Brevet FR2779433A1 — publié le 19991210

L'invention est relative au clonage de gènes intervenant dans la régulation de la division cellulaire chez les végétaux, et à leurs utilisations. La plupart des organes végétaux se développent s après la germination, par différenciation à partir des méristèmes. Préalablement à la différenciation, se produisent dans les méristèmes le ralentissement puis l'arrêt du cycle de division cellulaire. Simultanément, on observe fréquemment une augmentation de la taille des cellules, et une réplication du génome non accompagnée de mitose, dénommée " endoréplication ". L'endoréplication est un phénomène bien connu lors du développement de tissus de réserve; KOWLES [Genome, 35, pp. 68- 77, (1992)] mentionne ainsi une ploidie de 6C à 384C lors du développement de l'endosperme chez le maïs. Les phénomènes intervenant lors de l'arrêt de la division cellulaire précédant la différenciation jouent un rôle essentiel dans le développement et l'ontogenèse végétale. Les mécanismes impliqués dans ces phénomènes sont encore mal connus; il semble que l'inhibition du facteur promoteur de la phase M, et l'induction des protéine-kinases de la phase S (GRAFI, Science, 269, pp. 1262-1264, (1995)] seraient impliqués. Toutefois, on n'a jusqu'à présent identifié aucun facteur directement impliqué dans ce mécanisme chez les plantes. Les Inventeurs ont entrepris l'étude de ce mécanisme, dans le but de découvrir des moyens de le contrôler, et d'agir par son intermédiaire sur le développement et l'ontogenèse végétale. Ils ont choisi comme modèle d'étude le système symbiotique Rhizobium/légumineuses. Dans ce système, les facteurs Nod de nature lipooligosaccharidique, produits par les Rhizobium, constituent des signaux mitogènes qui induisent localement la formation d'un nouveau méristème, à partir duquel se différencient les cellules formant les nodosités racinaires [TRUCHET, Nature, 351, pp. 670-673, (1991); YANG, Plant Cell, 6, pp. 1415-1426, (1994); SAVOURE, EMBO.J., 13, pp. 1093-1102, (1994)]. Les nodosités comprennent 3 zones principales: une zone apicale, constituée de cellules méristématiques; une zone intermédiaire d'invasion, ou de différenciation (zone II), o intervient l'infection des cellules par les bactéries, ainsi que l'arrêt de la division cellulaire, accompagné d'endoréplication et d'augmentation de la taille des cellules, et suivi par leur différenciation; et une zone de fixation (zone III), formée de cellules différenciées infectées par les bactéries, et o intervient la fixation de l'azote. Au cours de cette étude, les Inventeurs ont isolé, à partir de nodosités de luzerne (Medicago sativa), un gène jouant un rôle essentiel dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'induction de l'endoréplication. Ce gène, dénommé ci-après ccc52Ms, code pour un polypeptide de 475 acides aminés, ayant une masse moléculaire théorique de 52 kDa, dénommé ci-après ccc52Ms; cette protéine comprend des motifs WD répétés; la présence de tels motifs implique que ccc52Ms appartient à la superfamille des protéines à motifs répétés. Les motifs WD répétés comprennent environ 40 aminoacides contenant un certain nombre d'acides aminés conservés dont le motif WD (Trp-Asp) qui se situe fréquemment à une extrémité du motif répété [NEER et al., Nature, 371, pp. 297-300, (1994)]. Les membres de cette famille régulent différentes fonctions, telles que la transduction de signal, la transcription, l'épissage de pré-ARNm, l'organisation du cytosquelette, la fusion vésiculaire ou le cycle cellulaire. Bien que la structure générale soit globalement similaire dans toutes les protéines, la grande variété fonctionnelle des motifs WD répétés suggère que ces motifs répétés se sont différenciés et sont devenus fonctionnellement spécialisés. Une homologie fonctionnelle se reflète dans le nombre de motifs WD répétés, par une homologie importante des motifs WD répétés à des positions équivalentes dans différentes protéines, par rapport à d'autres motifs répétés dans les mêmes protéines, et par une similarité significative des extrémités C et N terminales. La comparaison de la séquence de ccc52Ms avec les séquences de protéines connues a fait apparaître une homologie élevée avec des protéines à motifs WD40 répétés qui interviennent dans la régulation du cycle cellulaire, et, plus spécifiquement, avec les protéines fzr de Drosophile (57% d'identité), hctl de Saccharomyces cerevisiae (46% d'identité), et srwl de Schizosaccharomyces pombe (52% d'identité), qui appartiennent à la famille " fizzy-related ". Les recherches effectuées par les Inventeurs dans des bases de données de séquences ont en outre fait apparaître une homologie importante avec le produit du gène fzr de X. laevis ou de C. elegans. En ce qui concerne plus particulièrement la sous-famille fzr, il a été montré chez la Drosophile que le gène fzr est exprimé en fin de prolifération cellulaire pendant l'embryogénèse. Le produit de ce gène entraîne une diminution des cyclines mitotiques, et est nécessaire pour l'arrêt de la prolifération cellulaire et le début des endocycles [SIGRIST et LEHNER, Cell, 90, pp. 671-681, (1997)]. Chez Saccharomyces cerevisiae, hctl est nécessaire pour la protéolyse de la cycline mitotique, Clb2 [SCHWAB et al., Cell, 90, pp. 683-693, (1997)]. Chez Schizosaccharomyces pombe, le produit du gène sr- wl contrôle le cycle cellulaire et la différenciation en régulant négativement les complexes