Brevet FR2785613A1 — publié le 20000512

La présente invention est relative à des peptides, comprenant entre 28 et 40 acides aminés, ayant une activité de conotoxine. La présente invention est également relative aux applications desdits peptides, comme réactif biologique et comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégénératives. Les cônes sont des mollusques prédateurs qui possèdent un appareil venimeux très évolué leur permettant de capturer leur proie en l'immobilisant. Ils peuvent être classés en trois groupes selon leur régime alimentaire : il existe ainsi environ 50 espèces de cônes piscivores qui se nourrissent de poissons, 50 espèces de cônes malacophages qui se nourrissent de mollusques et plus de 500 espèces de vermivores qui se nourrissent de vers. Plusieurs toxines ont été isolées à partir des venins de cônes, en particulier piscivores. Ces toxines, impliquées dans l'immobilisation de la proie par le cône, sont communément appelées conotoxines. Ces molécules sont des peptides de 10 à 40 résidus d'acides aminés dont l'action physiologique est de se lier avec une forte affinité et spécificité aux récepteurs et aux canaux ioniques des cellules excitables et non excitables. Plusieurs familles de conotoxines responsables des effets toxiques provoqués par le venin brut ont été caractérisées, en fonction de leur cible physiologique. Certaines d'entre elles agissent au niveau du canal sodique. Ces toxines, en se fixant sur le canal, altèrent son activité en affectant l'une ou l'autre de ses trois fonctions (conductance, activation et inactivation). Au moins six sites de fixation des toxines ont ainsi été mis en évidence sur le canal sodique (Catterall, 1986 ; Gordon, 1997). Parmi les conotoxines qui agissent sur ce canal, on peut citer : - les -conotoxines et les p0-conotoxines On les retrouve aussi bien dans les venins de cônes piscivores (C. geographus, par exemple) que dans les venins de cônes malacophages (C. pennaceus, par exemple). Les p-conotoxines de cônes piscivores telles que la -GIIA et la u-GIIIB de C. geographus bloquent les canaux sodiques du muscle squelettique d'amphibien et de mammifère. La composition en acides aminés de ces trois toxines a été déterminée (Cruz et coll., 1985b) : ce sont des peptides basiques composés de 22 résidus d'acides aminés réticulés par trois ponts disulfures et ayant l'extrémité C-terminale amidée. Les deux premières toxines (à 50 nM) bloquent les canaux sodiques musculaires d'une manière réversible et dépendante du potentiel de membrane, sans affecter (à 50 M) les canaux sodiques neuronaux. L'action spécifique des u-conotoxines sur les canaux sodiques du muscle squelettique a été confirmée par des expériences de fixation. En effet, il a été montré que les - conotoxines (à 10 M) n'ont aucune affinité pour les canaux sodiques neuronaux 3 3 alors qu'elles inhibent la fixation spécifique de la H-saxitoxine et de la H-tétro- dotoxine sur le site 1 des canaux sodiques du muscle squelettique (Moczydlowsky et coll., 1986). Une autre u-conotoxine de cône piscivore, la u-PIIIA, un poly- peptide de 22 résidus d'acides aminés réticulés par trois ponts disulfures, qui a été isolée à partir du venin de C. purpurascens (Shon et coll., 1998), bloque de manière irréversible les canaux sodiques musculaires d'amphibien et de mammi- fère en se fixant sur leur site 1. Cependant, contrairement aux u-conotoxines décrites ci-dessus, la u-PIIIA bloque également les canaux sodiques de type II du cerveau de rat exprimés dans des ovocytes de xénope, mais de manière réversible. La -PIIIA permet ainsi de distinguer trois catégories de canaux sodiques sensibles à la tétrodotoxine (TTX) : (1) les canaux sensibles à la u-PIIIA et à la -GIIIA (canaux sodiques du muscle squelettique), (2) les canaux sensibles à la u-PIIIA et insensibles à la toxine III (ou u-GIIIA) (canaux sodiques neuronaux de type (II)) et (3) les canaux résistants à ces deux toxines (Shon et coll., 1998). Fainzilber et coll. (1995a) ont isolé deux u-conotoxines de cônes malacophages, la u-PnIVA et la u-PnIVB à partir du venin de C. pennaceus. Ces toxines bloquent spécifiquement les canaux sodiques neuro- naux de mollusque. En effet, elles n'exercent aucune action sur les canaux sodiques neuronaux de mammifère, que ce soit au niveau des cellules chromaffines de boeuf ou des synaptosomes de