Brevet FR2791138A1 — publié le 20000922

Réactif pour la détermination des leucocytes et la mesure de l'hémoglobine dans un échantillon de sanq L'invention se rapporte aux analyses hématologiques. Elle concerne plus particulièrement un réactif pour la déter- mination des leucocytes et la mesure de l'hémoglobine dans un échantillon de sang. L'invention vise également à procurer un tel réactif qui permet l'identification d'une sous-population leucocytaire, en particulier les polynucléaires basophiles. La détermination des leucocytes, en particulier de certaines souspopulations leucocytaires, ainsi que la mesure de la concentration en hémoglobine des êrythrocytes ou globules rouges sont très importantes pour le diagnostic en pathologie humaine. On rappelle ici que les leucocytes, ou globules blancs humains, sont divisés en cinq sous-populations, à savoir trois sous-populations principales: les lymphocytes, monocytes et polynucléaires ou granulocytes, ces derniers étant eux-mêmes subdivisés en neutrophiles, éosinophiles et basophiles, en fonction des caractéristiques de leurs granules cytoplasmiques. La détermination des leucocytes totaux ainsi que l'identifi- cation de leurs différentes sous-populations sont réalisées par l'intermédiaire de techniques traditionnelles d'observa- tion microscopique, ou de techniques plus modernes, fondées principalement sur la mesure de variations de résistivité (WO 84/03771) ou la diffraction optique (US 3 740 143) développées pour des appareils automatiques spécifiques. Pour l'identification des sous-populations leucocytaires, la numération des granulocytes basophiles est particulièrement délicate étant donné que cette population ne représente, chez un individu sain, que 0,5 % à 1 % de la population leucocy- taire totale. On observe une augmentation de cette population basophile, qui atteint alors une proportion de 2 à 3 % en poids, lors de réactions allergiques. Parmi les infections, ce sont la tuberculose et la varicelle qui peuvent entraîner une basophilie et, pour les maladies métaboliques, le myxoedème et les hyperlipidémies. Par conséquent, la numération des granulocytes basophiles revêt une importance particulière. Le Brevet FR 90 01660 et son équivalent US 5 196 346 décri- vent un réactif qui préserve les granulocytes basophiles, de façon à permettre leur détermination par mesure de résistivi- té. Cependant, ce réactif ne permet pas la mesure de l'hémo- globine. Or, rappellera que l'hémoglobine est une chromo-protéine contenue dans les globules rouges du sang ou érythrocytes. La mesure de la concentration en hémoglobine nécessite donc l'utilisation d'un réactif de lyse cellulaire capable de provoquer la lyse des érythrocytes, afin de libérer l'hémo- globine pour sa mesure. Il est connu pour cela d'utiliser des réactifs contenant au moins un détergent et des ions cyanures capables de procéder à la transformation de ''hémoglobine en un composé chromogène pour permettre sa détermination par mesure de colorimétrie. Un réactif cyanuré de ce type est décrit dans les Brevets US 3 874 852 et US 3 854 914. Toutefois, ces réactifs ont pour inconvénient principal d'utiliser du cyanure. De plus, ils ne permettent pas d'identifier et de quantifier les sous-populations leucocy- taires contenues dans l'échantillon de sang à analyser. Il est à noter que des réactifs, ne contenant pas de cyanure et permettant la détermination des leucocytes en plus de la mesure de l'hémoglobine, ont déjà été proposés dans l'art antérieur. Ainsi, le document WO 96 02841 décrit un réactif de mesure de l'hémoglobine sans cyanure, lequel contient un détergent ainsi qu'un sel d'hydroxylamine. Ce réactif peut être utilisé pour la numération des leucocytes totaux, mais aucune différentiation leucocytaire n'est possible. Le Brevet US 5 242 832 décrit un réactif similaire qui permet également une identification leucocytaire partielle. Cepen- dant, ce réactif ne permet pas l'identification des cellules basophiles, mais seulement l'évaluation des