Brevet FR2785501A1 — publié le 20000512

SOLUTION DE PERFUSION ET/OU DE CONSERVATION ET/OU DE REPERFUSION LORS DE LA TRANSPLANTATION D'ORGANES. L'invention a pour objet une solution de perfusion et/ou de conservation et/ou de reperfusion lors de la transplantation d'organes, notamment de l'organe cardiaque. La période de préservation des c#urs humains est à présent de 4 heures et un certain nombre de rejets sont encore dus à une altération,de l'état du greffon entre la période de prélèvement et le moment de l' implantation chez le receveur La préservation myocardique à court terme (4 heures) est assurée actuellement par une conservation au froid après un arrêt cardioplégique. Il existe cependant une variété de procédés différant par la composition de la solution utilisée, la température de la conservation et le protocole d'administration. Différentes solutions d'arrêt et de préservation du coeur ont été développées pour protéger le myocarde en chirurgie cardiaque. La solution de St Thomas [Ledingham, S.J.M., Braimbridge, M.V., Hearse, D. J. The St Thomas' hospital cardioplegic solution : comparison of the efficacay of two formulations. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1987) 93 : a été en particulier très utilisée. Des solutions proches de la solution de St Thomas ont été développées telles que la solution de Broussais [Fabiani, J. N., Ponzio, O., Jebara, V. La protection myocardique ; encycl. Méd. Chir. (Paris, France). , Techniques chirurgicales, Thorax, 42511, 10-1989]. Plus récemment des expériences ont été réalisées avec la solution de l'Université de Wisconsin (UW) [Ledingham, S. J.M., Katayama, O., Lachno, D. R., Yacoub, M.H. Prolonged cardiac preservation. Evaluation of the University of Wisconsin preservation solution by comparison with the St Thomas' solution in the rat. Circulation (1990) 82 (Part2): IV351-8] couramment utilisée pour d'autres organes (foie, rein). L'utilisation de la solution UW a permis en matière de transplantation rénale et hépatique, des progrès impressionnants dans la conservation du greffon en augmentant significativement la durée d'ischémie froide avant transplantation. Certaines équipes ont déjà fait état de résultats intéressants en appliquant la solution UW à la conservation du greffon cardiaque. Cette solution comporte différents éléments protecteurs ; le glutathion et l'allopurinol, inhibiteurs de la formation des radicaux libres de l'oxygène, des agents imperméants (lactobionate et raffinose) et de l'adénosine, un précurseur de l'ATP. Différentes solutions dérivées directement de la solution UW ont été développées, d'autres encore ne reprennent que certains éléments de la solution UW (solution Celsior) [Ménasché, P., Termignon, JL., Pradier, F., Grousset, C., Mouas, C. Expérimental evaluation of Celsior, a new heart preservation solution. Eur J. Cardio. Thorac. Surg. (1994) 8 : 207-213].Il a été montré que la solution de l'Université de Wisconsin (UW) permettait d'améliorer la durée de préservation du myocarde. Cette solution comporte différents éléments protecteurs, le glutathion et l'allopurinol, inhibiteurs de la formation des radicaux libres de l'oxygène, des agents imperméants (lactobionate, raffinose), un précurseur de l'ATP (adénosine). Par contre, cette solution n'a pas été développée spécifiquement pour le coeur et présente différentes caractéristiques qui ne sont pas optimales sinon commageables pour le c#ur: 1) la solution UW est caractérisée par exemple par une forte concentration en K+ (125 mM) dommageable pour la cellule car elle entraîne une contracture, 2) le phosphate inorganique (Pi) est également présent à forte concentration or celui-ci est un inhibiteur de nombreuses ATPases (Na+/K+ ATPase, Ca2+ ATPases) et peut ainsi accroître l'accumulation en Na+ et Ca2+ délétère en cours de l'ischémie, 3) elle ne comprend pas de Ca2+ et de ce fait induit un influx massif de Ca2+ lors de la reperfusion, 4) l'adénosine a de nombreux effets dans le c#ur et sa concentration n'est pas optimisée dans la solution, 5) la solution UW ne comprend pas un certain nombre d'éléments dont l'effet protecteur a pu être démontré dans le c#ur. Il y a plusieurs années une solution de cardioplégie (solution B20) a été développée pour des durées d'ischémie courtes (2 à 3 heures) [Monique Bernard et al. J. Thorac. Cardiovasc Surg 90 : 1985]. Si l'on considère les besoins exprimés par les chirurgiens, seules les options d'un allongement de la durée de préservation à 12 heures ou à 6 mois ou plus présentent un intérêt. Un passage de 4 à 12 heures de préservation correspond en effet beaucoup plus qu'à un incrément marginal de la durée d'ischémie. Il présente plusieurs avantages ; (1) une extension de la zone géographique dans laquelle la collecte des greffons est pratiquée et donc une augmentation pour un patient donné des chances d'être greffé en lui offrant la possibilité d'utiliser un greffon prélevé, géographiquement à distance plus éloignée, (2) de pouvoir envisager de greffer en compatibilité HLA en dégageant le temps