Brevet FR2782094A1 — publié le 20000211

SOUCHES MUTANTES DE E. coli, ET LEUR UTILISATION POUR LA PRODUCTION DE POLYPEPTIDES RECOMBINANTS La présente invention a pour objet certaines souches mutantes de E. coli, et leur utilisation pour la mise en oeuvre de procédés de production de polypeptides recombinants. L'étude des gènes des organismes supérieurs, des micro-organismes, et des virus, requiert presque invariablement, outre le clonage de ces gènes, la production massive de leurs produits (protéines), afin par exemple d'obtenir des anticorps ou de réaliser des études biochimiques ou cristallographiques. D'un point de vue appliqué, l'utilisation en médecine de nombreux peptides et protéines humaines nécessite aussi l'expression des gènes correspondants dans des organismes hétérologues. Bien que des systèmes d'expression aient été mis au point dans divers hôtes eucaryotes (notamment chez les levures, les insectes, et les cellules de primates), l'hôte le plus utilisé pour ces stratégies d'expression reste la bactérie Escherichia coli (E. coli). La liste des protéines présentant un intérêt biotechnologique ou pharmacologique qui sont produites chez E. coli est longue; citons les exemples classiques de l'insuline humaine et de l'hormone de croissance humaine. Le système d'expression le plus connu chez les procaryotes a été développé aux USA par les groupes de Studier et de Richardson dans les années 80 (Tabor et Richardson, 1985 ; et Moffat, 1986). Il est basé sur l'exploitation des propriétés de l'ARN polymérase de T7 (à savoir de l'ARN polymérase codée par le bactériophage T7). Cette enzyme, qui peut être exprimée dans les cellules de E. coli sans toxicité, reconnaît un promoteur très spécifique. Tout gène intéressant (dit gène cible) peut être transcrit de façon très efficace, dès lors qu'il est placé en aval de ce promoteur et introduit dans une cellule de E. coli exprimant la polymérase de T7. Cependant, en termes d'expression, les résultats demeurent aléatoires. Si certains gènes cibles peuvent être convenablement surexprimés, d'autres ne le sont que médiocrement, voire pas du tout. Il ressort du travail antérieur des Inventeurs qu'une des principales causes de ces échecs réside dans l'instabilité spécifique des ARNm synthétisés par l'ARN polymérase de T7, qui entraîne une diminution du nombre de polypeptides synthétisés par message (Lopez et al., 1994 ; Iost et Dreyfus, 1994,1995). Cette instabilité est la conséquence de la grande vitesse d'élongation de l'ARN polymérase de T7 (Makarova et al., 1995). En effet, la vitesse d'élongation de la polymérase de T7, au contraire de l'ARN polymérase bactérienne, est beaucoup plus élevée que la vitesse de traduction des ARNm par les ribosomes. L'ARNm naissant est donc nu sur la plus grande partie de sa longueur, et est de ce fait facilement attaqué par les nucléases, à savoir principalement chez E. coli la ribonucléase dite E (ou RNase E), dont la séquence en aminoacides est décrite par Casaregola et al. (Casaregola et al., 1992,1994). La RNase E est une enzyme essentielle de E. coli ; elle est impliquée à la fois dans la dégradation des ARNm et dans la maturation des ARN ribosomaux (ARNr). Les mutations dans le domaine catalytique (à savoir dans la partie N-terminale de la RNase E) affectent ces deux fonctions à la fois, et ralentissent, voire arrêtent la croissance de E. coli (Cohen et McDowall, 1997). En revanche, les délétions dans la partie C-terminale de la RNase E n'affectent pas la viabilité de E. coli. En effet, en recherchant des révertants de mutations dans une protéine (MukB) nécessaire à la ségrégation des chromosomes après réplication, Kido et al. ont obtenu diverses mutations viables dans le gène rne, codant la RNase E chez E. coli, qui provoquent la synthèse d'une RNase E tronquée dans sa partie C-terminale (Kido et al., 1996). Ces auteurs ont conclu de ces expériences que la partie C-terminale de la RNase E n'est pas essentielle pour la viabilité de E. coli. Ils ont de plus émis l'hypothèse que la suppression des mutations mukB par troncature de la RNase E, reflète le fait que la RNase E tronquée est moins efficace que l'enzyme sauvage pour dégrader l'ARNm mukB. Stabilisé, celui-ci permettrait alors une plus forte synthèse de la protéine MukB mutante, corrigeant ainsi le phénotype associé à la mutation. Toutefois, cette stabilisation du messager mukB n'a pas été démontrée, et d'autres auteurs ont proposé une interprétation entièrement différente pour expliquer l'effet suppresseur de la troncature de la RNase E sur les mutations mukB (Cohen et McDowal, 1997). Ces auteurs postulent en effet une interaction directe entre la RNase E et MukB. A l'origine de cette idée se trouve le fait que la RNase E présente une analogie très significative avec la myosine eucaryote (Casaregola et al., 1992 ; McDowall et al., 1993), ce qui suggère qu'outre son activité RNase, elle pourrait, comme MukB, jouer un rôle structural. La présente invention découle de la démonstration par les Inventeurs du fait que la troncature de la RNase E provoque une stabilisation en masse de l'ARNm cellulaire - considéré dans sa globalité - , ainsi que de la majorité des que l'on observe avec les mutations N-terminales de la RNase E, est uniquement due à l'incapacité des cellules à maturer l'ARNr. En résumé, les délétions de la partie C-terminale de la RNase E n'ont pas d'effet sur l'activité du domaine catalytique, à en juger par la maturation rapide de l'ARNr. Cette maturation rapide explique que les cellules contenant une telle délétion soient viables. En revanche, la délétion stabilise globalement les ARNm, peut être parce qu'elle empêche l'association de la RNase E avec d'autres enzymes au sein d'une structure multiprotéique, le "dégradosome", qui pourrait être nécessaire à la dégradation des ARNm (Carpousis et al., 1994 ; Miczack et al, 1996 ; Py et al., 1996 ; Kido et al., 1996 ; Cohen et McDowall, 1997). Le point important, du point de vue de l'invention, est que grâce à ces délétions il est possible d'obtenir des souches de E. coli présentant une stabilité accrue des ARNm, tout en conservant une croissance normale. Les Inventeurs ont également pu mettre en évidence que la stabilisation des ARNm due à la délétion de la partie C-terminale de la RNase E, n'est pas uniforme, mais qu'elle est plus marquée pour les ARNm les moins stables. Ainsi qu'on l'a vu, tel est souvent le cas des ARNm des gènes "cibles" dans les systèmes d'expression. La contribution de ces ARNm à la synthèse protéique totale est donc augmentée par la présence de la délétion. Ainsi des souches de E. coli comportant une telle délétion expriment des polypeptides exogènes recombinants avec des rendements nettement accrus (notamment entre environ 3 à 25 fois) par rapport aux rendements d'expression de ces polypeptides recombinants par des souches de E. coli ne comportant pas cette mutation, et ce en particulier dans le cas où l'expression desdits polypeptides recombinants est placée sous le contrôle de l'ARN polymérase de T7. La présente invention a donc pour but de fournir de nouveaux procédés de production par E. coli de polypeptides ou protéines recombinants. notamment d'intérêt biologique ou pharmaceutique, ayant des rendements de production nettement supérieurs à ceux des procédés décrits jusqu'à présent. La présente invention a également pour but de fournir de nouvelles souches de E. coli pour la mise en oeuvre des procédés susmentionnés, ainsi que les méthodes de préparation de telles souches. La présente invention a pour objet l'utilisation de souches de E. coli dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARNm, cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli, pour la mise en #uvre d'un procédé de production de polypeptides (ou protéines) recombinants exogènes déterminés. La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation de souches de E. coli dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté conserve l'activité de maturation de l'ARNr de la RNase E, mais ne possède plus l'activité de dégradation de l'ARNm, pour la mise en #uvre d'un procédé de production de polypeptides (ou protéines) recombinants exogènes déterminés. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la mutation consiste en la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région du gène codant pour la partie C-terminale de la RNase E. L'invention concerne plus particulièrement encore l'utilisation susmentionnée de souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la mutation correspond à la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région délimitée par le nucléotide situé à la position 1935 et le nucléotide situé en position 3623 de la séquence d'ADN codant la RNase E représentée par SEQ ID NO 1. Avantageusement, la mutation susmentionnée provoque la modification ou la délétion d'au moins un aminoacide de la partie C-terminale de la RNase E. A ce titre, l'invention a pour objet l'utilisation susmentionnée de souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la mutation provoque la délétion d'au moins un jusqu'à la totalité des 563 derniers aminoacides de la séquence de la RNase E représentée par SEQ ID NO 2. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la mutation correspond à la substitution de la guanine G en position 2196 de SEQ ID NO 1, par une thymidine T, de manière à créer un codon stop TAA situé aux positions 2196 à 2198 de SEQ ID NO 1. Avantageusement, les souches susmentionnées de E. coli mutées, utilisées dans le cadre de la présente invention, contiennent un système d'expression inductible exogène, sous le contrôle duquel est placée l'expression des polypeptides recombinants déterminés, notamment le système d'expression inductible utilisant l'ARN polymérase du bactériophage T7. L'invention concerne également les souches de E. coli transformées de manière à ce qu'elles contiennent un système d'expression inductible exogène, et dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARNm, cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli. L'invention a également pour objet les souches de E. coli telles que décrites ci-dessus, transformées de manière à ce qu'elles contiennent un système d'expression inductible exogène, choisi notamment parmi ceux décrits ci-dessus, et dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté conserve l'activité de maturation de l'ARNr de la RNase E, mais ne possède plus l'activité de cette dernière de dégradation de l'ARNm. L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de E. coli telles que décrites ci-dessus, caractérisées en ce que le système d'expression inductible utilise l'ARN polymérase codée par le bactériophage T7. L'invention concerne également les souches de E. coli telles que décrites ci-dessus, caractérisées en ce que la mutation consiste en la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région du gène codant pour la partie C-terminale de la RNase E. L'invention concerne plus particulièrement encore les souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que la mutation correspond à la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région délimitée par le nucléotide situé à la position 1935 et le nucléotide situé en position 3623 de la séquence d'ADN codant la RNase E représentée par SEQ ID NO 1. L'invention a plus particulièrement pour objet les souches mutantes de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que la mutation susmentionnée provoque la modification ou la délétion d'au moins un aminoacide de la partie C-terminale de la RNase E exprimée par lesdites souches. A ce titre, l'invention a pour objet les souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que la mutation provoque la délétion d'au moins un jusqu'à la totalité des 563 derniers aminoacides de la séquence de la RNase E représentée par SEQ ID NO 2. L'invention a plus particulièrement pour objet les souches de E. coli telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce que la mutation correspond à la substitution de la guanine G en position 2196 de SEQ ID NO 1, par une thymidine T, de manière à créer un codon stop TAA situé aux positions 2196 à 2198 de SEQ ID NO 1. L'invention a également pour objet les souches de E. coli telles que décrites ci-dessus, caractérisées en ce que le système d'expression inductible contrôle la transcription d'une séquence d'ADN codant un ou plusieurs polypeptides recombinants déterminés. L'invention concerne également tout procédé de production de polypeptides recombinants déterminés, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de transformation de souches de E. coli dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARNm, cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli, avec un vecteur, notamment un plasmide, contenant la séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants, - la mise en culture des souches de E. coli transformées obtenues lors de l'étape précédente, pendant un temps suffisant pour permettre l'expression du ou des polypeptides recombinants dans les cellules de E. coli, - et la récupération du ou des polypeptides recombinants produits lors de l'étape précédente, le cas échéant après purification de ces derniers, notamment par chromatographie, électrophorèse ou précipitation sélective. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé de production de polypeptides recombinants déterminés, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de transformation de souches de E. coli telles que décrites cidessus, avec un vecteur, notamment un plasmide, contenant la séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants, de manière à obtenir des souches de E. coli susmentionnées, dans lesquelles la transcription de ladite séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants est placée sous le contrôle d'un système d'expression inductible, - la mise en culture des souches de E. coli transformées obtenues lors de l'étape précédente, et induction dudit système d'expression, pendant un temps suffisant pour permettre l'expression du ou des polypeptides recombinants dans les cellules de E. coli, l'induction dudit système d'expression étant notamment effectué en provoquant la synthèse de l'ARN polymérase de T7 lorsque ledit système d'expression fait appel à cette polymérase; cette synthèse peut notamment être provoquée en ajoutant de l'IPTG au milieu de culture, ou en élevant la température, suivant que le gène codant pour cette ARN polymérase est placé sous le