Brevet FR2793492A1 — publié le 20001117

NOUVEAU PROCEDE DE PURIFICATION PAR AFFINITE La présente invention porte sur un nouveau procédé de production et de purification par chromatographie d'affinité de protéines produites par expression d'un acide nucléique recombinant dans une cellule hôte. Des méthodes et des produits pour produire et/ou purifier des molécules polypeptidiques produites par des techniques de recombinaison génétique ont été développés par de nombreux auteurs. Les techniques de production de protéines recombinantes par génie génétique sont maintenant largement développées. En bref, des fragments d'ADN codant pour une protéine sont intégrés dans un vecteur ou un plasmide porteur des séquences régulatrices appropriées à leur expression dans un micro-organisme hôte. Les protéines d'intérêt recherchées sont ensuite isolées à partir du milieu de culture ou d'un lysat cellulaire par des techniques de purification. Les techniques de purification sont toujours basées sur une discrimination entre la protéine ou le polypeptide que l'on cherche à purifier d'avec les autres composants du lysat cellulaire ou du surnageant de culture. Ces techniques sont basées, soit sur une différence de poids moléculaire qui autorise une séparation par dialyse, gradient de centrifugation, chromatographie liquide de filtration etc., soit sur une différence de point isoélectrique qui permet une précipitation différentielle ou encore une séparation basée sur des propriétés ioniques différentes comme l'électrophorèse, la chromatographie d'échange d'ions etc. peut également être utilisée. Malheureusement, l'utilisation de ces techniques permet rarement d'avoir à la fois un rendement de purification et un degré de pureté acceptables, pour des molécules d'intérêt thérapeutique. La chromatographie d'affinité est une technique largement employée dans la purification des molécules biologiques. Elle est basée sur une interaction spécifique entre la molécule que l'on cherche à purifier et un ligand fixé sur un support. Néanmoins, l'utilisation de procédés industriels faisant appel à la chromatographie d'affinité passe par la mise au point de supports d'affinités "universels", c'est-à-dire utilisables pour purifier un large spectre de molécules ou macromolécules. L'utilisation du génie génétique pour fusionner des séquences peptidiques ("molecular tags") à des protéines recombinantes en vue de faciliter leur détection et/ou leur purification a connu un grand développement depuis une dizaine d'années. Ces motifs de reconnaissance qui jouent le rôle de véritables étiquettes intramoléculaires se retrouvent généralement aux extrémités amino- ou carboxy-terminales de la protéine de fusion. D'une manière générale, l'introduction d'une séquence de clivage protéolytique (par exemple la séquence reconnue par le facteur Xa ou encore la séquence de clivage de l'entérokinase) entre la protéine d'intérêt et l'étiquette permet d'éliminer celle-ci après purification de la protéine de fusion. La caractéristique commune à toutes ces étiquettes est leur capacité à fixer de manière spécifique un ligand pouvant être greffé à une phase solide - comme par exemple un support chromatographique - sans modification significative des paramètres de la fixation. Sur base de leur longueur, on peut classer ces étiquettes en deux grands types: les étiquettes protéiques qui correspondent à une protéine ou à un domaine fonctionnel de celle-ci (le poids moléculaire de telles étiquettes étant généralement supérieur à 20 kDa), et les étiquettes peptidiques qui sont souvent composées d'une dizaine d'acides aminés et dont le poids moléculaire est inférieur à 2 kDa. Il faut cependant observer que des peptides un peu plus longs peuvent être utilisés comme c'est la cas pour le peptide fixant la calmoduline et dont le poids moléculaire est de 4 kDa. Deux systèmes d'expression en fusion basés sur des étiquettes protéiques sont aujourd'hui largement utilisés en biotechnologies. Il s'agit des systèmes fusionnant la protéine d'intérêt avec la glutathion S- transférase (GST) de Schistosoma japonicum (systèmes commercialisés par Pharmacia) et des systèmes réalisant ces fusions avec la protéine colibacillaire fixatrice du maltose encore appelée MBP pour MaltoseBinding Protein (systèmes commercialisés par New England BioLabs). Dans le système GST, après purification de la protéine hybride (ou chimérique) sur matrice chromatographique portant du glutathion immobilisé (par exemple glutathion-sépharose), l'étiquette GST peut être enlevée par traitement enzymatique à la thrombine, au facteur Xa, ou à la protéase PreScission TMsuivant le type de vecteur qui fut utilisé pour le clonage. Cette technologie qui au premier regard peut apparaître très séduisante, comporte néanmoins des facteurs limitants qui peuvent s'avérer rédhibitoires dans certaines applications. Il y a tout d'abord la taille de l'étiquette qui est de 26 kDa et qui peut parfois fortement modifier la structure de la protéine d'intérêt, imposant donc un traitement protéolytique afin de s'en débarrasser. Il est aussi possible que la protéine de fusion fixe mal le gel de glutathion-sépharose car la protéine d'intérêt modifie la structure de l'étiquette GST. Il fut aussi observé que des protéines de fusion GST fixent trop fortement la résine de glutathion et nécessitent la présence de détergents pour leur élution. Dans le système MBP, la taille de l'étiquette MBP est encore plus élevée puisqu'elle est d'environ 40 kDa (3). Pour de très nombreuses applications (études structurales, immunisations, tests d'activités biologiques...), le clivage de l'étiquette MBP portée par la protéine de fusion s'avère donc être une nécessité. Après purification sur résine d'amylose (4), la protéine de fusion est soumise à une digestion au facteur Xa. Celui-ci coupe après l'arginine dans une séquence Ile-Glu-Gly-Arg située entre l'étiquette MBP et la protéine d'intérêt. L'expérience montre qu'une digestion optimale au facteur Xa ne répond que très rarement aux conditions décrites dans le protocole standard proposé par New England BioLabs, et doit donc être optimisée pour chaque protéine de fusion. Par ailleurs, des clivages à l'intérieur de la séquence de la protéine d'intérêt peuvent être observés. En ce qui concerne les étiquettes peptidiques, trois systèmes sont aujourd'hui essentiellement utilisés : a) Le système poly-histidine (par exemple le Système QIAexpress développé par Qiagen et greffant 6 histidines à la protéine d'intérêt) qui permet la purification de la protéine de fusion sur résine de nickel chélaté. Sa principale caractéristique est son étiquette limitée à 6 histidines qui fixent fortement les métaux de transition divalents comme le Ni++. En conséquence, la technique de chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC) est idéale pour purifier les protéines de fusion portant pareille étiquette. L'élution de la protéine de fusion est réalisée avec un tampon de compétition contenant de l'imidazole (5). Comme l'étiquette est de très petite taille, son clivage ne s'avère pas nécessaire pour un certain nombre d'applications de la protéine hybride purifiée. L'utilisation de ce type d'étiquette a montré que les rendements de purification sur IMAC Ni++ sont sensiblement augmentés lorsque la chromatographie est réalisée en conditions dénaturantes. Par ailleurs, des corps d'inclusions sont souvent observés dans le colibacille exprimant des protéines recombinantes portant le motif poly-histidine. b) Le système FLAG (Sigma) est basé sur l'octapeptide Asp-TyrLys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys dont le caractère très hydrophile est sensé réduire les interactions hydrophobes qui sont une cause majeure de précipitation cytoplasmique des protéines recombinantes produites chez le colibacille. Différents anticorps monoclonaux ont été dirigés contre le motif FLAG. Ceux-ci permettent de purifier par affinité la protéine hybride et de la tracer sans avoir à fabriquer au préalable un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt. La société SIGMA qui commercialise le système FLAG a développé une famille de vecteurs d'expression pour différents hôtes: bactéries, levures, cellules de mammifères. L'expression de la protéine hybride peut être cytoplasmique ou extracellulaire suivant qu'il y ait ou non un peptide signal dans la construction. La purification d'une protéine hybride à motif FLAG s'effectue par chromatographie d'affinité en utilisant une matrice d'agarose sur laquelle ont été fixés de manière covalente des anticorps anti-FLAG dont la réactivité est dépendante du calcium. L'élution s'effectue donc avec un tampon contenant de l'EDTA ou de l'EGTA qui est un chélateur plus spécifique du calcium. Si la protéine d'intérêt est une métallo-protéine ou si son activité dépend de la présence d'ions métalliques, l'agent chélateur utilisé lors de l'élution devra dans un premier temps être enlevé avant que le métal indispensable à l'activité biologique de la protéine ne soit renouvelé. Alternativement, une élution avec du peptide FLAG libre pourra être envisagée. Le gel d'affinité ne peut être utilisé au maximum qu'une dizaine de fois. Au-delà, des pertes significatives de capacité sont