Brevet FR2775692A1 — publié le 19990910

f4 2775692 La présente invention concerne le domaine de la biologie et de l'immunologie. Elle concerne plus particulièrement de nouvelles méthodes de préparation de cellules tueuses naturelles activées et les moyens de mise en oeuvre de ces nouvelles méthodes. Elle concerne également l'utilisation des cellules activées obtenues par les méthodes de l'invention, dans les domaines de l'immunologie, I'immunothérapie ou plus généralement de la Biotechnologie médicale. Les cellules tueuses naturelles (" cellules NK ") sont une population de lymphocytes qui representent une ligne de defense tres precoce contre les virus io et les cellules tumorales. Les cellules NK peuvent être caractérisées par la présence des marqueurs CD56 et CD16, et par l'absence du marqueur CD3. Les cellules NK ont notamment été impliquées dans l'immunité antitumorale non spécifique d'antigènes, pour la prévention d'établissement de tumeurs primitives ou métastatiques chez l'hôte immunocompétent ou immunosupprimé. En particulier, le rôle des cellules NK dans l'immunosurveillance antitumorale (tumeur primitive ou métastases) a été suggéré chez les souris porteuses de tumeurs et traitées par IL-2 et/ou IL-12/IL-15, avec ou sans cellules LAK (" cellules tueuses activées par les lymphokines "), cellules NK adhérentes (" A- NK ") ou non-adhérentes (" NA-NK ") - obtenues ex vivo en stimulant les cellules NK par de fortes doses d'lL-2. Les cellules NK semblent en particulier avoir un rôle clef contre les cellules tumorales ou les variants CMH classe I négatifs. En raison de leurs propriétés cytotoxiques non-spécifiques d'antigène et de leur efficacité, les cellules NK constituent donc une population de cellules effectrices particulièrement intéressante pour le développement d'approches immunoadoptives de traitement de cancers ou maladies infectieuses. A cet égard, des approches d'immunothérapie adoptive antitumorales ont été décrites dans l'art antérieur. Ainsi, dans certaines indications comme les patients porteurs de lymphomes malins intensifiés, l'administration de A-NK avec faibles doses d'lL-2 a donné des résultats prometteurs en situation adjuvante. Les cellules NK ont également été utilisées pour le traitement expérimental de 2 2775692 différents types de tumeurs et certaines études cliniques ont été initiées (Kuppen et al., Int. J. Cancer. 56 (1994) 574; Lister et al., Clin. Cancer Res. 1 (1995) 607; Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 889). En outre, ces cellules peuvent également être utilisées in vitro pour la lyse non-spécifique de cellules n'exprimant pas de molécules du CMH de classe-l, et plus généralement de toute cellule sensible aux cellules NK. Toutefois, la thérapie adoptive utilisant les cellules NK (pour le traitement de tumeurs murines ou humaines ou d'autres pathologies telles que les maladies infectieuses) ou toute autre utilisation in vitro ou in vivo de ces cellules o impliquent l'expansion et l'activation ex vivo des cellules NK. A cet égard, les techniques actuelles d'activation des cellules NK reposent toutes sur l'utilisation de cytokines, généralement à fortes doses mal tolérées par l'hôte. En effet, les données disponibles semblent indiquer que les cellules NK ex vivo ne survivent pas et ne peuvent être activées sans support nourricier ni cytokines. Ainsi, les méthodes actuelles d'activation des cellules NK in vitro impliquent la culture de ces cellules en présence de différentes cytokines (telles que par exemple IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IFNot, IFNy, IL-6, IL-4 dans certaines circonstances), seules ou en combinaison, activation qui peut être considérablement augmentée par des facteurs d'adhésion ou de costimulation tels que ICAM, LFA ou CD70. De manière similaire, in vivo, l'efficacité des cellules NK dans l'immunité antitumorale n'est pas dissociable de la co- administration de cytokines telles que IL-2/IL-15 ou IL-12, et IL-10. Les IFN ont aussi un rôle activateur en association à l'IL-2. Les méthodologies d'activation décrites dans l'art antérieur sont donc toutes dépendantes de l'utilisation de cytokines. Or, ces méthodes présentent certains inconvénients, liés notamment aux coûts de préparation des cytokines, au caractère toxique de nombreuses cytokines, qui ne peuvent être utilisées dans des applications in vivo, ou encore au caractère non-spécifique de nombreuses cytokines, dont l'emploi in vivo risque de s'accompagner de nombreux effets indésirables. En outre, la fonction "natural killing" étant souvent altérée chez les patients porteurs de tumeurs, la 3 2775692 possibilité de prélever ces cellules en vue de leur activation ex vivo peut être considérablement réduite. Il existe donc un besoin réel de disposer de nouvelles méthodes d'activation de cellules NK. La présente demande apporte une solution à ce problème en proposant des nouvelles approches originales pour l'activation des cellules NK. La présente demande démontre en particulier, pour la première fois, la possibilité d'activer les cellules NK au repos avec une autre population de cellules. La présente demande décrit également, pour la première fois, une méthode d'activation des cellules NK non-dépendante de la présence de io cytokines, et donc permettant de pallier aux inconvénients décrits dans l'art antérieur. La présente invention décrit donc de nouvelles méthodes de préparation de cellules tueuses naturelles activées et les moyens de mise en oeuvre de ces nouvelles méthodes. Un premier aspect de l'invention réside donc dans une méthode i5 d'activation des cellules NK comprenant la mise en contact de cellules NK avec des cellules dendritiques. Comme indiqué ci-après, la mise en contact peut être réalisée in vitro, ex vivo ou in vivo. Elle peut comprendre soit la coculture de cellules NK et de cellules dendritiques in vitro, soit l'incubation de cellules NK in vitro ou in vivo avec un facteur de stimulation des cellules NK provenant des cellules dendritiques, soit encore le transfert passif in vivo de cellules dendritiques, soit également l'administration in vivo d'un ou plusieurs facteurs de croissance des cellules dendritiques. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de cellules dendritiques pour l'activation de cellules tueuses naturelles in vitro, ex vivo ou in vivo. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules tueuses naturelles in vivo. Un autre aspect de l'invention concerne également une coculture de cellules dendritiques et de cellules NK. 4 2775692 Un aspect supplémentaire de l'invention est relatif à une composition comprenant un facteur de stimulation des cellules NK provenant des cellules dendritiques. D'autres aspects de l'invention sont notamment une sous-population de cellules NK activées par le procédé de l'invention et l'utilisation de ces cellules ou de co-cultures NK/DC pour stimuler in vivo ou in vitro une activité cytotoxique contre des cellules cibles sensibles aux cellules NK. Selon un autre aspect, l'invention est également relative à des méthodes permettant l'augmentation majeure de l'activité cytolytique et sécrétrice d'lFNg des cellules NK au repos. io L'invention concerne également des approches thérapeutiques nouvelles, notamment pour le traitement de pathologie infectieuses ou tumorales, impliquant en particulier le transfert passif de cellules NK activées par des cellules dendritiques ex vivo, ou bien de cellules dendritiques pour activer directement les cellules NK in situ ou bien des deux populations cellulaires co- incubées ex vivo. Comme indiqué ci-avant, un premier objet de l'invention concerne donc un procédé pour l'activation de cellules NK au moyen de cellules dendritiques. Ce procédé comprend notamment la mise en présence de cellules NK avec des cellules dendritiques. La présente invention découle en particulier de la démonstration par la demanderesse de la capacité des cellules dendritiques à activer les cellules NK au repos. Les résultats présentés dans la présente demande démontrent notamment que les cellules NK au repos, co-cultivées en présence de cellules dendritiques survivent et sont très fortement activées pour leur capacité lytique et de production d'lFNy. En outre, les cellules activées ainsi obtenues lysent des cibles NK sensibles mais pas les cibles LAK sensibles, ce qui différencie ce phenomène d'activation du phénomène LAK classique, IL-2 dépendant. La présente demande démontre également que les cellules dendritiques allogéniques aussi bien qu'autologues sont capables d'activer les cellules NK in vitro, et que les mécanismes d'activation des cellules NK en présence des cellules dendritiques n'impliquent pas l'IL-12 ni l'IL-2. D'autre part, les résultats 2775692 présentés démontrent également l'implication d'une interaction cellulaire entre les cellules NK et les cellules dendritiques dans le processus d'activation, démontrant l'existence d'un facteur membranaire des cellules dendritiques intervenant dans cette activation. La pertinence de cette activation des cellules NK par les cellules dendritiques a de plus été démontrée in vivo, dans un modèle de tumeur CMH classe I négatif. Dans les souris porteuses de cette tumeur, la seule expansion de cellules dendritiques permet l'élimination de la tumeur de façon NK- dépendante. De plus, le transfert adoptif passif de cellules dendritiques à io l'animal immunosupprimé déficient en cellules T et B, porteur de la tumeur, permet également un ralentissement significatif de la croissance tumorale. Ces résultats démontrent donc que les cellules dendritiques possèdent la capacité d'induire l'activation des cellules NK, in vitro, ex vivo ou in vivo, que cette activation permet de stimuler in vitro la lyse de cellules NK-sensibles et in vivo l'immunité naturelle d'un organisme hôte, et peut ainsi conduire à l'élimination in vivo de tumeurs ou de cellules infectées. Les résultats obtenus dans la présente invention sont d'autant plus surprenants que, jusqu'à présent, peu ou pas d'études avaient suggéré que les cellules NK pouvaient être activables, in vitro, par un autre type cellulaire, excepté des transfectants codant pour l'IL-2 et/ou 'IL-12, IL-15 et CD70. Au contraire, certains travaux semblaient plutôt suggérer un rôle inhibiteur des macrophages sur l'activation IL-2 dépendente des cellules NK, par l'intermédiaire des PGE2. La présente invention constitue, à notre connaissance, la première mise en évidence d'une activation des cellules NK, non dépendante de cytokines, et utilisant une autre population cellulaire. Le terme "activation" de cellules NK au sens de l'invention désigne plus particulièrement l'augmentation de la production d'IFNy et de l'activité cytotoxique des cellules NK. Ces deux paramètres peuvent être aisément mesurés selon les techniques connues de l'homme du métier et illustrées dans les