contrôle d'un promoteur régulé par le répresseur lac (Studier et Moffat, 1986), ou sous le contrôle d'un promoteur thermoinductible (Tabor et Richardson, 1985), - et la récupération du ou des polypeptides recombinants produits lors de l'étape précédente. Un procédé général pour l'obtention de souches mutantes de E. coli telles que décrites ci-dessus, et susceptibles de pouvoir être utilisées dans le cadre de la présente invention, comprend les étapes suivantes : - préparation d'un plasmide contenant un gène rne comportant une mutation telle que décrite ci-dessus, et dans lequel le promoteur dudit gène rne est supprimé, - introduction du plasmide obtenu à l'étape précédente dans une souche de E. coli comportant un système d'expression inductible, ainsi qu'une mutation chromosomique dans le gène rne conférant une propriété particulière à ladite souche de E. coli, telle que la mutation dite rnel (Ono and Kuwano, 1979) rendant la croissance de l'hôte thermosensible, et permettant de sélectionner l'acquisition de la mutation souhaitée du gène rne sur le chromosome de E. coli, - mise en culture des souches de E. coli ainsi transformées, et sélection des souches de E. coli possédant la propriété particulière susmentionnée, à savoir des clones résultant de la recombinaison homologue qui permet de remplacer ladite mutation chromosomique par la séquence homologue correspondant au gène rne muté dudit plasmide, notamment sélection des clones thermorésistants dans le cas où la mutation chromosomique est ladite mutation rnel, - élimination du plasmide des clones sélectionnés, et identification parmi ces clones de ceux comportant le gène rne muté susmentionné, notamment en analysant par électrophorèse la longueur du polypeptide RNase E tronqué, codé par le gène rne muté susmentionné, produit par les cellules mutantes de E. coli. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation d'une souche mutée de E. coli selon l'invention, et de son utilisation pour la production de polypeptides déterminés. 1) Construction d'un gène rne muté contenant un codon STOP au 586ème codon Cette position particulière a été choisie parce que la troncature ainsi créée dans la RNase E est formellement équivalente à celle qui résulte de la mutation spontanée smbB131 (rebaptisée ici rnel3l) obtenue par Kido et al (1996). Celleci est une délétion de 2 nucléotides au 586ème codon, entraînant un changement de phase de lecture suivie d'un arrêt après une traduction supplémentaire de 32 codons sans rapport avec la séquence normale de la RNase E. Pour construire un tel gène, le nucléotides G2196 de la séquence est substitué par T, créant un codon TAA (stop) aux nucléotides 2196-2198 de SEQ ID NO1 (cette mutation sera conventionnellement notée ici "G2196T"). Pour créer la substitution souhaitée, le gène rne sauvage est d'abord souscloné dans le 'phagemide' pEMBL8+ (Dente et al., 1983). Pour cela, on amplifie à partir du génome de E. coli la totalité de la séquence transcrite du gène rne à l'aide des amorces suivantes : SEQ ID NO 3 : 5' GGGCTGCAGTTTCCGTGTCCATCCTTG 3' (la séquence en gras correspond aux nucléotides (nt) 81-98 de SEQ ID NO 1 ; la séquence en italique est la séquence de reconnaissance de l'enzyme PstI), et SEQ ID NO 4 : 5' GGGAGATCITGATTACTTTGAGCTAA 3' (la séquence en gras est complémentaire aux nt 3630 à 3647 de SEQ ID NO 1; la séquence en italique est reconnue par l'enzyme BglII). Le fragment amplifié est alors digéré par les enzymes Bglll et PstI (ces enzymes n'ont pas de sites de coupure à l'intérieur de la séquence rne), puis inséré entre les sites BamHI et PstI de pEMBL8+ (rappelons que les sites BamHI et BglIII peuvent être ligaturés entre eux). On note que la séquence rne ainsi clonée est dépourvue de son promoteur. On élimine toute transcription parasite provenant du vecteur en introduisant ensuite dans le site PstI de la séquence obtenue, et dans le même sens que le gène rne, le fragment synthétique suivant: : SEQ ID NO 5 : CTGCAGATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTCTGCAG (la séquence en gras correspond à un terminateur transcriptionnel très efficace, celui de l'opéron tryptophane (Christie et al., 1981), et les extrémités en italique correspondent à la séquence reconnue par PstI). Ces précautions garantissent que la séquence rne portée par le plasmide ne peut être transcrite à partir de promoteurs plasmidiques, et donc que la RNase E ne peut être synthétisée à partir du plasmide. L'intérêt de ce point apparaîtra plus loin. Dans la suite, le plasmide ainsi obtenu est nommé pRNE. La substitution désirée (G->T) est alors introduite dans le plasmide pRNE en utilisant la méthode classique de mutagenèse dirigée décrite par Kunkel (Kunkel et al., 1987). Pour cela, le plasmide pRNE est introduit dans la souche RZ1032 (Hfr KL16 PO/45 (lysA61-62 dutl ungl thil relAl supE44 zbd- 279::Tn10). Les mutations dutl et ungl présentes dans cette souche provoquent l'incorporation de desoxyuridine (dU) au lieu de thymidine (T) dans l'ADN. Les cellules sont alors surinfectées par le phage M13 'helper' K07 (Pharmacia), ce qui provoque l'accumulation dans le milieu de 'phages' comportant la séquence de pRNE sous forme de simple brin, avec dU à la place de T. Après déprotéinisation, cette matrice simple brin est hybridée avec l'oligonucléotide synthétique suivant : SEQ ID NO 6 : GCGGTGGTTAAGAAACCAAAC correspondant aux positions 2188 à 2208 de SEQ ID NO 1 (le 'T' qu'on souhaite incorporer à la place de G est indiqué en gras), puis l'hybride est converti en ADN double brin par incubation avec la polymérase de Klenow. la ligase de T4, de l'ATP et les quatre dNTP (Kunkel et al., 1987). L'hybride double brin est alors introduit dans XL1, une souche de E. coli classiquement utilisée pour le clonage (Stratagene). Cette souche est sauvage pour les gènes dut et ung, et par conséquent le brin initial comportant dU à la place de T, sera dégradé. La grande majorité des colonies de XL1 obtenues comportent donc la mutation désirée dans le plasmide pRNE. Choisissant quatre candidats, on s'assure alors que la mutation souhaitée est bien présente et que le plasmide n'en comporte pas d'autre. Pour cela, on détermine à l'aide d'amorces oligonucléotidiques appropriées, la séquence de la région AflII-NruI (nt 1931-2345 de SEQ ID NO 1), et on sélectionne les candidats qui ne comportent dans cette région que la seule mutation souhaitée, à l'exclusion de toute autre modification. Le fragment AflII-NruI provenant d'un tel candidat est alors isolé et on le substitue au fragment AflII-NruI du plasmide pRNE initial (non mutagénisé). On obtient ainsi un plasmide comportant la mutation souhaitée ; plasmide est appelé par la suite pRNE-STOP. 2) Introduction de la mutation créant un stop au codon 586 de la RNase E, sur le chromosome de BL21 (DE3), souche exprimant l'ARN polymérase du bactériophage T7. Principe général. La mutation souhaitée (G2196T) ne produit pas de changement de phénotype par rapport au gène sauvage. Pour l'introduire sur le chromosome, on est donc conduit à procéder en deux étapes : introduit d'abord dans la RNase E une mutation faux-sens au codon 66 (mutation dite arns, ou rnel; Ono & Kuwano, 1979). Cette mutation correspond à la transition G636A, suivant