Brevet FR2785912A1 — publié le 20000519

SÉQUENCES D'ACIDES NUCLÉIQUES DÉRIVÉES DU GENE DE CAPSIDE DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DE LA LAITUE, ET LEUR UTILISATION POUR L'OBTENTION DE PLANTES TRANSGÉNIQUES RÉSISTANTES AUX POTYVIRUS. L'invention est relative à des plantes transgéniques résistantes aux infections virales et permettant une sécurité biologique accrue. Parmi les virus phytopathogènes, les potyvirus, dont font partie en particulier le virus de la mosaique de la laitue (LMV), le virus de la sharka (PPV), et le virus Y de la pomme de terre (PVY) , constituent le groupe le plus important, tant par leur nombre (plus d'un tiers des virus de plante) que par l'étendue des dégâts qu'ils provoquent dans les cultures. Le PVY, par exemple, est dans de nombreux pays, un obstacle majeur au rendement des cultures de tabac, de pomme de terre, de poivron, de tomate, etc. D'autres virus de cette famille (virus de la mosaïque du haricot (BYMV), virus de la panachure de la tulipe (TBV), virus de la mosaïque du navet (TuMV), virus A de la pomme de terre (PVA)...) sont également responsables de dégâts importants. La lutte contre ces virus phytopathogènes est aujourd'hui encore largement basée sur la sélection de variétés résistantes. Cependant, une approche plus récente, basée sur le concept de résistance dérivée du pathogène [POWELL ABEL et al., Science 232,738-743, (1986) ] est de plus en plus utilisée. Cette approche est basée sur l'obtention de plantes transgéniques, transformées par un gène viral, qui confère la résistance. Par exemple, l'expression d'un gène codant pour la capside virale (coat protein mediated protection) a pu être appliquée avec succès à la plupart des groupes de virus phytopathogènes [pour revue : et BEACHY, Annual Review in Microbiology 47 : 739-763,(1993) ; LOMONOSSOFF, Annual Review of Phytopathology. 33 : 323-33, (1995) ; BAULCOMBE, The Plant Cell 8 : (1996) ; BEACHY, Current Opinion in Biotechnology 8 : 215-220,(1997)]. Le transgène d'origine virale utilisé peut conférer une résistance spécifique, limitée à la souche virale dont est issu le transgène, et à quelques souches très voisines : on parle dans ce cas de : protection homologue . Différents gènes peuvent conférer ce type de résistance, par exemple des gènes de protéine de capside (CP), de polymérase, de protéase. Le transgène viral peut également conférer une résistance contre des virus différents de celui dont il est issu ; ce type de protection dénommé : protection hétérologue , a été observé pour des gènes de protéine de capside, et présente un spectre d'action variable ; STARK et BEACHY, [Bio/Technology, 7:1257-1262, (1989)] font état d'une protection limitée ; LING et al., [Bio/Technology 9 : (1991) ], et BLAISE et al., [Ann. Tabac 27 : (1995) ] mentionnent l'obtention d'une résistance à plusieurs virus. Une construction, obtenue à partir du gène codant pour la capside du PPV (plum pox virus), a permis d'obtenir, chez le tabac, une protection partielle vis à vis du PVY [RAVELONANDRO et al. Plant Science, 91,157-169 (1993) ]. Dans le cas du potyvirus LMV, on a en particulier observé, chez plusieurs espèces végétales, qu'une construction chimérique, comprenant le gène codant pour la capside du LMV, modifié à son extrémité 5' afin d'introduire un codon d'initiation de la traduction, et comprenant la totalité de la région 3' non-codante du gène viral, pouvait conférer une résistance à différents virus autres que le LMV. Cette construction a par exemple permis de conférer, chez le tabac, une protection totale vis-à-vis de PVY [DINANT et al., Phytopathol. 