Brevet FR2790558A1 — publié le 20000908

Procédé d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire. La présente invention a pour objet un procédé d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire ainsi qu'un agent d'évaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire. Chez l'homme et les mammifères, l'importance des processus de protéolyse intracellulaire transparaît dans la multiplicité des secteurs où il est impliqué. A travers le renouvellement protéique, les activités protéolytiques conditionnent l'accrétion des protéines déterminant ainsi, au même titre que la synthèse protéique, l'intensité de la croissance. Ces activités interviennent aussi dans les phénomènes de prolifération et de transformation cellulaires et dans plusieurs affections. Certaines situations de stress (sepsis, polytraumatismes, brûlures étendues, SIDA, présence de tumeurs,...) s'accompagnent d'une fonte protéique musculaire, première manifestation visible d'une activation de l'ensemble des systèmes intracellulaires de protéolyse. Les pertes d'azote urinaire de l'ordre de 10 à 25 g/j chez les patients traumatisés peuvent être doublées en cas d'infection, ce qui correspond à la perte quotidienne de 300 à 600 g de muscle. Il est donc apparu opportun de pouvoir évaluer la protéolyse musculaire à un stade précoce, avant de constater une perte musculaire importante. De plus, pour des raisons pratiques, un procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire devra être d'une mise en oeuvre facile et permettre d'obtenir des résultats rapidement. Ces résultats devront être quantitatifs et/ou qualitatifs. Après de longues recherches qui vont être décrites ci-après, la demanderesse a mis au point un nouveau procédé permettant d'évaluer la protéolyse musculaire, remplissant les conditions pratiques énoncées cidessus, tout comme un agent d'évaluation de la protéolyse permettant de mettre en oeuvre ce nouveau procédé. Dans un premier temps, la demanderesse a cherché à inventorier les gènes dont le niveau d'expression était modifié de manière appréciable lors d'une induction de la protéolyse musculaire. Parmi les modèles d'induction de la protéolyse musculaire, l'injection unique de bactéries vivantes, E. coli, chez des rats, permet de maintenir ces animaux dans une situation catabolique durant plusieurs jours et reproduit ainsi les modifications métaboliques les plus proches de celles observées chez l'homme. Cette situation catabolique est dans la suite du texte dénommée "sepsis". Pour mettre en évidence les gènes surexprimés lors de la protéolyse musculaire, la demanderesse a utilisé la méthode dite "DD-RTPCR" (Differential Display - Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Le principe de cette technique est basé sur l'amplification combinatoire de fragments d'ADN à partir de la totalité des ARN messagers, ci-après appelés ARNm, présents dans le tissu musculaire de rats du modèle ci-dessus décrit, c'est-à-dire de rats en situation de sepsis, et des rats témoins, n'étant pas en situation de protéolyse. Les ARNm, isolés de ces tissus, sont soumis à l'action de la reverse transcriptase en présence d'une amorce ancrée en 3' sur la queue poly A des ARNm. Puis, une étape d'amplification est réalisée par PCR en présence d'un décamère jouant le rôle d'amorce en 5'. L'amplification des fragments représentant la totalité des messagers est obtenue par l'emploi successif de plusieurs combinaisons décamères-amorces 3'. L'étape d'amplification est ensuite réalisée en présence d'un dNTP marqué au 33P. Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les gels sont alors révélés en autoradiographie classique. Les bandes des gels obtenus en utilisant l'ADN des rats en situation de sepsis sont comparées aux bandes des gels obtenus en utilisant l'ADN des rats témoins. Les fragments différentiels, c'est-à-dire les bandes présentes uniquement sur le gel obtenu en utilisant l'ADN des rats en situation de sepsis, sont ensuite prélevés, réamplifiés, clonés, puis séquences. Cette séquence est alors comparée à l'ensemble des séquences nucléotidiques présentes dans des banques d'ADN. Ainsi, le fragment différentiel peut être identique à une séquence d'ADN connue. En procédant de cette manière, la demanderesse a, de façon surprenante, identifié un fragment différentiel. La figure 1 représente le gel obtenu après