Brevet FR2776775A1 — publié le 19991001

DISPOSITIF DE MESURE DE POLARISATION OU D'ANISOTROPIE DE FLUORESCENCE Domaine technique et art antérieur L'invention se rapporte au domaine des mesures optiques, en particulier à toutes les mesures optiques faisant intervenir l'évaluation expérimentale de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence d'un chromophore, isolé ou associé, de quelque manière que ce soit, à une autre molécule. Ces mesures peuvent être utilisées pour évaluer la mobilité de ce chromophore, et les modifications de sa mobilité provoquées par tout événement physique, chimique ou biologique intervenant dans la solution, par exemple la liaison du chromophore ou de la molécule portant le chromophore sur une autre molécule, la dénaturation/renaturation de la molécule portant le chromophore, la modification de flexibilité de la totalité ou d'une partie de la molécule portant le chromophore étudié, l'agrégation ou la cristallisation de la protéine portant le chromophore, etc... L'application de cette méthode se situe donc dans de nombreux domaines de la chimie, de la biologie ou de la pharmacologie. Des études d'anisotropie ou de polarisation de fluorescence sont effectuées depuis longtemps dans les domaines cités ci-dessus. Le principe général de la mesure est le suivant: lorsque l'on excite le chromophore avec une lumière d'excitation de longueur d'onde appropriée Xexc, le chromophore absorbe cette lumière et est excité à un niveau d'énergie élevé. Le chromophore dissipe cette énergie au bout d'un temps très court (de la ns à la ps), en émettant à son tour une lumière de longueur d'onde plus élevée: em. C'est le phénomène de fluorescence. Si la lumière d'excitation n'est pas polarisée, la lumière est émise de manière isotrope. Si, par contre, la lumière d'excitation est polarisée, la lumière émise ne sera plus isotrope, et le degré d'anisotropie sera dépendant de la mobilité du chromophore. Le principe de la méthode de mesure de l'anisotropie ou de la polarisation de fluorescence va être rappelé en liaison avec les figures 1 et 2. La figure 1 donne la définition des coordonnées, la référence 2 désignant la lumière incidente, polarisée selon l'axe des Z. Le chromophore excité par la lumière est orienté de manière aléatoire, et est immobilisé de manière à ce qu'aucune réorientation significative du chromophore ne puisse se produire pendant le temps de vie du niveau excité du chromophore. Dans ces conditions la fraction de chromophore excité orienté de 0 à O+ dO et de O à (+dD est: W(O,D).dO.dO.dV=(3/47)cos20.sinO.dû.dD La distribution des chromophores excités se fait donc, comme illustré sur la figure 2, dans un cône 4 autour de la direction d'incidence. Dans les conditions o la même transition électronique est impliquée dans l'absorption et l'émission de lumière, le dipôle émetteur aura la même distribution que celle de la figure 2. Dans ce repère la lumière émise aura trois composantes (Ix, Iy et Iz), comme illustré sur la figure 2. Les mesures d'anisotropie sont effectuées classiquement en positionnant un détecteur en position I. Devant ce détecteur est positionné un dispositif polarisant permettant de mesurer séparément les composantes Iz et Ix (ces mesures sont en général désignées par I// et Il. Avec un détecteur idéal on aura: Iz=I// et Ix=Il). Dans le cas décrit ici, Iz et Ix ont les valeurs suivantes: Iz = |dct dû. cos2 0.W(,) =) 3 / 5 Ix = f df dû. sin2 0.cos2.W,) = 1 / 5. Pour un chromophore non orienté et isotrope on a, en plus: Ix=Iy L'anisotropie de fluorescence est définie comme: A= (I//-I )/(I/+21L)= (Iz-Ix) / (Iz+2Ix)=0, 4. Cette valeur est l'anisotropie maximum atteinte par un chromophore immobilisé. Parfois les mesures font référence à la polarisation de fluorescence définie comme suit: P=(I//-Il)/(I//+Il)=(Iz-Ix)/(Iz+Ix)=0,5. Cette valeur de polarisation est le maximum atteint pour un chromophore immobilisé. Un détecteur en position II permet de déterminer Ix et Iy. Dans le cas réel d'un chromophore mobile la valeur mesurée de l'anisotropie de fluorescence peut prendre des valeurs comprises entre 0 et 0,4, suivant la mobilité de la molécule. Cette mesure est donc extrêmement informative