Cdc2/cycline de type B [YAMAGUCHI et al., Mol. Biol. Cell., 8, 2475-2486, (1997)]. Chez les plantes, aucune protéine de la famille fzr n'a été décrite jusqu'à présent. Aucune autre séquence peptidique végétale présentant un degré d'homologie aussi important n'a été retrouvé dans les banques de données. L'existence d'un gène codant pour une protéine à motifs WD40 répétés et son isolement à partir d'ADNc de carotte ont été récemment décrits [LUO et al., Plant Mol. Biol., 34, pp. 325-330, (1997)]. Cependant, le produit de ce gène, qui est apparenté aux protéines cdc20, p55, et fizzy, présente une plus faible homologie (44% d'identité) avec la protéine ccc52Ms, que les protéines fzr d'invertébrés et de levure; ceci indique que la protéine de carotte appartient à un sous-groupe distinct de protéine à motifs répétés. La recherche d'homologues de ccc52Ms dans une base de données du génome d'Arabidopsis thaliana a toutefois fait apparaître une séquence peptidique partielle déduite d'un clone génomique (AB005230) et présentant 64% d'identité avec ccc52Ms, ce qui montre l'existence d'homologues du gène ccc52Ms chez d'autres plantes. La figure 1A représente l'alignement, effectué en utilisant le logiciel " PRETTYBOX ", des séquences fzr de Drosophile (dmfzr), de X. laevis (xlfzr), hctl de Saccharomyces cerevisiae (schctl), srwl de Schizosaccharomyces pombe (srwl), et ccc52 de Medicago sativa, (ccc52ms) et d'Arabidopsis thaliana (ccc52at). La figure lB représente un dendrogramme de la famille des protéines à motifs WD40 répétés, qui montrent que les protéines ccc52 forment avec les autres protéines fzr, une sous-famille représentant une branche qui a évolué séparément de celles respectivement constituées par les protéines cdc20, p55, et fizzy. La protéine ccc52Ms contient 7 domaines à motifs WD40 répétés, situés dans les portions centrale et C-terminale de la molécule (l'emplacement de ces domaines, numérotés de I à VII est indiqué sur la figure 1A au dessus de l'alignement des séquences). Ces domaines ne présentent que peu d'homologie entre eux, d'o l'on peut conclure qu'ils représentent des sites d'interaction avec des protéines différentes. Le dernier domaine (VII) comprend un site potentiel de liaison pour les cyclines. Dans la partie N-terminale de la molécule, sont localisées une séquence peptidique (DRFIPSR) qui correspond à un motif conservé chez les protéines fzr ainsi que chez d'autres protéines à motifs WD40 répétés telles que cdc20, p55 et fizzy, ainsi qu'une séquence peptidique (AYTTLLRTALFG) qui correspond à un motif spécifique de la famille fzr (l'emplacement de ces motifs, respectivement indiqués A et B, sur la figure 1A au dessus de l'alignement des séquences). 3 sites potentiels de phosphorylation par des cdk (cyclin dependent kinases ou kinases cyclines- dépendantes), SPSR, SPVK et SPYK, sont localisés dans la portion Nterminale, respectivement aux positions 43-46, 128-131 et 144-147. Le premier et le second de ces sites sont également présents chez d'autres protéines fzr, tandis que le troisième paraît plus spécifique des protéines ccc52 de plantes. Une séquence de 15 acides aminés RDNSPPPEPSPESLR (encadrée sur la figure 1A), commençant au résidu 16, et correspondant à un motif de dégradation protéique PEST est également présente dans la portion N- terminale. Ce motif intervient probablement, par l'intermédiaire de la dégradation de ccc52, de réguler ses interactions avec d'autres protéines. La structure de la protéine ccc52Ms est schématisée sur la figure 2. La séquence de l'ADNc cloné par les inventeurs est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1; la séquence de la protéine ccc52Ms correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO:2. La région 3' non traduite du transcrit de cet ADN comprend 2 séquences AUUUA, qui correspondent à des séquences d'instabilité des ARNm, et peuvent donc jouer un rôle pour réguler la quantité de transcrits de ccc52. Les Inventeurs ont étudié in vivo l'activité de la protéine ccc52Ms et ont montré qu'elle intervenait dans la régulation de la différenciation cellulaire, en favorisant l'endoréplication. En particulier, l'expression de la protéine ccc52Ms dans des plantes transgéniques induit chez celles-ci une augmentation de l'endoréplication et du niveau de ploidie des cellules des plantes. La présente invention a pour objet une protéine végétale à motifs WD40 répétés, dénommée ccc52, caractérisée en ce qu'elle appartient à la sous-famille fzr. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention ladite protéine végétale présente au moins 45%, et de préférence au moins 55% d'identité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:2 ou au moins 60% et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:2. La présente invention englobe en particulier la protéine ccc52Ms, ses isoformes, ainsi que les protéines autologues de Medicago et les protéines orthologues d'autres végétaux, pouvant être rattachées à la famille des protéines fzr. L'invention englobe également des protéines dérivées des protéines ccc52, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ou d'une ou plusieurs séquences d'acides aminés; il peut s'agir par exemple de protéines dans lesquelles des modifications ont été apportées en dehors des régions fonctionnelles, ou bien de protéines dans lesquelles des modifications ont été apportées pour modifier leur activité, par exemple de protéines stabilisées par délétion du