Brevet FR2781376A1 — publié le 20000128

COMPOSITION PROTECTRICE ET REGULATRICE DE L'HOMÉOSTASIE DE LA MASSE OSSEUSE CONTENANT DES POLYMERES OU BIOPOLYMERES ET LEURS UTILISATIONS. La présente invention concerne l'utilisation de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP et notamment de dérivés de dextrane carboxyméthyl- benzylamide-sulfonate, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des troubles de l'homéostasie du tissu osseux. L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour être utilisée dans un procédé de protection et de régulation de l'homéostasie de la masse osseuse, et plus particulièrement pour la cicatrisation des os longs. On connaît dans l'art antérieur des dérivés de dextrane carboxyméthylbenzylamide-sulfonate, désignés CMDBS, dont certains miment les propriétés de l'héparine et peuvent être utilisés en tant que produits de substitution du plasma grâce à leurs propriétés anti- coagulante et anti-complémentaire. D'autres de ces dérivés miment une propriété différente de l'héparine qui consiste en une stabilisation, une protection et une potentialisation de l'activité biologique in vitro des facteurs de croissance de la famille des FGF (Tardieu et coll., Journal of Cellular Physiology, 1992, 150, Pages 194 à 203). Ces dérivés, leur préparation et leur utilisation sont décrits dans le brevet français No. 2 461 724 ainsi que dans le brevet US No. 4 740 594. Ils sont obtenus par substitution par 2 2781376 des résidus carboxyméthyle, carboxyméthyle - benzylamide et carboxyméthyle - benzylamide - sulfonate. Par ailleurs, le brevet francais No. 2 644 066 décrit l'utilisation de certains CMDBS, seuls ou associés aux FGFs, pour la cicatrisation de la peau et de la cornée. Un autre biopolymère, le dextrane sulfate, a également été proposé dans le brevet japonais No. 13890 en association avec des FGF, comme stabilisateur et protecteur Plus récemment, il a été proposé dans les brevets français No. 2 718 023, No. 2 718 025 et No. 2 718 023 d'utiliser des polymères capables de protéger, stabiliser et potentialiser les facteurs de croissance à affinité pour l'héparine, tels les facteurs de croissance des fibroblastes ou FGF et du Transforming Growth Factor bêta (TGFf), comme médicament pour le traitement des lésions respectivement du tractus digestif, du système nerveux, des tissus musculaires. Pour illustrer cet effet protecteur des CMDBS, ces brevets rapportent les résultats de la digestion protéolytique par de la trypsine du FGF1, du FGF2 ou du TGFf. Ces propriétés de protection, de stabilisation et de potentialisation des facteurs de croissance à affinité pour l'héparine ont permis de caractériser une nouvelle classe de polymères, désignés HBGFPP pour "Heparin-Binding Growth Factor Protector and Potentiator", présentant une activité cicatrisante et réparatrice des tissus musculaires, nerveux et du tractus digestif et dépourvus, aux doses utilisées, d'activités anti-coagulantes. Les polymères ou biopolymères HBGFPP sont définis par les propriétés suivantes: - ils protègent spécifiquement les facteurs de croissance des familles FGF et TGF bêta de la dégradation trypsique, 3 2781376 - ils n'inhibent pas de manière significative la coagulation. Outre, les applications des HBGFPP ci- dessus, le brevet français No. 2 718 024 propose l'utilisation de ces polymères comme médicament pour le traitement des inflammations. Cette activité anti- inflammatoire est illustrée par l'activité d'inhibition in vitro d'enzymes protéolytiques impliquées dans la réaction inflammatoire comme l'élastase leucocytaire ou la plasmine et in vivo par des études histologiques démontrant une réaction cellulaire inflammatoire réduite dans les tissus traités par des dérivés de dextrane CMDBS. Les applications des HBGFPP et plus particulièrement du CMDBS proposées dans les brevets cités ci-dessus, dont l'enseignement est incorporé à la présente demande par référence, sont donc limitées à la réparation et à la cicatrisation de certains tissus seulement. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence de nouvelles propriétés des HBGFPP comme agents exerçant des effets protecteurs et régulateurs sur l'homéostasie de la masse osseuse et favorisant la régénération des os longs. En effet, les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence les capacités des CMDBS à traiter et/ou prévenir les lésions et souffrances tissulaires rencontrées en traumatologie osseuse et nécessitant des chirurgies réparatrices ou plastiques, comme dans les pertes de masse tissulaire notamment l'ostéoporose, ou de nécroses liées à des inflammations ou au vieillissement comme la polyarthrite rhumatoïde ou les maladies parodontales ou encore les arthroses. 