Brevet FR2795732A1 — publié le 20010105

La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic des angiomes caverneux ou cavernomes pour la détection de mutations dans le gène Krill. En particulier, cette détection est mise en #uvre au moyen de séquences nucléotidiques également objet de la présente invention. L'invention concerne également l'utilisation de tout ou partie du gène Kritl à des fins thérapeutiques dans le domaine de la pro ou anti-angiogenèse. Les cavernomes sont des malformations vasculaires le plus souvent localisées dans le système nerveux central mais également dans la rétine, le foie, les reins, etc.. et sont caractérisés par des cavités capillaires anormalement élargies sans intervention du parenchyme cérébral (Russell et al.). Les symptômes cliniques comprennent des céphalées, des hémorragies, des crises d'épilepsie et des déficits neurologiques focaux. La prévalence des angiomes caverneux est proche de 0,5 % dans la population générale (Otten et al.). Ces angiomes peuvent être transmis de façon héréditaire sous une forme autosomique dominante dans près de 50 % des cas (Rigamonti et al). 3 localisations (ou loci) de malformations caverneuses cérébrales (CCM) ont été identifiées sur le bras long du chromosome 7, le bras court du chromosome 7 et le bras long du chromosome 3 (7q, 7p et 3q respectivement). Un important effet fondateur a été observé dans la population hispano-américaine, dans laquelle toutes les familles étaient liées au locus CCM1 localisé sur 7q (Rigamonti et al. ; Dubovsky et al. ; Günel et al. ; et Craig et al.). Les inventeurs ont récemment établi les caractéristiques génétiques et cliniques des cavernomes, ainsi que les caractéristiques héréditaires dans une série de 57 familles françaises (La bauge et Des investigations de neuroimagerie ont confirmé la grande fréquence de lésions multiples dans les cavernomes héréditaires. Une corrélation hautement significative a également été mise en évidence entre le nombre de lésions et l'âge du patient, ce qui suggère fortement la nature dynamique de ces malformations vasculaires appelées également hamartomes. L'analyse de liaison génétique conduite dans 36 de ces familles a montré que 65 % d'entre elles étaient liées au locus CCMI avec aucun effet fondateur (Laberge et al.). La taille de l'intervalle génétique contenant le locus CCM avait été réduite en 1995 à 4 centimorgans, le locus CCMI étant encadré par D7S2410 et D7S689 (Johnson et al.). Au moyen essentiellement d'une approche in silico, les inventeurs ont établi une carte physique et transcriptionnelle de l'intervalle de CCM1. Parmi les 53 unités transcriptionnelles cartographiées à l'intérieur de la région critique, l'une d'elles correspondait à Krit1, un gène dont le produit interagit avec Rap 1 A (également appelé Krevl), un membre de la famille des gènes Ras impliqués dans la prolifération cellulaire, la différentiation et la morphogenèse (Bos et al.). En utilisant en combinaison la technique SSCP et le séquençage, les inventeurs ont identifié dans 8 familles CCM non apparentées des mutations conduisant très probablement à une protéine Kritltronquée. La coségrégation de ces mutations avec le phénotype affecté suggère fortement que Kritl est la protéine mutée dans les familles atteintes de cavernomes liés au locus CCMI et suggère l'implication de la voie de transduction du signal de Rap 1 A dans la vasculogénèse et/ou l'angiogénèse. En utilisant un contig de YAC préalablement publié, et les bases de données de séquences publiques (The Washington Univcrsity Chromosome 7 Project), les inventeurs ont construit des contigs de BAC/PAC couvrant 90 % de l'intervalle CCMI, estimé à 1 600 Kb (Figure 1). 20 familles comprenant 179 méioses potentiellement informatives et dont il avait été précédemment montré qu'elles avaient une probabilité a posteriori d'être liées au locus CCM1 supérieure à 90 % ont été utilisées pour cartographier finement ce locus avec des marqueurs polymorphes identifiés au moyen des séquences BAC/PAC (Figure 1). Un événement de recombinaison observé chez un individu affecté (famille 27 dans Labauge et al.) a permis aux inventeurs de réduire légèrement cet intervalle qui est maintenant encadré par M2456 (limite centromérique) et D7S689 (limite télomérique). Le criblage de banques de données publiques telles que Gene Map du Human Genome, Unigene et dBEST a permis aux inventeurs de cartographier à l'intérieur de cet intervalle 574 Expressed Sequence 7àT.s (EST) qui ont ensuite été regroupées en 53 unités transcriptionnelles putatives comprenant 6 gènes déjà connus: CDK6, HUM1,D14, KRIT1, PEX-1, mMTERF et Yotiao. Krill avait été identifié lors d'un criblage destiné à identifier les protéines interagissant avec Rap 1 A/Krev I , un membre de la famille des gènes Ras (Serebriiski et al.). Il code pour une protéine de 529 acides aminés qui comprend 4 domaines ankyrines et interagit avec Rap1A/Krev1 au moyen de sa région carboxyterminale. Il a déjà été indiqué que l'ARN messager de Krill était exprimé à des niveaux faibles dans de nombreux tissus y compris le cerveau. Bien que la fonction exacte de Krill soit encore inconnue, les inventeurs ont considéré qu'il était un bon gène candidat