motif PEST. La présente invention a également pour objet un fragment d'acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence codant pour une protéine ccc52, telle que définie ci-dessus, ou de sa séquence complémentaire. Dans ce cadre, la présente invention englobe en particulier les ADNc et les ADN génomiques des protéines ccc52. l0 Des fragments d'acide nucléiques, conformes à l'invention peuvent être aisément identifiés et clones en criblant des banques d'ADNc ou d'ADN génomique de plantes à l'aide d'oligonucléotides dérivés de la séquence de ccc52Ms, et notamment d'oligonucléotides dérivés des s15 régions de cette séquence spécifiques des protéines fzr, et en particulier des protéines ccc52. Les protéines ccc52 peuvent être produites, en particulier, en exprimant ces séquences d'acide nucléique dans des cellules hôtes. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ccc52, telle que définie ci- dessus ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie de ladite protéine, ou de sa séquence complémentaire, pour réguler la différenciation et la prolifération de cellules végétales. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine de la sous-famille fzr ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie de ladite protéine, ou de sa séquence complémentaire, pour réguler la différenciation et la prolifération de cellules végétales. On peut citer parmi de telles protéines, la protéine fzr de drosophile ou la protéine fzr de levure. La modification de l'expression et/ou de l'activité de protéines ccc52 dans des cellules de plantes permet de modifier le cycle cellulaire, en favorisant soit la prolifération soit la différenciation, et de contrôler ainsi le processus de développement, afin d'obtenir par exemple une stimulation de l'embryogénèse somatique, d'augmenter la régénération in vitro de plantes à partir des cals, en augmentant la conversion en embryons, ou de favoriser le développement de certains organes, par exemple d'augmenter la productivité des tissus de réserve en augmentant leur endoploidie. On peut en particulier utiliser les séquences d'ADNc de protéines ccc52 ou des portions de ces séquences d'ADNc, ou de leur transcrits sens ou antisens; il peut s'agir par exemple de la totalité d'une séquence codant pour une protéine ccc52Ms, ou d'une portion de cette séquence codante, et/ou de tout ou partie des régions 5' et 3' non traduites. Ces séquences peuvent être utilisées en orientation sens, ou si l'on souhaite inhiber l'expression de la protéine ccc52Ms dans une plante ou dans un tissu ou organe de celle-ci, en orientation antisens. La présente invention englobe également des constructions d'ADN recombinant, contenant au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. Généralement, ladite séquence d'acide nucléique sera placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Avantageusement, on pourra ainsi utiliser un promoteur fort, pour augmenter, dans les cellules hôte, les niveaux d'expression de la protéine ccc52; il pourra s'agir d'un promoteur inductible ou bien d'un promoteur constitutif; il peut s'agir d'un promoteur ubiquitaire, ou d'un promoteur tissu-spécifique. L'utilisation de promoteurs inductibles permet d'obtenir un blocage de la mitose, et l'induction de l'endoréplication au moment souhaité. L'utilisation de promoteurs tissu-spécifiques permet de cibler l'action de la protéine ccc52 sur certains tissus et organes (par exemple, des tissus de réserve). A titre d'exemples de promoteurs forts utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera: le promoteur CaMV35S [BENFLY et al, Science, 250, pp. 959-966, (1990)]; le promoteur 35S; les promoteurs Agrobacterium tumefaciens T-DNA: nopaline synthase, octopine synthase, mannopine synthase, 1', 2' [SANDERS et ai., Nucleic Acid Res., 15, pp. 1543-1558, (1987); HOOYKAAS and SCHILPEROORT, Plant. Mol. Biol., 19, pp. 15-38, (1992)]. A titre d'exemples de promoteurs inductibles utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera: le promoteur inductible par la tétracycline [WEINMANN et al., Plant J., 5, pp. 559-569, (1994)]; le promoteur inductible par le cuivre [METT et al., Transgenic Res., 5, pp. 105-113, (1996)]; le promoteur inductible par les glucocorticoides [AOYAMA et CHUA, Plant. J., 11, pp. 605-612, (1997)]. A titre d'exemples de promoteurs tissu- spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera: le promoteur endosperme-spécifique [OPSAHL-FERSTAD et al., Plant J., 12, pp. 235-246, (1997); DOAN et al., Plant Mol. Biol., 31, pp. 877-886, (1996); les promoteurs nodosités-spécifiques (enodl2A/B ou leghémoglobine) [TRINH et al., Plant Cell Reports, (17, pp. 345-355, (1998); VIJN et al., Plant Mol. Biol., 28, pp. 1103- 1110, (1995)] ou bien des promoteurs précoces inductibles par le facteur Nod et des promoteurs tardifs (promoteur de la cycline D ou des nodulines tardives (type leghémoglobine) et promoteurs régulés par des hormones, tels que parA/B [TAKAHASHI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8013-8016, (1990)], GH3 [LIU et al., Plant Cell, 6, pp. 645-657, (1994)]. L'Invention englobe en particulier des vecteurs recombinants portant au moins un insert contenant un fragment d'ADN conforme à l'invention. Ces vecteurs sont utilisables pour transformer des cellules hôtes. L'Invention a également pour objet des cellules et des organismes pluricellulaires transformés par au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention; il s'agit en particulier de cellules végétales ou de végétaux. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, et se réfère à des exemples non limitatifs illustrant l'identification, le clonage et l'expression du gène ccc52Ms. EXEMPLE 1: CLONAGE ET SEQUENCAGE D'UN ADNC de ccc52Ms. Un clone d'ADNC de ccc52Ms a été obtenu par criblage différentiel à partir d'une banque d'ADNC de nodosités de Medicago sativa, fortement stimulées pendant l'organogénèse nodulaire. Le protocole suivant a été utilisé: L'ADNc de ccc52Ms de M. sativa est isolé par la technique de DD-RT-PCR (Differential Display RT-PCR) [LIANG et PARDEE, Science, 257, pp. 967-971, (1992)], en utilisant les kits RNAimage (GenHunter Corporation). Les échantillons d'ARN sont isolés à partir de la zone racinaire sensible au facteur Nod de jeunes plants de M. sativa (croissance dans un milieu limité en nitrate), en l'absence de bactéries ou inoculés par des souches de R. meliloti Nod+ (EK1433) ou Nod(EK133) pendant 4 jours. Le fragment de DD-RT-PCR ccc52Ms, présentant une augmentation de l'expression des nodosités, est cloné dans le vecteur de clonage pCT-TRAP (GenHunter Corporation) et utilisé comme sonde pour l'isolement des clones complets à partir d'une banque d'ADNc de nodosités de M. sativa sp. varia A2, construite dans k-ZAP (Stratagène) (CRESPI et al., EMBO J., 1994, 13, 5099- 5112). Sept clones d'ADNc, obtenus à partir de 2.105 phages et coupés in vivo, conformément au protocole de Stratagène, représentent 2 types d'ADNc différant l'un de l'autre uniquement au niveau de 4 acides aminés (16R- G, 17D-N, 33S-N, 52R-G) et de la longueur du fragment 3'UTR. Une identité de 99% des clones, au niveau de la séquence en acides aminés, suggère qu'ils représentent des allèles du même gène chez M. sativa tétraploide allogame. Le séquençage des ADNc de ccc52Ms est effectué avec le système ABIprism de Perkin-Elmer, utilisant les amorces T3 et T7 du vecteur Bluescript (Stratagène) et les amorces spécifiques suivantes: 52'L: GAAATCCACCACCGACTT, P55A2-L: AGCAACCATTACACCTCACC p55B-L: TTTGGGGGTTGATGATTGTG p55CL: CTCTCTACCGTTCTATCTCTTGGGA P55B-R: CCTCTGATTTGTGTCCTGA P55-R: AGCTTTGACATGGTGGGGTATCTCC P55CR: GGTAAAGATGCTACTTTGGTGGTGT. Les clones génomiques ccc52Ms et ccc52Mt sont isolés à partir de banques génomiques de M. sativa cv. Nagyszénasi et M. trucatula ecotype GHOR, en utilisant l'ADNc de ccc52Ms comme sonde d'hybridation. Ces banques génomiques sont construites par digestion partielle de l'ADN génomique avec l'enzyme de restriction MboI et le clonage des fragments d'ADN de taille comprise entre 15 et 20 Kb dans le site BamHI de X-EMBL4. EXEMPLE 2: IDENTIFICATION DE LA FAMILLE DU GENE ccc52Ms DANS Medicago ET SON EXPRESSION DANS DIFFERENTS ORGANES VEGETAUX. L'existence de copies multiples du gène ccc52 est recherchée par hybridation de type Southern dans des cultivars tétraploïdes de M. sativa Nagyszénasi et Cardinal et chez M. truncatula diploïde autogame, une plante modèle dans la recherche sur les légumes (Fig. 3A). L'ADN de plante est isolé à partir des feuilles jeunes, en utilisant le kit d'extraction Nucleon PhytoPure DNA (Amersham). Les échantillons d'ADN sont digérés par EcoRI et transférés sur membrane de nylon Biotrans (+) (ICN). L'hybridation Southern est réalisée conformément aux protocoles publiés, dans des conditions stringentes à 65 C (hybridation dans un tampon CG; lavage: 2 x SSC, 0,1% SDS pendant 2 fois 15 mn, puis 0,5 x SSC, 0,1% SDS pendant 2 fois 30 min.) (SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989); AUSUBEL, Current Protocols in Molecular Biology, (1989)] L'expression de ccc52Ms est étudiée par analyse Northern. L'ARN total est isolé à partir de différents organes de M. sativa cultivar Sitel: - à partir des racines, inoculées pendant 4 jours avec le mutant Nod- R. meliloti (EK133) et avec la souche surproductrice de facteurs Nod (EK1433); - à partir des nodosités, 12, 19, 23 et 30 jours après une infection par R. meliloti, et, - à partir des tiges, des hypocotyles, des feuilles, des bourgeons, des fleurs, des racines de plants de 3 jours, de 7 jours, des racines privées d'azote et ne présentant pas de pointes racinaires, des racines de 7 jours, sans pointes racinaires, mises en culture en présence de nitrate, des nodosités spontanées développées en l'absence de R. meliloti et des pointes racinaires ou de culture de cellules de M. sativa sp. varia A2. mg de plante, collectés sous azote liquide, sont utilisés pour l'extraction de l'ARN (RNeasy Plant, Quiagen). tg d'ARN est chargé par ligne sur un gel dénaturant (formaldéhyde) [SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)]. Le transfert d'ADN est effectué dans une solution de transfert 10 x SSC [CHOMCZYNSKI et al., Analytical Biochemistry, 221, pp. 303-305, (1994)]. Aussi bien dans le cas de l'hybridation Southern que dans le cas de l'hybridation Northern, le fragment d'ADNc ccc52Ms est marqué avec du [ -32P] dCTP (Kit Megaprim, Amersham). L'hybridation avec la sonde Msc27 sert de contrôle pour le chargement de l'ARN [SAVOURE et al., EMBO J., 13, pp. 1093-1102, (1994)]. a) Les résultats sont illustrés par la figure 3A, qui représente l'hybridation avec la sonde de l'ADN génomique de M. sativa ou M. truncatula digéré avec EcoRI (E); on observe que la sonde s'hybride avec différents fragments EcoRI, ce qui indique que ccc52Ms représente chez Medicago, une petite famille multigénique. b) La figure 3B