Brevet FR2778851A1 — publié le 19991126

L'invention concerne une composition pour retarder la sénescence, l'autodestruction et l'hémolyse des érythrocytes, qui comprend des inhibiteurs de cystéine- protéases, en particulier des inhibiteurs des caspases et des calpaïnes. Ces inhibiteurs sont choisis, de préférence, parmi des analogues des triou tétrapeptides du site de reconnaissance et de clivage des cystéine- protéases. Ils seront utilisés seuls ou en mélange, notamment dans les milieux de conservation des érythrocytes destinés aux transfusions sanguines. Il est connu que les érythrocytes ont une durée de vie de 120 jours, dans la circulation sanguine. Ensuite ils sont phagocytés par les macrophages. Cette phagocytose est précédée et provoquée par de nombreuses perturbations physiologiques et morphologiques au sein des érythrocytes, notamment la réduction de leur taille, l'apparition de pseudopodes, l'émission de vésicules, la désialylation des glycoconjugués membranaires et l'externalisation de la phosphatidylsérine (qui passe de la couche interne à la couche externe des feuillets lipidiques de la membrane). Il a été démontré que ces deux derniers évènements, la désialylation et l'apparition de phosphatidylsérine, qui sont considérés comme des marqueurs de sénescence, sont directement associés au mécanisme de capture par les macrophages (Bratosin et al. Glycoconjugate J. 12, 1995, 258-267; Bratosin et al. Comptes Rendus Acad. Sci. 320, 1997, 811-818). On sait également que, après transfusion sanguine, % des érythrocytes transfusés disparaissent de la circulation après 24 heures et 70 % après 3 jours. Ce phénomène a également été attribué à la sénescence des érythrocytes pendant leur stockage et à leur phagocytose après transfusion. En outre, l'autodestruction et l'hémolyse des érythrocytes commence déjà dans les poches de sang pendant leur stockage. Toute amélioration des conditions de stockage des érythrocytes destinés aux transfusions, permettant de préserver leur intégrité et leur activité physiologique, constituerait donc un progrès considérable dans le domaine transfusionnel. C'est un objet de la présente invention d'apporter une telle amélioration. Bien que les érythrocytes soient des cellules sans noyau et sans mitochondries, les Demandeurs ont émis l'hypothèse que les phénomènes associés à la sénescence et à l'autodestruction des érythrocytes pouvaient être assimilés à un mécanisme d'apoptose, ce qui n'a jamais été envisagé précédemment. Au contraire, il a encore été publié récemment que "les érythrocytes ne peuvent pas subir d'apoptose puisqu'ils sont dépourvus de noyau"(Boas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95-1998-3077). Les Demandeurs ont, en conséquence, étudié l'effet d'inhibiteurs connus de l'apoptose sur les marqueurs de la sénescence des érythrocytes. Parmi diverses familles d'inhibiteurs connus, les Demandeurs ont choisi des oligopeptides, principalement des tri- et tétrapeptides et des analogues ou dérivés de ceux-ci qui ont déjà été décrits comme inhibiteurs des caspases et calpaïnes. Ces deux familles d'enzymes sont des protéases qui participent à une cascade de réactions associées à l'apoptose cytoplasmique. - De nombreux travaux ont mis en évidence le rôle de diverses familles de protéases intracellulaires, en particulier des cystéine-protéases, dans la modulation de l'activité d'autres protéines cellulaires et dans des équilibres entre activateurs et inhibiteurs de diverses fonctions cellulaires (voir revue par Sorimachi et al. Biochem. J. 328, 1997, 721-732). Parmi ces protéases, les caspases clivent spécifiquement après un résidu d'acide aspartique (voir revue par Cohen, Biochem. J. 326, 1997, 1-16). Jusqu'à présent, dix caspases ont été identifiées