Brevet FR2783325A1 — publié le 20000317

MOYENS POUR LE CONTRÔLE DE LA REGULATION NEGATIVE D'UNE ACTIVATION TRANSMISE PAR UN RTK La présente invention se rapporte, de manière générale, à des moyens pour le contrôle de la régulation négative d'une activation transmise par un RTK (récepteur à activité tyrosine kinase), et pour le contrôle de la régulation négative d'une prolifération et/ou d'une différenciation cellulaire induite par un RTK en particulier. Les RTK constituent une famille de récepteurs doués de propriétés enzymatiques tyrosine kinase propres. Parmi les RTK, peuvent être notamment cités les récepteurs pour les facteurs de croissance, pour les facteurs de différenciation, ou pour les honnones tels que erb Bl (ou EGF-R, récepteur pour le facteur de croissance des cellules épithéliales), erb B2 (ou HER2, ou neu, récepteur pour le facteur de différenciation neu), PDGF-R (récepteur pour le facteur de croissance dérivé des plaquettes, sous forme a ou P), NGF-R (récepteur pour le facteur de croissance du système nerveux), FGF-R (récepteur pour le facteur de croissance des fibroblastes), Kit (récepteur pour le facteur des cellules souches ou SCF, "Stem Cell Factor"), le récepteur pour l'insuline (ou I-R). Les RTK sont exprimés par de nombreux types cellulaires : des cellules hématopoïétiques (pour Kit et CSF-R, par exemple), tout comme des cellules non hématopoïétiques telles les cellules épithéliales (EGF-R), les mélanocytes (Kit) cellules du système nerveux central (NGF-R), cellules hépatiques et adipocytaires (Insuline-R), les cellules intestinales et les cellules germinales (Kit). Les RTK contrôlent la stimulation de la prolifération et/ou de la différenciation des cellules qui les expriment : leur activation induit à des réponses cellulaires de type non immunitaire, telles que déclenchement du cycle cellulaire de la mitose en particulier, induction d'une différenciation cellulaire, survie ou transformation cellulaire, déclenchement de la méiose, activation de métabolismes cruciaux pour la vie de la cellule tels que métabolisme cellulaire du glucose, des nucléosides, des acides aminés. L'activation de RTK peut conduire à des réponses physiologiques ou pathologiques : les RTK sont en effet des proto-oncogènes (forme c-), et de nombreuses formes oncogéniques, constitutionnellement activées (forme v-, mutante), ont été identifiées. Le contrôle de la régulation négative des RTK permettrait donc de contrôler des événements cruciaux de la vie cellulaire à l'état physiologique tout comme pathologique. S'il est connu qu'un RTK puisse être activé par stimulation de son ligand et agrégation, les moyens assurant la régulation négative de cette activation, qui assurent donc des fonctions de contrôle sur l'inhibition de la prolifération et de la différenciation cellulaire, restaient indéterminés. Les inventeurs ont précisément mis au point des moyens qui permetttent un contrôle de la régulation négative d'une activation transmise par un RTK, c'est-à-dire des moyens permettant d'analyser cette régulation négative, tout comme, si nécessaire, de la moduler afin de la stimuler (dans le but de diminuer l'activation du RTK considéré) ou afin de l'inhiber (dans le but de libérer l'activation du RTK considéré). Les moyens de contrôle selon l'invention mettent à profit la découverte que, de manière tout-à-fait surprenante, un immunorécepteur à ITIM (motif d'inhibition d'immunorécepteur basé sur résidu (s) tyrosineI/V/L/xYxxL/V), tel que, par exemple, les RFc[gamma]IIB (immunorécepteurs inhibiteurs pour la portion Fc des IgG), KIR (immunorécepteur inhibiteur pour des molécules du CMH ou HLA), Ly49, NKG2A, CD22, CD72, PIR-B, gp49Bl; MAFA, ILTs, LIRs, SIRPa, LAIRs, est capable, par co-agrégation, d'inhiber l'activation d'un récepteur qui n'est pas un immunorécepteur, qui n'interagit donc pas avec l'antigène et ne comprend pas d'ITAM (motif d'activation d'immunorécepteur basé sur résidu (s) à savoir qu'un tel récepteur à ITIM est capable, par co-agrégation, d'inhiber l'activation transmise par un RTK, et en particulier, d'inhiber une prolifération et/ou une différenciation cellulaire induite par un RTK. La présente invention a ainsi pour objet des méthodes et kits pour l'identification d'agents utiles au contrôle d'une régulation négative de l'activation d'un RTK (agents stimulateurs ou inhibiteurs d'une telle régulation négative), des composés artificiels tels qu'obtenus par de telles méthodes, des méthodes et kits pour le diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activation d'un RTK, ainsi que des utilisations de tels agents ou de tels composés articiels pour la fabrication de médicaments. Un aspect de la présente invention se rapporte ainsi à une méthode pour l'identification d'un agent utile à la stimulation d'une régulation négative de l'activation d'un RTK, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de co-agréger un récepteur à activité tyrosine-kinase (RTK) à un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, et/ou en ce qu'elle comprend la détection des entités constitutives d'un tel composé. Un composé co-agrégeant ainsi détecté, ou la combinaison des entités constitutives ainsi détectées correspond essentiellement, selon l'invention, à un agent utile à la stimulation d'une régulation négative de l'activation d'un RTK. Avantageusement, ladite détection est réalisée par criblage fonctionnel de banques chimiques et/ou biologiques selon les techniques classiques. Des exemples de banques biologiques appropriées comprennent notamment des banques de phages exprimant après recombinaison génétique des anticorps ou auto-anticorps humains, et/ou des fragments de tels anticorps ou autoanticorps. Des banques chimiques peuvent également être criblées de manière à identifier des mimétopes de tels composés. Des conditions appropriées à la physiologie cellulaire peuvent correspondre à des conditions in vivo telles que notamment après injection à un homme ou un animal tel que la souris, tout comme à des conditions m vitro mimant les conditions in vivo, telles que notamment en présence d'un milieu de culture de type RPMI ou DMEM complémenté à 10% de sérum de veau foetal (SVF) dans lequel, les cellules expriment les RTK et les récepteurs à ITIM considérés sont incubées, par exemple dans un incubateur humidifié à 37 C. Lorsqu'un composé co-agrégeant détecté selon l'invention co-agrège efficacement un récepteur à ITIM à un RTK, la stimulation de régulation négative ainsi induite conduit à une phosphorylation du (ou des) motif(s) ITIM dudit