Brevet FR2791361A1 — publié le 20000929

Fragment d'acide nucléique comprenant un gène fonctionnel dans Magnaporthe et un transposon Impala La présente invention concerne un nouvel outil de mutagénèse performant, permettant la création d'une collection de mutants chez les champignons filamenteux, en particulier Magnaporthe grisea, par insertion aléatoire du transposon Impala caractérisé chez Fusarium oxysporum dans le génome des dits champignons. Ceci requiert la mise en place de systèmes de sélection adaptés à Magnaporthe permettant de repérer l'excision et la réinsertion de l'élément dans le génome ainsi que de le stabiliser. Les transposons peuvent être définis comme des éléments génétiques mobiles capables de se déplacer entre deux séquences d'ADN non homologues. De par leur capacité à s'insérer dans des gènes (exons, introns, régions régulatrices), ils peuvent être la source de mutations. Ils participent, de ce fait, à l'évolution des génomes qu'ils parasitent. Les transposons ont été classifiés en deux groupes selon leur mode de propagation (Finnegan, 1989 ; Capy et al., 1998) : - Les éléments de classe 1 (rétroéléments) transposent via un intermédiaire ARN rétrotranscrit en ADN par une transcriptase réverse. Cette classe se subdivise en rétroéléments ou rétrotransposons bordés ou non par des LTR (long terminal repeat). Parmi les rétroéléments à LTR se trouvent les éléments de la famille gypsy et de la famille copia. Ils possèdent des gènes homologues aux gènes gag et pol des rétrovirus et diffèrent par l'organisation des différents domaines fonctionnels du gène pol. De plus, la famille gypsy possède un gène homologue à env participant, chez les rétrovirus, à leur infectiosité. Parmi les rétroéléments sans LTR on distingue les LINEs possédant des gènes gag, pol et une séquence poly-A, ainsi que les SINEs, possédant également une queue poly-A mais dépourvus des séquences gag et pol; ils sont supposés dériver des éléments LINEs antérieurs (Eickbush,1992 ; Okada and Hamamda, 1997) - Les éléments de classe II transposent via un mécanisme d'excision et réinsertion de la séquence d'ADN du transposon. Leur structure générale se compose de deux séquences répétées en orientation inverse (ITR) bordant une phase de lecture ouverte codant pour une transposase nécessaire à la transposition de l'élément. Ces éléments ont été regroupés en superfamilles, suivant les homologies des séquences de leur transposases et/ou des ITRs, dont celle des Tel/mariner (Doak et al., 1994), des Fotl lPogo (Capy et al., 1998 ; et Riggs, 1996), des éléments hAT (Calvi et al., 1991), des éléments P (Kidwell, 1994) ou des éléments CACTA (Gierl 1996). Des représentants de toutes ces catégories d'éléments ont été identifiés chez les champignons filamenteux. Cependant, il est intéressant de constater que la très grande majorité des rétrotransposons à LTR des champignons caractérisés à ce jour appartiennent à la famille gypsy et les éléments de classe II, à la famille Fot1/Pogo identifiés chez Fusarium oxysporum et Drosophila melanogaster, respectivement. Différentes stratégies ont été mises en #uvre pour identifier des transposons. La première et la deuxième mettent à profit les connaissances qui dérivent des éléments caractérisés auparavant. Il s'agit de l'utilisation de sondes hétérologues utilisées dans des expériences d'hybridation de Southern ou des amplifications à l'aide d'oligonucléotides dérivés de domaines fortement conservés tels que celui de la transcriptase réverse des rétroéléments à LTR. La troisième stratégie consiste à caractériser des séquences d'ADN répétés. Dans ce cas, une hybridation différentielle entre l'ADN génomique et une sonde ribosomique est nécessaire. La dernière méthode, à la différence des trois précédentes, permet d'identifier des éléments fonctionnels et actifs ; il s'agit du piège à transposon. Cette stratégie met en #uvre l'inactivation d'un gène marqueur, dont la mutation engendrée par l'insertion de l'élément, peut être identifiée par un crible positif. Ainsi, le gène am (glutamate deshydrogénase) a permis de caractériser le rétroélément Tad, de type LINE, chez Neurospora crassa, à la suite de sa réinsertion dans ce gène (Kinsey et Helber, 1989). Le gène niaD (nitrate réductase) d'Aspergillus nidulans a également été utilisé pour piéger des transposons. En effet, une mutation inactivant ce gène confère une résistance