Brevet FR2785149A1 — publié le 20000505

La présente invention a pour objet des compositions fongicides mettant en oeuvre des mélanges d'enzymes et de substrats naturels agissant en synergie pour inhiber la croissance de champignons, et pouvant être appliqués sur différents types de surfaces sous la forme d'un revêtement solide ou semi-solide. Elle est également relative à un procédé de préparation de telles compositions et leurs utilisations, notamment à la protection des semences contre les champignons phytopathogènes. Dans le texte qui suit, les références bibliographiques citées entre parenthèses sont rassemblées en fin de description. Les substances antifongiques les plus couramment utilisées, que ce soit pour des usages médicaux ou pour l'agriculture, sont des molécules synthétisées par voie chimique, qui présentent souvent une toxicité non négligeable envers les mammifères, le gibier, les poissons, et d'autres organismes vivants (Index phytosanitaire 1995, Ed. ACTA). Dans leurs utilisations agricoles, elles présentent l'inconvénient de pouvoir se retrouver dans les nappes phréatiques et dans les aliments. Leur large spectre d'action présente le désavantage d'éliminer des espèces dites utiles en cela qu'elles participent à la limitation de l'émergence d'autres ravageurs. On peut également signaler la faculté d'adaptation à ces substances de synthèse de certaines espèces de champignons ou d'insectes à combattre. Au contraire l'évolution a conféré aux végétaux supérieurs des systèmes de défense très complexes impliquant des cascades d'événements contrôlés par des médiateurs et par des effecteurs pouvant être de nature protéique, polyosidique, ou être des molécules de petit poids moléculaire. Ces réactions naturelles de défense mettent en oeuvre des synergies entre plusieurs familles d'enzymes et différentes petites molécules antifongiques : phytoalexines, antibiotiques (Schirmbôck et al., 1994 ; Rajnchapel-Messaï, 1988). Par exemple, certains végétaux réagissent aux attaques d'insectes ou de champignons en produisant des enzymes, chitinases ou glucanases, capables de dégrader les parois polysaccharidiques de ces agresseurs. La composition des parois de champignons, constituées de l'imbrication de couches organisées de polysaccharides de natures variées, comme par exemple des poly-p, 1-3 glucanes et de la chitine (c'est à dire poly-p, 1-4 N-acétylglucosamine), rend nécessaire cette réponse complexe. Un inconvénient est que cette capacité de défense n'est pas partagée par toutes les espèces ou variétés végétales et que sa mise en action nécessite une attaque préalable du végétal. D'où la nécessité de procurer une protection supplémentaire à la plante. Une première approche actuellement à l'étude fait appel au génie génétique et consiste à cloner dans la plante le gène d'une protéine impliquée dans ces réactions de défense, par exemple une chitinase, une glucanase ou une autre enzyme susceptible d'inhiber la croissance des champignons phytopathogènes (Gilbert et al., 1996 ; Cornelissen et Melchers, 1993 ; Stintzi et al., 1993 ; Harman et al.,1992). On peut citer l'introduction du gène d'une chitinase de haricot dans du tabac et dans du colza transgéniques, qui a conféré aux plantes un accroissement de résistance contre Rhizoctonia solani (Broglie et al., 1991). De même l'introduction d'un gène de la bactérie Serratia marcescens dans du tabac transgénique a donné des résultats semblables (Jach et al., 1992). Par contre la surexpression d'une chitinase de tabac dans un tabac transgénique a été réalisée sans qu'un effet protecteur significatif n'ait pu être mis en évidence (Neuhaus et al., 1991). Le rôle du lysozyme a également été soulevé dans la mesure où ce dernier possède une activité endochitinase et où de nombreuses enzymes de plantes ont la bifonctionnalité lysozyme / chitinase (Düring, 1993). Du lysozyme de poule a ainsi été cloné dans du tabac transgénique, puis produit et secrété par la plante et son activité mesurée in vitro : dans ces conditions l'enzyme recombinée est capable d'inhiber certaines bactéries ou champignons (Trudel et al., 1995) ; par contre la protection de la plante n'a pas été démontrée. Les résultats obtenus restent variables en fonction du couple constitué de la variété végétale et de la souche microbienne. En résumé, les inconvénients principaux de la méthode par génie génétique végétal sont : - le temps relativement long nécessaire pour mettre au point une variété végétale recombinée, - la difficulté accrue pour introduire et rendre efficaces plusieurs gènes d'enzymes par exemple, - la difficulté de généraliser les acquis d'un travail de recombinaison effectué sur une plante à d'autres espèces ou variétés, - les risques, avérés ou non, s'attachant à l'utilisation en champ de végétaux recombinés. Une deuxième approche consiste à essayer d'induire les réactions physiologiques de la plante elle-même : défense contre des agresseurs potentiels ou germination. Il est connu que certaines plantes réagissent à la présence de