4 2781376 La présente invention concerne donc l'utilisation des polymères et biopolymères de la famille des HBGFPP, et notamment des CMDBS pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des troubles de l'homéostasie du tissu osseux. L'invention vise plus particulièrement la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des lésions et souffrances tissulaires rencontrées en traumatologie osseuse et nécessitant des chirurgies réparatrices ou plastiques, comme dans les pertes de masse tissulaire notamment l'ostéoporose, ou de nécroses liées à des inflammations ou au vieillissement comme la polyarthrite rhumatoïde ou les maladies parodontales ou encore les arthroses. L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour être utilisée dans un procédé de protection et de régulation de l'homéostasie de la masse osseuse, et plus particulièrement pour la cicatrisation des os longs. En effet, les HBGFPP présentent des propriétés inattendues sur la cicatrisation des os longs. Les propriétés du CMDBS sur la réparation des défauts d'os plats du crâne décrites dans l'art antérieur (Blanquaert F, et al., Bone, 1995; 17(6): 499- 506) n'était pas, a priori, transposable sur l'os long. L'os plat et l'os long sont de nature totalement différente car: - Ils sont d'origine embryologique différente. L'os plat est un dérivé des cellules du tissu conjonctif alors que l'os long dérive des cellules cartilagineuses. 2781376 - L'os plat est un os spongieux et ne contient pas de canal médullaire par opposition à l'os long. - L'os plat ne cicatrise pas naturellement lorsqu'il y a une perte de substance comme lors d'une trépanation comme le montre l'absence de cicatrisation sur des cranes provenant de civilisations préhistoriques comme les Incas ou les Egyptiens (voir par exemple Evidence for stone age cranial surgery,7000 BC, Nature, 1997, 367, 360). Or, de manière surprenante, les HBGFPP présentent des effets sur la réparation de défauts os longs très importants, de l'ordre du tiers de la longueur de la diaphyse d'un fémur de rat. Il a été observé non seulement une réparation avec la reformation d'un fût osseux mais aussi que celui ci était rempli de moelle osseuse, c'est à dire que le traitement par le CMDBS a conduit à la reformation d'un véritable canal médullaire alors qu'en l'absence de CMDBS le défaut est simplement comblé de matériel osseux désorganisé. L'invention se rapporte à toute composition pharmaceutique dans laquelle les HBGFPP, sont associés à un véhicule pharmaceutique sous une forme permettant l'administration per os, per cutanée, sous cutanée, topique, intramusculaire, intraveineuse ou intra artérielle ou dans tous les compartiments liquidiens de l'organisme. Les travaux menés dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence que le CMDBS agit plus particulièrement dans des fenêtres de doses en dehors desquelles des effets biologiques toujours satisfaisants ne sont pas obtenus. Selon les voies d'administration et le type de lésion, les doses efficaces optimales sont celles définies ci-dessous. Avantageusement, de manière à recouvrir toute la surface d'une plaie ou à remplir le volume d'une lésion tissulaire, les compositions (, 2781376 pharmaceutiques de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration de 0,001 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre carré ou de 0,005 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre cube de tissu à traiter. Ainsi, les compositions de l'invention contiennent de préférence entre 0,01 et 10 milligramme de HBGFPP par millilitre de solution physiologique de dissolution. Pour une administration par voie systémique (veineuse, artérielle), par voie intra-péritonéale, intra oculaire, dans le liquide céphalorachidien, dans le liquide intracochléaire ou dans tous fluides péri ou intra tissulaires, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration de 0,1 et milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter. Pour une administration par voie intramusculaire, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration comprises entre 0,2 et 500 milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 1 et 50 mg par kg. Pour une administration per os, les compositions de l'invention sont dosées de façon à permettre une administration comprise entre 1 et 5000 milligrammes de HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 10 et 500 mg par kg. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant d'une part la préparation de CMDBS, et d'autre part leur propriétés comme agent régulant l'homéostasie des tissus osseux, c'est à dire leur masse tissulaire, leur fonctionnalité et leur remodelage. 7 2781376 Exemple 1: Préparation de CMDBS. Les CMDBS utilisés dans les exemples donnés ci après ont été préparés et sélectionnés comme décrits dans les précédents brevets. A titre de rappel leur formule générale est présentée figure 1. Deux polymères particuliers ont été utilisés dans les exemples présentés. Le CMIDBS 192 et le CMDBS 282. Ces deux CMDBS se définissent respectivement par leur taux de substitutions en motifs carboxyméthyle (CM), carboxyméthyle-benzylamide (CMB) et carboxyméthyle- benzylamide-sulfonate (CMBS) présentés dans le tableau I ci dessous. Tableau I Polymères Motifs CM Motifs CMB Motifs CMDBS carboxyméthyle benzylamide CMBS sulfonate CMDBS 192 110 2,5 38 CMDBS 282 90 0 36,5 Ils appartiennent à la famille des HBGFPP en ce qu'ils ont été sélectionnés sur des critères in vitro pour avoir une activité anticoagulante faible qui est respectivement de 2 et 4 UI/mg, pour stabiliser et potentialiser l'activité mitogène du FGF2 sur des cellules 3T3, pour protéger le FGF1 et le TGFI d'une attaque par la trypsine, pour inhiber l'activité de l'élastase leucocytaire et de la plasmine et sur des critères in vivo en stimulant la régénération du muscle squelettique dans le modèle présenté dans le brevet français nO 2 718 026 EXEMPLE 2: Effets des CMDBS sur la régénération des os lonas. Cet exemple illustre la reconstruction d'un défaut osseux, pratiqué dans le tube diaphysaire d'un fémur de rat, à l'identique avec au bout de 8 semaines et mieux à 12 semaines une reconstitution d'un canal médullaire identique à celui d'origine et de corticales matures comme dans l'os non fracturé d'origine (figure 2). Des rats mâles Wistar (Ico: WI (IOPS AF/Han), Iffa Credo) de 275 à 325 grammes sont utilisés. L'étude est réalisée en accord avec les recommandations de la CEE sur le travail sur animal (décret 87-848 - 04/19/1987). Sous anesthésie, par injection de pentobarbital de sodium, le fémur est abordé latéralement. Les tissus musculaires et périostiques sont désolidarisés du tube diaphysaire. Une plaque en polyéthylène de haute densité est fixée à la surface du fémur par des broches de Kirschner. Un défaut segmentaire de 5 millimètres est pratiqué au milieu de la diaphyse fémorale. Un implant et inséré à la place du défaut osseux avant suture des tissus. Cet implant correspond à une matrice osseuse allogénique déminéralisée préparée avec des diaphyses fémorales d'autres rats selon la procédure décrite par F. Blanquaert et coll. (1995, Bone 17:499-506), imprégnée ou non de CMDBS par incubation dans une solution saline comprenant 100 microgrammes par millilitre de ce produit. Les animaux sont ensuite maintenus en cage sans contrainte déambulatoire. Les fémurs des animaux sont radiographiés toutes les deux semaines pendant 12 semaines avant d'être euthanasies. Les fémurs sont alors prélevés et soumis aux traitements nécessaires à une étude histologique. Les radiographies sont étudiées en 9 2781376 particulier au niveau de leur densitométrie par analyse d'images. La figure 2 montre les effets des CMDBS sur la régénération des os longs et rapporte les études radiographiques de fémurs de rat traités ou non par du CMDBS 282. La figure 2-A présente le modèle de défaut pratiqué dans la diaphyse fémorale. La figure 2-B, montre la radiographie d'un fémur dont la diaphyse a été excisée sur 6 mm juste après l'opération. Les figures 2-C, 2D et 2-E représentent des radiographies de fémur des différents groupes expérimentaux. La figure 2-C montre la radiographie à 12 semaines d'un fémur qui n'a recu aucun traitement particulier. Il n'y a pas eu en 12 semaines de phénomène cicatriciel et le fut osseux n'est pas reconstitué. Sur la figures 2-D, on observe le défaut osseux comblé par de la matrice osseuse déminéralisée. Dans ce cas, un matériel radio opaque est