récepteur à ITIM, et au recrutement de phosphatases telles que SHIP (cas de RFcylIB), SHP-1, SHP-2 (cas des autres récepteurs à ITIM). La mesure du niveau de phosphorylation du (ou des) motif(s) ITIM dudit récepteur à ITIM est donc un indicateur du niveau de la régulation négative exercée par un composé co-agrégeant détecté selon l'invention sur l'activation dudit RTK. Un moyen pour vérifier qu'un composé est capable de stimuler la régulation négative d'une telle activation, ou pour mesurer son niveau d'efficacité, comprend ainsi notamment la mesure du niveau de phosphorylation du (ou des) motif(s) ITIM dudit récepteur à ITIM en présence et en l'absence dudit composé testé, et la vérification que le niveau de phosphorylation observé en présence de ce composé est inférieur à celui observé, dans des conditions par ailleurs comparables, en l'absence de ce même composé. La différence statistique entre ces deux niveaux de phosphorylation donne une image du niveau d'efficacité du composé testé. Un composé co-agrégeant détecté selon l'invention présente la propriété remarquable d'être capable, dans lesdites conditions, de stimuler la régulation négative d'une réponse cellulaire de nature non immunitaire à laquelle l'activation de RTK peut être associée. Un moyen pour induire une réponse non immunitaire à laquelle l'activation de RTK peut être associée comprend l'activation desdits RTK à l'aide d'un ligand de ces RTK, de manière à les agréger ensemble. Une telle activation peut conduire à des réponses cellulaires de type non immunitaire (prolifération et/ou différenciation cellulaire notamment), réponses qui sont inhibées en présence d'un composé co-agrégeant détecté selon l'invention est capable d'inhiber (par stimulation de la régulation négative). Un moyen pour vérifier qu'un composé est capable de stimuler la régulation négative de l'activation d'un RTK, ou pour mesurer son niveau d'efficacité, comprend ainsi notamment la vérification d'un effet inhibiteur du composé testé sur la réponse non immunitaire induite par ledit RTK. Ladite réponse cellulaire induite par ledit RTK, qu'un composé coagrégeant détecté selon l'invention peut inhiber, est avantageusement comprise parmi le groupe constitué par la mise en route du cycle cellulaire (passage de l'état quiescent Go à la phase G1; passage de G1 à phase S de synthèse d'ADN ; de S à la phase G2 et de la phase G2 à la phase M de mitose ; retour de M vers l'état quiescent Go) le déclenchement d'une mitose, l'induction d'une différenciation cellulaire, le déclenchement d'une méiose, l'activation d'un métabolisme essentiel à la vie cellulaire tel que le métabolisme du glucose, le métabolisme des nucléosides, le métabolisme des acides aminés. Un moyen pour vérifier qu'un composé co-agrégeant détecté selon l'invention est capable d'inhiber la prolifération des cellules exprimant les RTK et les récepteurs à ITIM considérés peut par exemple consister à vérifier que ledit composé co-agrégeant est capable, dans lesdites conditions, d'inhiber l'incorporation, par lesdites cellules, d'un nucléoside, et de thymidine en particulier. Un composé co-agrégeant détecté selon l'invention est ainsi capable d'inhiber de telles réponses non immunitaires, et, de manière particulièrement remarquable, de bloquer au stade G1 les cellules exprimant les RTK et récepteurs à ITIM considérés, sans pour autant tuer ces mêmes cellules. Avantageusement, ladite détection de la méthode d'identification d'un agent stimulateur selon l'invention est réalisée de manière à détecter un composé comprenant au moins une entité présentant, dans lesdites conditions, une affinité pour une molécule choisie panni le groupe constitué par ledit RTK, une partie extracytoplasmique de ce RTK, une partie intracytoplasmique de ce RTK, un ligand de ce RTK ou une molécule capable de se fixer à ce ligand. Ladite détection est en outre avantageusement réalisée de manière à détecter un composé comprenant au moins une entité présentant, dans lesdites conditions, une affinité pour me molécule choisie parmi le groupe constitué par ledit récepteur à ITIM, une partie extracytoplasmique de ce récepteur, une partie intra-cytoplasmique de ce récepteur, un motif ITIM de ce récepteur, un ligand de ce récepteur ou une molécule capable de se fixer à ce ligand. Un composé co-agrégeant détecté selon l'invention est donc capable de se lier de manière directe au RTK et/ou au récepteur à ITIM considéré, ou bien de manière indirecte, par l'intermédiaire d'un ligand de ce RTK et/ou de ce récepteur à ITIM, ou d'une molécule se fixant à ce(s) ligand (s). Ledit RTK peut être avantageusement choisi parmi le groupe constitué par un récepteur pour un facteur de croissance, un récepteur pour un facteur de différenciation, un récepteur pour une hormone. Des exemples de tels RTK comprennent les récepteurs PDGF-R, CSF-R, EGF-R, NGF-R, Insuline-R, Kit. Ledit récepteur à ITIM peut être avantageusement choisi parmi le groupe constitué par les RFcyIIB (cellules B, T), les KIR (cellules NK et mastocytes), Ly49 et NKG2A, CD22 et CD72 (cellules B), les PIR-B (cellules B et cellules myeloïdes), gp49Bet MAFA (mastocytes), les ILTs et LIRs (mastocytes et cellules dendritiques), LAIRs (cellules lymphoïdes), SIRPa (cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques). Un composé co-agrégeant particulier détecté selon l'invention est capable, dans lesdites conditions, de co-agréger le récepteur à ITIM RFcyIIB, à un RTK, et à Kit notamment. Un tel composé co-agrégeant particulier est par exemple essentiellement constitué de tout ou partie d'une portion Fc d'anticorps, et de tout ou partie d'un ligand dudit RTK (dans le cas du RTK Kit, le ligand est le facteur de croissance des cellules souches (SCF)). Le récepteur à ITIM ici considéré étant le RFcylIB, des exemples de tels composés co-agrégeants particuliers détectés selon l'invention comprennent des anticorps, et des auto-anticorps isolés. Ils comprennent également des composés artificiels résultant de la combinaison artificielle de fragments Fv, Fab, F (ab')2, CDR d'anticorps anti-RFc[gamma]IIB et de fragments Fv, Fab, F (ab')2, ou CDR d'anticorps anti-RTK, et anti-Kit an particulier. Un autre aspect de l'invention vise une méthode pour l'identification d'un agent utile à l'inhibition d'une régulation négative de l'activation d'un RTK, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé qui soit antagoniste d'un composé capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de co-agréger un récepteur à activité tyrosine-kinase (RTK) à