observées. Vu le caractère fragile des anticorps anti-FLAG fixés sur ce gel, celui-ci ne peut pas être lavé (sanitization) avec des agents dénaturants comme l'urée, ou des tampons dont le pH serait inférieur à 5. Ces traitements seraient cependant intéressants pour s'assurer de la complétion de l'élution. En conséquence, il est recommandé de ne pas purifier plusieurs protéines hybrides sur un même gel et ce, de manière à éviter toute contamination. Ces considérations sont des limites à la technique FLAG. c) Un système basé sur la fusion à la protéine d'intérêt d'un peptide de 4 kDa qui fixe la calmoduline (ou CBP pour Calmodulin-Binding Peptide) est développé par Stratagene. Dans cette optique, des vecteurs d'expression ont été développés pour le colibacille et la levure (S. pombe). La purification des protéines hybrides se fait sur une matrice portant de la calmoduline immobilisée. La fixation a lieu dans un tampon neutre et l'élution nécessite la présence de 2 mM EGTA. L'étiquette portant le peptide de 4 kDa peut optionnellement être enlevée par traitement à la thrombine ou à l'entérokinase. Parmi ces nombreuses solutions de chromatographie d'affinité, aucune n'est réellement satisfaisante au sens où aucune ne réunit les qualités de rendement, de pureté et de sauvegarde de la structure de la protéine recombinante après purification. En outre, aucun moyen n'a été décrit à ce jour permettant de construire par génie génétique une molécule hybride dans laquelle l'affinité pour le ligand peut être modulée de façon contrôlée en fonction du but à atteindre : rendement, pureté, etc. Le besoin existe donc toujours pour une technologie de purification d'une protéine recombinante à partir d'un milieu quelconque, ladite technologie présentant les qualités requises pour subir une transposition industrielle et obtenir une protéine avec un rendement et un degré de pureté suffisants à l'utilisation industrielle que l'on souhaite en faire, et notamment comme protéine thérapeutique. L'invention résulte de l'étude structurelle et fonctionnelle d'un antigène de mycobactéries impliqué dans l'adhérence aux cellules épithéliales. L'identification et la caractérisation d'antigènes de type "adhésine" impliqués dans l'adhérence des bactéries à leurs cellules cibles peuvent aider dans le développement de nouveaux vaccins capables de bloquer l'interaction initiale entre le pathogène et la cellule hôte. La présente invention résulte de l'isolement d'une nouvelle adhésine de Mycobacterium tuberculosis et de sa caractérisation moléculaire (1). Il s'agit de l'hémagglutinine mycobactérienne de liaison à l'héparine ou HBHA (pour heparin-binding hemagglutinin). Cette nouvelle agglutinine mycobactérienne fonctionne comme adhésine pour les cellules épithéliales. La structure de la HBHA révèle que le domaine carboxyterminal de la protéine contient des motifs répétés strictement identiques riches en lysine. Il s'agit du motif R1 : KKAAPA répété trois fois entre les résidus 160 et 177, et le motif R2 : répété deux fois entre les acides aminés 178 et 194. Les motifs R2 sont séparés par un tripeptide APA. Comme l'héparine est un polysaccharide anionique, les inventeurs ont émis l'hypothèse que les 15 résidus basiques (K, lysines) présents parmi les 39 acides aminés carboxy-terminaux de la HBHA jouent un rôle dans la fixation à l'héparine, probablement au travers d'une interaction de type électrostatique avec les charges négatives du polysaccharide. La présente invention résulte de développements basés sur l'ensemble des observations et hypothèses décrites ci-dessus. Elle tire parti des séquences répétées de la HBHA afin de développer un nouveau procédé de purification par affinité. En effet, ces répétitions peuvent constituer un nouveau type de label moléculaire (ou d'étiquette moléculaire), qui rassemble un certain nombre des avantages cités plus haut et qui viserait à fournir un procédé industrialisable d'obtention d'une protéine recombinante purifiée ayant essentiellement les mêmes propriétés structurelles et fonctionnelles que la protéine native. Par industrialisable, il est bien entendu que le rendement et la pureté sont déterminants parmi de nombreux critères à prendre en compte. L'invention consiste à mettre à profit les propriétés (supposées) des motifs R1 et R2 de liaison aux polysaccharides sulfatés, et plus particulièrement à l'héparine, pour construire des molécules recombinantes hybrides comportant la séquence protéique que l'on souhaite produire et purifier à laquelle sont liés de façon covalente un ou plusieurs de ces motifs R1 ou R2 comme label moléculaire. Le polypeptide hybride ainsi produit par recombinaison génétique in vitro, que ce soit dans une cellule procaryote ou eucaryote, pourrait donc être spécifiquement retenu à un support porteur d'héparine, telle une matrice d'héparine-sépharose. Autrement dit, l'invention consiste à utiliser ces motifs R1 et R2 comme labels moléculaires (tag) qui permettraient d'immobiliser de manière réversible sur un support porteur de polysaccharides sulfatés (héparine), un polypeptide recombinant porteur de ce ou ces labels moléculaires. Dans l'ensemble du présent texte, on parle indifféremment de polysaccharides sulfatés, polymères sulfatés. Les polymères synthétiques (polymères de synthèse biospécifiques) de type polystyrènes greffés, dérivatisés ou équivalents font partie de cette définition. En effet, le terme de polysaccharides sulfatés peut s'appliquer à l'héparine mais également à d'autres glycosamino-glycanes et notamment le sulfate de chondroïtine. Mais dans la mesure où depuis longtemps les supports porteurs d'héparine sont commercialisés, la validation expérimentale de l'invention met en #uvre l'utilisation de tels supports, comme ceux produits par la société Upjohn Pharmacia (héparine-sépharose CL-6B), qui sont des supports à base de dextrane, sur lesquels l'héparine a été fixée par des techniques classiques comme la technique au bromure de cyanogène. Dans le présent texte, les termes "protéine de fusion", "protéine hybride", "polypeptide de fusion" et "polypeptide hybride" sont considérés comme équivalents et indiquent une expression commune dans une cellule hôte d'une séquence polynucléotidique unique, sous le contrôle des mêmes éléments de régulation, de séquences d'origine naturelle ou synthétique et ligaturées par les techniques classiques de recombinaison génétique. L'invention porte sur un procédé de production et de purification de protéines de fusion par chromatographie d'affinité sur un support solide porteur de polymères sulfatés et comprenant les étapes suivantes : a) construction d'un vecteur d'expression susceptible d'exprimer dans une cellule hôte un polypeptide hybride comprenant ladite protéine, au moins un motif R1 de formule: X1X2Y1Y2PY3 , entre 0 et cinq motifs R2 de formule: X1X2Y1Y2Y3X3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R(Arg) , Y1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisis en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2 ; b) introduction dudit vecteur dans une cellule hôte susceptible d'exprimer ledit polypeptide hybride ; c) mise en contact dudit polypeptide hybride avec des polysaccharides sulfatés liés de façon covalente à un support solide, d) élution du polypeptide hybride lié au support d'affinité par un gradient salin compris entre 0 et 1 M, e) le cas échéant, traitement du polypeptide hybride avec une protéase à sérine, et récupération de la protéine dépourvue des séquences R1 et R2. Ces motifs R1 et/ou R2 peuvent être situés dans la partie Cterminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt. Afin de connaître l'importance relative des répétitions R1 et R2 dans cette fixation à l'héparine, nous avons produit dans le colibacille: -i) des formes recombinantes de HBHA qui présentent des délétions dans les séquences répétées et -ii) des protéines de fusion MBP qui possèdent tout ou partie des séquences répétées. Pour chacune de ces espèces moléculaires, nous avons étudié l'affinité pour l'héparine immobilisée. Celleci est évaluée par la molarité en NaCI requise pour l'élution, c'est-à-dire pour abolir toute interaction avec une matrice d'héparine-sépharose CL-6B équilibrée avec du tampon PBS. Les résultats obtenus sont décrits dans les exemples ci-après. Le procédé de l'invention propose ainsi un moyen permettant selon l'objectif recherché de moduler l'affinité de la protéine que l'on cherche à purifier par le nombre de motifs R1, le cas échéant combinés avec des motifs R2, que l'on intègre dans le polypeptide hybride et par conséquent ses conditions d'élution et de production. L'hôte cellulaire préféré pour exprimer ce polypeptide hybride peut être n'importe quel hôte cellulaire procaryote ou eucaryote. Si un hôte procaryote est utilisé, il est préférable que l'hôte en question soit dépourvu de protéases à sérines ou pour le moins que l'expression de celles-ci soit inhibée. Lorsque l'hôte cellulaire est une cellule eucaryote (levure, cellule animale), le polypeptide hybride est susceptible de subir des modifications co- ou post-traductionnelles, notamment d'être glycosylé, ce qui peut présenter un avantage certain pour conserver les propriétés de la protéine ainsi produite, notamment ses propriétés immunogènes. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le polypeptide hybride comprend trois motifs R1 de formule KKAAPA et deux motifs R2 de formule KKAAAKK, lesquels motifs sont strictement ceux décrits dans la molécule HBHA. Il est clair néanmoins que l'acide aminé lysine peut être substitué de façon conservative par l'arginine, ces deux acides aminés ayant les mêmes propriétés cationiques, et l'acide aminé alanine peut être substitué par tout type d'acide aminé et de la façon préférée par la leucine, l'isoleucine ou la valine. Les motifs R1 ou R2 peuvent être contigus ou séparés par un espaceur. A titre d'exemple, le polypeptide APA, qui constitue l'espaceur entre les deux motifs R2 de la protéine native HBHA, peut être utilisé. Néanmoins, la longueur et la nature de cet espaceur ne sont pas déterminantes dans les propriétés fonctionnelles du polypeptide hybride que l'on souhaite purifier. La présente invention porte également sur des vecteurs d'expression pour la production d'une protéine recombinante comprenant : a) une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide hybride comprenant ladite protéine, au moins un motif constitué de la séquence R1 de formule :X1X2Y1Y2PY3, entre 0 et cinq motifs constitués de la séquence R2 de formule : X1X2Y1Y2YX3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R (Arg) , etY1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, b) les séquences régulatrices permettant l'expression de ladite séquence dans une cellule hôte. Dans le vecteur d'expression, les polynucléotides codant pour R1 et/ou R2 peuvent être, soit en amont c'est-à-dire du côté 5', ou en aval, c'est-à-dire du côté 3' de la séquence codant pour la protéine ou le polypeptide d'intérêt. Les vecteurs d'expression et la méthode d'obtention du polypeptide hybride sont également réalisés par des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, le domaine C terminal de la HBHA porteur des séquences codant pour les motifs R1 et R2 est amplifié par PCR à partir d'un plasmide porteur du gène HBHA tel que décrit dans (1) puis ligaturé au gène codant pour la protéine que l'on souhaite purifier après digestion par les enzymes de restriction appropriées. L'amplification des motifs codant pour 1 à 5 R1 ou 0 à 5 R2 est réalisée aisément en ayant recours à des amorces d'amplification placées de façon à amplifier spécifiquement l'ensemble 3 R1, 2 R1, 1 R1, 3 R1 + 2 R2,1 R1 + 2R2 etc. Les amplicons obtenus peuvent ensuite être dupliqués à volonté sur le polypeptide de fusion. Les techniques de base pour constituer des plasmides porteurs du polypeptide hybride sont décrites dans Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. Ed. John Wiley and Sons, New York, 1990. Le gène fusionné que l'on souhaite exprimer via un polypeptide de fusion peut être n'importe quel gène d'intérêt ; néanmoins, vu les propriétés de rendement, de pureté et de conditions non dénaturantes utilisées pour ce procédé de purification par affinité, il semble particulièrement approprié pour la production d'antigènes vaccinants ou de protéines d'intérêt thérapeutique. Il est en effet connu que l'un des freins au développement pharmaceutique de médicaments comprenant comme principe actif des protéines ou polypeptides recombinants est la difficulté de la mise en oeuvre du procédé industriel de purification. L'invention porte également sur les polypeptides hybrides obtenus après expression chez un hôte cellulaire d'un vecteur recombinant porteur des séquences codant pour la protéine que l'on souhaite obtenir et pour le nombre de motifs R1 et R2 préalablement choisis. L'invention porte également sur un procédé de production et de purification d'une protéine par chromatographie d'affinité utilisant un support solide auquel est greffé un polysaccharide sulfaté ou tout analogue fonctionnel synthétique, ledit polypeptide hybride comprenant une séquence protéique dont l'obtention à l'état purifié est recherchée, au motif un motif R1 et entre 0 et 5 motifs R2 tels que définis plus haut. Dans le procédé selon l'invention, le nombre de motifs R1 est choisi en fonction de l'affinité recherchée entre ledit polypeptide hybride et le ligand, l'affinité augmentant avec le nombre de motifs R1. A titre d'exemple, quand le polypeptide hybride comprend 3 R1 et 2 R2, la force ionique d'élution du support est de 300 mM. Quand les peptides comprennent 1 R1 et 2 R2, cette force ionique n'est plus que de 100 mM. Les résultats plus détaillés sont exposés dans les exemples ci-après. Dans le procédé de l'invention, après avoir choisi le nombre de motifs R1 et R2 qui permettra la purification optimale, on construit un vecteur d'expression susceptible d'exprimer ce polypeptide hybride et porteur des séquences codant pour la protéine que l'on cherche à purifier et pour le nombre de motifs choisis. De façon préférée, les motifs R1 et R2 sont respectivement de formule KKAAPA et KKAAAKK. Les motifs peuvent être contigus ou séparés de préférence par des espaceurs à dominante cationique. Ils peuvent être dans la partie N- ou C-terminale de la protéine hybride. L'invention porte en fait sur l'utilisation des motifs répétés de la partie carboxy-terminale de la HBHA comme label moléculaire, dans la fabrication par recombinaison génétique in vitro de polypeptides hybrides comportant une séquence protéique ou polypeptidique que l'on souhaite purifier par chromatographie d'affinité. Les inventeurs ont décrit dans (1) un anticorps monoclonal mAB 3921 E4 qui reconnaît spécifiquement la HBHA native et recombinante. Dans les expériences ci-après, les inventeurs démontrent que l'épitope reconnu par cet anticorps est contenu dans les motifs R1 et R2 de la HBHA. L'invention porte sur l'utilisation de l'anticorps monoclonal 3921 E4, tel que décrit dans D. A. Rouse et al (1991) Infection and Immunity 59 : 2595-2600, pour tracer toute protéine ou polypeptide de fusion portant l'étiquette moléculaire selon l'invention et contenant au moins un motif R1. L'invention porte enfin sur une trousse ou kit pour la production d'un polypeptide recombinant porteur d'un label moléculaire selon l'invention et comprenant au moins : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide R1 de formule :X1X2Y1Y2PY3, ou un vecteur le contenant, b) le cas échéant un polynucléotide codant pour un polypeptide R2 de formule: X1X2Y1Y2Y3X3X4, ou un vecteur le contenant, dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R(Arg) , Y1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline ; c) le cas échéant, l'anticorps monoclonal 3921 E4. Avantageusement, les séquences en a) ou en b) sont précédées ou suivies d'une séquence multisite de clonage. Dans un kit selon l'invention, R1 sera de préférence de formule KKAAPA, et R2 de formule KKAAAKK. La partie expérimentale qui suit comprend deux parties. La première permet de montrer la spécificité des motifs R1 et R2 pour la fixation à l'héparine quand ceux-ci sont dans la HBHA, ainsi que la sensibilité desdits fragments aux protéases à sérines quand ceux-ci ne sont pas glycosylés, propriété intéressante dans le cas d'un processus industriel de production d'une protéine ou d'un polypeptide recherché. La deuxième partie est une démonstration expérimentale de la production d'une protéine hybride (MBP de E. coli) fusionnée avec des nombres variables de motifs R1 et R2, et les propriétés obtenues avec ces polypeptides hybrides. Les exemples ci-dessous permettent d'établir et de démontrer ce qui est revendiqué mais ne constituent que des exemples non limitants. L'homme du métier pourra sur cette base analyser les constructions qu'il souhaite réaliser sur la base des techniques classiques connues de recombinaison génétique in vitro et des indications de la présente description. PARTIE EXPERIMENTALE Légende des figures : La figure 1 représente un gel d'électrophorèse SDS-PAGE indiquant que le sulfate de dextrane inhibe la protéolyse de la HBHA complète recombinante produite dans E coli XL1-Blue. Après induction avec de l'IPTG à 1 mM final, une culture de E. coli XL1-Blue (pKK-HBHA) a été centrifugée, et les cellules resuspendues dans 20 ml de tampon PBS. La suspension cellulaire est ensuite soniquée pendant deux minutes à 4 et du dextrane (500 kDa) ou du sulfate de dextrane (500 kDa) est alors ajouté à la concentration finale de 500 g/ml à deux ml de sonicat. Les échantillons sont ensuite incubés à 37 C. Le profil SDS-PAGE a été déterminé pour chaque échantillon après une minute (ligne A), 15 min (ligne B), 30 min (ligne C), 1 heure (ligne D) et 3 heures (ligne E) d'incubation. La HBHA recombinante est indiquée par une étoile, et les poids moléculaires sont indiqués en kDa dans la marge de gauche. La figure 2 représente un gel SDS-PAGE de la HBHA recombinante produite dans E coli BL21 (DE3). Un lysat de E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) a été préparé par sonication d'une culture induite par l'IPTG comme décrit dans la légende de la figure 1. Après 5 min (ligne A), 15 min (ligne B), 30 min (ligne C), 1 heure (ligne D), 2 heures (ligne E), 4 heures (ligne F) et 24 heures (ligne G) d'incubation à 37 , les lysats sont analysés par gel SDS-PAGE. Dans la marge de gauche sont indiqués les