Brevet FR2793807A1 — publié le 20001124

MÉTHODE D'INSERTION D'UN FRAGMENT D'ACIDE NUCLEIQUE DANS UN VECTEUR, SES APPLICATIONS ET LES KITS POUR SA MISE EN #UVRE. La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et se rapporte plus précisément à l'insertion de fragments d'ADN dans un vecteur plasmidique. L'insertion de fragments d'ADN est la base de la plupart des manipulations d'ADN effectuées dans les laboratoires de biologie moléculaire. La stratégie classique consiste à opérer une réaction de ligation entre un fragment d'ADN clivé à ses extrémités par des enzymes de restriction d'une première part, et un plasmide clivé par les même enzymes de restriction, ou au moins des enzymes de restriction générant des sites compatibles. Ce système classique implique la présence regroupée de nombreux sites de restrictions sur chaque plasmide, de façon à pouvoir intégrer des fragments d'ADN d'extrémités variées. Plus récemment, il a été décrit dans la demande de brevet international PCT No. W09206189 une technique de clonage d'acide nucléique amplifié par PCR. Cette technique connue sous le nom de "TA-cloning@" (Invitrogen catalogue 97/98 page 54) permet l'insertion de fragments d'ADN amplifiés par PCR dans un plasmide clivé par une enzyme de restriction libérant à chacune de ses extrémités une Thymidine 3'-sortante. Cette technique est basée sur le fait que les produits de PCR contiennent à leur extrémités une Adénine 3'-sortante. La complémentarité entre le vecteur-T et le produit de PCR-A permet la ligation efficace de l'un dans l'autre au moyen d'une ligase ou d'une topoisomérase. Cette technique offre l'avantage d'être universelle, car tout produit de PCR peut être inséré dans le vecteur-T, mais elle pose plusieurs problèmes : la fabrication et la conservation de vecteurs-T n'est pas aisée, - l'utilisation de polymérases thermostables contenant une activité exonucléase, qui est nécessaire à l'obtention d'un bonne fidélité lors de l'amplification, n'est généralement pas possible, cette activité éliminant les Adénines 3'-sortantes du produit de PCR, - l'insertion de fragments d'ADN ne se fait pas de façon orientée, et les insertions multiples, successives ou simultanées, sont malaisées. Il a également été décrit dans la demande de brevet international PCT No. W09222649 une technique de clonage de produits de PCR. Cette technique connue sous le nom de "CLONEAMP#" (Life Technologies catalogue 97/98 page 152) propose d'amplifier un fragment d'ADN par PCR avec des amorces associés à des séquences contenant des dUMP, puis de traiter les produits d'amplification avec l'UDG de façon à obtenir des extrémités 3' compatible avec un vecteur correspondant. La présente invention a précisément pour objet une nouvelle méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur, qui est universelle et indépendante de la compatibilité entre sites de restrictions. La méthode de l'invention permet par ailleurs de construire des banques d'ADN complémentaire orientées, et offre la possibilité d'isoler de façon aisée des parties 5' de séquences d'ADN dont ont connaît la partie 3'. La méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) on prépare une molécule d'acide nucléique double brin comprenant le fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, et en 5' dudit fragment un premier acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 5' d'un des brins d'un vecteur clivé, et en 3' dudit fragment un second acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 3' du même brin dudit vecteur clivé, b) on dénature d'une part ladite molécule d'acide nucléique et d'autre part un vecteur clivé dont les extrémités 5' et 3' de l'un des brin sont complémentaires desdits premier et second acides nucléiques étiquettes, c) on incube ladite molécule d'acide nucléique avec le vecteur clivé dont les extrémités 5' et 3' sont complémentaires des premier et second acides nucléiques étiquettes, dans des conditions permettant l'hybridation desdits premier et second acides nucléiques étiquettes sur le vecteur clivé, d) on copie : - d'une part, le vecteur clivé dans le sens 5' vers 3' à partir de l'extrémité 3' du second acide nucléique étiquette hybridé à l'extrémité 3' du vecteur clivé, et d'autre part, le fragment d'acide nucléique dans le sens 5' vers 3' à partir de l'extrémité 3' du vecteur clivé, e) on ligature : - d'une part, l'extrémité 3' du brin néosynthétisé avec comme matrice le vecteur, avec l'extrémité 5' du premier acide nucléique étiquette hybridé à l'extrémité 5' du vecteur clivé, et - d'autre part, l'extrémité 3' du brin néosynthétisé avec comme matrice le fragment à insérer, avec l'extrémité 5' du vecteur clivé, f) éventuellement on répète les étapes (b) à (e), g) éventuellement, on transforme un hôte cellulaire pour sélectionner les vecteurs ayant intégré le fragment d'acide nucléique. Une représentation schématique des étapes de la méthode de l'invention est donnée à la figure 4 en annexe. La molécule d'acide nucléique comprenant le fragment d'acide nucléique à intégrer dans un vecteur est préparée par amplification dudit fragment par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir de deux oligonucléotides amorces. Comme représenté à la figure 1 en annexe, chacun de ces oligonucléotides est composé de deux parties : - une partie en 3' homologue à une partie du fragment à insérer. - une partie en 5', constituant l'acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. Avantageusement, chaque acide nucléique étiquette présente les caractéristiques suivantes : La séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé est caractérisée en ce qu'elle est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. En d'autres termes, la séquence de l'extrémité clivée du vecteur qui est complémentaire de ladite séquence nucléique homologue de l'acide nucléique étiquette est bordée sans la