cerveau de rat. Récemment, deux p0-conotoxines, MrVIA et MrVIB, ont été isolées à partir du venin du cône malacophage C. marmoreus. Ces peptides sont constitués de 31 résidus d'acides aminés réticulés par 3 ponts disulfures. Ces deux toxines inhibent la conductance sodique au niveau des neurones d'aplysie (Fainzilber et coll., 1995b ; Mclntosh et coll., 1995b). De plus, la O-MrVIA bloque les canaux sodiques de type II du cerveau de rat, exprimés dans les ovo- cytes de xénope, sans cependant affecter ou modifier la fixation spécifique de la 3 H-saxitoxine sur des membranes de cerveau de rat ou d'organe électrique de torpille (Terlau et coll., 1996b). Ces résultats indiquent que la O-MrVIA exerce une action inhibitrice sur les canaux sodiques neuronaux en se fixant sur un site différent du site 1. Il apparaît donc que, d'un point de vue général, l'action des - conotoxines et des uO-conotoxines se traduit par un blocage des canaux sodiques sensibles au potentiel de membrane, certaines d'entre elles ayant une spécificité d'espèces et/ou de tissus. - Les 8-conotoxines dans les venins de cônes malacophages ou piscivores L'action des 8-conotoxines se traduit, d'une manière générale, par un ralentissement de l'inactivation des canaux sodiques. De plus, certaines d'entre elles, telles que la 8-TxVIA, isolée à partir du venin C. textile (Fainzilber et coll., 1994), et la 5-GmVIA, isolée à partir du venin du cône malacophage C. gloriama- ris (Shon et coll., 1994) possèdent des propriétés de liaison effective et silencieuse respectivement chez le mollusque et le mammifère. Deux 8-conotoxines, la 8-NgVIA et la 8-PVIA, isolées respecti- vement à partir du venin de C. nigropunctatus et de C. purpurascens (Fainzilber et coll., 1995c ; Shon et coll., 1995), ont une activité toxique lorsqu'elles sont injec- tées chez le mammifère. De plus, la 8-PVIA supprime une partie du processus d'inactivation des canaux sodiques au niveau des cellules d'hippocampe de rat (Terlau et coll., 1996a) alors que la 8-NgVIA exerce un effet similaire au niveau des neurones de mollusques (Fainzilber et coll., 1995c). La structure générale des p-conotoxines, des fiO-conotoxines et des 8-conotoxines est illustrée à la figure 6. Compte tenu de l'activité des conotoxines sur les canaux sodiques, les Inventeurs ont cherché s'il était possible d'obtenir une conotoxine capable d'avoir une activité spécifique au niveau des canaux sodiques neuronaux et plus particulièrement sur l'inhibition de l'inactivation des canaux sodiques neuronaux. La présente invention a pour objet une conotoxine, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 28 et 40 acides aminés, en ce qu'elle comprend six cystéines qui forment trois ponts disulfure et en ce qu'elle présente la structure générale suivante : U C XI X2 X3 X4 X5 X6 C Yl Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 C C Zl Z2 Z3 C VI V2 V3 C R, dans laquelle : U représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres, au moins l'un des X est un acide aminé chargé basique, sélectionné de préférence parmi Lys et Arg, les autres X étant de préférence sélectionnés parmi les acides aminés polaires, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 et Y9 sont sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, Y6 est sélectionné dans le groupe constitué par les acides aminés chargés basiques et notamment : Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-méthyl-lysine, diméthyllysine et triméthyl-lysine, Zl, Z2, Z3, VI, V2 et V3 sont sélectionnés dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes et les acides aminés polaires neutres et R représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres. Les peptides sont de préférence amidés en C-terminal. On entend par : - acides aminés hydrophobes, les acides aminés suivants : Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met et Trp ; - les acides aminés chargés acides, les acides aminés suivants : Asp et Glu - les acides aminés chargés basiques, les acides aminés suivants : Lys, Arg, ornithine et leurs dérivés, et - les acides aminés polaires neutres, les acides aminés suivants : Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gln, His. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite conotoxine, elle présente la séquence suivante : Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-Lys-AsnGly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys-Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp-Leu (DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL) . Cette conotoxine, dénommée EVIA par les Inventeurs, est considérée comme appartenant d'un point de vue structurel à la O-superfamille. Une comparaison de la répartition des motifs cystéine apparte- nant à la O-superfamille et agissant au niveau du canal sodique (u0-conotoxines et 8-conotoxines) ou non (co-conotoxines et K-conotoxines) est illustrée à la figure 7. Les conotoxines selon l'invention, bien qu'elles présentent le même motif en cystéines que les conotoxines définissant la O-superfamille, présentent, de manière inattendue, une activité spécifique au niveau des canaux sodiques neuronaux : action au niveau présynaptique sans affecter les fibres musculaires. Les expériences électro-physiologiques, réalisées au niveau de la jonction neuromusculaire d'amphibien et de mammifère ainsi que sur des fibres nerveuse myélinisées, montrent que ces toxines et notamment la toxine EVIA, inhibent l'inactivation des canaux sodiques neuronaux, ce qui provoque une augmentation de l'excitabilité des terminaisons nerveuses. Cette augmentation de l'excitabilité se traduit par des réponses synaptiques répétées qui déclenchent des potentiels d'action musculaires. Ces potentiels d'action entraînent une augmentation de la force contractile. De plus, les toxines et notamment la toxine EVIA n'affecte ni les canaux sodiques du muscle squelettique, ni le potentiel de membrane des fibres musculaires. De manière surprenante, les toxines selon l'invention et notamment la toxine EVIA agissent de manière sélective sur les canaux sodiques neuronaux sans affecter ceux du muscle squelettique. Cette action se traduit par une augmentation (i) de la durée du potentiel d'action au niveau des axones et (ii) l'excitabilité membranaire au niveau des terminaisons nerveuses. De telles conotoxines peuvent avantageusement être obtenues par synthèse ; en outre, la conotoxine EVIA existe, en petites quantités, dans le venin de Conus ermineus, un cône piscivore de l'atlantique. Cette toxine est un polypeptide de 32 acides aminés réticulés par trois ponts disulfures. L'invention englobe également des peptides dérivés de cette conotoxine par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ; il peut s'agir par exemple de peptides dans lesquels des modifications ont été apportées, notamment par substitution des acides aminés dextrogyres par des acides aminés levogyres (pseudopeptides) ou des peptides obtenus par modélisation moléculaire et présentant une activité sur les canaux sodiques telle que définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide tel que défini ci-dessus associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les conotoxines selon l'invention, et notamment la conotoxine EVIA, en augmentant de manière sélective l'excitabilité nerveuse membranaire peuvent restituer une conduction nerveuse déficitaire et augmenter la réponse contractile du muscle squelettique en réponse à la stimulation nerveuse. Certaines maladies neurodégénératives du système nerveux, telles que la sclérose en plaques ou les syndromes myasthéniques, tels que le syndrome de Lambert-Eaton et la myasthénie congénitale, se caractérisent par une diminution de l'excitabilité nerveuse au niveau des nerfs moteurs périphériques et une diminution de l'efficacité neuromusculaire. Les conotoxines selon l'invention constituent ainsi un agent efficace dans le traitement symptomatique de ces maladies. La présente invention a également pour objet une composition contenant au moins une conotoxine selon l'invention et au moins une aminopyridine. L'utilisation des aminopyridines (4-aminopyridine ou 3,4-diaminopyridine) seules ont notamment été décrites dans le traitement symptomatique du syndrome de LAMBERT-EATON. Elles sont administrées, per os entre 5 mg trois fois/j à 15 mg quatre fois/j ; des doses journalières supérieures à 80 mg doivent être évitées. Elles ont l'inconvénient de présenter un certain nombre d'effets indésirables sur le système nerveux central (instabilité à la marche, anxiété, convulsions...) (J. Molgo et al., Eur. J Physiol., 1996, 431, suppl., R295R296). Les compositions selon l'invention, qui comprennent en combinaison une conotoxine telle que définie ci-dessus