Brevet FR2792837A1 — publié le 20001103

La présente invention se rapporte à des médicaments destinés au traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse et des maladies associées aux troubles de la production de leptine. Les adipocytes sont considérés comme jouant un rôle clé dans le contrôle de la masse corporelle, aussi bien dans les cas normaux de ce contrôle du poids que dans les cas pathologiques, où existe un dérèglement de ce contrôle, notamment en cas d'augmentation de la masse graisseuse (obésité) ou en cas de diminution de cette masse graisseuse (cachexie). Cependant peu d'informations existent sur les facteurs qui régulent la biologie des adipocytes, en particulier sur ceux qui interviennent dans la formation de la graisse. L'obésité est une maladie chronique dont les conséquences sur la santé sont importantes et dont la fréquence à travers le monde est en pleine expansion (Hill J.O. et al. (1998), Science, 280,1371-1374). Parce que l'obésité résulte d'un déséquilibre de la balance énergétique et que les adipocytes sont considérés comme le site principal de stockage et de mobilisation de l'énergie, de nombreuses études ont été réalisées pour comprendre la biologie des adipocytes. Les états cachectiques, caractérisés par la perte du tissu adipeux et de la masse musculaire squelettique, sont observés en cas d'infections, de SIDA et chez la moitié des patients atteints d'un cancer. Ces modifications ne peuvent pas s'expliquer seulement par l'anorexie observée dans ces maladies puisqu'un complément nutritionnel seul, ne suffit pas à inverser ce processus de perte de poids. Une augmentation de la consommation d'énergie au repos pourrait contribuer à cette perte de poids chez certains patients cancéreux et pourrait expliquer l'augmentation de l'oxydation de la graisse. Il a été suggéré, que des facteurs circulants comme les cytokines, le TNF-a (facteur de nécrose tumorale a), les interleukines-1 et-6 et l'interféron y pourraient être des médiateurs intervenant dans la cachexie ; toutefois, à ce jour aucune étude en laboratoire ou en clinique ne permet de prouver que ces différents facteurs pourraient jouer un rôle dans la cachexie chez l'homme et que l'action des cytokines à elle seule pourrait expliquer le mécanisme complexe de perte de poids, due à la cachexie observée dans les cancers et le SIDA (Argiles J. M et al., (1997), Faseb, 11,743-751 ; Tisdale M. J., (1997), J Natl ; Cancer Inst , 89,1763- 1773). De même aucun lien n'a été mis en évidence entre les taux plasmatiques de leptine et les états cachectiques alors que cette hormone impliquée dans l'obésité est sécrétée par les adipocytes (Leroy P. et al. (1996), J Biol. Chem. 271, 2365-2369) La différenciation adipocytaire (ou adipogénèse) fait intervenir plusieurs facteurs transcriptionnels, en particulier des facteurs de la famille des C/EBP (CCAAT/enhancer binding proteins) et des PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors), ainsi que des facteurs de la famille des protéines à motif HLH (héliceboucle-hélice). La régulation de l'activité de ces facteurs transcriptionnels par certains agents, conduit à la modulation de la différenciation adipocytaire. Ainsi certains agents favorisent la différenciation adipocytaire (action adipogénique), d'autres inhibent la différenciation adipocytaire (action anti-adipogénique), d'autres, enfin, peuvent avoir les deux types d'action. Parmi les agents anti-adipogéniques, on trouve les deux formes d'une cytokine, le TNF-a (facteur de nécrose tumorale a) qui inhibe l'expression de C/EBPa et de PPARy2 et le TNF-P (facteur de nécrose tumorale P) qui prévient la différenciation adipocytaire indépendamment de son effet mitogénique (Loftus T.M. étal., Curr. Opin. Genet. Dev. (1997), 7, 603-608). Des études réalisées sur les adipocytes ont montré également que les adipocytes sécrètent le TNF-a et une autre cytokine multifonctionnelle, l'IL-6, (interleukine-6) qui sembleraient ainsi jouer un rôle dans la régulation de l'entrée des acides gras dans le tissu adipeux et dans leur métabolisme (Fried S.K. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1998), 83,847-850). Cependant, à l'exclusion du TNF et de l'IL-6, qui sont des cytokines à action très générale, aucune étude, à ce jour, n'a montré que d'autres médiateurs de l'inflammation intervenaient dans la différenciation adipocytaire, ou étaient sécrétés par les adipocytes. La synthèse des cytokines se fait de novo lors d'une activation cellulaire et elles agissent en se fixant sur des récepteurs spécifiques, possédant une seule région transmembranaire et liés à des kinases intracellulaires. Leur action s'exerce le plus souvent localement (action paracrine-ou autocrine), mais elles peuvent également agir à distance (action endocrine). Parmi les médiateurs inflammatoires, on trouve des cytokines chimiotactiques, appelées chimiokines, qui sont connues pour jouer un rôle important dans la transmigration périvasculaire et l'accumulation des leucocytes au site du dommage tissulaire. On distingue quatre classes de chimiokines selon la distance qui existe entre les deux premiers des quatre résidus cystéine entrant dans la formation des ponts disulfures, les dites classes sont : - les a-chimiokines (CXC), comme l'interleukine-8 (IL-8), SDF1 (stromal cell derivated factor), GRO (melanoma growth-stimulating activity) et IP-10 (interferon-y inducible 10 K Da protein), - les ss-chimiokines (CC), comme RANTES (regulated-upon- activation, normal 7'-ce// expressed and secreted), MIP-la, MIP-1ss et MIP-2 (macrophage inflammatory proteins) et MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 et MCP-5 (monocyte chemotactic protein), - les [gamma]-chimiokines (C), comme la lymphotactine et - les -chimiokines (CX3C), comme la neurotactine. Ces chimiokines agissent également en se fixant sur des récepteurs qui possèdent 7 régions transmembranaires et sont liés à la protéine G. En plus de leur rôle bien établi en tant que médiateurs de l'inflammation, on a montré récemment (P. Proost et al., Int. J. Clin. Lab. Res. (1996), 26,211-223) que les chimiokines avaient en fait des fonctions biologiques beaucoup plus larges, comme par exemple des propriétés de régulateur de croissance et d'angiogénèse. De même on a montré qu'elles interviennent également dans le développement des systèmes immunitaire, circulatoire et nerveux central. (R. Horuk, Nature (1998), 393,524-525). Toutefois, aucune étude n'a encore montré que les chimiokines pouvaient exister dans les adipocytes et avoir un rôle important. Or, les Inventeurs ont montré, de manière surprenante, que les chimiokines, indépendamment de leur rôle anti-inflammatoire, pouvaient jouer un rôle dans la régulation de la biologie des adipocytes. Les adipocytes représentent les 3/4 des cellules du tissu adipeux, les autres cellules étant essentiellement des cellules précurseurs, en particulier des préadipocytes (cellules sans lipides). Le tissu adipeux joue un rôle central dans le contrôle de l'équilibre énergétique de l'organisme. Les principales fonctions sont le stockage des réserves énergétiques sous forme de triglycérides et leur mobilisation sous forme d'acides gras libres ; de plus, le développement excessif de la masse adipeuse observée au cours de l'obésité fait à la fois intervenir une hypertrophie et une hyperplasie cellulaire. Bien que le développement du tissu adipeux blanc ait lieu essentiellement en période post-natale, une augmentation de la population adipocytaire, à partir du recrutement de précurseurs cellulaires présents dans la fraction vasculaire du stroma de ce tissu, peut aussi survenir. Aussi, les composés qui pourraient inhiber la prolifération des préadipocytes et/ou empêcher l'accumulation des lipides dans les adipocytes et/ou modifier la production de leptine, pourraient être utiles pour la préparation de médicaments utiles dans le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse. En conséquence, les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des médicaments destinés au traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie et au traitement des maladies associées à des troubles de la production de leptine, notamment en cas d'hypogonadisme. Lors de leurs travaux, les Inventeurs ont montré : - que des cultures primaires de préadipocytes blancs humains et d'adipocytes blancs humains expriment les ARNm de certaines chimiokines et de leurs récepteurs, - que l'expression des ARNm de ces chimiokines et celle de leurs récepteurs est modifiée lors de la différenciation adipocytaire, - que le tissu adipeux brun exprime les ARNm de certaines chimiokines et de leurs récepteurs, - que des récepteurs de chimiokines sont présents dans le tissu adipeux blanc humain et qu'un traitement par les chimiokines conduit à une diminution de la masse graisseuse et - que MIP-1[alpha] augmente le taux de leptine dans les cultures