chitine, de chitosan ou d'oligosaccharides issus de la dégradation de la paroi de leur propres cellules ou de la dégradation des parois de champignons (Teichgrâber et al, 1991). On peut ainsi citer la production accrue de chitinases par différentes semences mises à tremper dans des solutions contenant du chitosan et des dérivés du chitosan (Hirano et al., 1990, Teichgrâber et al, 1991 ). De même, dans des cultures de cellules de riz en suspension dans un milieu liquide, Inui et al. (1996) ont montré que la présence de Nacétyloligosaccharides augmentait la production de chitinases par ces cellules. Les exemples cités ci-dessus ne répondent cependant pas à l'objectif de protection d'une semence pendant la période allant de sa récolte à son semis, compte tenu des pratiques agricoles usuelles (immersion des semences avant stockage peu réaliste). Des préparations contenant des composés tels que la chitine, le chitosan ou leurs dérivés, la N-acétylglucosamine, ont d'autre part montré leur faculté de favoriser la germination des graines (He et al., 1990). Mais il n'y a pas, dans ce cas, de protection pendant le stockage des semences stockées et pendant les phases précédant le réveil de l'activité métabolique et la germination. La compétition entre la rapidité de l'agression éventuelle et la réponse défensive de la semence contrôle seule l'efficacité de cette méthode vis-à-vis des pathogènes. On peut également citer l'utilisation comme agent nématicide d'un mélange chitine-protéines baptisé Clandosan 618 et commercialisé par IGENE Biotechnology Inc. (Columbia, MD, USA), mais qui suppose l'incorporation dans les sols de quantités de l'ordre de deux tonnes par hectare (Brevet US n 5 057 141). Enfin, une troisième approche proposée pour la protection des semis est la bactérisation des semences. Elle consiste en la fabrication d'un enrobage, pelliculage ou encapsulation permettant d'immobiliser sur la semence, pendant le temps de stockage, certaines bactéries bénéfiques. Une fois le semis effectué, ces bactéries peuvent protéger la plante en colonisant la rhizosphère aux dépens des germes telluriques pathogènes par simple "occupation" du biotope, éventuellement assistée par une secrétion de substances antibiotiques ; elles peuvent également dans certains cas produire des substances stimulant la germination ou la croissance de la plante par des effets comparables à certaines hormones. Parmi les bactéries les plus souvent étudiées pour un tel objectif de bactérisation, on peut citer Pseudomonas fluorescens et P. putida (Digat, 1994). Cependant certains inconvénients résident dans cette technique : - les bactéries mises au contact des graines subissent les mêmes traitements que celles-ci : séchage, élévation de température dans certains cas. Après ces "stress" hydrique et thermique et une période de stockage de quelques mois, les bactéries ne sont pas toujours capables de se développer dans un contexte de compétition avec la flore tellurique. - dans le cas où la colonisation de la rhizosphère est efficace, on pourrait arguer d'une introduction abusive d'espèces vivantes dans l'environnement et d'un risque inconnu lié à cette dissémination. On peut citer également des préparations contenant de la chitine, une culture de bactéries du genre Streptomyces et de la perlite qui, mélangées à du terreau et du compost, protègent contre le virus de la mosaïque de l'ail (Kajimura et al., 1991). Mais cet exemple d'application s'éloigne de celle que l'on vise et possède également les inconvénients de la manipulation de bactéries vivantes. La présente invention décrit des compositions mettant en oeuvre des substances actives naturelles, non polluantes, non toxiques pour l'homme ou les animaux, applicables directement dans le contexte des pratiques usuelles de l'agriculture, ou dans d'autres applications, et conférant une protection active contre les champignons phytopathogènes ou d'autres champignons, tout en maintenant ou améliorant le pouvoir germinatif des semences. Ces compositions s'appliquent directement sur les objets à protéger, notamment les semences, oignons ou racines. Elle consiste en la combinaison astucieusement choisie d'au moins une enzyme glycolytique et son substrat et/ou des oligomères de celui-ci, dans des proportions qui, lorsque la composition est appliquée sur des semences, ont un effet inhibiteur de la germination inférieur à 10 %. La ou les enzymes glycolytiques sont obtenues par production à partir de souches bactériennes non pathogènes, non recombinées cultivables en fermenteur. Les enzymes en cause prises isolément, ou associées par deux, ne procurent qu'une très faible protection contre la contamination par des champignons phytopathogènes ; en outre, elles diminuent les capacités germinatives des semences comme le montrent les exemples ci-après. Dans les compositions selon l'invention, la ou les enzymes glycolytiques sont combinées avec d'autres enzymes ou composés polysaccharidiques incubés avec des enzymes qui, seuls, ne manifestent pas d'activité antifongique