Brevet FR2792207A1 — publié le 20001020

La présente invention concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par l'application d'un champ électrique parallèle à l'écoulement du flux, une chambre d'écoulement et d'électropulsation ainsi que leur application au traitement cellulaire, notamment la destruction, le transfert transmembranaire de molécules, la fusion membranaire et l'insertion de protéines membranaires. Il est connu d'appliquer un champ électrique à des cellules : lorsque l'on place une cellule dans un champ électrique, les lignes de champ sont déviées par celle-ci, ce qui provoque une accumulation des charges à la surface de la cellule. Ainsi, il en résulte une différence de potentiel transmembranaire induite AV qui se superpose à la différence native ##o [Bernardt J. et Pauly H. (1973):(1)]. La formule la plus complète retenue dans le cas d'un champ à cinétique en vague carrée et d'une cellule sphérique en suspension est la suivante [Kinosita et Tsong (1979) (2) ] : L'expression de cette différence de potentiel induite en un point M au temps t est fonction de : E : l'intensité du champ électrique appliqué, f : le facteur forme de la cellule (1,5 dans le cas d'une sphère), g (#) : est un facteur (de la perméabilité membranaire #) lié aux conductivités des milieux externe et interne et à celle de la membrane, r : le rayon de la cellule, # : l'angle entre le vecteur champ électrique macroscopique et la normale au plan de la membrane au point considéré M, #p : est le temps de charge de la capacité membranaire (de l'ordre de la microseconde). t : temps d'application du champ. Lorsque la durée des impulsions est très supérieure au temps de charge de la membrane (t #p), le terme 1-e-t/#p) devient très proche de 1, on retrouve alors, à l'état stationnaire la formulation classique : Le terme en cos # indique que pour une valeur de champ donnée, l'amplitude de cette différence de potentiel n'est pas identique en tout point de la cellule. Elle est maximale aux points faisant face aux électrodes (pôles) et diminue le long de la surface cellulaire pour s'annuler à l'équateur. Cette différence de potentiel généré par le champ s'ajoute à la différence de potentiel de repos ##o. Il en résulte une différence de potentiel résultante AVr. Au niveau de l'hémisphère cellulaire situé face à l'anode, les valeurs numériques de ##o et de AV s'additionnent pour tenir compte de la vectorialité de l'effet du champ, ce qui entraîne une hyperpolarisation de la membrane. En revanche, au niveau de l'hémisphère situé face à la cathode, les valeurs numériques de ##o et de AV se retranchent, et la membrane subit une dépolarisation. Lorsque cette différence de potentiel membranaire résultante devient supérieure à une valeur seuil estimée à 200-250 mV [Teissié et Tsong (1981):(3)], il y a induction d'un phénomène de perméabilisation [Ho et Mittal (1996):(4)]. La structure membranaire responsable de cette perméabilité membranaire est inconnue à ce jour, et on emploie préférentiellement le terme de structure transitoire de perméabilisation (STP), ce qui est exprimé de façon usuelle par le terme de "pores". Si les conditions d'électroperméabilisation sont contrôlées, ce phénomène de perméabilisation est transitoire et réversible, et affecte peu ou pas la viabilité cellulaire. Cette propriété induite par le champ permet d'avoir un accès direct au contenu cytoplasmique [Mir et al. (1988):(5); Tsong (1991):(6) ; Hapala, (1997) :(7)]. Ceci permet de faire pénétrer dans la cellule des molécules étrangères et naturellement non perméantes et de modifier ainsi son contenu de façon soit transitoire, soit permanente (électrochargement, électrotransformation, électroinsertion). En revanche, dans des conditions d'électropulsation particulières drastiques, l'électroperméabilisation est un phénomène irréversible qui conduit à la mort cellulaire ou électromortalité [Hamilton et Sale (1967) :(8) ; Sale et Hamilton (1967):(9), (1968):(10), Hulsheger et