Brevet FR2777018A1 — publié le 19991008

La présente invention concerne la mise en évidence d'enzymes de type hydrolase, en particulier de peptidases, par l'utilisation de substrats chromogènes efficaces. Depuis de très nombreuses années, on utilise des substrats particuliers pour permettre la détermination de la présence ou de l'absence d 'activités enzymatiques caractéristiques de bactéries. Par le choix des substrats, selon qu 'il y a réaction ou non il est possible de caractériser la nature d'un genre de bactéries ou de différencier des espèces d'un genre bactérien donné. Les substrats synthétiques d'enzymes sont constituées de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Ces substrats particuliers peuvent être des substrats fluorescents ou chromogènes. En fait, c 'est la seconde partie ou parfie marqueur qui est fluorescente ou chromo gène, lorsqu 'elle n'est pas associée à la première partie. Les substrats fluorescents peuvent être de différentes compositions. Tout d'abord les substrats à base d'umbelliférone ou d'aminocoumarine, et ses dérivés substitués en position 2, qui permettent la libération d'un composé fluorescent de couleur variant du bleu au vert sous lampe à ultraviolets (Uv) (Àex= 365 nm). Ensuite les substrats à base de résorufine (et dérivés) où il y a libération d'un composé fluorescent rose sous lumière naturelle (aux= 530 nm). Enfin les substrats à base de fluorescéine (et dérivés) qui, après dégradation, libère un composé fluorescent jaune sous lumière naturelle (rez= 485 nm). Ces substrats sont peu adaptés à une utilisation dans des milieux gélosés, et sont plus utilisés en milieu liquide. Les substrats chromogènes peuvent également être de différentes natures. Premièrement, ily a les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés qui, en présence d'oxygène, produisent un précipité variant du bleu au rose. Leurs applications sont essentiellement limitées aux osidases, estérases et ne concernent pas la détection d'une activité peptidase. Bien adaptés à une utilisation sur support solide (filtre, gélose, gel d'électrophorèse, ...), ils sont par contre moins bien adaptés à une utilisation en milieu aqueux liquide (formation d'un précipité). Deuxièmement, il y a les substrats à base d'hvdroxyquinohne ou d'esculétine et leurs dérivés, qui en présence de sels de fer, produisent 1m précipité brun. Encore une fois leurs applications sont limitées aux osidases et estérases. Ils sont adaptés à une utilisation sur support solide, et peu adaptés à une utilisation en milieu aqueux liquide. Troisièmement, il existe des substrats à base de nitrophénol et nitroaniline et dérivés, ou l'on obtient la formation d'un composé jaune. ns permettent de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. Cependant, dans le cas de la détection d'activités peptidases, la nitroaniline libérée est toxique pour les bactéries que l'on souhaite identifier ou caractériser, ce qui peut etre préjudiciable pour des analyses en cours ou ultérieures. D'autre part, ils sont peu adaptés à une utilisation sur support solide, et mieux adaptés à une utilisation en milieu liquide. De plus, ils sont peu chromogènes du fait du coefficient d'extinction relativement faible de la couleur (jaune) dont le contraste est peu prononcé dans les milieux biologiques. Enfin et quatrièmement, il y a les substrats à base de naphtol et naphtylamine et ses dérivés. Dans ce cas, la réaction s'effectue en deux temps, le naphtol ou naphtvlamine libéré par l'activité enzymatique subit un "azo-coupling" en présence d'un sel de diazonium qui est ajouté au moment de la révélation, conduisant à la formation d'un composé insolubl coloré. ns permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. La réaction d"'azo-coupling" s'effectue dans un milieu souvent chimiquement agressif, toxique pour les bactéries et rendant l'échantillon inutilisable pour d'autres analyses, de plus les naphtylamines sont cancérigènes. Pour révéler la naphtylamine et donc une activité peptidase, il est aussi possible d'ajouter en fin de réaction enzymatique du p-diméthylaminocinnamaldehyde en milieu acide, à la place d'un sel de diazonium, avec toujours des inconvénients de toxicité vis-àvis de l'échantillon analysé. Il