Brevet FR2790752A1 — publié le 20000915

L'invention concerne des microorganismes capables de dégrader en particulier des isoalcanes et des éthers. Elle s'applique particulièrement aux industries du traitement de l'eau et des sols contaminés par des coupes pétrolières telles que l'essence, le gazole ou le kérosène. Pour les essences, la suppression du plomb tétraéthyle a eu pour conséquence la mise au point de nouvelles formulations dans lesquelles les isoalcanes et les produits oxygénés, tels que les éthers, sont des constituants importants. En effet, les isoalcanes tels que l'isooctane (2,2,4-triméthylpentane) et les composés oxygénés, tels que les éthers comme le méthyl-tert-butyl éther (MTBE), mais aussi l'éthyl-tert-butyl éther (ETBE) et le tert-méthyl amyl éther (TAME), permettent de conférer aux essences un bon indice d'octane. Les déversements accidentels de ces produits conduisent à la pollution des sols et des eaux souterraines ou de surface. Les composés aromatiques tels que benzène, toluène, éthylbenzène, xylène, sont facilement dégradés par les microflores du sol (Tsao C-W et al. 1998. Appl Environ Microbiol 64 : 4924- 4929 ; Zhang W et Bouwer EJ. 1997. Biodégradation 8 : 167-175 ; Alvarez PJJ et Vogel TM.1991. Appl Environ Microbiol 57 : 2981-2985). A l'inverse, les composés qui comportent des atomes de carbone très substitués sont très récalcitrants à la biodégradation par les microorganismes de l'environnement. La littérature relative tant à la biodégradation des isoalcanes très substitués qu'à la biodégradation des éthers d'alkyles utilisés dans les essences, indique que le métabolisme de ces composés dans l'environnement n'est pas un phénomène commun. Il est relativement lent en conditions aérobies et anaérobies voire inexistant pour les isoalcanes en anaérobiose (Mc Kenna EJ. 1972. In : Degradation of synthetic organic molecules in the biosphere. National Acad Sci . pp73-97 ; Nakajiama et al. 1985. Agr Biol Chem 49 : On a découvert une nouvelle bactérie permettant de dégrader les isoalcanes et notamment les plus récalcitrants possédant en particulier un atome de carbone quaternaire tels que le 2,2-diméthylpentane, 2,2,4-triméthylpentane et les alcanes polysubstitués tels que le 2,3-diméthylpentane et le 2,3,4triméthylpentane, ainsi que les éthers. Un des objets de l'invention est de décrire un procédé qui met en #uvre cette nouvelle bactérie dans le but de dégrader les hydrocarbures et notamment les isoalcanes et les alcanes ainsi que d'autres hydrocarbures dans des effluents gazeux ou aqueux de façon que les rejets soient compatibles avec les normes en vigueur. Un autre objet est de dégrader au moins en partie une coupe d'hydrocarbures de type essence contenue dans des effluents pouvant contenir des éthers comme le MTBE, l'ETBE et/ou le TAME. Un autre objet est de dégrader au moins en partie une coupe d'hydrocarbures contenue dans les effluents de type kérosène et/ou de type gazole. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de cette bactérie pour la décontamination in situ des sols pollués. Cette nouvelle bactérie a été déposée à l'Institut Pasteur (CNCM de l'Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, F75724, Paris Cedex 15) sous le nom de Corynebacterium urealyticum CIP-I- 2126. