Brevet FR2795424A1 — publié le 20001229

La présente invention concerne un nouveau promoteur végétal capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante, ainsi que des vecteurs recombinants contenant un tel promoteur, de préférence associée à une séquence nucléotidique dont l'expression est recherchée dans les cellules constitutives des racines de plantes. Dans les années récentes, les applications industrielles rendues possibles par les transformations des plantes à l'aide du génie génétique ont été croissantes. De nombreux gènes d'origine procaryote ou eucaryote (d'animaux ou de plantes), codant spécifiquement pour des protéines conférant de nouvelles propriétés agronomiques, ont été isolés et transférés chez les plantes par génie génétique Dans un grand nombre de cas, les gènes qui ont été introduits dans des plantes constituent des séquences chimères, associant des éléments régulateurs d'origines différentes. Ainsi, le gène codant pour une protéine d'intérêt est souvent placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort permettant à ladite protéine d'être exprimée dans la totalité de la plante. A titre d'exemple, le promoteur du transcrit 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (35S CaMV) a été largement utilisé dans des constructions de gènes chimères pour l'expression de protéines d'intérêt chez les plantes. Désormais, pour un grand nombre d'applications, il n'est pas nécessaire que la protéine d'intérêt conférant la propriété agronomique recherchée présente une expression distribuée dans la totalité des organes et/ou des types cellulaires de la plante transformée. Très précocement, la recherche d'une expression plus spécifique du gène d'intérêt a été entreprise et a conduit, par exemple, à l'identification de promoteurs spécifiques de tissus ou d'organes. En particulier, un promoteur dirigeant l'expression d'un polynucléotide d'intérêt de façon à la fois forte et ciblée dans la racine permettrait de nombreuses applications que l'on peut classer comme suit . (i) défense contre les pathogènes à point d'entrée racinaire, telles que des bactéries, des champignons, des nématodes ou des insectes. (ii) résistance au stress (froid, stress hydrique, stress salin); (iii) amélioration de la qualité (exemple: augmenter la teneur en saccharose dans la betterave à sucre); (iv) nutrition (exemple: exprimer un gène de transporteur des nitrates). Comme déjà indiqué plus haut, les promoteurs décrits dans l'état de la technique ne permettent pas l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans l'ensemble des couches cellulaires de la racine y compris toutes les assises. Par exemple, le gène arsk1 d'A. thaliana (Hwang et al., 1995) est exprimé spécifiquement dans la racine, mais son expression est limitée aux couches externes de la racine (épiderme, endoderme, cortex) c'est-à-dire les cellules impliquées dans l'absorption d'eau. L'expression est très faible dans le système vasculaire. Le profil d'expression de ce gène évoque un rôle dans le stress hydrique. De fait, l'expression de ce gène est inductible par un stress hydrique (exposition des racines à l'air, ou traitement des racines par l'ABA ou NaCI), et diminue fortement lorsque les racines sont réhydratées. Un autre exemple illustratif est le mutant scarecrow d'A. thaliana (Malamy et al. 1997) qui est affecté dans l'organisation radiale de la racine : les couches de l'endoderme et du cortex ne s'individualisent pas et restent fusionnées en une couche mutante possédant des caractéristiques de l'endoderme et du cortex Le gène scarecrow affecté par la mutation est exprimé dans l'endoderme, les cellules initiales de l'endoderme, et parfois dans le centre quiescent de la racine. De plus, les promoteurs décrits dans l'état de la technique, d'une part, ne permettent pas un haut niveau d'expression du polynucléotide d'intérêt, et d'autre part, ne sont pas actifs tout au long du développement de la plante. Le besoin d'un promoteur végétal fort, spécifique des racines, et actif quel que soit le stade de développement de la plante, est désormais comblé selon la présente invention. La demanderesse a ainsi isolé, à partir du génome végétal d'Arabidopsis thaliana, un nouveau promoteur capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans les racines d'une plante, ledit promoteur assurant un haut niveau d'expression du polynucléotide d'intérêt à la fois dans l'épiderme, le cortex, le vaisseau ou l'endoderme ainsi que dans toutes les assises de la racine, ceci durant tous les stades de développement de la plante. Ainsi, la présente invention est relative à un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour un promoteur végétal capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante, durant la totalité du développement de cette dernière, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée. Le terme isolé au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur. Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. L'invention concerne également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Le pourcentage d'identité de nucléotides entre deux séquences, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences. Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité des deux bases par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus (par exemple le logiciel FASTA de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison , Wis). A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel précité FASTA, en utilisant exclusivement les paramètres par défaut. Ainsi, les différences nucléotidiques que peut comprendre un acide nucléique selon l'invention par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs ou non. Font également partie de l'invention des acides nucléiques comprenant tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, ou encore 99,8% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Selon un autre aspect, l'invention est également relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Par partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, on entendra une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 1 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante. L'activité biologique d'une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples. A titre illustratif, une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être obtenue par coupure enzymatique d'un acide nucléique tel que décrit ci-dessus, notamment un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1, à l'aide d'endonucléases de restriction. Une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aussi obtenue par exemple par délétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 à l'aide de la technique à l'exonucléase III décrite dans les exemples. Un polynucléotide partie du promoteur végétal selon l'invention a avantageusement une longueur en nucléotides allant de 200, 250,300, 400,500, 750,100, 1200,1500 ou 2000 nucléotides (ou paire de bases s'il se présente sous la forme double brin). L'homme du métier peut à cet effet utiliser la carte de restriction de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, représentée à la figure 1. Pour la mise en oeuvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments de polynucléotides correspondant à une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention pourra également être préparée par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du côté 5' et du côté 3', la séquence d'intérêt , par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets américains N US 4 683 195, US 4,683,202 et US 4,965,188. Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions d'hybridation suivantes: ' préhybridation des filtres pendant 8 heures à 65 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7. 5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll , 0,02% BSA, et 500 g par ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé; # hybridation des filtres pendant 48 heures à 65 C en présence de tampon 1 x SSC correspondant à 0,15 M de NaCI et 0.05M de citrate de sodium ; # trois lavages des filtres dans une solution contenant 2 x SSC et 0,1 % SDS à 68 C pendant 15 minutes. Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation, dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 20 nucléotides. Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites doivent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de Hames et Higgins (1985, Nucleic Acid Hybridization : Apractical approach , Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford), ou encore dans l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité. L'invention concerne également un acide nucléique comprenant un polynucléotide promoteur tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléotidique d'intérêt fonctionnellement associée au promoteur végétal et dont l'expression est recherchée dans les cellules de la racine d'une plante. Un acide nucléique répondant à une telle définition est par exemple l'acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID N 2 comprenant la séquence du gène gus placé sous le contrôle du promoteur de séquence nucléotidique SEQ ID N 1. De manière avantageuse, un tel acide nucléique comprendra une séquence nucléotidique d'intérêt choisie parmi les séquences codantes de gène interagissant avec des parasites ou des pathogènes tels que les nématodes ou les champignons, comme par exemple les séquences codantes de glucanase, ladite séquence nucléotidique d'intérêt étant placée sous le contrôle d'un polynucléotide promoteur selon l'invention. Il peut également s'agir de séquences d'endochitinases telles que celles décrites dans le brevet européen n EP 493,581 ou encore de séquences de gènes agissant sur la teneur en sucre de la plante. A titre d'exemple, les séquences codantes de gènes d'intérêt assurant la protection d'une plante contre d'autres conditions de stress pourront être avantageusement placées sous le contrôle d'un polynucléotide promoteur selon l'invention. Stress hydrique ou salin: # gène arsk1 (Hwang, I. et al. ; 1995); # CDNA pA9 (Winicov, I., Deutch S. E. 1994); # CDNA Alfin 1 (Bastola, DR étal. 1998). D'autres séquences codantes pourraient être utilisées sous le contrôle du promoteur selon l'invention, pour agir sur la teneur en saccharose de la betterave à sucre : gèneBvSPS1 (Hesse H. et al., 1995), ou surexprimer un gène déjà exprimé physiologiquement comme les gènes de transporteurs de nitrate NRT1 ou NRT2 ( Crawford, N.M. et al. ,1998, Leah R et al , 1991) L'invention est en outre relative à des fragments nucléotidiques comprenant 10 à 2000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence SEQ ID N 1 ou encore un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, de tels fragments auront une longueur de 10,12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70,80, 100, 200, 500, 1000,1500 ou 2000 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide promoteur selon l'invention ou consistant en des fragments d'une longueur de 12,15, 18,20, 25,35, 40, 50,70, 80, 100, 200, 500, 1000,1500 ou 2000 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide promoteur selon l'invention. De tels fragments nucléotidiques pourront avantageusement être mis en oeuvre en tant que sondes ou amorces nucléotidiques aux fins de détection ou d'amplification de la totalité ou d'une partie d'une séquence à activité promoteur spécifique des racines de plantes selon l'invention. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un polynucléotide promoteur selon l'invention. Un tel vecteur recombinant comprendra avantageusement une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle dudit promoteur végétal. Des vecteurs pouvant être utilisés aux fins de la présente invention sont notamment les suivants : # vecteur pBIN19 (Bevan et al., 1984, Nucleic Acids Research, vol. 12 : 8711-8721, commercialisé par la Société CLONTECH , Palo Alto, Californie, USA); # vecteur 101 (Jefferson , 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol.5: 387-405, commercialisé par la Société CLONTECH); # vecteur pB1221 (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol.5: 387-405, commercialisé par la Société CLONTECH); # vecteur pBI121 (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol.5: 387-405, commercialisé par la Société CLONTECH). # vecteur pEGFP (Cormack, B.P. et al. 1996 ; Yang T.T. et al., 1996), commercialisé par la Société Clontech. Un vecteur recombinant préféré selon l'invention est par exemple le vecteur recombinant contenu dans la souche d'E. Coli déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-Organismes (CNCM) le 25 Mai 1999 sous le n d'accès 1-2218. L'invention a en outre pour objet une cellule hôte recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique à activité de promoteur végétal spécifique des racines de plantes selon l'invention, éventuellement associée à un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier, ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. Les cellules hôtes recombinantes préférées selon l'invention peuvent être indifféremment d'origine bactérienne ou végétale. Ainsi, peuvent notamment être utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens. Il s'agit également de cellules de plantes transformées par un vecteur conforme à l'invention, tel que des cellules d'Arabidopsis thaliana, de colza, de tabac ou encore de maïs. Une cellule hôte recombinante préférée selon l'invention est la cellule de la souche de E.coli déposée à la CNCM le 25 Mai 1999 sous le n d'accès 1-2218. L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal recombinant caractérisé en ce qu'il comprend des cellules hôtes recombinantes telles que définies ci-dessus. L'invention concerne en particulier une plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique comprenant un polynucléotide promoteur conforme à l'invention et une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle de ce dernier. Une plante transgénique selon l'invention peut être notamment un colza, un tabac, un maïs ou encore Arabidopsis thaliana. Les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont donc la propriété d'exprimer une séquence nucléotidique d'intérêt spécifiquement au niveau des différents types cellulaires de la racine ( de l'extérieur vers l'intérieur: épiderme, cortex, endoderme, pericycle, vaisseau), à tous les stades de développement de la plante. L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique exprimant spécifiquement une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine à tous les stades de développement de ladite plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale conforme à l'invention; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal selon l'invention. L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens contenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal selon l'invention; b) transformation de la plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal selon l'invention. L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) transfection d'une cellule de plante avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur selon l'invention; b) régénération d'une plante entière à partir de cellules de plante recombinantes obtenues à l'étape a) ; c) sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal selon l'invention. L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrit peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes: d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c); e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène. Selon une autre alternative, l'un quelconque des procédés cidessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes: d) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) de l'un quelconque de ces procédés avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène. L'invention a en outre pour objet une plante transgénique telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés ci-dessus. De manière préférée, une plante transgénique selon l'invention a non seulement intégré dans son génome un transgène comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal présentement décrit mais exprime ladite séquence nucléotidique d'intérêt majoritairement ou exclusivement dans les cellules constitutives de la racine. Enfin, l'invention concerne aussi une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent dans leur génome un acide nucléique selon l'invention. Il s'agit notamment d'une semence de Arabidopsis thaliana, de colza, de tabac ou de maïs ayant incorporé un acide nucléique selon l'invention. L'invention sera en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants. La figure 1 représente une carte de restriction de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1. Les motifs suivants ont été identifiés dans cette séquence : motifs TGACG correspondant au site de fixation du facteur Asfl spécifique de la racine dans le promoteur 35 S du CaMV (position 1000-1004 et 1866- 1870), deux motifs proches, à un nucléotide près, de séquences enhancer du même promoteur 35S (position 28-35 : CTGAAAG, au lieu de GTGAAAG et position 882-889: GTGCTTTG, au lieu de GTGGTTTG) et 3G-box ACGT (positions 285-288, 604-607,1107-1110). Par ailleurs, cette séquence comporte 21 motifs TATA et 9 motifs CAAT. L'importance fonctionnelle de ces motifs pourra être évaluée par la méthode à l'exonucléase III, selon Ausubel et al. (1989). Cette méthode permet d'obtenir des fragments de promoteur de taille décroissante, qui seront clonés en amont du gène gus dans un vecteur permettant la transformation d'Arabidopsis. La figure 2 illustre la construction 1 ayant été utilisée pour l'isolement du promoteur selon l'invention, en l'absence (figure 2a) ou en présence (fig. 2b) de l'insert. L'insert de 4. 27 kb est cloné à partir du vecteur de kanamycin rescue (figure 7) dans l'ADN-T du vecteur pBin19 par une double digestion EcoRI-Xbal. Cet insert comporte 2. 14 kb de séquence génomique du clone lr1 ( SEQ ID N 3 nct 136-2284) et 2. 