illustre les résultats obtenus avec l'ARN total de racines inoculées avec le mutant Nod- EK133 de R. meliloti (piste 1), ou avec la souche EK1433 surproductrice de facteurs Nod (piste 2) et avec 1'ARN extrait des nodosités, 12, 19, 23 et 30 jours après infection avec R. meliloti (pistes 3-6, respectivement). La sonde Msc27 a été utilisée comme contrôle de la présence d'ARN. Ces résultats montrent qu'on n'observe dans l'ARN total de racines, qu'une faible quantité de transcrits, ce qui reflète la faible proportion des cellules impliquées dans l'organogénèse des nodosités par rapport au nombre total de cellules des racines. En revanche, dans les nodosités de différents âges on observe un niveau élevé de transcription, qui reflète la persistance des méristèmes apicaux et des zones de différenciation. c) la figure 3C montre les résultats obtenus avec les ARN totaux de: 1: culture de cellules de M. sativa sp. varia A2, 2: tiges, 3: hypocotyles, 4: feuilles, 5: bourgeons floraux, 6: fleurs, 7: racines de pousses de 3 jours, 8: racines de pousses de 7 jours, privées d'azote, dépourvues d'extrémité, 9: pointes racinaires de 7 jours, cultivées en présence de nitrates, dépourvues d'extrémité, 10: nodosités spontanées développées en absence de R. melioti, 11: nodosités fixatrices d'azote, 12: extrémités de pointes racinaires. Cette analyse montre que l'expression du ccc52Ms n'est pas limitée aux nodosités, bien que cet organe soit celui qui contienne le niveau de transcrits le plus élevé. Ces transcrits sont présents en quantités variables pratiquement dans tous les organes, ce qui indique que cette protéine intervient dans le développement de chacun d'entre eux. Mis à part les nodosités, le niveau de transcription est également élevé chez les jeunes pousses, et dans les cultures cellulaires, o l'on détecte en outre un ARNm de plus petite taille qui peut correspondre soit à une polyadénylation différente, soit à l'expression d'une copie homologue du gène. Des analyses par hybridation in situ ont également été effectuées, et montrent que l'ARNm de ccc52Ms est localisé principalement dans la zone de différenciation, et en particulier à l'interface entre les zones II et III de la nodosité, qui sont les régions o la différenciation est la plus active. Les hybridations radioactives sont réalisées selon la technique de SAVOURE et al. [EMBO J., 13, pp. 1093-1102, (1994)] alors que les hybridations non- radioactives (marquage à la digoxigénine) sont réalisés conformément aux protocoles établis par le fabricant (Boehringer-Mannheim). Parallèlement, on observe dans les mêmes zones une expression des cyclines de type Gi et mitotiques, ainsi que de l'histone H3 spécifique de la phase S. Ceci indique que ccc52Ms intervient dans la régulation du cycle cellulaire, probablement d'une manière similaire à ses homologues de la levure et de la drosophile, c'est-à-dire par l'intermédiaire de la protéolyse de cyclines mitotiques, qui inhibe la mitose et induit des cycles d'endoréduplication. EXEMPLE 3: EXPRESSION DE ccc52Ms CHEZ Schizosaccharomyces pombe L'expression de ccc52Ms a été étudiée chez S. pomnbe chez qui un homologue fonctionnel srwl a été décrit récemment (YAMAGUCHI, publication précitée). Le gène codant pour ccc52Ms a été cloné dans le plasmide pREP1 sous contrôle du promoteur Pnmtl répressible par la thiamine. L'ADNc de ccc52Ms obtenu après coupure de k-ZAP (Stratagène) est digéré avec AgeI et partiellement avec EcoRV. Le fragment AgeI-EcoRV de 1,6 kb représentant la région codante, à l'exception des 4 premiers codons, est cloné dans un vecteur SKII Bluescript (Stratagène) digéré par XmaI (compatible avec AgeI) et EcoRV. A partir de ce plasmide (pSK52B), l'ADNc de ccc52Ms est coupé par digestion BamHI-EcoRV et cloné dans les sites BamHI-SmaI du plasmide pREP1 [MAUNDRELL et ai., Gene, 123, pp. 127-30, (1993)]. Pour générer un cadre de lecture en phase avec le codon de traduction ATG présent dans le vecteur, derrière le promoteur nmtI, l'ADN est digéré avec BamHI et l'extrémité 5' est complétée en présence d'enzyme de Klenow et de dNTPs. La religature des extrémités à bouts francs entraîne une fusion correcte, également vérifiée par séquençage. Ce plasmide, dénommé pREP52, est transformé dans des cellules compétentes S. pombe SP-Q01 et les transformants sont sélectionnés sur des plaques d'agar EMM-thiamine, en utilisant le kit ESP (Stratagène). Les vecteurs pREP1 [MAUNDRELL et al., Gene, 123, pp. 127-30, (1993)] et pESP1 (Stratagène) sont utilisés comme contrôles négatifs; un contrôle positif est constitué de srwl cloné dans pREP1 [YAMAGUSHI et al, Mol. Biol. Cell., 8, pp. 2475-2486, (1997)], transformés dans S. pombe SP-Q01. Les transformants purifiés S. pomnbe SP-Qo01 sont cultivés dans 2 ml de milieu EMM-thiamine 5 M pendant 32 h à 30 C. Les cellules sont lavées 2 fois avec ml d'eau stérile et remises en suspension dans 5 ml de milieu EMM. Les suspensions cellulaires sont divisées en deux moitiés: 2,5 ml sont cultivées avec de la thiamine et 2,5 ml sont cultivées sans thiamine, à 30 C. Des aliquots de cultures sont prélevés après 16 h et 24 h de culture et fixés avec de l'éthanol, colorés avec du DAPI ou de l'iodure de propidium pour une analyse en cytométrie de flux et en microscopie [BEACH e al, Curr. Genet., 10, pp. 297-311, (1985)]. En présence de thiamine, l'expression de ccc52Ms est réprimée et on observe une croissance normale (Figure 4A). En l'absence de thiamine (Figure 