Brevet FR2789398A1 — publié le 20000811

Procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes incorporés dans un produit solide. L'invention concerne le domaine de la microbiologie ainsi que le domaine de l'alimentation animale. Plus précisément, l'invention se rapporte à un procédé permettant de dénombrer de façon rapide les microorganismes incorporés dans un produit solide. L'invention trouve tout particulièrement son application pour la séparation rapide et le dénombrement des bactéries, composantes de base d'un produit probiotique, stabilisées sur un support végétal destiné à l'alimentation animale. Toutefois, on comprendra que la présente invention pourra également être appliquée à d'autres types de produits solides que de tels additifs probiotiques. Les produits probiotiques peuvent être définis comme des produits incluant des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés dans un certain nombre, ont un effet bénéfique sur la santé. Les microorganismes répertoriés comme ayant des propriétés probiotiques sont essentiellement des bactéries et des champignons microscopiques appartenant à quelques espèces de différents genres. Ainsi, les lactobacilles qui sont des bactéries lactiques naturellement présentes dans le tractus gastro-intestinal des mammifères, sont très utilisées à titre de probiotiques pour leur aptitude à résister à l'ensemble des barrières physiologiques lorsqu'elles intègrent l'organisme de l'hôte. Afin d'assurer une viabilité maximale des microorganismes probiotiques, les fabricants ont développé diverses approches. La première consiste à sélectionner des bactéries sporulées, c'est-à-dire naturellement protégées par leur endospore, comme certains Bacillus. Une deuxième approche consiste à protéger les cellules dans une coque protectrice par un procédé technologique dit d'encapsulation. Cette technique est très utilisée pour les levures. Encore une autre approche consiste à adapter les cellules de microorganismes aux chocs osmotiques par déshydratation progressive du milieu de culture puis à les stabiliser sur un support végétal présentant des micro-cavités dans lesquelles les 2 2789398 cellules de microorganismes se fixent. Une telle technique assure un taux de survie maximal de 90% des microorganismes au cours du stockage de l'additif probiotique et de 100% après son incorporation dans l'aliment fini. La présente invention se rapporte au dénombrement des microorganismes dans ce type d'additifs. En effet, il est reconnu que les microorganismes d'intérêt probiotiques doivent parvenir vivants dans l'intestin des animaux auxquels ils sont administrés, à une teneur minimale de 105 UFC (Unités Formant Colonies) par gramme pour procurer des effets bénéfiques. Dans ce cadre, il a déjà été envisagé d'effectuer un dénombrement de ces microorganismes par microscopie à épifluorescence. Cette technique est d'ailleurs très utilisée pour le dénombrement des microorganismes pathogènes dans l'eau de boisson, pour le dénombrement de la " flore totale " dans le lait et, d'une manière générale pour le dénombrement de microorganismes contenus dans un liquide. Jusqu'ici la généralisation de cette technique aux produits solides s'est toutefois heurtée aux difficultés de filtration des suspensions et d'élimination des débris solides avant la phase d'observation. Walls et al. ont proposé dans un article paru en 1990 dans "Letters in Applied Microbiology 10,23 - 26" de séparer les microorganismes de la viande crue par digestion enzymatique à l'alcalase. Rodriguez Szulc et al. ont quant à eux proposé, dans un article paru en 1996 dans "Journal of Applied Bacteriology , 673-680" de détacher les bactéries de la surface de la viande de boeuf par action enzymatique et centrifugation différentielle. Toutefois, ces différentes techniques utilisant des digestions enzymatiques et des centrifugations différentielles se sont révélées peu adaptées pour extraire rapidement les lactobacilles inclus à l'intérieur de la matrice complexe des additifs probiotiques stabilisés sur support végétal. Il a également été utilisé une séparation imunomagnétique mais une telle technique n'a pas été retenue car trop coûteuse Le principal objectif de la présente invention est donc de définir un procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes intégrés dans une matrice solide, tel que notamment un additif probiotique seul ou 3 2789398 incorporé dans un mélange, dans le but de pouvoir effectuer facilement un dénombrement fiable et reproductible des microorganismes, notamment par épifluorescence. Cet objectif est atteint grâce à un procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes incorporés dans un produit solide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à