13kb de l'ADN-T de pGKB5: séquence codante de gus et signal de polyadénylation nos (figure 8 - nct 632-2762). LB : bordure gauche de l'ADN-T de pBin19. LacZ: lacZ région du phage M13mp19. NPTII: fragment contenant le promoteur nos, le gène de résistance à la néomycine, et le site de polyadénylation nos. RB . bordure droite de l'ADN-T de pBin19. kan : fragment contenant l'origine de réplication RK2 du plasmide pRK252 et le gène kan de résistance à la kanamycine de Streptococcus. La figure 3 illustre l'expression GUS du transformant d'Arabidopsis (écotype WS) au cours du développement. a- 7 jours après germination. b- 14 jours après germination. c- 24 jours après germination. d- détail d'une racine. La figure 4 illustre une coupe transversale de racine du transformant après révélation de l'activité GUS. La figure 5 réprésente une autoradiographie d'un Northern blot hybridé avec une sonde GUS. 6 g d'ARN ont été déposés dans chaque puits. Puits n 1-3-5: ARN de parties aériennes du transformant homozygote n 1, n 13 et de plante non transformée WS, respectivement. Puits n 2-4-6: ARN de racines des mêmes plantes. La figure 6 illustre l'analyse quantitative de l'expression GUS de transformants d'Arabidopsis obtenus avec la construction 1, au cours du développement. Elle matérialise la comparaison de l'activité GUS dans les racines et la partie aérienne du transformant initial (a) et des transformants individuels caractéristiques 6-1 et 2b (b-c), au cours du développement. L'activité gus est exprimée en unités de fluorescence par minute et par : - 1 g de protéines (racines) - 20 g de protéines (feuilles) A 2,72 unités de fluorescence correspond 1 pmol du produit mu, qui est le produit de la catalyse enzymatique du substrat mug (4-méthyl-ss-D glucuronide) par GUS. La figure 7 illustre le vecteur obtenu à la suite du Kanamycin rescue . La technique de kanamycine rescue utilise le vecteur P38 (a), qui comporte le début du gène Nptll de résistance à la kanamycine, jusqu'au site Pstl, en aval d'un promoteur IS50. Après digestion par Pstl du vecteur P38 et de l'ADN du transformant, ligation des deux et sélection sur kanamycine, on obtient le vecteur montré en b). L'insert 1 est le fragment Pstl obtenu à partir de l'ADN génomique du transformant: il comporte la région promotrice (SEQ ID N 1, nct 1 à 2149) accolée au fragment d'ADN-T délimité par le site d'insertion côté RB et le site Pstl situé dans le gène de la kanamycine (figure 8, nct 632 à 4279). Le gène de résistance à la kanamycine se trouve ainsi reconstitué et le vecteur recombinant est sélectionné sur kanamycine. La figure 8 donne une représentation schématique de l'ADN-T de PGKB5 utilisé pour créer la collection de transformants de Versailles. La figure 9 illustre la séquence de l'ADN-T de PGKB5, également référencée comme la séquence SEQ ID N 5. - RB bordure de 24 pb : - gène gus : séquencegus sans promoteur : 638-2504 (ATG:638- 640, codon stop: 2444-2446), site de polyadénylation du gus: 3'nos: 2505- 2793, site EcoRI: AATT/C:2759-2763. - gène KanR : nos: 4752-4480, séquence KanaR: 4479- 3490 (ATG: 4466-4464, codon stop : 3665-3663, site Pstl: CTGCA/G : 4275- 4280), site ocs3' : - gène PhosphinothricineR (bastaR) : promoteur 35S : séquence phosphinotricineR: 5890-6503 (ATG:5930-5932, codon stop: 6480-6482), site 3'g7 : - LB bordure de 24 pb : EXEMPLES: MATERIELS ET METHODES: 1 - Transformation (Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. , 1993. Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris 316 : 1194-1199. ) 6 mg de graines (soit environ 300 graines) d'Arabidopsis thaliana d'écotype Wassilevskija ont été semés sur des bacs de compost 40 x 30 cm. Les bacs sont laissés 64 h à 4 C pour la germination, puis sont placés en serre (photopériode : 16h de jour, température : 15 C nuit / 25 C minimum jour) et arrosés avec la solution nutritive standard de Coïc et Lessaint (Coïc, Y., Lessaint, C. 1971. Comment assurer une bonne nutrition en eau et ions minéraux en horticulture. Hortic. fr.8:11-14). MP5-1 Agrobacterium est cultivé dans du milieu LB ( Luria-Bertani, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York ) avec 50 mg/l de rifampicine, 100 mg/l de gentamycine et 200 mg/l de kanamycine, 14h à 28 C (jusqu'à A600=0. 8). Après centrifugation, le culot de bactéries est remis en suspension dans le milieu d'infiltration (MI), à un tiers du volume de culture initial (MI= macro et micro nutriments de Murashige et Skoog, contenant 10 g/l 6-benzylaminopurine et 5% sucrose (Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15 : 473-497). Des lots de 100 à 500 plantes de 3 à 4 semaines bien développées ont été extraits du sol, rincés à l'eau, immergés dans 21 de milieu MI contenant Agrobacterium dans une cloche à vide de 101 de contenance. Les plantes sont maintenues sous vide (104 Pa) pendant 20 mn. Toutes les manipulations des plantes traitées, jusqu'à leur récolte, ont été effectuées avec des gants en latex. Les plantes traitées ont été plantées dans un nouveau compost, à raison de 54 plantes par bac, puis incubées 2 jours sous un plastique pour prévenir toute déshydratation et pour faciliter l'enracinement. Quatre à six semaines après la plantation, la génération T1 a été récoltée en mélange. Les plants ont été sélectionnés sur du sable irrigué avec de l'eau contenant de l'herbicide Basta (5-10 mg/ml phosphinothricine). Deux mois plus tard, les graines T2 ont été récoltées individuellement et conservées pour les analyses ultérieures. Il - Kanamycin rescue (Bouchez D., Vittorioso P., Courtial B., Camilleri C., 1996. Kanamycin Rescue: A Simple technique for the recovery of T-DNA flanking séquences. Plant Mol Biol. Rep. 14 : - Extraction de l'ADN génomique De 0,5 à 0,75g de feuilles sont congelés rapidement dans l'azote liquide, broyés, en présence de polyclaTM, en fine poudre dans un mortier à l'aide d'un pilon, et la poudre est transférée avec l'azote liquide dans un tube "Oak Ridge", dans lequel sont ajoutés 15ml de tampon d'extraction (Tris 100mM, EDTA 50mM, NaC 1500mM, (3-mercaptoéthanol 10mM, pH8). Après addition de 1 ml de SDS 20%, les tubes sont incubés à 65 C pendant 10mn en agitant toutes les 3 à 4mn. 5ml d'acétate de potassium (5M) sont ajoutés et incubés à 0 C pendant au moins 20mn. Après centrifugation à 25000g (13000rpm) pendant 20mn, le surnageant est filtré à travers un filtre Miracloth (Calbiochem) dans un tube de 30ml contenant 10ml d'isopropanol et incubé à -20 C pendant 30mn. Après centrifugation à 20000g (10000 tpm) pendant 15mn, le culot d'ADN est séché en renversant le tube sur du papier absorbant pendant 10mn L'ADN est repris dans 0,7ml de TE 50/10 (Tris 50mM, EDTA 10mM pH8) auxquels sont ajoutés 5 l de RNAse (5mg/ml) et incubé à 37 C pendant 10mn. L'ADN est extrait par un volume égal de phénol/chloroforme 1/1 et précipité à l'isopropanol (1 volume)/ NaOAc (3M) (1/10 de volume). Le culot d'ADN est séché et repris dans 10 l de TE 10/1 (Tris 10mM, EDTA 1 mM, pH8). - Clonage Première digestion. 0. 5 g d'ADN génomique d'Arabidopsis sont digérés avec Pstl (BRL life technologies, 95613, Cergy-Pontoise), précipités à l'ethanol (2. 5 volumes)/ NaOAc 3M (1/10 du volume) et remis en suspension dans de l'eau. 2. 5 g du vecteur pResc38 sont digérés par PstI, déphosphorylés avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau (BRL), extraits avec un volume de phénol- chlorophorme (1/1) précipités à l'éthanol/ NaOAc, et remis en suspension dans de l'eau. Première ligation. 0. 5 g d'ADN génomique digéré par Pstl et 2.5 g de pResc38 digéré par Pstl et déphosphorylé sont mis à liguer dans 100 l de volume total avec 5 unités de T4 ADN ligase (BRL), toute la nuit à12 C. Deuxième digestion. Le mélange de ligation précédent est précipité à l'éthanol (2. 5 volumes)/ NH40Ac 8M (1/2 du volume), remis en suspension dans de l'eau, et complètement digéré avec un deuxième enzyme de restriction : Xbal, dans un volume total de 100 l en utilisant 20 unités d'enzyme de restriction. Le mélange est précipité à l'éthanol/NH40Ac et mis en suspension dans de l'eau. Deuxième ligation. Afin de circulariser les molécules d'ADN, une deuxième ligation est réalisée sur le produit de la deuxième digestion avec une concentration d'ADN plus faible, dans un volume total de 200 l et en utilisant 5 unités de T4 ADN ligase. Le mélange est incubé toute la nuit à 12 C, puis précipité à l'éthanol/ NH40Ac, rincé 2 fois à l'éthanol 70% (v/v), séché, et repris dans 20 l d'eau. - Transformation L'électroporation est réalisée grace à un appareil de type GenePulser (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) avec un voltage de 1,5 kV. Les cellules electrocompétentes DH10B electromax (BRL) sont rapidement décongelées puis placées sur la glace. Dans une cuvette d'electroporation froide (diamètre interélectrode de 1 mm, Bio-Rad), sont mélangés 2 l du produit de ligation précipité et 40 l de cellules compétentes. Après électroporation, 1 ml de milieu SOC froid (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,T. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York) est ajouté immédiatement. L'ensemble est transvasé dans un tube de culture de 13 ml et incubé 2h à 37 C sous agitation. Un volume de 250 l de culture est étalé sur des boîtes de Pétri LBagar contenant 100 mg/l de carbenicilline et 50 mg/l de kanamycine et incubé à 37 C toute la nuit. III - Clonage dans Pbin19 L'insert cloné dans le vecteur P38resc de "Kanamycin rescue" subit un clonage intermédiaire dans le vecteur Bluescript pBKS+ (Stratagène, San Diego CA92121) avant d'être cloné dans le vecteur binaire pBin19 en vue de la transformation des plantes. Ces clonages se font de manière directionnelle par double digestion EcoRI/Xbal. Environ 250 ng de vecteur P38resc contenant l'insert et digéré par EcoRI et Xbal sont ligués avec environ 100 ng de vecteur KS+ digéré par les mêmes enzymes, non déphosphorylé, dans 40 l de volume final avec 10 U de T4 ADN ligase (BRL). Après incubation une nuit à 12 C, le mélange de ligation est précipité à l'éthanol/ NH40Ac, repris dans 10 l d'eau et utilisé pour électroporer des bactéries NM522 (BRL), rendues électrocompétentes suivant la technique décrite par Sambrook et al.,(1989). Les colonies positives blanches sont sélectionnées sur un milieu LB-agar contenant 40 mg/l de XGal, 8 mg/l d'IPTG (Genaxis Biotechnology, 78180, Montigny le Bretonneux) et 100mg/l de carbénicilline. -Clonage dans pBin19. L'insert contenu dans pBKS+, après digestion par EcoRI et Xbal, est purifié par électroélution à partir d'un gel d'agarose à 1%, selon la technique de Sambrook et al., (1989). Pour le clonage, 100ng de l'insert de 4. 3 kb et 100ng de vecteur pBin19 (12 kb) préalablement digéré par EcoRI et Xbal (soit un rapport molaire insert/vecteur de 3/1) sont mélangés dans 40 l de volume total avec 10 l de ligase (BRL) et ligués sur la nuit à 12 C Après précipitation à l'éthanol/ NaOAc, le produit de ligation est repris dans 10 l d'eau et utilisé pour réaliser l'électroporation des bactéries NM522. La sélection des colonies positives se fait sur des boîtes de Pétri avec un milieu LB-agar contenant XGal et IPTG, comme ci-dessus et 50mg/1 de kanamycine. IV - Méthode à l'exonucléase III (Current Protocols in Molecular Biology, éditeurs: F.M. Ausubel, R. Brent, R. E Kingston, D D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl; published by Wiley Interscience) Le fragment d'ADN d'intérêt de 4,3kb a été recloné dans un vecteur pBluescript Il KS+ au site EcoRI du polylinker. Ensuite le plasmide de ce clone a été isolé et purifié par la méthode de "Qiagen-Midi-Preparation Tip 100( Qiagen) à partir d'une culture de 30 ml. Pour pouvoir séquencer dans les deux sens, 5 g plasmide ont été doublement digérés par Xhol/Kpnl d'une part et par Spel/Sacl d'autre part, dans un volume de 50 l chaque fois. (100ng de plasmide linéarisé de chaque digestion a été gardé pour une vérification sur gel d'agarose). Le reste du plasmide linéarisé à chaque digestion a été précipité à l'éthanol 95% (3 volumes) et NaOAc 3M (1/5 volume) pendant une heure dans la glace. Après 20 minutes de centrifugation à 13000 tpm et à +4 C , le plasmide digéré de chaque digestion a été rincé avec l'éthanol à 70%, seché au "speed-vac" pendant 5 minutes et repris dans 50 l de tampon Exolll dilué à 1 x (0.66M Tris/HCI pH=8,0 , 66 mM MgCl2, 50mM DTT, 500ug /ml BSA ; USB, United States Biochemicals). Pour créer les délétions de chaque côté, 25 l ( 2,5ug ) de chaque digestion ont été préincubés à 37 C pendant 2 minutes, 0,8 l de Exolll (100u/pl; USB), soit 150unités Exolll par picomole d'extremités 3', ont été ajoutés et reincubés à 37 C. Toutes les minutes, 3 l (300ng) d'ADN ont été prélévés et placés immédiatement dans la carboglace (=8 prélèvements totaux). Puis 3 l d'eau ont été ajoutés à chaque prélèvement , incubés pendant 10 minutes à 70 C pour inactiver l'enzyme Exolll. Tous les échantillons ont été placés dans la glace. Après addition de 15 l de tampon de nucléase S1 (300mM Na acétate pH 4,6 ,10mM Zn acétate, 50% v/v glycérol) et de 4 l (4 unités) de nucléase S1 (Gibco BRL) , ces échantillons ont été incubés pendant 20 minutes à température ambiante. La réaction de la nucléase S1 a été arrêtée en ajoutant 5 l de tampon "stop" (0,3M Tris/HCI pH 8,0 , 0.05M EDTA) à chaque échantillon . Des fractions aliquotes de 8 l ont été prélévées pour une vérification sur gel d'agarose. Le volume restant (22 l) de chaque échantillon a été incubé pendant 20 minutes à 37 C après avoir ajouté 2 unités de fragment de Klenow et 1 l de dNTP's à 0,25mM. Enfin les molécules délétées ont été recircularisées en ajoutant 1 l (1 unité) de T4DNA ligase (USB), 3 l de tampon 10x (660mM Tris/HCI pH=7,6, 66mM MgCl2, 100mM DTT, 660pm ATP) et 2 l d'eau à chaque échantillon. Les ligations ont été faites dans un volume total de 30 l et incubées à 16 C pendant la nuit. Puis un tiers du volume (10 l) des produits issus de chaque ligation a été utilisé pour transformer 100 l de cellules compétentes E.coli DH5a par la méthode au Chlorure de Calcium ( Current Protocols in Molecular Biology, éditeurs : F.M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl,; published by Wiley Interscience ) . Les cellules transformées de E. coli DH5a ont été sélectionnées sur LB-agar contenant de la carbénicilline à 100mg/l, 40 mg/l de XGal et 8 mg/l d'IPTG. V - Extraction des ARN totaux (Heim U., Weber H., Bâumlein H., Wobus U., 1993. A sucrosesynthase gene of Vicia faba L.: expression pattern in developing seeds in relation to starch synthesis and metabolic regulation. Planta 191 : 3494-501) Les tissus frais congelés (plantule -2g et racine #1g) ont été écrasés dans l'azote liquide à l'aide d'un mortier et un pilon. Puis 500 l de tampon d'extraction (1 M Tris/HCI pH 7,4 , 1% SDS , 5mM EDTA) pour 200mg tissu ont été ajoutés goutte à goutte, puis le même volume de phenol/chloroforme/isoamylalcohol, tout en continuant le broyage jusqu'a obtenir une poudre lisse. Après décongélation, chaque solution a été transferée dans un tube et centrifugée pendant 5 minutes à +4 C . Chaque phase aqueuse a été réextraite deux fois avec le même volume de phénol/chloroforme/isoamylalcohol et précipitée à l'éthanol (3 volumes) / NaOAC ( 1/10 volume) pendant une heure à -80 C. Après centrifugation pendant 30 minutes à +4 C, chaque culot a été séché brièvement et dissous dans de l'eau+DEPC . Une deuxième centrifugation pendant 10 minutes à +4 C a été faite et chaque surnageant a été mélangé avec le même volume de LiCI à 4M pour une précipitation des acides ribonucléiques dans la glace à +4 C pendant la nuit. Ensuite chaque solution a été centrifugée pendant 15 minutes et les culots d'ARN ont été lavés deux fois dans LiCI 2M et une fois dans de l'éthanol à 70% . Apès un séchage au "speed-vac , chaque culot d'ARN a été dissous dans de l'eau+DEPC et la concentration d'ARN a été verifiée par spectrophotométrie. VI - Test GUS (Jefferson R. A., 1987. Assaying chimeric genes in plants: the gus gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5 : - Par histochimie Quinze jours après la germination des transformants d'Arabidopsis, l'activité GUS est téstée grâce à l'acide X-glucuronique (X-Glu, Biosynth G. Staad, Suisse) comme décrit par Jefferson et al., modifié par l'utilisation de 100 mM KH2PO4, 0. 4 mM de catalyseur K3Fe (CN)6 0. 4 mM K4Fe(CN)6. Aucun bruit de fond n'a été observé dans les tissus des plantes non transformées. - Par fluorimétrie Les échantillons de plantes (racines ou feuilles) sont broyés en tube EppendorfTM avec 200 l de tampon d'extraction ( 50mM NaP04, 10 mM dithiothreitol, 10 mM EDTA, pH7) et une pincée de sable de Fontainebleau. Après centrifugation deux fois 10 min à 13000tpm à 4 C, le dosage d'activité GUS est réalisé sur le surnageant, dans 150 l de volume final contenant le substrat MUG (4-Methyl-p-D-glucuronide d'ombellifère, Sigma) à concentration finale de 3 mM. Après 15 min d'incubation à 37 C, l'activité GUS est mesurée grâce à un appareil Fluoroskan Il ( Labsytems, 91944 Les Ulis, France) avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 365 nm et 455 nm, respectivement. Les concentrations de protéines dans les extraits de plantes sont mesurées en utilisant le réactif de Bradford (Biorad) Les concentrations d'ADN sont mesurées en utilisant le réactif de Hoechst (Sigma). La réaction se fait dans 200 l de volume final (tampon Labarca-Paigen : 50 mM NaP04, NaCI 2M, EDTA 2mM, pH 7. 