Brevet FR2774292A1 — publié le 19990806

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES, COSMETIQUES ET/OU ALIMENTAIRES, A BASE DE DIATOMEES La présente invention se rapporte au domaine de la pharmacie, de la cosmétique et/ou de l'alimentation. Elle a plus précisément pour objet des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires à base de Diatomées. Les Diatomées constituent l'une des classes importantes du phytoplancton marin, ce sont des petits végétaux unicellulaires, ayant généralement de 2 à 400 pm de longueur, à l'exception de quelques formes pouvant atteindre jusqu'à 4 mm de long. Les Diatomées sont caractérisées par la présence d'une capsule protectrice siliceuse, le frustule, constitué de deux parties emboîtées l'une dans l'autre. Les Diatomées sont habituellement divisées en deux ordres, les Centrales (Diatomées centriques) et les Pennales (Diatomées pennées). Elles vivent en abondante quantité dans les océans et en grandes concentrations dans les lacs salés que l'on trouve aux Etats-Unis d'Amérique, en Australie et surtout dans la zone méditerranéenne. Elles peuvent être cultivées assez facilement en éprouvette, en bassin ou encore en réservoir plastique ou tout autre contenant approprié. Les Diatomées sont susceptibles de proliférer par voie végétative et de se reproduire par voie sexuelle. Selon l'environnement, elles sont capables de produire des substances messagères destinées à attirer, ou à informer un congénère. Selon la présente invention, il a été trouvé d'une manière surprenante que les Diatomées permettent d'activer ou de stimuler considérablement la synthèse de la pro-opiomélanocortine (POMC) et de ses dérivées, par les cellules de mammifères et, plus particulièrement par les cellules épithéliales. La pro-opiomélanocortine (POMC) est une prohormone contenant 265 aminoacides ; sa synthèse a été mise en évidence initialement dans l'hypophyse. La POMC, une fois synthétisée, est ensuite clivée par des convertases spécifiques en une série d'hormones différentes : ss-lipoprotéine (ss- LPH) contenant 91 aminoacides, B-endorphine contenant 31 aminoacides, corticotrophine (ACTH) contenant 39 aminoacides, met-enképhaline-5, mélanocyte stimulating hormone (MSH): MSH alpha, contenue entièrement dans la structure de l'ACTH, MSH bêta, contenue dans la structure de ss-LPH, MSH gamma, contenue dans un fragment de la première moitié de la POMC. Ainsi, les Diatomées permettent non seulement l'activation de la synthèse de la POMC mais également celle de ses dérivés tels que la ss-endorphine, MSH etc... Les endorphines sont également produites par d'autres prohormones que la POMC. Il existe en tout trois grands types de précurseurs d'endorphines: - la pro-opiomélanocortine (POMC) o ss-endorphine et met-enképhaline, - la pro-enképhaline Jusque récemment, il était admis que les neurohormones (endorphines. enképhalines) étaient synthétisées dans les organes neuroendocriniens comme l'hypophyse, la médullo-surrénale ou dans certains groupes de neurones du système nerveux central. Plus précisément, on savait que la synthèse de ss-endorphine avait lieu dans l'hypophyse et celles de la met-enképhaline et de la leuenképhaline dans les cellules chromaffines de la médullaire surrénale. Il est maintenant établi que ces neurohormones sont également synthétisées dans la peau. La peau est un organe continuellement exposé aux agressions. Lors d'une effraction ou d'une modification des propriétés de la barrière cutanée, des signaux d'alerte (système nerveux) sont activés. La coordination de ces deux systèmes est facilitée par le système neuroendocrinien. Cette intrication étroite qui existe entre les systèmes nerveux, immunitaires et neuroendocriniens est particulièrement démonstrative dans la peau. Le tissu cutané est richement innervé. Les différentes sensibilités (tactile, épicritique, au froid, à la chaleur...) sont assurées par des terminaisons nerveuses spécialisées. Sur les voies de la douleur sont installées des voies inhibitrices. Ainsi, au niveau de la moelle épinière, la neurotransmission peut être inhibée par des endorphines contenues et libérées par des neurones spécialisées provenant des voies descendantes de la moelle épinière. On sait maintenant que dans la peau elle-même la transmission de