exemples. Généralement, I'activation selon l'invention ne s'accompagne pas 6 2775692 d'une augmentation importante de la prolifération des cellules NK, toute population confondue, mais pourrait induire la prolifération d'une sous- population de celles-ci. Plus particulièrement, I'activation de cellules NK au sens de l'invention est indépendante de l'utilisation de cytokines classiques. Le terme cellules NK "activées" désigne au sens de l'invention des cellules NK présentant au moins les propriétés mentionnées ci-dessus. Le procédé d'activation des cellules NK selon la présente invention peut être mis en oeuvre in vitro, ex vivo ou directement in vivo. Dans un premier mode particulier de réalisation, le procédé de l'invention io comprend l'activation des cellules NK in vitro ou ex vivo par coculture des cellules NK avec des cellules dendritiques matures ou immatures, auto ou allogéniques. Selon ce premier mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, les cellules NK sont donc co- cultivées avec des cellules dendritiques. Dans ce mode de mise en ceuvre, les cellules dendritiques utilisées peuvent être soit autologues (c'est-à-dire provenir du même sujet que les cellules NK), soit allogéniques (c'est-à-dire provenir d'un autre sujet de la même espèce). En effet, les résultats présentés dans les exemples montrent que l'activation des cellules NK n'est pas affectée significativement par le caractère allogénique des cellules dendritiques. Ceci permet de manière particulièrement avantageuse d'utiliser, pour l'activation des cellules NK, des banques " universelles " de cellules dendritiques. De telles banques peuvent être constituées, comme décrit ci-après, par exemple par modification des cellules dendritiques de manière à les rendre immortelles. A cet égard, différentes lignées de cellules dendritiques peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention établies à partir de cellules dendritiques humaines immatures ou rendues matures (LPS, TNFo, RANKL, TRANS, CD40L). Préalablement à leur utilisation, il est. par ailleurs possible de soumettre les cellules dendritiques à des pré-traitements en vue d'améliorer leurs propriétés ou de les rendre compatibles avec un usage pharmacologique. Ainsi, les cellules dendritiques peuvent être soumises à une irradiation préalablement 7 2775692 à leur utilisation pour l'activation des cellules NK. Une telle irradiation permet notamment d'éliminer tout risque cancérigène associé à certaines populations de cellules dendritiques telles les cellules dendritiques immortalisées. Le prétraitement par irradiation peut être particulièrement souhaitable lorsque les cellules dendritiques ou les co-cultures sont utilisées in vivo. Un autre prétraitement des cellules dendritiques peut consister en une incubation en présence de facteurs de stimulation des cellules dendritiques (cytokines par exemple), de manière à améliorer leur activité de stimulation des cellules NK ou de manière à déclencher la production de dexosomes. o Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, les cellules dendritiques utilisées peuvent être des cellules dendritiques matures (LPS, TNFo, CD40L, RANKL, TRANS) ou immatures. Comme le montrent les exemples, les cellules dendritiques possèdent la propriété d'activer les cellules NK quel que soit leur stade de maturité. Toutefois, pour que l'activation soit plus efficace, il convient is avantageusement de respecter certains paramètres tels que le rapport de cellules NK sur cellules dendritiques et/ou le temps de la coincubation. Ainsi, les expériences réalisées par la demanderesse ont mis en évidence que les meilleures performances du procédé d'activation in vitro ou ex vivo sont obtenues lorsque le rapport initial cellules NK sur cellules dendritiques est compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,05 et 5. Il est entendu que l'homme du métier est en mesure d'adapter ce rapport en fonction des populations cellulaires utilisées, en tenant compte de l'effet d'étouffement des cellules NK qui peut être observé lorsque la quantité de cellules dendritiques est trop importante, et du faible niveau d'activation qui peut être observé lorsque le nombre de cellules dendritiques est trop faible. Des conditions particulièrement préférées sont celles dans lesquelles le rapport initial cellules NK sur cellules dendritiques est compris entre 0,1 et 1, plus préférentiellement de 0,1 a 0,2 environ. Concernant le temps de la coculture, il peut également être adapté par lI'homme du métier en fonction des populations cellulaires utilisées et notamment du stade de maturation des cellules dendritiques. Généralement, I'activation 8 2775692 optimale des cellules NK est observée après coculture pendant une période comprise entre 20 à 48 heures environ, lorsque les cellules dendritiques utilisées sont matures. Lorsque les cellules dendritiques utilisées sont immatures, la coculture est avantageusement maintenue pendant une période comprise entre 36 à 72 heures environ, afin d'obtenir les meilleurs niveaux d'activation. En particulier, ces périodes de coculture permettent d'obtenir la meilleure combinaison entre la proportion de cellules NK activées et la proportion de cellules viables. Il est à noter à cet égard que, durant la période d'activation par les cellules dendritiques, aucune prolifération globale significative des cellules o10 NK n'est observée (facteur 2 environ) n'excluant pas la prolifération isolée et particulière d'une sous- population NK. De plus, de manière particulièrement inattendue, il apparaît que les cellules dendritiques exercent également un effet positif sur la survie des cellules NK en culture. De ce fait, le procédé de l'invention permet d'obtenir des cellules NK activées, sans recours obligatoire à des cytokines, et avec des rendements améliorés. De même, les cellules NK en retour augmentent la survie des CD matures. L'activation des cellules NK in vitro peut être réalisée dans tout dispositif approprié à la culture cellulaire, de préférence en conditions stériles. Il peut s'agir notamment de plaques, boites de culture, flasques, fioles, poches, etc. La co-culture est par ailleurs réalisée dans tout milieu adapté à la culture des cellules dendritiques et des cellules NK. Il peut s'agir plus généralement de milieux de culture disponibles dans le commerce pour la culture de cellules mammifères, tels que par exemple le milieu RPMI, le milieu DMEM, le milieu IMDM ou des milieux GBEA (AIMV, X-VIVO), etc. Selon une première variante particulière du procédé de l'invention, l'activation in vitro ou ex vivo des cellules NK est réalisée par coculture de cellules dendritiques matures avec des cellules NK. Dans une expérience typique, les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse par traitement avec GM-CSF+IL-4, maturées en LPS, ou des cellules d'une lignée établie de cellules dendritiques, à l'état mature, sont resuspendues dans leur milieu de culture à 1 million/ml. Elles sont ensuite mises en culture en 9 2775692 plaques ou tout autre dispositif approprié. Des cellules NK fraiches au repos (autologues ou allogéniques), obtenues après étape d'adhérence, sont resuspendues dans un milieu approprié (milieu RPMI supplémenté par exemple) à la concentration d'1 million/ml. Elles sont ensuite ajoutées à la plaque contenant les cellules dendritiques, de telle façon que le ratio initial NK: CD soit de 0,1 à 0,3 environ. La coculture est recueillie à 24-36 heures environ. Le caractère activé des cellules NK est contrôlé par mesure de la production d'lFNy dans le surnageant et mesure de la cytotoxicité contre des cellules cibles. Les cellules NK sont également comptées (par exemple en bleu trypan) et analysées io (par exemple en cytométrie de flux) pour l'expression de marqueurs caractéristiques (tels que NK1.1 D x 5, ou asialo-GM1 chez la souris) et pour évaluer la mortalité cellulaire. Selon une autre variante particulière du procédé de l'invention, I'activation in vitro ou ex vivo des cellules NK est réalisée par coculture de cellules dendritiques immatures avec des cellules NK. Dans une expérience typique, les cellules sont traitées de façon identique à celle décrite ci-dessus, mais elles ne sont pas incubées en milieu de maturation, de manière à maintenir les cellules dendritiques à un stade immature. Dans ce mode de réalisation, la coculture est maintenue avantageusement au moins 36-72 heures pour permettre une activation optimale des cellules NK. Les cellules NK activées peuvent ensuite être analysées et contrôlées comme décrit ci-avant. Lorsque les cellules NK ont été ainsi activées, il est possible soit de séparer les cellules NK des cellules dendritiques, soit de récolter directement la coculture cellules NK:cellules dendritiques. A cet égard, l'invention a également pour objet une composition comprenant des cellules NK et des cellules dendritiques. Comme indiqué ci-avant, il s'agit avantageusement de cellules NK activées. En outre, il peut s'agir de cellules dendritiques matures ou immatures. Enfin, dans ces compositions selon l'invention, les populations cellulaires sont préférentiellement autologues, c'est-à-dire issues d'un même organisme. Ces compositions sont avantageusement constituées de populations cellulaires o 2775692 isolées, c'est-à-dire que chacune des deux populations cellulaires est composée au moins à 10%, de préférence au moins 30%, notamment au moins 50% du type cellulaire correspondant (NK ou dendritique). Par ailleurs, les compositions préférées selon l'invention comprennent généralement au moins 10%, de préférence de 20 à 60%, encore plus préférentiellement de 30 à 60% de cellules NK, et au moins %, de préférence de 40 à 80% de cellules dendritiques. Ces compositions peuvent être conditionnées dans tout dispositif adapté tel que poches, fioles, ampoules, seringues, flacons, etc., et peuvent être conservées (au froid) ou utilisées extemporanément, comme décrit plus loin. Avantageusement, ces 0io compositions comprennent de 104 à 109 cellules NK, de préférence de 106 à 108 environ (notamment pour une administration chez l'homme) ou encore de 105 - 106 (notamment pour une administration chez la souris. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'activation des cellules NK in vitro, ex vivo ou in vivo par mise en présence des cellules NK avec un facteur de stimulation provenant des cellules dendritiques. Les résultats présentés dans la présente demande illustrent en effet le caractère spécifique de l'activation des cellules NK par les cellules dendritiques, et donc indiquent l'implication d'un ou plusieurs facteurs produits ou exprimés par les cellules dendritiques dans la réalisation de cet effet. A cet égard, la présente demande montre également, dans une expérience de "transwell", qu'un contact intercellulaire entre les cellules NK et les cellules dendritiques semble nécessaire à l'activation. Ces résultats illustrent donc clairement l'existence d'un facteur de co-stimulation des cellules NK exprimé (à la surface) par les cellules dendritiques, responsable de ou au moins nécessaire à cette activation des cellules NK. Ce facteur de co-stimulation (membranaire), ou toute préparation acellulaire le comprenant, ou un facteur recombinant et/ou son DNA correspondant, peuvent donc également être utilisés in vitro ou in vivo pour activer les cellules NK, notamment pour des applications dans I'immunisation antitumorale ou antivirale. Ce facteur peut par ailleurs être bloqué par l'utilisation d'un compétiteur, d'anticorps spécifiques ou encore d'antisens, dans certaines situations telles que la maladie du greffon contre l'hôte ou le rejet de greffe. i 2775692 Selon un mode de mise en oeuvre particulier, I'invention comprend donc un procédé d'activation de cellules NK in vitro, ex vivo ou in vivo par mise en présence des cellules NK avec un facteur de stimulation membranaire provenant des cellules dendritiques. L'invention concerne également un procédé pour contrôler négativement l'activation des cellules NK in vitro ou in vivo comprenant la mise en présence de cellules NK et d'un composé capable d'interférer (i.e., d'inhiber au moins partiellement) avec l'interaction entre les cellules NK et les cellules dendritiques. Un tel composé peut comprendre par exemple une forme soluble (récepteur soluble) ou tout autre fragment du facteur membranaire io (notamment le domaine extracellulaire, en particulier le site de liaison), un analogue, un antagoniste, un compétiteur, un anticorps ou fragment d'anticorps, un antisens, etc. Un autre objet de la présente invention concerne également une composition comprenant un facteur membranaire impliqué dans l'activation des cellules NK par les cellules dendritiques. Le terme "impliqué" signifie que ce facteur est nécessaire ou tout au moins participe à l'activation des cellules NK par les cellules dendritiques. Cette composition est par exemple composée d'un extrait acellulaire de cellules dendritiques comprenant ledit facteur, ou de vésicules membranaires ou de toute forme isolée ou purifiée de ce facteur. Ce facteur, de nature essentiellement protéique, peut en particulier être obtenu par différentes méthodes d'isolement bien connues de l'homme du métier, telles que la lyse cellulaire, suivie de différentes étapes de centrifugation (centrifugations différentielles, ultracentrifugations, etc), et/ou la chromatographie, I'électrophorèse, la production d'anticorps neutralisants et leur utilisation pour I'isolement par immuno-affinité, etc. Chacune de ces techniques, seule ou en combinaison(s), peut être utilisée pour isoler le facteur membranaire impliqué dans l'activation, en suivant les différentes étapes de la purification par un test d'activation des cellules NK tel que décrit dans la présente demande. Une autre approche pour l'identification de ce facteur réside dans l'utilisation d'une banque de l'ADN de cellules dendritiques, et en la recherche de clones doués de l'activité ou capables de complémenter des mutants de cellules dendritiques 1 2 12 2775692 déficients pour cette activité. En outre, les compositions de l'invention peuvent également contenir tout acide nucléique codant pour le facteur membranaire des cellules dendritiques tel que décrit ci- dessus. Cet acide nucléique peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment à partir de la banque d'ADN de cellules dendritiques. Enfin, les compositions selon l'invention peuvent également contenir tout autre facteur de co-stimulation des cellules NK, et notamment toute lymphokine ou cytokine susceptible, en combinaison avec le facteur membranaire, d'activer les cellules NK. L'invention concerne donc en outre l'utilisation du facteur membranaire de 0o stimulation tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à l'augmentation de l'activité cytolytique des cellules NK ou la production d'IFNy et/ou de TNFcx in vivo. L'invention concerne aussi l'utilisation du facteur membranaire de stimulation tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à l'augmentation de l'immunité naturelle d'un organisme. L'invention concerne encore l'utilisation du facteur membranaire de stimulation tel que décrit ci-dessus pour l'augmentation de l'activité cytolytique des cellules NK ou la production d'IFNy et/ou TNFo in vitro ou ex vivo. L'invention concerne aussi tout composé capable d'interférer avec lI'intéraction entre les cellules dendritiques et les cellules NK, et donc d'inhiber au moins partiellement le contact entre une cellule dendritique et une cellule NK. Ce composé peut être, comme décrit ci- dessus, un anticorps neutralisant, antisens, ligand compétitif, analogue, fragment, etc. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un tel composé pour contrôler l'activation des cellules NK in vivo ou in vitro, notamment dans des applications telles que la prévention du rejet de greffe et de la GVH. En outre, I'invention concerne aussi l'utilisation de cellules dendritiques de phénotype "tolérogène", telles que les GC- DC, décrites notamment par Grouard et al. (Nature 384, 364-367, 1996) ou d'un produit dérivé de cellules dendritiques tolérogènes pour inhiber l'activation de cellules NK. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend lI'activation des cellules NK in vivo, par augmentation des niveaux decellules dendritiques in vivo. Cette augmentation in vivo permet en effet d'exercer une 13 2775692 activation in situ des cellules NK, et donc de renforcer l'immunité naturelle d'un organisme, notamment à l'encontre des cellules tumorales ou infectées. L'augmentation in vivo des niveaux de cellules dendritiques peut être réalisée par administration in vivo de cellules dendritiques (transfert passif) ou également par administration in vivo d'un ou plusieurs facteurs de croissance des cellules dendritiques. Cette administration est réalisée par exemple par injection, de préférence par injection sous cutanée ou systémique. L'injection est de préférence une injection locale ou régionale, notamment une injection au site ou proche du site à traiter, notamment proche d'une tumeur. Les résultats io présentés dans les exemples démontrent en particulier que l'administration par injection sous-cutanée ou intraveineuse de cellules dendritiques in vivo, immatures ou matures, allogéniques ou autologues, au site de la tumeur, permet de réduire la croissance de tumeurs CMH class I négatives. Les injections sont généralement réalisées sur la base de doses de cellules pouvant aller de 104 à iS 109 cellules dendritiques, de préférence comprises entre 105 et 107 inclus. En outre, le protocole d'injection peut être adapté par l'homme du métier selon les situations (préventif, curatif, tumeurs isolées, métastases, infection importante ou localisée, etc). Ainsi, il est possible d'effectuer le transfert passif de cellules dendritiques par des administrations répétées, par exemple 1 à 2 administrations par semaine pendant plusieurs mois. L'augmentation des cellules dendritiques in vivo peut également être réalisée par injection de facteur de croissance des cellules dendritiques in vivo. De tels facteurs sont par exemple le composé FIt3L (désigne dans ce qui suit composé "FL"), décrit par Lyman S.D et ai., (Blood 83, 2795-2801, 1994, Cloning of the human homologue of the murine FIt3L: a growth factor for early hematopoietic progenitor cells) et Maroskovsky E. et al. , (J. Exp. Med. 184, 1953-1962, 1996) ou le GM-CSF, par exemple. Comme le montrent les exemples, une stimulation de l'immunité naturelle (et donc de l'activité des cellules NK) in vivo est obtenue après injection quotidienne de FIt3L. Les résultats présentés montrent en outre que cette injection produit une augmentation du nombre absolu de cellules NK in situ, et induit des effets 14 2775692 antitumoraux, qui sont dépendants des cellules dendritiques lymphoides et de l'interaction B7/CD28 et de l'IFNy in vivo. Ce mode de réalisation constitue donc une autre approche particulièrement efficace pour augmenter l'activité cytolytique des cellules NK in vivo. Cette approche peut-être avantageusement associée à la co-administration d'un facteur de croissance des cellules NK in vivo. L'invention a donc également pour objet l'utilisation de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules NK in vivo. L'invention concerne aussi l'utilisation de cellules dendritiques pour io la préparation d'une composition destinée à activer l'activité cytolytique des cellules NK in vivo et la production d'lFNy et/ou TNFa par les cellules NK activées. Comme indiqué ci-avant, les cellules dendritiques utilisées à cet effet sont des cellules matures ou immatures, autologues ou allogéniques. En outre, il peut également s'agir de cellules dendritiques sensibilisées à un ou plusieurs antigènes. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un facteur de croissance des cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules NK in vivo ainsi que pour la préparation d'une composition destinée à activer l'activité cytolytique des cellules NK in vivo. Le facteur de croissance est préférentiellement le composé FL. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, les cellules NK peuvent être obtenues par différentes techniques connues de l'homme du métier. Plus particulièrement, ces cellules peuvent être obtenues par différents procédés d'isolement et d'enrichissement à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (lymphoprep, leucaphérèse, etc). Ainsi, ces cellules peuvent être préparées par gradients de densité Percoll (Timonen et al., J. Immunol. Methods 51 (1982) 269), par des méthodes de déplétion négatives (Zarling et al., J. Immunol. 127 (1981) 2575) ou par des étapes de tri par FACS (Lanier et al., J. Immunol. 131 (1983) 1789). Ces cellules peuvent également être isolées par immunoadsorption sur colonne en utilisant un système avidine-biotine (Handgretinger et al., J. Clin. Lab. Anal. 8 (1994) 443) ou encore par 2775692 immunosélection en utilisant des microbilles greffées avec des anticorps (Geiselhart et al., Nat. Immun. 