Brevet FR2776926A1 — publié le 19991008

La présente invention concerne des lipopeptides inducteurs de cytotoxicité T lymphocytaire et comprenant au moins un épitope T auxiliaire. Elle est en outre relative à l'utilisation de ces lipopeptides comme vaccin. II existe deux types de réponses immunitaires: la réponse humorale due aux anticorps, et la réponse cytotoxique due aux lymphocytes T CD8+ Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), en association avec les molécules de classe I du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (MHC), mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ (HTL) en association avec les molécules de classe Il du MHC. L'utilisation de lipopeptides pour l'induction d'une réponse cytotoxique, c'est-à-dire la génération in vivo de lymphocytes T cytotoxiques a déjà été décrite. En particulier, la demande FR-90 15 870 (publication 2.670 787.) (Institut Pasteur de Lille, Institut Pasteur, INSERM) décrit des lipopeptides constitués d'une partie peptidique comprenant de 10 à 40 acides aminés et d'une partie lipidique qui peut être dérivée d'acides gras ou de groupements stéroïdes. Ces lipopeptides montrent une bonne aptitude à induire une réponse cytotoxique. II convenait cependant de les rendre capables d'induire également une réponse T auxiliaire, dont on sait l'importance pour l'induction et le maintien de la réponse cytotoxique. A la connaissance des demandeurs, seul un article au nom de VITIELLO et al. (1995, J. Clin. Invest.,95, 341-349) a évoqué la possibilité de combiner sur une même molécule lipopeptidique un épitope CTL et un épitope induisant une réponse auxiliaire (épitope T-HELPER ou HTL). La synthèse de deux lipopeptides est décrite dans cet article. Le premier est constitué de la partie 18-27 du core du virus de l'hépatite B, en tant qu'épitope CTL, de la partie 830-843 de la toxine tétanique, comme épitope T auxiliaire, et de deux chaînes palmitoyles. Les auteurs observent l'induction d'une cytotoxicité T-lymphocytaire. Le second lipopeptide est constitué de l'épitope NP 147-155 du virus influenza murin, d'un épitope T auxiliaire et de chaînes lipidiques. Néanmoins, les lipopeptides décrits dans cet article présentent une faible solubilité, due à la présence d'une part de la partie lipidique, et d'autre part de motifs peptidiques hydrophobes. On notera à ce sujet que les produits décrits par ces auteurs sont stockés en solutions mères dans du DMSO concentré, et dilués extemporanément pour l'injection dans une solution aqueuse tamponnée. Cette forte hydrophobicité rend difficile la fabrication de solutions de ces lipopeptides, et de ce fait limite considérablement les possibilités de stérilisation par filtration, qui est la méthode généralement utilisée en raison de sa facilité de mise en oeuvre. Elle limite en outre fortement toute possibilité de caractérisation. Le problème à résoudre consistait donc à réduire 'hydrophobicité des lipopeptides multi-épitopes tout en maintenant l'accessibilité à l'apprêtement nécessaire à l'acheminement du motif épitope CTL vers le CMH de classe I. La présente invention a pour objet de résoudre ce problème. Les inventeurs ont maintenant trouvé qu'il était possible non seulement d'augmenter l'hydrophilie des molécules lipopeptidiques, mais aussi de limiter des interactions entre les différents épitopes, en introduisant des séquences hydrophiles d'acides aminés, appelées espaceurs, au sein de ces molécules. La présente invention a donc pour objet des lipopeptides comprenant au moins un épitope T auxiliaire, au moins un épitope CTL et au moins un résidu lipidique caractérisés en ce que les épitopes et la partie lipidique d'une part, et les épitopes d'autre part, sont séparés indépendamment par des séquences d'acides aminés, appelées espaceurs, comprenant des enchaînements d'acides aminés globalement chargés en milieu neutre, assurant l'hydrophilie du lipopeptide. De manière préférentielle, les espaceurs sont accessibles à un apprêtement protéolytique par le protéasome, préalable à la libération du motif épitope CTL. Cette accessibilité peut être mise en évidence comme décrit par OSSENDORP et al. (1996, Immunity, 5, 115-124). De manière préférentielle les espaceurs comprennent entre 1 et 10, préférentiellement entre 2 et 4 acides aminés, le nombre d'acides aminés étant suffisant pour obtenir des espaceurs globalement chargés en milieu neutre. Préférentiellement, au moins un des espaceurs comprend des arginines et/ou des glycines. Les arginines présentent l'avantage d'être chargées aux pH physiologiques, et de créer des sites de sensibilité particulière au clivage protéolytique lors de l'apprêtement des épitopes. Les glycines présentent l'avantage de permettre l'introduction, au sein de la partie peptidique du lipopeptide, d'un site éventuel pour une synthèse convergente par couplage de fragment. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux de l'invention, au moins un des espaceurs présente l'une des séquences suivantes: GLY ARG ou ARG GLY ARG. L'acide glutamique et/ou l'acide aspartique présentent également d'intéressantes propriétés applicables à la réalisation d'espaceurs selon la présente invention (accès à la dégradation protéolytique naturelle, et introduction de fonctions carboxylates ionisées en milieu physiologique à pH neutre). Ces acides aminés, rentrant dans la séquence des espaceurs, peuvent avantageusement être remplacés par leurs dérivés, ou par d'autres acides aminés fonctionnellement équivalents. Ces acides aminés peuvent, au sein des espaceurs, être séparés par des acides aminés peu encombrés d'un point de vue chimique, c'est-àdire présentant des chaînes latérales courtes, qui peuvent être, outre la glycine, I'alanine. La présence de ces acides aminés à chaîne courte facilite la protéolyse. Une cystéine, ou une chaîne alkyle fonctionnalisée par un groupe thiol, capable de ménager un site possible de ligation chimique simple entre deux fragments peptidiques grâce à la formation de liaisons covalentes non peptidiques peut aussi être introduite dans l'espaceur. Il est ainsi possible de réaliser une liaison disulfure entre deux peptides différents, comportant chacun une fonction thiol, ou une liaison thioéther, auquel cas l'un des deux peptides doit être fonctionnalisé par un halogénure d'alkyle. Les deux peptides peuvent aussi être liés par formation d'un hétérocycle thiazolidine l'un des peptides amenant une fonction aldéhyde. Cette fonction aldéhyde peut être facilement et sélectivement générée sous forme d'un groupement alpha-oxo acyle, obtenu par oxydation périodique d'une sérine, d'une thréonine, ou d'une cysteine introduite en position N-terminale d'un fragment peptidique II est aussi possible d'associer les deux peptides en utilisant la réactivité des aldéhydes avec des bases faibles, ou des méthodes de ligation via la formation d'une oxime (par réaction entre une fonction aldéhyde et une fonction amino-oxyacétyle), d'une hydrazone (par réaction entre une fonction aldéhyde et une hydrazide ou une aryl-hydrazine). Ces réactions de base sont rappelées dans la revue de James Tam et Jane Spetzler.(Biomed. Pep., Prot. and NucleicAcids (1995),1, 123-132). Une méthode de ligation consistant à générer une liaison hydrazone à partir d'une alkyl-hydrazine (générée par N-amination d'un précurseur amine) et d'un partenaire fonctionnalisé par un groupement alpha-oxo acyle a été récemment développée. Les hydrazinopeptides sont synthétisés par N-amination selon Klinguer et al. (Tet. Lett. (1996), 37, 7259-7262). Cette méthodologie permet de transformer n'importe quelle fonction amine du peptide en fonction hydrazine. La fonction hydrazine peut ainsi être située en position N-terminale, ou sur la chaîne latérale d'un acide aminé situé à n'importe quel endroit de la séquence. La fonction amine transformée peut être une fonction amine alpha, epsilon d'une lysine ou de l'acide aminocaproïque, une fonction delta amino d'une ornithine, ou toute autre fonction amine primaire ou secondaire. Les peptides aldéhydes sont générés comme décrits par Tam et Spetzler ( Biomed. Pep., Prot. and Nucleic Acids (1995), 1, 123-132). Les résidus sérine, thréonine ou cystéine précurseurs du groupement alpha oxo acyle peuvent être situés en position N-terminale, ou sur toute fonction amine d'une chaîne latérale à partir du moment ou ces résidus ne sont pas présents en position N-terminale dans les épitopes considérés. Le groupement lipidique peut être porté indifféremment par l'hydrazinopeptide ou le peptide aldéhyde. On entend, pour la compréhension de la présente invention, par épitope T auxiliaire, une séquence d'acides aminés capable de s'associer à au moins un récepteur HLA de classe Il. On entend par épitope CTL une séquence d'acides aminés capable de s'associer à au moins un récepteur HLA de classe Les épitopes T auxiliaires capables de s'associer à plusieurs récepteurs HLA de classe Il différents sont appelés épitopes auxiliaires multivalents (HTL multivalents). Les lipopeptides selon la présente invention comprennent préférentiellement l'enchaînement de: - une partie lipidique; - un premier espaceur; - un épitope T auxiliaire; - un second espaceur; et - un épitope CTL. Ils peuvent aussi comprendre - une partie lipidique; - un premier espaceur; - un épitope T auxiliaire; - un second espaceur; - un épitope CTL; - un troisième espaceur; et - un second épitope CTL. Les divers épitopes auxiliaires et CTL peuvent être présents dans des ordres différents dans l'enchaînement d'acides aminés. Ainsi, un épitope auxiliaire peut être compris entre deux épitopes CTL, desquels il sera séparé par deux espaceurs. La partie lipidique du lipopeptide est avantageusement obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction alpha aminée d'un peptide ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique , telle qu'une fonction epsilon amine ou thiol. Elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C10 à C20, éventuellement