d'adipocytes blancs humains. Par conséquent, la présente invention se rapporte à l'utilisation des ligands des récepteurs des chimiokines, qu'ils soient agonistes ou antagonistes, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie et au traitement des maladies associées à des troubles de la production de leptine, notamment en cas d'hypogonadisme. Au sens de la présente invention, on entend par ligand des récepteurs de chimiokines, aussi bien les ligands naturels que les analogues synthétiques. La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des ligands des récepteurs des a-chimiokines et des P-chimiokines pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie et au traitement des maladies associées à des troubles de la production de leptine, notamment en cas d'hypogonadisme. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise des ligands des récepteurs de l'IL-8. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise des ligands choisis dans le groupe constitué par les ligands des récepteurs de MCP-1 et MIP-1[alpha]. En effet les préadipocytes blancs humains en culture primaire expriment les ARNm de MCP-1, IL-8 et MIP-la ; l'expression de l'ARNm de MCP-1 n'est pas modifiée lors de la différenciation des préadipocytes, alors que les expressions de l'ARNm de IL-8 et de MIP-la sont diminuées dans les adipocytes, comparativement aux préadipocytes. Le récepteur adrénergique p3 (p3 AR) est spécifiquement exprimé dans les adipocytes où il intervient dans la régulation de la lipolyse et de l'adipogénèse (Strosberg A. D. et al. (1996) Trends in Pharmacological Sciences 17,373-381). De plus une mutation naturelle de ce récepteur a été associée à une obésité morbide (Strosberg A. D. et al. (1997) Trends in Pharmacological Sciences 18,449-454). Compte tenu de ce rôle des ss3 AR dans la régulation des fonctions des adipocytes, les Inventeurs ont recherché si l'addition d'isoprotérénol, agoniste des ss3 AR modifiait l'expression des ARNm des chimiokines elles mêmes ou celle des ARNm de leurs récepteurs. Dans ces conditions, l'expression de l'ARNm de l'IL-8 est stimulée par l'addition d'isoprotérénol dans le milieu de culture. En outre, l'expression des ARNm de certains récepteurs (CXCR1, CXCR2, CCR2, CCR5) augmente lors de la différenciation adipocytaire. Dans ces conditions, et de manière inattendue, l'expression des récepteurs des différentes chimiokines dans les adipocytes est étroitement corrélée à la présence de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme. L'incubation d'adipocytes blancs humains, en présence de l'IL-8, de MCP-1 et de MIP-1[alpha], conduit à une diminution du contenu lipidique de ces adipocytes. De plus, alors que l'incubation d'adipocytes blancs humains, en présence de l'IL-8 et de MCP-1 ne modifie pas la production de leptine par les adipocytes et ce quelque soit le stade de différenciation, l'incubation d'adipocytes en présence de MIP-la, conduit à une augmentation de la production de la leptine. La présente invention a également pour objet un procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme un ligand vis-à-vis des récepteurs de chimiokines portés par les préadipocytes et les adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de la molécule avec des préadipocytes ou des adipocytes portant des récepteurs de chimiokines, dans des conditions qui permettent la formation d'une liaison entre au moins un récepteur des chimiokines et ladite molécule, dès lors qu'elle s'avérerait effectivement posséder une affinité pour ce récepteur, et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur par des moyens physiques ou chimiques. Cette détection peut être réalisée par tout moyen classiquement utilisé, notamment par l'utilisation de ligands radiomarqués, par immunocytochimie, par fluorescence, ou par mesure du signal transductionnel (activated signal transduction pathways). Un tel procédé permet la sélection de ligands spécifiques des différents récepteurs des chimiokines exprimés dans les préadipocytes et les adipocytes, lesdits ligands agissant en outre sur la régulation des fonctions adipocytaires, en particulier sur la différenciation adipocytaire, la formation des lipides et la production de leptine. La présente invention a également pour objet un procédé pour l'étude des récepteurs des chimiokines exprimés par les préadipocytes et les adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de ligands déterminés avec