Brevet FR2787467A1 — publié le 20000623

Méthode et kit d'identification de Plasmodium falciparum L'invention a pour objet une méthode et un kit de diagnostic pour l'identification de Plasmodium falciparum dans un isolat. Plasmodium falciparum, agent étiologique de la forme la plus grave du paludisme, cause de 1,5 à 2,7 millions de décès chaque année, principalement chez des enfants de moins de 5 ans en Afrique sub-saharienne (OMS, 1997). L'incidence du paludisme dans le monde est estimée à 300-500 millions de cas cliniques par an. On estime qu'environ 2300 millions de personnes habitent dans des zones où existe un risque de paludisme. Ces zones endémiques se trouvent dans 100 pays, le Venezuela inclus. Un diagnostic précoce et un traitement rapide et approprié de la maladie sont indispensables pour prévenir la mortalité. L'identification du parasite du paludisme est habituellement effectuée par le diagnostic microscopique traditionnel, qui est peu coûteux et d'utilisation facile sur le terrain. Néanmoins, la sensibilité de la méthode microscopique exige des examinateurs très qualifiés, et prend beaucoup de temps quand un grand nombre d'échantillons doit être examiné. Une telle méthode n'est donc pas appropriée pour des aperçus épidémiologiques à grande échelle. D'autres méthodes de diagnostic du paludisme sont utilisées actuellement, parmi lesquelles : la technique d'orange d'acridine, le Quantitative Buffy Coat (QBC), les méthodes immunologiques pour la détection d'anticorps anti-Plasmodium et d'antigènes plasmodiaux dans le sang total et les techniques d'identification moléculaire de l'ADN parasitaire. Les marqueurs RAPD ont été largement utilisés dans l'étude de la diversité génétique et de la structure de population de plusieurs protozoaires pathogènes pour l'homme. La technique RAPD consiste à amplifier des fragments d'ADN génomique avec une amorce courte unique (10 bases de longueur en général) dont la séquence est déterminée aléatoirement. Cette méthode permet de détecter rapidement des polymorphismes utiles pour l'identification génétique d'isolats et permet aussi d'établir une cartographie génomique. Le polymorphisme RAPD est détecté par la présence ou l'absence des bandes amplifiées dans différents isolats de parasite, ou par des variations de taille ou d'intensité dues aux différences dans le site d'hybridation de l'amorce, provoquées par mutation, délétion ou insertion de séquences d'ADN. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à mettre en évidence que l'utilisation d'un nombre limité de marqueurs RAPD pertinents était suffisant pour identifier Plasmodium falciparum dans un isolat donné, quelle que soit sa variabilité génétique. L'invention a donc pour but de fournir une méthode et un kit, pour l'identification de Plasmodium falciparum dans un isolat, et l'établissement d'un disgnostic fiable et de mise en oeuvre aisée. La méthode d'identification de Plasmodium falciparum selon l'invention, qui comprend l'identification d'amplicons d'ADN génomique provenant d'un isolat à l'aide de marqueurs RAPD, est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'amorces d'amplification, permettant la discrimination de Plasmodium falciparum par rapport aux autres espèces de Plasmodium. Conformément à l'invention, on utilise ainsi des amorces capables d'amplifier des fragments d'ADN de Plasmodium falciparum de 1150 bases environ, tels qu'identifiés en électrophorèse pour des amplicons d'isolats de Plasmodium falciparum avec des amorces de séquence U10 5'ACCTCGGCAC3' ou R6 5'GTCTACGGCA3', dans les conditions décrites dans la partie exemple. De telles amorces comportent avantageusement 8 à 15 nucléotides, de préférence 10 nucléotides. La méthode selon l'invention est plus spécialement caractérisée par l'utilisation d'un jeu de 2 amorces RAPD désignées par U10 et R6, répondant respectivement aux séquences : U10 5'ACCTCGGCAC3' R6 5'GTCTACGGCA3' Avantageusement, les amorces RAPD choisies génèrent des profils d'amplification nets et très reproductibles. De manière remarquable, ces amorces sont suffisantes à elles seules pour identifier toutes les souches de Plasmodium falciparum. De manière générale, les amorces utilisées selon l'invention peuvent être obtenues par synthèse. Selon un aspect avantageux, la technique RAPD fournit des fragments d'ADN spécifiques pouvant être isolés et analysés par séquençage. Ils donnent donc la possibilité de synthétiser soit des sondes spécifiques, soit des amorces spécifiques pour l'élaboration de PCRdiagnostics. Leur séquençage permet de vérifier leur valeur en tant que marqueur synapomorphe. L'invention vise également des kits ou trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre d'une méthode d'identification telle que définie ci-dessus. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent : - un jeu d'amorces RAPD tel que défini cidessus, en particulier au moins les 2 amorces RAPD U10 et R6 avec, le cas échéant, - les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils électrophorétiques, et - une notice d'utilisation. De tels kits peuvent être aisément mis en oeuvre en routine au laboratoire, en permettant d'effectuer un processus rapide d'identification. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans l'exemple ci-après avec la description de modes de réalisation et d'application de l'invention. Dans cet exemple, il est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent, respectivement, les profils d'amplification d'isolats naturels de Plasmodium falciparum de différentes origines géographiques, et d'autres groupes taxonomiques, avec des amorces selon l'invention. Exemple : Marqueurs pour l'identification de Plasmodium falciparum dans des isolats On rapporte ci-après les résultats d'études par la technique RAPD, effectuées sur des stocks de Plasmodium falciparum. 1 - Echantillon étudié Les échantillons de sang ont été prélevés dans plusieurs communes de l'état de Bolivar, région d'endémie majeure du paludisme au VENEZUELA. Soixante-quinze isolats frais de Plasmodium falciparum ont été rassemblés. Ces échantillons de sang proviennent de mineurs et d'Amérindiens infectés, présentant une parasitémie modérée détectée par microscopie et n'ayant pas reçu de traitement pendant les 14 jours précédents. Les parasites ont été cultivés pendant 24 à 36 heures sur le terrain (Trager et Jensen, 1976, Human malaria parasites in continous cultures, Science 193, 673-675) afin d'augmenter la parasitémie et ont été cryopréservés immédiatement . Sur les 75 échantillons initiaux de Plasmodium falciparum du Venezuela, 59 ont été sélectionnés. Tous ceux qui montraient des infections mixtes par les marqueurs génétiques (MSP-1, MSP-2, RESA et CSP) ont été éliminés, ainsi que ceux qui ne donnaient pas de bons signes d'amplification aux RAPD. 13 isolats de Plasmodium falciparum provenant du Kenya, deux clones de référence de Plasmodium falciparum [3D7 (Afrique) et HB3 (Honduras) ], et 4 autres espèces de Plasmodium (P. cinomolgy, P. vivax, P. malariae et P. chabaudi) ont été inclus dans l'échantillon. La congélation des isolats cultivés a été effectuée en privilégiant les prélèvements ayant une parasitémie modérée ou élevée. L'isolat doit présenter une grande proportion de stades jeunes (trophozoites), car les formes âgées (schizontes) sont détruites à la décongélation. Après centrifugation (500 g pendant 5 min à 4 C), le culot d'hématies parasitées est remis en suspension dans un volume de solution de congélation V/V (28 % de glycérol ; % de sorbitol ou de mannitol ; 0,65 % de NaCl), stérilisé par filtration sur une membrane de 0,22 m de porosité. La suspension cellulaire est délicatement homogénéisée et répartie en lots de 1 ml dans des tubes de congélation. Les aliquots sont congelés immédiatement par immersion dans l'azote liquide. 2.- Technique d'amplification aléatoire de l'ADN (RAPD) . Extraction de l'ADN génomique L'ADN génomique du parasite est extrait à partir des hématies infectées. Le culot parasitaire est repris dans un volume de 150 /il d'eau stérile ajoutée par petits volumes. La solution est homogénéisée par pipetages successifs. Les parasites sont lysés en ajoutant 450 /il de tampon de lyse (Tris-HCL pH 8,50 mM, EDTA pH 8,50mM, NaCl 100 mM, SDS 1 %) en présence de 200 g de Protéinase K# (Boehringer Mannheim, Allemagne). La solution est mélangée en agitant doucement le tube à la main puis incubée à 42 C pendant 45 min. L'ARN est digéré en présence de 2 g de RNase à 37 C pendant 15 min. Les protéines sont ensuite extraites 2 fois avec 600 l de phénol saturé et tamponné, puis avec du phénolchloroforme (V/V) et enfin avec du chloroforme. L'ADN est précipité en présence de NaCl 0,1 M avec 2 volumes d'éthanol absolu à -20 C pendant une nuit. Il est centrifugé à 15800 g, et le culot est lavé 2 fois à l'éthanol à 70 %. Il est ensuite remis en solution et sa concentration est mesurée par spectrophotométrie(DO 260 nm x 50 x facteur de dilution = Concentration d'ADN en g/ml ou ng/1). La quantité d'ADN obtenue varie entre 1,25 et 31 g. Les stocks d'ADN sont alors conservés à -80 C. La concentration et la pureté de l'ADN sont vérifiés par mesure de l'absorbance de l'ADN extrait. . Amplification Les réactions d'amplification ont été conduites dans un volume final de 60 /il selon le protocole communiqué par Williams et al (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18,6531-6535, 80 ng d'ADN parasitaire ont été amplifiés dans un tampon de réaction contenant 0,2 g d'amorce (Operon Technologies), 4 x 100 m dNTP, 1, 5 mM MgCl2 en présence de 3 U de Taq polymérase (Boehringer Mannheim, Allemagne). . Amorces : On utilise les amorces U 10 et R6 de séquence : U10 5'ACCTCGGCAC3' R6 5'GTCTACGGCA3'; . Cycles d'amplification : Les amplifications sont réalisées sur un thermocycleur PTC-100 ou PTC-200 (MJ Research Inc.) Le programme d'amplification comprend . une dénaturation initiale de l'ADN (5 mn à 95 C), suivie de 45 cycles de . 