Brevet FR2796808A1 — publié le 20010202

La présente invention est relative à une méthode de criblage de médicaments aptes à moduler le transporteur ABCA ainsi qu'à ses applications. La présente invention est également relative à des vecteurs de recombinaison homologue et à des vecteurs d'expression d'un transporteur ABCA, à des cellules eucaryotes les contenant et à des séquences spécifiques issues de transporteurs ABCA. De manière générale, les transporteurs ABC constituent une superfamille de protéines hautement conservées impliquées dans le transport membranaire couplé à l'hydrolyse de l'ATP, d'un grand nombre de substrats (ions, acides aminés, peptides, sucres, vitamines et hormones stéroïdes, par exemple). Les protéines ABC sont caractérisées par la présence : - de deux cassettes de liaison à l'ATP (ATP Binding Cassette ou domaine de liaison nucléotidique à l'ATP (NBD ou ATP nucleotide-binding romain)), hautement conservées dans la famille des transporteurs ABC et comprenant chacune un motif A de Walker GX4GK(S/T), un motif B de Walker (R/K)X6-8hyd4D (hyd = résidu hydrophobe) et une séquence SS (signature sequence (L/Y)SGG(Q/M)), située entre le motif A de Walker et le motif B de Walker et - de deux domaines transmembranaires (TD) comprenant chacun six segments ou boucles transmembranaires (Figure 1). Un transporteur ABC fonctionnel requiert une association symétrique de ces quatre domaines protéiques ; la spécificité des molécules transportées est déterminée par les domaines transmembranaires, tandis que l'énergie requise pour le transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du NBD. Un nouveau sous-groupe de la famille des transporteurs ABC (ATP binding cassette), chez les mammifères le sous-groupe ABCA, a été décrit en 1994, suite à l'identification du transporteur prototype ABCA1 (M. F. Luciani et al., Genomics, 1994,21, 150-159). Les transporteurs du sous-groupe ABCA comprennent un domaine hautement hydrophobe (domaine HH1inclus dans le domaine de régulation R), localisé entre les deux moitiés de la protéine (figures 1,2 et 3). Des études fonctionnelles chez la souris ont montré que le transporteur ABCA1 est impliqué dans l'englobement ( engulfment ) des cellules en apop- tose par les macrophages (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996,15, 226-235 ; Y. Hamon et al., Blood, 1997,8, 2911-2915). Des études in vitro ont montré que le transporteur ABCAI humain est régulé, dans les macrophages, par les stérols (T. Langmann et al., BBRC, 1999, 257, 29-33). A l'heure actuelle, d'autres transporteurs de type ABCA ont été décrits, comme il ressort des données disponibles sur le site ,,7v,,,-w.med.rtig.nl/mdl/humanabe.htm et résumées dans le Tableau 1 ci-après. Tableau I Nom Symbole Chromosome Chromosome RNA AA Exons Accession humain souris ABC1 ABCA1 9q22-q31 4A5-B3 6,9 2259 48 AJ012376 ABC2 ABCA2 9q34 2A2-B 6,7 >2174 >42 U18235 (ABC-C) ABCA3 16p13.3 17B 6,5 1704 ? U78735 ABCR ABCA4 1 p22 ? 7,3 2273 50 NM000350 EST90625 ABCA5 17q21-q24 ? ? ? 38 U66672 EST155051 ABCA6 17q21 ? ? 38 U66680 KIAA0822 ABCA8 17q24 ? 5,7 1581 38 AB020629 Parmi ceux-ci, seuls quatre d'entre eux ont été complètement séquences : ABCA1, ABCA2, ABCA3 et ABCAR, soit chez l'homme, soit chez la souris. Le gène de souris ABCA1 est schématiquement illustré à la figure 1 : il comprend plus de 100kb sur le chromosome 4A5-B3 et est divisé en 49 exons. L'organisation de ces exons et la correspondance entre les exons et les différents domaines du transporteur ABCA1 sont également illustrées à la Figure 1. Une analyse croisée de l'organisation des gènes de différents transporteurs ABCA (ABCA1, ABCAR et ABCA2) montre une conservation maximale dans les régions codant pour les NBD (NBD1 et NBD2 : cassette de liaison à l'ATP) et les domaines transmembranaires (TD1 et TD2) (figures 2 et 3), alors que la région codant le domaine de régulation, présente une grande variabilité dans les positions des sites d'épissage et dans le nombre d'exons : exons pour ABCA2,13 pour ABCA1, 12 pour ABCAR. Cette variabilité se reflète au niveau de la séquence en acides aminés, bien que ses caractéristiques principales se retrouvent dans tous les transporteurs de cette famille : grand nombre de résidus chargés, présence de plusieurs sites de phosphorylation putatifs et présence de la zone hautement hydrophobe (HH1) ; toutefois, bien que la zone HH1 soit toujours présente, sa position varie d'un membre de la famille à l'autre ; par exemple la figure 4 illustre deux configurations possibles. Au niveau de la séquence en acides aminés, les transporteurs ABCA connus présentent une identité comprise entre 45 et 66 %. L'analyse comparative des plots d'hydrophobicité révèle également des profils similaires. Les domaines TD (domaine transmembranaire) incluent les 6 zones transmembranaires ainsi que les boucles intermédiaires précitées. Ceci correspond pour le transporteur ABCAI aux résidus 630-846 pour les zones transmembranaires N-terminales (TD1 : segments transmembranaires 1-6: exons 14-16) et aux résidus 1647-1877 pour les zones transmembranaires C-terminales (TD2: segments transmembranaires 7-12 : 36-40) (Figure 3). Une analyse plus précise des séquences TD parmi les différents transporteurs ABC de type A montre un plus grand degré de conservation dans le second groupe (TD2) malgré un degré faible de conservation de la séquence primaire lorsque l'on compare les séquences TD aux séquences NBD (taux d'identité moyen : 44 % pour TD1et 53 % pour TD2). Ceci est particulièrement frappant pour les TM 7, 9 et 10 qui présentent une identité supérieure à 50 %. En ce qui concerne les NBD, ils s'étendent, dans le transporteur ABCA1 par exemple, de l'acide aminé 885 à l'acide aminé 1152, pour la séquence Nterminale (NBD 1 : exons 17-22) et de l' acide aminé 1919 à l' acide aminé 2132 pour la séquence C-terminale (NBD2 : exons 42-47). Une analyse de la conservation des séquences NBD montre une identité comprise entre 55 % et 66 % (moyenne 59 %) pour NBD et entre 57 % et 69 % (moyenne 65 %) pour NBD2. Une analyse plus fine de la conservation des NBD conduit à une définition de motifs uniques à la famille ABCA, présentés dans le Tableau II ci-après. Tableau II Walker A - # #50 hot spot NBD1 GQ....LGHNGAGKTTT G.CPQ.N LTV.EH.FY NBD2 GECFGLLGCNGAGKSTT GYCPQFD ILTGRE.L ATS / C Walker B switch # 162 NBD1 LSGGM.RK LDEPT.G.DP L.TH.MDEA..LGDR NBD2 YSGG.KRK LDEPTTGMDP LTSHSMEECEALC.R Dans ce Tableau II, les acides aminés en gras correspondent aux zones conservées dans tous les transporteurs ABC, les points correspondent aux résidus non-conservés et les résidus en caractères normaux sont conservés dans les transporteurs de type ABCA. On peut observer une conservation élevée des résidus d'acide aminé entourant soit les glycines conservées du motif A de Walker, soit l'aspartate du motif B de Walker ; des conservations similaires se retrouvent à la fois dans NBD et dans NBD2. Au moins trois autres motifs ABCA peuvent également être définis : - la région autour du résidu histidyle, en aval du motif B de Walker est hautement conservée (switch #162) - le cluster de résidus autour de la glutamine +50 par rapport au motif A de Walker (#50) et - la région dite hot spot , qui correspond à la position DF508 dans CFTR (hot spot). Les transporteurs ABCA se retrouvent aussi bien chez les mammifères que chez les plantes, les insectes et mêmes les organismes inférieurs. Parmi les membres du sous-groupe des transporteurs ABCA, ABCA1 a été associé au processus