des préadipocytes ou des adipocytes, et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur par des moyens physiques ou chimiques. Cette détection peut être réalisée par tout moyen classiquement utilisé, notamment par l'utilisation de ligand radiomarqué, par immunocytochimie, par fluorescence, ou par mesure du signal transductionnel (activated signal transduction pathways). Un tel procédé permet d'étudier la pharmacologie des récepteurs de chimiokines impliqués dans la régulation des fonctions adipocytaires, en particulier dans la différenciation adipocytaire, la formation des lipides et la production de leptine, d'identifier des ligands ayant une meilleure affinité pour ces récepteurs et de mettre au point des médicaments actifs dans le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie. La présente invention a également pour objet un procédé pour l'étude de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier l'accumulation des lipides dans lesdits adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact du ligand à étudier avec des adipocytes et - la détection de la formation des lipides dans lesdits adipocytes, par des moyens physiques ou chimiques. Cette détection peut être réalisée par tout moyen classiquement utilisé, notamment par marquage au Oil Red O. selon la méthode décrite par Ramirez-Zacarias J.L. et al. (1992), Histochemistry, 97,493-497). Un tel procédé permet de sélectionner des ligands spécifiques des différents récepteurs des chimiokines exprimés dans les adipocytes, lesdits ligands agissant sur la formation des lipides dans lesdits adipocytes et de mettre au point des médicaments actifs dans le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie, et actifs dans le traitement des maladies associées à des troubles de la production de la leptine, notamment en cas d'hypogonadisme La présente invention a également pour objet un procédé pour l'étude de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier la production de leptine par lesdits adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact du ligand à étudier avec des adipocytes et - la détection de la production de leptine par des moyens physiques ou chimiques. Cette détection peut être réalisée par tout moyen classiquement utilisé, notamment par une méthode radioimmunologique. Un tel procédé permet de sélectionner des ligands spécifiques des différents récepteurs des chimiokines exprimés dans les adipocytes, lesdits ligands agissant sur la production de leptine par lesdits adipocytes et de mettre au point des médicaments actifs dans le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie, et actifs dans le traitement des maladies associées à des troubles de la production de la leptine, notamment en cas d'hypogonadisme. Selon l'invention, pour la mise en #uvre desdits procédés, on utilise des préadipocytes et des adipocytes issus du tissu adipeux blanc ou brun, humain ou murin ou des lignées cellulaires de préadipocytes, comme par exemple les lignées cellulaires de préadipocytes blancs de souris 3T3-Ll [Green H. et al. (1974), Cell, 1, 113-116; souche ATCC CCL-92.1, mouse embryo, substrain of 3T3 déposée à l'American Type Culture Collection (ATCC) ] et 3T3- F442A (Green H. et al. (1976), Cell, 7,105-113) et les lignées cellulaires de préadipocytes bruns humains PAZ-6 (Zilberfarb V. et al. (1997), J Cell Sc., 110, 801-807; souche 1-1531 déposée à Collection Nationale de Cultures et de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur). De préférence, on utilise des préadipocytes et des adipocytes issus du tissu adipeux blanc humain. La présente invention a, en outre, pour objet une trousse de détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour les récepteurs des chimiokines exprimées par les préadipocytes et les adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des préadipocytes ou des adipocytes en culture, - un ou plusieurs ligands témoins et - des moyens de détection du complexe ligand-récepteur. La présente invention a, en outre, pour objet une trousse de détection de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimées par les adipocytes, à modifier la formation des lipides dans lesdits adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des adipocytes en culture, et - des moyens pour détecter les lipides formés dans lesdits adipocytes. La présente invention a, en outre, pour objet une trousse de détection de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier la production de leptine par lesdits adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des adipocytes en culture, et - des moyens pour détecter la leptine produite par lesdits adipocytes. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles : - la figure 1 illustre l'expression des ARNm des chimiokines dans les préadipocytes et les adipocytes blancs humains ; la détection est réalisée par RT-PCR selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. Les préadipocytes et les adipocytes blancs humains sont cultivés en l'absence (-) ou en présence (+) d'isoproténérol 1 M pendant 18 heures; MIP-la (macrophage inflammatory protein la) ; MCP-1 (monocyte chemotactic protein). - la figure 2 illustre l'expression des ARNm des récepteurs de chimiokines dans les préadipocytes et les adipocytes blancs humains ; la détection est réalisée par RT-PCR selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. Les préadipocytes et les adipocytes blancs humains sont cultivés en l'absence (-) ou en présence (+) d'isoproténérol 1 M pendant 18 heures ; IL-8 (interleukine 8), MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP-1[alpha] (macrophage inflammatory protein la). - la figure 3 représente l'expression des récepteurs de chimiokines dans les adipocytes blancs humains détectée par immunocytochimie selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 ; CXCR1 et CXCR2 sont des récepteurs de IL-8 (interleukine 8), CCR2 est le récepteur de MCP-1 (monocyte chemotactic protein) et CCR5 est le récepteur de MIP-la (macrophage inflammatory protein 1) - la figure 4 représente l'effet des chimiokines sur l'accumulation des lipides dans les adipocytes blancs primaires humains. Les adipocytes blancs humains sont cultivés soit en l'absence de chimiokines, soit en présence de IL-8 (interleukine 8), de MCP-1 (monocyte chemotactin protein) ou de MIP-la (macrophage inflammatory protein la) à 50 nM ; formation des lipides est mesurée après 12 jours de culture. Les résultats sont exprimés comme la moyenne erreur standard à la moyenne (s. e.m.) de 5 ou 6 expériences. - la figure 5 représente l'effet des chimiokines sur la production de leptine par des adipocytes blancs primaires humains. Les adipocytes blancs humains sont cultivés soit en l'absence de chimiokines (-#-), soit en présence de IL-8 (-#- interleukine 8) à 100 nM, ou de MCP-1(--monocyte chemotactin protein) à 100 nM ou de MIP-1[alpha] (-O-macrophage inflammatory protein la) à 100 nM ; la production de leptine est mesurée après 4,8 et 12 jours de culture. Les résultats sont exprimés comme la moyenne erreur standard à la moyenne (s. e.m.) d'une expérience réalisée en triplicata. EXEMPLE 1 : Matériel et méthodes mis en oeuvre pour étudier l'expression des chimiokines et de leurs récepteurs dans les préadipocytes et les adipocytes blancs humains. 1. Cultures cellulaires : a) préadipocytes : le tissu adipeux omental est obtenu de sujets sains ayant subi une chirurgie esthétique. Le tissu est coupé en petits morceaux et digéré pendant 1 heure à 37 C par de la collagènase de type 2 (Worthington) à une concentration de 1 mg/ml. Après digestion, le tissu est filtré sur un filtre de nylon, et les préadipocytes sont isolés par centrifugation à 200 g pendant 10 minutes. Le culot, qui contient les préadipocytes, est traité par un tampon contenant : NH4C1 154 mM, KHC03 10 mM et EDTA 0,1mM afin d'éliminer les globules rouges. b) adipocytes : les préadipocytes obtenus sont mis en culture jusqu'à confluence dans un mélange (1:1) de Ham's F12/DMEM (Dubelcco 's modified Eagles médium ; Gibco-BRL) supplémenté avec du tampon Hepes 20 mM (Gibco-BRL), 5 % de sérum de veau foetal décomplémenté (Gibco-BRL) et des antibiotiques. Lorsque les cellules ont atteint la confluence, elles sont transférées dans un milieu supplémenté avec de la biotine (33 M, Sigma), du panthoténate (18 M, Sigma), de la triiodothyronine (T3,1 nM, Sigma), de l'insuline (85 nM, Sigma), de la dexaméthasone (1 M, Sigma), de la 3-isobutyl-1-méthyl-xanthine (250 nM, Sigma) et de la naphtiazol (1 M, agoniste de PPR-y, don du Dr. J. Duhault, IRIS France). Les cellules sont maintenues dans ce milieu pendant 12 jours en changeant le milieu tous les 3 jours. 