al., (1981):(11), (1983):(12) ; Mizuno et Hori (1988) :(13) ; Kekez et al. (1996):(14), Grahl et Mark) (1996) :(15)]. Cette propriété a été utilisée soit pour lyser des cellules afin de récupérer un métabolite d'intérêt, non excrété naturellement par la cellule, soit pour éradiquer des cellules en environnement (désinfection) ou dans les fluides alimentaires (stérilisation non thermique) [Jayaram et al. (1992):(16), Knorr et al. (1994) :(17) ; Qin et al. (1996) :(18) ; Qin et al. (1998) :(19)]. Il existe dans l'art antérieur deux systèmes moyens d'appliquer un champ électrique pulsé à un milieu liquide, et le choix dépend notamment du volume de milieu liquide à traiter. Ainsi, des systèmes de pulsation à lit fixe, encore appelé batch ont été décrits. Ces installations (chambres) et procédés ne permettent toutefois de traiter que de faibles volumes de l'ordre de la fraction de ml. La limite technique est associée à la puissance disponible sur les générateurs d'impulsions électriques pour un coût raisonnable. Outre les travaux de recherche, cette approche permet en milieu industriel l'obtention d'organismes génétiquement modifiés (OGM). Par ailleurs, on a décrit l'application d'un champ électrique pulsé à un flux, qui permet de traiter une suspension cellulaire en écoulement. Pour le processus en écoulement ou flux, deux stratégies ont été décrites : le flux continu et le flux séquentiel. Dans le second modèle dit à flux séquentiel, la chambre de pulsation est remplie, le flux est arrêté, le champ est ensuite appliqué puis la chambre est vidée, puis elle est remplie à nouveau. Les cellules sont immobiles pendant l'application du champ. Il n'y a donc pas de contraintes hydrodynamiques. Les conditions de travail sont donc identiques à celles décrites pour des expériences à lit fixe. Le débit est limité par la nécessité des temps d'arrêt présents lors de l'application des impulsions. Il est cependant possible de travailler sur des volumes importants mais pour des durées longues. L'avantage du système en flux est en effet de pouvoir traiter des volumes importants. Le flux consiste en un écoulement sans interruption dans la chambre et en une synchronisation des trains d'impulsions avec le débit de l'écoulement. Il est alors possible d'appliquer un nombre bien défini d'impulsions sur les cellules lors de leur temps de résidence dans la chambre de pulsation. Les cellules sont alors en déplacement et soumises à des contraintes hydrodynamiques de déformation et d'orientation. Le débit peut être très élevé n'étant limité que par la fréquence des impulsions. Cette approche permet donc de travailler sur des volumes importants dans des temps courts. Ainsi, pour réaliser certains traitements de flux séquentiel et/ou continu et notamment pour traiter certains flux colonisés, il est connu d'utiliser des systèmes en flux en appliquant un champ perpendiculaire à l'écoulement [Teissié et Conte (1988) :(20) ; Teissié et Rois, (1988):(21) ; Sixou et Teissié, (1990):(22) ; Teissié et al. (1992) :(23), Rois et al. (1992) :(24) ; Bruggeman et al. (1995) :(25) ; Qin et al. (1996):(18)]. On a également proposé des systèmes où le flux et les électrodes sont coaxiaux, systèmes avec lesquels on applique un champ non uniforme mais toujours perpendiculaire à l'écoulement [Qin et al. (1996):(18) ; Qin et al. (1998) :(19)]. Dans toutes les descriptions antérieures, le champ est appliqué de façon perpendiculaire à l'écoulement. D'après Bruggeman et al. (1995) :(25), pour une valeur de champ électrique donnée, la technique en flux résulte toutefois en une moins bonne efficacité que celle obtenue en batch, comme cela a été constaté pour l'électrochargement d'inositol hexaphosphate sur des globules rouges. Ainsi, selon ce procédé, une augmentation de l'intensité du champ électrique de 10% est nécessaire pour obtenir avec un flux continu des résultats similaires à ceux obtenus en batch. Il y a alors nécessité de travailler à intensité de champ plus intense, donc