d'englobement des cellules en apoptose (M.F. Luciani et al., EMBO J., 1996, précité). ; la fonction moléculaire précise exercée par le transporteur ABC pendant l'englobement n'est pas connue. Les transporteurs ABC ont également été associés à des pathologies ; dans le sous-groupe des transporteurs ABCA, actuellement seul ABCR a été associé, de manière claire à la pathogénèse des maladies dégénératives de l'oeil. Les Inventeurs ont maintenant trouvé que les transporteurs du sousgroupe ABCA sont susceptibles d'intervenir directement dans le contrôle de la composition en lipides de la membrane. En fait, à la fois chez les souris ABCA1 knock-out et chez des cellules eucaryotes transfectantes surexprimant un transporteur de type ABCA (ABCA1, par exemple), on observe une mobilité membranaire modifiée des phospholipides. Ces éléments ont conduit les Inventeurs à mettre au point un modèle adapté au criblage de molécules aptes à stimuler spécifiquement les transporteurs de type ABCA ; de tels transporteurs interviennent ainsi dans le contrôle de la composition lipidique des membranes et ensuite dans le contrôle de l'efflux de ces lipides vers le plasma. Il en résulte une modification des taux de lipide plasmatiques, étroitement liée au risque d'athérosclérose. Une modulation de l'activité des transporteurs ABCA permet donc un contrôle du risque des maladies cardiovasculaires. La présente invention a pour objet l'utilisation d'un mammifère nonhumain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. On entend par gène inactivé aussi bien un gène altéré, modifié, inhibé ou tronqué. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, au moins l'un des allèles du gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1 ou ATP nucleotidebinding domain 1). En particulier, les animaux hétérozygotes (présence à la fois de l'allèle sauvage et d'un allèle inactivé, tel que défini ci-dessus) constituent un modèle dans lequel le taux sanguin de cholestérol HDL est faible ; dans ce contexte, la stimulation des transporteurs ABCA entraîne une augmentation significative des particules HDL (restauration d'un taux normal de cholestérol HDL). La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu d'un mammifère non-humain recombinant pour le gène codant un transporteur de type ABCA, lesquelles cellules sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un allèle dudit gène inactivé, de préférence, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1 ou ATP nucleotide-binding domain 1), pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler (à stimuler) les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'extraction d'un échantillon biologique à partir d'au moins un @ mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; - la mise en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler ; @ - la mesure du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. La présente invention a également pour objet un vecteur de recom- binaison homologue d'un gène d'un transporteur de type ABCA de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique issue d'un gène codant un transporteur de type ABCA, inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDI). Conformément à l'invention, ledit gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons 17 à 22 correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP du transporteur ABCA 1. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA de mammifère, comprenant une séquence nucléotidique incluant un gène sélectionné dans le groupe constitué par : - le gène sauvage d'un transporteur de type ABCA et - les gènes d'un transporteur de type ABCA, mutés au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP (NBD1ou NBD2), pour la transformation génétique d'une cellule eucaryote conve- nable. Lesdits gènes mutés permettent notamment l'expression de protéines ABCA non-fonctionnelles utiles pour tester la spécificité des substances sélectionnées avec les modèles knock-out tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication dans une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection des cellules eucaryotes transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression d'un gène du transporteur du type ABCA dans lesdites cellules eucaryotes et une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker de la première cassette de liaison à l'ATP. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau de chacun des motifs A de Walker des deux cassettes de liaison à l'ATP. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques et les ADNc codant les transporteurs ABCA1 à ABCA4 et ABCAX. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence génomique (SEQ ID NO : 2) et la séquence d'ADNc (SEQ ID NO :1) codant le transporteur ABCAX. La présente invention a également pour objet des cellules eucaryotes hôtes obtenues par transformation génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. De telles cellules voient leur niveau d'expression du transporteur augmenté par rapport à leur niveau basal. Certaines desdites cellules surexpriment ainsi ledit transporteur ; par surexpression on entend toute expression supérieure au niveau naturel d'expression dudit transporteur. Ces cellules eucaryotes hôtes sont de préférence des cellules HeLa transfectées de manière stable par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus et par exemple caractérisé en ce qu'il est constitué d'une origine de réplication appropriée, d'un gène de résistance à un antibiotique, du promoteur viral SV40, d'une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté, d'un site de polyadénylation dérivé du virus SV40 et du gène codant la protéine GFP (greenfluorescence protein). La présente invention a également pour objet une méthode de production de mammifères non-humains recombinants, notamment des souris recombinantes porteuses d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1), caractérisée en ce que : - l'on tronque un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; - l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique dudit mammifère non-humain, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle tronqué ; - l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons dudit mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des événements de recombinaison homologue ; puis - l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifère non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques ; et - l'on obtient à la génération FI des mammifères non-humains, des souris par exemple, recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains (des souris par exemple) recombinés homozygotes, reconnaissables à la présence du marqueur. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse d'évaluation d'une substance apte à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - une culture de cellules issues d'au moins un mammifère nonhumain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du transporteur de type ABCA. La présente invention a également pour objet un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence SEQ ID NO :1 ou la séquence SEQ ID NO:2 et correspond au transporteur ABCAX. En variante, la présente invention a pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'administration à au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP ; - l'extraction d'un échantillon biologique à partir dudit mammifère non-humain ; - la mesure in vitro du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon biologique ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. La présente invention a également pour objet un transporteur ABCA muté, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation ponctuelle au niveau de l'une des cassettes de liaison à l'ATP, de préférence au niveau des motif A de Walker. La présente invention a en outre pour objet des réactifs de détection de séquences nucléotidiques spécifiques des transporteurs de type ABCA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences de 15 à 50 nucléotides amplifiant les fragments codant les séquences spécifiques au transporteur ABCA, telles que définies dans le Tableau II. On peut citer par exemple, les séquences SEQ ID NO:30 et 31. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention, avec réfé- rence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la correspondance entre la structure génomique du gène ABCA1 et des domaines de la protéine correspondante ; - la figure 2 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des NBD (NBD1 = N-terminal ; NBD2 = C-terminal). La structure génomique comparée des quatre transporteurs ABCA est illustrée. Les limites des domaines sont indiquées et correspondent aux exons intéressants. Les introns sont indiqués par des lignes noires ; les motifs conservés sont indiqués par des zones ombrées ; HS : hot spot ; S : switch région ; A : Walker A ; B : Walker B ; C : signature de transport active. Le rectangle du bas illustre une comparaison de l'organisation d'un NBD ou d'un NBD2 typique du transporteur de type ABCA. 1 : ABCA1 ; 2 : ABCA2 ; X : ABCA7 ; R : ABCAR ; - la figure 3 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des domaines transmembranaires (TD 1 : N-terminal ; TD2 : C-terminal) ; - la figure 4 représente la topologie prédictive du transporteur ABCA1, considéré comme le prototype du sous-groupe de transporteurs de type ABCA ; la figure 4A illustre un modèle topologique comprenant deux moitiés symétriques, interrompues par un domaine R (domaine de régulation). Le segment hautement hydrophobe HHI se présente sous la forme d'une épingle à cheveux traversant deux fois la membrane. Chaque moitié est composée d'un ensemble de six éléments transmembranaires et d'une cassette de liaison à l'ATP ; la figure 4B illustre un modèle topologique alternatif dans lequel le segment hautement hydrophobe HHI ne traverse qu'une fois la membrane (de l'intérieur vers l'extérieur), ceci conduit à une structure asymétrique comprenant une grande boucle extracellulaire suivie d'un nombre impair d'éléments transmembranaires dans la seconde moitié du transporteur ; - les figures 5 à 8 représentent les différents éléments nécessaires à la construction du vecteur utilisé pour la préparation de souris knock-out : la figure 5 illustre le vecteur de base (Lyl.41oxP21.1) utilisé pour la construction du vecteur de recombinaison ou de ciblage (figure 7 et 9 : ABClloxP-BN8); les figures 6 et 7 illustrent les fragments d'homologies utilisés en 5' (figure 6) et en 3' (figure 7) ; figure 8 illustre l'origine des fragments d'homologies utilisés ; - la figure 9 représente l'établissement de souris de phénotype ABCA1 nul : la figure 9a montre (1) l'organisation génomique d'une partie du locus ABCA1, dans laquelle les exons sont en noir (schéma du haut), (2) la structure du vecteur de ciblage et la structure prédite de l'allèle mutant (schéma du milieu et du bas). Enzymes de restriction : E : EcoRI, B : BamHI, H : HindIII. La position de la sonde (fragment HindIII de 500pb) utilisée pour le génotypage et la taille des fragments BamHI sur l'allèle sauvage et sur l'allèle mutant sont indiqués. La figure 9b illustre le génotypage des souris ABCA1 de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) par analyse en Southem blot sur de l'ADN digéré par BamHI. La sonde correspond à la région de recombinaison homologue située en 5' (voir figure 9a) ; la figure 9c montre que les souris ABCA1 -/- n'expriment pas le transcrit ABCA1. L'analyse en Northem blot sur de l'ARN de foie de souris ABCA1 de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) montre effectivement une absence de transcrits chez les souris -/-.La sonde utilisée est un fragment PstI d'ADNccorrrespondant à la région de recombinaison homologue située en aval. La position de l'ARN ribosomal et indiqué par référence à sa taille ; - la figure 10 représente la modification de la mobilité transmembranaire de la phosphatidylsérine (PS) dans les souris ABCAI KO (-/- ou -/+), évaluée par un test à la prothrombinase (figure 10a), par microvésiculation (figure lOb et par les mouvements de la PS (figure 10c). Les globules rouges obtenus à partir de souris sauvages +/+, ABCA1 +/- et ABCA1 -/- sont analysées dans des conditions de base (colonnes en noir) ou après stimulation au A23187 (0,5 M : colonnes hachurage épais ; 1 M : colonnes hachurage fin) ; Figure10a : nM d'équivalents PS exposés à la surface de 106 globules rouges. Les valeurs obtenues sont les suivantes : 5,89 1,8 pour-/-, 5,84 1,2 pour +/- et 8,53 2,7 pour +/+ dans des conditions de base ; 5,5 0,49 pour -/-, 14,21 2,2 pour +/- et 15,67 3,9 pour +/+ à 0,5 M d'A23187 et 7,93 2,1 pour -/-, 17,1 1,7 pour +/- et 22,5 6 pour +/+ à 1 M d'A23187 ; Figure 10b évaluation en cytométrie de flux de la microvésiculation de la membrane plasmique. Les valeurs en % de microvésicules sont : 2,59 1,2 pour -/-, 4,6 1,3 pour +/- et 4,5 1,2 pour +/+dans des conditions de base ; 2,56 1,1 pour-/-, 5,5 1,9 pour +/- et 9,1 3,3 pour +/+ à 0,5 mM d'A23187 et 4,5 2,2 pour -/-, 6,1 2,1 pour + /- et 14,97 5,2 pour +/+ à 1 mM d'A23187 ; Figure 10c : évaluation des mouvements de PS entre les deux feuillets lipidiques : à 20 min 86,9 % de PS pour-/-, 84,1 % de PS pour +/- et 85,7 % de PS pour +/+ sont distribués au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique. Après un stress au calcium (A23187,2 mM à t=20 min) 24 % de PS pour +/+, 15 % de PS pour +/- et 10,6 % de PS pour-/- migrent vers le feuillet externe. Le mouvement net global est diminué de 45 % chez les souris-/- et de 62 % chez les animaux +/-, par rapport aux animaux de type sauvage ; - la figure 11illustre l'évolution des paramètres lipidiques (cholestérol, HDL et triglycérides) chez les souris-/-, -/+ et +/+ ; - les figures 12 à 17 illustrent le contrôle de l'expression du transporteur ABCA1 dans des cellules HeLa (transfectants stables) : figure 12 : immunoprécipitation de la protéine ABCA1/GFP (bande à 250kDa) ; figure 13 : stratégie d'obtention d'une construction ABCA1/GFP ; figure 14 : mutants ABCA1 ; figure 15 : représentation schématique du plasmide pBI ABCA1/GFP ; figure 16 : mesure de l'efflux de phospholipides contenant de la choline ; figure 17 : mesure de l'efflux de cholestérol (15000 cellules HeLa, 15000 cellules 6C, 40000 cellules AG2 par puits). - la figure 18 (voir également SEQ ID NO:2) représente la séquence de l'ADN génomique du transporteur ABCAX ; cette figure, les exons sont en gras. - la figure 19 est une représentation schématique de la structure exon-intron du gène ABCX. - la figure 20 représente le protocole PCR (exemple 4). EXEMPLE 1 : Mesure des mouvements lipidiques. Analyse cinétique de l'apparition de phosphatidylserine sur le feuillet lipidique externe de la membrane plasmique de différents types cellulaires Les cellules sont récoltées soit à partir de culture in vitro ou ex vivo soit fraîchement isolées à partir de souris et placées à une concentration finale de 107 cellules/ml en milieu de culture RPMI. Pour chaque point de