2. Marquage au Oil Red O. et quantification des lipides dans les cellules adipocvtes : La solution de Oil Red O. est préparée selon la méthode décrite par Ramirez-Zacarias J.L. et al. (1992), Histochemistry, 97,493-497. Six plaques multipuits sont lavées 2 fois par du tampon PBS salin (phosphate buffered saline), fixées pendant 1 heure par une solution de formaline à 10 % dans le PBS, lavées avec de l'eau, marquées pendant 2 heures par immersion complète dans une solution de Oil Red O. et rincées deux fois avec de l'eau. L'excès d'eau est évaporé en plaçant les plaques à 37 C. Le colorant est extrait par 200 (il d'alcool isopropylique par puits et l'absorbance d'un aliquot est mesurée immédiatement à 492 nm. Les lipides (triglycérides) sont quantifiés en utilisant des courbes de calibration de trioléine (Sigma) selon la méthode décrite par Ramirez-Zacarias J.L. (Ramirez-Zacarias J.L. et al. (1992), déjà cité). 3. RT-PCR : L'ARN total est extrait des adipocytes blancs primaires humains (passage 1-3) en utilisant l'agent d'isolement Trizol RNA (Gibco Life Sciences). 20 g d'ARN total sont traités par 6 U d'ADNase I sans ARNase (RQ1 DNase Promega) dans un milieu contenant du Tris-HCl 40 mM, à pH 9, NaCL 10 mM, MgCl2 6 mM, en présence de 2 U/ l d'inhibiteur d'ARNase (RNaseOUT, Gibco Life Sciences). L'ARN est ensuite extrait par un mélange de phénol et de chloroforme, précipité par de l'éthanol, séché et suspendu dans l'eau. L'ADNc est préparé à parti de 2 g d'ARN total sans ADN en utilisant la transcriptase inverse du Virus de Moloney de la leucémie murine (SuperScriptTM II, Gibco Life Sciences) selon les instructions du fabricant. Des témoins sans transcriptase inverse sont préparés afin d'exclure toute possibilité de contamination par l'ADN. 100 ng d'ARN ainsi transcrits sont amplifiés par 1 U de Taq polymérase (Gibco Life Sciences) dans un volume final de 30 l de tampon contenant : Tris-HCl 20 mM, à pH 8,0, KCI 50 mM, MgCl2 1,5 mM, dNTP 250 M et 250 M de séquences amorces sens et antisens spécifique d'un gène dans un thermocycleur (GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer Cetus). Les produits d'amplification sont visualisés après électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 % par du BET (ethidium bromide). Pour la détermination semi-quantitative des RT-PCRs, on réalise l'analyse pendant la phase exponentielle de l'amplification. Les séquences amorces sens et antisens sont les suivantes : - cyclophiline : ID N 1 et SEQ ID N 2 ; - interleukine-8 : SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 ; - MIP-la : SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 ; - MCP-1 : SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ; - CXCR1 : SEQ ID N 9 et SEQ ID N 10 ; - CXCR2 : ID N 11 et SEQ ID N 12 ; - CCR1 : SEQ ID N 13 et SEQ ID N 14 ; - CCR2 : SEQ ID N 15et SEQ ID N 16 ; - CCR4 : SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18 ; - CCR5 : SEQ ID N 19 et SEQ ID N 20 ; - CCR9/10 : SEQ ID N 21 et SEQ ID N 22 ; 4. Caractérisation de l'expression des ARNm des récepteurs par immunocvtochimie : Les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes, traitées (quenching) par une solution de glycine 0,1 M dans du PBS (phosphate buffer saline) et perméabilisées par du PBS contenant 0,2 % de BSA (bovine serum albumin) et 0,05 % de saponine. Après plusieurs lavages, les cellules sont traitées par du PBS contenant 10 % de FCS (jeta! calfserum). Ensuite les cellules sont incubées pendant une nuit, soit avec des anticorps monoclonaux dirigés contre CXCR1, CXCR2, CXCR4, CCR1, CCR2 et CCR5 (dilution 1 :100, R&D), soit avec des anticorps polyclonaux dirigés contre CCR4 (dilution 1 :100, Santa Cruz). Finalement les cellules sont incubées avec un anticorps secondaire conjugué avec un chromophore (isothiocyanate de fluorescéïne (FITC) ou Cy3) dans le même tampon pendant 1 heure, puis lavées abondamment avant d'être montées. Les témoins sont préparés en omettant les anticorps primaires et en les remplaçant par des anticorps monoclonaux du même isotype. Après montage les cellules sont examinées au microscope à laser (MRC 1000 Biorad, Hercules, CA, USA). 