poids moléculaires en kDa. La figure 3 représente un gel SDS-PAGE et des analyses en immunoblot de HBHA recombinante (rHBHA) et de HBHA recombinante délétée des acides aminés 161 à 199 (rHBHAAC) produites dans E. coli XL1-blue et dans E. coli BL21 (DE3). La ligne A contient 200 ng de HBHA native purifiée par chromatographie sur héparine sépharose à partir d'un surnageant d'une culture de M. bovis BCG. Les lignes B et C correspondent à des lysats de culture de E. coli XL1-blue exprimant la HBHA recombinante complète. Les lignes D et E représentent des lysats de E. coli XL1-blue exprimant la HBHAAC recombinante. Les lignes F et G représentent les résultats obtenus avec les lysas de E. coli BL21 (DE3) (pET HBHAAC). Dans les lignes B, D et F, l'analyse est réalisée avant induction par IPTG ; dans les lignes C, E et F, l'analyse est réalisée après induction par IPTG. Les gels de polyacrylamide sont colorés avec du bleu de Coomassie R-250, et l'analyse en immunoblot est réalisée en utilisant l'anticorps monoclonal 3921 E4 tel que décrit dans la demande de brevet WO 97/44463. Les flèches indiquent la position de la HBHA recombinante (ligne C) et de la rHBHAAC (ligne E). Les poids moléculaires exprimés en kDa apparaissent dans la marge de gauche. La figure 4 représente également un gel SDS-PAGE et des analyses en immunoblot de formes recombinantes de HBHA présentant différentes délétions dans les motifs R1 et R2 de la partie carboxyterminale. La ligne A représente un lysat de E. coli BL21 (DE3) (pET24d+) et constitue donc le témoin n'exprimant pas de HBHA. La ligne B est un lysat cellulaire de E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) exprimant la HBHA recombinante complète. La ligne C montre un lysat cellulaire de E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+ 3R1) exprimant une forme recombinante de HBHA ne possédant que les 3 motifs R1 de son domaine C-terminal. La ligne D représente le résultat obtenu avec un lysat cellulaire des bactéries recombinantes exprimant HBHA A C + 2R1 (pET-HBHA A C + 2R 1). La ligne E est l'équivalent des précédentes sauf que un motif R1 a été ajouté (pET-HBHAAC + 1R1). La ligne F représente le lysat cellulaire des cellules E.coli BL21 (DE3) exprimant HBHAAC, c'est-à-dire qu'aucun motif R1 n'est exprimé. L'ensemble de ces lysats est obtenu à partir de cultures induites par l'IPTG. L'immunoblot utilise l'anticorps monoclonal 3921 E4. Les poids moléculaires en kDa sont exprimés sur la ligne de gauche. La figure 5 représente une analyse en SDS-PAGE de la maltose binding protein (MBP, ligne A) et de deux protéines hybrides entre la MBP et la partie carboxy-terminale de la HBHA (MBP + 3R1 + 3R2, ligne B et MBP + 1 R1 + 2R2, ligne C). La ligne D représente le résultat obtenu avec E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+2R1) exprimant une forme recombinante de HBHA ne possédant pas 2 motifs R1 de son domaine C-terminal. La figure 6 représente l'influence du dextrane et du sulfate de dextrane sur la réactivité en immunoblot de la protéine MBP (Maltose binding protein) et de la protéine de fusion MBP + 3R1 + 2R2 avec du sérum de lapin anti MBP (a-MAL E) et avec l'anticorps monoclonal 3921 E4. Les lignes A et B représentent respectivement les lysats de cultures induites par l'IPTG et exprimant la protéine MBP et la protéine MBP + 3R1 + 2R2). La première colonne représente un gel SDS-PAGE. Les cinq colonnes de droite sont une analyse par immunoblot après incubation des membranes avec du dextrane ou du sulfate de dextrane à 1 mg/ml dans du PBS. La figure 7 représente les résultats d'une chromatographie sur héparine-sépharose d'un lysat de culture E. coli B834 (Pmal+3R1+2R2) induite par l'IPTG de B834(pMAL + 3R1 + 2R2). Après induction par l'IPTG, une culture de 250 ml de E. coli est centrifugée puis les cellules sont ioniquées dans du PBS. Après clarification, le matériel soluble est chromatographie sur une colonne d'héparine-sépharose (1 cm x 4 cm), équilibrée en PBS. L'élution est réalisée en utilisant un gradient salin linéaire en PBS compris entre 0 et 500 mM NaCI. L'électrophorégramme montre le profil SDS-PAGE du matériel de départ (A) de la fraction exclue (B), du pic élué à 50 mM NaCI (C), du pic élué entre 250 mM et 350 mM de NaCI (D) et du matériel relargué à l'occasion de l'étape de regénération de la colonne en utilisant du NaCI 3M (E). Pour chaque fraction, 50 l ont été utilisés pour réaliser l'analyse en SDS-PAGE. 1. MATERIELS ET METHODES Les protocoles expérimentaux décrits dans (1) et dans WO 97/44463 sont utilisables dans la mise en #uvre des exemples et expériences décrits ci-après. 1) Souches bactériennes, conditions de croissance et manipulations d'ADN : Les conditions de croissance pour la souche M. bovis BCG (souche 1173 P2, World Health Organization, Stockholm, Suède) ont été décrites dans (2). E. coli XL1-blue (New England Biolabs, Beverly, MA), E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI) et E. coli B834 (3) sont cultivés en milieu LB (4). Après transformation avec des plasmides recombinants dérivés de vecteurs d'expression pKK-388-1 (Clontech, Palo Alto CA) ou pMAL-c (New England Biolabs), les souches de E. coli sont cultivées en présence de 100 g/ml d'ampicilline (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). La sélection à la kanamycine (Sigma-Aldrich) à 30 g/ml a été utilisée pour les souches d' E. coli transformées avec les dérivés de pET- 24d (+) (Novagen). Les enzymes de restriction, l'ADN ligase de T4, et les autres réactifs de biologie moléculaire ont été obtenus auprès de New England Biolabs, Boehringer Mannheim Corp. (Mannheim, Germany) ou Promega (Madison, WI). Les PCRs (polymerase chain reactions) ont été réalisés dans un thermocycleur Perkin-Elmer, modèle 480 en utilisant 100 ng de plasmide purifié et 1 g d'amorces telles que décrites dans la table 2 ci-après. Tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR ont été séquences en utilisant un kit de séquençage de ABI PRISM Dye Terminator Cycle et un séquenceur ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer). Les plasmides sont purifiés sur des cartouches nucléobond AX 100 (MachereyNagel, Düren, Allemagne) en suivant les instructions du fournisseur. 2) production de protéines recombinantes chez E. coli : La HBHA recombinante avec ou sans délétions dans les motifs répétés R1 et R2 de la partie carboxy-terminale, ainsi que les protéines de fusion entre la protéine MBP (maltose-binding protein) et les motifs répétés R1 et R2 de HBHA sont produits dans E. coli. Après transformation avec les plasmides d'expression recombinants appropriés, les cellules E. coli sont cultivées à 37 dans 250 ml de bouillon de culture LB additionné d'ampicilline ou de kanamycine. Quand la densité optique à 600 nm est de 0,5, l'isopropylthiogalactoside (IPTG) est ajouté à la concentration finale de 1 mM, et l'incubation poursuivie pendant 4 heures. Les cultures sont ensuite centrifugées pendant 15 min à 4 C et à 7000 x g. Les surnageants sont ensuite écartés et les cellules resuspendues dans 20 ml de tampon phosphate (PBS pH 7,4 ; Mm NaCl, 5Mm KCI, 20 mM Na2HP04, 3,5 mM KH2P04). La suspension cellulaire est conservée à-20 C jusqu'à l'analyse par chromatographie sur matrice d'héparine-sépharose. 3) Analyse des protéines recombinantes par chromatographie sur héparine-sépharose : Les suspensions cellulaires congelées sont décongelées et soniquées deux fois pendant 5 min à 4 C en utilisant un sonicateur Branson (modèle 450) muni d'une microsonde et délivrant une puissance réglée sur 5. Les lysats bactériens sont ensuite centrifugés à 10000 g pendant 15 min à 4 C. Les volumes de surnageants sont portés à 100 ml avec du PBS, puis déposés sur une colonne d'héparine-sépharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Suède) de 1 x 4 cm, préalablement équilibrée avec 100 ml de PBS. Le matériel retenu est élué avec un gradient linéaire de NaCI entre 0 et 500 mM, préparé dans 80 ml de PBS. La colonne est régénérée par lavage du gel avec 30 ml de PBS + 3M NaCI. Toutes les étapes chromatographiques sont réalisées à température ambiante, en utilisant un débit de 1,5 ml par min. En aval de la colonne, un spectrophotomètre (Uvicord 2510 SD, LKB, Bromma, Suède) enregistre en continu l'absorption à 280 nm de la phase mobile. 4) Purification de la HBHA native : La HBHA de M. bovis BCG a été purifiée par chromatographie sur héparine-sépharose conformément à un protocole décrit précédemment (2). Brièvement, 500 ml de surnageant d'une culture de M. bovis BCG sont cultivés jusqu'à la phase stationnaire puis chargés sur une colonne d'héparine-sépharose CL-6B. L'élution est réalisée avec un gradient linéaire de 0 à 500 mM de NaCI et la HBHA est collectée dans le pic de protéine observé à 300 mM NaCI. 5) Analyse en SDS-PAGE : L'électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE) est réalisée conformément à la technique de Laemmli (5) en utilisant un gel de concentration de 4 % et un gel de séparation de 12 ou de 15 % en polyacrylamide. Avant l'électrophorèse, les échantillons sont mélangés avec un tiers en volume de tampon de solubilisation (6 % SDS, 15 % de ss-mercaptoéthanol, 30 % de glycérol, 0,005 % de bleu de bromophénol dans du Tris-HCI, 0,18 M, pH 6,8) et chauffés à 95 C pendant 5 minutes. Après l'électrophorèse, les gels sont colorés avec du bleu de Coomassie R-250 (Merck). 