pour CCM1, et ceci pour plusieurs raisons. Rap1A / KrevIA a été identifié sur la base de son homologie avec Dras3, un homologue de Ras chez la drosophile, ainsi que sur la base de son activité anti-mitogène dans des fibroblastes transformes par K-ras (Pizon et al., 1988 / Kitayama et al., 1989). Bien que la pertinence physiologique de cet effet anti-mitogène observé in vitro n'ait pas encore été établie in vivo, ceci a conduit à considérer que cette protéine était un antagoniste de Ras. Un rôle de la voie de signalisation de Ras dans la vasculogenèse et l'angiogenèse a été fortement suggéré par les anomalies vasculaires observées dans les modèles murins invalidés pour les protéines impliquées dans cette voie, par exemple les protéines raf ou GAP120 (Henkemeyer et al., 1995 ; Wojnowski et al., 1997). En plus de ce rôle putatif en tant qu'antagoniste de Ras, Rapl A / Krevl a été impliqué dans la différentiation cellulaire et la morphogenèse (Asha et al., 1999 ; Quarck et al., 1996 ; Pizon et al., 1988). En d'autres termes, dans la mesure où la protéine Kritltronquée donne lieu à une anomalie de l'angiogenèse s'accompagnant d'une prolifération des cellules endothéliales, il est raisonnable d'en déduire que le gène Krill pourrait avoir un rôle de contrôle de l'angiogenèse. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont montré que des mutations dans le gène Krit1 susceptibles de donner lieu à une protéine Kritl tronquée sont responsables de l'apparition d'anomalies vasculaires Ces anomalies vasculaires peuvent affecter différents territoires incluant le cerveau et la peau et prendre différentes formes (cavernomes, angiomes capillaro-veineux). Le type des lésions observées (développement de maladies vasculaires anormales combiné à la nature des mutations observées (mutations entraînant une troncation de la protéine) suggèrent fortement que cette protéine exerce un contrôle de l'angiogenèse qui pourrait être susceptible d'applications thérapeutiques dans le domaine de l'antiangiogcncsc, en particulier dans le domaine tumoral. L'alignement de l'ADNc de Krill avec le BAC AC000020, l'un des BAC localisé dans l'intervalle, a permis aux inventeurs de déterminer la structure génomique de Kritl. Ce gène est codé par 12 exons qui sont tous compris dans le BAC AC000020. Les inventeurs ont dessiné les amorces oligonucléotidiques introniques destinées à amplifier les exons (Tableau n 1) ainsi que les séquences de jonction (Tableau n 2). Ces amorces ont été particulièrement délicates à mettre au point en raison de la richesse en bases A et T de Krit1 et sont très spécifiques de Krill. Ainsi, la présente invention a pour objet une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 17, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 20, SEQ ID N 21, SEQ ID N 22, SEQ ID N 23, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 28. Au moyen de ces amorces, les inventeurs ont pu amplifier tous les exons. Un ensemble de 20 patients CCM non apparentés appartenant à des familles dans lesquelles l'analyse HOMOG a montré une probabilité a posteriori d'être liée au locus CCM1 supérieure à 90 % a permis de procéder à des criblages de mutations par une analyse combinant une approche de type Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), dans 4 conditions distinctes, et une approche de séquençage. Les produits amplifiés de 8 de ces patients ont montré des variants de conformation anormaux qui n'ont été observés dans aucun des 50 sujets contrôles. L'analyse de la séquence de ces amplimères a révélé des mutations hétérozygotes dans ces 8 patients (Tableau 3 et Figure 3) Ces mutations coségrégeaient avec le phénotype malade dans les 8 ramilles de ces patients. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus pour la détection, à partir d'un prélèvement biologique, de la présence d'une mutation dans le gène Krit1; de préférence une mutation liée à la survenue d'anomalies vasculaires telles que définies précédemment. De manière préférentielle, le prélèvement biologique est du sang. Plus particulièrement, le pedigree 6 présente une délétion d'un A au nucléotide 1342, dans l'exon 10. Cette délétion conduit à un changement du cadre de lecture et ainsi à un codon stop prématuré. Dans le pedigree 10, une substitution de C par T au nucléotide 1283 dans l'exon 10 conduit au remplacement d'une glutamine par un codon stop. Le pedigree 58 montre quant à lui l'insertion d'un C après le nucléotide 1271, également dans l'exon 10, ce qui entraîne un changement du cadre de lecture et un codon stop prématuré. Le pedigree 41 montre une substitution de G par A au nucléotide 615 ce qui conduit au remplacement d'un tryptophane par un codon stop prématuré dans l'exon 5. Le pedigree 42 présente une délétion de 4 pb (nucléotides 681-684) dans l'exon 6 donnant lieu à un codon stop prématuré. Le pedigree 35 présente une délétion de 26 pb (nucléotides 1012-1037) à l'intérieur de l'exon 8 ; cette délétion causant un changement du cadre de lecture et un codon stop prématuré au codon 332. Le pedigree 18 présente une insertion d'un C à l'intérieur de l'exon 2 après le nucléotide 247 ; cette insertion conduit à un changement du cadre de lecture et à un codon stop