Brevet FR2795093A1 — publié le 20001222

Moyens pour l'identification du locus d'un gène majeur de la résistance au virus de la panachure jaune du riz et leurs applications. L'invention a pour objet des moyens, outils et procédés, pour l'identification du locus d'un gène majeur de résistance au virus de la panachure jaune du riz (en abrégé RYMV pour Rice Yellow Mottle Virus). Elle vise plus spécialement, en tant qu'outils, des marqueurs et des amorces PCR et leurs applications à l'établissement de la cartographie physique de la résistance et au clonage du gène. RYMV est un virus endémique en Afrique.Chez quelques rares variétés de l'espèce africaine de riz cultivé Oryza glaberrima, une résistance très élevée au RYMV a été identifiée. Mais comme les hybrides interspécifiques entre les deux espèces de riz cultivées sont extrêmement stériles, les recherches antérieures n'ont pas permis de décrire ni de bases génétiques, ni de mécanisme de cette résistance. Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré qu'une variété dénommée Givrante, originaire du Mozambique et identifiée par l'ADRAO, de l'espèce asiatique de riz cultivé Oryza sativa, manifestait les mêmes caractéristiques que celles observées chez 0. glaberrima. Les inventeurs ont caractérisé la résistance à RYMV en mettant en évidence qu'elle est liée à un gène majeur de résistance récessif et identique chez les deux sources de résistance considérée (O. Sativa et O. glaberrima) . Cette résistance intervient au niveau du mouvement de cellule à cellule et se traduit par un blocage du virus au niveau des cellules infectées alors que la réplication du virus est normale. La migration du RYMV se fait sous forme d'un complexe nucléoprotéique associant acide nucléique viral, protéine de la capside et protéine de mouvement du virus. Chez la plante, un facteur cellulaire, probablement une protéine, contribue également au déplacement du virus dans les cellules des variétés sensibles. Cheez les variétés résistantes au contraire, une mutation de cette protéine ne permet plus l'asociation avec le virus et donc sa diffusion dans la plante. Compte tenu de ces résultats, les inventeurs ont élaboré une méthode et des outils spécifiques pour identifier ce gène de résistance au RYMV qui code pour cette protéine permettant d'assurer le mouvement du virus dans la plante. L'invention a donc pour but de fournir un procédé pour l'identification de marqueurs moléculaires du locus de résistance au RYMV. Elle vise également, en tant que tels, les fragments d'ADN tels que révélés par ce procédé, et utilisables en tant que marqueurs. L'invention vise en outre les applications de tels marqueurs, notamment pour définir d'autres marqueurs de haute spécificité vis-à-vis du locus de résistance et pour prédire un phénotype résistant. L'invention vise tout particulièrement l'application desdits marqueurs pour établir la cartographie physique de la résistance et pour le clonage du gène. L'invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences des amorces utilisées dans les techniques PCR mises en oeuvre. Conformément à l'invention, l'identification de marqueurs du locus d'un gène majeur de résistance à YMV, comprend l'utilisation de marqueurs AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) et fait appel à la technique PCR. Ce procédé d'identification est caractérisé en ce qu'il comprend - l'amplification sélective de fragments d'ADN de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragments ayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer des adaptateurs complémentaires d'amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides spécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation, - la séparation des produits d'amplification, par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges de fragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avec les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie le cas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du taux de recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance. Dans un mode de réalisation de l'invention, les fragments d'ADN sont obtenus par digestion des ADN génomiques de plantes résistantes d'une part, et de plantes sensibles d'autre part, et de leurs parents, à l'aide d'enzymes de restriction. Des enzymes de restriction qui se sont révélées appropriées comprennent EcoRI et MseI. De courtes séquences nucléotidiques sont fixées aux fragments de digestion (adaptateurs) pour générer des extrémités franches auxquelles sont ensuite fixés des adaptateurs. Les amorces utilisées dans l'étape d'amplification sont complémentaires de ces adaptateurs avec, à leur extrémité 3', de 1 à 3 nucléotides qui peuvent être variables. L'étape d'amplification est conduite avantageusement selon la technique PCR. Des profils d'amplification spécifiques sont obtenus avec des couples d'amorces possédant à leur extrémité, respectivement, des motifs AAC et CAG, ACC et CAG, ou encore AGC et CAG. Les séquences correspondant aux adaptateurs EcoRI et Msel sont respectivement GAC TGC GTA CCA ATT C(SEQ ID N 1) et GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N 2). Les couples d'amorces mis en oeuvre pour l'amplification sont alors avantageusement choisis parmi E-AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; et