au chlorate. L'élément de classe II Fot1 de Fusarium oxysporum, est le premier transposon à avoir été identifié grâce à l'inactivation de ce gène (Daboussi et al., 1992). D'autre part, l'utilisation du gène niaD chez cet Ascomycete a permis de piéger le transposon Impala (Langin et al., 1995) appartenant à la superfamille des éléments de type Tcllmariner. Lorsque le transposon est intégré dans le promoteur ou les introns d'un gène donné, il peut alors inactiver l'expression de ce gène. En revanche, après transposition du transposon, le gène est réactivé ce qui constitue un contrôle positif de l'événement de transposition. Une telle stratégie d'identification de la transposition a été employée dans Fusarium avec un construit comprenant le transposon Impala intégré dans la séquence de régulation promotrice du gène de la nitrate reductase (niaD) d'Aspergillus nidulans (HuaVan, 1998). En reprenant ce même construit niaDllmpala dans d'autres champignons filamenteux, et plus particulièrement Magnaporthe grisea, la transposition d'Impala n'a pu être mise en évidence chez Magnaporthe grisea, sinon à un taux extrêmement faible incompatible avec le développement d'un outil de mutagénèse, un tel résultat démontrant que le construit niaDllmpala n'est pas fonctionnel dans d'autres champignons filamenteux, et plus particulièrement dans Magnaporthe grisea, et laissant entendre que le transposon Impala lui même n'est pas fonctionnel dans ces autres champignons filamenteux. Or, un tel outil permettant la création d'une collection de mutants d'insertion dans le génome de champignons filamenteux pathogènes comme Magnaporthe est essentiel à l'étude de leur génome, permettant l'analyse des fonctions de ces différents gènes ouvrant la voie à la découverte de nouveaux composés antifongiques utiles pour le traitement des affections fongiques en santé humaine ou animale ou pour l'agriculture. Après d'intenses recherches, on a maintenant constaté que le transposon Impala était également fonctionnel dans d'autres champignons filamenteux, et plus particulièrement dans Magnaporthe grisea. La présente invention concerne donc un fragment d'acide nucléique, en particulier un fragment d'acide nucléique isolé, comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans Magnaporthe grisea liée de manière fonctionnelle à une séquence codante d'un gène marqueur, ledit fragment d'acide nucléique comprenant un transposon Impala intégré dans ladite séquence de régulation promotrice ou dans ladite séquence codante d'un gène marqueur. Par séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans Magnaporthe grisea on entend selon l'invention tout fragment d'acide nucléique, séquence de régulation promotrice de champignon, dont l'intégration dans le génome de Magnaporthe grisea permet l'expression dans ce champignon d'une séquence codante à laquelle il est lié de manière fonctionnelle. Il est entendu qu'une séquence de régulation fonctionnelle partielle, non fonctionnelle en tant que telle mais dont l'intégration aléatoire dans le génome de Magnaporthe grisea en aval d'un promoteur de Magnaporthe grisea permet l'expression de la séquence codante, n'est pas une séquence de régulation fonctionnelle dans Magnaporthe grisea selon la présente invention invention. La séquence de régulation promotrice peut être une séquence de régulation promotrice d'un gène de Magnaporthe grisea, ou peut provenir d'un autre champignon, et plus particulièrement d'un autre champignon filamenteux. De manière avantageuse, la séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans Magnaporthe grisea est constituée par la séquence de régulation promotrice du gène de nia ou gpd et préférentiellement par une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans Magnaporthe du gène niaD ou gpdA (Punt et al., 1990) d'Aspergillus nidulans. Pour être fonctionnelle dans Magnaporthe, la séquence de régulation promotrice du gène niaD d'Aspergillus nidulans a une taille de préférence supérieure à 0,3 kb, plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 1 kb. La séquence codante pour un gène marqueur est appropriée pour sélectionner les événements de transposition au moyen d'un crible simple. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence codante d'un gène marqueur est choisie parmi les séquences codantes d'un gène rapporteur, en particulier GUS (US 5 268 463, US 5 599 670) ou GFP (US 5 491 084, US 5 741 668), les séquences codantes pour un gène de tolérance à un antibiotique ou un herbicide, comme les gènes de résistance à l'hygromycine (hph : Punt et al., 1987), à la phléomycine (ble : Drocourt, 1990), à l'herbicide bialaphos (Bar: Pall et Brunelli, 1993), ou un gène de résistance aux sulfonylurées (Sweigard et al., 1997). Selon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence codante d'un gène marqueur est choisie parmi les séquences de gènes codant pour des enzymes fonctionnelles dans les champignons, en particulier codant pour une nitrate réductase (nia). De manière plus préférentielle, le gène marqueur est le gène de la nitrate réductase. Lorsque l'on intègre le fragment selon l'invention dans un champignon nia-, la souche transformée avec cette construction conserve un phénotype mutant. L'apparition de colonies nia+ sur un milieu minimum (NaN03 comme seule source d'azote) révèle l'excision de l'élément à partir du gène niaD. Ces révertants nia+ peuvent être sélectionnés sur ce milieu grâce à leur phénotype dense et aérien différent du phénotype ras des colonies nia-.Plusieurs copies d'Impala ont été identifiées chez Fusarium oxysporum. La comparaison de leur séquence a permis de définir trois sous-familles possédant des ITRs de longueur et séquence variable (Hua-Van et al., 1998). La copie Impala 160 qui a transposé dans le gène de la nitrate réductase, provient de la duplication d'une copie Impala E ancestrale appartenant à la même sous-famille que les copies A et C. L'élément Impala 160 (1280 pb) est bordé par deux séquences répétées et inversées de 27 pb encadrant une phase de lecture ouverte codant une transposase de 340 acides aminés (Langin et al., 1995).Il s'insère au niveau d'un dinucléotide TA qui se retrouve dupliqué. L'excision d'Impala est imprécise et laisse le plus souvent une cicatrice de trois nucléotides, correspondant à l'extrémité gauche ou droite de l'élément, en plus du dinucléotide TA dupliqué lors de l'insertion. De manière préférentielle, le transposon Impala est intégré dans la séquence de régulation promotrice du fragment selon l'invention. La présente invention concerne donc également un champignon filamenteux choisi parmi les champignons des genres Magnaporthe ou Penicillium, dans le génome du quel est intégré un fragment d'acide nucléique selon l'invention. La réinsertion d'Impala dans le génome du champignon permet de générer une collection de mutants d'insertion de ce champignon. La présente invention concerne donc également des mutants d'insertion de champignons filamenteux choisis parmi les champignons des genres Magnaporthe ou Penicillium, dans le génome du quel est intégré le transposon Impala. La présente invention concerne également l'utilisation du transposon Impala pour la préparation des dits mutants. Les mutants ainsi obtenus peuvent être employés pour l'étude du génome des dits champignons filamenteux. Le contrôle d'une nouvelle réinsertion du transposon peut être négligé si les mutants sont testés à un effectif proche ou en deçà du taux de transposition de l'élément de transposition. Afin de contrôler l'excision du transposon, un système à double composante peut également être préparé (Hua-Van, 1998 ; Kempken and Kuck, 1998). Celui-ci implique la construction d'un élément défectif où la transposase est inactivée, en particulier par mutation, par délétion ou par remplacement par un gène marqueur dont le gène de résistance à l'hygromycine ou la GFP et pouvant être mobilisé grâce au maintien des ITRs, par une transposase fonctionnelle placée sur un deuxième vecteur intégratif, sous le contrôle d'un promoteur inductible ou placée dans un vecteur réplicatif contenant la séquence AMA1 d'Aspergillus nidulans (Gems et al., 1991), sous le contrôle de son propre promoteur ou d'un promoteur constitutif. Dans ce dernier cas, en absence de pression de sélection permettant le maintien du plasmide réplicatif, la transposase est perdue et le transposon stabilisé . Les moyens nécessaires à la préparation d'un tel système sont bien connus de l'homme du métier. La présente invention concerne enfin un fragment d'acide nucléique décrit précédemment dans lequel la transposase du transposon Impala a été inactivée, en particulier par mutation, par délétion ou par remplacement par un gène marqueur. Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention sans toutefois chercher à en limiter la portée. Description des figures Figure 1 : Cartographie du plasmide pNi 160 Figure 2 : Cartographie du plasmide pNil60+ (A) et du plasmide pAN301 (B) ayant servi à sa construction Figure 3 : Analyse moléculaire des cotransformants obtenus en REMI BamHI à l'aide des vecteurs pNi 160 et pCB1179. L'ADN des cotransformants est extrait, digéré par EcoRI et chargé sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE IX (5 g par piste). Après migration et transfert sur membrane de nylon positive, les fragments d'ADN sont révélés par hybridation Southern à une sonde radioactive correspondant au fragment EcoRI de 2,7kb du gène niaD présent dans pAN301. Figure 4 : moléculaire des révertants nia+ C14-1 et C14-2. L'ADN des révertants est extrait, digéré par EcoRI et chargé sur gel d'agarosel% dans le tampon TAE IX (5 g par piste). Après migration et transfert sur membrane de nylon positive, les fragments d'ADN sont révélés par hybridation Southern. A : Analyse du révertant C14-1 à l'aide d'une sonde radioactive correspondant au fragment EcoRI de 2,7kb du gène niaD présent dans pAN301 (piste 1) ou à l'ORF codant la transposase d'Impala (piste 2). B : Analyse des révertants C14-1 et C14-2 après les avoir purifié en isolant des monospores nia+. Les profils des révertants C14-1 (pistes 3 et 4) et des révertants C14-2 (pistes 5 et 6) sont comparés au profil du cotransformant C14 nia- d'origine (pistes 1 et 2). La sonde utilisée correspond à l'ORF codant la transposase d'Impala. Figure 5 : moléculaire de révertants nia+ issus d'un cotransformant obtenu à l'aide du vecteur pNil60+. L'ADN des cotransformants est extrait, digéré par EcoRI et chargé sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE IX (5 g par piste). Après migration et transfert sur membrane de nylon positive, les fragments d'ADN sont révélés par hybridation Southern à une sonde radioactive correspondant à l'ORF codant la transposase d'Impala. Figure 6 : Cartographie du plasmide pCITn Figure 7 : Cartographie du plasmide pHIN Figure 8 : Cartographie du plasmide pE06 Figure 9 : du plasmide pHIN+ Figure 10 : moléculaire de révertants nia+ issus du cotransformant D1 obtenu après transformation par le système à double composante. L'ADN des cotransformants est extrait, digéré par EcoRI et chargé sur gel d'agarose 1% dans le tampon TAE IX (5 g par piste). Après migration et transfert sur membrane de nylon positive, les fragments d'ADN sont révélés par hybridation Southern à une sonde radioactive correspondant à un fragment amplifié à partir du gène hph. Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al ou dans Sambrook et al., 1989. Exemple I. Mutagénèse insertionnelle par une copie autonome d'Impala. 1. Constructions disponibles. Le plasmide pNi 160 possède la copie Impala 160 intégrée dans la région promotrice du gène niaD d'Aspergillus nidulans, à 10 pb du codon ATG. Sa construction dérive du piège à transposon réalisé chez la souche F24 de Fusarium oxysporum transformée par le plasmide pAN301 (Malardier et al., 1989) possédant le gène de la nitrate réductase d'Aspergillus nidulans (Daboussi et al., 1992). La sélection de mutations spontanées dans le gène niaD a permis de caractériser chez le transformant TR7, portant une seule copie de pAN301, une insertion de 1,3 kb. Cette insertion est présente dans la région EcoRI-EcoRI de 2,7 kb de pAN301, ce qui a pour effet de générer un fragment EcoRI de 4 kb. Ce fragment a été cloné au site EcoRI de pUC19 après construction d'une banque génomique partielle et criblage par le fragment EcoRI de 2,7 kb provenant de pAN301 (Langin et al., 1995). Parallèlement le plasmide pi lANdel a été construit à partir de pAN301 en délétant un fragment Ndel de 7,8 kb placé en aval du gène niaD, ainsi qu'un fragment EcoRI-BamHI de 1 kb correspondant à la plus grande partie du promoteur du gène niaD (Langin et al., 1990). Le remplacement du fragment EcoRI de 2,7 kb présent dans p11#NdeI par le fragment de 4kb comportant le fragment de 2,7 kb de la nitrate reductase et l'élément Impala 160 a permis d'obtenir le plasmide pNil60 dans lequel l'élément est inséré dans la région promotrice du gène niaD, présentant ici une taille de 0,3 kb (figure 1) 2. Constructions réalisées. Le plasmide pNi160+ dérive du plasmide pNi160, par l'addition d'un fragment de 1 kb du promoteur du gène niaD présent dans pAN301. Pour ce faire, le plasmide pAN301 possédant 1,3 kb de promoteur niaD a été délété du fragment NdeI de 7,8 kb présent en aval de ce gène donnant le plasmide intermédiaire pAN301ANdeI. Puis son fragment BamHI-ApaI de 1 kb a été remplacé par un fragment BamHI-ApaI de 2,3 kb, provenant du plasmide pNil60 et possédant la même portion du gène niaD que le fragment de 1 kb plus l'élément Impala 160 (figure 2). 