et une aminopyridine, présentent, de manière surprenante, une action synergique dans les myasthénies et ont l'avantage de permettre de diminuer les doses d'aminopyridine et ainsi de diminuer le risque d'apparition des effets indésirables de ces dernières, notamment au niveau du système nerveux central. Elles sont avantageusement administrées par voie parentérale. La présente invention a également pour objet un réactif biologique, caractérisé en ce qu' il comprend une conotoxine, telle que définie ci-dessus, conjuguée à un marqueur approprié, notamment un fluorochrome tel que la rhodamine. Un tel réactif constitue un outil remarquable pour marquer au niveau des cellules les canaux sodiques neuronaux et en étudier la distribution. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre les étapes de purification de la toxine EVIA à partir du venin de C. ermineus ; la figure 1A correspond au fractionnement du venin brut de C. ermineus par chromatographie d'exclusion moléculaire (gel Sephadex G-50) ; figure 1B correspond à la fraction active (hachurée), qui a été fractionnée par chromatographie liquide haute pression à phase inverse sur une colonne C18 semi-préparative. La fraction indiquée par une flèche induit spontanément des contractions musculaires lorsqu'elle est appliquée sur une préparation nerf-muscle de grenouille. Les figures 1C et 1D correspondent à la purification de la toxine EVIA sur deux types de colonnes analytiques C18; - la figure 2 illustre l'effet de la toxine EVIA au niveau de la jonction neuromusculaire de grenouille. La figure 2A correspond à la réponse synaptique contrôle. La figure 2B correspond à la réponse obtenue, 15 minutes après l'addition de la toxine EVIA (200 nM) : trains de potentiels synaptiques ont été enregistrés en réponse à une stimulation du nerf moteur. La figure 2C correspond à un potentiel d'action musculaire contrôle. Les figures 2D et 2E montrent que la toxine EVIA (200 nM) provoque des potentiels d'action musculaires répétés en réponse à une stimulation du nerf moteur. Potentiel d'action musculaire évoqué par stimulation directe du muscle en contrôle (figure 2F) et 30 minutes après l'addition de la toxine EVIA (2 M) (figure 2G) ; - la figure 3 illustre l'effet de la toxine EVIA sur la fibre nerveuse myélinisée de grenouille : . figure 3A : potentiel d'action est enregistré dans des condi- tions contrôles (a) et après addition de la toxine EVIA (200 nM) ; . figure 3B : courant sodium a été enregistré en absence (a) et en présence de la toxine EVIA (200 nM) après des impulsions dépolarisantes à 0 mV à partir d'un potentiel de maintien de-70 mV. Les traces de courants en (b) représentent la différence des courants enregistrés avant et après l'addition de 0,5 M de TTX ; - la figure 4 illustre l'action de la toxine EVIA à 400 nM sur un diaphragme de souris ; la figure 4A correspond au contrôle ; la figure 4B correspond aux réponses synaptiques répétées obtenues 20 minutes après l'addition de la toxine EVIA ; - la figure 5 illustre la synergie d'action entre la conotoxine EVIA et une diaminopyridine ; - les figures 6 et 7 illustrent une comparaison de structure entre différentes conotoxines. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : et séquencage de la toxine EVIA. * Préparation du venin La méthode de dissection utilisée est celle décrite par Cruz et coll. (1976). Elle consiste, dans un premier temps, à extraire l'animal entier de sa coquille puis à le placer dans une cuve à dissection contenant de l'eau de mer. Le conduit à venin, la glande à venin, le sac radulaire et le pharynx sont prélevés et placés dans une cuve contenant 5 ml d'eau de mer. L'extrémité du conduit reliée au pharynx est coupée. Deux forceps sont ensuite utilisés : l'un pour maintenir la glande, l'autre pour presser le conduit et faire couler le venin dans une cuve stérile contenant environ 2 ml d'H2O 0,1% TFA (pH 2,5). Le venin est ainsi prélevé puis lyophilisé, pesé et conservé à -80 C. Des aliquots de 10 mg de venin de C. ermineus sont extraits deux fois par H2O 0,1% TFA de la façon suivante : des aliquots de 500 l de solution contenant 5 mg de venin sont agités à 4 C pendant une heure puis centrifugés à 6000 g à 4 C pendant 4 minutes. Une troisième extraction est effectuée en utilisant un mélange H2O/CH3CN (20/80). Les surnageants, contenant les peptides et les