E-AGC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondent respectivement à SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. L'étude comparative des profils d'amplification obtenus permet de révéler des bandes polymorphes spécifiquement présentes chez les variétés sensibles et leurs descendants sensibles, comme exposé dans les exemples, et correspondant en conséquence à des marqueurs de résistance. En particulier, la révélation sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes conduit à l'identification de 2 bandes marqueurs Ml et M2 respectivement de 510 pb et 140 pb. Ces 2 bandes déterminent, d'après l'analyse des données de ségrégation, un segment chromosomique de 10 à 15 cM portant le locus de résistance et sont situées de part et d'autre de ce locus, à 5-10 cM. Selon une disposition du procédé de l'invention, les bandes polymorphes identifiées en tant que marqueurs spécifiques du locus de la résistance au RYMV sont isolées à partir des gels. On opère avantageusement par excision des gels d'électrophorèse. Cette étape d'isolement est suivie d'une purification en procédant selon les techniques classiques. On dispose ainsi de fragments d'ADN. Selon une autre disposition de l'invention, lesdits fragments purifiés sont clonés dans un vecteur approprié, tel qu'un plasmide, introduit dans des cellules hôtes, notamment des cellules bactériennes comme celles de E. coli. Selon encore une autre disposition de l'invention, les fragments d'ADN purifiés et clonés sont séquencés. Mettant à profit les séquences des inserts correspondant auxdits fragments d'ADN, l'invention fournit également un procédé d'obtention de marqueurs de grande spécificité vis-à-vis du locus d'un gène majeur de résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on définit des couples d'amorces PCR complémentaires de fragments de la séquence d'un insert donné, on procède à une amplification spécifique de l'insert à l'aide de ces couples d'amorces, puis on soumet les produits d'amplification à une migration sur gel d'électrophorèse. Ces séquences d'ADN sont utilisables pour identifier un polymorphisme lié au locus de résistance dans une variété de riz à étudier suivant différents procédés, ainsi que décrit dans les exemples : 1) en identifiant directement un polymorphisme de taille de ces séquences d'ADN après amplification spécifique et séparation des fragments sur gel d'agarose, 2) en digérant les produits d'amplification par des enzymes de restriction pour séparer les produits de digestion sur gel d'agarose, 3) en utilisant ces séquences comme des sondes pour hybrider l'ADN de variétés de riz préalablement digérées par une enzyme de restriction et déterminer un polymorphisme de restriction. L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les bandes AFLP polymorphes telles qu'identifiées par le procédé défini ci-dessus, à partir d'ADN de plantes de riz, et le cas échéant isolées, purifiées et séquencées. Ces bandes AFLP sont caractérisées en ce qu'elles sont spécifiquement mises en évidence dans une variété sensible au RYMV (IR64) et dans la fraction de plantes sensibles issues du croisement de cette variété avec la variété résistance Gigante comme décrit dans les exemples. L'invention vise tout spécialement les séquences d'ADN correspondant à ces bandes polymorphes, et qui permettent de définir un segment du chromosome 4 de 10-15 cM portant le locus de résistance au RYMV. Compte tenu de leur procédé d'obtention, les bandes AFLP correspondent à des fragments de restriction et en particulier, conformément à un mode de réalisation du procédé de l'invention, à des fragments EcoRI - Msel. Des fragments de ce type sont appelés marqueurs Ml et M2 et sont caractérisés par une taille, respectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes. Ces fragments sont caractérisés en ce qu'ils correspondent à des séquences d'ADN flanquant le locus de résistance et situés de part et d'autre de ce dernier à 5-10 cM. L'invention vise un ADNc tel que défini cidessus, caractérisé en ce que lesdites séquences d'ADN correspondant auxdites bandes polymorphes, portent le locus de résistance à RYMV et définissent un segment inférieur à lOcM. L'invention vise également des fragments clonés dans des vecteurs tels que plasmides, ces vecteurs de clonage en tant que tels, caractérisés par le fait qu'ils comportent de tels fragments, et les cellules hôtes transformées à l'aide de ces vecteurs, tels que des cellules bactériennes comme E. coli. L'invention vise notamment la séquence d'ADN correspondant au fragment identifié comme marqueur Ml et répondant à la séquence SEQ ID N 3 suivante : CGTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAGC GAAGGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCGGAT CGGAGGAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAAGGGCA GATGAGGAGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGCAGATGCA AGATGGCTAGCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAGGGGCTTTC TTTGGGAGTATGCGCTCAGCATGGAACTGCGCGAAAGAAGTAGATTTCAGAGCAATG AAAGACAATCTGTTCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAACGAGTTATG AATGAAGGTCCATGGACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAATATGATGGC TGGTCCAAGATTGAAT La séquence d'ADN du marqueur Ml présente une taille de 471 pb. L'invention vise encore, en tant que nouveaux produits, les séquences de nucléotides utilisées comme