Brevet FR2786784A1 — publié le 20000609

La présente invention a pour objet un fragment d'ADN de 771C!rmoGsclIs aurantiacus codant pour la synthèse d'une xylanase thermostable d'environ 33 kDa ou tout fragment d'ADN équivalent, une construction d'ADN comprenant ledit fragment et permettant son expression dans une cellule hôte. une cellule transformée exprimant ledit fragment. La présente invention a également pour objet toute xylanase produite par une cellule ainsi transformée et l'utilisation de ladite xylanase pour différentes applications industrielles. Il est connu depuis 1977 que le champignon thermophile Thermoascus allra11liaCIIS produit une xylanase thermostable (Trans. Br. Mycol. Soc., 1977, 69(2), pp. 316-317). Les études menées sur différentes souches de Thermoascus aurantiacus ont permis en principe de sélectionner les souches produisant les concentrations les plus élevées possibles de xylanase dans le milieu de culture et de définir en principe les milieux de culture convenant le mieux pour cette production, Par exemple, le brevet US 4,966,850 décrit un procédé de production de xylanase thermostable par culture d'une souche sélectionnée de Thermoascus arrrarniacrrs sur milieu contenant au moins un substrat cellulosique ou hémicellulosique. Cependant, le champignon Thermoascus n'est pas un très bon producteur de xylanase au plan économique. De plus, industriellement, il est parfois intéressant de pouvoir obtenir cette xylanase sous forme d'une préparation enzymatique pure. Il est donc d'un grand intérêt de transformer un organisme connu pour ses capacités à produire rapidement des protéines enzymatiques à haute concentration dans le milieu de culture en y introduisant le gène codant la protéine qu'on veut obtenir en grande quantité. Pour transformer ce micro-organisme excréteur, dit "souche productrice" ou "souche hôte", avec un gène d'intérêt, il est indispensable de disposer de la séquence nucléique dudit gène. Cependant, jusqu'à présent ce résultat n'avait pas pu être obtenu. En 1989, la xylanase thermostable d'une souche de Thermoascus aurantiacus a été isolée et purifiée (Khandke et al., 1989, Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 274, pp. 491-500) et une séquence des acides aminés correspondant à cette protéine a été publiée (Srinivasa et al., Protein Séquences and Data Analyses, 1991, vol. 4, pp. 15- 20). Cette séquence semble au moins partiellement inexacte selon les résultats objets de la présente invention et qui sont décrits ci-après. De toute manière, aucune conclusion ne pouvait en être tirée quant à la séquence nucléique compte tenu des problèmes de dégénérescence du code génétique, et par ailleurs jusqu'à maintenant il n'avait pas été possible de réaliser une banque d'ADN de Thermoascus. Et de fait, jusqu'à maintenant, aucun gène d'intérêt de Thermoascus n'a été clone. Plusieurs gènes de xylanases thermostables issus de différents micro-organismes ont été séquences et leurs séquences publiées dans différents documents. Parmi ces documents, les deux documents WO 96/23062 et WO 97/27292 méritent une attention particulière car ils revendiquent toutes les séquences d'ADN homologues à celles publiées dans ces documents et codant pour une xylanase, lesdites séquences pouvant notamment être isolées à partir d'une banque d'ADNc préparée à partir de Thermoascus. Ces documents démontrent s'il en était besoin l'intérêt de disposer du gène codant pour la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. Ces deux documents font cependant l'impasse sur deux problèmes essentiels : . la production d'une banque génomique d'ADN de Thermoascus était un problème non résolu, a fortiori celle d'une banque d'ADN complémentaire (ADNc), . les taux d'identité ou d'homologie très variables entre les différentes xylanases, y compris les xylanases d'une même famille. On peut estimer qu'entre les xylanases de la famille 10 provenant de genres différents, les taux d'homologie calculés sur l'ensemble de la protéine mature varient entre 11 et 62 % sur la base des séquences connues. De fait, le document WO 96/23062 décrit une xylanase thermostable de Thermomyces = Humicola lamiginostts appartenant à la famille 11 des glycosyl- hydrolases selon la classification de Henrissat (Henrissat B., Biochem. J., 1991, vol 280, pp.309-316) (voir page 13, lignes 4 à 9 document WO 96/23062) alors que la xylanase XynA de Thermoascus appartient à la famille 10 des glycosyl-hydrolases. Le document WO 97/27292 décrit une xylanase de Myceliophtora thermophila qui appartient à la famille 10 des glycosyl-hydrolases (page 4, lignes 16 à 24) comme la xylanase XynA de Thermoascus, mais l'identité ou l'homologie entre les deux protéines matures est égale à 39 % selon les calculs effectués avec le logiciel GAP défini ci-après. Aucune identité significative n'a pu être calculée à l'aide de ce logiciel entre la protéine mature XynA de Thermoascus et la xylanase de Thermomyces dont la séquence d'acides aminés est donnée dans le document WO 96/23062. De manière générale, jusqu'à présent, la génétique moléculaire de Thermoascus Gllra1lli"CIiS était mal connue. Malgré l'intérêt suscité par les applications industrielles des enzymes de ce micro-organisme et malgré le fait qu'il ne semble pas un bon producteur industriel d'enzymes, aucun gène de ce micro-organisme codant pour des protéines n'avait été clone. Ceci s'explique par les difficultés spécifiques pour travailler au plan de la génétique moléculaire de ce micro-organisme et notamment les difficultés pour obtenir une banque d'ADN génomique de Tfiermoascus anramiacus. La présente invention permet de résoudre ces difficultés et notamment de construire des souches transformées hyperproductrices capables de produire industriellement la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. La présente invention a pour objet un fragment d'ADN de séquence nucléique choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID N 1 ou la séquence de l'un de ses fragments d'au moins 300 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides, et encore de préférence d'au moins 700 nucléotides ; b) la séquence complémentaire à l'une des séquences telles que définies en a) ; c) une séquence présentant une identité d'au moins 60 %, de préférence au moins 70 % et encore de préférence au moins 75 % avec l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ; d) une séquence codant pour un polypeptide ayant une activité xylanase et dont la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 70 %, de préférence au moins 80 % et encore de préférence au moins 85 % avec la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ou c). Le fragment d'ADN selon l'invention est de manière préférée caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être isolé à partir d'un champignon thermophile appartenant au genre Thermoascus ou appartenant à la même famille, et en ce qu'il code pour un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase. De préférence, le fragment d'ADN selon l'invention sera issu du genre Thermoascus. De préférence également, ledit fragment d'ADN codera pour une xylanase appartenant à la famille 10 des glycosyl-hydrolascs selon la classification de Henrissat et encore de préférence cette xylanase sera thermostable, c'est-a1-dirc qu'elle résistera au moins deux