est donc aisé de comprendre qu'il n'existe pas aujourd'hui de substrat chromogène pour révéler une activité peptidase qui soit particulièrement efficace et intéressant. L'invention permet la mise en évidence colorimétrique d'activités enzymatiques de type hydrolases (osidases, estérases, phosphatases, peptidases) à l'aide de substrats synthétiques à base de deux composés, ainsi qu'un procédé nouveau qui peut être appliquée à des milieux réactionnels aussi bien liquides que solides. Après hydrolyse des substrats, la détection des activités enzymatiques est basée sur la formation d'un complexe coloré à partir du couplage oxydatif des deux composés précédemment cités. Ce couplage oxydatif peut être facilité par un oxydant ajouté au milieu réactionnel ou produit lors d'un processus métabolique au sein de ce milieu, ou plus simplement par la présence d'oxygène endogène dans ce même milieu. Selon une première interprétation, la présente invention concerne une association de deux entités distinctes, I'une étant une molécule non chromogéne et l'autre étant le substrat permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins une enzyme. Le substrat est caractérisé par le fait qu'il est constitué d'une partie spécifique de l'enzyme, et d'une molécule non chromogène différente de la première, qui constitue la partie marqueur du substrat; les deux molécules non chromogènes réagissent ensemble quand elles sont sous forme libre et peuvent générer une molécule chromogène. Toujours selon cette première interprétation, I'invention concerne également une association de deux entités distinctes, correspondant chacune à un substrat différent et permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins deux enzymes. Chaque substrat est caractérisé par le fait qu'il est constitué d'une partie spécifique de l'enzyme recherchée, et d'une molécule non chromogène constituant la partie marqueur du substrat et que les deux molécules non chromogènes correspondant aux deux substrats réagissent ensemble quand elles sont sous forme libre et peuvent générer une molécule chromogène. Selon une seconde interprétation qui sera plus particulièrement utilisée par la suite, pour arriver à ce résultat, il est nécessaire d'utiliser une nouvelle forme de substrats. Ainsi, le substrat selon l'invention comporte deux molécules différentes. L'une des molécules est constituée d'une partie spécifique, d'une activité enzymatique, et d'une partie marqueur, distincte d'une molécule chromogène. L'autre molécule comporte toujours la partie marqueur, distincte d'une molécule chromogène, qui est libre ou associée avec au moins une partie spécifique, d'une activité enzymatique. L'objet de l'invention est donc, si la ou les activités enzymatiques sont présentes, de révéler la formation d'une molécule chromogène qui est efficace uniquement lorsque les deux parties marqueur, une fois libérées, se sont associées. A cet effet, la présente invention concerne un substrat chromogène permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins une enzyme, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de l'enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre substance non chromogène, et que la partie marqueur non chromo gène, une fois libérée, réagit avec la seconde molécule pour former une molécule chromogène. La présente invention concerne également un substrat chromogène permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins deux enzymes, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur-non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de la première enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre partie marqueur non chromogène associée à une partie spécifique cible de la seconde enzyme, et que les parties marqueur non chromogènes, une fois libérées, réagissent pour former une molécule chromogène. Quel que soit le mode de réalisation du substrat, la partie marqueur non chromogène de la première molécule est constituée d'aminobenzène ou l'un de ses dérivés; que la partie marqueur non chromogène de la seconde molécule est constituée d'anaphtol ou l'un de ses dérivés: et que la molécule chromogène obtenue est constituée par: Dans ce cas, le radical R1 est constitué de le radical R10 