sur l'environnement du chromophore. Pratiquement, la mise en oeuvre de la mesure a été réalisée selon trois méthodes. Dans la première méthode (figure 3), on utilise une source de lumière monochromatique 10, un polariseur d'excitation 12. Un échantillon à étudier 14 réémet une lumière d'émission 16, sous l'influence du rayonnement excitateur. La lumière 16 traverse un polariseur d'émission 18, un dispositif 20 de sélection de la longueur d'onde d'émission et un détecteur 22 de mesure de la lumière d'émission. Il faut en fait réaliser au moins 2 mesures: une avec le polariseur d'émission 18 vertical pour évaluer I//, la seconde avec un polariseur horizontal pour évaluer Il. Cette méthode a été utilisée mais elle est limitée en précision car la rotation du polariseur entraîne des altérations du chemin optique de la lumière (la transmittance du polariseur est différente selon son orientation) qui font que les mesures de I// et de Il sont entachées d'erreurs très difficiles à corriger. La deuxième méthode permet de corriger ces erreurs. Elle prend en compte le fait que les valeurs mesurées sont reliées aux valeurs théorique par la relation: I//=Az.Iz II=Ax.Ix La mesure effective d'anisotropie A devient donc: 7E IT/ /IT/ T / I// 2I- I)(/. Tz-- T l.iz T.2I_ Le terme G=Az/Ax a été introduit par Chen & Bowman (Science, 147, 729 (1965)) et Azumi & McGlynn (J. Chem. Phys. 37, 2413 (1962)). Ce facteur G peut être mesuré indépendamment en positionnant le détecteur en position II et en mesurant de nouveau les signaux en positionnant successivement le polariseur d'émission sur les deux positions I// et Il. On a alors: I'//=Az.Iy I'l=Ax.Ix Comme Iy=Ix, le rapport I'// sur I'l donne le facteur G: G=(I'//)/(I'I). Il s'ensuit donc qu'une mesure d'anisotropie de fluorescence demande alors quatre mesures. Dans les réalisations pratiques, on ne fait pas tourner le détecteur de la position I à la position II, mais on préfère laisser le détecteur en position I, et effectuer une rotation du polariseur d'excitation du plan vertical au plan horizontal. Cette procédure entraîne des défauts supplémentaires car la rotation du polariseur d'excitation s'accompagne toujours de modifications optiques qui provoquent une modification de la lumière transmise. De plus, devant le polariseur d'excitation se trouve en général un dispositif de sélection de la longueur d'onde d'excitation (monochromateur) qui polarise lui aussi la lumière, et qui perturbe l'effet de la rotation du polariseur d'excitation. Une troisième méthode (figure 4) est dérivée de la précédente, et a pour but de diminuer le nombre de mesures nécessaires. Dans cette méthode deux détecteurs 26, 29 sont disposés dans le plan: un sur l'axe Y, l'autre sur l'axe -Y. Le premier est équipé d'un polariseur vertical 24, le second avec un polariseur horizontal 27. Les deux mesures I// et Il sont donc effectuées simultanément. Le facteur G est calculé comme dans la méthode 2 en effectuant une rotation du polariseur d'excitation. Avec ces méthodes, les problèmes suivants se posent. Les mesures d'anisotropie ou de polarisation de fluorescence demandent une succession de 2 ou 4 mesures successives. Il s'ensuit que: - les mesures sont lentes, plusieurs secondes sont nécessaires pour une simple évaluation. Des dispositifs motorisés de rotation des polariseurs ont été réalisés; mais, ils restent trop lents pour un grand nombre de mesures, - les mesures sont imprécises. Effectuées à des temps différents, les mesures sont soumises à toute fluctuation d'intensité du dispositif d'excitation. Les bruits optiques, hydrodynamiques et électroniques mesurés au moment de chaque évaluation s'ajoutent de manière non cohérente. A ces imprécisions s'ajoutent en outre des défauts optiques inhérents au principe de rotation des polariseurs. Tout ceci fait que les mesures d'anisotropie de fluorescence n'ont pu pour l'instant répondre à un grand nombre de problèmes posés, à cause de leur limitation de vitesse et de précision. Une quatrième méthode (figure 5) a donc été développée, grâce à laquelle on peut effectuer les mesures successives de I// et Il à grande vitesse, mais sans rotation mécanique du polariseur. Pour cela on utilise