Brevet FR2793798A1 — publié le 20001124

La présente invention concerne un oligonucléotide de 8 à 100 nucléotides de long caractérisé en ce qu'il s'hybride avec un acide nucléique codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF-Ts et en ce qu'il est capable d'inhiber l'expression de EF-Ts chez les mammifères. L'invention porte sur l'utilisation dudit oligonucléotide ou d'un composé capable d'inhiber l'expression ou l'activité de EF-Ts pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies cardio-vasculaires et du cancer. La cellule musculaire lisse (CML) artérielle est un composant majeur des plaques athéroscléreuses et resténotiques (1). On sait que la migration et la prolifération de ces cellules jouent un rôle crucial dans la formation de lésions et l'athérogénèse (2,3,4). Au cours des stades initiaux de ces processus pathologiques, les CML artérielles migrent dans l'intima, modifient le taux de myofilaments dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi (5,6), prolifèrent et produisent des composants de matrice extracellulaire (1,7,8). Ensuite, les CML se transforment en cellules spumeuses en accumulant des lipides (9,10,11). Dans ces pathologies, les CML subissent une modulation phénotypique (12,13), au cours de laquelle elles passent d'un état contractile à un état de synthèse, puis à un état proliférant. Les CML récoltées pendant les passages de culture de cellules perdent progressivement leur phénotype contractile et présentent des caractéristiques identiques à celles observées dans des CML de synthèse d'épaississement diffus de l'intima (13,14) Dans les cultures à long terme, on a observé que certaines CML aortiques de rat avaient un phénotype transformé (15,16) présentant plusieurs similitudes avec celui des cellules hautement proliférantes (17) A l'heure actuelle, de nombreuses incertitudes subsistent quant à la cascade des gènes impliqués dans les modifications du phénotype des CML (18). Certains auteurs ont suggérés que la prolifération des CML dans l'intima de la paroi du vaisseau est le résultat d'un processus inflammatoirc(l) ou bien celui d'une croissance monoclonale (19,20) Selon Ross ( 1 ), les lésions athérosclércuscs sont dues à une réponse inflammatoire fibroprolilcrative excessive à diverses formes d'agressions de l'endothélium et des CML de l'artère. Un grand nombre de facteurs de croissance, de cytokines et de molécules vasorégulatrices participent à ce processus. Après la formation de la lésion, les cellules endothéliales sécrètent des facteurs chimiotactiques qui induiraient une prolifération des CML et le dépôt de lipides. Des lipoprotéines de basse densité (LDL) qui ont été oxydées participent également à la formation des cellules spumeuses et des lésions athéroscléreuses. Par ailleurs, Benditt a émis l'hypothèse selon laquelle un processus néoplasique pourrait se déclencher pendant l'athérogénèse en réponse à un événement de mutation ou viral (19,20). En effet, il a été montré que certains gènes étaient impliqués dans la pathologie de l'athérosclérose et du cancer (21,22). L'hypothèse de Benditt est étayée par des résultats expérimentaux démontrant l'apparition de CML dans des aortes d'animaux ayant reçu des injections d'un carcinogène seul (23), en combinaison avec de la méthoxamine (24) ou avec l'herpèsvirus de Marek oncogène (25). En outre, l'ADN provenant de plaques humaines transforme complètement des cellules NIH 3T3 transfectées (26) D'autres facteurs, tels que des agents bactériens (27) (Chlamydia pneumoniae) ou viraux (28) (herpèsvirus, cytomégalovirus) ont été détectés et pourraient être impliqués dans l'initiation et le maintien des lésions athéroscléreuses. Dans le cadre de la présente invention, en utilisant la technique différenciât display , on a isolé un gène (2A3-2) qui est surexprimé dans une lignée de cellules musculaires lisses de rat en prolifération rapide, mais non dans des cellules en état de synthèse. Ceci a ensuite été confirmé par des expériences de Northern blot effectuées sur les deux types de cellules En outre, une lésion par cathéter à ballonnet de carotides de rat a montré, par une technique de Northern blot virtuel, une régulation positive de ce gène dans les vaisseaux hyperplasiques. Ce gène 2A3-2 (1,2 kb) est exprimé dans le muscle squelettique, le coeur, l'aorte, le poumon, le foie, le rein et la rate De plus, l'amplification rapide en 5' d'extrémités d'ADNc (5'RACE) a permis le clonage et le séquençage de ce gène de 1,2 kb. La comparaison de ce gène nouvellement identifié avec les séquences disponibles dans les banques de données a montré une forte homologie avec les facteurs d'élongation traductionnelle (EF-Ts) mitochondriaux humain et bovin. Ainsi, le gène 2A3-2 joue un rôle dans la cascade d'événements impliqués dans le passage des celllules d'un phénotype quiescent à un phénotype proliférant. Description La présente invention concerne un oligonucléotide de 8 à 100 nucléotides de long caractérisé en ce qu'il s'hybride avec un acide nucléique codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF-Ts et en ce qu'il est capable d'inhiber l'expression de EF-Ts chez les mammifères. Cet oligonucléotide cible la région 5'ou 3' non traduite, le site d'initiation de la traduction, ou la région codante de l'ARNm de EF-Ts. De préférence, l'oligonucléotide antisens cible la région 5' du gène. En effet, la partie amino terminale de la protéine est celle qui porte la site actif. De plus, il est toujours plus efficace de bloquer en 5', non loin du codon d'initiation de la transcription. De préférence, l'oligonucléotide selon l'invention s'hybride avec un acide nucléique comprenant au moins 80 % d'homologie avec l'ARNm du gène humain codant pour EF-Ts. Il peut comprendre une séquence ayant au moins 80 % d'homologie avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 1 ou une séquence ayant au moins 80 % d'homologie avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 2 On entend par oligonucléotides dans le cadre de l'invention, des oligonucléotides antisens d'environ 8 à 100 nucléotides de long, de préférence de 10 à 50 nucléotides de long, capables d'inhiber l'expression de la protéine EF-Ts chez un mammifère, en particulier chez les humains Les nucléotides peuvent être liés entre eux soit par des liaisons 5'-3', soit 3'-3' (nucléotides inverses). Les nucléotides selon l'invention peuvent être des 2' -déoxynucléot ides ou des nucléotidcs modifiés en 2' qui facilitent l'hybridation sur l'ARNm cible On peut citer par exemple les 2'-fluoro, les 2'-methoxy. 