cinétique, la fixation à la surface des cellules, de l'annexine V conjuguée avec un fluorophore donné (FITC, PE ou Cy5) est enregistrée en fonction du temps par cytométrie de flux ; environ 106 cellules sont incubées à l'équilibre avec une concentration saturante d'annexine V conjuguée au fluorophore dans une solution A (NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4). A l'instant initial, l'ionophore de calcium A23187 (concentration variant entre 0,01 M et 10 M) est ajouté à la suspension cellulaire et les variations de fixation de l'annexine V à la surface des cellules sont enregistrées par intervalle de temps variant entre 100 ms et 1 sec. Les paramètres cinétiques de la fixation de l'annexine V sont calculés à partir du traitement des données d'enregistrement. Mesure des mouvements de phospholipides entre les feuillets lipidiques de la membrane plasmique des érythrocytes de souris Les érythrocytes sont préparés à partir d'échantillon de sang de souris. Après élimination des lymphocytes, les érythrocytes sont lavés et suspendus à une concentration d'hématocrite de 20%. Pour analyser les mouvements de phospholipides, les sondes lipidiques (phospholipides marqués en spin avec une courte chaîne ss (C5) portant une sonde nitroxyde) sont dispersées dans le milieu de culture cellulaire. Il en résulte une incorporation dans le feuillet externe de la membrane plasmique à une concentration finale de 1% des lipides totaux. A différents intervalles de temps, des fractions aliquotes sont diluées en présence de 2% d'albumine sérique bovine (BSA) dépourvue d'acide gras et conservées 1 minute sur la glace. La sonde phospholipidique extraite du feuillet membranaire externe par la BSA est réduite en présence d'ascorbate de sodium à une concentration finale de 65 mM. L'intensité résiduelle de résonance du champ électronique de spin, attribuable à la sonde localisée dans le feuillet interne, est exprimée en pourcentage des mesures réalisées sur des fractions aliquotes en l'absence de BSA et d'ascorbate de sodium. Mesure des efflux de cholestérol à partir de cellules en culture Les cellules à étudier sont distribuées en plaque de culture de 12 puits, le premier jour. Le milieu est changé par 1 ml de milieu de charge contenant 1,5 Ci/ml 14C-Cholesterol, 10 Ci/ml 3H-Choline le deuxième jour. Après deux rinçages avec du PBS-0,5%BSA, 1 ml de milieu d'efflux est ajouté le cinquième jour. Le milieu et des cellules sont séparés le sixième jour. Les milieux sont centrifugés 7 minutes à 3000 rpm pour éliminer les cellules mortes flottantes. Les cellules sont lysées dans deux fois 0,5 ml de SDS 0,2%, une partie est prélevée pour déterminer la concentration protéique. Les lipides sont extraits des milieux et les cellules sont lysées. Le comptage se fait par ajout de 3 ml de solution scintillante dans un compteur de scintillation. Le pourcentage d'efflux est la radioactivité mesurée pour le milieu divisée par la radioactivité totale (cellules + milieu). Lvse des cellules La lyse des cellules s'effectue après 2 rinçages au PBS dans une solution 0,2% SDS. Extraction lipidique 0,8 ml de lysat sont mélangés à 3 ml de Blight and dyer (chloroforme/méthanol 1:2, v/v) et laissé reposer 1 heure. Après l'addition d'l ml d'H20 et 1 ml de chloroforme, l'échantillon est vortexé 15 secondes et centrifugé à température ambiante 10 à 20 min. à 4000 rpm. La phase inférieure (organique) est pipetée et le chloroforme évaporé dans un speed vacuum. Le tube sec se garde à -20 C. Détermination de la concentration de cholestérol Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1:1, v/v) et la quantité voulue (en équivalent de g de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un solvant hexane/Et20/AcOH (80:20:1, v/v). La révélation se fait par un bain de 8 secondes dans du MnCl2 puis chauffage 30 minutes à 110 C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards par lecture de la fluorescence émise suite à l'excitation par une lampe à mercure. Les trois pics sont cholestérol (FC), triglycérides (TC), ester de cholestérol (CE). Dosage des phospholipides Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1:1 v/v) et la quantité voulue (en équivalent de g de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un solvant méthanol/chloroformeIMeAcIN-Prop/0,25%KCl (10:25:25:25:9, v/v). La révélation se fait par un bain de 12 secondes dans du CuSO4- et chauffage 10 minutes à 110 C puis 15 min à 170 C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards par lecture de la fluorescence émise suite à l'excitation par une lampe de mercure. Les différents pics sont sphingomyéline (SPM), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI) ; les phosphatidyléthanolamines (PE) et le phosphatidylglycérol (PG) ne peuvent pas être dissociés. EXEMPLE 2 : SourisABCA1 dans lesquelles le gène ABCA1 est inactivé : souris hétérozygotes (-/+) et souris homozygotes (-/-) A. Stratégie d'inactivation par recombinaison homologue du gène ABCA1 murin Les fragments d'ADN génomiques utilisés pour construire le vecteur de recombinaison homologue sont tous issus de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129SV cloné dans le vecteur lambda FIXII. Vecteur de recombinaison Le vecteur de base (Lyl.41oxP21.1) est dérivé du vecteur pKO (X. Morin et al., Neuron, 1997, 18, 3, 411-423) contenant le gène de résistance au G418 (Neo) issu du vecteur pMCINeoPolyA (STRATAGENE) flanqué en 5' d'un site multiple de clonage et séparé en 3' de la cassette HSV-Tk par un site BamHI. Un site loxP issu du vecteur pZ30 et excisé XhoI-SalI a été rajouté en amont du gène Neo dans le site Xhol (figure 5). Fragments génomiques d'homologies En 5' : un fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb a été utilisé. HindIII est localisé dans l'intron 15 et EcoRI en position 2636 dans l'exon 17 (figures 6 et 8). En 3' : un fragment BamHI-NotI de 11,5 kb a été utilisé. BamHI est localisé dans l'intron 22 et Notl est un site artificiel de clonage issu du phage lambda FIXII et serait situé dans l'intron 30. Ce fragment a été modifié par ajout d'un site loxP (dans la même orientation que le site loxP du vecteur) dans le site SphI situé à 5,5 kb de l'extrémité BamHI (figures 7 et 8). Origine des fragments d'homologies et détails de la construction (figure 8) : Fragment 5' : un fragment BamHI-BamHI de 6,8 kb a été excisé du phage lambda 13.1 (extrémités : dans l'intron 11 et dans l'intron 23) issu d'un criblage de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129SV décrite ci-dessus, par une sonde d'ADNc de ABCA1 de 875 pb EcoRI-PstI (2636- 3511). Ce fragment a été cloné dans pBKS (STRATAGENE) dans le site BamHI. Ce vecteur pBKS-BamHI a été digéré par EcoRI et HindIII. Le fragment de 1,8 kb a été cloné dans pBKS digéré EcoRI et HindIII. Ce vecteur pBKS-HindIII-EcoRI a été modifié par remplacement de la région EcoRI-SacI par le linker : AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) TTAAGAGCTCGCCGGCGAAGCTTCTCGA (SEQ ID NO :4) Ce linker contient un site XhoI servant à exciser le fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb pour le cloner ClaI-XhoI dans le vecteur de recombinaison digéré ClaI-XhoI oligonucléotides utilisés pour faire le linker : AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) CTTCGAAGCGGCCGCTCGAG (SEQ ID NO :5) Fragment 3' : le fragment BamHI-NotI a été excisé du phage lambda 3. 