Brevet FR2786201A1 — publié le 20000526

Gènes de biosynthèse et de transfert des 6-désoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et chez Streptomyces antibioticus et leur utilisation. La présente invention décrit des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transfert des 6-désoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine par manipulation génétique. L'érythromycine A est un antibiotique macrolide cliniquement important produit par la bactérie gram-positive Sac. erythraea. Les gènes de la biosynthèse de l'érythromycine sont organisés en un cluster de gènes ery qui inclut aussi le gène d'auto-résistance à l'érythromycine ermE. Le cluster ery contient les trois grands gènes eryAI, eryAII et eryAIII (locus eryA) codant pour trois polypeptides composant la polykétide synthétase (dénommée PKS) flanqués par deux régions comprenant les gènes impliqués dans les stades ultérieurs de conversion du noyau lactone (6-désoxyérythronolide B) en érythromycine A. Pendant le processus de biosynthèse de l'érythromycine A représenté à la figure 1, la biosynthèse des 6-désoxyhexoses comprend l'ensemble des réactions enzymatiques conduisant du glucose-1-phosphate au sucre activé final dTDP-L-mycarose ou dTDP-D-désosamine. Le dTDP-L-mycarose ou la dTDP-D-désosamine ainsi produits sont ensuite utilisés comme substrats pour le transfert des deux désoxyhexoses sur le noyau lactone. La formation de l'érythromycine requiert l'attachement du mycarose via l'hydroxyle en position C-3 du noyau lactone et l'attachement de la désosamine via l'hydroxyle en position C-5. L'ensemble des gènes eryB impliqués dans la biosynthèse ou le transfert du mycarose et l'ensemble des gènes eryC impliqués dans la biosynthèse ou le transfert de la désosamine n'ont pas encore été clairement identifiés. Le cluster ery d'une longueur de 56 kb comprend 21 phases ouvertes de lecture ou "open reading frames" (ORFs) dont la numérotation a été établie par Haydock et al. (1991) et Donadio et al. (1993). Le locus eryA comprend les ORFs 10, 11 et 12. Des travaux précoces d'interruption ou de remplacement de gène dans la partie gauche du cluster ery a permis une première identification du gène eryCI (ORF1) (Dhillon et al., 1989), puis du gène eryBI (ORF2), du locus eryH (ORFs 3,4 et 5) dont l'inactivation conduit à la production de 6-désoxyérythronolide B, d'un locus eryBII (ORFs 7 et 8) et le gène eryCII (Weber et al., 1990). Parmi les activités enzymatiques impliquées dans les modifications ultérieures du noyau lactone ont été identifiées le gène eryF (ORF4) responsable de l'hydroxylation en C6 (Weber et al., 1991) et le gène eryK (ORF20) responsable de l'hydroxylation en C12 (Stassi et al., 1993). D'autre part, le gène eryG (ORF6) responsable de la O-méthylation du mycarose en cladinose (position 3"OH) a été identifié (Weber et al., 1989). L'érythromycine A est ainsi formée via l'érythromycine B ou l'érythromycine C à partir de l'érythromycine D selon le schéma proposé (figure 1). La caractérisation fonctionnelle des gènes eryB et eryC situés sur la partie droite de cluster ery (ORFs 13 à 19) n'a pas encore été établie de façon précise, malgré les informations parcellaires communiquées dans différents articles de revues (Donadio et al., 1993 ; et Thorson, 1994 ; Katz et Donadio, 1995). En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment l'obtention d'analogues de l'érythromycine ayant des propriétés avantageuses, est intensivement recherchée. Les modifications peuvent être désirées dans la partie aglycone (macrolactone) ou/et dans son hydroxylation secondaire ainsi que dans la partie sucre (cladinose et/ou désosamine) de l'érythromycine. Les méthodes courantes telles que les modifications chimiques sont difficiles et limitées vis-à-vis du type de produit que l'on peut obtenir à partir de l'érythromycine. Par exemple, Sakakibara et al. (1984) passent en revue des modifications chimiques réalisées à partir de l'érythromycine A ou B, aussi bien dans la partie sucre que dans la macro- lactone. Des modifications de la macrolactone de l'érythromycine A par manipulation génétique du microorganisme Sac. erythraea ont été décrites dans la demande de brevet internationale WO 93/13663 ainsi que l'obtention de nouvelles molécules polykétides par altérations génétiques spécifiques du locus eryA du chromosome codant pour la PKS. Par exemple la 7-hydroxyérythromycine A, la 6-désoxy-7-hydroxyérythromycine A ou le 3-oxo-3-désoxy-5-désoaminyl-érythronolide A ont été ainsi obtenus. La présente invention concerne la caractérisation fonctionnelle de dix gènes de Sac. erythraea impliqués dans la biosynthèse ou l'attachement du mycarose et de la désosamine (eryBII, eryCIII et eryCII situés en aval du locus eryA et eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVI, eryCIV, eryCV et eryBVII situés en amont), leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine ainsi qu'un procédé de préparation de ceux-ci. La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN simple ou double brin isolée, représentée à la figure 2 (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant : - la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) et codant pour une désosaminyltransférase et - la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase. La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 2 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue par exemple par sous-clonage de fragments de restriction d'un fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin. L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 choisie parmi la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction. L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryCIII représentée à la figure 2 correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) et codant pour une désosaminyltransférase. La séquence eryBII correspondant à l'ORF7 code pour un polypeptide ayant 333 acides aminés (séquence de SEQ ID N 2), la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 code pour un polypeptide ayant 421 acides aminés (séquence de SEQ ID N 5) et la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 code pour un polypeptide ayant 361 acides aminés (séquence de SEQ ID N 3) . La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale. Par séquences qui hybrident et ayant la même fonction, on inclut les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standards de stringence élevée ou moyenne décrites par Sambrook et al. (1989) et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique. Par même fonction enzymatique, on entend une activité enzymatique donnée sur des substrats de même nature, par exemple un dTDP-6-désoxyhexose ou une macrolactone nue ou glycosylée. Les conditions de forte stringence comprennent par exemple une hybridation à 65 C pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE, 10 x Denhardt, 100 g/ml DNAss, 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC, 0,05 % SDS à 65 C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC, 0,1 % SDS à 65 C. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 65 C. Par séquences qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction, on inclut les séquences ayant une identité de séquence nucléotidique d'au moins 60 % avec l'une des séquences ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique. L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF représentée à la figure 2, choisie parmi l'ORF7 (ayant la séquence de SEQ ID N 2), l'ORF8 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) ou l'ORF9 (ayant la séquence de SEQ ID N 3) et les analogues de ce polypeptide. Par analogues, on inclut les peptides ayant une séquence en acides aminés modifiée par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés pour autant que ces produits conservent la même fonction enzymatique. Les séquences modifiées peuvent être par exemple préparées en utilisant la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier. L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORF 8 représentée à la figure 2 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) et ayant une activité désosaminyltransférase, dénommé EryCIII. L'invention décrit une protéine recombinante EryCIII de Sac. erythraea obtenue par expression dans une cellule hôte selon les méthodes connues de génie génétique et de culture cellulaire. L'obtention de la protéine recombinante purifiée a permis de confirmer la caractérisation de la fonction glycosyltranférase associée au produit du gène eryCIII dans un test in vitro qui met en évidence le transfert du sucre activé dTDP-D-désosamine sur le noyau lactone. L'invention a aussi pour objet la thymidine 5'-(trihydrogène diphosphate),P'-[3,4,6-tridésoxy-3-(diméthylamino)D-. xylo.-hexopyranosyl] ester (dTDP-D-désosamine) et les sels d'addition avec les bases, dont un exemple de préparation est décrit plus loin dans la partie expérimentale. L'invention a aussi pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6) correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant : - la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase, - la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) et codant pour une dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase et - la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase. La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 3 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue, par exemple, par sous-clonage de fragments de restriction de cosmides contenant une banque d'ADN génomique de Sac. erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin. L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 choisie parmi la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction. L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryBV représentée à la figure 3 correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase. La séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 code pour un polypeptide ayant 322 acides aminés (SEQ ID N 7), la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 code pour un polypeptide ayant 415 acides aminés (SEQ ID N 8), la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 code pour un polypeptide ayant 237 acides aminés (SEQ ID N 9), la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 code pour un polypeptide ayant 510 acides aminés (SEQ ID N 10), la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 code pour un polypeptide ayant 401 acides aminés (SEQ ID N 14), la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 code pour un polypeptide ayant 489 acides aminés (SEQ ID N 11) et la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 code pour un polypeptide ayant 193 acides aminés (SEQ ID N 12). La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale. Les séquences d'ADN qui hybrident ainsi que les séquences d'ADN qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction ont la même signification que celle indiquée précédemment. L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF représentée à la figure 3, choisie parmi l'ORF13 (ayant la séquence de SEQ ID N 7), l'ORF14 (ayant la séquence de SEQ ID N 8), l'ORF15 (ayant la séquence de SEQ ID N 9), l'ORF16 (ayant la séquence de SEQ ID N 10), l'ORF17 (ayant la séquence de SEQ ID N 14), l'ORF18 (ayant la séquence de SEQ ID N 11) ou l'ORF19 (ayant la séquence de SEQ ID N 12) et les analogues de ce peptide. Les analogues du polypeptide ont la même signification que celle indiquée précédemment. L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORF14 représentée à la figure 3 (ayant la séquence de SEQ ID N 8) et ayant une activité mycarosyltransférase, dénommé EryBV. La connaissance de chaque séquence d'ADN eryB ou eryC de l'invention indiquée ci-dessus et montrée à la figure 2 ou à la figure 3 permet de reproduire la présente invention par exemple par des méthodes connues de synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation ou par amplification par PCR. Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes connues, par exemple par synthèse chimique ou par la méthodologie de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentées à la figure 3, pour synthétiser des métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea. Par métabolites secondaires hybrides, on entend soit des analogues de l'érythromycine, c'est-à-dire des dérivés de l'érythromycine ayant une ou plusieurs modifications portant sur la partie sucre et possédant une activité antibiotique, soit des précurseurs de l'érythromycine tels que le 6désoxyérythronolide B ou l'érythronolide B auxquels sont attachés un ou plusieurs résidus sucre modifiés ou non et ne possédant pas d'activité antibiotique. Le résidu sucre modifié peut être par exemple, le 4-céto-L-mycarose. La synthèse de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea par utilisation de séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peut être réalisée par exemple, par l'inactivation d'un ou plusieurs gènes eryB ou eryC ci-dessus et l'introduction d'un ou plusieurs gènes exogènes ou de leurs dérivés obtenus par exemple par mutagénèse, ayant des séquences nucléotidiques codant pour des enzymes ayant la même fonction chez des souches productrices d'autres macrolides, par exemple la tylosine, la picromycine ou la méthymycine. En particulier, l'introduction de gènes exogènes peut être effectuée par intégration d'une séquence d'ADN obtenue selon la méthodologie du "DNA shuffling" (Stemmer, 1994) ou par la construction d'une séquence d'ADN chimère,par exemple à partir d'une séquence eryB ou eryC de l'invention intervenant dans le transfert d'un résidu sucre, par exemple la séquence eryCIII ou eryBV, et de gènes homologues isolés à partir de souches productrices de macrolides, par exemple Streptomyces fradiae, Streptomyces olivaceus, Streptomyces venezuelae ou Streptomyces antibioticus. L'invention concerne aussi l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentée à la figure 3 ou d'un fragment de cette séquence, comme sondes d'hybridation. Les séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peuvent être utilisées pour constituer des sondes d'hybridation d'au moins 19 nucléotides, permettant d'isoler des gènes homologues dans des souches productrices de macrolides en utilisant les méthodes classiques d'hybridation d'acides nucléiques immobilisées sur des filtres ou d'amplification par PCR, selon les conditions décrites par Sambrook et al. (1989) . L'invention concerne particulièrement l'utilisation de la séquence d'ADN eryCIII représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues responsables de la glycosylation de la macrolactone chez une souche productrice de macrolide. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation ci-dessus, dans laquelle les gènes homologues sont les gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus. L'invention décrit, à titre d'exemple, l'utilisation de la séquence du gène eryCIII comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues dans une souche productrice d'oléandomycine. La sonde eryCIII utilisée a permis d'isoler les gènes oleG1 et oleG2 codant pour des glycosyltransférases chez S. antibioticus impliquées dans le transfert de la désosamine et de l'oléandrose sur le noyau lactone. La caractérisation fonctionnelle des gènes oleG1 et oleG2 a permis de définir l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus. L'invention a donc pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15) correspondant à une région du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine comprenant : - la séquence correspondant à l'ORF oleP1 du nucléotide 184 au nucléotide 1386, - la séquence correspondant à l'ORF oleG1 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleG2 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleM du nucléotide 3992 au nucléotide 4720 (= séquence de SEQ ID N 20) et - la séquence correspondant à l'ORF oleY du nucléotide 4810 au nucléotide 5967. La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15) est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue par exemple à partir d'un cosmide couvrant la partie droite du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine par hybridation avec une sonde eryCIII, selon les conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin. L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 choisie parmi la séquence correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase et la séquence correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité glycosyltransférase. L'invention a tout particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée ci-dessus correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) codant pour une activité désosaminyltransférase, ainsi qu'une séquence d'ADN isolée ci-dessus correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité oléandrosyltransférase. La séquence correspondant à l'ORF oleG1 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 17) et la séquence correspondant à l'ORF oleG2 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 18). La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par altération du gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale. L'invention a aussi pour objet le polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 et ayant une activité désosaminyltransférase (séquence de SEQ ID N 17) et le polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 et ayant une activité oléandrosyltransférase (séquence de SEQ ID N 18). Les polypeptides ci-dessus dénommés respectivement OleGl et OleG2 peuvent être obtenus par les méthodes connues indiquées ci-dessus. L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea dans lequel : - on isole une séquence ADN contenant au moins une séquence eryB ou une séquence eryC du cluster de gènes de la bio- synthèse de l'érythromycine représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1) ou à la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6), - on crée une modification dans la dite séquence et on obtient une séquence