protéines solubles, sont rassemblés, lyophilisés puis conservés à -80 C. * Purification du peptide par HPLC Pour l'isolement du peptide, à partir du venin et les purifications ultérieures, on utilise le tampon A, qui consiste en 0,08 % d'acide trifluoroacétique et le tampon B qui consiste en 0,08 % d'acide trifluoroacétique et 80 % d'acétonitrile. Le venin brut est fractionné par chromatographie sur colonne Sephadex G-50. Les fractions actives sont combinées et fractionnées par HPLC en phase inverse sur une colonne semi-préparative C18 Vydac. La purification de la toxine EVIA est réalisée en deux étapes par chromatographie en phase inverse sur une colonne C18 Vydac (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m) et sur une colonne C18 Merck (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m). * Analyse de la séquence en acides aminés Pour analyser sa composition en acides aminés, le peptide purifié (1 nmole) a été hydrolysé par 200 l d'HCl 6M à 120 C pendant 16 heures. Les hydrolysats ainsi obtenus ont été analysés sur un analyseur automatique "Applied Biosystem 130A". Pour déterminer sa séquence en acides aminés, le peptide a été pyridyléthylé de la façon suivante : 1 nmole de toxine est réduite par le dithiothréitol dans l'hydrochlorure de guanidinium 6 M ; Tris/HCl 0,5 M ;EDTA, 2 mM (pH 7,5) pendant une heure puis traitée par la 4-vinylpyridine (1,5 M) à température ambiante pendant trois heures. Le dérivé obtenu est purifié par CLHP sur une colonne C18 Vydac (4,6 mm x 25 cm, granulométrie 5 m). La séquence en acides aminés est déterminée, par dégradation d'Edman, sur un microséquenceur "Applied Biosystem 477A" et les dérivés phénylthiohydantoïnes sont identifiés en utilisant un analyseur "Applied Biosystem 120A". L'analyse du produit par dégradation chimique d'Edman a ainsi conduit à la séquence peptidique de 32 résidus d'acides aminés (0 : hydroxyproline, "extrémité N-terminale amidée) : DDCIKOYGFCSLPILKNGLCCSGACVGVCADL* La séquence a été confirmée par l'analyse du peptide par spectrométrie de masse. L'ion moléculaire MH+ détecté correspond à la masse théorique du peptide séquence (masse observée : 3288.3 ; masse théorique 3288.4). Ce peptide a été nommé EVIA. La conotoxine EVIA contient 32 acides aminés dont 6 résidus cystéine. Le motif formé par les cystéines (-C-C-CC-C-C-) est caractéristique des conotoxines de la "O-superfamille" incluant les w-conotoxines qui inhibent les canaux calcium voltage-sensible, la conotoxine GS et les uO-conotoxines qui bloquent les canaux sodiques, les 8-conotoxines qui inhibent l'inactivation des canaux sodium voltage-sensible et la K-conotoxine qui bloque le canal potassium du type "shaker". La conotoxine EVIA présente le même motif cystéine et le même espacement entre les cystéines que les uO-conotoxines. De plus, comme les Oconotoxines et les 8-conotoxines, EVIA possède un nombre de résidus hydrophobes important expliquant les temps d'élution relativement important observés en chromatographie à phase inverse. * Spectrométrie de masse Le système utilisé est une ESI-IMS ("Electrospray Ionization Mass Spectra") comprenant une source d'ionisation par électrovaporisation ( electrospray ) (Analytica, Brandford, CT, USA), un analyseur de masse quadrupole (Model RI 0-10 ; Nermag) et un système d'analyse de données (ChemMS Chemstation, Hewlett-Packard). EXEMPLE 2 : Activité biologique du peptide EVIA Pour quantifier les activités biologiques du venin et du peptide isolé, plusieurs bioessais sont réalisés sur les poissons, les souris et les mollusques. L'injection intramusculaire est réalisée sur des poissons (Gambusia affinis, 1-2 g). Les souris utilisées sont des Swiss-Webster pesant entre 20 et 25 g. Les injections intra-cérébroventriculaires (i. c.v.) sont effectuées avec un appareil de stéréotaxie Harvard/ASI. Les mollusques utilisés sont des patelles (0,4-0,5 g). Les réponses positives, chez le poisson et la souris sont quantifiées par la DES , dose qui produit une hyperactivité chez 50 % des animaux testés pendant la durée de l'essai. Des préparations nerf-muscle Sartorius sont utilisées pour le criblage des différentes fractions. Cette méthode consiste à prélever sur des grenouilles mâles Rana esculenta, le Sartorius, à appliquer dans le milieu chaque fraction et à observer visuellement celles qui sont capables de provoquer spontanément