Brevet FR2780413A1 — publié le 19991231

ENZYMES A ACTIVITE a-GALACTOSYLTIRANSFERASE DE CELLULES D'INSECTES, ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet l'utilisation d'enzymes à activité cE- galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes pour la mise en oeuvre de procédés enzymatiques de transfert de résidus galactose sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, notamment dans le cadre de la préparation de composés a-galactosylés utilisables en tant que probiotiques ou facteurs de croissance dans des compositions alimentaires ou pharmaceutiques destinées à l'homme ou à l'animal. L'invention concerne également les procédés enzymatiques susmentionnés de transfert de résidus galactose, ainsi que les composés obtenus par ces procédés, et les compositions alimentaires ou pharmaceutiques comprenant lesdits composés. De nombreuses études ont tenté d'identifier la structure des N-glycannes portés par des glycoprotéines exprimées dans différentes cellules d'insectes, principalement dans la lignée Spodoptera frugiperda 9, en utilisant le baculovirus comme vecteur d'expression. Deux familles de Nglycannes ont été essentiellement retrouvées, (i) des structures de type oligomannosidique (Man9_sGlcNAc2), et (ii) de petites structures tronquées, fréquemment porteuses d'un résidu de fucose lié en acl,6 sur le résidu de GlcNAc impliqué dans la liaison N-glycosidique (Man32[Fuc0_]GlcNAc2) (Kuroda et al., 1986a; Jarvis et Sum-uners, 1989; Kuroda et al., 1989; Kuroda et al., 1990; Kuroda et al., 1991; Chen et al., 1991; Wathen et al., 1991; Williams et al., 1991; Noteborn et al., 1992; Veit et al., 1993; Voss et al., 1993; Yeh et al., 1993; Manneberg et al., 1994; Ponimaskin et al., 1994, Lopez et al, 1997). De plus, une petite proportion de structures hybrides contenant un unique résidu de GlcNAc en position terminale a été mis en évidence sur l'interleukine-3 murine exprimée dans des larves de Bombix mori (Hogeland et Deinzer, 1994) et récemment, une analyse des N- glycopeptides issus de l'interféron y humain produit dans la lignée cellulaire d'insecte Estigmena acrea a permis de mettre en évidence des N- glycannes de type hybride et de type N-acétyllactosaminique possédant des résidus de GIcNAc et de Gal en position terminale non réductrice (Ogonah et al., 1996). En revanche, un seul groupe a montré que le plasminogène humain recombinant produit dans les lignées de lépidoptères Spodoptera frugiperda 21 et Mamestra brassicae en utilisant le baculovirus comme vecteur d'expression, pouvait être porteur de glycannes de type N-acétyllactosaminique bi, triet tétra- 2 2780413 antennés avec des résidus d'acide sialique en position terminale (Davidson et al., 1990; Davidson and Castellino, 1991a et 1991b). L'étude des N-glycannes qui substituent les glycoprotéines endogènes d'insectes prouve que ces dernières sont totalement dépourvues de glycannes de type N-acétyllactosaminique (Butters and Hughes, 1981; Hsieh and Robbins, 1984; Williams et al., 1991) mais peuvent porter des oligosaccharides possédant des résidus de GlcNAc ou de GalNAc en position terminale non réductrice (Hard et al., 1993; Kubelka et al., 1993; Kubelka et al., 1994). D'autres équipes ont recherché dans les lignées cellulaires de lépidoptères les activités enzymatiques, qui catalysent dans les cellules de mammifères, la transformation des N- glycannes de type oligomannosidique en structures hybrides puis en structures N-acétyllactosaminiques. Ces travaux ont montré que les cellules de lépidoptères possèdent une activité c&-mannosidase II (Altmann and Mârz, 1995), une très faible activité [31,2-N- acétylglucosaminyltransférase I (Altmann et al., 1993a; Velardo et al., 1993), des activités ca1,6- ou cal,3- fucosyltransférasiques (Staudacher et al., 1992b), et sont totalement dépourvues des activités f31,4-galactosyltransférasique et sialyltransférasiques. Les investigations se sont principalement focalisées sur l'identification des N-glycannes synthétisés par les insectes, au détriment de l'évaluation des capacités de O-glycosylation de ces lignées. A ce jour, les O-glycannes d'insectes identifiés sont essentiellement des structures simples, réduites au noyau (GalNAc ou Gal[31-3GalNAc), sans squelette ni sucre périphérique. La comparaison des O-glycannes portés par une glycoprotéine recombinante, la gp50 (protéine de l'enveloppe du pseudorabies virus), produite simultanément dans la lignée d'insecte Spodoptera frugiperda 9, et dans deux lignées de mammifères Vero et CHO montre que les sites de O- glycosylation des gp50 exprimées dans les cellules de mammifères sont exclusivement substitués par le disaccharide Gal31-3GalNAc porteur de un ou deux résidus d'acide sialique. En revanche, les sites de O- glycosylation de la gp50 exprimée dans le système baculovirus- Spodoptera frugiperda 9 sont essentiellement occupés par un unique résidu de GalNAc (antigène-Tn) et pour une très faible proportion par le disaccharide Gal13l-3GalNAc (antigène-T). De plus, les O-glycannes de la gp50 exprimée chez l'insecte ne sont jamais porteurs de résidus d'acide sialique (Thomsen et al., 1990). L'analyse des O-glycannes portés par la chimeric respiratory syncytial virus protein exprimée dans Spodoptera frugiperda 9 (Wathen et al., 1991), ou ceux retrouvés sur l'interleukine 2 humaine produite par Spodoptera frugiperda 21 (Grabenhorst et al., 1993) confirment la seule présence des antigènes-Tn et -T. 3 2780413 Afin de poursuivre la comparaison entre le potentiel de O-glycosyiation des lignées cellulaires de mammifères Vero et CHO, et celui de la lignée de lépidoptère Spodopterafrugiperda 9, Thomsen et al. (1990) ont mesuré dans les trois lignées cellulaires les activités enzymatiques successives responsables de la synthèse des antigènes-Tn et -T: la polypeptide N-acétylgalactosaminyl transférase et la [31,3- galactosyltransférase. Ainsi, les auteurs ont constaté que l'activité polypeptide N-acétylgalactosaminyltransférase était similaire dans les trois lignées, mais comme l'analyse structurale le laissait supposer, l'activité 31,3-galactosyltransférase était extrêmement faible dans les cellules de lépidoptère. En résumé, la nature des N- et O-glycannes portés par les glycoprotéines recombinantes exprimées dans le système baculovirus / cellules d'insectes ou par les glycoprotéines endogènes des lignées cellulaires de lépidoptères, ainsi que la mesure des activités glycosyltransférasiques qui catalysent la synthèse de ces N- et O-glycannes prouvent que le potentiel de glycosylation des lignées cellulaires d'insectes est déficient part rapport à celui des cellules de mammifères. On peut conclure des études menées jusqu'à présent sur les cellules d'insectes, qu'il y a peu de galactose dans les cellules d'insectes, et, en tout état de cause, qu'aucune structure galactosidique en a n'a été mise en évidence dans ces dernières. Aujourd'hui, il est clairement établi que des épitopes oligosaccharidiques substituant des glycoprotéines ou des glycolipides présents à la surface des tissus de nombreux mammifères sont à l'origine de l'impossibilité de réaliser des xénogreffes, en particulier la transplantation d'organes animaux chez l'homme. Le principal responsable du rejet par le corps humain des greffons animaux a été identifié comme étant un épitope c-galactosylé, le disaccharide Galul-3Gal (Galili et al., 1988, Rother et Squinto, 1996). En effet, environ 1% des IgG humaines présentes dans la circulation sanguine reconnaissent spécifiquement le disaccharide Galdal- 3Gal, que cet épitope soit porté par des glycoprotéines (Castronovo et al., 1987; Towbin et al., 1987) ou des glycosphingolipides (Galili et al., 1984, 1985 et 1987). Par ailleurs, il est connu qu'à la surface des hématies et des cellules épithéliales humaines et animales, constituant les membranes des tissus, se trouvent des glycolipides possédant le disaccharide Galdal- 4Gal, parmi lesquels le galabiosyl céramide, les antigènes P k, Pet P1. Ce disaccharide Galal-4Gal est la structure reconnue par des bactéries, des toxines bactériennes et des virus dans le cadre du processus d'adhésion de 4 2780413 ces derniers sur les membranes. Ce disaccharide pourrait s'il était utilisé en tant que médicament, empêcher ce phénomène d'adhésion par un mécanisme de compétition. Cependant, les trop faibles rendements des procédés de synthèse chimique des épitopes oc-galactosylés en général, et plus particulièrement des disaccharides Galal-3Gal et Galod- 4Gal susmentionnés, ne permettent pas d'envisager une application industrielle de ces composés, notamment dans le cadre de la prévention des rejets de greffe dans le cas du disaccharide Galcl1- 3Gal, ou en tant que probiotique ou facteur de croissance dans le cas du disaccharide Galcal-4Gal. La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs, que, contrairement à ce que le laisse suggérer l'état de la technique décrit ci- dessus sur ce sujet, les cellules d'insectes expriment des enzymes à activité c- galactosyltranférase participant à la synthèse de composés xgalactosylés. La présente invention a pour but de fournir de nouveaux procédés enzymatiques de préparation de composés oc-galactosylés. L'invention a également pour but de fournir de nouveaux composés a- galactosylés tels qu'obtenus par mise en oeuvre de ces procédés. L'invention a plus particulièrement pour but de fournir de nouveaux médicaments contenant des composés Oc-galactosylés susmentionnés, notamment des composés comportant la structure Galal 1-4Gal susmentionnée. L'invention a également pour but de fournir de nouvelles méthodes de prévention ou de traitement des infections bactériennes ou virales par administration chez l'homme ou l'animal de compositions pharmaceutiques comprenant lesdits composés comportant la structure Gala 1 -4Gal susmentionnée. L'invention a également pour but de fournir de nouveaux compléments nutritionnels, ou de nouvelles compositions alimentaires, comprenant lesdits composés comportant la structure Gal1xl- 4Gal susmentionnée, et susceptibles d'être utilisés en nutrition humaine ou animale. Les principales abréviations utilisées