Brevet FR2790955A1 — publié le 20000922

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'oligonucléotides stabilisés comme principe actif antitumoral à action locale. Le traitement efficace des cancers reste l'un des défis majeurs de la médecine d'aujourd'hui. L'efficacité des thérapeutiques conventionnelles chirurgicales ou à visée cytolytique (chimiothérapie et radiothérapie) reste très limitée dans de nombreux cancers. Pour les astrocytomes par exemple, dont le traitement repose principalement sur l'exérèse chirurgicale et l'irradiation cérébrale locale, la médiane de survie est seulement de 4 à 6 mois après exérèse chirurgicale et de 8 à 10 mois avec l'association chirurgie et radiothérapie. Une chimiothérapie complémentaire allonge la survie chez les patients de moins de 60 ans, mais de façon très modeste, de l'ordre de 3 mois. Sous ce triple traitement, la médiane de survie reste inférieure à deux ans pour le grade histologique III (astrocytome anaplasique) et inférieure à 1 an pour le grade IV (glioblastome). La mortalité pour ces deux groupes est de 100% (Daumas-Duport C. et al. (1988), Cancer 62(10) pp 2152-65). La stimulation du système immunitaire général dans le traitement des cancers est une idée ancienne et de très nombreux produits ont été testés, comme par exemple les extraits bactériens (Jaeckle K. A. et al. (1990), J. Clin. Oncol. 8(8) pp 1408-18), l'ADN bactérien, notamment celui de Mycobacterium bovis (MY-1)(Tokunaga T. et al. (1984), JNCI 72 pp 955-62). MY-1 est cependant inefficace pour augmenter la survie dans un modèle de gliome chez la souris (Nakaichi M. et al. (1995), J. Vet. Med. Sci . 57(3) pp 583-5). L'IL2 (Herrlinger U. et al. (1996), J. Neurooncol. 27(3) pp 193-203) et plus récemment l'IL12 (Kishima H. et al. (1998), Br. J. Cancer 78(4) pp 446-53 ; Jean W. C. et al. (1998), Neurosurgery 42(4) pp 850-6) ont également été étudiés. Malheureusement, la plupart de ces produits ont une efficacité limitée ou une toxicité inacceptable et à ce jour, seul le BCG de Mycobacterium bovis a abouti à des applications cliniques, mais seulement dans des indications très limitées de cancers de la vessie (Soloway M. S. et al. (1988), Urol. Clin. North Am. 15 pp 661-9) Les oligonucléotides sont constitués d'une succession de bases puriques ou pyrimidiques variables, choisies afin d'être complémentaires d'un gène donné. Injectés chez l'animal, les oligodésoxynucléotides pénètrent dans les cellules et en se combinant spécifiquement avec l'ARN messager ou l'ADN génomique correspondant, ils inhibent l'expression du gène correspondant. C'est ce qu'on appelle des oligodésoxynucléotides antisens. En fait, il a été récemment montré que les oligodésoxynucléotides synthétiques possédaient parfois des effets biologiques propres, en dehors de leurs propriétés antisens classiques. Certains oligodésoxynucléotides, indépendamment de toute séquence antisens connues, stimulent, in vitro et in vivo, la prolifération des lymphocytes B, l'activité des cellules NK et induisent la sécrétion par ces cellules d'IFN a, d'IFN ss, d'IFN y, d'IL6, d'IL12 ou de TNF a (Yamamoto S. et al. (1992), J. Immunol. 148 (12) pp 4072-6 ; Yamamoto T. et al. (1994), Microbiol. Immunol. 38(10), pp 831-6 ; Yi A. K. et al. (1996), J. Immunol. 157 (12) pp 5394-402 ; Ballas Z. K. et al. (1996), J. Immunol. 157(5) pp 1840-5 ; J. S. et al. (1996), J. Immunol. 156(12) pp 4570-5 ; StaceyK. J. et al. (1996), J. Immunol. 157 (5) pp 2116-22). L'ensemble de ces cytokines oriente vers une réponse immunitaire de type Thl (Chu R. S. et al. (1997), J. Exp. Med. 186 (10) pp 1623-31). Des auteurs ont montré que les propriétés immunostimulantes de ces oligodésoxynucléotides sont en grande partie dépendantes de motifs 5'-CG-3' non méthylés (dinucléotides CpG non méthylés) qui sont sous-représentés dans l'ADN de mammifères (Kuramoto E. et al. (1992), Jpn. J. Cancer Res., 83 pp 1128-31). Si la séquence 5'-CG-3' non méthylée est indispensable, les deux nucléotides adjacents sont également cruciaux pour l'activité biologique optimale puisque certains auteurs ont montré que les hexamères les plus efficaces semblent être ceux du type 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-3' (Krieg A. M. et al. (1996), Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6 (2) pp 133-9) . Récemment dans la demande internationale WO 9855495, Schwartz D. et al. ont montré, que tous les hexamères tels que définis par Krieg A. M. et al.