Brevet FR2789399A1 — publié le 20000811

Procédé de fabrication d'extraits de micro-organismes photosynthétiques tels que notamment de spiruline. La présente invention concerne les procédés de fabrication d'extraits de micro-organismes photosynthétiques (bactéries pourpres, cyanobactéries et micro-algues). De tels extraits peuvent notamment être utilisés à des fins alimentaires, cosmétiques et/ou thérapeutiques. En outre, ces extraits constituent une base pour la purification de principes actifs ou de métabolites d'intérêt économique. A titre d'exemple de micro-organisme auquel le procédé selon l'invention peut être appliqué, on peut citer la spiruline (cyanobactérie filamenteuse comprenant deux espèces, Arthrospira platensis et Spirulina maxima) connue pour ses qualités nutritionnelles (richesse en protéines en acides gras essentiels, en polysaccharides sulfatés et en vitamines) et produisant des composés biologiquement actifs (anti-oxydants, anti- cancéreux, anti-viraux, immunostimulants, bifidogène). On comprendra toutefois que l'invention pourra bien sûr être appliquée à d'autres micro-organismes photosynthétiques. Actuellement, la spiruline est commercialisée sous forme de poudre sèche qui est la forme préférentielle de conservation des cyanobactéries et des micro- algues. Le séchage utilise un procédé thermique, soit séchage naturel au soleil pendant un temps très long, soit séchage forcé à 60-70 C ou plus. Ce procédé s'il permet la conservation d'une qualité alimentaire de la spiruline, entraîne de nombreuses dégradations biochimiques et donc des différentes activités de la spiruline. De plus cette forme de conservation tend à renforcer la solidité de la paroi de ces microorganismes et donc à amoindrir la disponibilité des protéines et des molécules actives, la majorité des cellules restant intacte lors de leur adsorption ou lors de leur utilisation. Le principal objectif de la présente invention est donc de proposer une poudre de micro-organisme permettant une totale disponibilité des molécules actives, et du contenu cellulaire. 2 2789399 Notamment un objectif de la présente invention est de proposer un nouveau type d'extraits de micro-organisme et notamment de spiruline dont les qualités organoleptiques et/ou biochimiques ne sont pas dégradées. Egalement un des objectifs de la présente invention est de décrire un tel procédé qui ne mette pas en oeuvre d'élévation de température et qui permette de conserver toutes les qualités biologiques intrinsèques des micro- organismes et notamment de la Spiruline. Ces différents objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé de fabrication d'un extrait d'au moins un micro-organisme photosynthétique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: - culture dudit micro-organisme dans un milieu liquide de culture adapté aux besoins nutritionnels dudit micro-organisme, - induction physiologique consistant à placer ladite culture dans un milieu liquide d'induction particulier afin de faire produire audit micro- organismes une quantité accrue de métabolites; broyage à froid de ladite culture de façon à obtenir un broyat de celle-ci; - mélange dudit broyat dans un milieu de séparation et séparation de la partie insoluble de la partie soluble dudit broyat par filtration tangentielle à froid permettant l'obtention d'un extrait brut. L'invention propose donc un procédé pouvant être mis en oeuvre sans chauffage et sans traitement chimique. Toutes les qualités biologiques intrinsèques du micro-organisme traité peuvent ainsi être conservées. Selon une variante préférentielle de l'invention, ledit milieu de culture, ainsi que le cas échéant les milieux d'induction et d'extraction, présentent des teneurs contrôlés en métaux lourds. En effet, les micro-organismes photosynthétiques ont la particularité d'accumuler des métaux lourds dans leur paroi polysaccharidique. Certains de ces métaux, tels que le mercure, le plomb ou le chrome, sont toxiques. De ce fait, les poudres de ces micro- organismes peuvent être impropres à la consommation humaine et aussi à l'usage thérapeutique que l'on peut en faire. L'utilisation d'un milieu de 3 2789399 culture présentant des teneurs contrôlées en métaux lourds s'oppose aux systèmes de cultures extensifs utilisés couramment dans le monde. De même certains pesticides ont une action sur l'organisme humain et animal, sans en avoir sur la croissance des micro-algues, ils peuvent s'accumuler, voire se dégrader sous une forme plus toxique lorsque l'on réalise ces cultures dans un environnement naturel ou en milieu de culture non contrôlé. C'est pourquoi l'étape de culture est préférentiellement mise en oeuvre dans un photobioréacteur isolé de l'extérieur dont les paramètres physico-chimiques sont contrôlés. La deuxième étape du procédé (étape d'induction physiologique) consiste à orienter le métabolisme des micro-organismes vers la fabrication de produits utiles aux buts choisis. Si le milieu de culture de la première étape est optimisé pour la production de biomasse, il ne l'est pas pour la production de molécules actives et/ou d'intérêt économique. La biomasse de