Brevet FR2782324A1 — publié le 20000218

La présente invention est relative a un procédé pour purifier et valoriser les acides désoxyribonucléiques ou ADN contenus dans du sang de volaille. Le sang de volaille du fait qu'il comprend des érythrocytes munis d'un noyau, constitue une source importante d'ADN d'origine animale. On connaît déjà des procédés pour obtenir des produits actifs riches en ADN à partir de sang de volaille. Selon l'un de ces procédés, on récupère le sang de volaille lors de l'abattage et on le conserve en lui ajoutant notamment un produit anticoagulant; puis on isole les érythrocytes par centrifugation et on les recueille sous forme d'un culot que l'on purifie par adjonction d'un détergent: on obtient ainsi par centrifuga- tion un produit exempt d'hémoglobine qui est soumis alors à un choc osmotique pour libérer la chromatine renfermant l'ADN. La chromatine obtenue selon ce procédé de l'art antérieur renferme environ 4g/l d'ADN et 4 g/I d'histones par litre de sang traité. Si une telle chromatine présente une composition satisfaisante pour de nombreuses applications, il est apparu que la présence d'histones pouvait être un handicap dans certains cas, par exemple: ils provoquent une modification de la réactivité de l'ADN; ils entraînent un changement de certaines des propriétés physiques de l'ADN telles qu'une moins bonne qualité hydratante; ils peuvent aussi fausser les dosages. Aussi un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé industriel pour purifier un ADN obtenu à partir du sang de volaille. Un autre but de l'invention est de fournir un tel procédé qui soit de mise en oeuvre simple et peu coûteuse. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé pour purifier les acides désoxyribonucléides ou ADN contenus dans du sang de volaille, qui est caractérisé selon la présente invention, par le fait que l'on récupère la chromatine contenue dans les érythrocytes, que l'on centrifuge celle-ci afin d'obtenir une fraction soluble et que l'on soumet celle-ci à un traitement enzymatique afin de récupérer l'ADN pur. De préférence, on centrifuge la chromatine à 50 000 g pendant une heure. Avantageusement, le traitement enzymatique est réalisé en présence de la protéinase K immobilisée sur des billes de verre poreuses alkylaminées. De préférence, les billes de verre poreuses ont été alkylaminées et l'enzyme fixée par la méthode au glutaraldéhyde. Avantageusement, le traitement enzymatique est réalisé à température ambiante et à un pH compris entre 7 et 12. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la récupération de la chromatine comprend les étapes ci-après: - collecte du sang nonhémolysé, - séparation du plasma et des éléments figurés par centrifugation ou sédimentation, - rupture des membranes plasmiques, - séparation des noyaux de l'hémoglobine par chromatographie d'exclusion- diffusion, - rupture des membranes nucléaires, - récupération de la chromatine. Avantageusement, le sang est collecté de manière hygiénique et non- hémolysée par ajout d'un anticoagulant tel que le citrate trisodique ou les polyphosphates. De préférence, la séparation du plasma et des éléments figurés est réalisée par centrifugation ou sédimentation. s15 Avantageusement la rupture des membranes plasmiques et nucléaires est réalisée par un traitement aux ultra-sons ou sonication. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, doit être lue en regard des figures annexées parmi lesquelles: - la figure 1 représente la courbe d'activité de la protéinase K sous forme libre ou immobilisée sur billes de verre poreuses (taille = 80-120 mesh; poro- sité = 300 nm) en fonction de la température du milieu réactionnel; - la figure 2 représente la courbe d'activité de la protéinase K sous forme libre ou immobilisée sur billes de verre poreuses (taille = 80-120 mesh; po- rosité = 300 nm) en fonction du pH du milieu réactionnel; - la figure 3 représente le spectre d'absorbance (200 nm-320 nm) d'une solution d'ADN extraite d'érythrocytes aviaires selon le procédé de la présente invention; - la figure 4 représente l'analyse électrophorétique en gel d'agarose (0,8 %) de solutions de chromatine et d'ADN. La chromatine récupérée à partir du sang de volaille est soumise, selon la présente invention, à une centrifugation pendant environ 1 heure à 50 000 g. On récupère ainsi une fraction insoluble qui est éliminée et une fraction soluble, à partir de laquelle sera obtenu l'ADN purifié. Le procédé selon la présente invention consiste à isoler l'ADN des his- tones contenus dans la chromatine: la technique enzymatique classique pour pu- rifier l'ADN n'est pas performante dans un contexte industriel, notamment en raison du coût des produits. Aussi a-t-il été mis au point un nouveau procédé enzymatique industria- lisable, selon lequel on immobilise la protéinase K, enzyme issue de Tritirachium album et couramment utilisée en laboratoire pour purifier l'ADN. D'ailleurs, cette enzyme a une activité protéolytique six fois plus importante que la pronase et trois fois plus que la trypsine d'origine bovine sur l'hydrolyse de l'hémoglobine. Cette enzyme a été immobilisée sur des billes de verre poreuses alky- laminées, par la méthode au glutaraldéhyde; on peut aussi mettre en oeuvre la méthode utilisant le 2, amino-4,6 dichloro-triazine ou le thiophosgène créant un isothiocyanate. L'activité de la protéinase K sous forme respectivement libre et immobi- lisée en fonction de la température réactionnelle est représentée à la figure 1: % d'activité correspond à l'activité maximale à 29 C et à pH 8. Les courbes montrent une activité maximale à 25 C pour la forme libre et à 29 C pour la forme immobilisée. Par ailleurs, on peut constater que l'activité de l'enzyme immobilisée est moins sujette aux variations de la température du milieu réactionnel que la forme libre. L'immobilisation de la protéinase K sur billes de verre poreuses rend donc l'enzyme moins sensible aux variations de la température. En conséquence, on peut purifier de l'ADN à partir de la chromatine d'origine aviaire à température ambiante, soit entre 18 C et 20 C, en conservant 95 % à 97 % de l'activité maximale de l'enzyme mise en oeuvre. L'activité de la protéinase K sous forme respectivement libre et immobi- lisée par le glutaraldéhyde sur billes de verre poreuses en fonction du pH est repré- sentée sur la figure 2. Les courbes montrent une activité maximale à pH 8 que l'enzyme soit immobilisée ou libre. Cependant, on constate que l'activité de l'enzyme fixée est moins sujette aux variations de pH du milieu réactionnel. En fait, I'immobilisation de la protéinase K sur billes de verre poreuses rend l'enzyme moins sensible aux va- riations du pH: en effet, il apparaît que le traitement enzymatique peut être réalisé à un pH compris entre 7 et 12. L'activité de la protéinase K sous forme immobilisée sur billes de verre poreuses en fonction du temps de contact avec la chromatine est exprimée en quantité de substrat dégradé par ml. Les résultats sont regroupés dans le tableau I ci-après. Les valeurs obtenues montrent que le débit d'élution le plus rapide as- surant l'élimination quasi complète des histones de la chromatine est de 1,5 ml/min. Le temps de contact de l'enzyme avec son substrat est alors de: Tc = 1, 75 ml /1,5 ml.min ' = 70 secondes Ce temps de contact minimum permet à 10 unités d'activité de protéi- nase K de dégrader la quasi totalité des histones contenues dans la solution chro- matinienne a la concentration de lmg d'histones / ml. Débit d'élution Quantité restante d'histones (ml/min) (pg/ml) 0 1000 +/-7 4 606 +/-11 3 470 +/-12 2 304 +/-9 1,5 15 +/-5 1 15 +/-3 0,5 14 +/-3 0,25 16 +/-2 Tableau I: Activité de la protéinase K immobilisée sur billes de verre poreuses (taille = 80 - 120 mesh; porosité = 300 nm) en fonction du