prématuré. Le pedigree 19 montre une substitution d'un G par un A au nucléotide 261 ; celle-ci entraîne un changement de cadre de lecture ainsi qu'un codon stop prématuré au codon 79. Les analyses SSCP des membres affectés et non affectes ont montré la coségrégation parfaite des mutations avec le phénotype affecté dans chacun de ces 8 pedigrees (Figure 3). Ainsi, les séquences nucléotidiques conformes à la présente invention sont utilisées pour procéder à la détection d'une mutation dans au moins un exon du gène Krill. Plus particulièrement, ces séquences nucléotidiques peuvent être utilisées par couple compte tenu de leur spécificité d'un exon selon la répartition suivante : - SEQ ID N 1/ SEQ ID N 2 pour l'exon 1, - SEQ ID N 3/ SEQ ID N 4 pour l'exon 2, - SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 pour l'exon 3, - SEQ ID N 7/ SEQ ID N 8 pour l'exon 4, - SEQ ID N 9 / SEQ ID N 10 pour l'exon 5, - SEQ ID N 11/ SEQ ID N 12 pour l'exon 6, - SEQ ID N 13 / SEQ ID N 14 pour l'exon 7, - SEQ ID N 15 / SEQ ID N 16 pour l'exon 8, - SEQ ID N 17 / SEQ ID N 18pour l'exon 9, - SEQ ID N 19 /SEQ ID N 20 pour l'exon 10, - SEQ ID N 21 / SEQ ID N 22 pour l'exon 10, - SEQ ID N 23 / SEQ ID N 24 pour l'exon 11, - SEQ ID N 25 / SEQ ID N 26 pour l'exon 12, - SEQ ID N 27 / SEQ ID N 28 pour l'exon 12. Avantageusement, la détection d'une mutation dans Krit1 est précédée de l'amplification de l'exon dans lequel la mutation est recherchée et cette amplification peut être réalisée par PCR ou PCR-like. La nature tronquante de ces mutations, leur absence chez les contrôles sains et leur conségrégation avec le phénotype affecté suggère fortement qu'il s'agit de mutations délétères dans ces familles. Les inventeurs n'ont pas détecté de variants de conformation anormaux de SSCP dans 12 des 20 familles testées. Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour expliquer ceci. La sensibilité de SSCP n'est pas de 100 % même lorsqu'on utilise plusieurs types de conditions comme cela a été le cas ici. De façon intéressante, aucun de ces variants de conformation anormaux n'a été observé dans le premier criblage qui a été réalisé à 20 C sans glycérol. De plus, les délétions qui emporteraient les régions contenant les séquences hybridant avec les amorces n'auraient pu être détectées par cette approche. Enfin, certaines de ces familles, bien que montrant une forte probabilité d'être liées au locus CCM1, pourraient en fait être liées à l'un des autres loci CCM. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic génotypique d'anomalies vasculaires chez un individu comprenant le prélèvement d'un échantillon biologique dudit individu ainsi que la détection de la présence d'une mutation dans le gène Krill par analyse de la séquence d'acides nucléiques présents dans ledit échantillon, une telle mutation étant liée à la survenue d'anomalies vasculaires. La séquence d'acides nucléiques analysée peut être indifféremment de l'ADN génomique, de l'ADNc ou de l'ARNm. L'analyse peut être réalisée par hybridation, par séquençage ou par migration électrophorétique, en particulier par SSCP ou DGGE (Electrophorèse en gel en gradient dénaturant). La détection de ces mutations pourrait également être réalisée à l'aide d'une méthodologie permettant de détecter directement la présence de la protéine tronquée, par exemple les méthodes dites de Protein Truncation Test (traduction in vitro de transcrits reverse d'ADNc suivie d'une révélation de la protéine par anticorps ou après marquage de la protéine à l'aide d'un acide aminé marqué). Enfin, la recherche de mutations peut être faite par analyse directe du transcrit reverse d'ADNc préparé à partir des ARN totaux (en particulier provenant de cellules transformées par le virus EBV, cellules dans lesquelles les auteurs ont montré l'expression du transcrit de Krit 1). Avantageusement, tout ou partie de la séquence d'acides nucléiques correspondant au gène Krill est amplifiée préalablement à la détection de la présence d'une mutation, cette amplification pouvant être réalisée par PCR ou PCR-like. De façon tout à fait préférentielle, cette amplification peut être réalisée au moyen d'amorces choisies parmi les séquences d'acides nucléiques conformes à la présente inventior, par exemple utilisées selon la répartition cidessus mentionnée. La question principale est donc de comprendre comment ces mutations ont pu conduire aux cavernomes. Peu de choses sont connues en réalité sur la nature de ces lésions qui sont considérées comme des malformations vasculaires ou hamartomes. Il semblerait que la période d'apparition de ces malformations pendant la vie embryonnaire n'est pas tout à fait claire. De plus, dans certains cas, particulièrement dans les cas familiaux, l'extension évolutive de ces hamartomes a été décrite : il a été suggéré que ces lésions peuvent exprimer des facteurs et/ou des récepteurs impliqués dans l'angiogenèse (Rothbart et al , 1996 ;Notelet et al., 1997). Il convient d'indiquer que les inventeurs ont observé dans quatre familles (Labauge et al., 1999) que des malformations cutanées (également appelées angiomes) pouvaient ségréger avec les cavernomes cérébraux. Toutes les mutations rapportées ici conduiraient, si elles