Brevet FR2781676A1 — publié le 20000204

Trimère du produit d'expression du gène env de HIV La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de protéines recombinantes, ayant pour origine la membrane du virus HIV responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), permettant la restauration de leur forme trimérique native, ainsi que l'utilisation de ces protéines dans un but de vaccination ou de diagnostique. Etat de la technique La glycoprotéine de l'enveloppe de HIV est codée par le gène "env", et la traduction de l'ARNm correspondant donne une protéine glycosylée, gpl60, sous forme d'un précurseur dont la masse moléculaire est de 160 kDa. La gap 160 est clivée à l'intérieur de la cellule pour donner, au niveau de la membrane cytoplasmique lors du bourgeonnement du virus en cours de formation, d'une part la gpl 20 que l'on retrouve à l'extérieur de la cellule et du virus, et, d'autre part, la gp41, partie transmembranaire de la glycoprotéine, qui correspond à l'extrémité carboxy-terminale du précurseur. Une fois la particule virale libérée, la gp41 seule protéine transmembranaire, présentera son extrémité carboxy-terminale tournée vers l'intérieur du virus et son extrémité amino-tenninale faisant saillie à l'extérieur, se maintenant associée de façon non covalente à la gap 120. Par son extrémité amino-terminale, elle est fixée d'une manière non covalente à la gp41 alors que le reste de la protéine est impliqué dans la reconnaissance du récepteur CD4 et des co-récepteurs CCR5 ou CXCR4 (spécifique des lymphocytes T4 auxiliaires, macrophages ; Trkola et al., J. Virol., 72, 1876-85, 1998 ; Schols et al., J. Virol., 72, 4032- 4037, 1998 ; Rubbert et al.. J. Immunology, 160, 3933-3941, 1998). La liaison de la ,p]20 au CD4 permet d'exposer la membrane de la cellule cible à la partie hydrophobe amino-terminale de la tp4l, ce qui induit le mécanisme de fusion des membranes du virus et des cellules, cette fusion étant à l'origine de la pénétration du virion dans la cellule cible lors de l'infection (Wong-Staal et al., In Molecular Genetic Medecine, 2, Friedman ed., 189- ? 19, 1992 ; Berger et al.. Nature, 391: 240, 1998). Ce processus de reconnaissance du récepteur viral, suivi de la fusion des membranes grâce à l'interaction de l'extrémité amino-terminale de la protéine de fusion avec la membrane de la cellule cible, n'est pas un mécanisme propre au HIV. Il est rendu possible grâce à la présence, sous forme oligomérique, des glycoprotéines transmembranaires du virus. Des pontages par agents chimiques ont permis de mettre en évidence des trimères au niveau des glycoprotéines de l'enveloppe de MuLV (Pinter et al., J. Virol., 30,157-165, 1979), de MuMTV (Racevskis et al., J. Virol., 35, 937-948, 1980). Il a aussi été montré que la protéine de l'enveloppe de RSV forme des oligomères retrouvés dans les cellules infectées et les particules virales (Einfeld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,8688-8692, 1988). Le virus de l'influenza exprime également à sa surface une hémagglutinine sous forme trimérique. Dans ce dernier cas, la forme multimérique est nécessaire au transport intracellulaire de la protéine (Copeland et al., J. Cell. Biol., 103, 1179-1191, 1986). L'influenza exprime aussi à sa surface une neuraminidase sous forme de tétramère (Varghese et al., Nature, 303, 35-40, 1983). Bien que la nature oligomérique des différentes protéines codées par le gène env ne fait aucun doute, le nombre de monomère est resté quant à lui sujet à controverse pendant longtemps. La glycoprotéine gap 160 a en effet été décrite longtemps comme pouvant s'assembler en dimères ou tétramères (Pinter et al., J. Virol., 63, 2674-2679, 1989; W094/00557 du CNRS; Schawaller et al., Virology, 172, 367-369, 1989; Earl et nl., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 648-652, 1990; Earl et ciel., J. Virology, 68, 3015-3026, 1994). D'autres rapports plus récent ont toutefois démontré que la gpl60 pourrait s'associer en fait naturellement, par sa partie gp41, sous la forme de trimères (Min Lu et al., Nature Structural Biology, 2, 1075-1082, 1995 ; Weisshorn et al., EMBO J., 15, 1507-1514,1996; Weisshorn et al., Nature, 387, 426-430, 1997), les formes dimériques ou tétramériques résultant en fait de ponts disulfures inter-chaînes abbérrants, ou de formes oligomériques transitoires (voir cidessous). Dans un but vaccinal, on peut produire et purifier la glycoproteine de l'enveloppe de HIV, soit en cultivant le virus HIV sur des lignées cellulaires et en purifiant la glycoprotéine du milieu de culture (W094/00557 du CNRS), soit en exprimant un recombinant de cette protéine par un vecteur différent de l'HIV, et en la purifiant du milieu de culture (W091/13906, Chiron). La purification de gap 160 à partir de cellules infectées par HIV ne permet que d'obtenir des tétramères, probablement une forme oligomérique transitoire, c'est à dire une forme qui ne correspond pas à celle prise par sa partie gp41 à la surface du virus (W094/00557 du CNRS). L'espression d'un recombinant de la gp160 par un vecteur différent de l'HIV, bien que présentant l'avantage de se soustraire aux dangers liés à l'agent infectieux HIV, ne permet pas aussi de retrouver la structure oligomérique " native " de la gp 160. En effet, VanCott et al. ont montré que la gap 160 recombinante exprimée par la vaccine, bien que présentant un pouvoir d'adhésion au CD4, comporte des différences structurelles (J. Imm. Meth., 183, p. 114, col. 1, li. 19-22, 1995). Randall et al. ont également montré que la gp 160 recombinante exprimée par la vaccine comporte des ponts disulfures inter-chaînes abbérants (Virology, 179, 827-833, 1990). Récemment, Parren et al. ont mis en évidence une corrélation entre l'obtention d'anticorps pouvant neutraliser in vitro l'infection de cellules par HIV et la nature oligomérique de la gp120 (J. of Virology, 72, 3512-3519, 1998). Pour cela, Parren et al. ont utilisé une gp 120 exprimée par HIV dans des cellules infectées, probablement pour contourner les problèmes liés aux différences structurales entre une gtl 20 native, exprimée à la surface du HIV, et celles produites par des vecteurs d'expression, telle que la vaccine. Par ailleurs, on sait que des anticorps spécifiques de la structure oligomérique de la gp160 peuvent être générées (Earl et al., supra), et participent de fait à un effet neutralisant contre l'infection in vitro de cellules par le HIV. La présente invention vise à fournir un procédé d'obtention de produits d'expression du gène env recombinant permettant la restauration de leur forme trimérique, cette forme étant utilisable dans le cadre d'une vaccination ou dans la mise en #uvre d'un diagnostic d'infection par HIV. En effet, les essais cliniques conduits sur des gp160 recombinantes posent le problème du spectre d'inhibition qui reste limité à quelques souches virales uniquement (Pialoux et al., Aids Res. Hum. Retr., 11, 373-381, 1995; Salmon-Céron et al., Aids Res. Hum. Retr., 12, 1479-1486, 1995). A ce jour, bien que la forme trimérique d'une gp)60 a été plusieurs fois identifiée dans un mélange d'autres formes polymériques, personne n'a purifié, ni suggéré de purifier, la forme trimérique de la gpl60. La présente vise à pallier ce besoin. Résumé de l' invention A cet effet, l'invention concerne toute glycoprotéine recombinante purifiée répondant aux propriétés suivantes : a) une capacité d'adhésion au CD4 ; b) une affinité avec un anticorps anti-gp 120 capable de neutraliser in vitro l'infection de cellules par HIV ; c) une affinité avec un anticorps anti-gp41 ; d) une forme trimérique dépourvue de ponts disulfures inter-chaînes Un deuxième objet de la présente invention concerne un vaccin comprenant la glycoprotéine purifiée selon l'invention, et un adjuvant. Un troisième objet de la présente invention concerne l'utilisation de la glycoprotéine selon l'invention dans la mise en #uvre de toute méthode de diagnostic in vitro d'infections causées par HIV. Un dernier objet de la présente invention concerne un procédé d'obtention d'une glycoprotéine selon l'invention, dans lequel on exprime, aux moyen de techniques de recombinaison génétique, une glycoprotéine répondant aux propriétés a), b) et c) selon l'invention, on la purifie, et on la soumet à des étapes impliquant au moins un agent réducteur, un détergent ionique et/ou un détergent neutre dans des conditions telles que l'on obtient une glycoprotéine répondant aux conditions selon l' invention. Description détaillée de l'invention Dans le cadre de la présente invention, la capacité d'adhésion au CD4 peut être déterminée par une précipitation radio-immune, par ELISA ou par résonance plasmonique de surface, le détail des ces méthodes étant exposé dans la suite de la description. Ces méthodes sont susceptibles d'être modifiées dans la limite des connaissances actuelles, l'objectif étant de s'assurer simplement que la glycoprotéine selon l'invention forme bien un complexe avec le CD4. Les molécules de CD4 peuvent être préparées de toutes sortes de manières différentes, incluant une purification depuis une source naturelle, ou le recours à des techniques de recombinaison génétique. Dans ce cadre, on peut utiliser les CD4 décrits dans W08903222, W08902922, Smith et al. (Science, 238, 1704-1707, 1987) et Littman et al. (Nature, 325, 453-455, 1987), par exemple. La société ERC BioServices Corporation, 649A Lofstrand Lane, Rockeville, MD 20850, USA, commercialise