2'-etlioxy, 2'-mcthoxycthoxy, 2'- allyloxy (-OCH2CH=CH2)-nucléotides. Les nucléotides peuvent également être modifiés en position 3' du sucre, en particulier à l'extrémité 3' terminale des oligonucléotides (estérification avec un phosphate ou avec un analogue du phosphate). La liaison internucléotidique de l'oligonucléotide selon l'invention peut être une liaison phosphodiester, phosphorothioate ou p-ehoxyphosphodiester. L'oligonucléotide peut comporter des groupes protecteurs en ses extrémités 3' et 5', en particulier des groupes protégeant contre une attaque par les nucléases. L'extrémité 3' terminale peut être protégée de préférence en comportant une majorité de liaisons 5'-3' du type phosphorothioate ou p-alkyloxyphosphotriester et/ou comporter des nucléotides substitués en position 3' tels que par exemple des nucléotides comportant des groupes du type alkyloxy L'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon l'invention peut également comporter des liaisons phosphorothioate ou p-alkyloxyphosphotriester et éventuellement le dernier groupe 5' hydroxyle peut être estérifié avec un groupe à base de phosphore, notamment du phosphate, un groupe phosphorothioate ou p-ethoxyphosphate. Les différentes structures possibles des oligonucléotides antisens et leur procédé de synthèse sont explicités en détail dans les documents WO 98/13526, WO 98/37240, WO 98/26062, WO 98/05770, WO 98/05771 et WO 97/21808. Ces documents sont incorporés dans la description par référence. L'invention concerne également un procédé pour sélectionner les oligonucléotides antisens capables d'inhiber l'expression de EF-Ts, ladite méthode consistant à identifier, parmi les différents oligonucléotides envisageables, les oligonucléotides possédant une forte affinité pour l'ARNm de EF-Ts. Un tel procédé, basé par exemple sur le calcul de la variance de l'énergie libre, est décrit dans WO 98/37242 incorporé dans la description par référence. Ce procédé peut être mise en #uvre par l'homme du métier par des expériences de routine. Les oligonlicléotides susceptibles d'être obtenus par un tel procédé font également partie de la définition générale des oligonucléotides selon l'invention. Ainsi, l'oligonucléotide selon l'invention peut comporter au moins une modification chimique du squelette et/ou d'un ou de plusieurs nucléotide(s), certaines desdites modifications par rapport à la structure naturelle des oligonucléotides étant explicitées ci-dessus. Un autre aspect de l'invention porte sur un procédé de criblage de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Traitement d'une cellule exprimant EF-Ts avec un ou plusieurs composés, b) mesure de l'expression et/ou de l'activité de EF-Ts, c) sélection des composés inhibant l'expression de EF-Ts et qui présentent peu ou pas de toxicité vis-à-vis de ladite cellule. Il est d'un intérêt particulier de tester des composés provenant de librairies obtenues par chimie combinatoire. Les différentes étapes de ce procédé sont à la portée de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de l'expression de EF-Ts peut se faire directement en mesurant la quantité de protéine produite par rapport à la quantité naturellement présente dans les cellules non traitées. Les méthodes d'électrophorèse des protéines, de western blot ou d'immunoprécipitation sont particulièrement adaptée à cette quantification L'expression peut également être évaluée en mesurant la quantité d'ARNm synthétisé en utilisant des sondes marquées avec un agent radioactif ou fluorescent. De telles sondes comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 1ou SEQ ID n 2. L'étape b) peut également consister en une mesure de l'activité de EF-Ts Toute méthode à la portée de l'homme du métier peut être mise en oeuvre. Il est possible par exemple d'évaluer la capacité du complexe F-Tu*EC'-'rs",, de polymériser la phénylalanine comme acide aminé (polymerization assay). Le complexe est actif in vitro en utilisant d'autres facteurs d'élongation provenant éventuellement d'autres espèces, notamment des humains et des bovins. L'incorporation de phénylalanine dans un complexe peptidique est un test rapide qui permet de mesurer la quantité des molécules d'EF-Ts présent dans un échantillon sachant qu'on connaît le nombre des molécules d'EF-Tu qu'on introduit et étant donné qu'une molécule d'EF-Ts est capable de faire 10 tours de polymérization peptidique, C. J. Schwartzbach, L. L. Spermulli ; J. Biol. Chem , 1991:266, 16324-16330, incorporé dans la description par référence. L'invention porte également sur un composé susceptible d'être obtenu à partir de du procédé décrit ci-dessus. De tels composés sont couramment appelés bas poids moléculaires . Bien entendu, tout procédé équivalent visant à identifier des composés ayant une affinité pour le gène, l'ARNm ou la protéine EF-Ts et bloquant l'activité de ces derniers, est également objet de l'invention Ledit composé peut cibler une séquence spécifique sur l'EF-Ts En effet, la structure du complexe EF-Tu*EF-Ts de Escherichia coli a été élucidée (T. Kawashima, C. Berthet-Colominas, M. Wulff, S Cusack, R. Leberman, 1996. Nature 379, 511-518, incorporé dans la description par référence). Il est d'un intérêt spécial de choisir un composé interagissant sur une partie spécifique de la structure 3-dimensionelle de la protéine EF-Ts, notamment avec la partie qui présente des similitudes avec le P21 (le produit de l'oncogène Ha-Ras) Une autre cible peut être les domaines de binding des nucléotides Guanines (GTP), en position amino terminal. Le blocage de ces sites représente une possibilité intéressante pour le traitement des hyperplasies. Une autre possibilité réside en l'utilisation d'anticorps anti-peptide TDFV qui est probablement le site actif où le Mg2+ se lie afin d'assurer la polyrnérization Ainsi, l'invention porte sur un anticorps anti-EF-Ts, notamment un anticorps anti-EF-Ts d'humain ou de rat, et sur son utilisation pour le traitement des hyperplasies, notamment pour le traitement de l'athérosclérose, de la resténosc induite par angioplastie, de l'angor instable, et/ou au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs du type Leimyosarcome. Un autre aspect de l'invention a trait à une composition comprenant un oligonucléotide ou un composé tel que décrit ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et à l'utilisation dudit oligonucléotide ou composé pour la préparation d'un médicament. De préférence, ce médicament est destiné au traitement des hyperplasies, notamment au traitement de l'arthérosclérose, de la resténose induite par angioplastie, de l'angor instable, et/ou au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs du type Leimyosarcome, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de l'angiogénèse. Parmi les inhibiteurs de l'angiogénèse, on peut notamment citer l'endostatine et l'angiostatine décrites par J. Folkman, les thrombospondine-1 et -2 (TSP-1, -2) Locopo et al (1998) ; les facteurs IFN gamma, TNFalpha, et IL- 1 alpha , Maier et al (1999), U-995, un inhibiteur dérivé du cartilage de requin, Sheu et al (1998), et les