Brevet FR2775435A1 — publié le 19990903

NANOPARTICULES COMPRENANT AU MOINS UN POLYMERE ET AU MOINS UN COMPOSÉ APTE À COMPLEXER UN OU PLUSIEURS PRINCIPES ACTIFS. L'invention concerne la délivrance de principes actifs utilisés notamment dans le domaine des médicaments à visée préventive, curative ou diagnostique et également l'amélioration de leur index thérapeutique (amélioration du rapport bénéfices/risques). Elle a plus particulièrement pour objet de nouvelles nanoparticules renfermant au moins un principe actif. La mise au point de nouveaux systèmes de délivrance ou libération de principes actifs a pour objectif premier la délivrance contrôlée d'un agent actif, notamment pharmacologique, à son site d'action à une vitesse et à une posologie thérapeutiquement optimales (1). L'amélioration de l'index thérapeutique peut être obtenue par modulation de la distribution du principe actif dans l'organisme. L'association du principe actif au système de délivrance permet notamment sa délivrance spécifiquement au site d'action ou sa libération contrôlée après le ciblage du site d'action. La réduction de la quantité de principe actif dans les compartiments o sa présence n'est pas souhaitable permet d'accroître l'efficacité dudit principe actif, de réduire ses effets secondaires toxiques, voire même de modifier ou de restaurer son activité. Les systèmes colloïdaux de délivrance de principes actifs comprennent les liposomes, les microémulsions, les nanocapsules, les nanosphères, les microparticules et les nanoparticules. Les nanoparticules présentent des avantages de ciblage, de modulation de distribution et de souplesse de formulation et ont une structure polymère qui peut être conçue et réalisée de façon adaptée au but poursuivi. Elles se sont révélées tout particulièrement prometteuses pour obtenir un meilleur index thérapeutique au sens défini ci-dessus, en raison de leur aptitude à assurer une libération contrôlée, une délivrance spécifique au site d'action ou délivrance ciblée, permettant à la fois une augmentation de l'efficacité et une réduction des effets secondaires toxiques au niveau des autres organes. Ce type d'administration nécessite l'emploi de polymères biodégradables. Parmi ceux-ci, les poly(cyanoacrylates d'alkyle) sont particulièrement intéressants car leur bioérosion est observée rapidement par rapport à d'autres polymères biodégradables et se déroule pendant des durées compatibles avec les applications thérapeutiques ou diagnostiques. Malgré ces caractéristiques intéressantes, la capacité de charge en principes actifs des nanoparticules de poly(cyanoacrylates d'alkyle), exprimée en tant que quantité de principe actif associée à une unité de masse de polymère, est souvent limitée, notamment lorsque le principe actif est très faiblement soluble dans l'eau car la fabrication des nanoparticules utilise des techniques de polymérisation en milieu aqueux. Cette limitation importante de la charge en principe actif s'observe en particulier avec les principes actifs hydrophobes, amphiphiles et/ou insolubles. L'aptitude relativement faible des nanoparticules conventionelles à transporter une quantité adéquate de principes actifs du site d'administration au site cible dans l'organisme risque souvent de conduire à la nécessité d'administrer des quantités considérables de polymères. Les poly(cyanoacrylates d'alkyle) sont utilisés pour produire des nanoparticules en tant que vecteurs de principes actifs (3). Toutefois, pour les raisons évoquées ci-dessus, les faibles charges obtenues, notamment avec les principes actifs hydrophobes, amphiphiles et/ou insolubles dans l'eau en limitent l'usage thérapeutique. On a maintenant trouvé de façon surprenante qu'il était possible d'élargir le domaine d'utilisation des polymères, en particulier des poly(cyanoacrylates d'alkyle), en leur associant un ou plusieurs composés aptes à complexer des principes actifs et ainsi obtenir de nouvelles nanoparticules possédant des propriétés originales. L'invention a donc pour objet des nanoparticules contenant au moins un principe actif, caractérisées en ce qu'elles comprennent l'association d'au moins un polymère, de préférence un poly(cyanoacrylate d'alkyle) dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 12 atomes de carbone, et d'au moins un composé apte à complexer ledit principe actif. Le composé apte à complexer le principe actif est de préférence choisi parmi les oligosaccharides cycliques, notamment parmi les cyclodextrines qui peuvent être neutres ou chargées, natives (cyclodextrines X, a, y, ú), branchées ou polymérisées ou encore modifiées chimiquement par exemple par substitution d'un ou plusieurs hydroxypropyles par des groupements tels que alkyles, aryles, arylalkyles, glycosidiques, ou par etherification, estérification avec des alcools ou des acides aliphatiques. Parmi les groupements ci-dessus, on préfère plus particulièrement ceux choisis parmi les groupements hydroxypropyle, méthyle, sulfobutylether. De façon inattendue, la présence d'un composé apte à complexer le principe actif dans l'association selon l'invention permet au principe actif, même s'il est hydrophobe, amphiphile et/ou insoluble, de pénétrer à l'intérieur de la structure polymérique résultant de l'association du ou des polymères et du ou desdits composés aptes à complexer le principe actif, et ceci avec un rendement d'encapsulation dans cette structure significativement accru par rapport à l'art antérieur, rendement qui semble lié à l'équilibre entre d'une part, la solubilisation résultant de l'utilisation de composés aptes à complexer le principe actif et, d'autre part, l'affinité du principe actif pour la nouvelle structure polymérique, ce qui constitue un progrès important sur