Brevet FR2792728A1 — publié le 20001027

L'invention a pour objet un procédé d'évaluation de l'effet d'un produit sur la lipogenèse de l'épiderme. La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment profond, le derme et un compartiment superficiel, l'épiderme. Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-même principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. Il contient également des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses. L'épiderme est en contact avec l'environnement extérieur. Son rôle consiste à protéger l'organisme de la déshydratation et des agressions extérieures, qu'elles soient chimiques, mécaniques, physiques ou infectieuses. L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau. Les cellules constituant l'épiderme sont délimitées par un domaine lipidique. Au cours de la différenciation, les phospholipides dont le rôle consiste à élaborer la structure fluide des membranes cellulaires des couches vivantes de l'épiderme, sont peu à peu remplacés par un mélange composé en majeure partie d'acides gras, de cholestérol et de sphingolipides. Ces lipides sont organisés en structures lamellaires spécifiques dont l'intégrité dépend non seulement de la qualité des fractions présentes mais aussi de leur proportion respective. Cette structure lamellaire des lipides du domaine lipidique de l'épiderme est responsable de la fluidité donc de la souplesse de la peau. Les lipides sont également responsables des propriétés "barrière" de l'épiderme particulièrement du stratum corneum. Les lipides épidermiques sont synthétisés principalement dans l'épiderme vivant. Ils sont principalement constitués de phospholipides, de sphingolipides, de cholestérol, d'acides gras libres, de triglycérides, d'esters du cholestérol et d'alcanes. Les phospholipides sont essentiels pour la constitution des membranes cellulaires. Ils jouent un rôle important dans la médiation des signaux extracellulaires et la formation de chaînes aliphatiques libres utilisées pour la production d'énergie. Ils constituent un réservoir d'acides gras libres nécessaires à la constitution des sphingolipides. Les sphingolipides (ou céramides) sont essentiels pour le maintien de la structure multilamellaire des lipides intercornéocytaires. Ils sont également essentiels pour les échanges en eau et la fonction "barrière" de l'épiderme. Le cholestérol joue un rôle primordial dans l'hydratation cutanée et dans la fonction "barrière" de l'épiderme. Les acides gras libres jouent un rôle majeur dans le maintien de la structure lamellaire des lipides du stratum corneum, mais également dans la constitution des membranes cellulaires o ils sont responsables de la fluidité membranaire mais également de processus physiologiques tels que le fonctionnement de récepteurs ou l'activité enzymatique. On comprend alors le rôle essentiel que jouent les lipides de la peau et l'importance que revêt leur intégrité. On sait malheureusement que les lipides de l'épiderme sont influencés par des facteurs tels que les régimes alimentaires, le climat et les saisons, les facteurs environnementaux et/ou les agressions externes. Tous ces facteurs ont pour conséquence d'altérer ou encore de modifier la composition des lipides de la peau ou d'en diminuer la quantité. En fait la principale conséquence de ces désorganisations des couches lipidiques de l'épiderme est l'assèchement de la peau. En effet la désorganisation des lipides quand il ne s'agit pas de leur disparition, a pour conséquence l'augmentation de la perte en eau de la peau. Or on sait que la perte en eau au travers des feuillets lipidiques de la peau a pour conséquence le déclenchement d'une néosynthèse de lipides par la peau afin de reconstituer son capital lipidique. Ainsi, une désorganisation régulière et limitée de la couche lipidique par des composants de type intercallants comme des faciliteurs de pénétration peut stimuler de façon constante la lipogenèse de la peau et préparer celle-ci à répondre rapidement et efficacement aux agressions extérieures qu'elle subit. On sait aussi que l'absence de la composante lipidique dans un régime conduit à une détérioration générale de la peau et particulièrement à l'apparition d'une peau écailleuse avec une augmentation concomitante de l'augmentation de la perte trans-épidermale en eau. Les lipides de la peau sont donc essentiels dans le maintien