La première mesure correspond sensiblement à une mesure qui aurait été effectuée sur une zone d'inhibition autour d'une pastille d'antibiotique. Sur la figure 3A, on a représenté les résultats de deux essais effectués sur un milieu de culture transparent du type Mailler Hinton. Pour le premier essai, la courbe Rsl correspond à la courbe de réponse en réflexion du milieu de culture sans germe, et la courbe Rgl correspond à la courbe de réponse en réflexion sur le mme milieu avec un germe. On constate que la courbe Rsl a un pic dont le coefficient en réflexion R s'élève à environ 16 %, pour un nombre d'onde N compris entre environ 18.500 et 19.000 cm~'. La courbe Rgl a également un pic pour le mme nombre d'onde, mais le coefficient en réflexion R de ce pic est de l'ordre de 3 %. Pour optimiser le contraste en réflexion entre les zones avec germe et les zones sans germe du milieu de culture, ce n'est pas tant la différence entre les deux courbes qui importe, mais le rapport entre la différence des deux courbes et l'une des deux courbes. Pour le deuxième essai, on a également tracé la courbe Rs2 pour la réponse du milieu de culture sans germe et la courbe Rg2 pour la réponse du milieu de culture avec germe. Les pics de ces deux dernières courbes correspondent sensiblement au mme nombre d'onde que les pics des deux premières courbes. On constate également que ces courbes présentent un autre pic au voisinage d'un nombre d'onde de l'ordre de 9.000 cari', ce qui correspond au proche infrarouge. Sur la figure 3B, on a effectué trois essais sur un milieu de culture transparent du type Millier Hinton additionné de sang de mouton, ce qui donne une couleur rouge à la gélose. De la mme manière que pour les essais illustrés sur la figure 3A, les courbes de la figure 3B présentent toutes un pic pour un nombre d'onde compris entre 18.500 et 19.000 cm~', ainsi qu'un autre pic au voisinage de 9.000 crri'. En revanche, le coefficient en réflexion R pour les pics est inférieur, du fait que la gélose est de couleur rouge. Sur la figure 3C, on a effectué un seul essai sur un milieu de culture transparent du type Mailler Hinton pigmenté par un germe de type pseudomonas aeruginosa, qui donne une couleur verte a la gélose. Dans ce cas, la courbe en réflexion Rg du milieu de culture avec germe présente un pic s'élevant à environ 6 % en coefficient de réflexion pour un nombre d'onde compris entre 18.500 et 19.000 cari'. La courbe de réponse Rs du milieu de culture sans germe présente un coefficient de réflexion pratiquement nul, avec un léger pic de l'ordre de 0,3 % pour le mme nombre d'onde. La courbe Rd représente la différence entre la courbe Rg et la courbe Rs. Un autre pic est également présent pour un nombre d'onde compris entre environ 9.000 et 9.500 cari'. On constate sur la figure 3C, que le coefficient en réflexion est inférieur pour une gélose de couleur verte que pour une gélose transparente ou de couleur rouge. Bien que les résultats ne soient pas illustrés, le coefficient en réflexion est encore inférieur pour une gélose "chocolat", c'est-à-dire une gélose transparente additionnée de sang chauffé. Le nombre d'onde N est l'inverse de la longueur d'onde k. Ainsi, la plage des nombres d'onde compris entre 18.500 et 19.000 cmi'correspond à une plage de longueurs d'onde comprise entre environ 526 et 540 nm, et la plage de nombres d'onde comprise entre 9.000 et 9.500 cm~'correspond à la plage de longueurs d'onde comprise entre environ 1.050 et 1. 