Brevet FR2791067A1 — publié le 20000922

La présente invention a pour objet la mise en évidence de séquences nucléotidiques permettant notamment de distinguer, en terme de diagnostic, une immunisation résultant d'une vaccination par le BCG d'une infection par M. tuberculosis. Les séquences en question sont spécifiques soit de M bovis BCG/ M. bovis, soit de M tuberculosis. La présente invention a également pour objet un procédé de détection des séquences en question, un procédé pour la détection d'anticorps générés par les produits d'expression de ces séquences ainsi que les kits pour mettre en #uvre ces procédés. Enfin, la présente invention a pour objet de nouveaux vaccins Le taux important de mortalité et de morbidité causé par Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, génère la nécessité de développer de nouveaux vaccins et des traitements chimiothérapeutiques toujours plus courts En effet, l'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux anti-tuberculeux et le risque accru chez les patients immunodéprimés, par exemples chez les patients atteints du sida, de développer une tuberculose, rend nécessaire la mise au point de méthodes rapides, spécifiques et fiables pour le diagnostic de la tuberculose et la mise au point de nouveaux vaccins. Le vaccin BCG conventionnel dérive d'une souche de Mycobacterium bovis qui a été atténuée par des passages en série répétés sur de l'agar de bile pomme de terre-glycérinox (Calmette, 1927 , Bloom and Fine, 1994). Cependant, malgré presque 50 ans d'utilisation mondiale, la raison de l'atténuation de M bovis BCG est encore inconnue Des questions persistent quant à la protection conférée par le vaccin contre la tuberculose pulmonaire, avec un efficacité comprise entre 0 et 80 % (Fine, 1994) De plus, de nombreuses sous-souches de BCG existent et offrent des niveaux variés de protection contre la tuberculose dans un modèle de souris (Lagranderie et al., 1996). L'atténuation de la souche d'origine de M bovis peut avoir été causée par des mutations dans le génome du bacille qui ont été sélectionnées durant les passages en série de la souche, mutations qui sont restées stables dans le génome. Cependant, comme la souche de M bovis d'origine est perdue, la comparaison directe de cette dernière avec M. bovis BCG est impossible. Malgré cela, l'identification de différences génétiques entre M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis est susceptible de révéler des localisations dont l'altération aurait pu conduire à l'atténuation de M bovis BCG. L'ADN de M. tuberculosis a plus de 99,9 % d'homologie avec l'ADN des autres membres du complexe tuberculeux (M bovis, M. microti, M. africanum). Bien que très apparentées, ces souches peuvent être différenciées sur la base de leur gamme d'hôte, de leur virulence pour l'Homme et de leurs caractéristiques physiologiques (Heifets and Good, 1994). Comme dans le cas de l'atténuation du BCG, la base génétique pour les différences phénotypiques entre les bacilles tuberculeux est largement inconnue. Cependant, la richesse de l'information contenue dans la séquence génomique de M. tuberculosis H37Rv donnait lieu à penser que les variations génétiques entre les souches allaient être mises à jour (Cole et al., 1998). La comparaison génomique présente un outil puissant pour de telles recherches puisque les génomes entiers peuvent être étudiés de préférence à l'étude des gènes dans leur individualité. Une précédente étude comparative de M bovis et M. bovis BCG par hybridation génomique soustractive a montré que trois régions, désignées RD1, RD2 et RD3 étaient délétées dans M bovis BCG comparativement à M bovis (Mahairas et al., 1996) Cependant, le rôle, le cas échéant, de ces régions dans l'atténuation de M bovis BCG n'a pas été clairement établie De façon similaire, d'autres études des différences génomiques entre M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis ont montré que de nombreuses localisations polymorphiques existaient entre ces souches (Philipp et al., 1996). Bien que la nature exacte de ces polymorphismes n'a pas été éclaircie, des analyses supplémentaires ont révélé qu'un polymorphisme était dû à la délétion de 12,7 kb dans M bovis et BCG comparativement à M. tuberculosis (Brosch et al., 1998). A partir de là, il apparaît qu'il existe deux classes de délétion : celles qui sont absentes de BCG mais présentes dans M. bovis et M tuberculosis et celles qui sont absentes de M bovis et BCG mais présentes dans M. tuberculosis. La banque de chromosome artificiel bactérien (BAC) de M. tuberculosis H37Rv témoigne de la connaissance complète de la séquence génomique de M. tuberculosis et présente un potentiel en tant qu'outil pour les applications postgénomiques telles que les comparaisons génomiques (Brosch et al., 1998). Afin de pousser plus avant les investigations dans les différences génomiques entre M tuberculosis et M bovis BCG, les inventeurs ont préparé une banque BAC de M. bovis BCG. Ce type de banque présente en effet certains avantages. Premièrement, le système BAC peut maintenir de larges inserts de DNA mycobactériens, jusqu'à 120 kb. Les 4,36 Mb du génome de M. bovis BCG pouvaient dont être représentées dans 50 à 60 clones, simplifiant le stockage et la manipulation de la banque. Deuxièmement, le système BAC peut permettre en toute confiance de répliquer les inserts sans générer de réarrangement ou de délétion dans les clones. De là, les altérations de l'insert ne peuvent pas être à l'origine d'erreur pour la variation dans le génome. Troisièmement, le positionnement des clones BAC sur le chromosome de M. bovis BCG est susceptible de générer une carte de clones se chevauchant ce qui devrait permettre la comparaison directe des segments locaux sur le génome de M tuberculosis et de M. bovis BCG, tout en étant une ressource intéressante pour le séquençage du génome de M bovis BCG. La construction d'une banque BAC de M. bovis BCG-Pasteur (I- 2049) est décrite ci-après ainsi que son utilisation, en conjonction avec la banque BAC de M tuberculosis H37Rv (1-1945), en tant qu'outilpour les comparaisons génomiques. Avec cette approche, les inventeurs ont pu identifier de nouvelles délétions et insertions entre les bacilles tuberculeux ce qui permet d'avoir un aperçu dans deux génomes de la dynamique et de la différentiation dans le complexe de M. tuberculosis. La voie principale pour extraire l'information biologique à partir du génome est la comparaison entre les génomes. La technologie des biopuces ou chips d'ADN (Chee et al., 1996 ; DeRisi et al , 1997) décrite par exemple dans les brevets n W097/02357 et n W097/29212 permet d'effectuer les alignements et sélectionner les séquences d'intérêt . Par ailleurs, la disponibilité d'un jeu minimum de clones de BAC pour les génomes de M. bovis BCG et M. tuberculosis H37Rv a procuré aux inventeurs des outils prêts à l'emploi pour les susdites études comparatives. La banque de BAC de M. bovis BCG contient plus de 1 500 clones avec une taille moyenne des inserts d'environ 75 kb. 57 clones couvrent le génome de BCG incluant un fragment HindIII de 120 kb qui était absent de la banque de BAC de M. tuberculosis. La construction des puces de BAC à partir de la banque de M. bovis BCG devait permettre aux inventeurs d'étendre leurs études comparatives concernant le bacille tuberculeux. Ces fragments peuvent s'hybrider avec de l'ADN génomique à partir d'isolats cliniques de M tuberculosis ou des souches épidémiques pour identifier d'autres délétions ou réarrangements, et de là, permettre un nouvel aperçu concernant la plasticité du génome ainsi que l'identification des gènes et des produits des gènes qui peuvent être impliqués dans la virulence. A l'issue d'expérimentations reportées ci-après, les inventeurs ont identifié 10 localisations ou loci qui sont absents dans M. bovis BCG comparativement à M tuberculosis. Des hybridations avec l'ADN génomique de M bovis ont révélé que 7 de ces loci étaient également délétés dans M. bovis comparativement à M tuberculosis. Ainsi, dans le texte ci-après, à chaque fois qu'il sera question de caractéristiques communes au génome de M. bovis BCG et à celui de M bovis, il sera indiqué qu'il s'agit du génome de M. bovis BCG / M. bovis . Il s'est ensuite avéré que 3 des délétions spécifiques apparaissant dans M bovis BCG étaient identiques aux régions RDI, RD2 et RD3 définies par l'équipe de Stover (Mahairas et al., 1996). Ainsi, en gardant la précédente nomenclature, les inventeurs ont appelé les 7 autres délétions du génome de M bovis BCG / M. bovis, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RD10. D'autres délétions se sont révélées être spécifiques du génome de M tuberculosis étant entendu que les séquences correspondantes étaient présentes chez M. bovis BCG / M bovis ; elles ont été appelées RvD1 et RvD2 (Tableaux 1 et 2). Les délétions RD5-RD10, RvDl et RvD2 ont permis aux inventeurs d'identifier de manière approfondie la dynamique du génome dans le bacille tuberculeux et ont donné des indications relatives aux bases génétiques de la différentiation phénotypique du complexe L'identification de RvDl et RvD2 en tant que délétions du génome de M tuberculosis H37Rv montre que le processus de délétion ne fonctionne pas dans un seul sens, et la perte d'informations peut donc avoir lieu à la fois dans les souches bovines et dans les souches humaines On constate que 8 des 10 délétions détectées sont localisées dans une région du chromosome où la terminaison de la réplication a probablement lieu. Les inventeurs ont ensuite, au sein de chaque région délétée, mis en évidence plusieurs ORFs (ou cadres ouverts de lecture) ou gènes et ils ont tenté de déterminer la fonction putative de chacun d'eux (Tableau 1). La présente invention a donc pour objet des séquences nucléotidiques délétées du génome de M. bovis BCG / M. bovis et présentes dans le génome de M. tuberculosis ou inversement choisies parmi les ORFs et gènes suivants : Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964, Rvl965, mce3, Rvl967, Rvl968, Rvl969, lprM, Rv1971, Rvl972, Rvl973, Rvl974, Rvl975, Rvl976c, Rvl977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075, echAl, Rv0223 c, RvD 1-ORF I , RvDl-ORF2, Rv2024c, plcD, RvD2-ORF 1, RvD2- ORF2, RvD2-ORF3, Rvl758 Par séquence nucléotidique selon la présente invention, on entend aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Plus particulièrement, les séquences nucléotidiques ci-dessus énumérées sont regroupées en régions nucléotidiques selon la répartition suivante - RD5 : Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, - RD6 . Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, - RD7: Rv1964, Rvl965, mce3, Rvl967, Rvl968, Rvl969, lprM, Rvl971, Rvl972, Rvl973, Rvl974, Rvl975, Rv1976c, Rvl977, - RD8 : ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, - RD9 : cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075, - RD10 : echA1, Rv0223 c, - RvD 1 . RvD 1 -ORF1, RvD 1 -ORF2, Rv2024c, - RvD2 : pIcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, Rv1758. De façon intéressante, 3 des délétions (RD5, RD6 et RD8) contiennent 6 gènes codant pour des protéines PE et PPE. Comme il a été suggéré que ces protéines ont un rôle éventuel dans la variation antigénique (Cole et al., 1998), on peut en déduire que ces loci peuvent représenter des sites d'hypervariabilité entre les souches tuberculeuses. Au moins 9 protéines susceptibles d'être exportées ou exposées à la surface sont codées par RD4 à RD10, ce qui indique que ces polypeptides ont peut-être un rôle important dans la reconnaissance immunitaire du bacille. Il a en effet été montré que des polypeptides sécrétés peuvent avoir un rôle de stimulateur potentiel dans le système immunitaire et ils sont susceptibles de jouer un rôle d'antigènes connus pour intervenir pendant l'étape précoce de l'infection (Elhay et al., 1998 ; Horwitz et al., 1995 ; Rosenkrands et al., 1998). Le fait que RD5 et RD6 contiennent des gènes codant pour des protéines appartenant à la famille de ESAT-6 dont 14 sont organisées en 11 loci distincts est particulièrement significatif (F Tekaia, S. Gordon, T. Garnier, R Brosch, B G. Barrell and S T. Cole, soumis) ESAT-6 est un antigène à cellule T majeur qui semble être sécrété par le bacille tuberculeux virulent d'une manière indépendante du peptide signal (Harboe et al., 1996). Il s'accumule dans le milieu extracellulaire pendant les phases précoces de croissance et son gène est localisé dans RDI, une région qui est délétée du génome de M bovis BCG (Mahairas et al., 1996 ; Philipp et al., 1996). 3 des 10 régions RD contiennent ainsi des gènes de la famille de ESAT-6, ce qui indique que d'autres sites de gènes ESAT-6 peuvent aussi donner lieu à des délétions ou des réarrangements. La séquence génomique de M. tuberculosis H37Rv a par ailleurs révélé la présence de 4 gènes hautement apparentés codant pour des enzymes de phospholipase C appelées plcA, plcB, plcC et plcD (Cole et al., 1998) La phospholipase C a été reconnue comme facteur de virulence important dans un certain nombre de bactéries incluant Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes et Pseudomonas aeruginosa où elle joue un rôle intracellulaire dans la dissémination des cellules bactériennes, dans la survivance intracellulaire et dans la cytolyse (Titball, 1993). La délétion RD5 englobe 3 gènes (plcA, plcB et plcC), cette région étant absente de M. bovis, M bovis BCG et M. microti. La mise en évidence de l'activité de la phopholipase C dans M tuberculosis, M microti et M bovis mais pas dans M. bovis BCG, a été précédemment décrite (Johansen et al., 1996 ; Wheeler et Ratledge, 1992) ainsi que le rôle des enzymes codées par plcA et plcB (également connues sous la dénomination mpcA et mpcB) dans l'hydrolyse à la fois de la phosphatidylcholine et de la sphingomyéline. Les niveaux de l'activité de phospholipase C détectés dans M. bovis sont très inférieurs à ceux observés dans M. tuberculosis qui sont en concordance avec la perte de plcABC, l'activité de la sphingomyélinase étant encore détectable. Les données de séquences présentées ici montrent que la phospholipase dans sa pleine longueur est codée par le gène plcD dans M bovis BCG-Pasteur et que son importante similarité de séquence avec les produits de plcA et plcB indique qu'elle est probablement dotée à la fois d'une activité phospholipase et d'un activité sphingomyélinase. Il est donc probable que plcD puisse être responsable de l'activité résiduelle de phospholipase C dans les souches présentant la délétion RD5, tel que M. bovis, bien qu'il soit difficile de relier cette interprétation avec l'absence observée de phospholipase C en dépit de la présence de sphingomyélinase dans la souche de M. bovis BCG utilisée dans d'autres études (Johansen et al., 1996 ; Wheeler et Raledge, 1992). Les études de l'expression avec le gène plcD cloné devrait clarifier ce point. Le gène mce a été décrit par l'équipe de Riley comme codant pour une protéine putative de M tuberculosis de type invasine, dont l'expression dans E. coh permet l'invasion des cellules HeLa (Arruda et al., 1993). 3 autres protéines Mce ont été identifiées comme parties du projet de séquençage du génome avec leur gène occupant la même position dans quatre grands opérons très conservés comprenant au moins huit gènes (Cole et al., 1998 ; Harboe et al., 1996) Il est difficile de déduire les effets de la perte de mce3 (RD7) sur M bovis, M. microti et M bovis BCG du fait que les trois copies de mce restantes pourraient complémenter toute perte d'activité, à moins que les opérons ne soient exprimés différentiellement. Cependant, il est intéressant de noter que RD7 est absent de certains membres du complexe de M. tuberculosis qui ne sont pas virulents pour l'Homme suggérant que RD7 puisse jouer un rôle spécifique dans la maladie humaine Le génome de M. tuberculosis H37Rv code également pour six protéines (EphA-F) qui montrent une similarité avec des hydrolases époxydes tandis qu'au moins 21 hydratases énoyle CoA (EchAl-21) et de multiples aldéhydes déshydrogénases sont présentes (Cole et al., 1998). La perte de ephA (RD8), echAl et l'aldéhyde déhydrogénase codée par Rv0223 c (RD 10) chez M bovis BCG / M. bovis peut donc être compensée par d'autres enzymes bien que la spécificité du substrat des enzymes de M tuberculosis est inconnue. Les hydrolases époxydes sont généralement considérées comme des enzymes de détoxification ; un récent rapport a encore montré qu'elles jouent un rôle dans l'activation des leucotoxines (Moghaddam et al., 1997), un acide gras toxique produit par les leucocytes qui sont impliqués dans le syndrome de détresse respiratoire chez l'adulte Cependant, la question de savoir si les hydrolases époxydes de M tuberculosis peuvent modifier chimiquement des chimiokines hôtes est sans réponse. Alternativement, elles peuvent jouer un rôle dans la détoxification lipidique des produits de peroxydation générés par les radicaux oxygènes à partir de macrophages activés. RD9 est une région délétée des génomes de M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG et M. microti comparativement à M. tuberculosis. En conséquence, en opposition avec les autres régions RD, la localisation de M. africanum est proche de M bovis, ce qui indique la présence de cette souche entre M. tuberculosis et M bovis (Heifets et Good, 1994). De façon similaire, la région RD4 peut différencier M microti des souches bovines (Tableau 2). Ainsi, les protéines codées par RD4 à RD10 peuvent donc présenter des antigènes intéressants, permettant la discrimination d'individus vaccinés par le BCG de patients infectés par M tuberculosis. Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique, b) détection des séquences d'ADN de la mycobactérie présente dans ledit échantillon biologique, c) analyse desdites séquences De préférence, dans le cadre de la présente invention, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple du sérum humain ou animal, du sang, une biopsie, du liquide broncho-alvéolaire ou du liquide pleural. L'analyse des séquences recherchées peut par exemple être réalisée par une électrophorèse sur gel d'agarose Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l'ADN de mycobactérie. Cette analyse peut également être réalisée par la technique d'hybridation moléculaire en utilisant une sonde nucléique Cette sonde sera avantageusement marquée par un élément non radioactif(sonde froide) ou radioactif. Avantageusement, la détection des séquences d'ADN des mycobactéries sera réalisée au moyen de séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences d'ADN. A titre d'exemple, il pourra s'agir de sondes nucléotidiques marquées ou non marquées ; il pourra également s'agir d'amorces en vue d'une amplification La technique d'amplification utilisée peut être la PCR mais également d'autres techniques alternatives comme la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brins, la technique TAS (Transcription-based Amplification System), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) ou la technique TMA (Transcription Mediated Amplification). Les amorces conformes à l'invention ont une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18 avec - le couple SEQ ID N 1 / SEQ ID N 2 spécifique de RD4, - le couple SEQ ID N 3 / SEQ ID N 4 spécifique de RD5, - le couple SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 spécifique de RD6, - le couple SEQ ID N 7 / SEQ ID N 8 spécifique de RD7, - le couple SEQ ID N 9 / SEQ ID N 10 spécifique de RD9, - le couple SEQ ID N 11 / SEQ ID N 12 spécifique de RD9, - le couple SEQ ID N 13 / SEQ ID N 14 spécifique de RD 10, - le couple SEQ ID N 15 / SEQ ID N 16 spécifique de RvD 1, et - le couple SEQ ID N 17 / SEQ ID N 18spécifique de RvD2, Dans une variante, l'invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG / M bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique à analyser avec au moins un couple d'amorces tel que défini ci-dessus, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, b) amplification de l'ADN de la mycobactérie, c) mise en évidence de l'amplification des fragments d'ADN. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés par une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, par une électrophorèse capillaire ou encore par une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions). La spécification de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant des sondes, des plasmides contenant ces séquences ou leur produit d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactif dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquences complémentaires à celles desdits fragments nucléotidiques amplifiés. Ces sondes et amplicons peuvent être marqués ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives telles que des enzymes ou des éléments fluorescents La présente invention a également pour objet un kit pour la détection et l'identification discriminante de M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les élément suivants : a) au moins un couple d'amorces tel que défini ci-dessus, b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, c) éventuellement, les éléments nécessaires permettant de vérifier ou comparer la séquence et/ou la taille du fragment amplifié. En effet, dans le cadre de la présente invention, en fonction du couple d'amorces utilisé, on peut obtenir des résultats très différents Ainsi l'utilisation d'amorces internes à la délétion, telles qu'elles sont décrites dans la présente invention pour RD4, RD5 et RD8, fait qu'aucun produit d'amplification n'est détectable chez M. bovis BCG Cependant, l'utilisation d'amorces externes à la zone de délétion ne donne pas nécessairement le même résultat, en ce qui concerne par exemple la taille du fragment amplifié, en fonction de l'importance de la zone délétée chez M. bovis BCG. Ainsi, l'utilisation du couple d'amorces SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 pour la détection de RD6 est susceptible de donner lieu à un amplicon chez M bovis BCG d'environ 3 801 pb alors que la mise en #uvre du couple d'amorces SEQ ID N 11 / SEQ ID N 12 pour la détection de RD9 donnera lieu chez M. bovis BCG à un amplicon d'environ 1 018 pb L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un couple d'amorces tel que défini ci-dessus pour l'amplification