est constitué de -H ou d'un atome, tel que -Br, -Cl, -I, ou un groupe d'atomes, tel que -SH, qui peut être enlevé durant le couplage oxydatif, et chaque radical R2 à RA R11 ou R12 est constitué de H, -OH, -Br, -Cl, -I, ou autres substituants plus complexes, tels que -CH3, -CH2CH3, OCH3, -OCH2CH3, -COOH. Dans le cas du radical Rl, X et/ou Y est constitué de -H, ou autres substituants plus complexes, tels que - CH3, - CH2CH3, Selon une variante de réalisation, au moins l'un des couples de radicaux R2/R3 et R4/R5 est constitué d'un système aromatique, alicyclique ou hétérocyclique. La présente invention concerne encore un procédé de détection d'une activité enzymatique par l'intermédiaire de substrats, tels que décrits ci-dessus, qui consiste à: - mettre les substrats en présence d'au moins un type de bactéries, - attendre que les bactéries hydrolysent les substrats, et détecter les activités enzymatiques basée sur la formation d'un complexe coloré à partir du couplage oxydatif des deux parties marqueur. L'invention concerne enfin l'utilisation de substrats, tels que décrits ci-dessus, pour la détection d'une activité enzymatique de type peptidase. L'invention, qui sera décrite ci-après, a trait à quelques modes de réalisation particuliers de l'invention. Ces modes de réalisation ne sont donc pas limitatifs de la portée de la présente invention qui peut être utilisée pour la détection de tout type d'activités enzymatiques, de type hydrolase, et pour tout genre ou type de bactéries. Le substrat chromogène, permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins une enzyme, est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de l'enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre substance non chromogène. La partie marqueur non chromogène, une fois libérée, réagit avec la seconde molécule pour former une molécule chromogène. Dans un autre cas de figure, le substrat chromogène, permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins deux enzymes, est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de la première enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre partie marqueur non chromogène associée à une partie spécifique cible de la seconde enzyme. Les parties marqueur non chromogènes, une fois libérées, réagissent pour former une molécule chromogène. Dans le cas d'une révélation d'une seule activité enzymatique, il y a deux molécules non chromogènes, c'est-à-dire une première molécule ayant une partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une partie marqueur alors que la seconde molécule n'est constituée que de la partie marqueur. Les deux parties marqueur sont respectivement constituées par les composés I et Il ci-dessous. Composé I Composé H ou: x .R1 =-OH ou -SH ou -N avec X et Y = -H ou autres substituants plus z complexes, comme -CH3, -CH2CH3, . R10 = -H ou un groupe ou atome qui peut être enlevé durant le couplage oxydatif, comme -Br, -Cl, -I, -SH, etc. e R2, R3, R4, R5, R7, R8, Rs, R11 et R12 = -H, -OH, -Br, -Cl, -I, -CH3, CH2CH3, -OCH3, -OCH2CH3, -COOH, ou tout autre substituant plus complexe, RiR3 et R4/R5 pouvant faire également partie d'un système aromatique, alicyclique ou mêmehétérocyclique, comme: Le composé m obtenu par la combinaison des deux composés I et II est donc le suivant: Composé m Pour comprendre l'invention, il est rappelé que la formule d'un substrat enzymatique d'hydrolase peut être schématisée sous forme: A - O - B, s'il s'agit d'un substrat d'osidase, de phosphatase, ou d'estérase. L'hydrolyse enzymatique peut alors s'écrire: A - O -B + H20 - A-OH + B-OH, avec selon l'invention: A-OH = ose, phosphate, acide gras (depuis le plus simple c'est-à-dire l'acide acétique), et B-OH = composé I avec R1 = -OH ou composé II. ACO-NH-B, s'il s'agit d'un substrat de peptidase. L'hydrolyse enzymatique peut alors s'écrire: A-CO-NH-B + H2O # A-COOH + B-NH2, avec selon l'invention: ACOOR = acide aminé ou chaîne d'acides aminés terminés ou non par un agent bloquant, et B-NH2 = composé I . Le procédé selon l'invention utilise, d'une part un substrat enzymatique tel que décrit ci-dessus, à base de: - soit un composé I dérivé de l'aminobenzène, avec R1 = -OH pour les substrats d'osidases, de phosphatases ou