un modulateur photoélastique 30, utilisé pour les mesures d'ellipsométrie ou de dichroisme circulaire ou linéaire. Il peut être utilisé en principe pour les mesures de polarisation et d'anisotropie de fluorescence. Si une lumière polarisée linéairement est présentée devant le modulateur à 45 de son axe principal, le modulateur va faire tourner le plan de polarisation entre 0 et 90 , à une fréquence très rapide (par exemple, 100 kHz). Un polariseur linéaire 32 est disposé derrière le modulateur. Si l'on synchronise l'électronique du détecteur 38 sur la fréquence de modulation, les deux directions I// et Il pourront donc être mesurées à grande vitesse, et sans aucun mouvement mécanique. Cette méthode, si elle permet de s'affranchir de la plupart des inconvénients des méthodes antérieures, présente un inconvénient majeur qui est de demander l'installation de plusieurs pièces d'optiques devant le détecteur de mesure, ce qui a pour effet (optique et géométrique) de diminuer fortement la sensibilité de mesure. Exposé de l'invention Le but de l'invention est de réaliser un dispositif et une méthode permettant d'effectuer des mesures de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence avec une plus grande précision, une plus grande vitesse de mesure et une plus grande sensibilité de détection. Ces spécifications sont importantes pour un grand nombre de mesures en chimie et biologie moderne. Ce but est atteint par un dispositif de mesure de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence, comportant: a) des moyens pour émettre un rayonnement excitateur: - une source de lumière monochromatique, - un polariseur d'excitation, - des moyens pour effectuer une rotation de polarisation de la lumière d'excitation, b) des moyens de détection d'un rayonnement émis par un échantillon sous l'influence du rayonnement excitateur. Les moyens pour effectuer une rotation de polarisation de la lumière d'excitation peuvent comporter un modulateur photoélastique. Les mesures d'anisotropie et de polarisation de fluorescence peuvent être réalisées, conformément à l'invention, i) en n'effectuant que deux mesures obtenues pour les deux orientations de la polarisation d'excitation, et ii) en utilisant un détecteur simple, sans polariseur. L'invention permet d'effectuer les mesures de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence, d'une part en éliminant les mécanismes de rotation mécanique de dispositifs polarisants, d'autre part en éliminant le dispositif de polarisation devant le détecteur d'émission de fluorescence. Ce dispositif permet donc des mesures de polarisation et d'anisotropie de fluorescence de haute sensibilité, et à des vitesse que ne peuvent atteindre les méthodes actuelles. Brève description des figures De toute façon, les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lumière de la description qui va suivre. Cette description porte sur les exemples de réalisation, donnés à titre explicatif et non limitatif, en se référant à des dessins annexés sur lesquels: - Les figures 1 et 2 illustrent le principe de la méthode de mesure de l'anisotropie ou de la polarisation de fluorescence. - Les figures 3 à 5 illustrent des techniques connues de l'art antérieur. - La figure 6 représente un dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention. - La figure 7 est un exemple d'une mesure cinétique d'anisotropie selon l'invention. Description détaillée de modes de réalisation de l'invention Un dispositif pour la mise en oeuvre de l'invention est représenté sur la figure 6. Sur cette figure, la référence 50 désigne une source de lumière monochromatique. Le faisceau émis par cette source traverse ensuite successivement un polariseur d'excitation 52 et un modulateur photoélastique 54 avant d'entrer dans l'échantillon à étudier 56. Un dispositif 58 de sélection de la longueur d'onde d'émission est associé à un détecteur de la lumière émise par l'échantillon. Si on reprend les notations de la figure 2, on voit que le détecteur est placé en position I et que la direction de polarisation est verticale, comme sur la figure 2. Le détecteur, insensible à la polarisation, va détecter Il=Iz+Ix. Une deuxième mesure est effectuée