Brevet FR2777905A1 — publié le 19991029

La présente invention est relative à des bactéries surproductrices d'aacétolactate, précurseur du diacétyle. Elle est en outre relative à un procédé d'obtention de ces bactéries. La présence de diacétyle est recherchée dans des aliments tels que les fromages frais, le beurre, les margarines ou la crème fraîche. Le diacétyle confère à ces produits un arôme caractéristique de type beurre . Sa présence dans les aliments résulte, soit de l'action de bactéries lactiques au cours du processus de fabrication, lors d'une fermentation, soit de l'utilisation d'additifs aromatiques contenant du diacétyle, ou son précurseur: I'a- acétolactate. Ce sont principalement les bactéries lactiques capables de métaboliser le citrate, telles que les souches de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, ou les souches appartenant au genre Leuconostoc, qui sont utilisées pour produire du diacétyle. Elles transforment le citrate présent dans le milieu de culture (le lait en contient environ 1,7 g/l) en pyruvate. Une partie du pyruvate est ensuite transformée en a-acétolactate par action de l'aacétolactate synthase, comme l'illustre la figure 1. L'a-acétolactate est un composé instable, qui se décarboxyle spontanément en diacétyle ou en acétoïne. La formation de diacétyle résulte d'une décarboxylation de type oxydative, qui est favorisée en présence d'un oxydant (par exemple en présence d'oxygène). Cependant, la plupart des bactéries lactiques capables d'utiliser le citrate n'accumulent pas d'a-acétolactate dans le milieu de culture en raison de l'action de l'a-acétolactate décarboxylase, qui transforme l'aacétolactate en acétoïne. De ce fait, la production de diacétyle par ces microorganismes est beaucoup plus faible (et en général inférieure à 5 mg/l) que celle d'acétoïne. Plusieurs procédés alimentaires utilisent des souches de L.l.l. diacetylactis capables d'accumuler de l'a-acétolactate dans le milieu de culture. Dans le procédé de fabrication de beurre, décrit par Veringa et al. (1976, Milchwissenschaft, 31, 658-662), la-acétolactate produit par un ferment aromatisant est transformé en diacétyle grâce à l'aération de la culture. Un additif aromatique peut également être obtenu par culture, dans du lait, d'un ferment produisant de l'a-acétolactate, puis conversion de l'a-acétolactate en diacétyle par une distillation en présence d'oxygène (Jônsson et al., 1980; Milchwissenschaft. 35, 461-465 et, brevet US n" 4,454,160). Il existe également des procédés de fabrication d'additifs aromatiques contenant de l'aacétolactate (demande EP-0 247.646). Celui-ci se transforme spontanément en diacétyle après son incorporation dans les aliments. La propriété de certaines souches de L. I. I. diacetylactis d'accumuler de l'a-acétolactate dans le milieu de culture est due à une déficience en aacétolactate décarboxylase. Une souche naturellement déficiente en aacétolactate décarboxylase a été décrite (Hugenholtz, 1993, FEMS Microbiology Reviews 12, 165-178), et plusieurs méthodes ont été développées pour sélectionner des mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase (brevet FR 2.696.191; demande de brevet FR 2.728.588; Monnet et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol, 63, 793-795; Goupil et al., 1996, Applied and Environmental Microbiology, 62, 2641-2643 ). La production de diacétyle et d'a-acétolactate par les bactéries lactiques peut être augmentée en agissant sur les conditions de culture ou de mise en oeuvre de ces bactéries, en présence d'oxygène (brevet FR 2 705 015) ou en supplémentant le milieu de culture avec du citrate ou du pyruvate. II a également été proposé de réaliser des cultures continues limitées en lactose (Hugenholtz, 1993, précédemment cité). Les travaux menés sur la modification génétique des lactocoques ont montré que seules les souches déficientes en a-acétolactate décarboxylase étaient capables de produire des quantités significatives d'a-acétolactate lors de leur culture dans du lait. Plusieurs travaux ont permis d'obtenir des souches de Lactococcus lactis déficientes en a-acétolactate décarboxylase, et dans lesquelles l'activité a-acétolactate synthase a été amplifiée (Gasson et al., 1996; Lait. 76, 3340; Bensson et al. 1996; Applied Microbiology and Biotechnology, 45, 107-111; demande de brevet EP 0.500.188). Cependant, I'amplification de l'a-acétolactate synthase n'a pas permis, à la connaissance du demandeur, d'augmenter fortement la production d'a-acétolactate lors de cultures dans du lait, par rapport aux