d'estérases, - soit un composé II dérivé de l'a-naphtol (à ltexclusion des substrats de peptidases), d'autre part. un agent de révélation présent initialement dans le milieu réactionnel, ou pouvant être ajouté pendant ou après la réaction enzymatique, cet agent étant; c soit le composé H pour la mise en évidence du composé I résultant de l'hydrolyse enzymatique des substrats à base de ce dernier composé, et soit le composé I pour la mise en évidence du composé II résultant de l'hydrolyse enzymatique des substrats à base de ce dernier composé. La formation dans le milieu réactionnel du complexe coloré m (dérivé de l'indophénol) à partir du couplage oxydatif de I et H permet de déceler l'hydrolyse du substrat et donc l'activité enzymatique impliquée. La couleur du composé m dépend des substituants sur les composés I et H. Elle est par exemple pourpre, si R1 = -OH et R2 à R11 = -H, ou bleue, si R1 = OH, R2 et R5 = -Cl et R3 à Rll =-H. Le procédé ainsi décrit est en particulier extrêmement intéressant pour déceler colorimétriquement des activités de type peptidases. En effet, selon l'état de la technique antérieur, le choix des réactions colorées se limitait à l'utilisation de substrats à base de nitroaniline, peu chromogène, et de substrats à base de naphtylamine très toxique, nécessitant l'addiction d'un réactif en fin de réaction (sel de diazonium, par exemple) pour déceler l'amine libérée. L'invention propose un nouveau type de substrats de peptidases, à base d'aminobenzène ou dérivés (composé I). Ce dernier, au tùr et à mesure qu'il est libéré dans le milieu réactionnel lors de l'hydrolyse enzymatique, forme un complexe fortement coloré (rouge à bleu, généralement) par couplage oxydatif avec l'a-naphtol ou un dérivé (composé H) présent dans ce milieu. La réaction de couplage peut également être obtenue en fin de test si l'addition du composé II intervient au terme de la réaction enzymatique. Un autre avantage important de l'invention consiste à associer deux substrats dans le milieu réactionnel, selon le procédé, I'un à base du composé I et l'autre à base du composé II. On peut imaginer ainsi tous les types de combinaisons de détection simultanée de deux activités enzymatiques (par exemple, une peptidase et une osidase, une estérase et une osidase, deux osidases, etc). Dans ces cas, il y aura la formation du complexe coloré m uniquement si les deux substrats sont hydrolysés. Cette combinaison peut être très utile pour les tests de diagnostic qui demandent une grande spécificité, notamment lorsqu'il s'agit de caractériser des micro-organismes. L'un des exemples cités illustre l'intérêt de cette détection simultanée de deux activités enzymatiques dans le domaine de l'identification des bactéries. Parmi les autres avantages de l'invention, il est possible de donner une double fonctionnalité au composé I. n est en effet possible de greffer chimiquement sur le composé I, d'une part sur le groupement -NH2, un acide aminé ou une chaîne d'acides aminés terminés ou non par un agent bloquant, et d'autre part sur R1, s'il s'agit d'un groupement hydroxyl (-OH), un ose, un phosphate ou un acide gras. On obtient une molécule que l'on peut qualifier de double substrat qui, pour générer le composé I à l'état libre dans le milieu réactionnel doit être hydrolysé par deux activités enzymatiques distinctes, d'une part, une peptidase et, d'autre part, une osidase, phosphatase ou estérase, selon la nature du produit greffé sur R1. Ainsi, en présence du composé II, le complexe coloré m ne peut être obtenu que si les deux activités enzymatiques sont présentes. L'intérêt de tels substrats à double fonctionnalité réside dans leur très grande spécificité qui peut être mise à profit pour caractériser des micro-organismes, par exemple. Dans le même sens, on peut concevoir selon l'invention un mélange d'un substrat à double fonctionnalité à base du composé I, tel que décrit cidessus, et un substrat à base du composé II pour la recherche d'une autre osidase, phosphatase ou estérase. Dans ce cas, la production du complexe coloré III nécessite la présence simultanée de trois activités enzymatiques, afin de libérer les composés I et II. Deux activités enzymatiques permettent d'hydrolyser la molécule à base du