qui participent à une cascade de réactions de clivage des protéines du noyau et du cystosquelette qui caractérisent la phase effectrice de l'apoptose. D'autre part les calpaïnes combinent un domaine à activité cystéineprotéase et un domaine qui lie le calcium; elles participent ainsi à diverses fonctions cellulaires. Outre leur rôle bien décrit dans des dysfonctionnements du cerveau et des muscles, les calpaïnes semblent également participer au processus d'apoptose. (Sorimachi - même référence). - L'étude du mode d'action des caspases a comporté la conception d'inhibiteurs synthétiques qui sont des oligopeptides dont la séquence est analogue de la séquence tri-ou tétrapeptidique du site de reconnaissance et de clivage présent sur les substrats naturels des caspases. Ainsi le tétrapeptide DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) correspond au site de clivage de la poly-ADP-ribose polymérase et YVAD (Tyr-Val-Ala-Asp) correspond à celui de l'ICE (IL-l1-converting enzyme). YVAD inhibe les caspases 1 et 4; DEVD inhibe les caspases 3 et 7. Divers dérivés (aldéhyde, nitriles, chlorométhyl, fluorométhyl, méthylcétones, etc....) ont également été conçus (voir revues: Nicholson et Thornberry; TIBS 22, 1997, 299-306; Villa et al. TIBS 22, 1997, 388-393). Un tripeptide modifié, Z-VAD k (benzyloxycarbonyl- Val-Ala-Asp-fluorométhylcétone) exerce une inhibition irréversible sur les caspases. Des applications thérapeutiques de ces inhibiteurs ont déjà été envisagées pour le traitement d'états pathologiques associés à des phénomènes d'apoptose, comme les hépatites fulminantes, l'infarctus du myocarde et des accidents ischémiques cérébraux. - Des inhibiteurs de la fonction cystéine-protéase de la calpaïne ont également été décrits (Sorimachi - même référence): la molécule connue sous le code E-64 (trans- époxysuccinyl-4-leucylamido-(4-guanidino)-butane), isolée à partir d'une culture d'Aspergillus japonicus, comme inhibiteur de papaïne, ainsi que deux dérivés E-64c (N-[N(L-3-trans-carboxyoxiranne-2-carbonyl)-L- leucyl] isoamylamine) et E-64d (N-[N-(L-3-trans- éthoxycarbonyloxyoxiranne-2-carbonyl)-L-leucyl] iso- amylamine) et la leupeptine (N-acétyl-Leu-Leu- argininal) isolée à partir de différentes souches d'Actinomycètes, ainsi que des proches analogues ou dérivés synthétiques tels que N-acétyl-Leu-Leu-norleucinal, N-acétyl-Leu-Leu-méthio- ninal, benzyloxycarbonyl-Leu-Leu-leucinal, etc... Ces molécules inhibent à des degrés divers les cystéine-protéases; certaines ont déjà été utilisées pour le traitement de dystrophies musculaires liées à ces protéases. Ces inhibiteurs sont commercialisés (notamment par les sociétés SIGMA et BACHEM) et sont proposés sous forme de réactifs inhibiteurs d'apoptose. Les Demandeurs ont utilisé ces divers inhibiteurs de caspases et de calpaïnes et ont pu montrer que, de manière surprenante, ils avaient également un effet inhibiteur sur quatre marqueurs bien définis de la sénescence des érythrocytes: - les changements morphologiques l'externalisation de la phosphatidylsérine - l'érythrophagocytose - l'hémolyse. Ces observations supportent donc l'hypothèse de départ et permettent d'assimiler la sénescence et l'autodestruction des érythrocytes à un phénomène d'apoptose. Les Demandeurs en ont déduit des applications pratiques, notamment pour l'amélioration des conditions de conservation des érythrocytes destinés aux transfusions. Ainsi l'invention concerne une composition pour retarder la sénescence, l'autodestruction et l'hémolyse des érythrocytes, qui comprend des inhibiteurs spécifiques du site actif de cystéine-protéases. Lesdits inhibiteurs présentent de préférence une analogie de structure avec le motif peptidique spécifiquement reconnu par les cystéine- protéases. Plus