Brevet FR2774472A1 — publié le 19990806

PERFECTIONNEMENTS AUX SYSTEMES D'ELECTROPHORESE MULTICAPILLAIRES La présente invention est relative aux systèmes d'électrophorèse multicapillaires. On sait que les techniques d'électrophorèse en gel classiques, dans lesquelles on injecte différents échantillons sur une pluralité de pistes définies dans un gel compris entre deux plaques, ne sont pas satisfaisantes, étant donné d'une part qu'elles nécessitent un certain nombre d'opérations manuelles et d'autre part qu'elles ne permettent pas des vitesses de migration et donc des débits de traitement très importants. Or les grands programmes de séquençage et de génotypage nécessitent un débit très élevé de séparation et d'identification des molécules d'ADN. On connaît par ailleurs des techniques d'électrophorèse utilisant pour la migration un capillaire rempli de gel ou d'une autre matrice de séparation présentant l'avantage d'être particulièrement maniable, facile à charger et de permettre un fonctionnement sensiblement automatique, avec des vitesses de séparation plus élevées que dans l'électrophorèse en plaques de gel grace à un champ électrique applicable important. Toutefois, I'utilisation d'un seul capillaire ne permet pas d'atteindre les mêmes débits que ceux que permettent les techniques d'électrophorèse en plaques qui possèdent de nombreuses pistes en parallèle, même si néanmoins les champs électriques qui peuvent être appliqués à un capillaire, et donc les vitesses de migration obtenues, sont importants. C'est pourquoi il a également été proposé des systèmes dits multicapillaires comportant une barrette de plusieurs capillaires juxtaposés. Un système de ce type est par exemple présenté dans la publication: " Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis. " - C. Heller - p. 236 à 254 - Editions Vieweg - 1997. Dans la technique décrite dans cette publication, les capillaires sont maintenus les uns par rapport aux autres dans une cuvette en verre dans laquelle lesdits capillaires s'étendent. Les molécules qui traversent les capillaires sont excitées par un rayonnement laser qui est envoyé, juste en sortie de la barrette, dans le plan de ladite barrette et perpendiculairement à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent. La fluorescence des molécules excitées par ce rayonnement est détectée au moyen notamment d'une caméra CCD qui est orientée avec un axe perpendiculaire au plan de la barrette de capillaires. Cependant, un tel système, oblige à prévoir des flux laminaires empêchant que les molécules en sortie des différents capillaires ne divergent de façon trop importante. Pour cela, la cuvette nécessite une réalisation mécanique de haute précision dans du verre. En particulier, le dispositif devra permettre d'éviter toute bulle de gaz venant perturber le flux. Comme on l'aura compris, une telle technique présente l'inconvénient majeur d'être très onéreuse. En outre, elle ne permet pas à l'opérateur de manier aisément les capillaires, qui doivent être pré-remplis au moment de la fabrication. Et on constate dans la pratique que cette technique est difficilement utilisable autrement que par des spécialistes. II a également été proposé des systèmes d'électrophorèse multicapillaires dans lesquels le faisceau laser d'excitation des molécules est envoyé sur celles-ci au travers des parois des capillaires, selon un axe dans le plan de la barrette, perpendiculaire à la direction selon laquelle les capillaires s'étendent, la fluorescence des molécules étant là aussi observées par des moyens de réception présentant un axe optique perpendiculaire au plan de la barrette des capillaires. On pourra par exemple à cet égard se référer à la publication " A capillary Array Gel Electrophresis System Using Multiple Laser Focusing for DNA Sequencing " - T. Anazawa, S. Takahashi, H. Kambara - Anal. Chem. - Vol. 68, N"15, - 1er Août 1996-p. 2699-2704. Toutefois, une telle technique est peu satisfaisante compte tenu du bruit de détection résultant de l'interaction de la lumière d'excitation et de la fluorescence des parois du capillaire. En outre, le faisceau laser perd en intensité au fur et à mesure qu'il traverse les capillaires, de sorte que les molécules qui se trouvent dans les capillaires les plus éloignés de la source laser sont moins excitées que celles qui se déplacent dans les premiers capillaires. Pour résoudre ce problème, il a également été proposé , notamment dans "Capillary Array Electrophoresis Using Laser-Excited Confocal Fluorescence Detection"- X. Huang, M. Quesada, R. Mathies - Anal. Chem. 1992, 64, 967-972, d'utiliser un faisceau d'excitation émis perpendiculairement par rapport au plan de la barrette et de réaliser une détection de la fluorescence par des moyens optiques dont l'axe est confondu avec celui du faisceau, cet