1 (extrémités : dans l'intron 16 et dans l'intron 30) issu du même ciblage que précédemment. Le site NotI est un site artificiel du vecteur lambda FIXII qui permet d'exciser l'insert du vecteur. Ce fragment a été cloné dans pBKS digéré BamHI et Notl. Ce vecteur pBKS-BamHI-NotI a été modifié par ajout d'un site loxP (avec un site Spel) dans le site SphI grâce au linker : CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO : 6) CGTACGTTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATAATGATCACGTAC (SEQ ID NO :7) Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO : 6) et CACTAGTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCATG (SEQ ID NO :8) Puis un linker contenant le site BamHI a été introduit à la place de la région NotI-SacII du polylinker de pBKS-BamHI-NotI : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO :9) CCGGCCTAGGTGCGCAGGCG (SEQ ID NO :10) Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO : 9) GGACGCGTGGATCC (SEQ ID NO : 11) Le fragment BamHI-NotI de 11,5 kb initial a pu donc être excisé BamHI et cloné dans le vecteur de recombinaison homologue contenant la région d'homologie 5'. Le vecteur a été linéarisé ClaI avant électroporation dans les cellules ES DBA-252 issues de souris de souche DBA-lLacJ. Recombinaison homologue La recombinaison homologue résultante de cette électroporation, en conditions classiques, permet un remplacement de 5,7 kb de l'ADN génomique d'ABCAl, soit 910 pb de séquence codante correspondant à une partie de l'exon 17 et la totalité des exons 18, 19, 20, 21 et 22, par le gène Neo (figure 9). Le génotype obtenu est vérifié par PCR et par analyse en Southem blot de l'ADN digérée par BamHI et hybridée avec une sonde située hors de la région de recombinaison homologue. La taille des fragments de restriction est de 6,8 kb pour l'allèle sauvage et de 4,4 kb pour l'allèle mutant (figures 9a et 9b). De manière plus précise, le génotypage par PCR est réalisé par utilisation de deux couples d'oligonucléotides : (1) un couple qui détecte l'allèle sauvage (environ 800 pb) : oligo KO sens : GGAACCCACTCATCTGAGGC (SEQ ID NO :12) oligo KO antisens : GGGGACAGACTCCCAGGTTC (SEQ ID NO :13) et (2) un couple détectant l'allèle recombiné (environ 2,3 kb) : BgIII sens : CACCTCCCCAGGGTGTTGGATAAT (SEQ ID NO :14) Neo : TGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCG (SEQ ID NO :15) Protocole de la PCR : 1-10' à 94 C 2-1' à 94 C 3-1' à 65 C 4-2'30"à72 C répéter 2- à 4-, 35 fois En Southem blot : En 5' après digestion de l'ADN génomique par BamHI, une sonde BglII-HindIII de 520pb (BglII dans l'exon 15 en position 2410 et HindIII de clonage dans l'intron 15) détecte un fragment à 6,8 kb pour l'allèle sauvage et 4,4 kb pour l'allèle muté (figure 9). En 3' en utilisant une sonde BgIII-Spel de 2,5 kb (BgIII dans l'intron 27 et SpeI dans l'intron 29). Par digestion de l'ADN génomique avec SpeI. La recombinaison a lieu avant le site loxP (contenant un site Spel) : détection d'un fragment de 7,5 kb. Par digestion EcoRI de l'ADN génomique : détection d'une bande de 5,3 kb si la recombinaison s'est produite correctement. Les clones résistants au G418/gancyclovir sont criblés par analyse en Southem blot et les cellules ES portant l'allèle tronqué sont microinjectées dans des embryons au stade blastocytes 3,5 jours. Le croisement des chimères conduit à une génération de descendants hétérozygotes croisés entre eux pour la production de mutants -/- homozygotes. B. Propriétés des souris ABCA -/-. Matériel et méthodes voir exemple 1 Résultats L'allèle mutant ABCA1 obtenu ne comprend pas les 5 exons codant la 1ère cassette de liaison ATP et une partie du domaine de régulation du transporteur. On obtient un phénotype nul ; les souris portant l'allèle mutant homozygote n'expriment pas l'ARNm d'ABCAI. L'analyse des différents croisements hétérozygotes montrent que l'allèle muté ABCA1 est transmis de manière mendélienne ; on observe un taux de mortalité élevé dans les premières semaines (50 des 79 nouveau-nés survivent à 4 semaines dans les proportions suivantes : -/- : 5/21 ; +/- 28/40 ; +/+17/18). Analyse de la cinétique de l'apparition de phosphatidylsérine (PS) sur le feuillet lipidique externe de la membrane plasmique de cellules-/-. Des hématies sont prélevées sur des animaux de 4 semaines et la quantité de PS exposée sur le feuillet externe de la membrane plasmique est évaluée dans les conditions exposées à l'exemple 1. Les résultats sont illustrés à la figure 10 et montrent que la perte de la fonction ABCA1 perturbe les mouvements transmembranaires de lipides après stimulation par le ionophore de calcium A23187. Analyse des lipides plasmatiques et des lipoprotéines Comme illustré à la figure 11, les HDL sont pratiquement complètement absentes du sérum des souris ABCA1 -/- et de plus, le cholestérol total est significativement réduit. Les souris ABCAI +/- présentent un phénotype intermédiaire qui peut refléter un effet gène-dépendant. Les taux sériques en triglycérides dans les mutants ABCA1 -/- sont significativement élevés par rapport à ceux observés chez les souris de type sauvage +/+ et chez les souris ABCA1 +/-. Ces résultats montrent une déficience plasmatique sévère en HDL chez les souris ABCA1 -/-. EXEMPLE 3 : obtention de transfectants stables pour ABCA1 et ses dérivés 1. Constructions préliminaires L'ADN complémentaire codant pour la protéine ABCA1 a été construit à partir des clones phagiques chevauchants XI 3C, #10F et #8a4 dans le vecteur de clonage procaryote pBluescript KS+/- (STRATAGENE). Le fragment EcoRI/HindIII du phage #10F (nucléotides 2568-5665) a été cloné en amont du fragment HindIII/XbaI du phage #8q4 (nucléotides 5666-6916) précédemment cloné HindIII/XbaI dans pBluescript KS+/- (KS 8a4 wt). La construction obtenue (ks 108 wt) a reçu le fragment NgoMI/EcoRI du clone #13C contenant la région 5' de ABCA1 (nucléotides 1-2567) permettant de reconstituer l'intégralité de l'ADNc de ABCA1. La construction finale (KS ABCAlwt) a été excisée NotI/ApaI et clonée dans le ecteur pSP64TN poly (A), modifiée du vecteur pSP64T poly(A) (F. Becq et al., J. Biol. Chem., 1997,272, 5,2695-2699) par l'insertion d'un adaptateur (GATCTGGGCCCACTCGAGTTAACG CGGCCGCA) (SEQ ID NO : 16) conférant les sites uniques de clonage ApaI, XhoI, HpaI et NotI. La construction finale baptisée pSP64TN ABCA1 a servi de base à toutes les constructions dans le vecteur d'expression bidirectionnel et conditionnel pBI (Clontech). 2. Constructions géniques dans le vecteur d'expression eucaryote pBI 2. 1. pBI ABCAI wt Le fragment NotI/Bspl20I de pSP64TN ABCA1 de type sauvage (wt) contenant l'intégralité de l'ADNc de ABCA1 a été inséré dans le site NotI dans le second site multiple de clonage (MCS II) du vecteur pBI (pBI ABCAI wt). 2. 