3. Transformation de Magnaporthe grisea La souche de Magnaporthe grisea G 11.174 présente une mutation ponctuelle dans le gène de la nitrate reductase responsable de son phénotype nia-. Son obtention est décrite dans l'article Daboussi et al., 1989. Elle est repiquée sur un milieu solide à base de farine de riz, à partir duquel il est possible de récolter des conidies du champignon. Le milieu liquide TNKYE préparé d'après le milieu B de Tanaka (Ou et al., 1985) permet de récolter du mycélium en vue d'extraire l'ADN génomique ou d'obtenir des protoplastes selon les protocoles décrits par Sweigard et al. (1990) et Sweigard et al. (1992). Le milieu gélosé TNK (agarose ultra pure, 8 g.l-') dépourvu d'extrait de levure (milieu MN03) permet de différencier la souche nia- G 11.174 de la souche nia+ G 11.25 ; la première présente un phénotype ras et filamenteux tandis que la seconde est dense et aérienne. 3.1. Transformation avec le plasmide pNi 160 Des protoplastes de la souche G 11.174 ont été cotransformés par le plasmide pNi 160 (apportant Impala 160) et le plasmide pCB 1179 (Sweigard et al., 1997) conférant la résistance à l'hygromycine. La méthode de transformation est décrite par Sweigard et al., 1992 et a été réalisée en présence de 4 unités de BamHI (REMI : restriction enzyme mediated integration ; Sweigard et al., 1998) et 1 g de chaque plasmide. Les protoplastes sont sélectionnés sur un milieu TNKYE où le glucose a été remplacé par du saccharose (400 pg.l-') et additionné d'hygromycine à raison de 240 g.ml-1. Afin de sélectionner les cotransformants, les colonies résistantes à cet antibiotique ont été analysées, après extraction de leur ADN génomiques, par amplification à l'aide des amorces SPE5 (5'AGAACACAACCCTGCCACGG 3') et SPE3 (5'TCCGGGCCGTATGCACAGAG 3') spécifiques du transposon Impala et générant un produit d'amplification de 573 pb. L'ADN des cotransformants a été digéré par EcoRI et analysé en Southern-blot (figure 3) en utilisant comme sonde un fragment EcoRI de 2,7 kb du gène niaD (sonde 2,7 kb) présent dans pAN301 (Malardier et al., 1989). Cette étude a permis de sélectionner 35 cotransformants possédant au moins une bande de 4 kb représentant la quasi totalité du gène nia d'Aspergillus nidulans introduit via pNil60. Ces cotransformants ont été cultivés sur milieu solide à base de farine de riz, pendant 10 à 14 jours, et les spores récoltées dans de l'eau. Après comptage, elles ont été ensemencées sur milieu gélosé MN03 à raison de 105-106 spores par boîtes. Des expériences reconstituant cette étape de sélection des révertants nia+ ont été réalisées. Nous avons ainsi observé que le milieu MN03 permet de détecter des colonies nia+ lorsque 10 spores sauvages (G11.25) sont mélangées à 106 spores du mutant nia- Gl 1.174 et incubées 14 jours à 26 C. Après 1 mois de culture à 26 C seulement un cotransformant (cotransformant Cl 4) a permis d'obtenir deux colonies (CI 4- 1 et C14-2) présentant un phénotype aérien. Ces colonies révertantes ont été récupérées et analysées par PCR à l'aide des amorces CI (5'CGCTGCGAATTCTTCAGT 3') et niaX (5'CTAGACTTAGAACCTCGG 3') encadrant le site d'insertion d'Impala160 dans le promoteur du gène niaD. L'amplification d'un produit de 200 pb révèle la présence de noyaux dans lesquels l'excision du transposon s'est produite. Afin d'obtenir des colonies homogènes, des conidies des révertants Cl 4-1 et Cl 4-2 ont été isolées sous la loupe binoculaire et cultivées séparément. Leur analyse par Southem-blot, à l'aide d'une sonde correspondant à l'ORF d'Impala permet de mettre en évidence la réinsertion de l'élément chez les deux révertants (figure 4). La cicatrice laissée par l'excision du transposon a été séquencée après clonage du produit PCR de 200 pb dans le vecteur pGEM-T easy (Promega). La cicatrice du révertant C141 est CTGTA et celle de C142, CAGTA. Ces cicatrices sont identiques à celles le plus souvent laissées par Impala lors de son excision chez Fusarium oxysporum (Langin et al., 1995). En culture sur