contenir par une Thymidine (T) en 3'. La position de cette Thymidine (T), par son homologie avec une Adénine (A), ajoutée lors l'étape (c) du procédé de l'invention, permet d'éviter d'éventuels problèmes de mésappariements. - L'extrémité 3' de la séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé est caractérisée en ce que : soit elle se termine au niveau du dernier nucléotide dudit vecteur clivé, et alors l'acide nucléique étiquette est constitué seulement de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, . soit elle est plus longue d'au moins un nucléotide que la séquence qui lui est homologue, et alors l'acide nucléique étiquette est constitué de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, prolongé en 3' d'au moins un nucléotide. En conséquence, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que à l'étape (a) on prépare une molécule d'acide nucléique comprenant : - le fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, - de part et d'autre dudit fragment, une molécule d'acide nucléique étiquette constituée d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée du fragment d'acide nucléique à intégrer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotides. De préférence, la séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé comprise dans l'acide nucléique étiquette est caractérisée en ce qu'elle est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. Avantageusement, chaque séquence nucléique homologue d'une extrémité du vecteur clivé, comprise dans l'acide nucléique étiquette est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C . Un exemple d'un acide nucléique étiquette selon l'invention, hybridé à l'extrémité d'un vecteur clivé, est représenté à la figure 2 en annexe. Sur cette figure, on a représenté en gras : - la base T qui borde l'extrémité du vecteur clivé complémentaire de la séquence nucléique homologue de l'acide nucléique étiquette, et - la base G qui sépare le fragment d'acide nucléique à insérer de la séquence nucléique homologue du vecteur clivé. Tous les vecteurs notamment plasmidiques contenant avantageusement un marqueur de résistance à un antibiotique peuvent être utilisés dans la méthode de l'invention. Le vecteur choisi doit être clivé au niveau d'un ou de deux sites de restriction, de façon à être linéarisé. Dans le cas où le vecteur est clivé au niveau de deux sites de restriction, différents ou identiques, le petit fragment libéré lors de ce clivage doit être éliminé par purification du vecteur linéaire par tout moyen connu de l'homme du métier, comme par exemple une purif ication sur gel d'agarose, sur colonne de Séphacryl. Les étapes de copie (d) et de ligation (e) de la méthode de l'invention, également dé s i gn é e s conjointement ci-après "réaction combinée" ou "réaction combinée en chaîne", consiste à soumettre, après la dénaturation de l'étape (b) et l'hybridation de l'étape (c) la molécule d'acide nucléique préparé à l'étape (a) et le vecteur clivé, à l'action d'une polymérase et d'une ligase thermostables, puis, avantageusement, à renouveler les étapes (b) à (e) selon une série de cycles de température. Les étapes (d) et (e) peuvent être réalisées soit successivement soit sensiblement simultanément après les étape de dénaturation puis d'hybridation. La réaction combinée permet à la fois : - la réplication totale du vecteur clivé à partir d'une amorce constituée de l'extrémité 3' de la molécule d'acide nucléique préparée à l'étape (a), puis la ligation simple brin de l'extrémité 3' nouvellement générée sur l'extrémité 5', phosphorylée, de la molécule d'acide nucléique ayant servi d'amorce. - la réplication du fragment d'acide nucléique à partir d'une amorce constituée par l'extrémité du vecteur clivé, puis ligation simple brin de l'extrémité nouvellement générée sur l'extrémité 5', phophorylée, du vecteur de la molécule d'acide nucléique La synthèse par une polymérase thermostable d'un brin représentant la taille complète du vecteur peut être difficile à réaliser, aussi, selon une forme préférée de mise en #uvre de la méthode de l'invention, l'étape (d) est effectuée en présence de relais, c'est à dire des oligonuclotides phosphorylés homologues de différentes parties du vecteur répartis de façon homogène sur chacun des deux brins du plasmide, à une distance entre eux de 500 à 2000 paires de bases. Comme indiqué précédemment la molécule d'acide nucléique comprenant le fragment d'acide nucléique à intégrer dans un vecteur est préparée à l'étape (a) par amplification dudit fragment par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir de deux oligonucléotides amorces, chacun composé de deux parties : - une partie 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer. - une partie 5', constituant l'acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. Avantageusement, la partie 3' de chaque oligonucléotide amorce comprend de 5 à 20 nucléotides dont la séquence est suffisamment homologue à celle de chacune des extrémités du fragment d'ADN pour s'hybrider à ladite extrémité à une température comprise entre 30 et 90 C, et de préférence environ 50 C. Comme indiqué précédemment, chaque acide nucléique étiquette entrant dans la constitution des oligonucléotides amorces comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. Egalement comme indiqué précédemment, chaque acide nucléique étiquette entrant dans la constitution des oligonucléotides amorces comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé, dont l'extrémité 3 ' - soit se termine au niveau du dernier nucléotide dudit vecteur clivé, et alors l'acide nucléique étiquette est constituée seulement de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, soit est plus longue d'au moins un nucléotide que sa séquence homologue, et alors l'acide nucléique étiquette est constituée de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, prolongé