6) Production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux : Des anticorps polyclonaux anti HBHA native ont été produits dans des rats, selon les techniques décrites, en utilisant 200 g d'antigène purifié pour chaque injection (2). La réalisation des hybridomes murins produisant les anticorps anti HBHA 4057D2 et 3921 E4 a été décrite dans (6) et dans WO 97/44463. L'anticorps monoclonal 4057D2 d'isotype IgG3, a été purifié par cryoprécipitation (7) et l'anticorps monoclonal 3921 E4 d'isotype IgG2a a été purifié par chromatographie sur protéine Asépharose Fast Flow (Pharmacia). Le sérum de lapin dirigé contre la MBP de E. coli a été acheté chez New England Biolabs. Les sérums humains de patients souffrant de turberculose ont été généreusement donnés par le docteur Françoise Mascart-Lemone (Hôpital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Belgique). 7) Analyse en Immunoblot : Le transfert des protéines des gels de polyacrylamide aux membranes de nitrocellulose (BA 85 ; Schleicher & Schuell) a été réalisé par la méthode de Towbin et al. (8). Après immobilisation, la HBHA native, la HBHA recombinante, de même que les versions tronquées de la HBHA recombinante, la MBP et les protéines de fusion MBP-HBHA ont été testées avec des sérums humains dilués 100 fois, des anticorps monoclonaux anti-HBHA murins purifiés (mABs), du sérum de rat antiHBHA dilué 500 fois ou du sérum de lapin anti-MBP dilué 10. 000 fois. Les immuns complexes sont développés avec des anticorps de chèvre marqués à la phosphatase alcaline et dirigés contre les immunoglobulines G humaines, murines, de rat, de souris ou de lapin (ProtoBlot System ; Promega, Madison, Wis. ). Pour établir l'influence du dextrane (500 kDa, Sigma), du sulfate de dextrane (500 kDa, Sigma) et de l'héparine (3 kDa, Sigma) sur l'immunoréactivité des anticorps monoclonaux anti-HBHA, des membranes de nitrocellulose portant les antigènes immobilisés sont incubées à température ambiante pendant une heure dans du PBS contenant 500 g/ml du polysaccharide à analyser. Après deux lavages pour enlever le polysaccharide non lié, les membranes sont testées avec des anticorps monoclonaux anti-HBHA, et développées comme décrit cidessus. 8. Concentrationsprotéiques : Les concentrations protéiques sont déterminées selon la méthode de Bradford (9) en utilisant l'albumine sérique bovine comme référence. 9. Plasmides utilisés dans cette étude : Tableau 1 : Plasmide Caractères essentiels et origine pKK388-1 Vecteur d'expression contenant le promoteur trc et les séquences d'opérateur Ampr et TETr (Clontech) pKK-HBHA pKK388-1 contenant le gène codant la HBHA de M. bovis BCG HBHA et placé sous le contrôle du promoter trc (1) pET-24d (+) Vecteur d'expression contenant le promoteur T7, Kmr (Novagen) pET-HBHA pET-24d (+) contenant le gène codant la HBHA de M. bovis BCG et placé sous le contrôle du promoteur T7 (cette étude). pET-HBHA#C pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 161 à 199 de la HBHA (cette étude). pET-HBHA#C+3R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 179 à 199 de la HBHA (cette étude). pET-HBHAAC+2R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 173 à 199 de la HBHA (cette étude). pET-HBHA#C+1R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 167 à 199 de la HBHA (cette étude). pMAL-c Vecteur d'expression contenant le gène E. coli malE codant la MBP et placé sous le contrôle du promoteur tac, AmpR (New England Biolabs) pMAL+3R1+2R2 pMAL-c contenant une forme de fusion entre le gène malE codant et les codons 161 à 199 du gène codant la HBHA de M. bovis BCG pMAL+1R1+2R2 pMAL-c contenant une fusion en phase entre le gène malE et les codons 173 à 199 du gène codant la HBHA de M. bovis BCG. 10. Amorces PCR utilisées dans les expériences ci-après : Les séquences des oligonucléotides utilisées pour réaliser des amplifications par PCR de la partie 3' du gène de la HBHA de même que les fusions entre le gène codant la MBP de E. coli et les séquences codant les motifs R1 et R2 de la HBHA, et les protéines de fusion entre la protéine MBP de E. coli et les motifs R1 et R2 de la partie carboxyterminale de la HBHA sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous ; les séquences de reconnaissance correspondant aux enzymes de restriction utilisées pour cloner les produits de PCR sont soulignées. Tableau 2 : Amont de HBHA (5') ATCTGTGTGGGCACTCGACCG (3') HBHAAC (Sacl) (5') TATAGAGCTCAGGCAGCTCGATGCCGACCAGCTTGGCG (3') HBHAAC + 1 R 1 (Sacl) (5') TATACGAGCTCCTAGGCCGGAGCGGCCTTCTGGCCGGA (3') HBHAAC +2/3 R1 (Sacl) (5') TATAGAGCTCCTAGGCCGGAGCAGCCTTCTTAGGCAGC (3') Amont E4 (EcoRI) (5') ATATGAATTCAAGAAGGCTGCTCCGGCCAAGAA (3') Aval E4 (Pstl) (5') CTCACGCCTGCAGACTATGCGGTTTGC (3') II. RESULTATS EXPERIMENTAUX : A. Détermination des propriétés des motifs R1 et R2 de la HBHA native et recombinante : 1) Le sulfate de dextrane protège la HBHA recombinante d'une dégradation protéolytique rapide. Quand le gène codant la HBHA est exprimé dans E. coli XL1-Blue, la protéine recombinante est rapidement dégradée par digestion protéolytique, essentiellement au niveau de la région carboxyterminale qui contient les motifs répétés riches en lysine, c'est-à-dire les motifs R1 et R2 (1). Dans la mesure où la dégradation de la partie carboxyterminale de la HBHA recombinante est corrélée avec une réduction de l'affinité à l'héparine, elle suggère fortement une implication de ces motifs répétés dans l'interaction entre la protéine et les polysaccharides sulfatés. Afin de tester cette hypothèse et en même temps tenter de réduire la dégradation carboxyterminale de la HBHA, du sulfate de dextrane ou du dextrane est ajouté à la concentration de 500 g/ml à un lysat de E. coli XL1-Blue (pKK-HBHA) préparé à partir d'une culture préalablement induite à l'IPTG. Comme indiqué dans la figure 1, le sulfate de dextrane, et non le dextrane, protège partiellement la rHBHA de la protéolyse au cours d'une incubation du lysat bactérien à 37 C. Cette observation suggère que, par sa liaison à l'extrémité carboxyterminale de la rHBHA, le polysaccharide sulfaté peut masquer les sites de clivage protéolytiques existant dans la séquence HBHA. Il a également été observé que la diminution de la concentration en sulfate de dextrane est corrélée avec une réduction de l'effet protecteur. En revanche, dans des conditions similaires, aucune inhibition de la dégradation de la HBHA n'est observée en utilisant l'héparine de 3 kDa, même à une concentration de 1 mg/ml. Ceci indique que la longueur des polysaccharides sulfatés peut être importante dans la protection de la rHBHA contre la dégradation protéolytique. 2) La rHBHA produite à un niveau élevé dans une souche de E. coli déficiente en protéases est beaucoup moins sensible à la dégradation protéolytique. Pour limiter la dégradation de la rHBHA, la protéine a été produite sous le contrôle du promoteur T7 dans E. coli BL21 (DE3), souche défective pour la synthèse de la protéase cytoplasmique Lon ainsi que la protéase de membrane externe OmpT. Un fragment de restriction Ncol- Hindlll de 643 bp provenant du plasmide pKK-HBHA a été ligaturé dans le plasmide pET-24d+ préalablement digéré avec Ncol et Hindlll. Le plasmide résultant nommé pET-HBHA a été utilisé pour transformer E. coli BL21 (DE3) et la production de rHBHA fut induite par l'addition d'IPTG. La figure 2 montre les résultats obtenus en SDS-PAGE à partir de lysats cellulaires induits à l'IPTG et incubé à 37 C pendant 24 heures. Aucune dégradation significative de HBHA n'est observée pendant les 4 premières heures d'incubation alors que dans les mêmes conditions, toute la HBHA exprimée dans E. coli XL1-Blue est dégradée en un peptide de 19 kDa (1). Après 24 heures d'incubation à 37 C, moins de 50 % de la rHBHA est clivée dans un polypeptide de 25 kDa (figure 2, ligne G). Ces résultats montrent qu'une souche de E. coli déficiente en protéases permet une production stable de rHBHA. En outre, l'utilisation du promoteur T7 à la place du promoteur trc permet une augmentation de 10 fois de la production de rHBHA comme cela est déterminé par une analyse densitométrique de l'électrophorégramme coloré en bleu de Coomassie. 