significative mais qui permettent une accélération de la germination des semences comme le montrent les exemples 3 et 4 ci-après. De façon préférée, la ou les enzymes glycolytiques sont des glycosidases choisies dans le groupe comprenant des chitinases, des laminarinases. Les autres enzymes ou composés polysaccharidiques pouvant avantageusement être incorporés dans la composition de l'invention sont le lysozyme et une chitine ou du chitosan ou des oligomères de ceux-ci obtenus par hydrolyse ménagée. Les compositions de l'invention peuvent enfin comprendre un agent filmogène permettant leur application sur l'objet à protéger. Quand on se réfère à la combinaison de l'invention, on entend par astucieusement choisie la sélection de chacun des éléments enzymatiques du substrat polysaccharidique et, le cas échéant, du composé filmogène qui permettra de traiter directement les semences à protéger selon un procédé décrit ci-après, ayant à la fois un taux d'inhibition de la croissance des champignons supérieur à 60 %, de préférence 80 % et un effet promoteur de la germination positif nul ou avec un effet inhibiteur d'un maximum de 10 %. Les propriétés caractérisant certaines combinaisons n'apparaissent pas comme l'addition des propriétés des différents éléments mais comme une synergie impliquant des réactions d'inhibition directement appliquées aux champignons phytopathogènes, et la transmission de médiateurs impliqués dans les processus de défense et de germination propres à la semence. Ainsi des préparations comportant, par exemple, des chitinases de la bactérie Serratia marcescens, des laminarinases de la bactérie Bacillus circulans, du lysozyme de poule et de la chitine partiellement hydrolysée au préalable par lesdites chitinases, ont provoqué une très forte diminution de la contamination des semences, bien supérieure aux effets obtenus avec des formules incomplètes, et une conservation de la capacité de germination. Ce résultat a été obtenu avec des semences contaminées par des champignons phytopathogènes, revêtues de préparations commerciales destinées au pelliculage dans lesquelles avaient été incorporées certaines combinaisons citées ci-dessus, puis séchées dans des conditions en vigueur dans la pratique agricole (courant d'air à 40 C) et déposées sur des boîtes de Petri contenant des milieux gélosés propices au développement des champignons et à la germination des semences. On montre ainsi que, dans des conditions réalistes d'emploi, les combinaisons d'enzymes et de substrats naturels nécessaires à l'inhibition des champignons phytopathogènes et à la promotion de la germination restent actives et mobilisables après mise en contact des agents de pelliculage et séchage sur la graine. De plus, des essais de stockage à différentes températures, après séchage, d'agent de pelliculage contenant des chitinases, ont montré la conservation, et même une amélioration de la stabilité, de l'activité de ces dernières après plusieurs mois de délai. Ainsi, une combinaison préférée de l'invention comprend de préférence une chitinase, une laminarinase, du lysozyme et une chitine et/ou des oligomères de celle-ci obtenus par hydrolyse ménagée. Les oligomères préférés issus de la chitine sont de formule [N acetyl glucosamine]n, ou (NAG)n, n étant compris entre 1 et 8 et de manière encore préférée n = 2 ou 3. D'autres polysaccharides résultant de la désacetylation de la chitine doivent être considérés comme des équivalents fonctionnels de celle-ci, ainsi que leurs produits d'hydrolyse ménagée. A titre d'exemple, le chitosan, dérivé 100 % désacétylé de la chitine peut être utilisé. Dans la composition selon l'invention, le rapport en poids entre les enzymes et les glycosaccharides peut être compris entre 10/1 et 1/10. L'effet recherché comme fongicide et comme stimulant de la germination peut être atteint quand 100 mg de chitinases sont combinées à 10 à 1000 mg de chitine ou de ses produits d'hydrolyse partielle. Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter des préparations filmogènes, et notamment des agents de pelliculage, d'enrobage ou d'encapsulation. On appelle dans cette description pelliculage ou enrobage un revêtement adhérant à la graine. Ce revêtement peut, par exemple, être déposé sur la graine sous forme de bouillie aqueuse et l'ensemble est séché à l'air chaud (40 C - 45 C). Tous les procédés industriels pratiquant pelliculage ou enrobage peuvent être appliqués au pelliculage et à l'enrobage des compositions de l'invention. Les agents de pelliculage utilisés sont des produits commerciaux: Sepiret 01 G et Sepiret 7017 Argent (Société Seppic, Castres). Le produit Sepiret 01 G est commercialisé sous forme de poudre tandis que Sepiret 7017 Argent est une suspension épaisse contenant 29% de matière sèche. Ces préparations filmogènes doivent être appropriées pour leur utilisation en application sur différents types de surface sous la forme d'un revêtement solide ou semi-solide. A titre d'exemple et sans être limitatif quant aux objets à traiter par ces