Brevet FR2780412A1 — publié le 19991231

Eosinophile-peroxydase humaine recombinante, procédé d' obtention, utilisation de ladite protéine. La présente invention relate la préparation de l'éosinophile-peroxidase humaine par génie-génétique. L'invention concerne également la préparation de sous-fragments de l'éosinophile-peroxydase humaine par génie-génétique. L'invention décrit un nouveau procédé d'obtention de l'éosinophile-peroxidase humaine. En particulier, l'invention permet de remplacer avantageusement l'éosinophile humaine obtenue par les techniques d'extraction classiques (dont nous exposerons plus loin la difficulté et les inconvénients majeurs) par l'éosinophile-peroxydase humaine recombinante obtenue selon la présente invention. Tout procédé, toute technique, tout produit ou toute méthode nécessitant pour sa réalisation, sa mise au point ou sa commercialisation l'utilisation de l'éosinophile-peroxidase humaine pourra avantageusement être considérablement amélioré par l'éosinophile- peroxydase humaine recombinante produite selon le procédé décrit ici. Notamment, la mise au point et la production d'un dosage immuno- enzymatique de l'éosinophile-peroxidase sera rendu possible grâce à notre invention. De même, la recherche de nouveaux médicaments dirigés contre les effets néfastes de l'éosinophile-peroxidase humaine pourra être très considérablement facilitée par l'utilisation de l'éosinophile-peroxidase ou de ses sous-fragments produits selon la présente invention. L'éosinophile-peroxidase (EPO) est une protéine appartenant à la famille des oxydo-réductases et possède en son sein une partie héminique qui lui confère son activité peroxydasique ainsi que des propriétés optiques caractéristiques. Sa masse moléculaire est située aux alentours de 71 KiloDalton (KDa). Elle est constituée de deux sous-unités. L'ADN complémentaire (ADNc) codant pour cette protéine a été cloné par l'équipe de R. Ten (Ten et al. , (1989) J. Exp. Med., 169, 1757-1769) et par celle de Sakami (Sakami et al., (1989) J. Biol. Chem, 264, 16828-16836) et la séquence nucléotidique codante est aujourd'hui connue. La protéine peut être préparée à partir d'extraits issus d'éosinophiles sanguins, par purification sur plusieurs types de supports chromatographiques. Néanmoins, compte tenu de la très grande difficulté à se procurer des éosinophiles humains, de par l'origine précisémment humaine des cellules mais également à cause de la très faible quantité d'éosinophiles circulants, il n'est pas envisageable de préparer de l'EPO en quantité suffisante pour réaliser une étude ou développer un dosage immuno-enzymatique. D'autre part, pour les mêmes raisons, il est difficile aujourd'hui d'entreprendre la recherche de nouveaux médicaments visant à diminuer les effets néfastes de cette protéine dans l'organisme humain dans un contexte allergique. L'EPO humaine peut être purifiée à partir de sang humain frais ou périmé, comme cela est décrit dans la littérature (Ben et al., (1984) Bioch. et Biophys. Acta, 784, 177-186), ou bien encore à partir de sang de patients atteints d'hyperéosinophilie (Abu-Ghazaleh et al., (1992) J. of Leukocyte Biol., 52,611-618). L'EPO humaine purifiée à partir d'extraits d'origine humaine sera appelée "EPO humaine extractive" par opposition à l'EPO humaine obtenue selon l'invention, et que l'on nommera EPO humaine recombinante (en abrégé: EPOrh). Compte tenu des quantités très faibles d'éosinophiles circulants, et sachant que ceux-ci contiennent environ 6,8 microgrammes d'EPO par million de cellules, on comprend que la purification de 1'EPO à des fins industrielles est impossible. L'utilisation de sang de patients sains ou malades à des fins de production industrielle pose des problèmes sérieux: problèmes d'éthique: il n'est pas concevable d'utiliser du matériel humain à des fins autres que celle d'améliorer la connaissance scientifique. Or l'EPO purifiée pourrait être, selon les applications décrites selon l'invention, employée à la production d'une trousse de dosage, ou d'un outil de recherche d'un nouveau médicament, ou bien encore par exemple à être intégrée dans un médicament. problèmes de sécurité biologique: l'utilisation de sang humain n'est pas sans danger. De nombreux virus connus ou inconnus y circulent et ne sont pas forcement éliminés lors du procédé de purification. On peut citer par exemple les problèmes de santé publique posés par l'utilisation de facteurs de coagulations utilisés pour le traitement de