composés décrits dans les revues Paper et al (1998), et Harris et al (1998). Les documents suivants sont incorporés par référence dans la description : - Locopo N; Fanelli M ; Gasparini G, Clinical significance of angiogenic factors in breast cancer, Breast Cancer Res Treat 1998;52(1-3):159-73 - Maier JA; Morelli D; Lazzerini D; Menard S; Colnaghi MI, Balsari A, Inhibition of fibronectin activated migration of microvascular endothelial cells by IL 1 alpha, TNF alpha and IFgamma , Cytokine 1999 Feb, 1 Il (2): 134-9 - Sheu JR; Fu CC; Tsai ML; Chung WJ, Effect of U-995, a potent shark cartilagederived angiogenesis inhibitor, on anti-angiogenesis and anti-tumor activities, Anticancer Res 1998 Nov-Dec; 1 8(6A):443 5-41 - Paper DH, Natural products as angiogenesis inhibitors, Planta Med 1998 Dcc;G4(8):68G-95 - Harris SR; Thorgeirsson UP, Tumor angiogencsis: biology and thcrapcutic prospects, In Vivo 1998 Nov-Dec; 12(6):563-70 La présente invention a également pour objet une sonde ou une amorce nucléotidique comportant une séquence possédant au moins 12 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts et un kit de diagnostique caractérisé en ce qu'il comprend une sonde marquée comportant une séquence possédant au moins 12 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts. Ce kit est utile pour la détermination de l'avancement de plaques d'athérome, pour l'étude du polymorphisme du gène codant pour EF-Ts dans le cadre des hyperplasies, et/ou pour la détection et le diagnostique des tumeurs. En utilisant la technique differencial display , on a isolé le gène 2A3-2 (1,2 kb) qui est surexprimé dans la lignée de cellules musculaires lisses de rat en prolifération rapide, mais pas dans la lignée de cellules de synthèse En outre, une lésion par ballonnet de carotides de rat a montré, par une technique de Northern blot virtuel, une régulation positive de ce gène dans des vaisseaux hyperplasiques Plusieurs faisceaux de preuves appuient l'affirmation ci-dessus : Les résultats de la différencia) display montre une régulation positive de 2A3-2 dans les CML en prolifération rapide (V8), mais pas dans les CML de synthèse (P9) Ensuite, ces résultats ont été confirmés par des Northern blot sur plusieurs tissus qui ont montré la présence de ce gène de 1,2 kb dans différents tissus de rat. La technique SMART en tandem avec le Northern blot montre une régulation positive de 2A3- 2 dans des carotides lésées par ballonnet par rapport aux témoins La technique 5'RACE nous a permis de cloner et de séquencer le gène de 1,2 kb entier. Ce gène montre, par recherche dans des banques de données, une homologie importante avec les facteurs d'élongation traductionnelle mitochondriaux humain et bovin (44) (EF-Ts). En outre, on peut noter que EF-Ts est un gène codé dans le noyau chez les mammifères Enfin, sur un Northern blot sur plusieurs tissus, Xin et al ont découvert un transcrit de 2,4 kb, comme nous l'avons fait, présent seulement dans les muscles squelettiques (44). Lors de la mise en oeuvre de la différenciai display sur des CML de synthèse et à prolifération rapide, un certain nombre de bandes ont été isolées. Ces bandes à expression différentielle ont montré une homologie de 72% avec les facteurs d'élongation traductionnelle (EF-Ts) mitochondriaux bovin et humain. La protéine est homologue à 85 % avec les EF-Ts bovin et humain. L'expression du gène codant pour EF-Ts apparaît après des agressions ou des lésions répétées de l'artère et participe au remodelage vasculaire. En effet, l'expression d'EF-Ts est 4 fois supérieure dans les carotides lésées par rapport à celle des témoins, 3 semaines après la lésion par ballonnet. Pour mieux comprendre le rôle d'EF-Ts dans la modulation des CML passant d'un phénotype contractile à un phénotype de synthèse, une hybridation in situ doit être effectuée sur des carotides laissées pendant différents laps de temps (7 à 40 jours) après la lésion par ballonnet. Il est intéressant de noter que l'expression d'EF-Ts dans des cellules de synthèse (P9), dans des conditions de quiescence (48,72 h) ou de prolifération (0,4, 8,24), n'a pas été altérée par l'état de prolifération des cellules Il apparaît par conséquent que le niveau d'expression du gène, entre P9 et V8, est lié à l'état phénotypique des cellules et non de leur vitesse de croissance On sait que la modulation des phénotypes de CML induit la régulation positive d'un certain nombre de gènes tels que c-myc (45), c-myb (46), c-fos (47), la sousunité p65 de Nf-kB (48), les protéines ras (49), l'ostéopontine (50), les kinases de protéines activées par un mitogène (MAP) (51), l'angiotensine II (52) la kinase cdk2 (53). En outre, on a récemment découvert que certains nouveaux gènes étaient positivement régulés dans des CML en prolifération activées, tels que sgk (54) (kinase régulée par le sérum et les glucocorticoïdes), le collagène de type VIII (55), la nucléophosmine (56) (une phosphoprotéine nucléaire impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire et la synthèse de protéines). La protéine- 10 inductible par l'interféron (IP-10) (57), et BART-I (58) (transcrit répondant à l'angioplastie par ballonnet dans les artères carotides de rat). Il est intéressant de noter que certains gènes, tels que le récepteur TGF-ss de type II (RII), peuvent jouer un rôle central dans l'athérosclérose et la prolifération des cellules de tumeur cancéreuse (21,22) et sont communs aux deux maladies. Il est en effet concevable qu'un certain mécanisme commun soit présent dans les deux pathologics. Enfin une récente étude (59), publiée par l'équipe de King et al. a montré que le glucose induisait, dans les CML aortiques bovines, un gène homologue au facteur d'élongation 2 humain, qui est un membre de la famille des GTPases et qui est essentiel pour la synthèse des polypeptides. Le gène 2A3-2 (EF-Ts), identifié dans cette étude dans les CML également, est essentiel pour la synthèse des protéines. En effet, EF-Ts est un facteur de traduction impliqué dans l'étape d'élongation et la synthèse de toutes les protéines cellulaires. En outre, un membre de la famille des facteurs d'élongation (EF-Tu), à laquelle appartient EF-Ts, facilite la liaison d'aminoacyl-ARNt au ribosome pendant le cycle d'élongation de la biosynthèse des protéines. Le facteur d'élongation EF-Ts agit comme un catalyseur dans le déplacement de GDP à partir du complexe EF-Tu*GHDP et permet la liaison de GTP. Cette réaction permet la formation du complexe ternaire EFTu*GTP*aminoacyl-ARNt. Une cartographie précise de la cascade de gènes impliqués dans la migration et la prolifération des CML, dans l'athérosclérose et la resténose, pourrait permettre à terme une meilleure compréhension de la modulation du phénotype des CML La prolifération vasculaire des CML contribue à la pathogénèse de l'athérosclérose. En outre, la prolifération des CML est un événement clé dans la formation de la néo-intima après angioplastie par ballonnet et resténose. Les signaux moléculaires qui assurent la médiation dans ces processus n'ont pas encore été identifiés. Cette étude a permis d'identifier un gène, 2A3-2 ou EF-Ts, dont l'implication dans les fonctions des CML n'avait pas été rapportée auparavant. Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ci-après LEGENDES Fig. 1 : Analyse par différencia! display (DD) montrant la bande d'ADNc 2A3-2. On a extrait l'ARN total à partir de CML de synthèse (P9) et proliférantes (V8), puis on l'a soumis à une DD. La migration des produits de PCR a été effectuée sur un gel dénaturant à 6% de polyacrylamide en utilisant une amorce arbitraire AP2 et une amorce 3' (dT11A). Les pistes 1 et 2 correspondent aux cellules de synthèse et proliférantes, respectivement. Fig. 2 : Analyse par Northern blot avec la bande d'ADNc 2A3-2. (A) Le gène 2A3-2 est positivement régulé dans les cellules proliférantes (V8), mais non dans les cellules de synthèse (P9). La quantification des signaux 2A3-2, rapportée aux niveaux d'actine ss. a montré une multiplication par 4 dans les cellules P200 par rapport aux cellules P9. Cette augmentation de l'expression du gène 2A3-2 dans P200 par rapport à P9 a été observée plusieurs fois (n=3) dans différents Northern blot. Le gène 2A3-2 a une masse moléculaire de 1,2 kb, comme le montre le Northern blot. Les pistes 1 et 2 correspondent respectivement à des cellules de synthèse et en prolifération rapide. (B) Analyse de plusieurs tissus de rat par Northern blot avec la bande d'ADNc 2A3-2. L'empreinte contenait 16 g d'ARN total provenant de divers tissus de rat et elle a été sondée par le fragment d'ADNc de 2A3-2 isolé par DD. Les tailles des marqueurs d'ARN sont présentées sur la gauche (en kb). On a pu observer des transcrits d'environ 1200 pb dans tous les tissus de rat analysés On observe un transcrit moins abondant d'environ 2,4 kb pour le muscle squelettique. Piste 1, muscle squelettique ; piste 2, coeur ; piste 3, poumon ; piste 4, foie ; piste 5, rate , piste 6, rein ;piste 7, aorte. Fig. 3 : Comparaison de carotides non traitées et de carotides traitées par ballonnet (A) Artère carotide droite témoin normale, x60 (B) Artère carotide gauche lésée par ballonnet avec formation de néo-intima. La prolifération des CML à l'intérieur de la couche intimale originelle a donné une hyperplasie intimale (IH). Ceci a été observé 3 semaines après la lésion (x60). a : adventice ; m : couche médiane ; L : lumière ; IH : hyperplasie intimale. Les pointes de flèche s représentent la lame élastique interne, IEL. Fig. 4 : Expérience de Northern blot montrant la régulation positive de 2A3- 2 en conditions in vitro et in vivo. (A) Northern blot virtuel typique montrant une régulation positive de 2A3-2 dans des cellules P200 (piste 2) comparées aux cellules p9 (piste 1). Les données ci-dessus, sur 2A3-2, confirment celles obtenues par des Northern blot. En outre, 2A3-2 est positivement régulé dans une carotide avec une hyperplasie (piste 5) comparée à une carotide saine (piste 4) et à une aorte (piste 3). On a observé que la taille du transcrit de gène (1,2 kb) était la même en conditions in vitro et in vivo. L'actine a servi de témoin de charge. (B) Quantification de 5 expériences de Northern blot virtuel qui inclut les expériences ci-dessus. Les différences de régulation positive, pour 2A3-2, entre des cellules P9 et P200 (pistes 1 et 2) et des carotides saines ou traitées par cathéter à ballonnet (pistes 4 et 5) sont significatives ( (C) Northern blot montrant l'expression de 2A3-2 dans des cellules P9 dans des états quiescent et proliférant. La quantification des signaux 2A3-2, rapportée aux niveaux de 28S, a montré que l'expression de ce gène n'a pas été altérée par l'état proliférant des cellules (rapport 1 à 1 dans toutes les pistes). Il apparaît par conséquent que le niveau d'expression du gène, entre les cellules P9 et V8, est lié à l'état phénotypique des cellules et non à leur vitesse de croissance. Les pistes 1, 2, 3, 4,5 et 6 correspondent à des teneurs en ARN au bout de 0 ,4 ,8, 24,48 et 72 heures de stimulation par FCS. Le ribosome 28S sert de témoin pour la charge et la quantification. Fig. 5 : Analyse des différentes parties du gène EF-Ts de rat (2A3-2). (A) La séquence nucléotidique (1149 pb) avec le signal poly-A (AATAAA) souligné. La queue poly-A est désignée par (A) n, tandis que les codons d'initiation et stop sont présentés en gras (ATG est en position +1). Il est important de noter que les gènes EF-Ts tant humain que bovin ont un intron de 224 pb en position 99 et ils ont une région non traduite en 5' (5'UTR) de très courte longueur (18 pb). (B) Séquence protéique prédite de EF-Ts (2A3-2) (324 aa) dans lequel les codons de méthionine (M) et stop (Z) sont présentés en gras. La protéine mature (*284 aa) commence à partir du résidu Ser souligné en position 41. Fig. 6 : Alignements multiples de séquences avec les gènes EF-Ts bovin et humain correspondants. Comparaison des séquences des protéines EF-Ts de cochon, de rat et humaine. La séquence protéique d'EF-Ts bovin est présentée dans le code à une lettre et seules les différences sont indiquées pour les deux autres séquences. La protéine mature de rat commence à partir du résidu Ser souligné en position 41et mesure 284 aa, tandis que les protéines EF-Ts homologues bovine et humaine mesurent 283 aa. ("." indique un résidu manquant, tandis que "-" indique un acide aminé similaire). Fig. 7 : Gène EF-Ts humain LOCUS HUMMTTSF1 1040 bp DEFINITION : Human nuclear-encoded mitochondrial elongation factor Ts (EF-Ts) ACCESSION L37936 SOURCE : Homo sapiens liver ADNc correspondant à l'ARNm Référence : Xin,H., Woriax,V., Burkhart,W. and Sprenurlli,L.L. Cloning and expression of mitochondrial translational elongation factor Ts from bovine and human liver, J. Biol. Chcm. 270 (29), 17243-17249 (1995). Les protocoles chirurgicaux et les soins procurés aux animaux, décrits ci-dessous, respectent strictement les recommandations du National Institute of Health and Medical Research (décret N 87-848 du 19 octobre 1987). Les rats SpragueDawley (espèce Rattus rattus, souche : OFA, Iffa Credo, France) utilisés dans cette étude ont été anesthésiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (0,11ml/100 mg de poids corporel). EXEMPLE 1 : Identification et clonage du gène 2A3-2. Matériels et méthodes Culture de cellules: On a obtenu des CML primaires à partir d'explants d'aortes thoraciques médianes de rats Sprague-Dawley mâles âgés de 7 à 8 semaines (250 g) et on les a cultivées comme préalablement décrit (14,30,31,32). On a conservé des échantillons de cellules dans l'azote liquide aux passages 2 à 10, puis tous les 10 passages. On