l'influx nerveux du nocicepteur peut être inhibée par des endorphines pouvant provenir de la circulation sanguine, apportées par l'infiltrat inflammatoire ou encore synthétisées in situ dans la peau. I1 a été montré récemment que la POMC et ses dérivés étaient exprimés et produits par les kératinocytes. Ainsi, Schauer et al (1994), Chakraborty et al (1996), Slominski et al (1995), Wintzen et al (1996) ont mis en évidence la présence de MSH, d'ACTH et de ss-endorphine dans le surnageant de kératinocytes humains normaux ou de lignées épidermiques cancéreuses. Parmi les autres cellules présentes dans la peau, les mélanocytes ont également la capacité de synthétiser des dérivés de la POMC (Chakraborty et al, 1996 ; Slominski et al, 1995). La pro-opiomélanocortine (POMC) et, par voie de conséquence, les hormones dérivées, interviennent dans de nombreux processus cutanés immunitaires et inflammatoires et sont considérées comme étant des messagers liant le système nerveux au système immunitaire. Ainsi, la ss-endorphine et l'o-MSH ont un rôle important dans le contrôle de l'inflammation et du système immunitaire : migration des monocytes, activation macrophagique, production de cytokines et de médiateurs proinflammatoires. La ss-endorphine module la synthèse d'immunoglobines, la prolifération des lymphocytes et l'activité des cellules natural tiller . L'importance des endorphines se vérifie également au niveau dermatologique. Ainsi, le taux ss-endorphines sériques et cutanés est augmenté dans le psoriasis, ce qui explique les altérations de la réponse neurogène érythémateuse et les anomalies de la transmission des stimulis sensoriels. La ss-endorphine produite par les cellules inflammatoires présentes dans les plaques de psoriasis ont un effet anti-nociceptif ce qui explique la rareté du prurit dans cette affection. Ainsi, les compositions selon l'invention à base de Diatomées sont destinées notamment à traiter les pathologies dans lesquelles sont associés des phénomènes inflammatoires. A titre d'exemple, on pourra citer : érythème solaire, urticaire, psoriasis, piqûres d'insecte, polychondrite atrophiante, prurit, atteintes articulaires des entéropaties chroniques, insuffisance veineuse, certains type d'allopécie etc... Au cours d'un stress, les dérivés de la POMC sont libérés dans la circulation sanguine. Les endorphines, de par leur effet antalgique, interviennent dans le contrôle de la douleur. Cependant, les endorphines, encore appelées hormones du plaisir , interviennent également dans le domaine du plaisir. Ainsi, certaines stimulations cutanées induisent la sécrétion d'endorphines : le massage et le bien être qu'il procure, s'accompagne d'une augmentation du taux d'endorphines dans le sang. Par ailleurs, après une irradiation induite par des UV chez l'homme ou après un exercice intense, le taux de B-endorphine sérique est stimulé. Les endorphines contrôlent encore la pousse des poils. En effet, à la phase anagène de la croissance des cheveux est associée une augmentation de la production d'endorphines. Les dérivés de la POMC, dont la ss-endorphine, la-MSH, 1'ACTH ont également une activité lipolytique. Ainsi, I'importance des endorphines peut être mesurée aussi bien au niveau cosmétique (plaisir et bien-être, pousse des cheveux, activité lipolytique...) qu'au niveau thérapeutique. La présente invention a pour objet des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires destinées notamment à stimuler ou à amplifier la synthèse de la proopiomélanocortine et de ses dérivées comme la '3-endorphine, par les cellules épithéliales de mammifères, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif des Diatomées, en association ou en mélange avec tout excipient ou véhicule inerte, non toxique, approprié à la voie d'administration envisagée. Par cellules épithéliales, on entend plus particulièrement les kératinocytes, les cellules de Malpighi etc... Les Diatomées utilisées dans la présente invention sont notamment les Diatomées de l'ordre des Centrales comme les Cyclotelles. Selon la présente invention, les Diatomées se trouvent sous forme de broyat, d'extrait, de suspension ou de solution. Les Diatomées, et plus particulièrement les Diatomées Centrales telles que Cyclotella, sont notamment présentes dans les