heures à 70 C en perdant moins de 10 % de son activité. Les définitions des termes employés sont les suivantes : Thermoascus : champignon filamenteux de la famille des Trichocomaceae selon le Dictionary of the Fungi, 8ème édition, préparé par l'International Mycological Institute, CAB International, 1995, référence ISBN 0-85198-885-7. L'expression tout champignon filamenteux de la même famille signifie tout champignon appartenant à la famille des Trichocomaceae ou tout champignon anamorphe correspondant à la forme asexuée imparfaite de Thermoascus à savoir tout champignon comme ceux appartenant aux genres Paecilomyces ou Polypaecilum ou Colpomella. Fragment d'ADN ou séquence d'ADN ou gène codant pour une xylanase : on entend par ces expressions la région de la séquence d'ADN qui correspond à une région qui est transcrite sous forme d'un polypeptide ayant une activité xylanase, Dans la séquence d'ADN de séquence SEQ ID N 1, la séquence codante est la région située entre le codon ATG de départ en position 859 pour la base A de l'ATG, et le codon stop en position 2773, pour la base A du codon stop TGA. Le polypeptide traduit comprend, en addition à la séquence mature ayant une activité xylanase, une séquence signal N-terminal d'environ une vingtaine d'acides aminés, probablement 26 acides aminés, cette séquence signal ayant en principe pour rôle de permettre la sécrétion du polypeptide. Dans la présente description, on entend désigner par xylanase dans l'expression fragment d'ADN codant pour une xylanase ou toute expression équivalente, d'une part l'ensemble du polypeptide qui est transcrit et d'autre part la partie mature ayant une activité xylanase. La séquence SEQ ID N 1 comprend en plus entre la base 1 et la base 858, une partie du promoteur de Thermoascus ; entre la base 2774 et la base 2966, une partie du terminateur de Thermoascus. Ce promoteur ou un fragment dérégulé fonctionnel de ce promoteur est également partie intégrante de l'invention. L'invention a également pour objet un fragment d'ADN selon l'invention, caractérisé en ce que sa séquence comprend tout ou partie de la séquence du promoteur et/ou de la séquence terminatrice et/ou de la séquence signal de la séquence SEQ ID N 1 codant pour ledit polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase. Le fragment d'ADN selon l'invention dont la séquence est référencée SEQ ID N 1, est obtenu à partir du génome du champignon Thermoascus, de préférence 771ermoasclis alira/1/iaclIs, Il correspond à une partie du gène appelé XY/1A, et code pour la xylanase désignée par XynA, toutes les xylanases selon l'invention étant de manière générale désignées par XynA. Le fragment d'ADN selon la présente invention peut être extrait d'un microorganisme le possédant dans son génome, ou être synthétisé en se fondant sur la séquence divulguée par la présente invention, par n'importe quelle technique appropriée à la disposition de l'homme du métier. Identité de séquences d'ADN L'identité d'une séquence d'ADN, parfois appelée improprement homologie, par rapport à la partie codante de la séquence SEQ ID N 1 (en général sans séquence signal) correspond au degré d'identité entre les deux séquences montrant la divergence d'une séquence par rapport à l'autre. L'identité peut être déterminée à l'aide de programmes d'ordinateur connus des biologistes moléculaires, comme le programme GAP (Huang X., 1994, Computer Applications in the Biosciences, 10, pp.227-235, University of Michigan, adresse Internet http://genome.cs.mtu,edu). Le programme GAP est utilisé avec les paramètres suivants pour comparer des séquences d'ADN : pénalité de création de 30, pénalité d'extension de 3 et score de divergence de -15. Identité de séquences peptidiques L'identité ou homologie entre deux séquences d'acides aminés correspond au degré d'identité entre ces séquences d'acides aminés, faisant apparaître par différence une divergence entre les séquences comparées. L'identité peut être déterminée à l'aide de programmes d'ordinateur connus des biologistes moléculaires, comme le programme GAP (Huang X., 1994, Computer Applications in the Biosciences, 10, pp,227-235, University of Michigan, adresse Internet http://gcnome.cs.nuu cdu). Le programme GAP est utilisé avec les paramètres suivants pour comparer des séquences peptidiques : pénalité de création de 10 et pénalité d'extension de 2, matrice Blosum 62 . Selon ce programme, la séquence peptidique de la xylanase thermostable de Thermoascus publiée par Srinivasa en 1991 ne présente que 59 % d'identité avec la séquence de la protéine mature correspondant à la xylanase thermostable XynA de Thermoascus selon l'invention. Ceci montre que la séquence publiée est erronée et cette erreur était certainement un obstacle supplémentaire pour isoler le gène xynA. Un autre aspect de l'invention concerne une construction d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'invention et les éléments nécessaires pour l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte. Ladite construction d'ADN selon l'invention permet la synthèse du polypeptide correspondant à une xylanase de préférence thermostable, homologue ou totalement identique à la xylanase XynA de Thermoascus, dans une cellule hôte. Une construction d'ADN selon l'invention peut être notamment toute construction adaptée aux opérations de recombinaison d'ADN, et le choix de ladite construction dépendra souvent de la cellule hôte dans laquelle elle doit être introduite. Ainsi, la construction d'ADN peut être par exemple un plasmide réplicatif ou un vecteur intégratif. Dans ladite construction d'ADN, ledit fragment d'ADN selon l'invention codant pour une xylanase homologue ou totalement identique à la xylanase XynA thermostable de Thermoascus est liée de manière fonctionnelle aux éléments nécessaires à sa transcription dans la cellule hôte, c'est-à-dire aux séquences transcriptionnelles et/ou régulatrices adéquates, notamment un promoteur et un terminateur. Le promoteur peut être toute séquence capable de promouvoir l'expression du gène dans la cellule hôte choisie et notamment il peut dériver de gènes codant pour des protéines de la cellule hôte. De préférence, le promoteur utilisé sera constitutif, c'est-à-dire qu'il n'aura pas besoin d'être induit par exemple par du xylane ou du xylose, comme par exemple le promoteur gpdA (glycéraldéhyde phosphate déhydrogénasc) d'A.,per3illrr.s nidulons, ou un promoteur inductible fort, c'est-à-dire ayant une expression forte sauf en présence d'un répresseur, comme par exemple le promoteur fort cbhI (ccllobiohydrolase 1) de Trichoderma reesei qui est réprimé par le glucose, Par ailleurs, si utile, la séquence signal de xynA peut être modifiée ou changée. De manière générale, la présente invention a aussi pour objet tout fragment d'ADN tel que défini ci-dessus comme étant un objet de l'invention et caractérisé par le fait qu'il a subi l'une des modifications suivantes : # changement du promoteur par un promoteur constitutif comme le promoteur gpdA d'Aspergillus nidulans, ou un promoteur inductible fort comme le promoteur cbhI de Trichoderma reesei, # changement du terminateur, # changement de la séquence signal, ces changements pouvant conduire à un promoteur, une séquence signal ou un terminateur hybride contenant encore éventuellement une partie du