amorces d'amplification en PCR. De telles amorces comprennent les couples E-AAC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; E-ACC/M-CAG ; dans lesquels E et M correspondent respectivement à SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. D'autres amorces encore sont complémentaires de séquences identifiées dans la séquence du fragment désigné par marqueur Ml. Il s'agit en particulier de séquences (5', 3') choisies parmi : AGGAAGGGGAACACAACAGCC (21 pb)(SEQIDN 4) TTATGCTGGAGGGGCTTGACC (21 pb)(SEQIDN 5) GCAGTTCCATGCTGAGCGCAT (21 pb)(SEQIDN 6) CCGAACATCCTCGAAAGGTCC (21 pb)(SEQIDN 7) TCATATTCTGCGAGGAGCACC (21 pb)(SEQIDN 8) Selon encore un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des séquences d'ADN obtenues avec les amorces ci-dessus pour définir des polymorphismes permettant l'identification de phénotypes résistants. L'invention concerne également un procédé d'identification de la séquence d'ADN portant le gène majeur de la résistance au RYMV. Ce procédé est caractérisé par le criblage d'une banque constituée de fragments d'ADN de 100 à 150 kb de la variété IR64 ou autre, telle que la banque BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), clonés dans des bactéries, pour sélectionner le ou les clones de la banque renfermant les marqueurs définis ci-dessus et le gène de résistance au RYMV. Une telle banque BAC est disponible auprès de l'IRRI. Pour identifier le gène du ou des clones sélectionnés, on procède à l'identification à partir du jus brut de protéines extraites de plantes, de la fraction, puis de proche en proche, de la protéine qui mise en présence de virus purifié permet le mouvement de cellule à cellule dans la variété résistante. La protéine candidate est alors séquencée partiellement soit à partir de l'extrémité N-terminale, soit à partir de fragments internes libérés par hydrolyse. Des amorces peuvent être ainsi définies et sont utilisées pour amplifier l'ADNc correspondant. Aux fins de validation, on vérifie que cet ADNc va obligatoirement aller hybrider le clone BAC identifié dans l'approche cartographique. En variante, on procède au sous-clonage du fragment BAC contenant le gène en éléments de plus petite taille sous forme de cosmides qui sont ensuite réordonnés de manière à couvrir l'ensemble du clone BAC de départ. Ces cosmides sont utilisés en transformation génétique pour réaliser un test de complémentation fonctionnelle permettant de valider la séquence contenue dans le cosmide et correspondant à l'ADNc isolé par l'approche protéine. Il s'agit en l'occurence de démontrer que la synthèse de la protéine responsable du mouvement du virus de cellule à cellule permet de rendre sensible la variété résistante. L'invention vise ainsi un ADNc capable de s'hybrider avec un clone BAC criblé à partir d'une banque constituée comme indiqué ci-dessus de fragments d'ADN de 100 à 150 kb d'une variété de riz telle que IR64, par exemple de banque BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), ce clone BAC appartenant à un contig (ou ensemble de clones BAC chevauchant) de clones BAC renfermant les séquences d'ADN des marqueurs identifiés à partir de riz grâce au procédé défini ci-dessus. Conformément à l'invention, le gène de résistance peut être transféré à des variétés sensibles par voie conventionnelle grâce à l'utilisation de marqueurs génétiques spécifiques qui lui sont liés. Ainsi des variétés résistantes pourront être développées beaucoup plus facilement et beaucoup plus rapidement. On notera de plus avec intérêt que la séquence de ce gène facilite l'accès à des gènes de résistance d'autres virus (Potyvirus par exemple) qui sont pathogènes d'autres plantes, mais caractérisés par le même mécanisme (mouvement de cellule à cellule). L'invention fournit ainsi des moyens de grand intérêt pour l'amélioration des plantes basés sur des résistances naturelles aux pathogènes des végétaux. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 9 qui représentent respectivement - la figure 1 : le clonage du marqueur Ml dans le plasmide PGEMTeasy. La digestion du plasmide montre un fragment d'ADN de 510 pb correspondant à la bande Ml ; - la figure 2 : l'amplification du marqueur Ml dans les quatre variétés de riz (Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681) en utilisant les couples d'amorces 2-4) : 291 pb ; (2-5) : 310 pb ; (1-3) : 288 pb ; (1-4) :406 pb ; (1-5) : 425 pb ; (2-3) . Le fragment Ml est légèrement plus grand chez Tog5681 que chez les autres variétés ; - la figure 3 : l'identification de sites de restriction sur la séquence du marqueur Ml chez les 4 variétés IR64, Azucena, Gigante et Tog5681 ; - la figure 4 : la digestion du marqueur Ml avec l'enzyme HpaII après amplification PCR en utilisant les couples d'amorces (1-3), (1-4) et (1-5) sur les quatre variétés (Azucena, Gigante IR64 et Tog5681). La présence d'un site de restriction HpaII dans les variétés IR64 et Tog5681 libère un fragment de 86 pb qui réduit d'autant la taille du fragment amplifié ; - la figure 5 : la caractérisation du marqueur Ml sur les plantes sensibles et résistantes de la descendance F2 (IR64 x Gigante). Les plantes F2 résistantes ont le profil du parent résistant (IR64-absence du site HpaII), à l'exception d'un seul recombinant, les plantes résistantes ont le profil du parent sensible (IR64-présence du site HpaII) à l'exception