avec des coûts d'utilisation plus élevés. En termes d'efficacité de chargement, l'approche par écoulement permet de traiter un volume beaucoup plus considérable. On a maintenant mis en évidence que l'application d'un champ électrique de façon sensiblement parallèle au flux peut permettre d'obtenir un meilleure efficacité des procédés de traitement en flux continu. Avec certaines espèces, dans le cas de l'électromortalité, le procédé de l'invention permet une éradication totale de la population, alors que celle-ci, que ce soit en flux à champ perpendiculaire ou en lit fixe, n'est pas possible avec les procédés et installations connus. De plus, la perméabilisation totale de la population de cellules sphériques déformables est possible, alors qu'un effet partiel est obtenu avec les procédés et installations connus. En outre, selon l'invention, il est possible de travailler avec des champs plus faibles, donc dans des conditions économiques de coût de fonctionnement plus rentables, par comparaison avec la technique batch (lit fixe). Enfin, cette configuration peut également être intéressante pour les systèmes cellulaires non sphériques, par exemple les systèmes cellulaires en bâtonnet qui subissent l'orientation forcée liée à la contrainte de l'écoulement. Ainsi, selon un premier objet de l'invention, celle-ci concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par un champ électrique pulsé appliqué au flux caractérisé en ce que le champ électrique est appliqué sensiblement parallèlement à l'écoulement. Un autre objet de l'invention concerne une chambre d'écoulement et de pulsation. Des dispositifs de traitement des flux aqueux par un champ sont connus. Selon l'invention, la chambre comporte au moins deux électrodes susceptibles de créer un champ uniforme sensiblement parallèle au flux s'écoulant entre elles. Un moyen de créer une telle configuration du champ consiste à prévoir comme électrodes susceptibles de créer un champ uniforme parallèle au flux s'écoulant entre elles, par exemple des électrodes au travers desquelles le flux s'écoule. De telles électrodes peuvent être des plaques trouées, des grilles, des toiles ou des barreaux par exemple. La section transversale de la chambre de pulsation peut avoir la forme notamment d'un cercle ou d'un polygone ou encore une forme elliptique. Lorsqu'elles sont de type grille ou barreau, les électrodes sont parallèles. Toutefois, d'autres configurations sont envisageables qui permettent de créer un champ uniforme parallèle au flux. Par ailleurs, la section longitudinale n'est pas nécessairement à bords parallèles. Ainsi, le flux colonisé peut être soumis à une contrainte hydrodynamique avant, après ou pendant son passage dans la chambre. Il peut être envisagé des géométries plus complexes en particulier des venturi où une contrainte hydrodynamique sera appliquée lors du passage dans la chambre. De telles contraintes peuvent être appliquées de façon connue par le choix de la configuration des conduites d'amenée et de sortie du flux de la chambre, ainsi que du flux vers la chambre, et la configuration de la chambre elle-même. Parmi les applications du procédé et des chambres selon l'invention, on peut citer la destruction cellulaire des cellules indésirables présentes dans un milieu aqueux colonisé et l'extraction de métaboliques cytoplasmiques par perméabilisation des membranes, ainsi que la modification du contenu cytoplasmique par transfert de petites molécules ou de macromolécules (peptides, protéines, acides nucléiques : oligonucléotides, ARN, ADN), la fusion de cellules et l'insertion de protéines transmembranaires. De plus, l'invention conceme un procédé de destruction cellulaire où l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique sensiblement parallèle à son écoulement. Elle concerne aussi un procédé de perméabilisation membranaire de cellules d'un flux aqueux colonisé, par application d'un champ électrique sensiblement parallèle au flux. Enfin, la présente