3) La HBHA recombinante délétée des motifs R1 et R2 (rHBHA#C) ne fixe plus l'héparine immobilisée et n'est plus reconnue par l'anticorps monoclonal 3921 E4. Un gène recombinant codant pour une HBHA délétée des séquences R1 et R2 de la partie carboxyterminale (acides aminés 161 à 199) a été généré par PCR en utilisant le plasmide pKK-HBHA comme matrice, et comme amorce les oligonucléotides "amont de HBHA" et "HBHAAC" tels qu'indiqués dans les tableaux 1 et 2. A la fin des 35 cycles de dénaturation (1 min à 94 C), d'hybridation (1 min à 55 C) et d'élongation des amorces (1 min à 72 C), un fragment de 492 bp correspondant au produit d'amplification attendu a été purifié par électro-élution à partir d'un gel d'agarose. Après digestion avec les enzymes de restriction Ncol et Sacl, ce fragment est ligaturé dans les plasmides pKK388-1 ou pET-24d (+) coupés par Ncol et Sacl, générant ainsi les plasmides recombinants pKK-HBHAAC et pETHBHAAC. Ensuite, le plasmide pKK-HBHAAC a été utilisé pour transformer E. coli XL1-BLue alors que le plasmide pET-HBHAAC a été introduit dans E. coli BL21(DE3). L'expression des protéines recombinantes suite à l'induction par l'IPTG est suivie par SDS-PAGE et immunoblot et les résultats sont indiqués dans la figure 3. Comme cela a déjà été observé pour la rHBHA entière, la production de rHBHA recombinante est augmentée significativement quand le promoteur T7, au lieu du promoteur trc, est utilisé pour contrôler l'expression du gène recombinant (figure 3, lignes E et G). Il est intéressant d'observer que dans les deux systèmes d'expression, le poids moléculaire apparent de la rHBHAAC est d'environ 25,4 kDa, alors que le poids moléculaire calculé est 17,4 kDa, indiquant que la délétion des motifs répétés n'entraîne pas l'abolition de la migration électrophorétique aberrante de la protéine recombinante déjà observée dans (1). L'incubation pendant une journée à 37 C des lysats bactériens de E. coli XL1-Blue (pKK-HBHAAC) induits par l'IPTG révèle que, contrairement à la rHBHA, la rHBHAAC ne subit pas de dégradation protéolytique. Ce résultat montre que la haute susceptibilité de la rHBHA au clivage protéolytique est due à la présence des motifs répétés riches en lysine dans cette partie de la protéine. Des observations préliminaires suggèrent également que l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal 3921 E4 est localisé près de l'extrémité carboxyterminale de la protéine puisque la dégradation de la rHBHA était accompagnée de la perte de réactivité avec cet anticorps (1). L'incapacité de l'anticorps monoclonal 3921 E4 de reconnnaître rHBHAAC en analyse immunoblot (figure 3, ligne E) confirme que tout ou partie de cet épitope est localisé dans les motifs répétés R1 et/ou R2 de HBHA. Pour déterminer si les lysines chargées positivement et présentes dans ces motifs répétés sont impliquées dans l'interaction avec l'héparine, des lysats de E. coli BL21(DE3) (pETHBHAAC) sont préparés à partir de 250 ml de culture induite par l'IPTG. Après clarification des lysats par centrifugation, plus de 90 % de la rHBHAAC sont trouvés dans la fraction soluble, ce qui suggère que la production de rHBHAAC ne conduit pas à la formation de corps d'inclusion. Quand la fraction soluble dérivée d'une culture de 250 ml est appliquée sur une colonne d'héparine sépharose, toute la rHBHAAC se trouve dans la fraction non retenue alors que dans les mêmes conditions, la rHBHA produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) se fixe à l'héparine immobilisée et requiert pour être éluée l'addition de 300 mM NaCI dans la phase mobile PBS. Cette observation indique que les motifs riches en lysine R1 et R2 de la HBHA sont des déterminants cruciaux pour l'interaction avec l'héparine. 4) La délétion contrôlée d'un ou plusieurs motifs répétés de la rHBHA réduit l'affinité pour l'héparine. Des polypeptides recombinants ont été construits, comprenant la rHBHAAC et entre 1 et 3 motifs R1 et sans motif R2 ou avec 2 motifs R2. Autrement dit, les séquences suivantes : rHBHAAC + 1 R1, rHBHAAC + 2 R1, rHBHAAC + 3 R1, rHBHAAC + 1R1 + 2R2, rHBHAAC + 3R1 + 2R2. Lorsque les motifs R2 sont présents, un espaceur composé de APA est inclus entre les deux motifs R2 comme cela existe dans la molécule native. Pour synthétiser le gène codant pour rHBHAAC +1R1, on amplifie par PCR un fragment d'ADN dérivé de la matrice pKK-HBHA, et on utilise comme matrice d'amplification HBHA amont et HBHAAC +1 R1 (tableau 2). La PCR consiste en 35 cycles de dénaturation (1 min à 94 C), hybridation (1 min à 55 C) et extension (1 mn à 72 C). Après purification et restriction par Ncol et Sacl, le fragment de 507 bp obtenu est ligaturé entre les sites Ncol et Sacl de pET-24d (+), donnantle plasmide recombinant pET- HBHAAC+1R1 utilisé pour transformer E.coli BL21 (DE3). Pour synthétiser les gènes codant pour rHBHAAC + 2R1 et rHBHAAC +3R1, les oligonucléotides HBHA amont et HBHAAC + 2/3 R1 (tableau 2) ont été utilisés comme amorces PCR et le plasmide pKK-HBHA est utilisé comme matrice. Les paramètres PCR sont identiques à ceux décrits pour la synthèse du gène codant pour rHBHAAC +1 R1, et à la fin des 35 cycles d'amplification, deux fragments d'ADN de 543 bp et 525 bp ont été obtenus. Ces fragments sont digérés avec Ncol et Sacl et ensuite ligaturés entre les sites Ncol et Sacl de pET-24d (+) générer les plasmides pET-HBHAAC + 3R1 et pET-rHBHAAC + 2R1 respectivement. Après transformation de E. coli BL21 (DE3), la production des protéines recombinantes est induite par addition d'IPTG et analysée par SDS-PAGE et immunoblot avec l'anticorps monoclonal 3921 E4 ; les résultats sont présentés dans la figure 4. Toutes les versions tronquées dans l'extrémité carboxyterminale de la rHBHA présentent une discordance entre leur poids moléculaire calculé et leur poids moléculaire apparent, ce qui confirme que les séquences répétées ne sont pas impliquées dans la migration électrophorétique aberrante déjà décrite dans (1). Le tableau 3 ci-dessous présente de manière comparée quelques propriétés des HBHA native, rHBHA, rHBHAAC, rHBHAAC + 3R1, rHBHAAC + 2R1, rHBHAAC + 1R1. Sont ainsi comparés la réactivité avec l'anticorps monoclonal 3921 E4, l'affinité pour l'héparine, le poids moléculaire calculé, le poids moléculaire apparent et la stabilité dans un lysat de E. coli BL21. Tableau 3 : HBHA rHBHA (b) rHBHA#C rHBHA#C rHBHA#C rHBHA#C +3R1 (c) + 2R1 (d) + 1 R1 (e) (f) Réactivité +++ +++ +++ + avec mAB 3921 E4 Affinité pour 300 mM 300 mM 100 mM 20 mM l'héparine (g) poids molé- 21,4 21,4 19,4 18,7 18,4 17,4 culaire calculé (kDa) poids molé- 28 27 27,2 26,6 26 25,4 culaire apparent (kDa) Stabilité +++ +++ dégrada- dégrada- dégrada- +++ dans un tion par- tion par- tion parlysat de E. tielle tielle tielle coli BL21 (DE3) (a) HBHA native purifiée à partir du supernageant de culture M. bovis BCG (b) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) (c) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+3R1 ) (d) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+2R1 ) (e) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHMC+1R1) (f) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHMC) (g) concentration en NaCI requise pour supprimer toute interaction entre la protéine et une matrice d'héparine-sépharose équilibrée avec PBS. Il apparaît clairement à l'examen de ce tableau que la rHBHAAC avec 1 à 3 motifs à R1 est moins stable dans E. coli BL21 (DE3) dans la mesure où une dégradation protéolytique significative de ces polypeptides recombinants est observée. Ceci indique que les séquences manquantes (motifs R2 et séquence VTQK) jouent un rôle protecteur contre la protéolyse (voir également figure 4, lignes C, D et E). L'analyse en immunoblot révèle que l'anticorps monoclonal 3921 E4 est incapable de reconnaître la rHBHAAC + 1 R1 et montre une faible réactivité avec rHBHAAC +2R1. Cependant, la réactivité de l'anticorps monoclonal 3921 E4 avec la rHBHAAC + 3R1 est au moins égale à celle observée avec la rHBHA entière. Ceci suggère que l'anticorps 3921 E4 reconnaît un épitope à cheval sur deux motifs R1 successifs. Quand on mesure l'affinité de ces différentes constructions avec l'héparine immobilisée, il apparaît que rHBHAAC + 1 R1 comme rHBHAAC n'est plus capable de se lier à l'héparine sépharose. En revanche, si deux motifs R1 sont présents, une faible affinité pour l'héparine est observée puisque le polypeptide (hybride) rHBHAAC + 2R1 se lie à l'héparine immobilisée mais le lien est complètement aboli par l'addition de 20 mM NaCI dans le tampon d'équilibrage. Il est enfin observé (voir tableau 3) que le passage de 2 à 3 motifs R1 permet d'augmenter significativement l'affinité pour l'héparine immobilisée puisque le décrochage de la rHBHAAC + 3R1 nécessite l'addition de 100 mM NaCI au tampon d'équilibrage. Ces résultats indiquent que le motif R1 est impliqué dans la liaison de la HBHA à l'héparine mais n'est pas suffisant pour conférer une affinité équivalente à celle de la rHBHA non tronquée. B. 1. Production de protéines de fusion entre la MBP (Maltose Bindinq Protein) de E. coli et les motifs répétés R1 et R2 de la HBHA : Afin de déterminer si tous les déterminants moléculaires requis pour la liaison à l'héparine de la HBHA sont localisés dans la partie carboxyterminale de la molécule, les acides aminés 161 à 199 de la HBHA furent génétiquement fusionnés à l'extrémité carboxyterminale de la MBP de E. coli qui est incapable de se lier à l'héparine (10). Dans un premier temps, la région 3' du gène HBHA codant pour les motifs répétés a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pKK-HBHA en utilisant les oligonucléotides "Amont E4" et "Aval E4" (voir point 1. 9 du chapitre matériel et méthode). 