Brevet FR2789498A1 — publié le 20000811

SYSTEME DIVISEUR DE FAISCEAU La présente invention concerne un système diviseur de faisceau pour un microscope à balayage laser comprenant un laser produisant un faisceau laser et un miroir partiellement réfléchissant divisant le faisceau laser en faisceaux partiels, et dans lequel les faisceaux partiels sortent du système diviseur de faisceau dans un plan et sont dirigés vers l'échantillon à analyser. Il est connu par DE 196 53 413 A1 d'illuminer plusieurs microlentilles adjacentes (réseau de microlentilles) avec un faisceau laser expansé pour produire une multitude de faisceaux partiels à partir du faisceau incident. Ceci signifie en particulier que chaque faisceau partiel est généré à partir d'une portion différente du profil du faisceau incident. Les faisceaux partiels sont focalisés par les microlentilles en fonction de leur longueur focale en un ou plusieurs plans faiblement espacés derrière le réseau de microlentilles et se propagent vers l'objectif du microscope qui focalise les faisceaux partiels vers l'échantillon. Ainsi les faisceaux illuminent la totalité de l'ouverture du microscope. Le nombre et l'écartement des faisceaux partiels sont fixés par la configuration du réseau de microlentilles. Typiquement, dans ces systèmes optiques, il existe une bifurcation du chemin du faisceau entre la source lumineuse du faisceau laser et l'échantillon afin de diriger la fluorescence provenant de l'échantillon vers un photodétecteur. Le problème avec ce microscope est que les faisceaux partiels ont des intensités sensiblement différentes. Les faisceaux laser ont une certaine distribution d'intensité à travers leur section. Les lasers utilisés en microscopie à balayage laser ont généralement un profil gaussien. Ceci signifie que les faisceaux partiels générés par le réseau de microlentilles provenant du centre du faisceau laser sont plus intenses que ceux provenant du bord du faisceau élargi. Le signal détecté est la fluorescence excitée par les faisceaux partiels. Dans le cas de l'excitation d'un photon, le signal est aussi différent que l'intensité des faisceaux partiels d'excitation. En microscopie non- linéaire (excitation de 2, 3 photons ou plus) cet effet est respectivement le carré ou le cube. Par exemple pour deux faisceaux ayant un rapport 4 en intensité les signaux générés par ces faisceaux auront un rapport de 4 (excitation de 1 photon), 16 (excitation de 2 photons) ou 64 (excitation de 3 photons). Ceci est un problème pour générer des faisceaux partiels à partir de microlentilles, particulièrement dans le cas de la microscopie à balayage laser non-linéaire. Un autre problème de ce microscope est que la résolution obtenue n'est pas suffisamment bonne pour la limite de diffraction des lentilles de l'objectif de microscope utilisé. La résolution latérale en microscopie à balayage laser est donnée par la largeur totale du demi-maximum du foyer généré dans l'échantillon. Dans le cas de ce microscope, la taille du foyer n'est pas seulement déterminée par I'ouverture des lentilles de l'objectif du microscope utilisé, mais également par la forme et la taille des microlentilles car ces microlentilles agissent comme l'ouverture de diffraction limite pour chaque faisceau partiel. Ceci signifie en particulier que la résolution diminue quand le nombre de faisceaux augmente car la taille des microlentilles est diminuée et le diamètre des foyers augmente. De plus les microlentilles ne sont pas éclairées de façon symétrique mais avec une partie de profil de faisceau laser élargi généralement décroissant vers les bords. En conséquence les foyers ont une distribution d'intensité dissymétrique dans l'échantillon. Comme la résolution est l'un des paramètres les plus importants en microscopie, ceci n'est pas un problème négligeable. Un autre problème avec ce microscope est que l'énergie du faisceau laser incident n'est pas entièrement utilisée. Une partie du faisceau laser élargi est coupée par le bord du réseau de microlentilles et par le bord de chaque micro lentille individuelle. Ces pertes s'additionnent de telle sorte que, par exemple, à partir d'une puissance de sortie du laser de 1.4 W, seulement environ 125 mW (9%) atteignent l'échantillon (JOrg Bewersdorf, Rainer Pick, Stefan