électrophorèse d'ADN de rats témoins et de rats en situation de sepsis, un fragment différentiel présent uniquement dans les échantillons d'ADN de rats en situation de sepsis est visible. Ce fragment de 256 nucléotides, après avoir été séquence, a été comparé à 325 789 séquences présentes dans une banque de données d'ADN. D'une façon inattendue, il a été constaté qu'il correspond au messager codant pour la cathepsine L. Cette dernière est une cystéine protéinase du lysosome. Le caractère différentiel de ce fragment a été confirmé par une analyse par protection aux RNases et par une analyse en Northern-blot. Ces expériences ont permis de démontrer que la teneur en ARNm de la cathepsine L était entre 15 à 20 fois supérieure chez les rats en situation de "sepsis", par rapport à la teneur en ARNm de la cathepsine L chez des rats témoins. Afin de s'assurer que cette augmentation du taux en ARNm de la cathepsine L observée chez les rats en situation de sepsis n'est pas une réponse spécifique à l'infection bactérienne, la demanderesse a déterminé la teneur en ARNm de la cathepsine L dans le muscle en situation protéolytique induite par d'autres causes que l'infection bactérienne. Il a été constaté que chez le rat porteur du sarcome de Yoshida (tumeur), la teneur en ARNm de la cathepsine L est fortement augmentée. Lors de traitements par des inhibiteurs de la protéolyse musculaire tels que la pentoxyfilline et Hw 448, il a été constaté que la teneur en ARNm de la cathepsine L diminue notablement. Une importante augmentation de la teneur en ARNm de la cathepsine L de muscles provenant de rats traités à la dexaméthasone, hormone induisant une protéolyse musculaire, par rapport à des rats témoins non traités, a aussi été constatée. Il a également été observé que la différence de la teneur en ARNm de la cathepsine L est spécifique du tissu musculaire, puisqu'elle a été observée dans deux types de muscles prélevés, Gastrocnemius et Tibialis, alors qu'elle est absente dans le foie des animaux chez lesquels les muscles ont été prélevés. La demanderesse a également étudié la corrélation entre le niveau d'ARNm et la quantité de protéine présente dans le muscle. Dans le cadre de la présente invention, il faut entendre par cathepsine L, la forme zymogène, aussi appelée M. E.P. (Major Excreted Protein) et la forme active de cette protéine. Pour ce faire, la demanderesse a effectué une analyse en Western-blot qui a permis de constater que la teneur en forme zymogène et active de la cathepsine L augmentait chez des rats en situation de "sepsis" dans des proportions de 2 à 5 fois par rapport à leur teneur chez des rats témoins non infectés. La demanderesse, en se basant sur ces variations de teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm, a ainsi isolé, de manière inattendue, un indicateur de l'intensité de la protéolyse musculaire. La présente invention est donc relative à un procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire, essentiellement caractérisé par le fait qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. Toutes analyses classiquement utilisées permettant de déterminer la teneur d'une protéine qualitativement et/ou quantitativement, peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention. La teneur en cathepsine L peut être déterminée, par exemple, en utilisant un anticorps dirigé contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L, forme zymogène ou active de cette protéine. Cet anticorps peut lui-même être marqué, c'est-à-dire par exemple couplé à un enzyme de marquage (analyse immunologique directe). Le couple Anticorps anti-cathepsine L/cathepsine L peut aussi être révélé par un deuxième anticorps marqué dirigé contre l'anticorps anti-cathepsine L (analyse immunologique indirecte). Des analyses mettant en oeuvre de tels anticorps sont, par exemple, celles connues de l'homme du métier appelées "Westem-blot", "ELISA" ou "Histo-Immuno". La technique semi-quantitative du Westem-blot consiste essentiellement à faire migrer les protéines d'un prélèvement musculaire ou sanguin sur un gel, à les transférer sur une membrane de nylon, puis à mettre le gel en présence d'anticorps monoclonaux anti-cathepsine L, à révéler ces couples Anticorps-cathepsine L par des anticorps marqués, et finalement à lire le gel ainsi obtenu. La technique ELISA, plus appropriée pour une détermination