Brevet FR2791347A1 — publié le 20000929

Cette invention est en rapport avec une séquence d'acides aminés d'un polypeptide précurseur de phytosulfokine. La phytosulfokine est un peptide dont on sait qu'elle stimule la prolifération des cellules végétales. Cette invention est en rapport aussi avec un gène qui code ce polypeptide précurseur. De plus, cette invention est en rapport avec un procédé pour stimuler la prolifération des cellules végétales par incorporation de ce gène dans une plante. Ces dernières années, du fait du développement de l'étude des gènes végétaux, on a introduit différents gènes étrangers dans des végétaux. Une telle technique est disponible pour plusieurs espèces végétales et joue un rôle important dans le développement industriel. Par exemple, une telle technique permet la production de nouvelles espèces végétales avec une productivité améliorée de leurs métabolites secondaires. Pour la production d'une plante transgénique, il est nécessaire de cultiver un petit nombre de cellules transformées, où un certain gène exogène est incorporé, pour régénérer un végétal entier. Cependant, dans le cas d'une cellule végétale où un certain gène exogène est incorporé, la prolifération d'une telle cellule est très lente. Par conséquent, la régénération d'une plantule pour produire une plante transgénique peut être difficile. Une cellule végétale sécrète dans le milieu extracellulaire des agents de stimulation inconnus pour stimuler la division cellulaire. Cependant, quand les cellules végétales existent en concentration insuffisante, la prolifération des cellules végétales devient difficile parce que la durée nécessaire pour que le facteur de stimulation parvienne à une concentration suffisante est trop longue, ou parce que la vitesse de dégradation du facteur de stimulation est plus grande que sa vitesse de sécrétion. De plus, la culture cellulaire elle-même est difficile dans beaucoup d'espèces végétales, ou la vitesse de prolifération cellulaire est très lente. Par conséquent, le développement d'une technique permettant de stimuler la prolifération des cellules végétales a été désiré. Les demandeurs ont isolé et purifié la phytosulfokine (PSK), à titre de facteur peptidique de stimulation des végétaux évoqué ci-dessus (Y. Matsubayashi et Y. Sakagami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, p. 7623,1996). La PSK est l'un des facteurs de stimulation des végétaux contenu dans ce que l'on appelle "le milieu conditionné : MC", un milieu utilisé pour la culture cellulaire. On sait que la PSK est sécrétée dans le milieu extra-cellulaire et a une fonction de type autocrine. On sait aussi que les résidus tyrosine de PSK sont sulfatés par une modification post-traductionnelle. L'existence de deux types de PSK, à savoir PSK-a et PSK-p, est reconnue et les séquences correspondantes sont décrites au-dessous. PSK-p est un produit de dégradation enzymatique de PSK-a et l'activité de prolifération cellulaire observée dans PSK-p est inférieure au dixième de celle de PSK-a. PSK-a: Tyr(S03H)-Ile-Tyr(S03H)-Thr-Gln PSK-p: Tyr(S03H)-Ile-Tyr(S03H)-Thr L'existence d'un peptide végétal physiologiquement actif dans lequel les résidus tyrosine sont sulfatés était inconnue jusqu'à la découverte de PSK. Mais chez les animaux on en connaît approximativement 30 types, y compris la cholécystokinine et la gastrine, qui présentent une telle propriété. Ce sont tous des peptides sécrétés dans le milieu extra-cellulaire qui sont biosynthétisés sous forme de leurs précurseurs, sulfatés et soumis à une maturation pendant leur passage dans l'appareil de Golgi. On suppose que l'excision de la séquence de PSK se produit dans la même manière. La présence d'une certaine séquence signal est prédite sur les peptides précurseurs dont les résidus tyrosine sont sulfatés spécifiquement, car les peptides précurseurs sont sécrétés dans la région extracellulaire. À