souches déficientes en a-acétolactate décarboxylase utilisées actuellement dans l'industrie laitière. II a aussi été proposé de construire des souches présentant simultanément plusieurs des caractéristiques suivantes: inactivation des activités a-acétolactate décarboxylase, lactate déshydrogénase, diacétyle réductase, pyruvate formiate lyase, pyruvate déshydrogénase et surexpression des activités a-acétolactate synthase et NADH oxydase (Hugenholtz, 1993, précédemment cité). En particulier, cet auteur mentionne la possibilité de combiner des phénotypes déficients en a-acétolactate décarboxylase, et l'inactivation de la lactate déshydrogénase, ainsi qu'éventuellement d'autres enzymes de la voie du pyruvate. Hugenholtz propose deux méthodes pour augmenter la production d'a-acétolactate. Selon une première méthode, la lactate déshydrogénase serait partiellement inactivée par culture dans des conditions de limitation en lactose. II s'agit donc d'une action sur le métabolisme et non d'une modification génétique. La seconde méthode consiste , à l'aide de la séquence connue de la lactate déshydrogénase de Lactococcus lactis, de combiner des mutations de l'acétolactate décarboxylase et de la lactate déshydrogénase. Néanmoins, cette solution nécessite obligatoirement l'utilisation de méthodes du génie génétique, et non d'une méthode de mutagenèse classique. Cette inactivation combinée des gènes codant pour la lactate déshydrogénase et l'a-acétolactate décarboxylase, par génie génétique, a aussi été mentionnée par GASSON et al. (1996, Lait, 76, 33-40). Or, la modification de souches par génie génétique (amplification ou disruption de gènes) présente un inconvénient. En effet, I'utilisation dans l'industrie alimentaire de bactéries obtenues par génie génétique est encore difficilement acceptée par les consommateurs de certains pays contrairement à l'utilisation de mutants, qu'ils soient spontanés ou qu'ils résultent de mutations aléatoires. En tout état de cause, la fabrication de doubles mutants par génie génétique n'a pas abouti, à la connaissance du demandeur. La non-viabilité de tels mutants peut expliquer cette absence de résultat. II ressort de l'analyse de l'état de la technique effectué ci-dessus que l'homme du métier cherchant à augmenter la production en a-acétolactate de bactéries lactiques était confronté à diverses possibilités de modifications dans la voie de synthèse de l'a-acétolactate. Rien ne l'incitait à choisir des étapes particulières. En outre, I'homme du métier était plutôt incité à utiliser les techniques du génie génétique. Les inventeurs ont montré qu'il était possible d'obtenir, au moyen de méthodes de mutagenèse classiques, des bactéries surproductrices d'aacétolactate viables, et présentant des caractères stables.. Ces méthodes permettent aux inventeurs d'obtenir des bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase dont l'activité lactate déshydrogénase est atténuée. La présente invention a donc pour objet des bactéries surproductrices d'a-acétolactate et/ou de diacétyle caractérisées en ce qu'elles sont déficientes en a-acétolactate décarboxylase et atténuées pour leur activité lactate déshydrogénase. Ces bactéries sont viables et présentent des mutations stables. Pour la présente invention, on entendra par bactéries déficientes en aacétolactate décarboxylase, des bactéries dans lesquelles l'activité aacétolactate décarboxylase est nulle ou suffisamment faible, pour permettre une accumulation temporaire d'a-acétolactate en présence de citrate ou de pyruvate. De manière préférentielle, cette accumulation représente au minimum plus de 20%, et préférentiellement plus de 30% de l'ensemble des composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, c'est-à-dire l'a-acétolactate et ses dérivés (diacétyle, acétoïne et 2,3-butanediol), lorsqu'une culture de la souche est inoculée à 1% dans du bouillon MRS (De Man et al., 1960, J. Appl. Bacteriol, 23, 130-135) modifié, supplémenté avec 10 mM de citrate ou de pyruvate de sodium. On notera que malgré la déficience en a-acétolactate décarboxylase, l'acétone constitue une partie des composés de la voie de l'aacétolactate synthase, du fait de l'existence d'autres voies de synthèse de ce composé. Des bactéries présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée sont telles que l'activité lactate déshydrogénase est suffisamment faible, pour ne permettre la synthèse que d'une quantité limitée de lactate. Avantageusement, cette activité est telle qu'elle permet la transformation d'au minimum 3 mM et préférentiellement