lymphccytes, monocytes et granulocytes. Le document WO 98 32016 décrit aussi un réactif de ce type. Toutefois, les sous-populations granulocytaires minoritaires, que sont les éosinophiles et les basophiles, ne sont pas identifiées par le réactif décrit dans cette publication. L'invention a notamment pour but de surmonter les inconvé- nients des réactifs connus. Elle vise en particulier à procurer un réactif d'analyse hématologique pour la détermination des leucocytes, et en particulier l'identification et la quantification d'une sous- population leucocytaire, que constituent les cellules basophiles, et cela dans un échantillon de sang total. L'invention vise également à procurer un réactif permettant notamment la lyse des érythrocytes ou globules rouges, nécessaire à la détermination des leucccytes ainsi qu'à la mesure de l'hémoglobine. Elle vise aussi à procurer un tel réactif d'analyse hématolo- gique sous la forme d'un réactif unique, et non pas d'un système de réactifs. Elle vise encore à procurer un tel réactif d'analyse hémato- logique qui ne comporte pas de composés cyanurés. En outre, l'invention vise à procurer un tel réactif hémato- logique convenant tout particulièrement aux automates hématologiques. L'invention propose à cet effet un réactif d'analyse hémato- logique du type défini ci-dessus, lequel comprend essentiel- lement: - un système tampon propre a ajuster sélectivement le pH du réactif à une valeur acide, en particulier inférieure à 3; - au moins un détergent de type cationique; et - un composé nitrogéné. Le système tampon du réactif est un constituant clé car le pH du réactif permet l'ident fication de la sous-population constituée par Les cellules bascph.._es, lesquelles sont d'un intérêt particulier. En effet, du fait de leurs caractéristiques biochimiques, les cellules basophiles sont susceptibles de résister plus longtemps que les autres sous-populations leucocytaires à l'agressivité d'un pH acide. Cette propriété Dermet donc leur isolement et leur ident-fication, notamment par une mesure résistive. Avantageusement, le système tampon est choisi pour que la valeur de pH du réactif soit inférieure à 3, et de préférence égale à 2,4. Le système tampon est avantageusement choisi parmi les suivants: chlorure de potassium / acide chlorhydrique; - acide tartarique / hydroxyde de sodium; - acide citrique / hydroxyde de sodium; - potassium hydrogénophtalate / acide chlorhydrique; - acide citrique / di- sodium hydrogénophosphate; et - acide borique / acide citrique / potassium dihydrogénophos- phate. Les détergents de type cationique exercent une fonction de lyse des globules rouges ou érythrocytes, ce qui permet de libérer l'hémoglobine qui peut être ensuite déterminée par mesure d'absorbance. D'une manière générale, Les détergents ioniques (anioniques et cationiques), sont principalement utilisés pour dissocier les complexes protéiques et solubili- ser les protéines des membranes. Ils sont dits dénaturants. Leur action est rapide et donc compatible avec les contrain- tes de cadence spécifiques aux appareils automatiques. Le détergent est avantageusement choisi parmi les composés suivants: - les amines primaires, 'es acétates et chlorhvdrates d'amines grasses; - les sels d'ammonium quaternaire et le bromure de trimé- thylcéthyl ammonium; - les amides de diamines substituées, cationisées par le sulfate d'éthyle, la diéthanolamino-propylamine ou le diéthylamino-propylamide; et - les amides de diéthylénetriamine cyclisés. Le composé nitrogéné exerce essentiellement une fonction de stabilisation physico-chimique des dérivés d'oxydation de l'hémoglobine. c Ce composé nitrogéné est avantageusement une thiourée, en particulier la,3-diméthyl-2-thiourée. Le réactif de l'invention peut comprendre en outre au moins un sel inorganique. Ce sel, s'il est présent, inte-vient dans l'activité déter- gente et permet de maintenir dans les limites de la normalité les phénomènes d'osmose au niveau des membranes cellulaires, ce qui est important pour la détermination