milieu gélosé MN03, ces révertants présentent un phénotype intermédiaire entre celui des souches G 11.174 et Gl 1.25 suggérant que le gène niaD présent dans la construction pNi 160 ne permet pas de complémenter de façon optimale la mutation de la souche G11.174. Pour tester cette hypothèse, des protoplastes de cette souche ont été transformés par les vecteurs pAN301 (3g) ou pAN301ANdeI (3 g possédant le gène niaD sous contrôle de 1,3 kb de promoteur et en présence de pCB 1179 (3 g). Après étalement des protoplastes et incubation à 30 C pendant 10 jours, sur milieu MN03 additionné d'hygromycine (240 g.ml-1) et où le glucose a été remplacé par du saccharose (400 g.l-1), des colonies à phénotype nia+ apparaissent. En revanche, aucune complémentation n'a été observée lorsque le vecteur pllANdel possédant le gène niaD sous contrôle d'un fragment de promoteur de 0,3kb (comme dans le cas de pNi160) a été utilisé. Ces expériences démontrent que le promoteur tronqué présent dans pNil60 est incapable de complémenter la mutation de la souche G11.174. La sélection de deux révertants (Cl 4-1 et Cl 4-2) avec cette construction n'est pas due à l'activité intrinsèque du fragment de promoteur de 0,3 kb mais peut s'expliquer si l'on considère que chez le cotransformant C14, le gène niaD s'est inséré dans une région où il bénéficie de séquences activatrices. Ceci suggère que pllANdel pourrait être utilisé dans le but de détecter des régions activatrices dans le génome de Magnaporthe grisea. 3. 2. Transformation avec pNi 160+ (selon l'invention) Des protoplastes de la souche G 11.174 ont été cotransformés par la nouvelle construction pNil60+ (1 g), possédant le gène niaD sous contrôle d'un promoteur entier de 1,3 kb et pCB1179 (1 g), en présence de 40 unités d'enzyme Ndel. Les cotransformants ont été criblés par amplification, à l'aide des amorces SPE5 et SPE3, puis ensemencés sur milieu riz en vue d'obtenir des conidies. Celles-ci ont été étalées sur milieu MN03 (de l'ordre de 105-106 spores par boîte) afin d'identifier des révertants. L'expérience conduite sur 19 cotransformants a permis d'obtenir des révertants dans 100% des cas ; ils apparaissent dès 10 jours de culture à 26 C. Le nombre de révertants oscille entre 2 et 83 selon le cotransformant considéré. 53 révertants appartenant à 8 cotransformants différents ont été analysés en Southern-blot grâce à une sonde correspondant à la totalité de la phase codante d'Impala (figure 5). Le pourcentage de réinsertions d'Impala chez M. grisea tiré de cette expérience atteint 74 %. Parmi ces réinsertions, 95 % d'entre elles sont différentes. Plus particulièrement, des cotransformants donnant 100% de réinsertion, dont toutes sont différentes, ont été identifiés. Ces résultats démontrent que la construction pNil60+ permet, à la différence de pNi 160, la sélection chez Magnaporthe grisea de nombreux révertants ayant une nouvelle insertion du transposon. Exemple II. Intégration du transposon Impala dans le promoteur du gène gpd Un plasmide permettant le clonage d'Impala dans un promoteur contrôlant l'expression du gène de résistance à l'hygromycine (hph) a été construit. Une double digestion BglII-HindIII du vecteur pAN7. 1 (Punt et al., 1987) permet de libérer un fragment de 3981 pb contenant la totalité de l'ORF codant la phase codante du gène hph ainsi que le promoteur du gène gpd délété de ses 137 premières paires de base. Les extrémités cohésives de ce fragment ont été transformées en bouts francs grâce à l'action 5 de l'ADN polymérase. Ce fragment a été par la suite ligué à un fragment PvuII de 2,5 kb, issu du plasmide pBluescript SK-, et portant l'origine de réplication ainsi que le gène de résistance à l'ampicilline. Le plasmide qui en résulte permet l'obtention chez Magnaporthe grisea de transformants résistants à l'hygromycine. Ce vecteur nommé pCLTn (figure 6) possède un site PvuII unique situé à 30 pb en amont du point +1 de transcription dans 10 lequel peut être cloné Impala ou tout autre transposon. Exemple III. Mutagénèse insertionnelle par une copie défective et mobilisable d'Impala. L'exploitation d'un système de mutagénèse à deux composantes nécessite de montrer que 15 l'élément transposable peut être acitivé en trans. Pour cela la transposase est placée dans un premier temps, sous le contrôle d'un promoteur constitutif. Dans un second temps, la stabilisation de l'élément défectif requiert l'utilisation d'un promoteur inductible contrôlant l'expression de la transposase ou d'un plasmide réplicatif portant la transposase sous le contrôle de son propre promoteur ou d'un promoteur constitutif. L'exploitation du 20 promoteur du gène de Magnaporthe grisea codant la nitrate réductase en tant que promoteur inductible semble spécialement indiquée . Lau et Hamer (1996) ont montré par hybridation northern à l'aide d'une sonde correspondant à un clone possédant le gène de la nitrate réductase de Magnaporthe grisea, qu'il s'exprime en présence de nitrate comme seule source d'azote alors qu'il est totalement réprimé en présence d'ammonium. 