plus de 10 mM dé glucose en composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, lorsqu'une culture de la souche est inoculée dans du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate. Avantageusement, de telles bactéries présentent une activité spécifique en lactate déshydrogénase inférieure à 10, et préférentiellement inférieure à 5 U/mg de protéines, et une activité a-acétolactate décarboxylase inférieure à environ 0,1 U/mg et préférentiellement inférieure à 0,01 U/mg de protéines. Ces activités sont mesurées comme décrit par Boumerdassi et al. (1997, Appl. Environ. Microbiol., 63, 2293-2299). L'activité spécifique de la lactate déshydrogénase est mesurée en suivant la décroissance de I'absorbance à 340 nm. La mesure est effectuée dans un tampon de trismaléate à 50 mM pH 7, contenant 100 ,ul d'extrait cellulaire, 10 mM de pyruvate de sodium, 1 mM de fructose 1,6-diphosphate et 0,15 mM de NADH. L'activité a-acétolactate décarboxylase est mesurée plus précisément comme décrit par Phalip et al. (1994, FEBS Lett., 351, 95-99). L'activité est mesurée à 30"C dans un milieu réactionnel contenant 200 mM de phosphate de potassium, 40 mM de L-leucine (pH 6) et la solution enzymatique. La réaction est initiée par addition de 50 mM de D-a-acétolactate. La concentration en acétoïne a été mesurée juste après l'addition d'a-acétolactate dans le milieu réactionnel et à nouveau 15 min après par la méthode de Westerfeld. L'a-acétolactate subissant une décarboxylation non-enzymatique lente (3 % par heure à pH 6 à 30oC) en diacétyle ou en acétoïne, qui donne une coloration similaire, un témoin a été effectué sans l'enzyme et la production d'acétoïne a été corrigée en fonction de la décarboxylation non-enzymatique. Une unité d'activité a-acétolactate décarboxylase représente la formation de 1 mole d'acétoïne par minute. De telles bactéries peuvent être des bactéries rentrant dans la fabrication d'aliments. Elles sont préférentiellement des bactéries lactiques. Elles appartiennent avantageusement aux genres Lactobacillus ou Lactococcus. De telles bactéries sont encore plus préférentiellement les souches de Lactococcus lactis déposées auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 19 Mars 1998, respectivement sous les N 1-1993 (MR3-Tl), 1-1994 (MR3 T5) et 1-1995 (MR3 T7). L'invention n'est néanmoins pas limitée à ces deux genres, et s'applique à tout genre de bactéries présentant ces activités enzymatiques. De telles bactéries peuvent être obtenues par un procédé comprenant les étapes suivantes: - mutagenèse de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase, - ensemencement des bactéries sur un milieu de sélection adapté, et - sélection des mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase, et présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée. Un tel procédé peut être mis en oeuvre à partir de bactéries déjà déficientes en a-acétolactate décarboxylase. II peut aussi être mis en oeuvre à partir de bactéries ne présentant pas de déficience ou d'atténuation pour les deux enzymes, auquel cas le procédé comprendra une ou plusieurs étapes supplémentaires de sélection de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase. Ainsi, un tel procédé peut comprendre les étapes suivantes: - mutagenèse de bactéries présentant une activité a-acétolactate décarboxylase et lactate deshydrogénase, - ensemencement des bactéries sur un milieu adapté à la sélection de mutants présentant une activité lactate deshyd rogénase atténuée, - sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée, - ensemencement des bactéries sur un milieu permettant la sélection de mutants déficients en activité a-acétolactate décarboxylase, - sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée et déficients en a-acétolactate décarboxylase La sélection des bactéries pour leur déficience en a-acétolactate décarboxylase, peut être effectuée avant l'étape de sélection pour leur activité lactate déshydrogénase atténuée, mais peut être aussi effectuée après cette dernière étape de sélection. La sélection de bactéries déficientes en a-acétolactate décarboxylase, peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. Elle peut être effectuée par mutagenèse aléatoire puis criblage des bactéries mutées sur un milieu gélosé comme décrit par Monnet et al. (1997, précédemment cité). Cette sélection est basée sur une conversion du diacétyle produit en un réactif présentant une coloration rouge intense constituée de diméthylglyoximate ammonioferreux. Cependant, toute autre technique d'obtention de mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase est utilisable, et en particulier les techniques décrites dans la demande de brevet FR 2 696 191 ou par Goupil et al. (1996, précédemment citée). II serait également possible d'utiliser une souche naturellement déficiente en a-acétolactate décarboxylase. Le milieu de sélection des mutants présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée est préférentiellement le milieu présentant la composition suivante: Tryptone:entre environ 1 et 5 g/l Peptone papaïnique de soja: entre environ 2 et 10 g/I Peptone pepsique de viande: entre environ 1 et 5 g/l Extrait de viande : entre environ 2 et 10 g/l Extrait de levure : entre environ 1 et 5 g/l Glycérophosphate de sodium, 6H2O: entre environ 5 et 30 g/l Acide ascorbique : entre environ 0,2 et 1 g/l Sulfate de magnésium : entre environ 0,1 et 0,52 g/l Hydrogénophosphate de potassium : entre environ 0,2 et 1 g/l Agar: entre environ 5 et 30 g/l Glucose : entre environ 5 et 30 g/I Chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium: entre environ 0,05 et 0,2 g/l Eau distillée qsp Il II peut être néanmoins tout autre milieu permettant de sélectionner des mutants ayant une activité lactate déshydrogénase nulle ou atténuée. De manière préférentielle, la mutagenèse est aléatoire et est effectuée à l'aide de nitrosoguanidine ou rayons ultraviolets. Néanmoins, d'autres agents mutagènes, tels que des agents mutagènes chimiques, peuvent être utilisés. Ces mutants peuvent aussi être des mutants spontanés, c'est-à-dire des souches dont les mutations sont apparues sans l'utilisation d'un agent mutagène. Les mutants obtenus peuvent être utilisés en tant que bactéries lactiques aromatisantes dans la fabrication de produits laitiers fermentés (fromages, laits fermentés), de beurre, de crème fraîche. Ils peuvent également être utilisés pour produire un additif alimentaire contenant de l'a-acétolactate ou du diacétyle. Ce type d'additif est utilisé dans la formulation de nombreux aliments (margarines, produits de viennoiseries....). La présente invention est donc relative à un produit alimentaire contenant au moins une bactérie décrite ci-dessus, ou une partie de cette bactérie, ou un composé de la voie de l'a-acétolactate synthase obtenu à l'aide de cette bactérie. De manière avantageuse, un tel produit est issu du lait ou du lactosérum. La présente invention a en outre pour objet un procédé de production d'arômes du type a-acétolactate ou diacétyle, ou de dérivés de l'a-acétolactate, comprenant les étapes suivantes: - mise en culture dans des conditions appropriées, d'une bactérie surproductrice en a-acétolactate, telle que décrite ci-dessus, et - récupération des arômes. Ces arômes peuvent être récupérés par des moyens connus de l'homme du métier, et en particulier par distillation, ou par séchage (atomisation ). L'utilisation des bactéries selon la présente invention présente de nombreux avantages. Elle permet d'augmenter la teneur en diacétyle des produits laitiers fermentés. En outre, I'utilisation de ces bactéries permet d'améliorer les procédés de fabrication des additifs aromatiques contenant du diacétyle et de l'a-acétolactate, du fait des diminutions des coûts de production de ces additifs. En effet, on note des productivités en a-acétolactate des bactéries surproductrices selon la présente invention, de l'ordre de dix fois supérieures aux souches à partir desquelles des mutations ont été effectuées. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. La figure 1 représente schématiquement la voie métabolique de l'aacétolactate. Les figures 2A à 2D illustrent respectivement les courbes d'évolution du pH ( figure 2A), des concentrations en diacétyle (figure 2B), en acétoïne (figure 2C), et en a-acétolactate (figure 2D) des souches MR3-T1, MR3-T5 et MR3-T7, cultivées en anaérobiose partielle dans du lait écrémé à 30"C. Les figures 3A à 3D représentent respectivement les courbes d'évolution du pH (figure 3A) de la concentration en diacétyle (figure 3B), en acétoïne (figure 3C), et en a-acétolactate (figure 3D) lors de cultures aérobies de la souche MR3-T7 (1-1995) dans du lait écrémé, ainsi que dans du lait supplémenté en extrait de levure, en catalase ou en hémoglobine. Les figures 4A à 4C illustrent respectivement l'évolution des concentrations en diacétyle (figure 4A), en acétoïne (figure 4B) et en aacétolactate (figure 4C) du mutant Y8T3, cultivé à 30"C et à pH 5,8 sur un milieu à base de lactosérum, avec 0%, 21% ou 100% d'oxygène dissous. EXEMPLE 1: Sélection de mutants surproduisant de l'ascétolactate Un milieu de culture gélosé (milieu LDHA-20) (tableau 1) a été mis au point pour détecter les mutants de Lactococcus lactis produisant moins de lactate que les souches parentales . 