Brevet FR2793260A1 — publié le 20001110

Procédé et dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides La présente invention concerne le domaine de l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à haut débit, à partir de prélèvements biologiques non liquides, à l'état naturel ou entrant dans des préparations par exemple alimentaires. On connaît dans l'état de la technique différents procédés d'extraction d'acides nucléiques et de protéines à partir de prélèvements non liquides mettent en jeu une première étape de broyage de l'échantillon, par des procédés divers tels pilage, ultrasons, haute pression... Il est intéressant, pour des échantillons mous, de les broyer à très basse température. En effet, cela diminue les risques de dégradation des macromolécules et facilite l'éclatement des cellules et donc améliore le rendement des extractions. Il s'en suit différents traitements de l'échantillon, qui visent à le laver, à supprimer les membranes cellulaires et à éliminer les produits non voulus. La première étape n'étant pas systématiquement mise en oeuvre. Le procédé faisant l'objet de la demande de brevet comporte les étapes suivantes: Il consiste, après broyage à basse température, (température inférieure à la température ambiante) par des procédés divers, simultanément, d'un nombre d'échantillons, à ajouter automatiquement et avec un temps d'attente minimal, un volume suffisamment précis de liquide/s, à chaque échantillon broyé, tout en contrôlant la température du broyat, du/des liquide/s et du mélange et à homogénéiser chaque mélange. L'un des liquides peut de préférence être un tampon de lyse des parois cellulaires et plus précisément, un tampon de lyse dénaturant. 2 2793260 Il s'agit en particulier d'éviter que les agents de dégradation des macro-molécules puissent agir, tout en permettant l'écoulement du/des liquide/s, même si le broyage a eu lieu à très basse température (inférieure à 0 C) Il s'agit de limiter les risques de contamination des personnes, par des virus, par exemple et de diminuer la perte de matériel biologique qui adhérerait aux pièces de broyage. Il permet le traitement plusieurs échantillons simultanément, et l'enchaînement des opérations et leur automatisation. Le dispositif préféré, décrit à titre d'exemple est constitué des éléments suivants: * L'équipement de broyage de base, qui est dédié aux échantillons végétaux, pour lesquels seules les protéines comptent, (Voir description du Equipement de broyage en annexe) auquel est ajouté: * Un dispositif constitué d'un réseau de buses, chacune étant située au voisinage de la tige de chaque pilon, communicant par des cathéters avec le/les réservoir/s du/des liquide/s à distribuer. Les réservoir peuvent être maintenus à des températures définies. Le/les liquides peuvent s'écouler par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes et le volume distribué réglé grâce à des cathéters de longueur et de diamètre précis, en jouant sur la durée d'ouverture des électrovannes. Une autre solution est par exemple d'aspirer et de refouler le/les liquides au moyen de pompes de précision. Dans ce cas il est facile de purger les cathéters. Les tiges de pilons servent de guide à l'écoulement du/des liquides vers les échantillons. * Des dispositifs de chauffage régulés, qui peuvent être des résistances noyées dans le plateau porte tubes du Équipement de broyage et/ou des rampes à infrarouge disposées autour de l'espace de travail. * Accessoirement, une plaque rigide, traversée par les tiges des pilons peut être rajoutée au dispositif préféré, pour couvrir chaque échantillon dans son conteneur, pendant le broyage, afin d'éviter des contaminations croisées. Cette plaque, grâce aux fraisages de chaque passage de tige de pilon sur la partie supérieure, favorise l'écoulement uniforme du/des liquides dans chaque conteneur d'échantillon, autour des pilons et contribue à les débarrasser des fragments adhérents. L'automate programmable qui contrôle l'équipement de broyage contrôle également les écoulements de liquide, les températures et le verrouillage de la plaque rigide. La présente invention concerne en particulier un dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour permettre l'écoulement du ou des liquides par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes. 4 2793260 REVENDICATIONS 1 - Procédé d'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - broyage à température inférieure à la température ambiante - par des procédés divers, simultanément, d'un nombre d'échantillons, - ajout automatique d'au moins un liquide à chaque échantillon broyé, - contrôle de la température du broyat, du/des liquide/s et du mélange et à homogénéiser chaque mélange. 2 - Procédé d'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'un des liquides est constitué par un tampon de lyse des parois cellulaires et plus précisément, un tampon de lyse dénaturant. 3 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides préféré, caractérisé en ce qu'il comprend * un équipement de broyage de base, qui est dédié aux échantillons végétaux, pour lesquels seules les protéines comptent, * Un dispositif constitué d'un réseau de buses, chacune étant située au voisinage de la tige de chaque pilon, communicant par des cathéters avec le/les réservoir/s du/des liquide/s à distribuer. Les réservoir peuvent être maintenus à des températures définies. 4 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour permettre l'écoulement du ou des liquides par gravité, lors de l'ouverture d'électrovannes. - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend des pompes et des moyens de purge des cathéters. 6 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il en outre des dispositifs de chauffage régulés. 7 - Dispositif pour l'extraction d'ADN, d'ARN et de protéines à partir de prélèvements biologiques non liquides selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il en outre une0 plaque rigide, traversée par les tiges des pilons peut être rajoutée au dispositif préféré, pour couvrir chaque échantillon dans son conteneur, pendant le broyage, afin d'éviter des contaminations croisées.