régions sub-sahariennes du pourtour méditerranéen où l'on trouve des lacs remplis d'une eau très salée qui, à certaines périodes de l'année, ne sont qu'une croûte de sels. Les Diatomées sont isolées par filtration de l'eau contenant lesdites Diatomées ou par tamisage du sel contenant lesdites Diatomées. Les Diatomées ainsi obtenues sont ensuite éventuellement soumises à un broyage, puis, le broyat de Diatomée ou les Diatomées est soumis à une extraction par un ou plusieurs épuisements à l'aide d'un solvant organique choisi dans le groupe constitué par les alcanols inférieurs (éthanol...), les cétones aliphatiques (acétone...), les alcanes (pentane, hexane, heptane...), les solvants halogénés (chloroforme...), les solvants aromatiques, les esters (acétate d'éthyle...) et/ou les éthers. Selon la présente invention, le solvant organique d'extraction sera de préférence l'éthanol ou l'acétone. On obtient ainsi un extrait éthanolique ou acétonique de Diatomées. Le broyat de Diatomées ou les Diatomées pourront également être soumis à une extraction par un ou plusieurs épuisements à l'aide de l'eau. Si le solvant est l'eau, on obtient une suspension de Diatomées, qui une fois chauffée puis décantée ou filtrée, se trouve sous forme de solution. La teneur en principe actif des compositions conformes à l'invention est assez variable selon les usages envisagés. Ainsi, les compositions dans lesquelles la teneur en Diatomées s'échelonne de 0,001 % à 10 % en poids par rapport au poids total de la composition, sont conformes à l'invention. Lorsque l'on utilise un extrait sec de Diatomées obtenu par évaporation du solvant, la concentration dans les compositions selon l'invention s'échelonne de 0,01 pLg/ml de milieu de culture à 10 llg/ml de milieu de culture. Dans le cas plus particulier des compositions sous forme de crèmes, la teneur en principe actif s'échelonne de 0,1 mg/kg de composition à 10 g/kg de composition. Dans le cas de compositions destinées à la voie orale, la teneur en principe actif s'échelonne de 0,01 mg/kg de poids corporel à 200 mg/kg de poids corporel. La suspension, la solution ou l'extrait de Diatomées peut, en fonction des besoins être concentré(e), séché(e) et éventuellement dilué(e) dans un solvant adapté à l'usage envisagé huile végétale, huile minérale, esters d'acides gras et de glycérol, liquide organique, cire ou composé ou mélange fusible. L'excipient ou le véhicule inerte des compositions conformes à l'invention est l'un de ceux qui conviennent pour l'administration par voie digestive, parentérale ou topique. A titre d'exemple, on pourra citer des adjuvants de fabrication (liants, fluidifiants...), des agents de sapidité, des colorants, des stabilisants, etc. Les compositions selon l'invention sont par exemple présentées sous forme de comprimés, de capsules, de gélules, de pilules, de solutés ou dc suspensions injectables, de patchs, de crèmes, de gels ou de pommade. La présente invention concerne encore l'utilisation des Diatomées en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires destinées notamment à stimuler ou à amplifier la synthèse de la pro-opiomélanocortine et ses dérivées comme la B-endorphine par les cellules épithéliales des mammifères. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Ces exemples sont décrits en tenant compte des figures annexées. Dans ces exemples, les essais ont été réalisés avec un extrait éthanolique de Diatomées Cyclotella. Cet extrait sera appelé extrait de Cyclotella et représenté par les initiales E.C . EXEMPLE I Etude de la cytocompatibilité de l'extrait de Cyclotella (E.C) On montre, dans un premier temps, que l'extrait de Cyclotella (E.C) est cytocompatible, c'est à dire qu'il n'affecte, aux concentrations utilisées, ni la prolifération, ni l'activité mitochondriale des cellules. Les tests de cytocompatibilité sont indispensables pour poursuivre les études sur un principe actif. En dehors de la connaissance de la cytocompatibilité des doses utilisées, qui est nécessaire à tous les produits destinés à une application cutanée cosmétique, ces tests définissent les concentrations optimales lors des évaluations d'activité et évitent l'introduction de résultats d'activité ambigus. La cytocompatibilité de l'extrait de Cyclotella est évaluée par deux tests biologiques réalisés sur les fibroblastes et les kératinocytes: L'activité mitochondriale et la prolifération des cellules. 