25 Positionner la transposase d'Impala sous le contrôle du promoteur du gène nia de Magnaporthe grisea devrait permettre la synthèse de l'enzyme et par conséquent l'excision de l'élément défectif dans les conditions de sélection des révertants (milieu MN03) et l'inhibition de sa production, une fois le révertant obtenu, lors de sa culture sur milieu riche (présence d'ammonium ou de glutamine). 30 1. Constructions disponibles. Le plasmide pHIN dérive de pNi 160. Dans celui-ci, la transposase codée par l'élément Impala a été remplacée par le gène de résistance à l'hygromycine (gène hph) sous contrôle du gène TrpC d'Aspergillus nidulans (figure 7). Sa construction est décrite dans Hua-Van, 1998. La présence du gène hph au sein des ITRs du transposon permet de s'assurer de l'intégration de l'élément défectif dans le génome du révertant obtenu. Le plasmide pE06 dérive du plasmide pNOM102 après substitution de l'ORF codant la p-glucuronidase par l'ORF codant la transposase d'Impala obtenue par PCR à l'aide d'amorces contenant un site Ncol. Ce plasmide permet l'expression de la tranposase sous le contrôle du promoteur constitutif gpd et du terminateur TrpC d'Aspergillus nidulans (figure 8). 2. Constructions réalisées. Le plasmide pHIN+ dérive du plasmide pHIN. Il a été construit en remplaçant le fragment BamHI-ApaI de 1 kb de pAN301ANdeI par le fragment BamHI-ApaI de 2,8 kb provenant de pHIN et apportant la copie Impala défective et marquée par hph. Comme dans pNi 160+, le gène de la nitrate réductase (niaD) est sous le contrôle de son promoteur de taille 1,3 kb (figure 9). D'après nos résultats, la construction de ce plasmide est nécessaire pour sélectionner l'excision de l'élément défectif, par restauration de l'activité nitrate réductase chez Magnaporthe grisea. 3. Utilisation de ces plasmides chez Magnaporthe grisea. Des protoplastes de Magnaporthe grisea G 11.174 ont été transformés par le plasmide pHIN+ ou cotransformés par les plasmides pHIN+ et pE06. La méthode de transformation est décrite par Sweigard et al. (1992) et a été réalisé avec 1 g de chaque plasmide. Les protoplastes sont sélectionnés sur un milieu TNKYE où le glucose a été remplacé par du saccharose (400 g.l-1) et additionné d'hygromycine à raison de 240 g.ml-1. Les transformants pHIN+ sont directement sélectionnés grâce à la présence du marqueur de résistance dans l'élément défectif. Les cotransformants sont isolés parmi les colonies résistantes à l'hygromycine, après extraction de leur ADN génomique, par amplification à l'aide des amorces SPE5 décrites en IV.3. Cette étude menée sur 12 colonies résistantes à l'hygromycine a permis d'isoler 4 colonies portant également pE06. Après sporulation sur milieu solide à base de farine de riz, les spores (105-106) de ces cotransformants ainsi que de 6 transformants portant pHIN+ ont été étalées sur milieu MN03 afin de sélectionner des révertants nit+ comme décrit en IV.3. Aucun de 6 transformants portant pHIN+ n'ont donné de tels révertants. Ceci montre que la copie défective d'Impala ne peut pas être mobilisée par un transposon endogène à Magnaporthe grisea. Parmi les 4 cotransformants pHIN+/pE06, deux d'entre eux donnent des colonies aériennes (cotransformants DI et D9). L'analyse en Southern de 6 révertants issus du cotransformant Dl, après digestion de leur ADN génomique par EcoRI et hybridation avec une sonde hph de 868 pb obtenue à l'aide des amorces hygl (5'AGCCTGAACTCACCGCGACG 3') et hyg4 (5'CGACCCTGCGCCCAAGCTGC 3') permet de caractériser la réinsertion de l'élément défectif pour 4 d'entre eux (figure 10). Parmi ceux-ci deux révertants possèdent deux insertions de l'élément. Cette analyse permet de montrer que l'élément défectif peut être mobilisé, chez Magnaporthe grisea, par la transposase d'Impala apportée en trans. 