(déjà cité) n'étaient pas immunostimulants et qu'il convenait plutôt de définir des octamères, de séquence 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CC-3' ou de séquence 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CG-3', pour avoir de manière certaine une activité immunostimulante. Les oligonucléotides sont des polymères formés par la combinaison de bases et de sucres, notamment des ribonucléotides ou des désoxyribonucléotides. A l'état naturel, les liaisons sont des liaisons phosphoesters sensibles aux nucléases de l'organisme humain. Ainsi les oligonucléotides présentent une demi-vie très courte (de l'ordre de la minute) quand ils sont injectés chez l'homme, ce qui limitent leurs effets biologiques. Aussi plusieurs études ont cherché à stabiliser les oligonucléotides en modifiant leur structure chimique pour les rendre résistants aux nucléases. Plusieurs types d'oligonucléotides stabilisés ont ainsi été créés comme, entre autres, les phosphorothioates ou les méthylphosphonates, (Crooke R. M. (1991), Anti-Cancer Drug Design 6 pp 609-46). Les plus fréquemment utilisés sont les oligonucléotides phosphorothioates. Les propriétés des oligonucléotides immunostimulants font actuellement l'objet de recherches pour déterminer leur intérêt comme adjuvant de certains vaccins anti-infectieux, comme l'hépatite B (par exemple Davis H. L. et al. (1998), The Journal of Immunology 160 (2) pp 870-6) . En cancérologie, ils sont utilisés principalement pour stimuler l'immunisation dirigée contre un antigène tumoral spécifique. Ainsi deux études rapportent des effets antitumoraux, obtenus dans un modèle de lymphome murin, lorsque des oligodésoxynucléotides immunostimulants sont utilisés à distance comme adjuvants, une partie de l'immunoglobuline des cellules lymphomateuses étant utilisée comme antigène. (Weiner G. J. et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 94, pp 10833-7 ; Wooldridge J. E. et al. (1997) Blood 89(8) pp 2994-8). Cependant la réalisation de tels vaccins chez l'homme se heurte à des problèmes techniques considérables, principalement en raison de la difficulté qui existe à déterminer un antigène cible potentiel face à un cancer donné chez un malade donné. Alors que les deux études rapportées par Weiner G. J. et al. et par Wooldridge J.E. et al. (déjà cités) montrent que les oligodésoxynucléotides, lorsqu'ils sont utilisés seuls, ne possèdent aucun effet antitumoral et que la demande WO 98/55495 divulgue l'utilisation d'oligonucléotides comme adjuvant destiné à stimuler une immunité contre un antigène spécifique, quelque soit le site d'injection, les Inventeurs ont montré, de manière surprenante, dans un modèle syngénique de gliome de rat et dans un modèle syngénique de neuroblastome de souris, que l'injection d'oligonucléotides stabilisés, seuls, sans antigène associé, en particulier lorsque l'injection est faite dans la tumeur elle-même, a des effets antitumoraux remarquables. De plus les Inventeurs ont montré que cet effet est lié d'une part à la présence d'une séquence particulière et d'autre part à la stabilisation des liaisons phosphates entre les bases et les sucres formant ces oligonucléotides. En conséquence, les Inventeurs se sont donnés pour but d'utiliser certains oligonucléotides stabilisés, comme principe actif antitumoral à action locale. Ainsi la présente invention a pour objet, l'utilisation d'oligonucléotides stabilisés qui comprennent au moins une séquence hexamérique du type : 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-3' pour la préparation d'un médicament à action antitumorale locale. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'oligonucléotides stabilisés qui comprennent au moins une séquence octamérique du type : 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CG-3' ou 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CC-3' comme principe actif antitumoral à action locale. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention les oligonucléotides stabilisés utilisés comprennent au moins une séquence hexamérique choisie dans le groupe constitué par : AACGTT, GACGTT, AGCGTT, GGCGTT, AACGTC, GACGTC, AGCGTC, GGCGTC. Dans un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, les oligonucléotides stabilisés utilisés comprennent au moins une séquence choisie dans le groupe constitué par : AACGTTCC, GACGTTCC, AGCGTTCC, GGCGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCG, AGCGTTCG, GGCGTTCG, AACGTCCC, GACGTCCC, AGCGTCCC, GGCGTCCC, AACGTTCG, GACGTTCG, AGCGTTCG, GGCGTTCG. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'une au moins des bases des hexamères et des octamères décrits ci-dessus peut être modifiée, notamment l'une au moins des cytosines peut être remplacée par une 5-bromocytosine. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'oligonucléotide stabilisé utilisé est choisi dans le groupe constitué par les séquences : SEQ ID N 1 : 5'-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3' SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' SEQ ID N 3 5'-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3' SEQ ID N 4 5'-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3' SEQ ID N 5 5'-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3' SEQ ID N 6 5'-TGCCAGTGACGTCATGTGAC-3' Conformément à l'invention, les oligonucléotides stabilisés utilisés sont sélectionnés notamment dans le groupe constitué par les oligonucléotides phosphorothioates, les oligonucléotides méthylphosphonates ou les oligonucléotides dont au moins une extrémité a été stabilisée (Crooke R. M. (1991), AntiCancer.Drug Design, 6 pp 609-46). De préférence les oligonucléotides stabilisés utilisés selon la présente invention sont des phosphorothioates. Conformément à l'invention, les oligonucléotides stabilisés peuvent être utilisés sous forme de simple brin ou de double brin. Pour l'utilisation conformément à l'invention, les oligonucléotides stabilisés peuvent avoir n'importe quelle longueur supérieure à 6 bases ou 6 paires de bases, de préférence plus de 20 bases ou de 20 paires de bases. Conformément à la présente invention, les oligonucléotides utilisés peuvent comprendre plusieurs séquences précédemment décrites adjacentes ou non, ils peuvent comprendre également d'autres séquences biologiquement actives, comme des séquences antisens. Les séquences hexamèriques ou octamèriques peuvent ellesmêmes être incluses dans des séquences antisens. Les oligonucléotides stabilisés peuvent être utilisés, conformément à l'invention, comme principe actif antitumoral à action locale. La présente invention a également pour objet l'utilisation des oligonucléotides stabilisés comme principe actif antitumoral à action locale, pour la préparation de médicaments aptes à être utilisés dans le traitement des cancers, quels que soient leur nature et leur degré d'anaplasie, en particulier les cancers des systèmes nerveux central et périphérique, notamment les astrocytomes, les glioblastomes, les médulloblastomes, les neuroblastomes, les mélanomes et les carcinomes. Les oligonucléotides stabilisés, utilisés conformément à l'invention, peuvent être couplés par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter l'affinité tumorale, comme par exemple un anticorps spécifique du tissu tumoral. Les oligonucléotides stabilisés sont utilisés préférentiellement par voie intra-tumorale, mais ils peuvent être administrés également par toutes autres voies, éventuellement par voies multiples, notamment par voies intraveineuse, intrapéritonéale, topique, transdermique, sous-cutanée, intra-artérielle, pulmonaire, naso-pharyngée ou orale, en solutions, en suspensions aqueuses ou huileuses, en poudre ou sous toute forme pharmaceutiquement acceptable. Ils peuvent être administrés en une ou plusieurs fois ou en libération continue, notamment au moyen de micropompes osmotiques, ou associés à tout moyen physique ou chimique, notamment à des agents encapsulants comme