particulièrement, un premier groupe d'inhibiteurs présente une analogie de structure avec un motif tétrapeptidique spécifiquement reconnu par des caspases. Un second groupe d'inhibiteurs présente une analogie de structure avec un motif tripeptidique spécifiquement reconnu par des calpaïnes. La composition selon l'invention comprend de préférence un mélange d'inhibiteurs de type analogue du motif tétrapeptidique et d'inhibiteurs de type analogue du motif tripeptidique. Les inhibiteurs du premier type sont choisis de préférence parmi les tétrapeptides Asp-Glu-Val-Asp, Tyr- Val-Ala-Asp ou le tripeptide Z-Val-Ala-Asp ou des dérivés de ceux-ci modifiés en amont ou en aval de la séquence spécifique précitée, tels que ceux qui ont été décrits dans la littérature (références citées plus haut); ils peuvent être utilisés seuls ou en mélange. Les inhibiteurs du deuxième type sont choisis de préférence parmi la leupeptine ou ses dérivés et la molécule E-64 ou ses dérivés, tels que ceux qui ont été décrits dans la littérature (références citées plus haut); ils peuvent être utilisés seuls ou en mélange. D'autres molécules pourraient encore être synthétisées ou utilisées comme inhibiteurs des mêmes caspases et calpaïnes, qui agiraient par un mécanisme quelconque sur le site actif de ces mêmes enzymes. Ces molécules pourraient également être utilisées comme inhibiteurs dans la composition selon la présente invention, au même titre que les analogues de structure. L'invention concerne également le procédé de conservation des érythrocytes qui permet d'en retarder la sénescence, l'autodestruction et l'hémolyse, par l'addition de la composition d'inhibiteurs dans le milieu de conservation, à une concentration finale en inhibiteurs comprise entre 0,1 et 100 mM, pour un hématocrite final voisin de 30 %. La composition selon l'invention trouve également des utilisations dans la préparation de médicaments destinés au traitement de diverses pathologies liées à des manifestations précoces ou aberrantes de sénescence ou d'autodestruction et d'hémolyse des érythrocytes et associées, notamment, à diverses formes d'anémie. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. La figure 1 est une photographie au microscope électronique à balayage qui illustre l'effet des inhibiteurs sur la morphologie des érythrocytes. La figure 2 est une photographie au microscope électronique à balayage qui illustre l'effet des inhibiteurs sur la capture des érythrocytes par les macrophages. ExemDle I I-A-Induction de l'autodestruction des érythrocytes in vitro Une population d'érythrocytes comprend toujours un certain pourcentage de cellules sénescentes ou en voie d'autodestruction, dont les caractéristiques morphologiques et physiologiques ont été décrites plus haut. On peut accélérer le processus de sénescence et provoquer l'autodestruction des érythrocytes, in vitro, en les maintenant de 24 à 48 heures à 37 C. (Ils sont normalement conservés à 4 C pendant 2 à 6 semaines dans les centres de transfusion). On peut également déclencher artificiellement le processus d'autodestruction par l'action d'un ionophore spécifique des canaux calcium, connu sous le numéro de code A-23187 (commercialisé par Calbiochem-Novabiochem). Cet ionophore augmente la solubilité des ions calcium dans les milieux lipidiques et, ainsi, facilite leur pénétration au travers des membranes cellulaires. Les marqueurs de sénescence suivants ont été retenus pour les études ulterieures, parce qu'ils sont faciles à observer et/ou à quantifier: 1Altération de l'aspect discoïde et apparition de pseudopodes (érythrocytes au stade "échinocytes"), puis de pseudopodes filiformes (érythrocytes au stade "sphéroéchinocytes"). 2- Capture et phagocytose des érythrocytes par les macrophages. 