Brevet FR2786273A1 — publié le 20000526

Le domaine de la présente invention est celui de l'analyse et de la détection de substances antigéniques à l'aide de techniques immunologiques. Plus particulièrement, l'invention concerne la mise en évidence d'espèces antigéniques (Ag) plus spécialement de nature protéique, immobilisées sur des supports formés par des membranes synthétiques et que l'on fait réagir avec des anticorps primaires AcI, ces derniers réagissant, une fois complexés avec les antigènes correspondants, avec des anticorps secondaires AcII, porteurs des moyens de révélation des complexes immunologiques formés :Ag/AcI/AcII. Il s'agit là de la technique connue d'immunoblot qui est actuellement largement utilisée dans l'étude analytique des espèces antigéniques protéiques. La présente invention concerne ainsi un procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative d'une ou plusieurs espèces antigéniques protéiques-cibles ci-après dénommé Agn (avec n = entier naturel positif), selon la technique d'immunoblot. La présente invention vise également un dispositif de mise sous presse d'une structure sandwich ainsi qu'un nécessaire d'analyse comprenant éventuellement ce dispositif, pour la mise en oeuvre du procédé d'immunoanalyse qui constitue l'objet principal de l'invention. La technique d'analyse par immunoblot d'espèces antigéniques protéiques a vu le jour en 1979. Elle a été décrite notamment dans les articles suivants : # Erlich, H. A., Levinson, J. R., Cohen, S. N. and Mc Devitt, H.O. (1979) "Filter affinity transfer. A new technique for the in situ indentification of proteins in gels". J. Biol Chem. 254,12,240. # Renart, J., Reiser, J. and Stark, G.R. (1979) "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and détection with antisera : améthode for studying antibody specificity and antigen structure". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3116. # Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) "electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procédure and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350. # Towbin, H., and Gordon, J. (1984) "Immunoblotting and dot immunobinding. Current status and outlook". J. Immunol Methods, 72,313. De manière classique, l'immrenoblot consiste essentiellement : - à immobiliser sur une membrane Western-blot (Mwb), un milieu protéique prélablement soumis à une électrophorèse sur gel, permettant la séparation des protéines selon leur charge et leurs masses molaires (Western-blot) ou à immobiliser les protéines du milieu d'analyse par dépôt direct de ce dernier sur une membrane Mdb (dot-blot) ; - à saturer les sites de la membrane (Mwb ou Mdb), laissés inoccupés par les constituants, notamment protéiques, du milieu d'analyse; cette saturation s'opérant e. g. à l'aide de protéines inertes, de tensioactifs TWEEN 20 ou de polyvinylpyrrolidone de façon à permettre ensuite l'utilisation de réactifs de nature protéique sans qu'ils soient fixés par la matrice membranaire ; - à effectuer la reconnaissance de l'espèce antigénique-cible Agn, au moyen d'anticorps spécifiques primaires AcI; - à fixer sur les anticorps primaires AcI, des anticorps secondaires AcII conjugués à des marqueurs permettant la révélation de la complexation antigènes/anticorps (enzymes, atomes radioactifs, particules d'or...) ; - à révéler l'espèce antigénique protéique cible par l'intermédiaire du marqueur auquel elle est indirectement liée. Ce procédé immunoblot a de nombreuses applications qui sont autant d'adaptations de la méthodologie générale sus-décrite à chaque cas particulier. A titre d'exemple d'application, on peut citer les articles suivants : # Bers, G. and Garfin, D. (1985) "Protein and nucleic acid blotting and immunobiochemical detection". BioTechniques 3, 276. # Bird, C.R., Gearing, A. J.H. and Thorpe, R. (1987) "The use of Tween 20 alone as a blocking agent for immunoblotting can cause artefactual results". J. Immunol. Methods 106,175. # Garfin, D. and Bers, G. (1985) "Basic aspects of protein blotting, in Baldo (Ed), Protein blotting : research and diagnostic applications", Karger, Basel, p. 5 ; décrivent des protocoles d'analyses spécifiques fondées sur l'immunoblot. Le succès de cette technique immunoblot ne saurait masquer les problèmes de mise en oeuvre qui peuvent se poser dans chaque cas d'espèce et qui requierent des adaptations en conséquence, du protocole opératoire. Ainsi, 1"un des problèmes majeurs que l'on rencontre souvent, est celui de la fixation non spécifique des anticorps secondaires AcII sur des protéines autres que les anticorps primaires, ce qui conduit à la révélation de protéines différentes des protéines cibles (faux-positifs). Si ce phénomène parasite peut être facilement décelé par la suppression de l'incubation de la membrane en présence d'anticorps primaires AcI, il est beaucoup plus difficile d'y remédier efficacement. Classiquement, les points sur lesquels peut jouer l'expérimentateur sont : - la diminution de la concentration de l'AcII utilisé, - l'addition de détergent aux solutions d'anticorps et aux solutions de lavage, - l'introduction de plus ou moins grandes quantités d'agents bloquants dans les solutions d'anticorps.pas toujours couronnées de succès ainsi que le souligne J. M. Gershoni dans l'ouvrage : "Protein blotting : A manual, in méthode of Biochemical Analysis", Ed. D. Glick, vol 33, p. 1-58,1988. Dans cet ouvrage, l'auteur aborde le paragraphe sur les faux positifs par la déclaration suivante : "je n'ai aucune bonne suggestion en ce qui concerne les faux positifs". J. M. Gershoni suggère en désespoir de cause d'essayer d'autres anticorps secondaires. En tout état de cause, puisque les ajustements tentés ne donnent que des résultats modestes, ces ajustements ne sont pas transposables d'une application à une autre. Il apparaît donc que les propositions techniques connues d'intervention sur le protocole d'immunoblot pour supprimer les faux-positifs, ne sont en fait que des pis-aller, qui ne sont pas en mesure de supprimer les signaux parasites résultant de la fixation non spécifique de l'AcII, sans provoquer de perte de sensibilité au niveau de la détection des signaux réellement spécifiques. Confronté à un tel état de la technique, l'inventeur s'est fixé pour objectif d'offrir une solution plus satisfaisante que celles connues jusqu'alors, au problème de la fixation non spécifique des anticorps secondaires AcII sur des protéines autres que les anticorps primaires AcI, dans le cadre de l'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de type immunoblot. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'analyse et/ou de détection d'antigènes protéiques cibles, lequel procédé se devant de ne pas être sujet au problème de faux-positifs par fixation non spécifique d'AcII et d'être applicable quel que soit l'antigène protéique visé. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé immunoblot qui ne souffre pas du problème des faux-positifs AcII, tout en offrant une très haute sensibilité de détection des antigènes protéiques cibles Agn. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de type immunoblot, qui résolve le problème des faux-positifs dus aux AcII, quelle que soit la nature des AcII mis en oeuvre. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé immunoblot simple, économique et non sujet à la fixation non spécifique d'AcII. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé et un dispositif immunoblot pour la détection et le dosage immunologiques de substances stupéfiantes et/ou dopantes dans les humeurs des humains et/ou des animaux, comme par exemple l'érythropoïétine recombinante que l'on cherche dans les urines, afin de révéler d'éventuelles pratiques de dopage chez les sportifs. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un nécessaire d'immunoanalyse pour la mise en oeuvre du procédé susvisé. S'étant fixée tous ces objectifs, l'inventeur a eu le mérite de mettre au point, de manière tout à fait surprenante et inattendue, un procédé immunoblot dans lequel on neutralise le problème des faux positifs dû à la fixation non spécifique d'AcII, en transférant tout ou partie des entités anticorps liées aux espèces antigéniques protéiques-cibles Agn, sur une membrane de transfert Mt, de façon à isoler ces entités anticorps des autres protéines du milieu d'analyse et à révéler exclusivement sur cette membrane de transfert Mt, lesdites entités-anticorps qui sont l'image des complexes Agn/AcI initiaux. D'où il s'ensuit que la présente invention concerne un procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative d'une ou plusieurs espèces antigéniques protéiques-cibles ci-après dénommées Agn (avec n = entier naturel positif), selon la technique d'immunoblot qui consiste essentiellement à : 1- soit séparer les Agn entre eux et par rapport aux autres protéines présentes dans le milieu d'analyse, sur au moins un support de séparation Ss, (e. g. par électrophorèse dénaturante en présence de Sodium DodécylSulfate (SDS), par électrophorèse non dénaturante, par électrophèse bidimensionnelle ou par focalisation isoélectrique), et transférer éventuellement les protéines (dont Agn) séparées sur Ss sur au moins une membrane d'adsorption Mwb qui devient ainsi l'image de Ss, 2- soit déposer directement le milieu d'analyse sur au moins une membrane Mdb 3- saturer Mdb ou Mwb à l'aide d'au moins un agent saturant, de préférence en solution, cet agent saturant étant par exemple constitué par des protéines inertes (e.g. : lait écrémé, caséine, gélatine, albumine sérique bovine, hémoglobine, etc. ), des tensioactifs (TWEEN 20) ou des polymères de type polyvinylpyrrolidone, les agents saturants constitués par des protéines inertes étant plus particulièrement préférés ; 4- mettre en présence de Mdb ou Mwb un ou plusieurs types d'anticorps primaires (AcI) spécifiques des Agn, de manière à ce que ces AcI puissent former des complexes avec les Agn éventuellement présents dans le milieu ; 5- laver la membrane Mdb ou Mwb de façon à éliminer notamment les AcI libres, non immobilisés dans les éventuels complexes Agn/AcI; 6- mettre en présence les complexes Agn/AcI avec un ou plusieurs types d'anticorps secondaires AcII anti-AcI, aptes à se lier avec les AcI pour former des complexes Ag,/AcI/AcII et dotés d'au moins un marqueur apte à permettre la révélation indirecte des éventuels complexes Agn/AcI. 7- laver la membrane Mdb ou Mwb de manière à éliminer les AcII non- immobilisés dans les complexes Agn/AcI/AcII ; 8- révéler les complexes Agn/AcI/AcII à l'aide des moyens de révélation qui conviennent aux marqueurs des AcII ; 9- procéder éventuellement à l'impression des informations révélées sur un film sensible ; ce procédé étant caractérisé en ce que, dès lors que les éventuels complexes Agn/AcI sont formés : a on modifie les conditions physico-chimiques régnant et/ou l'environnement dans et sur la membrane Mdb ou Mwb comprenant les éventuels complexes Agn/AcI de manière à rompre les liaisons Ag./Acl et à libérer les anticorps AcI ; b on transfère les anticorps ainsi libérés sur au moins une membrane de transfert Mt, tout en faisant en sorte que les antigènes Agn et les autres protéines du milieu d'analyse demeurent sur Mdb ou Mwb; ce transfert s'opérant notamment par désorption ; et on obtient de la sorte sur Mt, une image en AcI de Mdb ou Mwb, c on fait réagir les AcI libres transférés avec des AcII pour produire des complexes AcI/AcII ; d on lave la membrane Mt de façon à éliminer notamment les AcII libres non immobilisés dans les éventuels complexes AcI/AcII ; e on révèle lesdits complexes AcI/AcII présents dans et/ou sur Mt ; f éventuellement, on saisit les informations révélées sur au moins un autre support, de préférence par impression sur un film sensible. Grâce à cette technique avantageuse et originale d'isolement des AcI spécifiques des antigènes protéiques-cibles recherchés, l'invention fournit une solution simple, économique et performante au problème des faux positifs lié à la fixation non spécifique des AcII sur les protéines autres que les Agn. En outre, le procédé selon l'invention peut être largement mis en oeuvre dans de nombreuses applications, quelle que soit la nature des anticorps primaires et secondaires et sans que cela ne nuise à la sensibilité de mesure des signaux recherchés. En résumé, la technique selon l'invention