les systèmes de dispersion colloïdaux et les polymères, les administrations permettant d'avoir une dose thérapeutiquement efficace au site tumoral. Les doses efficaces seront déterminées en fonction de l'âge, de l'état de santé, du poids du patient et du type de cancer à traiter. Typiquement, les doses efficaces chez l'homme sont telles qu'au site tumoral, les doses sont comprises entre 10 et 1000 g/g de tumeur. Conformément à l'invention, l'utilisation des oligonucléotides peut être combinée avec d'autres thérapies, notamment la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie, l'immunothérapie et des thérapies différenciantes. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère aux exemples de réalisation de l'utilisation, objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 illustre les résultats obtenus après une injection intra-tumorale de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), dans le modèle du gliome CNS1 dans le cerveau de rat Lewis (Kruse C. A. et al. (1994), J. Neurooncol. 22 pp 191-200), sur le temps de survie des animaux témoins (-) ; PT1 50 g injecté à J1 (-.-.-.), PT1 50 g injecté à J5 (....) et PT1 50 g injecté à J9 (---), après l'injection des cellules tumorales. L'évaluation statistique des résultats est réalisée par le test de Kaplan-Meier. - la figure 2 illustre l'effet d'une injection intra-tumorale à J1 de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), à différentes doses, dans le modèle du gliome CNS1 du rat Lewis, sur le temps de survie des animaux témoins (-) ; PT1 50 g (----), PT1 10 g (-.-.-.) et PT1 1 g (....). - la figure 3 illustre l'effet d'une injection intra-tumorale de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), ou de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate IMM (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA-3'), dans un modèle de tumeurs gliales sous-cutanées. A J2 après l'injection des cellules tumorales, les animaux reçoivent, par voie sous cutanée, au niveau du site tumoral, du chlorure de sodium (témoin -#-), ou 50 g de PT1 (-0-)ou 100 g de PT1 (-*-) ou 50 g d'IMM (--). Le volume de la tumeur est évalué tous les deux jours. Les résultats sont exprimés en moyenne s. e.m. (test anova). - la figure 4 illustre l'effet d'une injection intra-tumorale de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 ou de l'oligodésoxynucléotide phosphodiester PE1 ayant tous les deux la SEQ ID N 2 (5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), dans un modèle de tumeurs gliales sous-cutanées. A J2 après l'injection des cellules tumorales, les animaux reçoivent par voie sous cutanée, au niveau du site tumoral, du chlorure de sodium (témoin -#-), ou 100 g de PE1 (-D-)ou 100 g de PT1 (-#-). Le volume de la tumeur est évalué tous les deux jours. Les résultats sont exprimés en moyenne s. e.m. (test anova). - la figure 5 illustre l'effet d'une injection intra-tumorale de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), ou de l'ollgodésoxynucléotide phosphorothioate IMM (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA-3'), dans le modèle du neuroblastome neuro2a chez la souris A/J (Sigal R. K. et al. (1991), J. Pediatr. Surg. 26 pp 389-96). A J2 après l'injection de ces cellules tumorales, les animaux reçoivent, par voie sous cutanée au niveau du site tumoral, du chlorure de sodium (témoin -#-), 50 g de PT1 (-#-), 100 g de PT1 (-A-) ou 50 g d' IMM (-J-). Le volume de la tumeur est évalué tous les quatre jours. Les résultats sont exprimés en moyenne s. e.m. (test-t de Student). - la figure 6 illustre l'effet d'une injection par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale de l'oligodésoxynucléotide phosphorothioate PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), à la dose de 50 g dans le modèle du neuroblastome neuro2a chez la souris A/J (Sigal R.K. et al. (1991) , J. Pediatr. Surg. 26 pp 389-96) . A J2 après l'injection de ces cellules tumorales, les animaux (n=6 par groupe) reçoivent 100 l de chlorure de sodium (groupe témoin -#-) ou 50 g de PT1 injectés par voie i. p. (-#-) ou par voie s.c. à distance de la tumeur (-#-) dans 100 (il