nécessaire, pour effectuer le meilleur appariement possible donneur-receveur (de telles greffes ont déjà montré en matière de transplantation rénale de bien meilleurs résultats en terme de survie du greffon, que le simple appariement ABO actuellement utilisé pour les greffes cardiaques), (3) enfin, le passage de 4 à 12 heures laisserait au moins 1 heure pour l'évaluation globale non invasive de l'état métabolique du greffon par spectroscopie de résonance magnétique (SRM) et imagerie par résonance magnétique (IRM) sans rupture de la chaîne de stérilité dans la mesure où l'étude peut se faire dans le sac de conservation. Or, à ce jour, aucune solution connue ne permet une conservation de l'organe cardiaque pendant une durée supérieure à 4 heures, et a fortiori pendant une durée de 12 heures. L'un des buts de l'invention est de proposer une solution de qualité améliorée, utilisée pour arrêter le c#ur puis pour le conserver pendant une durée supérieure à 4 heures, en vue de la transplantation. L'un des autres aspects de l' invention est de proposer une solution d'arrêt et de préservation de l'organe, notamment de l'organe cardiaque, permettant de maintenir une intégrité cellulaire et métabolique des organes après ischémie. Un autre aspect de l'invention est de proposer une solution de conservation d'organes, notamment de l'organe cardiaque, permettant une récupération fonctionnelle post ischémique. L'invention concerne une solution de perfusion et/ou de conservation et/ou de reperfusion lors de la transplantation d'organes, notamment de l'organe cardiaque, caractérisé en ce qu'elle contient les éléments suivants : K+ à raison d'environ 4 à environ 7 mM, notamment environ 4 mM Ca2+ à raison d'environ 0,2 à environ 0,3 mM, notamment environ 0,25 mM Mg2+ à raison d'environ 13 à environ 16 mM, notamment environ 13 mM glutamate à raison d'environ 18 à environ 22 mM, notamment environ 20 mM arginine à raison d'environ 2 à environ 4 mM, notamment environ 3 mM adénosine à raison d'environ 0,5 à environ 1 mM, notamment environ 0,5 mM La solution développée dans le cadre de la présente invention pour l'arrêt et la préservation des c#urs pour une ischémie de longue durée est telle qu'elle induit l'arrêt cardiaque avec une forte concentration en magnésium plutôt qu'en potassium. Elle comprend par ailleurs du glutamate (substrat métabolique de l'ATP en anaérobie) et se caractérise par une concentration non nulle en Ca2+ et une concentration en Na+ de type extracellulaire. A cette solution ont été ajoutés différents agents protecteurs, (lactobionate, raffinose, glutathion-forme réduite-, allopurinol et adénosine). En ce qui concerne certains composés (adénosine, butanedione-2,3-monoxime), une recherche de la concentration optimale a été réalisée. Des travaux récents ont souligné l'importance du dysfonctionnement endothélial dans les dommages liés à la séquence ischémie-reperfusion. De ce fait, a été incluse la L-arginine, précurseur de NO, dans la solution de préservation. Par solution de reperfusion lors de la transplantation d'organes, on désigne une solution utilisable pendant la greffe d'un organe, pour faire passer l'organe greffé de l'état d'ischémie à l'état cardioplégique. Selon un mode de réalisation avantageux, la solution de l' invention ne contient pas de butanedione 2,3-monoxime. Selon un mode de réalisation avantageux, la solution de l' invention contient au moins un agent imperméant choisi parmi l'acide lactobionique, le mannitol et le raffinose Par ordre de préférence, l'agent imperméant est choisi parmi : l'acide lactobionique, le mannitol et le raffinose Selon un autre mode de réalisation avantageux, la solution de l'invention contient au moins un agent piégeur de radicaux libres, notamment choisi parmi le glutathion (forme réduite), l'allopurinol, ou le mannitol. Selon un autre mode de réalisation avantageux, la solution de l' invention contient les éléments suivants : K+ à raison d'environ 4 à environ 7 mM, notamment environ 4 mM Ca2+ à raison d'environ 0,2 à environ 0,3 mM, notamment environ 0,25 mM Mg2+ à raison d'environ 13 à environ 16 mM, notamment environ 13 mM glutamate à raison d'environ 18 à environ 22 mM, notamment environ 20 mM arginine à raison d'environ 2 à environ 4 mM, notamment environ 3 mM adénosine à raison d'environ 0,5 à environ 1 mM, notamment environ 0,5 mM - au moins un agent imperméant, - au moins un agent piégeur de radicaux libres Osmolarité 340 mOsm pH 7,4 Selon un autre mode de réalisation avantageux, la solution de l'invention contient les éléments suivants : K+ d'environ 4 à environ 7 mM Ca2+ d'environ 0,2 à environ 0,3 mM Na+ d'environ 108 à environ 132 mM Mg2+ d'environ 13 à environ 16 mM glutamate d'environ 18 à environ 22 mM arginine d'environ 2 à environ 4 mM adénosine d'environ 0,5 à environ 1 mM mannitol d'environ 27 à environ 33 mM allopurinol d'environ 0,9 à environ 1,1mM glutathion (forme réduite) d'environ 2,7 à environ 3,3 mM raffinose d'environ 25 à environ 35 mM acide lactobionique d'environ 80 à environ 120 mM pH d'environ 