W. Hell, "Multifocal multiphoton microscopy", Optics Letters, Vol. 23, No. 9 (1998). La perte de puissance laser réduit de manière significative l'efficacité du microscope car le temps requis pour une mesure dépend de la puissance laser utilisée. Dans les applications biologiques du microscope à balayage laser sur des cellules vivantes, le temps de mesure est un facteur important car il détermine la vitesse maximale des processus à étudier. L'étude de la propagation dans les cellules nerveuses est un exemple (R. Yuste, W. Denk, "Dentitric spines as basic functional units of neuronal integration", Nature Vol. 375, pp. 682-684 (1995). Ici, la microscopie laser à balayage a été nécessaire pour obtenir des images haute résolution des couches profondes de tissus nerveux intacts. En opposition à cette application avantageuse de la microscopie à balayage laser, la vitesse lente de prise de vue empêchait l'étude de la propagation d'impulsions en résolution spatiale bi- dimensionnelle. L'augmentation de la vitesse de prise de vues entraîne ainsi une extension de la plage d'utilisation de la microscopie à balayage laser. La puissance laser sur l'échantillon est cruciale pour la vitesse de prise de vues. Du fait que la puissance d'un faisceau unique ne peut être augmentée arbitrairement sans risque de détérioration de l'échantillon, la puissance sur l'échantillon ne peut être augmentée de façon substantielle qu'en utilisant plusieurs faisceaux éclairant simultanément plusieurs points. Ici, I'efficacité du procédé de séparation de faisceau détermine (pour une puissance de sortie donnée du laser) le nombre maximum de faisceaux partiels. Un autre problème de ce microscope est que la distance et le nombre de faisceaux partiels sont déterminés par la nature du réseau de microlentilles. En fonction de l'application, une distance plus petite ou plus grande entre les faisceaux peut être acceptable. Des cellules uniques peuvent être étudiées à la vitesse maximum si tous les faisceaux sont dirigés sur la seule cellule à étudier. Dans ce cas, une distance d'environ 2gm entre les faisceaux est raisonnable. Dans les analyses de réactions biochimiques ("biochips") o l'investigation se fait sur des substrats microstructurés, une distance égale à un ordre de grandeur de la microstructure est acceptable (environ 201rm). Le diviseur de faisceau décrit actuellement ne permet pas de changer facilement le nombre et la distance des faisceaux. Dans DE 39 18 412 A1 un système de division de faisceau est décrit, comprenant un laser délivrant un faisceau laser et un miroir semitransparent divisant ledit faisceau laser en faisceaux partiels, lesdits faisceaux partiels quittant le système de division de faisceau dans un plan et étant dirigés sur l'échantillon à étudier. Dans DE 195 35 525 A1 un diviseur de faisceau est décrit, comprenant une couche semi-transparente et une couche à haut pouvoir réfléchissant, ladite couche semi-transparente se trouvant sur le chemin optique devant ladite couche à haut pouvoir réfléchissant et renvoyant vers ladite couche à haut pouvoir réfléchissant avec une transmission augmentant avec le nombre de réflexions afin de délivrer des faisceaux partiels d'égale intensité. Dans EP 03 86 643 A2, un diviseur de faisceau est décrit, comprenant une couche semi-transparente et une couche à haut pouvoir réfléchissant, ladite couche semi-transparente se trouvant devant ladite couche à haut pouvoir réfléchissant, o dans différents montages est inclinée ou décalée et o dans un autre montage deux séparateurs de faisceaux croisés à 90 degrés l'un par rapport à l'autre sont proposés afin de produire un réseau d'illumination bi- dimensionnel. Dans DE 38 76 344 T2, un diviseur optique est décrit, comprenant une couche semi-transparente à transmission constante et se trouvant entre deux couches à haut pouvoir réfléchissant, lesdites couches étant parallèles entre elles et ladite couche semi-transparente transmettant la lumière vers l'une desdites couches à haut pouvoir réfléchissant et réfléchit la lumière vers l'autre desdites couches à haut pouvoir réfléchissant avec une égale atténuation et de nouveau et de manière répétitive transmettant la lumière vers l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant et la réfléchit vers