15 (1996-97) 227). Il est également possible d'utiliser des combinaisons de ces différentes techniques, eventuellement combinées avec des méthodes d'adhérence sur plastique. Ces différentes techniques permettent d'obtenir des populations cellulaires fortement enrichies en cellules NK au repos, comprenant de préférence plus de 70% de cellules NK au repos. Plus préférentiellement, les populations de cellules NK utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention comportent généralement plus de 30% de cellules NK, avantageusement plus de o 50%. La pureté des populations cellulaires peut être améliorée si nécessaire en utilisant des anticorps spécifiques tels que des anticorps anti-CD56 et/ou des anticorps anti-CD16 et/ou des anticorps anti-CD3 (déplétion). Les cellules NK peuvent être conservées dans du milieu de culture sous forme congelée en vue d'une utilisation ultérieure. Avantageusement, les cellules NK sont préparées extemporanément, c'est-à-dire qu'elles sont utilisées pour l'activation après leur obtention. Les cellules dendritiques utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être préparées selon différentes techniques. Ces cellules peuvent être des cellules immatures ou matures, autologues ou allogéniques, "naives" ou sensibilisées à un ou plusieurs antigènes particuliers. Par ailleurs, les cellules dendritiques utilisées peuvent être des cultures de cellules enrichies en cellules dendritiques, voire des cultures cellulaires comprenant essentiellement des cellules dendritiques. Avantageusement, il s'agit bien évidemment de cellules dendritiques humaines. La préparation de cellules dendritiques a été bien documentée dans la littérature. Ainsi, il est connu que ces cellules peuvent être obtenues à partir de cellules souches hémotopoïétiques ou à partir de précurseurs monocytes, ou encore isolées directement sous forme différenciée (Revue par Hart, Blood 90 (1997) 3245). L'obtention de cellules dendritiques à partir de cellules souches est illustrée par exemple par Inaba et al. (J. Exp. Med. 176 (1992) 1693) chez la 16 2775692 souris, et par Caux et ai. (Nature 360 (1992) 258) ou Bernhard et ai. (Cancer Res. 55 (1995) 1099) chez l'homme. Ces travaux montrent notamment que des cellules dendritiques peuvent être produites par culture de moelle osseuse en présence de Facteur de Stimulation des Colonies de Granocytes-Macrophages (GM-CSF) ou, plus précisément, à partir de cellules souches hématopoïétiques (CD34+) par culture en présence d'une combinaison de cytokines (GM-CSF + TNFct + IL-3 et IL-4 ou bien en CD40L). L'obtention de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes est illustrée par exemple par Romani et al. (J. Exp. Med. 180 (1994) 83), Sallusto et 0o al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 1109), Inaba et al. (J. Exp. Med. 175 (1992) 1157) ou encore Jansen et al. (J. Exp. Med. 170 (1989) 577). Ces méthodologies reposent essentiellement sur le prélèvement de cellules mononucléées dans le sang et la mise en culture en présence de différentes combinaisons de cytokines. Une méthode particulière consiste à traiter les précurseurs monocytes du sang en présence de combinaisons de cytokines telles que Interleukine-4 + GM-CSF ou Interleukine-13 + GM-CSF par exemple. Cette technique est également illustrée par Mayordomo et al., 1995 (murin). Par ailleurs, il est également possible de traiter les précurseurs monocytes par des agents pharmacologiques de différenciation cellulaire, tels que des activateurs de canaux calciques ou le CD40L directement. Une autre approche pour l'obtention de cellules dendritiques consiste à isoler, à partir d'échantillons biologiques, des cellules dendritiques déjà différenciées. Cette approche a été décrite par exemple par Hsu et al. (Nature Medicine 2 (1996) 52). La méthodologie décrite par cette équipe consiste essentiellement à récolter des échantillons de sang périphérique et à les traiter par différents gradients et centrifugations de manière à en extraire les cellules dendritiques. La méthodologie privilégiée dans le cadre de la présente invention repose sur la production de cellules dendritiques à partir de précurseurs monocytes ou de moelle osseuse. Ces méthodologies sont illustrées dans les exemples. Plus particulièrement, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention des 17 2775692 cellules dendritiques obtenues par traitement de précurseurs monocytes (contenus dans le sang ou la moelle) en présence d'une combinaison GM- CSF+IL-4 ou GM-CSF+IL-13. Comme indiqué ci-avant, pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est possible d'utiliser une population de cellules dendritiques comprenant des cellules dendritiques immatures et/ou matures. Avantageusement, on utilise une population de cellules dendritiques composée principalement (i.e., au moins %, de préférence 70%) de cellules dendritiques immatures ou de cellules dendritiques matures. L'état immature des cellules dendritiques correspond à un io stade précoce de leur développement, auquel elles présentent une forte activité endocytique et expriment des niveaux faibles de molécules de classe I et Il du CMH et de molécules de co-stimulation lymphocytaire à leur surface. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la présente invention des lignées de cellules dendritiques. Il peut s'agir de lignées de cellules dendritiques immortalisées produites par exemple par introduction d'un oncogène dans les cellules dendritiques. Il peut s'agir à titre d'exemple murin d'une telle lignée, des lignées suivantes décrites dans l'art antérieur: lignée D1 (Winzler et al., J. Exp. Med. 185, 317-328, 1997), lignée XS (A. Takashima et al., J. Immunol. 1995; Vol. 154: 5128-5135), lignée tsDC (Volkmann et al., Eur. J. Immunol. 26: 2565-72, 1996). L'intérêt d'utiliser des lignées de cellules dendritiques réside dans la constitution de banques de cellules "universelles", utilisables industriellement pour activer des populations de cellules NK allogéniques provenant de sujets différents. Lorsque les cellules dendritiques sont préparées, elles peuvent être maintenues en culture, purifiées d'avantage, stockées ou utilisées directement dans la mise en oeuvre de la présente invention (activation in vitro, ex vivo ou in vivo de cellules NK, production d'extraits acellulaire, obtention du facteur de stimulation membranaire, etc). En outre, préalablement à leur utilisation pour l'activation de cellules NK, les cellules dendritiques ainsi préparées peuvent être sensibilisées à un antigène ou à un groupe d'antigènes. La présence de motifs antigéniques à la surface des cellules dendritiques pourrait en effet améliorer 18 2775692 (par cross-priming) ou inhiber (sur un mode KIR) leur activité immunogene (immunité acquise), notamment dans le cas d'utilisations in vivo. Dans cette optique, différentes techniques peuvent être utilisées pour sensibiliser les cellules dendritiques à des antigènes. Ces techniques comprennent notamment: - la mise en contact des cellules dendritiques avec des peptides antigéniques ("peptide pulsing"). Cette approche consiste à incuber les cellules dendritiques, pendant un temps variable (généralement de 30 minutes à 5 heures environ) avec un ou plusieurs peptides antigéniques, c'est-à-dire avec un peptide issu d'un antigène, tel qu'il pourrait résulter du traitement dudit antigène par une cellule présentatrice de l'antigène. Ce type d'approche a été décrit par exemple pour des peptides antigéniques du virus HIV, de l'lnfluenza ou de HPV ou pour des peptides dérivés des antigènes Muc-1, Mart, Her2 / Neu par exemple (Macatonia et al., J. Exp. Med. 169 (1989) 1255 Takahashi et al., Int. i5 Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa, J. Exp. Med. 182 (1995) 255 Ossevoort et al., J. Immunother. 18 (1995) 86; Mayordomo et al., précitée Mehta-Damani et al., J. Immunol. (1994) 996). Il est également possible d'incuber les cellules dendritiques avec un éluat peptidique acide d'une cellule tumorale selon la méthodologie décrite par Zitvogel et al. (1996, précitée). - la mise en contact des cellules dendritiques avec un ou plusieurs antigènes ("antigen pulsing"). Cette approche consiste à incuber les cellules dendritiques non pas avec un ou plusieurs peptides antigéniques, mais avec le ou les antigènes intacts. L'intérêt de cette technique réside dans le fait que l'antigène va être transformé en peptides antigéniques par les mécanismes naturels de la cellule dendritique, de sorte que les peptides antigéniques résultant et présentés par la cellule dendritique devraient procurer une meilleure immunogénicité. Cette approche a été illustrée par exemple par Inaba et al. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631) ou par Hsu et al., (Nature Medicine 2 (1996) 52). - la mise en contact des cellules dendritiques avec un ou plusieurs complexes protéiques antigéniques. Cette approche est similaire à la précédente mais peut permettre d'améliorer l'efficacité de transformation et/ou de 19 2775692 présentation de l'antigène. En particulier, I'antigène peut être utilisé sous forme soluble ou complexée à des éléments de ciblage, permettant notamment de cibler des récepteurs membranaires comme les récepteurs du mannose ou les récepteurs d'immunoglobulines (RFc) (complexes immuns). Il est également possible de rendre l'antigène particulaire de manière à améliorer sa pénétration ou encore sa phagocytose par les cellules. - la mise en contact des cellules dendritiques avec des cellules (fusion hybridome-like) ou des membranes, lysats ou sonicats de cellules exprimant des antigènes ou peptides antigéniques. Cette technique repose sur le transfert io direct d'antigènes ou peptides antigéniques par fusion de cellules ou de membranes cellulaires. Cette approche a été illustrée par exemple par la fusion entre des cellules dendritiques et des membranes de cellules tumorales (Zou et ai., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992)1, et Gilboa, précitée). - la mise en contact des cellules dendritiques avec des vésicules membranaires contenant des antigènes ou peptides antigéniques (notamment des exosomes de cellules tumorales tels que décrits ci-avant). Cette approche de sensibilisation des cellules dendritiques utilisant des exosomes, telle que mise en évidence dans la présente invention, est particulièrement avantageuse dans la mesure o elle ne nécessite pas la connaissance des antigènes particuliers et o les peptides antigéniques chargés sont dans une conformation native. Cette technologie est illustrée dans les exemples. - la mise en contact des cellules dendritiques avec des liposomes contenant des antigènes ou peptides antigéniques (Nair et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 609). - la mise en contact des cellules dendritiques avec des ARNs codant pour des antigènes ou peptides antigéniques, (voir Boczkowsky et al., 1996, précité). - la mise en contact des cellules dendritiques avec des ADNs codant pour des antigènes ou peptides antigéniques ou des séquences d'acides nucléiques couplées à des antigènes protéiques (éventuellement incorporés dans des vecteurs de type plasmidique, viral ou chimique). Ainsi, un mode de sensibilisation des cellules dendritiques consiste par exemple à infecter les 2775692 cellules dendritiques avec un virus contre lequel une protection est recherchée. Ceci a été décrit par exemple pour le virus de l'lnfluenza (Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994) 797; Macatonia et al., précitée). Une autre approche consiste à délivrer, au moyen d'un virus ou d'autres vecteurs de transfert d'acides nucléiques, un ADN codant pour le ou les antigènes ou peptides antigéniques d'intérêt. Une telle approche a été illustrée par exemple par Arthur et ai. (Cancer Gene Therapy, 1995) ou par Alijagie et al. (Eur. J. Immunol. 