les plans thérapeutique et industriel. Par ailleurs, les nanoparticules stabilisent également le complexe formé entre le(s)dit(s) composé(s) et le(s)dit(s) polymère(s) en raison de la nature solide des nanoparticules. Grâce à l'invention, il est maintenant possible de charger des nanoparticules par exemple de type poly(cyanoacrylate d'alkyle) non seulement avec les principes actifs hydrophiles mais également les principes actifs hydrophobes, amphiphiles et/ou insolubles. L'association d'un polymère et d'un composé apte à complexer le principe actif permet la création de nouveaux sites de fixation pour le principe actif qui n'apparaissent pas avec les polymères utilisés seuls. L'apparition de ces sites nouveaux, et en particulier celle d'une cavité hydrophobe avec les composés aptes à complexer les principes actifs, permet d'augmenter la charge en principe actif tout en maintenant la capacité de libération contrôlée et retardée de celui-ci qui est inexistante lorsqu'on utilise seuls les composés aptes à complexer. A titre de principes actifs susceptibles d'entrer dans la composition des nanoparticles de l'invention, on peut citer les anticancéreux, les antisens, les antiviraux, les antibiotiques, les protéines, polypeptides, polynucléotides, nucléotides antisens, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs, les stéroïdes, les analgésiques, les antimorphiniques, les antifongiques et antiparasitaires. Parmi ceux-ci, l'invention envisage tout particulièrement le taxol ou l'un de ses dérivés, la doxorubicine ou l'un de ses dérivés, les dérivés du platine. Le principe actif est en général présent en une quantité de 0,01 à 300 mg/g de nanoparticules. La proportion de composé apte à complexer le principe actif est en général de 0,1 à 70 % en poids. La proportion de principe actif et celle du composé apte à complexer sont indépendantes l'une de 1' autre. L'invention concerne aussi bien entendu les compositions pharmaceutique ou de diagnostic comprenant les nanoparticules de l'invention et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des nanoparticules à base d'un polymère et plus particulièrement de poly(cyanoacrylate d'alkyle) définies précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) préparer un complexe d'au moins un principe actif avec au moins un composé apte à le complexer, en solution dans un solvant aqueux ou non aqueux, b) ajouter progressivement au moins un monomère du polymère, et plus particulièrement le cyanoacrylate d'alkyle monomère dans la solution obtenue à l'étape (a), et c) effectuer une polymérisation de préférence anionique mais également inductible par d'autres agents notamment photochimiques de ce monomère, éventuellement en présence d'un ou plusieurs agents tensio-actif et/ou stabilisant. Aux étapes (a) et (b) du procédé de l'invention, le solvant est avantageusement choisi de façon à ce que, tout en maintenant des conditions favorables à la polymérisation des polymères et plus particulièrement des poly(cyanoacrylate d'alkyle), la solubilité du principe actif et du composé apte à le complexer soit maximale dans le milieu défini par ce solvant. Avantageusement un tel solvant est choisi de préférence parmi les solvants aqueux ou hydroalcooliques. La présence d'un agent tensio-actif ou d'un agent stabilisant est nécessaire pour préparer les nanoparticules de l'art antérieur. Comme le montrent les exemples qui suivent, de tels agents ne sont plus nécessaires dans le cadre de la présente invention. En effet, le composé apte à complexer le principe actif, comme les cyclodextrines, ont paradoxalement un effet stabilisant suffisant pour que l'agent tensio-actif habituellement utilisé soit absent. Ceci représente, sur le plan industriel, une économie notable. De même, on observe que le poly(cyanoacrylate d'alkyle) stabilise le complexe formé du principe actif et du composé apte à complexer le principe actif. Cependant, si le procédé de l'invention comprend l'utilisation d'un agent stabilisant et/ou tensio-actif on préfère un dextran, ou un poloxamer. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les potentialités des cyclodextrines vis-à- vis des principes actifs permettent d'adjoindre de nouvelles propriétés aux particules. En effet, la présence des cyclodextrines dans les particules permet de stabiliser les principes actifs qui seraient instables en solution ou encore de masquer certaines caractéristiques défarobles des principes actifs telle qu'une action irritante. Les procédés de fabrication des nanoparticules connus jusqu'à ce jour présentent des lacunes en ce qui concerne les possibilités d'ajustement de la taille des nanoparticules. Le procédé de l'invention permet de façon inattendue et remarquable d'ajuster la taille des nanoparticules directement au cours de leur fabrication sans aucune étape particulière supplémentaire. Comme le montrent les exemples qui suivent, la taille des nanoparticules selon l'invention est essentiellement fonction de la concentration en composé apte à complexer le principe actif. Dans le cas des cyclodextrines, on peut ainsi faire varier cette taille dans une gamme très large de 300 à moins de 50 nm. L'invention permet donc, à l'aide d'essais préliminaires simples, d'ajuster la taille des nanoparticules dans les compositions, notamment pharmaceutiques, de l'invention en fonction de l'effet particulier recherché. Le choix de la taille a priori permet, si on le souhaite, de s'affranchir de certaines barrières physiques s'opposant à la distribution des nanoparticules l'organisme ou d'éviter une capture des nanoparticules de la composition par le N système réticulo-endothélial. Il permet aussi un nouveau ciblage d'organes. En conséquence à l'étape (a) du procédé de l'invention