promoteur, de la séquence signal ou du terminateur du fragment d'ADN de Thermoascus ou d'un champignon filamenteux de la même famille. Ainsi, l'invention a également pour objet un fragment d'ADN selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'une au moins des séquences suivantes : - une séquence hétérologue de promoteur constitutif et non réprimé, notamment le promoteur pdA d'Aspergillus nidlllans ou une séquence hétérologue de promoteur inductible fort, notamment le promoteur cbhl de Trichoderma reesei ; - une séquence hétérologue terminatrice ; - une séquence signal hétérologue. Bien entendu les séquences homologues d'ADN selon l'invention correspondant aux séquences définies en c) et d) ci-dessus peuvent être obtenues à partir de toute banque d'ADN de champignons filamenteux de la même famille que Thermoascus, par des techniques d'hybridation appropriées, l'homme de l'art ayant tous les éléments pour définir à partir d'un manuel de base comme Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. ; Cold Spring Harbor, les conditions de stringence à la lumière des définitions données pour ces identités ou homologies. Les méthodes de ligation de la séquence d'ADN codant pour la xylanase et des séquences transcriptionnclles et/ou régulatrices nécessaires sont bien connues de l'homme de l'art ainsi que les méthodes utilisées pour les intégrer ensuite dans la construction d'ADN désirée pour transformer la cellule hôte choisie (voir par exemple manuel de base cité ci-dessus), L'invention comprend également un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase codé par un fragment d'ADN ou par une construction d'ADN selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 ou le polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 dans lequel le fragment peptidique correspondant au peptide signal a été délété. Un autre aspect de l'invention concerne une cellule hôte contenant la séquence d'ADN hétérologue selon l'invention, codant pour un polypeptide correspondant à une xylanase homologue ou totalement identique à la xylanase thermostable XynA de Thermoascus, ou la construction d'ADN selon l'invention la contenant. Ladite cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. Elle peut être une bactérie, appartenant par exemple au genre Bacillus. Elle peut aussi être une levure, comme par exemple une levure appartenant à un des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Yarrowia. Elle peut également être choisie parmi les champignons filamenteux, tels que Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus, Penicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauvaria, Hypocrea. Ladite cellule hôte, une fois transformée avec la construction d'ADN selon l'invention et cultivée dans des conditions adaptées, permet de produire et d'excréter une xylanase thermostable homologue ou totalement identique à la xylanase XynA, éventuellement sous forme pure quand la cellule hôte transformée n'est pas déjà productrice de xylanase, et de préférence n'est pas non plus productrice d'autres hydrolases comme des cellulases. La cellule hôte transformée est cultivée dans des conditions classiques, sur n'importe quel milieu conventionnel convenant à ladite cellule hôte, additionné ou non de xylanes et/ou de xylose et/ou d'un autre inducteur approprié. Les xylanases de préférence excrétées dans le milieu de culture sont récupérées par des procédés connus incluant entre autre la séparation des cellules du milieu par centrifugation ou filtration, la précipitation des fractions protéiques à l'aide de sels ou la concentration par ultrafiltration, éventuellement suivies de techniques chromatographiques comme la chromatographie par échange d'ions. La xylanase XynA obtenue selon ce procédé, de préférence sous forme pure est un autre objet de l'invention. La xylanase XynA étant de préférence thermostable, en cas de production par une cellule hôte non thermophile, elle peut être obtenue sous forme d'activité pure par un traitement thermique de l'ordre de 2 heures à 70 C. Encore un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la xylanase XynA produite par une cellule hôte transformée par la construction d'ADN selon l'invention. La xylanase thermostable XynA de Thermoascus aurantiacus est une protéine de poids moléculaire d'environ 33 kDa, dont l'activité enzymatique est caractérisée par les propriétés suivantes : pH optimum environ 4,4, température optimum environ 80 C, demi-vie égale à 30 mn à 80 C et pH=8 et à 15 mn à 80 C et pH=3. La perte d'activité totale se produit à 95 C. Ces propriétés rendent cette xylanase et les xylanases thermostables homologues XynA obtenues selon l'invention intéressantes à utiliser dans différentes applications industrielles mettant en #uvre des matières premières végétales ou des plantes contenant des hémicelluloses telles que les céréales. Ces applications sont nombreuses et se trouvent en particulier dans les domaines de l'alimentation animale, notamment du bétail (ruminants et porcins) ou de la volaille, à la panification, à la brasserie ou à la malterie. La xylanase XynA peut être utilisée sous forme d'une enzyme pure, ou en mélange avec d'autres activités enzymatiques selon une formulation particulièrement adaptée à l'alimentation animale, notamment du bétail ou de la volaille, à la panification, à la brasserie ou à la malterie. De plus, la xylanase codée par le fragment d'ADN selon l'invention a des propriétés spécifiques particulièrement intéressantes et inattendues en panification. De manière générale, il apparaît que la xylanase XynA de Thermoascus a des propriétés totalement inattendues en panification, alors que cette application n'avait jamais été décrite. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et la figure dont la légende est représentée ci-après . Légende de la figure Figure 1 : Représentation du plasmide pUT 1122 MILIEUX ET METHODES Milieu de base Mandels : Solution oligo-éléments: KH2PO4 2 g/1 FeSO4,7II2O 2,5 g (NH4)2SO4 1,4 g/1 MnSO4, 7H2O 1 g MgS047H20 0,3 g/l ZnSO4, 7H20 1,76 g CaCl2 0,3 gll CoS04, 7H20 1,25 g Oligo-éléments 1 ml/1 HCI IN 5 ml H2O 495 ml Milieu GS : Milieu BSM : Glucose 10 g/l KH2PO4 1 g/l Biosoyase (BioMérieux, France) 5 g/1 (NH4)2SO 2,5 gfi Agar 15g MgSO471120 0,3 g/1 CaCl2 0,2 g/1 Oligo-élémcnts 1 ml/1 Milieu GLCS : Milieu de base Mandels qsp 1 @ Tween 80 1 g/1 Extrait de levure 1 g/l Phtalate de potassium 10 g/I Glucose 30 g/l Corn Steep 5 g/1 pH 5,8 non ajusté Corn steep = liqueur de trempage du maïs. Dosage des protéines totales : Le dosage des protéines totales excrété dans le milieu de culture se fait selon la méthode de Lowry et al. (1951, J. Biol. Chem., 193, pp.265-275) après précipitation des protéines par un égal volume de TCAIO % (acide trichloroacétiquc 10 %), lecture des densités optiques (DO) à 540 nm et report à la courbe étalon donnant la correspondance entre l'absorbance et la teneur en protéines. Dosage de l'activit.c5rlanase d'une préparation enzymatique : L'unité de xylanase est définie comme la quantité d'enzyme qui libère à partir de xylane une micromole de fonction réductrice exprimée en équivalent xylose, par minute et dans les conditions du dosage. La méthode utilisée est basée sur la méthode Glucose-DNS décrite par Miller et al. (1959, Anal. Chemistry, vol.31, pp. 426-428). La