dans ce qui précède et ce qui suit, sont les suivantes: - les monosaccharides abréviation nom nom détaillé Glc Glucose D-glucopyranose GIcNAc N-acétyl-D-glucosamine 2-Acétamido-2-déoxy- D-glucopyranose Gal Galactose D- galactopyranose 2780413 GalNAc N-acétyl-D-galactosamine 2-Acétamido-2-déoxy- D-galactopyranose NeuAc acide N-acétyl-neuraminique -le glycosylnucléotide donneur UDP-Gal Uridine 5'-diphospho- galactose - le disaccharide GalcoE-4Gal en position terminale, ou à l'intérieur d'un oligosaccharide est appelé: galabiose - cE et P3 correspondent aux anoméries de la liaison acétalique. La présente invention a pour objet l'utilisation d'enzymes à activité OE-galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, pour la mise en oeuvre d'un procédé enzymatique de préparation de composés c-galactosylés. Par procédé enzymatique de préparation de composés oc-galactosylés, on entend tout procédé comprenant une étape de transfert, par l'intermédiaire d'une liaison c, d'un résidu de galactose sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé. La liaison en oc des deux résidus de galactose susmentionnés, conduit à la formation d'une structure de formule Galcl-nGal dans laquelle n correspond à la position de l'atome de carbone, du résidu de galactose terminal dudit substrat, porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu de galactose transféré. Par conséquent n représente 1, 2, 3, 4, ou 6. Cette structure de formule Galcd-nGal peut être soit en position terminale non réductrice dans les composés a-galactosylés ainsi obtenus, soit en position interne dans lesdits composés oc-galactosylés lorsque le procédé de préparation de ces derniers comprend une étape supplémentaire de liaison, par voie chimique ou enzymatique, d'un produit déterminé (désigné ci-après R1) au résidu de galactose identifié par l'expression Galcl dans la formule de la structure susmentionnée. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de 1'oc 1,4-galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de composés cl,4-galactosylés, ledit procédé comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose, par l'intermédiaire d'une liaison-cl, 4, sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, de manière à obtenir un composé oc-galactosylé comportant un disaccharide Galacl-4Gal en position terminale non réductrice. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'enzymes à activité co-galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, caractérisée en ce que lesdites enzymes sont celles exprimées dans les cellules d'insectes et 6 2780413 directement produites dans le milieu réactionnel dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention. A ce titre l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de cellules d'insectes en tant que source d'enzymes à activité cdl,4-galactosyltransférase, pour la mise en oeuvre d'un procédé enzymatique de préparation tel que décrit ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'enzymes à activité x-galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, caractérisée en ce que lesdites enzymes sont contenues dans des extraits cellulaires obtenus à partir de cellules d'insectes. Avantageusement les cellules d'insectes utilisées dans les procédés enzymatiques susmentionnés, ou à partir desquelles sont obtenus les extraits cellulaires susmentionnés, sont des cellules de lépidoptères. Notamment, les cellules de lépidoptères utilisées dans le cadre de la présente invention, sont celles des espèces suivantes: - Spodoptera, tel que Spodopterafrugiperda, - Mamestra, tel que Mamestra brassicae, - Trichoplusia, tel que Trichoplusia ni. De préférence, les cellules d'insectes utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules de Mamestra, tel que Mamestra brassicae, et plus particulièrement celles de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, d'une enzyme à activité cal,4- galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, notamment de lépidoptères définis ci-dessus, et avantageusement de cellules de Mamestra décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé enzymatique de préparation de composés o,4-galactosylés comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose, par l'intermédiaire d'une liaison-al,4, sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, de manière à obtenir un produit comportant le disaccharide Galod-4Gal en position terminale non réductrice. Avantageusement les lignées cellulaires d'insectes utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenues de la manière suivante: obtention des explants, notamment par prélèvement de tissus adipeux, d'ovaires, de tissus embryonnaires, d'hémolymphe, ou de disques imaginaux, - mise en culture des explants dans un milieu de culture approprié, 7 2780413 - changement du milieu de culture toutes les semaines pendant huit mois environ, - repiquage hebdomadaire de la lignée permanente ainsi obtenue, - clonage en vue de l'établissement d'une lignée particulière. Différentes méthodes d'obtention de lignées cellulaires d'insectes sont décrites de façon détaillée dans les revues suivantes: - Thèse de l'Université des Sciences et Techniques du Languedoc, soutenue le 5 juin 1975 par Jean-Marie Quiot, "Recherches sur la culture in vitro de cellules d'insectes et l'action de germes entomopathogènes en culture cellulaire", enregistrée à la bibliothèque centrale du Centre National de la Recherche Scientifique sous le numéro A.O. 10.963, - K. Aizawa, "Cell culture of Lepidoptera", paru dans Invertebrate Tissue Culture, édité par C. Vago, Academic Press New York and London (1971). L'invention concerne également les extraits cellulaires susmentionnés à activité oc-galactosyltransférase, notamment à activité ccl 1,4galactosyltransférase, tel qu'obtenu à partir de cellules d'insectes définies ci-dessus. Avantageusement les extraits cellulaires selon l'invention, sont obtenus par mise en oeuvre du procédé suivant: - lyse des cellules d'insectes, notamment des cellules de lépidoptères définies ci-dessus, par exemple par ultrasonication, - centrifugation du lysat cellulaire à basse vitesse, notamment à 13000 g pendant 10 mn à 4 C, - ultracentrifugation, notamment à 120000 g pendant 1 h à 4 C, du surnageant obtenu à l'étape de centrifugation précédente, - élimination du surnageant obtenu à l'étape d'ultracentrifugation précédente, et récupération du culot de microsomes, ledit culot étant le cas échéant remis en suspension, notamment dans une solution de saccharose à 0,25 M et NaCI à 0,2 M, et pouvant être conservé à -80 C. L'invention a également pour objet tout procédé enzymatique de préparation de composés ocl,4-galactosylés tels que définis ci- dessus, comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la réaction d'UDP-Gal avec ledit substrat en présence d'une enzyme à activité cc- galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, - le cas échéant la purification du produit obtenu lors de la réaction précédente. 8 2780413 Selon un mode particulièrement avantageux de réalisation du procédé enzymatique susmentionné de l'invention, la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence de cellules d'insectes, telles que décrites ci- dessus, exprimant l'enzyme à activité ac-galactosyltransférase nécessaire à ladite réaction. Avantageusement encore, le procédé enzymatique susmentionné de l'invention, est caractérisé en ce que la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence d'un extrait cellulaire tel que défini ci-dessus. Comme nous l'avons vu ci-dessus, les cellules d'insectes utilisées dans le cadre du procédé enzymatique susmentionné, sont avantageusement celles de lignées cellulaires telles qu'obtenues selon le procédé défini ci-dessus, et sont de préférence des cellules de lépidoptères appartenant notamment aux espèces suivantes: - Spodoptera, tel que Spodopterafrugiperda, Mamestra, tel que Mamestra brassicae, et plus particulièrement des cellules de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro I-2045, le 26 juin 1998, - Trichoplusia, tel que Trichoplusia ni. L'invention a plus particulièrement pour objet, tout procédé tel que décrit ci-dessus, de préparation de composés c-galactosylés comportant, en position terminale non réductrice, une structure de formule Galcl- nGal dans laquelle n est tel que défini ci-dessus. L'invention vise plus particulièrement tout procédé tel que décrit ci- dessus, de préparation de composés cl,4-galactosylés tels que définis cidessus, dans lequel l'étape de réaction de l'UDP-Gal avec ledit substrat est effectuée en présence d'une enzyme à activité al,4-galactosyltransférase. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé tel que décrit ci-dessus de préparation de composés c1,4-galactosylés, par transfert d'un résidu de galactose, par l'intermédiaire d'une liaison-al,4, sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes - la réaction d'UDP-Gal avec ledit substrat en présence d'une enzyme à activité Od,4-galactosyltransférase telle qu'obtenue à partir de cellules d'insectes, pour obtenir un composé ol,4galactosylé comprenant le disaccharide Galcl-4Gal en position terminale non réductrice, - le cas échéant la purification dudit composé al,4-galactosylé ainsi obtenu. 