de deux recombinants ; - la figure 6 : la ségrégation du marqueur Ml dans la population HD (IR64 x Azucena) : IR64-Azucena-30 individus HD (IR64 x Azucena); - la figure 7 : la carte de liaison génétique du chromosome 4 du riz avec le positionnement du marqueur Ml et l'identification de l'intervalle dans lequel se trouve le locus de résistance ; - la figure 8 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur des membranes portant l'ADN des 4 variétés (IR64, Azucena, Gigante et Tog5681) digérées par 6 enzymes de restriction ApaI, KpnI, PstI, ScaI, HaeIII. La variété Tog5681 présente un profil de restriction différent des autres variétés pour l'enzyme ScaI qui peut être utilisée pour marquer le locus de résistance de cette variété ; et - la figure 9 : l'hybridation du marqueur Ml utilisé comme sonde sur des membranes portant l'ADN d'individus issus de recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog 5681 et digérés avec l'enzyme ScaI. Cette descendance est en ségrégation pour la résistance au RYMV. Les individus sensibles (5) montrent tous la bande d'IR64 associée à la bande de Tog5681 (individus hétérozygotes). Les individus résistants (9) ne montrent que la bande de Tog5681 à l'exception d'un individu recombinant. Exemple 1 Identification des variétés sources de résistance Les variétés utilisées dans l'étude de la résistance et en particulier les deux variétés résistantes Gigante et Tog5681 ont été caractérisées grâce à des marqueurs microsatellites sur un échantillonnage représentatif de loci. Le polymorphisme se manifeste par le nombre de répétitions d'un court motif nucléotidique, le plus souvent binucléotidique qui est caractéristique d'une variété donnée. Sur un ensemble de loci, les allèles répertoriés permettent de disposer des caractéristiques spécifiques de chaque variété. La mise en évidence de ces marqueurs microsatellites s'effectue par l'amplification de l'ADN avec des amorces spécifiques déterminées par Chen et al. (1) , suivie d'une migration sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes suivant le protocole décrit par les mêmes auteurs. Le tableau 1 donne les résultats à partir d'un système de référence établi par Chen et al., ci-dessus suivant lequel les allèles sont identifiés par le nombre de répétitions du motif comparativement à la variété IR36 qui sert de témoin. Les deux variétés Gigante et Tog5681 sont ainsi décrites spécifiquement sur 15 loci vis-à-vis de toutes autres variétés (les marqueurs microsatellites sont donnés dans la 1ère colonne). Tableau 1 Locus Chr Taille référence IR36 Gigante IR64 Azucena TOG sur IR 36 568113 RM001 1 113 (2) n n-26 n n-22 n-26 RM005 1 113 (2) n n-6 n-4 n+16 n-8 RM011 7 140 (2) n n-4 n n-24 n-16 RM018 7 157 (2) n n+4 n+6 n+8 n-6 RM019 12 226 (2) n n n+21 n-9 n-21 RM021 11 157 (2) n n+8 n n-14 n-32 RM148 3 129 (3) n n+6 n n n+6 RM167 11 128 (3) n n+4 n n+32 n+24 RM168 3 116 (3) n n-20 n n-20 n-24 RM232 3 158 (1) n n-14 n n-12 n-16 RM022 3 194 (2) n n-2 n n-4 n-2 RM252 4 216 (1) n n+38 n+2 n-20 n+10 RM255 4 144 (1) n n n n n RM246 1 116 (1) n n-12 n-12 n-16 n-12 RM231 3 182 (1) n n+6 n-22 n-4 n-12 Exemple 2 : Caractérisation de la résistance La résistance a été caractérisée à partir de l'inoculation artificielle de jeunes plantules avec du virus comparativement à une variété témoin IR64 extrêmement sensible. Le contenu en virus a été suivi pendant 60 jours après inoculation grâce à des tests ELISA sur les dernières feuilles émises. Ces tests n'ont jamais pu mettre en évidence de signal significativement différent de plantes témoins non inoculées par le virus. Une autre expérimentation a été réalisée en inoculant des protoplastes isolés des deux variétés Tog5681 et Gigante. Dans les deux cas, il possible de détecter la présence des protéines virales (protéine de la capside et protéine de mouvement P1), ainsi que l'accumulation d'ARN viral, qui témoignent de la capacité de ces protoplastes à multiplier le virus, et ceci de la même manière que les protoplastes de variétés sensibles comme IR64. Ainsi, si on considère que la réplication, le mouvement de cellule à cellule, et le transport à longue distance à travers les vaisseaux, sont les trois étapes principales du déroulement du cycle infectieux dans la plante, la résistance de ces deux variétés réside le plus logiquement dans un blocage du virus au niveau des cellules infectées. Exemple 3 : Génétique de la résistance Différents croisements FI ont été réalisés entre la variété d'O. sativa résistante (Gigante), une variété d'O. glaberrima résistante Tog5681 (également identifiée par l'ADRAO) et la variété de référence très sensible IR64 (sélectionnée à l'IRRI). La culture du matériel végétal, les croisements et la production des descendances ont été réalisés dans les serres de l'IRD à Montpellier. Les hybrides FI obtenus entre les variétés sensibles et résistantes ont été testés pour la résistance au virus du RYMV par test ELISA et suivi des symptômes. Ces hybrides FI se sont tous révélés aussi sensibles que le parent sensible et ont donc montré que la nature de la résistance était récessive. En revanche, les hybrides entre les deux sources de résistance Gigante et Tog5681 n'ont donné que des hybrides FI résistants en faveur d'un seul et unique locus de résistance chez ces deux sources de résistance. Les études ont porté sur la