invention concerne l'application du procédé de traitement au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucléotides) dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à l'insertion de protéines membranaires. Par flux colonisé, on entend tout flux de milieu aqueux domestique, naturel, alimentaire ou utilitaire comportant des cellules indésirables. Ces cellules ou microorganismes peuvent être de façon générale tout organisme monocellulaire se développant ou vivant dans le flux aqueux. Dans certains cas, il y a lieu de les éradiquer pour des raisons de santé ou d'hygiène publique, d'écologie ou d'entretien d'équipements industriels. Ainsi, certaines cellules prolifèrent dans certains milieux et leur présence ou leur multiplication dans les eaux et liquides à traiter est néfaste au fonctionnement des installations ou à la santé ou au bien-être. Le flux colonisé peut être un milieu aqueux contenant des cellules ou microorganismes producteurs de molécules d'intérêt dont on souhaite récupérer le contenu ou introduire des molécules ou macromolécules effectrices sur son activité (modification génétique par exemple). Il peut s'agir de cellules sphériques déformables mais également de tout système cellulaire sensible au champ électrique, en vue de l'électromortalité, et des autres applications des procédés de l'invention, et notamment des systèmes cellulaires ayant d'autres configurations, comme des bâtonnets, des bactéries ou des levures peuvent être traités. La présente invention sera mieux comprise au vu de la description détaillée et des dessins annexés. La figure 1 illustre, pour des amibes, les résultats en terme de pourcentage de viabilité des cellules, par l'application de champ électrique pulsé où le champ est appliqué respectivement de façon parallèle à un écoulement (1-noir), de façon perpendiculaire à un écoulement (2-grisé) et de façon discontinue (batch - blanc). Les figure 2A et 2B illustrent, en terme de pourcentage de perméabilisation de la membrane cellulaire d'amibes, l'efficacité d'un champ appliqué à intensité E (kV/cm) de façon perpendiculaire à l'écoulement (flux-*- 2A) et celle d'un champ appliqué de façon parallèle à l'écoulement (flux -#- 2B), comparées à celle d'un champ appliqué de façon discontinue (batch : -o- 2A et 2B). La figure 3 représente une vue schématique d'une cellule utilisable selon l'invention. Selon l'invention, de préférence, le flux est continu. Toutefois, le procédé de l'invention peut également être mis en oeuvre avec un flux séquentiel. Les valeurs définissant le champ électrique appliqué dépendent de l'installation et de l'application prévue pour le procédé. Ainsi la différence de potentiel électrique appliquée entre les deux électrodes est une fonction de l'utilisation envisagée. Elle est souvent sous le contrôle de la distance entre les deux électrodes. Elle doit permettre de couvrir des gammes de champ électrique comprises entre quelques V/cm et des dizaines de kV/cm. Le profil des impulsions est optimisé pour le type d'application. Il peut être de type vague carrée, trapèze, sinusoide, triangle ou à déclin exponentiel. Les impulsions peuvent être unipolaires ou bipolaires. La fréquence des impulsions est optimisée pour le type d'applications mais reste de préférence inférieure au MHz. Le système de pulsation mis au point au laboratoire pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention comporte les différents éléments suivants : un réservoir de cellules doté notamment d'un agitateur, une pompe péristaltique, une chambre de pulsation et une décharge du flux traité permettant de récupérer les cellules, et des moyens de convoyer le flux du réservoir à la chambre et de la chambre à la décharge. Un exemple de réalisation de la chambre sera décrit plus loin en détail. La pompe péristaltique (pompe, minipuls 3, Gilson) assure une surpression dans le réservoir de cellules, ce qui permet d'entraîner la suspension cellulaire vers la chambre d'électropulsation, sans