a montré que les CML au passage 9 étaient au stade de synthèse On a utilisé dans cette étude une lignée de cellules musculaires lisses de rat spontanément hautement proliférantes (17) (V8). On a établi cette lignée cellulaire à partir de cellules aortique de rat adulte soumises à plus de 200 passages (17). On a cultivé les deux types de cellules dans du milieu MEM supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau-né (NCS). On a montré que la vitesse de croissance des cellules à 200 passages P200 était supérieure (x 1,4) à celle des cellules de synthèse P9 (17). Afin qu'elles atteignent, en même temps, une densité de cellules et une confluence similaires, les cellules P9 et P200 ont été respectivement ensemencées à 14 x 10 3 et 10 x 10 3 cellules/cm 2 dans des boîtes de 25 cm2 Ces cellules sont parvenues à confluence en 5 à 7 jours, on les a trypsinisées et on a compté des fractions aliquotes (60 x 103 à 80 x 103 cellules/cm2). Avant extraction de l'ARN, on a stoppé la croissance des cultures par incubation dans du milieu MEM supplémenté par 0, 1% de NCS pendant 24 heures Préparation d'ARN total et polyA+ : après culture des cellules, on a lavé les cellules avec du milieu de Hanks (Sigma, France), et on les a utilisées pour la préparation d'ARN. On a extrait l'ARN total en utilisant la méthode au thiocyanatc de guanidinium (33). Pour l'analyse par différenciât display, on a éliminé la contamination par l'ADN génomique avec de la DNase 1 (MessageClean, GenHunter, EUA). Pour la construction de la banque d'ADNc et l'amplification rapide des extrémités 5' d'ADNc (5'-RACE), on a isolé l'ARN poly(A+) de l'ARN total en utilisant des amorces oligodT30 (Kit Oligotex mRNA, Qiagen, France). Analyse par visualisation différencia! display : La tehnique differencial display a été effectuée comme préalablement décrit (29) (RNAimage, GenHunter). En résumé, cette technique comprend les étapes suivantes : (i) Réaction de transcription inverse (RT) : On a soumis 0,2 g d'ARN total provenant de chaque échantillon à une transcription inverse avec 100 U de transcriptase inverse de MMLV en présence de 250 mol/l de dNTP et 2 mol/l HT11M (M peut représenter dA, dG, dC et H représente le site de restriction de Hind III). Le mélange réactionnel de RT de 20 l a été soumis à une transcription inverse pendant 1 h à 37 C, puis on a dénaturé l'enzyme par chauffage à 75 C pendant 5 min. (ii) Amplif calion par PCR : On a utilisé 2 pi du mélange d'ADNc monocaténaire ainsi obtenu pour 8 réactions de PCR différentes, chaque mélange réactionnel contenant une amorce arbitraire différente de l'extrémité 5'. Le mélange de PCR de 18 ul contenait 2 pmol/1 de l'amorce HTl 1M (la même que pour la RT), 2 umol/I d'une amorce arbitraire spécifique, 25 mol/l des dNTP avec 0,25 l de a- 32 P dATP (2000 c/mmol, Amersham, RU) et 1 U de polymérase d'ADN Taq (Perkin Elmer). Les paramètres d'amplification par cycles thermiques (40 cycles) en utilisant le système GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) étaient les suivants 94 C (15s), 40 C (2 min), 72 C (30 s) et une étape d'cxtcnsion finale de 5 minà 72 C. (iii) Séparation par électrophorèse: On a séparé 3,5 l des produits de PCR sur un gel dénaturant à 6 % de polyacrylamidc dans du tampon TBE après addition de 2 l de colorant de charge (formamide 95%, EDTA 10 mmol/l, pH 8,0, xylène cyanole 0,09%, et bleu de bromophénol 0,09%). On a soumis les gel à une tension de 1400 V pendant 4 h, on les a séchés sans fixation pendant 2 h à 80 C, exposés pendant 72 h, puis visualisés par autoradiographie. Récupérations des bandes, clonage et séquençage : (i) Les bandes présentant une expression différentielle (régulées positivement ou négativement) ont été recueillies dans des conditions stériles en excisant la tranche de gel à partir du gel séché en utilisant une lame de rasoir. On a placé chaque tranche de gel dans 100 l d'eau stérile, on a fait bouillir le tout pendant 15 min pour solubiliser l'ADN, puis on l'a précipité à l'éthanol. (ii) La réamplification est effectuée avec 4 l de fragment purifié en utilisant la même paire d'amorces et les mêmes paramètres de PCR que ceux qui ont permis d'obtenir la bande. (iii) On a fait migrer les fragments d'ADN réamplifiés sur un gel à 1,5% d'agarose On a cloné les bandes que l'on a avait réussi à amplifier dans un vecteur PCR II (kit de clonage IA, Invitrogen, Pays-Bas). (iv) Pour le séquençage d'ADN, on a effectué des minipréparations d'ADN plasmidique (34), puis on a appliqué la méthode de séquençage aux didésoxy (35) (Kit de séquençage T7, Pharmacia, France). Résultats , Sur les gels de differencial display , on a observé 51bandes, en utilisant 8 amorces arbitraires et 3 amorces de RT, qui présentaient une expression différentielle entre les cellules de synthèse et les cellules en prolifération rapide (P9 et V8). Les bandes de faibles masses moléculaires n'ont donne que peu d'informations sur les séquences et se sont souvent révélées, comme on a pu le vérifier par réamplification par PCR et Northcrn blot, être des faux positifs. Parmi les 36 bandes de masses moléculaires élevées retenues, on a réamplifié 22 bandes et on les a clonées dans un plasmide PCR Il. Les séquences provenant de différents clones ont ensuite été envoyées à des banques de données pour des recherches d'identité et d'homologies. On a ensuite utilisé la technique Northern blot pour certains des fragments d'ADNc nouvellement identifiés, pour évaluer les niveaux d'expression dans les deux types de cellules. Un des gènes qui a nettement donné une visualisation différentielle était la bande 2A3-2 (Fig. 1). Ce fragment d'ADN présentait une régulation positive, en employant des Northern blot, dans les cellules en prolifération rapide par rapport aux cellules de synthèse (Fig. 2A). La quantification des signaux de 2A3-2, rapportée au niveau de l'actine, a montré une multiplication par 4 dans les cellules P200 par rapport aux cellules P9. Cette augmentation de l'expression a été observée plusieurs fois (n=3) dans différents Northern blot. On a déterminé que la masse moléculaire de 2A3-2, selon le Northern blot, était de 1,2 kb. Homologies avec les banques de données : on a comparé les séquences obtenues avec des séquences connues par recherche dans les différentes banques de données (GenBank, EMBL, EST, STS, etc.) en utilisant les programmes BLAST (36) et FASTA (37). EXEMPLE 2 : Distribution du gène 2A3-2 dans les tissus. Matériels et méthodes Sondes et Northern blot . On a extrait l'ARN total comme indiqué ci-dessus, on l'a dénaturé, séparé par électrophorèse dans un gel de formaldéhyde-MOPSagarose, puis transféré sur une membrane de nylon (Hybond, Amersham) Après buvardage capillaire effectué sur une nuit, on a cuit la membrane pendant 2 h à 80 C. On a préparé des sondes pour les Northern blot