également un CD4 produit par les cellules CHO ST4.2 (In : Aids Research and Référence Reagent Program Catalog, the Nat. Inst. Helath U. S.D.H.H.S.), par exemple. De préférence, la capacité d'adhésion est au moins identique à celle d'une gp120 d'une souche d'HIV infectieux, par exemple une gap 120 provenant des isolats SF2, HXB2, BRU, MN, SC, NY5, CDC4, WMJ2, RF, MAL, ELI, Z96, Z3, Z321 et JY15 (Myers et al., Human Retroviruses and Aids, Los Alamos, New Mexico, 1990), ou des autres isolats décrits par Tersmette et al. (J. Virol., 62,2026-2032, 1988), Popovic et al. (Science, 224,497-500, 1984), et EP541753 (Transgène S. A.), par exemple. L'affinité mesurée (Kd) par résonance plasmonique de surface peut être aussi de l'ordre de 10-- à 10'12 M, de préférence 10-9 à 10'" M, ce qui est conforme aux affinités déjà mesurées pour des gp120 (Smith et al., Science, 238: 1704, 1987; Lasky et al., Cell, 50 : 975,1987), par exemple. La glycoprotéine recombinante selon l'invention présente aussi une affinité avec un anticorps anti-gpl20 capable de neutraliser in vitro l'infection de cellules par HIV. Le terme " anticorps " regroupe toutes les immunoglobulines ou fragments de celles-ci, d'original polyclonale, monoclonale ou chimérique (voir US4816397), par exemple. Tous les anticorps connus, ou susceptibles d'être préparés, capables de reconnaître un épitope de la gap 120 et de neutraliser in vitro l'infection de cellules par un HIV, peuvent être pris en compte dans le cadre de la présente invention. Il suffit qu'une glycoprotéine du HIV présente une affinité avec un anticorps de ce type pour qu'on la considère comme répondant aux besoins de la présente invention. Sans vouloir être limité par les techniques et anticorps utilisables pour les besoins de l'invention, à titre d'information, on peut citer les articles de VanCott et al. (1995, supra), et Earl et ciel. ( 99-4, supra), par exemple. En ce qui concerne les tests de mesure de l'efficacité neutralisante d'un anticorps in vitro, on peut citer les articles de Pialoux et al. (1995, supra) et SalmonCéron et al. (1995, supra), par exemple. Il suffit d'observer une neutralisation in vitro de l'infection de cellules par HIV, quelque soit le seuil de neutralisation, pour considérer que l'anticorps satisfait aux besoins de la présente invention. Par ailleurs, la glycoprotéine recombinante selon l'invention présente aussi une affinité avec un anticorps anti-gp41. Les remarques exposées ci-dessus s'applique mutatis mutandis à la gp41, à la différence près que l'effet neutralisant d'un anticorps anti-gp41 n'est pas important, tout en pouvant être un critère préférentiel à ne pas négliger. La mesure de l'affinité de la glycoprotéine sous forme trimérique avec les anticorps anti-gp41 et anti-gpl20 peut être effectuée par une réaction immunologique direct avec l'anticorps, ou par ELISA, par exemple. Les conditions opératoires peuvent varier dans les limites des connaissances actuelles, les variations et/ou adaptations par rapports aux techniques connues ne représentant pas en fait un obstacle difficile pour l'homme du métier. La forme trimérique de la glycoprotéine selon l'invention peut être observée sur gel SDS PAGE en condition réductrice ou non (voir l'exemple 1). L'homme du métier peut cependant recourir à toutes sortes d'autres analyses, comme la centrifugation analytique ou l'analyse par diffusion de la lumière. L'objectif est simplement de mettre en évidence l'association de trois molécules de gp160 non-liées par des ponts inter-chaînes. La glycoprotéine selon l'invention, en répondant aux propriétés exposées ci- dessus, peut donc être composée de tout ou partie de la protéine gap4), et de tout ou partie de la protéine gp 120. De ce fait, cette glycoprotéine peut être codée par tout ou partie d'un gène env, natif (provenant d'un isolat d'HIV) ou non, ladite glycoprotéine étant soit purifiée à un stade où le clivage n'est pas encore effectuée in site, ou ledit clivage étant rendu inopérant soit à cause de la nature de l'hôte cellulaire qui ne serait pas pourvu des enzymes nécessaires, soit à cause d'inhibiteurs de ces enzymes, soit encore du fait que le site de clivage a été génétiquement modifié, par exemple. La modification génétique du site de clivage est bien connu de l'homme du métier, et permet d'obtenir des protéines entières, de tailles variables, renfermant tout ou partie de la gp41 et tout ou partie de la gp41. A titre d'information, non limitative, on peut citer les glycoprotéines gpl60 et gpl40 décrites par EP541753 (supra), EP679187 (supra), Earl et al. (1994, supra), Kieny et al. (1988, supra), l'enseignement technique de cette littérature étant incorporé par référence dans la description de la présente invention. Plus