9 2780413 Avantageusement, le procédé susmentionné est effectué de telle manière que la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence de cellules d'insectes exprimant l'enzyme à activité (cl,4galactosyltransférase nécessaire à ladite réaction. Les cellules d'insectes productrices de l'enzyme à activité c l,4galactosyltransférase, et utilisées dans le procédé susmentionné, sont de préférence celles de lignées cellulaires telles qu'obtenues selon le procédé défini ci-dessus. Avantageusement lesdites cellules d'insectes sont des cellules de Mamestra, tel que Mamestra brassicae, et plus particulièrement des cellules de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. Selon un autre mode de réalisation du procédé susmentionné, la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence d'un extrait cellulaire tel que défini ci-dessus, et obtenu à partir de cellules d'insectes productrices de l'enzyme à activité (xl,4-galactosyltransférase, selon le procédé susmentionné. L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé tel que décrit ci-dessus de préparation de composés o-galactosylés, caractérisé en ce que * le substrat est un composé de formule Gall3l- noX-R dans laquelle - no correspond à la position, sur le résidu X défini ci-après, du carbone porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu terminal de [3-D-galactopyranose dudit substrat (représenté par Gall31 dans la formule ci- dessus), et représente 1, 2, 3, 4, ou 6, de préférence no représente 3 ou 4, et - X représente un oside, notamment un résidu de galactose, ou de glucose, ou de N-acétyl-D-galactosamine ou de 2-O-acétyl-Dgalactopyranose, - R représente: un atome d'hydrogène, 30. un monosaccharide ou un oligosaccharide, un oside ou oligoside porteur à leur extrémité réductrice d'un aglycone tel que défini ci-dessous, un aglycone, tel qu'un groupe benzyle ou phényle, substitué ou non, notamment un groupe paranitrophényle, ou un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe -(CH2)m-CH3 dans lequel m représente 0 ou un nombre entier de 1 à 7, une glycoprotéine, notamment une glycoprotéine substituée par des O-glycannes, telle que l'asialo-fétuine, 2780413 un acide amine, un peptide, une protéine, ou une néoglycoprotéine, notamment l'albumine sérique bovine chimiquement couplée à un oligoside, un glycolipide, notamment le lactosylcéramide de formule Gal31- 4Glcp1-Cer, le GM3 de formule NeuAcca2-3Gal31-4GlcP1-Cer, le GD3 de formule NeuAcc2-8NeuAcc*2-3Gal 1 -4Glc[3 1 -Cer, un lipide, un céramide, un support multivalent non immunogène, notamment un dérivé de polyacrylamide, ou une polylysine, dont les fonctions amines des chaînes latérales sont substituées par des groupes de formule Gall3-noX- dans laquelle no et X sont tels que définis ci-dessus, * le produit obtenu est un composé de formule (I) suivante Galx -nGal 1 -noX-R (I) dans laquelle no X et R sont tels que définis ci-dessus, et n correspond à la position de l'atome de carbone, du résidu de galactose terminal dudit substrat, à savoir du résidu de P-D- galactopyranose dudit substrat (représenté par Galbl3 dans la formule ci- dessus), porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu de galactose transféré (représenté par Galal dans la formule ci- dessus). L'invention concerne plus particulièrement tout procédé tel que décrit ci- dessus, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi les composés suivants Gal3 1 -3GalNAc, GalJ3 1 -3GalNAcc 1-O-bn, Gal3 1-3(2-O-Ac)Gal3 1-O-Me, Gale 1 -3GlcNAc3 -O-octyl, Gal31-3GlcNAc, Gal 1 - 4Glc, Gal3 1-3GlcNAc3 1 -3Gal 1 -4Glc, Gall 1-4GlcNAc, Galp3 1-4GlcNAc 1- 3Gal1 1-4Glc, Gall 1-3GalNAc13 1-4Gal 1 -4Glc1 1 -Cer, Gal3 1-3GalNAc 1 -4(NeuAcoc2-3)Gal 1 -4Glc3 1 -Cer, Galp 1 -3GalNAc]3 14(NeuAcoc2-8NeuAccc2-3)Gal [31-4Glc 1 -Cer, Gall 1-3GalNAcol1-O-Ser/Thr. (Ac = acétyle, bn = benzyle, Me = méthyle, Cer = céramide) Avantageusement, ledit substrat est choisi parmi les composés suivants Gall3 1-3GalNAc, Gal3 1 -3GalNAcoa 1-O-bn, Galp3 1-3(2-O-Ac)Gal3 1 -O-Me. il 2780413 L'invention a également pour objet les composés Oc-galactosylés de formule (I) suivante: Gal i -nGal3 1 -noX-R (I) dans laquelle n, no X et R sont tels que définis ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet les composés oEgalactosylés susmentionnés de formule (I) dans laquelle n = 4. Des composés cxl,4-galactosylés susmentionnés particulièrement préférés sont ceux répondant aux formules suivantes Gal1l-4Gal3] -3GalNAc, Galocl-4Galp13-3GalNAcal-O-bn, Galoc -4Gal 31-3(2-O-Ac)Gal 1 -O-Me, Galoxl-4Gal 13-3GlcNAc3 1-O-octyl, Galo 1-4Gal31 -3GlcNAc, GalIx 1- 4Galp 1-4Glc, Galc1-4Gal13l-3GlcNAc3 1-3GalF31-4Glc, Galo1l- 4Gal3 1-4GlcNAc, Galc -4Gal3 1-4GlcNAc3 1-3Gal3 1 -4Glc, Galca -4Gal1 i- 3GalNAcp 1 -4Gal13 -4GlcF1 -Cer, Gala 1-4Gal 1 -3GalNAc 1 -4(NeuAccz2- 3)Gal 1 i-4Glc3 1 -Cer, Galoc 1 -4Gal3 1 -3GalNAc3 1 - 4(NeuAccx2-8NeuAccoE2-3)Gal 1 -4Glc3 1 -Cer, Galca 1 -4Gal F31-3GalNAcc 1 -O-Ser/Thr. L'invention concerne également tout procédé, tel que décrit ci-dessus, de préparation de composés ca-galactosylés comportant une structure de formule Galcl-nGal définie ci-dessus, en position interne, ledit procédé étant effectué suivant les mêmes étapes que celles des procédés décrits ci-dessus, et comprenant une étape supplémentaire de liaison, par voie chimique ou enzymatique, d'un produit déterminé (R1) au résidu terminal de galactose identifié par l'expression Galucl dans la formule de la structure susmentionnée. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les composés cz- galactosylés de formule (II) suivante: R1-Galixl-nGalp13-noX-R (II) dans laquelle n, no X et R sont tels que définis ci-dessus, et R1 représente un oside ou oligoside. L'invention concerne plus particulièrement les composés ca-galactosylés de formule (II) susmentionnée, et correspondant aux formules suivantes GalNAc3 1-3Galc 1-4Galp 1-nX-R, GalNAcc -3GalNAc131-3Galc - 4Gal31 -nX-R, dans lesquelles n, no X et R sont tels que définis ci-dessus. 12 2780413 L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé cxgalactosylé, tel qu'obtenu par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, et plus particulièrement au moins un composé de formule (I) ou (II) susmentiomnnée, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques de l'invention, sont davantage caractérisées en ce qu'elles se présentent sous une forme administrable par voie orale ou parentérale, et comprennent notamment entre environ 1 mg à environ g de composé a-galactosylé selon l'invention. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention, sontcaractérisées en ce qu'elles comprennent également un ou plusieurs antibiotiques. L'invention concerne également l'utilisation de composés ct-galactosylés, tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, et plus particulièrement de composés de formule (I) ou (II) susmentionnée, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement d'infections bactériennes ou virales, chez l'homme ou l'animal. L'invention a plus particulièrement pour objet, l'utilisation de composés cx-galactosylés susmentionnés, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des infections par: - les souches d'Escherichia coli uropathogènes, - les souches d'Escherichia coli exprimant les G-adhésines sur leurs P- fimbriae, - les souches de Streptococcus suis qui sont responsables de méningites chez le porc et l'homme, - la Vero toxine d'Escherichia coli qui peut contaminer les viandes bovines et ovines et provoquer des diarrhées hémorragiques et des insuffisances rénales aiguës chez les consommateurs. L'invention a également pour objet l'utilisation de composés oc- galactosylés, tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, et plus particulièrement de composés de formule (I) ou (II) susmentionnée, pour la préparation de compositions alimentaires utilisables dans le domaine de la nutrition animale ou humaine. A ce titre, l'invention a pour objet toute composition alimentaire comprenant au moins un composé ca-galactosylé tel que décrit ci-dessus. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de procédés de préparation de composés ca-galactosylés de l'invention, et de l'étude de leurs propriétés biologiques. 13 2780413 Les épitopes oc-galactosylés étant fortement antigéniques chez l'homme, les Inventeurs ont recherché la présence de glycannes porteurs de résidus o:- galactosylés (en position terminale non réductrice) sur les glycoprotéines endogènes des lignées cellulaires d'insectes. En effet, les modifications post- traductionnelles subies par les protéines et particulièrement la glycosylation sont sous la dépendance de l'équipement enzymatique propre à chaque lignée cellulaire et le plus souvent, la fraction glycannique des glycoprotéines recombinantes garde une information spécifique issue du système qui l'a produite. Après séparation par SDS-PAGE et électrotransfert des protéines présentes dans des lysats de cellules d'insectes saines (non infectées par le baculovirus), la recherche des épitopes cc-galactosylés substituant les glycoprotéines endogènes a été réalisée sur la base de la fixation sur les glycoprotéines d'une lectine végétale, la lectine Bandeiraea simplicifolia lectine- I isolectine B4 (BSI-B4), spécifique des disaccharides GalIxl-3/4Gal en position terminale non réductrice (Hayes et al., 1974; Murphy et al., 1977; Wu et al., 1995). Toutes les lignées de lépidoptères testées se sont avérées posséder des glycoprotéines endogènes dont la fraction glycannique est reconnue spécifiquement par la BSI-B4. Les Inventeurs se sont plus particulièrement intéressés à la lignée Mamestra brassicae (Mb), car celle-ci s'est avérée posséder les glycoprotéines les plus fortement reconnues par la BSI-B4. Ainsi, une activité c1l,4-galactosyltransférasique chez Mb qui catalyse le transfert d'un résidu de oc-Gal sur les accepteurs Gal13-3GalNAc-R, a été mise en évidence. 1) Matériels et méthodes 1) Matériels Tous les produits utilisés sont de qualité analytique. L'UDP-[6-3H]-Gal (650 GBq/mmol) provient d'Amersham (France), ce glycosyl-nucléotide radioactif a été dilué avec de l'UDP-Gal non-radioactive achetée chez Sigma (St Louis, MO, USA). La BSI-B4 couplée à la peroxydase, les tablettes de DAB (substrat insoluble de la peroxydase), la BSI-B4, les substrats GMIa (Gall1- 3GalNAcp 1 -4(NeuAcca2-3)Gal, 1-4Glcp3 1-Cer), GAI (Gal 1 -3GalNAc3 1- 4 Gal3 1-4Glcr31-Cer), GD1b (Gal31-3GalNAc, 1-4(NeuAcc.2-8NeuAccx2- 3) Gal3 1 -4Glcp1 -Cer), GM2 (GalNAcp1 -4(NeuAccx2-3)Gal 1 -4GlcI1 - Cer), Gal13l-3GalNAcOc-O-bn, lactose (Gal31-4Glc), Gal, Galcl-pNp, Gal31- pNp, Gaklo-O-Me, la fétuine, l'angiotensine I et le Triton X- 100 proviennent de chez Sigma. La N-acétyllactosamine (Gal31-4GlcNAc) et la N-acétyl-isolactosamine (Gal13l-3GIcNAc) proviennent de chez Calbiochem (CA, USA). Le Lacto-N- tétraose (Galp31-3GlcNAc31-3Gal13-4Glc) et le lacto-N-néotétraose (Gall31- 14 2780413 4GlcNAcP1-3Galp1-4Glc) ont été préparés à partir de colostrum bovin (Paulson et al., 1978). Le Lactosylcéramide (Gal31-4Glc31-Cer), et le substrat Gal31- 3GalNAc proviennent de cez Sigma. Les substrats Gal13l-3(2-O-Ac)Gal13l-OMe et Gal3l1-3GlcNAc31-O-octyl sont synthérisés au laboratoire. L'asialofétuine a été obtenu après hydrolyse acide de la fétuine. La désialylation de la fétuine a été contrôlée en réalisant une composition en monosaccharides de l'asialo- glycoprotéine après méthanolyse, triméthylsililation et séparation des monosaccharides dérivés par chromatographie en phase gazeuse. Les supports de chromatographie Dowex 1x2 (forme CI-, 100-200 mesh), Bio-Gel P-2 (200- 400 mesh) et P-4 (200-400 mesh) proviennent de chez BioRad (France). Les cartouches Sep-Pak C18 proviennent de chez Waters Corp. (Milford, MA, USA). La membrane de nitrocellulose BioTrace NT a été achetée chez Gelman Sciences. Les anticorps monoclonaux murins anti-Pt, anti-Pk, anti- P, et les érythrocytes provenant d'individus du groupe sanguin P / Pl proviennent de I'Institut National de la Transfusion Sanguine (Paris, France). 