en suivant la méthode d'amorçage aléatoire (High Prime, Boeringher, Allemagne), en utilisant les inscris amplifiés par PCR dans le vecteur PCR II décrit ci-dessus, puis on les a purifiées en utilisant du G-scphadcx (Colonnes Quick Spin, Bochringer). La préhybridation et l'hybridation ont été effectuées selon des protocoles standard (28). On a exposé les empreintes avec des écrans d'intensification contre un film Kodak pendant une semaine à -70 C. On testé une charge similaire d'ARN en utilisant la sonde d'actine. Résultats. Un Northern blot sur plusieurs tissus de rat, sondé par la bande d'ADNc 2A3-2, a montré que le gène de 1,2 kb était présent dans les tissus de muscle squelettique, de coeur, d'aorte, de poumon, de foie, de rein et de rate (Fig. 2B). Le muscle squelettique contient non seulement l'ARNm de 1,2 kb normal, mais également un transcrit moins abondant d'environ 2,4 kb. Ce transcrit peut provenir de l'utilisation d'un autre site de polyadénylation (41). Le Northern blot multiple montre que le gène 2A3-2 n'est pas un artefact induit par la culture de cellules, mais qu'il est présent dans différents tissus. EXEMPLE 3 : SMART et Northern blot virtuel de carotides. Matériels et méthodes Lésion par cathéter à ballonnet de l'artère carotide gauche de rat : On a obtenu des artères carotides sur des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 10 à 14 semaines (350 g). On a induit la formation de néo-intima comme préalablement décrit (39). En résumé, on a exposé la carotide gauche sous un microscope opératoire (OPMI7, Car) Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Après incision de l'artère carotide externe gauche, on a introduit le cathéter à ballonnet (2F Fogarty, Baxter, EUA) par l'artère carotide primitive. On a produit une lésion de la carotide primitive gauche en faisant passer le cathéter à ballonnet gonflé d'avant en arrière trois fois dans la carotide. Le ballonnet était suffisamment gonflé pour produire une légère résistance et on a ensuite retiré le cathéter pour ligaturer l'artère externe. On a maintenu les rats dans des conditions ad libitum pendant une durée totale de 3 scmaincs, après la lésion par le ballonnet, au bout desquelles on les a anesthésiés à l'uréthanc (Sigma) pour l'extraction des vaisseaux. Chaque artère carotide a été coupée en deux morceaux, le premier a été immédiatement rapidement congelé dans de l'azote liquide pour l'extraction d'ARN, tandis que l'on a fixé le second afin de l'utiliser pour des contrôles histologiques et morphologiques. On a également extrait la carotide droite, considérée comme l'artère témoin normale. Ce modèle expérimental est connu pour induire une hyperplasie néo-intimale similaire à celle observée chez les humains après une angioplastie. Technique SMART et Northern blot virtuel : Les quantités d'ARN total étant limitées, on a effectué l'analyse de l'expression des gènes de carotides de rat par un tandem de SMART-PCR (Clontech, Californie) et de Northern blot virtuel, plutôt que par Northern blot standard. Une description complète de la technologie SMART, et de ses applications, est donnée dans le manuel Clontech. En bref, on synthétise de l'ADN avec 1 g d'ARN total provenant de divers échantillons (cellules P9 et V8, aorte, carotides droite et gauche traitées). La RT a été mise en oeuvre pendant 1 h à 42 C en utilisant 200 unités/ l de transcriptase Superscript II (Gibco-BRL), 10 mol/l de l'amorce de synthèse d'ADNc (CDS), 10 mol/l d'oligo SMART, 10 mmol/I de dNTP, et 20 mmol/1 DTT. Lorsque l'extrémité 5' de l'ARNm est atteinte, l'activité de transférase terminale de l'enzyme ajoute quelques nucléotides, principalement des désoxycytidines, à l'extrémité 3' de l'ADNc. La RT change alors de matrices et continue la réplication vers l'extrémité de l'oligo à l'extrémité 5' de l'ARNm. Le mélange réactionnel de RT a ensuite été chauffé à 72 C pendant 5 min. L'ADNc simple brin de longueur totale obtenu contient une séquence complémentaire de l'oligo SMART, qui est ensuite utilisée comme matrice en PCR pour produire de l'ADNc bicaténaire. En choisissant le nombre optimal de cycles de PCR, on s'assure que l'ADNc double brin restera en phase exponentielle d'amplification. Dans les expériences qui ont conduit à l'invention, le nombre optimal de cycles est de 16, car le plateau a été atteint au bout de 17 cycles. Seul les ADNc ss ayant la séquence SMART à l'extrémité 5' et l'oligo(dT) à l'extrémité 3' sont exponcntiellcmcnt amplifiés par PCR. Le mélange réactionnel de PCR de I00 }il contient 10 nunolll de dNTP, 10 !l1101/1 de l'amorce de PCR (complémentaire de l'oligo SMART et de l'amorce CDS), 2 l de la polymérase KlenTaq 50x, et 10 l du tampon de PCR KlenTaq 10X. Les conditions de PCR sont les suivantes : une étape à 95 C (1 min) ; puis 16 cycles à 95 C (15 s), 65 C (30 s), et 68 C (6 min). On obtient un Northern blot virtuel en faisant tout d'abord migrer 0,5 g d'ADNc amplifié par PCR SMART sur un gel agarose/EtBr. Ensuite, on transfère le matériau soumis à l'électrophorèse sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham), que l'on sonde ensuite avec un fragment de 2A3-2 marqué au 32P, comme dans un Northern blot standard. On utilise également de l'actine pour évaluer une charge similaire. Résultats. On a utilisé une hyperplasie néo-intimale de carotides de rat, induite par une lésion par cathéter à ballonnet, pour étudier le rôle in vivo de ce gène dans les CML. On a traité des carotides gauches de rat par un cathéter à ballonnet pour initier la prolifération de CML et la formation d'une néo-intima. Par ailleurs, on a utilisé les carotides droites non traitées comme témoins (Fig 3). La quantité d'ARN total extrait d'une carotide étant inférieure à 2 g, nous avons utilisé un tandem de SMART-PCR et de Northern blot virtuel pour évaluer les niveaux d'expression de 2A3-2. Cette approche en tandem de technologies a donné des informations similaires à celles obtenues par un Northern blot standard. On a montré que le gène 2A3-2 était positivement régulé (multiplication par 4) dans la carotide gauche traitée par le ballonnet, par rapport à la carotide droite témoin. L'expérience de Northern blot virtuel a été répétée, et confirmée sur 5 empreintes différentes. Les Northern blot virtuels ont en outre confirmé la régulation positive de 2A3-2 dans les cellules V8, mais pas dans les P9, comme préalablement observé par Northern blot standard (Fig. 4A). Il est intéressant de noter que l'expression de EF-Ts dans les cellules P9, dans des conditions de quiescence (48, 72 h) ou de prolifération (0,4, 8,24) n'a pas été altérée par l'état de prolifération des cellules (Fig. 4C). EXEMPLE 4 : 5'RACE et séqueçage du gène 2A3-2. Matériels et méthodes Amplification rapide en 5' d'extrémités d'ADNc (5'RACE) : Pour obtenir la région 5' amont du gène, on a