de séquences d'ADN de M. bovis BCG 1 M. bovis ou M. tliberclilosis. L'intérêt de l'utilisation de plusieurs couples d'amorces sera bien évidemment de croiser les résultats obtenus avec chacun d'eux pour affiner le résultat de l'analyse En effet, lorsqu'il est indiqué, dans le cadre de la présente invention, que certaines délétions sont spécifiques de M. bovis BCG / M. bovis, cela n'est pas tout à fait exact puisque certaines d'entre elles sont également retrouvées chez M microti OV254, chez M. tuberculosis CSU#93 et chez M. africanum ainsi que chez certains isolats cliniques (Tableau 2). Ainsi, l'utilisation du couple d'amorces SEQ ID N 1 / SEQ ID N 2 spécifique de la région RD4 ne donnera pas lieu à des amplicons de taille normale avec M. bovis BCG / M. bovis dans l'échantillon biologique. En revanche si le couple d'amorces utilisé est SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 spécifique de RD6 et que des amplicons de taille normale ne sont pas retrouvés, il ne sera pas possible, à partir de ce seul résultat, de discriminer entre la présence, dans l'échantillon biologique, de M. bovis BCG / M. bovis, M. microti OV254 et M. tuberculosis CSU#93. La discrimination sera plus radicale quand il s'agira de déterminer si la mycobactérie présente dans l'échantillon biologique à analyser est M bovis BCG / M. bovis ou M. tuberciilosis H37Rv car les couples d'amorces SEQ ID N 15 / SEQ ID N 16 et SEQ ID N 17 / SEQ ID N 18 ne sont spécifiques que de M. tuberculosis H37Rv. Par conséquent, l'absence d'amplicon de taille normale lors de l'utilisation de l'un ou l'autre de ces couples d'amorces pourra être considérée comme significative de la présence de M tuberculosis H37Rv dans l'échantillon biologique analysé. La présente invention a également pour objet les produits d'expression de tout ou partie des séquences nucléotidiques délétées du génome de M bovis BCG / M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou inversement telles qu'énumérées dans le Tableau 1. Par produit d'expression , on entend toute protéine, polypeptide ou fragment polypeptidique résultant de l'expression de tout ou partie des susdites séquences nucléotidiques et de préférence présentant ou moins l'une des caractéristiques suivantes - capable d'être exporté ou sécrété par une mycobactérie et ou d'être induit ou réprimé lors de l'infection par la mycobactérie, et/ou - capable d'induire, de réprimer ou de moduler directement ou indirectement, un facteur de virulence de mycobactérie, et /ou - capable d'induire une réaction d'immunogénicité dirigée contre une mycobactérie, et/ou - capable d'être reconnu par un anticorps spécifique de mycobactérie. En effet, la présente invention a également pour objet un procédé de détection discriminante in vitro d'anticorps dirigés contre M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un produit d'expression tel que ci-dessus défini, b) mise en évidence du complexe antigène - anticorps formé. L'invention a également pour objet un procédé de détection discriminante d'une vaccination avec M. bovis BCG ou d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère, comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'un échantillon biologique contenant des cellules, plus particulièrement des cellules du système immunitaire dudit mammifère et plus particulièrement encore, des cellules T. b) incubation de l'échantillon biologique de l'étape a) avec au moins un produit d'expression conforme à la présente invention, c) détection d'une réaction cellulaire indiquant une sensibilisation préalable du mammifère audit produit, notamment la prolifération cellulaire et/ou la synthèse de protéines telles que l'interféron gamma. La prolifération cellulaire pourra être mesurée par exemple par incorporation de 3H-Thymidine. L'invention concerne également un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par M tuberculosis chez un mammifère éventuellement préalablement vacciné avec M bovis BCG comprenant a) un produit d'expression conforme à la présente invention, b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, c) les réactifs permettant la détection des complexes antigène - anticorps produits par la réaction immunologique, d) le cas échéants, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par ledit produit, e) le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticorps reconnus par ledit produit. Les réactifs permettant la détection des complexes antigène anticorps peuvent porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'anticorps utilisé n'est pas marqué. L'invention a également pour objet des anticorps mono- ou polyclonaux, leurs fragments ou anticorps chimériques, capables de reconnaître spécifiquement un produit d'expression conforme à la présente invention. La présente invention concerne donc également un procédé pour la détection discriminante de la présence d'un antigène de M bovis BCG / M. bovis ou de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps conforme à l'invention, b) mise en évidence du complexe antigène - anticorps formé. L'invention concerne également le kit pour la détection discriminante de la présence d'un antigène de M. bovis BCG / M bovis ou de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les éléments suivants : a) un anticorps conforme à l'invention, b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, c) les réactifs permettant la détection des complexes antigène - anticorps produits par la réaction immunologique. Les réactifs ci-dessus mentionnés sont bien connus de l'homme du métier qui n'aura aucune difficulté à les adapter au contexte de la présente invention. L'invention a également pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit d'expression conforme à l'invention. Avantageusement, la composition immunogène conforme à l'invention entre dans la composition d'un vaccin lorsqu'elle est présentée en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement avec un ou plusieurs adjuvant(s) de l'immunité tel que l'alun ou un représentant de la famille des muramylpeptides ou encore d'adjuvant incomplet de Freund. L'invention vise également un vaccin comprenant au moins un produit d'expression conforme à l'invention en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et le cas échéant, un ou plusieurs adjuvant(s) de l'immunité approprié(s). Les connaissances standards sur l'évolution du complexe de M. tuberculosis sont basées sur l'hypothèse que M tuberculosis est dérivé de M bovis (Sreevatsan et al., 1997). Cependant, la distribution de RDI à RD10 parmi le complexe tuberculeux suggère qu'une évolution linéaire de M. tuberculosis à partir de M. bovis est trop simpliste. Il apparaît en effet, de façon plus probable, que les deux bacilles sont dérivés d'une souchemère commune que les délétions reflètent donc l'adaptation des bacilles à leur niche particulière, c'est-à-dire que la perte de RD4 à RD10 a probablement aidé M. bovis à devenir un agent pathogène des bovins plus puissant que M. tuberculosis. Des études génomiques fonctionnelles détermineront quel rôle ces délétions jouent dans la différentiation phénotypique du complexe tuberculeux Enfin, les inventeurs ont mis en évidence, toujours par la comparaison du BAC de M. tuberculosis H37Rv et du BAC de M. bovis BCG deux duplications dans le génome de M bovis BCG-Pasteur, appelées DU! et DU2. II s'agit de duplications de régions de plusieurs dizaines de kilobases qui semblent être absentes à la fois de la souche type de M. bovis et de M tuberculosis H37Rv. La mise en évidence de ces deux duplications a été faite suite à une digestion des mêmes clones pour chaque BAC avec HmdIII et une analyse sur gel d'électrophorèse en champs pulsé (PFGE). Ces observations ont été confirmées par hybridation de l'ADN chromosomique digéré issu deM bovis BCG, de la souche type de M. bovis et M tuberculosis H37Rv avec des sondes sélectionnées couvrant les régions dupliquées. Des amorces spécifiques pour les régions réarrangées ont été préparées et testées sur l'ADN génomique à partir d'isolats additionnels de M bovis BCG et M. tuberculosis. Il a été déterminé que DU1 et DU2 étaient présentes chez trois souches de M. bovis BCG y compris chez M. bovis BCG-Pasteur et absentes de trois autres sous-souches de M. bovis BCG. Ces deux duplications sont également absentes de la souche type de M bovis et de M tuberculosis H37Rv. Ainsi, toujours dans le cadre de la présente invention relativement à la détection discriminante de M. bovis ou M. tuberculosis, l'invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes - la digestion par une enzyme de restriction d'au moins une partie du génome de la mycobactérie présente dans l'échantillon biologique à analyser, et - l'analyse des fragments de restriction ainsi obtenus. La digestion par une enzyme de restriction peut en effet être réalisée soit sur l'intégralité du génome de la mycobactérie, soit sur un ou plusieurs clones de la banque réalisées à partir du génome en question. Préférentiellement, l'enzyme de restriction utilisée dans le cadre du susdit procédé est HindIII. En ce qui concerne l'analyse des fragments de restriction, celle-ci peut consister à compter lesdits fragments et/ou à déterminer leur longueur. En effet, comme ceci est expliqué ci-après, la digestion par HindIII de M bovis BCG donne lieu à un fragment de plus que ceux obtenus après digestion par Hindlll du génome de M tuberculosis H37Rv. Le nombre des fragments ainsi obtenus peut également être complété par la détermination de leur longueur. Ceci peut être réalisé au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple sur un gel d'électrophorèse en champs pulsé (PFGE). Il a ainsi pu être déterminé que le fragment supplémentaire apparaissant après digestion par HindIII du génome de M bovis BCG-Pasteur présentait une taille d'environ 29 kb. Une autre façon d'analyser les fragments de restriction résultant de la digestion enzymatique du génome de la mycobactérie telle que ci-dessus décrite, consiste à mettre en contact lesdits fragments avec au moins une sonde appropriée, couvrant par exemple la région dupliquée, dans des conditions d'hybridation afin d'identifier ensuite le nombre et la taille des fragments qui ont hybridé Les sondes utilisées à cette fin peuvent être marquées ou non marquées selon les techniques bien connues de l'homme du métier. LEGENDES DES FIGURES FIGURE 1 : Carte du BAC de Mycobacterium bovis BCG Pasteur superposée au BAC de M tuberculosis H37Rv et aux cartes de cosmide Les clones X correspondent aux clones dans pBeloBACll de M bovis BCG, les clones XE correspondent aux clones dans pBACe3. 