composé I et une activité enzymatique permet d'hydrolyser la molécule à base du composé II. On augmente ainsi encore la spécificité du test. Selon l'invention, il est aussi possible de combiner différents types de substrats dans le même milieu réactionnel, en particulier des substrats connus dans l'art antérieur et des substrats selon le procédé revendiqué. Cela permet de mettre en oeuvre différentes réactions colorées, et donc de révéler en même temps plusieurs activités enzymatiques au sein du même milieu réactionnel. L'invention peut s'appliquer à la recherche d'activités enzymatiques dans différents types d'échantillons, biologiques ou non. Elle peut également être utilisée pour caractériser des microiirganismes comme des bactéries ou des levures. Les tests enzymatiques peuvent alors être pratiqués en milieu liquide dans des tubes individuels ou dans des supports compartimentés, comme les plaques de microtitration, par exemple. Ils peuvent être pratiqués également en milieu gélosé (dans des boîtes de Pétri, par exemple) avec coloration des colonies produisant les activités enzymatiques recherchées. La présente invention concerne donc un procédé de détection d'une activité enzymatique par l'intermédiaire de substrats, tels que décrits cidessus, qui consiste à: - mettre les substrats en présence d'au moins un type de bactéries, - attendre que les bactéries hydrolysent les substrats, et - détecter les activités enzymatiques basée sur la formation d'un complexe coloré à partir du couplage oxydatif des deux parties marqueur. Le couplage oxydatif est facilité soit par: - I'ajout d'au moins un oxydant dans le milieu réactionnel, - la production, lors d'un processus métabolique au sein de ce milieu réactionnel, d'au moins un oxydant, - la présence d'oxygène endogène dans ledit milieu réactionnel. Les exemples cités ci-dessous permettront de mieux comprendre l'invention. Ils concernent uniquement le domaine de la bactériologie, mais il est clair que le procédé peut s'appliquer à tous les autres domaines de l'enzymologie, impliquant la recherche d'hydrolases. # Exemple 1 : Détection de la ss-glucosidase en milieu liquide (méthode 1) Le milieu réactionnel proposé dans cet exemple a pour formulation: . peptone de viande . 10 g eNaCI. 5g . &alpha;-naphthyl-ss-D-glucopyranoside 0.5 g . 4-aminophénol . 50 mg . H2O .. 1000 ml . pH 7.0 Ce milieu est stérilisé par filtration sur filtre Millipore 0,22 11 et réparti dans des tubes stériles à raison de 5 ml par tube. Le test de recherche de la ss-glucosidase est pratiqué sur 4 souches cultivées pendant 24H à 35-370C sur gélose Trypticase-Soja. Ces souches appartiennent respectivement aux espèces: - Escherichia colt, -Staphylococcus sciuri, - Streptococcus pyogenes, -Enterococcus faecalis. A partir des cultures précédentes, on réalise des suspensions aqueuses ajustées à 0,5 McFarland. 100 microlitres de ces suspensions sont utilisés pour ensemencer quatre tubes de milieu réactionnel, chaque tube correspondant à une souche. Les tubes bouchés sont incubés à 35-37 C pendant 18 à 24H. Après l'incubation, on observe l'apparition d'une coloration pourpre correspondant à la formation du complexe indophénol et traduisant la présence d'une activité ss-glucosidase. Les résultats obtenus sont les suivants: souche résultat résultat théorique attendu obtenu E. coli S. sciuri + + S. pyogenes E. faecaiis + + O Exemple 2: Détection de la ss-glucosidase en milieu liquide (méthode 2) Le milieu réactionnel proposé dans cet exemple a pour formulation: o peptone de viande .. 10 g . NaCl 5 g o a-naphtol .. 50 mg 4-aminophényl-B-D-glucopyranoside 0.5 g o H2O . ... 1000 ml . pH .. 7.0 La préparation du milieu, le choix des souches testées et la pratique du test sont identiques à la procédure décrite dans l'exemple 1. L'apparition d'une coloration pourpre due à la formation du complexe indophénol indique la présence d'une activité ss-glucosidase. Les résultats obtenus sont identiques à ceux de l'exemple 1, à savoir: souche résultat résultat théorique attendu obtenu E. coli 5. sciuri + + S. pyogenes E. faecalis + + Ces résultats montrent qu'il est possible de détecter une activité de type osidase en utilisant selon l'invention aussi bien un substrat à base du composé I qu'un substrat à base du composé II. n en serait de même pour rechercher des activités de types estérases ou phosphatases. # Exemple 3 : Détection de la pyroglutamyl-aminopeptidase en milieu liquide: Le milieu réactionnel proposé dans cet exemple a pour formulation: peptone de viande . lOg oNaCl . 