1 ml d'une solution à 10 g/l de TTC (chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium) stérilisée par filtration est ajouté à 100 ml de gélose avant de couler les boîtes de Pétri. On verse approximativement 60 ml de gélose pour une boite de Pétri de diamètre égal à 14 cm. Sur ce milieu, les souches de Lactococcus lactis sont généralement de couleur blanche. Les mutants moins acidifiants que les souches parentales forment des colonies dont le centre est de couleur brune. Dans le cas où la souche parentale formerait déjà des colonies brunes sur ce milieu, il serait nécessaire d'abaisser sa teneur en glycérophosphate, de sorte que la couleur des colonies soit blanche. L'utilisation du milieu LDHA-20 présente plusieurs avantages. Sa mise en oeuvre est simple et de plus il est possible d'examiner rapidement un grand nombre de clones (plus de 1000 clones peuvent être ensemencés sur une boîte de Pétri ayant un diamètre égal à 14 cm). A partir de mutants déficients a-acétolactate décarboxylase Y8, MR3 et NO8, sélectionnés à partir des souches de L.I.I. diacetylactis Y, MR et NO, comme décrit par Monnet et al., (1997 précédemment cités) on réalise les opérations suivantes. Des bactéries sont cultivées pendant 12 h à 30"C dans 5 ml de bouillon M17 (Terzaghi et Sandine, 1975, Applied Microbiology. 29, 807-813). Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation, lavées deux fois avec du tampon phosphate (100 mM, pH 7), puis remises en suspension dans 1 ml de tampon contenant du N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG). La concentration en NTG dépend de la souche utilisée, elle est ajustée de manière à obtenir un taux de survie des cellules proche de 10%. Après une incubation d'une heure à 30"C, les cellules sont récupérées par centrifugation, lavées deux fois avec 5 ml de tampon, puis remises en suspension dans 5 ml de bouillon M17. Après une incubation d'une heure à 30"C, la suspension est diluée dans de l'eau peptonée (1 g/l de bactopeptone), puis elle est ensemencée sur des boîtes de Pétri contenant de la gélose LDHA-20. Les boîtes de Pétri sont incubées pendant 48 h à 30"C avant d'être examinées. Tous les clones formant des colonies brunes sont ensuite testés individuellement pour leur capacité de production d'a-acétolactate à partir des sucres. Cependant, en raison de l'instabilité de l'a-acétolactate, sa concentration en fin de culture est généralement très inférieure à la concentration maximale observée pendant la culture. Elle ne reflète donc pas la potentialité de production d'a-acétolactate d'une souche. Etant donné que l'aacétolactate ne se dégrade qu'en acétoïne et en diacétyle, et que ces deux composés peuvent être éventuellement réduits en 2,3 butanediol, la concentration totale en diacétyle, acétoïne, a-acétolactate et 2,3 butanediol en fin de culture reflète davantage la capacité de production d'a-acétolactate d'une souche. Tous ces composés sont issus de la voie de l'a-acétolactate synthase. Les résultats relatifs à la recherche de mutants à partir des souches Y8, MR3 et NO8, sont présentés dans le tableau 2. On constate que seule une faible proportion des clones formant des colonies brunes ont une production de composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase supérieure à 3 mM, dans du bouillon MRS (De Man et al., 1960 J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135) modifié dépourvu de citrate. Les valeurs de production des composés issus de la voie de l'aacétolactate synthase sont présentées dans le tableau 3. Les simples mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase (souches Y8, MR3, NO8, FC10, FM2, CM5, 3M1 et 6M1) ont une production inférieure ou égale à 0,1 mM. Les 46 mutants sélectionnés au cours de cette étude ont une production comprise entre 3,4 et 32,8 mM. Sachant qu'une mole de glucose (sucre contenu dans le bouillon MRS) est nécessaire pour former une mole de diacétyle, d'acétoïne, d'a-acétolactate ou de 2,3 butanediol, les mutants sélectionnés ont donc transformé entre 3,4 et 32,8 mM de glucose en composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase. De plus, tous les mutants produisent encore du lactate, ce qui indique que leur activité lactate déshydrogénase n'est pas nulle. Les valeurs d'activité lactate déshydrogénase et a-acétolactate décarboxylase d'une partie