2) Culture des cellules d'insectes et préparation des homogénats cellulaires Le clone Spodoptera frugiperda Sf-9 issu de la lignée cellulaire IPLB-Sf- 21-AE (Vaughn et al., 1977) provient de l'ATCC (CRL 1711) et le clone Trichoplusia ni Tn-5-B14 provient de l'ATCC (CRL 10.859). Le clone Mamestra brassicae SPCMb-92-C6 a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. Les trois lignées cellulaires ont été adaptées, maintenues et cultivées à 28 C dans le milieu de culture EX-CELL 401 (Sera-Lab, UK). Le milieu EX- CELL 401 permet de cultiver les lignées cellulaires d'insectes en absence totale de sérum. Les cellules ont été récoltées à confluence et les homogénats cellulaires ont été obtenus après lyse des cellules à 0 C dans un tampon cacodylate de sodium mM pH 6,5 contenant 1 % de Triton X-100, 20 % de glycérol, 0.5 mM de dithiotréitol et 5 mM de MnCI2 (1 ml pour 3 x 107 cellules). Après 10 minutes d'incubation sous agitation, les homogénats cellulaires sont centrifugés 10,000 g pendant 15 minutes. Les protéines contenues dans ces surnageants seront séparées sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). La mesure de la concentration en protéines dans chaque homogénat cellulaire (surnageant après centrifugation) a été réalisée par la méthode décrite par Peterson (1977) en utilisant l'albumine bovine sérique pour réaliser la gamme étalon. 2780413 3) Electrophorèse el Western blot La séparation par SDS-PAGE des protéines contenus dans les homogénats cellulaires a été réalisée en conditions réductrices et en utilisant un gel formé d'un gradient de 4 % à 20 % de polyacrylamide. Pour chaque homogénat cellulaire 40 /g de protéines sont déposés par puits. Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (blot) comme décrit par Vaessen et al. (1981). Les dépôts ayant été réalisés en double, le blot est coupé en deux moitiés identiques. Les deux parties sont tout d'abord mis en présence de polyvinylpyrolidone (2 % in TBS) puis incubées avec la BSI-B4 couplée à la peroxydase (2 /g / ml in TBS contenant 1 mM MgCI2, 1 mM MnCI2, i mM CaC12) avec ou sans la présence de sucre compétiteur 0.5 M acMe-Gal. Après lavage, les glycoprotéines reconnues par la lectine ont été mises en évidence en utilisant le protocole de Sigma Fast staining qui utilise du DAB et de l'Urée / H202 4) Préparation des microsomes et mesure des activités enzymatiques 2 x 108 cellules de la lignée Mb cultivées dans le milieu EX-CELL 401 ont été remises en suspension dans 10 ml de 0.25 M sucrose / 0.2 M NaCI à 0 C puis lysées par ultrasonication, 5 impulsions en maintenant la température égale à 0 C. Pour obtenir des microsomes, le lysat cellulaire a été centrifugé à basse vitesse 13.000g pendant 10 minutes à 4 C, puis le surnageant a subi une ultracentrifugation à 120.000g pendant 1 heure à 4 C. Après avoir éliminé le surnageant, le culot de microsomes a été remis en suspension dans du 0.25 M sucrose / 0.2 M NaCI et conservé à -80 C. Tous les essais ont été réalisés au moins en double. L'incorporation de [6-3H]-Gal a été déterminée après soustraction de la radioactivité mesurée en absence d'accepteur exogène. Pour chaque activité mesurée, le résultat représente la valeur moyenne des différents essais exprimée en nmol de résidus de Gal transférés par mg de protéines et par heure. Les conditions finales de chaque essai étaient les suivantes: un volume final de 50 îl; fraction microsomale (35 /g de protéines); tampon MES 0, 125 M pH 7,0; 0,15 % de Triton X-100; 5 mM de y-galactonolactone; 10 mM d'ATP; 12,5 mM de MnC12; 1 mM d'UDP-[6-3H]-Gal (235 MBq / mmol; 11, 75 kBq / 50,u); suivant le type d'accepteur utilisé 4 mM d'oligosaccharide ou d'aryl-glycoside, 1 mM de ganglioside, ou 2 mg / ml de glycoprotéine. Enfin, chaque essai était incubé 1 heure à 37 C. 16 2780413 Afin de séparer le donneur radioactif (UDP-[3H]-Gal) du produit formé plusieurs méthodes ont été utilisées en fonction du type de substrat accepteur utilisé. Pour les accepteurs de type oligosaccharidique, les réactions ont été stoppées par addition de 0,5 ml d'H20 et les produits ayant incorporés le [3H]-Gal ont été recueillis après chromatographie échangeuse d'ions sur une colonne de 1 ml de Dowex 1x2 ( forme-CF, 100-200 mesh) équilibrée en eau. La mesure de la radioactivité des produits formés a été effectuée par comptage à scintillation (Vandamme et al., 1992). Dans le cas de l'utilisation de glycoprotéines comme accepteurs, les réactions ont été stoppées par addition de 1 ml d'acide phosphotungstique glacial (5 % dans HCI 2 M). Les précipités formés ont été retenus sur des filtres en fibre de verre, lavés successivement avec une solution à 5 % d'acide trichloroacétique, de l'eau distillée et de l'éthanol. Les filtres pouvaient alors subir un comptage à scintillation (Vandamme et al., 1992). Dans le cas de l'utilisation d'aryl-glycoside et de glycolipides comme accepteurs, les réactions ont été stoppées par addition de 1 ml d'éthanol. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 3,000 g pendant 5 minutes, puis les surnageants ont été déposés sur des colonnes Sep-Pak C18. Après lavage par 5 ml d'eau, les aryl-glycosides ont été élues par 5 ml d'une solution aqueuse contenant 30 % d'acétonitrile. Quant aux glycolipides, après lavage avec 5 ml d'eau puis addition de 2 ml de méthanol, les élutions étaient réalisées par 5 ml de chloroforme / méthanol (1/1, vol./vol.). Enfin, comme précédemment la mesure de la radioactivité était effectuée par comptage à scintillation (Vandamme et al., 1992). La durée des réactions enzymatiques étant limitée à 1 heure, nous avons considéré que les réactions étaient linéaires (vitesse initiale constante). Pour la détermination des paramètres cinétiques (KM et VMax), les incubations ont été réalisées pendant 1 heure en présence de concentrations variables (0.125 - 4 mM) des accepteurs Gal11-3GalNAccul-O-bn et Gal31-3GlcNAc31-O-octyl. 5) Préparation d'une importante quantité du produit obtenu après transfert de Gal sur l'accepteur Gal1l-3GalNAccl-O-bn Les conditions de la réaction ont été semblables à celles décrites précédemment. Toutefois, les modifications ont été les suivantes: un volume final de 600 fll; fraction microsomale (850 gg de protéines); 4 mM d'UDP-[6-3H]-Gal (62 MBq / mmol; 0,148 MBq / 600 p.l); 4 mM de Gal31-3GalNAccl-O-bn. Le mélange réactionnel a été incubé pendant 24 h à 37 C. Puis, le mélange réactionnel a été déposé sur Sep-Pak C18, l'élution a été réalisée comme décrit précédemment, puis le produit formé (en mélange avec l'accepteur restant) a été 17 2780413 lyophilisé. Des aliquotes (5gtl) du mélange réactionnel ont été prélevés tout au long de l'incubation à 0, 2, 4, 8, et 24 heures et la mesure de la radioactivité transférée a été effectuée. Le pourcentage de transfert après 24 heures d'incubation était de 66 % (ce qui correspond à environ 970 pg de produit galactosylé formé). Le produit purifié a été ensuite analysé par RMN et MS. Pour réaliser les étude d'immunoréactivité, 4 mg du produit galactosylé avec 90 % de pureté, ont été produits. Cette seconde préparation en grande quantité a été réalisée comme décrit précédemment, dans un volume final de 1,85 ml (1,4 mg de protéines provenant des microsomes de Mb) et une incubation à 37 C pendant 48 heures. 6) Analyse par RMN bi-dimentionnelle homonucléaire et hétéronucléaire L'analyse par spectroscopie RMN-1H a été réalisée sur un spectromètre Br ker ASX 400WB transformé de Fourrier et contrôlée par un ordinateur Aspect 3000. Les déplacements chimiques (6) ont été mesurés par rapport à la référence interne en l'occurrence les protons de l'acétone à È = 2.225 ppm dans le D20 à 25 C. Le spectre COSY avec un ou deux relais et le spectre HMQC ont été réalisés en utilisant les séquences d'impulsions standard de Br ker. 7) Spectrométrie de Masse à Désorption Laser (MALD-MS pour Matrix- Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry) et Chromatographie en phase Gazeuse couplée à un Spectromètre de Masse (GC-MS pour Gas Chromatography-Mass Spectrometry) /ug du produit galactosylé ont été perméthylés suivant Ciucanu et Kerek (1984) puis analysés par MALD-MS. Ensuite, les composés méthyles ont été méthanolysés et les méthyl-glycosides formés ont été identifiés par GC-MS après peracétylation comme décrit par Fournet et al. (1981). Le poids moléculaire du produit galactosylé et perméthylé a été mesuré par MALD-MS sur un appareil à temps de vol Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Germany) équipé d'un laser à azote de longueur d'onde d'émission 337 nm. Les spectres sont mesurés en mode positif avec une énergie d'accélération de 6 keV. Les échantillons ont été préparés en mélangeant, directement sur la cible, 1/l1 de la solution à analyser (environ 50 pmol) avec 1ld d'une solution de matrice (12 mg / ml d'acide 2,5-dihydroxybenzoïque dissous dans un mélange méthanol / eau, 70:30) puis la cristallisation s'est déroulée à température ambiante. Une calibration externe a été réalisée avec l'angiotensine I standard (PM: 1296.7). 10 accumulations ont été nécessaires pour obtenir le spectre de masse. 