5) contenant le réactif de Hoechst à 0.5 mg/ml. EXEMPLE 1: Isolement d'une séquence nucléotidique d'environ 2,2 kb par piégeage de promoteur. Une collection de transformants d'Arabidopsis thaliana (écotype WS) a été obtenue selon la technique décrite par Bechtold et al. (1993). Les plantes ont été transformées par insertion aléatoire dans leur génome d'un ADN de transfert (ADN-T) transmis par la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Cet ADN de transfert comporte un gène gus sans promoteur tel que décrit par Bouchez étal. (1993, C.R.A.S. Paris, volume 316 :1188-1193). La méthode de transformation ln planta a été choisie et mise au point à la Station Génétique de Versailles de l'Institut National de la Recherche Agronomique selon la méthode décrite par Bechtold et al. (1993, C.R.A.S Paris, volume 316:1194-1199). Cette méthode permet d'obtenir rapidement un nombre élevé de transformants indépendants comportant un nombre limité d'insertions (1,5 insertions par transformant en moyenne). Un criblage de l'expression du gène GUS par histochimie parmi les transformants selon la méthode décrite par Mollier et al. (1995, C.R.A.S. Paris, volume 318: 465-474) a permis d'isoler un transformant présentant une activité GUS particulière: # expression très forte spécifiquement dans la racine, et ce tout au long du développement, comme montré dans les clichés correspondant à la figure 3a-c. La racine est colorée sur toute la longueur sauf la zone d'élongation (figure 3d) # expression dans toutes les assises cellulaires de la racine (épiderme, cortex, endoderme, péricycle, vaisseau conducteur) telle que cela peut être observé sur le cliché de la figure 4. Ce transformant a été caractérisé plus avant par la technique de Southern blot (Southern E M.,1975). Une séquence d'environ 2,2 kb située en amont de la bordure droite de l'insertion, correspondant au promoteur, a été clonée par la technique de Kanamycin Rescue selon la technique décrite par Bouchez et al. (1996, Plant Mol. Biol. Rep. vol. 14:115-123). Le vecteur de Kanamycin rescue est représenté en figure 7. EXEMPLE 2 : de la séquence complète du promoteur selon l'invention. Le fragment d'ADN de 2,2 kb a été utilisé comme sonde pour rechercher le promoteur entier dans une banque d'ADN génomique d'Arabidopsis thaliana d'écotype Columbia (J. T. Mulligan, Stanford CA 94305). Deux phages d'environ 15 kb ont été sélectionnés (clones Ir1 et Ir2).. Ces deux clones de phages comportaient un insert correspondant à un fragment génomique de 4,413 kb (SEQ ID N 3) et contenant la séquence de la sonde. L'insert de ces deux phages a été entièrement séquence par la méthode à l'exonucléase III décrite par Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, éditeurs. F. M. AUSUBEL, R. BRENT., R.E. KINGSTON, D. D. MOORE, J.G. SEIDMAN, J. A. SMITH, K. STRUHL; published by Wiley Interscience). Il s'agit de la séquence SEQ ID N 3 . Le début de la séquence correspondant à l'ADN-T est localisé à partir du nucléotide en position 2285 de la séquence SEQ ID N 3. L'expression spécifique du gène gus a été mise en évidence par des expériences de Northern blot sur des ARN totaux extraits de transformants homozygotes pour l'insertion. Les résultats d'une expérience de Northern blot sont représentés à la figure 5. Un transcrit d'environ 2 kb est mis en évidence sur les ARN de racine et n'est pas détectable sur les ARN des parties aériennes (figure 5) Les ARN totaux ont été extraits de racines et de parties aériennes de la lignée transformée selon la méthode décrite par Heim et al. (1993, Planta, vol. 191: 3.494, 3501). En vue de mettre en évidence un éventuel transcrit endogène correspondant au promoteur, des gels de Northern ont été réalisés sur des ARN totaux extraits de plantes non transformées, et hybridées avec le fragment génomique de 4,413 kb (SEQ ID N 3) qui contient environ 2,2 kb en aval du promoteur. Aucun transcrit n'a été détecté avec cette sonde. En outre, deux banques d'ADNc d'Arabidopsis thaliana indépendantes (une banque d'ADNc de racines et une banque d'ADNc de plantes entières) ont été criblées avec cette même sonde de 4,413 kb. A nouveau, les résultats ont été négatifs et aucun ADNc correspondant au promoteur n'a été trouvé. Enfin, aucune phase codante n'a pu être mise en évidence en aval du promoteur en utilisant les logiciels classiques de prédiction. Logiciels Net Plant Gene et Net Gene 2 : S.M. Hebsgaard et al.(1996). Brunak S. et al. (1991). Logiciel Genscan : Burge, C. et al. (1997) ; Burge, C. B. (1998). La séquence de 4,413 kb (SEQ ID N 3) est très riche en bases A et T (68% de A et de T) et comporte 67 motifs ATG, 20 motifs CAAT, 38 motifs TATA, 9 motifs TATAAT et 2 boîtes Cr. Les résultats obtenus indiquent qu'aucun transcrit n'est décelable en aval du promoteur étudié. Il s'agirait donc d'un promoteur cryptique. EXEMPLE 3 : en évidence de l'activité promotrice. L'activité promotrice a été démontrée en réalisant une retransformation in planta d'Arabidopsis thaliana (écotype WS) par ce promoteur de 2,2 kb placé en amont du gène rapporteur gus. Pour cette expérience, la construction suivante a été réalisée, qui est représentée sur la figure 2 : fragment d'environ 4,27 kb compris entre les sites Xbal et EcoRI du vecteur de kanamycin Rescue (cf. figure 7) a été cloné dans l'ADN-T du vecteur pBin19 selon la technique décrite par Bevan M. (1984, Nucleic Acid Research vol. 12: 8711-8721). Ce fragment d'ADN de 4,27 kb est inclus dans la séquence SEQ ID N 4, cette séquence comprenant également un polysite de clonage du vecteur P38, comme décrit ci-après. Il comporte: les sites de clonage de P38: Xbal, Spel, BamHl, Smal, Pstl (nct 1 à 29), la séquence promotrice SEQ ID N 1 (nct 30 à 2178) et la séquence du gène gus de l'ADN-T de PGKB5 jusqu'au site EcoRI (nct 2179- 4309). EXEMPLE 4 : de plantes d'Arabidopsis thaliana avec la construction contenant le gène gus placé sous le contrôle du promoteur. Des plantes d'Arabidopsis thaliana ont été transformées via Agrobacterium tumefaciens avec la construction 1 décrite dans la figure 2 et neuf transformants individuels ont été étudiés pour l'expression du gène gus, d'abord en histochimie. L'expression du gène gus a également été quantifiée par dosage fluorimétrique selon la technique décrite par Jefferson (1987, Plant, Mol. Biol. Rep. volume 5.387), modifiée par l'utilisation de 5mM de substrat dans les racines d'une part, et dans les parties aériennes (cotylédons, feuilles, tiges), d'autre part, et ce, à plusieurs stades du développement des plantes. L'activité du gène gus des neuf transformants a été comparée à celle du transformant initial. Les résultats sont représentés sur le tableau # ci-après. Pour le transformant de départ ACC6H, à l'état homozygote, ou ACC6T3, en ségrégation, l'activité du gène gus dans les racines diminue avec l'âge de la plante, alors qu'une faible activité dans les parties aériennes devient détectable en fin de développement. Pour 6 des 9 transformants étudiés (transformants 6i, 6h, 6-1,6-2, 6-3 et 6a) l'activité du gène gus dans les racines est encore plus forte que dans celle du transformant de départ (4 à dix fois ) et l'activité dans les feuilles devient plus facilement détectable. Cependant, le rapport activité du gène gus dans les racines/activité du gène gus dans la feuille reste constant. Pour ces transformants, la spécificité racinaire est donc inchangée par rapport au transformant de départ. Seul le niveau d'expression du gène gus est globalement plus élevé. Pour 3 des transformants (6b, 2b et 6k) le rapport activité du gène gus dans la racine/activité du gène gus dans la feuille est plus faible que dans le transformant de départ; l'expression du gène gus est donc moins spécifique des racines pour ces transformants. La diminution de l'activité GUS dans les racines au cours du développement est illustrée en figure 6, pour le transformant initial (a) et deux transformants caractéristiques (b et c). Pour le transformant initial, l'activité dans les feuilles n'est pas détectable. Pour le transformant 6-1, elle est faiblement détectable, et le rapport activité GUS racine/feuille est le même que pour le transformant initial. Pour le transformant 2b par contre, l'activité GUS dans les feuilles est plus élevée, et le rapport racine/feuille est nettement diminué. Jour 12 Jour 19 Jour 26 Jour 33 Transfor- racine feuille rapport racine/ racine feuille rapport racine feuille rapport racine feuille rapport mant feuille racine/feuille racine/feuille racine/ feuille ACC6H 4.06 0,02 4,19 0,09 47 1,55 0,05 31 12,07 0,19 11 ACC6T3 4.39 0,02 3,98 0,09 44 1,3 0,04 33 2,44 0,25 10 6i 16,42 0,05 12 0,25 48 4,93 0,12 41 8,74 0,57 15 6h 25,87 1,39 19 4,94 0,17 29 4 0,27 15 4,64 0,32 15 6.1 32,05 1,01 32 22 0,6 37 7,9 0,56 14 10,3 0,51 20 6. 3 40,61 1,84 22 7,75 0,45 17 21,68 0,73 30 3,97 0,34 12 6. 2 48,87 1,61 30 6,49 0,17 38 22,01 1,01 22 4,55 0,79 6 6a 6,93 0,14 50 1,4 0,01 140 1 0,27 25 1,48 0,07 21 6b 8,62 0,73 12 5,43 0,78 7 2,35 0,26 9 2,63 0,19 14 2b 33,02 4,91 7 4,93 1,31 4 3,69 1,3 3 2,8 0,77 4 6k 107,93 11,57 9 32,3 3,09 10 11,74 3,65 3 6,6 1,75 4 WS -0,06 0,33 0,1 0,07 -0,01 0 -0,04 0,01 TABLEAU 1 LISTE DE SEQUENCES Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Promoteur s'exprimant spécifiquement dans les cellules de racines de plantes, vecteurs et cellules hôtes recombinantes comprenant un tel promoteur et plantes transgéniques obtenues INRA Promoteur Végétal Racine 5 PatentIn Ver. 2. 