Brevet FR2775524A1 — publié le 19990903

La présente invention concerne une structure antigénique utilisable pour la détection et le dosage d'anticorps, un procédé pour la préparation d'une telle structure antigénique sur une microplaque, un ensemble de diagnostic et de dosage d'anticorps utilisant une telle structure, des substances immunogènes comportant la structure antigénique, leur application à la préparation de lignées cellulaires murines hybrides, ainsi que les anticorps monoclonaux obtenus. La détection des anticorps dirigés contre l'haptène formé par la liaison d'un aldéhyde, tel que le dialdéhyde malonique (MDA), avec les groupements aminés libres des protéines, est utile pour la mise en évidence de certaines modifications pouvant affecter les protéines, par exemple dans des organismes vivants. La présence de ces anticorps, comme par exemple AcAIP, dans l'organisme humain ou animal peut constituer un test pronostic utile dans certaines pathologies. On sait en effet que l'oxydation in vivo de certaines protéines, en particulier des lipoprotéines de basse densité (LDL), entraîne la formation de dérivés dialdéhydiques, comme le MDA, qui peuvent réagir avec les groupes amine primaire de certaines molécules biologiques pour former des couplages intramoléculaires du type l-amino-3-imino-alkylène, et notamment 1-amino3-imino-propène (AIP). Ainsi, par exemple, Gonen B. et al. ["Immunogenicity of malondialdehyde-modified low density lipoproteins1' B. Gonen, J.J. Fallon, S.A. Baker, Atherosclerosis, 65, 265-272 (1987)] utilisent une technique ELISA de détermination des anticorps dirigés contre des lipoprotéines de basse densité (LDL) modifiées par le MDA. La spécificité des anticorps est évaluée par la technique ELISA en fixant les protéines LDL modifiées par adsorption sur la plaque de titrage. Cette technique présente cependant l'inconvénient de la labilité de la liaison d'affinité entre la plaque et la protéine, de l'encombrement stérique important de la protéine limitant l'accès à l'antigène, et de la reproductibilité insuffisante des préparations. Le brevet FR-A-2.601.141 décrit un produit de couplage à base d'haptène lié à une molécule support, telle qu'une protéine, en particulier une protéine LDL, par l'intermédiaire d'un dialdéhyde tel que l'aldéhyde malonique. Les produits obtenus, portant des cycles aminés, peuvent être utilisés pour préparer des anticorps dirigés contre la structure -NH-haptène, utiles dans des dosages de produits pharmaceutiques spécifiques, du type aminoquinoléine, notamment des antimalariens. Le brevet EP-A-484.863 décrit un anticorps monoclonal spécifique de lipoprotéines LDL modifiées par le MDA, préparé en utilisant comme antigènes les protéines modifiées par le MDA. Le procédé de dosage consiste à immobiliser des anticorps reconnaissant les protéines LDL modifiées par le MDA sur un support, à marquer des anticorps réduits reconnaissant les protéines LDL modifiées par le MDA, à mettre les deux anticorps en contact avec l'échantillon à tester, et à effectuer un dosage suivant une technique du type ELISA. Y. Chancerelle et al., "Immunological relevance of MDA Further evidence about the epitopes recognized by antibodies obtained from rabbits immunized with MDA-modified lysozyme" Biochem. International, li, 157-163 (1991), décrivent une technique utilisant le lysozyme modifié par le dialdéhyde malonique comme antigène, fixé sur la microplaque par adsorption, après purification par chromatographie d'exclusiondiffusion. L'étude montre que le sérum de lapin immunisé par certaines protéines modifiées par le MDA, par exemple le lysozyme, contient des anticorps réagissant spécifiquement avec les épitopes contenant les mêmes ponts AIP que ceux formés dans le lysozyme modifié. Tous ces travaux ont montré que les protéines modifiées par le MDA sont antigéniques, en particulier par les ponts 1amino-3-imino-propène (AIP) formés, que l'organisme produit des anticorps dirigés contre ces ponts, et qu'il est possible de détecter ces anticorps au moyen d'antigènes porteurs de ces sites AIP. Cependant, ces techniques manquent de spécificité vis-àvis de la structure à détecter, et les antigènes utilisés possèdent une stabilité