en 3' d'au moins un nucléotide. Ainsi, chaque acide nucléique étiquette entrant dans la constitution des oligonucléotides amorces est constitué d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée de la partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotide. Avantageusement, chaque acide nucléique étiquette entrant dans la constitution des oligonucléotides amorces comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C. L'invention concerne donc aussi les oligonucléotides constituant des amorces pour la préparation par PCR d'une molécule d'acide nucléique contenant un fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur clivé, susceptible d'être utilisés dans la méthode décrite précédemment. Un tel oligonucléotide est composé de deux parties : - une partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer, - une partie en 5', constituant un acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. la partie 3' d'un tel oligonucléotide comprend de 5 à 20 nucléotides dont la séquence est suffisamment homologue à celle d'une extrémité du fragment d'acide nucléique pour s'hybrider à ladite extrémité à une température comprise entre 30 et 90 C, et de préférence environ 50 C. La partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette d'un tel oligonucléotide comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité d'un vecteur clivé qui est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. La partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette d'un tel oligonucléotide est avantageusement constituée d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée de la partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotide. La partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette d'un tel oligonucléotide comprend de préférence une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C. L'invention concerne aussi une paire d'amorces utile pour une réaction d'amplification par PCR d'un fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur clivé constituée de deux oligonucléotides précédents, ainsi que le produit d'amplification obtenu par une réaction PCR mise en #uvre avec ladite paire d'amorces. Un tel produit d'amplification est plus particulièrement celui préparé à l'étape (a) du procédé de l'invention, constituée d'une molécule d'acide nucléique double brin comprenant le fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, et en 5' dudit fragment un premier acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 5' d'un des brins d'un vecteur clivé, et en 3' dudit fragment un second acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 3' du même brin dudit vecteur clivé, La méthode de l'invention est remarquable en ce qu'elle peut être utilisée pour insérer dans un vecteur un fragment d'acide nucléique inconnu ou hétérogène, par exemple dans le cas de la préparation de banques d'ADN. Un tel fragment d'acide nucléique ne peut être facilement amplifié par PCR en utilisant des oligonucléotides flanquants. Il est alors possible à l'étape (a) de préparer une molécule d'acide nucléique comprenant à l'une de ses extrémités un adaptateur constitué par les première et seconde d'acide nucléique étiquette. Un exemple de préparation d'une molécule d'ADNc ayant des adaptateurs est représenté à la figure 3. Ces adaptateurs peuvent être ligués sur le fragment d'acide nucléique à insérer dans le vecteur par toute méthode connue de l'homme du métier. La méthode de l'invention est également utile pour la recherche des extrémités 5' d'une séquence d'acide nucléique. Dans ce cas on utilise pour la préparation de la molécule d'acide nucléique de l'étape (a) deux oligonucléotides composés chacun de deux parties : - une partie en 3 ' dégénérée de façon à être homologue de plusieurs séquences d'acides nucléiques, et - une partie en 5', désignée précédemment acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. Afin d'augmenter le rendement de l'insertion du fragment d'acide nucléique dans le vecteur, la méthode de l'invention comprend la répétition des étapes : b) dénaturation, c) hybridation, d) copie, c) ligation, définissant un cycle de température correspondant chacune à la réaction considérée. La méthode de l'invention trouve de nombreuses applications comme bien entendu le sous-clonage de fragments d'ADN obtenus par PCR, ou encore par exemple la construction de banques d'ADNc, la recherches d'extrémités 5' de gènes partiellement clonés, et la construction de combinaisons moléculaires complexes. L'invention concerne aussi un kit pour la mise en #uvre de la méthode de l'invention. Un tel kit comprend les produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. L'invention concerne également un kit pour la fabrication de banques d'ADNc mettant en #uvre la méthode d'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur décrite précédement. Il s'agit par exemple de construire une banque d'ADNc intégré dans un plasmide, par exemple pBM.l, à partir d'ARN messager isolé d'une lignée cellulaire ou d'un tissu. Un tel kit est composé des produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique, clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - un oligonucléotide nécessaire à la synthèse du premier brin, - deux oligonucléotides homologues à chacun des brins de l'une des extrémités du vecteur clivé, susceptibles d'être ajoutés en tant qu'adaptateurs à l'ADNc une fois celui-ci synthétisé, un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, - une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. La méthode de l'invention est également utile pour la recherche des extrémités 5' d'une séquence d'acide nucléique. Un kit pour la mise en #uvre de la méthode de l'invention dans cette application est composé des produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique, clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - deux