un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, et/ou en ce qu'elle comprend la détection des entités constitutives d'un tel composé antagoniste. Le composé antagoniste ainsi détecté selon l'invention, ou la combinaison des entités constitutives d'un tel composé antagoniste correspond essentiellement, selon l'invention, à un agent utile à l'inhibition d'une régulation négative de l'activation d'un RTK. Des exemples de conditions appropriées à la physiologie cellulaire ont été indiquées ci-dessus. Un moyen de réaliser ladite détection consiste à cribler fonctionnellement des banques chimiques et/ou biologiques selon les techniques classiques. Des exemples de banques biologiques appropriées comprennent notamment des banques de phages exprimant après recombinaison génétique des anticorps ou auto-anticorps humains, et/ou des fragments de tels anticorps ou autoanticorps, des banques chimiques peuvent également être criblées de manière à identifier des mimétopes. Par composé antagoniste d'un composé co-agrégeant, nous entendons, dans la présente demande, tout composé qui est capable, dans lesdites conditions, de diminuer de manière significative, ou d'empêcher, l'action de co-agrégation dudit composé co-agrégeant. Un tel composé antagoniste détecté selon l'invention est capable d'inhiber la régulation négative de l'activation d'un RTK, et est ainsi indirectement capable de stimuler cette activation. Ladite détection de la méthode d'identification d'un agent inhibiteur selon l'invention est avantageusement réalisée de manière à détecter un composé capable, dans lesdites conditions, d'empêcher la liaison (directe ou indirecte) de ladite molécule co-agrégeante au RTK considéré, ou bien encore d'empêcher la liaison (directe ou indirecte) de ladite molécule coagrégeante au récepteur à ITIM considéré, ou bien encore d'empêcher ces deux types de liaison. Un tel composé antagoniste détecté selon l'invention est avantageusement choisi ou construit de manière à bloquer le site de liaison au ligand dudit RTK, et/ou de bloquer ledit récepteur à ITIM au niveau de son site de liaison au ligand ou au niveau du (ou de ses) motif(s) ITIM. Un tel composé antagoniste détecté selon l'invention peut ainsi être choisi de manière à être capable, dans lesdites conditions, de bloquer le site de liaison au ligand dudit RTK. Dans le cas particulier où le récepteur à ITIM considéré est le RFcyIIB, ledit composé antagoniste selon l'invention peut dériver d'un anticorps, ou d'un auto-anticorps, par suppression de la (ou des) partie(s) de cet anticorps reconnue(s) par le RFcyIIB, et par suppression de son fragment Fc en particulier, ledit anticorps étant capable, dans lesdites conditions, et lorsqu'il comporte l'ensemble de ses entités (anticorps complet), de stimuler la régulation négative d'une activation de RTK. Un tel composé antagoniste particulier détecté selon l'invention est alors essentiellement constitué par un fragment d'anticorps ou d'auto-anticorps, et d'anticorps ou auto-anticorps humain en particulier, préférentiellement choisi parmi le groupe constitué par un fragment Fv, Fab, F (ab')2, ledit fragment étant dirigé contre le RTK considéré. Un anticorps, ou autoanticorps, considéré comme inhibiteur de l'activation d'un RTK peut ainsi, selon l'invention, si l'inhibition observée avec cet anticorps est exercée par l'intermédiaire du récepteur à ITIM RFcylIB, présenter des propriétés de stimulateur de cette même activité en lui retirant la ou les partie(s) reconnue(s) par RFcyIIB, et en lui retirant sa position Fc en particulier. Des exemples de tels composés antagonistes selon l'invention comprennent également, dans le cas où le récepteur à ITIM considéré est RFcylIB, tout fragment d'anticorps ou auto-anticorps, qui soit dirigé contre le RFcylIB, sans être dirigé contre le RTK considéré, cela de manière à bloquer le site de liaison du RFcyIIB considéré ; de manière avantageuse, ce fragment d'anticorps est spécifique du récepteur à ITIM considéré. Des fragments d'anticorps préférés sont d'origine humaine. Un composé antagoniste détecté selon l'invention peut également être choisi de manière à être capable, dans lesdites conditions, de bloquer le récepteur à ITIM considéré au niveau de son site de liaison au ligand, et/ou au niveau de son (ou ses) motif(s) ITIM. Lorsqu'un composé co-agrégeant selon l'invention co-agrège efficacement un récepteur à ITIM à un RTK, le (ou les) motif(s) ITIM dudit récepteur à ITIM deviennent phosphorylés, puis recrutent des phosphatases telles que SHIP (cas de RFcylIB), SHP-1 SHP-2 (cas des autres récepteurs à ITIM). Un composé antagoniste détecté selon l'invention peut donc être essentiellement constitué de toute entité capable, dans lesdites conditions, de bloquer le (ou les) motif (s) dudit récepteur à ITIM, et/ou capable d'empêcher la fixation de phosphatases telles que SHIP, SHP-1, SHP-2. Un autre aspect de l'invention vise ainsi tout composé artificiel capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de coagréger un récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) et un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, ainsi que tout composé artificiel antagoniste d'un tel composé artificiel co-agrégeant. Par composé artificiel selon l'invention, nous entendons, dans la présente demande, tout composé obtenu par synthèse chimique et/ou génie génétique telle que, notamment, molécule chimique ou peptide simple obtenu par synthèse chimique, combinaison de fragments d'anticorps ou d'auto-anticorps, et d'anticorps ou d'auto-anticorps humains en particulier, telle qu'anticorps humanisés, anticorps bispécifique, fragment scFv (fragment simple-chaîne de fragments variables). Un composé artificiel co-agrégeant selon l'invention peut être par exemple obtenu en assemblant des fragments d'anticorps anti-RTK et antirécepteur à ITIM (ou anti-ligand de ces récepteurs, ou anti-molécules se fixant à ces ligands), de manière à former un anticorps bispécifique ou un scFv (anticorps qui peut être produit par expression recombinante par des bactéries sous une forme associée à la protéine GST, et purification à l'aide d'anticorps anti-GST). De tels composés artificiels sont capables, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de contrôler la régulation négative d'une stimulation transmise par un RTK, et en particulier de contrôler la régulation négative d'une prolifération et/ou une différenciation cellulaire induite par un RTK : lorsqu'ils sont co-agrégeants, lesdits composés artificiels sont ainsi capables de