en faisant tourner la polarisation de la lumière d'excitation de (cela est équivalent à placer le détecteur en position II). Le détecteur mesure alors I2=Iy+Ix. Pour un système non orienté, on a: Iy=Ix; donc I2=2.Ix L'anisotropie peut être calculée simplement à partir de ces valeurs, en effectuant: A=(I-I2) (Ii+I2/2)=(Iz-Ix)/(Iz+2Ix) De même la polarisation P peut être obtenue par: P=(Il-I2)/Il=(Iz+Ix) / (Iz+Ix) La figure 6 montre un exemple de réalisation non limitatif. Le changement de polarisation de la lumière d'excitation y est obtenu avec un modulateur photoélastique, tel que décrit par exemple dans l'article de K.W. Hipps et al. "Application of the photoelastic modulator to polarization spectroscopy", J. Phys. Chem., vol. 83, p. 555- 562 (1979) ou celui de J.C. Kemp "Piezo-optical birefringence modulators: new use for a long-known effect", J. Opt. Sci. Of America, vol. 59, p. 950-954 (1969).; mais, tout autre dispositif permettant d'effectuer cette rotation de polarisation peut être utilisé. La détection est effectuée par un détecteur devant lequel est placé un dispositif de sélection de la longueur d'onde d'émission: filtre coloré, filtre interférentiel ou monochromateur. Si un monochromateur est utilisé on dispose également un dispositif mélangeant les polarisations avant la détection, une fibre optique pouvant effectuer cette opération. Aucun dispositif polarisant n'est placé devant le détecteur. La figure 7 montre un exemple de mesure cinétique d'anisotrope de fluorescence selon l'invention. La résolution temporelle de cette mesure est de l'ordre de la milliseconde et le niveau de bruit de l'ordre de 5.10-3. Elle correspond à la mesure de changement d'anisotropie dans la réaction suivante. Au début de l'expérience, du bromure d'éthidium est lié à de l'ADN. Le bromure d'éthidium est immobilisé dans la structure de l'ADN. Au début de l'expérience le système ADN-bromure d'éthidium est mélangé avec un détergent (SDS) qui provoque la dissolution de la structure de l'ADN et la libération du bromure d'éthidium. Celui-ci se retrouve en solution, et donc mobile. Il en résulte une diminution sensible de l'anisotropie de fluorescence du bromure d'éthidium. Ces mesures ont été réalisées avec une vitesse de mesure de 2 ms par point, et à cette vitesse, la sensibilité est de 5.10-3 unités d'anisotropie. Aucun système actuel n'atteint ces performances. Les mesures d'anisotropie de fluorescence selon l'invention peuvent s'appliquer dans divers domaines de la biologie structurale ou de la biologie cellulaire. Elles peuvent s'appliquer par exemple dans les domaines suivants (liste non limitative): - étude des interactions substrat-protéine, - étude des interactions protéine-protéine ou protéine- acide nucléique ou peptide-acide nucléique, - étude de conformation ou de flexibilité locale de peptides, - études de repliement de protéines, etc. REVENDICATIONS 1. Dispositif de mesure de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence, comportant: a) des moyens pour émettre un rayonnement excitateur: - une source (50) de lumière monochromatique, - un polariseur d'excitation (52) - des moyens (54) pour effectuer une rotation de polarisation de la lumière d'excitation, b) des moyens (58, 60) de détection d'un rayonnement émis par un échantillon sous l'influence du rayonnement excitateur. 2. Dispositif selon la revendication 1, les moyens pour effectuer une rotation de polarisation de la lumière d'excitation comportant un modulateur photoélastique (54). 3. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, les moyens de détection comportant: - un détecteur (60), - un dispositif (58) de sélection de la longueur d'onde d'émission d'un rayonnement émis. 4. Dispositif selon la revendication 3, le dispositif (58) de sélection de la longueur d'onde d'émission comportant un filtre coloré ou un filtre interférentiel. 5. Dispositif selon la revendication 3, le dispositif (58) de sélection de la longueur d'onde d'émission comportant un monochromateur et des moyens pour mélanger les polarisations avant détection. 6. Dispositif selon la revendication 5, les moyens pour mélanger les polarisations avant détection comportant une fibre optique.