Brevet FR2790006A1 — publié le 20000825

! La présente invention concerne le domaine technique du dénombrement de bactéries au sens général, présentant notamment un arrangement complexe, adhérentes à un support et observées à l'aide d'un microscope. Dans de nombreux domaines techniques, notamment dentaire, agro- alimentaire ou médical, il apparaît le besoin de pouvoir dénombrer les bactéries, afin de déceler leur présence ou de comprendre les mécanismes intervenant lors de l'adhésion bactérienne. Par exemple, dans le domaine dentaire, l'adhésion bactérienne sur les surfaces dentaires est à l'origine de la formation d'un biofilm: la plaque dentaire, responsable du développement des caries dentaires, de maladies paro- dentales, ainsi que de l'altération des restaurations dentaires. Parmi les 500 taxons bactériens présents dans la plaque dentaire, seules les bactéries pionnières ont la capacité de se fixer directement et durablement sur les surfaces dures de la cavité buccale. Il s'agit principalement des streptocoques oraux et des actinomyces. De nombreuses études de dénombrement des bactéries ont été décrites dans la littérature, notamment sur des surfaces solides. Les principales méthodes actuelles sont basées sur l'observation directe des bactéries adhérentes sur un support, par exemple par microscopie à contraste de phase, par microscopie en épifluorescence, par microscopie confocale à balayage laser, par marquage radioactif ou par microscopie électronique à balayage. Le comptage direct par microscopie en épifluorescence, d'échantillons colorés à l'acridine orange est le plus largement utilisé depuis plusieurs années en raison de sa relative simplicité et de la bonne reproductibilité des résultats. Ces méthodes de dénombrement sont de plus en plus souvent couplées à des techniques d'analyse d'images prises par une caméra, ce qui permet de réduire considérablement le temps d'analyse et de palier à la subjectivité liée à l'interprétation de la personne chargée du comptage. Ces méthodes d'analyse d'images reposent sur la qualité des images obtenues permettant la séparation des bactéries par rapport au support, afin de permettre leur dénombrement. Toutefois, il doit être considéré que ces méthodes concernent principalement l'observation de bactéries simples très individualisées et en faible nombre. Ainsi, les méthodes connues ne permettent pas de pouvoir compter des bactéries adhérant en grand nombre sur un support, fortement associées entre elles comme les streptocoques qui se présentent en diplocoques ou en chaînettes. De même, de telles méthodes ne permettent pas d'assurer un dénombrement pour des bactéries, telles que les actinomyces bacilles polymorphes susceptibles de présenter, en outre, des arrangements complexes. De plus, il doit être constaté que les méthodes de dénombrement connues pour dénombrer des bactéries adhérentes sont souvent très spécifiques des organismes dénombrés et du type de préparation, ce qui les rend très difficile à appliquer à d'autres travaux. L'objet de l'invention vise donc à remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un procédé de comptage des bactéries adhérentes sur un support, conçu pour permettre le dénombrement de bactéries même fortement associées et présentant des formes variables, et des arrangements complexes. Pour atteindre cet objectif, le procédé selon l'invention est du type consistant: - à rendre visibles les bactéries du support afin de les observer à l'aide d'un microscope et d'en prendre une image à l'aide d'une caméra, - et à dénombrer les bactéries à partir des tâches lumineuses apparaissant sur l'image. Selon l'invention, le procédé de comptage de bactéries adhérentes à un support et présentant un arrangement complexe consiste: - à déterminer un ou plusieurs morphotypes donnés de bactéries dans chacun desquels les bactéries présentent une forme analogue, - à définir, pour chaque morphotype de bactéries, des caractères lumineux donnés correspondant à des points caractéristiques de lumière, - à sélectionner une image sur laquelle apparaissent les tâches lumineuses correspondant à un morphotype de bactéries, - à rechercher sur l'image, les points caractéristiques de lumière correspondant au morphotype de bactéries, - et à compter ces points caractéristiques de lumière en vue de dénombrer les bactéries qui adhérent au support. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite cidessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation et de mise en oeuvre de l'objet de l'invention. La fig. 1 est un schéma illustrant un dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé de comptage de bactéries conforme à l'invention. Les fig. 2A à 21 sont des images permettant d'illustrer les différentes phases caractéristiques de comptage de bactéries du type cocci. Les fig. 3A à 3Q sont des images permettant d'illustrer le procédé de comptage de bactéries du type bacille. La fig. 1 illustre un dispositif 1 adapté pour permettre le dénombrement de bactéries adhérentes sur un support 2 au sens général. Le dispositif 1 comporte un microscope 3 d'observation des bactéries. Dans un exemple préféré de réalisation, le microscope 3 est du type à épifluorescence et comporte une lampe à fluorescence 4 fournissant un faisceau lumineux incident 5 destiné à rendre visibles ou lumineuses les bactéries placées sur le support 2. Le faisceau lumineux incident 5 est renvoyé par un élément optique 6 pour traverser un objectif 7 avant d'atteindre le support 2. Le faisceau lumineux réfléchi 8 par le support 2 et traversant l'objectif 7 est récupéré par une caméra CCD 9, reliée à une unité 10 permettant l'acquisition des images, ainsi que l'analyse des images prises, afin d'assurer le comptage des bactéries. Il est à noter que les bactéries pourraient être rendues visibles par d'autres moyens, tels que par exemple par un procédé de microscopie à contraste de phase. Conformément à l'objet de l'invention, le procédé permet de dénombrer, sur une image, des bactéries fortement associées présentant une forme analogue. Ainsi, il est défini un premier morphotype de bactéries I, de type rond, correspondant à des cocci. Tel que cela ressort de la fig. 2A, les bactéries I appartenant à ce premier morphotype, telles que des streptocoques, présentent une propension à être associées en chaînette. Dans le même sens, il peut être défini, par exemple, un deuxième morphotype de bactéries I1, du type en bâtonnet, correspondant à des bacilles. Tel que cela ressort plus précisément de la fig. 3A, les bactéries II appartenant à ce deuxième morphotype, telles que des actinomyces, sont susceptibles d'être associées entre elles pour constituer des objets polymorphes. Conformément à l'invention, le procédé consiste à définir, pour chaque morphotype de bactéries, des caractères lumineux donnés correspondant à des points caractéristiques de lumière. En d'autres termes, pour chaque type de morphotype de bactéries, il est défini une signature lumineuse permettant de reconnaître les bactéries appartenant à chaque morphotype. Le procédé consiste ensuite à sélectionner sur une image, les tâches lumineuses correspondant à un morphotype donné de bactéries. Il est ensuite procédé à une recherche sur cette image des points caractéristiques de lumière correspondant aux morphotypes de bactéries. Ces points caractéristiques de lumière sont ensuite comptés, en vue de permettre de dénombrer les bactéries adhérentes au support 2. La description qui suit donne un exemple de réalisation d'un procédé de comptage pour le premier morphotype de bactéries I, du type en rond. Le principe de comptage pour ce premier morphotype de bactéries repose sur la détection des maxima de luminosité apparaissant sur une image. La fig. 2A montre une image brute A, prise par la caméra d'une partie du support 2 sur lequel apparaissent uniquement des bactéries I relevant du premier morphotype, telles que des streptocoques. A partir de l'image brute AI, le procédé consiste à éliminer les défauts d'éclairage par la mise en oeuvre d'une opération dite chapeau de forme, permettant d'obtenir une image BI (fig. 2B) suivie d'une opération permettant d'augmenter le contraste, en vue d'obtenir une image, dite en gris traité, Ci (fig. 2C). A partir de cette image en gris traité Ci, il est procédé à une opération de seuillage permettant de conserver les tâches lumineuses dépassant un niveau de gris déterminé, en vue d'obtenir une image dite binaire Di (fig. 2D). Ainsi, tous les points lumineux dépassant un niveau de gris donné apparaissent en blanc, tandis que les points lumineux en dessous de ce niveau de gris apparaissent en noir. De préférence, cette image binaire Di est améliorée en éliminant le bruit de fond en appliquant un filtre binaire médian (image El - fig. 2E) et en lissant les contours des tâches lumineuses en réalisant une légère ouverture, afin d'obtenir une image FI (fig. 2F), dite binaire améliorée. Ces opérations de traitement d'images sont classiques en la matière, afin