stimuler une telle régulation négative ; lorsqu'ils sont antagonistes, ils sont capables d'inhiber une telle stimulation. Cet aspect de l'invention inclut donc également tout agent artificiel tel qu'obtenu à l'aide d'une méthode d'identification selon l'invention présentée ci-dessus. Selon un autre aspect, la présente invention vise également l'utilisation d'un agent stimulateur ou inhibiteur identifié selon l'invention, et/ou d'un composé artificiel selon l'invention dans le diagnostic (à titre de cible à détecter), et/ou la prévention, le soin, le traitement (à titre d'agent actif ou d'adjuvant) d'une régulation négative inappropriée (excessive ou déficiente) de l'activité d'un RTK. Un agent identifié selon l'invention, ou un composé artificiel selon l'invention, peut ainsi avantageusement être utilisé, à titre de cible, pour le diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée (jugée excessive ou déficiente) de l'activation d'un RTK. Des agents préférés pour une telle utilisation à titre de cible diagnostique comprennent notamment des anticorps ou auto-anticorps humains, et leurs fragments. L'invention vise ainsi une méthode pour le diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activité d'un RTK, caractérisée en ce qu' elle comprend : - la détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un agent, stimulateur ou inhibiteur de ladite régulation négative, tel qu'identifié selon l'invention, et/ou d'au moins un composé artificiel co-agrégeant ou antagoniste selon l'invention avec, le cas échéant, la mesure de son titre (ou leurs titres respectifs), et - la comparaison du résultat obtenu pour ledit échantillon aux résultats observés en moyenne en conditions physiologiques. Un kit pour la mise en oeuvre de cette méthode de diagnostic selon l'invention comprend les réactifs nécessaires à la détection des molécules visées. Par exemple, un kit destiné au diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activation de RTK par des récepteurs RFcyIIB peut comprendre les réactifs nécessaires à la détection de molécules coagrégeantes naturelles telles que des auto-anticorps anti-RTK ; de tels réactifs peuvent par exemple correspondre à des cellules transfectées par les cDNA codant les RTK considérés, et à des réactifs d'immunofluorescence indirecte. Un kit destiné à la détection d'auto-anticorps anti-facteur de croissance peut comprendre les réactifs nécessaires à la réalisation d'un test ELISA sur des facteurs de croissance immobilisés sur des plaques à 96 puits. Une autre méthode selon l'invention pour le diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activité d'un RTK comprend : - la détection, dans un échantillon biologique, du niveau de phosphorylation de récepteur à ITIM, et - la comparaison du résultat obtenu pour ledit échantillon aux résultats observés en moyenne en conditions physiologiques. Un kit pour la mise en oeuvre de cette autre méthode de diagnostic selon l'invention comprend notamment les réactifs à la détection d'un niveau de tyrosine-phosphorylation, tels que le matériel et les réactifs nécessaires à une immunoempreinte à l'aide d'anticorps anti-phosphotyrosine. Un tel kit peut, en outre, également comprendre le matériel et les réactifs nécessaires à l'immunoprécipitation des récepteurs à ITIM visés, de préférence à l'aide d'anticorps spécifiques des récepteurs à ITIM particuliers visés. La présente demande vise également l'utilisation d'un agent identifié selon l'invention et/ou d'un composé artificiel selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à pallier, prévenir, et/ou traiter une régulation négative inappropriée de l'activation d'un RTK. Un agent stimulateur de ladite régulation négative, identifié selon l'invention, ou un composé co-agrégeant artificiel selon l'invention peut en effet être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir, pallier et/ou traiter une régulation négative déficiente de l' activation d'un RTK (prolifération et/ou différenciation jugée(s) excessive(s)), et pour la fabrication d'un médicament anti-cancéreux, contraceptif ou abortif en particulier. Un agent inhibiteur de ladite régulation négative, identifié selon l'invention, ou un composé antagoniste artificiel selon l'invention peut quant à lui être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir, pallier et/ou traiter me régulation négative excessive d'un RTK (déficience en prolifération et/ou différenciation cellulaire), et, avantageusement, pour la fabrication d'un médicament choisi parmi le groupe constitué par un médicament destiné à re-stimuler un système immunitaire, un médicament contre l' aplasie, un médicament destiné à stimuler une prolifération cellulaire, un médicament destiné à réparer des lésions cutanées, un médicament contre le diabète, un médicament contre une stérilité, et une stérilité masculine en particulier. Le terme médicament comprend ici l'agent actif, tout comme l'adjuvant qui sert à son administration. Les molécules antagonistes selon l'invention peuvent en effet être avantageusement utilisées pour la fabrication d'adjuvant des médicaments ci-dessus mentionnés, et d'un adjuvant de vaccin en particulier. La présente invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre illustratif : ne la limitent en aucune façon. Il y est fait référence aux figures 1 à 4. Les figures 1A,1B,1C représentent l'incorporation dans des mastocytes déficient la RFc[gamma]IIB-/- et de type sauvage de thymidine induite par des anticorps anti-c-Kit. Les figures 2A, 2B, 2C, 2D illustrent l'incorporation dans des mastocytes BALB/c de thymidine induites par des anticorps anti-c-Kit. Les figures 3A et 3B illustrent la phosphorylation de RFcyIIB et c-Kit, et le recrutement de phosphatases par RFcylIB après co-agrégation de c-Kit avec RFcylIB. La figure 4 représente l'induction et l'inhibition de la prolifération de mastocytes (agrégation de c-kit et co-agrégation de c-kit aux RFcyIIB respectivement). EXEMPLES 1 Nous avons étudié les conséquences d'une co-agrégation des RFcyIIB à c-Kit qui sont co-exprimés par les mastocytes. Le protooncogène c-Kit est me protéine transmembranaire qui est un récepteur à tyrosine kinase de la famille des récepteurs CSF-1/PDGF ("colony stimulating factor-1/platelet- derived growth factor", facteur de stimulation des colonies 1/facteur de croissance dérivé des plaquettes). Après dimérisation par le SCF ("Stem Cell factor"), c-Kit est autophosphorylé et induit la prolifération cellulaire. c-Kit contrôle ainsi la croissance des cellules hématopoïétiques, des