des cellules basophiles. Ce sel joue également un rôle dans les méthodes de mesure de résistivité qui sont généralement appliquées dans les automates hématologiques. Le sel inorganique est avantageusement constitué par un sel de métal alcalin. En tant que sels utilisables, on peut citer principalement les chlorures ou sulfates de sodium ou de potassium. De manière préférentielle, le détergent est présent à une concentration de 0,2-20 g/l et le composé nitrogéné à une concentration de 0,1-10 g/l. L'invention sera décrite maintenant en référence à l'exemple non limitatif suivant. EXEMPLE On prépare un réactif d'analyse hématologique à partir des composés cidessous, et dans les concentrations indiquées: Composés Concentrations chlorure de potassium 5-10 g/1 1,3- diméthyl-2-thiourée 6,5-3 g/l dodecyltriméthyl ammonium 0,5-5 g/l chlorure potassium hydrogénophosphate/HCl 1,0-10 g/l Les composés ci-dessus sont mélangés et le pH est ajusté à une valeur acide inférieure A 3, et typiquement de l'ordre de 2,4. A l'aide de ce réactif, on procède à des analyses hématolo- giques sur un échantillon de sang total humain en utilisant un automate d'hématologie. Pour cela, on met en contact 10p1 de l'échantillon de sang total avec 2ml du réactif ci-dessus à 35 C. On procède à différents types d'analyses en comparant le réactif de l'invention avec un ou plusieurs réactifs de référence. Le réactif de référence est une lyse utilisée dans las automates hématologiques afin de reproduire le dosage de l'hémoglobine suivant la méthodologie classique, non auto- matique, dite de Drabkin. Il s'agit du dosage de la cyanmé- thémoglobine. Selon cette méthode, le fer ferreux (Fe++) de!'hème des hémoglobine, oxyhémoglobine et carboxyhémoglobine contenues dans les globules rouges est oxydé en fer ferrique (Fe+++) par le cyanure de fer pour former la méthémoglobine. La méthémoglobine se combine ensuite avec des ions cyanure pour former la cyanméthémoglobine, laquelle est mesurée par spectrophotométrie à 540 nm [Drabkin, J. Biol. Chem. 112:51 (1935)]. Par contre, le réactif de l'invention est utilisé dans un mode de dosage sans cyanure. L'hémoglobine érythrocytaire est éluée par l'action d'un agent de lyse approprié. Le fer hémique de l'hémoglobine éluée est oxydé par l'action combinée du composé érythrolytique et de l'oxygène dissous dans la solution. La méthémoglobine libre est instable si on la compare à la cyanméthémoglobine. On utilise donc des composés ayant des atomes donneurs d'électrons pour réduire le fer hémique et stabiliser la méthémoglobine. Le réactif de l'invention est utilisé pour différents types d'analyses effectuées sur un automate hématologique. ) Numération des leucocytes On procède à une numération des leucocytes ou globules blancs totaux. On compare les résultats de mesure obtenus avec le réactif de l'invention et avec un réactif de référence qui ne permet pas de différentiation leucocytaire même partielle. La figure 1 montre les valeurs de mesures exprimées en milliers de cellules, d'une part pour le réactif de réfé- rence représenté en abscisse, et d'autre part pour le réactif de l'invention représenté en ordonnée. Le graphique montre une excellente corrélation entre les deux types de mesures. Les valeurs du coefficient de corré- lation (R2 = 0,99) et de la pente de la droite de régres- sion (0,99) indiquent une très bonne corrélation. 2) Différentiation et numération des Dolynucléaires baso- philes La figure 2 montre la courbe résultant de l'analyse résis- tive d'un échantillon de sang total avec le réactif de l'invention décrit plus haut. Cette courbe représente un histogrammme de répartition des cellules en fonction de leurs tailles. L'axe des x (abscisse) correspond à la détermination des volumes cellulaires (p3) calculés par une mesure résistive. Les polynucléaires basophiles se situent à droite du cur- seur central (BAS). A gauche de ce curseur central se trouvent toutes les autres sous-populations leucocytaires non différentiables volumétriquement du fait de la forte agressivité du pH du réactif. Dans l'exemple, on identifie des polynucléaires basophiles qui représentent une proportion de 6,2 % (en volume) par rapport à la population leucocytaire totale. 