altérée, - on intègre la séquence altérée dans le chromosome de la souche hôte et on obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant la formation du métabolite secondaire hybride et - on isole le métabolite secondaire hybride. La modification de la séquence d'ADN peut être réalisée par exemple par une addition et/ou par une délétion de séquences d'ADN d'au moins un nucléotide, dans une séquence eryB ou eryC de l'invention qui code pour l'une des enzymes correspondantes indiquées ci-dessus. L'intégration de la séquence altérée dans la souche hôte peut être réalisée par exemple par la méthodologie de la recombinaison homologue qui peut être effectuée selon le schéma montré à la figure 4 et conduit à la génération de mutants chromosomiques de souches Sac. erythraea que l'on cultive ensuite selon les méthodes générales connues de culture cellulaire. L'invention a particulièrement pour objet le procédé cidessus dans lequel la séquence ADN code pour l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase. L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé ci-dessus dans lequel l'altération de la séquence résulte dans l'inactivation d'au moins l'une des enzymes indiquées ci-dessus. L'inactivation d'au moins 1-lune des enzymes est mise en évidence, d'une part par l'absence de production d'érythromycine, d'autre part par l'accumulation de précurseurs de l'érythromycine tels que le 6-désoxyérythronolide B, l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B et/ou l'accumulation de métabolites secondaires hybrides tels que définis précédemment dans les surnageants de cultures des souches modifiées correspondantes. L'invention concerne tout particulièrement le procédé ci-dessus dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-cétoL-6-désoxyhexose 4-réductase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une mycarosyltransférase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase. L'invention concerne aussi le procédé ci-dessus dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est un analogue de l'érythromycine choisi parmi la 4"-céto-érythromycine, la 4'-hydroxy-érythromycine ou la 3"-C désméthyl-2",3"-ène- érythromycine ou dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est le désosaminyl érythronolide B. Des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention sont donnés dans la partie expérimentale. L'accumulation de métabolites secondaires hybrides dans des souches de Sac. erythraea modifiées est également décrite plus loin. L'invention concerne aussi une souche de Sac. erythraea modifiée dans laquelle au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase est inactivée et produisant au moins un métabolite secondaire hybride. L'invention concerne particulièrement la souche de Sac. erythraea modifiée BII92 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase est inactivée et produisant la 3"-C désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C, la souche de Sac. erythraea modifiée BIV87 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 4-réductase est inactivée et produisant la 4"céto-érythromycine, la souche de Sac. erythraea modifiée CIV89 dans laquelle une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase est inactivée et produisant la 4'-hydroxyérythromycine D ainsi que la souche de Sac. erythraea modifiée BV88 dans laquelle une mycarosyltransférase est inactivée et produisant du désoaminyl érythronolide B. Des constructions détaillées des souches ci-dessus sont données plus loin dans la partie expérimentale. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de précurseurs de l'oléandomycine chez S. antibioticus dans lequel - on crée une altération de la séquence du gène choisie parmi la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) dans le chromosome d'une souche hôte et obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant l'accumulation des précurseurs de l'oléandomycine et - on isole ces précurseurs. L'altération de la séquence d'ADN peut être réalisée par exemple par interruption du gène cible dans la souche S. antibioticus, par exemple par intégration d'un plasmide par la méthodologie de la recombinaison homologue et conduit à la génération de mutants chromosomiques de la souche sauvage. L'invention concerne particulièrement un procédé ci- dessus dans lequel l'altération est créée dans la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et dont il résulte au moins l'élimination de l'activité désoaminyltransférase et l'accumulation du précurseur de l'oléandomycine 8,8a-désoxyoléandolide. L'accumulation d'un précurseur non glycosylé de l'oléandomycine 8,8a-désoxyoléandolide observée par interruption du gène oleG1 est due à un effet polaire transcriptionnel inactivant le gène oleG2. Un exemple de mise en oeuvre du procédé ci-dessus est donné plus loin dans la partie expérimentale. Matériels et méthodes générales. 1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de croissance. La souche Sac. erythraea utilisée pour la réalisation de l'invention est un variant phénotypique spontané dit "red variant" (Hessler et al., 1997) de la souche sauvage Sac. erythraea NRRL 2338 dont la croissance est effectuée en routine soit sur milieu solide R2T2 (milieu R2T décrit par Weber et al., 1985 sans peptone), R2T20 (Yamamoto et al., 1986) ou Ml-102 sur agar (Kaneda et al., 1962), soit en milieu liquide TSB (Oxoid) à 30 C. La souche Streptomyces lividans 1326 (John Innes Culture Collection) décrite par Hopwood et al. (1983), utilisée pour la préparation de plasmides dépourvus d'origine de réplication d'Escherichia coli tels que pIJ702 et pIJ486, a été maintenue sur milieu solide R2YE (R5) et al., 1985). La croissance des souches E. coli XL1-blue (Stratagene), JM110 (Stratagene) et DH5a.MCR (GibcoBRL), utilisées pour les préparations de plasmides, a été effectuée en routine en milieu liquide 2 x YT ou LB ou en milieu solide LB sur agar, tels que décrits par Sambrook et al. (1989). La souche E. coli XL1-blue est utilisée pour les clonages en routine. La souche JM110 est utilisée pour des clonages où l'on utilise des sites de restriction tels que BclI. La souche DH5a.MCR est utilisée pour la préparation de plasmides destinés à être introduits chez Sac. erythraea pour une transformation optimale. La sélection des plasmides dans E. coli a été effectuée sur ampicilline (Sigma) à 100 g/ml. Les souches Bacillus subtilis ATCC 6633 ou Bacillus pumilus ATCC 14884 ont été utilisées comme souches indicatrices pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les plasmides Litmus28, pUC18 et pUC19 (New England Biolabs) ont été utilisés en routine pour les sous-clonages. Le vecteur pIJ702 (Katz et al., 1983) a été obtenu du John Innes Institute. Le vecteur pIJ486 (Ward et al., 1986) a été obtenu de C.J. Thompson (Université de Bâle, Suisse). Le phagmide pTZ18R a été obtenu de Pharmacia Biotech. Le vecteur navette coli-streptomyces pUWL218 (Wehmeier, 1995) utilisé pour l'intégration chromosomique dans Sac. erythraea a été obtenu de W. Piepersberg (Université de Wuppertal, Allemagne). 2. Manipulation de l'ADN et séquençage. Les méthodes générales de biologie moléculaire utilisées sont décrites par Sambrook et al., 1989. Les réactifs d'origine commerciale ont été utilisés incluant les enzymes de restriction (New England Biolabs et Boehringer Mannheim), le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I (Boehringer Mannheim). La trousse "DNA ligation system" (Amersham) a été utilisée pour effectuer les ligations et la trousse Plasmid Midi kit (Quiagen) ou RPM kit (Bio101 Inc. ) pour purifier l'ADN plasmidique. La préparation de l'ADN du bactériophage X a été réalisée selon Ausubel et al. (1995) et l'isolement de l'ADN chromosomique de Sac. erythraea selon Hopwood et al. (1985). La transformation de S. lividans et l'isolement des plasmides ont été effectués selon Hopwood et al. (1985). 3. Préparation de l'érythronolide B et du 3-a-mycarosyl érythronolide B. L'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B ont été purifiés à partir d'extraits de culture du mutant eryCI (clone WHB2221 décrit par Dhillon et al., 1989) par chromatographie sur gel d'aminopropyl (LichroprepNH2 25-40 , Merck) avec un gradient d'élution par des mélanges chlorure de butyle/chlorure de méthylène successifs (100: 0, 80:20, 50 :50 et 20 :80) suivid'un gradient d'élution linéaire par le mélange chlorure de butyle/méthanol variant de 99:1 à 90 :10. Les fractions contenant les produits attendus sont amenées à sec sous vide puis analysées par chromatographie en couche mince (ccm). L'érythronolide B est ensuite cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/hexane puis recristallisé dans l'éthanol. Le 3-a-mycarosyl érythronolide B est cristallisé deux fois dans un mélange acétate d'éthyle/hexane. Milieux cités. 1. R2T2 : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2S04 0,25g ; extrait de levure 6,5 g ; 5,0 g ; 22,0 g ; eau distillée qsp 860 ml. La solution est stéri- lisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 20 ml de glucose à 50 % ; ml de Tris-HCl 1M, pH7,0 ; 5 ml de KH2P04 à 0,5 % ; 2,5 ml de NaOH 1N ; 50 ml de CaCl2 1M ; 50 ml de MgC12,6H20 1M et 2 ml de solution de "trace éléments" (Hopwood et al., 1985). 2. R2T20 : Pour un litre de solution aqueuse : milieu R2T2 contenant 206 g de sucrose. 3. Ml-102 (Kaneda et al., 1962) : Pour 1 litre de solution aqueuse : glucose 5 g ; sucre brun commercial 10 g ; 5 g ; de levure 2,5 g ; Versène 36 mg ; eau courante 1000 ml ; final ajusté à 7,0 à 7,2 avec KOH. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. 4. R2YE (R5) et al., 1985) : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2S04 0,25 g ; MgCl2,6H20 10,12 g ; casaminoacides 0,1 g ; de "trace éléments" 2 ml ; extrait de levure 5 g ; TES 5,72 g ; bactoagar 15 g ; eau distillée qsp 940 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 10 ml de KH2P04 0,5 % ; ml de CaCl2 1M ; 15 ml de L-proline à 20 % ; 20 ml de glucose à 50 % et 1 ml de CuCl2 10mM. 5.2 x TY : Pour 1 litre de solution aqueuse : tryptone 10 g ; de levure 10 g ; NaCl 5 g. 6. Tampon PT : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 100 g ; K2S04 0,25 g ; MgCl26H20 5,1 g ; de "trace éléments" 2 ml ; distillée qsp 875 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 5 ml de CaCl2 et 20 ml de TES 5,3 %. 7. Sucrose-succinate (Caffrey et al., 1992) : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 0,2 M ; succinique 20 mM ; phosphate de potassium 20 mM (pH 6,6) ; sulfate de magnésium 5 mM ; de potassium 100 mM ; solution de "trace éléments" 2 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention. La figure 1 représente la voie de biosynthèse de l'érythromycine A. La figure 2 représente la séquence nucléotidique (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine comprenant les ORFs 7,8 et 9 et leurs séquences protéiques déduites. La figure 3 représente la séquence nucléotidique (séquence de SEQ ID N 6) de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine comprenant les ORFs 13 à 19 et leurs séquences protéiques déduites. La figure 4 représente le schéma de substitution de gène par recombinaison homologue. La figure 5A représente l'organisation de la partie gauche du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythromy- cine chez Sac. erythraea dont les ORFs 1 à 9 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pK62, pBCKl, pKB22, pBK44, pBIISB, pEco2 et pK23, générés à partir du clone génomique XSE5.5. (Abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Bc, BclI ; Bg, BglII ; E, EcoRI ; K, KpnI ; M, MluI ; P, PstI ; S, SacI ; Sa, SalI.) La figure 5B représente l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythromycine chez Sac. erythraea dont les ORFs 13 à 21 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pBK6-12, pCN9, pNC028, pNB49, pNC062, pPSP4, pNC062X et pBAB18. (Abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Ba, BalI ; Bc, BclI ; C, ClaI ; E, EcoRI ; K, KpnI ; N, NcoI ; Ns, NsiI ; P, PstI ; Pv, PvuII ; S, SacI ; Sc, ScaI ; Sh, SphI ; Sp, SpeI ; X, XbaI ; Xh, XhoI). La figure 6A représente le schéma de construction du plasmide pBIlA. La figure 6B représente une carte de restriction du plasmide pUWL218. La figure 6C représente une carte de restriction du plasmide pBIlA. La figure 7A représente le schéma de construction du plasmide pdel88. La figure 7B représente le schéma de construction du plasmide pdel88A. La figure 7C représente le schéma de construction du plasmide pOBB. La figure 7D représente le schéma de construction et une carte de restriction du plasmide pCIII#. La figure 8A représente le schéma de construction du plasmide pCII. La figure 8B représente une carte de restriction du plasmide pORT1. La figure 8C représente une carte de restriction du plasmide pCII. La figure 9A représente le schéma de construction du plasmide pBIVA. La figure 9B représente une carte de restriction du plasmide pBIVA. La figure 10A représente le schéma de construction du plasmide pBV#. La figure 10B représente une carte de restriction du plasmide pBVA. La figure 11A représente le schéma de construction du plasmide pPSTI. La figure 11B représente une carte de restriction du plasmide pPSTI. La figure 12A représente le schéma de construction du plasmide pXhoI. La figure 12B représente une carte de restriction du plasmide pXhoI. La figure 13A représente le schéma de construction du plasmide pCIVA. La figure 13B représente une carte de restriction du plasmide pCIVA. La figure 14A représente le schéma de construction du plasmide pCVA. La figure 14B représente une carte de restriction du plasmide pCVA. La figure 15 représente l'analyse par Southern blot des souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée Wt. Pour chaque mutant, l'enzyme de restriction utilisée est indiquée en-dessous de chaque blot et la taille des bandes détectées devant chaque blot est estimée par rapport aux marqueurs de poids moléculaire #-HindIII et X-BstEII (non détectables par auto-radiographie). La figure 16 représente l'analyse par PCR des souches mutantes BII91, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée Wt et aux plasmides pBII#, pCIUA, pCII#, pBIVA, pBVA, PCIVA et pCVA utilisés respectivement pour obtenir le mutant par recombinaison homologue. Les tailles des bandes détectées par coloration au bromure d'éthydium sont estimées par rapport aux marqueurs de poids moléculaire X174-HaeIII ou X-BstEII. La figure 17 représente l'analyse par CCM des métabolites produits par les souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement aux produits standards érythromycine A (Er A), érythronolide B (EB) et 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB). La figure 18 représente l'analyse par SDS-PAGE de la purification de la protéine EryCIII successivement après extraction à l'urée 7M (ligne 2), chromatographie Q Sépharose (ligne 3), chromatographie Superdex (ligne 4), chromatographie Q source (ligne 6) avec des marqueurs standard de poids moléculaire (lignes 1 et 5); La figure 19 représente l'analyse par CMM du test d'activité biologique de la protéine EryCIII, par incubation avec d-TDP-D-désosamine (ligne 2) ou avec d-TDP-D-désosamine et 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB) (ligne 3) comparativement au contrôle MEB (ligne 1) et au contrôle érythromycine A (ligne 4). Les pointillés marquent les zones montrant une activité antibiotique par autobiogramme sur B. pumilus. La figure 20 représente la localisation des six cosmides (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67, cosAB63 et cosAB61) couvrant l'ensemble du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine. Les fragments de restriction BamHI (noté B) hybridant avec les sondes notées str M, D, E et les fragments BamHI (3,5 kb et 2,7 kb) hybridant avec la sonde eryCIII sont montrés. La figure 21 représente l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandromycine chez S. antibioticus dont les différentes ORFs (notées olePl, oleGl, oleG2, oleM, oleY, oleP et oleB) sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction du plasmide pC035-S et l'insert du plasmide pC03 généré à partir du pC035-S. La double flèche indique l'insert correspondant à la séquence de la figure 22 (abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Bg, BglII ; K, KpnI ; S, SacI ; Sh, SphI ; l'étoile indique qu'il ne s'agit pas d'un site unique). La figure 22 représente la séquence nucléotidique (séquence de SEQ ID N 15) de la région couvrant les gènes olePl, oleGl, oleG2, oleM et oleY de la biosynthèse de l'oléandomycine et leurs séquences protéiques déduites. EXEMPLE 1 : clonage et séquençage de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine. Un fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea NRRL 2338 ayant > 20 kb en aval du gène ermE couvrant notamment les ORFs 3 à 9 et correspondant au clone XSE5.5 ainsi que la séquence nucléotidique d'un fragment de 4,5 kb correspondant à la région du cluster ery comprise entre 3,7 kb et 8,0 kb à partir de l'extrémité 3' du gène ermE et comprenant les ORFs 3,4, 5 et 6 ont été décrits par Haydock et al. (1991). En tenant compte de la carte de restriction montrée par Haydock et al. (1991), des sous-clones ont été dérivés du clone XSE5.5 par sous-clonage de fragments de restriction dans pUC19. Les plasmides pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ont été ainsi générés selon la figure 5A de la façon suivante : A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI, les plasmides pK62 et pK66 ont été directement construits par sous-clonage du fragment KpnI de 5,8 kb dans pUC19, le plasmide pK66 correspondant au même fragment KpnI sous-cloné avec une orientation inversée de l'insert par rapport au vecteur. Le plasmide pKB22 contenant un insert de 2,9 kb a été ensuite dérivé du plasmide pK66 par excision du fragment BamHI-BglII (2,9 kb) couvrant l'ORF8 ainsi qu'une partie des ORFs 7 et 9 par digestion avec les enzymes de restriction BamHI et BglII. De la même façon, le plasmide pKB44 contenant un insert de 2,9 kb a été obtenu à partir du plasmide pK62 par excision du fragment BamHI-BgIII (2,9 kb) couvrant le gène eryG correspondant aux ORFs 5 et 6 et le gène eryF correspondant à l'ORF4. Le plasmide pBIISB a été dérivé du plasmide pBK44 par sous-clonage dans pUC19 du fragment Sali de 600 pb obtenu à partir du plasmide pBK44 digéré par l'enzyme de restriction SalI (figure 5A) . A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, le plasmide pEco2 a été directement construit par sous-clonage du fragment EcoRI (2,2 kb) dans pUC19. Les sous-clones pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ainsi obtenus ont été ensuite séquences. L'analyse a été faite sur des échantillons d'ADN plasmidique, préalablement purifié sur une colonne de Quiagen 100 (Quiagen), sur le séquenceur automatique ABI prism 377. Les réactions de séquençage ont été réalisées par la méthode de Sanger (1977) en utilisant les amorces M13 conventionnelles ou des amorces synthétiques et des didésoxynucléosides triphosphate fluorescents et la polymérase Taq FS (Perkin Elmer) en présence de 5 % de diméthylsulfoxide, les amorces synthétiques utilisées ayant les séquences suivantes : C3R2 TCCTCGATGGAGACCTGCC (SEQ ID N 22) B2R1 GAGACCATGCCCAGGGAGT (SEQ ID N 23) C3S2 TCTGGGAGCCGCTCACCTT (SEQ ID N 24) C2R1 GACGAGGCCGAAGAGGTGG (SEQ ID N 25) C2S GCACACCGGAATGGATGCG (SEQ ID N 26) fullC3S CCGTCGAGCTCTGAGGTAA (SEQ ID N 27) fullC3R GCCCGAGCCGCACGTGCGT (SEQ ID N 28) et C4 TGCACGCGCTGCTGCCGACC (SEQ ID N 29). L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel AutoassemblerTM pakage (Applied Biosystem). Les séquences ont été analysées en utilisant l'ensemble des logiciels GCG (Devereux 1984). Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 3412 bp de la figure 2 (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) dans laquelle trois ORFs (7,8 et 9) ont été identifiées respectivement du nucléotide 8957 au nucléotide 7959, du nucléotide 10219 au nucléotide 8957 et du nucléotide 11315 au nucléotide 10233 (numérotés dans la figure 2 à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) (respectivement séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046, du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 et du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et correspondant respectivement aux gènes eryBII, eryCIII et eryCII selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les trois ORFs 7,8 et 9 ont la même orientation, la lecture se faisant à partir de la région 3' du gène eryAIII. Des échantillons de E. coli XL1-blue contenant la région codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 : - le plasmide pK62 comprenant la séquence codante pour l'ORF7, l'ORF8 et une partie de l'ORF9 sous le numéro 1-1897, - le plasmide pEco2 comprenant la séquence codante pour l'ORF9 et une partie de l'ORF8 sous le numéro 1-1899. EXEMPLE 2 : construction du plasmide pBII#. Un plasmide d'intégration, dénommé pBII# et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF7, a été construit selon le schéma de la figure 6A. Le fragment BclI-BamHI de 598 pb a été délété dans le plasmide pK62 obtenu à l'exemple 1 par digestion avec les enzymes Bell et BamHI. Le plasmide pBCKl résultant a été ensuite digéré avec les enzymes de restriction MluI et BglII de façon à déléter un fragment ayant 853 pb à l'intérieur de l'ORF7 du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 de la séquence de la figure 2. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, le plasmide contenant la délétion , a été religaturé et transformé dans E. coli XL1-blue. A partir du plasmide pl9BII ainsi généré, le fragment KpnI-HindIII (4,3 kb) qui porte la délétion a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 (figure 6B). La présence de la délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 dans le plasmide pBII# ainsi généré (figure 6C) a été confirmée par séquençage. Le plasmide pBII# a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 3 : construction d'une souche Sac. erythraea ery BII# (BII92). La construction d'une souche Sac. erythraea dans laquelle le gène eryBII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBII# préparé à l'exemple 2 et le processus d'intégration ont été réalisés de la façon suivante : La préparation des protoplastes a été réalisée selon la méthode décrite par Weber et Losick (1988), en utilisant du PEG 3350 (Sigma) au lieu de PEG 1000 et un tampon P modifié (dénommé PT) contenant MgCl2,6H20 28 mM et sans P04H2K au lieu des tampons P, L ou T décrits, selon les conditions opératoires suivantes : Les cellules (au moins 108 spores) de Sac. erythraea "red variant" (dont un échantillon a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1902) ont été mises à pousser dans 50 ml de milieu TBS pendant 3 à 5 jours à 30 C, puis lavées dans du sucrose à 10,3 %. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 ml de tampon PT contenant 2 à 5 mg/ml de lysozyme (Sigma), puis incubées à 30 C pendant 1 à 2 heures en désagrégeant les amas de mycélium toutes les 15 minutes jusqu'à conversion d'au moins 50 % du mycélium en protoplastes. Les protoplastes ont été lavés avec 50 ml de tampon PT, remis en suspension dans 12,5 à 25 ml du même tampon, congelés lentement puis stockés à -80 C par aliquots de 200 l. Pour la transformation, un aliquot a été décongelé et 50 l ont été prélevés puis transférés dans un tube de 15 ml. Un à 10 g d'ADN plasmidique pBII#, préparé à l'exemple 2 à partir de la souche E. coli DH5aMRC ont été mis en solution dans 5 à 10 l de tampon TE (Tris HC1 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) puis déposés sur la paroi du tube incliné auquel a été ensuite ajouté 0,5 ml d'une solution de PEG 3350 dans le tampon PT préparée extemporanément à partir d'une solution aqueuse à 50 % que l'on dilue au demi dans le tampon 2 x PT. Après dilution avec 3 à 5 ml de tampon PT puis centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn, le culot a été dissocié dans 0,5 ml de tampon PT et la suspension de protoplastes transformés ainsi obtenue a été immédiatement répartie sur 2 ou 3 boîtes R2T2 très sèches (3 h sous une hotte à flux laminaire). Les boîtes ont été ensuite incubées à 32 C pendant 16 à 24 h jusqu'à apparition du voile de régénération des protoplastes. A partir d'une solution stock de thiostrepton (Sigma) à 50 mg/ml dans le DMSO, une quantité appropriée a été diluée dans 0,5 à 1 ml d'eau puis étalée sur les boîtes de façon à obtenir une concentration finale de 20 g de thiostrepton/ml de gélose. Après absorption complète de l'antibiotique, les boîtes ont été incubées à 32 C pendant 3 à 4 jours, ce qui permet la visualisation des transformants. Les boites ont encore été incubées plusieurs jours jusqu'à développement complet des spores. La sélection des intégrants correspondant au premier événement de recombinaison (figure 4) a été réalisée par réplication des boites sporulées à l'aide de velours ou par étalement d'une suspension des spores sur des boites R2T2 contenant du thiostrepton puis incubation à 32 C, ce qui permet la croissance des clones d'intégrants potentiels. Pour la sélection de clones ayant subi un deuxième événement de recombinaison (figure 4), 5 à 10 clones résistants au thiostrepton obtenus ci-dessus ont été mis en culture dans 8 ml de milieu liquide TSB à 30 C pendant 3 à 4 jours. 50 à 100 l ont été prélevés et remis en culture dans les mêmes conditions. Après 4 cycles successifs de dilution et culture destinés à favoriser la perte du marqueur de résistance au thiostrepton, des protoplastes ont été préparées à partir des cellules comme indiqué ci-dessus, de façon à chasser le plasmide. Les protoplastes ont ensuite été étalés sur des boites R2T2 de façon à obtenir des colonies individualisées dont la sensibilité au thiostrepton a été déterminée par réplique sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton. Selon la position du deuxième événement de recombinaison par rapport au site de délétion (figure 4), on peut attendre que le phénotype des colonies sensibles au thiostrepton soit du type sauvage ou du type muté porteur de la délétion. Parmi les colonies sensibles au thiostrepton, la sélection des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée par antibiogramme sur la souche B. pumilus ATCC 14884 sensible à l'érythromycine. La souche B. pumilus a été utilisée comme souche indicatrice pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les colonies ont été étalées à l'anse de platine sur des boites R2T2, puis incubées pendant 3 à 4 jours à 30 C. Des zones d'agar où le mutant a poussé à confluence ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boites A-Merck recouvertes d'une surcouche de 4 ml de 0,5 x A Merck (Antibiotic agar N 1 Merck) inoculée d'une suspension de spores de B. pumilus, puis incubées une nuit à 37 C. La présence de la délétion attendue dans le chromosome du mutant (délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 de la figure 2) a ensuite été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR de la façon suivante : Pour l'analyse par Southern blot, le transfert d'ADN génomique, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction appropriée, sur des membranes GeenscreenPlus (Dupont NEN) a été réalisé dans NaOH 0,4 M selon Ausubel et al. (1995). Les hybridations ont été effectuées en utilisant comme sonde l'oligonucléotide marqué à son extrémité 5' en utilisant du [[gamma]32P]ATP (Amersham) et la polynucléotide kinase (Boehringer Mannheim) selon Sambroock et al. (1989), ayant la séquence suivante : B2-S TTGGCGAAGTCGACCAGGTC (SEQ ID N 30) correspondant à la région d'ADN du début du gène eryG située de la position 4118 à la position 4137 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X60379 et décrite par Haydock et al. (1991). Les hybridations ont été effectuées avec un tampon d'hybridation rapide (Amersham) et les conditions de lavage suivantes : 2 x 5 mn, 2 x SSC, 20 C ; 30 mn, 2 x SSC, 65 C ; 30 mn, 0,1 x SSC, 20 C. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique isolé selon Hopwood et al. (1985) puis digéré par l'enzyme de restriction KpnI, une bande de 5,8 kb à partir de la souche sauvage "red variant" et une bande de 4,9 kb à partir du mutant BII92 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 900 pb dans cette région du chromosome. Pour l'analyse par PCR ,un échantillon de 100 /il d'une culture de 3 jours en milieu TSB a été centrifugé. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 10 /il de milieu TSB, puis utilisé pour l'amplification dans l'appareil genAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer Cetus). Après chauffage de l'échantillon pendant 3 mn à 94 C, les conditions d'amplification suivantes ont été utilisées : 94 C, 1 mn ; 55 C, 1 mn ; 72 C, 3 mn ; 30 cycles ; polymérase Ampli Taq (Perkin Elmer) en présence de diméthylsufoxyde 10 % (v/v) suivis d'une élongation de 3 mn à 72 C . L'amplification a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide B2S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B2-R GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA (SEQ ID N 31) correspondant à la séquence du brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 8873 à la position 8892 de la séquence de la figure 2 à laquelle ont été ajoutés trois nucléotides à l'extrêmité 5' et permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF7. L'analyse par amplification par PCR sur des cellules entières a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande de 0,16 kb dans le mutant BII92 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBII. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBII (853 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BII92, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 4 : fermentation de la souche BII92 et identification des métabolites secondaires produits. Des extraits de bouillon de culture de la souche ont été analysés par chromatographie en couche mince (ccm) avec l'érythromycine A, l'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B comme standards. La souche BII92 a été cultivée en erlen de 50 ml dans les conditions permettant une production optimale d'érythromycine A et de ses dérivés qui consistent à effectuer une préculture cellulaire à 28 C pendant 48 heures dans le milieu EPI (Solulys L-Corn steep liquor (Roquette frères) 5 g/1 ; farine de soja déshuilée (Cargill) 10 g/1 ; C03Ca 2 g/1 ; ClNa 5 g/1 ; pH = 6,8 ; glucose qsp 15 g/1 ajouté après autoclavage), puis une culture pendant 72 heures après dilution à 7 % v/v avec le milieu EP2 (farine de soja déshuilée 10 g/1 ; C03Ca 0,2 g/1 ; Cl2Co-6H20 1 mg/1 ; pH = 6,8-7 ; glucose qsp 20 g/1 ajouté après autoclavage). Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9-10 avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques ont été séchées sur S04Mg, amenées à sec sous pression réduite puis analysées par ccm sur gel de silice 60 F254 (Merck) [dichlorométhane/méthanol (90: 10, v/v) ou éther isopropylique/méthanol/NH40H à 25 % (75: 35:2, v/v) ]. De façon alternative, l'analyse a été réalisée par ccm sur des plaques de gel de silice greffées de type NH2 F254 (Merk) [chlorure de butyle/méthanol (90: 10, v/v) ]. La révélation chimique des plaques a été effectuée par pulvérisation d'une solution de p-anisaldéhyde-acide sulfurique 98 %-éthanol (1: 1:9, v/v), suivie de chauffage pendant quelques minutes à 80 C. Les activités antibiotiques potentielles ont été analysées par bioautographie directe des plaques de ccm sur agar ensemencé de B. pumilus ATCC 14884. Les résultats obtenus par révélation chimique (figure 17) montrent que la souche BII92 accumule préférentiellement l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB. Des métabolites mineurs de faible mobilité manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits à l'acétate d'éthyle et identifiés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) couplée à la spectrométrie de masse. La RP-HPLC a été effectuée sur colonne (250 x 4,6mm) de Kromasil C18 5 en utilisant comme phase mobile le mélange acétonitrile/méthanol/acétate d'ammonium 0,065 M pH 6,7 (350: 150:500, v/v) sur un chromatographe Waters équipé d'un spectromètre de masse Finningan TSQ 7000. A côté de traces d'érythromycine A, B, C et D, 4 métabolites mineurs dénommés Ml à M4 ont été détectés : - Ml donne un pic parent à m/z 704 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminyl- érythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 30 comparée à l'érythromycine A (m/z 734) ou de 16 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour Ml est la 3"-C désméthyl- 2",3"-ène-érythromycine C. - M2 donne un pic parent à m/z 706 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminyl- érythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine A (m/z 734) ou de 14 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M2 est la 3"-C désméthyl- érythromycine C. - M3 donne un pic parent à m/z 690 et des produits de fragmentation à m/z 560 et m/z 158. La présence de désaminyl- érythronolide B (m/z 560) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine B (m/z 718) ou de 14 comparée à l'érythromycine D (m/z 704) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M3 est la 3"-C désméthyl- érythromycine D. - M4 donne un pic parent à m/z 720 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. Le profil est identique à celui de l'érythromycine C (m/z 720) avec la présence de désosaminylérythronolide A (m/z 576) et la perte du résidu sucre aminé (m/z 158), mais le métabolite M4 n'a pas le même temps de rétention en RP-HPLC que l'érythromycine. La structure proposée pour M4 est la 3"-C désméthyl- érythromycine A. La détection par SM-SM du métabolite mineur Ml ayant un sucre neutre insaturé (3"-C désmêthyl-2",3"-ène-érythromycine C) indique que le gène eryBII code pour la dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose. La souche BII92 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1903. EXEMPLE 5 : construction du plasmide pCIII#. L'ORF8 pouvant être traductionnellement couplée à l'ORF7 située en aval, une délétion en phase a été introduite de façon à éviter un effet polaire. Un plasmide d'intégration, dénommé pCIII# porteur d'une telle délétion, a été construit selon le schéma de la figure 7(A-D). Une délétion SalI de 663 pb a été introduite dans l'ORF8 du nucléotide 9384 au nucléotide 10046 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant dans le plasmide pUC19 les deux fragments SalI (a : 794 pb et b : 631 pb montrés à la figure 5A ) isolés à partir du plasmide pBK44 obtenu à l'exemple 1 pour générer le plasmide pdel88 (figure 7A). La présence de la délétion de 663 pb a été confirmée par séquençage. Le plasmide pdel88 a été ensuite soumis à deux sous-clonages additionnels de façon à élargir les régions chromosomiques utilisables pour la recombinaison homologue des deux cotés du site de délétion. Le fragment SacI (450 pb) du plasmide pdel88 a d'abord été remplacé par le fragment SacI (1,1 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 pour générer le plasmide pdel88A (figure 7B). Puis le fragment EcoRI (1,5 kb) portant la délétion dans l'ORF8 a été isolé du plasmide pdel88A et utilisé pour remplacer le fragment EcoRI (1,66 kb) porteur de l'ORF intacte dans le plasmide pOBB. Le plasmide pOBB, représenté à la figure 7C, correspond au plasmide pBK44 préparé à l'exemple 1 dans le site PstI duquel a été souscloné le fragment PstI de 4 kb du plasmide pIJ486 obtenu par digestion par l'enzyme de restriction PstI et porteur de l'origine de réplication streptomyces ainsi que du gène de résistance au thiostrepton. Le plasmide résultant pCIIIA porte des régions chromosomiques pour la recombinaison homologue de 1,27 kb et 1,38 kb respectivement en amont et en aval du site de délétion. Le plasmide pCIII ainsi obtenu (figure 7D) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 6 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIII# (CIII68) . Une souche dans laquelle le gène eryCIII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCIIIA obtenu à l'exemple 5 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIIIA. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 663 pb du nucléotide 9384 au nucléotide 10046 de la séquence de la figure 2) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par amplification par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C3-S ATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID N 32) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 10196 à la position 10219 de la séquence de la figure 2, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,5 kb à partir du mutant CIII68 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide C3-S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C3-R TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID N 33) correspondant à la séquence située de la position 8954 à la position 8974 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF8. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,2 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 0,6 kb dans le mutant CIII68 de façon identique au signal obtenu avec pCIII. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 700 pb détectée par l'analyse de Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIII (663 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIII68, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 7 : fermentation de la souche CIII68 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche CIII68 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CII68 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC. La séquence eryCIII présente une forte homologie avec d'autres glycosyltransférases putatives telles que DauH (43 % d'identité au niveau protéique) et DnrS (47 % d'identité) impliquées dans la biosynthèse de la daunorubicine chez S. peucetius (Otten et al., 1995) et chez Streptomyces sp C5 (Dickens et al., 1996) ainsi que TylM2 (50 % d'identité) impliquée dans le transfert du mycaminose sur la tylactone dans la voie de biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (Gandecha et al., 1997). Ces observations indiquent que gène eryCIII code pour la désosaminyltransférase dans la voie de biosynthèse de l'érythromycine. EXEMPLE 8 : construction du plasmide pCII# . Un plasmide d'intégration, dénommé pCII et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF9, a été construit selon le schéma de la figure 8A. Le plasmide pK23 (figure 5A) a été obtenu par sousclonage dans pUC19 du fragment KpnI de 10 kb isolé à partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI. Dans un premier temps, le vecteur navette pORTl, montré à la figure 8B, a été obtenu par sous-clonage du fragment PstI de 4kb isolé par digestion du plasmide pIJ486 avec l'enzyme de restriction PstI incluant le gène de résistance au thiostrepton et le réplicon Streptomyces, dans le site PstI de pUC19. Une délétion hors phase de 304 pb a été introduite dans l'ORF9 du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant le fragment SacI-KpnI (1,1 kb) du plasmide pK23 avec le fragment EcoRI-KpnI (1,7 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 dans le plasmide pORTl ci-dessus préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pCII ainsi obtenu (figure 8C) a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 9 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIlA (CII62). Une souche dans laquelle le gène eryCII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCII# obtenu à l'exemple 8 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythràea avec le plasmide pCIIA. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype eryont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 304 bp du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide C3-S ayant la séquence ci-dessus, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,8 kb à partir du mutant CII62 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 400 pb dans cette région du chromosome. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C2-S GGAATTCATGACCACGACCGATC (SEQ ID N 34) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN de la fin du gène eryAIII située de la position 20258 à la position 20280 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X62569 et décrite par Bevitt et al., 1992 et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C2-R CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC (SEQ ID N 35) correspondant à la séquence située de la position 10558 à la position 10585 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF9. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 760 pb dans la souche sauvage et une bande d'environ 460 pb dans le mutant CII62 de façon identique au signal obtenu avec pCIIA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 400 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCII# (304 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CII62, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 10 : fermentation de la souche CII62 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche CII62 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CII62 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC. La séquence eryCII présente une forte homologie avec des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse de la daunosamine (DnrQ, 38 % d'identité au niveau protéique, Otten et al., 1995) et du mycaminose (protéine codée par l'ORF1*, 40 % d'identité au niveau protéique, Gandecha et al., 1997) qui ont également besoin de transférer un groupement céto en position 3 à partir d'un carbone adjacent. Ces observations indiquent que le gène eryCII code pour la dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase dans la voie de biosynthèse de la dTDP-désosamine. EXEMPLE 11 : clonage et séquençage de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine. Des cosmides contenant la région eryAI-eryK du cluster de gènes ery tel que le cosmide Cos6B, ont été isolés par screening d'une banque d'ADN génomique de Sac. erythraea dans le vecteur cosmidique pWE15 (Stratagene) en utilisant comme sonde un fragment d'ADN de 13,2 kb comprenant la totalité du gène eryAI et correspondant à la région d'ADN comprise entre le site NcoI situé à la position 44382 de la séquence de la figure 3 et le site NcoI situé à la position 392 de la séquence X62569 (Bevitt et al., 1992). La sonde a été préparée de la façon suivante : Dans un premier temps, le fragment NcoI de 13,2 kb a été isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992 et sous-cloné dans le site SmaI de pUC18 après remplissage des extrémités NcoI avec le fragment de Klenow. A partir du plasmide pNC012 ainsi généré, le fragment de 13,2 kb a été isolé par digestion avec l'enzyme de restriction NcoI. Le cosmide cos6B ainsi obtenu a été digéré par l'enzyme de restriction NcoI et les fragments résultants de 2,8 kb et 6,1 kb ont été clones dans le site NcoI du vecteur Litmus28 générant respectivement les plasmides pNC028 et pNC062 montrés à la figure 5B. Le plasmide pNC028 a été séquence par génération de sous-clones en utilisant l'exonucléase III selon le protocole du fournisseur de la trousse Erase-a-Base Kit (Promega) en digérant par les enzymes de restriction respectivement SacI/XbaI et NsiI/BamHI pour la direction inverse. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes 644 GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG (SEQ ID N 36) 645 GAACTCGGTGGAGTCGATGTC (SEQ ID N 37) et 650 GTTGTCGATCAAGACCCGCAC (SEQ ID N 38) Pour le séquençage du plasmide pNC062, des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al. (1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes : 646 CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT (SEQ ID N 39) 647 TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT (SEQ ID N 40) 648 GCTACGCCCTGGAGAGCCTG (SEQ ID N 41) 649 GTCGCGGTCGGAGAGCACGAC (SEQ ID N 42) et 874 GCCAGCTCGGCGACGTCCATC (SEQ ID N 43). Les jonctions NcoI ont été séquencées en utilisant comme matrice l'ADN du cosmide cos6B obtenu ci-dessus dont les régions recouvrant les sites NcoI ont été séquencées en utilisant les amorces ayant les séquences 644 et 645 indiquées ci-dessus. De plus, un fragment ClaI-NcoI de 0,9 kb, contenant le début de la séquence du gène eryAI et la partie 5' de l'ORF13, a été cloné dans pUC18. Ce fragment a été préparé de la façon suivante : Le plasmide pBK6-12 représenté à la figure 5B a d'abord été généré par sous-clonage dans le phagmide pTZ18R du fragment KpnI de 4,5 kb isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992. Le sous-clone pCN9 a ensuite été généré par sous-clonage du fragment ClaINcoI de 0,9 kb isolé à partir du plasmide pBK6-12 dans le site SmaI de pUC19, après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow. Le plasmide pCN9 ainsi obtenu (figure 5B) a été séquence. Des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al. (1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorce l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : 875 CGACGAGGTCGTGCATCAG (SEQ ID N 44). Le séquençage de l'ADN est réalisé par la méthode de Sanger (1977) en utilisant un séquenceur automatisé sur les matrices d'ADN double brin avec le séquenceur Applied Biosystem 373 A. L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel SAP (Staden, 1984). Les séquences ont été analysées en utilisant le logiciel GCG (Devereux, 1984) . Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 8160 bp de la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6) dans laquelle sept ORFs (13-19) ont été identifiées respectivement du nucléotide 43841 au nucléotide 44806, du nucléotide 44809 au nucléotide 46053, du nucléotide 46109 au nucléotide 46819, du nucléotide 46907 au nucléotide 48436, du nucléotide 48436 au nucléotide 49638, du nucléotide 49679 au nucléotide 51145 et du nucléotide 51177 au nucléotide 51755 (numérotés dans la figure 3 à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) (respectivement séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207, du nucléotide 1210 au nucléotide 2454, du nucléotide 2510 au nucléotide 3220, du nucléotide 3308 au nucléotide 4837, du nucléotide 4837 au nucléotide 6039, du nucléotide 6080 au nucléotide 7546 et du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et correspondant respectivement aux gènes eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVI, eryCIV, eryCV et eryBVII, selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les sept ORFs (13-19) sont dans la même direction, la lecture se faisant à partir de la région 5' du gène eryAI. Des échantillons de E. coli XL1-blue contenant la région codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 : - le plasmide pBK6-12 comprenant la séquence codante pour l'ORF13 et pour une partie de l'ORF14 sous le numéro 1-1898 - le plasmide pNC028 comprenant la séquence codante pour les ORFs 14 et 15 ainsi que pour une partie des ORFs 13 et 16 sous le numéro 1-1901 et - le plasmide pNC062 comprenant la séquence codante pour les ORFs 17,18 et 19 ainsi que pour une partie de l'ORF16 sous le numéro 1-1900. EXEMPLE 12 : construction du plasmide pBIVA. L'ORF13 étant translationnellement couplé à l'ORF14 située en aval, une délétion en phase a dû être introduite. Un plasmide d'intégration, dénommé pBIVA et portant cette délétion, a été construit selon le schéma de la figure 9A. Le plasmide pPSP4 (figure 5B) a d'abord été construit par sous-clonage du fragment PvuII-SpeI (2,7 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12 obtenu à l'exemple 11 et du fragment SpeI-PstI (1,6 kb) isolé à partir du plasmide pNC028 obtenu à l'exemple 11 dans le vecteur pUC19 préalablement digéré à l'aide des enzymes de restriction SmaI et PstI. * A partir du plasmide pPSP4, le plasmide pl9BIVA a été généré en délétant le fragment BclI-NcoI de 510 pb interne à l'ORF13 et en lui substituant 45 pb venant d'un adaptateur synthétique de 54 pb. Cet adaptateur a été généré par appariement des 2 oligonucléotides complémentaires ayant les séquences suivantes SEQ A AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG (SEQ ID N 45) et SEQ B CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT (SEQ ID N 46) créant un site Bell et un site NcoI encadrant la séquence de 45 pb. Pour l'appariement, les deux oligonucléotides ont été mis à une concentration finale 1,8 M dans le tampon d'hybridation NaCl 50 mM, Tris, HC1 20 mM pH 7,4, MgCl2,6H20 2 mM, chauffés pendant 5 mn à 100 C puis refroidis lentement à température ambiante. Après digestion avec les enzymes de restriction Ncol et BclI, une ligature a été effectuée dans le plasmide pPSP4 dont le fragment BclI-NcoI de 510 pb avait préalablement été éliminé. A partir du plasmide pl9BIVA ainsi généré, le fragment SacI-EcoRI (2,2 kb) portant l'ORF13 modifiée a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pBIVA ainsi obtenu (figure 9B) a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 13 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBIVA (BIV87). Une souche dans laquelle le gène eryBIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIVA obtenu à l'exemple 12 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBIVA. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 510 bp du nucléotide 43872 au nucléotide 44382 de la séquence de la figure 3) et son remplacement par la séquence synthétique de 45 pb a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction Xhol, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence suivante B4-R AACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA (SEQ ID N 47) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 44687 à la position 44718 de la séquence de la figure 3, une bande de 5,4 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,7 kb à partir du mutant BIV87 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence d'un site Xhol supplémentaire à une distance de 2,7 kb en amont du site XhoI situé à la position 47114 de la séquence de la figure 3 confirmant ainsi l'incorporation de l'adaptateur dans le chromosome de mutant, telle qu'attendue par l'incorporation de l'adaptateur synthétique ci-dessus utilisé pour générer le plasmide pBIVA. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B4-S CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC (SEQ ID N 48) correspondant à la région d'ADN située de la position 43652 à la position 43678 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF13. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant BIV87 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBIV87 (figure 16). L'ensemble des résultats d'analyse par Southern et par PCR confirme la présence de la délétion de 510 pb et de l'adaptateur synthétique au niveau du chromosome du mutant. La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BIV87, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 14 : fermentation de la souche BIV87 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche BIV87 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche BIV87 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB. Des métabolites mineurs de faibles mobilités manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse comme décrit à l'exemple 4. Les résultats de spectre de masse indiquent que des formes modifiées de l'érythromycine A, B, C et D ont été produites. Un métabolite majeur et 3 métabolites mineurs ont été détectés. Le métabolite majeur M5 donne un pic parent à m/z 702 avec des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 684, m/z 560 et m/z 158 et correspond à l'élimination de 2 atomes d'hydrogène dans l'érythromycine D (m/z 704, m/z 686). La présence de désosaminyl érythronolide B (fragment m/z à 560) indique que la différence de masse est portée par le sucre neutre. La structure proposée pour ce métabolite est la 4"-céto érythromycine D. Les métabolites mineurs donnent aussi un profil avec une différence de 2 dans les valeurs m/z respectivement : - M6 (m/z à 718, m/z 700, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 720, m/z 702 pour l'érythromycine C ; - M7 (m/z à 732, m/z 714, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 734, m/z 716 pour l'érythromycine A ; - M8 (m/z à 716, m/z 698, m/z 560, m/z 158) au lieu de m/z 718, m/z 700 pour l'érythromycine B. Les structures proposées sont respectivement la 4"-céto érythromycine C pour M6, la 4"-céto érythromycine A pour M7 et la 4"-céto érythromycine B pour M8. Ces observations indiquent que le gène eryBIV code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose. La souche BIV87 a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1904 EXEMPLE 15 : construction du plasmide pBV#. Un plasmide d'intégration, dénommé pBV# et portant une délétion dans le gène eryBV codant pour l'ORF14, a été construit selon le schéma de la figure 10A. Une délétion de 726 pb a été générée dans l'ORF14 du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3 par ligature du fragment BclI-KpnI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12, obtenu à l'exemple 11, au fragment Kpnl-BamHI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pNC028, obtenu à l'exemple 11, dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré par l'enzyme de restriction BamHI. Le plasmide d'intégration pBVA ainsi obtenu (figure 10B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 16 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBVA (BV88). Une souche dans laquelle le gène eryBV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBV# obtenu à l'exemple 15 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBV#. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 726 pb du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : B5-R TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA (SEQ ID N 49) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46060 à la position 46098 de la séquence de la figure 3, une bande de 2,7 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,0 kb à partir du mutant BV88 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : B5-S AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT (SEQ ID N 50) correspondant à la région d'ADN située de la position 44799 à la position 44831 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF14. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,3 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 570 pb dans le mutant BV88 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBV88 (figure 16). Ces résultats confirment que la délétion de 710 pb détectée par analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBV# (726 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BV88, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 17 : fermentation de la souche BV88 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche BV88 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche BV88 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB. Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont également été détectés puis extraits et identifiés par RPHPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4. Le spectre de masse montre la présence d'un métabolite ayant un pic parent à m/z 560 et des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 542 et m/z 158 pour lequel la structure proposée est le désosaminyl érythronolide B. La séquence eryBV présente une forte homologie avec d'autres glycosyltransférases ainsi qu'avec le gène eryCIII ci-dessus (60,7 % d'identité au niveau nucléotidique, 44 % au niveau protéique). Ces observations indiquent que le gène eryBV code pour la mycarosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de l'érythomycine. EXEMPLE 18 : construction d'un plasmide pCVI# (pPSTI). Un plasmide d'intégration, dénommé pPSTI et portant une délétion dans le gène eryCVI codant pour l'ORF15, a été construit selon le schéma de la figure 11A de la façon suivante : Dans un premier temps, le plasmide pNB49 a été généré par traitement à l'exonucléase III du plasmide pNC028 obtenu à l'exemple 11 préalablement digéré par les enzymes de restriction NsiI et BamHI. Le plasmide pNB49 (figure 5B) contenant les nucléotides 44382 à 46562 de la séquence de la figure 3, a été ensuite digéré à l'aide de l'enzyme de restriction PstI puis traité par la nucléase Mung Bean (NE Biolabs) comme décrit par Sambrook et al. (1989). Après religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, les colonies résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnées par analyse de restriction avec l'enzyme Pstl. La perte du site PstI a été confirmée par séquençage d'un clone en utilisant l'amorce M13 inverse et la délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3 a été observée créant un changement de phase dans l'ORF15 dans le plasmide pNB49APst ainsi généré. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII du plasmide pNB49APst générant le plasmide pPSTI. L'orientation de pIJ702 dans pPSTI a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 0,9 kb après digestion avec l'enzyme de restriction Sphl. Le plasmide d'intégration pPSTI (figure 11B) ainsi obtenu a été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 19 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCVI# (PstlO) . Une souche dans laquelle le gène eryCVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pPSTI obtenu à l'exemple 18 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pPSTI. La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3. La sélection des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée comme à l'exemple 3 en utilisant une souche B. subtilis sensible à l'érythromycine au lieu d'une souche B. pumilus comme souche indicatrice. La souche B. subtilis ATCC 6633 a été utilisée pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques sur des boîtes d'agar en milieu Ml-102 inoculées avec le mutant à analyser et incubées pendant 3 jours à 30 C. Des zones d'agar recouvertes de bactéries ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes 2 x TY recouvertes d'une surcouche de 5 ml d'agar en milieu TY contenant 200 fil d'une culture de B. subtilis ATCC 6633, puis incubées une nuit à 37 C. L'absence de production d'érythromycine a été évaluée également en présence de précurseurs ajoutés tels que l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B par application de 10 /il d'une solution 10 mM de chaque métabolite sur les zones d'agar découpées suivie d'une incubation à 30 C pendant une nuit avant de recouvrir les boites de la culture de B. subtilis comme indiqué ci-dessus. La souche Sac. erythraea sauvage "red variant" a été utilisée comme contrôle. Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pPSTI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 3. Un fragment d'ADN de 1269 pb correspondant à l'ORF14 généré par PCR en utilisant les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes : 14-1 GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG (SEQ ID N 51) et 14-2 GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC (SEQ ID N 52) a été utilisé comme sonde. L'oligonucléotide 14-1 a été dessiné de façon à introduire un site BamHI et un site NdeI en amont de la séquence correspondant à la région d'ADN située de la position 44811 à la position 44833 de la séquence de la figure 3. L'oligonucléotide 14-2 a été dessiné de façon à introduire un site BglII en aval de la séquence correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46027 à la position 46053 de la séquence de la figure 3. L'ADN chromosomique préalablement digéré avec les enzymes de restriction ClaI et PstI a montré les bandes attendues de 4 kb et 7 kb à partir de l'intégrant alors que la souche sauvage présentait la bande de 3 kb attendue. Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'érythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery- (PstlO) a été confirmée par analyse de Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant PstlO, a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde PstI-NcoI de 0,8kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de lkb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 de la séquence de la figure 3 à partir de la souche sauvage et avec une bande >20 kb à partir du mutant. La perte du site PstI à la position 46368 ci-dessus a aussi été montrée après double digestion par les enzymes PstI et NcoI, résultant en une bande PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotide 46368 à 47142) à partir de la souche sauvage et une bande NcoI de 2,8 kb (nucléotide 44382 à 47142) avec le mutant. La souche recombinante ainsi obtenue, désignée PstlO, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits. EXEMPLE 20 : fermentation de la souche PstlO et identification des métabolites secondaires produits. La souche PstlO a été cultivée dans le milieu sucrosesuccinate décrit par Caffrey et al. (1992) pendant 3 jours à 30 C. Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9 avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques obtenues ont été séchées sur S04Mg2 puis amenées à sec sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans le mélange acétonitrile-eau (1:1, v/v), puis a ensuite été analysé par spectrométrie de masse sur un spectromètre BioQ (Micromass, Manchester, UK) ou Finningan LCQ (Finningag, CA). La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'érythronolide B (MK+ : m/z 441 et MNa+ : m/z 425) ainsi que de 3-a-mycarosyl érythronolide B (MK+ : m/z 585 et MNa+ : m/z 569) mise en évidence caractérise la souche PstlO comme un mutant eryC. La séquence eryCVI présente une forte homologie avec d'autres méthyltransférases telles que SnoX impliquée dans la biosynthèse de la nogalamycine chez S. nogalater (numéro d'accession EMBL S52403) (55,5 % d'identité au niveau protéique), TylM1 impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (numéro d'accession EMBL X81885) (65 % d'identité au niveau protéique) et SrmX impliquée dans la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens (numéro d'accession EMBL S25204) (52,8 % d'identité au niveau protéique). Ces observations indiquent que le gène eryCVI code pour la dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase impliquée dans la voie de biosynthèse de la dTDP-D-désosamine. EXEMPLE 21 : construction d'un plasmide pBViA (pXhoI). Un plasmide d'intégration, dénommé pXhoI et portant une délétion dans le gène eryBVI codant pour l'ORF16, a été construit selon le schéma de la figure 12A de la façon suivante : Le fragment NcoI-XhoI (3,1 kb) du plasmide pNC062 obtenu à l'exemple 11 et contenant les nucléotides 47142 à 50254 de la séquence de la figure 3 a été sous-cloné dans les sites Ncol et Xhol du plasmide Litmus 28. Le plasmide pNC062X (figure 5B) ainsi généré a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI puis traité avec l'ADN polymérase T4 (Boehringer Mannheim). Après religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, la perte du site PstI au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage et une délétion de 60 pb du nucléotide 47337 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 ont été observés. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII de cette contruction. L'orientation de pIJ702 dans la construction a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 4,3 kb après digestion avec l'enzyme de restriction Xhol. Le plasmide d'intégration pXhoI (figure 12B) ainsi obtenu a été utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 22 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBVI# (Xho91). Une souche dans laquelle le gène eryBVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pXhoI obtenu à l'exemple 21 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pXhoI. La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3. La sélection et l'analyse des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée selon les conditions décrites à l'exemple 19. L'intégration dans le chromosome et la présence de la délétion attendue ont été confirmées par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 19. Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pXhoI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern. En utilisant comme sonde le fragment PstI de 3,3 kb du plasmide pNC062, l'ADN chromosomique d'un intégrant préalablement digéré avec les enzymes de restriction PstI et BglII a montré les bandes 3 kb et 6 kb attendues. Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'érythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion de 60 pb du nucléotide 47338 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery- (XhoI) a été confirmée par analyse de Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant XhoI, a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de 1 kb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 de la séquence de la figure 3 à partir de la souche sauvage et avec une bande de 4 kb à partir du mutant indiquant que le site PstI à la position 47397 ci-dessus a été perdu. La perte du site PstI à la position 47397 a aussi été confirmée par PCR. L'ADN chromosomique a été soumis à une amplification par PCR en utilisant les amorces correspondant respectivement à la séquence du nucléotide 47300 au nucléotide 57320 et à la séquence du nucléotide 47661 au nucléotide 47636 de la séquence d la figure 3. Un fragment attendu de 306 pb a été ainsi amplifié à partir de la souche sauvage générant après digestion avec l'enzyme de restriction PstI deux bandes d'environ 100 et 300 pb. A partir du mutant Xho91, un fragment de 300 pb a été amplifié, résultant de la délétion de 60 pb. Ce fragment a été ensuite isolé et a été trouvé résistant à la digestion par l'enzyme PstI. La souche recombinante ainsi obtenue et désignée Xho91, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits. EXEMPLE 23 : fermentation de la souche Xho91 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche Xho91 et l'analyse du surnageant de culture par spectrométrie de masse ont été réalisées selon les conditions décrites à l'exemple 20. La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'une quantité majoritaire d'érythronolide B (MK+ : m/z 441 ; MNa+ : m/z 425 ; M-H20 H+ : m/z 385) ainsi que la présence de désosaminyl érythronolide B (m/z 560) mises en évidence caractérisent la souche PstlO comme un mutant eryB. Les résultats de spéctrométrie de masse ont été confirmés par spectrométrie de masse en haute résolution sur un spectromètre Brucker FT-ICR (Brucker, FRG). La séquence eryBVI présente une forte homologie avec DnmT impliquée dans la biosynthèse de la daunorubicine chez S. peucetius (numéro d'accession EMBL U77891) (43,9 % d'identité au niveau protéique). Ces observations indiquent que le gène eryBVI code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase impliquée dans la biosynthèse du dTDP-mycarose, comme suggéré par Scotti et Hutchinson, 1996. EXEMPLE 24 : du plasmide pCIV#. Un plasmide d'intégration, dénommé pCIVA et portant une délétion dans le gène eryCIV codant pour l'ORF17, a été construit selon le schéma de la figure 13A de la façon suivante : Le plasmide pNC062 obtenu à l'exemple 11 a été digéré à l'aide des enzymes de restriction BalI et BclI de façon à éliminer un fragment ayant 949 pb à l'intérieur de l'ORF17 du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, le plasmide a été religaturé et transformé dans E. coli XLl-blue. A partir du plasmide pBCB17 ainsi généré, le fragment de 2,68 kb portant la délétion a été isolé par digestion à l'aide des enzymes XbaI et SphI, puis sous-cloné dans les sites correspondant du 5 plasmide pUWL218. La présence de la délétion de 949 pb du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage. Le plasmide d'intégration pCIVA ainsi obtenu (figure 13B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour 10 transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 25 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIVA (CIV89). Une souche, dans laquelle le gène eryCIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide 15 pCIVA obtenu à l'exemple 24, a été préparée par transforma- tion des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIVA. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype 20 ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 949 bp du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que 25 par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C4-R AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC (SEQ ID N 53) 30 correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 49996 à la position 50022 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,2 kb à partir du mutant CIV89 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 35 indiquent la présence dans le mutant d'une délétion d'environ 1 kb dans cette région du chromosome. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C4-S GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT (SEQ ID N 54) correspondant à la région d'ADN située de la position 48169 à la position 48195 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF17. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande de 1,8 kb dans la souche sauvage et une bande de 900 pb dans le mutant CIV89 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCIVA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIV# (949 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIV89, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 26 : fermentation de la souche CIV89 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche CIV89 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CIV89 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC. Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont été également détectés, puis extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4. Un métabolite mineur donne un pic parent à m/z 720 et des produits de déshydration et de fragmentation à m/z 702, m/z 576 et m/z 174. Le pic 174 peut correspondre à la 4-hydroxydésosamine et le pic 576 au 4'-hydroxydésosaminyl érythronolide B. Ces résultats suggèrent que la différence de m/z de 16 comparée à l'érythromycine D (pic parent m/z 704) est portée par le sucre aminé. La structure proposée pour ce métabolite est la 4'-hydroxy érythromycine D. Ces observations indiquent que l'enzyme est impliquée dans le retrait du groupement hydroxyle dans la voie de biosynthèse de l'érythromycine et que le gène eryCIV code pour la dTDP-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase. La souche CIV89 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1905. EXEMPLE 27 : construction du plasmide pCV# . Un plasmide d'intégration, dénommé pCVA et portant une délétion dans le gène eryCV codant pour l'ORF18, a été construit selon le schéma de la figure 14A de la façon suivante : Le fragment BalI-BamHI (3,48 kb), obtenu à partir du plasmide pNC062 préparé à l'exemple 11 par digestion avec les enzymes de restriction BalI et BamHI, a été sous-cloné dans les sites SmaI-BamHI du vecteur pUC19. Du plasmide résultant pBAB18 (figure 5B), le fragment interne ScaI (lkb) a été ensuite délété par digestion avec l'enzyme ScaI pour générer une délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041 de la séquence de la figure 3 dans l'ORF18. Du plasmide pBABACV ainsi obtenu, le fragment portant la délétion a ensuite été réisolé à partir du polylinker de pUC19 par digestion avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI, puis sous-cloné dans le plasmide pUWL218. Le plasmide d'intégration pCVA ainsi obtenu (figure 14B) a été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea. EXEMPLE 28 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCVA (CV90). Une souche dans laquelle le gène eryCV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCVA obtenu à l'exemple 27 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCVA. La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3. De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3. Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C5-R AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA (SEQ ID N 55) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 51229 à la position 51259 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,1 kb à partir du mutant CV90 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 1,1 kb dans cette région du chromosome. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C5-S TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA (SEQ ID N 56) correspondant à la région d'ADN située de la position 49668 à la position 49694 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF18. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,6 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant CV90 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCV#. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 1,1 kb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide PCVA (1044 pb). La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CV90, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche. EXEMPLE 29 : fermentation de la souche CV90 et identification des métabolites secondaires produits. La culture de la souche CV90 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4. Les résultats de ccm (figure 17) montre que la souche CV90 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC. La séquence des résidus 38-50 (VTGAGDGDADVQA) Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gln Ala (SEQ ID N 61) de la protéine codée par eryCV (séquence de SEQ ID N 11) est proche de la séquence consensus de liaison au NAD+ décrit par Wierenga et al., 1985 et par Scrutton et al., 1990. Ces observations permettent de conclure que le gène eryCV code pour une réductase qui interviendrait comme une dTDP-4,6-désoxyhexose 3,4-réductase dans la voie de biosynthèse de la d-TDP-désosamine. EXEMPLE 30 : surexpression du produit du gène eryCIII dans E. coli. L'expression hétérologue du produit du gène eryCIII de Sac. erythraea correspondant à l'ORF8 décrite à l'exemple 1 et codant pour l'activité désosaminyltransférase identifiée à l'exemple 7 a été réalisée en utilisant E. coli comme souche hôte. La protéine ainsi produite sous forme de corps d'inclusion a été ensuite purifiée et son activité enzymatique déterminée in vitro. 1) Expression de la protéine EryCIII dans E. coli L'expression a été réalisée en utilisant le vecteur pETlla (Stratagène) pour le clonage et l'expression de protéines recombinantes dans E. coli sous le contrôle du promoteur de l'ARN polymérase du bactériophage T7. Dans un premier temps, le gène eryCIII a été amplifié à partir du plasmide pK62 décrit à l'exemple 1 de la façon suivante : L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant la polymérase Native Pfu (Stratagène) et comme amorces l'oligonucléotide A homologue au brin codant du gène eryCIII ayant la séquence A GAAGGAGATATACATATGCGCGTCGTCTTCTCCTC (SEQ ID N 57) permettant d'introduire un site NdeI en amont de l'ATG initiateur de eryCIII et l'oligonucléotide B homologue au brin complémentaire du gène eryCIII ayant la séquence B CGGGATCCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGC (SEQ ID N 58) permettant d'introduire un site BamHI en aval du codon stop du gène eryCIII. L'ADN amplifié a été ensuite digéré par les enzymes de restriction NdeI et BamHI, puis -le fragment NdeI-BamHI de 1,2 kb obtenu contenant la totalité du gène eryCIII a été ligaturé dans le vecteur d'expression pET11a (Stratagène) qui contient le gène ss-lactamase de résistance à l'ampicilline, l'origine de réplication ColEl et le promoteur du gène de l'ARN polymérase T7 situé en amont du site de clonage NdeI, préalablement digéré avec les enzymes de restriction NdeI et BamHI. Après ligation et transformation dans E. coli XL1- blue, le plasmide pCEIII ainsi obtenu a été confirmé par carte de restriction et séquençage. La souche d'E. coli BL21 (DE3) de la trousse pET (Stratagène) qui contient dans son ADN chromosomique le gène lacIq et le promoteur 2acUV5 en amont du gène de l'ARN polymérase T7, a ensuite été transformée par le plasmide pECIII.5. La souche transformée obtenue, dénommée BL21/pECIII, a été cultivée en erlen de 50 ml à 37 C en milieu LB ensemencé à DO600=0,1 à partir d'une préculture, puis induite par l'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (IPTG) lmM à D0600=1. Après 3 h 30 d'induction, 1 ml de culture a été prélevé et centrifugé, puis le culot bactérien obtenu a été dissout dans 240 fil d'eau et 120 /il de tampon d'échantillon SDS 3X (Tris- HC1 1M pH = 6,8 : 1,9 ml ; 3 ml ; -mercaptoéthanol 1,5 ml ; 20 % , 3 ml ; de bromophénol 1 % pH = 7 : 0,3 ml ; H20 qsq 10 ml). A partir de 15 /il de la solution obtenue, les protéines totales extraites ont été analysées par SDS-PAGE sur un gel à 10 % de polyacrylamide avec une coloration au bleu de Comassie. La surexpression d'une protéine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 46 Kd correspondant au PM attendu pour la protéine EryCIII a été observée comparative- ment aux protéines totales d'une souche témoin transformée par le plasmide pETlla. 2) Purification de la protéine EryCIII La souche transformée BL21/pECIII ci-dessus a été cultivée en fermenteur de 6 litres en milieu minimum contenant du glycérol comme source de carbone (Korz et al., 1995) à 25 C jusqu'à D0600=12, puis induite par l'IPTG pendant 18 h jusqu'à D0600=54. A partir du bouillon récolté, le culot bactérien contenant des corps d'inclusion a été isolé par centrifugation à 5000 g pendant 30 mn. L'induction de la protéine EryCIII a été contrôlée par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : à 20 %) et avec une coloration au bleu de Comassie après lyse sur un aliquot dans le tampon SDS 1 %, à 100 C pendant 5 min, soit directement sur le bouillon récolté, soit sur le culot bactérien après une première lyse par sonication dans un tampon phosphate. 190 g de culot bactérien correspondant à 1 litre de bouillon récolté ont été remis en suspension dans 2,5 volumes de tampon KH2P04/K2HP04 20 mM pH 7,2 contenant de l'EDTA 2,5 mM et du DTT 2,5 mM. Les cellules ont été ensuite lysées en utilisant un appareil Rannie (Mini-Lab, type 8-30H, APV Homogenisers As, Denmark) avec trois passages sous une pression de 1000 bars. Après centrifugation à 46.000 g pendant 3 heures, le culot obtenu a été mis en suspension dans 2,5 volumes d'urée 2M puis centrifugé dans les mêmes conditions. Le culot ainsi lavé a été ensuite mis en suspension dans 2,5 volumes d'une solution d'urée 7M dans du tampon tris 50 mM pH 7,5 (tampon A) de façon à solubiliser la protéine EryCIII. Après centrifugation dans les mêmes conditions, le surnageant recueilli obtenu contient 2,1 g de protéines totales déterminées par la méthode de Bradford en utilisant une trousse du commerce (Pierce). L'extrait dans l'urée 7M a été ensuite chargé à la vitesse de 0,5 mètres/h et à 4-8 C sur une colonne de 180 ml (5 cm x 9 cm) de Q sepharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A ci-dessus et avec une détection à 280 nm. La protéine EryCIII a été ensuite éluée avec le tampon A contenant NaCl 0,3M. Les fractions réunies, contenant la protéine EryCIII, mise en évidence par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 20 %) révélée par coloration au bleu de Comassie et 835 mg de protéines totales, ont été ensuite chargées sur une colonne de 5,5 litres (10 cm x 70 cm) de Superdex 200 Prep grade (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A ci-dessus. Par élution de la colonne avec le tampon A et par détection à 280 nm, un pic de protéine a été obtenu dont les fractions contenant la protéine EryCIII mise en évidence par SDS-PAGE et 200 mg de protéines totales ont été réunies puis purifiées sur une colonne de 180 ml (5 cm x 9 cm) de Q Source (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A. Par élution avec un gradient linéaire de NaCl variant de 0 à 0,3 M dans le tampon A, 30 ml de solution contenant 100 mg de protéine EryCIII dénaturée homogène en pureté évaluée par SDS-PAGE, avec une révélation au nitrate d'argent, ont été obtenus. La figure 18 montre l'évolution de la pureté de la protéine EryCIII suivie par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 15 %) pour un dépôt de 500 ng de protéines totales et une révélation au nitrate d'argent successivement après extraction à l'urée 7M (ligne 2), chromatographie Q sepharose (ligne 3), chromatographie Superdex (ligne 4), chromatographie Q source (ligne 6) par rapport aux marqueurs de poids moléculaire (lignes 1 et 5). La protéine EryCIII a été ensuite renaturée par dilution de l'éluat homogène avec une solution de tampon A contenant du DTT 10 mM pour obtenir une concentration finale en protéine de 0,1 mg/ml. La solution diluée a été ensuite dialysée contre du tampon Tris 50 mM ; 0,15 M ; % n-octyl--D-glucopyranosyl (NOG) ; DTT 10 mM, pH 8,3 puis concentrée à 4 mg/ml par ultrafiltration sur une membrane PLGC04310 (Millipore) ayant un seuil de coupure de 10.000. La protéine EryCIII purifiée a été ensuite conservée à l'état congelé à -20 C en aliquots de 500 /il. 3) Caractérisation de la protéine EryCIII La caractérisation de la protéine EryCIII ainsi obtenue a été examinée pour les propriétés suivantes : a) Homogénéité. L'électrophorèse par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 15 %) en utilisant l'appareil Phast System (Pharmacia) et une révélation au nitrate d'argent montre une pureté supérieure à 99 % pour un dépôt de 2000 ng. b) Poids moléculaire par électrophorèse et spectrométrie de masse. Par électrophorèse, un PM apparent de 46 kDa a été déterminé en accord avec le PM calculé de 45929. L'analyse par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse (HPLC : ESI-SM) donne une masse de 45934 uma. c) Séquence en acide aminés N-terminale La séquence N-terminale a été déterminée par microséquençage sur un microséquenceur de protéine Model A492 couplé à un analyseur HPLC de PTH-aminoacides (Applied Biosystems). Aucune séquence secondaire n'a été décelée pour les 10 premiers résidus qui est en accord avec la séquence en acides aminés décrite à la figure 2 (séquence de SEQ ID N 5) . d) Activité biologique L'activité désosaminyl transférase de la protéine EryCIII a été déterminée in vitro par la mise en évidence de la formation d'érythromycine D à partir de dTDP-D-désosamine, dont la préparation est décrite plus loin et de 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB) dont la préparation est décrite cidessus dans Matériels et Méthodes générales. Le milieu de réaction contient 150 nmoles de dTDP-Ddésosamine, 137,4 nmoles de MEB et 1 mg de protéine EryCIII en utilisant les conditions opératoires suivantes : Dans un tube en verre à vis, on introduit successivement 4,78 ml de tampon Tris 50 mM pH 7,3 (tampon B) ; 20 l de dTDP-D-désosamine, sel de triéthylamine (150 nmoles) en solution dans le tampon B contenant EDTA 1 mM et PEFABLOC 0, 4 mM (Merck) ; 100 /ni de MEB (137,4 nmoles) en solution dans le tampon B et 1 mg de protéine EryCIII correspondant à 250 /il d'un aliquot de solution congelée obtenue ci-dessus. Après homogénisation au Vortex, le tube bouché est placé pendant 5 h dans un bain thermostaté à 30 C, puis on ajuste le pH à 9-10 avec NaOH 32 % puis extrait le mélange réactionnel 3 fois avec 5 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait obtenu, amené à sec sous pression réduite, puis repris par 100 /il de chlorure de méthylène est ensuite analysé par ccm dans les conditions indiquées à l'exemple 4 en utilisant comme éluant le mélange chlorure de méthylène/méthanol (90 : 10,v/v). Un essai témoin (t = 0) dont l'incubation est arrêtée immmédiatement par l'ajout de NaOH, est effectué dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus par révélation chimique montrent l'apparition d'un produit moins mobile ayant un Rf voisin de l'érythromycine D attendue et pour lequel une faible activité antibiotique est détectée par autobiogramme direct des plaques sur B. pumilus. Aucune activité biologique n'est observée pour l'essai témoin (figure 19). Ces résultats confirment que la protéine EryCIII produite dans E. coli et purifiée ci-dessus a l'activité désoaminyl transférase attendue et a été correctement renaturée. EXEMPLE 31 : utilisation de la séquence du gène eryCIII comme sonde pour isoler les gènes oleGl et oleG2 codant pour des glycosyltransférases chez S. antibioticus. 1) clonage des gènes oleG1 et oleG2 La séquence du gène eryCIII de Sac. erythraea correspondant à l'ORF8 décrite à l'exemple 1 codant pour l'activité désosaminyltransférase a été utilisée pour préparer une sonde d'hybridation et a permis d'isoler des gènes homologues dans la souche S. antibioticus ATCC 11891 productrice d'oléandomycine par hybridation Southern. L'intégralité du gène eryCIII a été amplifiée par PCR à partir de 6 ng du plasmide pK62 obtenu à l'exemple 1 en suivant les conditions opératoires décrites à l'exemple 3 en utilisant la polymérase native pfu (Stratagene) et comme amorces l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : eryCIII-1 CGGGTACCATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID N 59) comportant un site de restriction KpnI dans sa région 5' et dont la partie 3' correspond au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 10196 à la position 10219 de la séquence de la figure 2 et l'oligonucléotide eryCIII2 ayant la séquence suivante : eryCIII-2 CGGGTACCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID N 60) comportant un site KpnI dans sa région 5' et dont la partie 3' correspond à la région d'ADN située de la position 8954 à la position 8974 de la séquence de la figure 2. La bande d'environ 1,2 kb obtenue par amplification a été ensuite digérée par l'enzyme de restriction KpnI et clonée dans le plasmide pUC19 préalablement digéré par l'enzyme KpnI. Le plasmide pCIIIPCRl ainsi obtenu a été ensuite utilisé pour réisoler le fragment KpnI de 1,2 kb correspondant à l'intégralité du gène eryCIII montré à la figure 2. Le fragment ainsi isolé a été ensuite marqué au 32P par la technique "random priming" décrite par Sambrook et al., 1989 et utilisé comme sonde eryCIII pour analyser par hybridation Southern des clones cosmides obtenus à partir d'une banque d'ADN génomique de S. antibioticus ATCC 11891 et préparés de la façon suivante (figure 20) : Une série de six cosmides (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67, cosAB63 et cosAB61) se chevauchant et couvrant environ 100 kb de la région correspondant au cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine a été isolée en suivant la méthode décrite par Swan et al., 1994 en utilisant comme sondes le fragment SmaI de 2 kb interne à la troisième sousunité de la polykétide synthase de Sac. erythraea dans le cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine (Cortes et al., 1990) suivie d'une marche sur le chromosome. Les sondes strD, strE et strM codant respectivement pour la dTDPglucose synthase, la dTDP-glucose 4,6-déshydratase et la dTDP-6-désoxyglucose 3,5-épimérase de S. griseus (Stockmann et Piepersberg, 1992) hybrident avec les cosmides cosAB61 et cosAB63 (fig. 20). De façon analogue, par hybridation Southern avec la sonde eryCIII préparée ci-dessus effectuée selon les conditions standard décrites par Hopwood et al., 1985, le cosmide cosAB35 (Swan et al., 1994) donne des signaux positifs dans deux fragments de restriction BamHI de 3,5kb et de 2,7 kb représentés à la figure 20. Le sousclonage et le séquençage ultérieurs montrent que ces deux fragments sont séparés par un fragment BamHI de 0,6 kb non détecté par hybridation. Un fragment SstI de 10,8 kb d'ADN génomique de S. antibioticus ATCC 11891 représenté à la figure 21, correspondant à la partie droite du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine comprise entre le site SstI en position 11081 du gène OLE-ORF3 des PKS de la séquence EMBL nOL09654) et le site SstI en position 5 de la séquence EMBL n L36601 situé à 1,4 kb en amont du gène oleB et hybridant avec la sonde eryCIII préparée ci-dessus, a été isolé à partir du cosmide cosAB35 et sous-cloné dans le vecteur plasmidique pSL1180 (Pharmacia Biotech). Le clone pC035-S ainsi obtenu a été utilisé pour générer des matrices simple brin par sous-clonage de différents fragments d'ADN dans les bactériophages M13mpl8 et MP13mpl9 (New England Biolabs), puis la séquence nucléotidique de ces fragments a été déterminée selon la méthode de Sanger et al. (1977) en utilisant une polymérase T7 modifiée (Sequenase version 2.0; U. S. Biochemicals) en présence d'a[35S]dCTP (Amersham) et de 7-déaza-dGTP, selon les recommandations du fournisseur afin de limiter les problèmes de compression de bandes. Les amorces conventionnelles fournies avec la trousse Sequenase ainsi que les amorces synthétiques (17mer) internes ont été utilisées. L'assemblage des données de séquence a été réalisé en utilisant le programme Fragment Assembly (Genetic Computer Group, University of Wisconsin) et l'identification des phases ouvertes de lecture en utilisant le programme CODONPREFERENCE (Devereux et al., 1984). Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 6093 bp représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15), comprise entre les sites SphI* et KpnI montrés à la figure 21, dans laquelle cinq ORFs ont été identifiées respectivement du nucléotide 184 au nucléotide 1386 (ORF dénommée oleP1), du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 (ORF dénommée oleG1), du nucléotide 2722 au nucléotide 3999 (ORF dénommée oleG2), du nucléotide 3992 au nucléotide 4729 (ORF dénommée oleM) et du nucléotide 4810 au nucléotide 5967 (ORF dénommée oleY). Les cinq ORFs sont transcrites dans la même direction. Des échantillons de E. coli contenant le plasmide pC035-S comprenant la région codante des ORFs olePl, oleGl, oleG2, oleM et oleY ont été déposés à la CNCM le 8 avril 1998 sous le numéro 1-2003. Le gène oleG1 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 17). Cependant, la présence d'un codon CGC codant pour une arginine très conservée dans cette classe de glycosyltransférase chez les Streptomycètes situé immédiatement en amont du codon GTG, indiquerait que le codon initiateur pourrait être le codon CTG en position 1431 de la séquence SEQ ID N 17. Le gène oleG2 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 18). La comparaison des séquences en acides aminés déduites des ORFs oleG1 et oleG2 ci-dessus avec les protéines de bases de données à l'aide du programme Blast (Altschul et al., 1990) a montré des similarités avec des glycosyl transférases de différentes sources, notamment environ 72 % de similarité et 53 % d'identité avec la déosaminyltransférase EryCIII décrite à l'exemple 30. L'identification de la fonction du gène oleG1 ou du gène oleG2 a été ensuite réalisée par interruption du gène cible dans la souche de S. antibioticus ATCC 11891 et par identification d'un précurseur non glycosylé de l'oléandomycine produit par la souche mutante en utilisant les méthodes décrites dans les exemples 3 à 4. 