5. Mesure de la production de leptine par les adipocytes La leptine est mesurée dans le milieu de culture, par une méthode radioimmunologique, selon la technique décrite par Ma Z. et al., (1996), Clinical chemistry, 42,942-946), à l'aide du kit de chez Linco Research Inc. (St Charles, MO, USA) en suivant les instructions du fabricant. La limite de détection de la méthode est de 0,5 ng/ml. EXEMPLE 2 : des ARNm des chimiokines dans les préadipocytes et les adipocytes blancs humains. Le mode opératoire est celui décrit dans l'exemple 1. Les résultats sont illustrés à la figure 1. La cyclophiline est utilisée comme témoin de l'expression des ARNm totaux. L'expression de MCP-1 n'est pas modifiée pendant la différenciation adipocytaire alors que l'expression de l'IL-8 et de MIP-la est diminuée dans les adipocytes comparativement aux préadipocytes. L'isoprotérénol stimule l'expression de l'IL-8 dans les adipocytes mais est sans effet sur celle de l'IL-8 dans les préadipocytes. L'isoprotérénol est sans effet sur l'expression de MIP-la et de MCP-1, aussi bien dans les préadipocytes que dans les adipocytes. EXEMPLE 3 : Expression des ARNm des récepteurs des chimiokines dans les adipocytes blancs humains. Le mode opératoire est celui décrit dans l'exemple 1. 1. dans les préadipocytes : les résultats sont illustrés dans la figure 2 et dans le tableau Ici-après. Les récepteurs CXCR1 et CCR2 ne sont pas exprimés dans les préadipocytes blancs humains. Les récepteurs CXCR2, CCR4 et CCR5 sont faiblement exprimés dans les préadipocytes blancs humains. Les récepteurs CCR1 et CCR9/10 sont fortement exprimés dans les préadipocytes blancs humains. L'isoproténérol stimule l'expression des récepteurs CXCR1, CXCR2, CCR2 et CCR5 dans les préadipocytes blancs humains, mais est sans effet sur l'expression des autres récepteurs. 2. dans les adipocytes : les résultats sont illustrés dans les figures 2 et 3 et dans le tableau I ci-après. Tous les récepteurs CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5 et CCR10 sont fortement exprimés dans les adipocytes blancs humains. L'isoproténérol est sans effet sur l'expression des différents récepteurs de chimiokines dans les adipocytes blancs humains. L'expression des récepteurs CXCR1, CXCR2 et CCR5 est limitée aux adipocytes complètement différenciés puisqu'elle est liée à la présence de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme (figure 3). L'expression des récepteurs CCR2, en revanche, apparaît dans les cellules sans gouttelettes lipidiques mais seulement après mise en culture dans le milieu de différenciation. L'expression du récepteur multifonctionnel CXCR4, récepteur de SDF-la (stromal cell derivated factor), est également limitée aux adipocytes complètement différenciés puisqu'elle est liée à la présence de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme (tableau 1). TABLEAU RECEPTEURS LIGANDS PREADIPOCYTES ADIPOCYTES CXCR1 IL-8, CGP-2 - ++ CXCR2 IL-8,NAP-2, + ++ GROa, ENA-78 CXCR4 SDF-la + ++ CCR1 MIP-la, RANTES + + MCP-3 CCR2 NICP-1,2,3,4,5 - ++ CCR4 MIP-la, RANTES + ++ TARC, MDC CCR5 MIP-1[alpha],ss, RANTES + ++ CCR10 MCP-1,3 ++ ++ EXEMPLE 4 : des chimiokines sur la formation de lipides dans les adipocytes. Les lipides sont mesurés selon la technique décrite dans l'exemple 1. Les résultats sont illustrés à la figure 4. IL-8 diminue de manière significative la formation des lipides dans les adipocytes après 12 jours de culture ; l'inhibition est en moyenne de 22 % 6, avec un taux d'inhibition maximale de 41 %. MIP-la diminue la formation des lipides dans les adipocytes après 12 jours de culture ; l'inhibition est en moyenne de 21 % 9, avec un taux d'inhibition maximale de 47 %. MCP-1 diminue également de manière significative la formation des lipides dans les adipocytes après 12 jours de culture ; l'inhibition est en moyenne de 23 % 7, avec un taux d'inhibition maximale de 47 %. Cet effet inhibiteur apparaît dès la concentration de 10 nM. De plus la diminution du taux de lipides induite par les chimiokines est liée à l'état de maturation des adipocytes ; en effet dans des cultures qui contiennent de nombreuses cellules avec des grandes vacuoles lipidiques les chimiokines induisent une diminution allant jusqu'à 59 % pour IL-8, 52% pour MIPla et 53 % pour MCP-1. EXEMPLE 5 : Production de leptine par des adipocytes blancs primaires différenciés in vitro La leptine est mesurée selon le mode opératoire décrit dans l' exemple 1. Les résultats sont donnés à la figure 5. La production de leptine par les adipocytes augmente lors de la différenciation et cet effet n'est pas modifié par l'addition de IL-8 ou de MCP-1 dans le milieu de culture, quelque soit le stade de différenciation. En revanche l'addition de MIP-la augmente d'environ 50 % et ce de manière significative, les taux de leptine, à tous les stades de différenciation. Ces résultats suggèrent que les chimiokines pourraient jouer un rôle important dans la régulation de la biologie