particulièrement, on peut utiliser comme source de gène en\\ tous les isolats de HIV connus, notamment ceux décrits ci-dessus. Le clonage peut être avantageusement effectué par la technique PCR, suivie d'une insertion du fragment d'ADN dans un vecteur approprié. On peut ensuite supprimer le(s) site (s) de clivage par mutagenèse dirigée comme décrit par Kieny et al. (1988, supra), ou dans l'exemple 1 ci-après. La préparation des vecteurs, et toutes les autres procédures techniques peuvent être effectuées selon les protocoles décrits dans les ouvrages de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989). Le vecteur d'expression dans lequel on clone finalement le fragment d'ADN codant pour une glycoprotéine selon l'invention, peut être un plasmide, un phage, un ADN entier de virus, un cosmide, un ADN destiné à s'intégrer dans une cellule, etc. Ce vecteur comprend de préférence des séquences régulant l'expression du gène en\', et le cas échéant d'autres séquences régulant la translocation de la glycoprotéine vers la membrane de la cellule hôte productrice. Les cellules hôtes les plus adaptées, en raison d'un glycosylation proche voire identique à celle désirée, sont des cellules eucaryotes supérieures, pouvant inclure, par exemple, des lignées cellulaires immortalisées provenant du singe (Cos-7, ATCC CRL 1651 ; Vero76, ATCC CRL 1587), du hamster (BHK, ATCC CRL 10 ;CHO, PNAS USA, 77 :4216, 1980), de la souris (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23, 243-251, 1980), de l'homme (Hela, ATTC CCL2; W 138, ATCC CCL75; Hep G2 ; HB 8065), du chien (MDCK, ATCC CCL34), etc. Les vecteurs d'expression les plus appropriés sont ceux se reproduisant dans des eucaryotes, notamment le virus de la vaccine qui est bien connu dans l'art antérieur (wu86/07593), par exemple. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on peut produire notamment des gp160 selon l'enseignement décrit dans Enz1753 (supra), ou des gp 140 selon la méthode de Earl et al. (1990, supra), voire tout autre variant de glycoprotéine dans laquelle une ou plusieurs parties de gp41 et/ou gp120 seraient éliminées, l'objectif étant que la partie gp41 soit suffisante pour que la formation de trimères s'effectue, et que la partie gp120 soit suffisante pour être reconnue par des anticorps anti-gpl20 neutralisants et par le CD4. Pour faire le choix de gênes env modifiés répondant aux besoins de la présente invention, l'homme du métier, est à même de procéder par étape ou par hasard, et de choisir ensuite parmi toutes les séquences ne répondant pas à nos besoins, celles qui y satisfont. Après avoir produit la glycoprotéine par des techniques de recombinaison génétique, ou par infection de cellules avec HIV, on la purifie au moyen de techniques connues de l'homme du métier, notamment celles faisant intervenir des lectines de lentille (Pialoux et al., 1995, .supra ; Salmon-Céron et al.,1995, supra), celle décrite dans W091/13906 (supra) pouvant être éventuellement encore adaptée aux besoins de la présente invention, ou même celle décrite à l'exemple 1 (immuno-affinité), par exemple. Rn ce qui concerne les protéines recombinantes, on peut noter qu'une partie des glycoprotéines ainsi purifiées présentent des ponts disulfures inter-chaînes, quelque soit la nature de l'hôte ou du vecteur utilisé. Les glycoprotéines s'associent en fait en dimères (une partie étant covalents) visibles sur gel SDS PAGE après fixation par un agent de pontage. En ce qui concerne les glycoprotéines purifiées de cellules infectées par HIV, celles-si se présentent aussi sous forme de tétramères (W094/00557, supra). Afin de répondre aux besoins de la présente invention, on dissocie donc les glycoprotéines, puis on les soumet à des conditions favorisant leur ré-assemblage naturel, c'est à dire sous forme de trimères. Pour cela, on soumet la glycoprotéine à des étapes impliquant au moins un agent réducteur, un détergent ionique et/ou un détergent neutre dans des conditions telles que l'on obtient une glycoprotéine satisfaisant aux besoins de la présente invention. On peut choisir un ou plusieurs agent(s) réducteur(s) parmi les molécules de dithiothréitol, (3-mercaptoéthanol, glutathion réduit ou le borohydrure de sodium, par exemple. On peut choisir un ou plusieurs détergent(s) ionique(s) parmi les sels de dodécyl sulfate, notamment le dodécyl sulfate de sodium (SDS) ou de lithium, les sels de dioctyl sulfosuccinate (de sodium, par exemple), les sels de cétryltriméthylammonium (de brome, par exemple), les sels de cétylpyridinium (de chlore, par exemple), les N-dodécyls- ou N-tétradécyl-sulfobétaïne, les zwittergents z, et le 3-[(3-cholarnidopropyl)-diméthylamino]-l -propane sulfonate (CHAPS), par exemple. De même, on