2) génération d'une souche de S. antibioticus oleG1# (A35G1). Une souche dans laquelle le gène oleG1 est interrompu a été préparée par intégration d'un plasmide pC03 dans les régions homologues de l'ADN chromosomique de la souche de S. antibioticus ATCC 11891 productrice d'oléandomycine. Dans un premier temps, le fragment BamHI de 0,6 kb interne au gène oleGl, obtenu par digestion du plamide pC035-S préparé ci-dessus, avec l'enzyme de restriction BamHI (figure 21), a été sous-cloné dans le site BamHI du plasmide pOJ260 NRRL B-14785. Le plasmide pC03 ainsi généré a été ensuite transféré dans la souche E. coli TG1 rec01504::Tn5 (Kolodner et al., 1985), puis utilisé pour transformer les protoplastes de S. antibioticus. La sélection des transformants a été réalisée par résistance à l'apramycine (Apramycine pour injection, Rhône Mérieux). La préparation des protoplastes a été réalisée à partir de la souche S. antibioticus ATCC 11891 en suivant les conditions décrites par Hopwood et al., 1985. La transformation a été réalisée en utilisant 50 l d'aliquot de protoplastes, 5 g d'ADN plasmidique pC03 et en remplaçant le thiostrepton par de l'apramycine à la concentration finale de 25 jug/ml. La sélection des intégrants effectuée par résistance à l'apramycine a permis d'isoler un clone dénommé A35G1. L'altération attendue dans la région correspondante du chromosome de S. antibioticus a été confirmée par analyse génomique par Southern blot. L'ADN chromosomique isolé puis digéré par l'enzyme de restriction PstI à partir de la souche S. antibioticus sauvage ou du mutant A35G1 a été analysé par Southern en utilisant comme sonde d'hybridation le fragment BamHI de 0,6 kb indiqué ci-dessus. Le remplacement du fragment PstI de 4,7 kb ainsi détecté dans la souche sauvage par deux fragments PstI de 2,4 et 6,5 kb dans le mutant A35G1 confirme l'intégration du plasmide pC03 dans le chromosome de la souche A35G1 au niveau de l'ORF oleGl. La souche recombinante A35G1 ainsi obtenue a été ensuite cultivée pour identifier les précurseurs produits par la souche. 3) fermentation de la souche A35G1 et identification des précurseurs de l'oléandomycine produits. La souche A35G1 a été cultivée pendant 72 h en erlen de 50 ml dans le milieu EP2 à partir d'une préculture de 48 h en milieu EPI dans les conditions décrites à l'exemple 4. Les extraits de bouillon avec de l'acétate d'éthyle ont été ensuite analysés selon les méthodes utilisées dans les exemples 3 et 4. a) L'essai biologique par antibiogramme a été réalisé de la façon suivante : Après croissance de la souche B. pumilus sur milieu TSB pendant une nuit à 37 C, la culture a été diluée à 1/100 dans du milieu contenant 50 % (w/v) de glycérol, puis la suspension cellulaire obtenue a été conservée à -20 C avant utilisation. L'essai biologique a ensuite été effectué en introduisant 150 /ni de la suspension cellulaire décongelée dans 100 ml de milieu TSB contenant 1 % d'agar et maintenu à 55 C. Le mélange a été ensuite versé dans des boites de pétri. Après refroidissement, des cylindres oxford contenant 50 à 200 l d'extraits à l'acétate d'éthyle ont été placés sur les boites d'agar, maintenus 2 h à 4 C, puis incubés pendant une nuit à 37 C. Les extraits ne montrent pas d'effet inhibiteur sur la croissance de B. pumilus ATCC 14884. b) L'analyse par ccm par révélation chimique a été effectuée selon les conditions décrites à l'exemple 4 en utilisant comme standards l'érythromycine A, l'érythronolide B ainsi que le 6-désoxyérythronolide B. L'analyse par ccm montre que la souche A35G1 ne produit pas d'oléandomycine mais accumule préférentiellement un produit pourpre ayant une mobilité plus grande que l'érythronolide B et voisine du 6-désoxyérythronolide B et que l'on peut attendre de la partie aglycone 8,8a-désoxyoléandolide. c) L'analyse par chromatographie RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse a été réalisée selon les conditions décrites à l'exemple 4. Deux métabolites majeurs, dénommmés M9 et M10, ont été détectés (élution à 6,12 mn et 17,23 mn respectivement). Les deux produits donnent un pic parent m/z 373 et des profils de fragmentation analogues qui peuvent être en accord avec la structure [8,8a-désoxyoléandolide]H+. Cependant seul le temps de rétention du métabolite M10 est en accord avec la structure proposée alors que le métabolite M9 pourrait correspondre à une structure isomère ou au noyau lactone ouvert. Des expériences de complémentation des souches mutantes de Sac. erythraea CIII68 décrite à l'exemple 6 et BV88 décrite à l'exemple 16 ont été également réalisées en utilisant des constructions plasmidiques permettant d'exprimer respectivement chacun des gènes oleG1 et oleG2. Ces observations et l'absence de détection d'oléandrosyl 8,8a-désoxyoléandolide ou de désosaminyl 8,8a-désoxyoléandolide indiquent que le gène oleG1 code pour la désoaminosyltransférase et le gène oleG2 code pour l'oléandrosyltransférase respectivement impliquées dans la biosynthèse de l'oléandomycine. PREPARATION DE L'EXEMPLE 30 :Thymidine 5'-(trihydrogendiphosphate),p'- [3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylohexopyranosyl]ester,N,N-diéthyléthanamine STADE A : chlorhydrate 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D- xylohexopyranose On ajoute sous agitation et à température ambiante 146,6 g d'érythromycine A, à 1,5 litres d'acide chlorhydrique 6N. On porte la solution obtenue au reflux pendant 2 h. On refroidit à la température ambiante, filtre et lave à l'eau le résidu obtenu. On extrait la phase aqueuse au chlorure de méthylène, puis à l'éther sulfurique. On ajoute à la phase aqueuse 10 g de noir L2S et chasse les traces d'éther sous pression réduite. On filtre, et concentre. On effectue un second envoi dans les mêmes conditions. On rassemble les deux essais, dissout dans l'éthanol (150 cm3), ajoute 150 cm3 d'éther éthylique. On essore, lave et sèche les cristaux obtenus. On obtient 42 g de produit recherché. F = 158-160 C. STADE B : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranose,l,2-diacétate On ajoute sous agitation à 20 C, 60 cm3 de triéthylamine dans un mélange renfermant 15,27 g de produit du stade A et 150 cm3 de chlorure de méthylène. On ajoute à 20 C une solution renfermant 20 cm3 d'anhydride acétique et 80 cm3 de chlorure de méthylène. On agite à la température ambiante pendant 20 heures. On filtre, lave et concentre. On empâte dans l'éther sulfurique. On concentre le filtrat sous pression réduite. On chromatographie le résidu obtenu en éluant avec le mélange acétate d'éthyle-triéthylamine (95-5). On obtient 18,6 g de produit recherché que l'on utilise tel quel dans le stade suivant. STADE C : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyra- nose,2-acétate On porte à 50 C un mélange renfermant 18,6 g du produit du stade B et 50 cm3 de DMF et ajoute 6,62 g d'acétate d'hydrazine NH2NH2, ACOH. On agite le mélange réactionnel et le verse sur une solution saturée de carbonate acide de sodium. On extrait la phase aqueuse à l'acétate d'éthyle. On rassemble les phases organiques, sèche, filtre et concentre. On distille sous pression réduite pour éliminer le DMF par entraînement azéotrophirque avec le toluène. On obtient 11,28 g de produit que l'on chromatographie sur silice en éluant avec le mélange acétate d'éthyle-triéthylamine (90-10). On obtient 6,5 g de produit recherché que l'on utilise tel quel dans le stade suivant. STADE D : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranose,2-acétate bis(phénylméthyl)phosphate On ajoute à -70 C, 5,7 cm3 d'une solution de n-butyllithium dans l'hexane dans une solution renfermant 1,738 g du produit du stade précédent et 40 cm3 de THF. On ajoute à -70#-75 C 10 g de dibenzylphosphochlorure préparé extemporanément (J. Chem. Soc. 1958, p. 1957), en solution dans 20 cm3 de THF. On maintient l'agitation pendant 1 h 30 entre-70 et -74 C. On verse sur une solution saturée de carbonate acide de sodium, extrait à l'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, filtre et concentre. On chromatographie le produit obtenu sur silice en éluant avec le mélange acétone-chlorure de méthylène (5-5). On obtient 1,070 g du produit recherché. STADE E : 3,4,6-tridéoxy-3- (diméthylamino)-D-xylohexopyranose,l-(dihydrogen phosphate),N,N-diéthyléthanamine On place sous agitation et sous courant d'hydrogène pendant 30 minutes à la température ambiante, un mélange renfermant 1,070 g du produit du stade précédent, 20 cm3 d'acétate d'éthyle, 10 cm3 de méthanol, 0,622 cm3 de triéthy- lamine et 200 mg de palladium sur charbon. On filtre, lave au méthanol et à l'acétate d'éthyle et concentre le filtrat. On obtient 1 g d'une huile à laquelle on ajoute 10 cm3 de méthanol. On agite la solution obtenue pendant 20 heures. On chasse le méthanol sous pression réduite à 30 C. On obtient 680 g de produit recherché. STADE F : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylohexopyranose,l-(dihydrogen phosphate) On dissout 420 mg du produit isolé sous forme de sels de triéthylamine, obtenu au stade précédent, dans 1,6 cm3 de méthanol. On ajoute 3,2 cm3 d'éther sulfurique. On ajoute ensuite 6,4 cm3 d'éther sulfurique. On obtient 250 mg de produit recherché fondant à 242-244 C. STADE G : Thymidine 5'-(trihydrogen diphosphate),P'-[3,4,6tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranosyl]ester,N,Ndiéthyléthanamine On mélange 228 mg du produit de la préparation 1,6 cm3 de pyridine et 544 mg de thymidine 5'-monophosphate morpholidate-4-morpholine-NN'-dicyclohexylcarboxamidine. On chasse la pyridine sous pression réduite au rotorvapor en maintenant la température à 30 C ou en dessous. On ajoute 6 cm3 de pyridine que l'on chasse sous pression réduite. On répète l'opération 2 fois. On ajoute 6 cm3 de pyridine, 105 mg de 1H-tétrazole. On agite pendant 3 jours à la température ambiante. On chasse la pyridine sous pression réduite. On reprend dans l'eau, filtre, concentre et obtient un produit que l'on purifie par chromatographie. On obtient ainsi le produit recherché. rf = 0,12 éluant CH2C12, MeOH, H20 (60-35-6). Références bibliographiques : Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) J Mol Biol 215 : 403-410. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA Struhl K (1995) Current protocols in molecular biology. Massachusetts General Hospital and Harvard medical School. John Wiley and Sons, Inc. Bankier AT, Weston KM, Barrell BG (1987) Methods in Enzymology 155 : 51-93. Bevitt DJ, Cortes J, Haydock SF and Leadlay PF, (1992), Eur. J. Biochem 204 : 39-49. Caffrey P, Bevitt DJ, Staunton J, Leadlay PF (1992) FEBS 304 : 225-228. Cortés J, Haydock SF, Roberts GA, Bevitt DJ, Leadlay PF (1990) Nature 348 : 176-178. Devereux J, Haeberli P, Smithies 0 (1984) Nucl Acids Res 12 : 387-395. 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Wierenga RK, Terpstra P, Hol WGJ (1986) J. Mol. Biol. 187 : 101-107. Yamamoto H, Maurer KH, Hutchinson CR (1986) J Antibiot 34 : 1304-1313. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : Hoechst Marion Roussel (B) RUE : Terrasse Bellini (C) VILLE : PUTEAUX (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : (G) TELEPHONE : (H) TELECOPIE : 01.49.91.46.10(ii) TITRE DE L' INVENTION : Gènes de biosynthese et de transfert des 6-desoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et chez Streptomyces antibioticus et leur utilisation. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : (D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : Saccharopolyspora erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT:complement (48..1046) (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBII" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:complement (2322..3404) (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese de la desosamine" /gene= "eryCII" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1: GCTTCACGCT CACCAGCCGT ATCCTTTCTC GGTTCCTCTT GTGCTCACTG CAACCAGGCT 60 TCCGGCGCCG CGCCGCCGGA GGCCACCGCG GGGAAGATCT CGTCCAGTTC GGACAGCGCC 120 TGCTCGTCCA GGGTCATCGC GGACGCCTTC AGCGCGGAGT CGAGCTGCTC GGGGGTTCGC 180 GGGCCGATGA CGGCGCCGGC GATGCCGGGC CGGGACAGCA CCCATGCGAG CCCCACCTCG 240 GCCGGGTCTT CGCCGAGGTT GCGGCAGAAC TTCTCGTAGG CCTCGATCGC CGGGCGCAGG 300 GACGGCAACA GCACCTGCGC ACGGCCCTGC GCCGACTTCA CCGCGGTGCC CGCGGCCAGC 360 TTCTCCAGCG CTCCGCTGAG CAGGCCGCCG TGCAGCGGCG ACCAGGCGAA GACGCCGAGC 420 CCGTAGGCCT GCGCGGCGGG CAGCACCTCC AGCTCGGCGT GCCGGACCGC CAGGTTGTAC 480 AGGCACTGGT GGGAGACCAT GCCCAGGGAG TGGCGGCGGG CGGCGTTCTC CTGCGCGGCG 540 GCGATGTGCC AGCCCGCGAA GTTCGACGAG CCGACGTAGG AGACCTTGCC GCTGGCGACG 600 AGGCTGTCCA TGGCCTGCCA CACCTCGTCC CACGGCGCGG ACCGGTCGAT GTGGTGCATC 660 TGGTAGACGT CGATGTGGTC GACGCCCAGC CTGCGCAGCG ATCCCTCGCA GGAGGCGATG 720 ATGTGCCGCG CCGACAGCCC GCTGTCGTTG ACGCGCTCGC TCATCTCGCC GCCGACCTTG 780 GTCGCCAGCA CGGTGTCCTC GCGCCGTCCG CCGCCCTGGG CCAGCCACCT GCCCACCAGC 840 TCCTCGGTGT GGCCCTTGTA GAGCCGCCAG CCGTACATGT CGGCGGTGTC GAGGCAGTTG 900 ATGCCGCGGT CCCGGGCGTG GTCCATCAGG CGCAGCGCGT CGTCGTCCTC GACGCGTCCG 960 CTGAAGTTCA CCGTGCCGAG CCAGAGCCTG CTGGTGAGCA GCGCGGAACG CCCGAGCCGC 1020 ACGTGCGTCG CGGCGTCGGT GGTCATCGTG GTTCTCTCCT TCCTGCGGCC AGTTCCTCGC 1080 AGATGCCGAC GACCTCGGCC GGTGACGGCT CCGCGAGCAT GTCGTCGCGC ATCCGCGCCG 1140 CGCCGGCGCG GTGGGCCGGG TCGTCGAGGA CCCGCTTCAC CGACTCCCGG AGCTGGTCGG 1200 GGGTCAGCTC GGGCACGGGC AGCGCGATCC CCGCCCCGAA TTCCTGCGTG CGCTGCGCGC 1260 GCACGCCGGT GTCCCAGCCG TCGGGCAGGA TCACCTGCGG CACGCCGTGG ATCGCCGCGG 1320 TGTGCCAGCT CCCGGGTCCG CCGTGGTGCA CCGTCGCCGC GCAGGTCGGC AGCAGCGCGT 1380 GCATCGGGAC GAAGCCGACC GTGCGGACGT TGTCCGGGAT GTTCGCGACG CCTTCTAGCT 1440 GCTGCGCGTC GAAGGTCGCG ATGATCTCGG CGTCGACGTC GCCGACGGCA CCCAGCAGCT 1500 CCTCGATGGA GACCTGCCCG ATGCTGTTCT CGCGGCTGGA GATCCCGAGC GTGAGGCACA 1560 CGCGGCGGCG CTCGGGCTCG TCGTGCAGCC ATTCCGGCAC CACGGACGGC CCGTTGTAGT 1620 CGACGTAGCG CATCCCGACG GTCTTCAGGC CGGTGTCGAG CCTGATCGCG GCCGGGGCGG 1680 GGTCGATCGT CCACTGCCCG ACGACCACCT CCTCGTCGAA GGCCGGGCCG CCGTACTTCT 1740 CCAGCGTCCA GGTGAGCCAC TCGGCGAGCG GGTCCTCCCG GTGCTCCTCC GGCTGGTCGG 1800 GCAGCAGGCC GAGGAAGTTC TGCCGCGCCC GGGTGGTGAT GTCGGGTCCC CACAGCAGCC 1860 GCGCGTGCGG CGTTCCGGTC ACCGCCGCCG CGATGGGCGC GGCGAAGGTG AGCGGCTCCC 1920 AGATGACCAG GTCGGGCCGC CACTTCCGGC AGAACGAGAC CATGCCTTCG ATGAGCGTGT 1980 CCGGGCTCAT CAGGGCGTAG AAGGTCGGGG TGAGCACGGT CTGCATGCCC AGCAGGTGCT 2040 CCCAGGTCAA GGTGGCGGGG TCCCGCTCGC TGAAGTCCAG GCTCCGGACG TAGTCGATGA 2100 TGTCGTGGCC CGCGTGGGTC ATGAAGTCCA CGAGGTCGAC GTCGGTGCCG ACCGGGACGG 2160 CGGTCAGCCC GGCCGCGGTG ATGTCCTCGG TGAGCGCCGG GGACGCGACC ACGCGGACCT 2220 CGTGCCCCGC CGCGCGGAAC GCCCATGCGA GGGGGACGAG GCCGAAGAGG TGGCTCTTGC 2280 TGGCCATGGA GGAGAAGACG ACGCGCATCG CGGTTACCTC AGAGCTCGAC GGGGCAGCGG 2340 TTGGTTCCCC GCAGGACGGG TGATCGGCGG CGCCGGACGA CCGGGCCGCT GGGCGTGAGT 2400 CCGGGCAGCG CCTTGGCCGC GGCCCGCAGT GCGGCGGTGG CGAGCGCGGT GACCAGCTCC 2460 TCCAGCCTGC CGGGGTGGCC GCGATGTGCC GACAGCGCGC GGTCGGCGTC GGGGCGGTCC 2520 ACGTCGAGGC GGTCGGGCTC GGCGAAGACC TCCGGGTCGC GGTTGGCCGC CGCGACGACG 2580 ACCACGACCT CCTCGCCTTC GCCGATCACG TGCTCGCCGA GCCGCACCTC TGCGGTGGCC 2640 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Ser Arg Val Ser His Ser Val Arg Ala 160 165 170 GGC GGC GCG ACC CGG ATG GAG ATC CAC TGG GTC GTG GCC GAC GCG GTG 3073 Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Trp Val Val Ala Asp Ala Val 175 180 185 AAC GGT CCG CGG CAC CAC GTG GAG CAC TAC GAG ATC ACG CTC TTC GAG 3121 Asn Gly Pro Arg His His Val Glu His Tyr Glu Ile Thr Leu Phe Glu 190 195 200 CGG CAG CAG TAC GAG AAG GCC TTC ACC GCG GCC GGT TGC GCT GTG CAG 3169 Arg Gln Gln Tyr Glu Lys Ala Phe Thr Ala Ala Gly Cys Ala Val Gln 205 210 215 220 TAC CTG GAG GGC GGA CCC TCC GGA CGC GGG TTG TTC GTC GGT GTG CGC 3217 Tyr Leu Glu Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Arg 225 230 235 GGA TGACCCGTGC GTTCGCGTTT TCCGTTCCTG GCACAGGTGA TCCGCTCCAC 3270 Gly GGGCCCTTTC CCCGCCGTGA CCGGACCCTT ACAGTGA GTG CGG GTC TTG ATC GAC 3325 Met Arg Val Leu Ile Asp 1 5 AAC GCC CGG CGG CAG CAA GCG GAG CCG TCG ACG ACA CCG CAG GGA GAG 3373 Asn Ala Arg Arg Gln Gln Ala Glu Pro Ser Thr Thr Pro Gln Gly Glu 10 15 20 TCG ATG GGT GAT CGG ACC GGC GAC CGG ACG ATT CCG GAA TCC TCG 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Ile Ile Ala Cys Ala Ser Ala Val Tyr Thr Arg Thr Ala Gly 500 505 510 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 11 : Met Asn Thr Thr Arg Thr Ala Thr Ala Gln Glu Ala Gly Val Ala Asp 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Asp Val Asp Arg Arg Ala Val Val Arg Ala Leu Ser 20 25 30 Ser Glu Val Ser Arg Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val 35 40 45 Gln Ala Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ala Ala His Tyr Gly Ala His Pro 50 55 60 Phe Thr Pro Leu Glu Gln Thr Arg Ala Arg Leu Gly Leu Asp Arg Ala 65 70 75 80 Glu Phe Ala His Leu Leu Asp Leu Phe Gly Arg Ile Pro Asp Leu Gly 85 90 95 Thr Ala Val Glu His Gly Pro Ala Gly Lys Tyr Trp Ser Asn Thr Ile 100 105 110 Lys Pro Leu Asp Ala Ala Gly Ala Leu Asp Ala Ala Val Tyr Arg Lys 115 120 125 Pro Ala Phe Pro Tyr Ser Val Gly Leu Tyr Pro Gly Pro Thr Cys Met 130 135 140 Phe Arg Cys His Phe Cys Val Arg Val Thr 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Asp Leu Gly Tyr Ala Leu 355 360 365 Glu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Glu Leu Leu Arg Ile Arg Pro 370 375 380 Glu Thr Met Arg Pro Thr Ala His Pro Gln Val Ala Val Gln Ile Asp 385 390 395 400 Leu Leu Gly Asp Val Tyr Leu Tyr Arg Glu Ala Gly Phe Pro Glu Leu 405 410 415 Glu Gly Ala Thr Arg Tyr Ile Ala Gly Arg Val Thr Pro Ser Thr Ser 420 425 430 Leu Arg Glu Val Val Glu Asn Phe Val Leu Glu Asn Glu Gly Val Gln 435 440 445 Pro Arg Pro Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Asp Gly Phe Asp Gln Ser Val 450 455 460 Thr Ala Arg Leu Asn Gln Leu Glu Arg Asp Ile Ala Asp Gly Trp Glu 465 470 475 480 Asp His Arg Gly Phe Leu Arg Gly Arg 485 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 12 : Met Ala Gly Gly Phe Glu Phe Thr Pro Asp Pro Lys Gln Asp Arg Arg 1 5 10 15 Gly Leu Phe Val Ser Pro Leu Gln Asp Glu Ala Phe Val Gly Ala Val 20 25 30 Gly His Arg 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erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..1203 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la byosynthese de la desosamine" /gene= "eryCIV" /note= "SEQ ID NO 6 DE 4837 A 6039" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: mat~peptide (B) EMPLACEMENT:! 