7,2 à environ 7,4 osmolarité d'environ 330 à environ 360 mOsm Dans la solution de l'invention, Na+ est sous forme NaOH, K+ est sous forme KC1 et KH2 P04, avantageusement à raison d'environ 2 à environ 3,5 mM KC1 et d'environ 2 à environ 3,5 mM KH2 P04, Ca2+ est sous forme de Ca Cl2, 2H2O et Mg2+ est sous forme MgClz, 6H20. La solution de l' invention est telle qu' elle permet la conservation d'organes, notamment de l'organe cardiaque pendant une durée d'au moins 12 à 15 heures et notamment pendant au moins 12 heures. L'invention concerne également une solution telle que définie ci-dessus, pour maintenir l'intégrité cellulaire et métabolique de l'organe après ischémie, cette intégrité pouvant être détectée par mesure des activités de l'un au moins des enzymes suivantes : lactate déshydrogénase, créatine kinase et/ou par mesure de l'un au moins des métabolites suivants : purines, nucléotides notamment nucléotides adényliques, inosine monophosphate, adénosine triphosphate, acides aminés, phosphate inorganique, lactate, phosphocréatine. L'invention concerne également une solution telle que définie ci-dessus, pour assurer la récupération fonctionnelle post ischémique, cette récupération fonctionnelle pouvant être mesurée par la mesure d'un au moins des paramètres hémodynamiques suivants : le débit coronaire, la pression développée, la fréquence cardiaque, et la pression diastolique. La qualité de la préservation est mesurée par l'étude de paramètres fonctionnels et métaboliques ainsi que par la mesure de l' intégrité cellulaire. Les paramètres fonctionnels mesurés sont : - la pression développée, - la pression diastolique, - la fréquence cardiaque, ces trois paramètres étant mesurés grâce à un ballonnet placé dans le ventricule gauche sur lequel se contracte le coeur ; le ballonnet est relié à un amplificateur (Statham P23dB) qui est connecté à un enregistreur, - et le débit coronaire(mesure des effluats sortant du c#ur pendant un temps donné). Les paramètres fonctionnels sont mesurés pendant la période de contrôle et pendant la période de reperfusion. Les paramètres métaboliques mesurés sont : - le phosphate inorganique, - l'adénosine triphosphate, - la phosphocréatine, et - le pH intracellulaire. L'acquisition de spectres de RMN du P-31 permet de suivre les niveaux de Pi (phosphate inorganique), ATP (adénosine triphosphate), PCr (phosphocréatine) ainsi que le pH intracellulaire (ATP et PCr = composés phosphorés à haute énergie). Les spectres sont acquis pendant toute la durée de l'expérience (contrôle, ischémie, reperfusion). Les nucléotides adényliques, l'inosine monophosphate et les purines sont mesurés dans les c#urs congelés en fin d'expérience ; cette mesure est complémentaire des résultats obtenus à partir des spectres de RMN du P-31. Les acides aminés sont mesurés dans les c#urs congelés à la fin des expériences. Ils jouent un rôle important dans le métabolisme et le maintien de la fonction cellulaire cardiaque. Ils sont déplétés pendant l' ischémie et la reperfusion. L'amplitude de cette déplétion est un reflet de l'altération du c#ur. Le phosphate inorganique (Pi) et les purines sont mesurés dans les effluats sortant du c#ur et donc sont mesurés uniquement pendant les périodes de perfusion (contrôle et reperfusion). Le Pi et les purines sont accumulés durant l'ischémie et sortent du c#ur au moment de la reperfusion, représentant une perte de précurseurs pour la synthèse des composés à haute énergie. Le lactate dans les effluats (contrôle et reperfusion) est évalué en tant qu'indice du métabolisme énergétique en anaérobie. Paramètres reflétant l' intégrité cellulaire. La fuite de créatine kinase (CK) dans les effluats indique un dommage cellulaire. Les quantités de créatine kinase (CK) et de lactate déshydrogénase (LDH) dans les c#urs congelés à la fin de l'expérience représentent également un indice de l' intégrité cellulaire. Le contenu myocardique en eau reflète également l' intégrité cellulaire. Afin de mettre en évidence l' intérêt présenté par la solution de l' invention, celleci a été comparée, à l'aide d'un grand nombre de paramètres et vis-à-vis de la protection apportée, aux solutions de référence que sont la solution de St Thomas et la solution UW, utilisées en matière de préservation des greffons cardiaques. Une comparaison avec les solutions Broussais et Celsior, utilisées dans certains centres de transplantation français a été également faite. Les résultats montrent que la solution de l' invention permet une protection supérieure à celle apportée par les autres solutions : St Thomas, UW, Broussais, Celsior (cf. figures). La solution de l'invention peut être utilisée pendant toutes les phases d'une transplantation : 1) pour arrêter le c#ur du donneur (solution cardioplégique), 2) pour conserver le c#ur (stockage hypothermique, transport), 3) pendant la réimplantation chez le receveur. Les solutions de l'invention peuvent être préparées de la façon suivante : les différents constituants sont dissous et dilués dans de l'eau distillée, le pH est ajusté à 7,4 avec NaOH,. La solution est filtrée sur 0,2 m. La solution apyrogène et stérile est préparée et conservée à l'abri de l'oxygène de l'air. ABREVIATIONS UTILISEES (figures, texte) ATP = adénosine triphosphate ADP = adénosine diphosphate AMP = adénosine monophosphate PCr = phosphocréatine Pi = phosphate inorganique LDH = lactate déshydrogénase CK = créatine kinase HPLC ou CLHP = chromatographie liquide haute pression SRM = spectroscopie de résonance magnétique EDP = pression diastolique dP = pression développée CF = débit coronaire RPP = "rate pressure product" = fréquence cardiaque x pression développée NAD = nicotinamide adénine dinucléotide. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente le protocole expérimental utilisé dans les exemples 1 et 2 décrits ci-après. Sur la figure 1, # # # # et # ont les significations suivantes : # correspond au contrôle (20 mn, 37 C) ; on mesure PCr, ATP, Pi, pHi par spectres P-31, et on mesure Pi, CK, purines et lactate dans les effluats. # correspond à l' ischémie (6h ou 8h ou 12h à 4 C) on mesure PCr, ATP, Pi, pHi par spectres P-31. # correspond à la reperfusion pendant lh à 37 C; on mesure : - PCr, ATP, Pi, pHi par spectres P-31 - Pi, CK, lactate et purines dans les effluats pendant la reperfusion ; on mesure ensuite les nucléotides, purines, acides aminés et le contenu en eau après la congélation des c#urs. # correspond à l'étape de cardioplégie (50 ml). # correspond à la congélation des c#urs. La figure 2 représente le protocole expérimental n 1 (voir exemple comparatif 3). Sur la figure 2, # # # et # ont les significations suivantes : # contrôle (20 mn, 37 C). # ischémie (12h, 4 C). # reperfusion (1h, 37 C). # correspond à l'étape de cardioplégie (50 ml). Les figures 3A et 3B représentent, dans le cadre du protocole n 1, la cinétique des paramètres hémodynamiques au cours de la reperfusion à l'aide respectivement de la solution de St Thomas (repérée par des carrés noirs), de la solution de Broussais (repérée par des carrés blancs), de la solution UW (repérée par des ronds noirs), de la solution de l'invention (repérée par des ronds blancs). *p #p La figure 3A représente le produit de la fréquence cardiaque par la pression développée (RPP) (pourcentage par rapport au contrôle) exprimé en fonction du temps de reperfusion (en minutes). La figure 3B représente le débit coronaire (CF) (pourcentage par rapport au contrôle) exprimé en fonction du temps de reperfusion en minutes. La figure 4A représente, dans le cadre du protocole n 1, la variation de la phosphocréatine (PCr) (pourcentage par rapport au contrôle) en fonction du temps de reperfusion (exprimé en minutes). La figure 4B représente, dans le cadre du protocole n 1, la variation de l'adénosine triphosphate (ATP) (pourcentage par rapport au contrôle) en fonction du temps de reperfusion (exprimé en minutes). La figure 4C représente, dans le cadre du protocole n 1, la variation de pH intracellulaire (pHi). Dans les figures 4A, 4B et 4C, le temps 0 correspond à la fin de l' ischémie. Dans les figures 4A. 4B. 4C, on a représenté respectivement la solution de St Thomas (repérée par des carrés noirs), la solution de Broussais (repérée par des carrés blancs), la solution UW (repérée par des ronds noirs), la solution de l'invention (repérée par des ronds blancs). Dans les figures 4A. 4B. 4C *p La figure 5 représente, dans le cadre du protocole n 1, les contenus en nucléotides adényliques (ATP = adénosine triphosphate, ADP = adénosine diphosphate, AMP = adénosine monophosphate, IMP (inosine monophosphate), et purines, dans les c#urs congelés à la fin de l'ischémie). Ces contenus sont exprimés en micromoles par gramme de protéines. La solution de St Thomas est représentée en noir, la solution de Broussais est représentée en hachure noir et blanc. La solution UW est représentée par des pointillés perpendiculaires et la solution de l'invention est représentée en gris. Sur la figure 5 *p La figure 6 représente, dans le cadre du protocole n 2, les métabolites dans les effluats coronaires au cours de la reperfusion. Ces métabolites sont : - CK (créatine kinase) exprimée en unités internationales par 60 mn de reperfusion, - Pi (phosphate inorganique) exprimé en micromoles par 60 minutes de reperfusion, - purines exprimées en micromoles par 60 minutes de reperfusion. Sur la figure 6 *p Les figures 7A et 7B correspondent au protocole expérimental n 2. La figure 7A correspond au groupe A (défini dans le protocole n 2). La figure 7 B correspond au groupe B (défini dans le protocole n 2). Sur les figures 7A et 7B, # # # # # # # et Obis ont les significations suivantes : # préparation Obis ischémie (5h). # transplantation (30 à 40 mn). # reperfusion in vivo (18 à 24h). # perfusion du c#ur isolé (60 mn). # cardioplégie (50 ml). # SRM du P-31 in situ. # prélèvement du c#ur. La figure 8A correspond, dans le cadre du protocole n 2, à la variation du rapport PCr/ATP exprimé en fonction du temps (en minutes). La figure 8 B correspond à la variation de pH intracellulaire (pHi) exprimé en