de la fonction barrière de la peau. On sait aussi que les lipides de l'épiderme ont également une influence sur l'activité de certaines enzymes dans la peau impliquées dans la maturation et dans la desquamation du stratum corneum. Des variations dans le taux et le type de lipides présents dans le stratum corneum influencent donc la fonction "barrière" du stratum corneum, le contenu en eau et l'état de la peau. On sait aussi qu'à la ménopause les femmes se plaignent de ce que leur peau tire et qu'elle prend l'aspect d'une "peau sèche", voire de l'apparition d'une xérose. Sans chercher à établir une quelconque théorie sachant que les lipides de la peau jouent un rôle important dans l'hydratation cutanée et que les déficits hormonaux associés à la ménopause s'accompagnent d'un ralentissement général du métabolisme cellulaire, on peut supposer que la sensation de peau qui tire ou de peau sèche que ressent la femme est notamment liée à une diminution de la quantité des lipides totaux de la peau. On comprend qu'il est donc important de pouvoir stimuler la synthèse des lipides de la peau pour maintenir et/ou restaurer leur intégrité afin de leur permettre de jouer les rôles importants qui leur sont dévolus. La demanderesse qui depuis fort longtemps s'intéresse à la peau est toujours à la recherche de nouveaux produits qui permettent le maintien de l'intégrité voire le renforcement des fonctions de la peau, en particulier les fonctions liées à son hydratation mais aussi sa souplesse, son élasticité, sa résistance aux mouvements du corps. Or pour évaluer de tels nouveaux produits il faut mettre en oeuvre des tests qui généralement sont réalisés soit sur des animaux soit directement sur l'homme. Outre le coût et les difficultés matérielles comme par exemple la durée des tests ou encore la non-homogénéité des supports, les variations liées aux époques et/ou l'environnement que l'on peut rencontrer dans la mise en place de tels essais, l'éthique, pour des raisons évidentes, conduit à chercher des protocoles de test excluant toute mise en oeuvre de supports vivants qu'ils soient humains ou animaux. La demanderesse a dans cet ordre d'idée depuis longtemps cherché à développer et mettre en place des méthodes alternatives permettant de substituer des études sur des supports exclusivement réalisés in vitro, comme des équivalents de peau et/ou des équivalents d'épiderme et/ou des équivalents de derme aux études réalisées sur des modèles humains et/ou animaux comme il en est décrit dans l'art antérieur. Un des impératifs de cette substitution est que les équivalents utilisés présentent un maximum de similitudes avec la peau, l'épiderme et/ou le derme des êtres vivants. 1o Ainsi, la demanderesse a établi un protocole de test sur équivalent de peau et/ou d'épiderme, reconstruits in vitro, pour évaluer l'effet d'un produit sur la lipogenèse de la peau et/ou de l'épiderme. Par "effet sur la lipogenèse," on entend selon l'invention les conséquences de l'application topique d'un produit sur la synthèse de novo des lipides de l'épiderme. Comme conséquence on envisage bien entendu selon les circonstances et le produit une stimulation, un maintien ou une inhibition. Cette évaluation s'effectue sur un marqueur choisi (un composant du domaine lipidique de l'épiderme) par rapport au même marqueur dans un équivalent de peau identique non traité par le composant à évaluer (le témoin). Par "produit," on entend selon l'invention un composé, un mélange de composés, une composition comprenant un composé ou un mélange de composés dans un milieu physiologiquement acceptable. Par "milieu physiologiquement acceptable," on entend selon l'invention un milieu compatible avec la peau, les muqueuses, les ongles, les cheveux. L'invention a donc pour objet un procédé d'évaluation de l'effet d'un produit sur la lipogenèse de l'épiderme, caractérisé en ce que dans une première étape on applique à la surface d'un équivalent de peau ledit produit, qu'on laisse ledit produit en contact avec ledit équivalent pendant un temps suffisant, et que dans une deuxième étape on mesure la variation d'un marqueur des lipides de l'épiderme et que l'on évalue les résultats de cette mesure par rapport à un témoin. Par équivalent de peau on entend un système tridimensionnel composé de deux équivalents de tissus à savoir un équivalent d'épiderme et un équivalent de derme. L'équivalent