1. TESTS DE L'ACTIVITE MITOCHONDRIALE L'activité mitochondriale est évaluée par le test XTT. Le test XTT est un test colorimétrique basé sur la réduction d'un sel de tétrazolium XTT soluble (XTT = 2,3-bis [2-Methoxy-4-nitro-5sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5 carboxyanilide) par la NADPH réductase mitochondriale des cellules vivantes en un sel de formazan jaune orange hydrosoluble qui se solubilise dans le surnageant du milieu de culture. Cette solution colorée est dosée par spectrophotométrie à l'aide d'un lecteur à microplaques, à 450 nm. La densité optique, mesurée par le test XTT, est directement corrélée à l'activité mitochondriale ou à la cytocompatibilité. Une bonne activité mitochondriale traduit une bonne cytocompatibilité. Le test est réalisé avec un nombre de cellules constant ; pour cela, les cellules sont incubées avec l'extrait de Cyclotella à confluence pour inhiber toute prolifération. A) Test sur les fibroblastes Les fibroblastes sont des cellules que l'on cultive aisément, ces cellules constituent la population cellulaire la plus abondante de la peau humaine. Les fibroblastes proviennent de peau humaine prélevée sur un enfant âgé de 7 ans. On met en incubation 3.105 fibroblastes pendant 24 heures dans 200 p1 de milieu de culture DMEM (Dubelcco Minimum Essential Medium). Les cellules en hyperconfluence, pour qu'elles ne se divisent pas, sont au 5e passage traitées avec diverses concentrations d'extrait éthanolique de Cyclotella. Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1: Activité mitochondriale (en D.O.) des fibroblastes cultivées avec des concentrations d'extraits éthanoligues de Cyclotella (E.C! variant de 0,068 à 1.366 KLg/ml E.C: Moyenne Ecart type en llg / ml (DO) Témoin (1) 1,027- Témoin (1) 1,027 1,147 1,145 1,090 1,207 1,123 0,068 E.C : 0,068 (2) 1,376 1,382 1,269 1,305 1,457 1,358 0,073 E.C : 0,136 (3) 1,562 1,552 1,561 1,457 1,446 1,516 0,059 E.C 0,273 (4) 1,345 1,645 1,599 1,568 1,565 1,544 0,116 E.C : 0,683 (5) 1,570 1,502 1,698 1,565 1,225 1,512 0,176 E.C: 1,366 (6) 1,363 1,514 1,464 1,443 1,609 1,467 0,112 L'extrait de Cyclotella ne modifie pas le métabolisme des fibroblastes : les différences ne sont pas statistiquement significatives par rapport au témoin. L'extrait de Cyclotella est cytocompatible avec les fibroblastes. B) Test sur les kératinocvtes Les kératinocytes constituent la population cellulaire la plus abondante dans l'épiderme : ce sont les premières cellules qui seront en contact avec le monde extérieur. Les kératinocytes proviennent de peau humaine prélevée sur un enfant âgé de 7 ans. On incube 2.105 kératinocytes pendant 24 heures dans 200 pLl de milieu de culture DMEM. Les cellules en hyperconfluence sont au 5e passage et sont traitées avec diverses concentrations d'extrait éthanolique de Cyclotella. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous Tableau 2 : Activité mitochondriale (en D.O.) des kératinocytes cultivés avec des concentrations d'extrait éthanolisue de Cyclotella (E.C) variant de 0,068 à 1,366 g/ml E.C: Moyenne Ecart type en llg / ml (DO) Témoin (1) 0,525 0,572 0,600 0,620 0,574 0,578 0,036 E.C : 0,068 (2) 0,608 0,662 0,641 0,582 0,610 0,621 0,031 E.C : 0,136 (3) 0,693 0,730 0,700 0,742 0,658 0,685 0,061 E.C : 0,273 (4) 0,674 0,697 0,579 0,647 0,674 0,654 0,046 E.C : 0,683 (5) 0,730 0 0,700 0,742 0,658 0,610 0,688 0,054 E.C:1,366 (6) 0,567 0,676 0,645 0,649 0,598 0,627 0,044 L'extrait de Cyclotella ne modifie pas le métabolisme des kératinocytes : les valeurs ne sont pas statistiquement significatives par rapport au témoin. L'extrait de Cyclotella est cytocompatible avec les kératinocytes. 