compositions, on peut citer les semences, oignons ou racines qui peuvent être stockés. De la même façon, les semis issus de semences préalablement traitées sont durablement protégés contre les infections. Les compositions peuvent également être mises en forme et utilisées en pulvérisation sur de petites surfaces aériennes, telles les plantes d'appartement ou les jardins dits biologiques. Dans le domaine alimentaire, les compositions peuvent être utilisées pour la conservation des aliments par des revêtements actifs des emballages. D'autres agents de pelliculage ou d'enrobage peuvent être utilisés. Les critères qui président au choix de ces agents sont : la texture conférée à la composition qui doit être appliquée, l'absence d'effets sur les activités enzymatiques de la composition et l'absence d'effet sur la physiologie des produits agricoles quand il s'agit de l'appliquer sur ceux-ci. La présente invention porte également sur un procédé de préparation d'une composition fongicide ou fongistatique comportant les étapes suivantes : a) production de glycosidases par culture microbienne ou de levure ; b) extraction de ces enzymes ; c) mélange des préparations enzymatiques avec leur substrat naturel ou des dérivés de ceux-ci obtenus par hydrolyse ménagée ; d) incorporation le cas échéant dans une préparation filmogène de type agent de pelliculage ou d'enrobage ; e) le cas échéant vérification de l'activité par incubation en présence des champignons pathogènes. Dans le procédé de l'invention, les chitinases peuvent par exemple être produites par culture de Serratia marcescens, la laminarinase par culture de Bacillus circulans. Plus particulièrement, la chitinase peut être produite par la souche Serratia marcescens déposée au BCCM sous le numéro LMGP- 18541 le 15 octobre 1998, qui fait également partie de l'invention. La préparation peut contenir en outre du lysozyme, qui peut être un lysozyme commercial. Le lysozyme, comme l'indique l'exemple 3 ci-après, peut améliorer le taux de germination. Les substrats naturels sont la chitine (poly p 1-4 N acétylglucosamine) et des oligomères de la chitine obtenus par hydrolyse ménagée par les chitinases citées ci-dessus. Les oligomères préférés issus de la chitine sont de formule [N acetyl glucosamine]n' ou (NAG)n, n étant compris entre 1 et 8 et de manière encore préférée n = 2 ou 3. Le choix des enzymes et leurs proportions relatives sera guidé par les tests de culture de champignons dans les conditions suivantes : Le milieu de croissance gélosé est composé de (en g/L): Extrait de levure 2, KH2P04 1,5, K2HP04 1,5, Mg(S04).7H20 0,3, NaNO3 3 et agar 14. Les cultures sont effectuées à 16 C dans des boîtes de Petri fermées avec du parafilm. Les compositions préparées sont ensuite déposées dans les boîtes de Petri. L'effet fongicide est ensuite mesuré par l'inhibition de la croissance des hyphes du champignon, et comparé à des préparations dépourvues totalement ou partiellement de certains de ses constituants. Quand le test est appliqué à des graines ou semences pelliculées, le taux de germination est déterminé par le nombre de graines germées sur le nombre total de graines, et comparé avec ceux de lots non pelliculés, ou des graines pelliculées mais en absence des enzymes et/ou de leur substrat. Des exemples de préparation des constituants de la composition selon l'invention, et de l'effet fongicide et sur la germination des semences des préparations ainsi préparées sont donnés ci-dessous et illustrés par les figures 1 et 2. La figure 1 représente l'essai standardisé de l'inhibition de Botrytis par les chitinases. (0) et (#) sont les cultures témoins (X) et (+) sont les champignons traités. La flèche indique le début de la croissance d'un des champignons traités. La figure 2 représente les cinétiques de contamination ainsi que les taux de germination en fonction du mélange appliqué. Elle illustre les résultats de l'exemple n 5 ci-après. L'homme du métier saura adapter les méthodes, objet des exemples, à d'autres combinaisons enzymes / substrat. Matériels et méthodes : 1. Production et récupération des chitinases : Les chitinases décrites ci après sont produites en fermenteur par la souche Serratia marcescens déposée au BCCM sous le numéro LMGP-18541 le 15 octobre 1998, cultivée sur un milieu contenant (en g/L): Chitine 10, extrait de levure 0,5, (NH4)2S04 1, Mg(S04).7H20 0,3 et KH2P04 1,36. A la fin de la fermentation (entre 4 et 5 jours), le moût est débactérisé par centrifugation puis filtration à 0,2 m et les protéines sont précipitées au sulfate d'ammonium (à 70% de la saturation). Le culot est récupéré par centrifugation, dialysé contre du tampon phosphate 200 mM à pH 6,6 puis lyophilisé. La poudre ainsi obtenue sera appelée Chitinases ou CNase par la suite. 2. Production et récupération des laminarinases : Les laminarinases décrites dans l'invention sont produites en fermenteur par la souche Bacillus circulans ATCC 21367 dans un milieu contenant (en g/L): Chitine 12, extrait de levure : 1, glucose : 0,2, KH2P04 : 2, Mg(S04,.7H20 : 0,2 et (NH4)2S04 : 1. Après débactérisation, le moût est concentré par ultrafiltration frontale (module Amicon et filtre YM10) puis dialysé contre du tampon acétate pH 5. La solution obtenue sera appelée Laminarinases (LMase) dans la suite. 