passage entre les galets de la pompe. Celle-ci est dotée d'un système débimétrique qui permet de régler le débit de manière précise. Le débit Q utilisé est basé sur la notion de temps de résidence de sorte que chaque cellule qui rentre dans la chambre de pulsation subisse les mêmes conditions électriques. Il est défini par la fréquence (F), le nombre (N) des impulsions et par le volume (V) de la chambre de pulsation par la relation suivante : fréquence (Hz) x 60 x Volume de la chambre (ml) Q(ml/minute) = nombre d'impulsions appliquées Selon l'invention, le débit peut être optimisé pour le type d'applications. Le débit est de l'ordre de 0,5 ml/min à plusieurs m3/s. Les électrodes dans les deux systèmes sont connectées à un générateur de haute tension impulsionel (1,5 kV/cm, 8 Amp, durée des impulsions programmables de 5 s à 24 ms, fréquence de 0,1 à 10 et jusqu'à 2000 Hz en pilotage externe) relié à un oscilloscope (Enertec) permettant ainsi de visualiser les paramètres électriques délivrés. Le profil cinétique des impulsions délivrées par le générateur est dit en vague carrée, l'intensité du champ demeurant constante durant toute la durée des impulsions (T). La flexibilité de l'électropulsateur permet de moduler la tension, la durée, le nombre et la fréquence des impulsions. Exemple Méthode de mesure Les expériences ont été réalisées sur des amibes, sous forme végétative (Naegleria lovaniensis Ar9M1). La taille des cellules est de 18,2 m (8,5 m - 31,5 m) x 10,9 m (4 m - 21 m). Elles sont cultivées en condition axénique sur des boîtes plastiques à 37 C et en utilisant le milieu de culture de Chang. Le milieu de pulsation utilisé est de l'eau de rivière filtrée et ayant une conductance de l'ordre de 200 S/cm. La viabilité est évaluée 24 heures après le traitement électrique par la technique de coloration au crystal violet. La perméabilisation des cellules est quantifiée en cytométrie de flux par l'utilisation d'un marqueur fluorescent naturellement non perméant, l'iodure de propidium. 1) Descriptif du système de pulsation à lit fixe La chambre de pulsation est constituée de deux électrodes à lames en acier inoxydable planes maintenues parallèles par des cales isolantes. La distance interélectrode est de 0,4 cm. 2) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ perpendiculaire à l'écoulement (comparatif). Les électrodes en acier inoxydable sont constituées par deux lames parallèles séparées par une distance interélectrode de 0,4 cm. Le volume de la chambre de forme parallélépipédique de pulsation est de 0,2 ml. 3) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ parallèle Les électrodes utilisées en acier sont des grilles constituées d'un maillage (80 m x 100 m) au travers duquel les cellules transitent. La distance interélectrode est de 0,93 cm et le volume de la chambre de pulsation est de 0,117 ml. Dans les deux cas, le milieu aqueux colonisé est pompé à partir d'un réservoir agité. Le flux aqueux créé est ainsi entraîné dans une conduite. La chambre de pulsation délimitée par les deux électrodes quel que soit l'orientation du champ est constituée par une portion de la conduite délimitée par deux électrodes. Les électrodes sont en forme de grillage et laissent passer le flux dans le cas du champ parallèle. Les électrodes sont reliées à un électropulsateur. Les deux chambres de pulsation en flux ont des volumes différents, ce qui explique pourquoi les débits utilisés pour avoir les mêmes conditions d'électropulsation sont différents. Le débit dans le cas où le champ est perpendiculaire à l'écoulement est de 1,2 ml/min et celui de la configuration du champ parallèle à l'écoulement est de 0,71 ml/min. Le liquide amené par une connectique reliée à une pompe d'alimentation passe à travers la première électrode, traverse la chambre, puis la seconde électrode avant d'être récupéré. 