la proportion de composé apte à complexer le principe actif est en général de 0,1 à 70 % en poids par rapport audit principe actif. En effet, comme indiqué précédemment, le choix de la concentration du composé apte à complexer le principe actif permet de faire varier la taille des nanoparticules obtenues par le procédé de l'invention. On obtient ainsi des nanoparticules de taille comprise entre 40 et 300 nm. Les études relatives à la libération du composé apte à complexer le principe actif, d'une part et du principe actif, d'autre part, montrent que le profil de libération du composé apte à complexer le principe actif est très rapide et que la libération est proche de 100%, tandis que la libération du principe actif comprend une première phase rapide, suivie d'une deuxième phase plus lente due à la bioérosion, classiquement décrite pour les poly(cyanoacrylates). L'utilisation, dans les essais de libération du principe actif, d'estérases qui dégradent les nanoparticules, montre que le principe actif est contenu en grande partie au sein du réseau matriciel nanoparticulaire, ce qui est important du point de vue de l'activité attendue (4). Les différents essais effectués sur une gamme de stéroïdes, du plus hydrophile (hydrocortisone) au plus hydrophobe (progestérone) ont montré que des principes actifs très variés peuvent être contenus dans les nanoparticules selon l'invention à des concentrations élevées, dépendantes de leurs caractéristiques physico- chimiques telles que notamment leur degré d'hydrophobicité. Ainsi, la progestérone utilisée comme modèle dans les exemples qui suivent a une solubilité dans l'eau très faible (0,01 mg/ml) qui, dans les processus classiques de polymérisation en émulsion dans l'eau, ne permet d'obtenir qu'une charge très faible en principe actif, dépourvue d'intérêt pratique. Ainsi, cette charge est faible lorsqu'on utilise les techniques de préparation de l'art antérieur. De façon particulièrement surprenante et intéressante, cette charge est de plus de 50 fois supérieure dans les nanoparticules selon l'invention. L'invention permet donc d'accéder à des principes actifs hydrophobes, amphiphiles et/ou insolubles et donc un renouveau de leur index thérapeutique. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation du procédé décrit ci-dessus pour fabriquer un médicament à effet ciblé et à index thérapeutique amélioré. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de la description des exemples qui suivent faisant références aux dessins annexés dans lesquels: La Figure 1 représente les variations de la taille des particules ou granulométrie et du potentiel zéta (moyenne de trois essais SEM) de nanoparticules de poly(cyanoacrylate d'isobutyle) (PIBCA) préparées en présence de 2-hydroxypropyl-p-cyclodextrine (HPCD), en fonction de la concentration initiale en HPgCD. La Figure 2 représente les variations de la granulométrie et du potentiel zéta (moyenne de trois essais SEM) de nanoparticules de PIBCA préparées en présence du complexe progestérone: 2-hydroxypropyl-0- cyclodextrine (HPICD), en fonction de la concentration initiale en HP5CD. La Figure 3 représente les variations de la teneur en HPPCD (moyenne de trois essais SEM) de nanoparticules de PIBCA préparées en présence de HPPCD, en fonction de la concentration initiale en HPCD. La Figure 4 représente les variations de la teneur en HPPCD (moyenne de trois essais SEM) de nanoparticules de PIBCA préparées en présence du complexe progestérone: HPPCD, en fonction de la concentration initiale en HPPCD. La Figure 5 représente les variations de la teneur en progestérone (moyenne de trois essais SEM) de nanoparticules de PIBCA/HPCD, en fonction de la concentration initiale en HP5CD. La Figure 6 montre l'influence de la taille des particules sur la vitesse de libération de la progestérone dans du tampon au borate alcalin (ABB) (pH 8,4), à partir de nanoparticules de PIBCA/HPPCD. La Figure 7 montre l'influence de la constitution du milieu de libération sur la vitesse de libération de la progestérone dans du milieu ABB (pH 8,4), à partir de nanoparticules de PIBCA/HP3CD. A: ABB:PEG 400 (80:20) B: ABB:PEG 400 (60:40) La Figure 8 montre l'influence de la présence d'enzymes de type estérase sur la vitesse de libération de la progestérone dans du milieu ABB (pH 8, 4), à partir de nanoparticules de PIBCA/HPCD. A: milieu de libération avec de l'estérase UI B: milieu de libération avec de l'estérase UI La Figure 9 montre la vitesse de libération de la HPgCD dans du milieu ABB à 37 C. La Figure 10 montre les courbes de calorimétrie par analyse différentielle (DSC) obtenues à une vitesse d'accroissement de la température de 10 C/min. ll Dans les exemples qui suivent, le cyanoacrylate d'isobutyle, l'hydrocortisone, la prednisolone et le danazol la progestérone et les estérases (19 UI/ml) ont été obtenus auprès de Sigma Chemicals (St. Louis, Mo, EUA), la spironolactone, la testostérone, l'acétate de mégestrol ont été obtenue respectivement auprès de Sophartex, Besin-Iscovesco et Upjohn, les a-, p- et 7-cyclodextrines, les 2- hydroxypropyl-a-, 2-hydroxypropyl-i- et 2-hydroxypropyl-y- cyclodextrines, dont les valeurs de MS moyennes sont respectivement de 0,9, 0,6 et 0,6, ont été obtenues auprès de Wacker Chemie GmbH (Munich, Allemagne) et l'éther de sulfobutyle et de - cyclodextrine (ci-après SBEPCD) a été obtenu auprès de CyDex L. C. (Overland Park, Kansas, EUA). Le poloxamer 188 (Lutrol F68 ) est un don de BASF (Ludwigshafen, Allemagne). Les autres produits chimiques et les solvants sont de qualité analytique et HPLC. EXEMPLE 1: Préparation de nanoparticules en présence de différentes cyclodextrines et de poloxamer. Les nanoparticules sont préparées par polymérisation anionique (2) de 100 1l de cyanoacrylate d'isobutyle dans 10 ml d'acide chlohydrique 0,01 M (pH 2,0) contenant 1% p/v de poloxamer 188 et en présence de 5 mg/ml de a-, p-, y-, 2-hydroxypropyl-a-, 2-hydroxypropyl- - ou 2-hydroxypropyl-y-cyclodextrine ou de sulfobutyle éther de Pcyclodextrine. La solution de cyclodextrine est agitée au moyen d'un agitateur magnétique (1000 tr/min) à la température ambiante et le monomère est ajouté goutte à goutte. Après agitation pendant 6 heures, la suspension est filtrée au moyen d'un préfiltre de 2,0 gm (Millex AP 500 ) puis encore caractérisée. EXEMPLE 2: Prénparation de nanoparticules en présence de différentes cyclodextrines. Les nanoparticules sont préparées par polymérisation anionique (2) de 100 g1 de cyanoacrylate d'isobutyle dans 10 ml d'acide chlorhydrique 0,01 M (pH 2,0) et en présence de 5 mg/ml de a-, È-, y-, 2- hydroxypropyl-X-, 2-hydroxypropyl-f- ou 2-hydroxypropyl-y- cyclodextrine ou de sulfobutyle éther de 0-cyclodextrine. La solution de cyclodextrine est agitée au moyen d'un agitateur magnétique (1000 tr/min) à la température ambiante et le monomère est ajouté goutte à goutte. Après agitation pendant 6 heures, la suspension est filtrée au moyen d'un préfiltre de 2,0 xm (Millex AP 500 ) puis encore caractérisée. EXEMPLE 3: Préparation de complexes Droaestérone / hydroxvpropvl-5-cyclodextrines (HPPCD). Les complexes progestérone/HPPCD sont préparés en mélangeant 3,615 g de HPPCD avec 3,0 g de progestérone dans 150 ml d'eau sous agitation au moyen d'un agitateur magnétique pendant 24 heures à la température ambiante. Après cela, le mélange est filtré (0,45 gm). La HPPCD et la progestérone sont dosées dans la solution filtrée avant d'être utilisées pour la préparation de nanoparticules chargées de progestérone. EXEMPLE 4: Préparation de nanoparticules de Polv(cyanoacrvlate d'isobutyle)/HPPCD (PIBCA/ HPLCD) charaées de proaestérone. La solution du complexe progestérone/HP5CD obtenu comme décrit dans l'exemple 3 est diluée pour obtenir des concentrations de 2,5, 5,0 7,5, 10,0, 12,5, ,0 et 20,0 mg/ml de HPPCD dans le milieu de polymérisation. Les nanoparticules sont préparées comme dans l'exemple 1, en absence ou en présence de 1% (p/v) de poloxamer 188. EXEMPLE 5 (témoin): Préparation de nanoparticules de poly(cvanoacrylate d'isobutvle) chargées de progestérone et dépourvues de HP5CD. Des nanoparticules de poly(cyanoacrylate d'isobutyle) sont préparées en l'absence de cyclodextrine dans le milieu de polymérisation, pour servir de témoin. Les nanoparticules chargées de progestérone sont préparées en dissolvant le principe actif dans de l'acide chlorhydrique dilué (pH 2,0) en présence de 1% (p/v) de poloxamer 188 (environ 60 pg/ml, correspondant à la solubilité maximale dans ce milieu). Le processus de polymérisation est mis en oeuvre comme décrit à l'exemple 1. EXEMPLE 6: Dosaae de la progestérone et de la HP5CD dans les nanoparticules obtenues. Les différentes suspensions de nanoparticules sont centrifugées à 82 000 g pendant 30 à 40 min à 25 C (Beckman, L5-65 Ultracentrifuge, rotor de type 70,1 Ti) et remises en suspension dans 5 ml d'eau distillée. Les suspensions sont finalement lyophilisées (Christ HED Freeze Drier, Allemagne). Pour doser la charge de progestérone dans les nanoparticules, les produits lyophilisés sont dilués dans de l'acétonitrile de qualité HPLC et les solutions sont analysées par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Le système de HPLC consiste en une unité de délivrance de solvant 510 de Waters (Saint-Quentin-en- Yvelines, France), un préleveur automatique d'échantillons WISP 712, une colonne (250 x 4,6 mm) Nova-Pak C18 4 lm, un détecteur d'absorbance 486 qui fonctionne à 245 nm et est en interface avec un module de données 746. Le débit est de 1,0 ml/min et la phase mobile est constituée d'eau et d'acétonitrile (40:60) o la durée de rétention est d'environ 12 min. Les résultats sont exprimés en tant que moyenne de trois dosages. Pour quantifier la HP5CD, les nanoparticules lyophilisées sont hydrolysées au moyen de NaOH 0,2 M pendant 12 heures, le pH est ajusté à 7,0 ( 0,5) et la HPPCD est quantifiée par dosage spectrophotométrique de la décoloration de solutions de phénolphtaléïne en présence de HPICD. En effet, la phénolphtaléïne forme des complexes d'inclusion stables et incolores avec les cyclodextrines (CD) (5). Par conséquent, l'intensité de la couleur d'une solution de phénolphtaléïne dans du tampon au borate alcalin décroît proportionnellement à la quantité de CD en solution. Des solutions de référence sont préparées en diluant des solutions-mères de CD dans de la solution tampon de borate alcalin à pH 10,0 contenant 2% d'une solution éthanolique de phénolphtaléïne 0,006 M. Les courbes de référence (X = 550 nm) sont linéaires pour les concentrations en CD allant de 1 à 100 gg/ml. Les échantillons sont additionnés de 4 parties de solution tampon contenant de la phénolphtaléïne et testées directement. EXEMPLE 7: Caractérisation des nanoparticules. La distribution granulométrique, la taille moyenne et la polydispersité des nanoparticules sont estimées par diffusion de la lumière laser en utilisant un NS Coulter Nanosizer (Coultronics, Margency, France). Les échantillons sont dispersés dans de l'eau MilliQ (résistivité > 18 Mi, Millipore, Saint-Quentin-en- Yvelines, France). Chaque analyse dure 200 s. La température est de 20 C et l'angle d'analyse est de 90 . Le potentiel zéta des particules en suspension dans l'eau MilliQ est déterminé par vélocimétrie Doppler au laser (Zetasizer 4, Malvern, Angleterre). RÉSULTATS DES EXEMPLES 1 A 7. Les caractéristiques des particules préparées en présence de 5 mg/ml de différentes cyclodextrines et 1% de poloxamer 188 (moyenne