6 de M. bovis BCG, les clones Rv correspondent aux clones dans pBeloBACll de M. tuberculosis, les clones Y correspondent aux clones dans le cosmide pYUB328 de M. tuberculosis et les clones I correspondent aux clones dans le cosmide pYUB412 de M tuberculosis. La localisation de chaque région de délétion est montrée sur la carte Les barres d'échelle indiquent la position sur le génome de M. tuberculosis. FIGURES 2A à 2F . Vue générale des régions délétées RD5- RD10 Les régions délétées à partir du génome de M tuberculosis sont délimitées par des flèches avec une séquence flanquant chaque délétion. Les ORF (cadres ouverts de lecture) sont représentés par des boîtes dirigées montrant le sens de la transcription comme précédemment décrit (Cole et al., 1998). Les fonctions putatives et les familles des ORF sont décrites dans le Tableau 3 Les codons stop sont indiqués par de petites barres verticales. FIGURE 3 . Détection de la délétion RD5 Des digestions du clone Rvl43 du BAC avec les endonucléases EcoRI, PstI et StuI ont révélé que des fragments de 1,5 kb (EcoRI), 1,5 kb (Pstl), 1,3 et 2,7 kb (Stul) ne montraient aucune liaison avec des sondes d'ADN de M. bovis ou de M bovis BCG (les bandes manquantes sont indiquées par des flèches) La taille en kilobases (kb) est indiquée sur la gauche. FIGURE 4 : Les régions RvDlet RvD2. A. Polymorphisme de taille dans des amplicons générés par des amorces flanquant (i) RvDl et (ii) RvD2. Des réactions de PCR ont été réalisées au moyen du kit GeneAmp XL PCR (Perkin Elmer) avec des matrices d'ADN de M. tuberculosis H37Rv, M. bovis et M. bovis BCG Pasteur en combinaison avec des amorces décrites dans le Tableau 3. La taille en kilobases est indiquée à gauche de chaque image. B. Structure des ORF des loci de RvD1 et RvD2. La séquence des deux loci a été déterminée à partir de M. bovis BCG Pasteur, la séquence flanquante dans M. tuberculosis H37Rv étant montrée. Les fonctions putatives des ORF sont décrites dans le Tableau 1 avec des barres verticales représentant les codons stop. FIGURE 5 : Région dupliquée DU1 dans M. bovis BCG-Pasteur comparativement à la même région dans M tuberculosis H37Rv FIGURE 6 . Région dupliquée DU2 dans M. bovis BCG-Pasteur comparativement à la même région dans M. tuberculosis H37Rv La présente demande ne se limite pas à la description ci-dessus et sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne doivent en aucune manière être considérés comme limitant la présente invention. EXEMPLES I. PROCEDURES ET RESULTATS Construction d'une banque BAC de M. bovis BCG-Pasteur Des tentatives précédentes pour cloner des inserts très larges d'ADN mycobactériens (120-180 kb) dans le vecteur pBeloACll se sont soldées par un échec (Brosch et al., 1998). Pour déterminer si cette détermination de taille était due au vecteur pBeloBAC 11, les inventeurs ont testé en parallèle le vecteur pBACe3. 6 de BAC qui utilise le système de sélection sacB (Lawes et Maloy, 1995 ; Pelicic et al., 1996). Des ligatures réalisées avec des fragments dans des gammes de taille de 50-125 kb ont donné 5 à 10 fois moins de transformants dans pBACe3. 6 que les ligatures contrôle utilisant pBeloBACll (clones X) La taille d'un insert dans les clones pBACe3 6 était approximativement comprise dans l'intervalle 40- 100 kb, similaire à ce qui avait été observé pour pBeloBACl1. Ceci suggère qu'une taille d'environ 120 kb est bien la taille limite supérieure pour la faisabilité du clonage d'ADN mycobactérien. Définition du jeu minimum des BACs de BCG 100 clones sélectionnés au hasard à partir des banques de pBeloBACll et de pBACe3. 6 ont été séquences aux extrémités pour déterminer leur position par rapport au chromosome de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998). Ceci a donné un réseau minimum de clones sur le génome mais avec un groupement préférentiel au voisinage de l'unique opéron rrn, ce qui a également été observé durant la construction de la carte du BAC de M tuberculosis (Brosch et al , 1998). Pour combler les trous entre les clones positionnés, des amorces de PCR ont été élaborées, sur la base de la séquence du génome complet de M. tuberculosis, de façon à cribler des pools de BAC pour des clones spécifiques. En utilisant cette méthodologie, des clones couvrant plus de 98 % du génome ont été isolés et positionnés sur la séquence du génome de M. tuberculosis. Un jeu minimum de 57 clones de BAC de M. bovis BCG a été nécessaire pour couvrir le génome (Figure 1). 56 de ces clones proviennent de la banque pBeloBACllet 1 provient de la banque de pBACe3. 6, à savoir XE015 (à environ 680 kb). Du fait que des expériences antérieures avaient montré que les clones de M tuberculosis basés sur pBeloBAC 11 présentaient une exceptionnelle stabilité (Brosch et al., 1998), ces clones ont été préférés au système pBACe3. 6 moins caractérisé. Le clone XE015 représente une région pour laquelle les clones de pBeloBACl1 ne pouvaient pas être trouvés. Deux zones d'environ 36-52 kb, couvertes par aucun clone, sont localisées à environ 2 660 kb et environ 2 960 kb sur le génome. Précédemment, l'isolement de cosmides et de clones de BAC de M tuberculosis qui couvraient la région à environ 2 960 kb a posé des problèmes (Brosch et al., 1998) suggérant que cette région pourrait contenir des gènes qui sont préjudiciables à E. coli. Utilisation des puces BAC pour détecter des délétions dans le génome de M. bovis BCG Il s'agit de la mise en évidence, à partir de la banque de BAC de M. tuberculosis H37Rv, de 63 clones couvrant 97 % du génome (Brosch et al., 1998). L'analyse in silico de la séquence du génome de M tuberculosis a révélé que la digestion de ces clones avec soit PvuII ou EcoRI donnait lieu à un nombre raisonnable de fragments de restriction pour chaque clone. Les fragments digérés ont migré à travers des gels d'agarose, ont donné lieu à des spots sur des membranes et ont ensuite été hybridés avec de l'ADN génomique marqué au 32P de M. bovis BCG et M. bovis. Les fragments de restriction qui n'ont pas hybridé avec les sondes d'ADN ont été considérés comme manquant dans les génomes de M. bovis ou BCG. Comme le criblage initial n'employait que deux enzymes, il est possible que d'autres délétions soient passées inaperçues. Cependant, il est probable que toutes les délétions importantes (> 5 kb) ont été détectées par cette approche. A partir d'une analyse de l'ensemble du génome, 10 loci ont été identifiés qui semblent être absents dans M. bovis BCG par rapport à M. tuberculosis. Des hybridations avec l'ADN génomique de M. bovis ont révélé que 7 de ces loci étaient également délétés dans M. bovis par rapport à M. tuberculosis. Une analyse plus serrée a révélé que les trois délétions spécifiques de M. bovis BCG étaient identiques aux régions RDI-RD3 définies par l'équipe de Stover (Mahairas et al., 1996) en gardant la précédente nomenclature, les 7 délétions M bovis / BCG ont été désignées RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RDI 0 (Figures 1 et 2). Les réactions de séquençage utilisant les clones de BAC correspondant en tant que matrice ont été utilisées pour définir précisément les zones terminales des délétions (Figure 2, Tableau 1). RD4 RD4 est une délétion de 12,7 kb précédemment caractérisée comme une région absente de M. bovis et M. bovis BCG des sous-souches Pasteur, Glaxo et Danemark (Brosch et al., 1998). Parmi les protéines codées par les 11ORFs, certaines montrent des ressemblances avec des enzymes impliquées dans la synthèse des lipopolysaccharides. Pour déterminer si RD4 était délété seulement dans les souches bovines, M africanum, M. microti, M. tuberculosis CSU#93 et 27 isolats cliniques de M. luberculosis ont été examinés pour la présence du locus (Tableau 2) Des réactions de PCR utilisant des amorces internes à RD4 (Tableau 3) n'ont généré que des produits dans des souches non bovines. RD5 RD5 a une taille de 8 964 pb localisée entre les positions génomiques 2626067-2635031 (Figure 3, Tableau 1) La région contenait 8 ORFs (Tableau 1), trois d'entre elles : pIcA, plcB et plcC, codent pour des enzymes de phospholipase C tandis que deux autres codent pour des protéines appartenant respectivement aux familles de ESAT-6 et QILSS (Cole et al., 1998 ; F Tekaia, S. Gordon, T Garnier, R. Brosch, B.G. Barrell et S T. Cole, soumis). L'ORF Rv2352c code pour une protéine PPE qui est un membre de la grande famille des protéines dans M. tuberculosis (Cole et al., 1998). Une autre protéine de la famille de PPE (Rv2352c) est tronquée dans M. bovis BCG du fait que l'une des délétions des parties terminales est située dans l'ORF. Des recherches dans les bases de données ont révélé qu'un segment de 3 013 pb de RD5 était virtuellement identique au locus mpt40 précédemment décrit, montré par Pattaroyo et al comme étant absent chez M. bovis et M. bovis BCG (Leao et al., 1995) Des amorces destinées à amplifier la partie interne de RD5 (Tableau 3) ont été utilisées dans des réactions de PCR avec de l'ADN issu de bacilles tuberculeux variés. Des amplicons n'ont pas été produits à partir des matrices de M. bovis, M. bovis BCG et M. microti (Tableau 2) indiquant que M. microti est également dépourvu du locus RD5. RD6 RD6 a été cartographiée au niveau de la séquence d'insertion ISI532, un élément IS qui est manquant chez M. microti, M. bovis et M bovis BCG (Gordon et al., 1998) (Tableau 1). La délimitation de la taille de la délétion a été compliquée par la présence de régions répétées flanquant directement l'élément IS et nécessitant l'utilisation d'amorces en dehors de la région répétée (Tableau 3). Ces amorces ont amplifiées des produits chez M. bovis et M. bovis BCG qui sont plus petits d'environ 5 kb que l'amplicon de M. tuberculosis. La marche à l'aide d'amorce a été utilisée pour localiser précisément les jonctions de délétions et a révélé une délétion de 4 928 b chez M. bovis et M. bovis BCG (position génomique de M tuberculosis 3846807-3841879). A l'instar de l'élément IS1532, il a été déterminé que RD6 contenait deux gènes codant pour des protéines PPE (Rv3425 et Rv3426) et une partie de Rv3424c dont la fonction est inconnue (Tableau 1). RD7 La délétion RD2 décrite dans Mahairas et al (Mahairas et al., 1996) a été cartographiée dans le clone Rv420 de M. tuberculosis et les résultats obtenus par les inventeurs ont suggéré l'existence d'une délétion supplémentaire chez M bovis BCG très proche de RD2. Des hybridations ont été répétées utilisant de l'ADN génomique de M. bovis en tant que sonde puisque cette souche contient des séquences RD2, simplifiant ainsi l'identification d'autres fragments délétés. Cette analyse (Figure 2) a révélé une délétion de 12 718 pb chez M bovis BCG par rapport à M tuberculosis, localisée 336 pb en amont de RD2, aux positions 2208003-2220721 sur le génome de M. tuberculosis. La région RD7 contient 14 ORFs (Tableau 3). 