de chlorure de sodium. Les exemples qui suivent illustrent l'invention, sans toutefois la limiter à ces modes de réalisation particuliers. Exemple 1 : Effet d'une injection intra-tumorale ou d'une injection intrapéritonéale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') sur la survie des animaux dans le modèle du gliome CNS1 dans le cerveau de rat Lewis 1. Mode opératoire : Des cellules de gliome CNS1 cultivées in vitro sont greffées dans le cerveau de rat Lewis sains, à raison de 10 cellules dans le cortex pariétal droit de rats (Kruse C. A. et al. (1994), J. Neurooncol, 22 pp 191-200). a) injection intra-tumorale . 50 g de PT1 dans 7 (il de chlorure de sodium sont injectés au niveau du site tumoral à 1,5 et 9 jours après la greffe (groupe traité à Jl, n=6 ; groupe traité à J5, n=8 ; traité à J9, n=4) ; un groupe témoin (n=14) reçoit du chlorure de sodium. b) injection intrapéritonéale . 50 g de PT1 sont injectés par voie intrapéritonéale, à J1 (n = 5) ; un groupe témoin reçoit du chlorure de sodium (n = 5). 2. Résultats : a) injection intra-tumorale . Ils sont illustrés dans la figure 1. Le groupe témoin montre une survie moyenne de 15 jours et tous les animaux meurent avant le 23ème jour. La survie des animaux traités par PT1 est très augmentée avec des survies à long terme (>90 jours) de 67% (p Tous les animaux morts présentent des tumeurs cérébrales à l'autopsie. Chez les rats survivants, aucun ne présente de signes neurologiques et aucune tumeur n'est trouvée à l'autopsie pratiquée à J90. b) injection intrapéritonéale Dans ces conditions le PT1 n'a pas d'effet significatif. Exemple 2 : Effet d'une injection intra-tumorale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') à différentes doses sur la survie des animaux dans le modèle du gliome CNS1 du rat Lewis 1. Mode opératoire : Les rats reçoivent à J1 après la greffe réalisée dans les conditions décrites à l'exemple 1, une injection intra-tumorale de 1 g, 10 ug ou 50 g de PT1 dissous dans 7 (il de chlorure de sodium ou le véhicule seul (n=5 par groupe). 2. Résultats : Ils sont illustrés dans la figure 2. Une survie supérieure à 90 jours est obtenue dans 60% des cas (p 50 g, et dans 20% des cas (non significatif) après une dos e de 10 g. Il n'y a aucun survivant après une dose de 1 g (n=5). Tous les rats témoins sont morts. Chez les rats survivants, aucun ne présente de signes neurologiques et aucune tumeur n'est trouvée à l'autopsie pratiquée à J90. Exemple 3 : Etude de la mémoire immunitaire à 3 mois dans le modèle du gliome CNS1 du rat Lewis après injection de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') 1. Mode opératoire : Chez des rats (n=5), traités à J5 après la greffe, par 50 g de PT1 et ayant survécu grâce ce traitement au PT1, une nouvelle greffe de 10cellules est pratiquée sur un autre site du cortex cérébral dans les conditions décrites à l'exemple 1, 12 jours après la fin du traitement initial. Parallèlement, une greffe de 105 cellules est réalisée chez des rats non traités auparavant. 2. Résultats : A 90 jours tous les animaux préalablement traités au PT1 ont survécu sans traitement supplémentaire. L'analyse histologique montre qu'il n'y a aucune tumeur résiduelle tant pour le premier site d'implantation des cellules tumorales que pour le second site. Tous les animaux témoins sont morts. Exemple 4 : Comparaison des effets d'une injection intra-tumorale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') sur la survie des animaux dans le modèle du gliome CNS1 du rat Lewis avec celle d'un oligodésoxynucléotide (IMM) comprenant une séquence non immunostimulante octanucléotidique (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA -3') 1. Mode opératoire : Les rats reçoivent à J1 après la greffe réalisée dans les conditions décrites à l'exemple 1, une injection intra-tumorale de 50 g de IMM dissous dans 7 l de chlorure de sodium ou le véhicule seul (n=5 par groupe). 