la numérotation de SEQ ID NO 1 (McDowall et al., 1993). Elle diminue la stabilité thermique de la RNase E, empêchant la croissance à haute température. Ensuite, on introduit dans la souche obtenue le plasmide pRNE-stop, et on sélectionne les cellules qui peuvent à nouveau croître à haute température. Rappelons que le gène rne-stop porté par le plasmide, n'étant pas transcrit, ne peut conduire à la synthèse d'une RNase E fonctionnelle. Toutefois, grâce à une double recombinaison homologue, le plasmide peut apporter au gène rne chromosomique la séquence sauvage à la position 636 (mutation A636G), rétablissant du même coup la croissance à haute température. La région d'homologie entre le plasmide et la région rne chromosomique s'étendant sur près de 1500 nt en aval de la mutation G2196T portée par le plasmide, cette dernière mutation a une forte probabilité d'être transférée sur le chromosome en même temps que A636G. Le plasmide est ensuite éliminé; le résultat est une souche comportant la seule mutation G2196T dans le gène chromosomique de la RNase E. Préparation d'un dérivé rnel (ams) de la souche BL21 (DE3). BL21 (DE3) est l'hôte habituel des systèmes d'expression bactériens fondés sur la transcription de gènes hétérologues par la polymérase de T7 (Studier & Moffat, 1986). Les outils permettant d'introduire la mutation rne1 dans n'importe quel contexte génétique ont été décrits, en particulier pour BL21 (DE3) ses dérivés (Mudd et al., 1990b ; Iost & Dreyfus, 1995). En bref, on part d'une souche bactérienne (CH1828), comportant la mutation amslrnel ainsi qu'un gène de résistance à la tétracycline inséré dans un locus chromosomique (zce-726) situé à peu de distance du gène rne. Utilisant la technique classique dite de transduction par le bactériophage P1 (Silhavy et al., 1984), une région du chromosome de CH1828 longue de quelques dizaines de milliers de nucléotides et entourant le locus zce-726, est transférée dans BL21 (DE3), sélectionnant l'acquisition de la résistance à la tétracycline (TetR). Une forte proportion (environ 50%) de ces clones TetR montrent également une croissance thermosensible, ce qui indique qu'ils ont reçu également l'allèle rnel. La souche résultante est appelée BL21 (DE3)rne1. Introduction de la mutation G2196T sur le chromosome de BL21 (DE3) On transforme BL21(DE3)rne1 avec le plasmide pRNE-stop (et, à titre de contrôle, avec le plasmide pEMBL8+ de départ), puis après croissance en milieu liquide complet (milieu LB; (Miller, 1972)) à 30 C, on étale environ 105 bactéries sur des boîtes de Pétri contenant le même milieu gélosé, puis on incube à 42 C. Pour les bactéries contrôle, on n'observe aucune croissance après 24h (la mutation amslrnel ne reverse pas spontanément). Au contraire, les bactéries transformées avec pRNE-stop montrent un grand nombre de clones thermorésistants, provenant de la réversion de la mutation rne1 chromosomique grâce à la séquence sauvage apportée par le plasmide. On choisit alors une douzaine de ces clones thermorésistants, et on élimine le plasmide de ces candidats en les cultivant sans ampicilline pendant une vingtaine de générations en milieu LB liquide (42 C). L'ampicilline est nécessaire au maintien des plasmides dérivés de pEMBL8+; en son absence, le plasmide ségrège très facilement (Dreyfus, 1988). Après réisolement sur milieu LB gélosé des candidats ainsi traités, on vérifie la perte du plasmide en testant que les colonies individuelles ne peuvent plus croître en présence d'ampicilline. Reste à identifier ceux des révertants thermorésistants - la majorité - qui, en même temps que la séquence sauvage à la position 636, ont aussi acquis la mutation G2196T. On procède en deux étapes. D'abord, les candidats sont réisolés sur milieu minimum gélosé (nous utilisons le milieu M63B1 avec du glycérol pour source de carbone ; (Miller,1972)); à titre de témoins, la souche initiale BL21 (DE3) le mutant thermosensible BL21(DE3)rnel sont également étalés sur les mêmes boîtes. Celles-ci sont incubées à 43 C. La mutation G2196T provoque un faible retard de croissance dans ces conditions extrêmes; les recombinants recherchés conduisent donc à des colonies plus petites que les cellules BL21 (DE3) ce qui permet un premier crible pour la recherche de ces recombinants. Le test final fait appel à la détermination directe de la taille du polypeptide RNase E, grâce à la technique immunologique dite de 'Western' (Sambrook et al., 1989). En bref, on fait croître les différents candidats (ainsi que les deux témoins mentionnés ci-dessus) en milieu LB liquide. Quand la densité optique des cultures à 600 nm atteint 0. 5, on récolte les cellules. Celles- ci sont resuspendues dans un tampon phosphate et lysées par sonication. Après élimination des débris, on dose les protéines dans l'extrait cellulaire (Bradford, 1976), puis on soumet 20 g du mélange protéique à une électrophorèse suivant la technique de Laemmli (Laemmli, 1970), en utilisant un gel de polyacrylamide à 7,5%. Cette technique permet la séparation des protéines suivant leur taille. Après électrophorèse, le mélange protéique est électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose. On sature ensuite la membrane avec des protéines non spécifiques, puis on l'incube avec une dilution (1/10.000) d'un anticorps polyclonal contre la RNase E élevé chez le lapin. On détecte les régions de la membrane ayant fixé l'anticorps anti-RNase E, en incubant celle-ci avec un anticorps de chèvre élevé contre les IgG de lapin, et couplé à l'enzyme peroxydase. La présence de la peroxydase sur la membrane est elle même révélée grâce à la technique d'électrochimioluminescence (ECL), en utilisant un kit commercialisé par Amersham. Cette technique permet de déterminer à quelle position a migré le polypeptide RNase E synthétisé par chacun des candidats, et donc la taille de ce polypeptide. En particulier, la réduction de taille occasionnée par la mutation G2196T est immédiatement visible dans ces tests. Plus de la moitié des candidats thermorésistants obtenus dans cette expérience possèdent la mutation désirée. Cas particulier de la mutation rnel3l. Le protocole décrit ci-dessus a été aussi utilisé pour introduire sur le chromosome de BL21(DE3) les mutations spontanées (telle rne131) isolées par Kido et al., et conduisant également à la synthèse d'une RNase E tronquée. Toutefois, ces mutations étant dès le départ localisées sur le chromosome, le protocole s'en trouve simplifié. La souche BZ31 (Kido et al., 1996) porte la mutation rnel3l. Grâce à la transduction par le bactériophage P1 (Silhavy et al., 1984 ; voir plus haut) on transpose dans BL21(DE3)rnel la région du chromosome de BZ31 entourant le locus rne en sélectionnant les transductants capables de croître à 42 C. On vérifie ensuite que ces clones synthétisent bien un polypeptide RNase E tronqué en utilisant la technique de "Western" décrite ci-dessus. Tous les candidats essayés (6/6, ou 100%) ont acquis la modification désirée. Incidemment, on peut vérifier que, comme on s'y attend au vu de l'expérience de construction de BL21(DE)rne1, 50% des transductants thermorésistants ont aussi acquis le locus zce-726 sauvage et sont donc redevenus sensibles à la tétracycline (TetS). On choisit par la suite un candidat TetS, appelé BL21(DE3)rne131. 