mis en oeuvre la technique 5' RACE essentiellement en appliquant le principe de PCR par impact (40) et en utilisant les kits d'amplification d'ADNc Marathon et Advantage KlenTaq Polymérase (Clontech). (i) Dans la première étape, on synthétise de l'ADNc simple brin avec 1 pg de d'ARN poly(A+) de V8, en utilisant 10 mol/l de l'amorce de synthèse d'ADNc et de RT de MMLV pendant 1 h à 42 C. On a vérifié la synthèse d'ADN par l'addition de dNTP dont l'un était de l'[alpha]-32P-CTP marqué par un isotope radioactif (1IlC/IlI, NEN, France). (ii) La seconde étape a consisté en la synthèse d'ADN double brin effectuée à 16 C pendant 3 h dans un mélange d'enzymes contenant de la polymérase d'ADN 1 d'E. coli, de la RNase H, et de la ligase d'ADN d'E. coli. Ces enzymes permettent la synthèse d'ADNc ds, la dégradation de l'ARN, et la formation de bouts francs, respectivement. On effectue ensuite une électrophorèse sur gel à 1% d'agarose pour estimer la quantité et la qualité de l'ADNc ds synthétisé. Le gel est ensuite séché et mis en contact avec un film Kodak à -70 C afin de visualiser la trace d'ADN. (iii) La troisième étape a permis d'obtenir une banque d'ADNc ds, à partir de cellules V8, en ligaturant un adaptateur aux deux extrémités de l'ADNc ds, en utilisant une ligase d'ADN de T4 à 16 C une nuit. (iv) Dans la dernière étape, on a soumis une fraction aliquote de la banque à une PCR. Le mélange réactionnel de PCR de 50 l contient 10 pmol/1 de dNTP, 10 umol/l de l'amorce adaptateur (complémentaire de l'adaptateur d'ADNc), 5 pl de la polymérase KlenTaq 50x, et 10 mol/l d'amorce spécifique du gène (GSP, Gene Spécifie Primer) complémentaire du fragment 3' à expression différentielle (GSP de 2A3-2: 5'-GGGTAAAGTTATTAAATATACAATGTAATAAACG-3') (SEQ ID n 4). Le mélange a été soumis à une étape de PCR à 94 C (1min) suivie de 33 cycles à 94 C (30 s), 60 C (30 s), et 68 C (2 min 15s) ; et d'une étape d'extension de 5 min à 72 C. Les fragments d'ADN amplifié ont été clones dans le vecteur PCR II et purifiés en utilisant le kit Qiagen Plasmid Midi (Qiagen) L'insert d'ADN est ensuite commercialement séquence (Genome Express, France). Résultats. La longueur totale de ce gène a été obtenue par 5'-RACE en employant une banque d'ADNc construite à partir de cellules V8 en prolifération rapide. La masse moléculaire du produit de 5'RACE était de 1,2 kb comme préalablement indiqué par Northern blot (Fig. 5). Le produit de PCR a été amplifié, purifié, cloné et séquence (Fig. 6A). La séquence nucléotidique complète de 2A3-2 a ensuite été envoyée à la banque de données EMBL, en utilisant le logiciel Sequin, afin d'obtenir un numéro d'accès (AJ006151). Caractéristiques du gène 2A3-2 : Le cadre de lecture ouvert du gène séquence (1 149 pb) a été identifié et on a montré qu'il contenait 972 pb allant du codon de début ATG jusqu'à un codon stop TAG (Fig. 6). Ce gène comprend une très courte région non traduite en 5' (7 pb de long). Le codon d'initiation (désigné par +1) est précédé d'un résidu G en position-3 et suivi d'un résidu T en position +4. L'analyse de nombreux sites de début de traduction montre que la séquence consensus contient une purine en position-3 et un résidu G en position +4 (42). Enfin, l'ADNc contenait 170 pb dans la région non traduite en 3' avec un signal poly-A typique (43) (AATAAA), qui a été déterminé 27 pb en amont de la queue poly-A Lorsque l'on a analysé la séquence nucléotidique de longueur totale par recherche d'homologies dans la banque de données GenBank, en utilisant FASTA, on a observé qu'elle présentait une homologie de 72% avec des facteurs d'élongation, EF-Ts, mitochondriaux humain et bovin (44). L'ATG d'initiation présumé a été attribué au premier résidu méthioninc et la séquence protéique déduite de 324 résidus d'acide aminé (aa) a été appelée protéine 2A3-2 (Fig. 6B). La séquence de la protéine 2A3-2 déduite donnait une masse moléculaire calculée de 27 kDa. La séquence a été testée sur la banque de données Swissprot, ce qui a confirmé les résultats de GenBank. Les homologies avec les EF-Ts bovin et humain étaient de 85% dans la protéine mature et de 70% sur la séquence protéique globale. Ces homologies importantes suggèrent que nous avons cloné le gène EF-Ts homologue de rat. Une comparaison de notre séquence avec les gènes EF-Ts humain et bovin est présentée sur la figure 7. Il est intéressant de noter que la séquence protéique d'E. coli a une homologie de 29% avec la séquence bovine. L'analyse de l'extrémité NH2-terminale de la séquence indique que la forme mature de l'EF-Ts de rat commence par Ser-41 dans le long cadre de lecture ouvert (figure. 6B et figure 7). Le signal d'importation mitochondrial est donc long de 40 aa tandis qu'il est de 55 aa dans la forme bovine. Les signaux d'importation mitochondriaux ne sont généralement pas conservés entre des espèces différentes ; cependant, ils sont généralement dépourvus d'acides aminés acides, sont enrichis en acides aminés basiques et hydroxylés, et peuvent former une hélice a ou une feuille ss amphiphiles. Le peptide intermédiaire pour l'EF-Ts de rat est dépourvu de résidus acides et est modérément riche en résidus basiques et hydroxylés (30%) Pour résumer, la séquence protéique comprend 324 aa (la protéine humaine en comprend 294, tandis que la bovine en comprend 338), tandis que la forme mature de la protéine a 284 aa (283 aa pour les homologues bovin et humain). La partie N-terminale de la protéine chez le rat comprend 29 aa de plus que l'humaine. REFERENCES 1- Ross R. The pathogcnesis of athcrosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 1993;362:801-809. 2- Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Replication of smooth muscle cells in vascular disease. Circ Res. 1986;58:4,427-444. 3- Campbell JH, Kocher 0, Skalli 0, Gabbiani G, Campbell GR. Cytodifferentiation and expression of alpha-smooth muscle actin mRNA and protein during primary culture of aortic smooth muscle cells. Correlation with cell density and proliferative state. 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LISTAGE DE SEQUENCE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS DE EF-TS D16711 4 PatentIn Vers. 2.0 1 1038 ADN Homo sapiens 1040 bp Human nuclear-encoded mitochondrial elongation factor Ts (EF-Ts) 1 ggcacgagtt tatgctgggc cccgtctgtc tgcctcggcc tccagcaagg agctcctcat 60 gaagctgcgg cggaaaacag gctactcctt tgtaaattgc aagaaagctc tggagacttg 120 tggcggggac ctcaaacagg cagagatctg gctccacaag gaggcccaga aggagggctg 180 gagcaaagct gccaagctcc aagggaggaa gaccaaagaa ggcctgattg ggctgttgca 240 ggaaggaaac acaactgtat tagtagaggt aaactgtgag acagattttg tttctagaaa 300 tttaaaattt caactgttgg tccagcaagt agcccttgga accatgatgc attgtcagac 360 cctaaaggat caaccctctg catacagtaa aggtttcttg aattcctctg agctttctgg 420 acttccagct gggcctgaca gagaaggctc actcaaggat cagttggctt tagcaattgg 480 aaaactggga gaaaacatga ttcttaaacg agctgcatgg gtgaaggtcc atcgggttct 540 acgttggctc ttatgtccac ggagcaatgc agagtccctc acttcacaag ctggtgctgg 600 ggaagtatgg ggccctggtc atctgtgaga cgtctgaaca gaaaacaaac cttgaagacg 660 ttggccgccg ccttgggcag catgtggtgg gcatggcccc cctctctgtt ggctccctgg 720 acgatgagcc tgggggagag gcagagacta agatgctgtc ccagccgtat ttgctggatc 780 cctccattac cttggggcag tatgtgcagc ctcagggggt gtcggtagta gactttgtgc 840 ggtttgaatg tggagaaggt gaagaggcag cagaaactga ataggttcca gagacttttg 900 gcccaggagg aatatttact tttagctctg gacatcatta caaaaaggaa tatttcccaa 960 acctcttcag accgagaatg catgggtaaa attattaaat agttgtataa taaaaataat 1020 tttttccttg tttgcgta 1038 2 1148 ADN rat Ratus ratus gène EF-Ts polyA~site (1148) n est un nombre entier compris entre 1 et 50. 