Brevet FR2778922A1 — publié le 19991126

La présente invention a pour objet la séquence de gènes de régulation de la synthèse de toxines produites par des bactéries du genre Clostridium. Elle est en outre relative à des polynucléotides comprenant ces séquences ainsi qu'à des microorganismes portant ces vecteurs. Les toxines tétanique et botulique sont des neurotoxines sécrétées par des bactéries du genre Clostridium, respectivement C.tetani et C. botulinum. Les gènes de structure de ces toxines ont été caractérisés dans 0o diverses souches. Dans le cas de la toxine botulique, les gènes de structure sont associés à des gènes codant pour des protéines non toxiques, ainsi qu'à des gènes de régulation au sein d'opérons chargés de produire ces toxines. L'organisation est sensiblement identique dans les sept groupes de toxines connus (A, B, C1, D, E, F et G). Elle a entre autres été décrite par HAUSER et al. (1994, Mol. Gen.Genet, 243, 631-640), EAST et al. (1994, System. Appl.Microbiol., 17, 306-312) ou encore EAST et al. (1996, Int. J.Syst. Bacteriol., 46, 1005-1012). Un gène a été identifié dans le toxinotype Cl. Puis, ce gène prédit pour être un gène de régulation de l'expression des toxines a été mis en évidence par BHANDARI et al. (1997, Curr. Microbiol., 35;207- 214) dans des souches de C. botulinum de type B. Ce gène a été appelé P-21, mais est encore connu sous la dénomination Orf21 ou BolR. L'organisation des gènes exprimant la toxine chez C.tetani est bien moins complexe que celle mise en évidence chez C.botulinum. Ainsi, les opérons ou groupes de gènes commandant la synthèse de la toxine tétanique ne comprennent qu'un seul gène de structure. BHANDARI et al. (1997, précédemment cité) font remarquer qu'il existe une homologie entre le gène de régulation appelé P-21 chez Clostridium botulinum, et l'extrémité C-terminale (29 acides aminés) d'une protéine codée en amont du gène de structure de la toxine chez Clostridium tetani. Néanmoins, il s'agit simplement d'une hypothèse et aucune preuve ne vient confirmer l'appartenance de cette séquence de 29 acides aminés à une protéine de régulation. En tout état de cause la séquence complète de ce gène n'est pas décrite. L'étude de la synthèse de ces toxines et de son organisation génétique présente pourtant un grand intérêt pharmaceutique, du fait de leur nature. En effet, la production de ces toxines, ou de leurs fragments, a été tentée dans divers microorganismes tels qu'Escherichia coi, Lactococcus lactis, Baculovirus et Pichia Pastoris, mais ces productions se sont révélées insuffisantes pour que ces microorganismes soient utilisés à une échelle industrielle. 1o Les inventeurs ont montré qu'il existe un gène de régulation chez Clostridium tetani, permettant une régulation positive de la synthèse de la toxine de cette bactérie. Ils ont en outre montré que ce gène, ainsi que d'autres gènes de régulation de bactéries du genre Clostridium, pouvaient être utilisés pour la production de diverses protéines par des bactéries du genre Clostridium. La présente invention a donc pour objet une séquence présentant une identité d'au moins 60%, et préférentiellement 75%, avec au moins une partie substantielle du gène de régulation tetR présentant la séquence SEQ ID N 1 suivante, ou s'hybridant en conditions stringentes,( ou rigoureuses), avec cette partie. Les pourcentages d'identité indiqués dans la présente invention ont été calculés par le programme Best Phit (logiciel GCG). SEQ ID N 1: AACTATATTA ATATACACAT CCTCGGTAAT ATATCAATAC AATACATGTA ATTAATAATG TTTTTTGTAA AAGMTTAAGC TTAGTGGTTT ACTTTCAAAA TATAATAAAA CGTTAATTAT AGAAAAGTGA AAGTAAGGTG ATG CTT ATG GAA AAT CTA TTT GTA AAA ATT AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT AAA GAA TTT GAA GTA ATT ATT ATA CAT TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA CTTATT CGA AAG TAT AAT TTA GAA AGTCAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT CATTTA TGG AAT ATA CTT AAA AAA ATT GAT TTG AAT AAA TTT AAT ACA GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGTAGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGT AAT AAA AAA AAT AGG GAT AAA AAA ATA ATA TAT AAC TCA GAA ATT ACA AAT ATA AAA TTA AAT TTA ATG GAA AAT AGT