temps de contact en- zyme/substrat. A partir d'un litre de sang de volaille, on obtient 2 litres d'une solution de chromatine à la concentration de 4 g/l, soit 8 g de chromatine. Lorsque cette solution est centrifugée, la fraction insoluble de la chromatine, soit 20 % de la chromatine totale, est éliminée. Ce sont donc 6,4 g de chromatine soluble qui sont chromatographiés sur billes de verre poreuses en présence de protéinase K. Le rapport ADN/histones étant peu différent de 50 / 50, on soumet à la purification 3,2 g d'ADN par litre de sang traité. Le rendement de purification de l'ADN d'érythrocytes aviaires est de (3, 2 / 7) x 100 = 47 % de l'ADN total contenu dans ces demrniers. La perte provient uniquement de la purification de la chromatine. Cet ADN ainsi purifié est obtenu sous forme double brin. En effet, les spectres d'absorbance (200 nm - 320 nm) de cet actif en solution avant et après traitement thermique à 100 C (figure 3) mettent en évidence un effet d'hyperchromicité caractéristique du statut bicaténaire du polydésoxyribonucléotide. Les rapports DO260nm/DO280onm et DO260nom/ DO23onm sont respectivement de 1,95 et 1,82. Ces résultats sont, d'une part, comparables aux rapports de densité optique calculés à partir de l'absorbance d'un ADN commercial en solution à ces mêmes longueurs d'ondes et, d'autre part, attestent de l'état de pureté de l'ADN ex- trait. Un dosage chimique des protéines résiduelles montre que l'ADN obtenu présente un taux de pureté de 98,5 % +/-0,5 % (p/p). A partir d'une quantité d'ADN lyophilisé, ou de poudre d'ADN obtenue après précipitation à l'acétone, séchage et remise en solution, on effectue un do- sage quantitatif par la méthode de Burton: celui-ci montre que 98,5 % (+ /-0,5 %) de cette quantité correspond à de l'acide désoxyribonucléique. Si l'on compare ce taux de pureté à ceux de l'ADN commercial et de l'ADN extrait par traitement aux solvants organiques (phénol/chloroforme), on constate que I'ADN purifié selon le procédé de la présente invention est supérieur de 3 % en pureté, comme cela ressort dans le tableau Il ci-après. Tableau Il: Pourcentage d'acide désoxyribonucléique et de protéines contenus dans la chromatine extraite selon différents procédés et dans l'ADN purifié par diffé- rentes méthodes et de diverses origines. Acide désoxyrilbonucléique Protéines (%) (%) chromatine procédé industriel 40-50 50-60 origine: poulet procédé de laboratoire 40-50 50-60 origine: poulet ADN procédé industriel 98, 5 (+/-0,5) 1,5 (+/-0,1) origine: poulet procédé de laboratoire 95 (+/-0,5) 5 (+/-0,3) origine: poulet commercial 95 (+/-0,1) 5 (+/-0,4) origine: thymus de veau commercial commercial 95,2 (+ /-0,2) 4,8 (+/-0,3) origine: sperme de poisson 95,2 (+/-0,2) 4,8 (±0,3) On a tenté d'améliorer encore ce degré de pureté en réalisant des es- sais de purification par chromatographies en boucle sur billes de verre poreuses; c'est-à-dire que l'éluat est passé plusieurs fois (plus de 20 fois) sur la colonne. On constate un effet plafond de la purification qui se situe à 98,5 % (+/-0, 5 %). L'ADN du commerce extrait de façon conventionnelle par séparation au phénol / chloroforme fait ressortir l'intérêt de I'ADN extrait selon un procédé qui as- sortit à un faible coût un degré supérieur de pureté. La taille des fragments d'ADN, purifiés par chromatographie, reste éle- vée en dépit du nombre et de la vigueur des traitements mécaniques qui lui sont infligés: comme on peut le voir sur la figure 4 o la piste 1 est relative à une solution de chromatine extraite d'érythrocytes aviaires selon le présent procédé, la piste 2 concerne une solution de chromatine extraite d'érythrocytes aviaires selon un procédé conventionnel de laboratoire, la piste 3 est relative a une solution d'ADN purifié par le traitement enzymatique de la présente invention, et la piste 4 concerne une solution d'ADN purifié par un traitement acide (HCI à 