fonction du temps (en minutes). Le groupe B correspond à l'ensemble c#ur 1 et c#ur 2. Les résultats du groupe A correspondent à la moyenne de 4 expériences. Les résultats du groupe B sont représentés par 2 expériences (c#ur 1 et c#ur 2). Les courbes avec des carrés blancs comportant un point en leur centre, correspondent au groupe A, les courbes avec des losanges noirs correspondent au c#ur 1 (groupe B) et les courbes comportant des carrés blancs correspondent au c#ur 2 (groupe B). La figure 9 représente le protocole expérimental n 3. Sur la figure 9, # # # et # ont les significations suivantes : # contrôle (20 mn, 37 C). # ischémie (8h, 4 C). # reperfusion (lh, 37 C). # cardioplégie (50 ml). La figure 10A correspond, dans le cadre du protocole n 3, à la variation de pression diastolique (EDP) (en mm de Hg), exprimée en fonction du temps de reperfusion (en minutes). La figure 10B correspond, dans le cadre du protocole n 3, à la variation du produit de la pression développée par la fréquence cardiaque (RPP) (exprimé en pourcentage de la valeur contrôle) en fonction du temps de reperfusion (en minutes). Dans les figures 10 A et 10B les courbes comportant des ronds blancs correspondent à la présence d'arginine et les courbes comportant des ronds noirs correspondent à la solution de contrôle. p La figure 11correspond au protocole expérimental n 4. Sur la figure 11, # # # et # ont les significations suivantes : # contrôle (20 mn, 37 C). # ischémie (8h, 4 C). # reperfusion (1h, 37 C). # cardioplégie (50 ml). La figure 12 correspond, dans le cadre du protocole n 4, à la variation du débit coronaire (CF) (exprimé en ml/mn) en fonction du temps de reperfusion (en minutes). La courbe avec des ronds noirs correspond à la solution Celsior et la courbe avec des ronds blancs correspond à la solution de l'invention. La figure 13 correspond, dans le cadre du protocole n 4, à la variation de pression diastolique (EDP) (exprimé en mm/Hg) en fonction du temps de reperfusion (en minutes). La courbe avec des ronds noirs correspond à la solution Celsior et la courbe avec des ronds blancs correspond à la solution de l' invention. La figure 14 correspond, dans le cadre du protocole n 4, au dosage des nucléotides dans les c#urs congelés à la fin de la reperfusion. On a exprimé ainsi le dosage d'ATP (adénosine triphosphate), d'ADP (adénosine diphosphate), d'AMP (adénosine monophosphate), d'IMP (inosine monophosphate), de NAD (nicotinamide adénine dinucléotide), de PCr (phosphocréatine), en micromoles par grammes de protéines. La solution Celsior est représentée en noir et la solution de l'invention est représenté par des hachures. p EXEMPLES EXEMPLE 1 : DE C#UR ISOLE PERFUSE 1.1. Préparation du c#ur perfusé Les coeurs sont prélevés sur des rats mâles Sprague Dawley de 350 à 375g et anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital. Les c#urs sont ensuite perfusés suivant le modèle du c#ur contractant isovolumique. Dans ce modèle, le coeur est perfusé avec du tampon Krebs-Henseleit à 37 C, sans phosphate, de façon rétrograde par l'aorte, à une pression constante de lOOmmHg. Un ballon incompressible, placé dans le ventricule gauche rend la contraction isovolumique. Ce modèle permet d'évaluer la fonction cardiaque, par la pression développée et de mesurer la compliance par la mesure de la pression diastolique. 1. 2. Appareillage de perfusion Le système de perfusion est composé de différents réservoirs thermostatés à 37 C grâce à une circulation continue d'eau. Un circuit indépendant est prévu pour le réservoir contenant la solution de cardioplégie, maintenu à 4 ou 7,5 C. Dans le tube de spectroscopie de résonance magnétique (SRM), les effluats coronaires sont évacués par aspiration grâce à une pompe rotative et sont recueillis à des temps donnés pour la réalisation de différents dosages biochimiques. 1. 3. Solutions de perfusion Pendant les périodes de perfusion normoxique, la solution employée est du tampon bicarbonate de Krebs-Henseleit. La solution de cardioplégie utilisée pour arrêter et conserver le c#ur est variable. 1.4. Expériences de SRM du P-31 Les spectres de SRM du P-31 sont obtenus à 81MHz en utilisant un spectromètre Bruker-Nicolet WP-200 interface à un aimant vertical de 4,7 Tesla, équipé d'une sonde sélective de 20mm de diamètre. L'homogénéité du champ magnétique est réalisée en utilisant le signal des protons de l'échantillon contenus dans le volume sensible de la bobine. Les spectres sont acquis en 5 minutes par la sommation de 428 signaux d'induction libre avec un angle d' impulsion de 45 et un temps de répétition de 0,7sec. La largeur spectrale est de 6000Hz et la taille de mémoire de 2K. Avant la transformation de Fourier, le signal d'induction libre est multiplié par une fonction exponentielle générant un élargissement des raies de 20Hz. 1.4.1. Analyse des données de SRM du P-31 Les signaux observés sur le spectre de RMN du P-31 sont ceux du phosphate inorganique, de la phosphocréatine et des 3 phosphores de l'ATP. Sur certains spectres on peut observer un signal attribué aux phosphomonoesters (sucres phosphates). Les aires et les positions des résonances sont déterminées en utilisant le programme NMR1 (New Methods Research Syracuse , NY) sur une station de traitement IBM Risc System 6000. 