quantitative, consiste, dans un premier temps, à établir une gamme étalon en utilisant des concentrations connues de cathepsine L et en définissant les valeurs optiques correspondantes, puis à mesurer la valeur optique de l'échantillon et à déterminer, à l'aide de la gamme étalon, la concentration de cathepsine L, de façon précise. La technique Histo-Immuno, plus appropriée pour une détermination qualitative, consiste à effectuer une analyse immunologique directe ou indirecte sur le tissu musculaire. En comparant l'intensité du marquage de la cathepsine L à l'intensité du marquage d'une protéine de référence, la teneur en cathepsine L et ainsi la présence de protéolyse, pourra aussi être déterminée. Par exemple, si la concentration de la protéine de référence est relativement proche de celle de la cathepsine L, et que sa concentration ne varie pas en fonction de la protéolyse, deux marquages relativement similaires seront observés en l'absence de protéolyse, tandis qu'un marquage bien plus prononcé, correspondant à la cathepsine L, sera observé en présence de protéolyse. De telles protéines de référence sont notamment des protéines "de ménage" participant au métabolisme cellulaire basal. Des protéines de références peuvent aussi être choisies parmi les protéines de la structure contractile. Ces protéines de la structure contractile sont notamment l'actine et les myosines. Une protéine de référence pourra aussi être une protéine dont la teneur diminue lors de la protéolyse ; ainsi d'obtenir une amplitude de variation encore plus élevée. Un exemple d'une telle protéine est la GAPDH. Dans le cadre de la présente invention, toute technique classiquement utilisée pour une détermination qualitative ou quantitative d'ARNm, peut être utilisée. La teneur en ARNm de la cathepsine L pourra notamment être déterminée en hybridant l'ARNm du prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal avec une sonde marquée complémentaire de cet ARNm. De telles techniques sont, par exemple, les techniques appelées Dot-blot, Slot-blot, Northem-blot, RPA, cinétique RT-PCR, RT-PCR compétitive, mini et micro Array, Chips. Ces techniques sont connues de l'homme du métier. Ces techniques nécessitent toutes l'utilisation d'une sonde spécifique à l'ARNm de la cathepsine L. Cette sonde peut être un segment ou toute séquence complémentaire de l'ARNm de la cathepsine L. Ces sondes peuvent aussi être spécifiques de l'espèce pour laquelle la protéolyse est évaluée. Chez l'homme, la sonde préférée est la sonde de séquence n 1 correspondant à l'oligonucléotide débutant au 141ème nucléotide et se terminant au 1161 ème nucléotide de la séquence de l'ADNc du gène de la cathepsine L humaine. La figure 2 a pour objet la séquence d'ADNc du gène de la cathepsine L humaine. Sur cette séquence, sont aussi représentées la sonde de séquence n 1 et les amorces en 5' et 3' utilisées pour amplifier par PCR cette séquence n 1. Pour une analyse qualitative, la technique dite Northern est préférentiellement utilisée. Pour une analyse quantitative, on préfère utiliser la technique appelée RT-PCR compétitive. Un autre objet de la présente invention consiste à déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L, et en outre, à déterminer la teneur en ARNm d'une protéine de référence dont la teneur en ARNm est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur en ARNm diminue avec la protéolyse, puis à comparer les résultats obtenus. La comparaison des deux signaux reflétant la teneur en ARNm, permettra ainsi d'évaluer comparativement la protéolyse. Dans le cadre de la présente invention, on évalue préférentiellement la protéolyse musculaire en comparant la teneur en ARN messager de la cathepsine L à la teneur en ARNm d'une protéine de référence. La présente invention a encore comme objet un agent d'évaluation de la protéolyse musculaire essentiellement caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. Ce moyen permet la mise en oeuvre des procédés ci-dessus décrits. Ainsi, le moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L peut notamment comprendre des anticorps dirigés spécifiquement contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L. Ces anticorps peuvent être marqués dans le cas d'analyses immunologiques directes ou le moyen peut comprendre d'autres anticorps marqués anti- (Anticorps anti-cathepsine L) dans le cas