d'épiderme peut être physiquement séparé de l'équivalent de derme qui lui sert de support pour être utilisé seul. Selon l'invention, tout équivalent de peau qui présente un équivalent d'épiderme vivant est utilisable et ce quel que soit l'équivalent de derme sur lequel l'équivalent d'épiderme a été préparé. Par équivalent d'épiderme vivant, on entend tout équivalent d'épiderme contenant au moins des kératinocytes vivants. Mais bien entendu selon l'invention l'équivalent d'épiderme peut contenir en outre tous types de cellules comme par exemple des mélanocytes et/ou des cellules de Langerhans. Ainsi, l'équivalent de derme utilisé selon l'invention peut être choisi parmi les lattices mixtes collagène/fibroblastes, les substituts souscutanés à base de collagène contenant des fibroblastes, ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire des kératinocytes, particulièrement ceux dans lequel pourraient être inclus des fibroblastes. On citera à cet égard par exemple les équivalents de peau décrits dans les brevets ou dans les demandes de brevets EP 0502172, EP 0285471, EP 0285474, EP-A-0789074, EP 0418035, WO-A-90/02796, WO-A-91/16010, WO-A- 9510600, EP 0197090, EP 020753, CA 2119064, FR 2665175. Préférentiellement selon l'invention on utilise l'équivalent de peau décrit dans le brevet EP-0502172, c'est à dire l'équivalent de peau vendu par la société Episkin, France, constitué d'un biomatériau à base de collagène comportant intimement associés un support ou substitut dermique comprenant un couche essentiellement de collagène de type IV et un épithélium épidermique à cellules différenciées obtenu par culture de cellules épidermiques sur ladite couche dudit support ou substitut dermique. Ainsi, l'invention présente de nombreux avantages liés à l'aspect tridimensionnel d'un équivalent de peau, à la présence des deux tissus (équivalent d'épiderme et équivalent de derme) qui permet d'étudier les interactions entre les deux tissus et le rôle de chaque type cellulaire dans la réponse au produit testé, à la capacité de faire varier la nature, la qualité, la quantité dudit produit testé. Selon l'invention, dans la première étape du test on applique à la surface d'un équivalent de peau ou d'épiderme le produit à tester et on laisse ledit produit en contact avec ledit équivalent pendant un temps suffisant. De manière générale, le temps pendant lequel on laisse le produit à tester en contact avec l'équivalent de peau ou d'épiderme obtenu in vitro est conditionné à la fois par les paramètres du produit que l'on désire tester mais également par l'effet que l'on désire obtenir. C'est au minimum le temps nécessaire pour voir apparaître une modification du niveau d'expression du marqueur spécifique choisi (un composant du domaine lipidique de l'épiderme) par rapport au même marqueur dans un équivalent de peau identique non traité par le composant à évaluer (le témoin). Ce temps d'application peut aller de 1 minute à plusieurs heures voire plusieurs jours. Préférentiellement, selon l'invention, le temps d'exposition est compris entre 5 minutes et 24 heures. Selon une variante de l'invention, le produit à tester peut être appliqué sur l'équivalent de peau ou d'épiderme par des applications répétées à des intervalles de temps que l'expérimentateur peut aisément définir à sa convenance. Bien entendu, sans que cela influe sur l'invention, I'homme du métier choisira la quantité de produits qu'il désire appliquer sur l'équivalent en fonction du produit et de l'effet qu'il recherche. Selon l'invention, on mesure la variation d'un marqueur des lipides de l'épiderme et on évalue les résultats de cette mesure par rapport à un témoin. Par marqueur des lipides de l'épiderme, on entend, selon l'invention, tout élément lipidique de l'épiderme dont la présence, l'absence, la modification de l'expression ou la modification de la distribution peuvent être mesurées, en réponse à l'application à la surface de l'équivalent d'épiderme du produit à tester. On peut citer à titre d'exemple de marqueur, et sans limitation, le cholestérol, les phospholipides comme par exemple la phosphatidylcholine, la phosphatidylsérine, la phophatidyléthanolamine, le phosphatidylinositol ou la spingomyéline, les sphingolipides comme par exemple les céramides de type I à VII ou les glucosphingolipides ou cérébrosides comme l'acylglucosidecéramides, les lipides