1. 4.2. Quantification des dérivés phosphorés Les aires mesurées sont corrigées en tenant compte des facteurs de saturation déterminés en comparant les spectres acquis à des spectres complètement relaxés. Les aires des différents métabolites peuvent alors être converties en concentrations en se rapportant à l'aire de l'ATPp, considérant une concentration cytosolique de ll,6mM pour l'ATP (déterminée par chromatographie liquide haute pression). 1. 4.3. Mesure du pH intracellulaire La valeur du pH est calculée à partir du déplacement chimique du phosphate inorganique, relativement à la résonance de la phosphocréatine. En effet, sa position sur le spectre est indépendante du pH, permettant de relier le déplacement chimique du signal au pH grâce à une courbe de titration. 1. 5. Analyses biochimiques 1.5.1. Dosages dans les effluats de c#ur Dosage de la créatine kinase La créatine kinase dosée dans les effluats est un bon indicateur de l' intégrité cellulaire, la fuite en créatine kinase étant proportionnelle à l' intensité de la lyse cellulaire. L'activité totale de la CK est mesurée suivant la méthode de Rosalki à 30 C en utilisant un kit sigma [Rosalki, S. B. An improved procedure for serum creatine phosphokinase détermination. J. Lab. Med. 69,696-705 (1967). ] Un petit volume d'effluat est congelé de manière à pouvoir doser ultérieurement, le phosphate et le lactate ainsi que les purines. Dosage du phosphate Le phosphate est dosé par méthode colorimétrique [Ames, B.N. Assay of inorganic phosphates, total phosphate and phosphatases. Methods in Enzymology. 8, 115-118 (1966)] Dosage du lactate. Le lactate est dosé de manière enzymatique [Gutman, I. and Wahlefeld, A.W.L- (+)-.Lactase. Determination with lactate dehydrogenase and NAD. In Methods of Enzymatic Analysis (H.U. Bergmeymer), 3,1464-1468. Acad Press NY, New Yord, 1974]. Dosage des purines Le dosage des purines est réalisé par CLHP en mode isocratique [Wynants, J. , et al. Optimization of a HPLC method for the determination of nucleosides and their catabolites. Application to cat and rabbit heart perfusates. J Chromatogr. 386,297- 275 (1951)]. sur colonne Lichrosorb RP select B (45) à l'aide d'un système chromatographique (LKB, Bromma, Suède) comportant une pompe (modèle 2150), un détecteur à longueur d'onde variable (modèle 2151), un contrôleur (modèle 2152) ainsi qu'une vanne d'injection (Rheodyne 7125). Les données sont acquises en utilisant un programme d'intégration KONTRON pour PC (Kontron Instruments Munich, FRG). Les purines mises en évidence sont l'adénosine, l'inosine, l'allopurinol, la xanthine et l'hypoxanthine. 1. 5.2. Dosages dans les c#urs congelés A la fin de chaque expérience, les c#urs sont rapidement plongés dans l'azote liquide (freeze-clamping). Les c#urs sont ensuite placés au congélateur à -80 C pour des analyses métaboliques ultérieures et la détermination de leur contenu en eau. Détermination du contenu en eau Des fragments de c#ur sont décongelés, pesés, soumis à dessiccation pendant 48 heures puis repesés après cette perte d'eau. Cette technique permet d'évaluer le pourcentage d'eau dans les tissus et d'en déduire l'importance de l'#dème après reperfusion. Dosage de la créatine kinase Lors des dosages, environ 30mg de c#ur sont décongelés et homogénéisés dans un tampon de potassium phosphate, le dosage de la créatine kinase est ensuite réalisé par la même méthode enzymatique que dans les effluats. Les activités enzymatiques sont exprimées en unités internationales (UI) par milligramme de protéines cardiaques mesurées suivant la méthode de Lowry et Coll [Lowry, O. H., et al., R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem 193,265-275 (1951)]. Dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) L'activité de la LDH est mesurée par la méthode de Bernstein et Everse [Bernstein, L. K. and Everse, J. Determination of the isoenzyme levels of lactate deshydrogenase. Methods Enzymol. 41,47-52 (1975) ] dans les c#urs traités par un tampon potassium phosphate. Dosage des nucléotides par chromatographie liquide haute pression (CLHP). Les nucléotides sont dosés dans les extraits perchloriques des c#urs congelés à la fin de l'expérience. Le dosage des nucléotides est réalisé par CLHP en mode gradient sur colonne Lichrospher RP-18 sur le même système chromatographique que pour le dosage des purines. Le contenu total en nucléotides adényliques (ATP+ADP+AMP= TAN) est présenté dans les résultats. Dosage des acides aminés par chromatographie liquide haute pression (CLHP). Les acides aminés libres sont mesurés dans les extraits perchloriques en utilisant la méthode Pico-Tag (Waters) fondée sur les résultats de Cohen et al [Cohen, S.A., etal., PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320,769-770 (1986) ]. EXEMPLE 2 : TRANSPLANTATION CARDIAQUE HÉTÉROTOPIQUE ABDOMINALE CHEZ LE RAT LEWIS Des rats mâles Lewis de 300 à 375g sont utilisés comme donneurs et receveurs. Tous les animaux reçoivent des soins et sont maintenus dans un environnement conforme aux législations réglementant l'expérimentation animale. L'anesthésie est induite et maintenue à l'éther. La transplantation se déroule selon une procédure propre, non stérile. Préparation du donneur Après anesthésie, une laparotomie médiane xyphopubienne est réalisée et l'aorte et la veine cave sont contrôlées à l'étage sous rénal. 