5g o a-naphtol .. 50 mg o L-pyroglutamyl-4-amino-2,6-dichlorophénol .. 0.5 g . H2O ...1000 ml . pH .. 7.0 La préparation du milieu, le choix des souches testées et la pratique du test sont identiques à la procédure décrite dans l'exemple 1. L'apparition d'une coloration bleue due à la formation du complexe indophénol met en évidence une activité pyroglutamyl-aminopeptidase. A noter que la teinte bleue résulte de la présence de groupements chlore en position 2 et 6 sur le 4-aminophénol. Les résultats obtenus sont les suivants souche | résultat théorique résultat attendu obtenu E. coli S. sciuri S. pyrogenes + + E. faecalis l + # Exemple 4: Recherche combinée de deux activités enzymatiques selon le procédé de l'invention. Application à la détection simultanée de la ss-glucosidase et de la pyroglutamyl-aminopeptidase: Le milieu réactionnel proposé dans cet exemple a pour formulation; o peptone de viande . 10 g . NaCl. 5g o &alpha;-naphthyl-b-D-glucopyranoside.. 0.5 g o GpyroglutamylS-amino-2,6-dichlorophénol .. 0.5 g . H2O . ...1000 ml . pH .. 7.0 La préparation du milieu, le choix des souches testées et la pratique du test sont identiques à la procédure décrite dans l'exemple 1. L'apparition d'une coloration bleue due à la formation du complexe indophénol n'est possible que si les deux substrats sont hydrolysés. Elle traduit donc une combinaison d'activités ss-glucosidase et pyroglutamyl-aminopeptidase dans le même milieu réactionnel. L'absence de l'une des activités empêche la formation du complexe coloré. Les résultats obtenus sont les suivants; souche résultat théorique résultat attendu obtenu E. coli S. sciuri S. pyogenes E. faecalis + + Cet exemple illustre clairement un des avantages de l'invention en permettant une plus grande sélectivité dans la caractérisation des microorganismes (E. faecalis, dans cette application). : Exemple 5: Caractérisation de bactéries en milieu gélosé par recherche simultanée des activités ss-galactosidase (ssGAL) et I-alanine-aminopeptidase (Ala) A un milieu trypticase soja gélosé, sont ajoutés de l'&alpha;-naphthyl-ss-D- galactopyranoside et de la balanyl-N,N'-diméthyl-p-phénylène-diamine-naphtalène sulfonylhydrazide. Ce substrat est dérivé du composé I selon l'invention. Le milieu est réparti et ensemencé de la façon suivante; o six boîtes avec des cultures pures; - Escherichia coli [ ssGAL (+), Ala (+)] - Klebsiella pneumoniae [ssGAL (+), Ala (+)] - Salmonella typhimurium [ssGAL (-), Ala (+)j - Pseudomonas aeruginosa [ssGAL (-), Ala (+)] - Staphylococcus xylosus [ssGAL (+), Ala (-)] - Candida albicans [ssGAL (-), Ala (-)] o deux boîtes avec les mélanges de souches E. coli / S. xylosus et S. typhimurium / C. albicans. Les milieux sont incubés à 35-37 C. Après 18 - 24H d'incubation, seules les boîtes contenant les souches d'E. coli et K pneumoniae [ssGAL (+), Ala (+)] présentent des colonies colorées en bleu. Avec le mélange E. coli / S. xylosus, seules les colonies d'E. coli sont bleues, celles de S. xvlosus restant incolores. Tout comme dans l'exemple 4, la production du complexe coloré ffi à base d'indophénol a donc nécessité la présence conjointe de deux activités enzymatiques, ici la ss-galactosidase et la L-alanine-aminopeptidase. En revanche, la présence de l'une seulement ou aucune de ces deux activités n'entraîne pas la formation du complexe coloré. Comme cela est le cas dans l'exemple 5, le choix d'un dérivé approprié de la phénylène-diamine permet d'obtenir une coloration qui reste au voisinage immédiat des colonies et Q Exemple 6: Recherche combinée de trois activités enzymatiques selon le procédé de l'invention. Application à la détection simultanée de la ss-galactosidase (ssGAL), de la ss-glucosidase (ssGLU) et de la L-alanine-aminopeptidase (Ala): Le milieu réactionnel proposé dans cet exemple a pour formulation; peptone de viande . 10g .NaCl . 5 g o a-naphtyl-ss-D-glucopyranoside . 