la première étape est récupérée et placée dans un deuxième milieu contrôlé permettant la surexpression de molécules intéressantes par rapport à d'autres. Par exemple dans le cas de la spiruline, le simple fait de la mettre en présence de chlorure de sodium à 0,5 M suffit à provoquer une surexpression de phycocyanine. Le milieu d'induction physiologique est soumis aux mêmes conditions de contrôle que le milieu de culture. Cette induction physiologique a aussi pour objectif de favoriser la synthèse de protéines et de métabolites spécifiques du stress et qui ont la propriété de favoriser la conservation des extraits. L'induction physiologique pour les produits destinés aux fins alimentaires et cosmétiques sera préférentiellement menée " en eau de mer stérilisée par ultrafiltration. L'eau de mer autorise la surexpression de phycobiliprotéines et l'apport d'oligo- éléments. Cette eau de mer devra correspondre aux critères définis cidessus, c'est-à-dire, avoir une concentration en métaux lourds toxiques pondéralement inférieure à la concentration admissible sur le produit final. Le milieu d'induction physiologique est adapté à la finalité du produit, on pourra, par exemple enrichir la culture en nitrate, en sulfate voire en oligo- 4. 4 2789399 éléments pour induire l'expression de certaines voies métaboliques particulières, et/ou accumuler des oligo-éléments. La troisième étape du procédé consiste en un broyage des cellules. Cette étape est préférentiellement menée sous pH contrôlé. Après culture et induction physiologique, les cellules sont séparées du milieu par des moyens mécaniques, lavées à l'eau stérile et suspendues dans un milieu aqueux à une concentration connue et broyées. Ce broyage est réalisé à froid (à 4 C pour la spiruline) par des moyens mécaniques. L'eau stérile est le solvant préféré. Dans ce cas, la biomasse est reprise dans 2 à 3 fois son volume d'eau stérile. L'objectif consiste à casser les parois de façon à libérer sous forme soluble le contenu cellulaire et ses produits actifs telles les protéines, les vitamines hydrosolubles, les phycobiliprotéines, les glucides et les polysaccharides libres. Cette lyse de la cellule permet de disposer de ces nutriments sous une forme immédiatement assimilable par l'organisme, à la différence des cellules entières qui peuvent être mal digérées. Pour éviter la précipitation de certaines protéines, le pH est contrôlé à cette étape. La quatrième étape consiste à séparer la partie soluble de la partie insoluble. Cette étape permet d'obtenir un lysat clair débarrassé des cellules non cassées, des fragments de membranes et aussi des acides nucléiques de très haut poids moléculaire. Cette séparation se fait par une filtration tangentielle, préférentiellement par microfiltration tangentielle. Le filtrat obtenu est l'extrait brut. Celui-ci peut alors être valorisé de plusieurs façons. Pour un usage à court terme, cet extrait brut sera filtré par filtration frontale ou ultra-filtration tangentielle à 0,2 micromètres et conditionné stérilement. Pour un usage à long terme un conservateur autorisé pourra être ajouté. Le rétentat et/ou l'extrait pourront être lyophilisés. On notera que toutes les étapes de fractionnement ont lieu à froid, ce qui permet la conservation de toutes les molécules thermosensibles (vitamines, protéines, etc...). Cet extrait brut, permet aussi le mélange avec d'autres produits ou extraits naturels, pour une utilisation de complément alimentaire, par exemple on peut lui adjoindre les produits de la ruche (miel, gelée 2789399 royale, propolis) auquel cas on pourra se passer de conservateurs. La valorisation du filtrat peut faire intervenir des procédés de purification afin d'isoler une fraction particulièrement intéressante. Par exemple on peut utiliser la nano-filtration ou l'osmose inverse pour isoler les oligosaccharides, les protéines anti-oxydantes, les vitamines, les peptides, les hormones ou les facteurs de croissance. On peut poursuivre la purification par la chromatographie liquide. Le rétentat contenant les membranes, peut être valorisé par des étapes de purifications complémentaires. Cette fraction comprend des molécules liposolubles comme des vitamines, des lipoprotéines, des polysaccharides (anti-viraux, anti-inflammatoires, immunostimulants), des acides gras essentiels rares comme l'acide gamma-linoléique (obligatoire pour le développement de l'animal mais non synthétisé par lui), les carotènes (anti-oxydants) et des hormones (précurseurs des prostaglandines et des stéroïdes). Outre leur richesse nutritive, ces molécules constituent la base de formulations diététiques. De plus ces molécules ont des activités thérapeutiques importantes, applications pour lesquelles il est nécessaire d'obtenir des molécules pures pour en permettre le dosage. Le procédé selon l'invention, ainsi que les différents avantages qu'il présente seront plus facilement compris grâce à la description non limitative qui va suivre d'un exemple non limitatif de mise en oeuvre de celui-ci se rapportant à la fabrication d'un extrait liquide de Spiruline. Les cellules de spiruline sont cultivées dans