2 cacagggatg tcgctgctgc ggtcgctgcg cttcttcccg gtcgcgtgta ccggccgctc 60 ggcaagggct gtcctgctcc agccgtccca gccatggcac acgcttcacg cgggcccctc 120 gttgtcgtct tctgcctcca gcaaggagct cctcatgaag ctgcggcgga caacaggcta 180 ctcctttgtc aactgcaaga aggctctgga gacttgtggc ggggatctca agcaggcaga 240 ggcctggctg cacaaacagg cccagaagga aggatggagc aaagccgcca agctccatgg 300 gagaaagact aaagaaggct tgattggcct gctgcaggag gaaaacacag ctgttttagt 360 agaggtaaac tgcgagacag atttcgtctc cagaaatgta aaatttcaac agttggtcca 420 gcaagtagcc ctgggaacca tggcacactg tcagaacctg acggatcagc tctccacgta 480 cagtaagggc ttcctcaact cctctgagct ttctgaactt gcagctgggc ccgacgggga 540 agggtctctc aaggaccagt tggccttagc gattgggaca ctgggagaaa acatgagtct 600 taagcgagct gcctgggtga aggtgccctc tgggttctat gtcggctctt atgtgcacgg 660 agagatgcag agcccctccc tccagaacct ggtgctgggg aagtacgggg ccctggtcat 720 ctgccagact cctgagcaga tcacaaacct ggaggaggtt ggccgccgct tgggacagca 780 tgtggtgggc atggcccctc tctcagtggg ctccctggat gatggcctgg aggggagaca 840 gagacccgga tgctgcccca gccatatctc ctggatcctt ccatcacact ggggcagtat 900 gtgcagcccc agggcgtgac cgtagtcgac tttgtgcgct tcgaatgtgg agaaggtgag 960 caggtagcag aggctgaata ggtggaaata tttaattttc atacctggat ttccttataa 1020 aaagttattt tctaaacctc ttcaaccctc agattttttt tttagtttaa aatgaagtta 1080 tatattcatg ggtaaagtta ttaaatatca atgtaataaa cgatgatcat ttatttgcat 1140 aatacttan 1148 3 325 PRT rat Ratus ratus protéine EF-Ts 3 Met Ser Leu Leu Arg Ser Leu Arg Phe Phe Pro Val Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ala Arg Ala Val Leu Leu Gln Pro Ser Gln Pro Trp His Thr 20 25 30 Leu His Ala Gly Pro Ser Leu Ser Ser Ser Ala Ser Ser Lys Glu Leu 35 40 45 Leu Met Lys Leu Arg Arg Thr Thr Gly Tyr Ser Phe Val Asn Cys Lys 50 55 60 Lys Ala Leu Glu Thr Cys Gly Gly Asp Leu Lys Gln Ala Glu Ala Trp 65 70 75 80 Leu His Lys Gln Ala Gln Lys Glu Gly Trp Ser Lys Ala Ala Lys Leu 85 90 95 His Gly Arg Lys Thr Lys Glu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Gln Glu Glu 100 105 110 Asn Thr Ala Val Leu Val Glu Val Asn Cys Glu Thr Asp Phe Val Ser 115 120 125 Arg Asn Val Lys Phe Gin Gin Leu Val Gin Gin Val Ala Leu Gly Thr 130 135 140 Met Ala His Cys Gln Asn Leu Thr Asp Gln Leu Ser Thr Tyr Ser Lys 145 150 155 160 Gly Phe Leu Asn Ser Ser Glu Leu Ser Glu Leu Ala Ala Gly Pro Asp 165 170 175 Gly Glu Gly Ser Leu Lys Asp Gln Leu Ala Leu Ala Ile Gly Thr Leu 180 185 190 Gly Glu Asn Met Ser Leu Lys Arg Ala Ala Trp Val Lys Val Pro Ser 195 200 205 Gly Phe Tyr Val Gly Ser Tyr Val His Gly Glu Met Gln Ser Pro Ser 210 215 220 Leu Gln Asn Leu Val Leu Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Val Ile Cys Gln 225 230 235 240 Thr Pro Glu Gln Ile Thr Asn Leu Glu Glu Val Gly Arg Arg Leu Gly 245 250 255 Gln His Val Val Gly Met Ala Pro Leu Ser Val Gly Ser Leu Asp Asp 260 265 270 Glu Pro Gly Gly Glu Thr Glu Thr Arg Met Leu Pro Gln Pro Tyr Leu 275 280 285 Leu Asp Pro Ser Ile Thr Leu Gly Gln Tyr Val Gln Pro Gln Gly Val 290 295 300 Thr Val Val Asp Phe Val Arg Phe Glu Cys Gly Glu Gly Glu Gln Val 305 310 315 320 Ala Glu Ala Glu Glx 325 4 34 ADN Artificial Sequence Amorce spécifique du gène complémentaire du fragment 3' du gène 2A3-2 4 gggtaaagtt attaaatata caatgtaata aacg REVENDICATIONS 1. Oligonucléotidc de 8 à 100 nucléotides de long caractérisé en ce qu'il s'hybride avec un acide nucléique codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF-Ts et en ce qu'il est capable d'inhiber l'expression de EF-Ts chez les mammifères. 2. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il cible la région 5'ou 3' non traduite, le site d'initiation de la traduction, ou la région codante de l'ARNm de EF-Ts, de préférence la région 5' du gène. 3. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence ayant au moins 80 % d'homologie avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 1. 4. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence ayant au moins 80 % d'homologie avec une séquence de 10 à 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 2 5. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une modification chimique du squelette et/ou d'un ou de plusieurs nucléotide(s). 6. Procédé de criblage de composés inhibant l'expression ou l'activité de EF-Ts caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Traitement d'une cellule exprimant EF-Ts avec un ou plusieurs composés, b) mesure de l'expression et/ou de l'activité de EF-Ts, c) sélection des composés inhibant l'expression de EF-Ts et qui présentent peu ou pas de toxicité vis-à-vis de ladite cellule 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'on test des composés provenant de librairies obtenues par chimie combinatoire 8. Composé susceptible d'être obtenu à partir d'un procédé selon l'une des revendications 6 et 7. 9. Composition comprenant un oligonucléotide selon l'une des revendication 1à 5 ou un composé selon la revendication 8 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Utilisation d'un oligonucléotide selon l'une des revendication 1 à 5 ou d'un composé selon la revendication 8 pour la préparation d'un médicament. 11. Utilisation selon la revendication 10 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hyperplasies. 12. Utilisation selon la revendication 10 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'arthérosclérose, de la resténose induite par angioplastie et/ou de l'angor instable. 13. Utilisation selon la revendication 10 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs du type Leimyosarcome. 14. Utilisation selon l'une des revendications 11 à 13 en combinaison avec un inhibiteur de l'angiogénèse. 15Sonde ou amorce nucléotidique comportant une séquence possédant au moins 12 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts 16. Kit de diagnostique caractérisé en ce qu'il comprend une sonde marquée comportant une séquence possédant au moins 12 nucléotides consécutifs du gène codant pour EF-Ts. 17 Utilisation du kit selon la revendication 16 pour la détermination de l'avancement de plaques d'athérome, pour l'étude du polymorphisme du gène codant pour EF-Ts dans le cadre des hyperplasies, et/ou pour la détection des tumeurs.