ramifiées ou insaturées ou un dérivé d'un stéroïde. De manière avantageuse, la partie lipidique comprend au moins deux chaînes dérivées d'acides gras ou d'alcools gras en C10 à C20 liées aussi entre elles par l'intermédiaire d'un ou plusieurs acides aminés. La partie lipidique peut ainsi être constituée de deux chaînes d'acide palmitique liées aux groupements NH2 alpha et epsilon, d'une lysine. La partie lipidique peut aussi être constituée de, ou comprendre, un résidu d'acide palmitique, d'acide oléique, d'acide linoléique, d'acide linolénique, d'acide 2-amino hexadécanoïque, de pimélautide ou de triméxautide. La partie non lipidique comprend quant à elle entre 15 et 100, et préférentiellement entre 15 et 50 acides aminés. Le nombre d'acides aminés dépend du nombre d'épitopes constituant la partie non lipidique du lipopeptide, et de leurs tailles. De manière avantageuse, 'épitope T auxiliaire est un épitope capable de s'associer à plusieurs récepteurs HLA de classe Il différents, c'est-à-dire un épitope multivalent. II est préférentiellement l'épitope auxiliaire constitué par le peptide 830-843 de la toxine tétanique présentant la séquence suivante: QYIKANSKFIGITE La glutamine (Q) de cette séquence peut éventuellement être acétylée. D'autres épitopes HTL multivalents peuvent être l'épitope multivalent de l'hémagglutinine (PREVOST-BLONDEL et al. 1995, J. Virol., vol.62, ne12, pages 8046-8055) ou encore lépitope PADRE (ALEXANDER et al., 1994, Immunity, 1, 751). L'épitope CTL peut quant à lui être tout épitope capable d'activer des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. II est préférentiellement un épitope CTL d'une protéine présentée par une cellule tumorale et en particulier par un mélanome, d'une protéine du VIH, du virus de l'hépatite B (VHB) ou du papillomavirus, ou encore de la protéine p53. II peut être en particulier l'un des épitopes suivants: - épitopes de la protéine BCR-ABL, résultant de la translocation BCR- Abelson (leucémie myéloïde chronique) tels que mentionnés dans le tableau 1. - épitopes de la protéine p53, tels que ceux mentionnés dans le tableau 2. Les épitopes de la protéine p53 peuvent en outre être pris dans les séquences 25-35, 63-73, 129-156, 149-156, 187-205, 187-234, 226-264, ou 249-264 de cette protéine. - épitopes des protéines E6 ou E7 du papillomavirus humain (VPH), tels que ceux mentionnés dans le tableau 3. - épitopes de protéines du virus VIH-1 tels que ceux mentionnés dans le tableau 4, - épitopes du mélanome ou d'autres tumeurs, tels que ceux mentionnés dans les tableaux 5, 6 et 7 et en particulier épitopes de l'antigène melan-A/mart-1 du mélanome. D'autres épitopes CTL plurivalents présentant une capacité d'association avec des HLA de classe I peuvent être ceux compris dans le peptide 43-57 de HPV (GQAEPDRAHNIVTF) qui contient des épitopes HLAA2,A24, B7 et B18. Les épitopes CTL peuvent encore être ceux d'antigènes parasitaires, et en particulier ceux d'une protéine du stade intrahépatocytaire de Plasmodium falciparum. La liaison entre la partie lipidique et la partie non lipidique est préférentiellement effectuée par l'intermédiaire du groupement -NH2 du premier acide aminé de la partie non lipidique. Elle peut néanmoins être effectuée par tout autre moyen , et en particulier par le groupement a-NH2 d'une lysine. Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être administrés aux patients à traiter, en particulier aux personnes à vacciner, dilués dans un solvant adéquat, tel que par exemple un tampon physiologiquement acceptable. Ils peuvent néanmoins être mis sous une forme galénique compatible avec une administration par voie parentérale, sublinguale, intrapulmonaire ou transdermique. Ils peuvent être administrés par tout mode d'administration permettant une action efficace. Ce mode sera choisi en fonction de la maladie à traiter. A titre non limitatif, les lipopeptides peuvent en particulier être administrés par injection ou par voie sublinguale. Un autre objet de la présente invention est donc l'utilisation de ces lipopeptides pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin, préventif ou curatif, pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique, et en particulier, pour l'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre de cancers tels que le mélanome, des virus VIH et VHB, des papillomavirus, de la p53 ou de la malaria. La présente invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmacologiquement active d'un ou plusieurs des lipopeptides décrits cidessus, ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles. On notera enfin que les épitopes CTL décrits dans la présente demande constituent en eux-mêmes des objets de la présente invention. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. La figure 1 illustre la reconnaissance des lipopeptides monopalmitoyle et dipalmitoyle selon l'invention, comprenant l'épitope Mart 27-35, par une lignée de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dudit épitope dans un test Elispot-interféron gamma (IFN-y). Les figures 2A et 2B illustrent la reconnaissance des lipopeptides mentionnés pour la figure 1, par deux clones de lymphocytes infiltrants de mélanomes, respectivement LT8 et LT12, spécifiques de l'épitope Mart 2735. La figure 3 représente la formule d'un lipopeptide comprenant une liaison hydrazone. Exemple I Synthèse de lipopeptides dipaîmitovlés avec et sans espacer, et propriétés physico-chimiques 1. Synthèses des lipopeptides La série des trois lipopeptides suivants a été synthétisée. Lipopeptide NO 1 Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-AAA-AAGIGILTV Lipopeptide n02 Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAG IG I LTV Lipopeptide n03 Pam-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV Ces lipopeptides comprennent une extrémité lipidique constituée de deux résidus palmitoyl (Pam) liés au groupement NH2 d'une lysine, I'épitope auxiliaire de la toxine tétanique (peptide 830-843) et un épitope CTL reconnu dans mart-1 par le récepteur HLA A2.1. L'épitope Hbc 18-27 décrit par VITIELLO et al. (cité supra) est aussi reconnu par HLA A2.1, et présente une hydrophobicité similaire au motif choisi dans la série de lipopeptides précitée. La différence réside dans les séquences d'acides aminés comprises d'une part entre la partie lipidique et l'épitope auxiliaire et d'autre part, entre 'épitope auxiliaire et l'épitope CTL. Cette série a été réalisée pour évaluer la possibilité d'obtenir sous forme purifiée et caractérisable des produits définis par référence au produit selon VITIELLO et comportant comme celui-ci deux chaînes palmitoyles: les deux espaceurs de VITIELLO sont reproduits ou modifiés pour l'un ou les deux espaceurs selon la présente invention. Dans le lipopeptide n" 1, ces séquences sont identiques à celles du lipopeptide décrit par VITIELLO et aI.. Deux sérines sont insérées entre la partie lipidique et l'épitope auxiliaire. Trois alanines sont quant à elles placées entre l'épitope auxiliaire et l'épitope CTL. Le lipopeptide n"2 comprend les séquences SS ( séryl-séryl) et ARG -GLY-ARG. Le lipopeptide n" 3 est construit selon la présente invention, et comprend des espaceurs hydrophiles présentant respectivement les séquences GLY-ARG et ARG-GLY-ARG. La synthèse a été réalisée selon des procédures standards utilisées en phase solide selon la stratégie Boc-benzyle décrite par Merrifield ( 1963 J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; 1986 Science 232, 341-347). L'introduction en position N-terminale d'une di-Boc Lysine permet, après déprotection de la peptidyl résine, I'introduction simultanée des deux chaînes palmitoyle, pour obtenir le dérivé attendu. 2. Purification et propriétés physico-chimiques des lipopeptides. Le lipopeptide n" 1 est pratiquement insoluble dans l'eau, ou dans un mélange DMSO/eau 10% VN. II s'avère non purifiable, non caractérisable par HPLC selon des méthodes résolutives, en raison de la formation d'agrégats. L'identité de ce lipopeptide a pu être confirmée par mesure de la masse par spectrométrie PDMS-TOF, réalisée sur le produit brut, immédiatement après le clivage terminal par l'acide fluorhydrique et avant lyophilisation. Le produit devient totalement insoluble dans l'eau après lyophilisation. La mesure de la masse par spectrométrie PDMS-TOF du lipopeptide n"2 est possible, et confirme que le produit attendu a bien été obtenu. Cependant, ce produit adopte dans l'eau un comportement voisin du lipopeptide n 1, et ne peut donc être correctement analysé. Le lipopeptide n" 3 est soluble dans l'acide acétique à 80%. Il peut être stérilisable par filtration sur un microfiltre de 0,22 um. II peut être en outre dissous dans une solution DMSO/eau 10% VN. La mesure de la masse par spectrométrie PDMS-TOF confirme la présence du produit attendu. Le produit s'avère purifiable après injection d'une solution concentrée dans le DMSO, sur colonne Vydac C4, à 60"C, en utilisant un gradient d'acétonitrile, en présence du contre-ion TFA. Le produit est caractérisable par HPLC selon plusieurs méthodes résolutives conventionnelles, sur colonnes Vydac C4, Zorbax C3, Zorbax CN, Zorbax Cl, à 60"C, à l'aide de gradients d'acétonitrile en présence d'un contre-ion TFA, ou en utilisant un modificateur organique, tel que l'isopropanol ou le butanol en isocratique. Le trifluoroacétate du lipopeptide n"3 est soluble dans le DMSO (2025 mg/mL), et reste soluble après dilution par de l'eau (DMSO 10%). L'échange du contre-ion trifluoroacétate pour un contre-ion acétate peut être réalisé par RP-HPLC sur une colonne C4: le produit dissous dans le DMSO à 80% est injecté sur la colonne équilibrée par le solvant A (acide acétique à 5% dans l'eau). Après élimination des produits non retenus (contre-ions TFA, sels), le produit est élué par l'aide d'un gradient du solvant A vers le solvant B (acétonitrile 80% - acide acétique à 5% - eau 15%). L'acétate présente une solubilité comparable à celle du