25 (1995) 3100). Certains virus tels les adénovirus, les AAV ou les rétrovirus semblent pouvoir être utilisés à cet effet, pour délivrer un acide nucléique dans une cellule dendritique. L'invention concerne également l'utilisation des procédés, cellules et compositions décrits ci-avant, en particulier dans les domaines de l'immunologie, l'immunothérapie ou de la Biotechnologie médicale. Comme indiqué ci-avant, i5 ces utilisations sont multiples, à la fois in vitro et in vivo, pour contrôler l'activité des cellules NK. Des telles applications sont notamment le traitement de différentes pathologies telles que les cancers ou les maladies infectieuses, notamment virales ou à d'autres pathogènes. Les procédés, cellules et compositions de l'invention sont en particulier utilisables pour retarder la croissance, voire supprimer des tumeurs (en particulier des tumeurs exprimant faiblement des molécules de classe I du CMH) ou d'autres cellules pathologiques. Pour ce type d'applications, comme indiqué ci-avant, les compositions cellulaires (cellules NK activées, cocultures NK/DC ou cellules dendritiques) peuvent être administrées de manière loco-régionale, de préférence par injection sous-cutanée ou systémique. Les doses de cellules sont indiquées ci- avant ainsi que dans la partie expérimentale qui suit. L'invention est également utilisable in vitro pour le traitement de préparations cellulaires, notamment pour la destruction de cellules sensibles aux cellules NK. L'invention peut également être utilisée en combinaison ou comme adjuvant des immunisations basées sur le développement d'une activité lymphocytaire T cytotoxique spécifique d'antigène. L'invention concerne en outre l'utilisation de 21 2775692 cellules dendritiques ou d'un facteur membranaire de cellules dendritiques pour augmenter la survie de populations Iymphocytaires NK, in vitro, ex vivo ou in vivo, ainsi que pour augmenter, le cas échéant, la prolifération de sous- populations lymphocytaires NK. L'invention concerne en outre l'utilisation de cellules NK ou d'un facteur membranaire de cellules NK pour augmenter la survie de cellules dendritiques matures, in vitro, ex vivo ou in vivo, D'autres avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES FIGURE 1: Les cellules dendritiques immatures stimulent l'activité NK in vitro. Les cellules dendritiques autologues immatures dérivant de la moelle de souris BALB/c, c'est-à-dire cultivées en GM-CSF et interleukine-4, ont été co- incubées pendant une période de 40 à 72 heures à la concentration de 1 million de cellules par ml en puits à fond rond, dans des plaques de 96 puits, avec des cellules spléniques (dont 10-30% sont des NK) au repos, provenant de la rate des souris syngénique SCID BALB/c à la même concentration. La cytotoxicité contre les cellules cibles YAC et P815 ainsi que le relargage d'interféron y par les cellules NK sont déterminés comme décrit dans les Matériels et Méthodes. FIGURE 2: les cellules dendritiques matures stimulent directement I'activité NK in vitro. (a) Les cellules dendritiques d'origine splénique (dérivées de rate d'animaux C57BL/6) matures stimulent de manière très prononcée l'activité cytolytique des cellules NK. Les cellules dendritiques incubées pendant 24 heures dans un milieu contenant du TNFa ont été co- cultivées avec des cellules mononucléées non-adhérentes de la rate provenant de souris B6-Rag-/- ou de souris SCID dans un rapport 1:1 pendant 40 à 48 heures. Les lymphocytes 22 2775692 viables ont été testés contre les cellules YAC-1 dans un test de relargage du chrome 51 pendant 4 heures. Les résultats sont exprimés par le pourcentage de lyse spécifique à différents rapports cellules effectrices/cellules cibles. Ces expériences ont été réalisées 5 fois avec des résultats similaires. (b) Les cellules dendritiques d'origine splénique matures stimulent la production d'interféron y par les cellules NK. Les surnageants de cellules dendritiques ou de cellules NK syngéniques ou allogéniques cultivées séparément ou ensemble à différents rapports de concentration, ont été collectés au temps 48 à 72 heures et testés pour la présence d'interféron y murin io par ELISA. A noter sur cette figure que les rapports NK: CD correspondent en fait aux rapports cellules spléniques d'animaux déplétés en T/B/Mac (contenant -30% NK purs): CD. Aucune trace d'interféron y n'a été détectée dans le surnageant de cellules NK ou de cellules dendritiques cultivées séparément comme contrôles. FIGURE 3: L'activation implique un contact cellule NK:cellule dendritique. Etude de la lyse spécifique de cellules cibles (YAC-1) induite par des cellules NK activées in vitro par une lignée de cellules dendritiques, soit par coculture (triangles pleins), soit dans un système "Transwells" dans lequel les deux populations cellulaires sont séparées physiquement par une membrane poreuse (triangles vides) et sont à distance les unes des autres de l mm. Les contrôles sont représentés par les cellules NK et dendritiques cultivées séparément. FIGURE 4: L'administration de FL dans les souris Nude B6 portant une tumeur AK7 induit une suppression significative de la croissance tumorale. pg de FL ont été administrés quotidiennement pendant 20 jours à des souris B6-nude portant une tumeur établie au jour 20 du mésothéliome AK7. La croissance tumorale a été contrôlée 2 fois par semaine pendant 60 jours. Les tailles moyennes des tumeurs pour des groupes de 5 souris sont représentées sur la figure avec l'écart-type. Cette expérience a été répétée quatre fois avec 23 2775692 une suppression de la croissance tumorale similaire. Des résultats similaires ont été obtenus dans les souris Rag2 B6-/-. FIGURE 5: Les effets anti-tumoraux induits par FL sont dépendants des cellules NK. (a) Le composé FL n'a aucun effet dans les souris B6-beige. 10 pg de FL ont été administrés quotidiennement pendant 20 jours dans des souris B6-beige portant une tumeur AK7 établie de jour 20. La croissance tumorale a été contrôlée deux fois par semaine pendant 50 jours. La taille moyenne des io tumeurs pour des groupes de 5 souris est représentée sur la figure avec l'écart type. Cette expérience a été répétée deux fois avec des résultats identiques. (b) La co-administration d'anticorps monoclonal neutralisant anti-NK1.1 en même temps que FL inhibe l'effet anti-tumoral de FL. 300 pg par souris d'anticorps anti-NK1.1 ont été co-administrés quotidiennement à des souris immunocompétentes B6 portant une tumeur établie de 20 jours en même temps que le composé FL. Les groupes de souris traitées par un tampon phosphate PBS présentaient une cinétique de croissance tumorale similaire dans les souris beiges et dans les souris Nude. (*) représente des tumeurs significativement plus grosses dans les groupes de souris déplétées par NK1.1 en comparaison avec les animaux traités par FL seulement. Cette expérience a été reproduite 2 fois avec des données identiques. FIGURE 6: La thérapie par FL s'accompagne d'une activité NK augmentée dans les rates de souris B6. Les splénocytes de souris sans tumeur ou porteuses d'une tumeur AK7 ont été préparés après 20 jours de traitement en tampon phosphate (PBS) ou FL, et utilisés comme cellules effectrices dans un test de relargage du chrome utilisant les cellules YAC-1 comme cellules-cibles. Les résultats sont exprimés par le pourcentage de lyse spécifique à différents rapports effecteurs: cibles. Chaque groupe comprend 3 souris. 24 2775692 FIGURE 7: Rôle des cellules dendritiques lymphoïdes, de l'interaction B7/CD28 et des cytokines associées à la différenciation Thl dans l'effet anti- tumoral dépendant des cellules NK induit par FL. (a) Expériences de déplétion in vivo en utilisant des anticorps anti- CD8c ou anti-CD4 dans des souris B6-nude. Les souris B6 nude porteuses de tumeurs ont été traitées avec FL seul ou associé avec des anticorps anti-CD8oa ou anti- CD4 selon le protocole décrit dans les Matériels et Méthodes. La taille des tumeurs a été déterminée deux fois par semaine pour des groupes de 5 animaux. (*) représente des tumeurs de taille significativement plus petite dans io les groupes de souris injectées avec le FL et non déplétées comparés avec les animaux traités par l'anticorps anti-CD8a. Ces données ont été reproduites deux fois avec des résultats similaires. (b) Co-administration de CTLA41g in vivo. Des expériences similaires ont été réalisées avec l'anticorps de souris CTLA41g tel que décrit dans les Matériels et Méthodes. (*) représente des tumeurs de taille significativement supérieures dans le groupe des animaux traités par CTLA41g en comparaison avec les animaux traités par FL uniquement. Ces données ont été reproduites deux fois avec des résultats similaires. (c) Co-administration d'anticorps monoclonal anti-p40 - mlL-12 in vivo. Des expériences similaires ont été réalisées avec l'anticorps anti-p40 mlL-12 tel que décrit dans les Matériels et Méthodes. Aucun blocage significatif de l'activité antitumorale n'a été observé. Ces données ont été reproduites deux fois avec des résultats similaires. (d) Co-administration d 'anticorps monoclonal anti-IFN-y in vivo. Des expériences similaires ont été réalisées avec un anticorps anti-IFN-y. (*) représente des tumeurs d'une taille significativement supérieure dans les groupes traités par anticorps anti-lFN-y par comparaison avec des animaux traités par FL seul. Ces données ont été reproduites deux fois avec des résultats similaires. 2775692 FIGURE 8: Transfert adoptif de cellules dendritiques d'origine splénique dans des souris B6-nude portant des tumeurs AK7: effets antitumoraux prophylactiques et thérapeutiques. 8a: De 2 à 5 millions de cellules dendritiques immatures ont été injectées par voie sous-cutanée intratumorale directe dans des souris B6 nude porteuses de tumeurs AK7 au jour 1 (en prophylaxie). Les injections ont été réalisées deux fois par semaine pendant 15 jours. La croissance tumorale a été contrôlée et comparée avec un groupe d'animaux traités par PBS (cinq souris par groupe) selon le test t-student. Les résultats significatifs à 95% sont indiqués io par une (*). 8b: Idem mais les cellules dendritiques ont été injectees dans des tumeurs AK7 établies depuis 20 jours (en thérapeutique). MATERIELS ET METHODES 1. ANIMAUX Les souris femelles C57-BL/6 (B6) et BALB/c scid/scid (SCID) ont étéobtenues du Centre d'Elevage Janvier (Le Genest St-lsle, France). Les souris femelles C571BL/6-bg/bg (B6-beige) ont été achetées chez Harlan UK Limited (Oxon, Angleterre). Les souris femelles C57-BL/6-B6-nude (B6-nude) ont été obtenues du Centre de Recherche et d'Elevage Mollegaard A/S (Skensved, Danemark). Les souris femelles et mâles C57BL/6 Rag2-/(B6-Rag-/-) ont été achetées auprès du Centre de Développement des Techniques avancées du Centre National de la Recherche Scientifique (Orleans, France). Les souris * SCID beige et B6-nude ont été maintenues dans des conditions sans pathogène. Les souris ont été regroupées par âge (8 à 10 semaines) au début de chaque expérience. 