18 2780413 La séparation en GC des méthyl-monosaccharides partiellement méthylés et acétylés, issus du produit de la réaction enzymatique, a été réalisée sur une colonne capillaire de silice provenant de SGE (0.32 nun x 25 m). L'hélium a été utilisé comme gaz vecteur à une pression de 0,5 bar et une programmation de température (110-240 C et 3 C / minute). L'analyse par GC-MS a été effectuée sur un chromatographe en phase gazeuse (Delsi DI 700) couplée à un spectromètre de masse de type quadripôle (Nermag R10-10, Rueil Malmaison, France). L'ionisation par impact électronique utilise une énergie d'ionisation de eV et un courant d'ionisation de 0,2 mA. 8) Libération des O-glycannes de l'asialo-fétuine après que cette asialo- glycoprotéine ait servi d'accepteur de [6-3Hi-Gal 1,25 mg d'asialofétuine (concentration finale: 5 mg / ml) ont été incubés pendant 24 heures à 37 C, dans des conditions identiques à celles décrites précédemment, une fraction microsomale de Mb (210 lig de protéines) et 0, 5 mM d'UDP-[6-3H]-Gal (0,57 GBq / mmol; 74 kBq / gl). Après incubation, la glycoprotéine est séparée de l'excès d'UDP-[6-3H]-Gal par tamisage moléculaire sur une colonne de Bio-Gel P2 (200-400 mesh) équilibrée avec 0,1 M d'acétate de pyridine pH 5,6. Ensuite, L'asialo-fétuine marquée[3H] a été placée dans un milieu alcalin et réducteur contenant 0,1 M de NaOH avec 1 M de NaBH4 pendant 48 heures à 45 C (Spiro and Bhoyroo,1974). Par la suite l'échantillon est amené à pH 6 par addition d'une résine échangeuse d'ions Dowex 50 x 8 (forme-H+, 20-50 mesh) puis évaporé. La glycoprotéine est alors remise en suspension dans du méthanol et évaporée (3 fois). L'échantillon est ensuite remis en suspension dans de l'eau et déposé sur une colonne Bio-Gel P4 (80 x 1, 2 cm, 200-400 mesh) équilibrée avec une solution d'acétate de pyridine à 0,1 M pH 5,6. Cette étape permet de séparer par tamisage moléculaire les O-glycannes libérés et les N-glycopeptides. 9) Immunoréactivité du produitformé Galcu-4Gal31-3GalNAco-O-bn Les anticorps monoclonaux murins anti-PI, anti-Pk, anti-P et la lectine BSIB4 ont été testés en plaques de Takatski sur des hématies humaines papainées de phénotypes Pl, pkl, Pk2 et p (Tja--témoin négatif). Les conditions finales choisies pour réaliser les tests d'hémagglutination sont les suivantes: des suspensions d'hématies à 0,7 % en NaCl 150 mM, un tampon PBS pH 6,8, durée de mise en contact 7 minutes à une température de 37 C. Pour les essais avec la BSI-B4 on ajoute 0,1 mM de CaCI2 et 0,1 mM de MnCl2. Cette analyse avait pour but de contrôler la spécificité des réactifs et de titrer le système 19 2780413 agglutinant afin de déterminer pour chaque anticorps monoclonal la dilution maximale permettant d'obtenir une agglutination. Chaque anticorps monoclonal Pl, pkl, Pk2 o la lectine a été amené à la dilution appropriée est mis en contact avec des concentrations décroissantes de l'aryl-glycoside Galcl -4Gal f31-3GalNAccc1- O-bn ou Gal13-3GalNAcca1-O-bn (témoin négatif) pendant 4 heures à 22 C avant d'être mélangé avec les hématies papaïnées pour réaliser les tests d'inhibition des hémagglutination. Il) Résultats 1) Fixation de la BSI-B4 sur les glycoprotéines de Mb /g de protéines provenant des homogénats cellulaires de Sf-9, Mb et Tn cultivés dans le milieu EX-CELL 401 ont été séparés par SDS-PAGE et mise en présence de la BSI-B4 couplée à la peroxydase. Les trois lignées cellulaires possèdent des glycoprotéines reconnues par la BSI-B4. La fixation de la lectine est spécifique car en présence de 0.5 M du sucre compétiteur ccMe-Gal on n'observe plus de fixation de la BSI-B4. Chaque lignée cellulaire a un profil de révélation par la BSI-B4 qui lui est propre. Il apparaît que la fixation la plus importante de la BSI-B4 est observé sur des glycoprotéines de la lignée Mb. C'est une bande comprise entre 100-110 kDa qui est la plus fortement révélée par la BSI-B4 dans la lignée Mb et son intensité de coloration est même supérieure à celle des bandes révélées dans les lignées S/-9 et Tn. Dans la lignée Sf-9, la BSI-B4 révèle une large bande comprise entre 95 et 105 kDa, avec deux signaux plus faibles à 85 et 190 kDa. La BSI-B4 se fixe sur des glycoprotéines de la lignée Tn dont le poids moléculaire est compris entre 95 et 120 kDa, le signal le plus important étant observé entre 100-110 kDa. La BSI- B4 reconnaissant spécifiquement les séquences Galcl-3/4Gal (Hayes et al., 1974; Murphy et al., 1977; Wu et al., 1995), ces résultats indiquent que les trois lignées cellulaires Sf-9, Mb et Tn possèdent des glycoprotéines endogènes de haut poids moléculaires substituées par des glycannes qui portent des résidus ct-Gal en position terminale non réductrice. Ces oligosaccharides a-Galactosylés sont les témoins de la présence d'activités a-galactosyltransférasiques dans les trois lignées de lépidoptères. La fixation de la BSI-B4 étant la plus importante sur les glycoprotéines de la lignée Mb, l'activité ca- galactosyltransférasique dans cette lignée cellulaire d'insecte, a été étudiée. 2780413 2) Mb transfert preéférenliellement du Gal en position terminale sur Ica séquence Galp1l-3GalNAc. Afin de caractériser une éventuelle activité o-galactosyltransférasique chez Mb, des microsomes de Mb ont été incubés avec différents accepteurs potentiels dont le point commun était de posséder un résidu de Gal en position terminale non réductrice. Les résultats de ces expériences sont présentés dans le Tableau I. Il apparaît qu'il existe une activité galactosyltransférasique dans la fraction microsomale de Mb qui transfert préférentiellement des résidus de Gal sur les accepteurs GalJ31-3GalNAccd-O-bn, Gal31-3GalNAc, et même sur le substrat synthétique Galpl-3-(2-O-Ac)-Gal31-O-Me. La fraction microsomale de Mb a aussi la capacité de transférer des résidus de Gal sur la N-acétyl- isolactosamine (Gal31-3GlcNAc) ou GalJ31-3GlcNAc31-O-octyl, mais les pourcentages de transfert sont plus faibles (respectivement 36,9 % et 39, 9 %) que celui obtenu avec Gal31-3GalNAcOl-O-bn. Comme nous l'indique le Tableau I, le transfert de résidus de Gal sur la N-acétyllactosamine (Gal13l-4GlcNAc) ou le lacto-N- néotétraose (Gal31-4GlcNAc13l-3Galp31-4Glc) est respectivement 2,7 et 1, 5 fois plus faible que celui mesuré avec la N-acétyl-néolactosamine (Gal131-3GIcNAc) ou le lacto-N-tétraose (Gal31-3GlcNAc31-3Gal31-4Glc). Cela démontre que l'ca- galactosyltransférase de Mb catalyse préférentiellement le transfert de résidus de Gal sur des substrats accepteurs de type Gal13l-3-R que de type Galp1l-4R. * Remarquons, que le transfert de résidus de Gal sur le lactose (Gal314Glc) est très faible. De plus, le Gal, l'c- et le 3- aryl-glycosides de Gal ne sont pas des substrats accepteurs de l'activité enzymatique étudiée. Ces résultats démontrent que la spécificité de substrat de l'o-galactosyltransférase présente chez Mb est totalement différente de l'UDP-Gal: Galpl-4GlcNAc c 1,3-galactosyltransférase précédemment purifiée et clonée dans différentes sources (Blanken and Van den Eijnden, 1985; Joziasse et al., 1989; Joziasse et al., 1992). 21 2780413 Tableau I. Détermination de la spécificité de substrat de l'activité UDPGal: Gal31-3GalNAc (xl,4-galactosyltransférase de Marmestra brassicae vis-à-vis d'accepteurs oligosaccharidiques. Les résultats sont exprimés en valeur relative par rapport à l'incorporation de residus de Gal sur l'accepteur Gal13l-3GalNAcctl-O-bn pris comme reférence. Substrata Activité relative (%) Gal13 -3GalNAccl-O-bnb 100.0 (103.3)c Gal31- 3GalNAc 84,7 Galpl-3(2-O-Ac)GalIl-O- Me 78.3 Galp1-3GIcNAc31-O-octyl 39.9 Gal3-3GIcNAc 36.9 Gall-4Glc 15.2 Gal31-3GIcNAcp1- 3Gal1-4Glc 13.7 Galpl1-4GIcNAc 13.5 Gal31 -4GIcNAc31 -3Gal 1 -4Glc 9.3 Gal31-pNp 3.4 Gal 2.6 Galcd-pNp 1.6 Galkxl-O-Me 0.2 a Les substrats ont été utilisés à une concentration finale de 4 mM. bAc, acétyl; bn, benzyl; pNp, p-nitrophénol c L'activité (nmol.h-1.mg1) de la galactosyltransférase est indiquée entre parenthèses. Deux familles de glycannes porteurs respectivement en position terminale non réductrice du disaccharides Gal31-3GalNAc ou Gal[31-3GlcNAc semblent être toutes deux des substrats accepteurs de activité c-galactosyltransférasique de Mb. Nous avons déterminé les paramètres cinétiques du transfert des résidus de Gal sur les substrats accepteurs Gal31-3GalNAccz-1-O-bn et Gal[313GlcNAc13l-O-octyl en utilisant comme source d'enzyme la fraction microsomale de Mb. Les résultats présentés dans le Tableau II montrent que la valeur du KM obtenue avec Gal13l-3GalNAcat-1-O-bn est 13- fois inférieure à celle mesurée avec Gal1-3GlcNAc31-O-octyl. De plus, l'activité relative VMaX/KM est égale à 20 gl.mg-'.hl avec Gal13l3GlcNAc31-O-octyl et à 330 izl.mg'.hl avec Gal,31-3GalNAcca-1-O-bn, ce qui prouve incontestablement 22 2780413 que le disaccharide Gali3l-3GalNAc est le meilleur substrat accepteur de l'activité c-galactosyltransférase de Mb. Tableau Il. Comparaison des paramètres cinétiques de l'activité UDP-Gal: Galpl-3GalNAc ul,4-galactosyltransférase de la lignée Mamestra brassicae vis-à-vis des séquences Gal31- 3GalNAc et Gal31 -3GIcNAc. Substrat KM VMax VMa KM (mM) (nmol.mg-1.h'1) (pl.mg'l.h-1) Gall3l:3GalNAccd-O-bnb 0.3 99.1 330 Gall1-3GlcNAc[1-O-octyl 3.3 66.7 20 a activité relative. b Ac, acétyl; bn, benzyl; pNp, p-nitrophénol. 3) Le résidu de Gal est lié en ac,4- à l'extrémité non réductrice du disaccharide Gal31-3GalNAc Afin de déterminer précisément la liaison (anomérie et substitution) du Gal transféré sur GalI1-3GalNAc par l'activité a-galactosyltransférase de Mb, le produit galactosylé issu du transfert de Gal sur le substrat accepteur Gal31-3GalNAccL-1-O- bn (composé A) a été analysé par RMN (Tableau III). Un spectre RMN réalisé avec l'accepteur Gal13l-3GalNAc -1-O-bn (composé A) a permis de déterminer l'ensemble les signaux caractéristiques du composé A et particulièrement ceux provenant de l'unité 3-Gal en position terminale, 6 = 4.454 ppm (H-1), 8 = 3.620 ppm (H-3) et 8 = 3.900 ppm (H-4). Les signaux correspondant au composé A sont retrouvés sur le spectre RMN obtenu avec le produit de la réaction enzymatique en association avec de nouvelles résonances provenant du composé néosynthétisé (composé B). Le rapport obtenu après intégration des signaux provenant du résidu en position terminale P3-GalII A (SH-1 = 4. 