Brevet FR2791894A1 — publié le 20001013

La présente invention concerne l'utilisation d'interféron f3 pour le traitement du sarcome d'Ewing. La famille des tumeurs d'Ewing (EWS) représente le deuxième type de tumeur osseuse, après l'ostéosarcome, observé chez les jeunes enfants mais surtout chez l'adolescent et l'adulte jeune. De récentes données concernant son histogénèse suggèrent que son origine est neurale. Cette origine le relierait à une tumeur plus différenciée, le neuroépithéliome d'origine neuroectodermale primitive (pPNET). Ces deux tumeurs présentent la même In translocation chromosomique 11/22. Plus particulièrement, dans environ 80 % des cas, les cellules d'Ewing présentent une translocation chromosomique équilibrée entre les chromosomes 11 et 22, t(11;22)(q24;q12). Cette translocation chromosomique aboutit à la fusion de l'extrémité 5' du gène EWS, codant pour une protéine susceptible d'intervenir dans le métabolisme des ARNs, avec la partie 3' du gène Fli-1, un membre de la famille des facteurs de transcription de type Ets (Delattre et ai, 1992, Nature, 359:162-165). En fonction de la position des points de cassure (entre les exons 7 à 11 d'EWS et les exons 3 à 9 de Fli-1), des gènes de fusion variables peuvent être générés. La fusion la plus fréquente, EWS-Fli-1 de type 1, lie l'exon 7 de EWS avec I'exon 6 de Fli-1 et représente 50 % des cas. La fusion de type 11(25 % des cas) lie 'exon 7 de EWS avec 'exon 5 de Fli-1. En dehors de ces deux types principaux de fusion, une dizaine d'autres combinaisons ont été décrites. Dans certains cas de tumeurs d'Ewing, EWS n'est pas fusionné à Fli-1, mais à l'un ou l'autre des quatre autres membres de la famille Ets que sont ERG, ETV, E1AF ou FEV. Ces différentes altérations génétiques aboutissent à une conséquence biochimique constante: les cellules d'Ewing expriment toujours une protéine chimérique qui contient la partie N-terminale d'EWS fusionnée avec l'un ou l'autre des domaines de liaison à l'ADN des protéines de la famille Ets. Cette constance suggère que cette fusion exerce un rôle central dans le développement de la tumeur d'Ewing. Dans la tumeur d'Ewing, le rôle de la protéine de fusion EWS/Fli-1 a été démontré expérimentalement cette protéine peut transformer des fibroblastes de souris, et ces cellules sont capables de former des tumeurs chez les souris Nude. Par des expériences in vitro, il a été démontré que la protéine EWS/Fli-1 était capable d'activer la transcription de certains gènes de manière beaucoup plus efficace que la protéine Fli-1. Ceci suggère que cette protéine de fusion EWS/Fli-1 exerce ses actions oncogènes par l'intermédiaire de l'activation anormale de certains gènes cellulaires. Il a été par ailleurs montré que la protéine PU-1, autre protéine de la famille Ets, est impliquée dans le contrôle de l'expression de gènes régulés par les interférons (IFNs) et les cytokines (Perez et al, 1994, Mol. Cell. Biol., I Il a été rapporté qu'un traitement d'une lignée cellulaire obtenue à partir d'un sarcome d'Ewing, avec l'interféron u, induit une inhibition de la croissance cellulaire in vitro (Rosolen et ai, 1997, Modem Pathology, 10:55- 61). Les auteurs de la présente invention ont maintenant montré que l'interféron 3, qui se lie au même récepteur que l'interféron oa mais qui est connu pour exercer des activités différentes (Runkel et ai, 1998, the Journal of Biological Chemistry, 14:8003-8008), présente une action antiproliférative sur les tumeurs d'Ewing. Ils ont plus particulièrement montré que l'action antiproliférative de l'IFN-3 sur les cellules dérivées des tumeurs d'Ewing in vitro était nettement supérieure à celle de l'IFN-E. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'interféron 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du sarcome d'Ewing. La présente invention fournit également une méthode de traitement thérapeutique du sarcome d'Ewing, dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement une dose thérapeutiquement efficace d'un interféron 3 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Tout interféron f3 peut être utilisé conformément à la présente invention. On peut notamment utiliser un IFN-3 naturel (par exemple celui commercialisé par FRONE par Ares-Serono) ou un IFN-3 recombinant, tel qu'un interféron 13-1la (par exemple celui commercialisé sous le nom de REBIF par Ares-Serono ou celui commercialisé sous le nom AVONEX par Biogen, qui sont des interférons recombinants glycosylés produits dans des cellules de mammifères) ou un interféron 13-1lb (par exemple celui commercialisé sous le nom BETASERON par Schering AG ou BETAFERON par Berlex/Chiron). De manière préférentielle, on peut utiliser un IFN 13-1a glycosylé. L'interféron 13 peut par exemple être avantageusement administré io à un patient ayant subi un acte chirurgical. Conformément à la présente invention, I'interféron f3 peut être administré seul ou en association avec tout agent efficace contre le développement du sarcome, de manière simultanée ou séquentielle. Les modes d'administration, les posologies et les formes galeniques peuvent être déterminés de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la tolérance au traitement, etc. Une composition pharmaceutique comprenant de l'interféron 13, 2) utile selon l'invention, peut être notamment administrée par voie parentérale, intraveineuse, intermusculaire, sous- cutanée ou percutanée, ou orale. Une injection systémique est préférée, mais une injection dans la tumeur même peut également être avantageusement utilisée. Une dose de 1.106 à 90.106 unités internationales (UI), de préférence 1.106 à 45.106 unités internationales (Ul) peut par exemple être avantageusement administrée. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. LEGENDE DES FIGURES: La figure 1 représente le pourcentage d'inhibition de la croissance des diverses lignées cellulaires traitées avec l'IFN-ci, 13 ou , en concentration identique. La figure 2 représente le pourcentage d'inhibition de la croissance des cellules EW-7 traitées avec des doses croissantes d'lFN-cL, f3 ou y. La figure 3 représente l'effet de l'IFN-13 sur le développement des tumeurs d'Ewing générées par injection sous-cutanée, à des souris, de cellules o EW-7. Les volumes relatifs des tumeurs (RTV) sont mesurés au cours du temps. La figure 4 est une courbe de croissance des tumeurs d'Ewing greffées chez les souris Nude, après injection de l'IFN-P3. La moyenne des volumes relatifs des tumeurs (RTV) de douze souris est représentée. La figure 5 représente l'effet de l'IFN-3 sur les tumeurs d'Ewing greffées sur les souris Nude. Le volume des tumeurs est déterminé deux fois par semaine pour chaque groupe et la médiane du volume est définie. EXEMPLES: Exemple 1: Activité antiproliférative de l'interféron 13 sur les cellules dérivées des tumeurs d'Ewing. Etude in vitro. - - Les interférons (IFNs) -x et -f3 (dits de type 1) et l'IFN-y (de type Il) sont utilisés pour leur activité antiproliférative sur 5 lignées cellulaires dérivées soit de tumeurs d'Ewing primaires (avant tout traitement EW-7, COH), soit de récidives métastasées (EW-1, ORS, Simon) (fig.1). La lignée EW1 est une lignée de sarcome de la 8ème côte droite. o0 Cette lignée est dérivée d'un épanchement pleural (métastases) (exon 7 de EW/exon 5 de Fli) (Melot et ai, Hybridoma, 1997, n 16, page 457). La lignée COH est une lignée de tumeur du genou avec métastases pulmonaire. Cette lignée est dérivée de la tumeur primaire avant chimiothérapie (exon 10 de EW/exon 6 de Fli) (Melot et al, Hybridoma, 1997, n 16, page 457). La lignée EW7 est une lignée de tumeur de l'omoplate. Cette lignée est dérivée de la tumeur primaire avant chimiothérapie (exon 7 de EW/exon 6 de Fli). La lignée ORS est une lignée de cellules dérivées de tumeur secondaire (métastases) (Melot et ai, Hybridoma, 1997, n 16, page 457). La lignée SIMON est également une lignée de cellules dérivées de tumeur secondaire (métastases). 