Brevet FR2787454A1 — publié le 20000623

La présente invention concerne des peptides présentant une forte activité inhibitrice de la topoisomérase Il humaine a et qui trouvent une application en thérapeutique notamment comme antitumoraux. L'ADN topoisomérase Il est une enzyme essentielle à la vie des cellules eucaryotes. Elle change la topologie de l'ADN par coupure transitoire double- brin d'une hélice d'ADN à travers laquelle elle fait passer une autre hélice d'ADN. A l'intérêt biologique de cette enzyme, s'ajoute un intérêt pharmacologique puisqu'elle est la cible privilégiée de nombreux agents antitumoraux (Corbett et Osheroff, Chem. Res. Toxicol., 6, 585, 1993). L'un des problèmes majeurs de la chimiothérapie anticancéreuse actuelle est constitué par le manque de spécificité des agents antitumoraux ciblant la topoisomérase Il. Afin de résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle classe d'inhibiteurs peptidiques de la topoisomérase Il intéragissant sélectivement avec cette enzyme et bloquant son activité catalytique. Frère Gallois et al. ont décrit, dans Eur. J. Biochem., 249, 142, 1997, un fragment de la topoisomérase Il correspondant à la séquence 1013 à 1041 de la topoisomérase Il humaine oa qui présente une activité inhibitrice de la topoisomérase Il. La présente invention vise à fournir des peptides qui présentent une activité inhibitrice supérieure. La présente invention a ainsi pour objet un peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante: Thr - X1 - Leu - Asp - Ile - X2 - X3 - Asp - Leu X4 - Glu - Xs - Arg - Leu 5 10 - Lys - Tyr - Tyr - X6 - X7 - Arg - Lys - Glu - Phe - Leu - X8 - X9 - X1o - Leu - Gly 20 25 dans laquelle: X = Gln ouGlu X2= Leu ou Lys X3= Arg ou Lys X4= PheouTyr X = Leu ou Lys X6= Glyou Glu X = Leu ou Glu )X8= LeuouGlu X9 = Gin ou Lys X10 = Met ou Nle, et ses dérivés protégés pharmaceutiquement acceptables. Par dérivé protégé pharmaceutiquement acceptable, on entend en particulier des dérivés comprenant des groupes N-protecteurs pharmaceutiquement acceptables. Des groupes N-protecteurs pharmaceutiquement acceptables sont notamment les groupes protecteurs de l'attaque en N-terminal des enzymes exopeptidases. Comme exemples de tels groupes on peut citer les groupes acyles tels que les groupes t-butyloxycarbonyle (Boc), tert-amyloxycarbonyle (+ Aoc), benzyloxycarbonyle, benzoyle, acétyle, formyle, propanoyle, butanoyle, phénylacétyle, phénylpropanoyle, cyclo pentylcarbonyle. Les peptides selon l'invention peuvent être préparés de manière classique par synthèse peptidique en phase liquide ou solide par couplages successifs 2o des différents résidus d'acides aminés à incorporer (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N- terminale en phase solide) et dont les extrémités N-terminales et les chaînes latérales réactives sont préalablement bloquées. Comme exemple de groupes bloquant les extrémités N-terminales, on peut citer: Boc, Bpoc, Fmoc. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, un peptide selon l'invention. De telles compositions sont utilisables comme agent antiviral, antibactérien, antiparasitaire ou anticancéreux comme par exemple dans le traitement de tumeurs, de maladies parasitaires telles que la leishmaniose ou la maladie de Chagas ou bien dans le traitement des maladies des voies respiratoires telles que les otites ou pneumonies. La vectorisation préalable du peptide peut s'avérer avantageuse dans la mesure o elle peut favoriser le contact entre le peptide et les cellules ciblées. Les méthodes de vectorisation sont connues de l'homme du métier. L'une de ces méthodes consiste à encapsuler le peptide dans des liposomes tels que des liposomes cationiques. On sait que ces liposomes assurent une protection supplémentaire du peptide vis-à-vis de la dégradation in vivo. La libération lente du principe actif au niveau des zones ciblées est donc ainsi très nettement favorisée. La première étape du processus de transfection des cellules ciblées par le peptide ou du processus de libération du peptide implique la formation d'un complexe entre la paroi lipidique du liposome et le peptide. Après fusion des membranes respectives du liposome et de la cellule, il y a libération du peptide dans le cytoplasme. La préparation de tels liposomes est décrite de façon détaillée dans "Liposome technology", Gregoriadis (CFC Press, NY 1984) ou encore dans "Liposomes", Ostro (Macel Dekker, 1987) ou bien encore dans la publication de Lichtenberg et al. parue dans "Methods Biochem. Anal. 33 337-462, 1988). Dans les liposomes, le peptide est soit dispersé, soit contenu, soit autrement emprisonné dans des corpuscules constitués de couches aqueuses concentriques adhérant à des couches lipidiques. Le peptide est soit contenu dans la phase aqueuse, soit contenu dans la phase lipidique et éventuellement dans chacune des deux phases en fonction de sa solubilité. La phase lipidique peut comprendre notament des phospholipides tels que la lécithine ou la sphingomycéline, des stéroïdes tels que le cholestérol, des tensioactifs tels que le dicétylphosphate, la stéarylamine, I'acide phosphatidique et/ou d'autres matériaux hydrophobes. Le diamètre des liposomes varie de préférence entre 15 nm et 5 pm. On peut également envisager la vectorisation par incorporation du peptide dans les microsphères biodégradables. La préparation des compositions de l'invention est réalisée de façon classique et dépend du mode d'administration envisagé. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les peptides éventuellement incorporés à un vecteur sont administrés par voie transdermique, transmuqueuse ou intratumorale. Les compositions de l'invention se présentent préférablement sous la forme de solutions ou suspensions injectables. Comme véhicule pharmaceutiquement acceptable, on utilisera essentiellement des tampons, une solution saline de tampon phosphate (PBS) ou toute autre solution pour peu qu'elle présente un pH physiologiquement acceptable. On peut également incorporer le principe actif dans une matrice ou un i0 véhicule sous la forme de gel hydraté, par exemple un gel à base de copolymêre oxyde de propylène-oxyde d'éthylène liquide au-dessous de la température ambiante et gélatineux à une température égale ou supérieure à la température ambiante. Avant administration, le gel peut être éventuellement fluidifié. De façon à permettre une libération retardée du principe actif, on peut en variante formuler le peptide dans une composition à libération prolongée. De telles compositions ont été décrites dans la littérature. A cette fin, on peut notamment combiner le peptide à des polymères de l'acide polylactique. Toutes ces compositions peuvent être appliquées localement par injection directe ou bien libérées à partir d'implants ou bien encore diffusées localement à l'aide d'une pompe appropriée. La quantité de peptide à administrer dépend de la nature de la maladie à traiter, de la gravité, des conditions générales du patient, de son âge et de la durée du traitement. L'homme du métier peut facilement déterminer le dosage optimal le mieux adapté au traitement considéré. Exemple 1 Peptide ayant la séquence Thr - Gin - Leu - Asp - lie - Leu - Arg - Asp Leu - Phe - Glu - Leu - Arg - Leu - Lys - Tyr - Tyr - Gly - Leu - Arg - Lys - Glu - Phe - Leu - Leu Gn - Met - Leu - Gly. La synthèse du peptide correspondant a été réalisée par voie chimique en phase solide selon la stratégie Fmoc (9-fluorénylméthoxycarbonyl) sur un synthétiseur automatique Applied Biosystem 432 A en utilisant une résine HMP (4-hydroxyméthyl-phénoxyméthyl-copolystyrène-1% divinylbenzène) et I'activation par l'HBTU (2-(1 H-benzotriazol-1 -yl)-1, 1,3,3tétraéthyluronium hexafluorophosphate). Les extrémités N- et C- terminales ont été laissées libres. La déprotection a été faite par le TFA (acide trifluoroacétique). Le peptide déprotégé est ensuite filtré pour le séparer de la résine et précipité dans l'éther froid). Le peptide a été purifié par HPLC avec un appareillage Beckman System o0 Gold en phase inverse sur une colonne Spherisorb C18 (25x1 cm, 2 pm et 300 ) avec un gradient linéaire de 0 à 100% d'acétonitrile/eau (avec 0,1% de TFA) sur minutes, le débit étant de 4 ml/min. Les fractions présentant simultanément des pics d'absorption maximaux à 220 et 274 nm sont par la suite caractérisées en HPLC analytique et les fractions contenant le peptide pur sont groupées et 1i5 lyophilisées. Le peptide après purification a été caractérisé par: une HPLC analytique en phase inverse avec une colonne C18 Nucleosyl (25x0,46 cm, 5 pm et 300 A) en utilisant un gradient acétonitrile/eau (avec 0,1% de TFA) sur 45 minutes avec un débit de 1 ml/min.; * une analyse de la composition en acides aminés avec un appareil Beckman AAA-6300; * un séquençage sur un appareil Applied Biosystem 477 A utilisant la méthode, de dégradation d'Edman; * une spectroscopie de masse (ESIMS) sur un instrument quadrupole VG Biotech. INHIBITION DE LA TOPOISOMERASE II Test d'activité Deux tests enzymatiques permettent d'estimer l'effet des peptides sur l'activité de la topoisomérase Il: la relaxation de plasmides surenroulés et la décaténation d'ADN de kinétoplastes (Wang, J.C., An. Rev. Biochem., 54: 665- 697,1985; Maxwell, A., Advances in Protein Chemistry, 38: 69-107, 1986; Liu, L.F., Cell, 19: 697-707, 1980). Le peptide de l'exemple 1 inhibe totalement l'activité de la topoisomérase Il humaine a et celle de levure dans les deux tests à une concentration de 0,5 pM. "/er REVENDICATIONS 1. Peptide présentant la séquence d'aminoacides suivante: Thr - X - Leu Asp- lle- X2 - X3 - Asp - Leu - X4 - Glu - X5 - Arg - Leu 10 -Lys - Tyr - Tyr - X6-X7 - Arg-Lys - Glu-Phe - Leu - X8 - X - Xl o - Leu Gly 20 25 dans laquelle: X, = GIn ou Glu X2= Leu ou Lys X3= Arg ou Lys X4= PheouTyr X5 = Leu ou Lys X6= GlyouGlu X7 = Leu ou Glu X8= LeuouGlu X9 = Gin ou Lys Xlo = Met ou Nle, et ses dérivés protégés pharmaceutiquement acceptables. 2. Peptide selon la revendication 1 présentant la séquence d'aminoacides suivante: Thr - Gln - Leu - Asp - lie - Leu - Arg - Asp - Leu - Phe - Glu - Leu - Arg - Leu - Lys - Tyr - Tyr - Gly - Leu - Arg - Lys - Glu - Phe - Leu - Leu - Gin Met - Leu - Gly. 3. Composition thérapeutique comprenant, à titre de principe actif, un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2.