d'améliorer la qualité des images prises. A partir de l'image en gris traité Ci, le procédé consiste à déterminer tous les maxima en niveau de gris apparaissant sur cette image. Tel que cela apparaît plus précisément à la fig. 2G, une telle image G, est constituée par une série de points lumineux correspondant à des maxima de luminosité. La sélection des maxima de luminosité sur l'image permet de déceler individuellement les bactéries, même si elles se trouvent accolées, dans la mesure o entre deux bactéries accolées, apparaît une zone de moindre luminosité. Le procédé consiste ensuite à assurer une intersection entre l'image binaire améliorée FI et l'image des maxima G, permettant de faire apparaître sur une image Hl (fig. 2H), les maxima des seuls objets sélectionnés. L'intersection de l'image des maxima G, avec l'image binaire améliorée FI permet d'éliminer sur l'image des maxima, les points lumineux correspondant à des parasites. Sur l'image finale Hl apparaissent ainsi uniquement les points lumineux correspondant chacun à une bactérie. Le comptage des points lumineux individuels donne directement le nombre de bactéries 1. Selon une variante préférée de réalisation, il peut être prévu de vérifier que chacun de ces points correspond effectivement à une bactérie. Selon cette variante, le procédé consiste à reconstruire les maxima de l'image finale Hl dans l'image binaire améliorée Fl. Il peut être ainsi obtenu une image de vérification Il (fig. 2I) montrant les bactéries individualisées. La description qui suit montre un exemple d'un procédé de comptage d'un deuxième morphotype de bactéries II en bâtonnets, tel que des actinomyces. Ce procédé de comptage vise essentiellement à déterminer les caractères lumineux correspondant à ce deuxième morphotype et correspondant, d'une part, aux points lumineux d'extrémités d'une tâche lumineuse en forme de bâtonnet et, d'autre part, au point d'intersection entre deux bâtonnets. Ce procédé consiste à analyser une image, telle que A2 (fig. 3A), d'une partie d'un support 2 sur lequel apparaissent uniquement des bactéries II relevant du deuxième morphotype. A partir de cette image brute A2, le procédé consiste à éliminer les défauts d'éclairage par une opération, dite chapeau haut de forme (image B2 - fig. 3B) et à augmenter le contraste de cette image B2, en vue d'obtenir une image C2 (fig. 3C), dite en gris traité. Tel que cela apparaît sur cette fig. 3C, la luminosité d'une bactérie varie selon sa longueur. Aussi, à partir de cette image en gris C2, le procédé effectue une première opération de seuillage (fig. 3D) permettant de conserver les tâches lumineuses dépassant un niveau de gris haut, en vue d'obtenir une image à seuil haut D2. Le procédé vise également à effectuer une deuxième opération de seuillage permettant de conserver les tâches lumineuses dépassant un niveau de gris faible, inférieur au niveau de gris haut, en vue d'obtenir une image à seuil bas E2 (fig. 3E). Il doit être considéré que l'image D2 permet de sélectionner uniquement les tâches lumineuses correspondant à des bactéries souvent incomplètes, alors que l'image E2 comprend les tâches lumineuses correspondant aux bactéries complètes associées à du bruit de fond ou à des parasites. Aussi, à partir de l'image à seuil haut D2, il est procédé à une reconstruction des tâches lumineuses apparaissant sur cette image en les prolongeant dans les limites des tâches lumineuses apparaissant sur l'image à seuil bas E2. Il est obtenu ainsi une image F2 (fig. 3F), dite seuillée, permettant d'obtenir les bactéries entières sans bruit de fond. Toutefois, sur cette image, il apparaît des bactéries qui sont enchevêtrées ou contiguës, de sorte qu'un comptage des tâches lumineuses ne permettrait pas d'assurer un dénombrement correct. Conformément à l'invention, le procédé consiste, à partir de l'image dite seuillée F2, à déterminer la ligne médiane de chaque tâche lumineuse, en vue d'obtenir une image dite de lignes médianes G2 (fig. 3G). Cette image G2 fait apparaître les bactéries sous la forme de squelettes ou de segments de lignes. Or, il apparaît des ruptures sur certains segments de lignes, de sorte qu'il est procédé à une reconstruction de ces lignes. Ainsi, à partir de cette image dite de lignes médianes G2, le procédé consiste à sélectionner les points d'extrémités des segments, en vue d'obtenir une image correspondante de points sélectionnés H2 (fig. 311). Le procédé consiste, ensuite, à rassembler les points d'extrémités