des adipocytes et que les agonistes et les antagonistes des récepteurs de chimiokines pourraient être utiles pour la préparation de médicaments utiles pour le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse, notamment en cas d'obésité, de cachexie, d'anorexie, de diabète et d'hyperlipidémie et au traitement des maladies associées à des troubles de la production de leptine, notamment en cas d'hypogonadisme. REVENDICATIONS 1) Utilisation des agonistes et des antagonistes des récepteurs de chimiokines pour la préparation de médicaments utiles dans le traitement des troubles de la régulation de la masse adipeuse et dans le traitement des maladies associées aux troubles de la production de leptine. 2) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les agonistes et les antagonistes sont choisis dans le groupe constitué par les agonistes et les antagonistes des récepteurs CXCR des a-chimiokines. 3) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'on utilise des agonistes et des antagonistes des récepteurs de l'IL-8. 4) Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les agonistes et les antagonistes sont choisis dans le groupe constitué par les agonistes et les antagonistes des récepteurs CCR des p-chimiokines. 5) Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'on utilise des agonistes et des antagonistes choisis dans le groupe constitué par les agonistes et les antagonistes des récepteurs de MIP-la ou MCP-1. 6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le trouble de la régulation de la masse adipeuse est choisi dans le groupe constitué par l'obésité, la cachexie, l'anorexie, le diabète et l'hyperlipidémie et la maladie associée aux troubles de la production de leptine est l'hypogonadisme. 7) Procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme un ligand vis-à-vis des récepteurs de chimiokines, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de la molécule avec des préadipocytes ou des adipocytes portant des récepteurs de chimiokines, dans des conditions qui permettent la formation d'une liaison entre au moins un récepteur des chimiokines et ladite molécule, dès lors qu'elle s'avèrerait effectivement posséder une affinité pour ce récepteur, et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand-récepteur par des moyens physiques ou chimiques. 8) Procédé pour l'étude des récepteurs des chimiokines exprimés par les préadipocytes et les adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de ligands déterminés avec des préadipocytes ou des adipocytes, et - la détection de la formation d'un complexe du type ligand- récepteur par des moyens physiques ou chimiques. 9) Procédé pour l'étude de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier l'accumulation des lipides dans lesdits adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact du ligand à étudier avec des adipocytes et - la détection de la formation des lipides dans lesdits adipocytes, par des moyens physiques ou chimiques. 10) Procédé pour l'étude de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier la production de leptine par lesdits adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact du ligand à étudier avec des adipocytes et - la détection de la production de leptine par des moyens physiques ou chimiques. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendication 7 à 10, caractérisé en ce que les préadipocytes et les adipocytes sont issus du tissu adipeux blanc humain. 12) Trousse de détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour les récepteurs des chimiokines exprimées par les préadipocytes et les adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des préadipocytes ou des adipocytes en culture, - un ou plusieurs ligands témoins et - des moyens appropriés pour la détection du complexe ligand-récepteur. 13) Trousse de détection de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimées par les adipocytes, à modifier la formation des lipides dans lesdits adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des adipocytes en culture, et - des moyens pour détecter les lipides formés dans lesdits adipocytes. 14) Trousse de détection de la capacité d'un ligand des récepteurs des chimiokines exprimés par les adipocytes, à modifier la production de leptine par lesdits adipocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend : - des adipocytes en culture, et - des moyens pour détecter la leptine produite par lesdits adipocytes.