l'autre desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant avec une égale atténuation. La présente invention concerne un système de division de faisceau pour microscope à balayage laser permettant de changer facilement le nombre et l'écartement des faisceaux partiels. Selon la présente invention, le système de division de faisceau comprend un miroir partiellement réfléchissant à transmission constante, se trouvant entre deux miroirs à haut pouvoir réfléchissant, qui réfléchit le faisceau laser vers l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant et le transmet vers l'autre desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant avec une égale atténuation, et à nouveau et de manière répétitive réfléchit le faisceau laser vers l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant et le transmet vers l'autre desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant avec une égale atténuation et est placé à des distances différentes desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant et/ou lesdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant sont inclinés par rapport auxdits miroirs partiellement réfléchissants de telle sorte que les faisceaux réfléchis par lesdits miroirs partiellement réfléchissants ne recouvrent pas les faisceaux réfléchis par lesdits faisceaux à haut pouvoir réfléchissant, et dans la région de sortie du système le bord dudit miroir partiellement réfléchissant est décalé le long du bord de l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant et est décalé en arrière du bord de l'autre dudit miroir à haut pouvoir réfléchissant. Ceci ainsi que d'autres objets, caractéristiques, aspects et avantages de la présente invention deviendront plus clairs dans la description détaillée suivante de la présente invention et en tenant compte des figures jointes. La manière de diviser le faisceau en faisceaux partiels possède les avantages suivants: 1. l'énergie du laser incident est utilisée en totalité et répartie parmi les faisceaux partiels, 2. chaque faisceau partiel possède le même profil que le faisceau laser incident, 3. si le miroir partiellement réfléchissant divise le faisceau dans un rapport de 1:1 tous les faisceaux partiels ont la même intensité, 4. si les miroirs sont parallèles entre eux, les faisceaux partiels générés sont également parallèles entre eux. Si l'un ou les deux miroirs à haut pouvoir réfléchissant sont inclinés par rapport au miroir partiellement réfléchissant, les faisceaux partiels générés ont un angle entre eux. L'angle des faisceaux partiels détermine la distance des foyers générés par l'objectif de microscope sur l'échantillon, par ex. en inclinant les miroirs à haut pouvoir réfléchissant la distance entre les foyers peut être changée, 5. la distance des faisceaux partiels à la sortie du système de division de faisceau est déterminée par la différence des distances entre les miroirs à haut pouvoir réfléchissant et le miroir partiellement réfléchissant. En général, une haute efficacité du diviseur de faisceau et une égale intensité entre les faisceaux partiels est un avantage important en microscopie à balayage laser et conduit à une augmentation de la vitesse de prise de vues. La possibilité de changement de la distance des foyers procure la flexibilité nécessaire à une adaptation aux besoins des applications respectives. La figure 1 est un montage optique comprenant deux miroirs à haut pouvoir réfléchissant et un miroir partiellement réfléchissant placé entre les miroirs à haut pouvoir réfléchissant. La figure 2 est un arrangement en série de deux systèmes de division de faisceau avec un périscope placé entre les deux arrangements optiques. La figure 3 est un diviseur de faisceau dans un microscope à balayage laser. La figure 4 est un montage de plusieurs miroirs à haut pouvoir réfléchissant dans un montage en série avec plusieurs miroirs partiellement réfléchissants placés entre eux. La figure 1 est un diviseur de faisceau construit comme un montage de la présente invention générant huit faisceaux partiels 5 à partir du faisceau incident 1. Les faisceaux partiels 5 sont côte à côte sur une ligne. Le miroir à haut pouvoir réfléchissant 3 est fourni avec une marche, les distances respectives entre ce miroir et le miroir à haut pouvoir