4B), la surexpression de ccc52Ms entraîne l'inhibition de la croissance de S. pombe, qui s'accompagne d'une endoréplication comme le montre la figure 4D, qui montre la présence de noyaux à 4C, qui n'est pas observée dans les cellules contrôles S. pombe, portant le vecteur vide pREP1 (figure 4C) La morphologie des cellules est également modifiée en l'absence de thiamine (figure 4F). On observe un allongement des cellules et une augmentation de la taille des noyaux, identiques à ceux observés lors de la surexpression de l'homologue srwl [YAMAGUSHI et al, Mol. Biol. Cell. , 8, pp. 2475-2486, (1997)], tandis qu'aucun changement morphologique n'est observé lorsque S. pombe ne porte que le vecteur pREP1 (figure 4E). EXEMPLE 4: OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIQUES TRANSFORMEES PAR LE GENE ccc52Ms. s 1 Expression d'un transcrit antisens et son action sur le niveau de ploidie de Medicago truncatula. Dans un premier temps, le niveau de ploidie de différents organes de Medicago truncatula (plante naturellement diploïde) a été déterminé, par cytométrie de flux. Les résultats sont illustrés par la figure 5A, au niveau des pétioles. La technique utilisée est la suivante: l'ADN nucléaire de plantes fraîchement récoltées est analysé par cytométrie de flux (EPICS V, Coulter), conformément à la méthode de Brown et al., (A laboratory guide for Cellular and Molecular plant Biology, 1991, 326-345, ed. Negrutiu et al., Birkhâuser, Basel), modifiée de telle sorte que les noyaux soient colorés avec du DAPI à une concentration finale de 5 tg/ml. Le tampon nucléaire I est utilisé à 1% de Triton X-100 pour les nodosités. Dans les jeunes pousses, on trouve une quantité d'ADN de 2C à 8C dans la racine et le cotylédon, alors que l'hypocotyle contient également des noyaux à 16C. Ches les plantes adultes poussées en serre, les feuilles sont diploïdes, contenant 95% de noyaux à 2C et % de noyaux à 4C. Dans les pétioles et les nodosités, des noyaux de 2C à 32C ont été détectés. Toutefois, le pétiole contient majoritairement des noyaux à 2C, alors que les nodosités contiennent majoritairement des noyaux à 4C. Un fragment de 1,2kb contenant les Y de la séquence codante de ccc52Ms, a été placé en orientation antisens sous contrôle du promoteur 35S, dans un vecteur binaire obtenu à partir du vecteur pGPTV-BAR, portant le gène bar comme marqueur de sélection et des sites de clonage multiple. Cette construction est obtenue en insérant le promoteur 35S dans un fragment HindIII-XbaI (obtenu à partir de pBI121, Clontech), dans les sites HindIII-XbaI du vecteur pGPTV-BAR codant le gène de résistance à l'herbicide BASTA. Le gène uidA est ensuite éliminé du plasmide pGPTV-BAR par digestion XbaI-SstI au niveau du site multiple de clonage. Pour obtenir la construction antisens de ccc52Ms, un fragment SstI-PvuII de 1,2 kb est cloné au niveau des sites SmaI-SstI du vecteur binaire précité. Ces plasmides ainsi qu'un plasmide contrôle, contenant le gène gus ont été introduits dans Agrobacterium tumefaciens (EHA105) par électroporation et utilisés pour transformer Medicago truncatula R108-1 selon le protocole décrit par HOFFMANN et al. [Mol. Plant Microbe Interaction, 10, pp. 307-315, (1997)]; TRINH ET AL. [Plant Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)]. Le niveau de ploïdie des plantes transgéniques obtenues a été analysé, et le niveau de transcrits endogènes a été analysé par RT-PCR. Dans la mesure o le fragment SstI-PvuII de 1,2 kb utilisé pour la construction antisens ne contient pas le dernier quart de la séquence codante, les taux de transcrit endogène ccc52Mt peuvent être analysés dans les lignées transgéniques par RT-PCR en utilisant la paire d'amorces P55CL et P55CR comme illustré aux figures 5E et F. Sur 37 plantes transgéniques, 3 ont montré une endoploidie réduite, et une autre (A4) une endoploïdie significativement plus faible. C'est également dans cette plante que le niveau d'expression des transcrits endogènes de ccc52Ms est le plus faible, comme le montre la figure 5F. Dans cette plante, les pétioles contenaient 48% de noyaux 2C, 50,2% de noyaux 4C, 1,65% de noyaux 8C, alors que les pétioles des plantes témoin contiennent 51,5% de noyaux 2C, 31,8% de noyaux 4C, 14,1% de noyaux 8C, 2,6% de noyau 16C, et 0,178% de noyaux 32C. En outre, cette plante produit une quantité de graines significativement inférieure à celle des plantes témoin. Le fait qu'une réduction de l'endoploidie n'ait jamais été observée auparavant chez d'autres plantes transgéniques, permet d'attribuer ce phénomène à l'altération de l'expression de ccc52Ms, et non à un effet secondaire de la transgénèse. 