3) Mesure de l'hémoglobine On effectue une mesure de l'hémoglobine avec le réactif de l'invention et on compare les résultats de mesures de la concentration en hémoglobine avec le réactif de l'invention et un réactif de référence contenant des composés cyanurés. La figure 3 montre les -aleurs de concentrations en hémo- globine (exprimées en grammes/litre) obtenues par le réac- tif de référence (représentation en abscisse) et le réactif de l'invention (représentation en ordonnée). Là encore, les valeurs du coefficient de corrélation (R2 = 0,99) et de la pente de la droite de régression (1,09) indiquent une très bonne corrélation. Ainsi, l'invention procure un réactif unique qui permet la détermination des leucocytes, l'identification d'une sous- population leucocytaire (en particulier les polynucléaires basophiles) et la mesure de l'hémoglobine, et cela sans utilisation de composés cyanures. Le réactif de l'invention présente notamment la particula- rité de permettre la mesure de l'hémoglobine dans des conditions très acides par rapport aux réactifs connus. !0 En outre, ce réactif se présente sous la forme d'un réactif unique, et non d'un système de plusieurs réactifs, et il convient tout spécialement aux analyses effectuées sur des automates hématologiques. 5 Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'exemple de réalisation décrit précédemment et s'étend à d'autres variantes de réalisation. !1 Revendications 1. Réactif pour la détermination des leucocytes et des polynucléaires basophiles, ainsi que pour la mesure de l'hémoglobine dans un échantillon de sang, caractérisé en ce qu'il comprend: - un système tampon propre à ajuster sélectivement le pH du réactif à une valeur acide, en particulier une valeur infé- rieure à 3; - au moins un détergent de type cationique; - un composé nitrogéné. 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système tampon est propre à ajuster le pH à une valeur égale à 2,4. 3. Réactif selon l'une des revendications 1 et 2, carac- térisé en ce que le système tampon est choisi parmi: - chlorure de pctass um / acide chcrhydrique - acide tartarique / hydroxyde de sodium; acide citrique / hydroxyde de sodium; - potassium hydrogénophtalate / acide chlorhydrique; - acide citrique / di-sodium hydrogénophosphate; et - acide borique / acide citrique / potassium dihydrogéno- phosphate. 4. Réactif selon l'une des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que le détergent est choisi parmi: - les amines primaires, les acétates et chlorhydrates d'amines grasses; - les sels d'ammonium quaternaire et le bromure de trimé- thylcéthyl ammonium; - les amides de diamines substituées, cationisées par le sulfate d'éthyle, la diéthanolamino-propylamine ou le diéthylamino-propylamide; et - les amides de diéthylénetriamine cyclisés. 5. Réactif selon l'une des revendications i àa 4, caracté- risé en ce que le composé nitrogéné est une thiourée, en particulier la 1,3-diméthyl-2-thiourée. 6. Réactif selon l'une des revendications 1 à 5, caracté- risé en ce qu'il comprend en outre au moins un sel inorga- nique. 7. Réactif selon la revendication 6, caractérisé en ce que le sel inorganique est un sel de métal alcalin. 8. Réactif selon l'une des revendications 6 et 7, carac- térisé en ce que le sel inorganique est choisi parmi les chlorures et sulfates de sodium ou de potassium. 9. Réactif selon l'une des revendications 1 a 8, caracté- risé en ce que le détergent est présent à une ccncentration de 0,2-20 g/l et le composé nitrogéné à une concentration de 0,1-10 g/l. 10. Réactif selon l'une des revendications 1 à 9, caracté- risé par la composition suivante: Composés Concentrations chlorure de potassium 5-10 g/l 1, 3-diméthyl-2-thiourée 0,5-3 g/1 dodecyltriméthyl ammonium 0,5-5 g/l chlorure potassium hydrogénophosphate/HC! 1,0-10 g/l