8 d'entre eux (Rvl964-1971) constituent une partie de l'opéron avec le gène putatif d'invasine mce3 (Cole et al., 1998). Les ORFs Rvl968, Rvl969, Rvl971, Rvl973 et Rvl975 pourraient coder pour d'éventuelles protéines exportées ou exprimées à la surface puisqu'ils contiennent des séquences signal N-terminales putatives ou des ancrages membranaires. Elles sont toutes membres de la famille Mce et ont des propriétés communes (Tekaia et al., soumis). De façon intéressante, Mce3 et Rvl968 contiennent le tripeptide RGD ou Arg-Gly-Asp, un motif impliqué dans l'attachement cellulaire (Ohno, 1995 ; Relman et al., 1989). Rvl977, qui est tronqué par RD7, code pour une protéine présentant des similarités (38,5 % d'identité sur 275 acides aminés) avec un polypeptide hypothétique et la souche PCC 6803 de Synechocystis. Une analyse PCR (Tableau 2) a révélé que RD7 était présent dans 30 isolats cliniques de M tuberculosis ainsi que dans M africanum et M tuberculosis CSU#93. Le locus était cependant absent de M microti, M. bovis et M. bovis BCG. RD8 RD8 englobe une région de 5 895 pb positionnée sur la séquence génomique de M tuberculosis à 4556836-4062731. La délétion contient 6 ORFs (Figure 2, Tableau 1) avec une septième ORF : lpqQ qui code pour une lipoprotéine tronquée à son extrémité 5' par la délétion. Parmi ces 6 ORFs, Rv3619c et Rv3620c codent pour des membres des familles de ESAT-6 et QILSS (Cole et al., 1998, Harboe et al., 1996 ; F. Tekaia, et al., soumis) et 2 autres ORFs codent pour des protéines PE et PPE. Les 2 autres ORFs, ephA et Rv3618, codent pour une hydrolase époxyde putative et une monooxygénase respectivement. L'analyse PCR dirigée contre un segment interne de RD8 (Tableau 2) a révélé que la région était également délétée chez le type sauvage de M. bovis et M. microti. RD9etRD10 La délétion de 2 030 pb englobée par RD9 couvre 2 ORFs, Rv2037c et Rv2074, qui codent vraisemblablement pour une oxydoréductase et une protéine inconnue respectivement (Tableau 1). 2 ORFs additionnelles sont tronquées par RD9 : code pour une protéine exportée putative tandis que cobL code pour une méthyltransférase précorrine impliquée dans la synthèse de la cobalamine. L'analyse PCR avec des amorces flanquantes (Tableau 3) a révélé que RD9 est également présent chez M. africanum et M microti (Tableau 2). RD 10 est une délétion de 1 903 pb qui tronque 2 ORFs, echAlet Rv0223, qui codent une énoyl CoA hydratase et une aldéhyde déshydrogénase respectivement (Tableau 1). Des réactions de PCR ont révélé que RD10 était absent chez M. microti ainsi que chez M. bovis et BCG. D'autres différences entre M. tuberculosis et BCG Compte tenu du fait que les génomes des bacilles tuberculeux sont hautement conservés (Sreevatsan et al., 1997), la comparaison locale directe peut être entreprise d'une façon simple et ciblée en examinant les profils d'enzyme de restriction générés à partir des clones de BAC de M. tuberculosis et M. bovis BCG qui couvrent les mêmes régions. Une cartographie comparative de la zone englobée par le clone X318 a identifié cette zone comme étant très différente des clones correspondants de M. tuberculosis. Les données relatives aux séquences terminales à partir du clone X066 ont révélé que si sa séquence terminale SP6 permettait de le positionner à environ 2 380 kb sur la matrice de M. tuberculosis, la séquence terminale T7 ne générait aucune similarité significative avec une quelconque séquence de H37Rv, indiquant qu'une extrémité de X066 était interne au segment d'ADN présent dans BCG mais absent de H37Rv. Des amorces de séquençage ont été utilisées pour marcher le long du clone X318 du BAC de BCG (Figure 1) et ont révélé l'insertion à la position 2238724 pb dans le génome de M tuberculosis. Utilisées dans des réactions PCR, les matrices de M bovis BCG et M bovis ont généré des amplicons plus grands d'environ 5 kb que le produit de M. tuberculosis H37Rv (Figure 4A). L'insert entier, désigné RvDl, a été séquence à partir de X318 BCG. L'insert de 5 014 pb prolongé l'ORF, Rv2024c de M. tuberculosis de 2,8 kb et contenait un ORF additionnel, RvDl-ORF2, de 954 pb (Tableau 1, Figure 4B). RvD1-ORF1se superpose au point de jonction 5' de la délétion et s'étend à l'intérieur du DNA flanquant. L'analyse FASTA a révélé que RvD1-ORF1 et l'ORF2 codent pour des protéines ne présentant aucune similarité significative avec d'autres protéines dans les bases de données. Rv2024c étendu a montré certaines similarités (36,5 % d'identité sur 946 acides aminés) avec une protéine hypothétique d'Helicobacter pylori (n d'accession 025380). La perte de cette séquence n'a clairement aucune conséquence sur la virulence de M tuberculosis H37Rv puisque cette souche est pleinement virulente chez les modèles animaux. Une analyse PCR spécifique du locus a démontré sa présence dans plusieurs mais pas dans tous les isolats cliniques ainsi que dans toutes les souches BCG testées (Tableau 2). Un ORF codant pour une phopholipase, plcD, est interrompu par IS6110 dans M tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998) Pour déterminer si plcD était intact dans d'autres membres du complexe tuberculeux, des amorces qui flanquaient le site d'insertion IS6110 (Tableau 3) ont été utilisées dans des réactions de PCR avec M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis H37Rv. Ceci a révélé un polymorphisme au locus plcD où les amplicons de M. bovis et de M. bovis BCG étaient d'environ 5 kb plus grands que le produit de H37Rv (Figure 4A) Cette délétion d'environ 5 kb dans le génome de M. tuberculosis H37Rv par rapport à M. bovis BCG a été appelé RvD2. Le séquençage du clone X086 du BAC de M. bovis BCG a révélé que RvD2 était positionné entre les bases 1987699-19890045 dans le génome de M. tuberculosis. La région comprend 6,5 kb et contient 3 ORFs codant pour une protéine inconnue, une oxydoréductase et une protéine membranaire, et elle prolonge le gène plcD pour coder pour un produit de 514 acides aminés (Figure 4B, Tableau 1). II. DONNES EXPERIMENTALES Souches bactériennes et plasmides Les souches du complexe de M. tuberculosis (Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis et Mycobacterium bovis BCG) et soussouches de M. bovis BCG (Danemark, Glaxo, Russe, Japonais, Pasteur et Moreau) ont été obtenus à partir des stocks de laboratoires (Unité de G. M.B., Institut Pasteur). Mycobacterium tuberculosis CSU#93 a été reçu de John BELISLE, Department of Microbiology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523. Des isolats cliniques non épidémiques de M. tuberculosis ont été fournis par Beate HEYM, Hopital Ambroise Paré, 9 avenue Charles de Gaulle, 92104 BOULOGNE CEDEX, FRANCE. Les vecteurs de BAC pBeloBAC1 1 (Kim et al , 1996) et PBACe3. 6 (Genbank n d'accession U80929) ont été donnés par H. SHIZUYA, Department of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, CA, et P de JONG, Roswell Park Cancer Institute, Human Genetics Department, Buffalo, NY, respectivement. Les vecteurs et les recombinants dérivés ont été maintenus dans E. coli DH10B. Préparation de l'ADN génomique La préparation de l'ADN génomique dans des cubes d'agarose à partir de M. bovis BCG Pasteur a été réalisée comme indiqué précédemment (Philipp et al , 1996 ; Philipp et al , 1996) mais avec deux digestions à la protéinase K pendant 24 h chacune, plutôt qu'une digestion de 48 h. Les cubes ont été stockés dans 0,2 M EDTA à 4 C et lavés 2 fois dans 50 ml de Tris-EDTA (pH 8)/Triton X-100 (0,1%) à 4 C pendant 1 h, ensuite lavés 2 fois dans 50 ml d'un tampon d'enzyme de restriction Triton X-100 (0,1 %) pendant 1 h à température ambiante avant utilisation. Construction de la banque BAC Un vecteur d'ADN a été préparé comme précédemment indiqué (Woo et al., 1994). Des digestions partielles avec HindIII et EcoRI de l'ADN dans l'agarose, pour le clonage dans pBeloBACll et pBACe3.6 respectivement, et ensuite une migration en champs électrique homogène à contour serré (CHEF) ont été réalisées comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998). 5 zones, 50-75 kb, 75-100 kb, 100-125 kb, 125-150 kb et 150-170 kb ont été excisées à partir des gels d'agarose et stockées dans du TE à 4 C. Des ligatures avec les vecteurs pBeloBACl 1 et pBACe3. 6 et une transformation dans E. coli DH10B ont été réalisées comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998). Les transformants pBeloBAC11 ont été sélectionnés sur de l'agar LB contenant 12,5 g/ml de chloramphénicol, 50 g/ml de X-gal et 25 ug/ml d'IPTG, et ont été criblés avec des colonies recombinantes blanches Les transformants pBACe3 6 ont été sélectionnés sur de l'agar LB contenant 12,5 ug/ml de chloramphénicol et 5 % de sucrose. Les clones recombinant ont été repiqués, en deux exemplaires, dans des plaques microtitre à 96 puits contenant un milieu 2xYT avec 12,5 g/ml de chloramphénicol et ont été incubés toute la nuit à 37 C. Un volume égal de glycérol à 80% a alors été ajouté aux puits et une plaque a été conservée à -80 C en tant que plaque maîtresse. La plaque restante a été utilisée pour faire des ensembles de clones à des fins de criblage (voir ci-dessus). Préparation d'ADN à partir de recombinants et détermination de la taille des inserts Un recombinant portant un plasmide d'ADN a été préparé à partir de 40 ml de culture et a été mis en croissance sur le milieu 2xYT contenant 12,5 g/ml de chloramphénicol comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998) 100-200 ng d'ADN ont été digérés avec Dral (Gibco-BRL) et les produits de restriction ont été séparés sur un gel d'électrophorèse en champs pulsé (PFGE) avec un appareil CHEF de LKB-Pharmacia utilisant un gel d'agarose à 1 % (poids/volume) et une impulsion de 4 secondes pendant 15 h à 6,25 V/cm. Des marqueurs PFGE de taille moyenne et inférieure (New England Biolabs) ont été utilisés en tant que taille standard. Les tailles des inserts ont été estimées après coloration au bromure d'éthidium et visualisation avec de la lumière UV Réactions de séquençage Des réactions de séquençage ont été réalisées comme précédemment indiqué (Brosch et al , 1998). Pour des clones isolés à partir de la banque de pBeloBACl 1, les amorces SP6 et T7 ont été utilisées pour séquencer les extrémités des inserts, tandis que pour les clones pBACe3.6, les amorces dérivées du vecteur ont été utilisées. Les réactions ont été chargées sur des gels de polyacrylamide à 6 % et une électrophorèse a été réalisée avec un séquenceur d'ADN automatique 373A ou 377 (Applied Biosystems) pendant 10 à 12 h. Les réactions ont donné généralement entre 300 et 600 pb de séquences lisibles. Puces BAC Les clones qui se superposaient à partir de la banque pBeloBAC 11 de M tuberculosis H37Rv (Brosch et al., 1998) ont été sélectionnés de telle façon que 97 % du génome de M. tuberculosis étaient représentés. L'ADN préparé à partir de ces clones a été digéré avec EcoRI (Gibco-BRL) ou PvuII (Gibco-BRL) et a été mis à migrer dans des gels d'agarose à 0,8 %, de 25 cm de longueur, à un faible voltage pendant 12 à 16 h. Après coloration et visualisation aux UV, les gels d'agarose ont été traités avec la méthode Southern standard et les ADN ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose Hybond-C Extra (Amersham) L'ADN a été fixé à la membrane par chauffage à 80 C pendant 2 h. L'ADN génomique de M. tuberculosis H37Rv, Mycobacterium bovis ATCC 19210 et M bovis BCG Pasteur a été marqué avec [[alpha]-32P]dCTP au moyen du kit Prime-It II (Stratagene) Les sondes ont été purifiées à travers une colonne P10 (Biorad) avant utilisation. Des hybridations ont été réalisées à 37 C dans du formamide à 50 % comme précédemment décrit (Philipp et al., 1996). Les membranes ont été lavées pendant 15mn à température ambiante dans du 2xSSC/0,l % SDS et ensuite dans du lxSSC/0,1 % SDS et finalement dans du 0,1xSSC/0,1 % SDS. Les résultats ont été interprétés à partir des autoradiogrammes. En général, il a été difficile de visualiser sur les autoradiogrammes les fragments de moins de 1 kb, surtout après utilisation répétée des membranes. Les fragments