cellules germinales, des mélanocytes et des cellules intestinales et interstitielles. Dans les cellules transformées de mastocytomes de rat, de souris, et d'homme, une mutation ponctuelle dans le domaine kinase conduit à une activation constitutive de c-Kit et est à l'origine de ses propriétés oncogéniques. Des mastocytes dérivés de moëlle osseuse dépendants de facteur de croissance (BMMC) sont obtenus à partir de souris déficientes en RFcylIB et à partir de souris normales (témoins) C57BL/6. Les BMMC ont été obtenus en cultivant des cellules de moëlle osseuse de souris dans un milieu de culture constitué par RPMI (Seromed), du sérum de veau foetal (SVF) à 10%, de la glutamine, de la pénicilline et de la streptomycine (Gibco), et complémenté avec 20% de milieu conditionné par culture de cellules WEHI-3B. Après 4 semaines de culture, on constate, par observation microscopique et par immunofluorescence à l'aide d'IgE de souris et de fragments F(ab')2 d'Ig de chèvre anti-souris conjugués au FITC (Jackson ImmuroResearch), que les cultures contiennent plus de 90% de mastocytes. Il est connu que les BMMC expriment essentiellement RFcylIB et des traces de RFcylIIA. L'absence de RFcylIB dans les BMMC RFc[gamma]IIB-/- a été vérifiée par analyse, à l'aide d'anticorps polyclonaux anti-peptide spécifiques des RFcyIIB, de transferts de Western ("Western blot") de lysats cellulaires. Des fractions aliquotes de 5 x 105 BMMC ont été lysées pendant 5 minutes à 95 C dans du SDS (sodium dodécylsulfate) à 4% dans du RPMI. Les protéines sont précipitées à l'acétone froid pendant 30 minutes à 0 C, et lyophilisées sous vide (speedvac) pendant 20 minutes. Les précipités ont été solubilisés dans un tampon réducteur par électrophorèse, soumis à une électrophorèse en SDS et transférés sur des membranes Immobilon-P (Millipore). Les membranes sont saturées à l'aide de BSA (albumine de sérum bovin) à 5% diluée dans un tampon contenant 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl pH 7,4 et 0,5% de Tween 20 (Merk) (Tampon de Western), et incubées avec des anticorps polyclonaux de lapins anti-RFc[gamma]IIB, puis avec des Ig de chèvre anti-lapin conjuguées à la peroxydase de raifort (GAR) (Santa Cruz). Les anticorps marqués à la peroxydase ont été détectés à l'aide du kit ECL Amersham. Les résultats sont illustrés par la figure 1 A où est représentée l'expression de RFcyIIB dans des BMMC RFc[gamma]IIB-/- et des BMMC témoins C57BL/6. Des niveaux comparables d'incorporation de thymidine sont induits par le SCF dans les BMMC témoins et dans les BMMC RFc[gamma]IIB-/-. Les résultats sont illustrés par la figure 1B qui représente l'incorporation de thymidine induite par le SCF ("Stem Cell factor"). Les BMMC ont été incubées pendant 24 heures avec les concentrations indiquées de SCF, et l'incorporation de thymidine a été mesurée comme suit : des fractions aliquotes de 3 x 104 BMMC dans 40 l de RPMI contenant du SVF à 1% et de la BSA à 0,5% (Sigma) ont été incubées dans des plaques à 96 puits en présence de SCF recombinant (R&D Systems), ou en présence des concentrations indiquées des complexes immuns préformés, pendant 24 heures à 37 C. 0,5uCi de [3H]thymidine ont été ajoutés dans les puits, et les cellules ont été incubées pendant 4 heures supplémentaires à 37 C. Les cellules ont été récoltées à l'aide d'un micro-récolteur à cellules (Skatron) et la radioactivité incorporée a été mesurée à l'aide d'un compteur ss (Phannacia). Lorsqu'ils sont incubés avec des BMMC pendant 24 heures, les complexes immuns, réalisés avec des anticorps IgG ACK2 anticorps de rat anti-c-Kit de souris et des fragments F (ab')2 d'anticorps MAR (anticorps de souris anti-Ig de rat), n'induisent pas d'incorporation de thymidine dans les BMMC témoins. Les mêmes complexes induisent une incorporation dose- dépendante de thymidine dans les BMMC RFc[gamma]IIB-/-. Les résultats sont illustrés par la figure 1 C qui représente l'incorporation de thymidine induite par des complexes ACK2 F (ab')2 Les BMMC ont été incubés pendant 24 heures avec des complexes préfonnés constitués par les concentrations indiquées de F (ab')2 et d'IgG ACK2. L'incorporation de thymidine a été mesurée comme décrit ci-dessus à la figure 1B. La légende de la figure 1C est la suivante : rond blanc 0 ug/ml de MAR F (ab')2, noir 1 g/ml de MAR F (ab')2, carré noir 3 ug/ml de MAR F (ab')2, noir 10 g/ml de MAR F (ab')2. Ceci indique que les anticorps anti-c-Kit sont capables de mimer les effets du SCF dans les BMMC à la condition que ces BMMC n'expriment pas des RFcylIB qui pourraient être engagés avec la portion Fc des anticorps. Pour confinner cette hypothèse, des BMMC ont été produits à partir de souris BALB/c et ont été utilisés dans toutes les expériences qui suivent. Les BMMC BALB/c expriment c-Kit, comme le montrent les analyses par immunofluorescence avec ACK2, et expriment des RFcy, comme le montrent les analyses avec l'anticorps 2.4G2 de rat anti-RFcyIIB/IIIA de souris. Les analyses relatives à c-Kit avec ACK2 ont été réalisées par immunofluorescence indirecte comme suit. Les BMMC ont été incubées pendant 1 heure à 0 C en présence de 10 g/ml d'anticorps de rat 2. 4G2 ou ACK2 dans du HBSS (Solution Saline isotonique de Harks) contenant du SVF à 5%, ou en présence de milieu seul. Les cellules ont été lavées et marquées en les incubant pendant 30 minutes à 0 C en présence de 50 ug/ml de fragments F (ab')2 de souris anti-rat (MAR) à l'isothiocyanate de fluoresceine (Jackson ImmunoResearch). La fluorescence a été analysée par cytométrie de flux en utilisant un "FACScalibur"(Becton-Dickinson). Les analyses relatives à RFcyIIB ont été réalisées par immunofluorescence indirecte à l'aide de l'anticorps 2. 4G2 décrit par J.C. Unkeless, J. Exp. Med. 150, 580 (1979). Les résultats sont illustrés par la figure 2A où est représentée l'expression de c-Kit et de RFcyIIB par les BMMC. La liaison de l'anticorps anti-c-Kit ACK2 et celle de l'anticorps anti-RFcylIB 2. 4G2 sont analysées par immunofluorescence indirecte comme décrit ci-dessus. L'histogramme de gauche montre la fluorescence de cellules incubées seulement en présence de fragments MAR F(ab')2-FITC. L'histogramme en trait épais montre la fluorescence de cellules incubées en présence de fragments MAR F(ab')2FITC et d'anticorps 2. 