l'hémophilie, purifiés à partir de sangs contaminés. problèmes d'approvisionnement: en effet, compte tenu de la faible représentativité des éosinophiles dans le sang, il faut traiter plusieurs litres voire plusieurs dizaines de litres pour obtenir une quantité faible d'EPO. Or, le sang collecté par les Centres de Transfusion ne suffit pas à couvrir les besoins thérapeutiques actuels. En conclusion de ce qui précède, nous pouvons dire qu'il n'est pas possible d'utiliser l'EPO humaine extractive dans une application industrielle, qui par définition en nécessite une quantité substantielle. Afin de développer, de produire et de commercialiser une trousse de dosage de l'éosinophile-peroxidase, il est absolument nécessaire d'obtenir de cette enzyme très purifiée. En effet, il convient d'une part de disposer d'une quantité suffisante de cette enzyme pour procéder à l'immunisation des animaux utilisés soit pour la production d'anticorps polyclonaux, soit pour l'obtention d'anticorps monoclonaux. Dans le cas des anticorps polyclonaux, il est important de répéter les immunisations sur un même animal selon un calendrier vaccinal bien défini, avec des doses de protéine qui au total sur la campagne de vaccination représentent quelques dizaines de microgrammes pour de petits animaux de laboratoire à plusieurs milligrammes sur des animaux plus importants tels que la chèvre très souvent utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux en quantité. En ce qui concerne l'élaboration et la production d'anticorps monoclonaux chez la souris ou le rat, il est important de disposer d'EPO purifiée pour immuniser les animaux tel que mentionné plus haut, mais également pour sélectionner les hybridomes qui sont sécréteurs des anticorps spécifiquement recherchés. Enfin, il est très important de disposer de protéine purifiée afin d'étalonner la méthode de mesure développée et de fournir aux utilisateurs la possibilité d'étalonner ladite méthode afin de constituer une courbe de référence permettant d'établir une corrélation entre le résultat expérimental obtenu pour un échantillon et la concentration de la protéine dans le liquide mesuré. L'EPO produite selon l'invention permet avantageusement l'obtention des anticorps polyclonaux ou monoclonaux absolument nécessaires à la fabrication d'une telle trousse de dosage. L'immunisation d'une chèvre (animal classiquement utilisé pour la production d'anticorps polyclonaux) nécessite jusqu'à 5 mg de protéine immunogène. Cela représenterait, pour l'EPO humaine extractive, l'équivalent après purification de 20 litres de sang humain. L'EPO recombinante humaine selon l'invention pourrait également servir de support de recherche de nouveaux médicaments. Par exemple, l'effet toxique de l'éosinophile- peroxidase naturelle sur les tissus de l'arbre respiratoire pourrait être diminué ou modulé par l'administration de médicament interagissant directement sur ladite EPO. On pourrait imaginer ces médicaments interagissant avec le site actif responsable de l'activité enzymatique pour en diminuer la capacité néfaste, mais aussi d'autres molécules qui agiraient à différents endroits de la protéines. Dans tous ces cas de figure, il est absolument obligatoire de disposer de quantité suffisante d'EPO purifiée pour effectuer les essais in vitro, en testant les molécules sur la protéine purifiée, dans des systèmes de culture cellulaire ou bien encore sur les animaux de laboratoire utilisés en pharmacologie et en toxicologie. Une fois de plus, il s'agit ici de travaux que l'on ne peut raisonnablement pas entreprendre sans disposer de l'EPO préparée selon la présente invention. La myéloperoxydase, une protéine ayant certaines similitudes de séquence avec 1'EPO, est la cible d'autoanticorps (nommés P-ANCA) qui se développent dans des maladies de système telles que le syndrome de Churg-Strauss ou les vasculites nécrosantes. Du fait de la très grande difficulté d'obtention de l'éosinophile-peroxidase humaine, il est difficile d'envisager le développement d'une trousse de dosage qui permettrait de mettre en évidence le rôle des auto-anticorps dirigés contre l'EPO dans les maladies de système. En effet, il a été montré par Dolman K.M. dans j. Clin. Exp. Immunol. (1993), 92,58-64 que l'EPO humaine pouvait être la cible de tels autoanticorps. Cette démonstration a été faite par immunofluorescence indirecte. Une trousse de dosage de type ELISA concue à partir de l'EPO humaine recombinante selon l'invention permettrait une analyse