distribution des réponses ELISA (A 405 nm) dans les feuilles infectées par voie systémique des hybrides FI, des backcross et des descendants F2 obtenus à partir des backcross entre la variété IR64 sensible et les 2 cultivars résistants Gigante et Tog5681. En ce qui concerne Gigante, l'hérédité de la résistance a été confirmée par un test de résistance sur 55 familles F3 du croisement (IR64 x Gigante). Les résultats obtenus montrent que : - 1/4 de plantes F2 ne donne que des plantes résistantes dans les descendances F3, et sont homozygotes pour la résistance - 1/4 de plantes F2 ne donne que des plantes sensibles dans les descendances F3, et sont homozygotes pour la sensibilité - 1/2 des plantes F2 sont en ségrégation pour la résistance et donnent des plantes sensibles et résistantes avec la même proportion (3:1) dans les descendances F3. L'ensemble des résultats s'accorde parfaitement avec un seul gène de résistance récessif présent chez les deux variétés Gigante et Tog5681. Exemple 4 Identification des marqueurs de résistance Ml et M2 selon le protocole AFLP a - Obtention de pools d'ADN Les feuilles de 10 plantes sensibles et de 10 plantes résistantes issues d'une F2 (IR64 x Gigante) ont été prélevées pour extraire leur ADN. Les ADN ont été ensuite mélangés de manière stoechiométrique pour constituer deux pools d'ADN correspondant respectivement à 10 plantes F2 sensibles ou résistantes avec une concentration finale du mélange de 50 ng/ l. Ces mélanges ont servi de base à l'identification de marqueurs de résistance par la méthode AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) pour polymorphisme de longueur de fragments amplifiés qui a été développée par Zabeau et al (4), et Vos et al. (5) . Les produits utilisés se présentent sous forme d'un kit commercial (Gibco BRL) délivré par Keygene & Life Technologies. b - Obtention de fragments de restriction 250 ng de chacun des pools d'ADN à 50 ng/ l et des parents sont digérés simultanément par deux enzymes de restriction (EcoRI et MseI). Réaction de digestion (25 fil) : 5 /il d'ADN (50 ng/ml) 0, 2 /il (2 U) de EcoRI (10 U/l) 0,2 /il (2 U) de Msel (5 U/l) 5 /il de tampon T4 ligase 5X 14,5 l de H20 . La réaction de digestion s'effectue pendant deux heures à 37 C, puis 15 min. à 70 C pour inactiver les enzymes de restriction. Après digestion, il est procédé à une réaction de ligation. Réaction de ligation (50 l) : 25 l du milieu réactionnel de double digestion 1 l d'adaptateur EcoRI 1 l d'adaptateur Msel 5 l de tampon T4 Ligase 5X 1 l (1 U) de ligase (10 U/l) 17 l H20. La réaction de ligation s'effectue à 37 C, pendant 3 heures, suivie d'une inactivation de l'enzyme à 60 C pendant 10 min. c - Amplification L'amplification proprement dite a été réalisée en deux étapes : préamplification et amplification spécifique. Cl - Réaction de pré amplification (50 /il) 5 /il du milieu réactionnel renfermant l'ADN digéré et fixé aux adaptateurs, dilué au 1/10 0,5 /il d'amorce EcoRI (150 ng/ l) 0,5 /il d'amorce Msel (150 ng/ l) 2 /il de mélange de nucléotides 5 mM 5 /il de tampon 10 X, Promega 5 /il de MgCl2 25 mM 0,2 /il (1 U) de Taq polymérase (5 U/l) 31, 8 /il de H20 . Les caractéristiques de la pré-amplification par PCR sont les suivantes : 20 cycles avec dénaturation . 30 sec à 94 C hybridation : 30 sec à 56 C élongation 1 min à 72 C L'amplification sélective se fait à partir d'un aliquote de la première amplification diluée au 1/30 en utilisant des amorces ayant 3 nucléotides sélectifs à l'extrémité 3', et en marquant l'une des amorces pour révéler les bandes sur un film autoradiographique. On utilise les couples d'amorces suivants : E-AAC/M-CAG E-ACC/M-CAG E-AGC/M-CAG, dans lesquels E répond à la séquence GAC TGC GTA CCA ATT C (SEQ ID N 1), et M à la séquence GAT GAG TCC TGA GTA A (SEQ ID N 2). La température d'hybridation est diminuée de 0,7 C par cycle, pendant les 11 cycles suivants : 20 derniers cycles dénaturation : 30 sec à 90 C hybridation : 30 sec à 56 C élongation 1 min à 72 C On procède au marquage de l'amorce EcoRI (ramené à un tube de 0,5 /il) : 0,18 /il de l'amorce EcoRI (5ng) 0,1 /il de y33P ATP (10 mCu/ l) 0,05 fil de tampon kinase 10 X 0,02 /il (0,2U) de T4 polymérase kinase (10U/ l) 0, 15 /il de H20. La réaction de marquage se fait à 37 C pendant 1 heure et est arrêtée par 10 minutes à 70 C. C2 - Réaction d'amplification spécifique (20 ni) : 0,5 /il d'amorce EcoRI marquée 5 /il du milieu réactionnel de pré-amplification, dilué au 1/30, 0,3 /il d'amorce Msel (100 ng/ l) 0,8 [il de mélange de nucléotides 5 mM 2 /il de tampon 10 X Promega 2 /il de MgCl2 25 mM 0,1 /il (0,5 U) de Taq polymérase (5 U/l) 9, 3 l de H20. Les caractéristiques de l'amplification sont les suivantes 32 cycles avec . pour le premier cycle : dénaturation . 30 sec à 94 C hybridation : 30 sec à 65 C élongation 1 min à 72 C les 11 cycles suivants : les mêmes conditions que précédemment, avec diminution à chaque cycle de 0,7 C de la température d'hybridation ; et pour . les 20 derniers cycles : dénaturation . 