0,25 M). L'électrophorégramme des fragments d'ADN montre que l'on obtient des polymères de longueur comparable à celle des polymères obtenus par une extraction de type laboratoire. On peut constater sur ce type de gel que le traitement enzymatique par chromatographie ne modifie pas la taille des chaînes d'ADN. On a également comparé l'actif ainsi purifié à l'ADN obtenu par traite- ment acide. Celui-ci présente un degré de polymérisation assez faible car la grande majorité des fragments obtenus par ce procédé présentent une taille comprise entre 2Kpb et 0,1 Kpb; ces fragments d'ADN sont intermédiaires entre l'ADN moléculaire et les oligodésoxyribonucléotides. Enfin, le traitement de l'actif par la RNAse ne modifie pas le profil des électrophorégrammes en gel d'agarose, contrairement bien entendu, à la DNAse. Ainsi donc, le produit est non seulement quasiment dépourvu de protéi- nes mais, n'est également pas contaminé par les ARNs, et alors même qu'aucun traitement pour éliminer ces derniers ne figure dans les différentes étapes du pro- cédé. Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir plusieurs types actifs sous différentes formes: - ADN lyophilisé - poudre d'ADN poudre d'oligo-désoxyribonucléotides (traitement acide) Pour récupérer la chromatine à partir du sang de volaille, après avoir collecté celui-ci lors de la saignée en le mélangeant avec un anticoagulant tel que du citrate trisodique ou des polyphosphates, on le centrifuge ou on le soumet à une sédimentation afin de séparer le plasma des éléments figurés du sang. La centrifugation est réalisée en continu à 6000 tpm. Les éléments figurés sont soumis à un traitement aux ultra-sons ou sonication afin de casser les membranes cellulaires et on récupère par chromatographie d'exclusion-diffusion les noyaux cellulaires. Ceux-ci sont ensuite soumis à un nouveau traitement aux ultra-sons ou sonication afin de faire éclater la membrane nucléaire, puis on centrifuge à 50 000 g pendant une heure afin d'obtenir de la chromatine soluble. REVENDICATIONS 1. Procédé pour purifier et valoriser les acides désoxyribonucléiques ou ADN contenus dans du sang de volaille, caractérisé par le fait que l'on récupère la chromatine contenue dans les érythrocytes, que l'on centrifuge celle-ci afin d'obtenir une fraction soluble que l'on soumet à un traitement enzymatique afin de récupérer l'ADN pur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on centrifuge la chromatine à 50 000 g pendant 1 heure. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le traitement enzymatique est réalisé en présence de la protéinase K immobilisée sur des billes de verre poreuses alkylaminées. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on fixe la protéinase K sur les billes de verre poreuses, qui sont alkylaminées, par la méthode au glutaraldéhyde. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le traitement enzymatique est réalisé à température ambiante et à un pH compris entre 7 et 12. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que la récupération de la chromatine comprend les étapes ciaprès - collecte du sang non-hémolysé, - séparation du plasma et des éléments figurés par centrifugation ou sédimentation, - rupture des membranes plasmiques, - séparation des noyaux de l'hémoglobine par chromatographie d'exclusion- diffusion, - rupture des membranes nucléaires, - récupération de la chromatine. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le sang est collecté de manière hygiénique et non-hémolysée par ajout d'un anticoagulant tel que le citrate trisodique ou les polyphosphates. 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la séparation du plasma et des éléments figurés est réalisée par centrifugation ou sédimentation. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la rupture des membranes plasmiques et nucléaires est réalisée par un traitement aux ultra- sons ou sonication.