trifluoroacétate. II a été utilisé pour immuniser des souris transgéniques exprimant HLA-A2, et s'est avéré capable d'induire une réponse CTL satisfaisante en l'absence d'adjuvant d'immunisation. Ces résultats montrent donc que l'insertion d'espaceur hydrophile entre la partie lipidique et l'épitope auxiliaire d'une part, et d'autre part entre l'épitope auxiliaire et l'épitope CTL permet de solubiliser le lipopeptide, ce qui n'est pas le cas quand les séquences d'acides aminés sont différentes. EXEMPLE 2: Svnthèse de lipopeptides monopalmitovîés selon l'invention, et propriétés physico-chimiques: Une deuxième série de lipopeptides a été réalisée pour évaluer la possibilité d'obtenir sous forme purifiée et caractérisable des produits comportant cette fois-ci une seule chaîne palmitoyle; I'espaceur central employé est introduit selon la présente invention (-RGR- pour arginylglycyl-arginyl-), tandis que l'espaceur -SS-(seryl-seryl-) de VITIELLO est maintenu ou remplacé pour l'un ou les deux espaceurs selon la présente invention. L'introduction en position N-terminale d'une alpha-Fmoc, epsilon Boc Lysine permet, après déprotection sélective du groupe Boc, I'introduction d'une seule chaîne palmitoyle, pour obtenir le produit suivant: Lipopeptide n04: H-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV Ce produit s'avère difficilement purifiable. II n'est soluble en milieu aqueux qu'en présence de DMSO. Un profil chromatographique peut être obtenu par RP-HPLC uniquement sur une colonne de type Cl en utilisant un système solvant standard (acétonitrile/eaulacide trifluoroacétique), selon une méthode peu résolutive, qui ne permet pas de garantir la réelle pureté du produit. Le lipopeptide n"5 suivant, a été synthétisé. Lipopeptide n05: H-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR- AAGIGILTV Ce produit a été obtenu comme le lipopeptide n"4 par acylation sélective de la fonction epsilon NH2 de la lysine N-terminale. Ce lipopeptide n"5 satisfait au critère de purification et de caractérisation classiques. Cette comparaison entre les lipopeptides n"4 et n"5, qui sont des lipopeptides monopalmitoyles, confirme les résultats obtenus sur les lipopeptides dipalmitoyles. Les lipopeptides 3 et 5 ont été les seuls à répondre aux critères définis (accès à une méthode de purification et à des critères analytiques résolutifs). Leur étude a été poursuivie par l'étude de leur reconnaissance par divers types cellulaires. Les résultats de cette étude figurent dans l'exemple 3. Exemple 3. Activité biologique de lipopeptides dipalmitoyle et monopalmitoyle selon l'invention contenant un épitope CTL mélanome Le lipopeptide dipalmitoyle n"3 et le lipopeptide monopalmitoyle n"5 synthétisés comme indiqué respectivement dans les exemples 1 et 2 ont été testés. 10) Etude de la reconnaissance des lipopeptides mono- et dipalm-Mart 27-35 par une lignée de lymphocytes T cytotoxiques humains spécifiques de MART 27-35 dans un test Eleis out Interféron-v (lFN-y). a) Matériels et méthodes: La lignée L28.3 de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de MART 27-35 a été obtenue à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) de donneur sain HLA-A2+ Le protocole d'induction de ces cellules effectrices à partir de PBMC de donneur naïf a été décrit par Ostankovitch et al. (Int. J. Cancer, 1997, 72, 987-994). Méthode du test Elispot: Dans ce test les cellules cibles sont des PBMC autologues non stimulées (naïfs). 50 ,ul/puits d'anticorps murin anti-I FNy humain dilué dans du tampon PBS à une concentration de 4 uglml sont incubés dans des plaques de 96 puits à fond de nitrocellulose pendant la nuit à 4"C en chambre humide. Les PBMC sont décongelées, maintenues au repos durant 2 heures dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum humain AB (SAB) à 37 C dans une atmosphère, contenant 5% de CO2. Elles sont ensuite incubées durant une nuit avec les peptides à tester à différentes concentrations (10, 5 et 1 ug/ml). Les puits sont lavés avec du PBS puis saturés avec du milieu RPMI contenant 10% de SAB, pendant 2 heures à 37"C. Les cellules effectrices sont ensuite distribuées dans les plaques de 96 puits préalablement incubées avec l'anti-lFNy à raison de 20.000 cellules par puits dans 200ul final et en présence des PBMC autologues stimulées avec un rapport effecteur: cible (E T) de 1:1 La phytohémagglutinine (PHA) à la concentration de 4 iug/ml et le phorbol 12méristate 13-acétate (PMA)-ionomycine (150 et 500 ng/ml respectivement) sont utilisées à titre de témoins positifs. Après 20 heures d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2, les puits sont lavés 5 fois avec du PBS puis 1 fois avec de l'eau distillée, puis sont incubés toute la nuit à 4 C avec 100,ul/puits d'anticorps de lapin anti-lFNy humain dilué au 1/250ème dans du RPMI contenant 10% de SAB. Les puits sont ensuite lavés 5 fois avec du PBS contenant 0,05% de Tween 20, puis incubés pendant 2 heures à 37 C avec 1 100cul