4G2. L'histogramme en trait fin montre la fluorescence de cellules incubées en présence de fragments MAR F(ab')2-FITC et d'anticorps ACK2. Ces BMMC incorporent de la thymidine lorsqu'ils sont incubés pendant 24 heures avec du SCF, mais aussi lorsqu'ils sont incubés avec des fragments F (ab')2 complexés à des fragments MAR F (ab')2. Ces résultats sont illustrés par la figure 2B. L'incorporation de thymidine a été mesurée comme décrit plus haut. La légende de la figure 2B est la suivante : petit losange noir 0 g/ml de MAR F (ab')2 pour les concentrations de ACK2 indiquées en abscisse, rond noir 1 g/ml de MAR F(ab')2 pour les concentrations de ACK2 indiquées en abscisse, carré noir 10 g/ml de MAR F (ab')2 pour les concentrations de ACK2 indiquées en abscisse. Bien que l'anticorps ACK2 bloque la liaison du SCF à c-Kit, et ait été décrit comme un anticorps antagoniste de la stimulation, il peut donc fonctionner comme un anticorps agoniste de la stimulation lorsqu'il est dépourvu de sa portion Fc. L'ensemble des données présentées ici suggèrent que la co-agrégation de cKit avec les RFcyIIB par l'intermédiaire des portions, Fab et Fc des anticorps anti-c-Kit, respectivement, peut inhiber les réponses prolifératives des BMMC induites par c-Kit. Pour démontrer cette possibilité, des complexes immuns ont été fabriqués avec des anticorps anti-biotine et des IgG ACK2 biotinylées, les complexes ont été utilisés pour stimuler des BMMC BALB/c dans lesquels les RFcyIIB sont libres, ou ont été rendus inaccessibles à l'aide de l'anticorps 2. 4G2 qui bloque le site de liaison de RFcylIB. (J.C. Unkeless, J. Exp. Med. 150, 580 (1979)). Lorsqu'ils sont incubés avec les BMMC pendant 24 heures, les complexes anti-biotine-ACK2-biotine n'induisent pas d'incorporation significative de thymidine. Si, cependant, les BMMC sont préincubés avec l'anticorps 2.4G2, les mêmes complexes induisent une incorporation dosedépendante de thymidine. Ces résultats sont illustrés par la figure 2C. Les BMMC préincubées avec 2.4G2 (agrégation de c-Kit, symboles blancs), ou sans 2. 4G2 (co-agrégation RFcyIIB-c-Kit, symboles noirs) ont été incubés pendant 24 heures avec les complexes constitués par les concentrations indiquées de biotine-ACK2 et d'anticorps anti-biotine (a-biotine en abrégé), et l'incorporation de thymidine a été mesurée comme indiqué ci-dessus pour la figure 2B. La légende de la figure 2C est la suivante : - courbes de gauche : rond noir : a-biotine 0 g/ml, 2. 4G2 0 g/ml, triangle noir : a-biotine 3 g/ml, 2. 4G2 0 ug/ml, rond blanc : a-biotine 0 g/ml, 2. 4G2 10 g/ml, triangle blanc : a-biotine 3 g/ml, 2. 4G2 10 g/ml, - courbes du centre : rond noir : a-biotine 0 g/ml, 2. 4G2 0 g/ml, triangle noir : a-biotine 10 g/ml, 2. 4G2 0 g/ml, rond blanc : a-biotine 0 ug/ml, 2. 4G2 10 g/ml, triangle blanc : a-biotine 10 g/ml, 2. 4G2 10 g/ml, - courbes de droite : rond noir : a-biotine 0 g/ml, 2. 4G2 0 g/ml, triangle noir : a-biotine 30 g/ml, 2. 4G2 0 g/ml, rond blanc : a-biotine 0 ug/ml, 2. 4G2 10 ug/ml, triangle blanc : a-biotine 30 ug/ml, 2. 4G2 10 g/ml, Aucune liaison de l'annexine V n'est détectable dans les cellules traitées avec les complexes biotine ACK2-anti-biotine, qu'elles aient été ou non préincubées avec l'anticorps 2. 4G2, ce qui exclut la possibilité que le défaut d'incorporation de thymidine par les BMMC non exposés à 2.4G2 puisse être à une apoptose. Pour analyser l'apoptose, les BMMC ont été incubés avec ou sans l'anticorps 2. 4G2, et stimulés avec les complexes immuns comme décrit ci-dessus. Des cellules traitées pendant 1 heure à 37 C avec 0,5g/ml d'anticorps monoclonal anti-Fas (Phanningen) ont servi de témoins positifs. Des fractions aliquotes de 5 x 105 cellules ont été lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Sodium), incubées pendant 10 minutes à 0 C en présence d'iodure de propidium et d'annexine V conjuguée à la FITC comme recommandé par le fabricant (Immunotech). La fluorescence a été analysée à l'aide d'un "FACScalibur". Les résultats sont illustrés par la figure 2D sur laquelle peut être observée l'absence d'apoptose après agrégation de cKit ou après co-agrégation c-Kit-RFcyIIB. Sur cette figure 2D, les BMMC préincubés en présence de 2. 4G2 (agrégation de c-Kit, courbe de droite) ou en l'absence de 2.4G2 (co-agrégation c-Kit-RFcylIB, courbe de gauche) ont été incubées pendant 24 heures en présence de complexes biotine ACK2anti-biotine et les cellules mortes et apoptotiques ont été visualisées à l'aide, d'iodure de propidium et d'annexine V comme ci-dessus indiqué. Lorsqu'ils sont co-engagés avec c-Kit par le même anticorps, les RFcylIB peuvent donc inhiber l'incorporation de thymidine induite par des anticorps anti-c-Kit sans pour autant tuer les BMMC. Afin d'analyser la contribution du RFcylIB dans cette inhibition, les BMMC ont été préincubés avec ou sans de 2. 4G2 avant d'être stimulés pendant 5 minutes à l'aide de complexes biotine-ACK2-anti-biotine. RFcyIIB et c-Kit ont été immunoprécipités, et leur phosphorylation a été analysée par immunoempreinte à l'aide d'anticorps anti-phosphotyrosine. Brièvement, les expériences ont été réalisées comme suit. Les BMMC, remis en suspension à 5 x106/ml, ont été incubés pendant 1 heure à 37 C en présence ou en absence de 10 g/ml de 2. 4G2 dans du milieu de culture. Ils ont été lavés, remis en suspension à la même concentration dans le même milieu, et stimulé pendant 5 minutes à 37 C pour des complexes immuns ou du SCF. Ils ont été centrifugés, et les culots contenant 1 x 107 cellules pour l'immunoprécipitation par anti-c-Kit, ou 3 x 107 cellules pour l'immunoprécipitation par anti-RFcylIB ont été lysés pendant 15 minutes à 0 C à la concentration de 1 x 108 cellules/ml dans un tampon de lyse contenant 10 mM de Tris pH 7,4 ; mM de NaCl; 1% de NP40; 1mM de Na3VO4; 5mM de NaF; 5 mM de pyrophosphate de sodium; 0,4 mM d'EDTA; 10 ug/ml d'aprotinine; 10 ug/ml de leupeptine; 10 ug/ml de pepstatine et 1 mM de PMSF. Les lysats ont été centrifugés à 10 000 RPM pendant 15 minutes à 4 C, et les surnageants ont été incubés pendant 1 heure à 4 C avec de la protéine G-Sepharose conjuguée à l'anticorps anti-c-Kit 2B8 (Pharmingen), ou à l'anticorps 2. 