propos du peptide PSK, l'existence d'un peptide précurseur est prédite sur la base d'une telle connaissance. Par conséquent, le gène qui code le polypeptide précurseur de PSK du riz a été isolé et la séquence de bases du gène du précurseur a été déterminée. Le gène ainsi obtenu a été incorporé dans des cellules Oc de riz en culture, et l'effet du gène a été examiné. La surexpression du gène qui code le polypeptide précurseur de PSK augmentait la sécrétion de PSK dans le milieu cultivé et favorisait la prolifération des cellules Oc du riz. La lignée cellulaire Oc du riz provient de la variété C5924 du riz (Oryza sativa L. ). C'est une lignée cellulaire prépondérante du riz à prolifération rapide obtenue de la manière suivante : des grains de riz (Oriza sativa L. C5924) sont stérilisés avec une solution d'hypochlorite de sodium à 5% pendant 10 min et lavés trois fois avec de l'eau distillée stérilisée. Puis ils sont amenés à germer dans des conditions aseptiques dans du milieu basal de Murashige et Skoog (MS). Au bout d'une semaine de germination, des explants radiculaires sont excisés des plantules et cultivés sur du milieu MS gélosé (1 %) contenant 1 mg/1 de 2,4-D et 0,1mg/l de kinétine. Les cultures de cals obtenues à partir des explants radiculaires sont souscultivées tous les mois sur le milieu utilisé pour l'induction des cals. Les cellules ainsi obtenues sont appelées cellules Oc. Ces cellules sont ensuite sous-cultivées à 25 C à l'obscurité à 120 tr/min dans du milieu MS additionné de 1 mg/1 de 2,4-D à intervalles réguliers de 2 semaines. Les cellules Oc prolifèrent rapidement dans les cultures en suspension. Le polypeptide précurseur de PSK (préprophytosulfokine) de cette invention est identifié par une séquence d'acides aminés appelée séquence n . 1 dans la liste de séquences annexée et le gène qui code la préprophytosulfokine est identifié par une séquence de bases appelée séquence n . 2 dans la liste de séquences annexée. En général, un acide aminé est codé par plusieurs codons d'ADN. Par conséquent, plusieurs gènes, différents du gène natif de cette invention, peuvent coder des séquences d'acides aminés identiques à celle de la préprophytosulfokine. Le gène de cette invention n'est pas limité au gène natif seulement et inclut beaucoup d'autres séquences de bases qui codent la préprophytosulfokine. Le polypeptide précurseur de PSK de cette invention inclut un polypeptide qui a une séquence d'acides aminés qui a au moins 40% d'homologie avec la séquence d'acides aminés appelée séquence n . 1 dans la liste de séquences annexée, dans la mesure où il conserve les caractéristiques biochimiques de la préprophytosulfokine. De préférence, le polypeptide précurseur de cette invention a plus de 50% d'homologie avec la séquence d'acides aminés appelée séquence n . 1 dans la liste de séquences annexée. De préférence encore, le polypeptide précurseur de cette invention a plus que 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés appelée séquence n . 1 dans la liste de séquences annexée. De plus, le gène de cette invention inclut un gène qui code le polypeptide précurseur de PSK décrit ci-dessus et qui consiste en une séquence de bases qui s'hybride dans des conditions strictes ou stringentes avec la séquence de bases appelée séquence n . 2 dans la liste de séquences annexée. La prolifération d'une cellule végétale peut être stimulée par incorporation d'un gène qui code la préprophytosulfokine bien qu'une cellule végétale où un certain gène exogène est incorporé ait tendance à voir sa vitesse de prolifération diminuer. Par conséquent, la différenciation cellulaire et la régénération d'une plantule peuvent être accomplies par incorporation du gène qui code la préprophytosulfokine. De plus, une amélioration de la croissance d'une plante peut être obtenue par incorporation du gène. Le gène selon cette invention peut être incorporé dans plusieurs