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de traitement d'effluents contenant des hydrocarbures comprenant des isoalcanes afin de réduire au moins en partie la concentration en hydrocarbures, caractérisé en ce qu'on fait croitre en présence d'un substrat approprié une bactérie Corynebacterium urealyticum CIP-I-2126 et on fait dégrader les hydrocarbures contenus dans les effluents par la biomasse de ladite bactérie ainsi produite. La bactérie selon l'invention a été préalablement sélectionnée dans une nappe phréatique anciennement polluée par une coupe d'essence avantageusement sans plomb, avant d'être ensemencée en présence dudit effluent contenant les hydrocarbures. Selon une caractéristique du procédé, le substrat de croissance peut comprendre lesdits effluents contenant les hydrocarbures. Selon une variante, le substrat peut être choisi dans le groupe formé par les alcools de préférence primaire ou secondaire, de 2 à 8 atomes de carbone, les mono ou polyacides aliphatiques éventuellement hydroxylés, de 2 à 8 atomes de carbone, les sels de mono ou polyacides aliphatiques éventuellement hydroxylés de 2 à 8 atomes de carbone, l'isooctane et leurs mélanges. On a obtenu d'excellents résultats lorsque le substrat était l'éthanol, l'isooctane, l'acétate d'un sel de métal alcalin ou d'ammonium, seul ou en mélange entre eux. L'isooctane en particulier s'avère être un excellent substrat. Selon une autre caractéristique du procédé, la concentration en hydrocarbures dans les effluents liquides peut être au plus égale à 1700 mg/L et de préférence comprise entre 300 et 1000 mg/L. On a déjà mentionné que les effluents peuvent contenir en plus des hydrocarbures d'une coupe essence, kérosène ou gazole, au moins un éther qui améliore leurs propriétés. C'est ainsi que de préférence, la coupe essence peut renfermer le MTBE, l'ETBE, le TAME ou leur mélange pour améliorer son indice d'octane. Dans ces conditions, on peut faire dégrader les effluents contenant les hydrocarbures et au moins un éther par la biomasse des bactéries produite en présence d'un moins une souche choisie dans le groupe formé par Pseudomonas cepacia CIP I-2052, Arthrobacter globiformis ATCC 53596, Bacillus vacc JOB5 pour minéraliser sensiblement tout l'éther. La concentration de l'éther dans les effluents peut être comprise entre 50 et 1500 mg/L et de préférence entre 100 et 500 mg/L. Les techniques ex-situ d'épuration biologique des pollutions concernent les sols et les eaux souterraines. Le traitement des sols fait appel à la technique d'aération (venting) qui permet la récupération des produits volatils sous forme d'une phase gazeuse. Ces effluents gazeux, tout comme les effluents liquides, les eaux souterraines polluées par exemple, peuvent être traités ensuite par un biofiltre. Ils sont introduits dans le biofiltre, par exemple, dans lequel les bactéries sont fixées sur un support minéral ou organique ou bien peuvent être ajoutées comme inoculum à des boues de station d'épuration. Les effluent peuvent être enrichis en isooctane pour améliorer le stade de croissance. Selon un mode de réalisation, on peut utiliser la souche selon l'invention, en présence d'air dans au moins un biofiltre alimenté par l'effluent à dépolluer. Selon un mode plus avantageux, il est préférable d'utiliser un système de deux ou plusieurs biofiltres placés en série. Le premier, ensemencé avec, par exemple, une microflore aérobie d'une boue de station d'épuration, dégrade principalement les composés aromatiques, tandis que le second, ensemencé avec au moins la souche CIP-I-2126 dégrade en présence d'air ou d'oxygène les composés réfractaires tels que les isoalcanes et les cycloalcanes. Le débit d'alimentation est par exemple compris entre 0,1 et 2 UL de biofiltre/Heure. L'effluent, débarrassé au moins en partie des hydrocarbures et éventuellement des éthers, est ensuite soutiré. L'invention sera mieux comprise au vu des exemples suivants qui illustrent l'invention. Exemple 1 (selon l'invention) Isolement de souches dégradant les iso-alcanes La méthode d'isolement est essentielle pour l'obtention de souches dégradant en particulier les iso-alcanes. Des échantillons