des contractions musculaires (présence de la toxine). La fraction provoquant des contractions spontanées du muscle est indiquée par les hachures (figure lA). Cette fraction active est ensuite fractionnée par chromatographie liquide haute pression à phase inverse (figure 1 B). Les composants de cette fraction ont été testés sur la préparation nerf-muscle Sartorius et un seul composé (flèche) éluant à 43% d'acétonitrile provoque des contractions spontanées au niveau de la jonction neuromusculaire de grenouille. Ce composé a été purifié par CLHP en utilisant deux types de colonne analytique C18 (figure 1C et 1 D). Les souris utilisées sont des Swiss-Webster pesant entre 20 et 25 g. Les injections intra-cérébroventriculaires (i. c.v.) sont effectuées avec un appareil de stéréotaxie Harvard/ASI. La toxine EVIA est solubilisée dans une solution saline (NaCl : 0,15 M). Un volume de 5-10 III de solution est injecté avec une seringue Hamilton de 50 l dans le ventricule droit de la souris. Cette toxine (40 nmoles) provoque une hyperactivité se caractérisant par des courses rapides et des crises convulsives. L'injection de toxine (10 nmoles) par voie intramusculaire sur le poisson (Gambusia affinis pesant entre 1 et 1,5 g) provoque une hyper-activité et une contraction de toutes les nageoires. A plus fortes doses (1 nmole), le peptide est extrêmement toxique chez la souris, provoquant la mort en moins d'une minute. Le peptide EVIA a été injecté dans le pied du mollusque Patella. A la différence des résultats observés avec la toxine 8-TxVIA (Fainzilber, 1991 ; Hillyard, 1989) qui provoque une paralysie rigide du pied du mollusque, la toxine EVIA ne produit par d'effet significatif. Le peptide EVIA est donc actif spécifiquement sur les vertébrés. Le Tableau 1 ci-après montre que l'EVIA est une toxine active mais non toxique chez les vertébrés. Tableau 1 EFFET DE LA TOXINE EVIA SUR LA JONCTION NEUROMUSCULAIRE ISOLEE DE GRENOUILLE DE50 dans DE50 sur poisson mammifère mollusque jonction neuromusculaire g.g masse corporelle-' g Venin brut 0,53 0,25 pas d'effet 1,5 pmole.masse corporelle-' nmole EVIA 4,1 1,8 pas d'effet 1,2 ii:l La préparation nerf-muscle pectoral cutané (Cutaneous pectoris) est prélevée sur des grenouilles mâles Rana esculenta, pesant entre 20 et 25 g, préalablement décérébrées et démédullées. Ce muscle présente l'avantage d'être plat et de ne contenir que très peu de couches de fibres musculaires, ce qui permet de suivre facilement le trajet des branches nerveuses. Après dissection, la préparation est fixée et épinglée dans une cuve en Plexiglass, dont le fond est recouvert de Rhodorsil, contenant 2 ml de solution physiologique de composition suivante en mM) : NaCI, 115 ; KCI, 2,1 ; CaCl2, 1,8 ; tampon HEPES (N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N'-2-éthanesul-fonate de sodium), 5. Le pH est ajusté à 7,25. Un milieu de découplage excitation-contraction a été utilisé lors des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires au cours de l'étude de l'action de la toxine EVIA qui entraîne des contractions musculaires spontanées incompatibles avec ce type d'enregistrement. Le découplage consiste en un choc osmotique entraînant des perturbations de système tubulaire des fibres musculaires, ce qui a pour conséquence un découplage entre l'excitation membranaire et la contraction musculaire (del Castillo et Escalona de Motta, 1978). Pour cela, les préparations sont traitées pendant 17 min. avec une solution physiologique contenant 2 M de formamide, puis abondamment rincées avec une solution physiologique standard pendant 1 h 30. Dans ces conditions, le potentiel de repos des fibres est légèrement diminué (-60 mV au lieu de-80 mV) mais les terminaisons nerveuses répondent normalement à la stimulation électrique. Les potentiels d'action et les réponses synaptiques sont enregistrés sur le muscle Cutaneous pectoris à l'aide d'une microélectrode de verre selon les techniques conventionnelles d'enregistrement intracellulaire. Après amplification, les signaux électriques sont observés sur un oscilloscope digital (Tektronix 5223) et simultanément enregistrés sur un magnétoscope (Sony PCM 701 ES). Le nerf moteur est stimulé à l'aide d'une électrode de succion formée d'un tube de verre étiré et poli à l'une de ses extrémités de manière à pouvoir aspirer le nerf sans le