plantes. Les plantes décrites dessous sont des plantes préférables pour l'incorporation du gène. Ce sont des plantes monocotylédones comme le riz, le maïs, l'asperge et le blé ou des plantes dicotylédones comme l'arabidopsis, le tabac, la carotte, le soja, la tomate et la pomme de terre. Les techniques communes connues peuvent être adoptées pour produire un transformant. A titre d'exemple de vecteur disponible, on peut citer pAct-nos/Hmz. Un tel vecteur peut être introduit dans Agrobacterium, par exemple, et un transformant peut être produit par infection d'un cal ou d'une jeune plante. D'autres objets et avantages de l'invention deviendront plus apparents à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 montre la séquence de bases du gène OsPSK et la séquence d'acides aminés correspondante. La figure 2 montre la détection d'analogues de PSK qui existent dans un milieu conditionné de cellules Oc de riz transformées, par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (CL-SM). La figure 3 montre des cellules Oc du riz non transformées après deux semaines de culture. La figure 4 montre des cellules Oc de riz où le gène OsPSK est incorporé dans l'orientation sens, après deux semaines de culture. La figure 5 montre des cellules Oc de riz où le gène OsPSK est incorporé dans l'orientation antisens, après deux semaines de culture. La figure 6 représente un transfert de Western montrant la détection du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz où le gène est incorporé dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens. La figure 7 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz au bout de 3,7, 10 et 14 jours. La figure 8 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz où le gène est incorporé dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens. La figure 9 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des plants de riz, examinée sur plusieurs parties d'un corps végétal. La figure 10 représente un transfert de Western montrant le nombre de copies du gène OsPSK, examiné après traitement avec diverses enzymes de restriction. La figure 11 représente un transfert de Western montrant la conservation du gène OsPSK examinée sur Arabidopsis thaliana, Asparagus officinalis, Daucus carota et Zinnia elegans. Un criblage a été exécuté comme décrit au-dessous, sur une banque d'ADNc construite à partir de cellules Oc du riz avec des sondes constituées par un mélange d'oligonucléotides, pour tenir compte de la dégénérescence du code génétique, qui correspondent à la séquence d'acides aminés de PSK. L'ARN poly (A) + a été purifié avec une colonne d'oligo (dT) à partir de cellules Oc cultivées pendant 10 jours. Une banque d'ADNc a été construite avec le kit de synthèse d'ADNc ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Quatre-vingt-seize types d'oligonucléotides 15-mères qui correspondent à la séquence d'acides aminés de PSK-a ont été synthétisés, marqués avec [y - 32P]ATP avec un kit de kination (Toyobo, Osaka), et utilisés pour cribler la banque d'ADNc par hybridation sur plages à 25 C dans une solution qui contient 6X de citrate de sodium salin (SSC), 20 mM de NaH2P04, 0,4% de SDS, 5X de solution de Denhardt et 500 mg/1 d'ADN de sperme de saumon. Les filtres ont été lavés plusieurs fois avec 6X SSC et 0,1% SDS à 25 C pendant une heure. A titre de résultat, trois clones d' ADNc s'hybridaient avec les sondes. Les plasmides pBluescript qui contiennent les inserts positifs ont été excisés et introduits dans la souche SOLR de Escherichia coli. Les inserts sousclonés ont été séquences avec le kit de séquençage Big Dye Terminator Cycle et l'analyseur génétique PRISME ABI 310 (Applied Biosystems, Foster, CA) conformément aux protocoles du fabricant. Le résultat a montré qu'un clone d'ADNc code le précurseur de phytosulfokine. L'ADNc ainsi obtenu est appelé OsPSK. Le résultat de l'analyse de la séquence a révélé que l'ADNc OsPSK avait une longueur de 725 paires de bases (pb). La séquence de bases de l'ADNc OsPSK est montrée dans la séquence supérieure de Fig. 1 et dans la séquence n . 