d'eau, prélevés d'une nappe phréatique anciennement polluée par une coupe d'essence, sont utilisés pour ensemencer, au taux d'inoculation de 10% (v/v), des fioles hermétiquement fermées contenant un milieu minimum salin vitaminé (MMSV) dont la composition est la suivante : Na2HP04, 12H20 4,5 g/L NH4N03 1,0 g/L KH2P04 680 mg/L MgS04, 7H20 100 mg/L FeS04, 7H20 1 mg/L MnS04, H20 100 g/L (NH4)6Mo7O24, H20 25 g/L NaB4O7, 10H2O 25 g/L Co(N03)2, 6H20 25 g/L CuCl2 25 g/L ZnCl2 25 g/L NH4N03 10 g/L biotine 200 g/L pyridoxine 100 g/L riboflavine 50 g/L acide nicotinamique 50 g/L panthoténate 50 g/L acide p-aminobenzoïque 50 g/L acide lipoïque 50 pg/L acide folique 20 g/L thiamine 15 g/L cyanocobalamine 1,5 g/L Immédiatement après ensemencement, le substrat de croissance, l'iso-octane (ou 2,2,4-triméthylpentane) est ajouté au milieu MMSV à raison de 500 mg/l. Après trois semaines d'incubation sous agitation à 30 C, on constate que l'absorbance de cette culture d'enrichissement a augmenté d'environ 0,1 unité. On procède alors à un premier repiquage sur un milieu de composition identique, au même taux d'ensemencement que pour la culture d'enrichissement. Lorsqu'une croissance est à nouveau repérée par augmentation d'absorbance, on effectue un deuxième repiquage dans le mêmes conditions que précédemment. Après quinze jours d'incubation, une partie aliquote du milieu de culture liquide est alors prélevée et étalée sur des boîtes de Pétri de milieu MMSV gélosé. Ces boîtes sont incubées dans une enceinte fermée et l'iso-octane est fourni sous forme de vapeur en plaçant dans l'enceinte un tube à essais contenant quelques millilitres d'iso-octane pur. Après quinze jours d'incubation à 30 C, des colonies repérées à la surface du milieu gélosé sont isolées. Elles sont capables de dégrader l'iso-octane. L'une d'entre elles constitue la souche CIP-I-2126. Il est nécessaire de traiter beaucoup d'échantillons pour isoler une souche active, ce qui indique que ces dernières sont relativement rares dans l'environnement. Identification de la souche CIP-I-2126 La souche CIP-I-2126 qui possède la capacité de dégrader l'iso-octane a été soumise à des tests biochimiques afin d'être identifiée par ses caractères phénotypiques. La souche CIP-I-2126 est un bacille aérobie strict à Gram positif, non mobile, non sporulé, non capsulé, non ramifié. Les caractères biochimiques de l'identification sont les suivants : Métabolisme respiratoire aérobie strict catalase + oxydase - nitrate réductase - nitrite réductase - urée + esculine - tween-80-estérase + Galerie API Coryné caractères positifs : a-glucosidase, urée, catalase. Les caractères biochimiques exprimés montrent que la souche CIP-I-2126 appartient à l'espèce Corynebacterium urealyticum. Dégradation de l'iso-octane Pour évaluer de façon simple et quantitative la capacité de dégradation des isoalcanes de la souche C. urealyticum CIP-I-2126, nous avons utilisé un substrat de référence, l'iso-octane. Une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml de capacité, hermétiquement fermée et contenant 55 ml de milieu MMSV auquel a été ajouté 345 mg/l d'iso-octane, est ensemencée par la souche CIP-I-2126. La culture est placée sous agitation (300 rpm) à la température de 30 C pendant 28 jours. L'iso-octane résiduel des fioles est mesuré après extraction au dichlorométhane et séparation par chromatographie en phase gazeuse sur colonne PONA (Chrompack) et détection à ionisation de flamme. Parallèlement à la mesure du substrat résiduel, la quantité de C02 produite au cours de l'essai est suivie par chromatographie en prélevant des fractions aliqotes (250 NI) de l'espace de tête dans la fiole. L'échantillon gazeux prélevé est injecté dans un chromatographe