voisins, en vue d'obtenir une image de points d'extrémités rassemblés 12 (fig. 31). Le procédé consiste ensuite à ajouter à cette image de points d'extrémités 12, l'image des lignes médianes G2, en vue d'obtenir une image J2 (fig. 3J) dont les lignes médianes de chaque tâche lumineuse, sont déterminées en vue d'obtenir une image à squelettes K2 (fig. 3K). A partir de cette image à squelettes K2, Il peut être prévu de dénombrer les bactéries à partir du comptage des points d'extrémités des segments et des points d'intersection entre deux segments. Toutefois, afin d'améliorer la qualité du comptage, le procédé selon l'invention vise à éliminer sur l'image à squelettes K2, les segments présentant une longueur inférieure à une valeur de seuil donnée, de sorte qu'une image, dite ébarbulée L2, est obtenue (fig. 3L). En effet, les segments de lignes présentant une faible valeur de seuil et s'étendant latéralement par rapport à des segments de longueur plus importante, sont appelés, par la suite, barbules. Ces segments de lignes ou barbules, éliminés de l'image L2, apparaissent sur une image complémentaire M2 (fig. 3M). Toutefois, sur cette image M2 apparaissent aussi les extrémités des segments qui ont été rognées lors de l'enlèvement des barbules. Afin de distinguer les barbules des extrémités rognées des segments, le procédé consiste, à partir de l'image à squelettes K2, à déterminer les points triples, c'est-à-dire les points d'intersection entre deux segments et, notamment entre une barbule et un segment de plus grande longueur. La fig. 3N montre une image N2 comportant les points obtenus après un tel traitement. Il est ensuite procédé à une intersection entre cette image de points triples N2 avec l'image M2, de manière à éliminer les extrémités rognées des segments et à conserver uniquement les barbules. La fig. 30 illustre une image 02 dite de barbules obtenue après un tel traitement. La soustraction de cette image de barbules 02 à l'image complémentaire M2, permet d'obtenir une image P2 (fig. 3P) sur laquelle apparaissent uniquement les extrémités rognées des segments. Cette image P2 est ajoutée à l'image ébarbulée L2, afin de reconstruire les segments. La fig. 3Q montre une image finale des segments entiers Q2 obtenue après un tel traitement. Le dénombrement des bactéries est effectué à partir du comptage des points d'extrémités des segments et des points triples, c'est-à-dire des points d'intersection entre deux segments. A partir du comptage de ces points caractéristiques, il peut être déduit le nombre de bactéries relevant du deuxième morphotype et égal au nombre de points d'extrémités divisé par 2, ajouté au nombre de points triples comptés, divisé par 4. Un tel dénombrement permet de constater qu'un tel comptage aboutit à un résultat analogue à un dénombrement réalisé de manière visuelle. Bien entendu, le procédé décrit ci-dessus, à partir d'une image prise sur une partie du support 2, peut être appliqué sur un nombre déterminé d'images brutes prises pour couvrir la totalité du support 2. De même, dans la description qui précède, le procédé a été décrit en relation d'images intermédiaires permettant d'illustrer le procédé de traitement d'images à la suite d'opérations de traitement déterminées. Bien entendu, il doit être considéré que le procédé de traitement d'images peut être effectué sans avoir recours à l'établissement des images intermédiaires. Ainsi, le terme "image" doit être compris comme correspondant à un ensemble de données caractérisant le traitement d'images à un instant déterminé. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés, car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS: 1 - Procédé de comptage de bactéries adhérentes à un support (2) et présentant un arrangement complexe, du type consistant: - à rendre visibles les bactéries du support afin de les observer à l'aide d'un microscope (3) et d'en prendre une image à l'aide d'une caméra (9), - et à dénombrer les bactéries à partir des tâches lumineuses apparaissant sur l'image, caractérisé en ce qu'il consiste: - à déterminer un ou plusieurs morphotypes donnés de bactéries (I, II) dans chacun desquels les bactéries présentent une forme analogue, - à définir, pour chaque morphotype de bactéries (I, H), des caractères lumineux donnés correspondant à des points caractéristiques de lumière, - à sélectionner une image sur laquelle apparaissent les tâches lumineuses correspondant à un morphotype de bactéries, - à rechercher sur l'image, les points caractéristiques de lumière correspondant au morphotype de bactéries, - et à compter ces points caractéristiques de lumière en vue de dénombrer les bactéries qui adhèrent au support. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste, pour un morphototype de bactéries (I) en rond, à définir des caractères lumineux correspondant à des maxima de luminosité apparaissant sur l'image. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste: à partir de l'image brute (2A), à éliminer les défauts d'éclairage et à augmenter le contraste en vue d'obtenir une image dite en gris traité (CI), - à partir de l'image en gris traité (2C), à effectuer une opération de seuillage permettant de conserver les tâches lumineuses dépassant un niveau de gris déterminé, en vue d'obtenir une image dite binaire (DI), qui est améliorée en vue d'obtenir une image binaire traitée (FI), - à partir de l'image dite en gris traité (CI), déterminer tous les maxima de luminosité apparaissant sur l'image, - à procéder à l'intersection de l'image binaire traitée (FI) avec l'image comportant les maxima permettant de faire apparaître des points lumineux appartenant aux seules bactéries, - et à compter les points lumineux individuels correspondant au nombre de bactéries. 4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste pour un morphotype de bactéries (Il) en bâtonnet, à définir des caractères lumineux correspondant, d'une part, aux points lumineux d'extrémités d'une tâche lumineuse en forme de bâtonnet et, d'autre part, aux points d'intersection entre deux bâtonnets. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste: - à partir de l'image brute (3A) prise par la caméra (9), à éliminer les défauts d'éclairage et à augmenter le contraste en vue d'obtenir une image dite en gris traité (3C), - à partir de l'image en gris traité (3C), à effectuer une première et une deuxième opérations de seuillage permettant de conserver les tâches lumineuses dépassant un niveau de gris respectivement haut et faible en vue d'obtenir une image à seuil haut (D2) et une image à seuil bas (E2), - à partir de l'image à seuil haut (D2), les tâches lumineuses sont prolongées à partir des tâches lumineuses de l'image à seuil bas (E2), en vue d'obtenir une image dite seuillée (F2), à partir de l'image dite seuillée (F2), à déterminer la ligne médiane de chaque tâche lumineuse, en vue d'obtenir une image de lignes médianes (G2), - à partir de l'image de lignes médianes (G2), à sélectionner les points d'extrémités des segments et à rassembler les points d'extrémités voisins, en vue d'obtenir une image de points d'extrémités rassemblés (12), - et à reconstruire, à partir de l'image des lignes médianes (G2) et de l'image des points d'extrémités rassemblés (I2), une image dont les lignes médianes de chaque tâche lumineuse sont déterminées en vue d'obtenir une image à squelettes (K2), à partir de laquelle peuvent être dénombrées les bactéries en bâtonnet. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste: à partir de l'image à squelettes (K2), d'une part, à éliminer les segments présentant une longueur inférieure à un seuil donné, afin d'obtenir une image ébarbulée (L2) et une image complémentaire (M2) et, d'autre part, à déterminer les points d'intersection entre deux segments associés, de manière, à partir de l'image complémentaire (M2), à obtenir une image de barbules (02), - à soustraire à l'image complémentaire (M2), l'image de barbules (O2), afin d'obtenir une image des extrémités (P2) qui est ajoutée à l'image ébarbulée (L2), en vue d'obtenir une image des segments entiers (Q2), - et à partir de l'image des segments entiers (Q2), à compter les points d'extrémités et les points triples des segments, de manière à en déduire le nombre de bactéries égal au nombre des points d'extrémités divisé par 2 ajouté au nombre des points triples divisé par 4. 7 - Dispositif pour le comptage de bactéries adhérentes à un support (2), caractérisé en ce que 'il comporte: - des moyens (4) pour rendre visibles les bactéries (I, II), - un microscope d'observation (3) des bactéries, une caméra (9) de prise d'images des bactéries observées par le microscope (3), - et une unité (10) d'acquisition et d'analyse des images prises par la caméra et comportant des moyens d'analyse permettant la mise en oeuvre du procédé de comptage selon l'une des revendications 1 à 6. 8 - Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que les moyens (4) pour rendre visibles les bactéries sont une lampe à fluorescence.