4G2. Les immunoadsorbants ont été lavés dans le tampon de lyse et portés à ébullition pendant 3 minutes dans le tampon échantillon. Le matériel élue a été fractionné par électrophorèse la SDS et transféré sur des membranes d'Immobilon-P. Les membranes ont été saturées avec du BSA à 5% ou du lait écrémé à 5% (Régilait) dilué dans du tampon de Western. Les membranes sur lesquelles ont été transférées les immunoprécipités anti-c-Kit ont alors été incubées soit avec des anticorps anti-PY conjugués à la peroxydase de raifort (Chemicon) soit avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-c-Kit (Upstate Biotechnology Inc.), puis avec des anticorps de chèvre anti-lapin (GAR) conjugués à la peroxydase de raifort. Les membranes sur lesquelles ont été transférées les immunoprécités anti-RFcyIIB ont été incubées soit avec des anticorps anti-PY conjugués à la peroxydase de raifort soit avec des anticorps anti-RFcylIB, anti-SHP-1 (Transduction Laboratories) ou anti-SHIP (Upstate Biotechnology Inc. ), puis avec des anticorps de chèvre anti-lapin (GAR) ou des Ig de chèvre anti-souris conjugués à la peroxydase de raifort (Santa Cruz). Les anticorps marqués à la peroxydase ont été révélés à l'aide du kit ECL Amersham. Lorsqu'ils ont été co-agrégés avec c-Kit, les RFcyIIB sont devenus phosphorylés, et SHIP, mais pas à SHP-1, a co-précipité avec les RFcylIB phosphorylés. La phosphorylation des RFcyIIB et la co-précipitation de SHIP sont toutes deux empêchées lorsque les BMMC ont été incubés avec 2.4G2 avant d'être stimulés pour les complexes biotine ACK2-anti-biotine. Les résultats sont illustrés par la figure 3A qui représente la phosphorylation de RFcyIIB, et le recrutement de phosphatases. Les RFcyIIB ont été immunoprécipitées à partir de BMMC stimulés avec des complexes biotine ACK2-anti-biotine après incubation pendant 5 minutes en présence de 2.4G2 (agrégation de c-Kit) ou en absence de 2. 4G2 (co-agrégation c-Kit-RFcyIIB) comme décrit ci-dessus. Les immunoprécipités (Ip: a- RFcylIB) ont été soumis à électrophorèse et incubés séquentiellement avec des anticorps antiphosphotyrosine (a-PY), avec des anticorps anti-RFcylIB afin de vérifier que des quantités comparables de matériels ont été immunoprécipitées, et avec des anticorps anti-SHIP et anti-SHP-1 de manière à identifier les phosphatases co--précipitées. Les 4 pistes visibles dans la figure 3A correspondent au matériel immunoprécipité à partir de cellules traitées comme suit : piste 1, milieu de réaction, piste 2, complexes biotine-ACK2-anti-biotine seuls, piste 3, complexes biotine-ACK2-anti-biotine et 2. 4G2, piste 4, les lysats de cellules entières (WCL) ont servi de témoins positifs pour la détection des phosphatases. Du haut vers le bas, cette figure 3A, montre les protéines phosphorylées (blot : a-PY) les RFcylIB (blot : a-RFcyIIB), SHIP (blot: aSHIP) et SHP-1 (blot:a-SHP-l). Les complexes biotine-ACK2-anti-biotine ont aussi induit la tyrosylphosphorylation de c-Kit. La phosphorylation est intensité comparable, que les BMMC aient été préincubés avec ou sans 2. 4G2, indiquant que la coagrégation de c-Kit avec RFcylIB n'empêche pas sa phosphorylation. Ces résultats sont illustrés par la figure 3B : a été immunoprécipité à partir de BMMC incubés pendant 5 minutes avec du SCF, ou avec des complexes anti-biotine-ACK2-biotine après incubation avec 2. 4G2 (agrégation de c-Kit) ou sans 2. 4G2 (co-agrégation c-Kit-RFcylIB) comme décrit ci-dessus; les immunoprécipités ont été fractionnés par électrophorèse et analysés par immunoempreinte avec des anticorps anti-phosphotyrosine (a-PY), et avec des anticorps anti-c-Kit afin de vérifier que les quantités comparables du matériel ont été immunoprécipitées. La figure 3B montre les protéines phosphorylées en haut et c-Kit en bas. Les pistes correspondent au matériel immunoprécipité à savoir des cellules traitées comme suit : piste 1, SCF, piste 2, milieu seul, piste 3, complexes anti-biotine-ACK2-biotine, et 2.4G2; piste 4, complexes biotineACK2-anti-biotine. Les RFcyIIB peuvent donc être phosphorylés lorsqu'ils sont à proximité de c-Kit activé, ce qui leur permet de recruter SHIP. Comme SHIP n'est pas me protéine tyrosine phosphatase celle-ci n'affecte pas la phosphorylation de c-Kit, mais elle peut bloquer des signaux situés en aval, qui conduisent à une réponse proliférative. Finalement, nous avons examiné les conséquences de l'agrégation de cKit et de la co-agrégation de c-Kit à RFcyIIB sur la prolifération de BMMC. Des BMMC, préincubés avec ou sans 2.4G2, ont été cultivés pendant 4 jours en présence d'une concentration limitante de milieu conditionné WEHI-3, permettant la survie des BMMC, mais pas leur prolifération. Les BMMC ont été incubés en présence ou en absence de 10 g/ml de 2. 4G2 pendant 1 heure à 37 C dans du milieu du culture complémenté à 2% par du milieu conditionné WEHI-3B. Les cellules ont été ensemencées à 3 x 105 cellules/ml avec les complexes immuns préformés indiqués dans des plaques à 96 puits dans le même milieu. Après 4 jours de culture, les cellules excluant le bleu de Trypan ont été comptées au microscope. Les complexes biotine ACK2-anti-biotine induisent la prolifération des cellules dont les RFcyIIB sont bloqués par 2. 4G2, mais n'induisent pas la prolifération des cellules dont les RFcyIIB sont accessibles. Ces résultats sont illustrés par la figure 4. Des BMMC, préincubés avec 10 g/ml de 2. 4G2 (agrégation de c-Kit, barres blanches) ou sans 2.4G2 (co-agrégation RFcylIB-c-Kit, barres noires) ont été ensemencés à 3 x 105 cellules par ml et cultivés pendant 5 jours avec des complexes constitués par 10 g/ml de biotine-ACK2 et les concentrations indiquées (de gauche à droite 1 g/ml; 3 g/ml; 10 g/ml) d'anticorps antibiotine comme décrit ci-dessus. Cette figure 4 montre l'augmentation de la concentration en cellules viables après 5 jours de cultures. Ces résultats démontrent que la prolifération induite par c-Kit, des mastocytes dépendants de facteur de croissance peut être régulée négativement par des anticorps IgG lorsque ces anticorps co-agrègent c-Kit avec RFcyIIB. Cette inhibition n'affecte pas la phosphorylation de c-Kit et est corrélée avec la tyrosylphosphorylation des RFcyIIB (phosphorylation probablement réalisée par c-Kit) et le recrutement subséquent de SHIP. La régulation négative par les RFcylIB de la prolifération cellulaire induite par cKit démontrée ici dans un modèle expérimental peut être induite in vivo par des auto-anticorps non-neutralisants anti-SCF ou anti-c-Kit. Ces résultats appellent à rechercher l'existence de tels anticorps et le rôle qu'ils peuvent jouer dans des conditions normales ou pathologiques. La régulation négative décrite ici n'est sensiblement restreinte ni aux mastocytes ni à c-Kit, et les récepteurs à ITIM tels que les RFcyIIB sont susceptibles de contrôler toute prolifération cellulaire qui dépend d'un facteur de croissance qui se lie à un RTK. Les récepteurs à ITIM tels que les RFcyIIB peuvent donc contrôler la prolifération cellulaire induite par des récepteurs tels que le PDGF-R (récepteur pour le facteur de croissance dérivé de plaquettes), le CSF-R (récepteur pour le facteur de stimulation