neutres comme par exemple la lanostérol, les diglycérides, les triglycérides ou encore les esters de glycérol, les acides gras libres comme par exemple l'acide oléique, I'acide palmitique, I'acide linoléique, l'acide stéarique s Préférentiellement selon l'invention la marqueur dont on évalue la variation est choisi parmi le cholestérol, les phospholipides totaux et/ou les céramides totaux. L'effet d'un produit sur la lipogenèse de l'épiderme est ainsi représenté par la variation du marqueur des lipides de l'épiderme que l'on aura choisi de doser. Par variation, on entend toute modification de la quantité, de la concentration, de la répartition du marqueur que l'on dose. Pour cela, le procédé selon l'invention comprend une étape de dosage du marqueur des lipides de l'épiderme. Bien évidemment, quel que soit le mode de mise en ceuvre du procédé selon l'invention, toute méthode de dosage connue par l'homme du métier peut être utilisée. On peut, à titre d'exemple et sans limitation, citer les méthodes de dosage des lipides par colorimétrie, par électrophorèse, par spectrographie de masse, par chromatographie (en phase gazeuse ou sur plaque), les méthodes immunologiques, ou encore la microscopie optique ou électronique et toutes les techniques histologiques, histochimiques et/ou immunohistochimiques (à corriger et/ou modifier voire à compléter). Par exemple dans le cas de mesure de quantités lipidiques, on peut utiliser des techniques classiques comme par exemple I'HPTLC ou chromatographie sur couche mince haute performance avec mesure photodensitométrique après révélation par un réactif contenant de l'acétate et du sulfate de cuivre et carbonisation comme cela est décrit par Ponec M (1991, Adv. Lipid Res. 24:83- 117), et dans le cas de mesure de la synthèse lipidique, on peut utiliser des techniques classiques comme par exemple l'incorporation d'acétate-C14 par pré- incubation des épidermes et suivi du marquage par HPTLC et autoradiographie. Le résultat du dosage, qui représente la variation du marqueur des lipides de l'épiderme que l'on a choisi de doser, n'est en soi pas exploitable directement. Il ne devient intéressant que dans la mesure o il est comparé à un témoin. Ce témoin est constitué par le résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute application du produit à tester ou après application d'un produit ayant des caractéristiques différentes. L'homme du métier détermine aisément, par habitude, la nature du témoin nécessaire dans la mise en oeuvre du procédé. De manière préférentielle, le témoin correspond à un équivalent de peau n'ayant subi aucune application de produit. Le procédé selon l'invention peut ainsi permettre l'évaluation des effets d'un produit sur la lipogenèse de l'épiderme. Ceci est d'un grand intérêt dans l'optique de la connaissance des conséquences de l'application sur la peau d'un produit, particulièrement quand celui-ci est un produit nouveau. D'autres applications sont envisageables comme celles qui consistent à évaluer l'activité de nouveaux actifs sur la réparation de la barrière après agression avec des produits comme le propylène glycol qui introduisent dans la couche lipidique de l'épiderme des désorganisations. Ainsi on pourrait soit pré-traiter l'épiderme reconstruit pendant sa formation (de J3-6 à J13-14) avec l'actif restructurant de la barrière, agresser au propylène glycol et voir si la réparation est meilleure avec l'actif, ou bien agresser au propylène glycol puis traiter avec l'actif, I'agression comme le traitement pouvant se faire en applications uniques ou itératives. On va maintenant donner, à titre indicatif et sans limitation aucune des exemples d'utilisation du procédé selon l'invention. Exemple I: Effet du propylène glycol ou du N-octylaminocarbonyl-N-méthyl-D- alucamine sur la lipogenèse de l'épiderme: Les produits sont testés sur un équivalent de peau vendu par la société EPISKIN (LYON, France), après culture de celui-ci pendant 14 jours. Les milieux de culture et d'essais sont ceux inclus dans le kit vendu par le fournisseur. Pendant l'essai, les équivalents sont cultivés, pendant le temps de traitement, dans du milieu de culture contenant de l'acide acétique radiomarqué au carbone 14 ([2-14C]Acetic acid, 58 mCi/mmol, CFA14, AMERSHAM), à raison de 2p.ci/ml de milieu de culture. Le propylène glycol est appliqué sur la surface de l'équivalent de peau