83 : 824, (1993)], une protection partielle vis-à-vis du TVMV (tobacco vein mottling virus), du TEV (tobacco etch virus), du PVMV (pepper veinai mottling virus) et du TuMV (turnip mosaic virus) [BLAISE et al., (1995), cité cidessus)] ; chez la pomme de terre, un bon niveau de protection vis-à-vis du PVY a également été obtenu. [ROUSSELLE et al. : TRANSFORMATION GÉNETIQUE DE LA POMME DE TERRE POUR LA RÉSISTANCE AU PVY (POTYVIRUS) Sixièmes Rencontres de Virologie Végétale, Aussois, 9-13 mars 1997]. Les mécanismes impliqués dans la protection homologue ou dans la protection hétérologue sont encore mal connus. Dans le cas de la protection homologue, des expérimentations effectuées chez des potyvirus ont permis de supposer qu'un mécanisme de type co-suppression où la résistance serait conférée par l'intermédiaire de l'ARNm du transgène, serait au moins en partie responsable de la protection observée ; en présence d'une infection virale, le dépassement d'un seuil critique par la concentration en ARN viraux plus ARNm du transgène induirait une dégradation ribonucléasique, spécifique de ces séquences. Aucun mécanisme de ce type n'a été mis en évidence dans le cas de la protection hétérologue. Il a été supposé que la protéine capside pourrait intervenir dans l'induction de la résistance ; cependant la variabilité des phénotypes de résistance observés suggère l'implication de mécanismes différents. Parallèlement au développement des plantes transgéniques exprimant des séquences virales, l'éventualité de risques écologiques, liée à la culture à grande échelle de ces plantes, est de plus en plus prise en compte. En particulier, on peut craindre un effet épidémiologique sur les populations virales : émergence de souches résistantes, ou modifications de certaines propriétés biologiques. Dans le cas des potyvirus, plusieurs effets potentiellement négatifs ont été identifiés. 5 10 15 20 25 30 35 Le premier de ces effets résulte de la possibilité d'hétéroencapsidation, c'est-à-dire l'encapsidation partielle ou complète du génome nonhomologue d'un virus surinfectant par la protéine capside synthétisée à partir de la plante transgénique. L'hétéroencapsidation nécessite d'une part la reconnaissance par la protéine capside d'un signal d'encapsidation porté par le génome viral, et d'autre part des interactions protéines-protéines entre sousunités de capside. Ce phénomène a déjà été observé pour certains groupes de virus, en particulier les potyvirus, dans le cas de plantes transgéniques exprimant fortement des sous-unités capside ; il a pour conséquence un risque de modification de certaines caractéristiques biologiques du virus surinfectant. Par exemple, la dissémination de ce virus peut être affectée, dans la mesure où certains des déterminants de la dissémination par les insectes vecteurs sont portés par la protéine capside. Il en résulte donc un risque ponctuel de modification de la gamme des vecteurs pucerons après un passage sur de telles plantes [LECOQ et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 6 :403-406, (1993) ]. Les modifications liées à l'hétéroencapsidation ne sont cependant pas maintenues lors de la transmission de ces virus à des plantes non transgéniques. Un autre effet potentiellement négatif résulte principalement de la possibilité de recombinaison entre des séquences du transgène et des virus surinfectants ; cet effet a été décrit pour le groupe des bromovirus. Les modifications dues à ces recombinaisons sont généralement stables et peuvent conduire à l'apparition puis à la dissémination de virus nouveaux, aux propriétés biologiques différentes de celles des virus parentaux. Les régions susceptibles de favoriser de telles recombinaisons intermoléculaires sont principalement les séquences de la région 3' non-codante, qui favorisent et augmentent significativement la fréquence de recombinaison entre le virus surinfectant et l'ARNm du transgène [GREENE et ALLISON, Science, 263:1423-1425, (1994) ; Virology ; 225,1:231-234 (1996) ]. Les recombinaisons intermoléculaires se produisent plus fréquemment entre souches de même virus qu'entre des virus distincts. Dans le cas des plantes transgéniques exprimant des séquences de potyvirus, il a été montré [JAKAB et al. OCDE workshop : POTENTIAL ECOLOGICAL IMPACT OF TRANSGENIC PLANTS EXPRESSING VIRAL SEQUENCES , Gôdôllô, Hongrie, 24-26 avril 1997], qu'il existe une pression de