étaient traduites, à des protéines Kritltronquées qui seraient délétées de la région intcragissant avec Rap 1 A / Krev I , Les fonctions exactes de Rap 1 A / Krev1 ne sont pas tout à fait élucidées. Ce membre de la famille des Ras GTPase est exprimé de façon ubiquitaire particulièrement dans les neutrophiles, les plaquettes et le cerveau ; il est localisé dans les compartiments endocytiques/ lysosomiaux. Rap 1 A a été décrit comme interagissant avec B-Raf, ce qui est tout à fait intéressant au vu de l'apoptose massive endothéliale observée chez les souris déficientes pour B-Raf (Wojnowski et al., 1997). In vivo, des études sur les eucaryotes inférieurs tels que les levures et la drosophile ont récemment donné quelques indications sur les fonctions de Rap 1 A dans la différentiation et la morphogenèse (Asha et al.). L'interaction de Kritlet de Rap1A suggère que Krit1pourrait soit réguler Rap 1 A soit être un effecteur de Rap 1 A (Bos et al.). Les mutations rapportées ici pourraient résulter soit d'un effet dominant négatif soit d'une perte de fonction. L'observation des familles présentant des délétions complètes de Kritl serait un argument fort en faveur de cette hypothèse. Par ailleurs le fait que les formes sporadiques de cavernomes se manifestent par une lésion unique et que les formes familiales se manifestent pas des lésions multiples suggère fortement que ces lésions suivent la règle du double hit de Knudson (Knudson 1971) et qu'une perte complète de fonction de Kritl pourrait être nécessaire à l'apparition des cavernomes. En d'autres termes, dans les formes dominantes de la maladie, une première mutation, présente dans toutes les cellules de l'organisme à l'état hétérozygote, serait présente. L'apparition des lésions cavernomateuses serait conditionnée par la survenue d'une deuxième mutation touchant l'autre allèle de ce gène, mutation qui surviendrait de façon somatique. Dans les formes sporadiques, l'individu ne présente aucune mutation gcrminalc et la lésion unique résulterait de deux mutations survenues dans la même cellule. En résumé, les données reportée ici, suggèrent fortement que les mutations tronquantes de Krit sont responsables de l'apparition des cavernomes cérébraux observés dans les familles CCM1, mettant en exergue le rôle putatif de la voie de signalisation de Rap1 A dans ces mécanismes. Parmi les applications thérapeutiques concernées par la présente invention, pourraient être concernées différents types de malformations vasculaires, dysplasies vasculaires, angiomes et/ou toute situation où existe une angiogenèse anormale. Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation du gène Krit1 ou d'une séquence dérivée de ce gène pour la préparation d'un médicament ou son utilisation dans une approche de type thérapie génique destiné à contrôler ou inhiber l'angiogenèse. Par séquence dérivée de ce gène , on entend toute séquence ou partie de séquence normale ou mutée du gène Kritl. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression dans une cellule hôte appropriée comportant la séquence du gène krill ou une séquence dérivée de ce gène (la séquence dérivée est définie ci-dessus). Dans le cas où l'on souhaiterait réprimer une angiogenèse anormale, il pourrait être intéressant de surexprimer la séquence en question et c'est la raison pour laquelle le vecteur conforme à l'invention comprend, avantageusement, les éléments nécessaires à cette surexpression. En particulier, le vecteur conforme à l'invention peut être destiné à la thérapie génique et dans le cas où l'on souhaiterait limiter son site d'action, ce vecteur peut comporter une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique des séquences qu'il comprend. Enfin, la présente invention a pour objet une composition thérapeutique comportant à titre de principe actif tout ou partie de la protéine Krit1 normale ou modifiée, de façon a se substituer par exemple à une protéine tronquée et pallier la déficience. Le principe actif peut également être un vecteur tel que décrit précédemment. La Figure 1 représente la carte génétique, physique et transcriptionnelle du locus CCM1. La Figure lareprésente la carte génétique du locus CCM1. Ce locus était précédemment défini par l'intervalle D7S2410-D7S689. Les intervalles génétiques réduits MS2456-D7S689 sont indiqués par des crochets horizontaux. Les microsatellites déjà publiés sont encadrés. Les nouveaux microsatellites sont identifiés par des caractères gras. Certains des STS sont également montrés. Le STS sWSS 1703 correspond aux nucléotides 393-658 de Krill. Les marqueurs entre les crochets verticaux sont espacés de moins de 1 kb. La Figure lb représente la carte physique et transcriptionnelle du locus CCM1. Des contigs de BAC sont répartis sur l'intervalle CCM1. Le BAC AC000120 est représenté par le trait le plus épais. Les chevauchements avec soit les STS, soit les marqueurs microsatellites sont indiqués par des petites barres verticales. La flèche noire correspond à Kritl, les flèches blanches correspondent à des gènes humains bien caractérisés et les flèches vides correspondent à des gènes présentant de fortes homologies avec des gènes d'autres espèces (non caractérisés chez les humains). La Figure 