3) Utilisation des souches BL21(DE3)rneG2196T ou BL21(DE3)rne131 pour l'expression efficace de gènes placés sous le contrôle du promoteur T7. Principe. Les mutations rneG2196T ou rne131 provoquent la stabilisation globale des ARNm par un facteur 2 environ. Toutefois, cette stabilisation n'est pas uniforme pour tous les ARNm. En particulier, sans doute à cause des propriétés particulières de l'ARN polymérase de T7 (cette enzyme a une vitesse d'élongation bien plus élevée que celle des ribosomes qui traduisent le message; voir ci-dessus), les ARNm synthétisés par cette enzyme semblent d'avantage stabilisés que la plupart des ARNm cellulaires. Il en résulte que la proportion des protéines totales constituée par les produits de ces ARNm particuliers, s'accroît lorsque qu'une mutation telle que rneG2196T ou rne131 est présente dans la cellule. Cette observation est à la base de la présente invention. Nous donnons ci-dessous quelques exemples. Evaluation quantitative de l'invention: le gène lacZ comme système modèle. Voici quelques années, les Inventeurs ont décrit la construction d'un dérivé de BL21 (DE3), appeléENS134, qui comporte une copie du gène lacZ insérée dans la région malA du chromosome (Iost & Dreyfus, 1995; Lopez et al., 1994). Ce gène, qui code pour un enzyme de E. coli - la B-galactosidase - dont l'expression est particulièrement facile à quantifier (Miller, 1972), est placé sous le contrôle du promoteur T7. Il est suivi par un gène codant pour un ARNt particulier, l'ARNtArg5 de E. coli, dont l'expression donne une mesure commode du niveau de transcription (Lopez et al., 1994). Ce système bien défini permet des mesures particulièrement reproductibles sur la stabilité d'un ARNm particulier synthétisé par la polymérase de T7, ainsi que sur le rendement polypeptidique correspondant. A titre de test, la mutation rne131 a été introduite dans ENS134 comme décrit ci dessus pour BL21 (DE3). avons fait croître les cellules de ENS134 ou de son dérivé portant la mutation à 37 C En ce qui concerne le milieu de culture, nous avons utilisé un milieu synthétique riche ou un milieu minimum (Neidhart et al., 1974), en présence d'IPTG (isopropyl ss-Dthiogalactopyranoside ; il s'agit d'un inducteur dont la présence est nécessaire à la synthèse de polymérase de T7 dans BL21(DE3); Studier & Moffat, 1986). On récolte les cellules en phase exponentielle, on les lyse par sonication, et on dose la B-galactosidase dans l'extrait cellulaire, soit en mesurant l'activité enzymatique, soit en examinant l'abondance du polypeptide B-galactosidase par électrophorèse suivant Laemmli. On observe que la présence de la mutation augmente l'expression de la B-galactosidase par un facteur 25 environ en milieu riche, ou 80 en milieu minimum acétate, sans que le niveau de transcription du gène en soit affecté. Ce résultat, obtenu avec un système modèle, illustre les possibilités de l'invention. Expression de gènes eucaryotes clonés chez E. coli. Dans les systèmes d'expression basés sur les propriétés de la polymérase de T7, le gène à exprimer - généralement un gène eucaryote - est fusionné en aval du promoteur T7 et d'un site de fixation de ribosome (RBS) permettant la traduction chez E. coli. L'ensemble est inséré dans un plasmide multicopie dérivé de pBR322, appelé pET, et placé dans la souche BL21 (DE3) dans l'un de ses dérivés (Dubendorff & Studier, 1991 ; & Moffat, 1986; Studier et al., 1990). Comme ci-dessus, l'expression du gène à exprimer - le gène 'cible' - est déclenchée par ajout de l'inducteur IPTG au milieu de culture, qui provoque la synthèse de polymérase de T7. Toutefois, au contraire du système modèle décrit ci-dessus, l'induction par l'IPTG ne peut être ici que transitoire, parce que la transcription du gène à partir du promoteur T7 est si active qu'elle tue les cellules lorsque ce promoteur est présent sur un plasmide multicopie. On a introduit dans BL21 (DE3), dans BL21(DE3)rnel3l ou BL21(DE3)rneG2196T des plasmides pET comprenant un certain nombre de gènes eucaryotes, à savoir le gène Krox-20 impliqué dans le développement précoce de la souris (Vesque & Charnay, 1992), le gène engrailed-2 impliqué dans la morphogenèse de l'embryon de poulet (Logan et al., 1992), le gène codant pour la protéase de HTLV1, un rétrovirus humain (Malik et al., 1988), ainsi que deux gènes codant pour des facteurs (SF1 et MUD2) impliqués dans l'épissage des introns chez la levure Saccharomyces cerevisiae (produits des phases ouvertes YLR116W et YKL074C, respectivement; voir Saccharomyces Genome database, Stanford University). On a fait croître les cellules jusqu'à une D0600 d'environ 0. 5, puis on ajoute l'IPTG. Les cellules ont été récoltées quatre heures plus tard. On réalise alors un extrait cellulaire qu'on analyse par électrophorèse, comme décrit ci-dessus. Dans les trois premiers cas, pour lesquels on dispose d'anticorps spécifiques, la détection du produit du gène 'cible' se fait par la technique de 'Western' (les anticorps polyclonaux et monoclonaux élevés contre Krox-20 et engrailed-2, respectivement, ont été décrits : (Patel et al., 1989 ; Vesque & Charnay, 1992)); dans les deux derniers cas, on compare simplement le profil des protéines totales, colorées au bleu de Coomassie, avant et après induction par l'IPTG. Dans ces cinq cas, on observe que le produit du gène 'cible' est trois à dix fois plus abondant lorsque l'hôte est BL21(DE3)rne131 plutôt que BL21(DE3). Bibliographie Babitzke, P. & Kushner, S. R. (1991). The ams (altered mRNA stability) protein and ribonuclease E are encoded by the same structural gene of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,1-5. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. 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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM : (B) RUE: 3, rue Michel-Ange (C) VILLE : PARIS(E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL : CEDEX 16 (ii) TITRE DE L' INVENTION : Souches mutantes de E. coli, et leur utilisation pour la production de polypeptides recombinants (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 3661 paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 441..3623 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 1 : GAAAAAACTG TGAGTAAGCG GGTGATAAAT GGTAAAAGTC ATCTTGCTAT AACAAGGCTT 60 GCAGTGGAAT AATGAGGCCG TTTCCGTGTC CATCCTTGTT AAAACAAGAA ATTTTACGGA 120 ATAACCCATT TTGCCCGACC GATCATCCAC GCAGCAATGG CGTAAGACGT ATTGATCTTT 180 CAGGCAGTTA GCGGGCTGCG GGTTGCAGTC CTTACCGGTA GATGGAAATA TTTCTGGAGA 240 GTAATACCCA GTCTGTTTCT TGTATAATTG CGCTGTTTTT CCGCATGAAA AACGGGCAAC 300 CGACACTCTG CGCCTCTTTG AGCTGACGAT AACCGTGAGG TTGGCGACGC GACTAGACAC 360 GAGGCCATCG GTTCACACCC GGAAAGGCGT TACTTTGCCC GCAGCTTAGT CGTCAATGTA 420 AGAATAATGA GTAAGTTACG ATG AAA AGA ATG TTA ATC AAC GCA ACT CAG 470 Met Lys Arg Met Leu Ile Asn Ala Thr Gln 1 5 10 CAG GAA GAG TTG CGC GTT GCC CTT GTA GAT GGG CAG CGT CTG TAT GAC 518 Gln Glu Glu Leu Arg Val Ala Leu Val Asp Gly Gln Arg Leu Tyr Asp 15 20 25 CTG GAT ATC GAA AGT CCA GGG CAC GAG CAG AAA AAG GCA AAC ATC TAC 566 Leu Asp Ile Glu Ser Pro Gly His Glu Gln Lys Lys Ala Asn Ile Tyr 30 35 40 AAA GGT AAA ATC ACC CGC ATT GAA CCG AGT CTG GAA GCT GCT TTT GTT 614 Lys Gly Lys Ile Thr Arg