2 Expression de la protéine ccc52Ms dans des plantes transgéniques. Des vecteurs d'expression contenant le gène ccc52Ms sous contrôle du promoteur 35S, ainsi que des vecteurs d'expression comprenant le gène ccc52Ms, sous contrôle d'un promoteur tissu-spécifique, ont été construits selon le protocole suivant: Pour l'expression tissu- spécifique de ccc52Ms, l'ADNc est placé sous le contrôle des promoteurs enodl2AMs et Srglb3 décrits dans TRINH et al. [Plant Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)], sauf que pISV-BMCS, un dérivé de pISV2301, et seulement un fragment du promoteur enodl2AMs de 0,3 kb considéré comme suffisant pour une expression nodosité-spécifique [VIJN et ai., Plant Mol. Biol., 28, pp. 1103-1110, (1995)], sont utilisés. Construction de pISV-BMCS: pISV2301 est digéré par HindIII et SstI pour éliminer la séquence du promoteur 2X35S-AMV, qui est remplacé par l'oligo BMCS double-brin AGCTTCCCGGGGGAGCTCTAGACTCGAGCACCT BMCS AGGCCCCTCGAGATCTGAGCTCG SmaI SstI XbaI XhoI. pISV-BMCS12A est construit par clonage d'un fragment du promoteur enodl2AMs de 0,3 kb, généré par PCR, en utilisant le plasmide pPR89 (matrice) [BAUER et al., Plant J., 10, pp. 91-105, (1996)] et les amorces PE12A-L et PE12A-R, dans pISV-BMCS. pISV-BMCS-LB3 est construit par digestion de pISV-BMCS avec HindIII-SstI et clonage d'un fragment HindIII-SstI contenant le promoteur leghémoglobine de Sesbania rostrata à partir de pLP32 [TRINH et al, Plant s Cell Reports, 17, pp. 345-355, (1998)]. Ces vecteurs ont été utilisés pour transformer Medicago truncatulata selon le protocole décrit ci-dessus pour les séquences antisens. Lors de la régénération des plantes transgéniques, on observe une conversion des cals en embryons significativement plus importante chez les plantes transformées avec les constructions exprimant le gène ccc52Ms, que chez les plantes transformées avec la construction témoin, ce qui indique un effet positif de ccc52Ms sur l'embryogénèse somatique. 21 2779433 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) (B) RUE: 3 rue MICHEL-ANGE (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75794 (ii) TITRE DE L'INVENTION: GENES INTERVENANT DANS LA REGULATION DE LA DIVISION CELLULAIRE CHEZ LES VEGETAUX ET LEURS UTILISATIONS. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2006 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:182..1609 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GATTCGGCAC GAGGAAGAAA CAAAGAAACT CTCTCTCTCT ATTTCTTTCT CTCTGCACAA 60 TTTTCGAGTA GTGTTATTTT TTAATAAAAA ATTAATTAAT TTTTTTTTAT ATAAAAGCCG 120 TGCAAAAAAT TCTTTTACAG CGTTCTTTTT TCCCCGGGAA AAAAATTAAC ACAGCTCCGC 180 C ATG GAC GGA ACC GGT AAT CGA AAT CCA CCA CCG ACT TCC ACC GTC 226 Met Asp Gly Thr Gly Asn Arg Asn Pro Pro Pro Thr Ser Thr Val 1 5 10 15 AGA GAC AAT TCT CCA CCG CCT GAG CCA TCA CCG GAG AGT CTC CGT CAT 274 Arg Asp Asn Ser Pro Pro Pro Glu Pro Ser Pro Glu Ser Leu Arg His 25 30 GTA AGC CGT ATG ATC AAC AGC AAC CAT TAC ACC TCA CCT TCT CGA ACA 322 Val Ser Arg Met Ile Asn Ser Asn His Tyr Thr Ser Pro Ser Arg Thr 40 45 ATC TAC TCC GAT AGG TTC ATT CCG AGT AGA TCT GCT TCG AAA TTC GCT 370 Ile Tyr Ser Asp Arg Phe Ile Pro Ser Arg Ser Ala Ser Lys Phe Ala 55 60 22 2779433 TTG TTT GAT ATC AAT ACT CCG ACA GAA GGA CGC GAT GAT AGT TCC AGC 418 Leu Phe Asp Ile Asn Thr Pro Thr Glu Gly Arg Asp Asp Ser Ser Ser 70 75 GCT TAT ACG ACT CTT CTG AGA ACG GCG TTG TTT GGA CCG GAT GTT GCC 466 Ala Tyr Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ala Leu Phe Gly Pro Asp Val Ala 85 90 95 GGT CCG GTT ACG CCG GAA AAA ACC GAC TCG CCG TCG ATG ACA TTG CCG 514 * Gly Pro Val Thr Pro Glu Lys Thr Asp Ser Pro Ser Met Thr Leu Pro 105 110 AAT AGG AAT ATT TTT AGG TAT AAG ACG GAG ACG AGA CAG TCC ATG CAC 562 Asn Arg Asn Ile Phe Arg Tyr Lys Thr Glu Thr Arg Gln Ser Met His 120 125 TCG CTT TCG CCG TTT ATG GAT GAT GAT TTT GTT CCT GGT GTT AAT CAT 610 Ser Leu Ser Pro Phe Met Asp Asp Asp Phe Val Pro Gly Val Asn His 135 140 AGT CCG GTT AAG GCT CCT AGG AAG GTT CCT CGA TCG CCT TAT AAG GTT 658 Ser Pro Val Lys Ala Pro Arg Lys Val Pro Arg Ser Pro Tyr Lys Val 150 155 TTG GAT GCA CCT GCT TTG CAA GAT GAT TTT TAT CTG AAT CTG GTA GAT 706 Leu Asp Ala Pro Ala Leu Gln Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Leu Val Asp 165 170 175 TGG TCT TCA CAC AAT GTG TTG GCT GTT GGT TTG GGT AAC TGT GTC TAT 754 Trp Ser Ser His Asn Val Leu Ala Val Gly Leu Gly Asn Cys Val Tyr 185 190 CTC TGG AAT GCT TGT AGC AGC AAG GTA ACT AAA TTA TGT GAT TTG GCG 802 Leu Trp Asn Ala Cys Ser Ser Lys Val Thr Lys Leu Cys Asp Leu Gly 200 205 GTT GAT GAT TGT GTT TGT TCT GTT GGT TGG GCT CAA CGT GGT ACT CAT 850 Val Asp Asp Cys Val Cys Ser Val Gly Trp Ala Gln Arg Gly Thr His 210 215 220 CTT GCT GTT GGA ACT AAC AAT GGT AAA GTT CAG ATT TGG GAT GCA GCA 898 Leu Ala Val Gly Thr Asn Asn Gly Lys Val Gln Ile Trp Asp Ala Ala 225 230 235 AGA TGC AAG AAG ATA AGA TCA ATG GAG GGC CAT CGG TTA CGT GTC GGG 946 Arg Cys Lys Lys Ile Arg Ser Met Glu Gly His Arg Leu Arg Val Gly 240 245 250 255 GCC TTG GCC TGG AGT TCA TCT CTT TTG TCT TCT GGT GGA CGG GAT AAG 994 Ala Leu Ala Trp Ser Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Gly Arg Asp Lys 260 265 270 AAT ATT TAT CAA CGA GAT ATA CGC ACA CAA GAA GAT TTT GTT AGT AAA 1042 Asn Ile Tyr Gln Arg Asp Ile Arg Thr Gln Glu Asp Phe Val Ser Lys 275 280 285 CTG TCA GGA CAC AAA TCA GAG GTT TGT GGA CTG AAG TGG TCA TAT GAT 1090 Leu Ser Gly His Lys Ser Glu Val Cys Gly Leu Lys Trp Ser Tyr Asp 290 295 300 AAC CGT GAG TTG GCA TCT GGA GGA AAT GAC AAC AAA TTG TTT GTT TGG 1138 Asn Arg Glu Leu Ala Ser Gly Gly Asn Asp Asn Lys Leu Phe Val Trp 305 310 315 23 2779433 AAT CAA CAC TCA ACC CAG CCT GTC CTC AAG TAC TGT GAG CAC ACA GCA 1186 Asn Gln His Ser Thr Gln Pro Val Leu Lys Tyr Cys Glu His Thr Ala 320 325 330 335 GCT GTT AAA GCT ATT GCA TGG TCT CCT CAT CTT CAT GGA CTT CTT GCA 1234 Ala Val Lys Ala Ile Ala Trp Ser Pro His Leu His Gly Leu Leu Ala 340 345 350 TCT GGA GGA GGA ACT GCA GAT AGA TGT ATT CGT TTT TGG AAT ACA ACC 1282 Ser Gly Gly Gly Thr Ala Asp Arg Cys Ile Arg Phe Trp Asn Thr Thr 355 360 365 ACA AAC TCA CAC CTT AGC TGT ATG GAC ACT GGA AGT CAG GTT TGC AAT 1330 Thr Asn Ser His Leu Ser Cys Met Asp Thr Gly Ser Gln Val Cys Asn 370 375 380 CTT GTC TGG TCC AAA AAT GTC AAC GAA CTA GTA AGC ACA CAT GGG TAC 1378 Leu Val Trp Ser Lys Asn