équipé d'une colonne Porapak (Millipore Corp. ) et muni d'un détecteur catharométrique. Le C02 produit est évalué à l'aide d'un standard externe. On calcule le taux de dégradation de l'iso-octane qui est égal à la fraction molaire d'iso-octane consommé par la culture ainsi que le taux de minéralisation. Ce dernier est égal au rapport des quantités de carbone retrouvé dans le C02 produit sur la quantité de carbone introduite sous forme d'iso-octane. Les résultats obtenus avec la souche CIP-I-2126 sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1 : Suivi cinétique de la dégradation de l'iso-octane par la souche CIP-I-2126 DUREE TAUX DE TAUX DE D'INCUBATION (H) DEGRADATION (%) MINERALISATION (%) 50 20 10 75 52 13 135 100 33 500 100 50 672 100 50 On constate que la souche C. urealyticum CIP-I-2126 est capable de dégrader la totalité de l'iso-octane introduit. A la fin de l'essai, 50% du carbone a été minéralisé en C02. Le carbone qui n'est pas minéralisé est utilisé pour la production de biomasse ou encore de métabolites intermédiaires qui sont au moins en partie consommés. Exemple 2 (contre-exemple) Des échantillons de boues activées prélevées dans une station d'épuration d'eaux usées urbaines sont utilisés pour effectuer des isolements de souches dans des conditions identiques à celles décrites dans l'exemple 1. Après trois semaines d'incubation, l'absorbance de la culture d'enrichissement n'a pas varié et les repiquages successifs ne permettent pas l'isolement de souche dégradant l'iso-octane. Exemple 3 (effet de la concentration en iso-octane) La souche Corynebacterium urealyticum CIP-I-2126 est cultivée dans les mêmes conditions de température et d'agitation que dans l'exemple 1, en présence des concentrations suivantes d'iso-octane : 275,690, 1100 et 2200 mg/L. Les taux de dégradation de l'iso-octane dans les différents essais sont indiqués dans le tableau 2. Tableau 2 :Influence de la concentration en iso-octane sur la dégradation TENEUR INITIALE EN ISO- TAUX DE OCTANE (MG/L) DEGRADATION (%) 275 100 690 100 1100 95 2200 91 Le tableau 2 indique que la souche C. urealyticum CIP-I-2126 est capable de dégrader l'iso-octane à plus de 90 % jusqu'à au moins 2,2 g d'isooctane par litre de milieu et qu'elle possède une excellente résistance à l'effet toxique des polluants. Exemple 4 (capacité de dégradation des hydrocarbures individuels) On étudie la capacité de dégradation des hydrocarbures individuels purs par la souche C. urealyticum CIP-I-2126 dans des conditions identiques à celles utilisées pour l'iso-octane dans l'exemple, mais en utilisant lesdits hydrocarbures comme substrat de croissance. Les taux de dégradation et de minéralisation déterminés après 28 jours sont présentés dans le tableau 3. Tableau 3 : Dégradation de composés individuels par la souche C.urealyticum CIP-I-2126 TAUX DE FAMILLES COMPOSES DEGRADATION (%) Iso-alcanes 2-méthylpentane 100 2-méthylhexane 100 3-méthylhexane 100 2-méthylheptane 100 3-méthylheptane 100 2-méthyloctane 100 2,3-diméthylpentane 100 2,4-diméthylpentane 100 2,4-diméthylhexane 100 2,5-diméthylhexane 100 2,2-diméthylpentane 100 3,3-diméthylpentane 34 2,2-diméthylhexane 27 3,4-diméthylhexane 100 2,3,4-triméthylpentane 87 2,2,4-triméthylhexane 28 Alcanes heptane 100 linéaires octane 100 decane 100 Alcane cyclohexane 0 cyclique Aromatiques benzène 0 toluène 98 m-xylène 100 p-xylène 97 o-xylène 0 éthylbenzène 0 n-propylbenzène 0 1-méthyl 2-éthyl benzène 0 1-méthyl 3-éthyl benzène 0 1-méthyl 4-éthyl benzène 0 Ethers tert-butyl éthyl éther 81 tert-butyl méthyl éther 32 tert-amyl méthyl éther 51 Le tableau 3 indique que la souche C. urealyticum dégrade totalement 13 des 16 iso-alcanes testés tandis que les trois autres iso-alcanes (3,3-diméthylpentane, 2,2-diméthylhexane, 2,2,4-triméthylhexane) sont partiellement dégradés. Le spectre des produits dégradés (hydrocarbures et autres composés) par cette souche est particulièrement large. Exemple 5 (Dégradation des n- et iso-alcanes de haut poids moléculaire) On répète l'exemple 4 en remplaçant, dans deux essais séparés, les composés individuels de l'essence par le n-hexadecane d'une part et par le 2,6,10,14tetraméthylpentadecane (pristane) d'autre part qui sont des composés de la coupe gazole. Après 28 jours d'incubation à 30 C, on mesure par chromatographie en phase gazeuse la quantité de substrat carboné dans les deux essais. Les taux de dégradation sont alors respectivement égaux à 88 et 89%. Exemple 6 (capacité de dégradation des hydrocarbures en mélange) On étudie la dégradation d'un mélange d'hydrocarbures par la souche C.urealyticum CIP-I-2126 dans des conditions de température et d'agitation identiques à celles utilisées pour l'iso-octane dans l'exemple 1, mais avec le mélange comme substrat de croissance. Le mélange est composé des 23 hydrocarbures majoritaires et représentatifs d'une essence commerciale. Ces 23 composés, pris ensemble, représentent plus de 90% de l'essence complète. La teneur de chaque hydrocarbure dans le mélange est la même pour tous les hydrocarbures. La quantité de mélange mise en oeuvre est de 400 mg/L de milieu MMSV. Les taux de dégradation de chacun des composés, déterminés après 28 jours sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4 : Dégradation d'un mélange-modèle d'essence COMPOSES TAUX DE DEGRADATION (%) heptane 100 octane 100 2-méthylhexane 93 3-méthylhexane 92 3-méthylheptane 95 2,5-diméthylhexane 74 2,4-diméthylhexane 83 2,2,4-triméthylpentane 97 2,3,4-triméthylpentane 100 cyclohexane 57 benzène 13 toluène 93 éthylbenzène 100 m-xylène 92 p-xylène 100 o-xylène 90 n-propylbenzène 100 1-méthyl 2-éthylbenzène 100 1-méthyl 3-éthylbenzène 100 1-méthyl 4-éthylbenzène 100 1,3,5-triméthylbenzène 53 1,2,4-triméthylbenzène 100 1,2,3-triméthylbenzène 50 MTBE 62 ETBE 72 TAME 74 TOTAL 83 Le tableau 4 indique que tous les isoalcanes sont dégradés au moins partiellement lorsqu'ils sont fournis à la souche sous forme d'un mélange. Certains composés tels que l'éthylbenzène, l'o-xylène et le cyclohexane, qui n'étaient pas dégradés lorsqu'ils étaient fournis individuellement à la souche, sont dégradés quand ils sont apportés sous forme de mélange. Cette observation tend à indiquer que C. urealyticum CIP-I-2126 est capable de dégrader ces composés par co-métabolisme, c'est-à-dire en utilisant un autre hydrocarbure comme source de carbone et d'énergie. Exemple 7 (renforcement de microflores pour la dégradation de l'essence) On étudie comparativement la dégradation d'une essence, dans laquelle les composés dont la volatilité est supérieure ou égale à celle du pentane ont été éliminés, par des boues activées (voir exemple 2) et par des boues activées auxquelles est additionnée la souche C.urealyticum CIP-I-2126. Les conditions de température et d'agitation sont identiques à celles de l'exemple 1. Le substrat de croissance est une essence dépentanisée ajoutée à une concentration finale de 400 mg/L. Les taux de dégradation déterminés dans les deux essais après 28 jours sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 :Dégradation d'une essence étêtée CLASSES TAUX DE DEGRADATION (%) D'HYDROCARBURES BOUES ACTIVEES BOUES ACTIVEES + SOUCHE CIP-I-2126 Mono-aromatiques 100 100 Iso-alcanes 75 100 Alcanes linéaires 92 100 Alcanes cycliques 100 100 Alcènes 100 100 ETBE 7 100 MTBE 5 100 Le tableau 5 montre que le renforcement des boues activées avec la souche C. urealyticum CIP-I-2126 permet la dégradation des alcanes et