axe et le faisceau d'excitation étant déplacés successivement dans le temps de capillaire en capillaire. Mais cette technique n'est pas non plus satisfaisante étant donné qu'elle nécessite des moyens mécaniques complexes et qu'en outre le déplacement des moyens de détection d'un capillaire à un autre induit beaucoup de temps mort. Un but de l'invention est donc de proposer un système d'électrophorèse multicapillaires qui ne présente pas les inconvénients des techniques antérieures et qui est particulièrement fiable, facile d'utilisation, et présente des performances permettant un sèquençage et un génotypage à haut débit. Plus particulièrement, I'invention propose un système d'électrophorèse multicapillaire comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules se trouvant sur son trajet et à l'intérieur des capillaires, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce que lesdits moyens sont agencés de façon à réaliser une détection de la lumière qui émerge en sortie desdits capillaires et qui se propage selon la direction dans laquelle lesdits capillaires s'étendent. Ce système est avantageusement complété par les fférentes caractéristiques avantageuses suivantes prises seules ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles - la résolution des moyens de détection est suffisante pour distinguer la lumière qui émerge en sortie des capillaires de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure; - un cache noir formant diaphragme est monté en sortie des capillaires, - le système comporte une matrice de capillaires; - le faisceau d'excitation est de section droite elliptique et attaque simultanément plusieurs capillaires superposés; - l'espace entre les capillaires est rempli, au moins sur la trajectoire du faisceau d'excitation, par un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir traversé un capillaire; - ledit matériau est transparent et non fluorescent - le système comporte des moyens pour appliquer dans la cuvette de détection, une pression qui permet de remplir les capillaires avec la matrice de séparation, - le système comporte au moins un prisme intermédiaire pour séparer spatialement les différentes longueurs d'onde de fluorescence. - il comporte des guides optiques qui sont alignés avec les capillaires et récupèrent la lumière directionnelle en sortie de ceux-ci pour la guider sur des capteurs photosensibles. - il comporte en outre des moyens de multiplexage, qui, en combinaison avec lesdits capteurs photosensibles, permettent une détection de différentes longueurs d'onde. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore de la description. Cette description est purement illustrative et non limitative. Elle doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 est une représentation schématique en perspective d'un système conforme à un mode de réalisation possible de l'invention; - la figure 2 est une représentation schématique en illustrant la disposition des moyens de détection par rapport aux capillaires pour le système de la figure 1, - les figures 3a et 3b illustrent l'utilisation d'un faisceau d'excitation de section droite circulaire; - les figures 4a et 4b illustrent l'utilisation d'un faisceau de section droite elliptique; - la figure 5 illustre l'utilisation d'une matrice de capillaires - les figures 6a et 6b illustrent deux variantes possibles pour le montage des capillaires; - les figures 7a et 7b sont deux photographies illustrant la répartition du faisceau d'excitation après avoir traversé des capillaires, selon l'indice du milieu qui environne les capillaires et qui est traversé par ledit faisceau d'excitation - la figure 8 est un graphe sur lequel on a porté la réponse du système en fonction de la concentration des oligonucléotides - la figure 9 est un graphe sur lequel on a porté le rapport signal/bruit en fonction de la puissance totale du laser d'émission - la figure 10 est un graphe sur lequel on a porté l'intensité collectée en fonction du temps pour un exemple de séparation d'échantillons mis en oeuvre avec le système illustré sur la figure 1; - la figure il est un graphe sur lequel on a porté l'intensité du signal collecté en fonction de l'ouverture de l'objectif; - la figure 12 est une représentation schématique en vue de dessus illustrant des moyens possibles pour la détection de différentes longueurs d'ondes de fluorescence des différentes molécules. Le système d'électrophorèse multicapillaire représenté sur la figure 1 comporte, sur une table optique 1 - un canal 3 dans lequel s'étendent des capillaires, - une boite à haute tension 2 sur laquelle sont montées les entrées des capillaires, - une cellule de détection 4 disposée en sortie du canal 3, - une caméra CCD 6 et une optique de convergence 5 interposées entre ladite caméra 6 et la cellule de