3- Externalisation de la phosphatidylsérine. 4- Hémolyse des érythrocytes. L'aspect morphologique des érythrocytes est analysé en microscopie électronique à balayage. La phagocytose des érythrocytes par les macrophages est mesurée soit par observation et comptage direct sur vue au microscope, soit après marquage au colorant fluorescent PKH-26 par cytofluorimétrie en flux, comme décrit par Bratosin et al. (Cytométrie 30, 1997, 269). On utilise des macrophages péritonéaux de souris (femelles de race Swiss, âgées de 6 à 8 semaines). L'externalisation de la phosphatidylsérine est mesurée par marquage à l'annexine V conjuguée à la fluorescéine (annexine V-FITC) et cytofluorimétrie en flux, comme décrit par Kuypers et al. (Blood 87, 1996, 1179). L'hémolyse est évaluée par dosage de l'hémoglobine libérée dans le milieu de conservation. Dans les tableaux de résultats, les peptides inhibiteurs seront désignés par le code à une lettre: DEVD, YVAD, Z-VAD. I-B- Conditions d'étude des inhibiteurs Les érythrocytes sont mis en suspension en tampon HEPES additionné de CaC12 2,5 mM, à une concentration de 107 cellules par ml. - Les érythrocytes sont maintenus à 37 C pendant 48 heures - ou incubés en présence d'ionophore A-23187 5 M à 37 C pendant 3 heures - les inhibiteurs Asp-Glu-Val-Asp(DEVD), Tyr-Val- Ala-Asp(YVAD), leupeptine et E-64 sont ajoutés à la suspension d'érythrocytes à une concentration de 200 gM. Le mélange est maintenu à 20 C pendant 30 minutes. Le Z- Val-Ala-Asp(Z-VAD) est utilisé à 40 LM. I-C- Evaluation de l'effet des inhibiteurs sur la morDholoqie des érvthrocvtes La fiaure 1 montre l'aspect des érythrocytes observés en microscopie électronique à balayage: A- érythrocytes natifs Bérythrocytes traités par l'ionophore A-23187 C- érythrocytes mis en contact avec l'inhibiteur DEVD avant le traitement à l'ionophore La figure est présentée à titre d'exemple. Les mêmes résultats sont obtenus avec des érythrocytes maintenus à 37 C pendant 48 heures (B) et avec les inhibiteurs YVAD, E 64, et leupeptine (C). I1 apparaît clairement sur la figure 1C que la quasi totalité des érythrocytes traités ont conservé leur aspect natif discoïde, alors que sur la figure lB une proportion importante des érythrocytes sont des sphéroéchinocytes. Ces derniers sont les seuls à externaliser la phosphatidylsérine et à être phagocytés (Bratosin et al. Comptes Rendus de l'Acad. Sci. Paris, 320, 1998, 811). I-D- Evaluation de l'effet des inhibiteurs sur la capture et sur la Dhaaocvtose des érvthrocvtes par les macrophaaes Avec les mêmes conditions d'incubation et de traitement inhibiteur, on a évalué, par comptage sur images de microscopie électronique, le nombre d'érythrocytes capturés par des macrophages de souris en culture, après une mise en contact de 2 heures. Le comptage est effectué sur 500 macrophages par échantillon. Les résultats sont présentés dans le Tableau I et illustré par la figure 2. Ils montrent une importante réduction de la capture après traitement par les inhibiteurs. Tableau I Traitement des érythrocytes Nombre d'érythrocytes capturés par 100 macrophages aucun 6 ionophore A 23187 500 A 23187 + inhibiteurs: DEVD 70 YVAD 15 leupeptine 25 E-64 30 DEVD + leupeptine 14 La fiaure 2 montre la capture des érythrocytes humains par des macrophages péritonaux de souris, observée en microscopie électronique à balayage: A- érythrocytes natifs B- érythrocytes traités par l'ionophore A-23187 C- érythrocytes mis en contact avec la leupeptine avant le traitement à l'ionophore. La figure est présentée à titre d'exemple. Les mêmes résultats sont obtenus avec des érythrocytes maintenus à 37 C pendant 48 heures (B) et avec les autres inhibiteurs (C). D'autre part l'érythrophagocytose par les macrophages