d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de lapin biotinylés dilués au 1/500ème dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20 et 1% de BSA (sérum albumine bovine). Les puits sont à nouveau lavés cinq fois avec du PBS-Tween puis incubés pendant 1 heure à 37 C avec 100ul d'ExtrAvidine-Phosphatase Alcaline diluée au 1/600ème dans du PBS-Tween-BSA 1%. Après quatre lavages en PBS-Tween, les puits sont incubés avec 100cul de substrat de révélation (Alkaline phosphatase conjugate substrate kit, Réf. 170-6432. Biorad). Les puits sont ensuite lavés avec de l'eau distillée et séchés avant la lecture des résultats au stéréomicroscope. b) Résultats: La figure 1 illustre les résultats obtenus. Les deux lipopeptides de MART 27-35 stimulent de façon spécifique la sécrétion d'lFNy par la lignée de CTLs anti-MART 27-35. Ils sont donc présentés par les PBMC et reconnus par les CTLs d'une façon comparable au peptide nominal MART 27-35. 2) Etude de la reconaissance des lipopeptides mono- et dipalmitoyle MART 27-35 par deux clones de lymphocytes infiltrants de mélanomes humains spécifiques de MART 27-35, par un test de cytotoxicité par relarguage de 5'cor. a) Matériel et méthode: LT 8 et LT 12 sont deux clones HLA-A2+ obtenus par la restimulation de lymphocytes infiltrants de mélanome (TlLs), qui reconnaissent spécifiquement le peptide MART 27-35. Les cellules cibles utilisées dans ce test sont des cellules humaines HLA-A2+ de type T2. Ces cellules sont dépourvues de transporteurs de peptide et ne présentent donc que les peptides exogènes sur leurs molécules de classe I libres. Dans ce test, les cellules cibles sont incubées durant une nuit avec le peptide à tester à raison de 4 ug/106 cellules, dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37"C. Elles sont ensuite incubées pendant une heure à 37"C avec 100 uCi de chromate de sodium (51Cr). Les cellules cibles sont ensuite lavées deux fois dans du sérum physiologique contenant 5% de sérum foetal de veau (SVF), reprises dans du milieu RPMI 5% SVF et distribuées dans des plaques de 96 sont reconnus de façon similaire, et à un niveau au moins comparable au peptide original (MART 27-35) compte-tenu que les cellules cibles ont été exposées à la même concentration finale de peptides alors que la masse molaire des lipopeptides est environ 5 fois plus élevée que celle du peptide MART 27-35. EXEMPLE 4 : Préparation d'un lipopeptide comprenant une liaison hydrazone. L'hydrazinopeptide et le peptide aldéhyde présentent les formules suivantes: hydrazinopeptide: K(NH2)1LKEPVHGV-OH / épitope MHCI-POL HIV-1 peptide aldéhyde CHOCO-RTPPAYRPPNAPILK(Pam)-NH2/épitope MHCII-HBVc Le peptide aldéhyde comprend 'épitope 128-140 de la protéine core du virus de l'hépatite B (HBVc) tel que décrit par MILICH et al. (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1610-1614). 16 mg (12 umol) d'hydrazinopeptide et 15 mg (7 umol) de peptide aldéhyde sont dissous dans 4 ml de tampon citrate/phosphate 0,01M pH 5,4 et 1 ml de DMSO. Le pH est ajusté à 5,4 avec Na2HPO4 0,2M. Après 24h, le milieu est dilué avec 5 ml d'acide acétique et purifié sur une colonne C18 (15x500 mm). Eluant A : TFA 0,05% dans H2O, Eluant B : TFA 0,05% dans CH3CN/H2O (80/20). Gradient 0-40%B en 10 min. puis 40-1 00%B en 60min. Les fractions pures sont collectées et lyophilisées. 4,9 mg de produit pur est obtenu (rendement 22%). La formule du produit final est représentée sur la figure 3. TABLEAU 1 : Epitopes de BCR-ABL Peptide Séquence Fixation au HLA 247-255 EDAELNPRF B44 488-496 SELDLEKGL 768-776 DELEAVPN'I B44 901-934 b2a2 KEDALQRPV B44 902-935 b2a2 EDALQRPVA B44 986-994 GEKLRVLGY B44 1176-1184 EDTMEVEEF B44 152-1260 MEYLEKKNF B44 1691-1699 NEEAADEVF B44 49-57 VNQERFRMI B8 5SO-SSS LFQKLASQL BS 722-730 ARKLRHVFL B8 786-794 ALKIKISQI B8 886-893 CVKLQTVH B8 928-936 b3a2 KALQRPVAS B8 1830-1838 GAKTKATSL B8 1975-1983 IQQMRNKFA B8 1977-1984 QMRNKFAF B8 252-260 NPRFLKDNL B7 329-338 TPDCSSNENL B8 693-701 TPRRQSMTV B7 1058-1066 SPGQRSISL B7 196-1205 HPNLVQLLGV B7 1560-1569 SPKPSNGAGV B7 1717-1725 KPLRRQVTV B7 1878-1884 SPAPVPSTLB7 36-44 ERCKASIRR B27 71-79 DRQRWGFFRR B27 575-583 QRVGDLFQK B27 834-842 FRVHSRNGK 642-650 LLYKPVDRV A2 684-692 FLSSINEEI A2 708-716 QLLKDSFMV A2 714-722 FMVELVEGAAA A2 817-825 KLSEQESLL A2 881-889 MLTNSCVKL A2 908-917 GLYGFLNVIV A2 912-90 FLNVITVHSA A2 1240-1248 VLLYMATQI A2 1903-1911 FIPLISTRV A2 1932-1940 VVLDSTEAL A2 50-58 NQERFRMIY A1 223-231 VGDASRPPY A1 549-558 KVPELYEIHK A3/A11 583-591 KLASQLGVY A3/A11 715-724 MVELVEGARK A3/A11 916-923 IVHSATGFK A3/A11 920-928 b3a2 ATGFKQSSK A3/A11 924-932 b3a2 KQSSKALQR A3/A11 1156-1165 EVYEGVWKKY A3/A11 1311-1320 SLAYNKFSIK A3/A11 1499-1509 NLFSALIKK A3/A11 1724-1734 TBAPASGLPHK A3/A11 1905-1914 LISTRVSLRK A3/A11 1922-1930 RIASGAITK A3/A11 TABLEAU 2 - Epitopes de la p53 - épitopes de la p53 se liant au HLA-AI: RVEGNLARVEY (196-205) GSDCTTIHY (226-234) - épitopes de la p53 se liant au HLA-A2: LLPENNVLSPL (25-35) RMPEAAPPV (65-73) RMPEAAPRV ALNKMFCQL (129-137) STPPPGTRV (149-157) GLAPPQHLIRV (187-197) LLGRNSFEV (264-272) PLDGEYFTL (322-330) - épitopes de la p53 se liant au HLA-A3: RVRAMAIYK (156-164) RRTEEENLR (282-290) ELPPGSTKR (298-306) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B7: LPENNVLSPL (26-35) APRMPEAAPPV (63-73) APRMPEAAPRV APPQHLIRV (189-197) RPILTIITL (249-257) KPLDGETYFTL (321-330) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B8: CQLAKTCPV (135-143) GLAPPQHLI (187-195) NTFRHSVVV (210-218) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B51: LLPENNVLSPL (25-35) RMPEAAPPV (65-73) LIRVEGNLRV (194-203) TABLEAU 3 Epitopes des protéines ES et E, YMLDLQPETT (E7 11-20) LLMGTLGIV (E7 82-90) TLGIVCPI (E7 86-93) TIHDIILECV (E6 29-38) KLPQLCTEL (E6 18-26) RPPKLPQL (E6 8-15) ISEYRHYCY (E6 80-88) QAEPDRAHY (E7 44-52) EPDRAHYNIV (E7 46-55) TABLEAU 4 : Epitopes du virus VIH-1 HLA-A1 (Nef 96-106: GLEGLIHSQRR (Nef 121-128: FPDEQNYT (Nef 137-145: LTFGWCYKL (Nef 184-191: RFDSRLAF (Nef 195-202: ARELHPEY HLA-A2 Gp120 121-129: KLTPLCVTL P17 77-85: SLYNTVATL RT 200-208: ALVEICTEM RT 275-285: VLDVGDAYFSV RT 346-354: KIYQYMDDL RT 368-376: KIFFLRQHL RT 376-387: LLRWGLTTPDK RT 476-484: ILKEPVHGV RT 588-596: PLVKLWYQL RT 683-692: ELVNQUEQL Nef 136-145: PLTFGWCFKL Nef 180-189: VLQWRFDSRL Nef 190-98: ALHHVAREL Gp41 818-826: SLLNATVDI P24 185-193: DLNTMLNTV RT 346-354: VIYQYMDDL RT 588-596: PLVKLWYQL Pro 143-152: VLVGPTVNI (Gp120 37-44: TVYYGVPV (Gp120 115-122: SLKPCVKL (Gp120 313-321: RIQRGPGRA (Gp120 197-205: TLTSCNTSV (Gp120 428-435: FINMWQEV (Gp41 836-844: VVQGAYRAI (p24 219-228: HAGPIAPGQM (p14 422-431: QMKDCTERQA (p15 448-456: FLQSRPETA (RT 681-691: ESELVNQIIEG HLA-A3 P17 18-26: KIRLRPGGK P17 20-28: RLRPGGKKK RT 200-210: ALVEICTEMEK RT 325-333: AIFQSSMTK RT 359-368: DLEIGQHRTK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Gp 120 37-46: TVYYGVPVWK Gp41 775-875: RLRDLLLIVTR P17 18-26: KIRLRPGGK HLA-A11 RT 325-333: AIFQSSMTK RT 507-517: QIYQEPFKNLK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 84-92: AVDLSHFLK p24 349-359: ACQVGGPGHK P17 83-91: ATLYCVHQR Tableau 4 (suite) HLA-A24 (A9) Gpl20 52-61: LFCASDAKAY Gp41 591-598: YLKDQQLL ou 590-597: RYLKDQQLL (RT 484-492: VYYDPSKDL (RT 508-516: IYQEPFKNL (RT 681-691: ESELVNQIIEG HLA-A25 (A10) P24 203-212: ETINEEAAEW HLA-A26 (A10) P24 167-175: EVIPMFSAL HLA-A30 (A19) (Gp41 845-852: RAIRHIPRR HLA-A31 (A19) Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR HLA-A32 (A19) Gp 120 424-432: RIKQIINMW Gp41 774-785: HRLRDLLLI RT 559-568: PIQKETWETW HLA-A33 (A19) (P24 266-275: IILGLNKIVR HLA-B7 RT 699-707: YLAWVPAHK Nef 68-77: FPVTQVPLR Nef 128-137: TPGPGVRYPL Gp 120 303-312: RPNNNTRKSI Gp41 848-856: IPRRIRQGL RT 699-707: YLAWVPAHK HLA-B8 Gp 120 2-10: RVKEKYQHL P17 24-32: GGKKKYKLK Nef 90-97: FLKEKGGL = P24 259-267: GEIYKRWII Gp41 591-598: YLKDQQLL (Gp41 849-856: PRRIRQGL ou 851-859: RIRQGLERIL (P24 329-337: DCKTILKAL (RT 185-193: GPKVKQWPL (Nef 182-189: EWRFDSRL HLA-B14 Gp41 5S9-597: ERYLKDQQL P24 298-306: DRFYKTLRA (P24 183-191 ? : DLNTMLNTV (p24 304-313: LRAEQASVQEV (p24 305-313: RAEQASVQEV HLA-B18 Nef 135-143: YPLTFGWCY Nef 135-143: YPLTFGWCF Tableau 4 (suite) HLA-B27 P24 263-272: KRWIILGLNK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 234-141: RYPLTFGW ou 133-141: YPLTFGW Gp41 589-597: ERYLKDQQL (Gp41 791-800: GRRGWEALKY HLA-B35 GP120 78-86: DPNPQEVVL Gp120 257-265: RPVVSTQLL RT 285-294: VPLDKDFRKY RT 323-331: SPAIFQSSM RT 342-350: NPDIVTIYQY (consensus clade B) RT 460-468: IPLTEEAEL RT 598-608: EPIVGAETFY Nef 68-76: FPVRPQVPL Nef 74-81: VPLRPMTY Gp41 611-619: TAVPWNASW Gp120 42-52: VPVWKEATTTL P17 124-132: NSSQVSQNY (consensus clade B) P24 254-262: PIPBGEIY (consensus clade B) HLA-B37 Nef 120-128: YfPDWQNYT HLA-B44 (B12) P24 187-186: SEGATPQDL (p24 175-184: LESGATPQDL HLA-B51 (B5) gp41 562-570: RAIEAQQHL RT 200-208: ALVEICTEM RT 209-217: EKEGKISKI RT 295-302: TAFTIPSI HLA-B52 (B5) Nef 190-1998: AFHHVAREL HLA-B55 (B22) Gp120 42-51: VPVWKEATTTL HLA-B57 et B58 (B17) P24 240-249: TSLTQEQIGW Nef 116-125: HTQGYFPDWQ ou 116-124: HTQGYFPDW Nef 120-128: YFPDWQN (P24 147-155: ISPRTLNAW (P24 164-172: FSPEVIPMF HLA-Bw62 (B15) P17 20-29: RLRPGGKKKY P24 268-277: LGLNKIVRMY RT 427-438: LVGKLNWASQIY Nef 84-91: AVDLSHFL Nef 117-127: TQGYFPDWQY Tableau4(suite) HLA-Cw4 gp120 380-388: SFNCGGEFF HLA-Cw8 RT 663-672: VTDSQYALGI P24 305-313: RAEQASQEV Nef 82-91: KAALDLSHPL HLA-Cw? P24 308-316: QATQEVKNW TABLEAU 5 - Epitopes de Mélanome humain Gene/protéine MHC restriction Peptide Position des acides aminés Tyrosinase HLA-A2 MLLAVLYCL 1-9 HLA-A2 YMNGTMSQV 369-377 YMDGTMSQV HLA-A24 AFLPWHRLF 206-214 HLA-B44 SEIWRDIDF 192-200 mel17gp100 HLA-A2 KTWGQYWQV 154-162 HLA-A2 AMLGTHTMEV 177-186 HLA-A2 MLGTHTMEV 178-186 HLA-A2 ITDQVPFSV 209-217 HLA-A2 YLEPGPVTA 280-288 HLA-A2 LLDGTATLRL 457466 HLA-A2 VLYRYGSFSV 476-485 HLA-A2 SLADTNSLAV 570-579 HLA-A3 ALLAVGATK 17-25 Melan-AMART-1 HLA-A2 (E)AAGIGILTV 26(7)-35 HLA-A2 ILTVILGVL 32-40 gp75TRP-1 HLA-A31 MSLQRQFLR TRP-2 HLA-A31 LLGPGRPYR 197-205 TABLEAU 6: Epitopes de tumeurs