30 sec à 90 C hybridation : 30 sec à 56 C élongation 1 min à 72 C d - Electrophorèse et Autoradiographie A la fin de la réaction d'amplification, 20 /il de tampon de charge sont ajoutés (98 % de formamide, 0,005 % de xylène cyanol et 0,005 % de bleu de bromophénol). Les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (6 % d'acrylamide, 8 M d'urée) avec un tampon de migration TBE (Tris 18 mM, EDTA 0,4 mM, acide borique 18 mM, pH 8,0) pendant 3 heures de migration à puissance de 50 watts. Après migration, le gel est fixé dans une solution IV d'acide acétique/2V d'éthanol absolu pendant 20 minutes. Le gel est transféré sur un papier Wattman 3M et séché pendant 45 minutes à 80 C avec un sécheur de gel. Le gel est placé dans une cassette avec un film ultrasensible. L'autoradiographie est révélée après deux jours d'exposition. La comparaison des profils obtenus chez les parents et les pools de plantes sensibles ou résistantes permet d'identifier des bandes présentes dans l'un des pools, mais absentes dans l'autre. Ces bandes candidates au marquage de la résistance sont ensuite vérifiées individuellement sur chacune des plantes composant les pools d'ADN. e - Résultats L'étude des résultats obtenus montre que les deux marqueurs appelés Ml et M2 sont présents chez le parent sensible (IR64) ainsi que dans toutes les plantes F2 (IR64 x Gigante) composant le pool de plantes sensibles, alors que cette bande est absente chez le parent résistant (Gigante) et qu'un seul individu du pool résistant manifeste cette bande. Le même type de variation est observé dans le recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. Les autres marqueurs identifiés dans cette analyse (M3 à M6) montrent aussi la même variation: - présence des bandes chez le parent sensible et le pool des plantes sensibles F2 (IR64 x Gigante) ainsi que les plantes sensibles du recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. - absence de bande chez les parents résistants Gigante et Tog5681, chez le pool des plantes résistantes F2 (IR64 x Gigante) et chez les plantes résistantes du recroisement (IR64 x Tog5681) x Tog5681. Les données de ségrégation entre les marqueurs AFLP Ml à M6 et le locus de résistance pour les pools F2 (IR64 x Gigante) et le backcross interspécifique (IR64 x Tog5681) x Tog5681 sont résumées dans les tableaux 4 et 5. L'analyse des données de ségrégation et des rares recombinants observés dans les deux croisements permet d'évaluer les taux de recombinaison entre ces différents marqueurs et le locus de résistance. En particulier, les marqueurs Ml d'une part et les marqueurs M2 à M6 d'autre part déterminent un segment inférieur à 10-15 cM portant le locus de résistance. Ml et M2 sont ainsi à moins de 5-10 cM et placés de part et d'autre de ce locus. Résistance -Marqueur Mi Nombre d'individus observés Phénotype Résistane Sensible Génotype résistance RYMV a gg a gg lt lt ll ll Marqueur AFLP -/- -/- -/ -/- -/- -/- Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 10 Pool F2 5::::1siol::: ([RM : pci"iqu::: Tog5Ó31 II OS Résistance/Marqueur M2. M3.M4.M6 Nombre d'individus ocservés Phénotype Résistant Sensible Génotype résistance RYMV a/gg a gg lt lt ll ll Marqueur APLP -/- -.'- -;oui -I- -#'# #'- "' Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 11 0 Pool F2 sensible ([R64 x gigante) - - - - - 0 10 Backcross interspécifique Tog5681 10 0 3 Résistance Marque-.:.' M5 Nombre d'individus observés Phénotype résistant Sensible Génotype résistance RYMV a/gg a gg lt lt ll \-Iar::;u::::.:r .-'-..?L? -#- -,,'0 0,'0 -'" ofo Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 11 - 0 - - - - Pool F2 résistant ([R64 x gigante) - - - - - 0 10 8ac! Tableau -t.3 ' # Tableaux de contingence c.^,.r les marqueurs .A....CLP Mt à \[6 le tocus es rais,arc pour les pools F2 (fR-Ó" x Gigante) et le back cross ;c::s:ci ,que:: ([R5": x Tog:3i) r Tsg;6SI, Tableau 2 Marqueur M l/Marqueurs M2, M3, M4, M6Normere d'individus observés Génotype Ml G Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 0 0 10 Pool F2 sensible 1. [R6J. , gipm;:) 10 0 1) BaÓ.:cross inc Marqueur MI/Marqueur M5 Nombre d'individus observas G':no[ype\H Ginor.pe M5 -..f. Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 0 10 Pool F2 sensible ([R64 x gigante) 10 0 0 Backcross interspécifique Tog5681 11 2 3 10 #Mirqueur M5/Marcueurs M2, M3. \'- MÔNcmcrj i';r.civicus obser/és Gér.otvpeM5 "'" G Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 0 0 0 11 Pool F2 résistant ([R64 x gigante) 10 0 0 0 1 0 12 Backcross interscéci tique iog:63! 13 [-) bac! Tableau i.6 Tabkaux U cr,i:t:":g:":c oc....^. r" a l'C ks ::!.;:.:rs ...:.=L? ,(; J. ,',:6 ":;.5 ,:;5 :'';0':) (ciC=a C111f:CÎ :1G v2c: Exemple 5 : Isolement du margeur Ml Une nouvelle amplification, avec le même couple d'amorces, a été réalisée, suivie d'une migration sur gel de polyacrylamide dans les mêmes conditions que celles énoncées ci-dessus. La révélation a été faite par une coloration au nitrate d'argent, avec le kit silver staining (Promega), pour visualiser directement les bandes sur le gel. Après révélation, la bande Ml a été excisée du gel, puis l'ADN a été élué dans 50 /il d'eau à 4 C pendant une nuit. Un aliquot de 5 /il a été prélevé et réamplifié avec les mêmes couples d'amorces avec un marquage au p33. Le produit d'amplification a été séparé à nouveau sur gel d'acrylamide dénaturant à 6%, et comparé aux parents et aux pools sensibles et résistants. La piste correspondant à ce produit d'amplification montre une seule bande de 510 pb migrant exactement au même niveau que la bande d'origine qui avait été excisée. Un autre aliquot de 5 l a été également amplifié avec les mêmes amorces et a été séparé sur gel d'agarose à 1,8%. La bande correspondant à la taille attendue (510pb) a été à nouveau excisée et purifiée avec un kit gène clean (Promega). Exemple 6 : Clonage et Séquençage du Marqueur Ml . clonage 3 /il du produit de purification ont été utilisés pour une réaction de clonage pendant une nuit à 37 C. 3 /il de produit de purification 1 /il de vecteur PGEMTeasy 1 l de T4 Tampon ligase 10 X 1 fil de T4 DNA Ligase 4 /il de H20 La transformation a été réalisée avec la souche E. Coli JM109 en ajoutant 5 /il du produit de clonage à 100 /il de cellules compétentes de E. Coli JM109. Une préculture a été réalisée sur milieu de culture LB pendant 1 heure, à 37 C. Ensuite les bactéries ont été étalées sur boîte de Pétri contenant de l'agar à 1/1000 d'ampicilline. 