supérieurs à 1 kb ont donné des résultats plus clairs. Les clones qui sont apparus comme contenant des fragments sans contrepartie dans M. bovis BCG ont été repiqués pour des analyses ultérieures. La séquence génomique a permis l'établissement de cartes de restriction dans le but de déterminer les zones de délétion suspectées, permettant de sélectionner des enzymes donnant la meilleure résolution des régions. Des clones pouvaient ainsi être digérés avec une seconde gamme d'enzymes (généralement PstI et StuI, avec EcoRI inclus en tant que contrôle) et hybridés pour obtenir une taille plus précise de la délétion. Les amorces de séquençage qui flanquent les délétions ont ainsi été désignées et utilisées dans les réactions de séquençage avec le BAC correspondant de M bovis BCG utilisé comme matrice. Analyses PCR Les amorces utilisées dans les réactions de PCR sont listées dans le Tableau 1. Les réactions pour des produits attendus de moins de 3 kb ont été réalisées avec une polymérase Taq standard (Boehringer Mannheim). Les réactions mettaient en #uvre 5 l de tampon 10xPCR (100 mM de P-mercaptoéthanol, 600 mM de Tris HC1, pH 8,8), 20 mM de MgCl2, 170 mM de (NH4)ZS04, 5 gel de mélange nucléotidique à 20 mM, 0,2 M de chaque amorce, 10-50 ng de matrice d'ADN, du DMSO à 10 %, 0,5 unités de polymérase Taq et de l'eau distillée stérile à 50 l. Les cycles thermiques ont été réalisés avec un amplificateur PTC-100 (MJ Inc. ) avec une étape de dénaturation initiale de 90 secondes à 95 C suivie par 35 cycles de 30 secondes à 95 C, 1 min à 55 C et 2 min à 72 C. Les réactions de PCR susceptibles de donner lieu à des produits supérieurs à 3 kb ont été réalisées au moyen du kit de PCR GeneAmp XL (Perkin Elmer). Les réactions ont été lancées selon les instructions des fabricants, avec 0,8 mM de Mg(OAc)2, 0,2 M de chaque amorce et 10-30 ng de matrice d'ADN par réaction Les cycles thermiques étaient réalisés à 96 C pendant 1 mn, suivis ensuite par 15 cycles en 2 étapes à 94 C pendant 15 secondes et 70 C pendant 7 mn, suivis par 20 cycles en 2 étapes à 94 C pendant 15secondes et 70 C pendant 8 mn plus 15secondes par cycle. Analyse informatique Les données concernant les séquences ont été transférées du séquenceur automatisé ABI373A aux stations de travail Digital ou Sun et éditées au moyen du logiciel TED à partir de l'ensemble Staden. Les séquences éditées ont été comparées à la base de données des inventeurs concernant M. tuberculosis (H37Rv. dbs) pour déterminer les positions relatives des séquences terminales sur la séquence du génome de M tuberculosis. Avec cette méthode, une cartographie des clones BAC de M bovis BCG a été construite en utilisant la séquence de M. tuberculosis H37Rv comme matrice. Pour faire de la comparaison génomique, des digestions in silico au moyen d'enzymes de restriction ont été réalisées avec le logiciel NIP (Nucleotide Interprétation Program) à partir de l'ensemble Staden. Le programme Display and Analysis (DIANA) du Centre Sanger, Cambridge, UK, a été utilisé pour interpréter les données de séquence. Numéros d'accession des séquences d'ADN Les séquences nucléotidiques qui flanquent chaque locus RD dans M bovis BCG ont été déposées dans la base données EMBL Les numéros d'accession pour RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RDI 0 sont respectivement AJ007300, AJ131209, AJ007301, AJ131210, Y181604 et AJ132559. Les séquences de RvDl et RvD2 dans M. bovis BCG ont été déposées sous les n Y18605 et U18606 respectivement Mise en évidence de la région dupliquée DU1 DU1 a été la première région dupliquée observée quand les bandes de digestion par HindIII du clone X038 du BAC de BCG et du clone Rvl3 du BAC de H37Rv ont été comparées Les deux clones X038 et Rvl3 avaient des séquences terminales identiques, s'étendant de la position HindIII 4 367 kb au site HindIIT - 0 027 kb (via 4411529 b) sur la séquence du génome de M tuberculosis H37Rv (MTBH37RV), englobant l'origine de réplication. L'analyse in silico des sites de restriction HindIII pour la zone donnée entre - 4 367 kb et - 0 027 kb a révélé un site HindIII à la position -4 404 kb. En conséquence, la digestion de ces clones devrait montrer deux fragments de restriction plus la bande spécifique du vecteur à environ 7 kb. C'était le cas pour le clone Rvl3 de H37Rv. Au contraire, le clone X038 du BAC de BCG montrait trois bandes plus la bande spécifique du vecteur à environ 7 kb, deux d'entre elles étaient identiques au schéma de Rvl3. La bande additionnelle présente une taille d'environ 29 kb. Des analyses PFGE supplémentaires utilisant Dral ont révélé que X038 est bien de 29 kb plus long que Rvl3. Par un criblage PCR des pools de BAC de BCG utilisant des oligonucléotides sélectionnés, les inventeurs ont pu identifier trois clones X de plus couvrant les parties de cette région génomique dans BCG : X585, X592, X703. La séquence terminale et l'analyse PFGE ont montré que chacun de ces clones contient un insert de taille différente, correspondant aux trois bandes observées dans les résultats de digestion de X038 (Figure 1). Les séquences terminales sont : X585 (- 4 367-4 404 kb) ; X592 (# 4 404-4404 kb) , X703 (- 4 404-0 027 kb). Les séquences ont été répétées deux fois avec les mêmes résultats. Le curieux résultat selon lequel le clone X592 a des extrémités T7 et SP6 dans la même région génomique pouvait être expliqué par une duplication de cette région génomique dans BCG et a donné également l'indication sur la dimension du réarrangement. Des analyses de restriction comparatives additionnelles des clones X585, X592, X703 et X038 avec EcoRI ont révélé que X592 et X703 ont le même schéma de restriction à l'exception d'une bande de 10 kb présente dans X703 mais absente de X592. Sur la base de ces résultats, des amorces ont été préparées pour l'amplification de la région de jonction où le segment d'ADN dupliqué joint l'unique région L'analyse PCR avec des amorces à 16,000 et à 4398,700R a donné un produit d'une taille attendue à partir du clone X592 et également sur l'ADN génomique de BCG-Pasteur. Le séquençage des produits PCR obtenus directement sur l'ADN de BAC du clone X592 a révélé que la jonction était bien localisée aux bases 16,732/4398,593 comparativement à la séquence génomique de H37Rv. Une preuve additionnelle du réarrangement a été obtenue en utilisant un fragment PCR de 500 pb englobant la région oriC de H37Rv en tant que sonde marquée au 32P pour hybrider les produits de digestion de l'ADN génomique de M. tuberculosis, M. bovis et M. bovis BCG-Pasteur. Tandis que dans M. bovis et M. tuberculosis, une bande d'une taille moyenne d'environ 35 kb a été détectée, dans M bovis BCG-Pasteur deux bandes ont hybridé l'une d'environ 35 kb et l'autre de 29 kb. L'analyse PCR utilisant des amorces à 16,000F ou 16,500F (amorces sens) et à 4398,770R (amorce reverse) sur l'ADN génomique de souches variées de BCG (Pasteur, Glaxo, Cophenhague, Russie, Prague, Japon) a révélé que des produits ont seulement été obtenus à partir de trois souches y compris M bovis BCG-Pasteur Les trois autres sous-souches ont toujours donné des résultats négatifs malgré la confirmation des contrôles positifs. Comme attendu, la souche type de M. bovis et M. tuberculosis H37Rv étaient également toujours négatives. Cependant, il ne peut pas être exclu que les analyses PCR, de temps en temps, donnent des résultats faux positifs ou des résultats faux négatifs. La confirmation finale de ces données devrait être donnée sur des spots d'ADN génomique clivé par HindIII à partir de sous-souches BCG variées. Ainsi, les investigations sont en cours pour essayer d'obtenir de l'ADN à partir des sous-souches BCG (Glaxo, Prague, Russie, Copenhague et Japon) convenables pour une digestion avec HindIII. Un résumé des données de cartographie est montré sur la Figure 5. Mise en évidence de la région dupliquée DU2 Le deuxième grand réarrangement génomique observé dans le chromosome de M bovis BCG-Pasteur a été trouvé par l'analyse de plusieurs clones de BAC de BCG couvrant une région génomique d'environ 200 kb (3 550-3 750 kb). Leurs tailles évaluées par PFGE n'étaient pas conformes avec celles attendues à partir du génome de H37Rv et des données relatives aux séquences terminales. Les séquences terminales de X495 de BAC étaient toutes deux localisées aux alentours du site HindIII à 3 593 kb, tandis que les résultats PFGE montraient que le clone a une taille d'environ 100 kb, contenant trois fragments HindIII, d'environ 39 kb, environ 37 kb et environ 35 kb. Tandis que les bandes d'environ 39 kb et 37 kb étaient également présentes dans le clone Rv3 de H37Rv correspondant, la bande de 23 kb était d'environ 2 kb plus longue que le fragment HindIII de 21 kb dans Rv403 (le clone X1070 montrait également ce fragment spécifique de BCG de 23 kb). Cette trouvaille a conduit à l'hypothèse que la région génomique aux alentours de 3 593 kb devait avoir été dupliquée, ceci donnant lieu à l'introduction d'un nouveau site HindIII où le clone X495 prend fin. Pour montrer cela, plusieurs amorces dans la région chromosomique de 3 589 kb à 3 593 kb ont été testées pour le séquençage de l'ADN de X495 ou XI 070 du BAC et une jonction a donc été identifiée aux bases 3690124/3590899 relativement à la séquence génomique de H37Rv. Ceci explique pourquoi le fragment HindIII de 21 kb dans H37Rv qui s'étendait de 3 669 kb à 3 691 kb dans le clone Rv403 est d'environ 2 kb plus court que le fragment correspondant dans M. bovis BCG. Dans M. bovis BCG, le site HindIII a 3 691 kb a été déplacé dans la direction 3' par l'insertion d'un grand fragment d'ADN à la base 3690,124. Donc le fragment HindIII s'étendait de 3 669 kb à 3690,124/3590,899 jusqu'au site 3 593 kb HmdIII rendant le fragment d'environ 2 kb plus long que dans H37Rv (Figure 6). Ces résultats ont été confirmés par des expérimentations d'hybridation sur l'ADN génomique de M bovis, M. bovis BCG-Pasteur et M. tuberculosis H37Rv digéré par HindIII et utilisant de l'ADN marqué au 32P du clone X1070. Tandis que dans M bovis et dans M. tuberculosis une des bandes hybridées présentait une taille d'environ 21kb, la bande correspondante dans M bovis BCG-Pasteur présentait une taille d'environ 23 kb, similaire à la situation observée avec les clones de BAC. Ceci explique également les curieuses données de séquençage terminal pour le clone X495 dont l'extrémité SP6 se situe au site 3 593 kb de HindIII et dont l'extrémité T7 se situe au site 3 593 kb de HindIII également En fait, le clone enjambe la région génomique 3 593 à 3690,124 et se termine ainsi environ 2 kb plus loin dans la région dupliquée au site 3 593 de HindIII. De la même manière, l'estimation de la taille par PFGE d'environ 100 kb est correcte. Cette insertion de la grande duplication à la base 3690,124 interrompt le gène lpdA (Rv3303), mais les résultats de PCR montrent qu'une seconde copie (probablement intacte) de ce gène est présente dans la région dupliquée, couverte par les clones X094 ou X1026. Ces clones environnants X094 et X1026 présentent des séquences terminales identiques (3 593 kb et 3 749 kb) qui sont également curieuses. Conformément aux données relatives aux séquences