équivaut à réaliser un double transfert protéique sur membrane, que l'on peut également qualifier de "double blotting". Les modalités opératoires selon l'invention désignées par les références a à f s'inscrivent dans le cadre d'un procédé immunoblot, qui fait intervenir des étapes préalables 1 ou 2, respectivement westernblot ou dotblot. S'agissant des modalités de rupture des liaisons Agn/AcI on peut envisager des modifications de pH et/ou de la salinité du milieu dans lequel baignent les espèces formant des complexes immunologiques au sein des membranes. La salinité peut être modifiée aussi bien quantitativement que qualitativement par le choix des solutés salins. Un autre moyen utilisable en complément et/ou en remplacement de ceux évoqués supra pour rompre les liaisons Ag/AcI peut être l'emploi d'agents chaotropiques choisis dans le groupe comprenant : CF,COO"X'; SCNeX; CCI3COOe X (avec X = contre-anion e.g; : Na, Li, K), les agents réduisants la polarité tels que : le dioxane ou l'éthylène-glycol et les agents tels que l'urée et le chlorhydrate de guanidine. De manière préférée, on rompt les complexes immunologiques par le biais de modifications de pH :diminution ou augmentation par exemple jusqu'à un pH# 11. Plus préférentiellement encore les modifications de pH consistent en des diminutions jusqu'à des pH acides inférieurs à 4. Ces modifications de pH peuvent être réalisées à l'aide de solutions de tampons et/ou d'acide et/ou de base. Comme exemples de tampons, on peut citer les tampons phosphate-citrate pH 2,8 ou glycine/HCl pH 2,5. Comme exemple d'acide, on peut mentionner des solutions d'acide propionique. Comme exemple de base, on peut signaler des solutions de NaCl à pH ajusté à 11par l'ammoniaque. Avantageusement, pour la phase a, la modification de pH consiste en une diminution de pH pour atteindre un pH de rupture inférieur ou égal à 4, de préférence compris entre 1 et 5 pour une température comprise entrel5 et 25 C. En choisissant judicieusement les modifications des conditions physicochimiques et/ou de l'environnement des complexes immunologiques présents dans les membranes synthétiques Mdb ou Mwb, il est tout à fait envisageable-conformément à l'invention- de rompre sélectivement les liaisons antigènes/anticorps et donc de libérer sélectivement des entités anticorps AcI. Mais conformément à un mode plus spécialement privilégié de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la phase a est réalisée après fixation des AcI sur les Agn (étape 4 immunoblot classique) et, plus préférentiellement encore, après lavage pour éliminer les AcI non fixés (étape 5 immunoblot classique). Dans ce mode préféré, c'est donc l'AcI qui est libéré de l'Agn et qui est transféré sur la membrane de transfert Mt pour y être révélé par liaison avec AcII et par l'intermédiaire des marqueurs propres aux AcII sur Mt. Cette modalité opératoire correspond à la phase c. Ainsi, selon son mode préféré de mise en oeuvre, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'on exécute les phases a à f dès lors que les éventuels complexes Agn/AcI sont formés (étape 4 immunoblot classique) sans mettre en présence des AcII avec les complexes Ag"/AcI/AcII de sorte qu'aucun complexe Agn/AcI/AcII n'apparaît sur Mdb ou Mwb (étape 6 immunoblot classique) et en ce que l'on prévoit, en outre : ao préalablement à la phase a, une phase lavage de Mdb ou Mwb, de façon à éliminer les AcI libres non immobilisés dans d'éventuels complexes Agn/AcI (étape 5 immunoblot classique), bo préalablement à la phase b, une phase de mise en contact de la face de la membrane Mdb ou Mwb par laquelle les protéines-dont Agn- ont été adsorbées, avec une face de la membrane Mt, Co préalablement à la phase c dans laquelle on fait réagir les AcI de Mt avec des AcII pour produire des complexes AcI/AcII, une phase de saturation de Mt à l'aide d'au moins un agent saturant tel que défini supra, de préférence du type de ceux comprenant des protéines inertes. Dans ce mode préféré, la libération des AcI s'opère avantageusement par diminution du pH. De plus, on effectue le lavage de la phase a0 par exemple à l'aide d'une solution diluée d'au moins un agent saturant du type de ceux définis supra, cet agent étant de préférence choisi parmi les solutions de protéines et plus spécialement encore parmi les solutions du groupe comprenant : le lait écrémé, les solutions de caséine, de gélatine, d'albumine sérique bovine, d'hémoglobine, entre autres, ainsi que les mélanges de ces solutions. Concernant les phases bo et b de transfert des AcI libérés sur la membrane de transfert Mt, il est à souligner que la désorption s'effectue au mieux dès lors que l'on met en contact les deux faces des membranes Mdb ou Mwb et Mt en cause. Préalablement à la réaction (phase c) des AcII avec les AcI libérés et transférés sur Mt, on sature Mt de la même façon que Mdb ou Mwb dans l'étape 3 de l'immunoblot classique, d'au moins un agent saturant tel que défini ci-avant, et de préférence du type de ceux comprenant des protéines inertes en solutions non diluées. Ces dernières sont e.g. celles du groupes comprenant : le lait écrémé, les solutions de caséine, de gélatine, d'albumine sérique bovine, d'hémoglobine, entre autres, ainsi que les mélanges de ces solutions. Il est intéressant de noter que l'on sélectionne les matériaux constitutifs des membranes Mdb, Mwb et Mt parmi les polymères synthétiques ou naturels, de préférence parmi les polyalkylidènes halogénés tels que le fluorure de polyvinylidène ou bien encore parmi les celluloses modifiées ou non telles que la nitrocellulose, l'acétate de cellulose et leurs mélanges. Il est important qu'avant et pendant les transferts propres aux phases b0 et b, les membranes Mdb ou Mwb et Mt soient toujours humidifiées et contiennent une quantité minimale de milieu liquide. A cette fin, on prévoit avantageusement des réservoirs de milieu liquide, aptes à satisfaire aux besoins en liquide des membranes susvisées. En pratique, ces réservoirs peuvent être constitués par des feuilles de papier filtre imbibées de milieu liquide et maintenues en contact avec les membranes Mdb/Mwb ou Mt. Pour que le transfert des AcI de Mdb ou Mwb vers Mt, s'opère