1 1 2149 ADN Arabidopsis thaliana 1 gtcgaattgt gatatattgt aagcaatctg aaaagaataa gtgggatata taaacaaccg 60 gcgaaagtac aagttctacc tttttttggc atggaaccat gtttttagga tttactttgt 120 aattcctgaa tctttcattt cttgaattga tatttacatt tttatcaaaa aaaaagtaca 180 agttctacca aagcacagga gttaaacaac ttgtgtgtca aatgctaatt taaagcctaa 240 tcttatgatt tcccttttct tcacgatata tactgatatt gatatgcacc catttgtttg 300 tcattaactt cccactctat acatcagtat ctcaaagtcg aataacaata tccataagaa 360 gtggtatatt gtgaaaaaaa aaaaaaaaag tggtatactg gtatatacaa taccacggtc 420 tcgaattgcc tcaacaattt ctaggagaaa atggacgtgt ctctttggtt ttattttatt 480 cttaataaca tactctatat tttaaacact tcgatgtctc gcttaaattt cgaatgtgcc 540 taaatttctc taatcataaa tcgtaaagaa aattcgtcga agccacaggg acatgcatag 600 ggcacgtagt tacctttaaa accatcaaaa atatattaat agaaaaggaa acttcctaaa 660 agaacaattt aataaagtgg ataaaaaaag ataagaaggt aggcagaaga aaacgtatgg 720 ccgcgactcg taacaaggga cgtcccgacc actgcggaga cggcgagacg ctgactgatt 780 ttttcttttt cttttcctaa agaacgttgt ttcgtgctta caagggtcaa aaccatatcc 840 aattgttctg cctattatta tataactaaa gatcccctct tgtgctttgt ctttattcgt 900 gatatataat ctaacttaaa ttagttctaa aatatatatg tcctacctat gtttctactg 960 acctcagtcc ctagttagct atatggacat atgtgaaaat gacgcccaaa atttgaagag 1020 ttcctcttcc tgcaactaac tcttatctta ctcattgagc tatgttaaat attgaatgtt 1080 ggcactctcg tattaaatat gccagttgca cctagataaa aaaacatgat agacatttag 1140 tttaaaactt gaaatgttat ttgaactctt tggattacgt ggattgttgt atggattaaa 1200 ttttgaagat atttatatat tgaagatgtt tatatatatt agagtttata tagcagaaaa 1260 tattgatgta gatgttgtcc ttttgtagtt actctttttt gttgcgtagt cctttctcct 1320 catcctccta tgaagaaaaa tccaaatagt ttaaggaaat ttttgtgtaa ttcatagtct 1380 ttttcgtaac cacagttcta tgtagctatc gtcatcatat tcctctttgc aacaacaaaa 1440 aagatcgttt ttgtaaaatt tagtagggca ctaaagtcgt catttgttgt cctgtcgaaa 1500 tctagcgttc tgtcatccac aaataagttg tttgattcga gcttccaaga ttataatctt 1560 ttttagatgg gtcatgaaga tttctaactt cgtatacgag tgtatccata taatttctaa 1620 catatacgtc ttgtttttgg taggctctgc gtcttttgag accaccccct tgctaatgtt 1680 ttgttgcacc ttagacaatc cataatacgt tacgtgagtc gaagttgcac caaaatggtc 1740 caaatataat ttaaatttgg ccacaaaaca acattttaca aacaaattca acaaacatgc 1800 atcgtttcaa attttattta ttcaatggcg ttatttgttc attgtaaata ttctgtttaa 1860 ctcactgacg aattttttaa tttttcaaag aagaacattt ttgatataaa taacatttta 1920 tggaaccacc ggttaagctc gatgattttg agttttagtt ttgtcgtttt gtgaaatcat 1980 taacgaccta catttgatcc ctcattactt taataattag gaatcaaaca tgatgattaa 2040 gttcaccaaa gacgtctctt atggctatta agagtcagac gcaaggatga ccggggtcat 2100 taagacgtct tatattcaac cattactcca ctaattgcta attaatcag 2149 2 4280 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle:Construction promoteur + séquence codante du gène gus 2 gtcgaattgt gatatattgt aagcaatctg aaaagaataa gtgggatata taaacaaccg 60 gcgaaagtac aagttctacc tttttttggc atggaaccat gtttttagga tttactttgt 120 aattcctgaa tctttcattt cttgaattga tatttacatt tttatcaaaa aaaaagtaca 180 agttctacca aagcacagga gttaaacaac ttgtgtgtca aatgctaatt taaagcctaa 240 tcttatgatt tcccttttct tcacgatata tactgatatt gatatgcacc catttgtttg 300 tcattaactt cccactctat acatcagtat ctcaaagtcg aataacaata tccataagaa 360 gtggtatatt gtgaaaaaaa aaaaaaaaag tggtatactg gtatatacaa taccacggtc 420 tcgaattgcc tcaacaattt ctaggagaaa atggacgtgt ctctttggtt ttattttatt 480 cttaataaca tactctatat tttaaacact tcgatgtctc gcttaaattt cgaatgtgcc 540 taaatttctc taatcataaa tcgtaaagaa aattcgtcga agccacaggg acatgcatag 600 ggcacgtagt tacctttaaa accatcaaaa atatattaat agaaaaggaa acttcctaaa 660 agaacaattt aataaagtgg ataaaaaaag ataagaaggt aggcagaaga aaacgtatgg 720 ccgcgactcg taacaaggga cgtcccgacc actgcggaga cggcgagacg ctgactgatt 780 ttttcttttt cttttcctaa agaacgttgt ttcgtgctta caagggtcaa aaccatatcc 840 aattgttctg cctattatta tataactaaa gatcccctct tgtgctttgt ctttattcgt 900 gatatataat ctaacttaaa ttagttctaa aatatatatg tcctacctat gtttctactg 960 acctcagtcc ctagttagct 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ttcaatggcg ttatttgttc attgtaaata ttctgtttaa 1860 ctcactgacg aattttttaa tttttcaaag aagaacattt ttgatataaa taacatttta 1920 tggaaccacc ggttaagctc gatgattttg agttttagtt ttgtcgtttt gtgaaatcat 1980 taacgaccta catttgatcc ctcattactt taataattag gaatcaaaca tgatgattaa 2040 gttcaccaaa gacgtctctt atggctatta agagtcagac gcaaggatga ccggggtcat 2100 taagacgtct tatattcaac cattactcca ctaattgcta attaatcagt cccttatgtt 2160 acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag 2220 tctggatcg gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt tacaagaaag 2280 ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa 2340 ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca 2400 gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca 2460 ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt 2520 tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac 2580 tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca 2640 tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 2700 ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 2760 tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 2820 ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg 2880 gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg 2940 tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcc aacagttcct 3000 gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttacg 3060 tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg 3120 ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga 3180 tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg 3240 cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg 3300 ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca 3360 cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aagtgcacgg 3420 gaatatttcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg 3480 cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct 3540 gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa 3600 ggtactggaa aaagaacttc tggcctggca ggagaaactg catcagccga ttatcatcac 3660 cgaatacggc gtggatacgt tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga 3720 agagtatcag tgtgcatggc tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt 3780 cgtcggtgaa caggtatgga atttcgccga ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt 3840 tggcggtaac aagaaaggga tcttcactcg cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct 3900 gctgcaaaaa cgctggactg gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca 3960 atgaatcaac aactctcctg gcgcaccatc gtcggctaca gcctcggtgg ggaattgagc 4020 tcgatcgttc aaacattgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 4080 cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 4140 gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 4200 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 4260 ctatgttact agatcgaatt 4280 3 4413 ADN Arabidopsis thaliana 3 aagatccaca gtgaataaat aataagaacg gattcggtga tattgcaact atataatgaa 60 attgaatact ctgattcatc gctttgtatc aagatcgaat ctctaaaaac atatactcta 120 taataaatat ctgcagtcga attgtgatat attgtaagca atctgaaaag aataagtggg 180 atatataaac aaccggcgaa agtacaagtt ctaccttttt ttggcatgga accatgtttt 240 taggatttac tttgtaattc ctgaatcttt catttcttga attgatattt acatttttat 300 caaaaaaaaa gtacaagttc taccaaagca caggagttaa acaacttgtg tgtcaaatgc 360 taatttaaag cctaatctta tgatttccct tttcttcacg atatatactg atattgatat 420 gcacccattt gtttgtcatt aacttcccac tctatacatc agtatctcaa agtcgaataa 480 caatatccat aagaagtggt atattgtgaa aaaaaaaaaa aaaagtggta tactggtata 540 tacaatacca cggtctcgaa ttgcctcaac aatttctagg agaaaatgga cgtgtctctt 600 tggttttatt ttattcttaa taacatactc tatattttaa acacttcgat gtctcgctta 660 aatttcgaat gtgcctaaat ttctctaatc ataaatcgta aagaaaattc gtcgaagcca 720 cagggacatg catagggcac gtagttacct ttaaaaccat caaaaatata ttaatagaaa 780 aggaaacttc ctaaaagaac aatttaataa agtggataaa aaaagataag aaggtaggca 840 gaagaaaacg tatggccgcg actcgtaaca agggacgtcc cgaccactgc ggagacggcg 900 agacgctgac tgattttttc tttttctttt cctaaagaac gttgtttcgt gcttacaagg 960 gtcaaaacca tatccaattg ttctgcctat tattatataa ctaaagatcc cctcttgtgc 1020 tttgtcttta ttcgtgatat ataatctaac ttaaattagt tctaaaatat atatgtccta 1080 cctatgtttc tactgacctc agtccctagt tagctatatg gacatatgtg aaaatgacgc 1140 ccaaaatttg aagagttcct cttcctgcaa ctaactctta tcttactcat tgagctatgt 1200 taaatattga atgttggcac tctcgtatta aatatgccag ttgcacctag ataaaaaaac 1260 atgatagaca tttagtttaa aacttgaaat gttatttgaa ctctttggat tacgtggatt 1320 gttgtatgga ttaaattttg aagatattta tatattgaag atgtttatat atattagagt 1380 ttatatagca gaaaatattg atgtagatgt tgtccttttg tagttactct tttttgttgc 1440 gtagtccttt ctcctcatcc tcctatgaag aaaaatccaa atagtttaag gaaatttttg 1500 tgtaattcat agtctttttc gtaaccacag ttctatgtag ctatcgtcat catattcctc 1560 tttgcaacaa caaaaaagat cgtttttgta aaatttagta gggcactaaa gtcgtcattt 1620 gttgtcctgt cgaaatctag cgttctgtca tccacaaata agttgtttga ttcgagcttc 1680 caagattata atctttttta gatgggtcat gaagatttct aacttcgtat acgagtgtat 1740 ccatataatt tctaacatat acgtcttgtt tttggtaggc tctgcgtctt ttgagaccac 1800 ccccttgcta atgttttgtt gcaccttaga caatccataa tacgttacgt gagtcgaagt 1860 tgcaccaaaa tggtccaaat ataatttaaa tttggccaca aaacaacatt ttacaaacaa 1920 attcaacaaa catgcatcgt ttcaaatttt atttattcaa tggcgttatt tgttcattgt 1980 aaatattctg tttaactcac tgacgaattt tttaattttt caaagaagaa catttttgat 2040 ataaataaca ttttatggaa ccaccggtta agctcgatga ttttgagttt tagttttgtc 2100 gttttgtgaa atcattaacg acctacattt gatccctcat tactttaata attaggaatc 2160 aaacatgatg attaagttca ccaaagacgt ctcttatggc tattaagagt cagacgcaag 2220 gatgaccggg gtcattaaga cgtcttatat tcaaccatta ctccactaat tgctaattaa 2280 tcagattaat ttgtttaata cgataatgta ttttgattaa gtagctctca gccaacaggc 2340 aaaggataaa ttttggatta ttcaaagatt tgtgggcttc caaaagcata gggaatggct 2400 ccaactacat tgggaaatat attatttaaa tctccattcc catttgccac agtcgttgga 2460 gtttattttt tttttccaag tggaagaatc aattataatt gtcggaattt ctaaatccta 2520 cttgttggaa aacaaaccca agcaaaatta gtttagaaat gtacggaaat ctactataga 2580 attatactaa acatatcaat atagctttga ctttaaaatt aaaacaatta ttgtgggcaa 2640 ttagttagat attttaccag gggaaataag cagcactgtt catgcactct cttcttaatt 2700 actatacttt gaaagaatt atatgtcact gtattgccag ttgccactaa tatataaaca 2760 acatttcact tgttgacatc gctgtaaatg aagtttggaa cgaccctctt aacaactaat 2820 agggttaatt aaccactaaa tttttccaag ttgtcatttt gtcttaatgt gagacgtaat 2880 atctaatacg tcggtctaac ctaagagttg