insuffisante qui nuit à la fiabilité des méthodes de dosage. En particulier, la réactivité des plaques et des antigènes qui y sont adsorbés varie considé rablement d'un lot à l'autre, ce qui impose d'effectuer des expérimentations complémentaires sur des lots homogènes de plaques. De plus, il est pratiquement impossible de déterminer le nombre d'épitopes réactionnels présents sur les plaques. La présente invention a donc pour objet une structure antigénique définie, comportant un groupe de pontage aldéhyde bifonctionnel entre une structure aminée et un support, ainsi qu'un procédé pour sa préparation. L'invention a encore pour objet des plaques de détection et dosage d'anticorps procurant une excellente sélectivité des anticorps, ainsi qu'une stabilité et une fiabilité améliorées par rapport aux techniques classiques connues. La présente invention a aussi pour objet les substances immunogènes comportant les structures antigéniques ci-dessus, un procédé d'obtention de lignées cellulaires murines hybrides au moyen desdits substances immunogènes, ainsi que les anticorps monoclonaux obtenus dirigés contre le pont amino-iminoalkylène, et en particulier le pont amino-imino-propène. La structure antigénique suivant la présente invention se distingue en ce qu'elle comporte un groupe du type S-amino- imino-alkylène, et de préférence S-amino-imino-propène (S AIP), où S représente un support comportant des groupes amino libres, obtenu par liaison covalente entre un aldéhyde et les groupes amino libres du support S. Le support est de préférence une microplaque comportant au moins un groupement amino libre, mais il peut être plus généralement constitué par toute substance appropriée comportant des groupes amino libres, par exemple une protéine. Ainsi, la structure antigénique suivant l'invention peut être représentée par une formule du type S - N = CH - A - R où S est le support portant un groupe amino, A est un groupe dérivé d'un aldéhyde, R est un atome d'hydrogène ou un groupe - CH = N - P, et P est un reste de molécule à groupe amino, telle qu'une protéine ou un acide aminé. Lorsque P représente un reste d'acide aminé, il peut s'agir par exemple d'un acide aminé simple ou d'un acide diaminé. Dans le cas des acides aminés simples, le rattache ment au reste de la structure antigénique se fait par le groupement N-terminal, tandis que dans le cas des acides diaminés, le rattachement se fait par l'un des groupements amino et le deuxième groupement peut avantageusement être bloqué par un groupe approprié, par exemple un groupe acétyle. Comme exemple d'acide diaminé de ce type, on peut citer notamment l'acétyllysine. Le procédé de préparation suivant la présente invention consiste à faire réagir un composé contenant au moins une fonction aldéhyde avec un support, par exemple une plaque ou une microplaque, comportant au moins un groupe amino libre. Les microplaques utilisées dans l'invention, comportant des groupements amino libre, sont généralement disponibles dans le commerce (par exemple les microplaques Ref. 3390 de la société Costar). Ces microplaques se caractérisent par la présence d'un groupement amino fixé sur une chaîne carbonée plus ou moins longue constituant un groupe espaceur. Les microplaques peuvent être de type usuel dans la technique, à base de diverses matières plastiques, et de préférence à base de polystyrène. L'aldéhyde servant au couplage peut être choisi parmi les mono- ou poly-aldéhydes tels que le formol, le glyoxal, le glutaraldéhyde, le dialdéhyde malonique (MDA), le 4-hydroxynonénal (4HNE), etc. Ainsi, conformément à la présente invention, en maîtrisant les paramètres de la réaction de synthèse chimique de la structure antigénique, il devient possible par conséquent de fixer et déterminer précisément le nombre de sites réactifs présents sur la plaque. D'autre part, la liaison covalente entre la structure antigénique et la plaque est bien plus stable que dans les techniques connues utilisant l'adsorption. Comme indiqué ci-dessus, la substance immunogène suivant l'invention comprend une structure antigénique de type aminoimino-alkylène, et de préférence amino-imino-propène (AIP), associée à une structure aminée et en particulier une protéine