résultant de mutations Genelproteine Tumeur MHC Peptide Position des Restriction acides aminés MUM-1 Mélanome HLA-B44 EEKLIVVLF 30-38 CDK4 Mélanome HLA-A2 ACDPHSGHFV 23-32 ss-catenine Mélanome HLA-A24 SYLDSGIHF 29-37 CASP-8 carcinome HLA-B35 FPSDSWCYF 476-484 squameux de la tête et du cou TABLEAU 7 Antigènes communs à diverses tumeurs Gene tissu où a MHC Peptide antigénique Position des lieu acides aminés I'expression restriction normale MAGE-1 testicules HLA-A1 EADPTGHSY 161-169 HLA-Cwî6 SAYGEPRKL 230-238 MAGE-3 testicules HLA-A1 EVDPIGHLY 168-176 HLA-A2 FLWGPRALV 271-279 HLA-B44 MEVDPIGHLY 167-176 BAGE testicules HLA-CW 16 AARAVFLAL 2-10 GAGE- testicules HLA-Cw6 YRPRPRRY 9-16 1/2 RAGE-1 rétine HLA-B7 SPSSNRIRNT 11-20 GnTV aucun HLA-A2 VLPDVFIRC 38-64 REVENDICATIONS 1.Lipopeptide comprenant au moins un épitope T auxiliaire, au moins un épitope CTL et au moins un résidu lipidique, caractérisé en ce que les épitopes et la partie lipidique d'une part, et les épitopes d'autre part, sont séparés indépendamment par des séquences d'acides aminés, appelées espaceurs, comprenant des enchaînements d'acides aminés globalement chargés en milieu neutre, assurant l'hydrophilie du lipopeptide. 2. Lipopeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que les espaceurs sont globalement hydrophiles et présentent entre 1 et 10 acides aminés. 3. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'au moins l'un des espaceurs comprend entre 1 et 10, glycines et/ou arginines. 4. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'au moins l'un des espaceurs présente l'une des séquences suivantes: GLY ARG ou ARG GLY ARG. 5. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'au moins l'un des espaceurs comprend un ou plusieurs acides glutamique et/ou acides aspartique. 6. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les espaceurs intègrent une cystéine ou une chaîne alkyle fonctionnalisée par un groupe thiol et des liaisons non-peptidiques, telles que des liaisons disulfure ou dithioéther. 7. Lipopeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les espaoeurs comprennent un groupe tel qu'un groupe thiazolidine, oxime ou hydrazone. 8. Lipopeptide selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement: - d'une partie lipidique, - d'un premier espaceur, - d'un épitope T auxiliaire, - d'un second espaceur, et - d'un épitope CTL. 9. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'enchaînement: - d'une partie lipidique, - d'un premier espaceur, - d'un épitope T auxiliaire, - d'un second espaceur, - d'un premier épitope CTL, - d'un troisième espaceur, et - d'un second épitope CTL. 10. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la partie lipidique comprend une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras ou d'alcools gras en C10 à C20, éventuellement ramifiées ou insaturées, ou un dérivé de stéroide. 11. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la partie lipidique comprend au moins deux chaînes dérivées d'acides gras ou d'alcools gras en C10 à C20, liées entre elles par un ou plusieurs acides aminés. 12. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la partie lipidique est constituée de deux chaînes d'acide palmitique liées aux groupements NH2 d'une lysine. 13. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la partie lipidique comprend un résidu d'acide palmitique, d'acide oléique, d'acide linoléique, d'acide linolénique, d'acide 2-amino hexadécanoïque, de pimélautide ou de triméxautide. 14. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la partie non lipidique comprend entre 15 et 100 acides aminés. 15. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'épitope T auxiliaire est un épitope multivalent. 16. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'épitope T auxiliaire est le peptide 830-843 de la toxine tétanique présentant la séquence suivante: QYIKANSKFIGITE 17. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'épitope T auxiliaire est 'épitope de l'hémagglutinine ou l'épitope PADRE. 18. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il contient au moins un épitope CTL d'une protéine spécifique du mélanome, d'une protéine du VIH, du VHB, du papillomavirus, de la protéine p-53 ou d'une protéine du stade intra-hépatocytaire de Plasmodium Falciparum. 19. Utilisation d'un lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 18 pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique. 20. Utilisation d'un lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 18 pour la fabrication d'un médicament pour l'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre du VIH, du VHB, du papillomavirus, de la p-53 du mélanome, ou de la malaria. 21. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une dose pharmacologiquement efficace d'un ou plusieurs lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 18 et des excipients pharmaceutiquement compatibles. 22. Médicament ou vaccin, caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 18.