35 cycles de dénaturation (1 min. à 94 C), hybridation (1 min. à 62 C), et extension (1 min. à 72 C) ont été réalisés. Dans la mesure où l'oligonucléotide "Amont E4" a 2 sites d'hybridation sur l'ADN matrice, la PCR génère 2 produits de 222 bp et de 186 bp qui correspondent aux acides aminés 161 à 199 (3R1 + 2R2) de la HBHA, d'une part et 173 à 199 (1R1 + 2R2), d'autre part. Après digestion avec Eco-R1 et Pst-1, les fragments PCR sont ligaturés entre les sites Eco-R1 et Pst-1 du plasmide pMAL-c, générant ainsi les plasmides recombinants pMAL + 3R1 + 2R2 et pMAL + 1R1 + 2R2 qui sont utilisés pour transformer les souches E. coli B834 et E. coli XL1-Blue. Les productions des protéines de fusion MBP + 3R1 + 2R2 et MBP + 1 R1 + 2R2 sont induites comme précédemment par addition d'IPTG, et celles-ci sont analysées par SDS-PAGE et Immunoblot. Le tableau 4 ci-dessous résume les résultats obtenus. Tableau 4 : HBHA native MBP (a) MBP+3R1+2R2 MBP+1R1+2R2 (b) (c) Réactivité avec - +++ +++ +++ le sérum antiMBP Réactivité avec +++ - +++ +++ mAB 3921 E4 Affinité pour 300 mM - 300 mM 100 mM l'héparine (d) Poids 21,3 50,5 45,9 44,7 moléculaire calculé (kDa) Poids 28 51 (e) 45 (e) 44 (e) moléculaire apparent (kDa) a) protéine de fixation du maltose (MBA) lié codée par pMAL-c b) protéine de fusion codée par pMal +3R1+2R2 c) protéine de fusion codée par pMal +1 R1+2R2 d) concentration de NaCI requis pour supprimer l'interaction avec de l'héparine- sépharose équilibrée avec du PBS e) poids moléculaire observé quand le protéine recombinante est produite par E. coli B834. Lorsque le polypeptide hybride est produit dans E. coli B834, souche, nous le rappelons, qui est déficiente pour la synthèse des protéases Lon et OmpT, MBP+3R1+2R2 et MBP+1R1+2R2 ont un poids moléculaire respectif de 45 kDa et 44 kDa (données non montrées). Les deux protéines de fusion sont également reconnues en immunoblot par l'anticorps monoclonal 3921 E4 confirmant que l'épitope reconnu par cet anticorps monoclonal est localisé au niveau des motifs répétés, comme ceci apparaît tant dans le tableau 4 ci-dessus que dans la figure 5. De la même façon que les résultats obtenus en immunoblot avec rHBHAAC contenant de 1 à 3 motifs R1 (tableau 3), les observations du tableau 4 et de la figure 5 suggèrent que l'anticorps monoclonal 3291 E4 reconnaît un épitope comprenant la séquence AAPAKKA. Lorsque MBP + 3R1 + 2R2 et MBP + 1R1 + 2R2 sont produites par E. coli XL1-Blue, ces protéines hybrides sont rapidement dégradées en polypeptides de respectivement 41,5 kDa et 40 kDa qui sont résistants à une dégradation ultérieure mais qui ne sont plus reconnus par l'anticorps 3921 E4. Ceci confirme que les séquences riches en lysine de la HBHA sont hautement susceptibles à la protéolyse. En conséquence, l'utilisation d'une souche de E. coli déficiente en protéase est préférable pour la production stable de protéines recombinantes contenant ces motifs répétés nécessite. La capacité des protéines de fusion MBP de se lier aux polysaccharides sulfatés a été investiguée par immunoblot et par chromatographie sur héparine-Sépharose. Comme l'indique la figure 6, un prétraitement avec le sulfate de dextrane de membrane de nitrocellulose portant MBP+3R1+2R2 empêche la reconnaissance ultérieure par l'anticorps monoclonal 3921-E4. Une telle observation suggère que le polysaccharide se lie à la protéine de fusion et masque ainsi l'épitope de l'anticorps monoclonal. Cet effet masquant semble dépendre de la sulfatation du polysaccharide puisqu'un prétraitement avec du dextrane ne modifie pas la réactivité de l'épitope avec son anticorps. En outre, la taille du polysaccharide sulfaté apparaît également importante si on en juge à l'incapacité de l'héparine de bas poids moléculaire à réduire la réactivité entre la protéine de fusion et l'anticorps monoclonal 3921 E4 (données non montrées dans le tableau). Pour éliminer l'hypothèse selon laquelle des polysaccharides sulfatés puissent interférer de façon non spécifique et générale avec la réactivité des anticorps, des membranes de nitrocellulose portant de la MBP et de la MBP+3R1+2R2 immobilisées furent incubées avec du sulfate de dextrane ou du dextrane puis testées en réactivité avec un sérum antiMBP. Les résultats sont indiqués dans la figure 6. Comparé à la membrane contrôle, aucune modification de réactivité n'a été observée, ce qui suggère que des polysaccharides de haut poids moléculaire non pas d'effets inhibiteurs généraux sur la reconnaissance par des anticorps. Afin de déterminer directement que la protéine de fusion entre la MBP et les motifs répétés R1 et R2 de la HBHA se couple à l'héparine immobilisée, des lysats de cultures induites à l'IPTG de E. coli B834 (pMAL-c), E. coli B834 (pMAL+3R1+2R2) et E. coli B834 (pMAL+1 R1+2R2) ont été préparés et les fractions solubles obtenues après centrifugation chromatographiées sur héparine-Sépharose. Les trois protéines recombinantes sont produites au même niveau et sont également solubles puisque moins de 15 % du matériel recombinant est associé au culot de la centrifugation. Comme attendu, la MBP ne présente aucune affinité pour l'héparine puisqu'elle a été complètement trouvée dans la fraction exclue de la chromatographie sur colonne d'héparine-sépharose. En revanche, la MBP +3R1 + 2R2 se lie à l'héparine immobilisée de la même façon que la rHBHA comme ceci apparaît sur la figure 7. En outre, toutes les protéines de fusion présentes dans l'échantillon restent liées à l'héparine-sépharose et leur élution requiert l'addition de 300 mM de NaCI qui a été préalablement démontrée comme étant les conditions d'élution de la HBHA native ou recombinante. De manière intéressante, MBP+1 R1+2R2 se lie également à l'héparine-sépharose mais avec moins d'affinité puisque son élution est réalisée par addition de 100 mM de chlorure de sodium en tampon d'équilibrage de la colonne. Tout ceci assemblé avec les observations du II. A. 4), avec la rHBHAAC contenant 1 à 3 motifs R1 (tableau III), ces résultats indiquent que : a) tous les déterminants moléculaires requis pour la liaison à l'héparine de la HBHA sont présents dans les motifs répétés du domaine carboxyterminal ; b) la délétion des motifs R1 ou R2 réduit l'affinité pour l'héparine ; c) l'activité de liaison à l'héparine de la HBHA peut être transférée à une protéine hétérologue (par label moléculaire sur la fraction carboxyterminale des motifs répétés de la HBHA). COMMENTAIRES : L'ensemble des résultats précédents a permis de montrer que les motifs répétés riches en lysine de la partie carboxyterminale de la protéine HBHA sont responsables et seuls responsables des propriétés de fixer de la HBHA native ou recombinante aux polysaccharides polyanioniques sulfatés de type héparine. Ces résultats montrent en outre que la répétition du motif à l'extrémité C-terminale d'un polypeptide hybride permet d'augmenter l'affinité dudit polypeptide pour le polysaccharide sulfaté. Le fait que toute l'activité de liaison à l'héparine réside dans cette fraction répétée de la molécule, et que cette activité est transférable sur une protéine hétérologue, permet d'utiliser ces motifs R1 dupliqués de 1 à 5 fois de même que les motifs R2 comme nouveaux labels moléculaires pour la production de protéines recombinantes de fusion qui peuvent être ainsi aisément purifiées par chromatographie sur héparine-sépharose. Les résultats montrés ci-dessus montrent la spécificité de liaison et le haut rendement d'élution obtenu avec le gradient de NaCI. Ceci démontre donc bien que l'utilisation de ce nouveau label moléculaire (tag) permet la purification dans des conditions douces qui sont censées maintenir la protéine dans sa configuration native. En outre, les résultats expérimentaux ci-dessus montrent une susceptibilité de ce label moléculaire (tag) aux protéases. Cela signifie que si après la purification par chromatographie d'affinité, on souhaite enlever ce tag de la protéine de fusion, un simple traitement doux aux protéases à sérines est suffisant. Ceci permet donc d'avoir un nouveau procédé qui à la fois permet un bon rendement de purification des conditions d'élutions douces et non dénaturantes, et d'élimination du label moléculaire si besoin est dans des conditions également non dénaturantes. L'ensemble des étapes de ce procédé, accompagné par le fait que la construction moléculaire est de la routine pour l'homme du métier, permet d'envisager un nouveau procédé industriel de production de ce type de protéines recombinantes produites notamment chez E. coli. Le procédé permet également de configurer la construction génétique de façon à choisir l'affinité entre le polypeptide hybride recombinant et son ligand en fonction de l'utilisation que l'on souhaite en faire et des modalités expérimentales que l'on souhaite appliquer. En outre, ceci est facilité par le fait que les motifs répétés sont spécifiquement les seuls sensibles à l'action protéolytique par les protéases à sérines. Lorsque le peptide recombinant est produit par des souches bactériennes notamment E. coli, il suffit donc de choisir comme souches productrices des lignées d'E. coli déficientes dans les protéases Lon ou OmpT responsables de la dégradation de la rHBHA observée dans E. coli XL1-Blue. Les discordances observées entre les poids moléculaires observés en migration par gel en SDS-PAGE et le poids moléculaire calculé ne sont pas dues à une glycosylation préalablement observée dans la HBHA native et qui protège cette dernière contre la protéolyse (réf. 2). L'hypothèse très probable est que le fort contenu en résidus acides dans le domaine aminoterminal de la HBHA (15 résidus acides entre les acides aminés 37 et 89) peut interférer avec la liaison au SDS et ainsi induire une migration électro phorétique aberrante (réf. 12). La démonstration dans les résultats expérimentaux ci-dessus de la spécificité de l'anticorps monoclonal 3921 E4 pour les motifs répétés R1 font de cet anticorps un outil de choix pour le suivi expérimental de la production et de la purification du polypeptide hybride comportant des fragments R1 dans leur extrémité C-terminale. Et l'utilisation de cet anticorps monoclonal 3921 E4 pour le suivi de la production et de la purification d'une protéine hybride comportant les motifs R1 fait également partie de l'invention. BIBLIOGRAPHIE (1) Menozzi, F.D., R. Bischoff, E. Fort, M. J. Brennan, and C. Locht, 1998. Molecular characterization of the mycobacterial heparin-binding hemagglutinin, a novel mycobacterial adhesin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 12625-12630. (2) Menozzi, F.D., J. H. Rouse, M. Alavi, M. Laude-Sharp, J. Muller, R. Bischoff, M. J. Brennan and C. Locht, 1996. Identification of a heparin- binding hemagglutinin present in mycobacteria. J. Exp. Med. 184 : 1001. (3) Wood, W. B., 1966. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli: bacterial mutations affecting the restriction and modification of DNA. J. Mol. Biol. 16 : 118-133. (4) Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (5) Laemmli, U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227 : (6) Rouse, D. A., S. L. Morris, A. B. Karpas, J.C. Mackall, P. G. Probst, and S.D. Chaparas, 1991. Immunological characterization of recombinant antigens isolated from a Mycobacterium avium #gt11 expression library by using monoclonal antibody probes. Infect. Immun. 59 : 2595-2600. (7) Gagnon, P., 1996. Purification tools for monoclonal antibodies. Validated Biosystems Edition, Tucson, AZ. (8) Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon, 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4354. (9) Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 : (10) Hannah, J. H., F. D. Menozzi, G. Renauld, C. Locht, and M.J. Brennan, 1994. Sulfated glycoconjugate receptors for the Bordetella pertussis adhesin filamentous hemagglutinin (FHA) and mapping of the heparin-binding domain on FHA. Infect. Immun. 62 : 5010-5019. (11) Herrmann, H.L., P. O'Gaora, A. Gallagher, J. E.R. Thole, and D. B. Young, 1996. Bacterial glycoproteins: a link between glycosylation and proteolytic cleavage of a 19kDa antigen from Mycobacterium tuberculosis. EMBO J. 15 : (12) McCauliffe, D.P., F. A. Lux, T.-S. Lieu, I. Sanz, J. Hanke, M.M. Newkirk, L. L. Bachinski, Y. Itoh, M. J. Siciliano, M. Reichlin, R. D. SOntheimer, and J.D. Capra. 1990. Molecular cloning, expression, and chromosome 19 localization of a human Ro/SS-A autoantigen. J. Clin. I nvest. 85: 1379-1391. REVENDICATIONS 1. Procédé de production et de purification d'une protéine hybride par chromatographie d'affinité sur un support solide porteur de polysaccharides sulfatés et comprenant les étapes suivantes : a) construction d'un vecteur d'expression susceptible d'exprimer dans une cellule hôte un polypeptide hybride comprenant ladite protéine, au moins un motif R1 de formule: X1X2Y1Y2PY3 , entre 0 et cinq motifs R2 de formule: X1X2Y1Y2Y3X3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R (Arg) , etY1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), !(!)eu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polymères sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, b) introduction dudit vecteur dans une cellule hôte susceptible d'exprimer ledit polypeptide hybride, c) mise en contact dudit polypeptide hybride avec des polysaccharides sulfatés liés de façon covalente à un support solide, d) élution du polypeptide hybride lié au support d'affinité par un gradient salin compris entre 0 et 1 M, e) le cas échéant, traitement du polypeptide hybride avec une protéase à sérine, et récupération de la protéine dépourvue des séquences R1 et R2. 2. Procédé de production et de purification selon la revendication 1 dans lequel le polypeptide hybride comprend 1 à 5 motifs R1, le nombre de motifs étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le polysaccharide sulfaté . 3. Procédé de production et de purification selon la revendication 2 dans lequel le polypeptide hybride comprend trois motifs R1 de formule KKAAPA 4. Procédé de production et de purification selon la revendication 1 , 2 ou 3 dans lequel le polypeptide hybride comprend 2 motifs R2 de formule KKAAAKK. 5. Procédé de production et de purification selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel le polysaccharide sulfaté est l'héparine. 6. Vecteur d'expression pour la production d'une protéine recombinante comprenant: a) une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide hybride comprenant ladite protéine, au moins un motif constitué de la séquence R1 :X1X2Y1Y2PY3 , entre 0 et cinq motifs constitués de la séquence R2: X1X2Y1Y2Y3X3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R (Arg) , etY1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, b) les séquences régulatrices permettant l'expression de ladite séquence dans une cellule hôte. 7. Vecteur selon la revendication 6 dans lequel le polypeptide hybride comprend 1 à 5 motifs R1. 8. Vecteur selon la revendication 6 ou 7 dans lequel le polypeptide hybride comprend 2 motifs R1 de formule KKAAPA. 9. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 dans lequel le polypeptide hybride comprend 1 ou 2 motifs R2 de formule KKAAAKK. 10. Vecteur selon l'une des revendications 6 à 9 dans lequel la protéine que l'on cherche à produire est un antigène vaccinant. 11. Procédé de production et de purification d'un polypeptide hybride par chromatographie d'affinité sur un support solide porteur de polymères sulfatés, ledit polypeptide hybride comprenant une séquence protéique dont l'obtention à l'état purifié est recherchée et des séquences présentant une affinité pour lesdits polymères sulfatés, caractérisé en ce que : a) lesdites séquences présentant une affinité pour lesdits polysaccharides sulfatés comprennent un à cinq motifs R1 de formule : X1X2Y1Y2PY3 et 0 à cinq motifs R2 de formule X1X2Y1Y2Y3X3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K(Lys) ou R(Arg) , et Y1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), !()!eu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, b) le nombre de motifs R1 est choisi en fonction de l'affinité recherchée entre ledit polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, l'affinité augmentant avec le nombre de motifs R1 ; c) on construit un vecteur d'expression susceptible d'exprimer dans une cellule hôte le polypeptide hybride et porteur des séquences codant pour ladite protéine et pour le nombre de motifs R1 et R2 choisis en a) et en b) ; d) on introduit ledit vecteur dans une cellule hôte susceptible d'exprimer ledit polypeptide hybride dans le surnageant de culture, e) ledit surnageant de culture contenant le polypeptide hybride est mis en contact avec des polysaccharides sulfatés liés de façon covalente à un support solide, f) le polypeptide hybride lié audit support est élué par un gradient de NaCI compris entre 0 et 1 M, g) le cas échéant, le polypeptide hybride est traité par une protéase à sérine, et la protéine recherchée dépourvue des séquences R1 et R2 est récupérée. 12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel R1 est de formule KKAAPA. 13. Procédé selon la revendication 11 dans lequel quand le nombre de motifs R1 varie entre 1 et 5, la force ionique d'élution du polypeptide hybride du polymère sulfaté varie entre 10 et 500 mM 14. Procédé selon la revendication 11 dans lequel R2 est de formule KKAAAKK. 15. Utilisation des motifs répétés R1 de formule : X1X2Y1Y2PY3 et R2 de formule X1X2Y1Y2Y3X3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R (Arg) , etY1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), )(!!eu), V(Val) et P représente une proline, comme label moléculaire dans la fabrication par recombinaison génétique de polypeptides recombinants hybrides comportant une séquence protéique ou polypeptidique que l'on souhaite purifier par chromatographie d'affinité. 16. Utilisation selon la revendication 15 dans laquelle R1 est de formule KKAAPA. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16 dans laquelle R2 est de formule KKAAAKK. 18. Trousse ou kit pour la production d'un polypeptide recombinant porteur d'un label moléculaire selon l'invention et comprenant au moins : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide R1 ou un vecteur le contenant de formule :X1X2Y1Y2PY3 ou un vecteur le contenant, b) le cas échéant un polynucléotide codant pour un polypeptide R2 ou un vecteur le contenant de formule: X1X2Y1Y2Y3X3X4, ou un vecteur le contenant, dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R(Arg) , Y1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, c) le cas échéant, l'anticorps monoclonal 3921 E4. 19. Trousse selon la revendication 18 dans laquelle R1 est de préférence de formule KKAAPA. 20. Trousse selon la revendication 19 dans laquelle R2 est de formule KKAAAKK. 21. Trousse selon la revendication 18 dans laquelle la séquence en a) ou en b) est précédée ou suivie d'une séquence multisite de clonage.