3. Lysozyme : Le lysozyme utilisé et appelé (LZ) dans cette description est une poudre commerciale de chlorhydrate de lysozyme (Sigma). 4. Chitine : Le traitement de la chitine brute (Sigma) par l'acide chlorhydrique, puis la soude à chaud, puis l'acide phosphorique, permet d'obtenir une chitine dite colloïdale, purifiée des ions calcium et protéines initialement présents. 5. Préparation du mélange chitinase / chitine : 100 mg de CNase et 200 mg de chitine colloïdale dans 10 ml de tampon phosphate pH 6,6 sont incubés à 50 C pendant 15 à 20 minutes. Le mélange est ensuite lyophilisé et est appelé (M+) dans la présente description. On souligne donc ici que le mélange (M+) contient des chitinases actives. La dénaturation des enzymes par chauffage juste après l'incubation suivie d'une lyophilisation fournit le mélange (M-). 6. Dosages enzymatiques : Cas des chitinases : Les essais d'activité chitinolytique sont réalisés à 50 C sous agitation sur 0,5 ml de solution enzymatique et 1,5 ml de tampon phosphate contenant 20 mg de chitine. Après une heure, la réaction est arrêtée par addition d'acide trichloroacétique et les extrémités réductrices libérées sont révélées par chauffage avec une solution de dinitrosalicylate de sodium et dosées par spectrophotométrie à 530 nm à l'aide d'une courbe étalon de N-acétylglucosamine (NAG). L'unité d'activité chitinolytique est définie comme la quantité d'enzymes nécessaire pour libérer une micromole d'équivalents NAG après une heure d'incubation à 50 C et à pH 6,6. Cas des laminarinases : L'activité des laminarinases est déterminée en mesurant les quantités d'équivalents glucose produits par la réaction enzymatique. 0,2 ml de l'échantillon enzymatique sont tamponnés avec 0,5 ml de tampon acétate 100 mM à pH 5 puis mis à incuber à 50 C pendant 1 h avec 0,3 ml d'une solution à 30 g/L de laminarine (Sigma). La réaction est arrêtée par l'acide trichloroacétique. Le protocole de dosage des extrémités réductrices est identique à celui utilisé pour la mesure de l'activité chitinolytique. L'unité d'activité des laminarinases correspond à la libération d'une micromole d'équivalents glucose en une heure à pH 5 et à 50 C. Le dosage des protéines totales est réalisé par la méthode du BCA en utilisant de l'albumine bovine comme référence. 7. Dosage et caractérisation des mélanges protéiques utilisés : Le mélange protéique CNase est sous forme de poudre lyophilisée et contient 5,6 U/mg d'activité chitinolytique et 0,28 mg d'équivalents albumine/mg. Le mélange protéique LMase est liquide. Il contient 87 U/ml d'activité laminarinase et 0,6 mg d'équivalents albumine/ ml. 8. Pelliculage / enrobage : On appelle dans cette description pelliculage ou enrobage un revêtement adhérant à la graine. Ce revêtement est déposé sur la graine sous forme de bouillie aqueuse et l'ensemble est séché à l'air chaud (40 C - 45 C). Les agents de pelliculage utilisés sont des produits commerciaux: Sepiret 01 G et Sepiret 7017 Argent (Société Seppic, Castres). Le produit Sepiret 01 G est commercialisé sous forme de poudre tandis que Sepiret 7017 Argent est une suspension épaisse contenant 29% de matière sèche. Dans les exemples qui suivent : - la figure 1 représente un essai standardisé de l'inhibition de Botrytis par les chitinases. (0) et ( ) sont les cultures témoins (x) et (+) sont les champignons traités. La flèche indique le début de la croissance d'un des champignons traités. - la figure 2 représente la cinétique de germination et de contamination de semences de blé en fonction des compositions utilisées. E1, E2 et E3 ont la signification donnée dans l'exemple 5 ci-après. Exemple n 1 : Pelliculage de carrés d'agar : inhibition de Botrytis cinerea : Des carrés d'agar (de côté = 51 mm) et de faible épaisseur (e=10,5 mm) sont prélevés d'une boîte de Petri contenant une culture du champignon phytopathogène Botrytis cinerea. Ils sont revêtus d'une suspension de Sepiret 01 G à 15% (m/v) contenant 20 mg/g de chitinases ; puis ils sont séchés à l'air chaud (40 - 45 C) pendant 15 - 20 minutes. Les carrés ainsi pelliculés sont placés au centre d'une boîte de Petri contenant le milieu de croissance. A intervalles, la surface occupée par les hyphes du champignon en croissance est déterminée semi-quantitativement par décalque sur papier millimétré. La comparaison de la croissance entre B. cinerea enrobé avec les chitinases et un témoin enrobé par la même suspension sans chitinases (essai dupliqué) donne les profils de la figure 1. On peut constater que : En l'absence de chitinases, et après une phase de latence de 4 à 5 jours, les hyphes occupent une surface de 17 cm2 en 17 jours. En présence de chitinases, un retard à la croissance d'au moins 10 jours a lieu ainsi qu'une diminution de la vitesse de croissance : les