50 /il d'IPTG-XGal sont ajoutés juste avant l'étalement des bactéries pour sélectionner les bactéries transformées. Une colonie blanche (transformée) a été sélectionnée et remise en culture dans les mêmes conditions (Agar plus ampicilline). A partir de cette culture, une mini-préparation d'ADN plasmidique a été réalisée avec le kit Wizard plus (Promega). L'ADN plasmidique contenant l'insert a été digéré avec l'enzyme EcoRI pour vérifier la présence du marqueur Ml. Un gel d'agarose à 1,8% a permis de vérifier la présence de la bande de 3 kb correspondant au plasmide et de la bande de 510 pb corespondant au marqueur Ml (photo 1) . . Séquençage La séquence de l'insert (SEQ ID N 3) est la suivante (5', 3') : SEQ ID N 3 20 30 40 50 60 70 GTGCTTGCTTATAGCACTACAGGAGAAGGAAGGGGAACACAACAGCCATGGCGAGCGAA GGTTCAACGTCGGAGAAACAGGCTGCGACGGGCAGCAAGGTGCCGGCGGCGGATCGGAG GAAGGAAAAGGAGGAAATCGAAGTTATGCTGGAGGGGCTTGACCTAAGGGCAGATGAGG AGGAGGATGTGGAATTGGAGGAAGATCTAGAGGAGCTTGAGGCAGATGCAAGATGGCTA GCCCTAGCCACAGTTCATACGAAGCGATCGTTTAGTCAAGGGGCTTTCTTTGGGAGTAT GCGCTCAGCATGGAACTGCGCGAAAGAAGTAGATTTCAGAGCAATGAAAGACAATCTGT TCTCGATCCAATTCAATTGTTTGGGGGATTGGGAACGAGTTATGAATGAAGGTCCATGG ACCTTTCGAGGATGTTCGGTGCTCCTCGCAGAATATGATGGCTGGTCCAAGATTGAAT Les séquences correspondant aux amorces utilisées pour les amplifications AFLP ont été retrouvées et montrent que la bande correspond à un fragment de restriction (EcoRI - Msel). En déduisant les séquences correspondant aux amorces, la taille réelle du fragment d'ADN de riz cloné est de 471 pb. L'utilisation des différents couples d'amorces (1-3), (1-4), (1-5) d'une part et (2-3), (2-4), (2-5) d'autre part permet de valider le clonage de la bande AFLP Ml. L'amplification de l'ADN des variétés utilisées dans les croisements avec ces amorces ne montre qu'une seule bande. Le fragment correspondant à la variété Tog56581 est un peu plus important que celui des autres variétés (fig. 2) . Exemple 7 : Transformation de la séquence Ml en marqueur polymorphe Un polymorphisme pour le marqueur Ml a été déterminé entre les parents de la population haploide doublée (IR64 x Azucena). Cette population compte plus de 300 marqueurs répartis sur les 12 chromosomes du riz. Pour cela, on s'est appuyé sur les sites de restriction de la séquence du marqueur Ml déterminée sur le parent IR64 (fig. 3). Les amorces (1-3), (1-4) et (1-5) ont été utilisés pour amplifier l'ADN des parents des croisements qui a ensuite été digéré par des enzymes de restriction. Le site de restriction HpaII/MspI libère un fragment de 86 pb lorsque l'amorce 1 est utilisée. Ce site est absent chez les variétés Gigante et Azucena. (fig. 4). Le marqueur a été testé sur les individus F2 du pool sensible et du pool résistant du croisement (IR64 x Gigante). Tous les individus résistants ont le profil de la variété Gigante (absence du marqueur AFLP Ml associée à l'absence du site de restriction HpaII/MspI) à l'exception de l'individu (5. 11). Les individus sensibles présentent le site de restriction HpaII/MspI à l'état homozygote comme la variété IR64 à l'exception de deux individus hétérozygotes qui sont recombinés (fig. 5). La séquence du marqueur Ml que l'on peut amplifier par des amorces spécifiques correspond bien au marqueur AFLP Ml. La digestion par l'enzyme HpaII/MspI permet de distinguer l'allèle venant du parent sensible (IR64) du parent résistant (Gigante). Ces nouvelles données permettent de conforter la position du locus de résistance entre les marqueurs Ml et M2 et d'estimer les taux de recombinaison à 0,065 0,045 pour la distance entre Ml et le locus de résistance et 0,11 0,047 pour la distance entre les marqueurs Ml et M2. Exemple 8 : Cartographie du marqueur Ml Soixante individus de la population (IR 64 x Azucena) ont été passés pour le marqueur Ml : amplification avec les amorces (1-3) et digestion par l'enzyme HpaII/MspI, suivie d'une séparation des fragments sur un gel d'agarose à 2,5 %. La ségrégation du marqueur Ml est sans distorsion (fig. 6). Les résultats permettent de cartographier le marqueur Ml en utilisant un logiciel de cartographie (Mapmaker V3), qui permet de placer le marqueur Ml sur le chromosome 4 entre les marqueurs RG 163 et RG 214 (fig. 7). Cet intervalle représente la zone où se situe le locus de résistance au RYMV. Exemple 9 : Marquage du locus de résistance de la variété Tog5681 La présence du site de restriction HpaII/MspI dans la variété Tog5681 ne permet pas d'utiliser la stratégie de l'exemple 8 pour vérifier que le marqueur Ml est aussi un marqueur de la résistance provenant de Tog5681. Aussi, les 4 variétés Azucena, Gigante, IR64 et Tog5681 ont été digérées avec 12 enzymes de restriction (BamHI, Bg/II, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, ApaI, KpnI, PstI, ScaI, XbaI, HaeIII) pour identifier un polymorphisme de restriction en utilisant la séquence d'ADN du marqueur Ml comme sonde. L'enzyme ScaI permet d'identifier un polymorphisme entre IR64 et Tog5681 (fig. 8). Ce polymorphisme a été utilisé pour valider le marqueur Ml sur un recroisement (IR64 x Tog5681) x IR64 en ségrégation pour la résistance. 