rapide et fine de la présence ou non d'autoanticorps anti-EPO dans le sang de patients atteints de différentes maladies. Pour cette même raison de limitation d'EPO, la production industrielle d'une telle trousse de dosage était à ce jour impossible. Grâce à l'EP0 obtenue selon l'invention cette difficulté sera aisémment contournée. Pour obtenir de l'éosinophile- peroxydase recombinante humaine selon l'invention, il a été nécessaire de disposer dans un premier temps de l'ADN complémentaire codant pour ladite protéine. Pour cela, nous avons procédé à la mise en culture et à la différenciation de cellules de sang de cordon en précurseurs éosinophiles exprimant l'ARN messager codant pour 1'EPO humaine. Cette différentiation a été obtenue par stimulation des cellules avec des interleukines selon la méthode décrite par Gruart et al.,(1992) Blood, 79,2592-2597. La préparation de l'ADNc de l'EPO humaine a été faite à partir de l'ARNm amplifié de façon sélective grâce à des sondes choisies à cette fin. La séquence de l'ADNc de l'EPO a été contrôlée par plusieurs séquençcages successifs. La présente invention a pour objet les produits d'expression obtenus à partir des différentes constructions utilisant tout ou partie de l'ADNc de l'EPO humaine, ainsi que lesdites constructions moléculaires et les cellules transformées par cesdites constructions. Plus précisémment, la séquence utilisée pour l'expression de l'EPO recombinante humaine est décrite dans la figure 1. De préférence, pour l'obtention d'une molécule entière, la cassette d'expression comprendra la séquence comprise entre les sites BamHI et HindIII. De préférence, la cassette d'expression sera celle qui est décrite dans la figure 1. Cette cassette sera introduite dans un vecteur d'expression. Ce vecteur pourra permettre l'obtention de l'EPO recombinante humaine selon l'invention, à partir de cellules eucaryotes. De préférence, le vecteur sera construit pour fonctionner dans les cellules de mammifère. Ce vecteur sera préférentiellement le vecteur pHXB65 décrit dans la figure 3. Mais encore, le vecteur pourra également être construit en vue d'obtenir une production de l'EPO recombinante dans les cellules d'insecte. De préférence, ce vecteur comportera les séquences nécessaires à l'obtention d'un virus recombinant, lequel infectera les cellules qui produiront l'EPO recombinante. Pour l'expression d'un sous-fragment de la protéine, on choisira préférentiellement d'introduire dans la cassette d'expression le fragment noté EP1 sur la figure 2 dont la séquence est comprise entre les sites BamHI et HindIII, ou bien encore la séquence notée EP2 sur la figure 2 comprise entre les sites SmaI et EcoRI. La cassette d'expression sera introduite dans un vecteur d'expression. Ce vecteur pourra être plus particulièrement adapté pour fonctionner dans des cellules de mammifère. Mais également, le vecteur peut être aussi défini pour permettre l'expression dans des cellules bactériennes. Ce vecteur peut permettre l'expression des sous-fragments de l'EPO humaine seuls, ou avantageusement, fusionnés avec une autre partie peptidique qui permet une extraction plus aisée. Pour construire un dosage immunoenzymatique de l'EPO humaine à des fins de diagnostic par exemple, il sera très avantageux d'utiliser l'EPO recombinante humaine selon l'invention. Elle pourra être introduite dans la trousse de dosage en tant que gamme d'étalonnage. Mais aussi, elle remplacera de façon très avantageuse l'EPO humaine dans le procédé de mise au point et de fabrication de ladite trousse de dosage. Les sous-fragments de l'EPO recombinantes obtenus selon la présente invention seront particulièrement indiqués pour obtenir des anticorps dirigés contre différentes parties de l'EPO humaine. L'éosinophile-peroxidase humaine recombinante peut servir dans la préparation d'une trousse de dosage des auto-anticorps circulant dans le sang humain de certains malades. Par exemple, l'EPO recombinante humaine peut être fixée sur tout type de support solide. Ce peut être une microplaque en polystyrène (plaque ELISA) comme une membrane synthétique. La fixation peut être covalente ou non covalente. Le tampon de coating est à un pH compris entre 6 et 9; il peut être avantageusement constitué de carbonate ou d'acétate d'ammonium. Le coating peut être obtenu en laissant la solution de coating contenant l'EPO selon l'invention, dont la concentration est comprise entre 0,5 et 5 gg/ml, en contact pendant une durée de 1 heure à 48 heures. La