2 de la liste de séquences annexée. La séquence contient seize GA répétés dans la région non traduite en 5' (Fig. 1 ligne pointillée). Le cadre de lecture ouvert était long de 267 pb et code la préprophytosulfokine (précurseur du polypeptide PSK) consistant en 89 acides aminés. La séquence d'acides aminés de la préprophytosulfokine est montrée dans la séquence inférieure de la Fig. 1 et dans la séquence n . 1 de la liste de séquences annexée. La séquence de la Fig. 1 suggère une masse moléculaire prédite de 9,8 kDa et un point isoélectrique de 6,48. Une région hydrophobe de 22 acides aminés qui ressemblait à un peptide signal clivable a été trouvée à l'extrémité NH2-terminale de la préprophytosulfokine. Une telle structure de région hydrophobe est trouvée dans des précurseurs de peptides bioactif des animaux. La forme mature prédite de la préprophytosulfokine contient un haut pourcentage d'acides aminés chargés (6% d'acide aspartique, 7,5% d'acide glutamique, et 6% de lysine) et est par conséquent hydrophile. Parmi les 89 acides aminés de la préprophytosulfokine, les acides aminés 80 à 84 codent PSK-a (Fig. 1 ligne double). Les tyrosines sulfatées sont habituellement localisées dans les régions acides de protéines sécrétoires. Tous les sites qui ont été caractérisés dans les animaux contiennent des résidus acide aspartique et acide glutamique près de la tyrosine sulfatée. Les acides aminés acides sont montrés par des cercles dans la Fig. 1. Il y a un résidu acide aspartique en position immédiatement NH2-terminale -1 par rapport à la première tyrosine de PSK, et deux ou trois résidus acides sont trouvés entre-5 et +5 par rapport au premier ou deuxième résidu tyrosine dans PSK-a, respectivement. Une telle caractéristique de la structure suggère que les résidus tyrosine pourraient être sulfatés par la sulfotransférase. Les sites de maturation supposés qui sont contigus à PSK sont conformes à la séquence consensus pour la peptidase V8, ce qui suggère que PSK pourrait être obtenue par maturation protéolytique à partir de la préprophytosulfokine. Les sites de reconnaissance par la peptidase V8 sont indiqués par les flèches. Aucune homologie significative n'a été trouvée entre l'ADNc et d'autres séquences dans les banques de données d'ADN, à l'exception de plusieurs marqueurs de séquence du riz exprimés sans fonction connue. Pour confirmer que le gène OsPSK code effectivement PSK, des cellules Oc du riz ont été transformées avec un ADNc d'OsPSK muté. Les ADNc mutés utilisés pour la transformation sont conçus pour produire de la PSK-a ou de la PSK-p mutée où la thréonine, localisée à la quatrième place du peptide, est remplacée par la sérine. La PSK-a obtenue est appelée [Ser4]PSK-a et la PSK-P est appelée [Ser4]PSK-ss. Les séquences de [Ser4]PSK-a et [Ser4]PSK-ss sont présentées ci-dessous. [Ser4]PSK-a: Y(S03H)IY(S03H)SQ [Ser4]PSK-(3: Y(S03H)IY(S03H)S Une amorce 22-mère (5'-CATCTTGGGAGTAGATATAATC-3') a été synthétisée et utilisée pour obtenir l'ADNc de préprophytosulfokine muté décrit ci-dessus avec un kit de mutagenèse in vitro (Takara, Tokyo). Le plasmide pActnos/Hmz qui contient des gènes de résistance à la kanamycine et à l'hygromycine pour la sélection de transformants a été employé comme vecteur binaire pour la transformation de cellules Oc. L' ADNc de type sauvage ou muté concernant la sérine a été excisé avec Sma 1 et Eco RV et inséré dans le site Sma I du vecteur. L'expression des gènes chimères était sous le contrôle du promoteur de l'actine du riz incorporé dans le vecteur binaire. Les constructions ont été utilisées pour transformer la souche d'Agrobacterium LBA4404 par appariement triparental (procédé de transfert d'un plasmide binaire de E. coli à