a été mesurée par cytofluorimétrie apres marquage par la PKH-26. Les résultats sont présentés dans le tableau II, exprimés en pourcentage d'inhibition de l'érythrophagocytose. Les mesures sont effectuées sur 5 000 cellules pour chaque condition. Tableau II Pourcentage d'inhibition de l'érythrophagocytose Inhibiteurs: à 37 C après traitement par l'ionophore A-23187 DEVD 50 + 8 60 + 10 YVAD 56 + 12 40 + 8 Z-VAD - 41 + 12 Leupeptine 82 + 12 49 + 13 E-64 80 + 19 37 + 8 DEVD + E-64 92 + 3 95 + 3 I-E- Evaluation de l'effet des inhibiteurs sur l'externalisation de la phosphatidylsérine Avec les mêmes conditions d'incubation et de traitement inhibiteur, on évalue la capacité des érythrocytes de fixer l'annexine V-FITC. Après lavage en tampon phosphate isotonique, les érythrocytes (105 cellules dans 100 g1) sont incubés en présence de 0,1 gg d'annexine VFITC, pendant 15 min à C, dans l'obscurité. Le pourcentage de cellules fluorescentes (annexine- positives) est déterminé par cytofluorimétrie en flux (sur FACScan cytofluorimètre-Becton-Dickinson, avec programme LYSIS), par comptage de 5 à 10 000 cellules par échantillon. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. Tableau III Pourcentage d'inhibition de l'externalisation de la phosphatidylsérine Inhibiteurs à 37 C après traitement par l'ionophore A-23187 DEVD 83 + 12 90 + 6 YVAD 82 + 4 82 + 10 Z-VAD - 71 + 10 Leupeptine.89 + 8 83 + 13 E-64 82 + 8 96 + 4 DEVD + E-64 96 2 94 + 2 Note:le Z-VAD étant additionné d'éthanol ou de DMSO provoque la lyse des érythrocytes pendant une incubation prolongée. Le test à 37 C n'est donc pas réalisé. I-F- Evaluation de l'effet des inhibiteurs sur l'autodestruction des érythrocvtes par hémolvse Des érythrocytes humains ont été incubés en présence d'ionophore A-23187 à 37 C pendant 8 et 20 heures, en absence et en présence d'inhibiteurs. L'hémolyse est mesurée et exprimée en mg d'hémoglobine libérée par litre de milieu. Les résultats présentés dans le tableau IV montrent que les inhibiteurs protègent les érythrocytes de la lyse. Tableau IV Hémoglobine dans le milieu de conservation (mg/1) Traitement des Temps d'incubation érythrocytes 8 hr 20 hr - ionophore en absence d'inhibiteur 60 195 - ionophore en présence d'inhibiteurs: DEVD 7 46 YVAD 8 41 leupeptine 9 27 DEVD + leupeptine 8 32 YVAD + leupeptine 9 24 ExemDile II Clairance in vivo d'érvthrocvtes de souris Pour évaluer l'effet des inhibiteurs sur les érythrocytes en conditions de stockage, puis transfusés, on a mis au point un modèle d'étude sur souris Balb-c. Les érythrocytes de souris sont isolés par centrifugation (2 000 g, 5 min à 4 C) de sang hépariné. Après 3 lavages,en tampon phosphate à pH 7,2 ils sont repris en tampon HEPES additionné de 0,1 % de sérumalbumine humaine. L'hématocrite final est de 10 %. Les érythrocytes sont incubés pendant 4 jours à 20 C (au lieu de 37 C pour les érythrocytes humains en raison de la plus grande fragilité des érythrocytes de souris). Ensuite, les érythrocytes sont centrifugés et marqués au colorant fluorescent PKH-26 (dans les mêmes conditions utilisées pour les érythrocytes humains). On reprend 100 g1 de culot érythrocytaire dans 100 il de tampon phosphate pour les injecter dans le sinus rétro- orbital des souris. Des échantillons de sang sont ensuite prélevés au cours du temps pour mesurer la présence, puis la clairance des érythrocytes injectés. La mesure est effectuée par cytofluorimétrie en flux. Chaque mesure porte sur 10 000 cellules. La première prise de sang est effectuée 1 heure après l'injection, de manière à ce que tous les érythrocytes injectés soient passés dans la circulation. Le même mode opératoire est appliqué aux érythrocytes incubés à 20 C en présence des inhibiteurs à une concentration de 2 mM. On