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MOLECULE : ADN(génomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : Streptomyces antibioticus (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:184..1386 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "olePl" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1437..2714 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "glycosylation de 8,8a-desoxyoleandolide" /gene= "oleGl" /transl~except= (pos: 1437.. 1439, aa : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT:2722..3999 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "glycosylation de 8,8a-desoxyoleandolide" /gene= "oleG2" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:4810..5967 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "oleY" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: mat~peptide (B) EMPLACEMENT:184 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 15 : GCATGCCCCG CTTTCCTCCC CCTCTCCGAA CGCATCGACG ACCCGATCCC CCTCAGGGAC 60 CGGTGAAGGA GCGTGTTGCA CTCATGCAGG ACATGCAAGG CGTACAGCCC GAACCAGCCA 120 GTGTCGAACA CGCGGCGGAC GCAGCTCGAA CAGAGCGAAC GGCGCACGGA AGCCGCCCAG 180 GAG ATG GAG GAC AGC GAA CTG GGG 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1580 Ser Gln Pro Ser Leu Ser Asp Val Val Thr Gln Ala Gly Leu Thr Ser 35 40 45 GTC CCG GTG GGC ACC GAG GCT CCG GTC GAG CAG TTC GCG GCG ACC TGG 1628 Val Pro Val Gly Thr Glu Ala Pro Val Glu Gln Phe Ala Ala Thr Trp 50 55 60 GGC GAC GAT GCC TAC ATC GGC GTC AAC AGC ATC GAC TTC ACC GGC AAC 1676 Gly Asp Asp Ala Tyr Ile Gly Val Asn Ser Ile Asp Phe Thr Gly Asn 65 70 75 80 GAC CCC GGC CTG TGG ACG TGG CCG TAC CTC CTG GGC ATG GAG ACC ATG 1724 Asp Pro Gly Leu Trp Thr Trp Pro Tyr Leu Leu Gly Met Glu Thr Met 85 90 95 CTG GTG CCG GCC TTC TAC GAG TTG CTG AAC AAC GAG TCC TTC GTG GAC 1772 Leu Val Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Leu Asn Asn Glu Ser Phe Val Asp 100 105 110 GGC GTA GTC GAG TTC GCC CGT GAC TGG CGG CCC GAC CTG GTG ATC TGG 1820 Gly Val Val Glu Phe Ala Arg Asp Trp Arg Pro Asp Leu Val Ile Trp 115 120 125 GAG CCG CTG ACG TTC GCC GGC GCG GTG GCG GCG CGC GTC ACC GGC GCG 1868 Glu Pro Leu Thr Phe Ala Gly Ala Val Ala Ala Arg Val Thr Gly Ala 130 135 140 GCC CAC GCC CGG CTG CCG TGG GGG CAG GAG ATC ACC CTG CGC 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Pro Val Pro Asp Asn Val Arg Leu Val Asp Phe 290 295 300 Val Pro Leu His Ala Leu Met Pro Thr Cys Ser Ala Ile Val His His 305 310 315 320 Gly Gly Ala Gly Thr Trp Leu Thr Ala Ala Val His Gly Val Pro Gln 325 330 335 Ile Val Leu Gly Asp Leu Trp Asp Asn Leu Leu Arg Ala Arg Gln Thr 340 345 350 Gln Ala Ala Gly Ala Gly Leu Phe Ile His Pro Ser Glu Val Thr Ala 355 360 365 Ala Gly Leu Gly Glu Gly Val Arg Arg Val Leu Thr Asp Pro Ser Ile 370 375 380 Arg Ala Ala Ala Gln Arg Val Arg Asp Glu Met Asn Ala Glu Pro Thr 385 390 395 400 Pro Gly Glu Val Val Thr Val Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gly Gly 405 410 415 Arg Gly Arg Gly Gly Gly Asn His Ala Gly 420 425 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides amin s (B) TYPE : amin (D) CONFIGURATION : lin aire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 19 : Met Ser Tyr Asp Asp His Ala Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg Cys Ala 1 5 10 15 Gly Gly Asp Glu Arg Phe Leu Leu Asn Thr Val Glu Glu Trp Gly Ala 20 25 30 Ala Glu Ile Thr Ala Ala Leu Val Asp Glu Leu Leu Phe Arg Cys Glu 35 40 45 Ile Pro Gln Val Gly Gly Glu Ala Phe Ile Gly Leu Asp Val Leu His 50 55 60 Gly Ala Asp Arg Ile Ser His Val Leu Gln Val Thr Asp Gly Lys Pro 65 70 75 80 Val Thr Ser Ala Glu Pro Ala Gly Gln Glu Leu Gly Gly Arg Thr Trp 85 90 95 Ser Ser Arg Ser Ala Thr Leu Leu Arg Glu Leu Phe Gly Pro Pro Ser 100 105 110 Gly Arg Thr Ala Gly Gly Phe Gly Val Ser Phe Leu Pro Asp Leu Arg 115 120 125 Gly Pro Arg Thr Met Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ala Arg Ala Thr Asn 130 135 140 Val Val Leu His Ala Thr Thr Asn Glu Thr Pro Pro Leu Asp Arg Leu 145 150 155 160 Ala Leu Arg Tyr Glu Ser Asp Lys Trp Gly Gly Val His Trp Phe Thr 165 170 175 Gly His Tyr Asp Arg His Leu Arg Ala Val Arg Asp Gln Ala Val Arg 180 185 190 Ile Leu Glu Ile Gly Ile Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly 195 200 205 Ala Ser Leu Lys Met Trp Lys Arg Tyr Phe Pro Arg Gly Leu Val Phe 210 215 220 Gly Val Asp Ile Phe Asp Ser Arg Arg Ala Thr Ser Arg Val Ser Arg 225 230 235 240 Arg Ser Ala Ala Arg Gln Asp Asp Pro Glu Phe Met Arg Arg Val Ala 245 250 255 Glu Glu His Gly Pro Phe Asp Val Ile Ile Asp Asp Gly Ser His Ile 260 265 270 Asn Ala His Met Arg Thr Ser Phe Ser Val Met Phe Pro His Leu Arg 275 280 285 Asn Gly Gly Phe Tyr Val Ile Glu Asp Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Pro 290 295 300 Gly Tyr Gly Gly Pro Ser Gly Ala Arg Cys Pro Ser Gly Thr Thr Ala 305 310 315 320 Leu Glu Met Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Val His Tyr Glu Glu Arg 325 330 335 Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Asp Tyr Ile Ala Arg Asn Leu Val Gly 340 345 350 Leu His Ala Tyr Gln Thr Thr Ser Ser Ser Ser Arg Arg Ala Ile Asn 355 360 365 Lys Glu Gly Gly Ile Pro His Thr Val Pro Arg Glu Pro Phe Trp Asn 370 375 380 Asp Asn 385 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 738 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : lin aire(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN(g nomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : Streptomyces antibioticus (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT:1..738 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "oleM" /note= "SEQ ID NO 15 DE 3992 A 4729" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: mat~peptide (B) EMPLACEMENT : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 20 : ATG CGG GCT GAC ACG GAG CCG ACC ACC GGG TAC GAG GAC GAG TTC GCC 48 Met Arg Ala Asp Thr Glu Pro Thr Thr Gly Tyr Glu Asp Glu Phe Ala 1 5 10 15 GAG ATC TAC GAC GCC GTG TAC CGG GGC CGG GGC AAG GAC TAC GCC GGC 96 Glu Ile Tyr Asp Ala Val Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Gly 20 25 30 GAG GCG AAG GAC GTG GCG GAC CTC GTG CGC GAC CGG GTG CCG GAC GCG 144 Glu Ala Lys Asp Val Ala Asp Leu Val Arg Asp Arg Val Pro Asp Ala 35 40 45 TCC TCC CTC CTG GAC GTG GCC TGC GGC ACG GGC GCG CAC CTG CGG CAC 192 Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Thr Gly Ala His Leu Arg His 50 55 60 TTC GCC ACG CTC TTC GAC GAC GCC CGC GGT CTC GAA CTG TCC GCG AGC 240 Phe Ala Thr Leu Phe Asp Asp Ala Arg Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ser 65 70 75 80 ATG CTG GAC ATC GCC CGC TCC CGC ATG CCG GGC GTG CCG CTG CAC CAA 288 Met Leu Asp Ile Ala Arg Ser Arg Met Pro Gly Val Pro Leu His Gln 85 90 95 GGG GAC ATG CGA TCC TTC GAC CTG GGG CCA CGC GTC TCC GCG GTC ACC 336 Gly Asp Met Arg Ser Phe Asp Leu Gly Pro Arg Val Ser Ala Val Thr 100 105 110 TGC ATG TTC AGC TCC GTC GGC CAC CTG GCC ACC ACC GCC GAA CTC GAC 384 Cys Met Phe Ser Ser Val Gly His Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Asp 115 120 125 GCG ACG CTG CGG TGC TTC GCC CGG CAC ACC CGG CCC GGC GGC GTG GCC 432 Ala Thr Leu Arg Cys Phe Ala Arg His Thr Arg Pro Gly Gly Val Ala 130 135 140 GTC ATC GAA CCG TGG TGG TTC CCG GAG ACC TTC ACC GAC GGC TAC GTG 480 Val Ile Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Val 145 150 155 160 GCG GGT GAC ATC GTA CGC GTC GAC GGC CGG ACC ATC TCC CGG GTG TCC 528 Ala Gly Asp Ile Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Ile Ser Arg Val Ser 165 170 175 CAC TCG GTA CGG GAC GGC GGC GCC ACC CGC ATG GAG ATC CAC TAC GTG 576 His Ser Val Arg Asp Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Tyr Val 180 185 190 ATC GCC GAC GCC GAG CAC GGT CCC CGG CAC CTG GTC GAG CAC CAC CGC 624 Ile Ala Asp Ala Glu His Gly Pro Arg His Leu Val Glu His His Arg 195 200 205 ATC ACG CTG TTC CCG CGG CAT GCG TAC ACG GCC GCG TAC GAG AAG GCG 672 Ile Thr Leu Phe Pro Arg His Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Ala 210 215 220 GGC TAC ACC GTC GAG TAC CTC GAC GGC GGG CCC TCG GGC CGG GGG CTG 720 Gly Tyr Thr Val Glu Tyr Leu Asp Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu 225 230 235 240 TTC GTC GGC ACC CGG ACG 738 Phe Val Gly Thr Arg Thr 245 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 246 acides amin s (B) TYPE : amin (D) CONFIGURATION : lin aire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 21 : Met Arg Ala Asp Thr Glu Pro Thr Thr Gly Tyr Glu Asp Glu Phe Ala 1 5 10 15 Glu Ile Tyr Asp Ala Val Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Gly 20 25 30 Glu Ala Lys Asp Val Ala Asp Leu Val Arg Asp Arg Val Pro Asp Ala 35 40 45 Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Thr Gly Ala His Leu Arg His 50 55 60 Phe Ala Thr Leu Phe Asp Asp Ala Arg Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ser 65 70 75 80 Met Leu Asp Ile Ala Arg Ser Arg Met Pro Gly Val Pro Leu His Gln 85 90 95 Gly Asp Met Arg Ser Phe Asp Leu Gly Pro Arg Val Ser Ala Val Thr 100 105 110 Cys Met Phe Ser Ser Val Gly His Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Asp 115 120 125 Ala Thr Leu Arg Cys Phe Ala Arg His Thr Arg Pro Gly Gly Val Ala 130 135 140 Val Ile Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Val 145 150 155 160 Ala Gly Asp Ile Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Ile Ser Arg Val Ser 165 170 175 His Ser Val Arg Asp Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Tyr Val 180 185 190 Ile Ala Asp Ala Glu His Gly Pro Arg His Leu Val Glu His His Arg 195 200 205 Ile Thr Leu Phe Pro Arg His Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Ala 210 215 220 Gly Tyr Thr Val Glu Tyr Leu Asp Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu 225 230 235 240 Phe Val Gly Thr Arg Thr 245 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 22 : TCCTCGATGG AGACCTGCC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 23 : GAGACCATGC CCAGGGAGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 19paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc * "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24 : TCTGGGAGCC GCTCACCTT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 25 : GACGAGGCCG AAGAGGTGG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 26 : GCACACCGGA ATGGATGCG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 27 : CCGTCGAGCT CTGAGGTAA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 28 : GCCCGAGCCG CACGTGCGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 29 : TGCACGCGCT GCTGCCGACC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 30 : TTGGCGAAGT CGACCAGGTC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 31 : GCCGCTCGGC ACGGTGAACT TCA 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple - (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 32 : ATGCGCGTCG TCTTCTCCTC CATG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 33 : TCATCGTGGT TCTCTCCTTC C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 34 : GGAATTCATG ACCACGACCG ATC 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 28 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 35 : CGCTCCAGGT GCAATGCCGG GTGCAGGC 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 36 : GATCACGCTC TTCGAGCGGC AG 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 37 : GAACTCGGTG GAGTCGATGT C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 38 : GTTGTCGATC AAGACCCGCA C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 39 : CATCGTCAAG GAGTTCGACG GT 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 40 : TGCGCAGGTC CATGTTCACC ACGTT 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 20 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 41 : GCTACGCCCT GGAGAGCCTG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 21 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 42 : GTCGCGGTCG GAGAGCACGA C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 43 : GCCAGCTCGG CGACGTCCAT C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 44 : CGACGAGGTC GTGCATCAG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 45 : AATTGATCAA GGTGAACACG GTCATGCGCA GGATCCTCGA GCGGAACTCC ATGGGG 56 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 46 : CCCCATGGAG TTCCGCTCGA GGATCCTGCG CATGACCGTG TTCACCTTGA TCAATT 56 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 47 : AACTCGGTGG AGTCGATGTC GTCGCTGCGG AA 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 48 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc= "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 48 : CAATATAGGA AGGATCAAGA GGTTGAC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 49 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 39 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc= "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 49 : TCCGGAGGTG TGCTGTCGGA CGGACTTGTC GGTCGGAAA 39 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 50 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 50 : AGGAGCACTA GTGCGGGTAC TGCTGACGTC CTT 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 51 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 51 : GGGGGATCCC ATATGCGGGT ACTGCTGACG TCCTTCG 37 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 52 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 52 : GAAAAGATCT GCCGGCGTGG CGGCGCGTGA GTTCCTC 37 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 53 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 27 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 53 : AGCGGCTTGA TCGTGTTGGA CCAGTAC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 27 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 54 : GGCCTATGTG GACTACGTGT TGAACGT 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 55 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc * "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 55 : AACGCCTCGT CCTGCAGCGG AGACACGAAC A 31 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 56 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 56 : TTCGCTCCCC GATGAACACA ACTCGTA 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 57 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 57 : GAAGGAGATA TACATATGCG CGTCGTCTTC TCCTC 35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 58 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 58 : CGGGATCCTC ATCGTGGTTC TCTCCTTCCT GC 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 59 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 59 : CGGGTACCAT GCGCGTCGTC TTCTCCTCCA TG 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 60 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 60 : CGGGTACCTC ATCGTGGTTC TCTCCTTCC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 61 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 13 acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : Peptide (B) EMPLACEMENT:1..13 (D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQ ID NO 11 DE 38 A 50" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 61 : Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gln Ala 1 5 10 REVENDICATIONS 1) Utilisation de la séquence d'ADN eryCIII représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues responsables de la glycosylation de la macrolactone chez une souche productrice de macrolide. 2) Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle les gènes homologues sont les gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus. 3) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15) correspondant à une région du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine comprenant : - la séquence correspondant à l'ORF oleP1 du nucléotide 184 au nucléotide 1386, - la séquence correspondant à l'ORF oleGl du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleG2 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleM du nucléotide 3992 au nucléotide 4720 (= séquence de SEQ ID N 20) et - la séquence correspondant à l'ORF oleY du nucléotide 4810 au nucléotide 5967. 4) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 choisie parmi la séquence correspondant à l'ORF oleGl (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase et la séquence correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité glycosyltransférase. 5) Séquence d'ADN isolée selon la revendication 4 correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) codant pour une activité désosaminyltransférase. 6) Séquence d'ADN isolée selon la revendication 4 correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité oléandrosyltransférase. 7) Polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 et ayant une activité désosaminyltransférase (séquence de SEQ ID N 17). 8) Polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 et ayant une activité oléandrosyltransférase (séquence de SEQ ID N 18). 9) Procédé de préparation de précurseurs de l'oléandomycine chez S. antibioticus dans lequel - on crée une altération de la séquence du gène choisie parmi la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) dans le chromosome d'une souche hôte et obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant l'accumulation des précurseurs de l'oléandomycine et - on isole ces précurseurs. 10) Procédé selon la revendication 9 dans lequel l'altération est créée dans la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et dont il résulte au moins l'élimination de l'activité désoaminyltransférase et l'accumulation du précurseur de l'oléandomycine 8,8a-désoxyoléandolide.