préparation des tampons, des substrats et des réactifs de dosage, le dosage ainsi que la détermination des activités xylanases totales suivent les Laboratory procedures in growth, enzyme measurement, and related analytical procédures (Mary Mandels, 1977, International Course/Symposium Bioconversion of Cellulose Materials into Energy, Chemicals & Microbial Proteins ). - Préparation du substrat : 1 g de xylane d'avoine (Sigma) ou de bouleau (Sigma) est dissous dans 50 ml de soude 1N. Lorsque la dissolution est complète, le pH est ajusté à 4,8 par de l'acide chlorhydrique concentré. On ajoute ensuite 50 ml de tampon citrate 100 mM pH 4,8 de façon à obtenir une solution de xylane à 1 % dans du tampon citrate pH 4,8 à 0,05 M. - Dosages : A 500 l de préparation enzymatique à la concentration adéquate (de façon à obtenir des DO entre environ 0,150 et 0,300 à 540 nm), sont ajoutés 500 l de solution de xylane à 1 % préparée selon le procédé décrit précédemment. L'incubation est effectuée à 50 C ou à 70 C pendant 15 minutes. On ajoute 3 ml de réactif DNS (Miller et al., 1959), on incube 10 minutes à 100 C avant de rajouter 16 ml de tartrate de sodium-potassium à 16 g/1. La lecture des densités optiques est effectuée à 540 nm. La détermination de l'activité totale se fait par rapport à une courbe étalon xylose. Cette activité est exprimée en U par ml, c'est-à-dire en unité xylanase par ml du milieu de culture après séparation de la biomasse par filtration ou en U par mg de protéines totales récoltées, ces protéines étant déterminées par la méthode de Lowry définie ci-dessus. EXEMPLES EXEMPLE 1 : Clonage du gène xynA A) Extraction de l'ADN génomique de Thermoascus aurantiacus De manière générale, il a été constaté que les protocoles d'extraction d'ADN génomique publiés ne convenaient pas pour l'extraction de l'ADN génomique de Thermoascus. Les protocoles suivants ont notamment été essayés sans succès : a) la technique publiée par Wilmotte A. (Syst. Appl. Microbiol., 1993, vol. 16, pp. 436- 444), qui est une des deux techniques de base pour l'extraction de l'ADN génomique des champignons filamenteux ; b) la technique CTAB publiée par Rogers et al. (Plant Molecular Biology Manual, A6, 1988, pages 1-10), qui est l'autre technique de base ; c) DNeasy# Plant Minikit vendu par QIAGEN, Allemagne. En pratique, il était impossible d'obtenir une seule amplification par PCR. Quant aux ligations, plus la quantité d'ADN utilisée était grande moins la réaction fonctionnait (habituellement c'est le contraire qui se passe). Ces difficultés non résolues expliquent probablement pourquoi aucun gène de Thermoascus n'avait été cloné jusqu'à présent. Pour résoudre ce problème, il a été essayé de laver le mycelium avec différents détergents susceptibles d'éliminer les inhibiteurs des réactions recherchées et notamment les polysaccharides. Après de nombreux essais, un protocole a été mis au point, ce protocole repose sur la combinaison des moyens suivants : 1) lavage du mycelium dans une solution de 0,1 % Triton X100# (fournisseur SIGMA), ce Triton X100# étant le nom commercial d'une solution de t- Octylphénoxypolyéthoxyéthanol ; 2) emploi du kit de marque Boehringer pour l'extraction d'ADN de plantes (Boehringer Mannheim), qui n'est pas connu comme pouvant convenir pour l'extraction de l'ADN des champignons filamenteux, et qui a été adapté en ajoutant un broyage préliminaire complémentaire du mycélium dans l'azote liquide. Ce mode opératoire spécifique a permis d'obtenir à partir de Thermoascus aurantiacus de l'ADN génomique stable permettant pendant 6 mois des réactions de PCR (Polymerase Chain Reaction) et de ligation, B) Stratégie d'isolement du gène à partir de la banque génomique d'ADN - Conception des amorces Les difficultés très importantes rencontrées pour obtenir une banque d'ADN génomique stable, sont accrues dans le cadre d'un travail avec de l'ARN et excluaient pratiquement la réalisation d'une banque d'ADNc. De plus, les essais réalisés à partir de l'ARN de Thermoascus aurantiacus pour obtenir une telle banque ont été infructueux. La seule voie pratiquement possible était donc de cloner par PCR le gène de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus à partir d'une banque d'ADN génomique, malgré la présence prévisible de nombreux introns. La première démarche fut d'essayer de définir des amorces à partir de la séquence d'acides aminés publiée par Srinivasa en 1991. A partir de cette séquence, diverses amorces dégénérées pour PCR furent conçues. Malgré les efforts longs et importants qui furent consacrés à ce travail, ce fut un échec. Une conclusion s'est alors imposée : la séquence publiée pour cette xylanase XynA de Thermoascus était erronée. Ceci fut confirmé lors de l'obtention du résultat objet de l'invention : la séquence d'acides aminés publiée pour cette protéine mature XynA de Thermoascus ne comporte que 59 % d'identité avec la séquence de cette protéine telle qu'elle peut être déduite du gène xynA qui a été isolé. Cette séquence d'acides aminés est donnée en SEQ ID N 2. En comparant les deux séquences, l'homme de l'art comprend aisément, en tenant compte des problèmes de dégénérescence du code génétique et des difficultés spécifiques à la technique PCR utilisée, pourquoi il a été impossible pratiquement malgré les efforts consentis d'obtenir un résultat en partant de la séquence d'acides aminés publiée. Cette première démarche ayant conduit à un échec, la conception des amorces devait être reprise depuis le début. La nouvelle démarche a consisté en premier lieu à rechercher des séquences d'acides aminés de xylanases de la même famille déjà publiées et de rechercher des régions conservées. Il a été fait l'hypothèse, contrairement à ce qui pouvait être déduit du document WO 96/23062 cité ci-dessus que cette xylanase thermostable de Thermoascus appartenait à la famille 10 selon la classification de Hcnrissat déjà citée (famille 10 anciennement dénommée famille F). Ont ainsi été retenues, les séquences d'une cellobiohydrolase de Cellulomonas finit, de la xylanase A de Pénicillium chrysogenum, de la xylanase C d'Aspergillus nidulans et la séquence de la xylanase A de Pseudomonas jluorescens, Les régions les mieux conservées de la séquence peptidique de ces glycosyl-hydrolases ont été déterminées à partir des séquences disponibles sur banques de données et ont été comparées au moyen du logiciel Clustal V (Higgins D., 1991, C.A.B.I.O.S., vol.8, pp. 189-191). Plusieurs combinaisons d'amorces ont alors été conçues en tenant compte : . des régions homologues identifiées (ou régions conservées), sachant qu'en cas de divergences il était donné la préférence à la séquence des xylanases d'origine fongique {Pénicillium chrysogenum et Aspergillus nidulans), . de la localisation probable des introns, la séquence connue de l'ADN codant pour la xylanase de la famille 10 $ Aspergillus nidulans comporte 7 introns, celle de Pénicillium chrysogenum en comporte 9, le résultat de l'invention montre que celle de Thermoascus aliranliaclis en comporte 10 au total, . des différents triplets de codons qui du fait de la dégénérescence du code génétique, peuvent être à l'origine de chaque acide aminé de la séquence peptidique consensus choisie pour concevoir une amorce. De plus, il faut correctement doser l'utilisation de la synthèse