2 pBI ABCA1/GFP La construction pBI ABCAI/GFP (figure 15) a été obtenue en 3 étapes : Le site Xba du MCS de KS 108 wt a été délété par coupure enzymatique des sites NotI et Spel, suivie du remplissage de leur extrémité 5' débordante par le fragment Klenow de la DNA polymérase 1 d'E. coli (Pharmacia). La construction KS 108/GFP a été obtenue par PCR (Polymerase Chain Reaction, technique d'extension par chevauchement (VALLEJO et al., page 603 et sv. in PCR Primers, Ed C. W. Dieffenbach G. S. Dveksler, CHSL press, 1995). Cette technique repose sur l'utilisation de 4 oligonucléotides (A, B, C, D) au cours de deux séries d'amplification (figure 13) : L'amorce A, oligonucléotide 5' sens, spécifique de la région 3' de ABCAI : A : TGAACCAACCACAGGCAT (ABCA1 nc 6221-6239) (SEQ ID NO :17). Les amorces B (3' antisens) et C (5' sens), partiellement complémentaires contenant l'extrémité 3' de ABCA1 (sans le codon stop) fusionnée avec l'extrémité 5' de EGFP (à partir de l'ATG d'initiation). B:TCGCCCTTGCTCACCATTACATAACTTTCTTTCACTTTC (GFP ne 17-1 ; ABCA1 ne 6798-6786) (SEQ ID NO :18). C : ATGGTGAGCAAGGGCGA (GFP nc 1-17) (SEQ ID NO :19). L'amorce D (3' antisens) spécifique de la région 3' de EGFP, contenant une mutation silencieuse du site BsrGI (en gras) le codon stop de la EGFP (en minuscule) et deux sites de clonage additionnels NotI et XbaI soulignés et séparés par /: D : CTGCTCTAGA/GCGGCCGCTttaCTTATA (GFP nc 730-722) (SEQ ID NO : 20) La première série de PCR a été réalisée d'une part avec les amorces A et B sur la matrice KS 108AXbaI et d'autre part avec les amorces C et D sur la matrice pEGFP (Clontech). Les amorces B et C étant complémentaires, les produits d'amplification AB et CD peuvent d'apparier et servir de nouvelle matrice pour une seconde amplification avec les amorces A et D. Le produit PCR AD obtenu a été ensuite cloné dans le site BsrGI/XbaI du vecteur KS 108AXbaI. La construction a été vérifiée par séquençage (T7 sequencing Kit, Pharmacia). Le fragment SphI/SphI contenant l'extrémité 3' de ABCA1 wt de pBI ABCAlwt a été remplacé par le fragment SphI/SphI de KS 108/GFPAXbaI contenant l'extrémité 3' de ABCA1 fusionnée à la EGFP pour donner pBI ABCA1/GFP. 2. 3. Constructions mutantes Les mutations ponctuelles de ABCAI ont été réalisées au préliminaire dans le vecteur pSP64TN ABCA1 wt. Elles ont consisté à muter la lysine en méthionine du motif Walker A (GAGKS) de chacune des deux cassettes ATP de ABCA1. 2.3.1. K879M La mutation de la lysine de la première cassette ATP (Lys 879) par extension par chevauchement par PCR suivant la méthode précédemment décrite : A ABCA1 spécifique : TTGTCCGGACGCTGTTAG (SEQ ID NO :21) B comportant la mutation Lys (AAG) en MET (ATG) : GGTGGTGGTCATGCCGGCTCC (SEQ ID NO :22) C complémentaire de l'oligo B : GGAGCCGGCATGACCACCACC (SEQ ID NO :23) D ABCAI spécifique : GGGACGATTCCACATCTT (SEQ ID NO :24) Le fragment AD obtenu a été cloné EcoRV/BsshII dans pSP64TN ABCAI wt en remplacement du fragment wt. La construction pSP64TN ABCAI MK a été validée par séquençage. 2.3.2. K1892M La mutation de la lysine de la seconde cassette ATP (Lys 1892) a été réalisée par PCR simple en tirant avantage de la présence du site HpaI à proximité de la région à muter. Deux oligonucléotides ont été dessinés. Oligo 5' sens contenant le site Hpal (souligné) et la mutation ponctuelle (en gras) : GTTAACGGAGCTGGATGTCA (SEQ ID NO :25). Oligo 3' antisens spécifique du vecteur, en aval du codant stop de ABCA1. L'amplification a été réalisée sur la matrice pSP64TN ABCA1 wt. Le fragment PCR obtenu a été cloné HpaI/XbaI dans pSP64TN myc (construction contenant l'épitope antigénique c-myc inséré dans le deuxième site BsrGI de ABCA1 wt...) en remplacement du fragment équivalent (possédant l' insertion c-myc et pas la mutation). La construction a été criblée positivement avec une sonde ADNc spécifique du fragment ABCAI HpaI/XbaI et négativement avec une sonde spécifique de l'oligo c-myc. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1 KM) a été validée par séquençage. 2. 3.3. K879M, K1892M Le double mutant a été obtenu par insertion du fragment PCR généré pour la réalisation du mutant de la première cassette ATP dans le vecteur pSP64TN ABCAI KM donnant lieu à la construction pSP64TN ABCAI MM vérifiée par séquençage. 2.3.4. K1892R Une construction équivalente à pSP64TN ACB1KM a été réalisée suivant le même mode opératoire à la distinction de la nature de la mutation consistant à remplacer la lys en arginine (AAG->AGG). 2.3.5. #HH1 Une construction visant à déléter le segment HH1 et une partie du domaine régulateur a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCAI wt comme matrice. A ABCAl spécifique 5' sens : ne : 2778-2795 B : 3' antisens contenant trois mutations (dont deux silencieuses) introduisant une mutation ponctuelle (K1285G) créant un site unique NruI en gras souligné : GAAACCCTÇGCGACTCCGTC : ne 4036-4055 (SEQ ID NO : 26) C : 5' sens complémentaire de B : GACGGAGTCGCGAGGGTTTC : ne 4055-4036 (SEQ ID NO :27) D ABCA1 spécifique 3' antisens : ne :6049-6033 Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/HpaI de pSP64TN ABCA1 wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1KG) est séquencée puis digérée Bst1107I/NruI et religuée sur ellemême (pSP64TN ABCA1 AHH1) : la délétion est de 132pb soit 44aa. 2.3.6. #R Une construction visant à déléter le domaine régulateur (R) a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCA1 wt comme matrice pour l'amplification. A ABCA1 spécifique 5' sens : ne : 2778-2795 B : 3' antisens contenant 4 mutations (dont une silencieuse) introduisant une mutation ponctuelle (L1554T) créant un site unique MIuI en gras souligné : GGTTGGCACGCGTAATGGCA ne : 4848-4866 (SEQ ID NO :28) C : 5' sens complémentaire de B : TGCCATTACGCGTGCCAACC ne : 4866-4848 (SEQ ID NO : 29) D ABCA1 spécifique 3' antisens : ne : 6049-6033 Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/HpaI de pSP64TN ABCA1 wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCA1 LT) est séquencée puis digérée BssHII/MIuI et religuée sur ellemême (pSP64TN ABCA1 AR). La délétion est de 1848 pb soit 616 aa. 2. 4 Constructions mutantes dans pBI Toutes les constructions obtenues (MK, KM, MM, #HH1, AR) sont transférées dans pBI ABCA1/GFP en remplaçant le fragment BsrGI/BsrGI de ABCA1 par le fragment équivalent des différentes constructions. pBI ABCA1/GFP MK pBI ABCAl/GFP KM pBI ABCA1/GFP MM pBI ABCA1/GFP #HH1 pBI ABCA1/GFP AR Une construction supplémentaire a de plus été réalisée en délétant un fragment de 549 pb (position 3122-3671) en aval de la première cassette ATP, en digérant pBI ABCA1/GFP par PmII puis religué sur lui-même pBI ABCA1/GFP #Pm##. 3. Obtention de cellules transfectantes stables pour ABCA1/GFP et ses mutants 3.1. Procédure de transfection Les ADNc des différentes constructions ont été purifiés selon la méthode dite de purification au polyéthylèneglycol faisant suite au protocole classique de lyse alcaline (MANIATIS et al.). Les préparations obtenues sont stockées par aliquotes de 20 g à -80 C en acétate de sodium 0,3 M, éthanol 100%. Les cellules utilisées sont des cellules HeLa tet-off (Clontech), cultivées dans du milieu DMEM complet (supplémenté en Sérum de veau f#tal (FCS) 10% pénicilline/streptomycine 50Ul/ml à 37 C 7,5% C02. Les cellules commerciales ont été expandues et congelées en FCS 90%, DMSO 10% au passage 2 et 3 à raison de 2 x 106 cellules par ampoule et stockée en azote liquide. La transfection de ces cellules a été réalisée avec le réactif Fugene# (Boehringer). 5 x 105 cellules sont étalées la veille de la transfection dans un puits d'une plaque 6 puits en DMEM complet. Un aliquote d'ADNc est centrifugé pendant 10 min. à 15000 rpm à 4 C. Le culot est décanté délicatement sous une hotte cellulaire. Le culot ne devant pas trop sécher, il est rapidement resuspendu dans 8 l de H20 millipore stérile à la concentration de 2,5 g/ l. 2,5 g d'ADN sont mélangés à 100 ng de pTKHyg (1/50) (Clontech), vecteur possédant le gène de résistance à l'hygromycine utilisé comme agent de sélection lors de la phase d'établissement des lignées transfectants stables. Le mélange d'ADN est incubé pendant 15 min. avec 5 l de Fugene# préalablement dilué dans 100 ul de DMEM sans FCS ni antibiotiques. Pendant ce temps, les cellules sont lavées 3 fois en DMEM complet et incubées pendant la nuit dans 900 l de DMEM complet auxquels ont été rajoutés les 100 l du mélange Fugene#/ADN. 3. 