Agrobacterium par coculture de E. coli contenant le plasmide binaire, de E. coli auxiliaire contenant un plasmide auxiliaire (pRK2013) et de l'organisme receveur Agrobacterium), et la transformation de cellules Oc à médiation par Agrobacterium a été exécutée. Les quantités de PSK-a et de ses analogues, libérées dans le milieu par la souche de type sauvage ou le transformant, ont été mesurées par analyse par chromatographie liquide/ spectrométrie de masse (CL/SM). Un milieu conditionné (MC) obtenu à partir de cellules Oc de type sauvage ou transformées cultivées pendant 14 jours a été chromatographié sur une colonne de DEAE Sephadex A- 25. Les PSK-a et PSK-p contenues dans les fractions de 800 et 1200 mM de KCl ont été adsorbées sur des cartouches Sep-PakVac, éluées avec de l'acétonitrile à 30% qui contient 0,1% d'acide trifluoroacétique, et lyophilisées. Les spectres de masse ont été obtenus avec un spectromètre de masse VG Platform Quadruple Fisons avec ionisation à électropulvérisation (ou électrospray) connecté à un système de CLHP Jasco PU980. Les fractions qui contiennent les PSK ont été dissoutes dans 200 l d'eau et séparées sur une colonne de CLHP en phase inverse (4,6 x 250 mm) avec de l'acétonitrile à 10% qui contient 0,1% d'acide trifluoroacétique à 1,0 ml/min. Les ions pseudomoléculaires de PSK ont été surveillés par balayage toutes les 1,9 s en mode de surveillance sélectif à l'égard des ions. Les séquences d'acides aminés des peptides ont été déterminées par un sequenceur Applied Biosystems modèle 490. Le résultat de l'analyse quantitative d'analogues de PSK exécutée par CL-SM comme décrit ci-dessus est montré dans la Fig. 2. Dans la Fig. 2 les pics qui correspondent à [Ser4] PSK-a (temps de rétention 6,9 min), PSK-a (temps de rétention 8,0 min), [Ser4] PSK-(3 (temps de rétention 9,0 min) et PSK-P (temps de rétention 12,7 min) ont été détectés dans le liquide d'élution provenant du milieu conditionné des cellules Oc transgéniques contenant l'ADNc muté. En outre, les peptides contenus dans les fractions correspondantes ont été séquences et il a été confirmé qu'il s'agissait bien de [Ser4] PSK-a et de [Ser4] PSK-P, ce qui est en faveur de l'hypothèse selon laquelle l'ADNc OsPSK code la préprophytosulfokine et PSK-P est un produit de dégradation enzymatique de PSK-a. En outre, l'ADNc OsPSK a été introduit dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens dans des cellules Oc avec le même vecteur binaire. Puis les quantités de PSK-a et de PSK-P ont été analysées par CL-SM. Les cellules Oc témoins ou transformées (0,8 g) ont été placées dans 100 ml de milieu frais et les quantités de PSK-a et de ses analogues ont été déterminées par analyse au bout d'une semaine de culture. Les résultats indiqués par la valeur moyenne de trois expériences indépendantes sont montrés dans Tableau 1 avec les écarts-types (unité de concentration nM). La PSK-a et la PSK-p accumulées dans le milieu conditionné du transformant sens étaient 1,6 fois plus concentrées que dans le témoin. L'augmentation de la sécrétion de PSK s'est révélée être due à l'introduction du gène. Les quantités de PSK-a et de PSK-p accumulées dans le milieu conditionné du transformant antisens était inférieures à 60% du niveau témoin moyen, ce qui indique une baisse de la sécrétion de PSK. D'autre part, la quantité totale de [Ser4]PSK-a et de [Ser4]PSK-P était égale à 34% de PSK-a et de PSK-P de type sauvage seulement, ce qui suggère que le remplacement d'acides aminés peut diminuer l'efficacité de la maturation et/ou de la modification. Tableau 1. Accumulation de PSK dans du milieu conditionné par des cellules Oc témoins ou transgéniques type cellulaire PSK-a PSK-P [SER4]PSK-a [SER4]PSK-ss témoin 12,6+1,1 332,7+20,1 0 0 antisens 7,3+0,4 175,8+15,4 0 0 sens 21,0+1,9 555,7+31,1 0 0 mutant [Ser4] 11,5+0,9 302,5+15,8 3,1+0,3 105,2+8,9 L'effet du gène OsPSK sur la prolifération cellulaire