Val Asn Glu Leu Val Ser Thr His Gly Tyr 385 390 395 TCC CAG AAC CAG ATT ATT GTT TGG AGA TAC CCC ACT ATG TCA AAG CTG 1426 Ser Gln Asn Gln Ile Ile Val Trp Arg Tyr Pro Thr Met Ser Lys Leu 400 405 410 415 GCG ACT CTT ACC GGC CAT ACT TAT AGG GTT CTC TAT CTT GCC ATC TCT 1474 Ala Thr Leu Thr Gly His Thr Tyr Arg Val Leu Tyr Leu Ala Ile Ser 420 425 430 CCA GAT GGA CAG ACT ATT GTA ACT GGA GCT GGA GAT GAA ACG CTT AGG 1522 Pro Asp Gly Gln Thr Ile Val Thr Gly Ala Gly Asp Glu Thr Leu Arg 435 440 445 TTC TGG AAT GTT TTC CCT TCC CCT AAA TCA CAG AAT ACT GAA AGT GAA 1570 Phe Trp Asn Val Phe Pro Ser Pro Lys Ser Gln Asn Thr Glu Ser Glu 450 455 460 ATC GGA GCA TTA TCT CTT GGA AGA ACT ACT ATC AGG TGA TTGATCCTGG 1619 Ile Gly Ala Leu Ser Leu Gly Arg Thr Thr Ile Arg * 465 470 475 CGTTGCAGCC CAATCATGTG GCATATTTCT AAGTTTGGGT TGCTGTGTAG AACTAAATTT 1679 CTGAGCGGAG AACACCATGG TGGAAAAACC TTGAATATAA AAACACCACC AAAGTAGCAT 1739 CTTTACCAAC TGGGAGAGCC TTGGAGGGAG CTATAAAAGT TTTGATATGG CTGCCGGTGA 1799 TATTCCTGCA TTCATGTGTA GTCTCATTTT ATATTGAAAA GATGATAACA AATGGGTAAT 1859 TTATTGTCTT GGACTTATAC ATGCATTGAT GGAGTTGTAG CCAAGTTTTT TTATTACTCT 1919 TTTTTTCTTT CTTCTTTTTG ATAGTGCTCT CCTGCATTAT TTATATAATT TTAAGATGCG 1979 TTAACAGAGA AAAAAAAAAA AAAAAAA 2006 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 476 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine 24 2779433 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Asp Gly Thr Gly Asn Arg Asn Pro Pro Pro Thr Ser Thr Val Arg 1 5 10 15 Asp Asn Ser Pro Pro Pro Glu Pro Ser Pro Glu Ser Leu Arg His Val 25 30 Ser Arg Met Ile Asn Ser Asn His Tyr Thr Ser Pro Ser Arg Thr Ile 40 45 Tyr Ser Asp Arg Phe Ile Pro Ser Arg Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu 55 60 Phe Asp Ile Asn Thr Pro Thr Glu Gly Arg Asp Asp Ser Ser Ser Ala 70 75 80 Tyr Thr Thr Leu Leu Arg Thr Ala Leu Phe Gly Pro Asp Val Ala Gly 90 95 Pro Val Thr Pro Glu Lys Thr Asp Ser Pro Ser Met Thr Leu Pro Asn 105 110 Arg Asn Ile Phe Arg Tyr Lys Thr Glu Thr Arg Gln Ser Met His Ser 120 125 Leu Ser Pro Phe Met Asp Asp Asp Phe Val Pro Gly Val Asn His Ser 135 140 Pro Val Lys Ala Pro Arg Lys Val Pro Arg Ser Pro Tyr Lys Val Leu 150 155 160 Asp Ala Pro Ala Leu Gln Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Leu Val Asp Trp 170 175 Ser Ser His Asn Val Leu Ala Val Gly Leu Gly Asn Cys Val Tyr Leu 185 190 Trp Asn Ala Cys Ser Ser Lys Val Thr Lys Leu Cys Asp Leu Gly Val 200 205 Asp Asp Cys Val Cys Ser Val Gly Trp Ala Gln Arg Gly Thr His Leu 210 215 220 Ala Val Gly Thr Asn Asn Gly Lys Val Gln Ile Trp Asp Ala Ala Arg 225 230 235 240 Cys Lys Lys Ile Arg Ser Met Glu Gly His Arg Leu Arg Val Gly Ala 245 250 255 Leu Ala Trp Ser Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Gly Arg Asp Lys Asn 260 265 270 Ile Tyr Gln Arg Asp Ile Arg Thr Gln Glu Asp Phe Val Ser Lys Leu 275 280 285 Ser Gly His Lys Ser Glu Val Cys Gly Leu Lys Trp Ser Tyr Asp Asn 290 295 300 Arg Glu Leu Ala Ser Gly Gly Asn Asp Asn Lys Leu Phe Val Trp Asn 305 310 315 320 Gin His Ser Thr Gln Pro Val Leu Lys Tyr Cys Glu His Thr Ala Ala 325 330 335 2779433 Val Lys Ala Ile Ala Trp Ser Pro His Leu His Gly Leu Leu Ala Ser 340 345 350 Gly Gly Gly Thr Ala Asp Arg Cys Ile Arg Phe Trp Asn Thr Thr Thr 355 360 365 Asn Ser His Leu Ser Cys Met Asp Thr Gly Ser Gln Val Cys Asn Leu 370 375 380 Val Trp Ser Lys Asn Val Asn Glu Leu Val Ser Thr His Gly Tyr Ser 385 390 395 400 Gln Asn Gln Ile Ile Val Trp Arg Tyr Pro Thr Met Ser Lys Leu Ala 405 410 415 Thr Leu Thr Gly His Thr Tyr Arg Val Leu Tyr Leu Ala Ile Ser Pro 420 425 430 Asp Gly Gln Thr Ile Val Thr Gly Ala Gly Asp Glu Thr Leu Arg Phe 435 440 445 Trp Asn Val Phe Pro Ser Pro Lys Ser Gln Asn Thr Glu Ser Glu Ile 450 455 460 Gly Ala Leu Ser Leu Gly Arg Thr Thr Ile Arg * 465 470 475 REVENDICATIONS 1) Protéine végétale à motifs WD40 répétés, caractérisée en ce qu'elle appartient à la sous-famille fzr. 2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente au moins 45%, et de préférence au moins 55% d'identité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:2 ou au moins 60% et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:2. 3) Fragment d'acide nucléique purifié caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence codant pour une protéine selon la revendication 1, ou de sa séquence complémentaire. 4) Vecteur recombinant contenant un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3. ) Cellule transformée par au moins un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3. 6) Cellule transformée selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale. 7) Plante transgénique transformée par au moins un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3. 8) Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ou d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 3, pour réguler la différenciation et la prolifération de cellules végétales. 9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite protéine ou ladite séquence d'acide nucléique est utilisée pour favoriser l'endoploidie dans les cellules d'une plante ou d'un tissu végétal. 10) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite protéine ou ladite séquence d'acide nucléique est utilisée pour favoriser la régénération in vitro de plantes à partir de cals en culture. 11) Utilisation d'une protéine de la sous- famille fzr ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie de ladite protéine, ou de sa séquence complémentaire, pour réguler la différenciation et la prolifération de cellules végétales.