à raison de 2 ptl/cm2 d'une solution mère à 3% dans le milieu de culture. Le N-octylaminocarbonyl-N-methyl-D-glucamine est appliqué sur la surface de l'équivalent de peau à raison de 2 pl/cm2 d'une solution mère à 10- 6M dans le milieu de culture. Le produit appliqué est laissé en contact avec l'équivalent de peau pendant 1, 5 ou 24 heures. Le témoin est constitué par un équivalent d'épiderme identique subissant une application topique de milieu de culture sans produit à tester. Dosage des lipides: A la fin de l'incubation on détache l'équivalent d'épiderme de son support collagénique. La préparation des lipides de l'équivalent d'épiderme est réalisée selon la technique et avec les tampons décrits par M. Ponec (1991, Adv. Lipid Res. 24:83- 117), L'analyse par HPTLC est réalisée selon la technique décrite par M. Ponec (1991, Adv. Lipid Res. 24:83-117). En fin de migration des lipides une autoradiographie de la plaque de chromatographie est réalisée pendant une nuit. L'analyse densitométrique de l'autoradiographie est réalisée à l'aide d'un densitomètre de marque Berthold, modèle DAR, Signal Analyser. Résultats et conclusion: Les tableaux ci-dessous montrent la variation du taux de lipide, en comparaison au témoin non traité. Propylène glycol 1 5 24 Phospholipides -26,70% 379,47% 8,61% Sphingolipides 34,04% 80,60% 34,43% AGL 9,25% 11,86% 23,73% Cholestérol 14,54% 104,15% 0,27% Lipides Neutres 21,74% 73, 16% 85,78% Lipides totaux 11,20% 138,50% 27,86% | Noctylaminocarbonyl-N-méthyl-D-glucamine | _ 5 24 Phospholipides 222,86% 299,25% -39, 21% Sphingolipides 54,61% 27,84% 6, 66% AGL 11,02% 17,00% 19, 49% Cholestérol 33,16% -0,40% -4,62% Lipides Neutres 32,11% 3,24% 71,88% Lip tot 77,96% 65,67% 5,20% Ces résultats montrent une augmentation selon des cinétiques différentes de la synthèse des lipides de l'épiderme dès les premiers temps d'application des produits testés. il REVENDICATIONS 1. Procédé d'évaluation de l'effet d'un produit sur la lipogenèse de l'épiderme, caractérisé en ce que dans une première étape on applique à la surface d'un équivalent de peau ledit produit, qu'on laisse ledit produit en contact avec ledit équivalent pendant un temps suffisant, et que dans une deuxième étape on mesure la variation d'un marqueur des lipides de l'épiderme et que l'on évalue les résultats de cette mesure par rapport à un témoin. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'équivalent de peau est constitué d'un équivalent d'épiderme vivant et d'un équivalent de derme. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise un équivalent de peau constitué d'un biomatériau à base de collagène comportant intimement associés un support ou substitut dermique comprenant un couche essentiellement de collagène de type IV et un épithélium épidermique à cellules différenciées obtenu par culture de cellules épidermiques sur ladite couche dudit support ou substitut dermique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'équivalent d'épiderme comprend en outre des mélanocytes et/ou des cellules de Langerhans. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on laisse le produit à tester au contact de l'équivalent de peau pendant un temps d'application qui peut être compris entre 1 minute et plusieurs jours. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on laisse le produit à tester au contact de l'équivalent de peau pendant un temps d'application qui peut être compris entre 5 minutes et 24 heures. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le marqueur des lipides de l'épiderme est choisi parmi le cholestérol, les phospholipides, les sphingolipides, les glucosphingolipides, les lipides neutres, les diglycérides, les triglycérides, les esters de glycérol, les acides gras libres. 8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que le marqueur des lipides de l'épiderme est choisi parmi le cholestérol, les phospholipides totaux et/ou les céramides totaux. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le témoin est constitué par le résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute application du produit à tester ou après application d'un produit ayant des caractéristiques différentes. 10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le témoin est constitué par le résultat du même dosage effectué dans les mêmes conditions, mais en l'absence de toute application du produit à tester.