de 3 préparations répétées + SEM) sont rassemblés dans le tableau I ci-dessous. Tableau I CD Taille (nm) Potentiel % (mV) Teneur en CD (5 mg/ml) + S.D. S.D. (gg de CD/mg de nanoparticules) alpha 228 69 -34,4 4,0 ND béta 369 + 7 -24,7 8,2 360 gamma 286 9 -22,9 0,6 240 HPalpha 244 + 25 -27,0 2,2 ND HPbéta 103 6 -8,6 + 0,9 247 HPgamma 87 3 -2,6 2,2 220 SBEbéta 319 10 -45,4 2,4 ND CD = cyclodextrine HP = hydroxypropyl SBE = éther de sulfobutyle La taille des particules, le potentiel zéta, la teneur en cyclodextrine et la stabilité (valeurs non représentées) sont influencés par la nature de la cyclodextrine. La quantité des différentes cyclodextrines liées aux particules est dans la gamme de 20 à 35% (p/p) du poids total des particules. Les nanoparticules formulées avec la HP5CD sont les plus intéressantes car elles présentent une granulométrie moyenne inférieure à 100 nm et un potentiel zéta voisin de zéro mV. En outre, l'HP3CD présente une très grande solubilité dans le milieu de polymérisation et une excellente tolérabilité. Elle permet par ailleurs l'encapsulation de nombreuses substances. Par conséquent, les études complémentaires ont été effectuées avec la HP5CD. En présence de HP5CD dans le milieu de polymérisation, l'addition de l'agent tensio-actif poloxamer 188 n'est pas essentielle pour la production de nanoparticules. D'une part, comme le montre la Figure 1, la taille et le potentiel zéta des particules ne sont pas modifiés par la présence de poloxamer 188. D'autre part, la concentration de HPICD influence considérablement la taille et le potentiel zéta. Une augmentation de la concentration de HPICD de 0 à 12,5 mg/ml conduit à une diminution de la taille des particules de 300 nm à moins de 50 nm. De même, le potentiel zéta des particules décroît progressivement de valeurs fortement négatives (-40 mV) à un potentiel de surface proche de 0 mV. Ces tendances sont généralement maintenues lorsque les nanoparticules sont préparées en présence de progestérone, comme le montre la Figure 2. Par rapport aux particules dépourvues de progestérone, le potentiel zéta est légèrement négatif dans la gamme de concentration de HPCD à l'étude. De plus, en l'absence de poloxamer 188, on observe une augmentation rapide de la taille des nanoparticules jusqu'à 450 nm, suivie d'une diminution rapide lorsque la concentration de HPPCD est supérieure à mg/ml. Ce phénomène est supprimé en présence de poloxamer 188. L'addition de HPfCD dans le milieu de polymérisation conduit à l'association de grandes quantités de HPPCD aux nanoparticules, comme le montre la Figure 3. La quantité de HPPCD associée aux particules augmente continuellement et peut atteindre 60% du poids des particules. Lorsque les masses initiales de HPPCD et de cyanoacrylate d'isobutyle dans le milieu de polymérisation sont égales, la quantité de HPPCD associée aux particules est d'environ 35%. De plus, l'association de HPICD aux particules n'est pas influencée par la présence de poloxamer 188. La teneur en HPPCD des nanoparticules n'est pas considérablement affectée par la présence de progestérone dans le milieu de polymérisation, comme le montre la Figure 4. La charge de progestérone des particules augmente de façon spectaculaire lorsque les particules sont préparées en présence de HPICD. La charge de progestérone, en l'absence de HPICD est de 0,79 gg/mg de particules et elle augmente progressivement jusqu'à être multipliée par 50, ce qui correspond à 45 gg/mg de particules, comme le montre la Figure 5. Il n'y a pas de différences significatives entre les particules préparées avec ou sans poloxamer 188. Les caractéristiques des nanoparticules utilisées dans les exemples 8 à 10 qui suivent sont décrites dans le tableau II ci-dessous. Tableau II ta Taille Teneur en Teneur en Formulationa SD HPPCDb principe actifc 2,5 158 22 64 5,4 10,9 3,3 ,0 70 5 240 7,6 23,9 4,4 a = concentration initiale en HPCD dans le milieu de polymérisation (mg/ml) b = jg de HPCD par mg de nanoparticules c = gg de progestérone par mg de nanoparticules EXEMPLE 8: Libération de la progestérone in vitro à partir de nanoparticules de PIBCA/HPKCD. Une quantité pesée de nanoparticules lyophilisées (contenant 1% (p/v) de glucose)est mise dans un flacon contenant 15 ml d'une solution tampon au borate alcalin (ABB) (pH 8,4) ou d'ABB contenant des estérases IN (25 et 100 UI) ou d'ABB/poly(éthylèneglycol) 400 (PEG) à et 40% (v/v). Les échantillons sont agités au moyen d'un agitateur magnétique à 200 tr/min et 37 C, et prélevés à des intervalles prédéterminés. Les suspensions sont centrifugées à 82 000 g pendant 30 minutes à 20 C puis la teneur en progestérone du surnageant est dosée pour tous les milieux et la teneur en HP5CD pour les milieux au PEG. La teneur en progestérone est dosée par HPLC comme décrit plus haut, avec injection de 100 1l pour les échantillons incubés dans des milieux à l'ABB et 20 gil pour les milieux au PEG. Tous les essais sont réalisés dans des conditions telles que la concentration en principe actif dans la phase de libération soit maintenue au-dessous de 10% de saturation. EXEMPLE9: Libération de la HP5CD in vitro à partir de nanoparticules de PIBCA/HPPCD. L'étude de la libération de la HPICD est effectuée comme celle de la progestérone dans du milieu ABB avec quantification de la teneur en CD après ultracentrifugation, par complexation avec de la phénolphtaléine comme décrit plus haut. La concentration de CD à 100% de libération est d'environ 100 gg/ml. EXEMPLE 10: Calorimétrie par analyse différentielle (DSC). Les études de DSC sont effectuées en utilisant un calorimètre d'analyse différentielle Perkin Elmer DSC- 7. La température est calibrée en utilisant le point de transition de fusion de l'indium. Des