pentes des courbes représentant les cinétique de croissance en présence de chitinases sont plus faibles. Dans le cas de l'essai représenté par (x) sur la figure 1, on peut même observer un effet fongicide - par comparaison à l'effet fongistatique de l'essai noté (+) - puisqu'aucune croissance de champignon n'est notée même après 17 jours d'incubation. Exemple n 2 : Pelliculage de lentilles: Inhibition de Botrytis cinerea : Formulation : 50 mg de CNase sont mélangés à 1 g d'une suspension aqueuse de Sepiret 01G à 15 % (m/v). Pelliculage : Des lots de 12 graines (416 mg) de lentilles contaminées naturellement par le champignon phytopathogèneBotrytis cinerea sont pelliculés avec la préparation ci-dessus selon la méthode décrite au paragraphe 8 ci-dessus. Test d'inhibition et de germination : Les graines pelliculées sont placées dans des boîtes de Petri contenant le milieu de croissance. Au cinquième jour, les taux de contamination (nombre de graines contaminées/ nombre total de graines) et de germination (nombre de graines germées/ nombre total de graines) sont déterminés et comparés avec ceux de lots non pelliculés (graines nues) et de lots pelliculés avec l'agent Sepiret 01G uniquement. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1 suivant : Tableau # Taux de contamination Taux de germination Graines nues 50% 80% Sepiret 01 G 31% 70% Sepiret 01 G + CNase 9% 53% On observe un effet inhibiteur de la croissance de B. cinerea (taux de contamination passant de 31 à 9%, soit une division par un facteur trois), du fait de l'action des chitinases mais également une perte en taux de germination (de 70 à 53%). Exemple n 3 : Pelliculage de blé contaminé par Fusarium sp. : mélanges monoenzymatiques : Formulation : - chitinases seules : quantité mise en oeuvre pour pelliculer 3 à 4 g de blé contaminé naturellement par les champignons phytopathogènes Fusarium nivale et Fusarium roseum. : 100 mg de CNase sont mélangés à 3,4 ml d'une suspension de Sepiret 7017 Argent composée de 3,6 g de la suspension commerciale et de 10ml d'eau. - laminarinases seules : quantité mise en oeuvre pour pelliculer 2 g de blé contaminé : 40 mg de LMase lyophilisée titrant 17 unités/mg sont mélangés à 2 ml d'une suspension de Sepiret 7017 Argent composée de 3 g de la suspension commerciale et de 5 ml d'eau. - lysozyme seul : quantité mise en oeuvre pour pelliculer 2 g de blé contaminé : 100 mg de LZ sont mélangés à 2 ml d'une suspension de Sepiret 7017 Argent composée de 5 g de la suspension commerciale et de 7,1 ml d'eau. Test d'inhibition et de germination : Les graines pelliculées sont placées dans des boîtes de Petri contenant le milieu de croissance. Au cinquième jour, les taux de contamination (nombre de graines contaminées/ nombre total de graines) et de germination (nombre de graines germées/ nombre total de graines) sont déterminés et comparés avec ceux de lots pelliculés avec l'agent Sepiret 7017 Argent uniquement. Les résultats obtenus figurent dans le tableau Il suivant : Tableau Il Taux de contamination Taux de germination Témoin CNase 86 % 76 % Essai CNase seule 65 % 50 % Témoin LMase 85 % 80 % Essai LMase seule 45 % 60 % Témoin LZ 65% 70% Essai LZ seule 65% 85% Pour ce qui concerne l'inhibition des champignons Fusarium sp. : on peut observer que le lysozyme seul n'a pas d'effet, que les chitinases seules ont un effet très faible, situé dans le domaine des incertitudes expérimentales et que les laminarinases divisent le taux de contamination par un facteur 1,9. Ceci peut s'expliquer par le fait que les couches les plus externes des parois de champignons sont souvent constituées de glucanes, dégradés par la laminarinase, alors que la chitine se trouve cachée dans des couches internes. Pour ce qui concerne le taux de germination des semences : on observe que les chitinases, respectivement les laminarinases, ont tendance à diminuer la germination, divisant le taux par un facteur 1,5 respectivement 1,3 ; le lysozyme ne change pas, voire améliore (variation relative de +20%), le taux de germination. Exemple n 4 : Pelliculage de blé : Inhibition de Fusarium sp. : Influence de différents substrats naturels en présence ou non de chitinases : Formulation : Une suspension aqueuse de Sepiret 7017 Argent composée de 7 g de bouillie commerciale et 10 ml d'eau est utilisée. 