2. CULTURES CELLULAIRES Les cellules AK7, fournies par A. Kane (Brown University, Providence, Rhode Island), sont une lignée de mésotheliome murin générée par injection intra-péritonéale de fibre d'asbestos crocidolite dans les souris B6. Cette lignée 26 2775692 cellulaire a été maintenue en milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum bovin-foetal inactive par traitement à la chaleur, 1.0 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 100 UI/ml de penicilline, et 100 pg/ml de streptomycine. Les lignées de cellules tumorales ont été maintenues in vitro, pour une période n'excédant pas un mois avant les expériences in vivo. Les lignées de cellules dendritiques murines sont maintenues dans un milieu IMDM contenant 10% de sérum bovin foetal inactive, 2 mM de L-glutamine, 50 pM de 2-13ME, 100 UI/ml de pénicilline, et 100 pg/ml de streptomycine (Milieu IMDM). Pour induire la maturation des cellules, du TNF-- de souris recombinant (R&D Systems, io Abingdon, UK) est ajouté à une concentration de 10 ng/ml pour 24 heures. La maturation peut également être induite par incubation des cellules en présence de LPS (1-10 pg/ml). La lignée de cellules YAC-1 est une lignée de lymphome dans un contexte A/Sn très sensible aux cellules NK. Les cellules P815 sont des cellules de mastocytome en contexte DBA/2 résistantes aux cellules NK. Tous is les milieux de cultures et réactifs ont été obtenus de GIBCO BRL (Life Technologies, Merelbeke, Belgique). 3. GÉNÉRATION ET CULTURES DE CELLULES DENDRITIQUES DÉRIVÉES DE MOELLE OSSEUSE. Les cellules dendritiques murines proviennent de la différentiation de cellules précurseurs de la moelle osseuse cultivées en présence de GM- CSF et IL-4 pendant 6 jours dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, de la L-glutamine, des acides aminés essentiels, de la pénicilline, de la streptomycine et du 3-2ME. Ces cellules ont été obtenues selon un protocole décrit par Mayordomo et ai (1996). Brièvement, la moelle osseuse est extraite de tibias et de fémurs, déplétée en lymphocytes et macrophages, et étalée sur des plaques de cultures 24 puits (0,25.106 cellules/ml) dans le milieu RPMI 1640 défini ci-dessus supplémenté avec rm IL-4 et rm GM-CSF (1000 UI/ml de chaque). Au jour 3, les cellules non ou peu adhérentes sont récoltées et étalées sur des plaques de cultures 24-puits (0,3.106 cellules/ml) pour 3 jours de culture supplémentaires avec le même milieu neuf. Les cellules dendritiques ainsi obtenues ont le phénotype attendu. Les cellules dendritiques ainsi 27 2775692 obtenues, sont des cellules immatures. Elles peuvent être induites pour la maturation en culture combinant l'interleukine-4 et le GM-CSF avec le TNF(10 ng/ml) et/ou le LPS (1-10 pg/ml). Les cellules sont utilisées à 24/48 heures après le stimulus de maturation pour la co-culture. Des cellules dendritiques autologues et allogéniques ont été utilisées pour la co-culture avec la même efficacité. En outre, les cellules dendritiques matures et immatures peuvent également être utilisées indifféremment. 4. GÉNÉRATION DES CELLULES NK Les cellules NK sont obtenues à l'état de repos à partir des rates de io souris SCID ou Rag2 -/- après une étape d'adhérence plastique pendant 2 à 3 heures à 37 C. Brièvement, les rates de souris B6-Rag-/- ou de souris SCID ont été dissociées en milieu complet RPMI 1640 tel que défini ci-avant pour générer des cultures de cellules en suspension. Après lyse des érythrocytes, les cellules ont été lavées une fois et étalées (2,5.106 cellules/ml) pendant 2 à 3 heures à 37 C. Ensuite, les cellules non-adhérentes ont été récoltées et comptées. Ces cellules sont composées essentiellement de cellules NK au repos. 5. CO-CULTURE NK/DC Pour les co-cultures, les cellules dendritiques immatures ou matures, autologues ou allogéniques, ont été récoltées, lavées 3 fois et ajoutées dans différents rapports de concentration à des cellules NK au repos, fraîchement isolées (1.106 cellules NK/ml) dans des plaques 96 puits à fond en U. Les cellules incubées individuellement (cellules dendritiques ou cellules NK) sont étalées à des concentrations similaires en tant que contrôles. 6. TEST DE SÉCRÉTION D'INTERFÉRON y Les surnageants de co- cultures cellules dendritiques/cellules NK sont collectés et le cas échéant congelés à -70 C. Les essais de dosage du relargage d'interféron y sont effectués en utilisant des Kits ELISA commerciaux (Genzyme Corp. Cambridge, Etats-Unis). La sensibilité de détection des tests utilisés est proche de 5 pg/ml. Des effets de doses sont réalisés consistant à faire varier le ratio cellules dendritiques sur cellules NK. 28 2775692 7. TEST DE CYTOTOXICITE DES CELLULES NK. La cytotoxicité in vitro des cellules NK est évaluée selon les méthodes classiques du relargage du chrome 51 des cibles marquées NK sensibles (YAC- 1) ou NK résistantes (P815). Plus précisément, les cellules de co-cultures NK/CD ou de cultures séparées incubées pendant 40 à 72 heures, ont été collectées, marquées au Bleu Trypan pour exclure les lymphocytes et les cellules dendritiques, et comptées et utilisées comme cellules effectrices dans un test de cytotoxicité utilisant les cellules YAC-1 et P815 comme cellules-cibles. Les cellules-cibles o10 ont été pré-incubées pendant I à 2 heures à 37 avec du Na5'CrO4 (100 pCi/106 cellules; New England Nuclear) lavées une fois, incubées dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 5% de sérum bovin foetal inactivé, pendant 1/2 heure à 37 C. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois et étalées à 2.103 cellules par puits, dans des plaques de microtitration 96 puits ayant un fond en V. Les cellules effectrices et cibles ont été mélangées à différents rapports effecteurs/cibles dans un volume total de 0,2 ml et incubées pendant 4 heures à 37 C. Le degré de lyse des cellules cibles a été mesuré en comptant 0.1 ml de surnageant transféré dans une plaque Luma. Le relargage spontané a été déterminé à partir de puits contenant des cellules cibles marquées seules et le relargage maximum de chrome 51 a été déterminé par addition de 2% de cétrimide. La cytotoxicité spécifique a été calculée comme suit: pourcentage du relargage du chrome 51 = x (coût cpm expérimentaux - coût du relargage spontané) / (coût cpm du relargage maximum - coût cpm du relargage spontané). Pour les tests in vivo, les rates de 2 ou 3 souris porteuses de cellules AK7 ou dépourvues de tumeurs ont été prélevées après 20 jours de traitement avec le composé FL ou par un tampon phosphate (PBS). Des suspensions de cellules de splénocytes déplétées en érythrocytes par lyse osmotique ont été utilisées immédiatement comme cellules effectrices dans un test de cytotoxicité en utilisant les cellules YAC-1 et P815 comme cibles tel que décrit cidessus. 8. TRAITEMENT IN VIVO DE SOURIS PAR LE COMPOSE FL. 29 2775692 Des souris sont inoculées par voie intradermique dans le flanc droit avec la dose tumorigène minimum de cellules AK7 (3.106 cellules) dans un volume de 0,1 ml de PBS. Le composé FL dérivé de cellules CHO a été fourni par Immunex Corp. (Seattle, USA, Lynch et al., Nature Medecine 3: 625, 1997). Cette cytokine a été utilisée sous forme diluée dans du PBS à 100 pg par ml. Des tumeurs AK7 établies au jour 20 (environ 20 mm2 de diamètre) ont été traitées par une injection journalière unique (injection sous-cutanée dans le flanc gauche) soit de FL soit de PBS (10pg) dans un volume total de 0,1 ml pendant jours consécutifs. Les souris ont été contrôlées pour la croissance tumorale 2 io fois par semaine et la taille moyenne des tumeurs a été illustrée en mesurant deux diamètres perpendiculaires en millimètres en utilisant un pied à coulisse. Les taux de croissance tumorale ont été déterminés en rapportant la taille des tumeurs (mm2) par rapport au temps après le jour 1 de traitement par FL. Toutes les études ont été réalisées au moins 4 fois avec des groupes de 5 animaux. 9. EXPERIENCES DE DEPLETION PAR ANTICORPS IN VIVO. Les anticorps anti-CD8ct (clone YTS 191.1.2, IgG2a de rat), anti-CD4 (clone YTS 169.4.2.1, IgG2a de rat) et anti-NK1.1 (clone PK136, IgG2 de souris) ont été utilisés dans les expériences de déplétion. Les hybridomes ont été cultivés dans des souris athymiques et les fluides ascitiques ont été récoltés et purifiés selon les techniques décrites précédemment par précipitation à l'acide caprylique puis au sulfate d'ammonium, dialysés contre du PBS, puis ajustés à 1 mg/ml (McKinney, 1987). Sauf contre-indication dans les légendes des figures, la déplétion est commencée au jour 1 du traitement par FL des souris B6, 200 à 300 pg d'anticorps monoclonal sont injectés par voie intra- péritoneale pendant 3 jours consécutifs, puis tous les deux jours pendant le traitement FL. Après le traitement FL, les anticorps monoclonaux sont administrés 2 fois à 4 jours d'intervalle. Des expériences réalisées en parallèle par cytométrie de flux aux moyens d'anticorps fluorescents ont permis de confirmer que les déplétions observées sont supérieures à 99% pour les sous-populations cellulaires ciblées, au jour 9 et au jour 20 du traitement FL. Pour les expériences de blocage de B7, 2775692 les souris ont été injectées par voie intra-péritonéale avec 200pg de protéine de fusion de souris CTLA41g (fournie par L. Adorini, Hoffman La Roche, Italie) à 2 jours d'intervalle entre le jour 10 et le jour 18 du traitement FL. Pour les études de neutralisation de l'IL-12 endogène, I'anticorps purifié anti-p40 IL- 12 (clone C- 17-8, IgG2a de rat), a été injecté par voie intrapéritonéale à des doses individuelles de 300 pg à 3 jours d'intervalle entre le jour 5 et le jour 17 du traitement FL. Pour les études de neutralisation de l'interféron y endogène, 300 pg d'anticorps anti-interféron y (IgG de hamster) ont été injectés par souris par voie intra-péritonéale aux jours 10, 15 et 20 de l'administration de FL. Toutes les o expériences ont été réalisées avec 5 souris par groupe et au moins deux fois. 10. TRANSFERT ADOPTIF DE CELLULES DENDRITIQUES DANS LES SOURIS. Des souris B6-nude ou SCID portant une tumeur AK7 au jour 1 ou au jour ont été injectées par voie intratumorale sous-cutanée deux fois par semaine, avec 2 à 5.106 cellules dendritiques immatures pendant deux semaines. Cinq souris par groupe ont été traitées. La croissance tumorale a été contrôlée comme décrit précédemment. 