dégénérée et l'utilisation d'inosine (nucléotide capable de complémenter n'importe lequel des quatre nucléotides naturels A, T, G, C). Les inosines ont été utilisées de préférence du côté 5' des amorces, tandis que les dégénérescences ont été placées du côté 3'. De nombreuses combinaisons d'amorces et/ou de conditions PCR ont été essayées et plusieurs centaines de réactions ont été effectuées. Finalement, un fragment du gène xynA a été obtenu avec les deux amorces décrites ci-après dans le tableau 1, avec la séquence de la région conservée correspondante définie dans le cadre de la recherche ci-dessus. Dans le tableau cidessous, où les protéines et les bases sont définies par le code international à une lettre, sont repris : . pour mémoire l'alignement correspondant de la séquence d'acides aminés partiellement erronée publiée pour XynA de Thermoascus, altrc1nliaclts (= Ta). On peut remarquer que pour la région en 5' la séquence est exacte, que par contre ce n'est pas le cas pour la région en 3', . l'alignement des séquences d'acides aminés des glycosyl-hydrolases du groupe 10 d'Aspergillus nid,dans, Pénicillium chrysogenltm, Cellltlomonas fimi et Pseitdonioiiasj7iiorescetis, . la séquence d'acides aminés définie pour la région conservée, . les différents codons possibles, . les amorces qui en ont été déduites, étant entendu que ces amorces contiennent chacune un site de restriction, pour permettre l'insertion ultérieure dans un plasmide de clonage à savoir le site Asp718I dans l'amorce X25 du côte 5', et le site BamHi dans l'amorce X18du côté 3'. TABLEAU ! Conception amorce 5': Ta XynA (publiée) A K L Y 1 N D Y N L D S A A. nidulans XlnC A K L Y I N D Y N L D S A P. dll}t'i08f'1I6II X)1.1A A K L Y I N D Y N L D S A C. fimt A K L C I N D Y N V E G I CONSENSUS A K L Y I N D Y N L D S A code GCN AAA CTN TAC ATA AAC GAC TAC AAC CTN GAC TCN GCN génétique G TTA T C T T T T TTA T AGC possible G T G T X25 5'- CA GGTACC TAY ATH AAY GAY TAY AA Asp718I Conception amorce 3' : Ta XynA (publiée) A F K N T L T N V M K A. nidulans XynC V G 1 T V W G V S D K p, duysogc'Illl1l/ X)11A V G 1 T V W G V A D P C. fimt Q GVTVWG 1 T D K RJluorescensXylA G G 1 T V W G I A D P CONSENSUS G 1 T V W G V ? D ? code GGN ATA ACN GTN TGG GGN GTN GAC génétique C T possible T X18 3' - TAD TGN CAN ACC CCN CA CCTAGG TG BamHI Dans le tableau ci-dessus, selon le code international : Y correspond à C ou T H correspond à A ou C ou T D correspond à A ou G ou T N correspond à A ou T ou G ou C. Les amorces X18 et X25 ainsi définies ont été synthétisées par une société spécialisée. C) Extraction d'une sonde avec les amorces X18et X25 et clonage du gène complet Pour obtenir une amplification spécifique des amorces et pouvoir éliminer les fragments trop courts, il est nécessaire d'estimer la taille approximative des fragments d'ADN attendus, cette taille des fragments dépendant du nombre d'introns entre la région correspondant à chaque amorce. Si on se réfère à la comparaison des 4 séquences protéiques connues de glycosyl- hydrolases de la famille 10, on peut estimer qu'entre les amorces X25 et X18, il y a au moins 98 acides aminés (soit 3 x 98 = 294 pb). Une taille d'au moins environ 300 pb est donc la taille minimale absolue. De plus il est très probable que plusieurs introns soient présents dans cette partie du gène. Si on se réfère aux deux séquences génomiques connues de champignons (Aspergillus 1lidu/ans xyrrC et Pénicillium chrysogerrunr xyit4) on peut estimer à au moins 200 pb la taille de séquences introniques. Une estimation prudente de la taille minimale attendue est donc de 500 pb. Compte tenu de ces éléments, la réaction de PCR permettant d'obtenir la sonde recherchée a été réalisée avec une banque d'ADN génomique de Thermoascus auronliacus, comme décrit ci-dessous, en présence des amorces X 18 et X25, les fragments amplifiés de moins de 500 pb étant éliminés. Les précisions données ci-dessous concernant les réactifs, les fournisseurs, le matériel et les cycles utilisés sont données sous forme résumée et uniquement à titre d'exemple, il s'agit de procédures bien connues de l'homme de l'art, une fois le contexte clairement défini. Dans un microtube à parois fines de 5001 #urogentec. Belgique); 1 yl d'ADN génomique de T. auranliacus à 1 yg/pl. 1 l d'amorce X25 à 1 g/ l 1 ul d'amorce X18 à 1 iig/lil 2,5 l de tampon Tfl x20 (Epicentre Technologies, USA) 3 l de MgCl2 25 mM (Epicentre Technologies, USA) 5 l de dNTP (nucléotides) 2,5 mM (Pharmacia Biotech, Suède) Eau distillée stérile qsp 49 l 1 l Tfl polymerase à1 u./ l (Epicentre Technologies, USA) Appareil pour réaliser lescycles thermiquesde PCR appeléThermocycler modèle. IThermoieT"@ (Eurogentec#quibio. Belgiq : 1 cycle 1 mn à 94 C 5 cycles : 20s à 94 C / 20sà37 C / 1mn à 72 C 30 cycles : 20s à 94 C / 20s à 50 C / 1mn à 72 C 1 cycle : 4mn à 72 C A la suite de l'amplification par PCR avec les amorces X25 et X18, deux fragments ont été obtenus dont l'un d'une taille proche de la taille attendue c'est-à-dire d'environ 700 pb. Il a été élué à partir d'un gel (Nusieve GTG#, fournisseur PMC Bioproducts, USA) et introduit dans le plasmide pBluescript KS+ (Stratagene, USA) à l'aide des sites de restriction asp718I et BamHI prévus dans les amorces. Le plasmide ainsi construit, appelé pBS ::GG, a été séquence pour s'assurer qu'il portait le fragment d'ADN souhaité, à savoir un fragment d'environ 700 pb flanqué des amorces X25 et X18et potentiellement susceptible d'être un fragment du gène codant pour la xylanase xynA. De manière classique, le fragment du gène xynA d'environ 700 pb ainsi obtenu a ensuite servi de sonde (marquage DIG, Boehringer-Mannhcim, Allemagne) pour cribler une banque génomique de Thermoascus aurantiacus. Cette banque a été construite dans Escherichia coli DH5[alpha] tk-, par restriction EcoRI de l'ADN génomique et clonage dans le site EcoRI (dephosphorylé par la Shrimp Alcaline Phosphatase, BoehringerMannheim) du vecteur pBluescript KS+ (Strategene, USA). Finalement, un plasmide de grande taille (20kb) fut retenu : pBS::Ta6-1 et partiellement séquence par séquençage double brin à partir d'amorces dans la région déjà séquencée. Cette séquence a été référencée comme SEQ ID N 1. Elle comporte une partie du promoteur du gène xynA, sa partie codante débute avec l'ATG en position 859 et se termine avec le codon STOP TGA en position 2773. Cette partie codante du gène xynA comporte ) !exons et 10 introns. Le polypeptide codé se déduisant de cette séquence est estimé posséder 329 acides aminés, il comporte une séquence signal et une protéine mature, Il paraît probable que la séquence signal corresponde aux 26 premiers acides aminés. La séquence complète de ce polypeptide avec sa séquence signal estimée de 26 acides aminés est donnée en SEQ ID N 2. Enfin, la séquence d'ADN référencée comme SEQ ID N 1 comprend une partie du terminateur. La séquence d'ADNc correspondant à la séquence d'ADN génomique codante du gène xynA peut être obtenue plus aisément maintenant qu'elle est connue, à partir d'ARN, ou synthétisée directement. La comparaison de la séquence d'acides aminés correspondant à la protéine mature ainsi déduite a été comparée comme déjà indiqué avec la séquence publiée en 1991, le taux d'homologie est de 59 %. TABLEAU 2 Micro-organisme donneur Famille glycosyl- % d'identité