a été étudié. Le résultat a montré que les cellules transgéniques sens S2 se divisaient approximativement deux fois plus vite (Fig. 4) que le témoin (Fig. 3), tandis que les transformants antisens A2 ralentissaient leurs activités mitogènes cellulaires (Fig. 5). De plus, le fait de munir les transformants antisens de PSK-a permettait de rétablir en partie leurs activités mitogènes (38-64%), ce qui indique que le gène OsPSK favorise la division des cellules végétales. Puis la présence du gène incorporé dans les cellules transformées a été confirmée par transfert de Southern (Fig. 6). Dans la Fig. 6, chaque piste indique les échantillons suivants : W : eau seulement N : cellules Oc du riz non transformées AI-A4: cellules transformées antisens S1-S4: cellules transformées sens P : vecteur d'expression seulement Dans la Fig. 6, une bande de 0,5 kb qui correspond au gène OsPSK incorporé a été identifiée dans les cellules transformées sens S1-S4 et dans les cellules transformées antisens A2. La bande de l,6kb qui correspond au gène OsRacl endogène (gène de l'actine du riz qui existe de manière endogène dans les cellules Oc et qui est utilisé comme gène témoin du fait de son expression constitutive) a été observée dans les cellules transformées sens et dans les cellules transformées antisens. La modification de l'expression du gène OsPSK qui se produit pendant la période de culture a été analysée par analyse par transfert de Northern exécutée par hybridation avec un ADNc de longueur intégrale marqué à 60 C. Dans la Fig. 7, la piste 1, la piste 2, la piste 3 et la piste 4 indiquent les résultats au bout de 3 jours, 7 jours, 10 jours et 14 jours, respectivement. Les résultats dans la Fig. 7 montrent que le gène OsPSK a été exprimé de façon continue dans les cellules Oc cultivées en fournissant PSK de manière continue et a permis aux cellules de proliférer rapidement. Surtout, le gène OsPSK a été exprimé le plus abondamment au bout de 10 à 14 jours. L'expression du gène OsPSK dans les cellules transformées a été confirmée dans la Fig. 8. L'expression du gène OsPSK dans les cellules transformées sens de la piste 1 a augmenté par rapport à celle des cellules non transformées (piste 3). D'autre part, l'expression dans les cellules transformées antisens diminuait (voie 2). De plus, la configuration de l'expression a été examinée sur un plant de riz (Fig. 9). La configuration montrée dans les pistes 1,2, 3,4, 5 indique les résultats pour la première feuille, la deuxième feuille, l'extrémité de la pousse, la racine latérale et la racine de la graine, respectivement. Une expression significative du gène dans l'extrémité de la pousse et la racine de la graine et une expression moindre dans les feuilles sont montrées dans la Fig. 9. Ces résultats indiquent que les régions à croissance active présentent une expression abondante du gène OsPSK. Finalement, une analyse par transfert de Southern a été exécutée après traitement avec différentes enzymes de restriction. Les enzymes de restriction utilisées pour le traitement enzymatique de la Fig. 10 étaient Bam HI (Ba), Eco RI (Ec), Xba 1 (Xb) et Xho I (Xh). De multiples petites bandes ont été observées dans l'échantillon traité avec EcoR I, ce qui indique que le gène OsPSK peut appartenir à une famille de gènes multiples. Cependant, les multiples bandes qui s'hybrident issues de la digestion avec Eco RI ont pu être attribuées aux sites de restriction trouvés dans l'ADNc OsPSK. Pour le vérifier, le transfert a été testé de nouveau avec un fragment de 300 paires de bases provenant de l'extrémité 5 ' de l'ADNc OsPSK. Comme prévu, seule une bande (3,7 kilopaires de bases) s'est hybridée. Par conséquent, il apparaît que la préprophytosulfokine est codée par un seul gène et non pas par des gènes multiples. Pour déterminer si des homologues d'OsPSK sont trouvés dans d'autres espèces végétales, une analyse par transfert