2. Sélection/Expansion Le surnageant est ensuite éliminé, les cellules sont ensuite lavées deux fois en DMEM complet. Les cellules sont ensuite incubées à nouveau pendant deux heures. Les cellules sont ensuite décrochées en trypsine EDTA et réparties en 7 boîtes de pétri de diamètre 10 cm. Parallèlement, trois lamelles en verre sont ensemencées avec 2,5 x 104 cellules afin de vérifier le pourcentage de transfection par observation des cellules en immunofluorescence directe (constructions GFP) ou indirecte (construction wt). La sélection en hygromycine (200 g/ml) débute deux jours après l'expansion. Les cellules sont en général sélectionnées environ deux semaines, aboutissant à l'apparition de clones cellulaires qui sont repiqués au moyen de cylindres de clonage puis transférés dans des plaques 96 puits afin de débuter leur expansion (96 puits/24 puits/6 puits/flasque 50 ml...). 3. 3 Criblage des clones On a pu estimer que en général, 85% des clones sélectionnés étaient en moyenne des clones faussement positifs, ayant intégré uniquement le vecteur de sélection. Parmi les 15% restant, nous devons choisir le meilleurs clone cellulaire. Pour cela, un premier tri est effectué juste après le repiquage en observant ces cellules sous un microscope à fluorescence inversée, donc sur des cellules vivantes mais dont le milieu de culture a été provisoirement remplacé par de tampon Ringer, BSA 1%. Dans un second temps, les clones sont criblés par cytométrie de flux : au cours de l'expansion, deux puits de 6 sont ensemencés avec la moitié d'un puits de 24 (passage précédent). L'un des deux puits de 6 est destiné à la congélation du clone (en attente). Le second est décroché en trypsine EDTA. Le culot cellulaire obtenu après inactivation de la trypsine est rincé deux fois en PBS IX sans ca et Mg puis les cellules sont fixées en solution PBS IX, PAF 1%, EDTA 5 mM. Les cellules sont ensuite analysées suivant deux critères : l'intensité de la fluorescence et la clonalité de la population cellulaire. Les résultats obtenus sont ensuite confirmés par immunofluorescence directe et immunoprécipitation avec un antisérum de lapin spécifique d'une protéine recombinante portion de la première cassette ATP de ABCA1 (ser 16 : 1/500). Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules est lavé en PBS 1 X froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec triton (100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X 100). Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C et le surnageant post nucléaire est ensuite nettoyé trois fois pendant 30' sous agitation à 4 C avec 100 l de Protéine A Sépharose (PAS) (50% v/v en Tampon A sans triton) afin d'éliminer le bruit de fond de fixation. Le surnageant nettoyé est ensuite incubé une heure en présence de sérum 16 (1/500ème) puis de 100 l de PAS. Le culot de PAS-Anticorps-Antigène est ensuite lavé trois fois en tampon A avec triton, trois fois en tampon A sans triton. Les complexes sont ensuite solubilisés en tampon de Laemmli pour SDS-PAGE supplémenté avec de l'urée 8 M. Les échantillons sont dénaturés 5' à 50 C et chargés sur un gel SDS-PAGE 6%.La bande revelée est de = 250 kDa (ABCA1# 220 + GFP 30). Dans le cas particulier de constructions non GFP, pBI ABCA1 wt, le criblage a été réalisé par Western blot avec le Serum 16. Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules est lavé en PBS IX froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec triton. Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C. La quantité protéique du surnageant post nucléaire est quantifié selon la méthode de Lowry (?) (KitBlorad). 20 g de lysat total sont chargés sur un minigel SDS-PAGE 6% en tampon de charge Urée 8 M. Le gel est ensuite dégorgé 15' en tampon de transfert (Tris, Glycine, Méthanol 20%), préalable au transfert humide sur membrane de nitrocellulose pendant une nuit à 0,5A constant. La membrane révélée au rouge ponceau est ensuite saturée en PBS IX, Lait 5%, Tween 20 0,1% pendant une heure à température ambiante. La membrane est ensuite incubée une nuit en PBS 1 X, Lait 1%, Tween 20 0,1% en présence de sérum 16 (1/500ème). La membrane est ensuite lavée 5 fois en PBS1X, Tween 20 0,1 % puis incubée avec un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase 1/1000ème) pendant une heure à température ambiante. La membrane est à nouveau lavée 5 fois en PBS 1 X, Tween 20 0,1%. La membrane est révélée avec le Kit ECL (Pharmacia). Dans ce cas, les clones sont criblés selon l'intensité de la bande apparaissant à 220 kDa par rapport à un échantillon témoin. La clonalité est vérifiée par immunofluorescence (Luciani and Chimini EMBO). 4. Marquage à l'annexine V à l'état basal Les cellules sont lavées une fois en PBS 1X et décrochés à la trysine EDTA pendant 3' à 37 C. La trypsine est inactivée avec 5 volumes de DMEM complet. Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4 C, lavées une fois en DMEM, et une fois en tampon Annexine V (10 mM Hepes NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCL2). Le culot cellulaire est resuspendu à la concentration de 106 cellules/ml en tampon Annexine V. 106 sont incubées en présence de 1 l d'Annexine V-Cy5 pendant 30' à 4 C à l'obscurité. Les cellules sont ensuite lavées une fois en tampon annexine V et fixées avec 200 l de solution tampon AnnexinV IX/paraformaldéhyde 1%. 5. Propriétés des cellules HeLa exprimant le transporteur ABCA1 Matériel et méthodes Cellules Trois clones ont été étudiés, les cellules HeLa non transfectées (cellules HeLa), des cellules HeLa transfectées avec le précurseur murin de l'interleukine 1~ et un gène de résistance à l'hygromycine comme contrôle de transfection (cellules 6C) et des cellules HeLa transfectées avec une construction couplant le gène ABCAI murin et le gène de la Green Fluorescence Protein (GFP) plus un gène de résistance à l'hygromycine (cellules AG2). Les cellules sont cultivées dans un milieu DMEM contenant 10% de FCS, 1% de Pénicilline et streptomycine (+200 ug/ml d'hygromycine pour les cellules 6C et AG2) à 37 C en présence de 5% de CO2. Lyse des cellules La lyse des cellules s'effectue après 2 rinçages au PBS dans une solution 0,2% SDS. Détermination de la concentration protéique Le protocole de détermination de la concentration protéique est dérivé de la méthode de Smith (SIGMA procédure No. TPRO-562) qui utilise la propriété à réduire le Cu II en Cu I d'une manière dépendante de leur concentration. L'acide bicinchroninique est utilisé pour révéler l'apparition de Cu I avec lequel il forme un complexe qui absorbe à 562 nm. Extraction lipidique Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple I. Détermination de la concentration de cholestérol Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1. Dosage des phospholipides Réalisée dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1. Efflux de Cholestérol et phospholipides contenant de la Choline Les cellules sont transférées dans des plaques de 12 puits (15000 cellules HeLa, 15000 cellules 6C, 40000 cellules AG2 par puits) le premier jour. La suite du protocole est identique à celui exposé à l'exemple 1. Résultats Analyse lipidique L'analyse lipidique des trois types cellulaires révèle une constance au niveau des phospholipides totaux. Mais l'on note une augmentation de 25% des SPM chez les cellules AG2 par rapport aux cellules 6C ou HeLa et une diminution de 20% des PC chez les cellules AG2 par rapport aux cellules 6C ou HeLa. Le ratio SPM/PC passe de 0,35 chez les