telle que l'albumine, par exemple l'albumine de souris. Le procédé d'obtention de lignées cellulaires murines hybrides anti-haptène amino-imino-alkylène, et en particulier amino-imino-propène (AIP), de l'invention consiste à effectuer la fusion de splénocytes de souris immunisées par une substance immunogène comportant la structure antigénique conforme à l'invention, avec des cellules de myélome de souris. La substance immunogène peut être en particulier de l'albumine de souris modifié par le dialdéhyde malonique (MDA) comme indiqué ci-dessus. Le procédé d'obtention des lignées celulaires est mis en oeuvre suivant les techniques classiques. Plus précisément, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes a) on immunise des souris avec une substance immunogène conforme à l'invention, de préférence en présence d'un adjuvant de Freund b) on prélève la rate des souris immunisées; c) on sépare les splénocytes et on les fusionne avec des cellules de myélome de souris, en présence d'un promoteur de fusion d) on cultive les cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif dans lequel les cellules de myélome non fusionnées ne se développent pas e) on sélectionne par des techniques classiques les cellules produisant l'anticorps désiré f) le cas échéant, on effectue le clonage des cellules sélectionnées. La substance immunogène utilisée dans le procédé de l'invention est de préférence l'albumine de souris modifiée par le MDA ou le 4HNE. Par exemple, le MDA peut être obtenu par hydrolyse acétique de 1,1,3,3-tétraéthoxypropane, et la solution de MDA obtenue est mise en contact avec une solution d'albumine de souris, puis le mélange est incubé pendant une période généralement comprise entre 2 et 4 semaines de manière à obtenir la substance immunogène comprenant la structure antigénique de l'invention associée à l'albumine comme structure porteuse. L'immunogène peut être administré par injection sous-cutanée ou intra-péritonéale, en une ou, de préférence, plusieurs injections espacées de plusieurs jours. La fusion des splénocytes avec des cellules de myélome de souris s'effectue en présence d'un promoteur de fusion, un polyéthylène glycol tel que le PEG 1000 ou le PEG 1500, en utilisant de préférence une cellule de myélome pour quatre ou cinq cellules de splénocytes. La culture des cellules hybrides est réalisée de manière classique sur des plaques de culture, en supplémentant le milieu par des éléments nutritifs appropriés. La sélection des cellules produisant l'anticorps désiré peut être réalisée par technique immuno-enzymatique sur microplaque, par une méthode ELISA spécifique, permettant de déterminer que les anticorps produits sont dirigés contre la structure AIP. Il est ainsi possible, conformément à la présente invention, de développer un kit ou ensemble de détection et de dosage d'anticorps, notamment AcAIP, présents dans des milieux biologiques, sur le principe des tests ELISA. L'ensemble de détection et de dosage comprend la structure antigénique précitée combinée à une protéine ou à un acide aminé. Le dosage peut se faire par mesure de la densité optique de l'échantillon, ou par la technique de dosage par compétition permettant une quantification précise du taux d'immunoglobulines spécifiques, au moyen d'anticorps monoclonaux correspondants. L'acide aminé ou la protéine utilisé n'étant pas reconnu par l'anticorps, sa nature est indifférente. La structure antigénique suivant l'invention ainsi que les microplaques les comprenant peuvent être utilisées pour la détection et le dosage des anticorps spécifiques dans les fluides biologiques, en immunobiologie et en immunopathologie, en particulier dans certaines pathologies humaines ou animales impliquant des modifications de protéines, notamment des lipoprotéines LDL, par exemple dans le cas d'athérosclérose. Plus particulièrement, les anticorps monoclonaux obtenus conformément à l'invention peuvent être utilisés, directement ou après marquage, pour visualiser les structures antigéniques correspondantes sur une cellule, un tissu, un organe ou des composants internes de la cellule (noyau, mitochondries, membranes), ainsi que sur une coupe de tissus ou d'organes, par des techniques d'immunocytochimie, d'immunofluorescence ou de cytométrie de flux, ou par d'autres techniques connues de visualisation. Suivant un autre exemple d'application de l'invention, les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans des techniques d'immunocompétition vis-à-vis de l'antigène ou des anticorps polyclonaux correspondants. L'invention peut également trouver application dans la détection et le dosage de divers composants, comme par exemple la détection et le dosage des aldéhydes dans les effluents pollués par une technique de compétition vis-à-vis d'un anticorps monoclonal. Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail sans en limiter la portée. Exemple 1 Préparation des plaques On utilise des plaques à base de polystyrène présentant des groupes amino libres du type Costar-NH2 ref. 3390. La 2 surface des puits de la plaque est d'environ 3 cm , pour une hauteur de 1 cm et un rayon de 0,4 cm. Dans chaque puits des plaques, on verse 300 Ul du réactif dianhydride malonique 10-3 M en solution dans l'acide acétique à 0,5%. Ce réactif est préparé par addition du précurseur tétraéthoxypropane (250 yl) dans 1.000 ml de solution aqueuse d'acide acétique à 0,5 W en laissant l'hydrolyse s'effectuer pendant une nuit à une température de 40C environ. On couvre et on laisse incuber pendant 24 heures à l'abri de la lumière. Les puits sont ensuite vidés et rincés plusieurs fois avec une solution saline de tampon phosphate à pH 7,4. Cette solution est préparée en diluant dix fois dans de l'eau la solution ayant la composition suivante NaCl 80,0 g KH2PO4 2,0 g Na2HPO4 11,5 g KCl 2,0 g Eau pour compléter à : 1000 ml On verse ensuite dans chaque puits 300 yl de réactif constitué par la N-a-acétyl-lysine 10 M (obtenu en ajoutant 188 mg de N-a-acétyl-lysine dans 1000 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 0,5%), puis on laisse incuber pendant 24 heures à 370C à l'abri de la lumière. Les puits sont rincés plusieurs fois en utilisant la même solution saline de tampon phosphate que ci-dessus. Les plaques ainsi préparées sont conservées à sec à une température d'environ 40C. Exemple 2 Dosage des anticorps AcAIP dans un sérum humain ou animal On utilise des plaques préparées comme indiqué dans l'Exemple 1, que l'on réhydrate en effectuant trois lavages au moyen de la solution saline de tampon phosphate décrite cidessus. On répartit dans chaque puits 300 ssl de réactif constitué par la solution de blocage ayant la composition suivante Tampon phosphate - Tween (contenant 0,05 de Tween 20) il BSA (albumine de sérum bovin - fraction V) 2 g Gélatine de poisson (P/V) 12 g On laisse incuber les plaques pendant 1 heure à 370C puis on vide les puits. On verse dans chaque puits 200 Hl d'une dilution appropriée du sérum à étudier, à l'exception des deux premières colonnes qui reçoivent un volume équivalent de solution tampon phosphate comme référence. On laisse ensuite incuber pendant 2 heures à 370C. Les plaques sont ensuite rincées au moyen de la solution de tampon phosphate pour éliminer les anticorps non fixés. On ajoute alors 200 y1 d'une dilution appropriée d'anticorps anti-Ig spécifique, marqué à la peroxydase, à l'exception de la 1ère colonne qui reçoit un volume équivalent de tampon, puis on laisse incuber pendant 2 heures à 370C. Les plaques sont rincées une nouvelle fois au moyen de la solution de tampon phosphate pour éliminer les anticorps non fixés. Puis on ajoute 200 ssl de substrat chromogène spécifique de la peroxydase dans tous les puits. La réaction est arrêtée en ajoutant 50 yl environ d'acide sulfurique 2,5 M dans tous les puits au terme d'un temps d'incubation préalablement déterminé (environ 3 min.) pour pouvoir obtenir une densité optique suffisante. La densité optique est lue sur un lecteur de microplaque de type usuel comportant un filtre réglé à la longueur d'onde caractéristique du chromogène (c'est-à-dire 492 nm). Les valeurs de la 1ère colonne représentent la référence ("réactif blanc") tandis que les valeurs de la 2ème colonne représentent les valeurs de la fixation non spécifique de l'immunoglobuline marquée utilisée. La courbe de titration, donnant la densité optique en fonction de la dilution, est représentée sur la