1 min à 94 C 1 min à 36 C, et 2 min à 72 C. L'élongation finale est de 7 min à 72 C. . Révélation Les fragments d'ADN amplifiés sont séparés selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,6 % dans le tampon de migration TAE (40 mM Tris- (acétate, 1 mM EDTA). 20 l de chaque échantillon sont mélangés avec 3 /il de tampon de charge (0,25 % de bleu de bromophénol, 0,25 % de xylène cyanol 40 % p/v de sucrose, puis déposés dans un puits du gel. La migration est effectuée pendant 5 h sous une tension de 3, 2 volts par cm. Le gel est ensuite coloré dans un bain de TAE contenant du bromure d'éthidium (0,5 g/ml), visualisé sous UV (234 nm) et photographié. 3. Résultats Les figures 1 et 2 réunissent un échantillon des profils d'amplification obtenus avec les amorces U-10 et R6, respectivement. L'amplification par chaque amorce a été faite sur de l'ADN de Plasmodium falciparum du Kenya (lignes 1 à 6), T. cruzi, P. vivax, P. malariae, P. cynomolgi, P. chabaudi (lignes 7 à 11 respectivement), clones de référence de Plasmodium falciparum (3D7 et HB3) et Plasmodium falciparum du Venezuela (lignes 12 à 17). Les lignes M correspondent aux marqueurs de poids moléculaire. L'examen de ces résultats montre que les amorces U-10 et R-6 donnent des profils identiques dans toutes les souches étudiées de Plasmodium falciparum. Avec l'amorce U-10, toutes les souches de Plasmodium falciparum ont donné le même profil génétique, mettant en évidence la bande d'environ 1150 pb, indépendamment de l'origine géographique de la souche, tandis que les autres parasites étudiés ont montré des profils génétiques très variables et complètement différents de ceux générés par Plasmodium falciparum. Ce même phénomène a été observé avec l'amorce R-6. Les résultats des produits d'amplification avec ces amorces, suggèrent qu'elles amplifient des régions très conservées hautement répétées dans le génome de Plasmodium falciparum provenant des isolats vénézueliens et kenyans. Ces résultats mettent en évidence le caractère spécifique des amorces U-10 et R-6 vis-à-vis de Plasmodium falciparum, quelle que soit son origine géographique et permettent aussi d'identifier spécifiquement les différents groupes taxonomiques étudiés. Ces résultats peuvent être avantageusement exploités pour rechercher et identifier la séquence génétique des fragments spécifiques générés par ces amorces (U-10 et R-6) dans le génome de Plasmodium falciparum. Le clonage et le séquençage de ces fragments de RAPD, permettra alors de développer des méthodes diagnostics de PCR spécifiques de cette espèce parasitaire. REVENDICATIONS 1/ Méthode d'identification de Plasmodium falciparum caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification d'amplicons d'ADN génomique provenant d'un isolat à l'aide de marqueurs RAPD, est caractérisée par la mise en oeuvre d'un jeu limité d'amorces d'amplification, permettant la discrimination de Plasmodium falciparum par rapport aux autres espèces de Plasmodium. 2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise des amorces capables d'amplifier des fragments d'ADN de Plasmodium falciparum de 1150 pb environ, tels qu'identifiés sur des profils électrophorétiques d'amplicons résultant de l'amplification de fragments d'ADN génomique de Plasmodium falciparum avec des amorces de séquence U10 5' ACCTCGGCAC3' ou R6 5'GTCTACGGCA3'. 3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'on utilise un jeu de 2 amorces répondant aux séquences 5' ACCTCGGCAC3' et 5'GTCTACGGCA3'. 4/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les amorces comportent de 8 à 15 nuclétotides, de préférence 10 nucléotides. 5/ Kits ou trousses de diagnostic caractérisés en ce qu'ils comprennent : - un jeu d'amorces RAPD selon la revendication 1 ou 2, en particulier les 2 amorces RAPD selon la revendication 3, avec, le cas échéant, - les réactifs, solutions, et tampons, pour l'établissement des profils électrophorétiques, et - une notice d'utilisation.