au mieux, il est prévu, conformément à l'invention, de réaliser une structure sandwich comprenant : # la membrane de départ Mdb ou Mwb et la membrane d'arrivée Mt accolées l'une à l'autre, la face de Mdb ou Mwb impliquée étant de préférence celle par laquelle ont été adsorbés les constituants du milieu d'analyse # ainsi que des moyens d'humidification desdites membranes. Cette structure sandwich est ensuite mise sous presse entre deux plateaux. La pression est avantageusement maintenue pendant toute la durée de la désorption. Classiquement, la durée de désorption varie de une à plusieurs minutes, par exemple cinq minutes. La température qui règne au sein de la structure sandwich est en pratique la température ambiante. Les opérations de saturation s'effectuent à l'aide de solutions ou de suspensions de protéines inertes, dont la température est comprise entre 5 et 50 de préférence entre 35 et 45 , par exemple de l'ordre de 37 C. Les étapes 4 et 6 ou la phase c de formation de complexes Agn/AcI ou AcI/AcII sont effectuées par incubation à une température en pratique comprise entre 0 et 40 C. Dans le cas où Agn = Erythropoïétine recombinante, l'incubation avec les AcI s'effectue à température ambiante (20 C) et l'incubation avec les AcII à température de 4 C. Les choix des températures d'incubation pour les complexations Ag/Ac, selon les Ac et Ag mis en oeuvre, sont à la portée de l'homme du métier. On connaît diverses possibilités de marquage et de révélation des AcII liés aux AcI et présents dans et sur la membrane de transfert Mt. Avantageusement, le système de marquage des AcII et de révélation des complexes AcI/AcII est choisi dans le groupe de systèmes comprenant : - les systèmes fondés sur des réactions colorimétriques ou sur la radioactivité, et - les systèmes de chimiluminescence tels que : . le système d'oxydation commercialisé par la Société COVALAB ; # les systèmes d'oxydation commercialisés par les sociétés AMERSHAM et PIERCE ; # les systèmes de phosphorylation commercialisés par les Sociétés SCHLEICHER-SCHUELL et ICN ; # les systèmes de reconnaissance de type ligand/récepteur, sucre/lectine, enzyme/substrat, enzyme/ inhibiteur, par exemple : récepteur membranaire, hormone, neurotransmetteur et, de façon générale, tous les transducteurs de signaux. Il est à noter que la révélation par chimiluminescence est préférée en raison de sa très bonne sensibilité. Comme exemple d'un tel système on peut citer celui comprenant la biotine qui permet par l'intermédiaire de complexes streptavidine peroxydase une réaction de chimiluminescence. Le protocole de "double blotting" selon l'invention n'entraîne pas de perte de sensibilité de la révélation par rapport au protocole immunoblot classique connu. En revanche, les réponses non spécifiques qui masquent les réponses spécifiques, sont totalement éliminées dans le nouveau protocole selon l'invention. Dans la phase f on recueille de manière conventionnelle les signaux de révélation apparus sur la membrane de transfert Mt, sur des supports sensibles, qui peuvent être des films photographiques ou photoradiographiques. Dans le cas où le milieu d'analyse est dilué et par exemple lorsqu'il s'agit d'urine on procède avant toute chose à une concentration dudit milieu d'analyse. Les techniques de concentration sont parfaitement connues et maîtrisées par l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'ultrafiltration. Les Agn concernés par l'invention sont les protéines au sens large. A titre d'exemples d'Agn, on peut l'érythropoïétine recombinante ou non (EPO ou EPOr), les protéines sériques, les protéines cellulaires de différents tissus, les protéines virales, etc., et leurs mélanges. Comme cela a été évoqué supra, le milieu d'analyse est avantageusement un milieu biologique, e.g. : sang, urine, salive, liquide céphalo-rachidien, milieu de culture cellulaire, milieu intra-cellulaire, etc. Sans que cela ne soit limitatif, le procédé selon l'invention s'est avéré particulièrement approprié pour la recherche de substances dopantes dans les milieux biologiques et en particulier d'érythropoïétine recombinante dans les urines de sportifs. La présente invention ne renvoie pas uniquement à des considérations méthodologiques mais concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre pour la phase b du procédé tel que décrit supra. En effet comme déjà indiqué ci-dessus, il importe de prévoir, pour le transfert par désorption de l'entité anticorps de la membrane Mdb ou Mwb vers la membrane Mt, une structure sandwich que l'on met sous presse et qui comporte, outre les membres susvisés, des moyens d'alimentation en milieu liquide de ces dernières. D'où il s'ensuit que la présente invention a aussi pour objet un dispositif adapté à la mise en oeuvre des phases b et b0, le dispositif comprenant essentiellement un système de presse à plateaux apte à maintenir plaquées l'une à l'autre, l'une des faces de la membrane Mdb ou Mwb (de préférence celle par laquelle les protéines -dont Agn- ont été adsorbées) et l'une des faces de la membrane Mt, ce dispositif comportant, de préférence, des moyens d'humidification de Mdb ou Mwb et/ou Mt, avantageusement constitués par du papier absorbant imbibé de milieu liquide. Pour en revenir au chapitre relatif à l'application industrielle de l'invention, il convient de signaler que sous un autre de ses aspects avantageux, l'invention a trait à un nécessaire d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative de type immunoblot d'une ou plusieurs espèces antigéniques protéiques-cibles Agn (n = entier naturel positif) pour la mise en oeuvre du procédé tel que décrit ci-dessus. Le nécessaire d'analyse peut comprendre : - les gels d'électrophorèse de séparation ; - les membranes Mdb ou Mwb, par exemple, en fluorure de polyvinylidène ; - les membranes Mt par exemple en fluorure de polyvinylidène ; - le milieu liquide de rinçage ou d'imprégnation des membranes, par exemple une solution saline phosphatée tamponnée à pH 7,4 ; - les solutions d'agent saturant, de préférence de protéines inertes telles que le lait écrémé en solution dans un tampon salin phosphaté ; - les anticorps primaires AcI anti Agn constitués, par exemple, par des anticorps monoclonaux de souris en solution à 0,1% dans un liquide contenant un tampon phosphate salin et du lait écrémé ; - les anticorps secondaires AcII anti AcI, comme, par exemple, les anticorps IgG, de chèvre anti-souris (H+L) biotinylés dans une solution de lait écrémé + tampon salin phosphate ; - le dispositif pour réaliser la structure sandwich sous presse ; - des papiers buvards ou papiers filtres constituant les moyens d'humidification ; - le système de révélation e.g. : streptavidine/peroxydaselsusbtrat oxydant ; - le film autoradiographique ou photographique pour l'impression des informations actiniques résultant de la révélation des complexes AcI/Acn. On aura noté que l'invention concerne également le nécessaire d'immunoanalyse susvisé caractérisé en ce qu'il comporte le dispositif tel que défini ci-dessus. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent et qui mettent bien en exergue tous les avantages, notamment en ce qui concerne la solution apportée au problème des faux positifs dus à la fixation non spécifique des AcII, ainsi que toutes ses variantes de mise en oeuvre. La description des exemples sera faite en relation avec les figures annexées : - la fig. 1 correspond à un schéma explicatif des phases bo et b de transfert ou de "double blotting", - la fig. 2 est un schéma en coupe longitudinale droite du dispositif de mise sous presse de la structure sandwich lors des phases de transfert b0 et b, - les fig. 3 A, B, C, sont des films autoradiographiques comprenant des taches de chimiluminescence correspondant aux résultats révélés pour des dilutions d'EPO recombinante humaine dans une solution de sérum albumine bovine et de tampon salin-phosphate (fig. 3A), dans des urines humaines concentrées avec AcI et AcII (fig. 3B), et sans AcI mais avec AcII, (fig 3C) par immunoblotting, - les fig. 4 A, B, C et A', B', C' montrent les résultats obtenus dans le procédé de "double-blotting" selon l'invention, en se plaçant dans les mêmes conditions que pour les fig. 3 A, B et C, - les fig. 4 A', B' et C' correspondent aux résultats obtenus sur la membrane de transfert Mt et les fig. 4 A, B et C correspondent aux résultats obtenus sur la membrane Mdb. - la fig. 5 montre les résultats d'un traitement de la membrane Mdb de la fig.4 A à l'aide d'AcI anti-EPO puis à l'aide d'AcII, auquel succède un traitement de révélation par chimiluminescence. * * EXEMPLES 1 -PRODUITS MIS EN OEUVRE ET METHODOLOGIE I. 1 Préparation des échantillons : Des urines humaines physiologiques dont la protéinurie est inférieure à 0,15 g/1 sont soumises à un traitement d'ultrafiltration permettant de les concentrer 50 fois et dans lequel on utilise des membranes commercialisées sous la dénomination YM 30 DIAFLO, par la Société AMICON. On réalise ensuite une série de dilutions d'érythropoïétine (EPO) recombinante humaine (rHuEPO) commercialisée par la Société BOEHRINGER. Les concentrations des solutions diluées obtenues s'étendent de 15,6 à 0,12 UI/ml (129,5 à 1 ug/ml) : - soit dans 0,1% poids/volume de sérum albumine bovine (SAB) commercialisée par la Société SIGMA, dans un tampon phosphate salin pH 7. 4 (essai A) (TPS); - soit dans des urines concentrées (essai B). I. 2 Méthodologie d'immuno6lotting classique: Etape~2; Des dépôts de 3 microlitres (dot-blots) de différents échantillons a, b, c, d, e, f, g, h, sont effectués sur des membranes en fluorure de polyvinylidène de porosité égale à 0,45 m, et commercialisées sous la dénomination IMMOBILON par la Société MILLIPORE, ces membranes Mdb ont été préalablement trempées dans du méthanol, rincées dans l'eau et équilibrées dans un tampon phosphate salin conformément aux instructions du fabricant. Etape.3 :. - Saturation La saturation est réalisée à l'aide d'une solution à 5% de lait écrémé en poudre (commercialisé sous la marque REGILAIT) dans du tampon phosphate salin. La mise en contact de cette solution de lactoprotéines inertes avec Mdb se déroule pendant 1 heure à 37 C . Etape.4..: Les membranes Mdb bloquées (ou saturées) sont ensuite incubées avec une solution d'anticorps primaire AcI titrant 1 ug/ml d'anticorps monoclonal de souris anti-EPO humaine dans une solution de tampon phosphate salin comprenant 1% de lait écrémé. Les AcI sont du type de ceux commercialisés par la Société GENZYME L'incubation des AcI s'effectue pendant 1 heure à température ambiante. Etape. 5.; Les membranes Mdb sont ensuite lavées à l'aide d'une solution de lavage constituée par un tampon phosphate salin titrant 0,5% de lait écrémé. L'opération de lavage dure 10 minutes, elle est répétée 5 fois avec une solution de lavage neuve. Etape.6..: Les membranes Mdb lavées sont alors incubées avec la solution d'anticorps secondaires AcII titrant 0,25 g/ml d'immunoglobulines IgG de chèvre anti-souris (H + L) biotinylées dans un tampon phosphate salin chargé à 1% de lait écrémé. Les AcII sont commercialisés par la Société VALBIOTECH sous la référence 2813 C. L'incubation des AcII avec les Mdb lavées s'effectue pendant 18 heures à 4 C. Les autres AcII testés sont : - les immunoglobulines biotinylées de lapin anti-souris commercialisées sous la dénomination E354 par la Société DAKO ; - des fragments F(ab')2 biotinylés d'immunoglobulines de lapin anti- souris, commercialisés sous la référence E0413 par la Société DAKO; - et des immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris (spécifiques du fragment Fc) conjuguées à de la peroxydase et commercialisées sous la référence A-0168 par la Société SIGMA. Etape 7; Les membranes Mdb comprenant éventuellement des complexes Agn = EPO/AcI/AcII sont soumis à trois lavages de 5 min chacun à l'aide d'une solution de lavage du même type que celle utilisée à l'étape 5 ci-dessus. Etape. 