2. Résultats : La durée de vie entre le groupe témoin, ayant reçu le chlorure de sodium, et le groupe traité, ayant reçu l'IMM n'est pas statistiquement différente. Ainsi, un oligonucléotide ne comportant pas de séquence immunostimulante ne permet pas d'augmenter la survie, à l'inverse d'un oligonucléotide comportant une telle séquence (voir exemples 1 et 2). Exemple 5 : Effet d'une injection intra-tumorale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') ou d'un oligodésoxynucléotide (IMM) comprenant une séquence non immunostimulante octanucléotidique (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA -3') dans un modèle de tumeurs gliales sous-cutanées. 1. Mode opératoire : Des cellules de gliome CNS1 cultivées in vitro, sont injectées par voie sous-cutanée à des rats Lewis sains, à raison de 2x106 cellules dans le flanc droit (Kruse C. A. et al. (1994), J. Neurooncol. 22 pp 191-200) . Ce modèle permet de suivre avec plus de précision la croissance de la tumeur, qui peut être aisément évaluée tous les jours chez l'animal vivant. Dans ce modèle 100% des animaux injectés développent une tumeur qui croît pendant au moins 2 semaines. Ensuite, à J2 après l'injection des cellules tumorales, 50 g ou 100 g de PT1 ou 50 g d'IMM, dans 100 fil de chlorure de sodium, sont injectés au niveau du site tumoral (groupe traité par 50 g de PT1, n=9 ; groupe traité par 100 g de PT1, n=6 ; groupe traité par 50 g d'IMM, n=9) ; un groupe témoin (n=9) reçoit 100 fil de chlorure de sodium. La croissance tumorale est mesurée tous les deux jours, et le volume tumoral est estimé au moyen de la formule : Vol=(longueur x largeur x largeur x n)/6. Les animaux sont sacrifiés à J12 après l'injection des cellules tumorales. 2. Résultats.: Ils sont illustrés dans la figure 3. Dans le groupe témoin, 9 animaux sur 9 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 900mm3. Dans le groupe traité par l'IMM, 9 animaux sur 9 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 1100 mm3. Dans le groupe traité par PT1 50 g, 7 animaux sur 9 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 400 mm3, alors que dans le groupe traité par PT1 100 g, seulement 3 animaux sur 6 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 200 mm . L'ensemble de ces résultats confirme donc que le PT1 a un effet antitumoral marqué, lié à la présence d'une séquence immunostimulante. Cet effet est dose-dépendant. Exemple 6 : Effetd'une injection intra-tumorale de PT1 (oligodésoxynucléotide phosphorothioate) ou de PE1 (oligodésoxynucléotide non stabilisé) dans un modèle de tumeurs gliales sous-cutanées ; PT1 et PE1 ayant tous les deux la même séquence immunostimulante (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') 1. Mode opératoire : Des cellules de gliome CNS1 cultivées in vitro, sont injectées par voie sous-cutanée à des rats Lewis sains, à raison de 2x106 cellules dans le flanc droit, dans les conditions décrites à l'exemple 5. Ensuite, à J2 après l'injection des cellules tumorales, 100 g de PT1 ou 100 g de PE1 sont injectés au niveau du site tumoral (groupe traité par 100 g de PT1 dans 100 /ni de chlorure de sodium, n=6 ; groupe traité par 100 g de PE1 dans 100 fil de chlorure de sodium, n=6) ; un groupe témoin (n=6) reçoit 100 fil de chlorure de sodium. La croissance tumorale est mesurée tous les deux jours, et le volume tumoral comme il est décrit dans l'exemple 5. Les animaux sont sacrifiés à J12 après l'injection des cellules tumorales. 2. Résultats : Ils sont illustrés dans la figure 4. Dans le groupe témoin, 6 animaux sur 6 ont développé une tumeur avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 1200 mm3. Dans le groupe traité par PE1, 6 animaux sur 6 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 1000 mm3. Dans le groupe traité par PT1 100 g, seulement 3 animaux sur 6 ont développé une tumeur, avec un volume moyen de la tumeur à J12 d'environ 200 mm3. Exemple 7 : Recherche du mécanisme des effets du PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'), in vitro et in vivo sur les cellules du gliome CNS1 1. Mode opératoire : a) in vi tro . A JO, on met des cellules de gliome CNS1 en culture. A Jl, on ajoute à ces cellules PT1 à des concentrations de 0,05 M, 0,5 M et de 5 M et à J3 on traite les cellules par de la trypsine et on mesure leur viabilité. b) in vivo : voir le mode opératoire de l'exemple 1. 