Ile Glu Pro Ser Leu Glu Ala Ala Phe Val 45 50 55 GAT TAC GGC GCT GAA CGT CAC GGT TTC CTC CCA CTA AAA GAA ATT GCC 662 Asp Tyr Gly Ala Glu Arg His Gly Phe Leu Pro Leu Lys Glu Ile Ala 60 65 70 CGC GAA TAT TTC CCT GCT AAC TAC AGT GCT CAT GGT CGT CCC AAC ATT 710 Arg Glu Tyr Phe Pro Ala Asn Tyr Ser Ala His Gly Arg Pro Asn Ile 75 80 85 90 AAA GAT GTG TTG CGT GAA GGT CAG GAA GTC ATT GTT CAG ATC GAT AAA 758 Lys Asp Val Leu Arg Glu Gly Gln Glu Val Ile Val Gln Ile Asp Lys 95 100 105 GAA GAG CGC GGC AAC AAA GGC GCG GCA TTA ACC ACC TTT ATC AGT CTG 806 Glu Glu Arg Gly Asn Lys Gly Ala Ala Leu Thr Thr Phe Ile Ser Leu 110 115 120 GCG GGT AGC TAT CTG GTT CTG ATG CCG AAC AAC CCG CGC GCG GGT GGC 854 Ala Gly Ser Tyr Leu Val Leu Met Pro Asn Asn Pro Arg Ala Gly Gly 125 130 135 ATT TCT CGC CGT ATC GAA GGC GAC GAC CGT ACC GAA TTA AAA GAA GCA 902 Ile Ser Arg Arg Ile Glu Gly Asp Asp Arg Thr Glu Leu Lys Glu Ala 140 145 150 CTG GCA AGC CTT GAA CTG CCG GAA GGC ATG GGG CTT ATC GTG CGC ACC 950 Leu Ala Ser Leu Glu Leu Pro Glu Gly Met Gly Leu Ile Val Arg Thr 155 160 165 170 GCT GGC GTC GGC AAA TCT GCT GAG GCG CTG CAA TGG GAT TTA AGC TTC 998 Ala Gly Val Gly Lys Ser Ala Glu Ala Leu Gln Trp Asp Leu Ser Phe 175 180 185 CGT CTG AAA CAC TGG GAA GCC ATC AAA AAA GCC GCT GAA AGC CGC CCG 1046 Arg Leu Lys His Trp Glu Ala Ile Lys Lys Ala Ala Glu Ser Arg Pro 190 195 200 GCC CCG TTC CTG ATT CAT CAG GAG AGC AAC GTA ATC GTT CGC GCA TTC 1094 Ala Pro Phe Leu Ile His Gln Glu Ser Asn Val Ile Val Arg Ala Phe 205 210 215 CGC GAT TAC TTA CGT CAG GAC ATC GGC GAA ATC CTT ATC GAT AAC CCG 1142 Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Asp Ile Gly Glu Ile Leu Ile Asp Asn Pro 220 225 230 AAA GTG CTC GAA CTG GCA CGT CAG CAT ATC GCT GCA TTA GGT CGC CCG 1190 Lys Val Leu Glu Leu Ala Arg Gln His Ile Ala Ala Leu Gly Arg Pro 235 240 245 250 GAT TTC AGC AGC AAA ATC AAA CTG TAC ACC GGC GAG ATC CCG CTG TTC 1238 Asp Phe Ser Ser Lys Ile Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ile Pro Leu Phe 255 260 265 AGC CAC TAC CAG ATC GAG TCA CAG ATC GAG TCC GCC TTC CAG CGT GAA 1286 Ser His Tyr Gln Ile Glu Ser Gln Ile Glu Ser Ala Phe Gln Arg Glu 270 275 280 GTT CGT CTG CCG TCT GGT GGT TCC ATT GTT ATC GAC AGC ACC GAA GCG 1334 Val Arg Leu Pro Ser Gly Gly Ser Ile Val Ile Asp Ser Thr Glu Ala 285 290 295 TTA ACG GCC ATC GAC ATC AAC TCC GCA CGC GCG ACC CGC GGC GGC GAT 1382 Leu Thr Ala Ile Asp Ile Asn Ser Ala Arg Ala Thr Arg Gly Gly Asp 300 305 310 ATC GAA GAA ACC GCG TTT AAC ACT AAC CTC GAA GCT GCC GAT GAG ATT 1430 Ile Glu Glu Thr Ala Phe Asn Thr Asn Leu Glu Ala Ala Asp Glu Ile 315 320 325 330 GCT CGT CAG CTG CGC CTG CGT GAC CTC GGC GGC CTG ATT GTT ATC GAC 1478 Ala Arg Gln Leu Arg Leu Arg Asp Leu Gly Gly Leu Ile Val Ile Asp 335 340 345 TTC ATC GAC ATG ACG CCA GTA CGC CAC CAG CGT GCG GTA GAA AAC CGT 1526 Phe Ile Asp Met Thr Pro Val Arg His Gln Arg Ala Val Glu Asn Arg 350 355 360 CTG CGT GAA GCG GTG CGT CAG GAC CGT GCG CGT ATT CAA ATC AGC CAT 1574 Leu Arg Glu Ala Val Arg Gln Asp Arg Ala Arg Ile Gln Ile Ser His 365 370 375 ATT TCT CGC TTT GGC CTG CTG GAA ATG TCC CGT CAG CGC CTG AGC CCA 1622 Ile Ser Arg Phe Gly Leu Leu Glu Met Ser Arg Gln Arg Leu Ser Pro 380 385 390 TCA CTG GGT GAA TCC AGT CAT CAC GTT TGT CCG CGT TGT TCT GGT ACT 1670 Ser Leu Gly Glu Ser Ser His His Val Cys Pro Arg Cys Ser Gly Thr 395 400 405 410 GGC ACC GTG CGT GAC AAC GAA TCG CTG TCG CTC TCT ATT CTG CGT CTG 1718 Gly Thr Val Arg Asp Asn Glu Ser Leu Ser Leu Ser Ile Leu Arg Leu 415 420 425 ATC GAA GAA GAA GCG CTG AAA GAG AAC ACC CAG GAA GTT CAC GCC ATT 1766 Ile Glu Glu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Thr Gln Glu Val His Ala Ile 430 435 440 GTT CCT GTG CCA ATC GCT TCT TAC CTG CTG AAT GAA AAA CGT TCT GCG 1814 Val Pro Val Pro Ile Ala Ser Tyr Leu Leu Asn Glu Lys Arg Ser Ala 445 450 455 GTA AAT GCC ATT GAA ACT CGT CAG GAC GGT GTG CGC TGT GTA ATT GTG 1862 Val Asn Ala Ile Glu Thr Arg Gln Asp Gly Val Arg Cys Val Ile Val 460 465 470 CCA AAC GAT CAG ATG GAA ACC CCG CAC TAC CAC GTG CTG CGC GTG CGT 1910 Pro Asn Asp Gln Met Glu Thr Pro His Tyr His Val Leu Arg Val Arg 475 480 485 490 AAA GGG GAA GAA ACC CCA ACC TTA AGC TAC ATG CTG CCG AAG CTG CAT 1958 Lys Gly Glu Glu Thr Pro Thr Leu Ser Tyr Met Leu Pro Lys Leu His 495 500 505 GAA GAA GCG ATG GCG CTG CCG TCT GAA GAA GAG TTC GCT GAA CGT AAG 2006 Glu Glu Ala Met Ala Leu Pro Ser Glu Glu Glu Phe Ala Glu Arg Lys 510 515 520 CGT CCG GAA CAA CCT GCG CTG GCA ACC TTT GCC ATG CCG GAT GTG CCG 2054 Arg Pro Glu Gln Pro Ala Leu Ala Thr Phe Ala Met Pro Asp Val Pro 525 530 535 CCT GCG CCA ACG CCA GCT GAA CCT GCC GCG CCT GTT GTA GCT CCA GCA 2102 Pro Ala Pro Thr Pro Ala Glu Pro Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala 540 545 550 CCG AAA GCT GCA CCG GCA ACA CCA GCA GCT CCT GCA CAA CCT GGG CTG 2150 Pro Lys Ala Ala Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gln Pro Gly Leu 555 560 565 570 TTG AGC CGC TTC TTC GGC GCA CTG AAA GCG CTG TTC AGC GGT GGT GAA 2198 Leu Ser Arg Phe Phe Gly Ala Leu Lys Ala Leu Phe Ser Gly Gly Glu 575 580 585 GAA ACC AAA CCG ACC GAG CAA CCA GCA CCG AAA GCA GAA GCG AAA CCG 2246 Glu Thr Lys Pro Thr Glu Gln Pro Ala Pro Lys Ala Glu Ala Lys Pro 590 595 600 GAA CGT CAA CAG GAT CGT CGC AAG CCTCGT CAG AAC AAC CGC CGT GAC 2294 Glu Arg Gln Gln Asp Arg Arg Lys Pro Arg Gln Asn Asn Arg Arg Asp 605 610 615 CGT AAT GAG CGC CGC GAC ACC CGT AGT GAA CGT ACT GAA GGC AGC GAT 2342 Arg Asn Glu Arg Arg Asp Thr Arg Ser Glu Arg Thr Glu Gly Ser Asp 620 625 630 AAT CGC GAA GAA AAC CGT CGT AAT CGT CGC CAG GCA CAG CAG CAG ACT 2390 Asn Arg Glu Glu Asn Arg Arg Asn Arg Arg Gln Ala Gln Gln Gln Thr 635 640 645 650 GCC GAG ACG CGT GAG AGC CGT CAG CAG GCT GAG GTA ACG GAA AAA GCG 2438 Ala Glu Thr Arg Glu Ser Arg Gln Gln Ala Glu Val Thr Glu Lys Ala 655 660 665 CGT ACC GCC GAC GAG CAG CAA GCG CCG CGT CGT GAA CGT AGC CGC CGC 2486 Arg Thr Ala Asp Glu Gln Gln Ala Pro Arg Arg Glu Arg Ser Arg Arg 670 675 680 CGT AAT GAT GAT AAA CGT CAG GCG CAA CAA GAA GCG AAG GCG CTG AAT 2534 Arg Asn Asp Asp Lys Arg Gln Ala Gln Gln Glu Ala Lys Ala Leu Asn 685 690 695 GTT GAA GAG CAA TCT GTT CAG GAA ACC GAA CAG GAA GAA CGT GTA CGT 2582 Val Glu Glu Gln Ser Val Gln Glu Thr Glu Gln Glu Glu Arg Val Arg 700 705 710 CCG GTT CAG CCG CGT CGT AAA CAG CGT CAG CTC AAT CAG AAA GTG CGT 2630 Pro Val Gln Pro Arg Arg Lys Gln Arg Gln Leu Asn Gln Lys Val Arg 715 720 725 730 TAC GAG CAA AGC GTA GCC GAA GAA GCG GTA GTC GCA CCG GTG GTT GAA 2678 Tyr Glu Gln Ser Val Ala Glu Glu Ala Val Val Ala Pro Val Val Glu 735 740 745 GAA ACT GTC GCT GCC GAA CCA ATT GTT CAG GAA GCG CCA GCT CCA CGC 2726 Glu Thr Val Ala Ala Glu Pro Ile Val Gln Glu Ala Pro Ala Pro Arg 750 755 760 ACA GAA CTG GTG AAA GTC CCG CTG CCA GTC GTA GCG CAA ACT GCA CCA 2774 Thr Glu Leu Val Lys Val Pro Leu Pro Val Val Ala Gln Thr Ala Pro 765 770 775 GAA CAG CAA GAA GAG AAC AAT GCT GAT AAC CGT GAC AAC GGT GGC ATG 2822 Glu Gln Gln Glu Glu Asn Asn Ala Asp Asn Arg Asp Asn Gly Gly Met 780 785 790 CCG CGT CGT TCT CGC CGC TCG CCT CGT CAC CTG CGC GTA AGT GGT CAG 2870 Pro Arg Arg Ser Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Arg Val Ser Gly Gln 795 800 805 810 CGT CGT CGT CGC TAT CGT GAC GAG CGT TAT CCA ACC CAG TCG CCA ATG 2918 Arg Arg Arg Arg Tyr Arg Asp Glu Arg Tyr Pro Thr Gln Ser Pro Met 815 820 825 CCG TTG ACC GTA GCG TGC GCG TCT CCG GAA CTG GCC TCT GGC AAA GTC 2966 Pro Leu