0.5 g . L-alanyl-4-amino-2,6-dichlorophényl-ss -D-galactopyranoside . 0.5 g . H2O . ...1000 ml .pH . 7.0 La préparation du milieu est identique à la procédure décrite dans l'exemple 1. Le test de recherche des 3 activités enzymatiques est pratiqué sur 5 souches cultivées pendant 24H à 35-370C sur gélose Trypticase-Soja. Ces souches appartiennent respectivement aux espèces; - Escherichia coli [ssGAL (+),ssGLU (-), Ala (+)i -Klebsiella pneumoniae [ssGAL (+),ssGLU (+), Ala (+)] - Salmonella typhimurium [ssGAL (-),ssGLU (-), Ala (+)] - Stenotrophomonas maltophilia [ssGAL (-),ssGLU (+), Ala (+)] - Staphylococcus saprophyticus [ssGAL (+),$GLU (-), Ala (-)] L'apparition d'une coloration bleue due à la formation du complexe indophénol n'est possible que si les 3 substrats sont hydrolysés. Elle traduit donc une combinaison d'activités ss-galactosidase, ss-glucosidase et L-alanine-aminopeptidase dans le même milieu réactionnel, comme c'est le cas pour la souche de K. pneumoniae. L'absence de l'une des activités empêche la formation du complexe coloré. Les résultats obtenus sont les suivants souche résultat théorique résultat attendu obtenu E. coli K.pneumoniae + + S. typhimurium S. maltophilia S. sapropriticus Cet exemple montre une nouvelle fois les potentialités de l'invention pour mettre en oeuvre des tests hautement sélectifs. Les six exemples cités décrivent uniquement des tests enzymatiques selon l'invention. Il est bien entendu possible de combiner ceux-ci aux tests connus dans l'art antérieur, utilisant des substrats chromogéniques ou fluorogéniques. REVENDICATIONS 1. Substrat chromogène permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins une enzyme, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de l'enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre substance non chromogène, et que la partie marqueur non chromogène, une fois libérée, réagit avec la seconde molécule pour former une molécule chromogène 2. Substrat chromogène permettant de détecter la présence de l'activité enzymatique d'au moins deux enzymes, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'au moins deux molécules, une première molécule constituée d'une partie marqueur non chromogène associée à au moins une partie spécifique cible de la première enzyme et une seconde molécule constituée d'une autre partie marqueur non chromogène associée à une partie spécifique cible de la seconde enzyme, et que les parties marqueur non chromogènes, une fois libérées, réagissent pour former une molécule chromogène. 3. Substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que la partie marqueur non chromogène de la première molécule est constituée d'aminobenzene ou l'un de ses dérivés; que la partie marqueur non chromogène de la seconde molécule est constituée d'anaphtol ou l'un de ses dérivés; et que la molécule chromogène obtenue est constituée par: 4. Substrat, selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le radical R1 est de constitué que le radical Rlo est constitué de -H ou d'un atome, tel que -Br, -Cl, -I, ou un groupe d'atomes, tel que -SH, qui peut être enlevé durant le couplage oxydait, et que chaque radical R2 à R9, R11 ou R12 est constitué de -H, -OH, -Br, -Cl, -I, ou autres substituants plus complexes, tels que -CH3, -CH2CH3, -OCH3, -OCH2CH3, COOH. 5. Substrat dans le cas où le radicalR1 est constitué selon lue quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait que X et/ou Y est constitué de -H, ou autres substituants plus complexes, tels que - CH3, - CH2CH3, 6. Substrat, selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait qu'au moins l'un des couples de radicaux RZ/R3 et R4/Rs est constitué d'un système aromatique, alicyclique ou hétérocyclique. 7. Procédé de détection d'une activité enzymatique par l'intermédiaire de substrats, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste à; - mettre les substrats en présence d'au moins un type de bactéries, - attendre que les bactéries hydrolysent les substrats, et - détecter les activités enzymatiques basée sur la formation d'un complexe coloré à partir du couplage oxydatif des deux parties marqueur. 8. Utilisation de substrat, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la détection d'une activité enzymatique de type peptidase.