échantillons pesant environ 4 mg sont placés dans des capsules d'aluminium et chauffés de 0 à 250 C à une vitesse d'exploration de C/min. RESULTATS DES EXEMPLES 8 À 10. La Figure 6 des dessins annexés représente le profil de libération de la progestérone à partir de nanoparticules combinées de PIBCA/HPPCD dans l'ABB (pH 8,4). Sur ce graphique on peut observer une courbe de libération biphasique avec une libération initiale rapide (effet d'éclatement) dans la première heure pour les deux formulations testées (environ 10 et 34% des nanoparticules de 150 et 70 nm, respectivement). Cette libération rapide pourrait être attribuée à la fraction de progestérone qui est adsorbée ou faiblement liée à la grande surface générée par la formation de nanoparticules plutôt qu'au complexe progestérone/CD incorporé dans le réseau polymère. La seconde phase correspond à une libération exponentielle plus lente avec environ 35 et 62% de progestérone libérée à partir de nanoparticules de 150 et nm, respectivement. La phase de libération ralentie peut être le résultat d'une simple diffusion vers l'extérieur de la progestérone à partir des nanoparticules ou de la pénétration de la solution de libération dans les nanoparticules avec dissolution de la progestérone, suivie de sa diffusion à l'extérieur. Les études in vitro démontrent que différents facteurs peuvent affecter la libération de principes actifs à partir de systèmes colloïdaux. Ces facteurs comprennent la taille et la morphologie des particules, la charge en principe actif et la solubilité de celui-ci (6, 7, 8). Conforménent à ce qui a été observé dans les travaux antérieurs, les nanoparticules les plus petites (70 nm) avec une charge supérieure en principe actif (24 gg/mg) présentent une libération plus rapide que les particules plus grandes (170 nm) avec une charge plus faible en progestérone (10,5 gg/mg). La taille moyenne et la charge de principe actif des nanoparticules représentent les facteurs majeurs de la vitesse de libération, avec une réduction de la phase rapide pour les nanoparticules plus grandes. La Figure 7 montre les profils de libération de la progestérone à partir de nanoparticules de PIBCA/HP3CD en présence de PEG 400 (20 et 40%) en tant qu'agent solubilisant. L'utilisation de ce type de milieu permet de réduire le volume de milieu de libération et par conséquent la concentration en principe actif permettant une meilleure détection (9). Dans un cas comme celui-ci o des solvants ou des agents solubilisants non aqueux sont employés, on peut obtenir des informations concernant le mécanisme de libération. Comme montré à la Figure 7, le profil de libération n'est pas identique pour les deux milieux, ce qui signifie que la libération est fortement influencée par la concentration en PEG. Par conséquent, la libération de la progestérone doit être déterminée par la pénétration du solvant dans la matrice polymère, avec dissolution et diffusion à l'extérieur du principe actif à partir des nanoparticules. Au contraire, quand la libération du principe actif résulte de la simple diffusion à travers une matrice polymère, la composition du solvant de libération ne peut pas influencer la libération de principe actif (10). Le procédé de préparation de nanoparticules qui consiste à ajouter le monomère à une solution aqueuse d'agent tensio-actif et à agiter pour obtenir des micelles (2), peut déterminer la distribution du principe actif dans les micelles pendant l'étape de polymérisation. La libération rapide observée dans les figures 6 et 7 suggère que la surface des particules a été enrichie en progestérone au cours de l'étape de polymérisation. Par ailleurs, une forte proportion du principe actif a pu être piégée dans le réseau de polymère qui pouvait avoir une structure interne hautement poreuse (11). Ce fait pourrait expliquer l'augmentation de la vitesse de libération lorsque la concentration en PEG augmente (Figure 7), le PEG pénétrant dans la structure à des vitesses différentes selon la constitution du milieu de libération puis modifiant la diffusion du principe actif vers l'extérieur. Malgré une augmentation très importante de la vitesse de libération obtenue grâce à l'addition de PEG dans le milieu de libération, la libération de la progestérone n'atteind pas 100% (elle est d'environ 75 et 82%, respectivement avec 40% de PEG). Au contraire, la présence d'enzymes de type estérase dans le milieu de libération conduit à une libération plus rapide que dans une solution de libération dépourvue d'estérase et la quantité de progestérone libérée est très proche de 100% pour les deux formulations testées et pour les deux concentrations d'enzyme (Figure 8). Ces faits peuvent suggérer que les molécules de progestérone sont, au moins en partie, piégée à l'état moléculaire dans la matrice polymère de la nanoparticule de l'invention et/ou liées au réseau de cyanoacrylate d'isobutyle (12). L'utilisation d'enzymes de type estérase dans le milieu de libération conduit à une dégradation ou une dissolution des chaînes polymères des nanoparticules de poly(cyanoacrylate). Dans ce cas, les principes actifs immobilisés dans la matrice sont alors libérés par la dégradation progressive de celle-ci. La bioérosion provoquée par l'hydrolyse de la liaison ester des chaînes latérales du PIBCA est le mécanisme qui permet une accélération significative de la libération de progestérone, ce qui correspond aux résultats rapportés par d'autres auteurs (12, 13). Parfois, les études de libération de principes actifs effectuées dans des milieux contenant des estérases ne conduisent pas à une libération de 100% du principe actif incorporé (12, 14, 15). Il est suggéré qu'alors il existe la possibilité d'une liaison entre les chaînes de