4. Autres constructions. Il s'agit, dans un premier temps, de construire un plasmide où la transposase d'Impala est sous le contrôle du promoteur du gène nia cloné chez Magnaporthe grisea (pNiaI). Ce plasmide est utilisé en combinaison avec pHIN+ ou tout autre plasmide dérivé de celui-ci où le promoteur niaD d'Aspergillus nidulans, inactivé par l'insertion de l'élément défectif, contrôle l'expression des gènes marqueurs utilisés pour la sélection des révertants. Pour faciliter la sélection des cotransformants un marqueur de résistance devra être ajouté à pNiaI, différent de celui présent dans le plasmide portant la copie défective de l' élément. Dans un second temps, il s'agit de cloner la transposase sous le contrôle de son promoteur ou d'un promoteur constitutif, et plus précisément sous le contrôle du promoteur du gène gpdA, dans un vecteur portant la séquence AMA et un marqueur de sélection différent de celui présent dans l'élément défectif ou le plasmide pHIN+. Références Calvi BR, Hong TJ, Findley SD and Gelbart WM (1991) Evidence for a common evolutionary origin of inverted repeat transpsosons in Drosophila and plants : hobo, Activator and Tam3. 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Fragment d'acide nucléique comprenant dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans Magnaporthe grisea liée de manière fonctionnelle à une séquence codante d'un gène marqueur, caractérisé en ce que ledit fragment d'acide nucléique comprend un transposon Impala intégré dans ladite séquence de régulation promotrice ou dans ladite séquence codante d'un gène marqueur. 2. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence de régulation promotrice d'un gène de Magnaporthe grisea, ou d'un autre champignon, en particulier d'un autre champignon filamenteux. 3. Fragment selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est constituée par la séquence de régulation promotrice du gène de niaD ou gpdA 4. Fragment selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence de régulation promotrice du gène niaD de Fusarium fonctionnelle dans Magnaporthe grisea. 5. Fragment selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice du gène niaD de Fusarium a une taille supérieure à 0,3 kb, plus préférentiellement supérieure ou égale à environ 1 kb. 6. Fragment selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence codante d'un gène marqueur est choisie parmi les séquences codantes d'un gène rapporteur, en particulier GUS ou GFP, les séquences codantes pour un gène de tolérance à un antibiotique ou un herbicide, en particulier les gènes de résistance à l'hygromycine (hph), à la phléomycine (ble), à l'herbicide bialaphos (Bar), ou un gène de résistance aux sulfonylurées. 7. Fragment selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la séquence codante d'un gène marqueur est choisie parmi les séquences de gènes codant pour des enzymes fonctionnelles dans les champignons, en particulier codant pour une nitrate réductase (niaD) ou une nitrilase. 8. Fragment selon la revendication 7, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène de la nitrate réductase. 9. Fragment selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le transposon Impala est intégré dans la séquence de régulation promotrice du fragment selon l' invention. 10. Fragment selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la transposase du transposon Impala a été inactivée, en particulier par mutation, par délétion ou par remplacement par un gène marqueur. 11. Champignons filamenteux choisi parmi les champignons des genres Magnaporthe ou Penicillium, dans le génome du quel est intégré un fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10. 12. Champignon selon la revendication 11, caractérisé en ce que le gène marqueur est le gène de la nitrate réductase et le champignon est nia-. 13. Mutants d'insertion de champignons filamenteux choisis parmi les champignons des genres Magnaporthe ou Pénicillium, dans le génome du quel est intégré le transposon Impala. 14. Utilisation du transposon Impala pour la préparation de mutants d'insertion de champignons filamenteux choisis parmi les champignons des genres Magnaporthe ou Penicillium. 15. Utilisation des mutants selon la revendication 14 ou obtenus selon la revendication 14, pour l'étude du génome des dits champignons filamenteux.