1. ANALYSES STATISTIQUES DES DONNEES. La méthode exacte de Fisher a été utilisée pour interpréter le caractère significatif des différences entre les différents groupes expérimentaux (présentés comme une moyenne avec écart type). Pour interpréter des expériences de transfert passif de cellules dendritiques, 2 groupes ont été comparés en utilisant le t-test de Student. Le caractère significatif à 95% des résultats est représenté pour chaque expérience individuelle. EXEMPLES Les résultats présentés dans les exemples qui suivent démontrent en particulier: 1) que la coculture de cellules dendritiques et de cellules NK purifiées entraîne la survie des cellules dendritiques matures et des cellules NK et 31 2775692 l'activation rapide des cellules NK, en d'autres termes que la cellule dendritique, à défaut de toute autre connue, peut permettre de rendre une cellule NK fortement tueuse et sécrétrice d'IFNy contre ses cibles naturelles NK sensibles, sans addition de cytokines et sans mise en évidence de taux détectables de sécrétion d'lL-2, IL-12 dans ces cocultures; 2) que le transfert adoptif de cellules dendritiques ou bien l'expansion directe in vivo des cellules dendritiques entraîne des effets antitumoraux importants dus à l'activation des NK. EXEMPLE 1: Les cellules dendritiques stimulent l'activité cytolytique et la production d'interféron y par les cellules NK in vitro. Cet exemple illustre les propriétés des cellules dendritiques à différents stades de différentiation d'activer les cellules NK au repos in vitro. L'activité cytotoxique, la production d'interféron y et la prolifération ont été testées. Dans une série d'expériences, des cellules dendritiques fraichement dérivées de moelle osseuse syngénique ont été cultivées en présence d'interleukine-4 et de GM-CSF et maintenues à l'état immature (voir matériels et méthodes). Les cellules dendritiques immatures ont été collectées, lavées de manière intensive et co-incubées dans un rapport initial 1:1 environ avec des cellules mononucléées non-adhérentes obtenues à partir de splénocytes fraîchement récoltés chez des souris SCID BALB/c syngéniques, dans du milieu complet en l'absence de cytokine. Le tiers de ces splénocytes non-adhérents sont marqués positivement avec l'anticorps monoclonal Dx5 ou avec l'anticorps monoclonal anti-NK1. 1. Après co-culture pendant 40 à 72 heures, les cellules NK sont comptées et testées dans un essai de cytotoxicité par mesure du relargage du chrome 51 pendant 4 heures contre des cellules YAC-1 et P815 à différents ratios effecteur/cible. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 1 et montrent que ces cellules dendritiques induisent l'activation de l'activité cytolytique des cellules NK. En particulier, ces résultats montrent: 32 2775692 - que la co-culture des deux types cellulaires permet de récolter des cellules NK viables, et - que lorsque les cellules NK et les cellules dendritiques sont co-incubées à un ratio de 0,1 à 0,3:1, une lyse spécifique de 20 à 50 % des cellules YAC-1 est obtenue à un rapport cellules effectrices /cellules cibles de 25 à 100:1. Les cellules P815, qui sont NK insensibles, ne sont pas lysees dans les conditions testées et aucune des deux populations cellulaires (cellules NK et cellules dendritiques) cultivées séparément à des concentrations similaires n'induit de lyse significative des cellules YAC-1 (Figure 2). io Dans une autre série d'expériences, une lignée de cellules dendritiques de rate à été utilisée. Cette lignée à été maintenue dans des conditions de cultures permettant une croissance à long terme de cellules au stade immature. Cette lignée a ensuite été induite à maturation en présence de TNFo ou de LPS pendant 24 heures. Les cellules maturées présentent des changements i5 morphologiques importants comme décrits précédemment par Winzler et al. Les agrégats ne sont plus adhérents et des analyses par FACS font apparaître une expression importante des molécules CD11c, I-Ab, B7.2, et CD40. Ces cellules dendritiques matures ont été testées dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus, par coincubation pendant 40 à 48 heures avec des cellules NK au repos fraîchement récoltées chez des souris B6-Rag-/- à différents ratios. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 2. Ces résultats montrent que: - la co-culture des deux types cellulaires permet de récolter des cellules NK viables dans les puits de manière significativement supérieure que dans une culture de cellules NK séparée (10 à 30 % vs 2 à 5 %). - lorsque les cellules NK et les cellules dendritiques sont co-incubées à un ratio de 0,1 à 0,3:1, une lyse spécifique de 40 à 60 % des cellules YAC-1 est obtenue à un rapport cellules cibles/cellules effectrices de 25:1. Les cellules P815 qui sont NK insensibles, n'ont pas été lysées dans toutes les conditions testées. Aucune des deux populations cellulaires (cellules NK et cellules dendritiques) cultivées séparément dans du milieu de culture à des 33 2775692 concentrations similaires n'a induit une lyse significative des cellules YAC-1 (Figure 2a). Les résultats obtenus montrent également que le surnageant de co- culture NK-DC contient des niveaux significatifs d'interféron y qui diminuent en fonction du nombre de cellules dendritiques stimulantes (figure 2b). En revanche, I'interféron y n'était pas détectable dans le surnageant de cellules dendritiques ou de cellules NK cultivées séparément. Aucune prolifération significative n'a été observée dans ces conditions de co-culture ainsi que déterminé par l'incorporation de thymidine après une co-culture de 40 à 70 io heures. Ces résultats illustrent donc la capacité des cellules dendritiques immatures et matures à stimuler l'activité des cellules NK à la fois pour la production d'interféron y et pour l'activité de lyse spécifique. De manière similaire aux expériences précédentes, il a également été i5 démontré que les cellules dendritiques allogéniques étaient capables de stimuler l'activation de cellules NK. Brièvement, des splénocytes allogéniques non- adhérents de souris SCID BALB/c ont été activés par co-culture de 40 à 48 heures en présence de cellules dendritiques matures à un ratio NK:DC de 0,1 à 0,3:1. Les résultats sont présentés sur la figure 2a et 2b et montrent que ces cellules dendritiques allogéniques activent à la fois les propriétés lytiques des cellules NK et la production d'interféron y. L'ensemble de ces résultats montre clairement que les cellules dendritiques matures ou immatures, autologues ou allogéniques, qu'il s'agissent de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse ou de rate ou de lignées établies de cellules dendritiques, sont capables d'activer par co-culture l'activité lytique des cellules NK ainsi que la production d'interféron y par les cellules NK. EXEMPLE 2: La stimulation des cellules NK par les cellules dendritiques implique un contact cellulaire direct. Les cellules dendritiques matures sont connues pour sécréter différentes cytokines telles que 'IL-12, I'IL-15, I'lFNcoJ3 ou TNFa qui pourraient être 34 2775692 responsables de l'activation des cellules NK. Un système de culture "Transwell" a été utilisé pour déterminer l'implication possible de facteurs solubles dans l'activation des cellules NK par les cellules dendritiques. Les résultats présentés sur la figure 3 montrent que l'activité cytolytique et la production d'interféron y par les cellules NK en réponse aux cellules dendritiques n'est détectée que dans le cas o les cellules NK sont co-incubées en contact avec les cellules dendritiques mais pas lorsque les cellules sont séparées par une membrane poreuse. Ces résultats montrent donc que l'activation des cellules NK par les cellules dendritiques requiert un contact ou une interaction directe 0o cellules/cellules, et que cette activation implique un facteur de co-stimulation, présent dans la membrane des cellules dendritiques. EXEMPLE 3: L'expansion de cellules sanguines blanches de la lignée dendritique par le composé FL s'accompagne de la régression d'une tumeur établie de classe 1 négative dans les souris B6-nude ou dans les Rag2 B6 -/-. Les cellules AK7 représentent une lignée de mésothéliome syngénique de souris B6 faiblement immunogéniques qui infiltrent spontanément la cavité péritonéale après établissement prolongé dans le flanc abdominal. La tumeur AK7 ainsi obtenue exprime des niveaux très faibles de molécules de classe I in vitro. Le traitement par le composé FL de tumeurs AK7 établies au jour 20 dans les souris B6-nude induit une suppression transitoire de la croissance tumorale et finalement un retard de croissance significatif in vivo (voir figure 4). Le composé FL n'exerce en revanche aucun effet cytotoxique direct sur les cellules AK7 in vitro. Ces effets anti-tumoraux in vivo commencent à être observés au jour 10 du traitement par FL lorsqu'une splénomégalie et adénomégalie, attribuable à l'expansion des cellules sanguines blanches de la lignée dendritique, ont été observées. Les cinétiques de croissance tumorale reprennent un rythme normal 5 à jours après arrêt du traitement FL, lorsque le nombre des cellules dendritiques décroît. Les effets anti-tumoraux induits par FL observés dans les souris B6-nude ou Rag2 B6 -1- ont été aussi prononcés que ceux rapportés dans 2775692 les souris immunocompétentes (figures 5b), soulignant que ni les cellules T, ni les cellules B ne sont impliquées dans le retard de croissance tumorale. Ces résultats démontrent donc que l'administration d'un facteur de croissance des cellules dendritiques induit une régression de tumeurs de classe I négative. Ces résultats montrent en outre que cet effet n'est pas dû à l'activité de cellules T ou B. EXEMPLE 4: Les effets anti- tumoraux médiés par le composé FL ne sont pas observés dans les souris beige et sont bloqués par l'administration d'un o anticorps monoclonal anti-NK1.1 dans des souris immunocompétentes porteuses de la tumeur. De manière à déterminer plus précisément les mécanismes des effets antitumoraux induits par FL, des souris B6-beige portant la tumeur AK7 ont été traitées par FL selon un régime thérapeutique similaire. Les souris B6-beige présentent des mésothéliomes qui grossissent progressivement jusqu'à entrainer la mort, malgré une administration de FL (Figure 5a). De manière à déterminer plus précisément l'implication des cellules NK dans l'activité tumoricide induite par FL, des souris B6immunocompétentes ont été déplétées en utilisant des anticorps monoclonaux anti-NK1.1. Comme le montrent les résultats présentés sur la figure 5b, cette déplétion est nécessaire et suffisante pour annuler complètement les effets anti-tumoraux induits par FL. En conséquence, ces résultats montrent que les cellules NK jouent un rôle critique nécessaire et suffisant dans l'efficacité du composé FL comme agent anti-tumoral. EXEMPLE 5: Le composé FL augmente de manière significative l'activité NK splénique in vivo. Cet exemple illustre la capacité