observable mais même si le comblement est effectué aucun remaniement n'est marquant. La structure de comblement ne présente pas l'organisation d'un os long traditionnel. Sur la figure 2-E, le défaut osseux a été comblé par de la matrice osseuse déminéralisée imprégnée dans une solution de CMDBS 282 à 100 microgramme par millilitre. Dans ce cas, la structure des tissus de comblement est radioopaque et correspond à la radiographie d'un os normal. L'os compact cortical est reconstitué et est en continuité avec les zones adjacentes d'origine. La cavité centrale présente une opacité comparable à celle de la cavité médullaire d'origine avec laquelle elle est en parfaite continuité. 2781376 Le CMDBS 282, imprégné dans la matrice osseuse déminéralisée en comparaison d'une matrice imprégnée dans du sérum physiologique sans le polymère induit une accélération tout à fait significative sur les processus de remodelage et de maturation osseuse. Cet effet se manifeste par la reformation de nouvelles corticales parfaitement détectable après 12 semaines alors que dans les conditions contrôles ce phénomène ne se déroule pas. Après 12 semaines, cinq des sept animaux traités par l'association avec du CMDBS 282 présentent à l'étude radiologique les évidences d'une union complète du défaut avec la reformation de corticales épaisses et délimitées tandis que sans le CMDBS seule l'union est observée avec des images radiologiques d'os immature sans corticalisation. Ces résultats illustrent les effets ostéoinducteurs des polymères de l'invention sur leur capacité à induire non seulement la réparation des os longs mais aussi et surtout leur potentiel à réguler l'homéostasie des tissus régénérés au niveau de leur masse comme de leur remodelage. Les propriétés des CMDBS comme agents régulateurs de l'homéostasie des tissus osseux, c'est à dire sur la masse tissulaire, sa fonctionnalité et son remodelage sont confirmées par l'exemple 3 ci-après. EXEMPLE 3: Effets des CMDBS, sur le remaniement et la protection de la masse osseuse dans un modèle de parodontie aiquë chez le hamster. Le modèle utilisé dans cet exemple concerne le remaniement osseux de la mandibule de Hamster. Une parodontie est induite chez des Hamsters dorés de Syrie (centre d'élevage Dépré, références HSM Il 2781376 41/50) après deux mois d'une alimentation hyperglucidique. Le régime administré se compose de saccharose (56 %), lait en poudre écrémé (28 %), farine complète de blé (6 %), levure de bière (4 %, luzerne en poudre (3 %), poudre de foie (1 %) et chlorure de sodium (2 %). Les animaux sont répartis en groupes expérimentaux. 14 animaux constituent les groupes témoins qui reçoivent une alimentation normale à base de biscuit et de croquette. 24 animaux constituent les groupes expérimentaux soumis au régime hyperglucidique. Ils développent une parodontie chronique établie au bout de deux mois. Les groupes expérimentaux reçoivent après ce délai, chaque semaine pendant 3 semaines, une injection intramusculaire de CMDBS 282 à différentes doses comprises entre 0,1 et 15 milligrammes par kilogramme sous un volume de 0,5 millilitres de sérum physiologique tamponné. Les groupes contrôles sont non traités et reçoivent une injection de sérum physiologique sans CMDBS (SHAM). Le poids des animaux est relevé chaque semaine. Un mois après chaque type de traitement, les animaux sont sacrifiés, les mandibules prélevées et préparées pour une étude histologiques. Les inclusions des pièces opératoires sont réalisées dans du méthyl métacrylate stabilisé. Dans ce modèle de parodontite, seuls 200 micromètres sont exploitables en hauteur pour chaque hémimandibule. Le système est standardisé de façon étudier toujours la même séquence de coupes à une profondeur définie et repérée par le tissu osseux compris entre les racines des deux premières molaires du coté lingual. La maladie parodontale, au niveau de ces molaires se manifeste par l'apparition d'une poche parodontale qui délimite un volume rempli de plaque bactérienne. Cette maladie entraîne une destruction 12 2781376 importante de l'os parodontal qui se caractérise par une importante résorption ostéoclastique et une réduction des surfaces osseuse en apposition c'est à dire à une phase d'ostéosynthèse. La résorption osseuse est quantifiée en mesurant les zones de contact entre l'os et les ostéoclastes (Oc). Ce sont des cellules géantes colorées en bleu