oligonucléotides composés chacun de deux parties : - une partie en 3 ' dégénérée de façon à être homologue de plusieurs séquences d'acides nucléiques, et - une partie en 5', désignée précédemment acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent qui se rapportent la préparation de molécule d'acide nucléique comprenant le fragment d'acide nucléique à insérer, et à des applications de la méthode de l'invention : - insertion simple d'un produit de PCR, - préparation d'une construction complexe, - sous-clonage de mutants obtenus obtenus par PCR chevauchantes, - fusion de protéine, - cas d'une PCR utilisant des oligonucléotides dégénérés, - insertion d'une banque d'ADNc dans le plasmide pBM.l. Exemple 1 : Préparation de molécule d'acide nucléique comprenant le fragment d'acide nucléique à insérer. Le segment d'ADN de séquence connue est inséré dans le plasmide par PCR en utilisant des oligonucléotides amorces constitués en deux parties tels que décrits précédemment. La qualité de cette amplification peut être vérifiée en faisant migrer une partie du produit de PCR sur un gel d'agarose, et en observant la présence d'une bande d'ADN à la taille attendue. Pour éviter tout risque d'interférence des oligonucléotides résiduels lors des étapes ultérieures, il peut être nécessaire de purifier le produit de PCR par l'une des techniques classiques de purification sur gel ou sur colonne de séphacryl, etc... Dans un autre mode de mise en #uvre de la méthode de l'invention, les fragments d'ADN à insérer sont des ADNc, fabriqués à partir d'ARNm, de séquences inconnues. Dans ce cas des adaptateurs oligonucléotidiques peuvent leur être ajoutés de telle sorte qu'un des adaptateurs est homologue à l'une des extrémités du plasmide dans lequel est inséré chacun de ces fragments d'ADN, et le second adaptateur est homologue à l'autre extrémités du plasmide dans lequel est inséré chacun de ces fragments d'ADN. La seconde étape consiste à effectuer une réaction combinée en utilisant comme matrice fractionnée d'une part le vecteur clivé comme décrit précédemment, et d'autre part le produit de PCR. On ajoute à cette matrice, les enzymes nécessaires à l'activité recherchée, polymérase thermostable contenant une exonucléase et ligase thermostable, leurs tampons et substrats, ainsi qu'une série d'oligonucléotides phosphorylés complémentaires en plusieurs points du plasmide, destinés à servir de relais lors de la réaction combinée, l'efficacité de cette activité décroissant fortement avec la longueur du brin à synthétiser. Un exemple de mélange de réaction est le suivant : Produit de PCR 5 l Vecteur clivé purifié (100 ng/ l) 1 fil Vent Polymérase (5 U) 0,51 Tth ligase (40 U) 0,5 [il Tampon 10X Taq Pol 1, 25 (il Tampon 5X Tth Ligase 2 , 5 (il Mélange de relais 12 x 5 pmoles/l 2 [il dNTP 2,5 nmoles / l 0,5 l Eau désionisée 11,75 l Total 25 l Le mélange est ensuite soumis à une série de cycle de température, tels que [(94 , 1') ; (50 , 1') ; (72 , 5')] . A l'issue de cette réaction combinée, tout ou partie du mélange de réaction est directement transformé en bactéries compétentes en utilisant l'une des techniques classiques de transformation. Les bactéries sont ensuite étalées sur un milieu solide contenant le milieu sélectif correspondant au gène de résistance du plasmide employé. Après une période d'incubation adéquate, les colonies bactériennes sont individuellement examinées soit par minipréparation d'ADN plasmidique soit, avantageusement, par PCR sur colonies. La présence d'un insert correspondant à la taille attendue est alors détectée par migration électrophorétique de l'ADN sur gel d'agarose. Exemple 2 : Insertion simple d'un produit de PCR. Cet exemple correspond à l'utilisation la plus simple de la méthode de l'invention. Dans cet exemple, une grande quantité d'un vecteur plasmidique est préparée de telle sorte à pouvoir être utilisée dans le cadre de la présente technique, et pourra ainsi être utilisée pour un grand nombre d'insertion de fragment d'ADN indépendants. Cet exemple s'adapte parfaitement à la réalisation de kits de clonage de fragment d'ADN, notamment obtenu après une amplification par PCR. 1) Préparation du vecteur. pBM.l est un vecteur plasmidique d'une taille de 4 kb. Un microgramme de ce plasmide est simultanément digéré par les deux enzymes de restriction XhoI et EcoRI, dont des sites uniques sont présents au niveau du polylinker du plasmide, dans des conditions standard. Ce produit de digestion est ensuite purifié en utilisant une colonne de Séphacryl, de façon éliminer du mélange les petits fragments issus de la double digestion, potentiellement nuisibles. La préparation plasmidique est ensuite ajustée à 100 ng/l. 2) Choix des oligonucléotides. Les séquences des amorces nécessaires à l'amplification par PCR du gène à insérer dans le plasmide et les séquences des deux extrémités du plasmide pBM.1 clivé par XhoI et EcoRI étant connues, la séquence des oligonucléotides à employer dans le cadre de la présente invention peut être déterminée. La partie 3' de ces oligonucléotides est fixée par la séquence du fragment d'ADN à insérer. Dans le présent exemple, il s'agit du gène de résistance à l'ampicilline, présent sur le plasmide SK+ (Catalogue Stratagene 97/98 p312), entre deux oligonucléotides distants d'environ 700 bases l'un de l'autre, et antiparallèles. La partie 5' de ces oligonucléotides est fixée par la séquence des extrémités du plasmide pBM.l clivé, et est en outre définie par le fait qu'elle déborde cette extrémité (de un nucléotide dans l'exemple présent), et que le premier nucléotide en amont du site de sa liaison sur sa séquence complémentaire est préférentiellement une thymidine. Deux parties 5' distinctes sont définies, l'une étant complémentaire de l'extrémité XhoI du vecteur, l'autre de son extrémité EcoRI. La partie 5' XhoI a été associée à la partie 3' AmpA de façon à obtenir un oligonucléotide d'environ 40 bases, et nommé FF32. La partie 5' EcoRI a été associée à la partie 3' AmpB de façon à obtenir un oligonucléotide d'environ 40 bases, et nommé FF34. 