1 - Le corps : Un trou cylindrique (diamètre de l'ordre des millimètres) est percé dans une plaque de plexiglas (épaisseur de 1 à 10 mm). Matériau : plexiglas, qui est un isolant électrique, tout autre matériau isolant peut être envisagé, en particulier ceux qui sont aptes à être moulés. La section transverse a été choisie pour une commodité de réalisation (un coup de foret). La section longitudinale est à bords parallèles, ce qui assure un critère de bonne homogénéité du champ donc de traitement des cellules. 2 - Les électrodes : De la toile métallique en acier (grille) ou des aiguilles en acier inoxydable (barreau) ont été utilisées. Pour la toile, la maille a été choisie avec un pas fin pour assurer une bonne conformité du champ. Cela permet de traiter de façon plus homogène les cellules. Tout matériau conducteur de l'électricité peut constituer les électrodes. Les électrodes sont reliées au générateur d'impulsions électriques. Les électrodes sont placées contre le corps de la chambre. L'étanchéité est obtenue par des joints toriques et un dépôt de silicone. 3 - Connecteurs d'alimentation en fluide : Ils sont insérés dans des plaques de plexiglas maintenues en contact intime avec les électrodes. Des joints toriques et un dépôt de silicone assurent l'étanchéité. A la figure 3 apparaît le tuyau d'amenée du flux raccordé par un raccord 6 à un porte-raccord 5. Entre un joint torique externe 4 et un joint torique interne 3 se trouve maintenue l'électrode 2. Le joint torique interne 3 assure l'étanchéité avec le corps 1. Un autre joint torique interne 3' assure l'étanchéité avec le corps 1 et maintient la seconde électrode 2'. Sur le trajet du flux, des éléments 4', 5', 6', 7' homologues des éléments 4,5, 6 ,7 ci-dessus conduisent le flux vers la sortie du dispositif. Les électrodes 2,2' sont connectées au générateur d'impulsion électrique (non représenté). Résultats Pour les trois techniques d'électropulsation (batch, champ parallèle au flux, champ perpendiculaire au flux) on a mesuré l'efficacité pour la destruction des amibes. Les cellules ont été électropulsées, dans tous les cas, par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence d'1 Hz. Les résultats concernant l'évolution de la viabilité avec l'intensité du champ électrique sont présentés sur la figure 1. On obtient dans la configuration en flux avec le champ parallèle à l'écoulement, un profil de chute de la viabilité, où la viabilité est d'autant plus affectée que l'intensité du champ électrique augmente. L'utilisation en flux d'un champ parallèle à l'écoulement donne les plus faibles taux de viabilité pour chaque intensité du champ électrique étudiée, et s'avère donc être une technique très efficace pour éradiquer des amibes. Pour une valeur de champ de 1,5 kV/cm, on observe une élimination totale des amibes. Par ailleurs, les résultats obtenus avec un champ perpendiculaire à l'écoulement montrent que dans ce type de configuration, pour des valeurs de champ élevées (= 1 kV/cm), l'augmentation de l'intensité du champ électrique ne se traduit pas par un accroissement du taux de mortalité. 25% de la population n'est pas affecté par l'effet lytique du champ. Les figures 2A et 2B comparent les profils obtenus de perméabilisation en fonction de l'intensité du champ électrique pour les deux techniques en flux par rapport au profil de perméabilisation obtenu en batch. Les cellules, dans les trois cas, sont électropulsées par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence de 1 Hz. Dans la configuration où le champ est perpendiculaire à l'écoulement (2A), sur une gamme d'intensité de champ électrique allant de 0 à 0,75 kV/cm, l'augmentation de l'intensité du champ électrique se traduit par une augmentation du taux de perméabilisation. L'augmentation de l'intensité du champ n'entraîne pas un accroissement du nombre de cellules perméabilisées. Un plateau de seulement 40% est obtenu. Dans le cas où le champ est parallèle à l'écoulement (2B), sur toutes les valeurs de champ utilisées, l'augmentation de l'intensité du champ électrique est corrélée à une augmentation du taux de perméabilisation. En terme d'efficacité de perméabilisation en flux, l'utilisation d'un champ parallèle à l'écoulement donne les meilleurs résultats. L'augmentation de l'intensité du champ permet de perméabiliser plus de 90% de la population. Par ailleurs, la perméabilisation en flux, avec champ parallèle à l'écoulement, est déclenchée pour des valeurs inférieures à la valeur critique en batch (0,25 kV/cm). REFERENCES 1. Bernhardt J. et al., Biophysik. 