durée de coating dépendra du procédé industriel choisi pour la production des supports sensibilisés avec l'EPO. Le dosage est ensuite réalisé conformément aux techniques sérologiques par méthode immunoenzymatique en vigueur. Après une phase de saturation des sites aspécifiques, le plasma ou le serum à analyser est dilué dans un tampon contenant des protéines et un détergent. Après un temps de contact qui peut aller de 30 minutes à 4 heures, le support est lavé plusieurs fois. La présence d'autoanticorps spécifiquement dirigés contre l'EPO humaine peut alors être détectée par l'application d'une solution contenant des anticorps couplé avec un système enzymatique. On peut à ce stade de l'opération, choisir quelle classe d'immunoglobuline anti-EPO mesurer (IgG, IgA, IgM par exemple). Comme nous l'avons mentionné, l'EPO humaine peut également être utilisée comme cible médicamenteuse. En effet, l'on peut envisager de mettre au point des préparations chimiques ou biologiques qui inhibent l'activite enzymatique de l'éosinophile-peroxydase humaine afin de réduire son potentiel toxique. Pour cela, il est nécessaire de tester plusieurs milliers de composés sur ladite éosinophile-peroxidase humaine. Cette dernière n'étant pas disponible, elle pourra être avantageusement remplacée par l'éosinophile-peroxidase humaine produite selon l'invention. Le test pourra être effectué sur l'EPO recombinante humaine produite de préférence par des cellules de mammifère. On peut également orienter les efforts de recherche de nouveaux médicaments vers d'autres parties de l'éosinophile-peroxidase humaine différentes de son site actif héminique. Dans ces conditions, on pourra également utiliser l'EPO produite selon l'invention dans des cellules bactériennes. De préférence, on utilisera les fragments EP1 ou EP2 pour réaliser cette étude. Liste des Figures Figure n 1: Cassette d'expression contenant la séquence codante de l'EPO humaine comprise entre les sites BamHI et HindIII. Le codon ATG codant pour une méthionine est indiqué, ainsi que le codon stop (TGA). On remarquera l'ajout des sites de restriction BamHI et EcoRI en 5' et des sites EcoRIet HindIII en 3' de l'ADN complémentaire. Les principaux sites de restriction de l'ADNc sont mentionnés. Figure n 2: Cassette d'expression contenant la séquence EP1 et EP2. Figure n 3: Vecteur pHXB65. Figure n 4: Oligonucléotides utilisés pour la réalisation des cassettes d'expression. Figure n 5: Comportement immunologique de l'EPOrh selon la présente invention dans le titrage d'un sérum polyclonal de lapin obtenu par immunisation de l'EPO extractive. A: titrage du sérum sur une plaque sensibilisée avec de l'EPO humaine extractive; B: titrage du même sérum sur une plaque sensibilisée avec de l'EPOrh Figure n 6: Exemple d'utilisation de l'EPO recombinante humaine dans un dosage immunologique. Parallèlisme des courbes d'étalonnages faites avec l'EPO humaine extractive et l'EPO humaine recombinante selon l'invention. Liste des Abréviations: ADNc: ADN complémentaire ARMm: ARN messager bp: paire de base BSA: sérum-albumine bovine EDTA: ehtylène-diamine tetracétate ELISA: enzyme-linked immunoassay EPOrh: éosinophileperoxydase recombinante humaine IgG: immunoglobuline de classe G IgA: immunoglobuline de classe A IgM: immunoglobuline de classe M Met: méthionine PBS: Tampon phosphate de sodium TMB: tetraméthylbenzidine Exemple n 1: production par génie-génétique de l'éosinophile- peroxydase humaine 1.1 Obtention de 1'ADNc codant pour l'éosinophileperoxidase humaine 1.1.1 Culture et différenciation des cellules de sang de cordon Les cellules d'une poche de sang de cordon obtenue auprès d'une maternité ont été traitées sur un coussin de Ficoll. La phase contenant les cellules mononuclées (les progéniteurs) ont été mises en culture dans du RPMI1640 contenant du pyruvate de sodium (10mM), du sérum de veau foetal (10%), de la L-glutamine (2mM), un mélange de pénicilline/streptomycine et du 2- mercaptoéthanol (50 AM). Le milieu de culture contient également des cytokines permettant la différenciation préférentielle des cellules souches en éosinophiles, à savoir du GM-CSF, de l'Interleukine-3 et de l'Interleukine-5 à la concentration de 5.1010 mol/L. La différenciation des cellules en éosinophiles a été suivie en testant l'activité peroxydase résistante au cyanure. Le traitement au cyanure a permis d'éliminer de l'analyse les éventuelles cellules qui pourraient se différencier en neutrophiles et exprimant donc la