sélection positive générant des virus recombinants quand la résistance virale dépend d'homologies de séquences (protection homologue, s'exerçant par l'intermédiaire de l'ARN). L'utilisation de stratégies de protection homologue risque donc d'augmenter de façon significative les recombinaisons entre souches de virus. En revanche, dans le cas de protection hétérologue, médiée par un mécanisme différent, les risques de recombinaison seraient plus limités. Dans le but de minimiser les risques indiqués ci-dessus, les Inventeurs ont entrepris la construction, à partir d'un gène de capside de potyvirus capable de conférer une protection hétérologue, d'un gène modifié, dépourvu des séquences susceptibles d'entraîner un risque biologique, tout en conservant sa capacité à conférer une protection hétérologue. Des constructions contenant un gène de capside de potyvirus modifié afin de diminuer le risque biologique ont déjà été testées ; cependant, il apparaît que ces modifications peuvent également altérer les caractéristiques de la protection conférée, en particulier son spectre d'activité. Par exemple, dans le cas du PPV, il a été constaté que la modification de certaines séquences du gène de capside conférait une résistance régie par des phénomènes de co-suppression, et spécifique du PPV [JACQUET et al., Transgenic Research 7, 29-39 (1998) ; JACQUET et al., Journal of General Virology 79,1509-1517 (1998)] alors que le gène complet peut également conférer une protection hétérologue (cf. publication de RAVELONANDRO et al. (1993) citée cidessus. Les Inventeurs ont recherché s'il était possible dans le cas du gène de capside du virus LMV, de procéder à des modifications de la séquence visant à réduire les risques biologiques sans pour autant altérer les capacités de protection hétérologue. Dans ce but, ils ont utilisé comme matériel de départ un gène de capside de LMV, à partir duquel ils ont procédé à la délétion de la région contenant la séquence déterminant la transmission par les insectes vecteurs, et pour limiter les risques de recombinaison d'une portion de la région 3' non-codante comprenant des signaux reconnus par la réplicase virale. Ils ont constaté que, contrairement à ce qui avait été observé dans le cas du gène de capside de PPV [JACQUET et al., Transgenic Research 7,29-39 (1998)], la suppression de ces régions dans le gène de capside de LMV ne nuisait pas à la protection hétérologue La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique obtenue à partir de la séquence du gène de capside du potyvirus LMV, par inactivation fonctionnelle d'au moins : - une portion de l'extrémité 5' de la séquence codant pour la protéine de capside, comprenant la séquence codant pour le tripeptide DAG ; - une portion de la région 3' non codante, comprenant des signaux nécessaires à la reconnaissance par la réplicase virale. L'analyse de la séquence de l'extrémité 3' non-codante des gènes de capside de potyvirus indique la présence de signaux potentiels de reconnaissance par la réplicase virale en différents endroits de cette séquence, et notamment dans la région située au niveau des 80 derniers nucléotides (nucléotides 131 à 211) de cette région 3' non-codante. Cette région apparaît en effet capable de former une structure secondaire en épingle à cheveux, similaire à celle observée chez d'autres potyvirus, notamment le TEV, où il a été montré qu'elle jouait un rôle essentiel pour l'initiation de la réplicase du génome viral [HALDELMAN-CAHILL et al., J. Virol. 72,4072-4079 (1998) ]. Au sens de la présente invention, on entend par inactivation fonctionnelle toute mutation (addition, délétion ou substitution de nucléotides) entraînant la perte de la fonctionnalité de la région concernée. Par exemple, l'inactivation fonctionnelle de la région codant pour le tripeptide DAG peut s'effectuer par délétion de cette région, mais également par toute autre mutation entraînant le remplacement de ce tripeptide par une autre séquence peptidique ; même l'inactivation fonctionnelle des signaux de reconnaissance de la réplicase virale peut s'effectuer par délétion de tout ou partie des séquences impliquées dans ces signaux, mais également par tout autre mutation entraînant une modification de structure de la ou des portions concernées de la région 3'. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite séquence comprend au moins la séquence codant pour les acides aminés 42 à 258 de la protéine de capside du potyvirus LMV. Par exemple, une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention peut être obtenue à partir de la séquence du gène de capside du potyvirus LMV, par délétion : - des 7 premiers codons de la séquence codant pour la protéine de capside ; - de la portion de la région 3' non codante située entre 14 pb et 211 pb en aval du codon d'arrêt de la séquence codant pour la protéine de capside. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention telle que définie ci-dessous, pour l'obtention de plantes transgéniques résistantes à des potyvirus autres que le LMV. Ces plantes peuvent être obtenues par les techniques habituelles, connues en elles-mêmes, de transgénèse végétale. La présente invention englobe également les cellules végétales et les plantes transgéniques comprenant dans leur génome au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. Par exemple, des séquences d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être utilisées pour obtenir des plantes résistantes au PVY, au TVMV, au TEV, au PVMV, au TuMV, au PVA (potato virus A), au TBBV (tulip band-breaking virus) au TBV (tulip breaking virus) au TCBV (tulip chlorotic blotch virus), au WMVII (watermelon virus II), au ZYMV (zucchuni yellow mosaic virus), au BYMV (bean yellow mosaic virus), au BCMV (bean common mosaic virus), au CYW (clover yellow vein virus), au JGMV (johnson grass mosaic virus), au MDMV (maize dwarf mosaic virus), au PeMoV (peanut mottle virus), au PetFMV (petunia flower mottle virus), au PeVMV (pepper veinai mottle virus), au PRSV (papaya ringspot virus), au PSbMV (pea seed-borne mosaic virus), au PStV (peanut stripe virus), au SbMV (soybean mosaic virus), au SCMV (sugarcane mosaic virus), au OYDV (onion yellow dwarf virus), au LYSV (leek yellow stripe virus), au WYDV (wakegi yellow dwarf virus), au SPFMV (sweet potato feathery mottle virus). En particulier, des séquences d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent être utilisées pour transformer les plantes suivantes, afin de leur conférer une résistance aux potyvirus : - Tabacs industriels (par exemple variétés de tabacs bruns et blonds Burley et Paraguay), pour conférer une résistance au PVY ; TEV ; TVMV ; PEMV ; - Ail, oignon, échalote pour conférer une résistance au OYDV, au LYSV, au WYDV ; - Arachide pour conférer une résistance au PeMoV, au PStV ; Canne à sucre pour conférer une résistance au SCMV, au MDMV, au JGMV ; - Colza, choux chinois pour conférer une résistance au TuMV ; Cucurbitacées pour conférer une résistance au PRSV, au WMVII, au ZYMV ; - Légumineuses pour conférer une résistance au BCMV, au BYMV, au CYVV, au PSbMV ; - Papayer pour conférer une résistance au PRSV ; - Patate douce pour conférer une résistance au SPFMV (sweet potato feathery mottle) ; - Pétunia pour conférer une résistance au PVY, au TuMV, au PetFMV ; - Piment pour conférer une résistance au PVY, au PepMoV, au TEV ; - Prunus pour conférer une résistance au PPV ; - Soja pour conférer une résistance au SbMV ; - Tomate pour conférer une résistance au PVY, au TEV ; - Pomme de terre, pour conférer une résistance au PVY, et à d'autres potyvirus , tels que le PVA ; - Glaïeul pour conférer une résistance au BYMV ; - Tulipe, pour conférer une résistance aux potyvirus de la tulipe (TBBV, TBV, TCBV). La mise en #uvre de la présente invention permet d'obtenir un spectre d'activité et un niveau de protection comparable à celui de l'utilisation de constructions contenant le gène capside complet du LMV, tout en ne présentant pas les risques biologiques qui pourraient découler de l'utilisation du gène complet. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples non limitatifs d'obtention et d'utilisation de constructions d'acide nucléique conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION D'UN GÈNE MODIFIÉ À PARTIR DU GÈNE DE CAPSIDE DU LMV. Un fragment d'acide nucléique a été préparé par PCR, en utilisant comme matrice pKYLMVCP [DINANT et al., Molecular Breeding 3,75-78, (1997)] qui comprend la totalité de la séquence codant pour la protéine de capside du LMV, et des séquences 3' non traduites. Les amorces utilisées sont les suivantes : 5'-GGGTACCATGGTGACAGGCCAAGGCAGTAAAACTGA-3' pour l'extrémité 5' et 5'-CCTAGAGCTCCCAACACACGCCTTTAGTGCAA-3' pour l'extrémité 3'. Le produit d'amplification obtenu correspond à la séquence codant pour la protéine de capside du LMV, dans laquelle : - la région codant pour la séquence peptidique N-terminale MVDAKLDAG, qui comprend le motif tripeptidique DAG, nécessaire à la transmission par les pucerons, a été remplacée par une séquence codant pour la séquence peptidique MVTG ; - la région 3' non codante a été délétée des 195 pb précédant le polyA, et ne comprend plus que les 13 pb après le codon stop de la séquence codante. Le produit PCR a été cloné dans un vecteur intermédiaire de clonage pour constituer une cassette d'expression, dans laquelle la séquence codante de la protéine capside du LMV est sous contrôle du leader #' de traduction du TMV [GALLIE et al., Nucleic Acid Research 15 : 3257-3273 (1987) ], du promoteur constitutif 35S dupliqué de pCa2 [(KAY et al., Science 236 :1299-1302 (1987)] et du terminateur de la nopaline synthase (tNOS) de pBI101 (CLONTECH). Après vérification de la séquence du produit d'amplification et des éléments de contrôle (enhancer #', promoteur, et terminateur), la cassette d'expression a été transférée dans le vecteur binaire pBBNPTII. Ce plasmide dérive de pBBRlMCS-2 [KOVACH et al., Gene 166 :175-176 (1995) ]. Il possède les frontières de T-DNA de pDHB3 et la cassette pNOS-NPTII-TNOS de pKYLX71-35S2 [MAITI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 6110-6114 (1993)]. Le vecteur obtenu, dénommé pBB-NPTII-CP*(7) est représenté sur la figure 1. Légende de la figure 1 : - MOB : gène nécessaire pour la mobilisation du plasmide ; - Kan : gène (TnphoA) conférant la résistance bactérienne à la kanamycine ; - LB : frontière gauche du T-DNA ; - pNOS/NPTII/tNOS : gène de la néomycine phosphotransférase sous contrôle des séquence promoteur et terminateur de la nopaline synthase ; - PE-35S : promoteur 35S du CaMV (cauliflower mosaic virus) dupliqué ; - CP* : gène de capside du LMV modifié ; - tNOS : terminateur de la nopaline synthase ; - RB : frontière droite du T-DNA ; - REP : gène nécessaire pour la réplication du plasmide. EXEMPLE 2 : OBTENTION DE PLANTES TRANSGÉNIQUES TRANSFORMÉES PAR LE GÈNE DE CAPSIDE DE LMV MODIFIÉ Introduction du gène dans Agrobacterium et transformation du tabac : Le plasmide binaire pBB-NPTII-CP*(7) a été introduit par électroporation dans la souche désarmée d'Agrobacterium tumefaciens C58pGV2260 [DEBLAERE et al., Nucleic Acid Research 13 : 4777-4788 (1985) ]. La transformation du tabac Xanthi XHFD8 [BOURGIN, Mol gen Genet 161 : 225-230 (1978) ] a été réalisée en utilisant des protocoles de transformation et de régénération standard [DINANT et al., European Journal of Plant Pathology 104 : 377-382 (1998)]. L'insertion du gène CP délété a été vérifiée par PCR, à partir d'ADN isolé des plantes transformées, en utilisant les amorces décrites à l'exemple 1 cidessus. EXEMPLE 3 : PROTECTION HÉTÉROLOGUE CONFÉRÉE PAR LE GÈNE DE CAPSIDE DE LMV MODIFIÉ Des plants de tabac de la variété Xanthi XHFD8 ont été transformés selon le protocole décrit à l'exemple 2 ci-dessus : soit avec le vecteur pBB-NPTII-CP*(7) portant le gène de capside de LMV modifié décrit à l'exemple 1 ; - soit avec le vecteur pKYLMVCP portant le gène de capside de LMV complet. Les transformants primaires ainsi obtenus ont été bouturés, et environ 15 boutures par transformant ont été acclimatées simultanément en serre afin d'être utilisées pour des tests de résistance au PVY. Les plantes ont été inoculées, 6 semaines après acclimatation (stade 4 feuilles bien développées) avec la souche nécrotique : Nysa de PVY [TORDO et al., J. Gen Virol. 