2. TESTS DE PROLIFERATION La prolifération des cellules est l'un des reflets les plus importants du comportement cellulaire. Une substance pharmacologique destinée à ce type d'application ne doit pas provoquer de prolifération excessive, ni de diminution importante des divisions cellulaires. Un nombre constant de cellules sont mis à incuber dans leur milieu respectif en présence de concentrations croissantes d'extrait éthanolique de Cyclotella. Un dénombrement des cellules est effectué après 24 heures. Comme précédemment, les concentrations d'extrait éthanolique de Cyclotella varient de 0,068 à 1,366 ssg/ml. L'effet des extraits de Cyclotella (E.C) sur la prolifération des fibroblastes et des kératinocytes est illustré par le tableau 3 ci-dessous E. C: | Fibroblastes (F) Kératinocytes (K) en g/ml 0 = témoin (1) 1,000 1,000 0,068 (2) 1,120 1,098 0,136 (3) 1,090 1,107 0,273 (4) 1,075 1,114 0,683 (5) 1,127 1,095 1,366 (6) 1,114 1,112 Cet essai a été effectué trois fois. On ne note pas un dénombrement statistiquement significatif entre les différentes concentrations et par rapport au témoin. L'extrait de Cyclotella ne modifie pas la prolifération des fibroblastes et des kératinocytes. EXEMPLE II Activité de l'extrait de Cyclotella (E.C) sur la synthèse d'une l5-endorphine par les cellules épithéliales Les cellules épithéliales dont il s'agit ici sont les kératinocytes humains. Le test dont les résultats sont rassemblés dans le tableau 4 ci-dessous, est un test d'évaluation par immunofluorescence, obtenu avec un anticorps anti ss-endorphine. L'intensité de fluorescence traduit le taux de synthèse de ss-endorphine par les kératinocytes plus l'intensité de fluorescence est forte, plus le taux de synthèse de ss-endorphine est fort. Les valeurs données sont des valeurs arbitraires correspondant à l'intensité de fluorescence. Kératinocytes (Kc) Kc + IL-l Kc + E.C (témoin) ( témoin activé ) Synthèse de (3- 0,120 1,000 1,650 endorphine Les kératinocytes en présence d'interleukine-l (IL-l) synthétisent environ 10 fois plus de ss- endorphine que les mêmes kératinocytes au repos. Les kératinocytes traités par l'extrait de Cyclotella synthétisent 16 fois plus de p-endorphine que les mêmes kératinocytes au repos. Ainsi, la synthèse de la prohormone pro-opiomélanocortine (POMC), et par conséquent de l'hormone B-endorphine dérivée, est fortement stimulée par les cellules épithéliales en présence de l'extrait de Cyclotella. REVENDICATIONS 1. Compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires destinées notamment à stimuler ou à amplifier la synthèse de la pro-opiomélanocortine et de ses dérivées comme la ss-endorphine par les cellules épithéliales de mammiferes, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif des Diatomées, en association ou en mélange avec tout excipient ou véhicule inerte, non toxique, approprié à la voie d'administration envisagée. 2. Compositions selon la revendication 1, dans lesquelles les cellules épithéliales sont les kératinocytes. 3. Compositions selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lesquelles les Diatomées sont de l'ordre des Centrales comme les Cyclotelles. 4. Compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lesquelles les Diatomées se trouvent sous forme de broyat, d'extrait, de suspension ou de solution. 5. Compositions selon la revendication 4, dans lesquelles l'extrait de Diatomées est obtenu par extraction du broyat de Diatomées ou des Diatomées par un ou plusieurs épuisements à l'aide d'un solvant organique choisi dans le groupe constitué par les alcanols inférieurs, les cétones aliphatiques, les alcanes, les solvants halogénés, les solvants aromatiques, les esters et/ou les éthers. 6. Compositions selon la revendication 5, dans lesquelles le solvant organique est l'éthanol ou l'acétone. 7. Compositions selon la revendication 4, dans lesquelles la solution de Diatomées est obtenu par extraction du broyat de Diatomées ou des Diatomées par un ou plusieurs épuisements à l'aide de l'eau, puis par chauffage, et décantation ou filtration de la suspension ainsi obtenue. 8. Compositions selon l'une quelconque de revendications 1 à 7, dans lesquelles la teneur en Diatomées s'échelonne de 0,001 % à 10 % en poids par rapport au poids total de la composition. 9. Compositions selon l'une quelconque des revendications l à 8, dans lesquelles l'excipient ou le véhicule inerte est l'un de ceux qui conviennent pour l'administration par voie digestive, parentérale ou topique. 10.Utilisation de Diatomées en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques, cosmétiques et/ou alimentaires destinées notamment à stimuler ou à amplifier la synthèse de la pro-opiomélanocortine et de ses dérivées comme la ss-endorphine par les cellules épithéliales de mammifères.