par le bleu de toluidine. L'apposition quant à elle se caractérise par une bande de tissu ostéoïde, O identifiée par une coloration bleu atténuée recouverte d'ostéoblastes. A l'inverse des OC, les ostéoblastes sont des cellules de petite taille, de forme cubique et mononuclées. Les quantifications de ces phénomènes se font à l'aide d'une station d'imagerie assistée d'un logiciel de traitement d'images. Le tableau II ci-dessous présente les quantifications obtenues dans les différentes conditions expérimentales. Tableau II Résorption Apposition Témoins 0,5 0,3 57,7 2,9 Shams 41,2 1,9 18,2 1, 1 Injection 400 microgrammes/ml 37,9 4,5 20,1 1,7 Injection 1500 microgrammes/ml 14,4 + 2,2 41,3 3,3 Chez les animaux témoins qui n'ont pas développé la maladie, l'activité de la résorption est quasiment nulle alors que celle de l'apposition est importante. Chez les animaux non traités (SHAM), la maladie est fortement développée et se caractérise par une forte résorption et un faible taux d'apposition. Chez les animaux traités à la dose de 1,5 milligrammes par kilogramme de CMDBS, le taux de résorption est fortement diminué et est associé à une augmentation très a3 2781376 importante du taux d'apposition qui atteint près de 80 % du taux établi chez les témoins. Ces effets montrent que les CMDBS régulent la masse du tissu osseux en rééquilibrant la balance du remodelage entre la résorption et l'apposition et confirment le rôle de ces polymères comme agent de régulation de l'homéostasie osseuse. 14 2781376 REVENDICATIONS 1) Utilisation d'un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des troubles de l'homéostasie du tissu osseux. 2) Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des lésions et souffrances tissulaires rencontrées en traumatologie osseuse et nécessitant des chirurgies réparatrices ou plastiques. 3) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de l'ostéoporose. 4) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de nécroses liées à des inflammations ou à des maladies parodontales ou à la polyarthrite rhumatoïde ou au vieillissement ou arthroses. ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP est le CMDBS ou l'un de ses dérivés. 6) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour être utilisée dans lE5 2781376 un procédé de protection et de régulation de l'homéostasie de la masse osseuse. 7) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moins un polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP, avantageusement associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour être utilisée dans un procédé de cicatrisation des os longs. 8) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que le polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP est associé dans la dite composition à un véhicule pharmaceutique sous une forme permettant l'administration per os, per cutanée, sous cutanée, topique, intramusculaire, intraveineuse ou intra artérielle ou dans tous les compartiments liquidiens de l'organisme. 9) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que son dosage permet une administration de 0,001 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre carré ou de 0,005 à 1 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par centimètre cube de tissu à traiter. ) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle contient entre 0,01 et 10 milligramme de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par millilitre de solution physiologique de dissolution. 11) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que son 16 2781376 dosage permet une administration par voie systémique, intra-péritonéale, intra oculaire, dans le liquide céphalorachidien, dans le liquide intracochléaire ou dans tous fluides péri ou intra tissulaires, de 0,1 et 100 milligrammes de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter. 12) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que son dosage permet une administration par voie intramusculaire, comprise entre 0,2 et 500 milligrammes de polymère ou biopolymère de la famille des HBGFPP par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 1 et 50 mg par kg. 13) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que son dosage permet une administration per os comprise entre 1 et 5000 milligrammes de polymère par kilogramme de poids d'homme ou d'animal à traiter, et de préférence entre 10 et 500 mg par kg.