2 représente la coségrégation des variants de conformation avec le phénotype malade au sein de 8 pedigrees (SSCP). Les symboles vides désignent les sujets dont l'examen du cerveau par IRM est normal, les symboles noirs à moitié pleins correspondent à des patients asymptomatiques présentant des cavernomes sur l'examen par IRM, les symboles noirs pleins correspondentà des patients symptomatiques et présentant des cavernomes sur l' IRM ; le signe ? correspond aux sujets ayant un statut inconnu et le signe \ correspond à des patients décédés. Les patients décédés ou avec un statut inconnu n'ont pas été testés pour la mutation mais sont représentés pour une meilleure compréhension des structures familiales. Les bandes anormales sont indiquées par une flèche. La Figure 3 illustre les mutations de Krill. La Figure 3a représente la structure du gène Kritl et de la protéine putative correspondante. ns signifie non-sens, del signifie délétion et ins signifie insertion. Pour les insertions, le numéro de nucléotide correspond au nucléotide précédant l'insertion. L'expression Krev Interacting Région correspond à la région (acides aminés 483-529) dont la délétion abolit l'interaction avec Krev lors du test en double hybride dans la levure. La Figure 3b représente les mutations de Krill, identifiées dans les 8 pedigrees mentionnés plus haut. Les flèches indiquent les sites de mutation WT signifie séquence de type sauvage et MT signifie séquence mutante. Dans le pedigree 42, le chromatogramme et la séquence présentés correspondent au brin négatif ; le brin positif a montré une superposition complète des séquences normales et anormales et ne permettaient pas d'avoir une bonne visualisation du site du début de la délétion. EXEMPLES MATERIELS ET METHODES Patients 20 patients non apparentés appartenant à des familles dont on savait qu'elles présentaient de façon héréditaire des cavernomes ont fait partie de l'étude avec leur libre consentement (Labauge et al.). L'analyse de ce panel de familles avec le test HOMOG a montré que ces familles avaient une probabilité a posteriori d'être liées au locus CCM1 supérieure à 90 % (Laberge et al.), Une approche combinant biologie moléculaire et bio informatique a été utilisée pour établir la carte physique et transcriptionnelle du locus CCM1. Après validation d'un contig de YACs préalablement publiée par Johnson et al. (1995), les auteurs ont positionné dans l'intervalle par PCR et par une approche in silico 574 EST (Expressed Séquence Tags) qu'ils ont regroupés en 53 groupes. Réduction de l'intervalle Génétique 12 marqueurs microsatellites polymorphes recouvrant l'intervalle D7S2410-D7S689 ont été sélectionnés pour les analyses de liaison 7 d'entre eux étaient préalablement connus: D7S2410, D7S2409, D7S 1813, D7S 1789, D7S646, D7S689 et D7S558, et ont été utilisés par plusieurs équipes (Günel et al, dans Neurosurgery, Craig et al., Labauge et al., Laberge et al.). Les derniers MS65, MS2453A, MS2456A, MS119 et MS120 ont été identifiés par les inventeurs sur la base des données de séquence des BAC cartographiés dans l'intervalle. Détection des mutations et identification Sur la base de la comparaison des séquences de l'ADNc de Kritet du BAC AC 00000120, les inventeurs ont détermine 14 jeux d'amorces pour amplifier les 12 exons et les sites de jonction exon / intron de Krit1 à partir de l'ADN génomique. Des réactions de PCR ont été mises en #uvre comme suit : après une première étape initiale de dénaturation à 94 C (4 min), 30 cycles d'amplification consistant en des étapes à 94 C (15s), une température d'hybridation optimisée comprise entre 45 C et 55 C (15s) et 72 C (15s) suivie par une étape d'extension finale à 72 C (10 min). Les produits de PCR ont été soumis à une électrophorèse dans 4 types de conditions (acrylamide à 10 % avec ou sans glycérol à 4 C et 20 C) sur un appareil Mighty Small II (PharmaciaBiogen) utilisé en condition de courant constant de 35 mA. Des variants de conformation ont été révélés à l'argent (Silver Stain Plus kit, Biorad). Des amplimères montrant un pattern de bandes SSCP atypiques ont été séquences (AB 1377, Perkin Elmer). Toutes les mutations décelées lors du séquençage ont été testées pour leur coségrégation avec le phénotype malade par une approche SSCP. TABLEAU 1 : AMORCES EXON AMORCE SENS AMORCE REVERSE TAILLE DE L'AMPLIMERE 1 GAGCGGATAAAAACTAAT GAGCTAAAATTCATTCAA 205 (SEQ ID No 1) (SEQ ID N 2) bzz- - 2 GCTCTTAATGGGTTTTTG AGCAATGTGGAGTAAAAC 183 (AEQ ID N 3) (SEQ ID N 4) 3 TTTGGAATGAGAACAGTC GTCCTGTTGTATTTTTCA 265 (AEQ ID N 5) (SEQ ID N 6) 4 GTTGTTGTTTTTTGTTTG ACCTGGAAAATAACTTAC 208 (SEQ ID N 7) SE ID N 8)~~~~~~~~~ 5 ATGTAATGCCTTTTTTCC ATGCCTGGCTCTAACTAT 181 (SEQ ID N 9) (SEQ ID N 10) 6 TTGTTAGATTGTGATGTA AACATAATAAAAACTTTC 257 SE ID N 11 (SEQ ID N 12) 7 TTTATAAAAGGAATGATG TCAACTCAAACCATATCA 335 (SEQ ID N 13) SE ID N 14) 8 TGTAGCCTAATAACCAAA AGCATAGCACAAGACCAT 243 (SEQ ID N 15) SEQ ID N 16) 9 GGTGAAGTTTTTAATATG CAATAGTTTATGAAGTCC 213 SE ID N 17 SEQID N 18) - 10 ATATTTACAAAGGCAAGC TGACATGATTGGTAAAAA 180 (SEQ ID N 19) (SEQ ID N 20) TGGTACATTTTCCTTTCA CTTTATGATTGCTGGGGC 201 (SEQ ID N 21) SE ID N 22 11 GGTGAAGTTTTTAATATG CAATAGTTTATGAAGTCC 205 (SEQ ID N 23) (SEQ ID N 24) 12 