des colonies), l'EGF-R (récepteur pour le facteur de croissance des cellules épithéliales), le FGF-R (récepteur pour le facteur de croissance des fibroblastes), le NGF-R (récepteur pour le facteur de croissance du système nerveux), le récepteur pour l'insuline. Il s'ensuit que les principales molécules effectrices du système immunitaire, à savoir les anticorps IgG, peuvent contrôler la prolifération de la plupart des cellules de la lignée hématopoïétique. Puisque l'inhibition SHIP-dépendante exercée par les RFcyIIB affecte des signaux libres en aval de la phosphorylation du récepteur, elle peut aussi affecter la prolifération de cellules transformées indépendantes de facteur de croissance qui portent une forme oncogénique, constitutivement activée, d'un RTK. Ainsi, les anticorps (IgG dans le cas des RFcylIB) anti-RTK ou anti-ligand d'un tel récepteur (anti-facteur de croissance par exemple) fournissent des outils thérapeutiques potentiels pour contrôler spécifiquement la prolifération de cellules malignes exprimant des récepteurs à ITIM tel que les RFcylIB. EXEMPLE 2 : Le criblage fonctionnel de banques chimiques et/ou biologique permet d'identifier d'autres molécules co-agrégeantes ou antagonistes selon l'invention. Un tel criblage s'effectue selon les techniques standards de criblage. Une stratégie de criblage appropriée est la suivante : 1. Recherche de ligands monovalents capables de se lier à des immunorécepteurs à ITIM et à des RTK : - Contruction d'une banque de molécules monovalentes, - Construction et expression d'immunorécepteurs à ITIM et de RTK dans des cellules, - Test de liaison des molécules monovalentes aux cellules tranfectées. 2. Recherche de ligands homo-divalents capables d'agréger des RTK: - Construction d'une banque de molécules homo-divalentes, - Construction de chimères activatrices et expression dans des cellules appropriées, - Construction et expression de systèmes rapporteurs dans les mêmes cellules, - Test et transfert dans un système automatisé pour criblage à grande échelle, - Criblage de ligands pour les domaines extracellulaires des récepteurs à étudier. 3. Recherche de ligands hétéro-divalents capables de co-agréger des récepteurs à ITIM et des RTK - Constuction d'une banque de molécules hétéro-divalentes à partir des ligands identifiés au cours de la deuxième phase, - Construction de chimères activatrices et inhibitrices et cotransfection avec un système rapporteur. - Criblage des hétérodimères. REVENDICATIONS 1. Méthode pour l'identification d'un agent utile à la stimulation d'une régulation négative de l' activation d'un RTK, caractérisée en ce qu' elle comprend la détection d'au moins un composé capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de co-agréger un récepteur à activité tyrosine-kinase (RTK) à un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, et/ou en ce qu'elle comprend la détection des entités constitutives d'un tel composé. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite détection est réalisée de manière à détecter un composé comprenant au moins une entité présentant, dans lesdites conditions, une affinité pour une molécule choisie parmi le groupe constitué par ledit RTK, une partie extracytoplasmique de ce RTK, une partie intra-cytoplasmique de ce RTK, un ligand de ce RTK ou une molécule capable de se fixer à ce ligand. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite détection est réalisée de manière à détecter un composé comprenant au moins me entité présentant, dans lesdites conditions, une affinité pour une molécule choisie parmi le groupe constitué par ledit récepteur à ITIM, une partie extracytoplasmique de ce récepteur, me partie intra-cytoplasmique de ce récepteur, un motif ITIM de ce récepteur, un ligand de ce récepteur ou une molécule capable de se fixer à ce ligand. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit composant co-agrégeant détecté est capable, dans lesdites conditions, de conduire à l'inhibition d'une réponse cellulaire de nature non immunitaire à laquelle l'activation de RTK peut être associée, telle que l'inhibition d'une prolifération et/ou différenciation cellulaire. 5. Méthode pour l'identification d'un agent utile à l'inhibition d'une régulation négative de l'activation d'un RTK, caractérisée en ce qu'elle comprend la détection d'au moins un composé qui soit antagoniste d'un composé capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de co-agréger un récepteur à activité tyrosine-kinase (RTK) à un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, et/ou en ce qu'elle comprend la détection des entités constitutives d'un tel composé antagoniste. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite détection est réalisée de manière à détecter un composé capable, dans lesdites conditions, de bloquer le site de liaison au ligand dudit RTK, et/ou de bloquer ledit récepteur à ITIM au niveau de son site de liaison au ligand ou au niveau du (ou de ses) motifs) ITIM. 7. Composé artificiel, caractérisé en ce qu'il est capable, dans des conditions appropriées à la physiologie cellulaire, de co-agréger un récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) et un récepteur comprenant au moins un motif ITIM, ou de s'opposer à une telle co-agrégation. 8. Méthode pour le diagnostic in vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activité d'un RTK, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un agent, stimulateur ou inhibiteur de ladite régulation négative, tel qu'identifié à l'aide d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et/ou d'au moins un composé artificiel co-agrégeant ou antagoniste selon la revendication 7, avec, le cas échéant, la mesure de son titre (ou leurs titres respectifs), et - la comparaison du résultat obtenu pour ledit échantillon aux résultats observés en moyenne en conditions physiologiques. 9. Méthode pour le diagnostic m vitro d'une régulation négative inappropriée de l'activité d'un RTK, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la détection, dans un échantillon biologique, du niveau de phosphorylation de récepteur à ITIM, et - la comparaison du résultat obtenu pour ledit échantillon aux résultats observés en moyenne en conditions physiologiques. 10. Utilisation d'un agent identifié à l'aide d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et/ou d'un composé synthétique selon la revendication 7, pour la fabrication d'un médicament destiné à pallier, prévenir, ou traiter une régulation négative inappropriée (déficiente ou excessive) de l'activation d'un RTK.