myéloperoxydase. Au bout de 9 jours de différenciation, les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées dans un tampon PBS, culotées et congelées à -70 C jusqu'à leur utilisation pour le clonage du cDNA. 1.1.2 Matériel nécessaire à l'isolement de l'ADNc - Préparation des ARN totaux d'éosinophiles Le culot de cellules a été homogénéisé à l'ultraturax à +4 C dans 3 ml de 4M guanidium isothiocyanate, 10 mM EDTA, 2% Sarkosyl, 1% b-mercaptoéthanol, 50 mM Tris HCl pH 7,6. Après l'addition de 3 ml de phénol/chloroforme/isoamylalcool (10/10/1), la suspension a été homogénéisée puis centrifugée 15 min à 15 00Og. A partir de la phase acqueuse, les ARN totaux ont été précipités par l'addition d'un volume d'isopropanol et une centrifugation de 30 minutes à 20 000g. Le culot asséché a été repris dans de l'eau traitée au DEPC (di-éthyl-pyrocarbonate). - Synthèse du premier brin d'ADNc pg d'ARN totaux ont été utilisés pour réaliser la synthèse des premiers brins d'ADNc selon le kit SuperScript de Life Technologies. De l'oligo(dT)12-18 a été employé comme amorce de la transcriptase inverse. Les ADNc ainsi obtenus ont été utilisés comme matrice dans des réactions de PCR (Polymerase Chain Reaction) - Synthèse d'oligonucléotides Nous avons fait synthétiser quatre oligonucléotides (o265, o266, o267, o271: cf figure 4) pour permettre l'isolement dans deux plasmides de la séquence codante de l'EPO. 0265 confère des sites de restriction BamHI et EcoRI, en amont de l'ATG, o271 introduit des sites de restriction HindIII et EcoRI en aval du codon STOP. 0266 et o267 s'hybrident de part et d'autre d'un site de restriction SmaI interne aux séquences d'EPO décrites (Sakamaki et al. , (1989) J. Biol. Chem., 264,16828-16836, Ten et al, (1989) J. Exp. Med., 169,1757-1769. 0266 et o271 ont des séquences complémentaires au brin d'ADN codant. 0265 et o267 ont des séquences similaires à celle du brin d'ADN codant. 1.1.3 Amplification de la séquence de l'ADNc et sous clonage Les morceaux d'ADN délimités par les séquences complémentaires soit de o265 et o266, soit de o267 et o271, ont été amplifiés par PCR. Dans un premier temps la partie 3' de la séquence codante de l'EPO isolée dans un insert SmaI-EcoRI a été clonée dans le plasmide pUC19 (Life Technologies). Puis dans le plasmide résultant nous avons introduit un fragment BamHI-SmaI comprenant la partie 5' de la séquence codante de l'EPO pour obtenir le plasmide pUC6915. 1.1.4 Analyse de de la séquence isolée Nous avons fait séquencer l'ensemble des séquences de l'EPO introduites dans pUC19. La séquence obtenue est similaire à celle de Sakamaki et al. ((1989)J. Biol. Chem., 264, 16828- 16836). Une carte des sites de restriction communs en a été déduite (cf figure 1). 1.2 Constuction de cassettes d'expression L'expression de tout ou partie de l'EPO recombinante a été mise en évidence par la technique de DOT BLOT. 10 pl d'échantillon à analyser ont été déposés sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a ensuite été saturée en 10 mM TrisHCl pH 7, 5, 150 mM NaC1, 3 % de poudre de lait. Une dilution au 1/100 dans du tampon de saturation, d'un sérum anti EPO de lapin a alors été mise en contact avec la membrane pendant 2 heures à température ambiante. Après 3 lavages en 10 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % tween 20, nous avons incubé la membrane pendant 2 heures avec des anticorps anti lapin couplés à la phosphatase alcaline, dilués dans du tampon de saturation. Les anticorps non fixés ont été éliminés par 3 étapes de lavages. La révélation a été effectuée en présence d'un mélange volume à volume de naphtol AS-MX phosphate (1 mg/ml en eau) et de o dianisidine tetrazotized fast blue B salt (1 mg/ml en 200 mM tris HCl pH8). 1.2.1 Expression dans des cellules de mammifères (cellules ovariennes de hamster chinois:CHO) La totalité de la séquence codante de l'EPO comprise entre les sites EcoRI de pUC6915 a été sous clonée dans le site EcoRI de pHXBl. Le plasmide obtenu a été nommé pHXB65. La résistance à la néomycine (néophosphotransférase bactérienne) portée par le plasmide pHXB65 a permis, après sa transfection des CHO, la sélection de cellules recombinantes exprimant l'EPO recombinante. Le plasmide pHXB65 a été coprécipité avec du CaCl2 sur des CHO en culture. Après 24 heures, le précipité a été retiré et les cellules ont été mises en présence de milieu frais. 