AATAGATAGGGAACTGCC GTGGCTTGAGTAACAGTT 234 (SEQ ID N 25) (SEQ ID N 26) TAATGCCCACTGAAAGAA GGCTGGTCTTGAACTCTG 199 (SEQ ID N 27) SE ID N 28) TABLEAU 2 : SEQUENCES DES JONCTIONS INTRON-EXON EXON POSITION SUR TAILLE SEQUENCE POSITION SUR BAC L'ADNE AC000120 1 8-133 126 atcaggtcag ACAGAAAACT.. TACAAATCGG gtaagagttg 127165-127040 (SEQ ID N 29) (SEQ ID N 30) 2 134-249 116 ccctttctag GTAGATAAAG...CAGAAGACAA gtactgtttc 126561-126445 (SEQ ID N 31) (SEQ ID N c 32) 126561-126445 3 250-393 144 taatgattag GGAACGACAG...ATGCATGCTG gtaaatggaa 126228-126086 (SEQ ID N 33) (SEQ ID N 34) 4 394-550 157 ttttatacag GTATGGAAAA...AACGGATAGA gtaagttatt 118319-118163 (SE ID N 3) (SEQ ID N 36 5 551-657 107 acatttctag CATATAACAG...TAACAAACCA gtaagaatta 117464-117357 (SE ID N 37) (SE ID N 38) 6 658-815 157 tttcttgtag TATGAAAAAG...GAAAACCTCA gtaagaaagt 114615-114459 (SEQ ID N 39) (SEQ ID N 40) 7 816-967 152 tgtttttcag GCCTTCAACT...TGAAA.AACAG gtttgcttgg 113690-113539 (SEQ ID N 41) (SEQ ID N 42) 8 968-1134 168 ttcctttaag ATTGAAGACC.. GTTTCCTAAA gtaagtattt 106414-106248 (SEQ ID N 43) (SEQ ID N 44) 9 1135-1222 88 gtgcttacag TGAAGAAAAT...TGAATACAAG gtaagctgtt 105616-105529 (SEQ ID N 45) (SEQ ID N 46) 10 1223-1429 207 ttgtttttag AATCTCAGTA...GGAAACTAAG gtagattttc 105038-104832 (SEQ IDN 47) (SEQ ID N 48) 11 1430-1546 117 tatgttgcag GCTTTACTCA. TACAAAACAG gtaagtatca 93060-92942 (SEQ ID N 49) (SEQ ID N 50) 12 1547-2004' 458* tactttgtag GCTCTGGTCG. 92441-91984' (SEQ ID N 51) * Exon 12 non entièrement déterminé car contient des séquences Alu TABLEAU 3 : MUTATIONS DANS KRITI PEDIGREE MUTATIONS DANS MUTATIONS DES ACIDES AMINES L'ADN GENOMIQUE 6 Délétion (A) Changements en acides Normal (WT) IF (438) TKASPSNHKVIPVIVG nt 1342 aminés après AA 438 Mutant (MT): IF (438) TIRTAPAIIKSSLM*stop Exon 10 codon 10 Faux-sens (C # T) Changements en acides WT . FL (420) QN . nt 1283 aminés après AA 420 MT . FL (420) * stop codon Exon 10 18 Insertion (C) Changements en acides WT : ED (74) KERQWDD... après nt 247 aminés après AA 74 MT : ED (74) QGTTVGR*stop codon Exon 19 Faux-sens (G # A) Changements en acides WT RQ (79) WVDD nt 261 aminés après AA 79 MT RQ (79) * stop codon Exon 3 35 Délétion (26 pb) Changements en acides WT EA (328) RYNLLKGFYTAPDAKL nt 1012 aminés après AA 328 MT : EA (328) SSS* stop codon Exon 8 41 Faux-sens (G# A) Changements en acides WT. NN (197) WEEAA . nt 615 aminés après AA 197 MT - NN (197) * stop codon z~~ Exon 5 42 Délétion (GAAT) Changements en acides WT : IY (217) RMDGSYRSVELK... nt 681-684 aminés après AA 217 MT ' IY (217) RMGHIVLLN*stop codon Exon 6 58 Insertion (C) Changements en acides WT: LQ (415) RMFLQNCQIFTKASPSNHKV après nt 1271 aminés après AA 415 MT : LQ(415)HVLTQLTDIKGYKPQQS*stop codon Exon 10 LISTAGE DE SEQUENCE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE - INSERM D18210 Utilisation du gène Kritl dans le domaine de l'angiogenèse 51 PatentIn Vers. 2.0 1 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 1 gagcggataa aaactaat 18 2 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 2 gagctaaaat tcattcaa 18 3 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 3 gctcttaatg ggtttttg 18 4 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 4 agcaatgtgg agtaaaac 18 5 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 5 tttggaatga gaacagtc 18 6 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 6 gtcctgttgt atttttca 18 7 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 7 gttgttgttt tttgtttg 18 8 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 8 acctggaaaa taacttac 18 9 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 9 atgtaatgcc ttttttcc 18 10 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 10 atgcctggct ctaactat 18 11 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 11 ttgttagatt gtgatgta 18 12 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 12 aacataataa aaactttc 18 13 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 13 tttataaaag gaatgatg 18 14 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 14 tcaactcaaa ccatatca 18 15 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 15 tgtagcctaa taaccaaa 18 16 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 16 agcatagcac aagaccat 18 17 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 17 ggtgaagttt ttaatatg 18 18 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 18 caatagttta tgaagtcc 18 19 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 19 atatttacaa aggcaagc 18 20 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 20 tgacatgatt ggtaaaaa 18 21 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 21 tggtacattt tcctttca 18 22 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 22 ctttatgatt gctggggc 18 23 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 23 ggtgaagttt ttaatatg 18 24 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 24 caatagttta tgaagtcc 18 25 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 25 aatagatagg gaactgcc 18 26 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 26 gtggcttgag taacagtt 18 27 18 ADN Artificial Sequence Amorce sens 27 taatgcccac tgaaagaa 18 28 18 ADN Artificial Sequence Amorce reverse 28 ggctggtctt gaactctg 18 29 20 ADN Homo sapiens 29 atcaggtcag acagaaaact 20 30 20 ADN