broyer un échantillon dudit produit solide dans un liquide de suspension, effectuer une sonification basse fréquence du broyat obtenu, effectuer une centri-filtration du broyat puis une centrifugation du filtrat, reprendre le culot obtenu lors de ladite étape de centrifugation dans un liquide et effectuer un dénombrement desdits microorganismes. Le procédé selon l'invention se caractérise essentiellement par l'utilisation d'une étape de sonification basse fréquence permettant de séparer les microorganismes du reste du produit solide sans abîmer ceuxci. Il est en effet impératif de ne pas tuer ces microorganismes lors des étapes préparatives audit dénombrement. Le procédé comprend également une étape de centrifiltration. Une telle étape de centrifiltration a été définie comme étant la plus efficace, en combinaison avec la sonification, pour extraire les cellules de microorganismes des cavités du produit solide en limitant la présence de grosses particules. Une telle étape de centrifiltration s'est avérée en effet plus efficace notamment comparativement à une décantation, une simple centrifugation ou une filtration. La combinaison de la centrifiltration avec la sonification permet de décrocher les microorganismes des particules de produits solides et de disperser efficacement les cellules en les séparant les unes des autres, en évitant ainsi la formation d'amas de microorganismes. Préférentiellement, cette étape de centrifilitration sera effectuée en utilisant un filtre en papier cellulosique. Il a en effet été constaté que ce type de filtre donnait les meilleurs résultats. Comme indiqué ci-dessus, le procédé selon la présente invention sera particulièrement utile lorsque l'on envisagera d'effectuer un dénombrement des microorganismes par épifluorescence. Il pourra toutefois être utilisé 4 2789398 préalablement à d'autres étapes de dénombrement, notamment un dénombrement par ensemencement du culot sur milieu gélosé. Egalement comme déjà mentionné ci-dessus, le procédé selon l'invention pourra être appliqué à différents types de produits solides.Toutefois, préférentiellement, ce produit solide sera un additif probiotique sur support végétal destiné à l'alimentation animale, c'est- à-dire un composé végétal présentant des cavités à l'intérieur desquelles sont logées des bactéries telles que notamment des lactobacilles. En ce qui concerne les paramètres de fréquence de l'étape de sonification, ceux-ci pourront varier notamment en fonction du type de microorganismes contenus dans le produit solide auquel le procédé sera appliqué et en fonction du produit. Toutefois, lorsque le microorganisme en question sera un lactobacille et le produit solide un additif végétal, la sonification basse fréquence sera mise en oeuvre à une fréquence comprise entre 5 watts et 150 watts. Préférentiellement cette fréquence sera de 40 watts. Ladite étape de centrifiltration sera quant à elle préférentiellement mise en oeuvre pendant au moins une minute à au moins 1000 tr/mn tandis que ladite étape de centrifugation sera mise en oeuvre préférentiellement pendant au moins une minute à au moins 10 000 tr/mn. Afin d'optimiser le procédé on notera qu'une sonification sera également effectuée lors de l'étape de reprise du culot. Egalement selon une variante préférentielle du procédé, on ajoute dans le liquide de supension du broyat au moins un agent tensio-actif. L'ajout d'un tel agent tensioactif dans le liquide de suspension permet de limiter la réagrégation des cellules et de bien les disperser sur la membrane de centrifiltration. Le procédé selon la présente invention va maintenant être décrit en référence à un exemple non limitatif de réalisation de celle-ci. Le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur des échantillons d'additifs probiotiques préparés à partir d'un lait fermenté par deux souches sauvages de lactobacilles (Lactobacillus rhamnosus et Lactobacillus acidophilus). Ces souches sont déposées à l'Institut Pasteur de Paris 2789398 respectivement sous les numéros de collection CNCM MA 27/6B et CNCM MA 27/6R. Ces bactéries sont incorporées sur un support végétal expansé constitué en partie par du maïs expansé.Cet additif probiotique se présente sous la forme d'une poudre beige à gros grains. 