terminales, les clones apparaissaient comme présentant une longueur de 155 kb tandis que l'estimation de la taille par PFGE de ces clones montrait que les clones étaient d'environ 100 kb de long. Les inventeurs ont donc supposé que les clones X094 et X1026 ne s'étendaient pas de 3 749 kb au site original de HindIII à 3 593 kb qui est d'environ 155 kb en direction 5' mais s'étendait seulement jusqu'au site dupliqué de HindIII, où le clone X495 se termine (voir plus haut). Les résultats d'hybridation ont montré qu'une bande d'environ 35 kb dans le profil HmdIII du clone X094 s'hybridait avec l'ADN génomique du clone X1070 suggérant que les clones X094 et X1026 contenaient de l'ADN dupliqué issu de la région 3 690 kb. Une preuve supplémentaire a été obtenue par l'analyse PCR et le séquençage de l'ADN, avec des amorces variées provenant des régions 3 675,3 680,3690 kb. Cependant, par PCR, les amorces pour la région 3 669 ne donnaient jamais de produits à partir de X094 suggérant qu'entre 3 669 et 3 675 il y avait une autre jonction de réarrangement. Cette jonction a été déterminée par séquençage et elle se trouve à la position 3608,471/3671,535. Les analyses PCR étaient également positives pour X094 avec des amorces 3 692 et 3 707 suggérant que X094 contient des régions chromosomiques à partir du site 3 691 HindIII jusqu'à 3 749 comme indiqué par les données relatives aux séquences terminales Cependant, quand les fragments PFGE des clones Rv403 et X094 du BAC H37Rv ont été comparés, il s'est avéré évident que le nouveau site HindIII devait avoir été introduit dans BCGPasteur dans la région entre 3 691 à 3 749 en tant que digestion par HindIII du clone Rv403 une bande d'environ 48 kb est présente (correspondant à la région 3 691 à 3 749) tandis que dans BCG, deux bandes d'environ 20 et d'environ 30 kb sont présentes. Il semblerait que M tuberculosis H37Rv ait perdu un fragment d'environ 2 kb à la position 3710 kb. Ce fragment est désigné RvD3 sur la figure 1. Des expérimentations avec de multiples jeux d'amorces (3689,500F ou 3689,900F sens 3591,000R, 3591,500R ou 3592,000R reverse) pour amplifier la région de jonction au niveau de la base 3690124/3590899 (décrit ci-dessus) dans différentes souches de M. bovis BCG ont révélé que des amplicons pouvaient être obtenus seulement à partir de M. bovis BCG-Pasteur et à partir de deux autres sous-souches de BCG, tandis que les autres sous-souches de BCG ne donnaient pas d'amplicon. Cependant, comme pour DU1, les conclusions finales devront seulement être faites après confirmation des résultats sur des spots HindIII hybridés avec l'ADN marqué issu de la région 3689500F-3690,OOOR qui devrait donner lieu à des bandes avec des souches de BCG réarrangées, l'une d'entre elles présente une taille d'environ 23 kb, environ 2 kb de plus que la bande correspondante dans les digestions génomiques de M. bovis et de M. tuberculosis. La seconde bande d'environ 35 kb devrait seulement être présente dans les souches réarrangées et pas dans M. tuberculosis H37Rv ou la souche type deM. bovis (Figure 6). Cependant, le fait que M. bovis BCG-Pasteur et deux autres soussouches de M. bovis BCG ont un jeu complètement dupliqué de gènes responsables des procédés majeurs tels que, entre autres, la division cellulaire et la traduction du signal, comprenant deux origines de réplication, est l'un des aspects surprenant révélé aux inventeurs par cette approche des comparaisons génomiques Puisque le matériel biologique est sujet à changements, et étant donné que les essais de vaccination BCG ont donné des résultats très variables de protection (0-80 %), il pourrait être important d'évaluer si cette variation dans l'efficacité de protection peut être attribuée en partie au choix de la sous-souche BCG utilisée. Ainsi, il convient d'investiguer encore plus loin afin de déterminer s'il y a un corrélation entre les trouvailles génomiques et les variations phénotypiques parmi les différentes sous-souches de BCG. TABLEAU 1 : DES DELETIONS DELETIONS ORF/ position* DANS LE TAILLE DU Fonction putative ou famille GENE GENOME DE M. PRODUIT TUBERCULOSIS H37RV Rv2346c 2625889-2626170 94 aa Famille de ESAT-6 Rv2347c 2626224-2626517 98 aa Famille de QLISS Rv2348c 2626655-2626978 108 aa Inconnue RD5 plcC 2627173-2628696 508 aa Phospholipase plcB 2628782-2630317 512 aa Phospholipase plcA 2630538-2632073 512 aa Phospholipase Rv2352c 2632924-2634096 391 aa Protéine PPE Rv2353c 2634529-2635590 354 aa Protéine PPE Rv3425 3842235-3842762 176 aa Protéine PPE RD6 Rv3426 3843032-3843727 232 aa Protéine PPE Rv3427c 3843884-3844636 251 aa Transposase IS1532 Rv3428c 3844737-3845966 410 aa Transposase IS1532 Rvl964 2207698-2208492 265 aa Membranaire intégrale Rvl965 2208505-2209317 271 aa Membranaire intégrale Mce3 2209325-2210599 425 aa Protéine type invasine motif RGD Rvl967 2210599-2211624 342 aa Protéine exportée Rv1968 2211624-2212853 410 aa Protéine exportée, motif RGD Rvl969 2212853-2214122 423 aa Protéine exportée lprM 2212853-2214122 377 aa Lipoprotéine Rvl971 2215255-2216565 437 aa Protéine exportée RD7 Rvl972 2216590-2217162 191 aa Protéine membranaire Rvl973 2217162-2217641 160 aa Protéine exportée Rvl974 2217657-2218031 125 aa Inconnue Rv1975 2218050-2218712 221 aa Protéine exportée Rvl976c 2218845-2219249 135 aa Inconnue Rvl977 2219752-2220795 348 aa Inconnue, signature de liaison Zn TABLEAU 1 (SUITE) ephA 4057730-4058695 322 aa Epoxyde hydrolase Rv3618 4058695-4059879 395 aa Monooxygénase Rv3619c 4059984-4060265 94 aa Famille de ESAT-6 RD8 Rv3620c 4060295-4060588 98 aa Famille de QLISS Rv3621c 4060648-4061886 413 aa Protéine PPE Rv3622c 4061899-4062195 99 aa Protéine PE lpqG 4062524-4063243 240 aa Lipoprotéine cobL 2328975-2330144 390 aa Précorrine méthylase Rv2073c 2330215-2330961 249 aa Oxidoréductase RD9 Rv2074 2330991-2331401 137 aa Inconnue Rv2075 2331417-2332877 487 aa Protéine ou membranaire exportée RD10 echAl 265505-266290 262 aa Hydratase énoyl CoA Rv0223c 266302-267762 487 aa Aldéhyde déshydrogénase RvDl- NA 675 aa Inconnue RvDl ORF1 RvDl- NA 318 aa Inconnue ORF2 Rv2024c NA 1606 aa Inconnue plcD NA 514 aa Phospholipase RvD2- NA 394 aa Sucre transférase RvD2 ORF1 RvD2- NA 367 aa Oxidoréductase ORF2 RvD2- NA 945 aa Protéine membranaire ORF3 Rvl758 NA 143 aa Cutinase NA: Non applicable * Telle que définie par Cole et al., Nature, 1998, 393, pages 537-544 TABLEAU 2 : DISTRIBUTION DES DELETIONS PARMI LE COMPLEXE DE M TUBERCULOSIS DELETION M. tuberculosis M. africanum M. bovis M. bovis M. micron M. tuberculosis M. tuberculosis H37Rv BCG OV254 CSU#93 ISOLATS CLINIQUES* RD4 # # X X # # 27/27 RD5 # # # # # # ND ( J J X X X X 19/30 7 J J X X X J 30/30 RD8 ./ ./ X X X ./ ND 9 J X X X X J g/g RD 10 J J X X X J g/g RvD 1 X J J J J J 5/7 RvD2 # # # # # # 4/7 ND Non déterminé ./ = la région est présente, X = la région est délétée * Nombre d'isolats cliniques positifs pour la présence de région TABLEAU 3:AMORCES PCR DELETION NOM DE L'AMORCE SEQUENCE TAILLE DU PRODUIT ATTENDUE RD4* 277-32F ACATGTACGAGAGACGGCATGAG H37Rv. 1031 bp 277-32R ATCCAACACGCAGCAACCAG BCG : de produit RD5* IcC-B.5P GATTCCTGGACTGGCGTTG H37Rv 1623 bp IcC-B 3P CCACCCAAGAAACCGCAC BCG. Pas de produit RD6 78-dell ACAAAATCGCCTCGTCGCC H37Rv. 8729 bp 78-de!2 ACCTGTATTCGTCGTTGCTGACC BCG- 3801 bp RD7 v420-flankl.F GGTAATCGTGGCCGACAAG H37Rv 13068 bp V420-flank2 R CTTGCGGCCCAATGAATC BCG : 350 bp RD8* D8-ephA F GTGTGATTTGGTGAGACGATG H37Rv. 678 bp D8-ephA R GTTCCTCCTGACTAATCCAGGC BCG Pas de produit RD9 B2329.5F CTGCCCGTCGTGCGCGAA H37Rv. 3048 bp B2332 SR AGTGGCTCGGCACGCACA BCG: 1018 bp RD10 D10-264F CGCGAAAGAGGTCATCTAAAC H37Rv. 3024 bp D10-267R GATGCTCAAGCCGTGCACC BCG. 1121 bp RvD1 Bo1i2268469.F GCGCCACAAACGTACTATCTC H37Rv : bp Boli2269064.R GTTTCACCGGCTGTCGTTC BCG. 5595 bp RvD2 28-IS6110B 5' CCACACCGCAGGATTGGCAAG H37Rv 2007 bpt 28-RHS 2 TCGAGTGCATGAACGCAACCGAG BCG- 7456 bp * = Amorces internes à la délétion t = Taille incluant une copie de IS6110 non présent dans BCG REFERENCES 1 Arruda, S., Bomfim, G., Knights, R., Huima, B T and Riley, L W. (1993) Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells Science 261 : 1454-1457. 2. Bloom, B R. and Fine, P. E M (1994) The BCG experience: Implications for future vaccines against tuberculosis In Tuberculoses: Pathogertesis, Protection and Control. Bloom, B.R (eds) Washington D C.. American Society for Microbiology, pp 531-557. 3. Brosch, R., Gordon, S.V., Billault, A, Garnier, T., Eiglmeier, K, Soravito, C., Barrell, B.G. and Cole, S. T (1998) Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificial chromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics Infect Immun 66 : 2221-2229. 4. Calmette, A. (1927) La vaccination contre la tuberculose, 250 p, Paris: Masson et Cie. 5. Chee, M, Yang, R, Hubbell, E, Berno, A, Huang, XC, Stern, D., Winkler, J., Lockhart, D. J., Morris, M S. and Fodor, S. P. (1996) Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science 274 : 610-614. 6 Cole, S T , Brosch, R., Parkhill, J , Garnier, T , Churcher, C., Harris, D. et al. (1998) Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome séquence. Nature 393 : 537-544. 7 DeRisi, J.L., Iyer, V.R. and Brown, P O. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale Science 278 : 610-614. 8 Elhay, M.J, Oettinger, T and Andersen, P (1998) Delayed-type hypersensitivity responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the guinea pig. Infect Immun 66 : 3454-3456. 9 Fine, P.E.M. (1994) Immunities in and to tuberculosis : for pathogenesis and vaccination. In Tuberculosis: Back to the future. Porter, J D H and McAdam, K P W J (eds) Chichester. John Wiley and Sons Ltd , pp. 53-74. 10 Gordon, S.V., Heym, B., Parkhill, J., Barrell, B G and Cole, S. T (1998) New insertion séquences and a novel répétitive element in the genome of Mycobacterium tuberculosis. Microbiology (in press) 11. Harboe, M, Oettinger, T., Wiker, H G., Rosenkrands, I. and Andersen, P. (1996) Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG Infect Immun 64 : 16-22 12. Heifets, L B and Good, R.C. (1994) Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis. In Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control. Bllom, B. R. (eds) Washington D.C. : Society for Microbiology, pp. 85-110. 13. Horwitz, M.A, Lee, B.W., Dillon, B J and Harth, G. (1995) Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis Proc Natl Acad Sci USA 92 : 14 Johansen, K.A., Gill, R.E. and Vasil, M.L (1996) Biochemical and molecular analysis of phospholipase C and phospholipase D activity in mycobacteria. Infect Immun 64 : 15. Kim, U.J., Birren, B.W., Slepak, T., Mancino, V, Boysen, C., Kang, H.L., Simon, M.I. and Shizuya, H. (1996) Construction and characterization of a human bacterial artificial chromosome library. Genomics 34 : 213-218. 16 Lagranderie, M R., Balazuc, A. M , Deriaud, E and Leclerc, C D (1996) Comparison of immune responses of mice immunized with five different Mycobacterium bovis vaccine strains. Infect Immun 64 : 1-9. 17 Lawes, M. and Maloy, S. (1995) MudSacI, a transposon with strong selectable and counterselectable markers' use for rapid mapping of chromosomal mutations in Salmonella typhimurium. J Bacteriol 177: 1383-1387. 