3) Réaction de PCR. Une réaction de PCR est réalisée en utilisant le plasmide SK+ et les oligonucléotides FF32 et FF34. Vingt-cinq cycles de température [(94 , 1') ; (50 , 1') ; (72 , 1')] sont effectués en présence de 5 unités de polymérase Vent (New England Biolabs) et des concentrations en ions et en dNTP compatibles avec l'activité de cette enzyme. L'efficacité de cette réaction de PCR est contrôlée par électrophorèse en gel d'agarose d'une partie du produit de cette réaction. 4) Réaction combinée en chaîne. Une réaction combinée en chaîne est réalisée selon le protocole suivant : Produit de PCR 5 l pBM.1 clivé et purifié (100 ng/1) 1 {il Vent Polymérase (5 U) 0,5 l Tth ligase (40 U) 0,5 l Tampon 10X Taq Pol 1,25 l Tampon 5X Tth Ligase 2,5 [il Mélange de relais 12 x 5 pmoles/l 2 l dNTP 2,5 nmoles / l 0,5 l Eau désionisée 11,75 {il Total 25 [il Ce mélange de réaction est soumis à 12 cycles de température [(94 , 1') ; (50 , 1') ; (72 , 5')]. 5) Transformation du produit de réaction combinée. Dix microlitres de ce mélange de réaction sont prélevés et transformés dans des bactéries compétentes de la souche DH10B en utilisant un protocole classique de transformation par choc thermique. Le mélange de transformation est ensuite étalé sur une boite de petri supportant un milieu solide contenant une concentration optimale de Kanamycine, et incubées au moins 16 heures. 6) Examen individuel des colonies. Vingt-quatre des colonies bactériennes présentes sur la boite de petri à l' issue de l' incubation sont prélevées et testées pour la présence d'un insert au niveau du polylinker par la technique de la PCR sur colonies, en utilisant des oligonucléotides flanquants. La détection d'inserts au niveau du polylinker se fait par électrophorèse des produits de PCR sur colonies. Les résultats ce cette électrophorèse permettent d'identifier 11 colonies sur 24 contenant un insert au niveau du polylinker. Le séquençage complet de l'insert présent au niveau de deux de ces colonies bactériennes confirme que l'insertion du fragment d'ADN en utilisant la technique de l'invention s'est déroulée sans ajout ni retrait de nucléotides au niveau des jonctions. Exemple 3 Préparation d'une construction complexe. Cet exemple fait référence au précédent, mais en diffère en ce que, à l'étape 2), six oligonucléotides sont déterminés de façon à obtenir une construction composée de trois fragments de PCR amplifiés de telle sorte que leurs extrémités soient homologues deux à deux comme montré sur la représentation schématique donnée à la figure 5 en annexe). La troisième étape du protocole est dans cet exemple constitué de trois PCR indépendantes effectuées avec trois paires d'oligonucléotides et trois matrices différentes, comme montré à la figure 5 en annexe. Cinq microlitres de chacun de ces trois produits de PCR sont mélangés, et les autres réactifs nécessaires à effectuer la réaction combinée telle que décrite dans l'exemple précédent leur sont ajoutés. Le protocole est ensuite identique à celui de l'exemple précédent. 30% des colonies examinées contiennent un insert composé de la succession des trois fragments de PCR telle qu'explicitée à la figure 5. Exemple 4 : Sous-clonage de mutants obtenus obtenus par PCR chevauchantes. Une technique de mutagenèse utilisée par un grand nombre de laboratoires implique la réalisation de deux produits de PCR, dont les extrémités sont homologues et constituées par un oligonucléotide contenant la mutation désirée. Dans un deuxième temps, les deux produits de PCR sont traditionnellement utilisés comme matrice dans une seconde réaction de PCR, chevauchante au niveau des extrémités homologues, et en utilisant des oligonucléotides flanquant l'ensemble. Ce grand produit de PCR est ensuite sous-cloné dans un plasmide. La méthode de l'invention présente une amélioration de cette technique, permettant de grouper les étapes de PCR chevauchante et de sous-clonage. Cet exemple est proche des deux précédents, et respecte l'ordre et la composition de leurs étapes. Toutefois, dans la seconde étape, le choix des oligonucléotides fait intervenir, outre les deux oligonucléotides décrits dans l'exemple 3, deux oligonucléotides internes au fragment à muter, contenant la mutation désirée, et complémentaires, nommés ici MutA et MutB (figure 6). Dans la troisième étape, deux réactions de PCR sont effectuées en utilisant comme matrice le fragment d'ADN dans lequel introduire une mutation, la première au moyen des oligonucléotides FF32 et MutA, la seconde au moyen des oligonucléotides FF34 et MutB. Dans la quatrième étape, les deux produits de PCR sont mélangés, et ce mélange est complété de façon à être le support d'une réaction combinée, selon le protocole décrit dans les premier et second exemples. La suite du protocole est identique, et permet l'obtention directe du fragment d'ADN muté sous-cloné dans le plasmide pBM.l. Exemple 5 : Fusion de protéine. Dans cet exemple, on cherche à fusionner sans disruption de phase codante, deux domaines de deux protéines différentes. La construction d'ADN doit donc se faire au nucléotide près, ce qui est difficile à réaliser par des techniques autres que celle de la présente invention. Le gène codant pour la protéine X est cloné dans le vecteur pBM.l, l'ensemble étant dans la suite appelé pBM.1-X. Le gène codant pour la protéine Y n'est pas inséré dans le plasmide pBM.l. 1) Préparation du vecteur. Le vecteur pBM.1-X est clivé d'une première part au niveau du site unique de restriction le plus proche du site de jonction, l'enzyme de restriction utilisée étant dans la suite appelée enzl. D'une seconde part, ce vecteur est clivé au niveau du site du polylinker tel que le fragment du gène de la protéine X à éliminer soit borné par les deux sites de clivage. L'enzyme de restriction utilisée pour ce second clivage est baptisée enz2. Le vecteur est ensuite isolé de la partie du gène A à éliminer par purification sur gel, en utilisant l'une ou l'autre des multiples technique de purification de l'ADN à partir de la bande d'agarose. 