peut choisir un ou plusieurs détergentes) neutre(s) parmi le tween20#, le tween80@, l'octylglucoside, le lauryl-maltoside, l'hecameg, le lauryldiméthylamine, le décanoyl-N-méthyl-glucamide, le polyéthylène-glycol-lauryl-éther, le triton X 100, le Lubrol PX@, par exemple. Les conditions opératoires doivent être suffisantes pour dissocier les glycoprotéines, et les ré-assembler en trimères. Pour cela, généralement on peut dissocier les glycoprotéines à l'aide d'un ou plusieurs détergent(s) ionique(s), en présence d'agent réducteur ou non, puis on peut favoriser le réassemblage des monomères en substituant le détergent ionique par un détergent neutre, par exemple au moyen d'une dialyse. De cette manière, on est assuré d'obtenir une glycoprotéine selon l'invention comprenant moins de 50% d'autres contaminants protéiques (constitués principalement par des dimères covalents) De préférence, pour obtenir exclusivement des trimères de glycoprotéines selon l'invention, on soumet au cours du traitement les glycoprotéines purifiées à un agent réducteur, de sorte à libérer les dimères covalents, le cas échéant on bloque des fonctions sulfhydryls libres au moyen de molécules appropriées, telles que des agents d'alkylation comme le N-éthyl-maléimide ou l'iodo-acétamide, puis on ré-oxyde doucement les fonctions sulfhydryls restantes en présence d'un agent oxydant tel que du glutathion oxydé, par exemple. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on peut soumettre la glycoprotéine purifiée successivement à un agent réducteur, à un agent d'alkylation, à un agent oxydant, à un détergent ionique et à une dialyse contre un détergent neutre, par exemple Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, on peut soumettre la glycoprotéine purifiée successivement à un détergent ionique, à un agent réducteur, à un agent oxydant et à une dialyse contre un détergent neutre. A la fin du procédé, on peut substituer le détergent neutre par un tampon approprié, par exemple au moyen d'une dialyse. Un autre objet de la présente invention concerne un vaccin comprenant la glycoprotéine selon la présente invention et un adjuvant. Ce vaccin peut contenir comme antigène de surface du HIV uniquement la glycoprotéine selon la présente invention, les formes dimériques ou monomériques d'une gpl60 ou gp120 étant spécifiquement exclues, par exemple, pour des raisons d'immunogénéicités réduites. On peut également adjoindre à ce vaccin d'autres valences concernant d'autres maladies, les quantités d'antigènes et/ou la formulation de chaque valence devant néanmoins être probablement optimisée (s) sorte à assurer une réponse immunitaire efficace, par exemple. Les valences d'autres pathogènes peuvent provenir de bactéries, de virus ou de parasites, par exemple ceux provoquant des hépatites (A à G), la rougeole, les oreillons, la polio, la tuberculose, la diphtérie, la malaria, etc. Parmi les adjuvants utilisables, on peut dénombrer tous les sels d'aluminium, comme les phosphates et hydroxydes d'aluminium ; l'adjuvant de Freund ; le N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanine-?-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro- 3-(hydroxyphosphoryloxy)) (voir Sanchez-Pescador et al., J. Immu., 141, 1720-1727, 1988) ; les molécules dérivées de Quillaja saponaria, comme le Stimulon (Aquila, US) ; l'Iscoms (CSL Itd, US) ; toutes molécules à base cholestérol et analogues, comme le DC Chol (Targeted Genetics) ; le glycolipide Bay R1005# (Bayers, DE) ; les antigènes de Leishmania brasiliensis comme le LeIF (nom technique) disponible auprès de Corixa Corp. (US), les polymères de la famille de polyphosphazènes, comme l'Adjumer (nom technique) disponible auprès du "Virus Research Institute " (US). Les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être utilisées pour la prévention d'infections par le HIV-1, le dosage et la voie et la fréquence d'administration devant cependant être probablement optimisé de sorte à obtenir une réponse immunitaire efficace. Un dernier objet de la présente invention concerne l'utilisation de la glycoprotéine selon l'invention dans la mise en #uvre de toute méthode de diagnostic in vitro d'infections causées par HIV. D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront au cours des descriptions suivantes d'exemples de formes de réalisation qui sont fournis à des fins d'illustration de la présente invention et qui ne sont pas destinés à être limitatifs. La manipulation des cellules, la préparation des vecteurs, la transformation de cellules, et toutes les autres procédures techniques sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. (1989, supra). Ces exemples sont précédés d'une brève description de la figure 1, et des méthodes