des mutants sélectionnés sont présentées dans le tableau 4. Comme pour les souches parentales, aucune activité a-acétolactate décarboxylase n'est détectable pour les mutants sélectionnés. A titre de comparaison les sondes Y, MR et NO, avaient cune activité a-acétolactate décarboxylase égale à 0,64, 0,55 et 0,48 U/mg, respectivement. Cependant, L'activité lactate déshydrogénase des mutants est inférieure à celle des souches parentales. Ceci confirme le fait que la forte production, par les mutants, de composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase, est due à une faible activité lactate déshydrogénase. De plus, aucun des mutants sélectionnés ne possède une activité lactate déshydrogénase nulle. De ce fait, ils produisent encore du lactate, en quantité variable, lorsqu'ils sont cultivés sur du bouillon MRS modifié (tableau 3). EXEMPLE 2: Culture des mutants dans du lait ou du milieu à base de lactosérum Pour une utilisation dans un procédé industriel, il est préférable que les mutants sélectionnés soient capables de produire de l'a-acétolactate dans du lait, ou dans un milieu à base de lactosérum. 1 ) Cultures sur du lait en anaérobiose partielle Les mutants MR3-T1 (1-1993), MR3-T5 (1-1994) et MR3-T7 (1-1995), ainsi que la souche parentale MR3, ont été cultivés à 30"C dans du lait écrémé (figure 2). La souche parentale, qui est déficiente en a-acétolactate décarboxylase, produit 2,6 mM d'a-acétolactate après 6 heures de culture. La concentration en a-acétolactate diminue ensuite en raison de l'instabilité de ce composé. Les mutants MR3-T1, MR3-T5 et MR3-T7, produisent respectivement 8,4, 13.5 et 10,0 mM d'a-acétolactate. Lors de ces cultures, on constate que la capacité de production d'aacétolactate par les différents mutants varie en sens inverse de leur activité acidifiante. De plus, on constate que la souche MR3-T1 atteint une valeur de pH identique à celle de la souche parentale, ce qui est intéressant dans le cas ou l'on recherche également une acidification du lait (I'acidification est plus lente que pour la souche parentale, mais la valeur de pH finale est identique). La production de diacétyle est égale à 0,16, 0,25, 0,38 et 0,26 mM pour les souches MR3, MR3-T1, MR3-T5 et MR3-T7, respectivement. Cette production est relativement faible en raison des conditions d'anaérobiose. 2") Cultures aérobies sur du lait Le mutant MR3-T7 a été cultivé en aérobiose sur du lait (culture de 300 ml dans une fiole Erlenmeyer de 2 I, agitée à 200 tr/min) (figure 3). On constate que cette souche ne produit que 3,5 mM d'a-acétolactate dans ces conditions et n'acidifie quasiment pas le milieu de culture. Lorsque le milieu est supplémenté avec de l'extrait de levure (5 g/l), de la catalase (70 U/ml) ou de l'hémoglobine (0,2 g/l), la production d'a-acétolactate atteint 14,5, 13,9 et 32.4 mM, respectivement. L'extrait de levure et la catalase décomposent le peroxyde d'hydrogène. De plus, certaines bactéries lactiques sont capables de décomposer le peroxyde d'hydrogène en présence d'hémoglobine. La faible acidification et production d'a-acétolactate par la souche MR3-T7 en aérobiose, était donc probablement due à une accumulation toxique de peroxyde d'hydrogène. Pour favoriser la production d'a-acétolactate par des mutants sélectionnés selon l'invention, il est donc préférable de réaliser des cultures aérobies, en présence d'un composé permettant de limiter l'accumulation de peroxyde d'hydrogène. De plus, la production de diacétyle est élevée en raison des conditions de culture aérobies. Elle atteint 5,9 mM dans la culture supplémentée avec de la catalase. 3 ) Cultures dans du milieu à base de lactosérum Le mutant Y8-T3 a été cultivé sur un milieu contenant 50 g/l de lactosérum clarifié, 5 g/l de bactopeptone et 3 g/l d'extrait de levure (ce milieu ne contenait pas de citrate). Les cultures ont été réalisées à 30"C dans un fermenteur de 7 I contenant 5 I de milieu, et à un pH régulé à une valeur de 5,8. La concentration en oxygène dissous a été régulée à 0, 21 et 100% de la saturation du milieu par de l'oxygène (figure 4). La production la plus élevée d'a-acétolactate (43 mM, ce qui représente 5,7 g/l) a été obtenue après 17 h de culture à 21 % d'oxygène dissous. La production de diacétyle la plus élevée (3,5 mM, ce qui représente 0,3 g/l) a été obtenue à 100% d'oxygène dissous. EXEMPLE 3: Stabilité des mutants sélectionnés Tous les caractères phénotypiques induits par des mutations (qu'il s'agisse de mutations spontanées, ou réalisées à l'aide d'agents chimiques ou de certains types de