300 UI d'héparine sont injectées dans la veine cave inférieure, un long cathéter est introduit dans l'aorte de façon rétrograde et l'arrêt cardiaque est induit par injection de 40ml de liquide de cardioplégie. Le thorax est ensuite abordé par un volet costal antérieur. 10ml supplémentaires de liquide de cardioplégie sont injectés à travers la veine cave inférieure sus-diaphragmatique, afin de purger les cavités cardiaques. Les veines caves inférieures, supérieures droite et gauche sont liées. L'artère pulmonaire est sectionnée prés de sa bifurcation et l'aorte, au pied du TABC. Enfin, les veines pulmonaires sont immédiatement immergées dans le liquide de cardioplégie à 4 C. Préparation du receveur Après anesthésie, une laparotomie médiane xyphopubienne est réalisée. L'aorte et la veine cave sont contrôlées et exposées en sous-rénal. Après électrocoagulation des artères et des veines lombaires, les vaisseaux sont clampés par un double clamp approximateur. Le greffon est placé transversalement à gauche de l'aorte du receveur, dans la cavité abdominale, l'hypothermie locale est maintenue à l'aide d'un glaçon. La suture aortique est menée en premier (anastomose termino-latérale entre l'aorte du donneur et l'aorte du receveur au monofil de polyamide 10/0-aiguille BV70, puis l'anastomose entre l' artère pulmonaire du donneur et la veine cave du receveur est conduite de la même manière). Un déclamplage progressif des vaisseaux en aval puis en amont est ensuite réalisé pendant que le c#ur est réchauffé à l'aide de sérum à 37 C. Après vérification de l'hémostase, l'abdomen est ensuite refermé en 2 plans par un surjet. A la 24ème heure, l'animal est à nouveau anesthésié pour une 2ème laparotomie. L'aspect fonctionnel du greffon est noté. Le greffon est excisé, puis canulé et perfusé au krebs pour étude hémodynamique et métabolique par spectroscopie de résonance magnétique du phosphore-31. L'animal est ensuite sacrifié. EXEMPLE COMPARATIF 3 Protocole 1 : hémodynamique et métabolique par spectroscopie de résonance magnétique du P-31 sur des c#urs soumis à une ischémie totale de 12 heures, après un arrêt cardioplégique sur une préparation de c#ur isolé, perfusé. Dans ce protocole, 4 solutions cardioplégiques ont été comparées, la solution UW, la solution de Broussais, la solution de St Thomas et la solution CRMBM. Les résultats montrent une meilleure préservation du métabolisme et de l'intégrité cellulaire au cours de l'ischémie et de la reperfusion après une ischémie de 12 heures avec la solution CRMBM, comme cela a déjà été observé dans un protocole de 6 heures d'ischémie (non montré). La récupération fonctionnelle est très significativement améliorée avec cette solution après une ischémie de 12 heures puisqu'elle atteint 50 % dans ce groupe alors qu'elle est pratiquement nulle avec les autres solutions. Protocole 2 : Evaluation métabolique et hémodynamique sur le modèle de la transplantation hétérotopique en position abdominale chez le rat. Le modèle de la transplantation hétérotopique permet de réaliser une reperfusion physiologique (au sang, déclampage progressif, assistance cardiaque prolongée). D'autre part, il permet d'évaluer la récupération métabolique et fonctionnelle à long terme. Les c#urs sont divisés en 2 groupes dans cette étude. : Groupe A (contrôle) : la transplantation est effectuée immédiatement après le prélèvement (la durée d'ischémie est de 40 mn environ). Groupe B : le c#ur prélevé sur le donneur subit une ischémie froide de 5h20 avant transplantation (ischémie totale de 6 heures en comptant la durée de la réalisation opératoire de la transplantation). Après implantation du c#ur, l'animal receveur est refermé et le c#ur est examiné après une période de 24 H. Une étude du c#ur est d'abord réalisée in situ sur l'animal entier par SRM du P-31 sur le système Biospec en utilisant une bobine de surface double accord 'H-"P de 1,5 cm de diamètre. Son aspect morphologique est également examiné puis, comme le c#ur ne travaille pas dans ce modèle, le c#ur est excisé et une évaluation hémodynamique est réalisée sur un modèle de coeur isovolumique avec évaluation du métabolisme énergétique par spectroscopie de résonance magnétique (étude sur le spectromètre Bruker-Nicolet WP2000 couplé à un aimant vertical de 4,7T). Des dosages biochimiques sont également réalisés dans les effluats et dans les c#urs congelés à la fin des expériences. Les c#urs transplantés dans les 2 groupes ont tous repris des contractions régulières lors du déclampage. Après 24 heures