76 : 939-949 (1995) ] qui produit des symptômes systémiques, se manifestant par des nécroses annulaires typiques, au bout de 10 jours. Des plantes témoin (soit non transformées, soit transformées, mais ne portant pas de séquences d'origine virales (témoin de transformation) ) ont été inoculées de la même manière. L'inoculation a été réalisée mécaniquement, en frottant une feuille préalablement saupoudrée de carborundum avec un jus de plante obtenu à partir d'un broyat de plantes infectées, dilué au 1/250ème. Cette dilution produit 100% d'infection chez les plantes témoin. L'apparition des symptômes a été surveillée quotidiennement pendant 30 jours après l'inoculation, et à intervalles plus espacés par la suite, pendant 2 mois après inoculation. Deux tests ELISA ont été réalisés, 14 et 21 jours après inoculation, à l'aide d'un anticorps dirigé contre le PVY (sérum polyclonal anti-PVY). Ce sérum reconnaît toutes les souches de PVY pour vérifier l'absence d'accumulation virale chez les plantes ne présentant pas de symptômes. Les résultats de ces expérimentations sont illustrés dans le tableau I ci-dessous . TABLEAU I Construction Nombre de Nombre de Pourcentage Pourcentage de Pourcentage de lignées lignées de plantes plantes plantes obtenues- résistantes nécrosées, tolérantes sans immunes, après après 10 symptôme 8 semaines semaines après 8 semaines Témoin 3 0 100 0 0 pKYLMVCP 4 4 0 60 à 100% 0 à 40% pBB-NPTII-CP*(7) 17 15 0 à 10% 50 à 90% 0 à 40% a: pour chaque lignée, en moyenne 12 boutures issues du transformant primaire ont été testées. Dans les plantes témoin, la totalité de plantes ont présenté les nécroses annulaires caractéristiques de la souche Nysa, sept jours après inoculation ; ces symptômes ont persisté pendant toute la durée de l'expérience (2 mois). Pour les 19 lignées obtenues transformées avec les gènes CP LMV original et CP modifié, l'ensemble des plantes testées montre une résistance complète à la nécrose. A aucun stade après inoculation, des nécroses ne sont apparues, sur la feuille inoculée, ni sur les feuilles systémiques. Sur certaines plantes (dites tolérantes) on constate l'apparition de symptômes légers, sous forme d'anneaux légèrement chlorotiques, difficilement discernables sur la majorité des plantes. Ces plantes accumulent faiblement le virus (confirmé par ELISA). Une proportion non négligeable de plantes (jusqu'à 40% pour certaines lignées) ne présentent aucun symptôme et pas d'accumulation virale (plantes immunes). REVENDICATIONS 1) Séquence d'acide nucléique obtenue à partir de la séquence du gène de capside du potyvirus LMV, par inactivation fonctionnelle d'au moins : - une portion de l'extrémité 5' de la séquence codant pour la protéine de capside, comprenant la séquence codant pour le tripeptide DAG ; - une portion de la région 3' non codante, comprenant des signaux nécessaires à la reconnaissance par la réplicase virale. 2) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la séquence codant pour les acides aminés 42 à 258 de la protéine de capside du potyvirus LMV. 3) Séquence d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de la séquence du gène de capside du potyvirus LMV, par délétion : - des 7 premiers codons de la séquence codant pour la protéine de capside ; - de la portion de la région 3' non codante située entre 14 pb et 211 pb en aval du codon d'arrêt de la séquence codant pour la protéine de capside. 4) Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention de plantes transgéniques résistantes à des potyvirus autres que le LMV. 5) Plante transgénique, caractérisée en ce qu'elle comprend dans son génome au moins une séquence d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3.