mesurant l'affinité de la gpl60 au CD4. Mise en évidence d'une affinité au CD4 par précipitation radio-immune : on utilise un CD4 recombinant marqué au soufre 35 produit par des cellules CHO (Genentech, USA ; VanCott et al., 1995, supra). On effectue ensuite des expériences de coprécipitation, au cours desquelles le CD4 est ajouté en quantité croissante à une quantitée fixe de gpl60 purifiée sous forme trimérique pour déterminer le point de saturation, puis on les coprécipite avec un antisérum anti-gpl60. Pour cela, on mélange le CD4 et la gpl60 pendant 1 h à 4 C, on ajoute l'anticorps (OKT4, Ortho Diagnostics, US), on lave les complexes, et on les sépare par électrophorèse. Mise en évidence d'une affinité au CD4 par ELISA : la mesure des constantes d'affinité du CD4 pour la glycoprotéine selon l'invention est mesurée en utilisant la technique de Friguet et al. (J. of immunological methods, 77, 305-319, 1985). Mesure de l'affinité de la gp120 sur le CD4 par résonance plasmonique de surface : le Biacore est un appareil pour l'analyse des interactions biospécifiques en temps réel et sans marquage qui utilise le principe de résonance plasmonique de surface. Lors de l'analyse, un des interactants (le ligand) est couplé à une matrice hydrophile (dextran) ou hydrophobe (surface HPA). L'autre interactant (analyte) passe au contact de la surface par l'intermédiaire d'une cartouche de transfert microfluidique. L'augmentation de masse au voisinage de la surface due à l'interaction entre les molécules, est représentée en fonction du temps sur un sensorgramme. Différentes chimies de couplage permettent la fixation de pratiquement toutes les biomolécules sur la matrice. L'utilisateur crée donc une surface biospécifique sur mesure, pour chaque type d'application. En pratique la glycoprotéine selon l'invention est couplée sur la matrice et différentes concentration de CD4 sont envoyées par l'appareil au contact de cette matrice. A chaque fois la masse de CD4 fixée sur la glycoprotéine est enregistrée. Le logiciel Biaeval3 calcule automatiquement la constante de dissociation du CD4 sur la gpl20. Figure 1 : représentation de l'analyse SDS PAGE en condition réductrice obtenue avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée, traitée pour faire des trimères et fixée par un agent de pontage (col. 3 et 4) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec la gp160 produite par VVTG9150, purifiée et directement fixée (col. 2) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec des monomères de gp 160 (col. 5 et 6) ;et au regard de celle obtenue en condition non-réductrice avec la gp160 produite par VVTG9150 et purifiée (col. 7). Exemple 1 Un vecteur recombinant basé sur le virus de la vaccine, VVTG9150, est utilisé pour la production de gp160. La construction du plasmide de transfert du gène codant pour la protéine env hybride HIV -1 M'\j/LAJ dans le génome du virus de la vaccine VVTG9150 est décrite ci-après. Le fragment d'ADN PstI-KpnI de pTG 1163, réf. Kieny et al. (Prot. Eng., 2, 219-225, 1998) qui contient la séquence codant pour le peptide signal et les premiers acides aminés de la gp!20 du virus H1V-l,i, est inséré aux sites PstI et KpnI du bactériophage M 13TG 130, réf. Kieny et al. (Gene, 26,91-99, 1983) générant M13TG4147. Le fragment Pstl-PstI de pTG1163, contenant la totalité du gène codant pour une gp160/soluble de HIV -1 L-\I est introduit dans le site de restriction Pstl de M13mp70, générant M 13TG4137. L'ADN du bactériophage M13TG4137 est ensuite coupé par Bg 1 II, digéré par la polymérase I (fragment de Klenow) afin de générer une extrémité franche, puis coupé par EcoRI, afin d'être inséré aux sites EcoRV et EcoRI du bactériophage M13TG4147, générant M13TG4158. Une délétion sur M13TG4158 est ensuite réalisée avec un oligonucléotide, qui permet l'introduction d'un site SphI et d'un site Smal. On obtient le bactériophage M 13TG4168. Le gène codant pour la gp120MN est ensuite amplifié à partir d'ADN de cellules SupTl infectées avec le virus HIV-1,,-, par la technique de PCR avec des oligonucléotides qui introduisent respectivement des sites 5/?! et SmaI. Le fragment d'ADN amplifié est ensuite digéré par SphI et SmaI et inséré aux sites correspondant de M 13TG4168, générant M 13TG4174. Une mutagénèse dirigée sur M 13TG4174 est réalisée avec un oligonucléotide permettant de muter un site potentiel d'arrêt de transcription (TTTTTNT) reconnu par le virus de vaccine dans les gènes précoces et d'introduire un site de restriction EcoRI, générant ainsi M13TG81?0. Le fragment Pst\-Pst\ de M 13TG8120 est ensuite cloné dans le site PstI du plasmide pTG9148 générant pTG9150 (le virus VVTG9150 après transfection). pG9148 est d'ailleurs généré de la façon suivante : la séquence correspondant au promoteur H5R du virus de la vaccine est amplifiée par la technique de PCR avec des oligonucléotides introduisant respectivement des sites BamHI et Bg1II. Le fragment d'ADN amplifié est ensuite digéré par Bglll et BamHI et inséré aux sites correspondant de M13TG6131 (Gene, 26, 91-99, 1983) générant M13TG8124. Le fragment BamHI-Bg 1 II de M13TG8124 contenant la séquence promotrice H5R est introduit dans le site de restriction BamHI de pTG9133 générant pTG9145. Le plasmide pTG9133 a été construit par introduction d'un site BamHI entre les sites Clal et EcoRI de pTGIH-TK (Nature, 312, 5990, 163-166, 8 Nov. 1984) par ligation d'un adaptateur OTG4451/OTG4452. Un site de clonage multiple issu de M 13TG 131 digéré par Bg1II et EcoRI est introduit dans les sites BamHI et EcoRI de pTG9145 générant pTG9148. En conclusion, VVTG9150 code donc pour une gpl60 hybride et soluble dans laquelle la partie gpl20 dérive du HIV-1MN, et la partie transmembranaire gp41 provient d'un isolat LAI. Plusieurs modifications sont en outre introduites dans cette séquence codante. Premièrement, un site de restriction SphI est créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide signal, sans altérer la séquence en acides aminés. Deuxièmement, un site de restriction SmaI est créé immédiatement au-dessus de la séquence de clivage entre la gpl20 et la gp41, sans altération de la séquence en acides aminés. Troisièmement, les deux sites de clivage en position 507-516 (numérotation des acides aminés conforme à Myers et al., in : Human retroviruses and AIDS, Los Alamos Nat. Lab., USA, 1994) sont mutés (séquence originale KRR...REKR muté en QNH...QEHN). Quatrièmement, la séquence codant pour le peptide hydrophobique transmembranaire IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV (acides minés 689-710 de Myers et al.) est supprimée. Cinquièmement, un codon stop a été substitué pour le second codon E codant PEGIEE (acides aminés 735-740 de Myers et al.), c'est-à-dire le 29ieme acide aminé du domaine intracytoplasmique. VVTG9150 est ensuite propagé pour produire la gp160 hybride sur des cellules BHK21, dans des conditions conventionnelles (Nature, 312,163-166, 1984). La glycoprotéine hybride gp160 est alors purifiée successivement par chromatographies échangeuse d'ions, une chromatographie d'immunoaffinité, une gel filtration, et une concentration. En résumé, on fait passer le milieu de culture contenant la gp160 successivement au travers de deux supports DEAE Trisacryl LS Plus@, mis en équilibre dans des colonnes BPG200 et BPG100# (Pharmacia) avec un tampon pH 8,3 contenant 2,42 g/l de Tris et 1 ml/1 de triton XI00. Puis on fait passer les fractions d'élution contenant la gpl60 au travers d'un support AF-Tresyl Toyopearl (Tosoh Corp, JP) sur lequel a été greffé l'anticorps IAM5F3 (publication ? ) et qui a été mis à l'équilibre dans un tampon composé de 29,22 g/1 de NaCl, 2,42 g/1 de Tris et 1 mi/1 de triton XI 00. On collecte l'élution dès l'augmentation de DO visible sur l'écran et ce,jusqu'à la ligne de base. On neutralise ensuite le pH de l'élution avec 4% (v: v) de tampon Tris HCl 2M. On soumet l'élution neutralisée à une filtration surgel dans une colonne XK 50/100# contenant le support sephacryl HR S300 mis à l'équilibre dans un tampon PBS. Si la concentration en protéines est alors inférieure à 0,44 mg/ml, on concentre l'élution dans une cellules Amicon équipée d'une membrane YM30. Puis, on inactive l'élution ou le concentrât dans un bain marie à 60 C pendant 1 h, et on le filtre (0,22 m) dans un flacon Nalgène. On peut ainsi obtenir environ 1,34 mg/ml de gpl60 pure à 91 % (visualisée sur SDS PAGE). A partir de 560 l de gp 160 purifiée (1 mg/ml), on ajoute 65 l de tampon 1 M phosphate de sodium pH7,8 ;5,5 l d'eau distillée et 19,5 l de dithiothreitol 250 mM (DTT), et on agite au vortex pendant 15 s. On ajoute 51,5 l de phosphate de sodium 1 M (NaH2P04), puis on bloque les groupes sulfhydryls par addition de 95 l de Nethyl-maléimide 100mM, on incube pendant 15 min, on réoxyde les groupes sulfhydryls par addition de 32,5 l de glutathion réduit à 150 mM, et 484 l de glutathion oxydé à 100 mM, on incube pendant 30 min. On dissocie ensuite les dimères de gpl60 par addition de 13,2 l de dodecyl sulfate de sodium (SDS) à 10%. On place l'échantillon dans une cassette de dialyse d'une capacité de 3 ml contre 3 1 de tampon PBS avec 10mM d'octylglucoside. On effectue la dialyse pendant la nuit à température ambiante sous agitation douce. On élimine enfin le détergent par une ou plusieurs nouvelles dialyses contre du tampon PBS. Les gpl60 ainsi traitées se retrouvent sous forme de trimères exclusivement. La figure 1 représente l'analyse SDS PAGE en condition