les c#urs examinés in situ par SRM présentent des niveaux similaires en métabolites énergétiques quelle que soit la durée de l'ischémie. De même les c#urs explantés et perfusés sont caractérisés par des indices métaboliques et fonctionnels similaires dans les deux groupes. Les résultats obtenus sur le modèle de la transplantation hétérotopique chez le rat montrent que la solution mise au point apporte une bonne protection sur ce modèle et valident les résultats acquis sur le modèle du c#ur isolé, perfusé. Protocole 3 : de la solution CRMBM par l'ajout de L-arginine : étude hémodynamique et métabolique sur le modèle de c#ur isolé et perfusé. L'apport de L-arginine à la solution de préservation a été étudié sur le modèle du c#ur isolé, perfusé décrit précédemment, soumis à 8 H d'ischémie. Les résultats montrent une amélioration de la récupération fonctionnelle post-ischémique et un pool plus élevé en acides aminés au cours de la reperfusion. Protocole 4 : comparaison de la solution CRMBM avec la solution Celsior récemment brevetée : étude hémodynamique et métabolique sur le modèle de c#ur isolé et perfusé. L'étude réalisée sur le c#ur isolé, perfusé, soumis à 8 heures d'ischémie démontre l'obtention d'une meilleure protection de l'intégrité membranaire avec la solution CRMBM, ainsi que l'atteste en particulier une perte réduite de la créatine kinase au cours de la reperfusion. REVENDICATIONS 1. Solution de perfusion et/ou de conservation et/ou de reperfusion lors de la transplantation d'organes, notamment de l'organe cardiaque, caractérisée en ce qu'elle contient les éléments suivants : K+ à raison d'environ 4 à environ 7 mM, notamment environ 4 mM Ca2+ à raison d'environ 0,2 à environ 0,3 mM, notamment environ 0,25 mM Mg2+ à raison d'environ 13 à environ 16 mM, notamment environ 13 mM glutamate à raison d'environ 18 à environ 22 mM, notamment environ 20 mM arginine à raison d'environ 2 à environ 4 mM, notamment environ 3 mM adénosine à raison d'environ 0,5 à environ 1 mM, notamment environ 0,5 mM 2. Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un agent imperméant choisi par ordre de préférence parmi l'acide lactobionique, le mannitol et le raffinose 3. Solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un agent piégeur de radicaux libres, notamment choisi parmi le glutathion (forme réduite), l'allopurinol, ou le mannitol. 4. Solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient les éléments suivants : K+ à raison d'environ 4 à environ 7 mM, notamment environ 4 mM Ca2+ à raison d'environ 0,2 à environ 0,3 mM, notamment environ 0,25 mM Mg2+ à raison d'environ 13 à environ 16 mM, notamment environ 13 mM glutamate à raison d'environ 18 à environ 22 mM, notamment environ 20 mM arginine à raison d'environ 2 à environ 4 mM, notamment environ 3 mM adénosine à raison d'environ 0,5 à environ 1 mM, notamment environ 0,5 mM - au moins un agent imperméant, - au moins un agent piégeur de radicaux libres Osmolarité 340 mM pH 7,4 5. Solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient les éléments suivants : K+ d'environ 4 à environ 7 mM Ca2+ d'environ 0,2 à environ 0,3 mM Na+ d'environ 108 à environ 132 mM Mg2+ d'environ 13 à environ 16 mM glutamate d'environ 18 à environ 22 mM arginine d'environ 2 à environ 4 mM adénosine d'environ 0,5 à environ 1 mM mannitol d'environ 27 à environ 33 mM allopurinol d'environ 0,9 à environ 1,1mM glutathion (forme réduite) d'environ 2,7 à environ 3,3 mM raffinose d'environ 25 à environ 35 mM acide lactobionique d'environ 80 à environ 120 mM pH d'environ 7,2 à environ 7,4 osmolarité d'environ 330 à environ 360 mOsm 6. Solution selon la revendication 5, dans laquelle Na+ est sous forme NaOH, K+ est sous forme KCI et KH2 P04, avantageusement à .raison d'environ 2 à environ 3,5 mM KCI et d'environ 2 à environ 3,5 mM KH2 P04, Ca2+ est sous forme de Ca Cl2, 2H2O et Mg2+ est sous forme MgCl2, 6H2O. 7. Utilisation d'une solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la conservation d'organes, notamment de l'organe cardiaque pendant une durée d'au moins 12 à 15 heures et notamment pendant au moins 12 heures. 8. Utilisation selon la revendication 7 d'une solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour maintenir l'intégrité cellulaire et métabolique de l'organe après ischémie, cette intégrité pouvant être détectée par mesure des activités de l'un au moins des enzymes suivantes : lactate déshydrogénase, créatine kinase et/ou par mesure de l'un au moins des métabolites suivants : purines, nucléotides notamment nucléotides adényliques, inosine monophosphate, adénosine triphosphate, acides aminés, phosphate inorganique, lactate, phosphocréatine. 9. Utilisation selon la revendication 7, d'une solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour assurer la récupération fonctionnelle post ischémique, cette récupération fonctionnelle pouvant être mesurée par la mesure d'un au moins des paramètres hémodynamiques suivants : le débit coronaire, la pression développée, la fréquence cardiaque, et la pression diastolique.