24 heures plus tard, l'agent de sélection (G418) a été mélangé au milieu de culture à raison de 800 pg/ml de milieu. Nous avons attendu 18 jours pour voir apparaitre les clones cellulaires. Ces clones ont été amplifiés. L'expression de l'EPO recombinante a été mise en évidence dans le surnageant de culture de plusieurs clones par son activité enzymatique (test réalisé avec la TMB 1,5 mM en présence de 2 mM peroxyde d'hydrogène dans un tampon acétate 0,1M à pH 5,0). 1.2.2 Expression dans des cellules sf9 (Spodoptera frugiperda) Par PCR nous avons remplacé les sites de restriction BamHI et EcoRI en amont des 6 nucléotides de la séquence Kozack par un site SalI. Des sous- clonages suscessifs dans différents plasmides ont apporté un site BamHI en aval du codon STOP. Le fragment d'ADN SalI-BamHI contenant la totalité de la séquence codante de l'EPO a été cloné dans les sites XhoI et BglII du plasmide pTen21 (Chaabihi et al. (1997) J. Virol. Methods, 63,1- 12 2780412 7). Le plasmide obtenu a été nommé pHXB71. Dans ce plasmide navette la séquence codante de l'EPO est placé sous le contrôle du promoteur P10 de la polyhédrine. Ce plasmide navette a été cotransfecté en présence d'ADN génomique défectif linéaire de baculovirus, dans des cellules sf9 en culture selon le protocole décrit par Summers et Smith ((1987), A manual of mehtods for Baculovirus vectors and insect culture procedures, Texas University, College Station). Après 5 jours de culture les virus ont été récoltés puis dilués pour être isolés par la technique de "plaque assay". Au bout de 6 jours de culture nous avons sélectionné des plages de cellules infectées dépourvues de polyhédrine, caractéristiques des virus recombinants. Les virus recombinants sélectionnés ont servi à l'infection de cellules sf9. Après 5 jours, l'expression de l'EPO recombinante a été mise en évidence dans les extraits cellulaires. 1.2.3 Expression dans Escherichia coli Des fragments de la séquence codante de 1'EPO ont été clonés en phase avec des séquences codant pour des peptides cibles. De par leur caractéristiques chimique, enzymatique ou conformationnelle ces peptides facilitent la purification des protéines chimères exprimées. Nous avons crée un site BamHI en amont du nucléotide 619 avec l'oligonucléotides o510. Un site HindIII a été introduit après le nucléotide 1158 à l'aide de l'oligonucléotide o512. Nous avons amplifié par PCR la séquence comprise entre les nucléotides 619 et 1158 avec les amorces o510-o512. Le fragment BamHI- HindIII appelé EP1, généré après l'action des enzymes spécifiques des sites de restriction cités, a été sous cloné dans les sites correspondants du vecteur d'expression pHX-A. Le plasmide obtenu nommé pHXA-EP1 a été introduit dans une souche d'Escherichia coli M15. L'addition d'isopropylthiogalactoside (IPTG) au milieu de culture de ces bactéries transformées a servi à induire l'expression du fragment EP1 de l'EPO. L'analyse en Dot Blot d'extraits bactériens a révélé une réponse très fortement positive (révélation avec un anticorps polyclonal de lapin anti-EPO humaine au 1/2000). Le fragment SmaI-EcoRI de 907pb (paire de bases) comprenant la partie 3' terminale de la séquence codante a été cloné dans les 13 2780412 sites de restriction correspondants du plasmide pHX-B. Le plasmide résultant nommé pHXB-EP2 a été introduit dans une souche d'escherichia coli JM109. L'expression du fragment d'EPO codé par cette séquence a été induite en présence d'IPTG. Les 3 clones recombinants analysés présentent tous une réaction positive en Dot Blot (révélation avec un anticorps polyclonal de lapin anti-EPO humaine au 1/2000). Exemple n 2: Utilisation de l'éosinophile-peroxidase recombinante humaine dans une trousse de dosage inmmnunologique 2.1 Obtention d'anticorps polyclonaux anti-EPO L'EPO recombinante purifiée à partir d'extraits de cellules d'insecte Sf9 infectées avec le virus recombinant (clone vEPO104) a été injectée à deux lapins selon un calendrier défini: (injection j0, puis rappels à j+30 et j+60). Le fragment EP1 purifié à partir d'un extrait de cellules d'E. coli transformées avec le plasmide pHXA-EP1 et le fragment EP2 provenant également de cellules d'E.coli mais transformées avec un plasmide PHXB-EP2 ont été injectés à deux lapins selon le même calendrier vaccinal que précédemment. Le développement de la réponse immunitaire a été suivi par une méthode immunochimique dite ELISA: L'EPO humaine extractive, l'EPOrh ou bien encore les fragments sont dilués dans un tampon carbonate 100 mM pH 9,7 à raison de 5 pg de protéine ou fragment par millilitre de tampon. 