Figure 1. Exemple 3 Préparation d'anticorps monoclonaux A. Préparation d'un immunogène On prépare tout d'abord un immunogène constitué par de l'albumine de souris modifé par le dialdéhyde malonique (MDA) par la méthode suivante. Le dialdéhyde malonique (MDA) est obtenu en hydrolysant 125 yl 1 de 1,1,3,3-tétraéthoxypropane (TEP) dans 50 ml d'acide acétique à 1 W en solution aqueuse. On met en contact 1 ml de cette solution avec 1 ml de solution d'albumine de souris (concentration 10 mg/ml) et le mélange est maintenu sous incubation pendant 21 jours afin de développer les sites aminoimino-propène (AIP) sur l'albumine. En fin d'incubation, l'antigène est conditionné à la concentration de 1 mg/ml. B. Immunisation des souris Des souris Balb/C femelles de 6 semaines sont immunisées par injection intrapéritonéale de 25 yg d'antigène par souris. Deux nouvelles injections sont effectuées à J+21 et J+46. La première immunisation est effectuée en présence d'adjuvant complet de Freund, et les suivantes en présence d'adjuvant incomplet. Aux jours J+3, J+37 et J+73, un prélèvement sanguin est effectué dans le sinus rétro-orbitaire à l'aide de pipettes Pasteur stériles. Le sang ainsi recueilli est centrifugé deux fois et le sérum aliquoté dilué au 1/10 dans du PBS. L'évaluation de l'immunisation est faite en testant les sérums prélevés en dilution sur des plaques de microtitration par une technique ELISA spécifique. Suivant cette technique, l'antigène (pont AIP) est réalisé directement sur la plaque par voie chimique comme indiqué à l'Exemple 1, ce qui permet de fixer sélectivement les anticorps correspondants. Ces tests montrent la positivité des sérums. C. Fusion cellulaire Trois jours avant la fusion, 10 pl d'antigène sont ajoutés à 150 yl de PBS stérile et sont injectés à une souris choisie en fonction du test ELISA ci-dessus. Après sacrifice de l'animal, la rate est prélevée et on observe une forte splénomégalie avec des nodules d'activation. Deux myélomes sont utilisés pour la fusion (SP2/O-AG14 et X63Ag8/653). Les comptages cellulaires après lavage par les techniques usuelles donnent les résultats suivants 6 splénocytes de souris : 140 x 106 cellules vivantes 6 myélome SP2/O-AG14 : 40 x 10 cellules vivantes myélome X63Ag8/653 : 28 x 106 cellules vivantes Dans tous les cas, le taux de viabilité et supérieur à 95%. L'hybridation lymphocytaire est conduite en présence de PEG 1500 (Sigma) à 40% avec un rapport splénocyte/myélome de 5/1. 24 plaques de 96 puits ont été préparées en présence de 10.000 macrophages péritonéaux de souris Balb/C par puits. La distribution des cellules est réalisée en faisant varier la quantité de splénocytes par puits entre trois groupes de plaques (2,5 x 104, 5 x 104, et 105 respectivement) pour la fusion avec le myélome SP2/O-AG14, tandis qu'elle est de 105 splénocytes par puits pour la fusion avec le myélome X63Ag8/653. Le milieu utilisé est le suivant : RPMI 1640 (Biowhittaker), 2 mM glutamien (Biomérieux), 1 mM pyruvate de sodium (Sigma); HAT (Sigma): hypoxanthine 100 mM, aminoptérine 0,4 mM, thymidine 16 mM, sérum de veau foetal décomplémenté 20% (USDA) , pénicilline 100U/ml, streptomycine 100 mg/ml (Sigma). L'observation de l'évolution s'accompagne des observations suivantes : J+3 : apparition des premiers clones ; J+7 changement de milieu dans tous les puits ; J+ll : ajout de 5.000 macrophages par puits. Après observation microscopique, les puits dans lesquels un seul clone a poussé sont prélevés pour criblage. D. Criblage des surnageants d'hybridomes de fusion 600 surnageants d'hybridomes (utilisés purs) sont testés en ELISA suivant la même technique qu'au point B. ci-dessus. A l'issue du criblage 45 hybridomes sont sélectionnés pour la réactivité de leur surnageant sur l'antigène AIP en ELISA. Les anticorps produits dans les 45 surnageants d'hybridomes sont isotypés à l'aide des réactifs anti-isotype de souris du kit Cliniscience (SBA Clonotyping II, n 5060-05). Seuls les anticorps secrétant des anticorps de type IgG sont cultivés afin d'assurer leur préservation et de fournir une quantité suffisante de surnageant. Ainsi, 15 hybridomes sont sélectionnés et testés sur plaque ELISA spécifique, et par technique de compétition