Thr Val Ala Cys Ala Ser Pro Glu Leu Ala Ser Gly Lys Val 830 835 840 TGG ATC CGC TAT CCA ATT GTA CGT CCG CAA GAT GTA CAG GTT GAA GAG 3014 Trp Ile Arg Tyr Pro Ile Val Arg Pro Gln Asp Val Gln Val Glu Glu 845 850 855 CAG CGC GAA CAG GAA GAA GTA CAT GTG CAG CCG ATG GTG ACT GAG GTC 3062 Gln Arg Glu Gln Glu Glu Val His Val Gln Pro Met Val Thr Glu Val 860 865 870 CCT GTC GCC GCC GCT ATC GAA CCG GTT GTT AGC GCG CCA GTT GTT GAA 3110 Pro Val Ala Ala Ala Ile Glu Pro Val Val Ser Ala Pro Val Val Glu 875 880 885 890 GAA GTG GCC GGT GTC GTA GAA GCC CCC GTT CAG GTT GCC GAA CCG CAA 3158 Glu Val Ala Gly Val Val Glu Ala Pro Val Gln Val Ala Glu Pro Gln 895 900 905 CCG GAA GTG GTT GAA ACG ACG CAT CCT GAA GTG ATC GCT GCC GCG GTA 3206 Pro Glu Val Val Glu Thr Thr His Pro Glu Val Ile Ala Ala Ala Val 910 915 920 ACT GAA CAG CCG CAG GTG ATT ACC GAG TCT GAT GTT GCC GTA GCC CAG 3254 Thr Glu Gln Pro Gln Val Ile Thr Glu Ser Asp Val Ala Val Ala Gln 925 930 935 GAA GTT GCA GAA CAA GCA GAA CCG GTG GTT GAA CCG CAG GAA GAG ACG 3302 Glu Val Ala Glu Gln Ala Glu Pro Val Val Glu Pro Gln Glu Glu Thr 940 945 950 GCA GAT ATT GAA GAA GTT GTC GAA ACT GCT GAG GTT GTA GTT GCT GAA 3350 Ala Asp Ile Glu Glu Val Val Glu Thr Ala Glu Val Val Val Ala Glu 955 960 965 970 CCT GAA GTT GTT GCT CAA CCT GCC GCG CCA GTA GTC GCT GAA GTC GCA 3398 Pro Glu Val Val Ala Gln Pro Ala Ala Pro Val Val Ala Glu Val Ala 975 980 985 GCA GAA GTT GAA ACG GTA GCT GCG GTC GAA CCT GAG GTC ACC GTT GAG 3446 Ala Glu Val Glu Thr Val Ala Ala Val Glu Pro Glu Val Thr Val Glu 990 995 1000 CAT AAC CAC GCT ACC GCG CCA ATG ACG CGC GCT CCA GCA CCG GAA TAT 3494 His Asn His Ala Thr Ala Pro Met Thr Arg Ala Pro Ala Pro Glu Tyr 1005 1010 1015 GTT CCG GAG GCA CCG CGT CAC AGT GAC TGG CAG CGC CCT ACT TTT GCC 3542 Val Pro Glu Ala Pro Arg His Ser Asp Trp Gln Arg Pro Thr Phe Ala 1020 1025 1030 TTC GAA GGT AAA GGT GCC GCA GGT GGT CAT ACG GCA ACA CAT CAT GCC 3590 Phe Glu Gly Lys Gly Ala Ala Gly Gly His Thr Ala Thr His His Ala 1035 1040 1045 1050 TCT GCC GCT CCT GCG CGT CCG CAA CCT GTT GAG TAATAATTAG CTCAAAGTAA 3643 Ser Ala Ala Pro Ala Arg Pro Gln Pro Val Glu 1055 1060 TCAAGCCCTG GTAACTGC 3661 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 1061 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 2 : Met Lys Arg Met Leu Ile Asn Ala Thr Gln Gln Glu Glu Leu Arg Val 1 5 10 15 Ala Leu Val Asp Gly Gln Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ile Glu Ser Pro 20 25 30 Gly His Glu Gln Lys Lys Ala Asn Ile Tyr Lys Gly Lys Ile Thr Arg 35 40 45 Ile Glu Pro Ser Leu Glu Ala Ala Phe Val Asp Tyr Gly Ala Glu Arg 50 55 60 His Gly Phe Leu Pro Leu Lys Glu Ile Ala Arg Glu Tyr Phe Pro Ala 65 70 75 80 Asn Tyr Ser Ala His Gly Arg Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Arg Glu 85 90 95 Gly Gln Glu Val Ile Val Gln Ile Asp Lys Glu Glu Arg Gly Asn Lys 100 105 110 Gly Ala Ala Leu Thr Thr Phe Ile Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Leu Met Pro Asn Asn Pro Arg Ala Gly Gly Ile Ser Arg Arg Ile Glu 130 135 140 Gly Asp Asp Arg Thr Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ala Ser Leu Glu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Gly Met Gly Leu Ile Val Arg Thr Ala Gly Val Gly Lys Ser 165 170 175 Ala Glu Ala Leu Gln Trp Asp Leu Ser Phe Arg Leu Lys His Trp Glu 180 185 190 Ala Ile Lys Lys Ala Ala Glu Ser Arg Pro Ala Pro Phe Leu Ile His 195 200 205 Gln Glu Ser Asn Val Ile Val Arg Ala Phe Arg Asp Tyr Leu Arg Gln 210 215 220 Asp Ile Gly Glu Ile Leu Ile Asp Asn Pro Lys Val Leu Glu Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln His Ile Ala Ala Leu Gly Arg Pro Asp Phe Ser Ser Lys Ile 245 250 255 Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ile Pro Leu Phe Ser His Tyr Gln Ile Glu 260 265 270 Ser Gln Ile Glu Ser Ala Phe Gln Arg Glu Val Arg Leu Pro Ser Gly 275 280 285 Gly Ser Ile Val Ile Asp Ser Thr Glu Ala Leu Thr Ala Ile Asp Ile 290 295 300 Asn Ser Ala Arg Ala Thr Arg Gly Gly Asp Ile Glu Glu Thr Ala Phe 305 310 315 320 Asn Thr Asn Leu Glu Ala Ala Asp Glu Ile Ala Arg Gln Leu Arg Leu 325 330 335 Arg Asp Leu Gly Gly Leu Ile Val Ile Asp Phe Ile Asp Met Thr Pro 340 345 350 Val Arg His Gln Arg Ala Val Glu Asn Arg Leu Arg Glu Ala Val Arg 355 360 365 Gln Asp Arg Ala Arg Ile Gln Ile Ser His Ile Ser Arg Phe Gly Leu 370 375 380 Leu Glu Met Ser Arg Gln Arg Leu Ser Pro Ser Leu Gly Glu Ser Ser 385 390 395 400 His His Val Cys Pro Arg Cys Ser Gly Thr Gly Thr Val Arg Asp Asn 405 410 415 Glu Ser Leu Ser Leu Ser Ile Leu Arg Leu Ile Glu Glu Glu Ala Leu 420 425 430 Lys Glu Asn Thr Gln Glu Val His Ala Ile Val Pro Val Pro Ile Ala 435 440 445 Ser Tyr Leu Leu Asn Glu Lys Arg Ser Ala Val Asn Ala Ile Glu Thr 450 455 460 Arg Gln Asp Gly Val Arg Cys Val Ile Val Pro Asn Asp Gln Met Glu 465 470 475 480 Thr Pro His Tyr His Val Leu Arg Val Arg Lys Gly Glu Glu Thr Pro 485 490 495 Thr Leu Ser Tyr Met Leu Pro Lys Leu His Glu Glu Ala Met Ala Leu 500 505 510 Pro Ser Glu Glu Glu Phe Ala Glu Arg Lys Arg Pro Glu Gln Pro Ala 515 520 525 Leu Ala Thr Phe Ala Met Pro Asp Val Pro Pro Ala Pro Thr Pro Ala 530 535 540 Glu Pro Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala 545 550 555 560 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gln Pro Gly Leu Leu Ser Arg Phe Phe Gly 565 570 575 Ala Leu Lys Ala Leu Phe Ser Gly Gly Glu Glu Thr Lys Pro Thr Glu 580 585 590 Gln Pro Ala Pro Lys Ala Glu Ala Lys Pro Glu Arg Gln Gln Asp Arg 595 600 605 Arg Lys Pro Arg Gln Asn Asn Arg Arg Asp Arg Asn Glu Arg Arg Asp 610 615 620 Thr Arg Ser Glu Arg Thr Glu Gly Ser Asp Asn Arg Glu Glu Asn Arg 625 630 635 640 Arg Asn Arg Arg Gln Ala Gln Gln Gln Thr Ala Glu Thr Arg Glu Ser 645 650 655 Arg Gln Gln Ala Glu Val Thr Glu Lys Ala Arg Thr Ala Asp Glu Gln 660 665 670 Gln Ala Pro Arg Arg Glu Arg Ser Arg Arg Arg Asn Asp Asp Lys Arg 675 680 685 Gln Ala Gln Gln Glu Ala Lys Ala Leu Asn Val Glu Glu Gln Ser Val 690 695 700 Gln Glu Thr Glu Gln Glu Glu Arg Val Arg Pro Val Gln Pro Arg Arg 705 710 715 720 Lys Gln Arg Gln Leu Asn Gln Lys Val Arg Tyr Glu Gln Ser Val Ala 725 730 735 Glu Glu Ala Val Val Ala Pro Val Val Glu Glu Thr Val Ala Ala Glu 740 745 750 Pro Ile Val Gln Glu Ala Pro Ala Pro Arg Thr Glu Leu Val Lys Val 755 760 765 Pro Leu Pro Val Val Ala Gln Thr Ala Pro Glu Gln Gln Glu Glu Asn 770 775 780 Asn Ala Asp Asn Arg Asp Asn Gly Gly Met Pro Arg Arg Ser Arg Arg 785 790 795 800 Ser Pro Arg His Leu Arg Val Ser Gly Gln Arg Arg Arg Arg Tyr Arg 805 810 815 Asp Glu Arg Tyr Pro Thr Gln Ser Pro Met Pro Leu Thr Val Ala Cys 820 825 830 Ala Ser Pro Glu Leu Ala Ser Gly Lys Val Trp Ile Arg Tyr Pro Ile 835 840 845 Val Arg Pro Gln Asp Val Gln Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Glu 850 855 860 Val His Val Gln Pro Met Val Thr Glu Val Pro Val Ala Ala Ala Ile 865 870 875 880 Glu Pro Val Val Ser Ala Pro Val Val Glu Glu Val Ala Gly Val Val 885 890 895 Glu Ala Pro Val Gln Val Ala Glu Pro Gln Pro Glu Val Val Glu Thr 900 905 910 Thr His Pro Glu Val Ile Ala Ala Ala Val Thr Glu Gln Pro Gln Val 915 920 925 Ile Thr Glu Ser Asp Val Ala Val Ala Gin Glu Val Ala Glu Gln Ala 930 935 940 Glu Pro Val Val Glu Pro Gln Glu Glu Thr Ala Asp Ile Glu Glu Val 945 950 955 960 Val Glu Thr Ala Glu Val Val Val Ala Glu Pro Glu Val Val Ala Gin 965 970 975 Pro Ala Ala Pro Val Val Ala Glu Val Ala Ala Glu Val Glu Thr Val 980 985 990 Ala Ala Val Glu Pro Glu Val Thr Val Glu His Asn His Ala Thr