Homo sapiens 30 tacaaatcgg gtaagagttg 20 31 20 ADN Homo sapiens 31 ccctttctag gtagataaag 20 32 20 ADN Homo sapiens 32 cagaagacaa gtactgtttc 20 33 20 ADN Homo sapiens 33 taatgattag ggaacgacag 20 34 20 ADN Homo sapiens 34 atgcatgctg gtaaatggaa 20 35 20 ADN Homo sapiens 35 ttttatacag gtatggaaaa 20 36 20 ADN Homo sapiens 36 aacggataga gtaagttatt 20 37 20 ADN Homo sapiens 37 acatttctag catataacag 20 38 20 ADN Homo sapiens 38 taacaaacca gtaagaatta 20 39 20 ADN Homo sapiens 39 tttcttgtag tatgaaaaag 20 40 20 ADN Homo sapiens 40 gaaaacctca gtaagaaagt 20 41 20 ADN Homo sapiens 41 tgtttttcag gccttcaact 20 42 20 ADN Homo sapiens 42 tgaaaaacag gtttgcttgg 20 43 20 ADN Homo sapiens 43 ttcctttaag attgaagacc 20 44 20 ADN Homo sapiens 44 gtttcctaaa gtaagtattt 20 45 20 ADN Homo sapiens 45 gtgcttacag tgaagaaaat 20 46 20 ADN Homo sapiens 46 tgaatacaag gtaagctgtt 20 47 20 ADN Homo sapiens 47 ttgtttttag aatctcagta 20 48 20 ADN Homo sapiens 48 ggaaactaag gtagattttc 20 49 20 ADN Homo sapiens 49 tatgttgcag gctttactca 20 50 20 ADN Homo sapiens 50 tacaaaacag gtaagtatca 20 51 20 ADN Homo sapiens 51 tactttgtag gctctggtcg 20 REFERENCES I, Allschul, S. F., Maddcn T.L., Schaffer A. A. et al. Gappcd BLAST and PSI- I3LAST : a new génération of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402. (1997) 2. Asha H., de Ruiter N.D., Wang M. G. and Hariharan 1.K. The Rapl GTPase functions as a regulator of morphogenesis in vivo. EMBO, 18 : 605-615 (1999) 3. Bos J.L. All in the familly ? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras, Rap1 and Ral. EMBO, 17 : 6776-6782 (1998) 4. Craig H.D., Günel M., Cepada 0. et al. Multilocus linkage identifies two new loci for a Mendelian form of stroke, cerebral cavernous malformation, at 7pl(-13 and 3q25.2-27. HumMol Gc c7: 1851-1858.(1998) 5. Dubovsky J., Zabramsky J.M., Kurth J. et al. A gene responsible for cavenous malformations of the brain maps to chromosome 7q. Hum Mol Genêt 4: 453-458. (1995) 6. Ducros A., Denier C., Joutel A. et al. Recurrence of the T666M Calcium Channel CACNAIA Gene Mutation in Familial Hemiplegic Migraine with Progressive Cerebellar Ataxia. Am J Hum Genêt, 64 : 89-98. (1999) 7. Eenson DA, Boguski MS, Lipman DJ et al. GenBank. Nucleic Acids Res 27:12-7(1999) 8. Günel M., Awad I.A., Finberg K. S. et al. A Founder Mutation as a cause of cerebral cavernous malformation in Hispanic Americans. N Eng J Med 334 . 946-951. (1996) 9. Günel M, Awad IA, Finberg K et al. Genetic heterogeneity of inherited cerebral cavernous malformation. Neuros rrery 38 : 1265-1271. (1996) 10. Henkemeyer M., Rossi D.J., Holmyard D. P. et al. Vascular System dcfccts and neuronal apoptosis in micc lacking ras GTPasc-activing protcin. Nature 377 - 695-701. (1995) 11. Huang X., Adams M. D., Zhou H. and Kerlavagc A. R. A tool for analysing and annotating genomic séquences Genomics 46 . 37-45 (1997) 12. Johnson EW, Iyer LM, Rich SS et al. Refined Localization of tlie Cerebral Cavernous Malformation Gene (CCMI) to a 4 cM Interval of Chromosome 7q Contained in a Well-defined YAC Contig. Génome Research, 5 : 368- 380. (1995) 13. Kiayama H., Sugimoto Y., Matsuzaki T., Ikawa Y and Noda M. A ras- Related gène with Transformation Suppressor Activity. Cell, 56 : 77-84 (1989) 14. Knudson AG Mutation and Cancer: Statistical study of retinoblastoma ; Proc. Nat. Ac. Sci. USA 68,820-823 (1971). 15. Labauge P., Laberge S., Brunereau L. et al Hereditary cerebral cavernous angiomas : clinical and genetic features in 57 French families. Lance 352 : 1892-258. (1998) 16. Laberge S., Labauge P., Maréchal E., Maciazek J, Tournier-Lasserve E. Genetic heterogeneity and absence of founder effect in a series of 36 non Hispano-American cerebral cavernomas families. (European Journal of Human Genetics, in press) 17. Notelet L., Houtteville J. P., Khoury S., Lechevalier B. and Chapon F. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in cérébral cavenomas : ans immunocytochemical study of42 cases. Surg Neurol 47: 364-70 (1997) 18. Oten P, Pizzolata GP, Rillict B, Berney J A propos de 131 cas d'angiomes caverneux (cavernomes) du SNC, repérés par l'analyse rétrospective de 24 535 autopsies. Neurochirurgie 35 :82-83 (1989) 19. Pizon V., Chardin P., Lcrosey I., Olofsson B. and Tavitian A. Human cDNAs rapl and rap2 homologous to the Drosophilia gène Dras3 encode proteins closely related to ras in the eftector région. Oncogene, 3 : 201-204 ( 1988) 20. Pizon V., Cifuentes-Diaz C.,' Mege RM., Baldacci G. and Rieger F. Expression and localization of Rap proteins during myogenic differentiation. Eur J Cell Biol, 69 : 224-235(1996) 21. Quarck R., Berrou E., Magnier C., Bobe R., Bredoux R., Tobelem G., Enouf Eand Bryckaert M. Differentia! up-regulation of Rapla and Raplb proteins during smooth muscle cell cycle. Eur J Cell Biol 70 : 269-277 (1996) 22. Rigamonti D, Hadley MN, Drayer BP et al. Cerebral cavernous malformations. Incidence and familial occurrence. N Etigl J Med 3 1 9 : 343- 347.(1988) 23. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 386 : 671-674. (1997) 24. Russell DS, Rubenstein LJ. Pathology of tumours of the nervous system. 