454 ppm) et du résidu substitué [-Gall, B (6H-1 = 4.521 ppm) est égale à 3:7, ce ratio correspond à un transfert de Gal supérieur à 70 %. La valeur de la résonance du proton anomérique du résidu de Gal transféré 6 = 4.949 ppm (J12 - 3H z) est caractéristique de la forme-c du Gal. La conformation-a est confirmée par la valeur des constantes de couplages vicinales JHI,H2, JH2,H3 et JH3,H4. Le déplacement vers des champs plus faibles qui affect o232780413 les résonances du résidu 3- Gall, B H-3 (6 = + 0.072 ppm) et H-4 (6 = + 0.125 ppm) plaide en faveur d'une substitution 0-4 de ce résidu. Cette interprétation a été confirmée lors de l'examen du spectre HMQC, qui montre clairement deux résonances du C-4 à 6 = 70.20 ppm (c-Gali, B terminal) et, 6 - 78.47 ppmn (03-Galil B substitué sur 0-4). Tableau III. Déplacements chimiques du 1H et du 13C mesurés avec Galf3l1-3GalNAcca-1-O-bn (composé A) et Galal -4Galp1 -3GalNAcc-1 -O-bn (composé B). unité mono- Déplacement chimique (ppm) saccharidique H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 H-6' N/Ac Gal,1-3 IIA 4.454 3.508 3.620 3.900 3.75 3.87 3.82 GalNAcadIA 4.965 4.293 4.040 4.256 4.056 3.74 3.74 1.964 Gaxlo-4 IliB 4.949 3.825 3.909 4.025 4.341 3.69 3.69 Gal,1-3 IIB 4.521 3.546 3.692 4.025 3.75 3.87 3.82 GaINAcc1- IB 4.965 4.325 4.068 4.216 4.056 3.74 3.74 1.966 unité mono- Déplacement chimique (ppm) saccharidique C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 NAc Gal131-3 IIA 106.63 70.33 72.19 70.17 76.26 62.7 GalNAcad- IA 97.40 48.7 78.22 70.18 72.21 63.04 23.4 Galcd-4 IIIB 101.26 69.17 70. 58 70.20 72.19 61.25 Galp1-3 "iB 106.94 70.60 73.63 78.47 76. 26 62.7 GaiNAcal- lB 97.40 48.7 78.21 70.18 72.21 63.04 23.4 Sur la base de ces observations, la structure du composé néosynthétisé a été établie: Galxl-4Gal31-3GalNAcc-1-O-bn (composé B). Les résultats obtenus par RMN ont été confirmés par MS. Le spectre MALD-MS du produit de la réaction enzymatique après perméthylation montre uniquement deux molécules porteuses d'un ion Na+ ou K+. La masse du premier ion pseudomoléculaire correspond à la masse attendue de l'accepteur perméthylé Galp13l-3GalNAccc-1-O-bn ([M+Na]+= 594.4 m/z ou [M+K]+= 610.7 m/z / composé). La masse du second ion pseudomoléculaire correspond à 24 2780413 la masse théorique du composé B perméthylé ([M+Na]+= 798.9 m/z et [M +K]+ = 814.7 m/z). L'intégration des signaux permet de déterminer le rapport des intensités 20:80 entre le composés A et B. De plus, les méthyl-galactosides acétylés identifiés par GC-MS, le méthyl-2,3,6-tri-O-méthyl-4-mono-O-acétyl- galactopyrannoside et le méthyl-2,3,6-tri-O-méthyl-5-mono-O-acétyl- galactofurannoside confirment que le résidu de Gal transféré est lié par une liaison-1,4 sur le résidu Gal terminal de l'accepteur (Tableau IV) Tableau IV. Analyse par CG-MS des oligosaccharides perméthylés, méthanolysés et peracétylés provenant du matériel obtenu après transfert de Gal sur l'accepteur Galp13l-3GalNAcct-1-O-bn. composé A: Galpl- 3GalNAca-1-O-bn (accepteur); composé B: Galcl-4Gal31-3GalNAcc-1- O-bn (produit formé). Origine Monosaccharide méthyl-éther Ratioa Composé A Composé B (accepteur) (produit formé) (2, 3, 4, 6)-Me4-Galb 2.6 + + (2, 3, 6)-Me3 -4-Acl-Gal 1. 0 + (2, 3, 6)-Me3 -5-Ac1-Galc 0.9 + (4,6)-Me2-GalN(Me)Ac 1.9 + + a (2, 3, 6)-Me3 -4-Acl-Gal est utilisé comme base 1,0. b Ac, acétyl; Me, méthyl. c Cette forme furannique provient de la libération par méthanolyse du (2, 3, 6)-Me3 -Gal. Il s'établit alors un équilibre entre les structures a/b pyranne et a/b furanne du (2, 3, 6)-Me3-Gal. Après acétylation, la forme pyrannique est à l'origine du (2, 3, 6)-Me3 -4-Acl- Gal et la forme furannique est à l'origine du (2, 3, 6)-Me3-5-Acl-Gal. 4) Action de l'UDP-Gal: Galpl-3GalNAc al,4-galactosyltransférase sur les glycolipides et une asialo-glycoprotéine Afin de déterminer précisément la spécificité de substrat de l'activité ctl,4- Gal-T de Mb, des incubations ont été réalisées en utilisant comme substrat 2780413 accepteur une asialo-glycoprotéine et plusieurs glycolipides. Comme indiqué dans le Tableau V, il apparaît que les glycolipides et l'asialoglycoprotine semblenrt être de pauvres substrats accepteurs pour l'activité enzymatique étudiée et ceci malgré le fait que la plus part des accepteurs choisis (asialo-fétuin, GAI, GMl;,, et GDI.) portent une ou plusieurs séquences terminales GalgI1-3GalNAc. Comme prévu, parmi les cinq glycolipides testés le GMIa et le GAI sont tous deux des accepteurs de l'ccl,4-Gal-T de Mb. Un faible transfert a été aussi observé sur le lactosylcéramide ce qui peut être relié au transfert obtenu avec le lactose (Tableau I). Enfin, aucun transfert de Gal n'a été observé sur le GM2 puisque la fraction glycannique de ce glycolipide porte en position terminale non réductrice un résidu de GalNAc. Tableau V. Détermination de la spécificité de substrat de l'activité UDPGal: Gali1-3GalNAc cl,4-galactosyltransférase de la lignée Mamestra brassicae vis-à-vis une asialo-glycoprotéine et des glycolipides utilisés comme accepteurs. Les résultats sont exprimés en valeur relative par rapport à l'incorporation de résidus de Gal sur l'accepteur Gal1- 3GalNAccl-O-bn pris comme référence. Substrata [GaliI-3GalNAc-R] Activité relative séquences terminales (%) (mM) Gal131-3GalNAco1- O-bn 1.0 100.0 (77.3)b Asialo-fétuine 0.13 8. 1 Glycolipides GA1 1.0 8. 7 GMla 1.0 8. 3 GDlb 1.0 2.2 Lactosylcéramide 0.0 2.0 GM2 0.0 1. 4 a Les substrats ont été utilisés à une concentration finale de 2 mg / ml pour l'asialo-fétuine, ou 1 mM pour les glycolipides. b L'activité (nmol.h-'.mg1) de la galactosyltransférase est indiquée entre parenthèses. c Dans l'essai avec asialo-fétuine la [Gal31l-4GIcNAc-R] - 0.4 mM. 26 2780413 Il est surprenant de constater que le glycolipide GDi,, qui porte la séquence terminale GalI3l-3GalNAc est un très mauvais substrat accepteur. Cela est probablement dû à un encombrement stérique entre l'enzyme (l,4GaI-T et les deux résidus d'acide sialique liés en ca2,8 présents sur la fraction oligosaccharidique de ce glycolipide (Tableau I). Comme indiqué sur le Tableau V, la concentration finale utilisée lors des incubations avec les glycolipides était de lmM, en revanche avec l'asialo-fétuine la concentration était fixée à 2 mg/ml ce qui correspond à une concentration finale de la séquence termirale Gal3l1- 3GalNAc égale à 0,1 M. Malgré le fait que la concentration de la séquence terminale Galp1-3GalNAc était 10 fois inférieure lors des incubations réalisées avec l'asialo-glycoprotéine, le transfert obtenue avec l'asialo-fétuine est équivalent à ceux mesurés avec les glycolipides GM1a et GAI. Par conséquent, l'activité cxl,4-Gal-T de Mb agit préférentiellement sur le disaccharide Gal3l-3GalNAc lié par une liaison O-glycosidique à la chaîne peptidique (aglycone), plutôt que sur ce même disaccharide porté par un glycosphingolipide. ) Discrimination entre le [6-3H]-Gal porté respectivement par les O- et les N-glycannes de l'asialo-fétuine après que cette asialo-glycoprotéine ait été utilisée comme accepteur L'asialo-fétuine (Mr: 45,500 kDa) est substituée par trois N-glycarnnes tri- antennés de type N-acétyllactosaminique porteurs à leurs extrémités du disaccharide Gal3l-4GlcNAc et trois chaînes O- glycanniques Gal13l-3GalNAccl-O-Ser/Thr (Nilsson et al., 1979). Par conséquent, le mélange réactionnel contenant 5 mg/ml d'asialo- fétuine permet d'atteindre une concentration en résidus de Gal en position terminale égale à environ 206 jM pour la séquence Gal[1-3GlcNAc- R et à environ 618 gM pour la séquence Gal31-4GlcNAc-R. Après 24 heures d'incubation à 37 C, 36,2 % des résidus terminaux de Gal ont été substitués par du [3H]-Gal. Afin de discriminer entre le [3H]-Gal transféré respectivement sur les N- et les O-glycannes de l'asialo- fétuine, une 3-élimination réductrice a été réalisée et les O-glycannes libérés ont été séparés des N-glycopeptides par fractionnement sur une colonne Bio-Gel P4 préalablement calibrée. Le suivi de la radioactivité à la sortie de la colonne permet d'obtenir un profil de chromatographie sur lequel on distingue deux principaux pics situés respectivement aux volumes d'élution des N-glycopeptides et des O-glycannes de l'asialo-fétuine. Cette expérience confirme que l'activité al,4-Gal-T présente dans la fraction microsomale de Mb catalyse le transfert de Gal sur les asialo- 27 2780413 glycoprotéines possédant sur leur fractions glycanniques des résidus de Gal en position terminale. On peut constater que le transfert de [3H]- Gal s'effectue principalement sur les O-glycannes (74,7 % de la radioactivité transférée sur l'asialo-fétuine) plutôt que sur les N- glycannes (25,3 % de la radioactivité transférée sur l'asialo- fétuine). De plus, ce résultat montre que 65,5 % des séquences terminales Gal31-3GalNAc ont été substituées par un résidu de Gal, alors que seulement 7,9 % des séquences Gal3l-4GlcNAc ont été substituées. 6) Immunoréactivité du produitformé Galcc l-4GalJ1-3GalNA co-O-bn Les hématies du groupe P sont classées en cinq phénotypes Pl, P2, Pkl, Pk2 et p, en fonction de la présence ou de l'absence à leur surface de trois antigènes: I antigène P (GalNAcp31 -3Galc -4Gal[ 1-4Glc3 1- Cer), l'antigène pk (Gal il-4Gal31-4Glc3l1-Cer) et l'antigène P1 (Galc l-4Gal[ 1-4GlcNAc 3l-3Gal[31-4Glc[l-Cer). Les hématies P1 expriment les antigènes P et Pl; les hématies pk1 expriment les antigènes pk et Pl; les hématies Pk2 expriment uniquement l'antigène pk; alors que les hématies p n'expriment aucun antigènes du groupe P (les érythrocytes p seront utilisés comme témoin négatifs). Au cours de cette étude, la concentration minimale de l'aryl-glycoside Galol- 4Gal31-3GalNAccl-O-bn, qui entraîne une inhibition de l'hémagglutination des érythrocytes du groupe P, a été déterminé, et ceci pour chaque couple érythocyte-anticorps capable d'interagir (Tableau VI). Ces mêmes expériences ont été réalisées avec l'aryl- glycoside Gall-3GalNAccfl-O-bn et dans ce cas aucun phénomène d'inhibition n'a été observé. L'aryl-glycoside Galccl-4Gal3-3GalNAccd-Obn (concentration minimale 0,4 mM) s'est avéré capable d'inhiber l'agglutination des cellules Pkt et Pk2 (qui expriment l'antigène pk) causée par l'anticorps monoclonal anti-Pk. Cependant, les agglutinations des érythrocytes Pl causées par les anticorps anti-P ou anti-P1 ne sont pas inhibées par le produit formé Gal1l4Gal31-3GalNAccl-O-bn. Signalons, que l'aryl- glycoside Galxl-4Gal31-3GalNAccl-O-bn (concentration minimale 0,08 mM) est capable d'inhiber les hémagglutinations induites par la BSI-B4. 