des iso-alcanes et conduit à une dégradation totale de l'essence dans l'essai. Le taux de minéralisation avoisine 72%, le reste étant incorporé en majeure partie dans la biomasse cellulaire. REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement d'effluents contenant des hydrocarbures comprenant des isoalcanes afin de réduire au moins en partie la concentration en hydrocarbures, caractérisé en ce qu'on fait croitre en présence d'un substrat approprié une bactérie Corynebacterium urealyticum CIP-I-2126 et on fait dégrader les hydrocarbures contenus dans les effluents par la biomasse de ladite bactérie ainsi produite. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite bactérie est préalablement sélectionnée dans une nappe phréatique anciennement polluée par une coupe essence avant d'être ensemencée en présence dudit effluent contenant les hydrocarbures. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, dans lequel le substrat comprend lesdits effluents contenant les hydrocarbures. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le substrat est choisi dans le groupe formé par les alcools, de 2 à 8 atomes de carbone, les mono ou polyacides aliphatiques éventuellement hydroxylés, de 2 à 8 atomes de carbone, les sels de mono ou polyacides aliphatiques éventuellement hydroxylés de 2 à 8 atomes de carbone, l'isooctane et leurs mélanges. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le substrat est choisi dans le groupe formé par l'éthanol, l'isooctane, l'acétate d'un sel de métal alcalin ou d'ammonium, et leurs mélanges. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la concentration en hydrocarbures dans les effluents liquides est au plus égale à 1700 mg/L et de préférence comprise entre 300 et 1000 mg/L. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les effluents contiennent une coupe essence. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les effluents contiennent une coupe kérosène. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les effluents contiennent une coupe gazole. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel les effluents contiennent en outre au moins un éther. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel lequel l'éther est le MTBE, l'ETBE, le TAME ou leur mélange. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 à 11, dans lequel on fait dégrader les effluents contenant en outre l'éther par la biomasse desdites bactéries en présence d'au moins une souche choisie dans le groupe formé par Pseudomonas cepacia CIP I-2052, Arthrobacter globilis ATCC 53596, Bacillus vacc JOB5 pour minéraliser sensiblement tout l'éther. 13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel la concentration de l'éther dans les effluents liquides est comprise entre 50 et 1500 mg/L et de préférence entre 100 et 500 mg/L. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel on fait développer lesdites bactéries sur un système d'au moins un biofiltre de volume adéquat, on introduit les effluents en présence d'air ou d'oxygène dans le biofiltre à un débit d'alimentation de 0,1 à 2 UL de biofiltre/Heure et on soutire l'effluent débarrassé au moins en partie des hydrocarbures et éventuellement des éthers. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le biofiltre contient en outre une boue activée. 16. Procédé selon la revendication 14, dans lequel on fait passer dans une première étape les effluents sur un système de biofiltre contenant une boue activée, et on introduit dans une deuxième étape en présence d'air ou d'oxygène les effluents résultant de la première étape sur un système de biofiltre contenant au moins lesdites bactéries Corynebacterium urealyticum CIP-I-2126 et on récupère les effluents dépollués.