détection, - une source laser 7, - des moyens optiques 8 qui sont montés sur un rail 9 et qui permettent de diriger le faisceau de la source 7 sur la cellule de détection 4. Ainsi que l'illustre plus particulièrement la figure 2, la caméra CCD 6 observe la fluorescence des molécules excitées par le faisceau F laser selon un axe optique qui est parallèle à l'axe des capillaires C. Dés lors que la résolution de la caméra est suffisante, ceci permet de distinguer la lumière qui émerge de l'intérieur des capillaires C de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure. II en résulte une amélioration considérable du rapport signal sur bruit. Par exemple, dans le cas de capillaires C de 100 lim de diamètre intérieur et de 300 lim de diamètre externe, on peut utiliser comme détecteur une caméra CCD 6 permettant, en combinaison avec les moyens optiques 5, une résolution de l'ordre de 20-40 um. Egalement, pour minimiser le bruit de fond venant de la diffusion du faisceau F laser ou de la fluorescence des parois des capillaires C ou du milieu environnant, un cache noir formant diaphragme est avantageusement monté en sortie des capillaires C. On notera qu'étant donné que l'observation de la fluorescence des molécules se fait en sortie des capillaires C selon un axe parallèle à la direction des capillaires C, il devient possible d'utiliser des matrices de capillaires C, ce qui permet de multiplier considérablement le rendement d'électrophorèse. Le terme matrice doit être entendu de façon générale et désigne tout ensemble de capillaires C dans lequel ceux-ci sont répartis en étant superposés les uns aux autres selon deux directions. Ce terme englobe par conséquent tout aussi bien des matrices constituées de plusieurs barrettes superposées que d'autres dispositions de capillaires et notamment par exemple des ensembles dans lesquels les capillaires sont répartis en quinconce Le faisceau F d'excitation émis par la source laser 7 est envoyé sur la cellule de détection 4, pour attaquer les capillaires C perpendiculairement à la direction selon laquelle ils s'étendent. Le faisceau F d'excitation peut alors être soit de section circulaire (figures 3a et 3b), auquel cas il est envoyé dans le plan d'une barrette de capillaires C pour traverser successivement ces derniers. Avantageusement également, il peut être elliptique et attaquer une barrette selon une direction optique perpendiculaire au plan de ladite barrette, ce qui permet à un même faisceau F d'attaquer simultanément les différents capillaires C superposés (figures 4a et 4b). En outre, cela permet une plus grande tolérance sur la position relative des capillaires. Et ainsi que l'illustre la figure 5, on utilisera avantageusement un faisceau F elliptique dans le cas où les capillaires C sont répartis non pas selon une barrette, mais selon une matrice. Les capillaires C peuvent être maintenus entre eux par collage et/ou par des pré-formes. Par ailleurs, ainsi que l'illustre la figure 6a, il peut être prévu sur la trajectoire du faisceau d'excitation, dans les interstices entre les capillaires C un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir été traversé par un capillaire, notamment un matériau dont l'indice est inférieur à celui des capillaires. Ce matériau est choisi aussi transparent que possible et non fluorescent. L'effet de focalisation obtenu avec un tel matériau est illustré par les photographies reprises sur les figures 7a et 7b. On voit sur ces photographies qu'un faisceau F éclairant plusieurs capillaires C en parallèle crée des zones d'ombres après le passage à travers les capillaires C quand les indices des capillaires C et du milieu environnant sont proches, mais focalise la lumière transmise lorsque l'indice extérieur est inférieur à celui des capillaires C. Cette focalisation permet par exemple d'utiliser un même faisceau F elliptique pour éclairer l'ensemble des capillaires C d'une meme matrice. Le matériau qui assure la fonction de focalisation peut éventuellement être constitué par le matériau qui sert à la fix'ion des capillaires. Toutefois, on préfère les solutions dans lesquelles on utilise, pour empêcher la divergence du faisceau d'excitation qui traverse les capillaires, un matériau différent de celui qui assure la fixation des capillaires. On notera d'ailleurs, ainsi que l'illustre la figure 6b, que dans ce cas, le matériau qui empêche la divergence du faisceau d'excitation peut être constitué par la solution tampon dans laquelle les capillaires baignent. On donne ci-après des détails techniques relatifs au montage qui est illustré sur la figure 1 qui a été utilisé par les inventeurs. L'électrode dans la boîte 2 est alimentée dans un générateur de tension de type SPELLMAN. Les entrées et sorties des capillaires C sont électriquement reliées par l'intermédiaire