28 2780413 Tableau Vl. Inhibition de l'agglutination des hématies humaines du groupe P par l'aryl-glycoside Galc1-4Gal13-3GalNAcu-O-bn. Concentration minimale de l'aryl-glycoside entraînant l'inhibition de l'agglutination des hématies humaines papaïnées induite par des anticorps monoclonaux ou la BSI-B4. Anticorps monoclonal érythrocytes humains du groupe P ou Lectine P1 pk Pk2 Anti-Pi nta > 6.5 nt Anti-Pk nt 0.4 0.4 Anti-P > 6. 5 nt nt BSI-B4 0.08 0.08 nt ant: non testé. III) Conclusion Ce travail démontre pour la première fois la présence d'une activité UDP-Gal: Gali31-3GalNAc ccl,4- galactosyltransférase dans la lignée cellulaire de lépidoptère Mb. De plus, plusieurs approches ont été mises en oeuvre afin de démontrer l'existence de cette activité glycosyltransférasique originale. Après séparation par SDS-PAGE des protéines présentes dans les homogénats cellulaires des lignées d'insectes Sf-9, Mb et Tn, on observe par Western blot que la lectine BSI-B4 reconnaît spécifiquement des glycoprotéines endogènes au sein des trois lignées cellulaires de lépidoptères. Bien que le profil de fixation de la BSI-B4 soit spécifique pour chaque lignée, dans les trois clones cellulaires les glycoprotéines révélées ont un poids moléculaire apparent élevé majoritairement compris entre 90 et 120 kDa. La plus intense révélation est observée pour une bande de 100-110 kDa dans la lignée Mb. La spécificité de liaison de la BSI-B4 étant connue (Hayes et al., 1974; Murphy et al., 1977; Wu et al., 1995), ces résultats montrent que les trois lignées de lépidoptères étudiée possèdent des glycoprotéines endogènes substituées par des oligosaccharides porteurs à leurs extrémité non réductrice de la séquence Galcl-3/4Gal. Cette première observation a été le prétexte à la recherche d'une activité cx-galactosyltransférasique dans la lignée Mb. Afin de mettre en évidence l'activité glycosyltansférasique responsable chez Mb de la biosynthèse de 29 2780413 séquence terminale ac-Gal, nous avons incubé la fraction microsomaie de Mb avec de I'UDP-Gal et différents substrats accepteurs qui possédaient tous un résidu de Gal en position terminale non réductrice. Le choix des substrats accepteurs a été réalisé en fonction de la spécificité de la BSI-B4 et en fonction de la spécificité de substrat des différentes ca-galactosyltransférases caractérisées à ce jour qui catalysent toutes le transfert d'un résidu de Gal pour aboutir au disaccharide terminal Galal-3Gal (Blanken and Van den Eijnden, 1985; Joziasse et ai., 1989; Joziasse et al., 1992) ou Galacl-4Gal (Taniguchi et al., 1985; Bailly et al., 1992; Stults et al., 1995). Les différents substrats oligosaccharidiques, ont permis de mettre en évidence que l'a- galactosyltransférase de Mb agit préférentiellement sur des accepteurs de type Gal3 1-3-R (Table I) et parmi tous les glycannes accepteur, la mesure de l activité de substrat relative VMax / KM prouve que le disaccharide Gal3l-3GalNAc est le meilleur accepteur (Tableau II). Afin de déterminer la liaison (anomérie et substitution) entre le résidu de Gal transféré et l'accepteur, nous avons préparé une importante quantité du produit galactosylé en utilisant comme accepteur l'aryl-glycoside Galp3l- 3GalNAcal-O-bn et comme source d'enzyme la fraction microsomale de Mb. L'analyse par RMN et MS du produit formé a permis d'établir que l'activité a- galactosyltransférase de Mb synthétise le produit: Galal-4Gal1-3GalNAca1- O-bn. Il est remarquable qu'un seul produit galactosylé a été identifié sans qu'aucun signal correspondant à une nouvelle liaison 3 ou à des substitutions autres que celle du C-4 du Gal accepteur n'ait pu être mise en évidence au cours des analyses par RMN ou MS. On peut donc conclure que les microsomes de Mb renferment essentiellement ou exclusivement une activité a- galactosyltransférasique qui catalyse l'ajout de résidus de Gal par une liaison cai,4 sur les séquences terminales GalI31-3GalNAc. Le disaccharide terminal Gal13l-3GalNAc est habituellement retrouvé sur les sites de O-glycosylation de nombreuses asialo-glycoprotéines, ainsi que sur des glycolipides tels que le GA^, le GMIa ou le GDIb. Il est démontré que l'acl,4- GaI-T de Mb agit préférentiellement sur les glycoprotéines plutôt que sur les glycolipides. Ce résultat est en accord avec l'observation concernant la fixation de la BSI-B4 sur les glycoprotéines endogènes de la lignée Mb. Par la suite, il a été démontré que cette nouvelle activité catalyse préférentiellement le transfert de résidus de Gal sur les O-glycannes Gal13l-3GalNAcal-O-Ser/Thr plutôt que sur les disaccharides GalJ31-4GIcNAc présents en position terminale non réductrice des N-glycannes de l'asialo-fétuine. 2780413 La source d'enzyme utilisée étant la fraction microsomale de la lignée Mb, on ne peut pas exclure la présence ('autres galactosyltranstférases utilisant l'UDP-Gal comme substrat dolnneur. Toutefois, seule l'activité core-1 f1, 3- galactosyltranstférasique (UDP-Gal: GalNAcc l-O-Ser/Thr f1,3-galactosyl transférase) a été caractérisée dans les lignée cellulaires de lépidoptères (Thomsen et al., 1990) et l'activité [31,4galactosyltransférasique (UDP-Gal: GIcNAc J31,4-galactosyltransférase) qui catalyse l'addition de Gal sur les structures N-glycanniques n'a jamais été mise en évidence dans les cellules d'insectes. De plus, ces deux enzymes n'utilisent pas comme substrat accepteur des oligosaccharides porteur à leur extrémité non réductrice d'un résidu de Gal. Par conséquent, il est peut probable que des galactosyltransférases ait pu interférer dans les essais visant à caractériser cc- galactosyltransférase de Mb et ceci malgré la présence dans les microsomes de Mb de nombreuses glycosyltransférases. Le disaccharide Galal-4Gal a été recherché dans différents tissus animaux et humains (Taniguchi et al., 1985; Bailly et al., 1992; Stults et al., 1995). Ces études ont montré que seuls des glycolipides étaient porteurs du disaccharide Galxl-4Gal tels que, le galabiosylcéramide (Galctl- 4Gal13-Cer) ou les antigènes du groupe sanguin P (Yang et al., 1994). Le groupe sanguin P est constitué de trois antigènes qui possèdent le disaccharide Galcl-4Gal: l'antigène pk (Galal-4Gal31-4Glcpl-Cer); l'antigène P (GalNAc13l-3Gallcd- 4Gal1 -4Glc31 -Cer) et l'antigène P1 (Galcl-4Galp 1 -4GlcNAc 1-3Gal 131- 4Glc3l-Cer) (Bailly et al., 1992). L'activité cal,4-Gal-T caractérisée dans la lignée Mb est original car elle catalyse la synthèse de l'épitope Galal-4Gal lié en 31,3 sur un résidu de GalNAc et agit préférentiellement sur les glycoprotéines plutôt que sur les glycolipides. L'importante activité cl,4-Gal-T présente dans Mb a permis de synthétiser plusieurs milligrammes de l'aryl-glycoside Galc l-4Gal31- 3GalNAcal -O-bn et ainsi d'initier des expériences visant à trouver des applications au trisaccharide Galc1l-4Gal1l-3GalNAc. De plus, cet aryl-glycoside s'est avéré capable d'inhiber l'agglutination des hématies pk et Pk2 causée par les anticorps anti-Pk, spécifiques du glycosylcéramide Galcil-4Gal 1i-4Glcf31-Cer. Comme l'agglutination des érythrocytes Pl par l'anticorps anti-PI, spécifique du glycosylcéramide Galcc -4Gal 1 -4GlcNAc3 1 -3Gal[ 1 -4Glc3 1 -Cer, n'est pas inhibée par ce nouvel aryl-glycoside, on peut en conclure qu'il existe une inhibition spécifique de l'antigène pk, mais pas de réaction croisée avec l'antigène Pl. Ces résultats confirment des observations antérieures qui indiquent que les anticorps anti-Pk ont une spécificité relativement large vis-à-vis du disaccharide Gala l.-4Gal, alors que la spécificité des anticorps anti-P! 's'. plus stricte et met en évidence le rôle critique de la N-acétylglucosam. ine dans le trisaccharide terminal du glycosylcéramide P1 (Galeol-4Gal314G1cNPAc[SI5.- 3Galz!-4Glc[l-Cer) (Watkins et Morgan, 1976; Cowles et Blumberg, 1986 Bailly et al., 1987). De plus, l'aryl-glycoside Gal(l-4Gal[313GaiNAcoE.-O-bn est capable d'inhiber les agglutinations des hématies P1 et pk1 provoquées par la BSI-B4 (Tableau VI). Cette dernière information est a rapprocher de l'observation princeps, c'est à dire la fixation spécifique de la BSI-B34 sur les glycoprotéines endogènes de la lignée Mb, et plaide en faveur de la présence du trisaccharide Galucl- 4Gal[1-3GalNAc sur les glycoprotéines endogènes de la lignée Mb. Il faut signaler que de nombreuses études ont montré que le galabiosylcéramide, ainsi que les antigènes P1 et pk étaient présents sur les tissus humains et animaux (particulièrement chez le porc) (Holgersson et al., 1990; Lundblad et ai, 1980; Bock et ai, 1985; Lanne et ai, 1996). De plus, le disaccharide GalOE1-4Gal présent sur les glycolipides est responsable de la fixation de bactéries pathogènes, de toxines bactériennes et de virus à la surface de tissus humains et animaux. Le trisaccharide Galal-4Gal[1-3GalNAc, libre ou conjugué, peut inhiber l'adhésion sur les tissus hôtes des bactéries pathogènes, telles que: les souches d'Escherichia coli uréophatogènes (Bock et ai, 1985); les souches d'Escherichia coli exprimant les G-adhésines (Pap G) sur leurs P-fimbriae (Strômberg et al., 1990) et les souches de Streptococcus suis qui sont responsables de méningites chez le porc et l'homme (Haataja et ai, 1993 et 1994). Le trisaccharide Galoul-4Gal[31-3GalNAc peut aussi empêcher l'adhésion de toxines bactériennes, telles que: la Vero toxine d'Escherichia coli qui peut contaminer les viandes bovines et ovines et provoquer des diarrhées hémorragiques et des insuffisances rénales aiguës chez les consommateurs (Lingwood et ai, 1987; Yiu et Lingwood, 1992); la Shiga toxine de Shigella dysenteriae (Lindberg et al., 1987); l'enterotoxine-B de Staphylococcus qui est responsable de diarrhées potentiellement létales pour l'homme (Chatterjee et ai, 1995). De plus, l'activité octl,4-GT de Mb peut être utilisée pour la synthèse d'oligosaccharides renfermant le disaccharide Galal-4Gal. Ainsi, des glycannes porteurs d'une antigénicité de type P peuvent être utilisés pour lutter contre les infections provoquées par le Parvovirus B19 puisque celui-ci reconnaît l'antigène P. Ce virus est responsable d'anémies chez l'homme qui peuvent entraîner la mort de foetus (Brown et al., 1993). En conclusion, cette étude a permis d'identifier et de caractériser une nouvelle activité cal,4-Gal-T dans la lignée Mb responsable de la présence de 32 2780413 l'épitope disaccharidique Gal11-4Gal sur les O-glycoprotéines endogn'cs dec Mb. Cette nouvelle glycosyltransférase caractérisée chez les insectes représentent une source d'enzyme pour la biosynthèse d'épitopes oligosaccharidiques utilisables en thérapie. Références Altmann, F. and Mârz, L. (1995) Processing of asparaginelinked oligosaccharides in insect cells: evidence for có-mannrosidase II. 