18. Leao, S.C., Rocha, C.L., Murillo, L.A, Parra, C.A. and Patarroyo, M.E. (1995) A species-specific nucleotide séquence of Mycobacterium tuberculosis encodes a protein that exhibits hemolytic activity when expressed in Escherichia coli. Infect Immun 63 : 4301-4306. 19. Mahairas, G. G., Sabo, P. J., Hickey, M. J., Singh, D. C. and Stover, C.K. (1996) Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. JBacteriol 178: 1274- 1282. 20. Moghaddam, MF., Grant, D. F., Cheek, J M., Greene, J.F., Williamson, K.C. and Hammock, B. D. (1997) Bioactivation of leukotoxins to their toxic diols by epoxide hydrolase. Nature Med 3 : 21 Ohno, S. (1995) Active sites of ligands and their receptors are made of common peptides that are also found elsewhere J Mol Evol 40 : 22. Pelicic, V., Reyrat, J.M. and Gicquel, B. (1996) Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. J Bacteriol 178: 1197-9. 23. Philipp, W.J., Nair, S., Guglielmi, G, Lagranderie, M., Gicquel, B and Cole, S.T (1996) Physical mapping of Mycobacterium bovis BCG Pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and from M. bovis. Microbiology 142:3135-3145 24. Philipp, W J., Poulet, S., Eiglmeier, K., Pascopella, L., Balasubramanian, V., Heym, B , Bergh, S., Bloom, B. R., Jacobs, W.J. and Cole, S. T. (1996) An integrated map of the genome of the tubercle bacillus, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, and comparison with Mycobacterium leprae. Proc Natl Acad Sci USA 93 : 3132-3137. 25. Relman, D. A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R. and Falkow, S. (1989) Filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis: nucleotide séquence and crucial role in adherence. Proc Natl Acad Sci USA 86 : 2637-2641. 26 Rosenkrands, I., Rasmussen, P.B., Carnio, M., Jacobsen, S., Theisen, M. and Andersen, P (1998) Identification and characterization of a 29- kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infect Immun 66 : 2728- 2735. 27. Sreevatsan, S., Pan, X., Stockbauer, K.E, Connell, N. D., Kreiswirth, B.N , Whittam, T.S. and Musser, J.M. (1997) Restricted structural genes polymorphism in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent global dissémination. Proc Natl Acad Sci USA 94 : 9869-9874. 28. Titball, R.W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiological Reviews 57 : 347-66. 29. Wheeler, P. R and Ratledge, C. (1992) Control and location of acyl- hydrolysing phospholipase activity in pathogenic mycobacteria. J Gen Microbiol 138: 825-830. 30. Woo, S. S., Jiang, J , Gill, B S , Paterson, A H. and Wing, R.A. (1994) Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor. Nuc Acids Res 22: 4922-31. LISTAGE DE SEQUENCE INSTITUT PASTEUR Séquences délétées chez M. bovis BCG/M. bovis ou M. tuberculosis, proc de détection des mycobactéries utilisant ces séquences et vaccins. D18014 18 PatentIn Vers. 2.0 1 24 ADN Mycobacterium tuberculosis Y277-32F 1 gacatgtacg agagacggca tgag 24 2 21 ADN Mycobacterium tuberculosis Y277-32R 2 aatccaacac gcagcaacca g 21 3 20 ADN Mycobacterium tuberculosis plcC-B.5P 3 ggattcctgg actggcgttg 20 4 19 ADN Mycobacterium tuberculosis plcC-B.3P 4 cccacccaag aaaccgcac 19 5 20 ADN Mycobacterium tuberculosis Y78-dell 5 aacaaaatcg cctcgtcgcc 20 6 24 ADN Mycobacterium tuberculosis Y78-del2 6 aacctgtatt cgtcgttgct gacc 24 7 20 ADN Mycobacterium tuberculosis Rv420-flankl.F 7 tggtaatcgt ggccgacaag 20 8 19 ADN Mycobacterium tuberculosis RV420-flank2.R 8 tcttgcggcc caatgaatc 19 9 22 ADN Mycobacterium tuberculosis RD8-ephA.F 9 ggtgtgattt ggtgagacga tg 22 10 23 ADN Mycobacterium tuberculosis RD8-ephA.R 10 agttcctcct gactaatcca ggc 23 11 19 ADN Mycobacterium tuberculosis TB2329.5F 11 tctgcccgtc gtgcgcgaa 19 12 19 ADN Mycobacterium tuberculosis TB2332.5R 12 cagtggctcg gcacgcaca 19 13 22 ADN Mycobacterium tuberculosis RD10-264F 13 tcgcgaaaga ggtcatctaa ac 22 14 20 ADN Mycobacterium tuberculosis RD10-267R 14 agatgctcaa gccgtgcacc 20 15 22 ADN Mycobacterium bovis TBoli2268469.F 15 cgcgccacaa acgtactatc te 22 16 20 ADN Mycobacterium bovis TBoli2269064.R 16 agtttcaccg gctgtcgttc 20 17 22 ADN Mycobacterium bovis Y28-IS6110B.5' 17 cccacaccgc aggattggca ag 22 18 24 ADN Mycobacterium bovis Y28-RHS.2 18 atcgagtgca tgaacgcaac cgag 24 REVENDICATIONS 1. Séquences nucléotidiques délétées du génome de M. bovis BCG / M. bovis et présentes dans le génome de M. tuberculosis ou inversement choisies parmi les ORFs et gènes suivants . Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rvl964, Rvl965, mce3, Rvl967, Rvl968, Rvl969, IprM, Rvl971, Rvl972, Rvl973, Rvl974, Rvl975, Rvl976c, Rvl977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075, echA1, Rv0223c, RvD1-ORF1, RvDl-ORF2, Rv2024c, plcD, RvD2-0RFl, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, Rv1758. 2. Séquences nucléotidiques selon la revendication 1 regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvDl et RvD2 selon la répartition suivante : - RD5 : Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, plcC, plcB, plcA, Rv2352c, Rv2353c, - RD6 : Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, - RD7 : Rvl964, Rvl965, mce3, Rvl967, Rvl968, Rvl969, lprM, Rvl971, Rvl972, Rvl973, Rvl974, Rvl975, Rvl976c, Rvl977, - RD8 : ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, - RD9 : cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075c, - RD10 echAl, Rv0223c, - RvDl RvD1-ORF1, RvD 1-ORF2, Rv2024c, - RvD2 : plcD, RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, Rv1758. 3. Procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG / M. bovis ou M tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique, b) détection des séquences d'ADN de la mycobactérie présente dans ledit échantillon biologique, c) analyse desdites séquences. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel la détection des séquences d'ADN de la mycobactérie est réalisée au moyen de séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences d'ADN. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la détection des séquences d'ADN de la mycobactérie est réalisée par amplification de ces séquences à l'aide d'amorces. 6 Procédé selon la revendication 5, dans lequel les amorces ont une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 10, SEQ ID N 11 SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 17 et SEQ ID N 18 avec : - le couple SEQ ID N 1 / SEQ ID N 2 spécifique de RD4, - le couple SEQ ID N 3 / SEQ ID N 4 spécifique de RD5, - le couple SEQ ID N 5 / SEQ ID N 6 spécifique de RD6, - le couple SEQ ID N 7 / SEQ ID N 8 spécifique de RD7, - le couple SEQ ID N 9 / SEQ ID N 10 spécifique de RD8, - le couple SEQ ID N 11/ SEQ ID N 12 spécifique de RD9, - le couple SEQ ID N 13 / SEQ ID N 14 spécifique de RD10, - le couple SEQ ID N 15 / SEQ ID N 16 spécifique de RvD 1, et - le couple SEQ ID N 17 / SEQ ID N 18spécifique de RvD2, 7. Procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique à analyser avec au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, b) amplification de l'ADN de la mycobactérie, c) mise en évidence de l'amplification des fragments d'ADN. 8. Kit pour la détection et l'identification discriminante de M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les éléments suivants : a) au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6, b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, c) éventuellement, les éléments nécessaires permettant de vérifier ou comparer la séquence et/ou la taille du fragment amplifié. 9. Utilisation d'au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6 pour l'amplification de séquence d'ADN de M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis. 10. Produits d'expression de tout ou partie des séquences nucléotidiques délétées du génome de M. bovis BCG / M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou inversement telles que définies dans la revendication 1. 11. Procédé de détection discriminante in vitro d'anticorps dirigés contre M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un produit tel que défini dans la revendication 10, b) mise en évidence du complexe antigène - anticorps formé. 12. Procédé de détection discriminante d'une vaccination avec M bovis BCG ou d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère, comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'un échantillon biologique contenant des cellules, plus particulièrement, des cellules du système immunitaire dudit mammifère et plus particulièrement encore, des cellules T, b) incubation de l'échantillon biologique de l'étape a) avec au moins un produit tel que défini dans la revendication 10, c) détection d'une réaction cellulaire indiquant une sensibilisation préalable du mammifère audit produit, notamment la prolifération cellulaire et/ou la synthèse de protéines telles que l'interféron gamma. 13. Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par M tuberculosis chez un mammifère éventuellement préalablement vacciné avec M. bovis BCG, comprenant : a) un produit tel que défini dans la revendication 10, b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, c) les réactifs permettant la détection des complexes antigène - anticorps produits par la réaction immunologique, d) le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par ledit produit, e) le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticorps reconnus par ledit produit. 14. Anticorps mono- ou polyclonaux, leurs fragments ou anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un produit tel que défini dans la revendication 10. 15. Procédé pour la détection discriminante de la présence d'un antigène de M bovis BCG / M. bovis ou de M tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 14, b) mise en évidence du complexe antigène - anticorps formé. 16 Kit pour la détection discriminante de la présence d'un antigène de M bovis BCG / M. bovis ou de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : a) un anticorps tel que défini dans la revendication 14, b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique, c) les réactifs permettant la détection des complexes antigène - anticorps produits par la réaction immunologique. 17. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit tel que défini par la revendication 10. 18. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend au moins un produit tel que défini dans la revendication 10 en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité appropriés. 19. Procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes : - la digestion par une enzyme de restriction d'au moins une partie du génome de la mycobactérie présente dans l'échantillon biologique à analyser, et - l'analyse des fragments de restriction ainsi obtenus 20 Procédé selon la revendication 19, dans lequel l'enzyme de restriction est HindIII. 21. Procédé selon la revendication 19 ou 20, dans lequel l'analyse des fragments de restriction consiste à compter lesdits fragments et/ou à déterminer leur longueur. 22. Procédé de détection selon l'une des revendications 19 à 21, dans lequel l'analyse des fragments de restriction consiste à les mettre en contact avec au moins une sonde dans des conditions d'hybridation et à identifier les parties de fragments ou fragments hybridés