gttccgatca caaatttttg agaagtacct 2940 ttcaataaaa aatttgttgt tataatttca ccgtgttaag taaaaactta attaggagct 3000 attttctatt tgatgtgaat ttgaaaatgt cttcataaaa atagtatgga aaagggaatg 3060 taattaatat agaccacaga tacaaaaaga tgtcccgtgc ttaacacgtc tgagtcattg 3120 tcgtaccctt ttgccaactt tttcaagttt ctttcgtgaa aatgactaca ctttttaaaa 3180 taaattgaca gatgattgtt gcatgcatat aatattcgca aaatgccaaa ttctaccctt 3240 aaccaaataa tgggtaatgg atataaaata gttaacataa acaaaaattt ggaaattttg 3300 aaaaatagag agtaaattga ttttttttaa aaagtttgaa ttgaagtgaa aaaatatata 3360 ataaaaataa taaacctgta gtttgatata tatagttaga tagctcaagt ttgagtaact 3420 tgaagtcttg aattacttta tatgtttttc tcacagatta tattattttc gttctatccc 3480 aagaattggg ataatattct ctatattcga ggcctctctc ttaagaagtc ggtgtataat 3540 cttaagccct tacttgacac aaggcctcta ttaaaaagcc caataataat ttttcttttc 3600 aaagcccaac acgtcaagag gagaaagaag tgcgtttgcg tttggattga aaacgtggcg 3660 ggcggttgga aactgaatct taaacccttc actcacattc atcttcaccg tcaaatctct 3720 gaaactgagc ttcgacgatg ttgggtttac gaagatctgc gacgaccttg ttcgacatca 3780 gccagtctct gcttcgtaat gttacggtta gtatctgtct aacacttcag cgccacattt 3840 gggttttacg attagggttt caatagatcg aatcgattca tctctcttgg tattagattt 3900 catcaaattc aaatctatcg tcacctaaaa atctctcttt cggtatgtag tatttccggg 3960 gttgtttcaa agtcgtctta ttgctctgtg attttggctt cttacccatt ttcaacagtg 4020 ctatgtagaa gaaagaacaa atctttgaaa tcgaaaggtc taatgtatag ttcaatgtct 4080 acattatgag attgccatga tattatagtc aaacgattct cctaaagcgt ttacttttgt 4140 ggagcattct ttgttagttc tatgcaaata aagttctagg aatgataatt cttaaggaag 4200 catctcaaat gttggctagt tcttgtctca ggttaaaaca atgttttgca atttgctttt 4260 agttagaatt gttgacttgc ttagcttttt gactaactct gtctctgtga agcaaagttt 4320 gatcaaaccc attaccttat ttgatttctc tctttagatt atacatcaat ttatgtattt 4380 tctttgtcta cagtttcatg ggttacgagt cca 4413 4 4309 ADN S quence artificielle Description de la s quence artificielle:Insert du vecteur pBinl9 4 tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag tcgaattgtg atatattgta agcaatctga 60 aaagaataag tgggatatat aaacaaccgg cgaaagtaca agttctacct ttttttggca 120 tggaaccatg tttttaggat ttactttgta attcctgaat ctttcatttc ttgaattgat 180 atttacattt ttatcaaaaa aaaagtacaa gttctaccaa agcacaggag ttaaacaact 240 tgtgtgtcaa atgctaattt aaagcctaat cttatgattt cccttttctt cacgatatat 300 actgatattg atatgcaccc atttgtttgt cattaacttc ccactctata catcagtatc 360 tcaaagtcga ataacaatat ccataagaag tggtatattg tgaaaaaaaa aaaaaaaagt 420 ggtatactgg tatatacaat accacggtct cgaattgcct caacaatttc taggagaaaa 480 tggacgtgtc tctttggttt tattttattc ttaataacat actctatatt ttaaacactt 540 cgatgtctcg cttaaatttc gaatgtgcct aaatttctct aatcataaat cgtaaagaaa 600 attcgtcgaa gccacaggga catgcatagg gcacgtagtt acctttaaaa ccatcaaaaa 660 tatattaata gaaaaggaaa cttcctaaaa gaacaattta ataaagtgga taaaaaaaga 720 taagaaggta ggcagaagaa aacgtatggc cgcgactcgt aacaagggac gtcccgacca 780 ctgcggagac ggcgagacgc tgactgattt tttctttttc ttttcctaaa gaacgttgtt 840 tcgtgcttac aagggtcaaa accatatcca attgttctgc ctattattat ataactaaag 900 atcccctctt gtgctttgtc tttattcgtg atatataatc taacttaaat tagttctaaa 960 atatatatgt cctacctatg tttctactga cctcagtccc tagttagcta tatggacata 1020 tgtgaaaatg acgcccaaaa tttgaagagt tcctcttcct gcaactaact cttatcttac 1080 tcattgagct atgttaaata ttgaatgttg gcactctcgt attaaatatg ccagttgcac 1140 ctagataaaa aaacatgata gacatttagt ttaaaacttg aaatgttatt tgaactcttt 1200 ggattacgtg gattgttgta tggattaaat tttgaagata tttatatatt gaagatgttt 1260 atatatatta gagtttatat agcagaaaat attgatgtag atgttgtcct tttgtagtta 1320 ctcttttttg ttgcgtagtc ctttctcctc atcctcctat gaagaaaaat ccaaatagtt 1380 taaggaaatt tttgtgtaat tcatagtctt tttcgtaacc acagttctat gtagctatcg 1440 tcatcatatt cctctttgca acaacaaaaa agatcgtttt tgtaaaattt agtagggcac 1500 taaagtcgtc atttgttgtc ctgtcgaaat ctagcgttct gtcatccaca aataagttgt 1560 ttgattcgag cttccaagat tataatcttt tttagatggg tcatgaagat ttctaacttc 1620 gtatacgagt gtatccatat aatttctaac atatacgtct tgtttttggt aggctctgcg 1680 tcttttgaga ccaccccctt gctaatgttt tgttgcacct tagacaatcc ataatacgtt 1740 acgtgagtcg aagttgcacc aaaatggtcc aaatataatt taaatttggc cacaaaacaa 1800 cattttacaa acaaattcaa caaacatgca tcgtttcaaa ttttatttat tcaatggcgt 1860 tatttgttca ttgtaaatat tctgtttaac tcactgacga attttttaat ttttcaaaga 1920 agaacatttt tgatataaat aacattttat ggaaccaccg gttaagctcg atgattttga 1980 gttttagttt tgtcgttttg tgaaatcatt aacgacctac atttgatccc tcattacttt 2040 aataattagg aatcaaacat gatgattaag ttcaccaaag acgtctctta tggctattaa 2100 gagtcagacg caaggatgac cggggtcatt aagacgtctt atattcaacc attactccac 2160 taattgctaa ttaatcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 2220 aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag 2280 cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 2340 gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 2400 gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 2460 cattacggca aagtgtggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 2520 ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt 2580 tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa 2640 aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc 2700 agcgtaatgc tctacacac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat 2760 gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc 2820 agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg 2880 actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg 2940 tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg 3000 tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc 3060 tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg 3120 cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct 3180 tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact 3240 gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa 3300 gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt 3360 aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac 3420 gaaccggata cccgtccgca agtgcacggg aatatttcgc cactggcgga agcaacgcgt 3480 aaactcgacc cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc 3540 gataccatca gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc 3600 caaagcggcg atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag 3660 gagaaactgc atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg 3720 cactcaatgt acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat 3780 caccgcgtct ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat 3840 tttgcgacct cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc 3900 gaccgcaaac cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc 3960 ggtgaaaaac 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gattatcatc accgaatacg gcgtggatac 2160 gttagccggg ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg 2220 gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg 2280 gaatttcgcc gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg 2340 gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac 2400 tggcatgaac ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc 2460 tggcgcacca tcgtcggcta cagcctcggt ggggaattga gctcgatcgt tcaaacattt 2520 ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 2580 ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 2640 gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 2700 tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgaa 2760 ttcgatcgag gggatcgagc ccctgctgag cctcgacatg ttgtcgcaaa attcgccctg 2820 gacccgccca acgatttgtc gtcactgtca aggtttgacc tgcacttcat ttggggccca 2880 catacaccaa aaaaatgctg cataattctc ggggcagcaa gtcggttacc cggccgccgt 2940 gctggaccgg gttgaatggt gcccgtaact 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tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 3840 aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 3900 acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 3960 gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 4020 gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 4080 agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 4140 tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 4200 tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 4260 cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 4320 accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 4380 tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 4440 ccatcttgtt caatccacat gatcatgggc cggatctttg attgagagtg aatatgagac 4500 tctaattgga taccgagggg aatttatgga acgtcagtgg agcatttttg acaagaaata 4560 tttgctagct gatagtgacc ttaggcgact tttgaacgcg caataatggt ttctgacgta 4620 tgtgcttagc tcattaaact ccagaaaccc 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cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga 5520 tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa 5580 cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga 5640 aggtggcacc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc 5700 tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 5760 cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 5820 tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 5880 tttggagagg acacgctgaa atcaccagtc tctctctaca aatcggatcc atgagcccag 5940 aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg gtctgcacca 6000 tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg caggaaccgc 6060 aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc gtcgccgagg 6120 tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc aacgcctacg 6180 actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg ggactgggct 6240 ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag agcgtggtcg 6300 ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc ggatatgccc 6360 cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac gtgggtttct 6420 ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc accgagatct 6480 gatctcacgc gtctaggatc cgatggatcc cccgatgagc taagctagct atatcatcaa 6540 tttatgtatt acacataata tcgcactcag tctttcatct acggcaatgt accagctgat 6600 ataatcagtt attgaaatat ttctgaattt aaacttgcat caataaattt atgtttttgc 6660 ttggactata atacctgact tgttatttta tcaataaata tttaaactat atttctttca 6720 agatgggaat taacatctac aaattgcctt ttcttatcga ccatgtacat caagcttatc 6780 gataccgtcg gctattggta ataggacact gggattcgtc ttggacaact ttccttctca 6840 tctaagcgta gacaaccctc aactggaaac gggccggact ccagggcgtg tgccaggtgc 6900 ccacggaata gttttggcca gacccttgaa aatccgattc agtacaatcg attgccctca 6960 tttttacgtt ggcatatatc ctgccaaaca gccaacaacg cgcgtgcggt gaataggaaa 7020 gcgtttgagt tgcttgctca tatcgtgacg gttgacagca caggttgacc gcttgatgat 7080 tcgtacgagc cgccaaacat tggctgtcgt aatgatatac catgtcagaa cagcaatccg 7140 atggggcgga aagcattatc ttaatgcaca cggaaatggc gcgtcggtgg gtggaataca 7200 ccgacataga ggccgtaagt tctgcatggt catcgtcgga aaggtggcag caggcgcacg 7260 gctgtggcct cttgctcttt cagcgtgaaa tgcgtgttga aagaataatc gaagagagcg 7320 tccgctcgac accttcaatt atgccgattt gatcgatgaa ctgatcgagc tctgaaatcg 7380 aaggggcttc gataatcgca atcaaatcaa aagtgccact cacagaatga agagcgataa 7440 cggccgtgac cttcccaagg gaggccgtca cctgtgaaag cgccttcgta atggtgatca 7500 gaatatgggc tcgaaccaag ctcgagacct cgaggggggg cccggtaccc aattcgccct 7560 atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttac 7599 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES: F. M. AUSUBEL, R. BRENT, R.E. KINGSTON, D. D. MOORE, J.G. SEIDMAN, J. A. SMITH, K. STRUHL ; Current Protocols in Molecular Biology published by Wiley Interscience. # BASTOLA, D.R., PETHE, V. V. and WINICOV, 1. (1998). Alfin 1 , a novel zinc finger protein in alfalfa roots that binds to promoter elements in the sait inducible MSPRP2 gène, Plant. Mol. Biol. 38, 1123-1135). # BECHTOLD N. , Ellis J. PELLETIER G., 1993. Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199. # BOUCHEZ D., CAMILLERI C., CABOCHE M. 1993. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C.R. Acad. Sci. Paris 316 : 1188-1193.# BEVAN M. 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acid Research 12 : 8711-21.# BRUNAK S. ENGELBRECHT, J. and KNUDSEN, S.: Prediction of human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA séquence. Journal of Molecular Biology, (1991), 220, 49-65. # BURGE, C. and KARLIN, S. (1997). Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J. Mol. Biol. 268,78-94, BURGE, C. B. (1998). Modeling dependencies in pre-mRNA splicing signais. In SALZBERG, S. SEARLS, D. and KASIF; S. eds. Computational methods in molecular biology. Elsevier Science, Amsterdam, pp. 127-163. # BOUCHEZ D. , VITTORIOSO P., COURTIAL B. CAMILLERI C., 1996. Kanamycin Rescue : Asimple technique for the recovery of T-DNA flanking séquences. Plant Mol. Biol. Rep. 14 : 115-123.# BOUCHEZ D. CAMILLERI C., CABOCHE M. , 1993. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C. R. Acad. Sci. Paris 316 : 1188-1193.# CRAWFORD, N. M. and GLASS, A. D.M. 1998. Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends in Plant Science, 3,389-395. # CORMACK , B. P. VALDIVIA, R. H. FALKOW, S. (1996), FACS- optimized mutants of the freen fluorescent protein (GFP) Gene 173 : 33-38. # JEFFERSON R. A., 1987. Assaying chimeric genes in plants: the Gus gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep.5: 387. # HEBSGAARD S. M., P.G. KORMING, N. TOLSTRUP, J. ENGELBRECHT, P. ROUZE, S. BRUNAK: Splice site prediction in Arabidopsis thaliana DNA by combining local and global séquence information. Nucleic Acids Research, (1996), Vo1.24, N 17, 3439-3452. . HEIM U. WEBER H., BAUMLEIN H. WOBUS U. 1993. A sucrosesynthase gene of Vicia faba L. Expression pattern in developing seeds in relation to starch synthesis and metabolic regulation. Planta 191 : 3494-501. # HESSE, H. SONNEWALD, K. and WILLNITZER, L. (1995). Cloning and expression analysis of sucrose-phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L. ) Mol. Gen. Genet, 247,515-520). # HWANG et al., (1995). An Arabidopsis thaliana root spécifie kinase homolog is induced by dehydration, ABA, and NaCI. Plant J.8: 37-43. . HWANG I., GOODMAN, H. M. (1995). An Arabidopsis thaliana root spécifie kinase homolog is induced by deshydration, ABA, and NaCI, The Plant Journal, 8,37-43). # LEAH, R. TOMMERUP, H. SVENDSEN, I. and MUNDY, Y. (1991). Biochemical and molecular characterization of three barley seed proteins with antifungal properties . J. Biol. Chem. 266,1464-1573). . MALAMY, Y. E., BENFEY, P. N. (1997). Analysis of scarecrow expression using a rapid system for assessing transgene expression in Arabidopsis roots. Plant Y. 12: 957-963. # MOLLIER P., MONTORO P., DELARUE M. BECHTOLD N. BELLINI C., PELLETIER G., 1995. Promoterless gus A expression in a large number of Arabidopsis thaliana transformants obtained by in planta infiltration method. C. R. Acd. Sci. Paris 318 : 465-474.# SOUTHERN , E. M. (1975) Détection of spécifie séquences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98 : 503-577. . WINICOV, DEUTCH, C.E. (1994). Characterization of a CDNA clone from salt tolérant alfalfa cells that identifies salt-inducible root specific transcripts) J. Plant. Physiol. 144,222-228). # YANG T. T. CHENG, L. KAIN, S. R. (1996) Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. Nucleic Acids Res. 24 : 4592-4593.REVENDICATIONS 1. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un promoteur végétal capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante, durant la totalité du développement de cette dernière, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. 2 Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. 3. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire. 4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du promoteur végétal. 5 Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2. 6. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie parmi les séquences codantes de gènes interagissant avec des parasites ou des pathogènes, les séquences codant les endochitinases, les séquences codant pour des protéines de protection de la plante au stress hydrique ou salin, ou encore des gènes agissant sur la teneur en sucre de la plante ou sur le transport de nitrate. 7. Acide nucléique comprenant 10 à 2000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, utile comme sonde ou amorce nucléotidique. 8. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs Pbin19, 101, pBi221, pBi121. 10. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur contenu dans la souche dE Coli déposée à la CNCM le 25 Mai 1999 sous le Numéro d'accès 1-2218. 11. Cellule hôte recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 8 à 10. 12. Cellule hôte recombinante selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est d'origine bactérienne ou végétale. 13. Cellule hôte recombinante selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'Agrobacterium tumefaciens. 14. Cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de la souche d'E. Coli déposée à la CNCM le 25 Mai 1999 sous le Numéro d'accès 1-2218. 15. Organisme multicellulaire végétal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 à 13. 16. Plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7. 17. Plante transgénique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un colza, d'un tabac ou d'un maïs. 18. Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte recombinante végétale selon l'une des revendications 11 ou 12 ; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a). c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal. 19 Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens selon la revendication 13 ; b) Transformation de la plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a). c) Sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal. 20 Procédé d'obtention d'une plante transgénique caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) transfecter une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 8 à 10; b) régénération d'une plante entière à partir des cellules de plantes recombinantes obtenues à l'étape a) ; c) sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle du polynucléotide promoteur végétal. 21 Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de: d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène. 22. Procédé d'obtention d'une plante transgénique selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de: d) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène. 23 Plante transgénique, telle qu'obtenue selon le procédé selon l'une des revendications 18 à 22. 24 Semence de plante dont les cellules constitutives comprennent dans leur génome un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7. 25. Semence d'une plante transgénique selon l'une des revendications 16,17 et 23