détériorer. L'autre extrémité est reliée à une seringue d'aspiration. Deux fils de platine sont fixés sur l'électrode, l'un enroulé à l'extérieur du tube, l'autre à l'intérieur, et connectés tous les deux à la sortie d'isolement d'un stimulateur "Grass S44". Dans certaines expériences réalisées sur la fibre musculaire, la technique de courant imposé a été utilisée pour maintenir le potentiel membranaire de repos à une valeur choisie en injectant un courant par une deuxième électrode. Comme le montre la figure 2B, après l'application de l'EVIA (200 nM) sur une préparation neuro-musculaire isolée de grenouille préalablement traitée avec le formamide, une stimulation du nerf moteur provoque un train de potentiels synaptiques pouvant atteindre une fréquence de 300 Hz. Ces trains de potentiels synaptiques engendrent des trains de potentiels d'action dans les régions extrajonctionnelles des fibres musculaires. Sur les préparations neuro-musculaires non formamidées (couplage excitation-contraction non bloqué), l'addition de (+)-tubocurarine (20 M) supprime la contraction du muscle provoqué par la toxine EVIA. Ce résultat indique que la toxine agit principalement au niveau présynaptique. L'effet de la toxine EVIA sur le muscle squelettique a été étudié par stimulation directe de la fibre musculaire en injectant un courant de 2,5 ms de durée. La figure 2G montre que l'application de 2 M d'EVIA ne modifie ni le potentiel d'action musculaire, ni l'excitabilité des fibres musculaires. La toxine EVIA augmente donc de façon significative l'excitabilité de la jonction neuro-musculaire de grenouille sans affecter directement le muscle squelettique. EFFETS DE L'EVIA SUR LA FIBRE NERVEUSE MYELINISEE DE GRENOUILLE Pour les expériences électrophysiologiques réalisées sur le noeud de Ranvier, une fibre nerveuse myélinisée d'environ 0,5 cm de long a été isolée et montée dans une chambre comportant cinq compartiments telle qu'elle a été décrite par Nonner (1969). La solution physiologique a la composition suivante (en mM) : NaCl, 115 ; KCI, 2,1 ; CaCl2, 1,8 ; tampon HEPES (N-(2-hydroxyéthyl)pipérazineN'-éthanesulfonate de sodium), 5. Le pH est ajusté à 7,25. Le potentiel d'action et le courant sodium ont été enregistrés en utilisant respectivement les techniques conventionnelles de courant et de potentiel imposés. Le potentiel membranaire de repos des fibres est de -70mV, ce qui correspond à 30% d'inactivation du pic de courant sodium. Le noeud de Ranvier étudié est stimulé à une fréquence de 0,7 Hz. Dans les conditions de potentiel imposé, la membrane est maintenue à un potentiel de-70 mV entre les impulsions. Le courant sodium a été calculé en supposant une résistance axoplasmique de 10 M#. Les courants de fuite et capacitifs sont soustraits électroniquement du courant total. Pour enregistrer le potentiel d'action, les extrémités ont été coupées dans une solution contenant 120 nM de KCl. Pour enregistrer le courant sodium, le courant potassium a été bloqué par du CsCI interne (110 mM) et par du TEA externe (10 mM). Le courant sodium a été caractérisé par sa sensibilité à la TTX (0,5 M). Le potentiel d'action de fibres myélinisées, induit par une dépolarisation, n'est pas notablement modifié par 20 nM EVIA. En revanche, 200 nM de toxine provoque, après une minute, un allongement de la durée du potentiel d'action d'environ 6 fois. L'amplitude du pic du potentiel d'action est réduite d'environ 15% (figure 3A). L'effet de la toxine EVIA sur le courant sodique TTX-sensible a été étudié en voltage imposé sur les fibres myélinisées. Dans ces conditions, la toxine EVIA ralentit et/ou supprime une partie de l'inactivation du courant sodique (figure 3B). Par ailleurs, en présence de toxine, un courant sodique entrant est observé au potentiel de repos de la fibre (-70 mV). Enfin la toxine provoque une diminution de l'amplitude du courant sodique d'environ 40%. EFFETS DE L'EVIA SUR UN DIAPHRAGME DE SOURIS On observe des réponses synaptiques répétées 20 minutes après l'addition d'EVIA 400nM (figure 4B). EXEMPLE 3 : d'action d'une composition contenant la conotoxine EVIA et une diaminopyridine. La figure 5A montre la réponse synaptique contrôle à environ 0,2 mV : les réponses sont faibles car pour visualiser une augmentation de " release " (libération) de neurotransmetteur, on bloque partiellement