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Utilisation d'enzymes à activité ca-galactosyltransférase provenant de cellules d'insectes, pour la mise en oeuvre d'un procédé enzymatique de préparation de composés c.-galactosylés, ledit procédé comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé. 2. Utilisation selon la revendicationl, d'enzymes à activité al,4- galactosyltransférase, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de composés cl,4-galactosylés, ledit procédé comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose, par l'intermédiaire d'une liaison-alcd,4, sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, de manière à obtenir un produit comportant un disaccharide Galod-4Gal, en position terminale non réductrice. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les cellules d'insectes sont des cellules de lépidoptères, notamment des espèces - Spodoptera, tel que Spodopterafrugiperda, - Mamestra, tel que Mamestra brassicae, - Trichoplusia, tel que Trichoplusia ni. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les cellules d'insectes sont des cellules de Mamestra, tel que Mamestra brassicae, notamment des cellules de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. 5. Cellules de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. 6. Extrait cellulaire à activité cx-galactosyltransférase, notamment cxl,4-galactosyltransférase, tel qu'obtenu à partir de cellules d'insectes, notamment à partir de cellules de lépidoptères telles que définies dans la revendication 3 ou 4. 7. Procédé enzymatique de préparation de composés ca-galactosylés, comprenant une étape de transfert d'un résidu de galactose sur un résidu 42 2780413 terminal de galactose d'un substrat déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - la réaction d'UDP-Gal avec ledit substrat en présence d'une enzyme à activité cE-galactosyltransférase telle qu'obtenue à partir de cellules d'insectes, telles que celles définies dans la revendication 3 ou 4, - le cas échéant la purification du produit obtenu lors de la réaction précédente. 8. Procédé enzymatique selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence de cellules d'insectes exprimant l'enzyme à activité oc- galactosyltransférase nécessaire à ladite réaction, ou en présence d'un extrait cellulaire selon la revendication 6. 9. Procédé de préparation de cl,4-galactosylés, par transfert d'un résidu de galactose, par l'intermédiaire d'une liaison (x1,4, sur un résidu terminal de galactose d'un substrat déterminé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: - la réaction d'UDP-Gal avec ledit substrat en présence d'une enzyme à activité cO1,4- galactosyltransférase telle qu'obtenue à partir de cellules d'insectes, pour obtenir un composé cEl,4-galactosylé, comprenant le disaccharide Galol-4Gal en position terminale non réductrice, - le cas échéant la purification dudit produit ainsi obtenu. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la réaction d'UDP-Gal avec le substrat est effectuée en présence de cellules d'insectes, telles que celles définies dans la revendication 3 ou 4, productrices de l'enzyme à activité acl,4-galactosyltransférase nécessaire à ladite réaction, ou en présence d'un extrait cellulaire selon la revendication 6. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que les cellules d'insectes utilisées sont des cellules de Mamestra, tel que Mamestra brassicae, et plus particulièrement des cellules de la lignée cellulaire de Mamestra brassicae déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro- organismes de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-2045, le 26 juin 1998. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que * le substrat est un composé de formule Gal3 1-nOX-R 43 2780413 dans laquelle - no correspoid. 'a position, sur le résidu X défini ciaprès, du carbone porteur de l'hydroxyie ur leq;Jel s'effectue la liaison avec le résidu terminal de 3-D-galactopyranese dudit substrat (représenté par Gall31 dans la formule ci- dessus), et représente!, 2, 3, 4, ou 6; de préférence no représente 3 ou 4, et - X représente un, oside, notamment un résidu de galactose, ou de glucose, ou de N-acétyl-D-galaztosamine ou de 2-O-acétyl-Dgalactopyranose, R- représente un atome d'hydrogène, un monosaccharide ou un oligosaccharide, un oside ou oligoside porteur à leur extrémité réductrice d'un aglycone tel que défini ci-dessous, un aglycone, tel qu'un groupe benzyle ou phényle, substitué ou non, notamment un groupe paranitrophényle, ou un groupe alkyle de I à 10 atomes de carbone, notamment un groupe --(CH2)m-CH3 dans lequel m représente 0 ou un nombre entier de 1 à 7, une glycoprotéine, notamment une glycoprotéine substituée par des O-glycannes, telle que l'asialo-fétuine, un acide aminé, un peptide, une protéine, ou une néoglycoprotéine, notamment l'albumine sérique bovine chimiquement couplée à un oligoside, un glycolipide, notamment le lactosylcéramide de formule GalpIl- 4Glc31-Cer, le GM3 de formule NeuAcoe2-3Gal13-4Glc[1-Cer, le GD3 de formule NeuAcoc2-8NeuAccE2-3Gal131-4Glc[ 1-Cer, un lipide, un céramide, 25. un support multivalent non immunogène, notamment un dérivé de polyacrylamide, ou une polylysine, dont les fonctions amines des chaînes latérales sont substituées par des groupes de formule Gal1l-noX- dans laquelle no et X sont tels que définis ci-dessus, * le produit obtenu est un composé de formule (I) suivante GalOcl-nGall31-noX- R (I) dans laquelle: - no X et R sont tels que définis ci- dessus, et n correspond à la position de l'atome de carbone, du résidu de galactose terminal dudit substrat, porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu de galactose transféré. 13. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi les composés suivants Gal3 1 -3GalNAc, 44 2780413 Gall 1-3GalNAc i -O-bn, GaI3 i-3(2-O-Ac))Gal 1--O-Me, Gal3 i-3GlcNAc 1. O-octyl, Gall 1-3GlcNAc, GalplI-4Glc, Gal [1-3GicNAc3 1-3Gall31- 4Glc, Gal 1-4GlcNAc, Gal 1-i-4GlcNAc3 1-3Galp3 I -4Glc, Gal 13 - 3GalNAc13 1-4Gal13 1-4Glc13 1-Cer, Gal3 1-3GalNAc3 1- 4(NeuAcc2-3)Gal 13 -4Glc3 1-Cer, Gal[3 -3GalNAcp 1 -4(NeuAcoc2-8NeuAcc2- 3)Gal[3 1-4Glc 13 -Cer, Gal3 1-3GalNAccz1-O-Ser/Thr. 14. Composés de formule (I) suivante Galoi 1-nGal 1 -noX-R (I) dans laquelle: - no correspond à la position, sur le résidu X défini ci-après, du carbone porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu terminal de -D-galactopyranose dudit substrat (représenté par Gal31 dans la formule ci- dessus), et représente 1, 2, 3, 4, ou 6; de préférence no représente 3 ou 4, et - n correspond à la position de l'atome de carbone, du résidu de galactose terminal dudit substrat, à savoir du résidu de 13-Dgalactopyranose susmentionné, porteur de l'hydroxyle sur lequel s'effectue la liaison avec le résidu de galactose transféré (représenté par Galcul dans la formule ci-dessus), - X représente un oside, notamment un résidu de galactose, ou de glucose, ou de N-acétyl-D- galactosamine ou de 2-O-acétyl-D-galactopyranose, - R représente un atome d'hydrogène, un monosaccharide ou un oligosaccharide, un oside ou oligoside porteur à leur extrémité réductrice d'un aglycone tel que défini ci-dessous, un aglycone, tel qu'un groupe benzyle ou phényle, substitué ou non, notamment un groupe paranitrophényle, ou un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe -(CH2)m-CH3 dans lequel m représente 0 ou un nombre entier de 1 à 7, une glycoprotéine, notamment une glycoprotéine substituée par des O-glycannes, telle que l'asialo-fétuine, 2780413 un acide aminé, un peptide, une proiéine, ou une nréoglycoprotéine, notamment l'albumine sérique bovine chimiquement couplée à un oligoside, un glycolipide, notamment le lactosylcéraminide de formule Galp31- 4Glc31-Cer, le GM3 de formule NeuAca2-3GCal1i-4GlcM!-Cer, le GD3 de formule NeuAcac2-8NeuAccL2-3Gal 1-4.GIc3 1-Cer, un lipide, un céramide, un support multivalent non immunogëne, notamment un dérivé de polyacrylamide, ou une polylysine, dont les fonctions amines des chaines latérales sont substituées par des groupes de formule Gal3l-noX- dans laquelle no et X sont tels que définis ci-dessus. 15. Composés selon la revendication 14 de formules suivantes Gala 1-4Gal 1-3GalNAc, Gala i -4Gal31 -3GalNAca 1-O-bn, Galal-4Gal313(2-O-Ac)Gall1-O-Me, Gala 1-4Gal3 1-3GlcNAc 31-O-octyl, Galal 1-4Gal3 13GlcNAc, Gallc1-4Gal3 1-4Glc, Galc 1 -4Gal 1-3GlcNAc 1-3Gal3 1 -4Glc, Gala 1-4GalI 1-4GlcNAc, Gala 1-4Gal 1 -4GlcNAc31 -3Gal31 -4Glc, Galoc 1-4Gal3 1-3GalNAcp 1-4Gal3 1-4Glc[3 1 -Cer, Gala 1-4Gal 1- 3GalNAc3 1-4(NeuAca2-3)Gal[3 1-4Glc3 1 -Cer, Gala 1 -4Gal3 1-3GalNAc3 14(NeuAca2-8NeuAca2-3)Gal3 1 -4Glc3 1 -Cer, Galac1-4Gal[31-3GalNAcac1-O-Ser/Thr. 16. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé selon la revendication 14 ou 15, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et le cas échéant, en association avec un ou plusieurs antibiotiques. 17. Compositions alimentaires, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé selon la revendication 14 ou 15.