vis-à-vis d'un anticorps riche en anticorps spécifiques. On peut ainsi sélectionner les clones présentant les meilleures réponses vis-à-vis de l'antigène. Deux clones sont testés (compétition vis-à-vis d'un sérum) et développés, et les anticorps obtenus sont purifiés et ramenés à la concentration de 0,5 mg/ml, puis des tests ELISA en dilution sur des plaques pécifiques AIP sont effectués. Les tests montrent que l'anticorps obtenu comme indiqué ci-dessus est spécifiquement dirigé contre le pont AIP, et ceci indépendamment de la structure de la molécule (albumine ou lysozyme) à laquelle est lié l'antigène. Exemple 4 Cet exemple décrit l'application des anticorps obtenus dans l'Exemple précédent en immunocytométrie pour révéler des sites antigéniques AIP sur des cellules endothéliales en culture. Une série de dilutions de l'anticorps biotinylé sont effectuées. La dilution de travail retenue est la dernière dilution donnant une fluorescence nette. Témoin néaatif (cellules non peroxydées) Les cellules endothéliales en sub-culture 2 et non peroxydées sont marquées avec l'anticorps. En immunofluorescence on observe une fluorescence diffuse, peu marquée, révélant la présence de sites AIP natifs sur les cellules. Marquage positif (cellules peroxydées) Les cellules peroxydées présentent un marquage très positif de leur membrane cellulaire, mettant ainsi en évidence le développement de sites antigéniques spécifiques à la surface des cellules. REVENDICATIONS 1. Structure antigénique du type comportant un groupe de pontage entre une protéine et un support, caractérisée en ce qu'elle comporte un groupe de pontage du type S-aminoimino-alkylène, où S représente un support comportant des groupes amino libres, obtenu par liaison covalente entre un aldéhyde et les groupes amino libres du support S. 2. Structure antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le groupe de pontage est du type S-amino-imino-propène, où S est le support comportant des groupes amino libres. 3. Structure antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est représentée par la formule S - N = CH - A - R où S est le support portant un groupe amino, A est un groupe dérivé d'un aldéhyde, R est un atome d'hydrogène ou un groupe - CH = N - P, et P est un reste à groupe amino, telle qu'une protéine ou un acide aminé. 4. Structure antigénique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support S est une microplaque comportant des groupes amino libres. 5. Procédé de préparation d'une structure antigénique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un composé contenant au moins une fonction aldéhyde avec un support comportant au moins un groupe amino libre 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'aldéhyde est choisi parmi le formol, le glyoxal, le glutaraldéhyde, le dialdéhyde malonique (MDA), le 4-hydroxynonénal (4HNE). 7. Ensemble de détection et de dosage d'anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend une structure antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, combinée à une protéine. 8. Substance immunogène pour l'obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre le pont amino-imino-alkylène, et en particulier le pont amino-imino-propène, caractérisée en ce qu'elle comprend une source antigénique selon 1'une quelconque des revendications 1 à 3. 9. Procédé d'obtention de lignées cellulaires murines hybrides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) on immunise des souris avec une substance immunogène selon la revendication 8, de préférence en présence d'un adjuvant de Freund b) on prélève la rate des souris immunisées c) on sépare les splénocytes et on les fusionne avec des cellules de myélome de souris, en présence d'un promoteur de fusion d) on cultive les cellules hybrides obtenues dans un milieu sélectif dans lequel les cellules de myélome non fusionnées ne se développent pas e) on sélectionne par des techniques classiques les cellules produisant l'anticorps désiré f) le cas échéant, on effectue le clonage des cellules sélectionnées. 10. Anticorps monoclonaux dirigés contre le pont aminoimino-alkylène, et en particulier le pont amino-imino-propène, obtenus par le procédé selon la revendication 9.