rayons), sont plus ou moins stables. II est donc important d'étudier la stabilité des mutants obtenus afin de s'assurer qu'ils sont utilisables dans un procédé industriel. La capacité de production d'a-acétolactate dans du lait par les mutants, a été mesurée avant et après 10 repiquages successifs (ce qui représente un nombre de générations supérieur à 65) dans du bouillon M17 (Terzaghi et Sandine, 1975 précédemment cité) (tableau 5). Sur les 46 mutants testés, seuls 8 d'entre eux étaient stables dans ces conditions. Pour tous les autres mutants, I'instabilité résultait probablement de modifications génétiques entraînant une augmentation de l'activité lactate déshydrogénase, car ces souches devenaient plus acidifiantes après 10 repiquages . Auc TABLEAU 1 Préparation du milieu LDHA-20 Tryptone 2,5 g Peptone papaïnique de soja 5 g Peptone pepsique de viande 2,5 g Extrait de viande 5 g Extrait de levure 2,5 g Glycérophosphate de sodium, 6H2O 20 g Acide ascorbique 0,5 g Sulfate de magnésium 0,25 g Hydrogénophosphate de potassium 0,5 g Agar 15 g Glucose 10 g Eau distillée qsp Il pH 7 Autoclavage 115 C 15 min TABLEAU 2 Recherche de mutants de L.LI. diacetylactis produisant de i'a-acétoiactate dans un milieu dépourvu de citrate et de pyruvate Souche Nombre de clones Nombre de Nombre de clones 2 LDHA-20 des colonies brunes Y8 380 000 1 300 5 MR3 120 000 258 14 NO8 140 000 110 27 (1) Les souches parentales sont déficientes en a-acétolactate décarboxylase. (2) Correspond aux clones formant des colonies brunes sur gélose LDHA-20 et dont la production totale de diacétyle, d'acétoïne, d'a-acétolactate et de 2,3 butanediol est supérieure à 3 mM. Cultures de 24 h, en anaérobiose partielle et à 30 C, sur du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate. Tableau 3. Production de lactate et de composés issus de la voie de l'&alpha;-acétolactate synthase par des souches déficientes en &alpha;-acétolactate décarboxylasse, ainsi que par les muitants sélectionnés selon l'invention. Valeurs après 24 h de culture en aneérobiose parielle et à 30 C, sur du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate. Souche Composés issus de la voie de Lactate (mM) l'&alpha;-acétolactate synthase (mM) Souche Y 0 46,1 Souche MR 0 64,3 Souche No 0 63,2 Souches déficientes en &alpha;-acétolactate décarboxylase Y8 0.0 53.7 MR3 0.0 57.7 NO8 0.1 58.3 FC10 0.1 68.8 FM2 0.1 64.6 CM5 0.1 66.2 3M1 0.1 58.5 6M1 0.1 68.5 Mutants sélectionnés Y8-T1 4.4 30.5 Y8-T2 6.5 17.1 Y8-T3 8.9 18.8 Y8-T4 11.2 13.3 Y8-T5 5.3 42.5 MR3-T1 6.6 44.6 MR3-T2 15.4 37.8 MR3-T3 14.1 54.4 MR3-T4 11.3 38.5 MR3-T5 24.8 14.3 MR3-T6 30.4 16.7 MR3-T7 15.2 43.7 MR3-T8 3.7 47.4 MR3-T9 26.8 39.2 MR3-T10 33.6 30.2 MR3-T11 6.4 56.6 MR3-T12 13.1 47.6 MR3-T13 8.3 52.7 MR3-T14 16.8 37.6 NO8-T1 5.6 32.3 NO8-T2 10.6 31.0 NO8-T3 6.8 44.2 NO8-T4 18.3 26.1 NO8-T5 27.5 13.0 NO8-T6 19.2 45.2 NO8-T7 22.0 25.1 NO8-T8 10.2 18.5 NO8-T9 25.7 19.0 NO8-T10 18.5 16.9 NO8-T11 20.1 8.6 NO8-T12 9.5 13.2 NO8-T13 19.9 26.1 NO8-T14 21.6 14.1 NO8-T15 16.3 42.4 NO8-T16 32.8 22.6 NO8-T17 9.2 52.4 NO8-T18 9.9 8.5 NO8-T19 4.6 27.6 NO8-T20 24.5 14.0 NO8-T21 26.2 17.5 NO8-T22 23.0 12.4 NO8-T23 11.6 28.2 NO8-T24 15.3 18.4 NO8-T25 25.2 13.6 NO8-T26 24.4 11.6 NO8-T27 31.8 22.8 (1) Production totale de diacétyle. d'acétoïne, d'&alpha;-acétolactate et de 2,3 butanediol (2) Les premières lettres désignent la souche parentale dont est issu chaque mutant TABLEAU 4 Activités enzymatiques mesurées à partir d'extraits cellulaires des souches parentales Y8. MR3 et NO8 ainsi que des mutants issus de ces souches Activités spécifiques (U/mg de protéines) Lactate a-Acétolactate deshydrogénase décarboxylase Souche Y 19,50 0,64 Y8 21,81 Y8-T1 2,33 Y8-T2 4,30 Y8-T3 0,32 Y8-T4 0,01 Y8-T5 0,91 Souche MR 12,90 0,55 Souche MR3 10,84 MR3-T1 1,09 MR3-T3 1,69 MR3-T5 0,01 MR3-T7 7,07 MR3- T?2 0,86 MR3-T13 1,48 Souche NO 16,34 0,48 Souche N08 14,00 mutants N08-T1 1,99 N08-T11 5,59 N08-T16 11,63 N08-T25 0,01 TABLEAU 5 Etude de la stabilité des mutants après 10 repiquages successifs1 Mutants issus de Nombre de Nombre de Code des souches la mutants mutants stables souche instables stables2 parentale Y8 4 1 Y8-T5 MR3 9 5 MR3-T1, MR3-T3, MR3-T5, MR3-T7, MR3-T13 NO8 25 2 NO8-T1, NO8-T25 (1) Repiquages à 1% dans du bouillon M17. (2) Mutants dont la capacité de production d'a-acétolactate dans du lait n'est pas modifiée de façon significative après 10 repiquages successifs. REVENDICATIONS 1. Bactérie surproductrice d'a-acétolactate, et/ou de diacétyle, caractérisée en ce qu'elle est déficiente en a-acétolactate décarboxylase et présente une activité lactate déshydrogénase atténuée ou nulle. 