10: 89-98 (1973) 2. Kinosita K. et al., Biochim. Biophys. Acta 554 : (1979) 3. Teissié J. et al., Biochemistry 20 : 1548-1554(1981) 4. Ho S. Y. et al., Critical Reviews in Biotechnology, 16 : 349-362 (1996) 5. Mir L. M. et al., Experimental Cell Research 175 : (1988) 6. Tsong T. Y., Biophys. J. 60 : 297-306(1991 ) 7. Hapala I, Critical Reviews in Biotechnology 17 : 105-122 (1997) 8. Hamilton W. A. et al., Biochim. Biophys. Acta. 148 : (1967) 9. Sale J. H. et al., Biochim. Biophys. Acta. 148 : (1967) 10. Sale J. H. et al., Biochim. Biophys. Acta. 163 : (1968) 11. Hulsheger H. et al., Radial. Environ. Biophys. 20 : 53-65(1981) 12. Hulsheger H. et al., Radial. Environ. Biophys. 22 : (1983) 13. Mizuno A. et al., IEEE Transactions on Industry Applications 24 : 387- 394 (1988) 14. Kekez M.M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1278 : (1996) 15. Gralht T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 45 : 148-157 (1996) 16. Jayaram S. et al., Biotechnology and Bioengineering. 40 : (1992) 17. Knorr D. et al, Trends in Food Science and Technology 51 : 71-75 (1994) 18. Qin B-L. et al., Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 36: 603-627 (1996) 19. Qin B-L. et al., IEEE Transactions on Industry Application. 34 : 43-50 (1998) 20. Teissié J. et al., Bioelectrochem. Bioenerg. 19 : (1988) 21. Teissié J. et al., Bioelectrochem. Bioenerg. 19: 59-66 (1988) 22. Sixou S. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1028 : (1990) 23. Teissié J. et al., "Charge and Field effects in Biosystems III", Allen Ed, Birkhauser press pp 449-466 (1992) 24. Rois M. P. et al., Eur. J. Biochem. 206 : (1992) 25. Bruggemann U. et al., Transfusion 35 : (1995) REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par un champ électrique pulsé appliqué au flux caractérisé en ce que le champ appliqué est sensiblement parallèlement à l'écoulement du flux. 2. Procédé selon l'une des revendications 1, caractérisé en ce que le flux est continu. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électrique appliqué est de l'ordre de 0,1à 100 kV/cm. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les pulsations ont un profil en vague carrée, en vague triangulaire, en vague sinusoïdale, en vague trapézoïdale. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les impulsions sont délivrées par une fréquence inférieure au MHz. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le flux est soumis à une contrainte hydrodynamique. 7. Chambre d'écoulement et de pulsation comportant au moins deux électrodes susceptibles de créer un champ uniforme parallèle au flux s'écoulant entre elles. 8. Chambre selon la revendication 7, caractérisée en ce que les électrodes ont une structure au travers de laquelle le flux s'écoule. 9. Chambre selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que les électrodes sont des grilles ou des barreaux disposés de façon sensiblement parallèles entre eux, dans un plan sensiblement perpendiculaire au flux. 10. Procédé de destruction cellulaire caractérisé en ce que l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique sensiblement parallèle à son écoulement. 11. Procédé de perméabilisation membranaire de cellules caractérisé en ce que l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique sensiblement parallèle à son écoulement. 12. Application du procédé selon les revendications 1 à 9, au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucléotides) dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à l'insertion de protéines membranaires.