2. Résultats : a) in vi tro PT1, à des concentrations de 0,05 M, 0,5 M et de 5 M ne possède pas d'action cytotoxique directe sur les cellules CNS1 après 48 heures de culture. b) in vivo En revanche, les études immunohistochimiques montrent que l'injection de 50 g de PT1 au sein de la tumeur, déclenche une infiltration massive de cellules NK, de macrophages et de cellules microgliales alors que l'injection de chlorure de sodium est sans effet. Ces résultats suggèrent que l'action du PT1 est due à une activation du système immunitaire local. Exemple 8 : Effet d'une injection intra-tumorale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') et d'IMM (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA-3') dans le modèle du neuroblastome neuro2a chez la souris A/J 1. Mode opératoire : La tumeur est obtenue par injection d'un million de cellules neuro2a dans le flanc droit de souris A/J (Sigal R. K. et al. (1991), J. Pediatr. Surg., 26 pp 389-96). Cette tumeur grossit en 15-20 jours, aboutissant généralement au décès de l'animal ou obligeant à son sacrifice. A J2 après l'injection de ces cellules tumorales, 50 g ou 100 g de PT1 ou 50 g d'IMM dans 100 l de chlorure de sodium ou 100 l de chlorure de sodium (groupe témoin) sont injectés au même endroit (n=6 animaux par groupe). La croissance tumorale est mesurée tous les quatre jours et le volume tumoral est mesuré comme indiqué dans l'exemple 5. Les animaux sont sacrifiés à J22 après l'injection des cellules tumorales. 2. Résultats : Ils sont illustrés dans la figure 5. Dans ce modèle, le volume moyen de la tumeur à J22 est d'environ 800 mmdans le groupe témoin, d'environ 1200 mmdans le groupe traité par 50 g d'IMM, d'environ 200 mm dans les groupes traités par 50 g ou 100 g de PT1. Exemple 9 : Effet d'une injection par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') à la dose de 50 g dans le modèle du neuroblastome neuro2a chez la souris A/J 1. Mode opératoire : La tumeur est obtenue selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 8. A J2 après l'injection des celllules tumorales, 50 g de PT1 dans 100 (il de chlorure de sodium ou 100 l de chlorure de sodium (groupe témoin) sont injectés soit par voie sous-cutanée à distance de la tumeur, soit par voie intrapéritonéale (n=6 aniaux par groupe). La croissance tumorale est mesurée tous les quatre jours et le volume tumoral est mesuré comme indiqué dans l'exemple 5. Les animaux sont sacrifiés à J22 après l'injection des cellules tumorales. 2. Résultats : Ils sont illustrés dans la figure 6. Dans ce modèle, le volume moyen de la tumeur à J22 est d'environ 1000 mm dans le groupe témoin, d'environ 400 mm3 dans le groupe traité par 50 g de PT1 injecté par voie sous-cutané et d'environ 500 mm3 dans le groupe traité par 50 g de PT1 injecté par voie intrapéritonéale. Exemple 10 : Effet d'une injection répétée par voie souscutanée de PT1 (SEQ ID N 2 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3') ou d'IMM (SEQ ID N 9 5'-TGACTGTGAAGGTTCGAGATGA-3') à la dose de 10 g pendant 15 jours dans le modèle du neuroblastome neuro2a chez la souris A/J 1. Mode opératoire : La tumeur est obtenue selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 8. La croissance tumorale est mesurée régulièrement chez tous les animaux et lorsque le diamètre de la tumeur atteint 5 mm, PT1 est injecté, par voie sous-cutanée, autour de la tumeur, pendant 15 jours, à la dose de 10 g par jour dans 100 l de chlorure de sodium (groupe traité par PT1, n=7) ou IMM est injecté par voie sous-cutanée autour de la tumeur pendant 15 jours à la dose de 10 g par jour dans 100 (.il de chlorure de sodium (groupe traité par IMM, n=4) ou 100 l de chlorure de sodium est injecté par voie sous-cutanée autour de la tumeur pendant 15 jours (groupe témoin, n=6). 