utilise comme témoin des érythrocytes fraîchement prélevés. Les résultats présentés dans le tableau V montrent que la clairance des érythrocytes non traités est terminée dès la 6eme heure alors que les érythrocytes traités par les inhibiteurs sont encore présents après 48 heures. Tableau V Traitemen desNombre d'érythrocytes Traitement des marqués restant dans la érythrocytes circulation (sur 10 000 comptés) après 1 hr 6hr 20 hr 48hr aucun 364 343 317 305 4 jours à 20 C 34 11 11i 10 4 jours à 20 C en présence de 2 mM de * DEVD 276 260 220 210 * YVAD cmk 359 340 330 300 * leupeptine 219 230 250 230 * YVAD cmk + leupeptine 422 377 385 352 À DEVD + leupeptine 293 247 284 292 ExemDle III Etude de l'action des inhibiteurs de protéases sur les érvthrocvtes, dans les conditions de conservation des centres de transfusion. Le sang a été prélevé au Centre Régional de Transfusion Sanguine de Lille, dans les conditions habituelles, en "milieu de prélèvement" à pH 5,6. Il a été déleucocyté et déplaquetté. Les érythrocytes sont transférés en "milieu de conservation" à pH neutre, avec un hématocrite final de 30 %. Les érythrocytes sont normalement conservés à 4 C. Pour l'expérience présente, on a réalisé un vieillissement accéléré en les incubant à 37 C pendant 3 et 4 jours. Parallèlement, des aliquotes sont incubés en présence des inhibiteurs à la concentration de 3 mM. Après 3 et 4 jours, on mesure l'externalisation de la phosphatidylsérine, comme dans l'exemple I. Le tableau VI montre l'inhibition de l'externalisation de la phosphatidylsérine sous l'action des inhibiteurs. Tableau VI Pourcentage d'inhibition de l'externalisation de la phosphatidylsérine Inhibiteur: incubation de incubation de 3 jours 4 jours DEVD 58 42 YVAD 72 65 Leupeptine 62 52 DEVD + Leupeptine 68 64 REVENDICATIONS 1. Composition pour retarder la sénescence, l'autodestruction et l'hémolyse des érythrocytes, caractérisée en ce qu'elle comprend des inhibiteurs spécifiques du site actif de cystéine-protéases. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les inhibiteurs présentent une analogie de structure avec le motif peptidique spécifiquement reconnu par lesdites cystéine-protéases. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les inhibiteurs présentent une analogie de structure avec un motif tétrapeptidique spécifiquement reconnu par des caspases. 4. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les inhibiteurs présentent une analogie de structure avec un motif tripeptidique spécifiquement reconnu par des calpaïnes. 5. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'inhibiteurs analogues du motif tétrapeptidique selon la revendication 2 et d'inhibiteurs analogues du motif tripeptidique selon la revendication 3. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 5, caractérisée en ce que les inhibiteurs sont choisis parmi les tétrapeptides Asp-Glu- Val-Asp, Tyr-Val-Ala-Asp, ou le tripeptide Z-Val-Ala-Asp, ou des dérivés de ceux-ci modifiés en amont ou en aval de la séquence spécifique précitée, et sont utilisés seuls ou en mélange. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 et 5, caractérisée en ce que les inhibiteurs sont choisis parmi la leupeptine ou ses dérivés et la molécule E-64 ou ses dérivés, utilisés seuls ou en mélange. 8. Procédé pour retarder la sénescence, l'autodestruction et l'hémolyse des érythrocytes caractérisé en ce qu'il comprend l'addition de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans le milieu de conservation des érythocytes à une concentration finale comprise entre 0,1 et 100 mM. 9. Utilisation de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies liées à des manifestations précoces ou aberrantes de sénescence ou d'autodestruction et d'hémolyse des érythrocytes.