réfléchissant 4 ainsi que le miroir partiellement réfléchissant 2 sont variables par cette marche 3. Dans le diviseur de faisceau correspondant à la figure 2, un périscope 6 est placé entre deux montages optiques divisant le faisceau laser. Les faisceaux partiels 5 frappent le périscope qui les dirige vers le second montage optique qui les divise à nouveau. Dans ce second montage optique, chaque faisceau partiel est à nouveau divisé en plusieurs faisceaux partiels 5 afin de générer un réseau bi-dimensionnel de faisceaux partiels. Le même résultat peut être obtenu si les deux montages optiques qui divisent le faisceau laser sont inclinés l'un par rapport à l'autre, en particulier avec un angle de 90 degrés. La figure est un diagramme du chemin optique d'un microscope à balayage laser. Ici, il existe un miroir semi-transparent entre l'échantillon 10 et le photodétecteur 12. Ce miroir est semi-transparent de telle sorte que les faisceaux partiels provenant du montage optique divisant le faisceau laser sont directement réfléchis vers l'échantillon et les faisceaux provenant de l'échantillon sont transmis au photodetecteur 12 grâce à leur longueur d'onde différente. Il existe une lentille 11 devant le photodétecteur 12 comme on peut le voir à la figure 3. Le diviseur de faisceau correspondant à la figure 4 diffère légèrement de celui de la figure 1. Ici, les miroirs à haut pouvoir réfléchissant et le miroir partiellement réfléchissant ont été divisés en plusieurs miroirs placés séparément dans une série. Le résultat au regard de la division d'un faisceau laser en faisceaux partiels est identique à celui de la figure 1. REVENDICATIONS 1. Système de division de faisceau pour un microscope à balayage laser comprenant un laser délivrant un faisceau laser (1) et un miroir partiellement réfléchissant (2) divisant ledit faisceau laser en faisceaux partiels (5) qui quittent le système dans un plan et sont ensuite dirigés sur l'échantillon à analyser, caractérisé en ce que ledit miroir partiellement réfléchissant (2) a une transmission constante et est placé entre deux miroirs à haut pouvoir réfléchissant (3,4), et transmet ledit faisceau laser (1) à l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (3) et réfléchit ledit faisceau (1) à l'autre desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (4) avec pratiquement la même atténuation, et à nouveau et de manière répétitive, transmet ledit faisceau à l'un desdits miroirs et le réfléchit à l'autre desdits miroirs (4), et est placé à des distances différentes desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (3,4) et/ou lesdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (3,4) sont inclinés par rapport audit miroir partiellement réfléchissant (2) de telle sorte que les faisceaux (5) réfléchis par ledit miroir partiellement réfléchissant (2) ne coïncident pas avec les faisceaux réfléchis par lesdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (3,4), et en sortie du système, le bord dudit miroir partiellement réfléchissant (2) est décalé le long du bord de l'un desdits miroirs à haut pouvoir réfléchissant (4) et est décalé vers le bord de l'autre miroir à haut pouvoir réfléchissant (3). 2. Système de division de faisceau selon la revendication 1, caractérisé en ce que plusieurs systèmes de division de faisceau sont placés dans une rangée et tous les faisceaux (5) quittent le système dans un plan. 3. Système de division de faisceau selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que deux systèmes de division de faisceau inclinés de préférence d'un angle de 90 degrés sont placés dans une rangée avec tous lesdits faisceaux partiels (5) des deux dits systèmes de division de faisceau quittant les systèmes de division de faisceau dans un plan et lesdits faisceaux partiels (5) dans leur ensemble créant un réseau bidimensionnel. 4. Système de division de faisceau selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'objectif dudit microscope à balayage laser focalise lesdits faisceaux partiels (5) en différents points focaux. ?10 5. Système de division de faisceau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le diamètre desdits faisceaux partiels (5) est modifié avant que lesdits faisceaux entrent dans l'objectif dudit microscope à balayage laser.