2) Choix des oligonucléotides. Les deux oligonucléotides utilisés dans cet exemple sont chacun constitués de deux parties. Leur partie 3' permet l'amplification du fragment d'ADN désiré en utilisant le gène de la protéine Y comme matrice. Leurs extrémités 5' sont homologues aux extrémités du vecteur pBM.l-X Enzl Enz2. Le schéma de la jonction enz2 est comparable aux jonctions décrites dans le second exemple. La jonction enzl est légèrement différente, en ce que la jonction entre le gène de la protéine X et celui de la protéine Y, tel que préalablement déterminé, peut se situer à une distance nucléotidique relativement plus importante que dans le cas de l'exemple 2. Cette distance est comblée par l'oligonucléotide utilisé. Ainsi, le second oligonucléotide pourra contenir jusqu'à cent nucléotides, nécessaires à effectuer la jonction entre X et Y d'une part, et la position du site enzl d'autre part. A la troisième étape, la PCR est réalisée en utilisant les deux oligonucléotides tels que décrits précédemment, l'un étant potentiellement beaucoup plus long que l'autre. Hormis cette particularité, cette étape se déroule sensiblement pareillement à la troisième étape du deuxième exemple. Les quatrième, cinquième et sixième étapes se déroulent d'une façon comparable aux étapes correspondantes dans l'exemple 2. Exemple 6 Cas d'une PCR utilisant des oligonucléotides dégénérés. Dans cet exemple, deux oligonucléotides, chacun composé de deux parties, sont utilisés, d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 2. La différence majeure réside dans le fait que la partie 3' de l'un de ces deux oligonucléotides est dégénérée, c'est à dire qu'elle contient une série de 5 à 40, et de préférence environ 20 nucléotides aléatoirement constitués à certaines de ses positions, ou à chacune, d'un mélange des quatre nucléotides. Cet exemple s'adapte notamment au cas ou un expérimentateur connaît la séquence d'une partie seulement d'un gène, et où il cherche à isoler la partie qui ne lui est pas encore connue. Cet exemple s'adapte plus particulièrement au cas où un expérimentateur a déjà isolé et séquence la partie 3' d'un gène par exemple après criblage d'une banque d'ADNc, cherchant alors à isoler la partie 5' de ce même gène. 1) Préparation du vecteur. La première étape est identique à celle de l'exemple 2. 2) Choix des oligonucléotides. Deux oligonucléotides constitués chacun de deux parties doivent être déterminée. Leurs parties 5' sont identiques à celles décrites dans l'exemple 2. Leurs parties 3' sont pour l'une homologue à une partie de la séquence connue. Pour l'autre, cette séquence est constituée d'une série de nucléotides dégénérés. Chacune de ces deux parties 3' est associée indifféremment à l'une ou l'autre des parties 3'. Par exemple, l'oligonucléotide dégénéré est associé à l'oligonucléotide XhoI, tandis que l'oligonucléotide homologue à la partie connue de la séquence est associé à l'oligonucléotide EcoRI. 3) Amplification par PCR. Une PCR est réalisée en utilisant comme matrice un mélange d'ADN contenant le fragment d'ADN recherché, et de préférence l'ADN complémentaire ou génomique purifié à partir d'un tissu ou d'une lignée cellulaire dans lequel le gène correspondant à la séquence recherchée est exprimé. Le produit de cette PCR peut être observé par électrophorèse sur gel d'agarose. L'observation de bandes distinctes indique que la séquence recherchée a probablement été amplifiée. Les quatrième, cinquième et sixième étapes sont identiques à celles décrites dans l'exemple 2. A l'issue de cette série d'étapes, L'ADN plasmidique de certaines colonies bactériennes, sélectionné sur le critère de la présence d'une insertion d'ADN au niveau du polylinker du vecteur, peut être séquence. Cette séquence peut correspondre à la séquence recherchée. Exemple 7 : Insertion d'une banque d'ADNc dans le plasmide pBM.l. Dans cet exemple, il ne s'agit pas d'insérer un unique fragment d'ADN dans un vecteur clivé et purifié comme dans les exemples précédents, mais d'y insérer une banque d'ADN, c'est à dire un mélange hétérogène de fragments d'ADN. 1) Préparation du vecteur. La première étape est identique à celle décrite dans le deuxième exemple. 2) Préparation d'ADNc homologue à ses extrémités au plasmide clivé et purifié. Après avoir extrait de l'ARNm d'un tissu ou d'une lignée cellulaire, un premier brin d'ADNc est synthétisé selon l'une des procédure classique, en utilisant comme amorce un oligonucléotide composé de deux parties. La partie 3' de cet oligonucléotide est composé de plusieurs thymidines (entre 5 et 50, et de préférence environ 20). Cette partie 3' est destinée à s'hybrider sur la queue poly-A des ARNm. La partie 5' de cet oligonucléotide est homologue à l'extrémité EcoRI du plasmide pBM.l, et la déborde d'un nucléotide. En outre, en 5' de partie 5' est ajoutée un site de restriction rare, (tel que SwaI). Le second brin de l'ADNc est ensuite synthétisé selon l'une ou l'autre des techniques connues par l'homme du métier. Des adaptateurs, constitués d'oligonucléotides double-brin sont liés à cet ADNc selon une procédure de ligation classique. Ces adaptateurs se liguent indifféremment du côté 5' et du côté 3' de l'ADNc. Les ADNc ainsi obtenus sont ensuite digérés par l'enzyme SwaI, de façon à exciser spécifiquement l'adaptateur lié en 3', indésirable. Une réaction combinée en chaîne est ensuite réalisée comme à l'étape 4 de l'exemple 2. Le produit de cette réaction est ensuite transformé dans des