d'un tampon d'une solution de polymère à la cathode et à l'anode de ce générateur. L'anode se trouvant à la masse, la tension appliquée sur la cathode peut aller jusqu'à 30 kV pour un longueur de capillaires C entre 25 et 60cm. La cellule de détection 4 où débouchent les capillaires C est un parallélépipède rectangle aux parois opaques muni de deux fenêtres latérales en quartz pour l'entrée et la sortie du faisceau F laser, tandis qu'une autre fenêtre, également en quartz, se trouve dans l'axe des capillaires C pour permettre la collection de la lumière de fluorescence par l'optique 5 et la caméra 6. Cette dernière fenêtre peut être remplacée par un filtre pour discriminer la lumière de fluorescence de la lumière laser. En variante, ce filtre peut être disposé en sortie de ladite fenêtre. Une quatrième fenêtre, sur la paroi supérieure de la cellule permet d'observer avec un microscope l'alignement du faisceau F laser par rapport aux capillaires C. La colle qui est utilisée pour fixer les capillaires C dans la cellule de détection est une colle transparente qui polymérise aux UV. L'optique 5 est un objectif qui présente une focale de 1,2. Elle est avantageusement complétée par deux bonnettes avec un total de 6 dioptries, pour obtenir un agrandissement proche de 1. La caméra CCD 6 est du type de celles commercialisées par PRINCETON sous la dénomination 'Yrame transfer" Elle permet de réaliser des acquisitions successives sans temps mort. La surface active de la caméra est de 6 à 8 mm2 avec une taille de pixels de 22 pLm/22pm. La caméra est refroidie par effet Peltier jusqu'à 40 C environ. Le laser est un laser argon (ILT) présentant une puissance maximale d'environ 10 mW à la longueur d'ondes de 488 nm. Un prisme holographique permet d'éliminer toute longueur d'ondes autre cette longueur d'ondes de 488 nm. La matrice de séparation (gel ou autre) est injectée dans les capillaires au moyen d'une pompe qui permet d'appliquer une pression dans la cuvette de détection. On présente ci-après les résultats qui ont été obtenus avec un tel système pour une puissance de faisceau F laser de 8 mW et une distance entre les tranches de sortie des capillaires C et le point d'impact du faisceau F d'excitation de détection de 750 lim, en injectant, par voie électrocinétique ou avec un flux hydrodynamique des dilutions d'oligonucléotides d'une concentration connue. La figure 8 donne, en fonction de la concentration des oligonucléotides injectée, le nombre de charges collectées sur 9 pixels (sommation par le logiciel) après soustraction du signal des mêmes 9 pixels sans ADN dans les capillaires C. On constate une bonne linéarité sur deux ordres de grandeur. En ce qui concerne la sensibilité minimale détectable, la figure 9 donne, en fonction de la puissance totale du laser, le rapport signal sur bruit (S/N) obtenu pour la concentration la plus faible (1,8nm) utilisée dans le cas d'une part d'une sommation sur 9 pixels (courbe B) et d'autre part dans le cas où l'on utilise des pixels ayant une taille 9 fois supérieure (courbe R). La courbe B montre que pour cette concentration le rapport S/N est égale à 1.5 seulement. Cette sensibilité est satisfaisante pour les expériences de génotypage, mais est limite pour la concentration typique pour les bandes d'ADN dans les échantillons de séquençage. Pour améliorer la sensibilité, on peut utiliser des pixels plus gros, par exemple regroupant 9 des pixels du précédemment envisagés. On obtient alors une sensibilité environ trois fois plus élevée. Ceci vient du fait que le bruit de lecture de la caméra est presque neuf fois plus élevé si on lit 9 pixels individuellement, que s'ils sont regroupés en un seul pixel. La courbe R de la figure 9 montre le rapport S/N dans cette configuration. II est également possible de gagner en sensibilité en augmentant simplement la puissance du laser. Un laser de 80 mW devrait permettre d'obtenir une sensibilité environ 6 fois supérieure à celle mesurée pour 8mW. Combiné avec le gain d'un facteur 3 du au regroupement des pixels de la CCD, on atteint une amélioration en sensibilité d'un facteur 18 permettant le séquençage de l'ADN. Par ailleurs, les tests mis en oeuvre par les inventeurs ont montré que la sensibilité du système dépendait également de la position du point d'impact du laser par rapport à la sortie des capillaires C. Toutefois, celle-ci varie peu lorsque l'on fait varier la distance entre ledit point d'impact et la sortie d'1 mm à 250 um, ce qui confirme que l'essentiel de la lumière sortant par l'ouverture des capillaires C est effectivement collecté. Pour gagner encore en sensibilité, il faudrait alors s'approcher considérablement avec le faisceau F de la sortie des capillaires C. Un tel gain entrainerait une plus faible collimation de la lumière, ce qui dégraderait