de Southern a été exécutée après un traitement avec des enzymes de la restriction comme décrit dans la Fig. 10. Les enzymes utilisées pour le traitement de la Fig. 11étaient Bam HI (Ba) et Eco RI (Ec), respectivement. Une analyse par transfert de Southern a été exécutée sur l'ADN génomique de quatre espèces dont on sait qu'elles produisent PSK, à savoir Arabidopsis thaliana (colonne 1), Asparagus officinalis (colonne 2), Daucus carota (colonne 3), et Zinnia elegans (colonne 4). Des homologues d'OsPSK ont été détectés dans les quatre espèces comme montré dans la Fig. 11, ce qui indique que le gène OsPSK est conservé dans les monocotylédones et les dicotylédones. Par conséquent, on suppose que l'incorporation du gène OsPSK est efficace dans différentes espèces de plantes. Liste de séquences nom du demandeur : de l'université de Nagoya titre de l'invention : précurseur de phytosulfokine, gène le codant, cellule végétale contenant ce gène et procédé pour stimuler la prolifération des cellules végétales nombre total de séquences : 2 séquence n . 1 longueur de la séquence : acides aminés type de séquence : aminés organisme : cellule Oc de Oryza sativa L. séquence: MVNPGRTARA LCLLCLALLL LGQDTHSRKL LLQEKHSHGV GNGTTTTQEP SRENGGSTGS 60 NNNGQLQFDS AKWEEFHTDY IYTQDVKNP 89 séquence n . 2 longueur de la séquence : 725 bases type de séquence : organisme : cellule Oc de Oryza sativa L. séquence: GAAGAAGCAG CAGCAAAAAA GTTGATCAGT TAATTAGCAA GTGTGTTCTT CTTTCTTTTG 60 GTGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGATCTCAG AATGGTGAAT CCAGGAAGAA 120 CAGCTAGGGC ACTCTGCCTC CTATGCCTTG CTCTCCTCCT GCTAGGTCAA GATACCCATT 180 CCAGGAAGCT CCTGTTGCAG GAGAAGCACA GCCATGGCGT CGGCAACGGC ACAACCACCA 240 CCCAGGAACC AAGCAGAGAG AATGGAGGAA GTACAGGTTC CAATAACAAT GGGCAGCTGC 300 AGTTTGATTC AGCCAAATGG GAAGAATTCC ACACGGATTA TATCTACACC CAAGATGTCA 360 AAAACCCATA ATGGCTGTTC ATTTATGATT TGAACTAGTA CTAGTAGCTT ATACCTTCTG 420 CGCGTCTTTT GTTCGTTTGG AGAGGGGATT TTCTTGGGAT TTAGCATATG AACTAATTAA 480 ATTAAATCCC AGGCAAATCC CACTCAGCCC ATTTTGTGCA GAAGTTGTCA GTGTGCACTG 540 TATAATTATT TAGTCATACA CAACTACTCC TGGTAACTAC TCCTATCTTC GATGAATTTT 600 CTGGTTTTGC CAGACGTGAC AATAGTCCAG TAGCATGCAG TACCCTCTCA GAATCCCTGT 660 AATTTTTAGC AAAAAAAAAA GGAAGAAAAG AAAAGAAGCT TCCCTACTAA AAAAAAAAAA 720 AAAAA 725 REVENDICATIONS 1. Polypeptide précurseur de phytosulfokine caractérisé en ce qu'il consiste (a) en un polypeptide ayant la séquence des acides aminés 1 à 89 dans la séquence n . 1 de la liste de séquences, ou (b) en un polypeptide ayant une séquence d'acides aminés qui a plus de 40% d'homologie avec la séquence dudit polypeptide (a), ledit polypeptide étant soumis à une maturation et sulfaté sur les résidus tyrosine de ladite phytosulfokine dans une cellule végétale pour que la phytosulfokine dont les résidus tyrosine sont sulfatés soit sécrétée et puisse stimuler la prolifération de ladite cellule végétale. 2. Gène caractérisé en ce qu'il code le polypeptide précurseur selon la revendication 1. 3. Gène selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de bases parmi la séquence des bases 1 à 725 dans la séquence n . 2 de la liste de séquences et une séquence de bases qui s'hybride avec la séquence de bases précédente dans des conditions stringentes. 4. Cellule végétale transgénique caractérisée en ce qu'elle comprend le gène selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 incorporé dans la cellule pour stimuler la prolifération de ladite cellule. 5. Procédé pour stimuler la prolifération d'une cellule végétale caractérisé en ce qu'il comprend l'incorporation du gène selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 dans ladite cellule végétale. 6. Procédé pour produire une cellule végétale transgénique caractérisé en ce qu'il comprend l'incorporation du gène selon l'une quelconque des revendications 2 et 3 dans une cellule végétale pour stimuler la prolifération de ladite cellule végétale.