avec la partie hydrolase mature de la xylanase correspondant à SEQ ID N 2 Cellulomonas fimi 10 40 Fusarium oxysporum CelF 10 47 Pseudomonas j1uorescens 10 22 Aspergillus nidulans XlnC 10 62 Pénicillium chrysogenum XlnA 10 62 Myceliophtora thermophila 10 39 Thermotoga maritima XynA 10 11 Termotoga neapolilana XynA 10 11 Diclyoglomus thermophilum XynA 10 32 Prevotella ruminicola XynA 10 28 Dans le tableau 2 ci-dessus, toutes les glycosyl-hydrolases de la famille 10 citées sont des xylanases à l'exception de la cellobiohydrolasc de Cellulol1lollas fil1li et de l'cndoglucanase F de Fusarium oxysP rtll1l, Il permet de voir que les taux d'identité de la xylanasc XynA de Thcrmoascus avec les autres xylanascs de la famille 10 varient entre 11et 62 %. Ces xylanases de la famille 10 sont les xylanases les plus proches, car aucune identité significative, c'est-à-dire égale ou supérieure à 10 %, n'a pu être trouvée avec des xylanases de la famille 11 comme les deux xylanases XlnI et Xlnll de Trichoderma reesei, la xylanase A d'Aspergillus uidulans ou la xylanase thermostable de Thermomyces lannginosns. EXEMPLE 2 : dans la souche de Trichoderma reesei LysC du gène de la xylanase A avec sa propre séquence signal et sous la dépendance du promoteur gpdA LysC est une souche de laboratoire de Trichoderma reesei sécrétant peu de protéines endogènes, ce qui permet une production relativement pure de la xylanase XynA. Elle a été transformée avec le plasmide pUT11122 dont la construction est décrite ci-dessous. A - Construction du plasmide pUT 1122 Le plasmide pBS::Ta6-1, contenant le fragment d'ADN génomique portant le gène xynA, a été digéré par les enzymes Ncol et Hpal. Les fragments obtenus ont été séparés par électrophorèse, et le fragment de 2kb portant le gène xynA, sa séquence signal et un morceau de son terminateur, a été élué du gel et purifié. Ce fragment a été cloné dans un vecteur d'expression fongique à savoir le plasmide pAN52.1 (Punt et al., 1987, Gene, 56, pp. 117-124) de la façon suivante. Le plasmide pAN52.1a été digéré par BamHI puis traité par le fragment Klenow de l'ADN Polymerase 1 d'Escherichia coli de façon à remplir le bout cohésif (issu de la digestion par BamHI) pour obtenir un bout franc (donc propice à une ligation au résultat de la digestion par Hpal). Ensuite, après dénaturation des enzymes par la chaleur, le plasmide a subi une digestion par Ncol. Une nouvelle dénaturation par la chaleur a été effectuée pour détruire Ncol avant la ligation. Les deux morceaux d'ADN ont alors été ligaturés (T4 Ligase Gibco BRL, 2 heures, 30 C). Le plasmide obtenu, appelé pUT 1122 (figure 1) comporte une unité transcriptionnelle fongique permettant la production de la xylanase XynA. Elle est constituée du promoteur gpdA ( glyceraldeliyde phosphate dehydrogenase ) d'Aspergillus nitlulans, de la séquence signal native du gène de xyitA, du gène xynA de Thermoascus aiiratiliaciis, d'un fragment du teminateur natif du gène de xy"A, et du terminateur 1'1)C (tryptophane synthase) d'Aspergillus ni"l1, lalls En outre, le plasmide comporte une origine de réplication fonctionnelle dans Escherichia coli, et le gène bactérien bla ( beta-lactamase ) qui confère une résistance à l'ampicilline dans Escherichia coli, Ce vecteur ne comporte donc aucun marqueur de résistance fonctionnel en champignon et doit donc être utilisé en cotransformation avec un autre vecteur qui porte un gène de sélection fongique comme le plasmide pANS-1 (Punt et al, 1988, Fungal Genetic News Letter, 35, pp.25-30). B - Protocole d'obtention des spores compétentes et transformation Le protocole d'obtention des cellules compétentes, c'est-à-dire de spores compétentes de la souche Trichoderma reesei LysC se trouvant dans un état physiologique favorable à la transformation, et de transformation est celui décrit par Calmels T., Parriche M., Durand H. et Tiraby G. (Curr. Gcnct., 1991, vol. 20, pp. 309- 314). Les étapes suivantes ont été mises en #uvre selon le susdit protocole : # obtention des spores compétentes, # cotransformation des spores compétentes à l'aide du plasmide pUT1122 et du plasmide pAN8-l. C - Analyse des transformants Parmi les colonies apparues sur milieu sélectif, une centaine sont repiquées sur différents milieux : - milieu GS (témoin), - milieu GS avec phléomycine pour déterminer les colonies ayant acquis le marqueur de résistance, - milieu BSM contenant du xylane de bouleau (Sigma) pour déterminer les colonies ayant acquis une activité xylanase. Les colonies sélectionnées comme produisant la xylanase recombinante sont repiquées sur les mêmes trois milieux pour confirmation. Les colonies positives sont ensuite mises en culture sur milieu liquide GLCS pour la détermination précise de l'activité xylanase. Les souches recombinantes les plus performantes pour la production de xylanase thermostable XynA sont retenues. Une souche transformée appelée LysC-XynA-1a ainsi été sélectionnée. D - Propriétés de la souche transformée LysC-XynA-1 - Démonstration de la production de xylanase recombinante Cette souche transformée LysC-XynA-1 et la souche non transformée LysC ont été cultivées en parallèle sur milieu liquide GLCS pendant 5 jours sous agitation (200 rpm) à 27 C. Les protéines produites dans le milieu de culture ont été récoltées par centrifugation et les préparations enzymatiques ainsi obtenues sous forme liquide ont été testées selon les protocoles définis dans le chapitre Milieux et méthodes. L'activité xylanase des milieux de culture après séparation de la biomasse de Trichoderma a été mesurée en U/ml selon le protocole défini ci-dessus. La quantité de protéines a été également déterminée comme indiqué ci-dessus et les activités spécifiques par mg de protéines ont été calculées. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 : TABLEAU 3 Activités et activités spécifiques xylanases de la souche transformée LysC-XynA-1 et de la souche témoin LysC Activité Activité spécifique xylanases xylanases xylanases xylanases (avoine) (bouleau) (avoine) (bouleau) U/ml U/ml U/mg U/mg 50 C 70 C 50 C 70 C 50 C 70 C 50 C 70 C LysC-XynA-1 66,5 263 il 263 123 484 20 484 LysC (témoin) 0,6 0,6 1,0 0,6 0,7 0,7 1,2 0,75 LysC produit très peu de xylanases. Les xylanascs produites très faiblement par LysC voient leur activité décroître ou au moins ne pas augmenter à 70 C, elles ne sont pas thermostables. LysC-XynA-1 produit des quantités importantes de xylanascs et cette activité xylanolytiquc a un optimum d'activité supérieur ou égal à 70 C. De plus, un chauffage de 2 heures à 70 C des préparations obtenues avec LyxC-XynA-1 montre que ces activités xylanolytiques sont conservées. On peut donc en conclure que LysC-XynA-1 produit à un niveau appréciable la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. Ces expériences ont été reprises avec une souche industrielle de Trichoderma reesei comme la souche CL 847 (Durand et al., 1984, Génétique des micro-organismes industriels, 9ème colloque SFM, pp. 39-50) transformée avec pUT1122 ou avec un plasmide du même type où la partie codante xyu.4 de Thermoascus aurandacus est sous la dépendance du promoteur cbhl de Trichoderma. Ces souches cultivées industriellement en fermenteurs donnent des productivités élevées et des concentrations élevées de xylanase thermostable XynA dans le milieu de culture, ces