d'analyses immunologiques indirectes. Le moyen permettant de déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L comprend, entre autres, une sonde complémentaire dudit ARNm. Ce moyen peut aussi comprendre un support solide, tel qu'une membrane en nylon, une plaque de verre ou de silicium, sur lequel est fixée la sonde complémentaire de l'ARNm de la cathepsine L. Pour l'évaluation de la protéolyse chez l'homme, ce moyen pourra notamment comprendre la sonde décrite à la figure 2. Ce moyen peut également comprendre des composés nécessaires au marquage des ARN à tester. Les marqueurs utilisés de façon préférentielle ne sont pas radioactifs et peuvent être lus par fluorescence. Un autre objet de la présente invention consiste en un agent d'évaluation de la protéolyse musculaire contenant un premier moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm, et en outre un deuxième moyen permettant de déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse. Ces moyens peuvent par exemple être des supports solides tels que ceux décrits précédemment, sur lesquels est fixée la séquence complémentaire de l'ARNm. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer la présente invention, sans pour autant présenter un caractère limitatif. Exemple 1 Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la quantité de protéine Cathepsine L La teneur en cathepsine L, forme zymogène ("Pro") et active ("Active") a été déterminée par une analyse en western-blot. Les muscles Gastrocnemius de rats témoins (PF) et infectés (S) par une injection d'E. Coli, ont été prélevés 2 et 6 jours après infection. 200 mg de muscle sont homogénéisés dans un tampon 20mM phosphate pH 6,25, 0,1 % triton. L'homogénat est centrifugé à 15000 g durant 15 min à 4 C. Le surnageant est dilué avec un volume identique de tampon SDS-PAGE (Laemmly). Des échantillons (20g de protéines totales) sont soumis à une électrophorèse en présence de SDS sur un gel de polyacrylamide- 12,5%. Les protéines séparées sont électrotransférées sur une membrane de polyvinylidène difluoride dans un tampon tris 48mM-Glycine 30mM pH 8,3 contenant 20% (V/V) de méthanol. Les blots sont saturés durant 1 h par un tampon phosphate contenant 0,2% (W/V) de lait écrémé et 0,1% de triton X-100. La cathepsine L est révélée par chimioluminescence en utilisant le kit Aurora (ICN). L'anticorps polyclonal primaire utilisé est un IgG de lapin spécifique de la cathepsine L (don de Mr. M. GOTTESMAN, Bethesda, USA). L'anticorps secondaire est un anti-IgG de lapin obtenu chez la chèvre et conjugué à la phosphatase alcaline. Les signaux sont révélés par le STORM 484 et analysés avec le logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). Les résultats obtenus sont les suivants : Les valeurs sont exprimées en Unités Arbitraires Molecular Dynamics. - Moyenne (écart-type)-n=3 Cath. L Forme "Pro" Cath L. Forme (UA mol Dyn) "Active" (UA mol Dyn) PF 473 700 S 1243 3170 Rapport 2,6 4,53 moyennes S / PF Ainsi, il a été constaté que la teneur en cathepsine L forme prozymogène ou active correspond à 2 à 4,5 fois la teneur en cathepsine L des muscles d'animaux témoins. Exemple 2 Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la teneur en ARNm cathepsine L Les muscles Gastrocnemius et Tibialis de rats témoins (T) et infectés (S) par une injection d'E. coli ont été prélevés 6 jours après infection. Les ARNs totaux de ces muscles Gastrocnemius et Tibialis sont extraits selon la technique de Chomczynski et Sacchi (1987. Anal Biochem. 162, 156-159 : Single step method of RNA isolation by guanidium thiocyanatephenol-chloroforme extraction). On procède ensuite à la détermination de la teneur en ARNm Cathepsine L par une analyse en Northem-Blot. Après migration en conditions dénaturantes sur gel d'agarose 1%, 10 à 30 g d'ARNs sont transférés sur membranes de nylon (Hybond N+ Amersham). Les sondes utilisées en hybridation sont marquées avec le kit "ready to go DNA labelling" (Pharmacia Biotech) selon les instructions du fabricant. Les hybridations sont réalisées à 65 C durant 16 à 20 h dans le tampon "Rapid-Hyb Buffer" (Amersham Life Science). Les membranes sont lavées successivement avec les tampons SSC 2X-SDS 0,1%, SSC 0.5X-SDS 0,1% et SSC 0,1X-SDS 0,1 % durant 20 min à 65 C. Elles sont ensuite placées sur un écran "Phosphor Screen" et les signaux sont révélés et quantifiés à l'aide du