PIBCA et les molécules de principe actif (12, 14). Les profils de libération de la cyclodextrine à partir des nanoparticules représentés à la Figure 9 montrent une libération très rapide et très proche de 100% dans la première heure, ce qui montre que ces molécules ne sont pas liées de manière chimique au polymère mais vraisemblablement simplement adsorbées ou piégées dans le polymère. Les profils de DSC des échantillons contenant de la HPPCD montrent une transition endothermique large, reproductible dans la gamme de 30 à 90 C avec des températures de début comprises dans cette gamme (Figure a, c et d). Ce pic asymétrique a été attribué à l'élimination d'eau. Les échantillons contenant de la progestérone (mélange physique et progestérone seule) présentent un pic endothermique prononcé à environ 130 C, ce qui correspond à la température de transition de fusion de la progestérone sous forme cristalline (Figure 10 b et c). Le complexe HPPCD: progestérone ne présente que la transition endothermique dans la gamme de 30 à 90 C décrite ci-dessus, avec disparition de la transition de fusion de la forme cristalline de la progestérone (Figure d), ce qui suggère que le principe actif est dispersé à l'état moléculaire dans la cavité des molécules de cyclodextrine. Sous la même forme, des échantillons de nanoparticules de PIBCA/HPPCD chargées de progestérone ne présentent pas de pic endothermique prononcé qui, dans ce cas, est remplacé par une transition endothermique large dans la gamme de 130 à 170 C (Figure 10 e et f). Ce phénomène suggère que la progestérone se trouve à l'état moléculaire soit dissoute dans le polymère soit incluse dans les cyclodextrines associées au nanoparticules selon l'invention. Sous cette forme, l'ensemble des résultats concernant la libération de la cyclodextrine et de la progestérone dans les différents milieux et les courbes de DSC, ajoutés aux données de la littérature, indiquent que la morphologie des nanoparticules pourrait être représentée par un noyau polymère contenant une fraction du principe actif à l'état moléculaire, avec une surface enrichie par des complexes cyclodextrine:progestérone. Cette structure pourrait expliquer la libération biphasique de la progestérone avec une première phase rapide due peut-être à la désorption du complexe cyclodextrine:progestérone à partir de la surface, et une seconde phase très lente comprenant la diffusion de la progestérone vers l'extérieur, à travers le réseau polymère. EXEMPLE 11: Préparation de nanoparticules de pol (cyanoacrvlate d'isobutyle)/HP5CD chargées en divers principes actifs. Des complexes de prednisolone, de spironolactone, de testotérone, de progestérone, de danazol et d'acetate de megestrol ont été obtenues en mélangeant 300 mg HPPCD avec 15 mg de stéroides dans 15 ml d'eau à 37 C pendant 72 heures sous agitation magnétique. Les suspensions ont été filtrées (0.45 mm) et les concentrations en cyclodextrine et en principe actif ont été dosées selon l'exemple 12 ci-après. Des nano particules de poly(cyanoacrylate d'isobutyle)/HPCD sont préparées comme dans l'exemple 1 en ajoutant une solution des complexes formés contenant 10mg/ml de HPICD dans une solution de poloxamer à 1% p/V. EXEMPLE 12 (témoin): Préparation de nanoparticules de poly (cvanoacrylate d'isobutyle) charaées en divers principes actifs. Des solutions d'hydrocortisone, de prednisolone, de spironolactone, de testoterone, de 24 2775435 progestérone, de danazol et d'acetate de megestrol à des concentrations correspondant à la concentration à saturation dans du poloxamer 188 (1% p/v) ont été ajoutées séparemment dans les milieux de polymérisation. Des nanoparticules de poly(cyanoacrylate d'isobutyle) chargées en divers principes actifs ont alors été préparées selon l'exemple 1, mais en l'absence de HPPCD. EXEMPLE 13: Dosaae de l'hvdrocortisone, de la prednisolone, de la spironolactone, de la testoterone, de la propestérone, du danazol, de l'acetate de meaestrol et de HPfCD. Les différents stéroides ont été dosés selon l'exemple 6 qui permet le dosage de ces différentes substances dans les mêmes conditions analytiques. L'HPPCD a été dosée également selon l'exemple 6. EXEMPLE 14: Caractéristiques de taille et de Dotentiel zéta des nanoparticules préparées selon l'invention en présence ou en absence de poloxamer 188 Les nanoparticules préparées selon l'exemple 11 et l'exemple 12 ont été caractérisées selon l'exemple 7. La taille des particules chargées en stéroides était généralement diminuée et était proche de 100 nm environ lorsque les nanoparticules selon l'invention étaient préparées en l'absence de poloxamer 188 et seulement en présence de l'HPPCD suggérant un masquage des charges par les molécules de cyclodextrine localisées à la surface des particules. Le tableau III ci-dessous rapporte le chargement de la drogue par des nanoparticules de poly(cyanoacrylate d'alkyle) ou des nanoparticules de poly(cyanoacrylate d'alkyle) et hydroxypropyl-f- cyclodextrine et le contenu en cyclodextrine correspondant (moyenne de 3 valeurs). Tableau III Échantillon CD chargement (mg/g) de la drogue (mg/g) PIBCA PIBCA hydrocortisone (HD) - 2, 19 PE - 0,12 sprironolactone (SP) - 7,65 testosterone (TE) - 2,27 megestrol acetate (AM) - 0,25 danazol (DA) - 0,34 progesterone (PO) - 0,79 PIBCA/HPPCD HD 180 15,3 PE 210 15,5 SP 230 53,0 TE 180 19,5 AM 220 1,4 DA 280 11,2 PO 24,0 RESULTATS DES EXEMPLES 11 A 14: Augmentation de la charae en stéroides de nanoparticules selon l'invention. Les valeurs des chargements en stéroides exprimés en valeur absolues pour les nanoparticules selon l'invention ou les particules témoins sont rassemblées dans le tableau IV (moyenne de trois préparations). Le calcul des valeurs d'accroissement de la charge des particules montre que l'augmentation de la charge peut atteindre 129 fois, dans le cas de la prednisolone. Tableau IV Stéroides Chargement des Chargement des Augmentation nanoparticules nanoparticules du chargement de PIBCA sans combinées de (nombre de HP5CD PIBCA et HPPCD fois) (mmole/g) (mmole / g) Hydrocortisone 6,04 42,21 7,0 Prednisolone 0,33 43,00 129,2 Spironolactone 18,36 127,23 6,9 Testoterone 7,87 67,6 8,6 Acetate de 0,65 3,64 5,6 megestrol Danazol 1,01 33,19 32,9 Progesterone 2,51 69,60 27,7 RÉFERENCES 1) J. Kreuter, Colloidal Drug Delivery * Systems, Marcel Decker, New York, 1994, 219-342. 