2. Résultats : Dans le groupe témoin et dans le groupe traité par l'IMM, la croissance tumorale n'est pas ralentie et tous les animaux de ces deux groupes meurent de leur tumeur. Dans le groupe traité par PT1, la disparition complète de la tumeur, sans récidive à long terme, est observée chez 3 souris ; chez 3 autres les tumeurs se stabilisent pendant 3 semaines mais reprennent ensuite leur progression jusqu'aux décès des animaux. Ces résultats montrent que les oligonucléotides immunostimulants stabilisés utilisés selon l'invention, possèdent un effet anti-tumoral intrinsèque marqué, lié à la présence de la séquence immunostimulante et à leur stabilisation. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés qui comprennent au moins une séquence héxamérique de type, 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-3' pour la préparation d'un médicament à action antitumorale locale. 2. Oligonucléotides stabilisés qui comprennent au moins une séquence octamérique du type 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CG-3' ou 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-CC-3' comme principe actif antitumoral à action locale. 3. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon la revendication 1 caractérisée en ce que lesdits oligonucléotides comprennent au moins une séquence hexamèrique choisie dans le groupe constitué par AACGTT, GACGTT, AGCGTT, GGCGTT,AACGTC, GACGTC, GACGTC, AGCGTC, GGCGTC. 4. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon la revendication 2 caractérisée en ce que ledits oligonucléotides comprennent au moins une séquence choisie dans le groupe constitué par : AACGTTCC, GACGTTCC, AGCGTTCC, GGCGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCG, AGCGTTCG, GGCGTTCG, AACGTCCC, GACGTCCC, AGCGTCCC, GGCGTCCC, AACGTTCG, GACGTTCG, AGCGTTCG, GGCGTTCG. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est choisi dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 6. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que au moins une cytosine de la séquence hexamèrique ou octamérique est remplacée par une cytosine modifiée. 7. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les oligonucléotides stabilisés sont sélectionnés dans le groupe constitué par les phosphorothioates, les méthylphosphonates et les oligonucléotides dont au moins une extrémité a été stabilisée. 8. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les oligonucléotides sont sous forme de simple brin ou de double brin. 9. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les oligonucléotides sont couplés par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles à une molécule susceptible d'augmenter l'affinité tumorale. 10. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comme principe actif antitumoral pour la préparation d'un médicament utile pour traiter les cancers quels que soient leur nature et leur degré d'anaplasie. 11. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon la revendication 10, caractérisée en ce que le cancer est choisi dans le groupe constitué par les cancers des systèmes nerveux central et périphérique. 12. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon la revendication 11, caractérisée en ce que le cancer est choisi dans le groupe constitué par les astrocytomes, les glioblastomes, les médulloblastomes, les neuroblastomes, les mélanomes et les carcinomes. 13. Utilisation d'oligonucléotides stabilisés selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le médicament est administré de manière à avoir une dose au niveau du site tumoral de 10 à 1000 g/g de tumeur. 14. Utilisation des oligonucléotides stabilisés selon la revendication 13 caractérisée en ce que le médicament est administré par voie intratumorale. 15. Utilisation des oligonucléotides stabilisés selon la revendication 13, caractérisée en ce que le médicament est administré par une voie choisie dans le groupe constitué par les voies intraveineuse, intrapéritonéale, topique, transdermique, sous-cutanée, intra-artérielle, pulmonaire, naso-pharyngée ou orale. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, caractérisée en ce que les oligonucléotides stabilisés utilisés sont associés à tout moyen physique ou chimique facilitant l'obtention d'une dose locale efficace. 17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 16, caractérisée en ce que les oligonucléotides sont administrés sous toute forme pharmaceutiquement acceptable.