PhospoFluroImager STORM 484 (Molecular Dynamics). Les résultats obtenus sont repris dans la figure 3. Le rapport des pentes des 2 droites de cette figure représente le rapport des teneurs en ARNm Cathepsine L. On constate qu'il y a 8,7 fois (1,649/0, 189) plus de messager Cathepsine L dans le muscle de l'animal infecté(S) que dans celui de l'animal témoin (T). Exemple 3 Evaluation de l'intensité de la protéolyse musculaire en déterminant la variation relative d'un ARN messager Cathepsine L par rapport à celui d'une protéine de référence La protéine de référence utilisée est la GAPDH. Il a été constaté que la teneur en ARNm de GADPH, diminue faiblement lors de la protéolyse musculaire. Des muscles Gastrocnemius (Ga. ) et Tibialis (Ti. ) de rats témoins (T) et de rats infectés (S) par une injection d'E. Coli sont prélevés 2 (J2) et 6 jours (J6) après l'infection. On dispose 50 ng d'ADN de chacune des cibles, à savoir la Cathepsine L et la GAPDH, en dot sur une membrane de nylon Hybond N+ (Amersham). On dénature 5 à 25 g d'ARNs totaux extraits des muscles d'animaux témoins et infectés, par un traitement à 70 C pendant 10 min dans un volume de 14 l en présence de 2 l d'oligonucléotide dT25. La synthèse des premiers brins complémentaires des ARN messagers est effectuée à l'aide du kit Super-Script II (BRL) dans le mélange réactionnel suivant: - RNAsin 40 u lui - Tampon 5X 6 l - DTT 0,1 M 2 l - dATp, dGTP, dTTP 20 mM 1 l - dCTP 120 M lui - dCTP 32P 50uCi 5 l - Enzyme SuperScript lui Après 1 heure à 42 C, lui de superScript est rajouté au mélange et la réaction est poursuivie durant lh à la même température. En fin de réaction, les ARNs sont dégradés par un traitement à la soude et les ADNc synthétisés sont purifiés sur colonne de sephadex G50. Les membranes sont ensuite préhybridées durant 24h à 68 C puis hybridées à la même température pendant 60 h. Après lavages et exposition des membranes sur PhoporScreen, les signaux sont révélés (STORM Molecular Dynamics) et quantifiés à l'aide du logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). Le rapport des ARNm de cathepsine L et de GADPH est ensuite calculé. Les résultats suivants ont été obtenus: J2 J6 Ti. T Ti. Ga. T Ga. S Ti T Ti S Ga. T Ga. S Rapport ARNm Cathepsine L 0,01 0,12 0,02 0,18 0,05 1,74 0,07 0,45 ARNm Cathepsine L ARNm GADPH Les amplitudes de variation observées sont très importantes. Ainsi, le rapport ARNm Cathepsine L/ GADPH permet d'évaluer de manière certaine la protéolyse musculaire. REVENDICATIONS 1. Procédé d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé par le fait qu'il consiste à déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en cathepsine L est déterminée en utilisant un anticorps dirigé contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la teneur en ARNm de la cathepsine L est déterminée en hybridant ledit ARNm avec une sonde marquée complémentaire dudit ARNm. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la sonde complémentaire dudit ARNm correspond à la sonde de séquence n l. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il consiste en outre à déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur respective est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse, puis à comparer les teneurs ainsi déterminées. 6. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L et/ou de son ARNm d'un prélèvement musculaire ou sanguin du corps humain ou animal. 7. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen permettant de déterminer la teneur en cathepsine L comprend des anticorps dirigés contre la totalité ou une partie de la structure de la cathepsine L. 8. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon la revendication 6, caractérisé en ce que le moyen permettant de déterminer la teneur en ARNm de la cathepsine L comprend une sonde marquée complémentaire dudit ARNm. 9. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire, caractérisé en ce que la sonde complémentaire dudit ARNm correspond à la sonde de séquence n 1. 10. Agent d'évaluation de la protéolyse musculaire selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'il contient en outre un deuxième moyen permettant de déterminer la teneur d'une protéine de référence et/ou de son ARNm présente dans le prélèvement et dont la teneur respective est indépendante de la protéolyse ou dont la teneur diminue avec la protéolyse.