10 g de cette poudre ont été introduits dans un sac plastique d'un broyeur de marque STOMACHER avec 90 ml de diluant. Ce diluant comprend un agent tensioactif constitué par le Tween 80 permettant de limiter l'agrégation des bactéries. Le produit solide ainsi dilué est homogénéisé pendant 2 minutes dans le broyeur. ml de ce broyat sont ensuite transférés dans un tube plastique stérile et subissent une sonification à l'aide d'un sonificateur Vibracell (marque déposée) commercialisé par la société BIOBLOCK Scientific, pendant une durée de 10 secondes à une fréquence de 40 watts. L'échantillon sonifié subit ensuite une centrifiltration pendant 1 mn à 1000 tr/mn dans un Chemfiltre (marque déposée) commercialisé par la société CHEMUNEX à Maison-Alfort. Cette centrifiltration a été effectuée sur papier cellulosique présentant des pores de 20 micromètres. La combinaison de la sonification de la centrifiltration permet d'optimiser l'extraction des cellules des cavités végétales du produit en limitant la présence de grosses particules et tout en maintenant un très grand degré de viabilité desdites bactéries. Le filtrat récupéré lors de l'étape de centrifiltration est ensuite centrifugé dans un microtube pendant 1 mn à 10 000 tr/mn dans une centrifugeuse Sigma 3k10, commercialisée par la société BIOBLOCK Scientific. Cette centrifugation permet de récupérer les cellules bactériennes. Le culot de centrifugation est ensuite repris dans un diluant avec ou sans préincubation. Un traitement de sonification est nécessaire pour bien resuspendre ce culot pendant 5 secondes à 25 W. Le dénombrement des lactobacilles contenus dans le culot de centrifugation repris dans le diluant a été évalué par épifluorescence et par 6 2789398 dénombrement sur boîtes de culture. Le dénombrement sur boîtes a été effectué en réalisant une gamme de dilutions à partir de la suspension obtenue à partir du culot et en ensemençant celui-ci sur milieu gélosé spécifique à l'aide d'un ensemenceur spirale. s Un comptage direct par épifluorescence a également été effectué en utilisant comme fluorochromes d'une part le DAPI (4',6-diaminidino-2-2- phénylindole-2HCI) et d'autre part le "Substrat de Viabilité" commercialisé par la société CHEMUNEX à Maison-Alfort. Le premier de ces composés colore en bleu l'ensemble des lactobacilles, morts et vivants tandis que le second ne colore que les vivants. microlitres d'une solution de DAPI à 30 microgrammes par ml ont été ajoutés à 2ml de la solution contenant les lactobacilles. Le tout a été incubé mn à l'obscurité puis filtré à travers une membrane isopore. On a ensuite fait agir le " Substrat de Viabilité " avec une période d'incubation de 15 mn à l'obscurité. L'ensemble a été filtré sur membrane et rincé. La membrane a ensuite été séchée à l'air quelques minutes avant d'être déposée sur une lame de verre et les cellules ont été dénombrées au microscope (x 1000) à épifluorescence. Le comptage a été effectué en dénombrant 30 surfaces par membrane. Le mode de réalisation de l'invention ainsi décrite n'a pas pour objet de réduire la portée de celle-ci. En conséquence, il pourra y être apporté de nombreuses modifications sans sortir de son cadre. 7 2789398 REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation rapide et de dénombrement de microorganismes incorporés dans un produit solide caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à broyer un échantillon dudit produit solide dans un liquide de suspension, effectuer une sonification basse fréquence du broyat obtenu, effectuer une centrifiltration du broyat puis une centrifugation du filtrat, reprendre le culot obtenu lors de ladite étape de centrifugation dans un liquide et effectuer un dénombrement desdits microorganismes. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de centrifiltration est effectuée à l'aide d'un filtre cellulosique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que ladite étape de dénombrement desdits microorganismes comprend une étape de dénombrement par épifluorescence. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que ladite étape de dénombrement desdits microorganismes comprend une étape de dénombrement par ensemencement sur milieu gélosé. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que ledit produit solide est un additif probiotique sur support végétal destiné à l'alimentation animale. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que ladite étape de sonification basse fréquence est mise en oeuvre à une fréquence comprise entre 5 watts et 150 watts. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite fréquence est de 40 watts. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que ladite étape de centrifiltration est mise en oeuvre pendant au moins une minute à au moins 1000 tr/min. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que ladite étape de centrifugation est mise en oeuvre pendant au moins une minute à au moins 10 000 tr/mn. 8 2789398 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'une sonification est également effectuée lors de ladite étape de reprise du culot de centrifugation. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que ledit liquide de suspension contient au moins un agent tensioactif.