5 individus sensibles de ce recroisement ont été testés et montrent tous la bande caractéristique d'IR64. Les 9 individus résistants ne montrent que la bande de Tog5681 à l'exception d'un seul qui est recombinant (fig. 9). Le polymorphisme de restriction mis en évidence par l'enzyme ScaI en utilisant le marqueur Ml comme sonde est donc bien lié au locus de résistance de Tog5681. L'analyse génétique et l'idendification de marqueurs de résistance sont cohérentes pour considérer que le marqueur Ml cartographie bien le même locus de résistance chez les deux variétés Gigante et Tog5681. Exemple 10 : Transfert de la résistance assitée par la marqueur Ml. On notera que pour la validation des marqueurs de résistance en sélection, on utilisera également avantageusement le matériel résultant des recroisements d'une variété résistante telle que la variété Gigante avec IR64 afin d'introduire la résistance dans cette variété. Un tel matériel peut correspondre à différents stades de recroisement. On dispose par exemple du stade BC2 (87,5% théorique du génome du parent récurrent IR64), mais qui comporte le fragment de chromosome de Gigante portant la résistance au virus. A chaque génération de recroisement, la présence du gène a été vérifiée par une évaluation de la ségrégation de la résistance dans la descendance en autofécondation. Le contrôle des marqueurs sur les recroisements et leurs descendances permet d'éprouver la valeur prédictive de la résistance par la présence du fragment de chromosome portant le gène de résistance. Références bibliographiques (1) Chen, X. et al., (1997), Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L) Theor Appl Genet 95 : 553-567. (2) Panaud, 0. et al., (1996), Development of microsatellite markers and characterization of simple séquence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L) Mol Gen Genet 252 : 597-607. (3) Wu K. S. et al., (1993), Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Mol Gen Genet 241 : 225-235. (4) Zabeau et al., (1993), Selective restriction fragment amplification : a general method for DNA fingerprinting. EP 92402629. 7. (5) Vos et al., (1995), AFLP, a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23 : REVENDICATIONS 1/ ADNc capable de s'hybrider avec un clone BAC criblé à partir d'une banque constituée de fragments d'ADN de 100 à 150 kb d'une variété de riz telle que IR64, par exemple de banque BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), ce clone BAC appartenant à un contig, ou ensemble de clones BAC chevauchant, de clones BAC renfermant les séquences d'ADN des marqueurs identifiés à partir de riz grâce à un procédé comprenant - l'amplification sélective de fragments d'ADN de riz d'une part d'individus résistants, d'autre part d'individus sensibles, descendant de variétés parentales, ces fragments ayant été préalablement soumis à une étape de digestion, puis de ligation pour fixer des adaptateurs complémentaires d' amorces ayant, à leur extrémité, un ou plusieurs nucléotides spécifiques, l'une des amorces du couple étant marquée aux fins de révélation, - la séparation des produits d'amplification, par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, et - la comparaison des profils d'électrophorèse obtenus avec des mélanges de fragments issus de descendants résistants et des mélanges issus de descendants sensibles, avec les fragments provenant des variétés parentales, aux fins d'identification de bandes dont le polymorphisme est génétiquement lié au locus de résistance, cette identification étant suivie le cas échéant, à titre de validation, d'une vérification sur chacun des individus et du calcul du taux de recombinaison génétique entre le marqueur et le locus de résistance. 2/ ADNc selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites bandes AFLP polymorphes sont spécifiquement mises en évidence dans une variété sensible au RYMV, et dans la fraction de plantes sensibles issues du croisement de cette variété avec la variété résistante Gigante. 3/ ADNc selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites séquences d'ADN correspondant auxdites bandes polymorphes, portent le locus de résistance à RYMV et définissent un segment inférieur à lOcM. 4/ ADNc selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites séquences d'ADN sont des fragments EcoRIMseI. 5/ ADNc selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits fragments ont une taille respectivement, de 510 pb et de 140 pb en gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes. 6/ ADNc selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits fragments d'ADN correspondent à des séquences d'ADN flanquant le locus de résistance et situés de part et d'autre de ce dernier, à 5- 10 cM. 7/ ADNc selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise une séquence d'ADN répondant à SEQ ID N 3.