concentrations élevées de xylanase thermostable XynA étant mesurées après traitement 2 à 3 heures à 70 C. Bien entendu, des résultats similaires peuvent être obtenus avec tout microorganisme industriel déjà utilisé industriellement pour la production d'enzymes. EXEMPLE 3 : de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus en panification En panification, l'action des xylanases sur le xylane de la farine modifie les équilibres de répartition de l'eau dans les pâtes, ce qui améliore leurs qualités rhéologiques et permet d'obtenir des pains de meilleur volume. Par contre, les xylanases donnent souvent du collant à la pâte, ce qui est un défaut ennuyeux, car la pâte ne peut plus être travaillée en machine. La xylanase thermostable XynA selon l'invention peut être utilisée pour la préparation de pâte boulangère à partir de n'importe quel type de farine de blé pour la fabrication de différents pains, sans présenter de défauts de collants. Elle peut être utilisée pure comme en combinaison avec d'autres enzymes telles qu'amylases, cellulases, oxydases, autres xylanases ou protéases. On a ajouté : . d'une part une préparation de xylanases de Trichoderma reesei du commerce, . d'autre part la préparation de xylanases obtenue après culture de LysC-XynA-11 selon l'exemple 2, dans une panification française classique, avec une formule de pâte classique de type : farine 100 eau 65 levure pressée 2,5 sel 3 acide ascorbique 50 ppm amylase fongique. Par rapport au témoin, les deux préparations xylanolytiques de Trichoderma reesei et de Thermoascus donnent un gain de volume spécifique du pain de 10 à 15 %, étant entendu que l'essai avec la préparation de Trichoderma donne une pâte relativement collante, et risquant de poser problème lors du passage en machine, alors que l'essai avec celle de Thermoascus donne une pâte libre, passant en machine sans problème. De manière surprenante, la xylanase thermostable XynA de Thermoascus est intéressante en panification, alors que les températures de la fermentation panaire sont éloignées de son optimum d'activité. EXEMPLE 4 : de la xylanase XynA de Thermoascus en malterie ou en brasserie Dans le domaine de la brasserie, les xylanes sont responsables de la diminution de la vitesse de filtration dans les moûts. L'action des xylanases, en abaissant la viscosité, améliore la filtrabilité et permet un gain de productivité en salle de brassage. Dans un essai de filtration standard, on voit que la xylanase XynA de Thermoascus obtenue selon l'exemple 2 permet d'améliorer la filtrabilité d'un brassin de 50 %. Sa thermostabilité permet de l'ajouter très en amont, y compris lors du maltage. Une application particulièrement intéressante de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus est la suivante. Elle permet d'améliorer l'extraction de l'amidon des matières premières non maltées lors de leur hydrolyse par une alpha-amylase thermostable à 70 C. La xylanasc XynA de Thcrmoascus obtenue selon l'exemple 2, introduite lors de la liquéfaction ou de la cuisson des matières premières non maltées qui sont ajoutées au brassin permet en plus une amélioration du rendement d'extraction de l'amidon, et en conséquence une augmentation du degré alcoolique obtenu pour la bière. EXEMPLE 5 : Stabilité de la xylannse A de T/#,mo(l!îcll,Ç MMc il la granulation des aliments pour volaille La xylanase XynA de Thermoascus produite selon l'exemple 2 et une préparation xylanolytique de Trichoderma reesei (complexe xylanolytique produit par une souche industrielle) ont été comparées dans un test in vitro de stabilité à la granulation, Les deux enzymes ont été ajoutées en parallèle chacune dans une farine d'aliment (aliment sous forme pulvérulente avant granulation) pour volaille préalablement conditionnée à une humidité et une température similaires à celles qui sont rencontrées lors de la granulation des aliments(30 % d'humidité et 80 C). Les doses employées correspondent aux doses d'utilisation en alimentation animale soit 1400 U/kg de farine d'aliment. Les enzymes sont intimement mélangées avec la farine d'aliment et maintenues à 80 C sous une légère pression pendant 30 secondes. La farine d'aliment est alors refroidie rapidement par étalement sur une plaque de verre à 4 C. Les enzymes sont ensuite extraites des farines d'aliment par lavage à l'eau et leur activité dosée à l'aide d'une méthode spécialement adaptée au dosage des enzymes dans les aliments pour animaux comme par exemple la méthode de T. Cosson et al., 1998, Animal Feed Science and Technology. Le tableau ci-dessous donne les pourcentages d'activité xylanase trouvée pour chaque enzyme après traitement : Pourcentage d'activité résiduelle (%) XynA 95,4 xylanase de Trichoderma 12,3 La thermostabilité de la xylanase A de Thermoascus aurantiacus lui confère une bonne stabilité dans les conditions de la granulation des aliments pour volaille, stabilité qui lui permet de rester active dans l'aliment et d'avoir un effet après ingestion de l'aliment par l'animal. La xylanase XynA de Thcrmosascus entraîne de plus une diminution de la viscosité d'une mouture de blé hydratée à 100 % (poids pour poids), incubée 2 heures à pH 4,8 et 40 C, au moins égale à celle de la xylanase de Trichoderma, dans le cadre d'un essai où les deux préparations enzymatiques ont été ajoutées directement, sans traitement thermique préalable à la mouture de blé hydratée. LISTAGE DE SEQUENCES LA SOCIETE LESAFFRE ET CIE FRAGMENT D'ADN CODANT POUR LA XYLANASE THERMOSTABLE XynA DE THERMOASCUS D17799 2 PatentIn Vers. 2.0 1 2966 ADN génomique Thermoascus aurantiacus promoteur (1)..(858) exon (859)..(1102) intron (1103)..(1177) exon (1178)..(1218) intron (1219)..(1292) exon (1293)..(1341) intron (1342)..(1409) exon (1410)..(1531) intron (1532)..(1634) exon (1635)..(1780) intron (1781)..(1849) exon (1850)..(1938) intron (1939)..(2003) exon (2004)..(2022) intron (2023)..(2114) exon (2115)..(2142) intron (2143)..(2210) exon (2211)..(2300) intron (2301)..(2396) exon (2397)..(2462) intron (2463)..(2677) exon (2678)..(2773) terminateur (2774)..(2966) 1 taaccttcta acattcccta agacagaccg ttaagggtaa tccgtcgtga cataaggacg 60 tggataatac tccgttggtc gaggttcgct tgatcgagc caggggegaa acatggttct 120 ccccaccacg gtaagtcgcc taaatctagg gttgaaaatt ccgggccgtt aaagctacct 100 accctttctg tcaatgatcc gacgaggggg ggcatctctg cagagttctc cacattcaaa 240 tcggggtcag tacagtggta accgctggga ttaatttagg ctaaagcagt gatgtcacct 300 tattatttat cattgctatt atgtacataa aacaaccgag gagcgaacaa ggcaaaccac 360 cgacgagaac aatggtttgg tttacttttc ttcgacattg cggggcctct tggatcgcga 420 tgtccttttg tccttttctc ccgtcgaaga gagggaaaac agcctgaatg tgaacaatga 480 attgaatttt tccaccacat gtttgcattg ttcgttgagt aagtccaatc accttttaga 540 tgtttagtgg tttggtatta ttagcccctg gaagagacgc tggccttgtg gggtactcct 600 agctaaaatt catgtaagac ataggggctg ttgtaaacga gactttaacc aaactgttac 660 gaccggcaac aagttgcatg attgatgtgt aagatgtccc tgttcgggtc tcaaggggat 720 agttagatgc aaaggtactg tatttgggta tatatatcgt tcaaatgtcg gttccattgc 780 ccttccttca gagatcaatc actacttaaa atctgactgc atcaactact tacttgcctc 840 cttacctact aagaagccat ggttcgacca acgatcctac ttacttcact cctgctagct 900 cccttcgcag ctgcgagccc tatcctcgag gaacgccaag ctgcacagag tgtcgaccaa 960 ctgatcaagg ctcgcggcaa ggtgtacttt ggcgtcgcca cggaccaaaa ccggctgacg 1020 accggcaaga atgcggctat catccaggct gatttcggcc aggtcacgcc ggagaatagt 