bactéries compétentes en utilisant de préférence la technique de l'électroporation, connue pour donner une efficacité de transformation optimale. Un échantillon de ce mélange de transformation peut être prélevé, déposé sur un milieu solide contenant de la Kanamycine, et étudié par exemple par PCR sur colonies, comme décrit dans l'exemple 2, de façon à estimer le titre et la fréquence dans ce mélange de bactéries contenant un insert d'ADNc. Cette banque d'ADNc est ensuite destinée à être criblée par n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, et notamment par utilisation d'une sonde marquée ou d'anticorps couplés. REVENDICATIONS 1) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) on prépare une molécule d'acide nucléique double brin comprenant le fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, et en 5' dudit fragment un premier acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 5' d'un des brins d'un vecteur clivé, et en 3' dudit fragment un second acide nucléique étiquette comprenant une séquence nucléique complémentaire de l'extrémité 3' du même brin dudit vecteur clivé, b) on dénature ladite molécule d'acide nucléique et un vecteur clivé dont les extrémités 5' et 3' de l'un des brin sont complémentaires desdits premier et second acides nucléiques étiquettes, c) on incube ladite molécule d'acide nucléique avec le vecteur clivé dont les extrémités 5' et 3' sont complémentaires des premier et second acides nucléiques étiquettes, dans des conditions permettant l'hybridation desdits premier et second acides nucléiques étiquettes sur le vecteur clivé, d) on copie : - d'une part, le vecteur clivé dans le sens 5' vers 3' à partir de l'extrémité 3' du second acide nucléique étiquette hybridé à l'extrémité 3' du vecteur clivé, et d'autre part, le fragment d'acide nucléique dans le sens 5' vers 3' à partir de l'extrémité 3' du vecteur clivé, e) on ligature : - d'une part, l'extrémité 3' du brin néosynthétisé avec comme matrice le vecteur, avec l'extrémité 5' du premier acide nucléique étiquette hybridé à l'extrémité 5' du vecteur clivé, et d'autre part, l'extrémité 3' du brin néosynthétisé avec comme matrice le fragment à insérer, avec l'extrémité 5' du vecteur clivé, f) éventuellement on répète les étapes (b) à (e) , g) éventuellement, on transforme un hôte cellulaire pour sélectionner les vecteurs ayant intégré le fragment d'acide nucléique. 2) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon la revendication 1, caractérisée en ce que à l'étape (a) on prépare une molécule d'acide nucléique comprenant : - le fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, - de part et d'autre dudit fragment, une molécule d'acide nucléique étiquette constituée d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée du fragment d'acide nucléique à intégrer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotides. 3) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé comprise dans l'acide nucléique étiquette est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. 4) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que chaque séquence nucléique homologue d'une extrémité du vecteur clivé, comprise dans l'acide nucléique étiquette, est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C. 5) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une des quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'étape (a) la molécule d'acide nucléique est préparée par amplification du fragment d'acide nucléique à insérer dans le vecteur par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir de deux oligonucléotides amorces comportant chacun une partie en 5' constituant l'acide nucléique étiquette, dont l'extrémité 3' de la séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé : - soit se termine au niveau du dernier nucléotide dudit vecteur clivé, et alors l'acide nucléique étiquette est constitué seulement de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, - soit est plus longue d'au moins un nucléotide, et alors l'acide nucléique étiquette est constitué de ladite séquence homologue à l'extrémité du vecteur clivé, prolongé en 3' d'au moins un nucléotide. 6) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le vecteur est un vecteur plasmidique contenant avantageusement un marqueur de résistance à un antibiotique, et qui est clivé au niveau d'un ou de deux sites de restriction. 7) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les étapes de copie (d) et de ligation (e) consiste à soumettre, après la dénaturation de l'étape (b) et l'hybridation de l'étape (c) la molécule d' acide nucléique préparé à l'étape (a) et le vecteur clivé, à l'action d'une polymérase et d'une ligase thermostables. 8) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les étapes de copie (d) et de ligation (e) sont réalisées soit successivement soit sensiblement simultanément. 9) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'étape (d) est effectuée en présence d'oligonuclotides relais phosphorylés homologues de différentes parties du vecteur et répartis de façon homogène sur chacun des deux brins du plasmide, à une distance entre eux de 500 à 2000 paires de bases. 10) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que à l'étape (a) la molécule d'acide nucléique est préparée par amplification du fragment d'acide nucléique à insérer dans le vecteur par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir de deux oligonucléotides amorces, chacun de ces oligonucléotides étant composé de deux parties : - une partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer, - une partie en 5', constituant l'acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. 11) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon la revendication 10, caractérisée en ce que la partie 3' de chaque oligonucléotide amorce comprend de 5 à 20 nucléotides dont la séquence est suffisamment homologue à celle de chacune des extrémités du fragment d'acide nucléique pour s'hybrider à ladite extrémité à une température comprise entre 30 et 90 C, et de préférence environ 50 C. 12) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que la partie 5' de chaque oligonucléotide amorce constituant l'acide nucléique étiquette comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. 13) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que la partie 5' de chaque oligonucléotide amorce constituant l'acide nucléique étiquette est constituée d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée de la partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotides. 14) Méthode d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisée en ce que la partie 5' de chaque oligonucléotide amorce constituant l'acide nucléique étiquette comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C. 15) Un kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, - une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. 16) Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour la fabrication de banques d'ADNc. 17) Un kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 appliquée à la fabrication de banque d'ADNc, caractérisé en ce qu'il comprend les produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique, clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - un oligonucléotide nécessaire à la synthèse du premier brin, - deux oligonucléotides homologues à chacun des brins de l'une des extrémités du vecteur clivé, susceptibles d'être ajoutés en tant qu'adaptateurs à l'ADNc une fois celui-ci synthétisé, - un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, - une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. 18) Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour insérer un fragment d'acide nucléique inconnu ou hétérogène dans un vecteur. 19) Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour la recherche des extrémités 5' d'une séquence d'acide nucléique. 20) Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que les deux oligonucléotides amorces mis en #uvre pour la préparation de la molécule d'acide nucléique de l'étape (a) sont composés chacun de deux parties : - une partie en 3 ' dégénérée de façon à être homologue de plusieurs séquences d'acides nucléiques, et - une partie en 5', constituant l'acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. 21) Un kit pour la mise en #uvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 appliquée à la recherche des extrémités 5' d'une séquence d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend les produits suivants, proposés séparément ou sous forme de mélange : - un vecteur plasmidique, clivé dans son polylinker au niveau d'un ou de préférence de deux sites non compatibles, une série d'oligonucléotides relais complémentaires de régions du vecteur, - deux oligonucléotides composés chacun de deux parties : - une partie en 3 ' dégénérée de façon à être homologue de plusieurs séquences d'acides nucléiques, et - une partie en 5', constituant l'acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. - un tampon compatible avec l'activité simultanée d'une polymérase thermostable et d'une ligase thermostable, - une polymérase thermostable possédant de préférence une activité exonucléasique additionnelle, - une ligase thermostable, - une quantité suffisante de chacun des quatre désoxyribo-nucléotides. - éventuellement, de bactéries compétentes aptes à être transformées. 22) Un oligonucléotide constituant une amorce pour la préparation par PCR d'une molécule d'acide nucléique contenant un fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur, susceptible d'être utilisé dans une méthode selon l'une quelconque des revendication 1 à 14, caractérisée en ce que chacun ledit oligonucléotide est composé de deux parties : - une partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer, - une partie en 5', constituant un acide nucléique étiquette, comprenant une séquence nucléique homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé. 23) Un oligonucléotide selon la revendication 22, caractérisé en ce la partie 3' comprend de 5 à 20 nucléotides dont la séquence est suffisamment homologue à celle d'une extrémité du fragment d'acide nucléique pour s'hybrider à ladite extrémité à une température comprise entre 30 et 90 C, et de préférence environ 50 C. 24) Un oligonucléotide selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité d'un vecteur clivé qui est complémentaire d'une séquence du vecteur bordée par une Thymidine (T) en 3'. 25) Un oligonucléotide selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette est constituée d'une séquence nucléique, de l'ordre de 10 à 150 nucléotides et de préférence de l'ordre de 15 à 100 nucléotides, homologue à l'une des extrémités d'un vecteur clivé, ladite séquence nucléique homologue étant éventuellement séparée de la partie en 3' homologue à une extrémité du fragment à insérer par au moins un nucléotide et de préférence entre 1 et de l'ordre de 130 nucléotide. 26) Un oligonucléotide selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que la partie 5' constituant l'acide nucléique étiquette comprend une séquence nucléique homologue de l'extrémité du vecteur clivé qui est suffisamment homologue pour s'hybrider à ladite extrémité du vecteur clivé à une température comprise entre 30 et 90 C, de préférence entre 30 et 70 C et tout préférentiellement à une température de 50 C. 27) Une paire d'amorce utile pour une réaction d'amplification par PCR d'un fragment d'acide nucléique à insérer dans un vecteur clivé caractérisée en ce qu'elle est constituée de deux oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 22à 26. 28) Un produit d'amplification obtenu par une réaction PCR mise en #uvre avec une paire d'amorces selon la revendication 27.