100 pl de cette préparation sont déposés dans les puits d'une plaque de microtitration en polystyrène et incubés une nuit à température ambiante ou 2 heures à 37 C. Les puits sont saturés avec de la BSA (20 mg/ml dansdu PBS) à raison de 250 pl/ puits pendant une heure à 37 C. Les sérums à tester sont ensuite dilués de 2 en 2 dans du PBS contenant de la BSA (1 mg/ml) et du Tween-20 (0,1 %), et déposés dans les puits de la microplaque sensibilisée avec les protéines recombinantes. Après une heure d'incubation à 37 C, la plaque est lavée 4 fois avec du PBS contenant du Tween- (0,2%). Les puits sont alors remplis avec 100 pl d' un anticorps marqué à la phosphatase alcaline dilué au 1/3000ème dans un tampon PBS contenant 1 mg/ml de BSA et 0,1% de Tween-20. Cet anticorps est dirigé contre les IgG de l'espèce animale dont on veut établir le titre d'immunisation. Par exemple, la figure montre le titre obtenu chez un lapin immunisé avec de l'EPO humaine extractive sur une plaque sensibilisée avec de l'EPO humaine extractive (A) et sur une plaque sensibilisée avec de l'EPOrh (B). On remarque que l'on obtient un résultat tout à fait similaire, indiquant des caractéristiques immunologiques similaires entre l'EPOrh et l'EPO humaine extractive. Nous avons obtenu les titres suivants avec les différents antigènes: antigène titre/antigène titre/EPO extractive. EP1 1/12400 1/6400 EP2 1/3200 1/1600 EPOrh 1/6400 1/6400 Ce dosage pourrait tout à fait être appliqué en l'état au dosage des auto-anticorps humains, en remplaçant par exemple l'anticorps de révélation anti-IgG de lapin marqué à la phosphatase alcaline par un anticorps anti-IgG humain également marqué à la phosphatase alcaline. 2.2 Obtention d'anticorps monoclonaux L'EPOrh selon l'invention est injectée à raison de 10 pg/ souris, selon un calendrier étalé sur 12 semaines. La première injection est réalisée en présence d'adjuvant complet de Freund. Un premier rappel est réalisé au bout de trois semaines en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le développement de la réponse immunitaire est suivie en ELISA comme décrite au paragraphe 2.1. Ici l'anticorps secondaire utilisé est un anticorps anti IgG de souris marqué à la phosphatase alcaline. Cinq souris sur les sept immunisées ont donnée une réponse immune significative: animal titre souris PO78-1 1/16000 souris PO78-2 1/4500 souris PO78-3 1/10000 souris PO78-4 1/21000 souris PO78-5 1/2400 2780412 La souris PO78-4 ayant le titre le plus élevé a été choisie pour réaliser la première fusion. 24 heures avant la fusion, un rappel intra-veineux est fait avec 20 pg d'EPOrh diluée dans du sérum physiologique. Au jour de la fusion, l'animal est sacrifié et sa rate prélevée. Cette dernière est transvasée dans un potter avec 5 ml de milieu RPMI1640 et doucement broyée plusieurs fois, jusqu'à dispersion des splénocytes. Les cellules sont lavées et numérées puis mises en contact avec des cellules de myélome murin (X63.653) à raison d'une cellule de myélome pour 4 splénocytes. Dans cette fusion, nous avons obtenu 1,2.10 splénocytes que nous avons mélangé avec 3.10 cellules de myélome. Le mélange cellulaire est culoté par centrifugation et mis en contact avec 400 pl d'une solution de PEG-1000 (la reprise du culot se fait en trente secondes). Après une incubation de 3 minutes, 1 ml de milieu RPMI1640 est introduit dans la suspension cellulaire goutte à goutte à raison de 50 ul toutes les 15 secondes. On complète avec 9 ml de milieu RPMI1640 contenant 15% de SVF et les éléments de -5 -5 sélection (5.10 M hypoxanthine et 10 M azasérine). Après deux heures d'incubation dans une boîte de 75 cm2 (37 C en étuve à 5% C02), les cellules sont diluées dans un mélange de milieu sélectif et non sélectif (200 ml de milieu sélectif + 100 ml de milieu normal). Les cellules sont réparties dans des puits de 1 ml et mises en culture à 37 C dans une étuve régulée à 5% C02. Au bout de dix jours, tous les puits sont inspectés au microscope inversé. Les puits contenant des cellules vivantes sont testés en ELISA pour la présence d'anticorps anti-EPO. Le test utilisé est le même que celui servant à la détermination du titre d'immunisation des souris. Chaque puits positif est mis en clonage (dilution limite). De cette première fusion, et après trois clonages successifs, trois clones (1.1.1, 2.2.10, 13.3.3) ont été isolés. 