partiellement la résolution de l'image. Pour montrer la capacité du système à séparer des bandes, les inventeurs ont fait un test de migration avec l'échantillon double brin (f X174 de Gibco BRL) dans une solution de polymères (HPC 0,5%). Le marqueur utilisé était l'intercalaire SYBR(I) (Molecular Probes). Le résultat a été porté sur le graphe de la figure 10 pour deux capillaires C. Pour une concentration d'1 ng/pl, les inventeurs ont obtenu un signal excellent des 1 1 bandes. D'autres variantes que celle qui vient d'être décrite sont bien entendu envisageables. Notamment, les faisceaux de lumière de fluorescence en sortie des capillaires C - qui sont collimatés - peuvent être directement transmis à un ou plusieurs prismes intermédiaires pour séparer spatialement les différentes longueurs d'ondes émises et envoyer celles-ci sur un réseau de photodiodes. La dépendance de la lumière récoltée en fonction de l'ouverture de l'objectif a également été testée. Le signal net, c'est-à-dire la soustraction du signal brut moins le bruit sont donnés en fonction de l'ouverture de l'objectif dans la figure 10. En partant d'une ouverture 16, on trouve uneA augmentation du signal jusqu'à l'ouverture 2,8, puis le signal sature. Ceci est dû à la directionalité de la lumière émergeant des capillaires C. Dès que le cône de lumière est complètement accepté par l'objectif, un agrandissement supplémentaire n'est plus utile. Au contraire, dans ce cas le rapport signal sur bruit diminue. Ceci est une preuve expérimentale supplémentaire pour la faisabilité et l'interêt de la version illustrée sur la figure 12. Sur cette figure 12, la lumière émise en sortie des différents capillaires C est récupérée par des fibres optiques FO présentant un diamètre légèrement supérieur au diamètre intérieur des capillaires C. Dans ce cas, on notera que la capture des photons ne nécessitent aucun élément optique intermédiaire étant donné que lesdits photons de fluorescence sortent par l'axe des capillaires C en étant sensiblement parallèles. Les fibres optiques sont avantageusement couplées à des moyens de multiplexage optique M permettant de transmettre le signal reçu sur quatre capteurs photosensibles Ph correspondant à quatre longueurs d'ondes de fluorescence différentes. Comme on l'aura compris, les systèmes qui viennent d'être décrits sont d'une conception simple et permettent d'atteindre des hauts débits avec une grande fiabilité et une grande facilité de mise en oeuvre REVENDICATIONS 1. Système d'électrophorèse multicapillaire comportant une pluralité de capillaires juxtaposés, au moins une source pour l'émission d'un faisceau destiné à exciter des molécules se trouvant sur son trajet et à l'intérieur des capillaires, des moyens pour détecter la fluorescence des molécules excitées par ledit faisceau, caractérisé en ce que lesdits moyens sont agencés de façon à réaliser une détection de la lumière qui émerge en sortie desdits capillaires et qui se propage selon la direction dans laquelle lesdits capillaires s'étendent. 2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résolution des moyens de détection est suffisante pour distinguer la lumière qui émerge en sortie des capillaires de celle venant des parois de ceux-ci et/ou du milieu qui les entoure. 3. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'un cache noir formant diaphragme est monté en sortie des capillaires. 4. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une matrice de capillaires. 5. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le faisceau d'excitation est de section droite elliptique et attaque simultanément plusieurs capillaires superposés. 6. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'espace entre les capillaires est rempli, au moins sur la trajectoire du faisceau d'excitation, par un matériau dont l'indice de réfraction est choisi pour que le faisceau d'excitation ne diverge pas après avoir traversé un capillaire. 7. Système selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit matériau est transparent et non fluorescent. 8. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour appliquer dans la cuvette de détection, une pression qui permet de remplir les capillaires avec la matrice de séparation. 9. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un prisme intermédiaire pour séparer spatialement les différentes longueurs d'onde de fluorescence. 10. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des guides optiques qui sont alignés avec les capillaires et récupèrent la lumière directionnelle en sortie de ceux-ci pour la guider sur des capteurs photosensibles. 11. Système selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de multiplexage, qui, en combinaison avec lesdits capteurs photosensibles, permettent une détection de différentes longueurs d'onde.