5th ed. Baltimore, Md ; Williams and Wilkins : 730-736. (1989) 25. Rothbart D., Awad LA., Lee J., Kim J., Harbaugh R., Crisculo G. R. Expression of Angiogenic Factors and Structural Proteins in Central Nervous System Vascular Malformations. Neurosurgery 38: 915-925 ( 1996) 26. Rozen S., Skaletsky H. J. Primer 3 http://wwwgcnomc.wi. mit. cdu/gcnonic~soflvvarc/otlicr/primcr3 html (1996, 1997) 27. Serebriiskiil., Estojak J., Sonoda G. et al. Association of Krcvl/raplawith Kritl, a novel ankyrin repeat-containing protein encoded by a gène mapping to 7q21-22 Oncongene 15 : 1043-1049. (1997) 28. Wojnowski L., Zimmer A.M., Beck T. W. et al. Endothelial apoptosis in Braf-deficient mice. Nature Genêt 16293-297. (1997) 29. Xu HP., Wang Y., Riggs M., Rodgers L. and Wigler M. Biological activity of the mammalian RAP genes in yeast. Cell Regnl 1 :763-9 (1990) REVENDICATIONS 1 Séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 17, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 20, SEQ ID N 21, SEQ ID N 22, SEQ ID N 23, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 28. 2. Utilisation d'au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 1, pour la détection, à partir d'un prélèvement biologique, de la présence d'une mutation dans le gène Kritl. 3. Utilisation d'au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 2, pour la détection, à partir d'un prélèvement biologique, de la présence d'une mutation dans le gène Kritl liée à la survenue de cavernomes 4 Utilisation selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que la détection de la mutation est effectuée dans au moins un exon du gène Kritl 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'un couple de séquences est spécifique d'un exon selon la répartition suivante : - SEQ ID N 1 / SEQ ID N 2 pour l'exon 1, - SEQ ID N 3 / SEQ ID N 4 pour l'exon 2, - SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 pour l'cxon 3, - SEQ ID N 7 / SEQ ID N 8 pour l'cxon 4, - SEQ ID N 9 / SEQ ID N 10 pour l'cxon 5, - SEQ ID N 11 / SEQ ID N 12 pour l'cxon 6, - SEQ ID N 13 / SEQ ID N 14 pour l'exon 7, - SEQ ID N 15 / SEQ ID N 16 pour l'exon 8, - SEQ ID N 17 / SEQ ID N 18pour l'exon 9, - SEQ ID N 19 / SEQ ID N 20 pour l'exon 10, - SEQ ID N 21 / SEQ ID N 22 pour l'exon 10, - SEQ ID N 23 / SEQ ID N 24 pour l'exon 11, - SEQ ID N 25 / SEQ ID N 26 pour l'exon 12, - SEQ ID N 27 / SEQ ID N 28 pour l'exon 12. 6. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisée par le fait que la détection d'une mutation est précédée de l'amplification de l'exon dans lequel la mutation est recherchée. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait que l'amplification est réalisée par PCR ou PCR-like. 8. Méthode de diagnostic génotypique de cavemomes chez un individu, caractérisé par le fait que l'on prélève un échantillon biologique dudit individu, que l'on détecte la présence d'une mutation dans le gène Kritl, par analyse de la séquence nucléique présente dans ledit échantillon, une telle mutation étant liée à la survenue de cavernomes. 9. Méthode de diagnostic selon fa revendication 8, caractérisée par le fait que la séquence d'acide nucléique est de l'ADN génomiquc, de l'ADNc ou de l'ARNm. 10. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait que ladite analyse est réalisée par hybridation. 11. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée par le fait que ladite analyse est réalisée par séquençage. 12. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait que ladite analyse est réalisée par migration électrophorétique, et plus particulièrement par SSCP ou DGGE. 13. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée par le fait que ladite analyse est réalisée par une méthodologie visant à détecter la troncation d'une protéine. 14. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisée par le fait que tout ou partie de la séquence d'acide nucléique correspondant au gène Kritl est amplifiée préalablement à la détection de la présence d'une mutation. 15. Méthode de diagnostic selon la revendication 14, caractérisée par le fait que l'amplification est réalisée par PCR ou PCR-like. 16. Méthode de diagnostic selon la revendication 15, caractérisée par le fait que les amorces pour réaliser l'amplification sont parmi les séquences définies dans la revendication 1, de préférence dans la revendication 5. 17. Utilisation du gène Kritl ou d'une séquence dérivée de ce gène pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler ou inhiber l'angiogenèse. 18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que le médicament est destiné à la thérapie génique. 19. Vecteur d'expression dans une cellule hôte appropriée, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence du gène Kritl ou une séquence dérivée de ce gène. 20. Vecteur d'expression selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments nécessaires à la surexpression de la séquence. 21. Vecteur selon les revendications 19 ou 20, destiné à une utilisation selon l'une des revendications 17 et 18. 22. Vecteur selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique. 23. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins tout ou partie de la protéine Krit11 normale ou modifiée. 24. Composition selon la revendication 23, caractérisée en ce que le composé est un vecteur selon l'une des revendications 19 à 22.