1() Quelle que soit la lignée cellulaire utilisée, le traitement de 24 ou 48 heures par l'IFN-y ou par l'lFN-ox (400 unités/ml) aboutit à une faible inhibition de croissance cellulaire, 10 à 25 %. Le traitement par l'IFN-0 (REBIF , IFN-131a recombinant glycosylé 400 unités/ml) est plus efficace que le traitement par l'IFN-E ou l'IFN- y, car il conduit, après 24 heures d'activation, à une inhibition de croissance supérieure à 50 % quelle que soit la lignée cellulaire utilisée, avec par exemple une inhibition de 70 % sur la lignée EW-7 (cf figure 1). Comme le montre la figure 2, cette différence d'activité antiproliférative entre les trois IFNs ne dépend pas de la dose d'IFN utilisée. Les cellules EW-7 sont choisies pour mesurer l'effet antiprolifératif sous des doses croissantes d'lFNs, de 50 unités/ml à 5000 unités/ml. De manière générale, quelle que soit la dose d'IFN utilisée, l'inhibition de croissance après addition d'lFN-0 est très supérieure à l'effet observé après addition d'IFN-E ou d'IFN-y: de 40 à 80 % d'inhibition pour l'IFN-3 contre 6 à 10 % et 6 à 20 % pour l'IFN-y et l'IFN-a respectivement. On peut noter que l'addition d'IFN-3 à 500 unités/ml donne pratiquement le maximum de réponse antiproliférative. Les effets différenciels observés entre les deux IFNs seraient la conséquence d'une différence dans le mécanisme d'activation de gènes induits par les IFNs et impliqués dans leur effet antiprolifératif, comme les gènes codant pour la 2'5'oligo(A)-synthétase ou pour IRF-1 (InterferonRegulatory- Factor-1). Exemple 2: Activité antiproliférative de l'interférons-beta sur la croissance des tumeurs d'Ewing. Etude in vivo chez la souris Nude. A. Dans une première expérience, des tumeurs solides ont été générées par injection sous-cutanée de 20x106 cellules EW-7 chez des souris Nude de 8 semaines. Apres 10 jours, 2 groupes de 5 souris sont constitués, un groupe de souris témoins, un groupe de souris qui reçoit de l'IFN-3. Les injections sont effectuées dans la tumeur même à raison de 5x105 unités d'IFN par souris, 3 fois par semaine. Le traitement est poursuivi pendant 5 semaines au cours desquelles les tumeurs sont mesurées tous les trois jours. Les volumes relatifs (RTV) définis permettent de mettre en évidence un ralentissement de croissance très marqué après injection de l'IFN- 1 D3. En effet, la figure 3 est réalisée à partir des chiffres moyens des RTV et montre un ralentissement très net de la croissance tumorale après injection de l'IFN-P. Cette expérience, réalisée sur des tumeurs déjà établies, en phase exponentielle de croissance, permet de conforter les résultats obtenus in vitro sur les lignées cellulaires. B. Une seconde expérience a été effectuée in vivo, sur des souris Nude de 8 semaines. Un échantillon tumoral de 5 mm de diamètre, provenant d'une tumeur solide développée chez une souris Nude après injection de 20x106 cellules EW-7, maintenue par transfert in vivo, est greffé sur des souris Nude. Trois jours après la greffe, deux groupes de 12 souris ont été constitués, un groupe témoin qui reçoit des injections de tampon phosphate (PBS) et un groupe qui reçoit des injections d'IFN-3. L'IFN-P3 est injecté dans le site tumoral à raison de lx106 unités 5 jours par semaine (du lundi au vendredi) pendant 1 mois. Les courbes de croissance des tumeurs sont déterminées après les mesures du diamètre des tumeurs greffées sur chacune des souris, deux fois par semaine (voir figure 4). La figure 4 montre les courbes obtenues à partir de la moyenne des RTV pour chacun des groupes de 12 souris. On observe une progression pratiquement linéaire des tumeurs développées sur les souris témoins, alors que la prolifération tumorale est pratiquement inexistante pour les greffons qui ont reçu l'IFN-13. Ceci est confirmé par le calcul des médianes pour chacun des groupes (figure 5). Il est intéressant de noter qu'un mois après l'arrêt des injections d'lFNs, 40 % des souris ayant reçu l'IFN-13 n'ont pas développé de tumeurs. I( REVENDICATIONS 1. Utilisation d'interféron 3 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du sarcome d'Ewing. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'interféron 3 est un interféron P-la glycosylé. 1() 3.Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'interféron,3 est associé, de manière simultanée ou séquentielle, à un autre agent efficace contre le développement du sarcome d'Ewing. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le médicament est destiné à être administré à une dose de 1.106 à 45.106 unités internationales. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 précédentes, dans laquelle le médicament est destiné à être administré par injection systémique. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le médicament est destiné à être administré par injection dans la tumeur.