100 mg des substances indiquées ci-dessous sont mélangés à 2 ml de la suspension précédente et l'ensemble est mis en oeuvre pour pelliculer des lots de 2 g de blé. Ce dernier provient d'une culture contaminée naturellement par Fusarium nivale et Fusarium roseum. : Produits testés : N-Acétyl Glucosamine (NAG), chitine colloïdale, (M+) et (M-). Résultats : les taux de contamination et de germination au cinquième jour (cf méthode exemples 2 et 3) sont donnés dans le tableau III ci dessous : Tableau III Témoin NAG Chitine (M+) (M-) Contamination 65% 70% 45% 30% 50% Germination 80% 65% 55% 55% 70% On remarque qu'en l'absence d'enzymes actives dans la formule, c'est à dire dans les cas où la chitine ou son monomère NAG ou le mélange (M-) sont ajoutés, les effets sur la croissance du champignon contaminant sont faibles ou inexistants. Plus précisément, le monomère NAG n'a aucune incidence sur le taux de contamination, tandis que la présence de chitine, ou de chitine partiellement dégradée par l'incubation préalable avec les chitinases (mélange (M-)), semble provoquer une faible réduction de la contamination, qui pourrait être due à une réaction physiologique de la semence elle-même. Par contre on remarque une réduction de moitié du taux de contamination avec le mélange (M+) contenant les chitinases, la chitine et les produits de leur réaction hydrolytique. Cependant, avec ce mélange (M+) et également en présence de chitine seule, on note une diminution du taux de germination qui est divisé par un facteur 1,45. Exemple n 5 : Pelliculage du blé: mélange multienzymatique : Formulation : Une matrice de pelliculage -appelée (S) dans la suite- est préparée en mélangeant la bouillie commerciale de Sepiret 7017 Argent avec la solution de LMase, définie au paragraphe 2 de la section matériels et méthodes, dans les proportions : 70 g de bouillie pour 100 ml de LMase. Mélanges testés (quantités mises en oeuvre pour pelliculer 2tg de blé): E1: 100 mg CNase + 2 ml (S) E2 : 100 mg CNase + 100 mg LZ + 2 ml (S) E3 : 100 mg (M+) + 100 mg LZ + 2 ml (S) Témoin : 2 ml d'une suspension aqueuse à 70 % (m/v) de Sepiret 7017. Résultats : Les taux de contamination et de germination au 5ème jour sont donnés dans le tableau IV ci-dessous : Tableau IV Témoin E1 E2 E3 Contamination 85 % 45 % 35 % 5 % Germination 70 % 55 % 75 % 65 % Les cinétiques de contamination et les taux de germination sont montrés dans la figure 2. On observe que chacune des formules E1, E2, E3 a un effet inhibiteur significatif sur la croissance du champignon, avec une amélioration de l'efficacité de E1 à E3. L'effet antifongique des seules chitinases et laminarinases (formule E1 ) reste limité et de plus réduit le taux de germination. Par contre, on observe une réduction considérable du taux de contamination par Fusarium sp. (passage de 85 à 5% soit une division par un facteur 17) pour le mélange E3 qui contient les laminarinases, le lysozyme et les chitinases ainsi que de la chitine partiellement dégradée. Le taux de germination reste dans ce cas identique à celui du lot témoin. Exemple n 6 : Stabilité des chitinases dans l'agent de pelliculage Sepiret 01 G : Des lots identiques composés de 10 mg de CNase et 200 mg d'une suspension aqueuse de Sepiret 01 G (à 15% (m/v)) sont préparés. Les lots sont séchés sous vide à 40 C et conservés à trois températures différentes (4 C; 16 C; 32 C). A intervalles, des échantillons sont prélevés et les enzymes sont remises en solution dans du tampon phosphate pH 6,6. L'activité chitinolytique est dosée dans chaque échantillon et comparée avec celle d'un lot de CNase (sans Sepiret) ayant subi les mêmes traitements (séchage puis stockage aux mêmes températures). Les résultats sont les suivants (tableau V) : Tableau V Témoin = CNase Activité initiale Activité à 1 mois Activité à 2 mois 4 C 50 U/ml 44 U/ml 37 U/ml 16 C 50 U/ml 28 U/ml 26 U/ml 32 C 50 U/ml 13 U/ml 11 U/ml CNase + Sepiret Activité initiale Activité à 1 mois Activité à 2 mois 4 C 36 U/ml 32 U/ml 27 U/ml 16 C 36 U/ml 31 U/ml 27 U/ml 32 C 36 U/ml 21 U/ml 13 U/ml On remarque que le taux de récupération de l'activité chitinolytique après séchage et reprise dans du tampon est égal à 36/50 = 72%. On note en outre que si la perte de l'activité récupérable est identique à 4 C (de l'ordre de 25% après 2 mois de stockage) entre le témoin et les lots enrobés, elle reste beaucoup plus importante sans le Sepiret (48% de perte à 16 C au lieu de 25% et 78% de perte à 32 C au lieu de 64%). On peut conclure au rôle stabilisateur joué par les agents d'enrobage sur les chitinases utilisées. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES K. Broglie, I. Chet, M. Holliday, R. Cressman, P. Biddle, C. Knowlton, C. J. Mauvais, R. Broglie (1991). Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science, 254,1194-1197. B. J.C. Cornelissen et L. Melchers (1993). Strategies for control of fungal diseases with transgenic plants. Plant Physiol., 101,709-712. B. Digat (1994). Les bactéries stimulatrices de la croissance des plantes: le cas des Pseudomonas.C.R.Acad.Agric.Fr., 80, n 2, 125-140; séance du 2 mars 1994. K. Düring (1993). Can Lysozymes mediate antibacterial resistance in plants ? Plant Mol. Biol., 23,209-214. M.O Gilbert, Y. Y. Zhang, Z. K. Punja (1996). Indroduction and expression of chitinase encoding genes in carrot following Agrobacterium-mediated transformation. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant, 32,171-178. G. E. Harman, R.M. Broadway, A. Tronsmo, M. Lorito (1992). Purified Chitinases and Use Thereof. US Patent n 5,173,419. F. He et al., Brevet CN 1,044,748. Preparation and usage of seed-treating agent containing chitin (1990). M. Hirano et al., Brevet JP 03,198,702 (91,198,702). Method for promoting seed germination (1991). S. Hirano, T. Yamamoto, M. Hayashi, T. Nishida, H. Inui (1990). Chitinase activity in seeds coated with chitosan derivatives. Agric. Biol. Chem., 54, 10, 2719-2720. H. Inui, Y. Yamaguchi, Y. Ishigami, S. Kawaguchi, T. Yamada, H. lhara, S. Hirano (1996). Three extracellular chitinases in suspension-culture rice cells elicited by N-acétyl chitooligosaccharides. Biosci. Biotech. Biochem., 60, 12, 1956-1961. G. Jach, S. Logemann, G. Wolf, A. Oppenheim, I. Chet, J. Schell, J. Logemann (1992). Expression of a bacterial chitinase leads to improved resistance of transgenic tobacco plants against fungal infection. Biopractice, 1, 1-10. Y. Kajimura et al., Brevet JP 03 34,905 (91 34,905). Compositions containing chitinase-producing bacteria and colloidal chitin for growth acceleration and disease prevention in plants (1991). J. M. Neuhaus, P. Ahl-Goy, U. Hinz, S. Flores, F. Meins Jr (1991). High-level expression of a tobacco chitinase gene in Nicotiana sylvestris. Susceptibility of transgenic plants to Cercospora nicotianae infection. Plant Mol. Biol., 16,141-151. J. Rajnchapel-Messaï (1988). La stimulation des défenses des plantes. Biofutur Avril 1988,67, 21-29. M. Schirmbôck, M. Lorito, Y. -L. Wang, C. K. Hayes, I. Arisan-Atac, F. Scala, G. E. Harman, C. P. Kubicek (1994). Parallel formation and synergism of hydrolytic enzymes and peptaibol antibiotics, molecular mechanisms involved in the antagonistic action of Trichoderma harzanium against phytopathogenic fungi. Appl. Environ. Microbiol., 60, 4364-4370. A. Stintzi, T. Heitz, V. Prasad, S. Wiedemann-Merdinoglu, S. Kauffmann, P. Geoffroy, M. Legrand, B. Fritig (1993). Plant "pathogenesis-related" proteins and their role in defense against pathogens. Biochimie, 75,687- 706. P. Teichgrâber, L. Popper, D. Knorr (1991). Chitosan as an elicitor for the production of chitinase, an antifungal enzyme from soybean seeds. AgroIndustry Hi-Tech, June 1991, 11-14. J. Trudel, C. Potvin, A. Asselin (1995). Secreted hen lysozyme in transgenic tobacco : recovery of bound enzyme and in vitro growth inhibition of plant pathogens. Plant Sci., 106 (1) 55-62. REVENDICATIONS 1. Composition fongicide ou fongistatique comprenant en combinaison au moins une enzyme glycolytique et son substrat et/ou des oligomères de celui-ci, dans des proportions qui, lorsque la composition est appliquée sur des semences, ont un effet inhibiteur de la germination inférieur à 10 %. 2. Composition selon la revendication 1 comprenant une glycosidase ou un mélange de glycosidases choisi dans le groupe comprenant des chitinases, des laminarinases. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre du lysozyme. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison une chitinase, une laminarinase, du lysosyme et une chitine et/ou des oligomères de celle-ci obtenus par hydrolyse ménagée. 5. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que la chitinase est produite par culture en fermenteur de Serratia marcescens. 6. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que la laminarinase est produite par culture en fermenteur de la souche Bacillus circulans. 7. Composition selon la revendication 1 dans laquelle le substrat est une chitine ou des oligomères de la chitine obtenus par hydrolyse ménagée de cette dernière. 8. Composition selon la revendication 5 dans laquelle les oligomères issus de la chitine sont de formule [Nacetyl glucosamine]n, n étant compris entre 1 et 8. 9. Composition selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le rapport en poids entre le ou les enzymes et le substrat est compris entre 1/10 et 10/1. 10. Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est incorporée dans des préparations filmogènes. 11. Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce que les préparations filmogènes sont des agents de pelliculage, d'enrobage ou d'encapsulation. 12. Procédé de préparation d'une composition biofongicide comprenant au moins les étapes suivantes : a) production de chitinase par culture de Serratia marcescens, et/ou b) production de laminarinase par culture de Bacillus inculaus, c) préparation de chitine colloïdale, d) incorporation dans une préparation filmogène. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incorporation du lysozyme. 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13 caractérisé en ce que la chitine est préalablement partiellement hydrolysée. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14 caractérisé en ce que la préparation filmogène est un agent de pelliculage, d'enrobage ou d'encapsulation. 16. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 11à la protection des semences, oignons ou racines contre les infections fongiques. 17. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 11à la protection des semis préalablement traités par ladite composition. 18. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 11au traitement des emballages alimentaires. 19. Souche de Serratia marcescens déposée au BCCM sous le numéro LMGP-18541 le 15 octobre 1998.