du composé FL à augmenter l'activité des cellules NK in vivo. Le nombre absolu de cellules NK marquées positivement avec l'anticorps monoclonal anti-NK1.1 par analyse FACS dans les splénocytes et les cellules mononucléées des ganglions lymphatiques étaient légèrement 36 2775692 augmenté de 3 à 5 fois dans les souris présentant les tumeurs et dans les souris sans tumeur. Les splénocytes récoltés au jour 20 de souris B6 traitées par le composé FL ou par une solution saline, chez des souris présentant ou ne présentant pas de tumeurs AK7, ont été testés pour l'activité cytolytique spontanée contre des cellules YAC-1 in vitro dans un essai de relargage du chrome 51 sur une période de 4 heures. Une augmentation significative de l'activité NK mais pas de la production d'interféron y a été montrée dans différentes expériences réalisées à la fois avec des souris nude ou immunocompétentes, sans effet significatif attribuable à la présence de la tumeur io elle-même (figure 6). Aucune lyse n'a été observée contre des cellules P815. En outre, les niveaux de cytokine pour l'interféron y et le TNFa dans le sérum ou les surnageants de culture de cellules mononucléées de ganglions lymphatiques de la rate n'étaient pas statistiquement différents dans toutes les conditions testées et aucun niveau détectable n'a été observé pour l'IL-13 et l'IL12. Ces résultats montrent donc que le traitement par le composé FL est associé à une augmentation de l'activité NK dans la rate in vivo. EXEMPLE 6: La déplétion de souris Nude par administration d'anticorps monoclonal anti-CD8c ou de CTLA4-lg bloque de manière significative les effets anti-tumoraux dépendant des cellules NK. Cet exemple décrit le rôle des sous-populations de cellules dendritiques myéloïdes ou lymphoïdes induites par le composé FL dans l'augmentation périphérique de l'activité NK cytolytique et dans les effets antitumoraux NK dépendants. Puisque les cellules dendritiques lymphoïdes ont été décrites comme sécrétant de l'IL-12 en réponse à une stimulation SAC+IFNy in vitro et dans la mesure o l'IL-12 est un facteur de stimulation des cellules NK, une déplétion sélective des cellules dendritiques lymphoïdes CD8ac positives (DEC205+) en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD8ax a été entreprise dans les souris B6-nude. L'injection de l'anticorps monoclonal déplétant a été débutée aussitôt que des cellules dendritiques différenciees en présence de FL (jour 0 FL) apparaissent et poursuivie pendant jusqu'à 10 jours après l'arrêt du 37 2775692 traitement FL à hautes doses. La molécule CD8ct n'est pas exprimée sur les cellules NK de souris dans les souris B6-nude, ce qui rend de ce fait la déplétion ciblée vers les sous-populations de cellules dendritiques lymphoïdes. Des souris porteuses de tumeurs AK7 déplétées avec l'anticorps monoclonal anti-CD8(c répondent significativement moins au traitement FL que des souris contrôles non déplétées ou des souris injectées avec un anticorps anti-CD4 (figure 7a). Cependant, le composé FL demeure efficace dans les souris ayant reçu FL et déplétées pour les cellules CD8a positives en comparaison avec les animaux non traités par le composé FL, soulignant que les cellules dendritiques lymphoïdes sont seulement partiellement impliquées dans des effets anti- tumoraux dépendant des cellules NK. La petite population de cellules dendritiques myéloïdes exprimant le marqueur CD4 ne semble pas participer à ces effets anti-tumoraux (figure 7a). Pour confirmer encore le rôle critique des cellules dendritiques dans les effets anti-tumoraux dépendant des cellules NK, des molécules de co-stimulation B7 qui sont connues pour être impliquées dans la phase effectrice de la reconnaissance par les cellules NK, ont été ciblées en utilisant une injection systémique de la protéine de fusion murine CTLA4lg. Durant la période complète d'administration de CTLA4-lg, une perte statistiquement significative d'efficacité de FL sur la suppression de la croissance tumorale a été observée (figure 7b). Au contraire, une injection d'lgG humaine dans l'expérience contrôle n'a pas altéré l'efficacité de FL in vivo. Il faut souligner que la tumeur AK7 n'exprime pas les molécules B7 in vitro. Dans l'ensemble, ces données montrent que les cellules B7 positives et/ou les cellules dendritiques sont essentielles dans les effets anti-tumoraux dépendants des cellules NK obtenus par le facteur de croissance FL. EXEMPLE 7: L'interleukine 12 n'est pas impliquée dans les effets anti- tumoraux NK induits par FL. Les cytokines IL-12 et IFN-y sont des cytokines T de type Thl qui sont connues pour stimuler l'activité NK in vivo. De plus, comme décrit dans l'exemple 38 2775692 précédent, la sous-population de cellules dendritiques Iymphoïdes capables de sécréter de l'IL-12 est importante pour l'effet anti-tumoral observé. Bien que les niveaux d'lL-12 dans les sérums ou les surnageants deganglions lymphatiques ou de rates dérivées de cellules mononucléées, étaient indétectables dans les animaux traités par FL, des souris ont été injectées avec l'anticorps neutralisant anti-p40 IL-12 depuis le jour 5 jusqu'au jour 20 du traitement par FL. Aucun effet inhibiteur de ces anticorps monoclonaux sur les effets anti-tumoraux induits par FL n'a été observé in vivo (figure 7c). Une neutralisation de l'interféron y in vivo permet par contre de bloquer transitoirement les effets anti- tumoraux médiés par o FL ce qui sous-entend que la cytotoxicité des NK est médiée par l'IFNy car le mésothéliome est IFNy sensible (figure 7d). EXEMPLE 8: Le transfert adoptif des cellules dendritiques au début de l'établissement de tumeurs ou en cours de croissance tumorale à J20 dans les souris SCID affecte la croissance tumorale. De manière à écarter définitivement tout événement indirect susceptible de rendre compte de l'augmentation de l'activité NK indépendante de la population développée des cellules dendritiques et de manière à tester de manière formelle un effet in vivo direct de dialogue entre les cellules dendritiques et les cellules NK des souris B6-nude ou SCID porteuses de tumeurs AK7, connues pour présenter une activité NK forte, ont été transférées passivement avec 2 à 5 millions de cellules dendritiques immatures par injection sous-cutanée deux fois par semaine pendant deux semaines dès J1 ou dès J20 AK7. Les résultats sont présentés sur les figures 8a et 8b et montrent un retard significatif de croissance tumorale dans le groupe de souris traitées par les cellules dendritiques en comparaison avec le groupe contrôle. Ces résultats démontrent clairement le rôle des cellules dendritiques dans la stimulation de l'activité des cellules NK in vivo. 39 2775692 REVENDICATIONS 1. Procédé d'activation de cellules tueuses naturelles comprenant la mise en contact de cellules NK avec des cellules dendritiques in vitro ou ex vivo. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont des cellules dendritiques matures. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules dendritiques sont des cellules dendritiques immatures. 4. Procédé selon l'une des revendication 1 à 3 caractérisé en ce que les io cellules dendritiques et NK sont autologues. 5. Procédé selon l'une des revendication 1 à 3 caractérisé en ce que les cellules dendritiques et NK sont allogéniques. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le rapport cellules NK / cellules dendritiques est compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,05 et 5. 7. Co-culture de cellules dendritiques et de cellules NK. 8. Composition comprenant des cellules NK activées ou au repos et des cellules dendritiques autologues. 9. Composition comprenant des cellules NK activées par le procédé de la revendication 1. 10. Utilisation de cellules dendritiques pour l'activation de cellules tueuses naturelles in vitro ou ex vivo. 11. Utilisation de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules tueuses naturelles in vivo. 12. Utilisation de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer l'activité cytolytique des cellules tueuses naturelles in vivo. 13. Utilisation de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à augmenter la production d'IFNy par les cellules NK in vivo. 2775692 14. Utilisation selon les revendications 10 à 13 caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont des cellules dendritiques matures. 15. Utilisation selon les revendications 10 à 13 caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont des cellules dendritiques immatures. 16. Utilisation selon les revendications 10 à 15 caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont sensibilisées à un ou plusieurs antigènes. 17. Utilisation d'un facteur de croissance des cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules tueuses naturelles in vivo. 18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que le facteur de croissance est le composé FL. 19. Composition comprenant un facteur de costimulation des cellules NK exprimé par les cellules dendritiques. 20. Composition comprenant un composé capable d'interférer avec lI'interaction entre les cellules dendritiques et les cellules NK. 21. Utilisation d'un facteur selon la revendication 19 pour la préparation d'une composition destinée à activer les cellules tueuses naturelles in vivo. 22. Utilisation d'un composé selon la revendication 20 pour la préparation d'une composition destinée à contrôler négativement l'activité des cellules tueuses naturelles in vivo. 23 Utilisation de cellules dendritiques ou d'une composition selon les revendications 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de tumeurs. 24. Utilisation de cellules dendritiques ou d'une composition selon les revendications 8 ou 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de cellules infectées. 25. Utilisation d'une composition selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de tumeurs ou de cellules infectées. 41 2775692 26. Utilisation d'une composition selon la revendication 20 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif du rejet de greffe ou de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD). 27. Utilisation d'un facteur de croissance des cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée au traitement des tumeurs de classe I négative par augmentation de l'activité NK in situ. 28. Utilisation d'un facteur membranaire de cellules dendritiques pour la préparation d'une composition destinée à augmenter la survie ou la prolifération de sous-population lymphocytaires NK. o0 29. Utilisation d'un facteur membranaire de cellules NK pour la préparation d'une composition destinée à augmenter la survie de cellules dendritiques matures. 30. Utilisation de cellules dendritiques de phénotype tolérogène ou d'un produit dérivé de cellules dendritiques tolérogènes pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activation de cellules NK.