8.; Les membranes Mdb de l'étape 7 sont ensuite incubées dans une solution comprenant des complexes streptavidine : Cette solution de révélation est commercialisée sous la dénomination SPA par la Société VALBIOTECH. Sa concentration en peroxydase est de 1,25 g/ml. Le temps de contact de la solution de révélation avec les membranes est de 1 heure à température ambiante. Après trois lavages de 5 min chacun dans un tampon phosphate salin, les membranes Mdb sont ensuite incubées pendant 3 min avec le substrat chimiluminescent constitué par le produit référencé COVALIGHT. Ce substrat chimiluminescent a été préparé préalablement conformément aux instructions du fabricant. Après incubation, les membranes sont retirées du substrat chimiluminescent et enveloppées dans un plastique transparent. Etape.9; Les membranes de l'étape 8 sont ensuite appliquées pendant 2 min sur un film autoradiographique du type de celui commercialisé par AMERSHAM sous la dénomination HYPERFILM-ECL. Le film est ensuite développé en utilisant un révélateur rayons X et un fixateur rayons X de type LX 24 et AL4 de la Société KODAK. I. 3 - Autres matériaux mis en oeuvre Détergent TWEEN 20 de la Société PIERCE Urée de la Société SIGMA Sérum normal de chèvre commercialisé par la Société BIOCELL I. 4 - Procédé d'immuno-analyse selon l'invention ("double blotting") Les étapes 1 à 5 décrites au point 1.2 ci-dessus sont reproduites en formant une procédure d'immunoblotting classique sur membrane Mdb. Phase a0 : Cette phase est une étape de lavage correspondant à l'étape 5 de l'immunoblotting classique décrit ci-dessus. Cette phase a0 comprend en outre la préparation de la membrane de transfert Mt : La membrane Mt en fluorure de polyvinylidène est découpée aux mêmes dimensions que la membrane Mdb. Elle est ensuite trempée dans du méthanol, rincée à l'eau et équilibrée dans une solution 0,1M de glycine et d'acide chlorhydrique. Cette dernière solution a un pH de 2,5. Les membranes de transfert Mt sont étendues sur une feuille de papier filtre de 3 M M commercialisée par la Société WHATMAN. Cette feuille de papier filtre a été elle aussi préalablement imprégnée de la solution glycine/HCI à pH 2,5. Cette feuille de papier filtre constitue un moyen d'humidification ou d'alimentation en milieu liquide acide des membranes de transfert Mt. Phases a et b.:. Ces phases consistent successivement, d'une part, à rompre les liaisons entre les Ag=EPO, et les AcI, de façon à libérer ces derniers des complexes Agn = EPO/AcI, par acidification jusqu'à un pH de 2,5, et d'autre part, à transférer les AcI libérés de Mdb sur Mt. Cette opération est schématisée sur la fig. 1 annexée. Cette figure fait apparaître la membrane Mdb qui pourrait également être une membrane Mwb résultant d'un western-blot, ainsi que la membrane de transfert Mt. Dans un premier temps Mdb comprend des complexes Agn = EPOr/AcI ainsi que des protéines P différentes des espèces antigéniques protéiques-cibles Agn et n'ayant pas réagi avec les anticorps spécifiques AcI. La chute du pH à 2,5 provoque la libération des AcI et leur transfert de Mdb sur Mt. Les autres protéines P différentes des Agn et les Agn eux-mêmes ne migrent pas sur Mt. Pour favoriser le transfert par désorption, on utilise un dispositif de mise en oeuvre des phases a et b, conçu pour réaliser une structure sandwich comprenant les membranes Mdb et Mt et pour mettre sous presse cette structure sandwich. La fig. 2 annexée représente ce dispositif comprenant la structure sandwich ainsi que les moyens de mise sous presse de celle-ci. Comme le montre la fig. 2, la structure sandwich comporte les deux membranes Mdb ou Mwb et Mt accolées l'une à l'autre. La face de Mdb ou Mwb impliquée est celle comprenant les Agn = EPOr et les autres protéines P comme cela ressort de la fig. 1. De part et d'autre des membranes Mdb/Mt accolées, se trouve une feuille de papier filtre désignée par la référence 1, imprégnée de solution d'acidification HCl/glycine 0,1 M-pH 2,5 et constituant le moyen d'humidification et/ou d'alimentation en milieu liquide acide des membranes Mt et Mdb. Trois feuilles de papier filtre, sèches, désignées par la référence 2 et superposées sont accolées à la feuille de papier filtre 1 humide, associée à Mt. La structure sandwich l/Mdb/Mt/1/2 est disposée entre deux plateaux 3 qui sont maintenus sous pression à l'aide de deux pinces 4. Avant d'être intégrée dans la structure sandwich, la membrane Mdb lavée conformément à l'étape a0. = étape 5 est soumise à un traitement de rinçage dans de l'eau distillée et d'évacuation de l'eau de rinçage en excès. Cette membrane Mdb est mise en contact avec Mt conformément à la phase bo et préalablement à la phase b de transfert qui s'effectue au sein de la structure sandwich mise sous presse (dispositif de la fig. 2.). Les AcI migrent par désorption de Mdb sur Mt et vont se fixer sur cette dernière comme cela apparaît à la fig. 1. La phase b consiste en un transfert sélectif des molécules d'anticorps primaires AcI de la membrane dot-blot ou de la membrane western-blot sur une membrane séparée ou de transfert. Ce transfert s'effectue au moyen d'un flux de tampon acide circulant de la membrane Mdb ou Mwb vers la membrane de transfert Mt mise en contact avec la première. Cette diminution de pH ne nuit pas aux liaisons existantes entre la membrane et les protéines qui sont adsorbé es sur cette membrane. En effet, ces liaisons sont de nature hydrophobe donc insensibles aux variations de pH. Une fois libérés, les anticorps AcI sont immédiatement piégés par la membrane de transfert. Le procédé selon l'invention est bref. 5 min suffisent pour effectuer un transfert efficace des AcI sur la membrane Mt. La membrane Mdb ou Mwb peut être à nouveau retestée après transfert des anticorps primaires AcI sur la membrane de transfert, . Ceci peut être intéressant pour effectuer d'autres immuno-analyses avec d'autres anticorps que les AcI spécifiques de l'espèce antigénique protéique-cible Agn, par exemple l'EPO. Mais il est clair que le procédé de "double blotting" selon l'invention est un avant tout utile pour la suppression de la fixation non spécifique des anticorps secondaires sur d'autres espèces antigéniques protéiques différentes des espèces antigéniques protéiques cibles, et ce, sans nuire à la sensibilité de la détection. Phase c0 : La structure sandwich est démontée et on récupère les membranes Mdb et Mt. La membrane Mt est saturée à l'aide d'une solution de protéines inertes de préférence formée par du lait écrémé concentré à 5% dans du tampon phosphate salin. La saturation dure 1 heure à 37 C. Phase c : Les membranes Mt