2. Bactérie selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle accumule temporairement l'a-acétolactate. 3. Bactérie selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que, lorsqu'elle est cultivée dans du bouillon MRS supplémenté avec 10 mM de citrate ou de pyruvate de sodium, son activité a-acétolactate décarboxylase est nulle ou suffisamment faible pour permettre une accumulation temporaire d'une quantité d'a-acétolactate représentant au minimum 20% de l'ensemble des composés de la voie de l'a-acétolactate synthase. 4. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle présente une activité spécifique en a-acétolactate décarboxylase inférieure à environ 0,lU/mg. 5. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que lorsqu'elle est cultivée dans du bouillon MRS modifié dépourvu de citrate, son activité lactate déshydrogénase est suffisamment faible pour permettre la transformation de plus de 3 mM de glucose en composés issus de la voie de l'a-acétolactate synthase. 6. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle est une bactérie lactique. 7. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle appartient aux genres Lactobacillus ou Lactococcus. 8. Bactérie selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle appartient à l'espèce Lactococcus lactis. 9. Souche selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle a été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 19 Mars 1998 sous le N" 1-1993 (MR3T1). 10. Souche selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle a été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 19 Mars 1998 sous le N" 1-1994 (MR3 T5). 11. Souche selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle a été déposée auprès de la Collection Nationale de Culture des Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 19 Mars 1998 sous le N" 1-1995 (MR3 T7). 12. Procédé d'obtention de mutants de bactéries surproducteurs d'aacétolactate comprenant les étapes suivantes: - mutagenèse de bactéries déficientes en activité a-acétolactate décarboxylase, - ensemencement des bactéries sur un milieu de sélection adapté, et - sélection des mutants déficients en a-acétolactate décarboxylase et présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée. 13. Procédé d'obtention de mutants de bactéries surproducteurs d'aacétolactate comprenant les étapes suivantes: - mutagenèse de bactéries présentant une activité a-acétolactate décarboxylase et lactate deshydrogénase, - ensemencement des bactéries sur un milieu adapté à la sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée, - sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée, - ensemencement des bactéries sur un milieu permettant la sélection de mutants déficients en activité a-acétolactate décarboxylase, - sélection de mutants présentant une activité lactate deshydrogénase atténuée et déficients en a-acétolactate décarboxylase 14. Milieu de sélection de mutants présentant une activité lactate déshydrogénase atténuée caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante: Tryptone: entre environ 1 et 5 g/l Peptone papaïnique de soja : entre environ 2 et 10 gtl Peptone pepsique de viande : entre environ 1 et 5 g/l Extrait de viande: entre environ 2 et 10 g/l Extrait de levure: entre environ 1 et 5 g/l Glycérophosphate de sodium : 6H2O entre environ 5 et 30 g/I Acide ascorbique: entre environ 0,2 et 1 g/l Sulfate de magnésium: entre environ 0,1 et 0,52 gll Hydrogénophosphate de potassium : entre environ 0,2 et 1 g/l Agar: entre environ 5 et 30 g/l Glucose : entre environ 5 et 30 g/l Chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium: entre environ 0,05 et 0,2 g/l Eau distillée qsp Il 15. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 12 et 13 caractérisé en ce que le milieu gélosé de sélection de bactéries présentant une activité lac tate deshydrogénase atténuée comprend le milieu selon la revendication 14. 16. Procédé de production de composés issus de la voie de l'aacétolactate synthase comprenant les étapes suivantes: - mise en culture dans des conditions appropriées d'une bactérie selon l'une des revendications 1 à 11, - récupération des arômes. 17. Produit à usage alimentaire caractérisé en ce qu'il contient au moins une bactérie selon l'une des revendications 1 à 11, ou une partie de cette bactérie, ou un composé obtenu à l'aide de cette bactérie. 18. Produit selon la revendication 16 caractérisé en ce qu'il est issu du lait ou du lactoserum.