un photobioréacteur constitué par une colonne cylindrique transparente laissant passer les rayons lumineux nécessaires à la photosynthèse. Le milieu de culture utilisé a été le milieu de Zarouk dont la composition est donnée ci-après: NaHCO3: 16,8 g/l K2 HPO4: 0,5 g/l Na NO3: 2,5 g/ MgSO4,7 H20: 0,2 g/l K2SO4: 1 g/1 6 2789399 NaCI: 1 g/l. Les cellules sont prélevées en fin de phase exponentielle (1,5 à 2,5 unités de densité optique à 750 nm)par filtration sur un tamis de 120 microns et remises en culture dans le milieu d'induction physiologique, qui dans ce cas est de l'eau de mer stérilisée par filtration à 0,2 micron. Une addition de carbonate est nécessaire pour corriger le pH ainsi qu'une source azotée favorisant la synthèse des pigments. Cette étape dure 12 heures. Une variante du procédé consiste en un ajustement en oligoéléments de l'eau de mer par addition de certains d'entre eux. Dans ce cadre, le zinc, le cuivre et le manganèse ont été dosés avant et après ajustement. Les résultats sont donnés ci-après Avant: - Zn: 30 mg/Kg - Cu: 10 mg/Kg - Mn:30 mg/Kg Après: - Zn: 810 mg/Kg - Cu: 1540 mg/Kg - Mn: 1540 mg/Kg Les cellules de spirulines sont ensuite récoltées par tamisage à 120 microns lavées trois fois à l'eau déminéralisée et congelées à -40 C en absence d'air. La pâte congelée est ensuite concassée et mise en solution dans deux fois son volume d'eau stérile à 4 C et homogénéisée. La solution est ensuite soumise au broyage mécanique ou à la sonication jusqu'à éclatement complet des cellules. Cette opération est effectuée à la température de +2 C afin d'éviter la dénaturation du matériel biologique. Un contrôle du pH est nécessaire pour éviter la précipitation de certaines protéines, notamment la phycocyanine. Le broyat est ensuite clarifié par microfiltration tangentielle à 0,5 micron. le filtrat est stérilisé par filtration frontale ou par ultrafiltration à 0,2 micron. Cette fraction est conditionnée stérilement en ampoules ou flacons avec ou sans conservateurs pour l'utilisation finale. Le rétentat est 7 2789399 lyophillisé et conditionné en sachets ou en gélules pour l'utilisation ultérieure. Ce mode de réalisation n'a pas pour objet de réduire la portée de l'invention. Il pourra donc y être apporté de nombreuses modifications sans sortir de son cadre. En particulier, on noter que ce procédé pourra être transposé à d'autres micro-algues, notamment d'autres cyanobactéries ainsi qu'à toute autre micro-organisme adéquat. 8 2789399 REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'un extrait d'au moins un micro-organisme photosynthétique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: - culture dudit micro-organisme dans un milieu liquide de culture adapté aux besoins nutritionnels dudit micro-organisme, - induction physiologique consistant à placer ladite culture dans un milieu liquide d'induction particulier afin de faire produire audit micro-organismes une quantité accrue de métabolites; - broyage à froid de ladite culture de façon à obtenir un broyat de celle-ci; - mélange dudit broyat dans un milieu de séparation et séparation de la partie insoluble de la partie soluble dudit broyat par filtration tangentielle à froid permettant l'obtention d'un extrait brut. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que tous lesdits milieux de culture, d'induction et d'extraction présentent des teneurs contrôlés en métaux lourds. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ladite étape de culture est réalisée dans un photobioréacteur isolé de l'extérieur dont les paramètres physico-chimiques sont contrôlés. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que ledit milieu d'induction comprend de l'eau de mer. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire de reprise de la biomasse provenant de la première étape dans deux ou trois fois son volume d'eau stérile. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 5 caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à contrôler le pH du milieu lors de ladite étape de broyage pour éviter la précipitation de certaines protéines. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6 caractérisé en ce que ladite étape de séparation est effectuée par microfiltration tangentielle. 9 2789399 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire finale de stérilisation dudit extrait par filtration frontale ou ultra-filtration tangentielle à 0,2 micromètres dudit extrait brut. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de lyophilisation de l'extrait brut, et/ou du rétentat. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de purification du filtrat par nano- filtration ou osmose inverse permettant d'isoler une fraction particulièrement intéressante de celui-ci. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 10 caractérisé en ce que ledit micro-organismes est Arthrospira platensis ou Spirulina maxima. 12. Extrait de micro-organisme photosynthétique obtenu selon le procédé selon l'une des revendications I à 1l 1 caractérisé en ce qu'on lui ajoute au moins un composé choisi dans le groupe constitué par le miel, la gelée royale, la propolis.