les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine au curare 3 M. La figure 5B montre la réponse synaptique obtenue après stimu- lation avec 200 nM d'EVIA : obtient des réponses répétées, après stimulation du nerf moteur. La figure 5C montre que la toxine provoque des réponses synaptiques répétées, spontanément, sans stimulation. En B et C, les réponses ont une amplitude de 0,15-0,2 mV, comme pour le contrôle. Par contre, lorsque l'on ajoute la DAP, on a toujours des réponses répétées mais, en plus, les réponses ont une amplitude de 2,5-3 mV (soit 10 fois plus) (figure 5D), alors que la DAP seule, provoque également des réponses répétées, mais jamais à cette fréquence. EXEMPLE 4 : Synthèse de la toxine EVIA. Elle est réalisée sur phase solide par la technique Fmoc. La synthèse est mise en #uvre sur un synthétiseur automatisé ABI 430A (PerkinElmer, en utilisant une résine amidée comme phase solide et HBTU/HOBt, comme agents de couplage (Field C.G. et al., Peptide Res., 1991,4, 95-101). A l'issue du couplage, le peptide est déprotégé et clivé de sa matrice solide par de l'acide trifluoroacétique, puis purifié sur colonne préparative C18. REFERENCES # Catterall W. A., Ann. Rev. Biochem., 1986, 55, 953-985. # Cruz L.J. et al., Veliger, 1976, 18, 302-308. # Cruz L. J. et al., J Biol. Chem., 1985b, 260, 9280-9288. # Del Castillo J. et al., J Cell Biol. 1978, 78, 782-784. # Fainzilber M. et al., Eur. J Biochem., 1991,202, 589-595. # Fainzilber M. et al., J Biol. Chem., 1994, 269, 2574-2580. # Fainzilber M. et al., Biochemistry, 1995a, 34, 5364-5371. # Fainzilber M.et al., J Biol. Chem., 1995b, 270, 1123-1129. # Fainzilber M. et al., J. Biol. Chem., 1995c, 270, 1123-1129. # Gordon D., 1997, in Gutman, Y. & Lazarowici P., Toxins and signal transduc- tion, cellular and molecular mechanisms of toxins action series, Harwood Acadelic publishers, The Netherlands 119-149. # Hillyard D. R. et al., Biochemistry, 1989, 28, 358-361. # McIntosh J.M. et al., J Biol. Chem., 1995b, 270,16796-16802. # Moczydlowsky E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 5321-5325. #Nonner W., Pjlugers Arch., 1969, 309, 176-192. # Shon K. J. et al., Biochemistry, 1994,33, 11420-11425. # Shon K. J. et al., Biochemistry, 1995, 34, 4913-4918. # Shon K. J. et al., J Neurosci., 1998, 18, 4473-4481 # Terlau H. et al., Nature, 1996a, 381, 148-151. # Terlau H. et al., J Neurophys., 1996b, 76, 1-7. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en #uvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1 ) Conotoxine, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 28 et 40 acides aminés, en ce qu'elle comprend six cystéines qui forment trois ponts disulfure et en ce qu'elle présente la structure générale suivante : U C XI X2 X3 X4 X5 X6 C Yl Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 C C Zl Z2 Z3 C VI V2 V3 C R, dans laquelle : U représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres, au moins l'un des X est un acide aminé chargé basique, sélectionné de préférence parmi Lys et Arg, les autres X étant de préférence sélectionnés parmi les acides aminés polaires, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y7, Y8 et Y9 sont sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, Y6 est sélectionné dans le groupe constitué par les acides aminés chargés basiques et notamment : Lys, Arg, omithine, homoarginine, N-méthyl-lysine, diméthyle lysine et triméthyle lysine, Zl, Z2, Z3, VI, V2 et V3 sont sélectionnés dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes et les acides aminés polaires neutres et R représente 1 à 3 acides aminés sélectionnés parmi les acides aminés hydrophobes, les acides aminés chargés et les acides aminés polaires neutres. 2 ) Conotoxine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence suivante : Asp-Asp-Cys-Ile-Lys-OHPro-Tyr-Gly-Phe-Cys-Ser-Leu-Pro-Ile- Leu-Lys-Asn-Gly-Leu-Cys-Cys-Ser-Gly-Ala-Cys-Val-Gly-Val-Cys-Ala-Asp- Leu. 3 ) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2 associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 4 ) Composition contenant au moins une conotoxine selon la revendication 1 ou la revendication 2 et au moins une aminopyridine. 5 ) Réactif biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une conotoxine selon la revendication 1 ou la revendication 2, conjuguée à un marqueur approprié, notamment un fluorochrome tel que la rhodamine.