sont ensuite soumises à une incubation en présence des anticorps secondaires AcII de façon à les faire réagir avec les éventuels anticorps AcI libérés et transférés. Cela correspond à la procédure de l'étape 6 décrite ci-dessus. Phases d,e,f: Ces phases correspondent aux étapes 7,8, 9, décrites ci-dessus. Ils conduisent à des films photoradiographiques révélant les résultats de la chimiluminescence. II- EXEMPLES COMPARATIFS 1 COMP - 2 COMP et 3 COMP - ET EXEMPLES 1 A 4 Exemple 1 COMP : On réalise des essais a, b, c, d, e, f, g, h, de dilution de rHuEPO dans une solution à 1% de sérum albumine bovine d'un tampon phosphate salin. Les quantités d'EPO déposées sur la membrande Mdb sont : a :0,37 mUI (1,83 pg) (3,1 pg) b : 0, 73 mUI (3,66 pg) (6,1 pg) c: 1,46 mUI (7,32 pg) (12,3 pg) d : 2,93 mUI (14,6 pg) (24,6 pg) e : 5,86 mUI (29,3 pg) (49,1 pg) f :Il,7 mUI (58,6 pg) (98,27 pg) g : 23,4 mUI (117,2 pg) (196,5 pg) h : 46,9 mUI (234,4 pg) (393,1 pg) Les résultats obtenus sont donnés par la fig. 3A. Cette figure montre que la sensibilité de détection est de 5,86 mUI (essai e) Exemple 2 COMP : On réalise la même gamme de dilution de rHuEPO dans des urines concentrées par ultrafiltration et dont le taux de protéines totales, après concentration, est de 0,91 g/l. La fig. 3B donne les résultats obtenus. Il ressort de cette fig. que dans un milieu d'analyse urinaire aucune proportionnalité n'est observée dans l'intensité des tâches correspondant aux différentes concentrations en rHuEPO. Cela démontre que les signaux obtenus ne sont pas spécifiques de la rHuEPO présente. Les signaux obtenus présentent une intensité constante et correspondent donc à la révélation non spécifique de tout ou partie des protéines urinaires. Exemple 3 COMP : Cet exemple a été mis en oeuvre pour déterminer l'origine des faux positifs observés dans l'exemple 2 COMP. A cette fin, on a reproduit le même protocole que celui de l'exemple 2 COMP à l'exception de l'étape consistant à faire réagir les composés présents dans et sur la membrane Mdb avec les anticorps primaires AcI. Dans la mesure où comme cela apparaît sur la fig. 3C on obtient les mêmes résultats qu'à l'exemple 2 COMP fig. 3B, force est donc de conclure que les responsables des faux positifs sont les anticorps secondaires AcII biotinylés anti-souris (une fixation non spécifique de la streptavidine-peroxydase a été éliminée en omettant l'AcII dans le protocole d'immunorévélation : dans ce cas, en effet, aucune réponse n'est observée). Cette fixation non spécifique des anticorps secondaires est très forte et très stable puisque lesdites liaisons n'ont pas été inhibées par des changements de tampon pH et de force ionique. De même, la présence dans le milieu d'analyse de 0,05% de tensioactif TWEEN 20 ou d'urée à une concentration de 4 moles/1 n'a pas été de nature à supprimer ces liaisons non spécifiques des AcII aux protéines urinaires. Par ailleurs, l'incubation des membranes Mdb avec des protéines sériques normales de chèvre en solution de 5% dans un tampon phosphate sain, avant la mise en réaction des anticorps AcII formés par des anticorps de chèvre anti-souris biotinylés, n'a pas été de nature à mettre fin aux liaisons non spécifiques. Différents autres anticorps secondaires AcII ont été testés de la même façon (voir .1.3) sans que cela n'entraîne d'amélioration quant à la suppression de ces faux positifs. Exemple 4 Dans cet exemple on met en oeuvre des dilutions de rHuEPo dans une solution de sérum albumine bovine à 0,1% dans le tampon salin phosphate, identique à celle de l'exemple 1 COMP. Le protocole selon l'invention de "double blotting" est mis en oeuvre et tel que décrit au point 1.4 supra. La fig. 4 A montre les résultats obtenus avec la membrane Mdb, tandis que la fig. 4A' correspond à l'image en luminescence de la membrane de transfert Mt. Sur cette dernière, on obtient exactement le même modèle de tâches d'intensité croissante de a' à h' que celui de la fig. 3 A de l'exemple 1 COMP de a à h. L'absence de tâches sur la fig. 4 A, montre que les anticorps primaires AcI ont été transférés de la membrane dot-blot Mdb sur la membrane de transfert Mt, en réponse au pH acide imposé dans le milieu. Ce transfert des AcI est complet et n'entraîne aucune perte de sensibilité bien que l'on teste les anticorps AcI transférés à l'aide des anticorps secondaires AcII, et non la rHuEPO cible directement. Exemple 5 Dans cet exemple on teste le "double blotting" selon l'invention sur des dilutions de rHuEPO dans des urines concentrées. Les fig. 4 B et 4 B' correspondent aux images en chimiluminescence de la membrane dot-blot Mdb et de la membrane de transfert Mt, respectivement. A l'instar de la fig. 3 B la fig. 4 B fait apparaître le modèle de liaisons non spécifiques (ou faux positif) résultant de la liaison des AcII avec des protéines urinaires. En revanche la fig. 4 B' montre un modèle de tâches d'intensité croissante de a' à h'. Il s'agit là de signaux spécifiques correspondant aux quantités croissantes de rHuEPO qui avaient été ajoutées aux urines. Exemple 6 Par cet exemple, on prouve que les résultats obtenus à l'exemple fig. 4 B' sont parfaitement et véritablement spécifiques de l'EPO, en mettant en oeuvre un protocole dans lequel on omet l'incubation de la membrane de dot-blot Mdb avec les anticorps primaires AcI, avant la mise en contact de Mdb avec Mt. Dans ce cas, on obtient pour la membrane dot-blot Mdb une révélation non spécifique (fig. 4 C), tandis que la membrane de transfert Mt est dénuée de tout signal (fig. 4 C'). On remarquera que l'intensité des taches a' à h' de la fig. 4 B' est légèrement supérieure à celle des taches a à h de la fig. 4 A'. Ceci est imputable à la présence dans le milieu urinaire d'EPO endogène qui génère un signal additionnel à celui correspondant à la rHuEPO introduite. Exemple 7 Dans cet exemple, une membrane Mdb est préparée selon l'exemple 5 (rHuEPO diluée dans une solution de sérum albumine bovine à 0,1% dans le tampon salin phosphate), soumise au procédé de "double blotting" selon l'invention, puis à l'issue de ce dernier, testée par le procédé d'immunoblotting classique de l'étape 4 à l'étape 9. La fig. 5 présente les résultats obtenus. On obtient le même modèle de tâches que celui obtenu sur la membrane de transfert Mt fig. 4 A'. Cela montre que seuls les AcI avaient quitté la membrane dot-blot Mdb lors du transfert de la membrane Mdb sur la membrane Mt, la rHuEPO cible étant toujours présente sur cette membrane Mdb. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'immunoanalyse qualitative et/ou quantitative d'une ou plusieurs espèces antigéniques protéiques-cibles ci-après dénommées Agn (avec n = entier naturel positif), selon la technique d'immunoblot qui consiste essentiellement à : 1- soit séparer les Agn entre eux et par rapport aux autres protéines présentes dans le milieu d'analyse, sur au moins un support de séparation Ss, et transférer éventuellement les protéines (dont Agn) séparées sur Ss, sur au moins une membrane d'adsorption Mwb qui devient ainsi l'image de Ss ; 2- soit déposer directement le milieu d'analyse sur au moins une membrane Mdb ; 3- saturer Mdb ou Mwb à l'aide d'au moins un agent saturant comprenant de préférence des protéines inertes qui se présentent avantageusement sous forme de solution ; 4- mettre en présence de Mdb ou Mwb un ou plusieurs types d'anticorps primaires (AcI) spécifiques des Agn de manière à ce que ces AcI puissent former des complexes avec les Agn éventuellement présents dans le milieu ; 5- laver la membrane Mdb ou Mwb de façon à éliminer notamment les AcI libres, non immobilisés dans les éventuels complexes Agn/AcI; 6- mettre en présence les complexes Agn/AcI avec un ou plusieurs types d'anticorps secondaires AcII anti-AcI, aptes à se lier avec les AcI pour former des complexes Agn/AcI/AcII et dotés d'au moins un marqueur apte à permettre la révélation indirecte des éventuels complexes Agn/AcI; 7- laver la membrane Mdb ou Mwb de manière à éliminer les AcII non- immobilisés dans les complexes Agn/AcI/AcII; 8- révéler les complexes Agn/AcI/AcII à l'aide des moyens de révélation qui conviennent aux marqueurs des AcII ; 9- procéder éventuellement à l'impression des informations révélées sur un film sensible ; ce procédé étant caractérisé en ce que, dès lors que les éventuels complexes Agn/AcI sont formés : a on modifie les conditions physico-chimiques régnant et/ou l'environnement dans et sur la membrane Mdb ou Mwb comprenant les éventuels complexes Agn/AcI de manière à rompre les liaisons Agn/AcI et à libérer les anticorps AcI ; b on transfère les anticorps ainsi libérés sur au moins une membrane de transfert Mt, tout en faisant en sorte que les antigènes Agn et les autres protéines du milieu d'analyse demeurent sur Mdb ou Mwb ; transfert s'opérant notamment par désorption ; et on obtient de la sorte sur Mt, une image en AcI de Mdb ou Mwb ; c on fait réagir les AcI libres transférés avec des AcII, pour produire des complexes AcI/AcII ; d on lave la membrane Mt de façon à éliminer notamment les AcII libres non immobilisés dans les éventuels complexes AcI/AcII ; e on révèle lesdits complexes AcI/AcII présents dans et/ou sur Mt ; f éventuellement, on saisit les informations révélées sur au moins un autre support, de préférence par impression sur un film sensible. 2 -. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour l'étape a, la modification de pH consiste en une diminution de pH, pour atteindre un pH de rupture inférieur ou égal à 4 , de préférence compris entre 1 et 5 pour une température comprise entre 15 et 25 C. 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on met en oeuvre les phases a à f dès lors que les éventuels complexes Ag/AcI sont formés (étape 4 immunoblot classique) et sans mettre en présence des AcII avec les complexes Ag"/AcI de sorte qu'aucun complexe Ag"/AcI/AcII n'apparaît sur Mdb ou Mwb (étape 6 immunoblot classique) et en ce que l'on prévoit en outre : a0 préalablement à la phase a, une phase lavage de Mdb ou Mwb, de façon à éliminer les AcI libres non immobilisés dans d'éventuels complexes Agn/AcI (étape 5 immunoblot classique), bo préalablement à la phase. b, une phase de mise en contact de la face de la membrane Mdb ou Mwb par laquelle les protéines-dont Agn- ont été adsorbée avec une face de la membrane Mt, c0 préalablement à la phase c non facultative dans laquelle on fait réagir les AcI de Mt avec des AcII pour produire des complexes AcI/AcII, une phase de saturation de Mt à l'aide d'au moins un agent saturant. 4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on sélectionne des matériaux matériaux constitutifs des membranes Mdb, Mwb et Mt, parmi les polymères synthétiques ou naturels, de préférence parmi les polyalkylidènes halogénés tels que le fluorure de polyvinylidène ou bien encore parmi les celluloses modifiées ou non telles que la nitrocellulose, l'acétate de cellulose et leurs mélanges. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le système de marquage des AcII est un système de chimiluminescence. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu d'analyse est dilué et en ce que l'on procède avant toute chose à une concentration dudit milieu. 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les Agn sont des protéines de préférence choisies dans l'ensemble comprenant : l'érythropoïétine recombinante ou non (EPO ou EPOr), les protéines sériques, les protéines cellulaires, les protéines virales et leurs mélanges. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu d'analyse est un milieu biologique de préférence le sang, l'urine la salive, le liquide céphalorachidien, un milieu de culture cellulaire, un milieu intracellulaire. 9 - Dispositif pour la mise en oeuvre de l'étape b du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement un système de presse à plateaux apte à maintenir plaquées l'une à l'autre, l'une des faces de la membrane Mdb ou Mwb (de préférence celle par laquelle les protéines -dont Agn- ont été adsorbées) et l'une des faces de la membrane Mt, ce dispositif comportant, de préférence, des moyens d'humidification de Mdb ou Mwb et/ou Mt, avantageusement constitués par du papier absorbant imbibé de milieu liquide. 10 - Nécessaire d'immuno-analyse et/ou quantitative de type immunoblot, pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte le dispositif selon la revendication 9.