2.3 Production d'anticorps monoclonaux 2.3.1 Production du liquide d'ascite jours avant le début de l'expérience, 15 souris femelles sont sensibilisées par injection de Pristane (0,5 ml par animal) par voie intra-péritonéale. Chaque souris reçoit ensuite 5.106 hybridomes. Le poids de l'animal est suivi tous les deux jours. 16 2780412 Environ 10 à 15 jours après, les animaux développent une tumeur liquide avec un liquide d'ascite abondant dans la cavité péritonéale. Après sacrifice, les animaux sont ponctionnés. Le liquide d'ascite ainsi récolté servira à la production d'anticorps monoclonaux. 2.3.2 Purification des anticorps monoclonaux Le liquide d'ascite est dilué au 1/2 avec une solution de sulfate d'ammonium saturé, puis mis à incuber 1 heure à +4 C. Le précipité est ensuite repris dans du PBS et dessalé sur une colonne de type PD10 (Pharmacia). La purification est terminée par une chromatographie d'affinité sur Protéine-A. Les anticorps purifiés sont stockés à -70 C, à la concentration de 10 mg/ml dans du PBS. 2.4 Mise au point d'un dosage ELISA pour mesurer 1'EPO L'anticorps monoclonal 13.3.3 purifié est coaté sur une plaque de microtitration en polystyrène à raison de 100 pl par puits (dans tampon carbonate 100 mM pH 9,4 - 5 ig d'anticorps par ml), un nuit à température ambiante. La plaque est ensuite saturée avec 250 pl de gélatine 0,5% dissoute dans du PBS (1 heure à température ambiante). Les échantillons à tester sont incubés 1H30 à 37 C. 4 lavages (PBS-0,2% tween-20) sont effectués. 100 pl de sérum de lapin immunisé avec le fragment EP1 de l'EPO dilué au 1/3000ème dans du tampon PBS contenant 1 mg/ml de BSA et 0,2% de tween- 20 sont distribués dans chaque puits. Après une incubation de 1H30 à 37 C la plaque est à nouveau lavée 5 fois. Chaque puits reçoit enfin 100 pl de sérum anti IgG de lapin (dilué au 1/5000ème dans le même tampon de dilution que pour le polyclonal). Après une incubation de 1 heure à 37 C, la plaque est lavée puis mise en révélation avec 100 pl par puits d'une solution de pNPP (lmg/ml dans du tampon diéthanolamine 1M pH 9,8). La lecture est réalisée à 405 nm après arrêt de la réaction colorimétrique avec 50 pl de NaOH 3 M. La figure 6 montre la courbe d'étalonnage réalisée avec l'EPO recombinante humaine en comparaison avec l'EPO humaine extractive. Le parallélisme entre la courbe d'étalonnage réalisée avec l'EPO humaine extractive et l'EPO recombinante humaine montre que l'EPO selon l'invention est particulièrement adaptée pour l'étalonnage d'une trousse de dosage immuno-enzymatique. il 2780412 Revendications 1- EPO recombinante humaine (EPOrh) produite par génie-génétique. 2Sous-fragments de l'EPO humaine recombinante produits par génie-génétiques. 3- Cassette d'expression contenant la séquence comprise en les sites de restrictions BamHI-HindIII ou BamHI- EcoRI tels que décrits dans les figures 1 et 2. 4- vecteur d'expression eucaryote comportant une cassette d'expression selon la revendication 3. - Plasmide d'expression selon la revendication 4 consistant en le plasmide pHXB2. 6- Cellules de mammifères transformées avec un plasmide d'expression selon les revendications 4 et 5. 7- EPOrh et ses sous-fragments produits selon un procédé utilisant des cellules génétiquement modifiées selon la revendication 6. 8- Vecteur d'expression selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il fonctionne préférentiellement dans les cellules d'insecte. 9- vecteur d'expression selon la revendication 8 consistant dans le plasmide pHXB985. - Virus recombinants obtenus à partir d'un vecteur d'expression selon la revendication 8 et 9. 11- EPO RH ET ses sous fragments F1 et F2 obtenus à partir de cellules d'insectes infectées avec un virus selon la revendication 10. 12- cassette d'expression contenant les séquences nécessaires à l'expression des sous-fragments 111-222 et 333-444 dans les bactéries. 13- vecteur d'expression contenant les cassettes selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il est adapté à l'expression dans E. coli. 14 vecteur d'expression selon la reventication 13 consistant en le plasmide pHXB974. - Sous-fragments de l'EPO recombinante humaine obtenus à partir d'une culture de bactéries E. coli transformées avec un plasmide selon les revendications 13 et 14. 16- Obtention d'anticorps polyclonaux et monoclonaux à partir d'EPO recombinante humaine. 17- Trousse de dosage immunologique construite et produite à partir de l'EPOrh ou des sous-fragments EP1 et EP2. 18- Trousse de dosage immunologique permettant la détection des autoanticorps dirigés contre l'EPO humaine construite et produite à partir de l'EPOrh.