cellules HeLa à 0,6 chez les cellules AG2. De plus, il apparaît chez les cellules transfectées par ABCA1 un pic (aire inconnue) qui n'est pas présent dans les standards utilisés et dont la composition n'a pas été rapportée dans la littérature, ce composé semble augmenter de 2 à 5 fois suivant les expériences. En revanche, la concentration en cholestérol ne montre pas de différence significative entre les trois types de cellules. Efflux de Cholestérol et phospholipides contenant de la Choline Les incorporations de cholestérol et de choline ne sont pas différentes suivant le type cellulaire (Figures 17 et 18). Les cellules AG2 montrent une augmentation de l'efflux de phospholipides contenant de la choline significative par rapport aux cellules HeLa et 6C en présence d'Apo AI (+85%) ou de HDL (+50%) (Figure 16). EXEMPLE 4 : outils de détection de transporteurs ABCA Des outils de détection peuvent être obtenus sur la base des motifs spécifiques identifiés au Tableau II. La définition de paires d'oligonucléotides dégénérés ayant pour cible les séquences codant lesdits motifs permettent d'amplifier des régions génomiques ou des ADNc par amplification PCR. Pour l'amplification génomique, la stratégie exploite la conservation de la position des introns, parmi les différents transporteurs ABCA, chaque paire d'amorces étant adjacente à une limite exon-intron. Dans la mesure où la taille des introns est variable parmi les différents transporteurs ABCA, le produit d'amplification attendu est une échelle de bandes multiples résultant de l'amplification des gènes correspondants. Pour l'amplification de l'ADNc, le résultat attendu de l'amplification est une bande unique contenant différentes séquences issues de chacun des transporteurs exprimé dans la cellule ou le tissu d'intérêt. Exemple d'oligonucléotides pour le ciblage de gènes ABCA au niveau des motifs spécifiques NBD2 : paire GYCP : GGNTAYTGYCCNCARTTYGA (SEQ ID NO :30) paire YSGG : CKYTTRTTNCCNCCRCTRTA (SEQ ID NO :31), dans lesquelles R = A ou G ; Y = C ou T ; N = A, C, G ou T. Les conditions de la PCR sont les suivantes, pour 30 cycles : dénaturation 5 min à 95 C pour le premier cycle et 1 min 30 pour les autres, suivie d'une hybridation à 54 C pendant 1 min et d'une élongation à 72 C pendant 5 min (voir schéma sur la figure annexée). REVENDICATIONS 1 ) Utilisation d'un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins l'un des allèles du gène est inactivé par troncature au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1). 3 ) Utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu d'un mammifère non-humain recombinant pour le gène codant un transporteur de type ABCA, lesquelles cellules sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un allèle dudit gène inactivé, de préférence, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1), pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. 4 ) Procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'extraction d'un échantillon biologique à partir d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP ; - la mise en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler ; - la mesure du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. 5 ) Vecteur de recombinaison homologue d'un gène d'un transporteur de type ABCA de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique issue d'un gène codant un transporteur de type ABCA, inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDI). 6 ) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons 17 à 22 correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP du transporteur ABCA1. 7 ) Utilisation d'un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA de mammifère, comprenant une séquence nucléotidique incluant un gène sélectionné dans le groupe constitué par : - le gène sauvage d'un transporteur de type ABCA et - les gènes d'un transporteur de type ABCA, mutés au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP (NBD1 ou NBD2), pour la transformation génétique d'une cellule eucaryote convenable. 8 ) Vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication dans une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection des cellules eucaryotes transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée et une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP. 9 ) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker de la première cassette de liaison à l'ATP. 10 ) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker des deux cassettes de liaison à l'ATP. Il') Vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques et les ADNc codant les transporteurs ABCA1 à ABCA4 et ABCAX. 12 ) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence génomique (SEQ ID NO :2) et la séquence d'ADNc (SEQ ID NO :1) codant le transporteur ABCAX. 13 ) Cellules eucaryotes hôtes obtenues par transformation génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 8 à 12. 14 ) Cellules eucaryotes hôtes selon la revendication 13, caractérisées en qu'elles sont constituées par des cellules HeLa transfectées de manière stable par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, contenant le gène codant un transporteur de type sauvage ou muté et le gène codant la protéine GFP. 15 ) Méthode de production de mammifères non-humains recombinants, porteurs d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1), caractérisée en ce que : - l'on tronque un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBD1) ; - l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique d'un mammifère non-humain du même type, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle tronqué ; - l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons d'un mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des événements de recombinaison homologue ; puis - l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifère non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques ; et - l'on obtient à la génération FI des mammifères non-humains recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains recombinés homozygotes, reconnaissables à la présence du marqueur. 16 ) Kit ou trousse d'évaluation d'une substance apte à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - une culture de cellules issues d'au moins un mammifère nonhumain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison de l'ATP (NBD1) ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du transporteur de type ABCA. 17 ) Transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence SEQ ID NO :1 ou la séquence SEQ ID NO : 2 et correspond au transporteurs ABCAX. 18 ) Transporteur ABCA muté, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation ponctuelle au niveau de l'une des cassettes de liaison à l'ATP, de préférence au niveau des motif A de Walker. 19 ) Procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend : - l'administration à au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP ; - l'extraction d'un échantillon biologique à partir dudit mammifère non-humain ; - la mesure in vitro du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et - la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. 20 ) Réactifs de détection de séquences nucléotidiques spécifiques des transporteurs de type ABCA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences de 15 à 50 nucléotides amplifiant les fragments codant les séquences spécifiques au transporteur ABCA, telles que définies dans le Tableau II, et notamment les séquences SEQ ID N0:30 et N0:31.