réductrice (DTT) obtenue avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée, traitée pour faire des trimères et fixée par l'agent de pontage bi-fonctionnnel éthylène-glycol-bissuccinimidyl-succinate (EGS) (col. 3 et 4) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec la gp160 produite par VVTG9150, purifiée et directement fixée par l'EGS (col. 2 : des dimères) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec des monomères de gpl60 (col. 5 et 6) ; et au regard de celle obtenue en condition nonréductrice avec la gpl60 produite par VVTG9150 et purifiée (col. 7 : en absence d'agent réducteur, les liaisons inter-chaînes conduisent à la formation de dimères, trimères et tétramères). Exemple 2 On exprime par le virus de la vaccine une gp120 prolongée des 129 premiers acides aminés de la partie N-terminale de la gp41, comme décrit par Earl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 648-652, 1990. Dans la mesure où la partie gp41 est limité à ses 129 premiers acides aminés, celle-ci ne comporte pas de région transmembranaire. Cette glycoprotéine présente sur gel SDS PAGE un poids moléculaire de l'ordre de 140 kD et est communément appelée gp 140. On purifie cette gp140 successivement par chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité avec des lectines de lentilles, et par gel filtration, comme décrit par Pialoux et al. (1995, supra) et Salmon-Céron et al. (1995, supra). A partir de 100 l de gpl40 purifiée (lmg/ml), on ajoute 2 fil de dithiothreitol 250 mM (DTT), et 10 l de SDS (10%), on incube le mélange pendant 15 min, on lui ajoute 20 l de glutathion oxydé (250mM), on l'incube une nuit à 4 C, puis on place l'échantillon dans une cassette de dialyse d'une capacité de 3 ml contre 3 1 de tampon PBS contenant lOmM d' octylglucoside. On effectue la dialyse pendant la nuit à température ambiante sous agitation douce. On élimine enfin le détergent par une ou plusieurs nouvelles dialyses contre du tampon PBS. Contre toute attente, cette méthode permet d'éliminer tous les ponts disulfures inter-chaînes sans que l'on ait à bloquer les groupes sulfhydryls avec un agent alkylant. Les gpl40 ainsi traitées se retrouvent sous forme de trimères exclusivement. Exemple 3 On exprime par le virus de la vaccine une gpl60 telle que décrite par Kieny et al. (Protein Engineering, 2, 219-225, 1988). On la purifie comme décrit à l'exemple 1, puis on la traite avec du SDS, et on la dialyse contre un tampon PBS contenant 1 OmM d'octylglucoside. On obtient après traitement un mélange de trimères non-covalents et de dimères covalents de la gpl60, la forme prédominante étant constituée de trimères. Revendications 1. Glycoprotéine recombinante purifiée répondant aux propriétés suivantes : a) une capacité d'adhésion au CD4 ; b) une affinité avec un anticorps anti-gp 120 capable de neutraliser in vitro l'infection de cellules par HIV; c) une affinité avec un anticorps anti-gp41 ; d) une forme trimérique dépourvue de ponts disulfures inter-chaînes. 2. Glycoprotéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que la glycoprotéine est composée de tout ou partie de la gp160. 3. Glycoprotéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend moins de 50% d'autres contaminants protéiques. 4. Glycoprotéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que la capacité d'adhésion au CD4 est au moins identique à celle d'une gp120 d'un HIV infectieux. 5. Vaccin comprenant la glycoprotéine purifiée selon la revendication 1, et un adjuvant. 6. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il contient comme antigène de surface du HIV uniquement la glycoprotéine selon la revendication 1. 7. Procédé d'obtention d'une glycoprotéine selon la revendication 1, dans lequel on exprime, aux moyen de techniques de recombinaison génétique, une glycoprotéine répondant aux propriétés a), b) et c) énoncées à la revendication 1, on la purifie, et on la soumet à des étapes impliquant au moins un agent réducteur, un détergent ionique et/ou un détergent neutre dans des conditions telles que l'on obtient une glycoprotéine répondant aux conditions énoncées à la revendication 1. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on soumet la glycoprotéine purifiée successivement à un agent réducteur, à un agent d'alkylation, à un agent oxydant, à un détergent ionique, et à une dialyse contre un détergent neutre. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on soumet la glycoprotéine purifiée successivement à un détergent ionique, à un agent réducteur, à un agent oxydant, et à une dialyse contre un détergent neutre. 10. Utilisation de la glycoprotéine selon la revendication 1 dans la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro d'infections causées par HIV.