1080 atgaaatggg acgctactga acgtgcgtga gaaagataat 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gatgtgaccg atctgaaacc 1980 agtctaacgt tagctgggtc taggatcgca aacgcacctc aggtaaataa tcgggaatgc 2040 ctcggagaat aaaagagaaa aaaatgattg tcttatcaga tcgtatcgac tgactcatgg 2100 cttgtccaaa atagcgctgg tcagggagcc agtgttctac aataagtgcc cccctcccct 2160 attttgtttc ctattattgc gagaacggaa caggctgaca accccaaacg gctcttccgc 2220 tccttgctag tgccggaact cccgaggtcg ctatcacgga actggacgtg gctggtgcta 2280 gctcgacgga ttacgtcaat gtatgtactt cgttgtccct atcccccttg gatactttgt 2340 ataattatct tcccggagcc tgttgatcag atctgacgat catttctcgt ttttaggtcg 2400 tgaacgcttg cctcaacgtg cagtcctgcg tgggcatcac cgtctggggc gtggcagatc 2460 cggtaagcgc ggttcttccg tactccgtac ccaactagac gttcgggctg tcacgtcatg 2520 tcttaagtcg tctgcagtca ggccaaggcc aagacacagg acctgaaacg ggcaggcagc 2580 agctgctaag cagcccaaga agcagccaca tgatgcatga ttattattat tatatctccg 2640 agttctgggc taacgattgg tgataataaa taaataggac tcgtggcgtg ctagcacgac 2700 gcctctcctc ttcgacggca acttcaaccc gaagccggcg tacaacgcca ttgtgcagga 2760 cctgcagcag tgagtataga acggaacaga gtagtaagtc cggcaggact ttctattatt 2820 ttctctcctt ttttttcatt tcttcgatgg attgttaaca agtttcttca cagaaacagc 2880 aatagcaata acaacaacgc cgtcctcaaa gtaagcggaa agtgcgcatg atgggtgggt 2940 aaagtactgt acctaagtac tatgca 2966 2 329 PRT Thermoascus aurantiacus 2 Met Val Arg Pro Thr Ile Leu Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ala Pro Phe 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu Glu Arg Gln Ala Ala Gln Ser Val 20 25 30 Asp Gln Leu Ile Lys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Phe Gly Val Ala Thr 35 40 45 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asn Ala Ala Ile Ile Gln Ala 50 55 60 Asp Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr 65 70 75 80 Glu Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu Val 85 90 95 Asn Trp Ala Gln Gln Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val 100 105 110 Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn 115 120 125 Thr Leu Thr Asn Val Met Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr Arg 130 135 140 Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Asn 145 150 155 160 Glu Asp Gly Ser Leu Arg Gln Thr Val Phe Leu Asn Val Ile Gly Glu 165 170 175 Asp Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Gln Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn 180 185 190 Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro 195 200 205 Lys Thr Gln Ala Ile Val Asn Arg Val Lys Gln Trp Arg Ala Ala Gly 210 215 220 Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Gly Ala Ser Val Leu Gln Ala Leu Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly Thr 245 250 255 Pro Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Gly Ala Ser Ser Thr 260 265 270 Asp Tyr Val Asn Val Val Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Ser Cys Val 275 280 285 Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ala Ser 290 295 300 Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Phe Asn Pro Lys Pro Ala Tyr 305 310 315 320 Asn Ala Ile Val Gln Asp Leu Gln Gln 325 REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN, susceptible d'être isolé à partir d'un champignon thermophile appartenant au genre Thcrmoascus ou appartenant à la même famille et codant pour un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase, de séquence nucléique choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID N 1 ou la séquence de l'un de ses fragments d'au moins 300 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et encore de préférence d'au moins 700 nucléotides ; b) la séquence complémentaire à l'une des séquences telles que définies en a) ; c) une séquence présentant une identité d'au moins 60 %, de préférence au moins 70 % et encore de préférence au moins 75 % avec l'une des séquences telles que définies ena)oub); d) une séquence codant pour un polypeptide ayant une activité xylanase et dont la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 70 %, de préférence au moins 80 % et encore de préférence au moins 85 % avec la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ou c). 2. Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est issu d'un champignon appartenant au genre Thermoascus et qu'il code pour une xylanase thermostable du groupe 10. 3. Fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que sa séquence comprend tout ou partie de la séquence du promoteur et/ou de la séquence terminatrice et/ou de la séquence signal de la séquence SEQ ID N 1. 4. Fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'une au moins des séquences suivantes : a) une séquence hétérologue de promoteur constitutif et non réprimé ou une séquence hétérologue de promoteur inductible fort ; b) une séquence hétérologue terminatrice ; c) une séquence signal hétérologue. 5. Fragment d'ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit promoteur constitutif et non réprimé est le promoteur gpdA d'A.vjcrillrrs nidulans ou en ce que le promoteur inductiblc fort est le promoteur cbhl de 1>-icliolet-lela reesei, 6. Construction d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1à 5 et les éléments nécessaires pour l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte. 7. Polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase codé par un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 5 ou par une construction d'ADN selon la revendication 6. 8. Polypeptide selon la revendication 7 de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 ou polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 dans lequel le fragment peptidique correspondant au peptide signal est délété. 9. Cellule hôte, procaryote ou eucaryote, comprenant un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 5 ou une construction d'ADN selon la revendication 6. 10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule est une bactérie, une levure ou un champignon filamenteux, 11. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite bactérie est du genre Bacillus, ladite levure du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula ou Yarrowia et le champignon filamenteux du genre Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus, Pénicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauvaria ou Hypocrea. 12. Cellule hôte selon l'une des revendications 10 à 11, caractérisée en ce que ladite cellule est choisie parmi les cellules ne produisant pas à l'état naturel de xylanase ou parmi les cellules ne produisant pas à l'état naturel de xylanase et d'autres hydrolases comme des cellulases. 13. Procédé de production de xylanase thermostable caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture sur un milieu adéquat d'une cellule selon l'une des revendications 9 à 12 ; b) la récupération de ladite xylanase à partir du milieu de culture ou des cellules obtenues à l'étape a). 14. Xylanase obtenue par un procédé selon la revendication 13. 15. Utilisation de la xylanase selon la revendication 14 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 7 et 8 pour l'hydrolyse de tout substrat végétal contenant des hémicclluloscs, notamment dans le domaine de l'alirncntation animale, de la brasserie et de la malterie, 16. Utilisation de la xylanase selon la revendication 14 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 7 et 8 pour la panification.