Ala 995 1000 1005 Pro Met Thr Arg Ala Pro Ala Pro Glu Tyr Val Pro Glu Ala Pro Arg 1010 1015 1020 His Ser Asp Trp Gln Arg Pro Thr Phe Ala Phe Glu Gly Lys Gly Ala 1025 1030 1035 1040 Ala Gly Gly His Thr Ala Thr His His Ala Ser Ala Ala Pro Ala Arg 1045 1050 1055 Pro Gln Pro Val Glu 1060 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 27paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 3 : GGGCTGCAGT TTCCGTGTCC ATCCTTG 27 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : acidenucléique (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 4 : GGGAGATCTT GATTACTTTG AGCTAA 26 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 5 : CTGCAGATAG CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTCTGC AG 42 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 21 paires de bases (B) TYPE : nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 6 : GCGGTGGTTA AGAAACCAAA C 21 REVENDICATIONS 1. Utilisation de souches de Escherichia coli (E. coli) dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARN messagers (ARNm), cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli, pour la mise en #uvre d'un procédé de production de polypeptides (ou protéines) recombinants exogènes déterminés. 2. Utilisation de souches de E. coli selon la revendication 1, caractérisée en ce que le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté conserve l'activité de maturation de l'ARN ribosomal (ARNr) de la RNase E, mais ne possède plus l'activité de dégradation de l'ARNm. 3. Utilisation de souches de E. coli selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la mutation consiste en la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région du gène codant pour la partie C-terminale de la RNase E. 4. Utilisation de souches de E. coli selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mutation correspond à la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région délimitée par le nucléotide situé à la position 1935 et le nucléotide situé en position 3623 de la séquence d'ADN codant la RNase E représentée par SEQ ID NO 1. 5. Utilisation de souches de E. coli selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la mutation provoque la modification ou la délétion d'au moins un aminoacide de la partie C-terminale de la RNase E. 6. Utilisation de souches de E. coli selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la mutation provoque la délétion d'au moins un jusqu'à la totalité des 563 derniers aminoacides de la séquence de la RNase E représentée par SEQ ID NO 2. 7. Utilisation de souches de E. coli selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la mutation correspond à la substitution de la guanine G en position 2196 de SEQ ID NO 1, par une thymidine T, de manière à créer un codon stop TAA situé aux positions 2196 à 2198 de SEQ ID NO 1. 8. Utilisation de souches de E. coli selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdites souches contiennent un système d'expression inductible exogène, sous le contrôle duquel est placée l'expression des polypeptides recombinants déterminés, notamment le système d'expression utilisant l' ARN polymérase du bactériophage T7. 9. Souches de E. coli transformées de manière à ce qu'elles contiennent un système d'expression inductible exogène, et dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARNm, cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli. 10. Souches de E. coli selon la revendication 9, transformées de manière à ce qu'elles contiennent un système d'expression inductible exogène, et dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté conserve l'activité de maturation de l'ARNr de la RNase E, mais ne possède plus l'activité de cette dernière de dégradation de l'ARNm. 11. Souches de E. coli selon la revendication 9 ou 10, caractérisées en ce que le système d'expression inductible utilise l'ARN polymérase du bactériophage T7. 12 Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisées en ce que la mutation consiste en la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région du gène codant pour la partie C-terminale de la RNase E. 13. Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisées en ce que la mutation correspond à la substitution ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides de la région délimitée par le nucléotide situé à la position 1935 et le nucléotide situé en position 3623 de la séquence d'ADN codant la RNase E représentée par SEQ ID NO 1. 14. Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisées en ce que la mutation provoque la modification ou la délétion d'au moins un aminoacide de la partie C-terminale de la RNase E. 15. Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisées en ce que la mutation provoque la délétion d'au moins un jusqu' à la totalité des 563 derniers aminoacides de la séquence de la RNase E représentée par SEQ ID NO 2. 16. Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 15, caractérisées en ce que la mutation correspond à la substitution de la guanine G en position 2196 de SEQ ID NO 1, par une thymidine T, de manière à créer un codon stop TAA situé aux positions 2196 à 2198 de SEQ ID NO 1. 17. Souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 16, caractérisées en ce que le système d'expression inductible contrôle la transcription d'une séquence d'ADN codant un ou plusieurs polypeptides recombinants déterminés. 18. Procédé de production de polypeptides recombinants déterminés, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de transformation de souches de E. coli dont le gène codant la RNase E comporte une mutation telle que l'enzyme produite lors de l'expression de ce gène muté ne possède plus l'activité de dégradation des ARNm, cette mutation n'affectant pas significativement la croissance desdites souches de E. coli, avec un vecteur, notamment un plasmide, contenant la séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants, - la mise en culture des souches de E. coli transformées obtenues lors de l'étape précédente, pendant un temps suffisant pour permettre l'expression du ou des polypeptides recombinants dans les cellules de E. coli, - et la récupération du ou des polypeptides recombinants produits lors de l'étape précédente, le cas échéant après purification de ces derniers, notamment par chromatographie, électrophorèse, ou précipitation sélective. 19. Procédé de production de polypeptides recombinants déterminés selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de transformation de souches de E. coli selon l'une des revendications 9 à 16, avec un vecteur, notamment un plasmide, contenant la séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants, de manière à obtenir des souches de E. coli selon la revendication 17, dans lesquelles la transcription de ladite séquence nucléotidique codant un ou plusieurs polypeptides recombinants est placée sous le contrôle d'un système d'expression inductible, - la mise en culture des souches de E. coli transformées obtenues lors de l'étape précédente, et induction dudit système d'expression, pendant un temps suffisant pour permettre l'expression du ou des polypeptides recombinants dans les cellules de E. coli, - et la récupération du ou des polypeptides recombinants produits lors de l'étape précédente.