2) Brevets EP-B-0 007 895 (US-A-4,329,332 & US-A-4,489,055) et EP-B-0 064 967 (US-A-4,913,908). 3) C. Cuvier et coll., Biochem. Pharmacol., 44, 509-517 (1992). 4) AC de Verdière et coll., British Journal of Cancer 76(2), 198-205 (1997). ) M. Vikmon, Proceed. First International Symposium on Cyclodextrins, Budapest, 1981, 69-74. 6) E. Allémann et coll., Pharm. Res., 10, 1732-1737 (1993). 7) J.-C. Leroux et coll., J. Control. Rel., 39, 339-350 (1996). 8) N. Erden et coll., International Journal of Pharmaceutics, 137, 57-66 (1996). 9) J.-P.Benoit et coll., Microspheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects, Elsevier, Amsterdam, 1984, 91-102. ) C. Washington, Int. J. Pharm., 58, 1-12 (1990). 11) P. Couvreur et coll., J. Pharm. Sci., 68, 1521-1524 (1979). 12) F. Fawaz et coll., International Journal of Pharmaceutics, 154, 191-203 (1997). 13) J. L. Grangier et coll., J. Control. Rel., , 3-13 (1991). 14) Ch. Tasset et coll., J. Control. Rel., 33, 23-30 (1995). ) B. Seijo et coll., Int. J. Pharm., 62, 1-7 (1990). REVENDICATIONS 1) Nanoparticules contenant au moins un principe actif, caractérisées en ce qu'elles comprennent l'association d'au moins un polymère et d'au moins un composé apte à complexer ledit principe actif. 2) Nanoparticules selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'un au moins des polymères est un poly(cyanoacrylate d'alkyle) dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 12 atomes de carbone. 3) Nanoparticules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que le composé apte à complexer le principe actif est un oligosaccharide cyclique. 4) Nanoparticules selon la revendication 3, caractérisées en ce que le composé apte à complexer le principe actif est une cyclodextrine neutre ou chargée, native, branchée ou polymérisée ou modifiées chimiquement. ) Nanoparticules selon la revendication 4, caractérisées en ce que le composé apte à complexer le principe actif est une cyclodextrine modifiée chimiquement par substitution d'un ou plusieurs hydroxypropyles par des groupements alkyle, aryle, arylalkyle, glycosidique, ou par etherification, estérification avec des alcools ou des acides aliphatiques. 6) Nanoparticules selon l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles présentent une taille comprise entre 300 et moins de nm. 7) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le principe actif est hydrophile, hydrophobe, amphiphile et/ou insoluble. 8) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le principe actif est choisi parmi les anticancéreux, les molécules antisens, les antiviraux, les antibiotiques, les protéines, polypeptides, polynucléotides, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs, les stéroides, les analgésiques, les antimorphiniques, les antifongiques et antiparasitaires. 9) Nanoparticules selon la revendication 8, caractérisées en ce que le principe actif est le taxol ou l'un de ses dérivés. ) Nanoparticules selon la revendication 8, caractérisées en ce que le principe actif est la doxorubicine ou l'un de ses dérivés. 11) Nanoparticules selon la revendication 8, caractérisées en ce que le principe actif est un dérivé du platine. 12) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que le principe actif est présent en une quantité de 0,01 à 300 mg/g de nanoparticules. 13) Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que la proportion de composé apte à complexer le principe actif est de 0,1 à 70 % en poids. 14) Procédé de préparation de nanoparticules à base d'un polymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) préparer un complexe d'au moins un principe actif avec au moins un composé apte à le complexer, en solution dans un solvant aqueux ou non aqueux, b) ajouter progressivement au moins un monomère du polymère dans la solution obtenue à l'étape (a), et c) effectuer une polymérisation, par exemple anionique ou inductible par d'autres agents notamment photochimiques, de ce monomère éventuellement en présence d'un ou plusieurs agents tensio-actif et/ou stabilisant. ) Procédé de préparation de nanoparticules à base de poly(cyanoacrylate d'alkyle) selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'à l'étape (b) on ajoute progressivement au moins un cyanoacrylate d'alkyle monomère. 16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que aux étapes (a) et (b), le solvant est avantageusement choisi de façon à ce que, tout en maintenant des conditions favorables à la polymérisation des polymères et plus particulièrement des poly(cyanoacrylate d'alkyle), la solubilité du principe actif et du composé apte à le complexer soit maximale dans le milieu défini par ce solvant. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que l'étape (c) est effectuée sans agent tensio-actif et/ou stabilisant. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que dans l'étape (a) la proportion de composé apte à complexer le principe actif est en général de 0,1 à 70 % en poids par rapport audit principe actif. 18) Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 17 pour fabriquer un médicament à effet ciblé et à index thérapeutique amélioré.