110 nm. Ainsi, pour le pic situé entre 18.500 et 19.000 crri', on peut utiliser un filtre interférentiel dont la courbe de réponse F est illustrée sur la figure 2. Ce filtre présente un coefficient en transmission T supérieur à 90 % pour une longueur d'onde X inférieure à environ 550 nm. Sur la figure 4A, la courbe Ts représente la réponse en transmission d'un milieu de culture transparent sans germe, alors que la courbe Tg représente la réponse du mme milieu de culture avec germe. On constate sur ce graphique que la différence entre les courbes Ts et Tg augmente pour un nombre d'onde décroissant, entre 30.000 et 18.000 cm~l. Il est important de tenir compte également du coefficient en transmission du milieu de culture, car lorsque l'on place un fond noir sous la boîte contenant la gélose, la lumière est absorbée dans les zones d'inhibition du milieu de culture, pour améliorer le contraste avec les zones où le germe a poussé. Ainsi, pour un nombre d'onde compris entre 18.500 et 19.000 cari', la différence du coefficient en transmission est acceptable. Sur la figure 4B, le mme essai a été effectué pour un milieu de culture transparent pigmenté par un germe de type pseudomonas aeruginosa, ce qui donne une couleur verte à la gélose. La courbe Td représente la différence entre la courbe Ts et la courbe Tg. On constate également que, pour une plage de nombres d'onde compris entre 18.500 et 19.000 cni', la réponse en transmission est acceptable. Toutefois, en pratique, il est nécessaire de trouver un compromis entre la meilleure réponse en réflexion et la meilleure réponse en transmission du milieu de culture. Bien que 1'invention ait été décrite en liaison avec plusieurs variantes de réalisation particulières, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons, si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Appareil de lecture automatique d'un antibiogramme, ledit appareil comportant un système d'éclairage (4) pour éclairer une boite de Petri (B) contenant des pastilles d'antibiotiques positionnées sur un milieu de culture ensemencé avec un germe, et une caméra électronique CCD (1) pour 1'acquisition de l'image de l'antibiogramme, caractérisé par le fait qu'il est équipé, pour un milieu de culture donné et un germe donné, d'au moins un filtre optique (3) adapté pour que la caméra (1) puisse acquérir 1'image de l'antibiogramme dans une plage de longueurs d'onde déterminée, ladite plage étant déterminée de façon à maximiser le rapport Q défini par la formule : Q = Rs (X !-Rg (M Rs (X) où Rs (X) est le coefficient en réflexion du milieu de culture sans germe, en fonction de la longueur d'onde), et Rg (X) est le coefficient en réflexion du mme milieu, mais ensemencé avec le germe, en fonction de la longueur d'onde k. 2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la plage de longueurs d'onde est comprise entre environ 0,5 et 0,6/mi, et de préférence, inférieure à 0,55 item. 3. Appareil selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la plage est comprise dans l'infrarouge proche, de préférence, entre 1 et 1,3 lim. 4. Appareil selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que la plage précitée est déterminée de façon à maximiser à la fois le rapport Q précité et le rapport Q'défini par la formule suivante : Q'= Ts-Tg Ts (X) où Ts (X) est le coefficient en transmission du milieu de culture sans germe en fonction de la longueur d'onde k et Tg (X) est le coefficient en transmission du mme milieu, mais ensemencé avec le germe, en fonction de la longueur d'onde k. 5. Appareil selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le ou les filtres (3) sont des filtres interférentiels intercalés sur le champ d'observation (2) de la caméra (1). 6. Appareil selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la caméra (1) est une caméra électronique CCD matricielle ou linéaire. 7. Appareil selon la revendication 6, caractérisé par fait que le système d'éclairage comporte un moyen d'éclairage (4) pour focaliser des rayons lumineux (5) vers la surface de la boîte (B), les rayons incidents formant un angle oblique par rapport à la surface a éclairer de la boîte, de façon que les rayons réfléchis passent au voisinage de l'objectif de la caméra (1), sans toutefois y pénétrer. 8. Appareil selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'une unité de calcul pour déterminer sur ladite image les cercles d'inhibition autour de chaque pastille et calculer ainsi la concentration minimale inhibitrice de chaque pastille d'antibiotique.