TGC TCA AAT TAT TTA AAC TTC GAA TTT AAT GAT TTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA AAT CAA AGA AAA ATT TTA TAT ATG AAA TTT TTT GAA TAT ATG AAA GAA TGT GAT ATA GCT AAG CTT CAT ATG AGT CGT CAA GCT GTA TAT AAA AAT AAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT AAT ATA T AGTTTTTATA ATTTAATTAT GAATAATATT CTTAAGATAA AAAGTAAATT TTTAAAAAAT TTAAATTTTC AGTTTACAAA AAATAACCTG ATTATGTTAT ATGTAATTGT AAAAAACATA TAAAAAATCA GAAAAATTTA GGAGGTATAT TATTAATGGA TTAAATAATA ATTTTTTAAT TTACTTTTGA TTAATAAATA TTAAATGTTT ATTTTAATTA GGAGATGATA CGTATGCC Une telle séquence comprend de manière préférentielle au moins une partie de l'extrémité 3' de la séquence SEQ ID N 1. Le terme " partie " ou " fragment " de l'acide nucléique désigne tout acide nucléique comportant au moins une partie de la séquence concernée (par exemple la séquence SEQ ID N 1) et conservant une activité de régulation. La partie de la séquence comprend avantageusement 50 pb au moins, plus préférentiellement au moins 100 pb. Ces " parties " peuvent être générées aisément par les techniques classiques de la biologie moléculaire, soit par clivage et digestion enzymatiques à partir des fragments décrits, soit par synthèse en utilisant des synthétiseurs d'acides nucléiques. Le terme " hybridant " désigne au sens de l'invention toute hybridation dans des conditions normales, rigoureuses ou non, telles que définies ci-après. Des conditions d'hybridation rigoureuses ou stringentes sont par exemple: hybridation à 42 C, 50% de formamide, 5 X SSC, 1 X Denhardt; lavage à 65 C en 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Des conditions non rigoureuses sont notamment: hybridation à 37 C, 40% de formamide, 5 x SSC, 1 x Denhardt; lavage à 50 C en 1 x SSC, 0,1 % SDS. Les conditions rigoureuses sont particulièrement adaptées lorsque les acides nucléiques sont présents en faibles quantités et/ou sous forme peu purifiée. Les conditions non rigoureuses sont plus adaptées lorsque l'acide nucléique est présent en quantités plus importantes et se trouve sous forme significativement représentée dans l'échantillon. Avantageusement, les séquences " hybridant " sont des séquences qui hybrident en conditions rigoureuses, et qui possèdent donc un degré d'homologie structurale élevé avec la séquence concernée (par exemple la séquence SEQ ID N 1) ou ses fragments. Les protéines ou peptides présentant une identité d'au moins 60% et préférentiellement 75%, avec une protéine ou un peptide comprenant une partie substantielle de la séquence SEQ ID N 2 suivante, constituent un autre objet de la présente invention. SEQ ID N 2: Met Leu Met Glu Asn Leu Phe Val Lys lie Lys Thr Leu Lys Asn Asn Asn Lys Glu Glu Val lie lie lie His Phe Lys Asn Thr Val Asn lile Leu lie Arg Lys Tyr Asn Leu Glu Ser His Tyr Asn Asp lie Leu Tyr His Leu Trp Asn lie Leu Lys Lys lie Asp Leu Asn Lys Phe Asn Thr Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr lie Ser Arg Ser Leu Lys Arg Tyr Cys Leu Asp lie Cys Asn Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys lie lie Tyr Asn Ser Glu lie Thr Asn lie Lys Leu Asn Leu Met Glu Asn Ser Cys Ser Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp Leu lie Ser lie Leu Pro Glu Asn GIn Arg Lys lie Leu Tyr Met Lys Phe Phe Glu Tyr Met Lys Glu Cys Asp lie Ala Lys Leu His Met Ser Arg Gln Ala Val Tyr Lys Asn Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu Pro lie Val Asn Lys Leu lie Asn lie De manière avantageuse, une telle protéine ou un tel peptide, présente une identité de séquence d'au moins 60% avec une protéine ou un peptide comprenant une partie substantielle de la séquence constituée par l'enchaînement des acides aminés en positions 125 à 175 de la séquence SEQ ID N 2. La présente invention est en outre relative à des polynucléotides comprenant tout ou partie d'au moins une séquence de régulation d'un opéron de synthèse de toxines produites par une bactérie du genre Clostridium, sous une forme isolée du reste des gènes compris dans ledit opéron. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention, ladite séquence de régulation est celle d'un opéron, ou groupe de gènes, intervenant dans la synthèse des toxines des espèces C. botulinum et C.tetani, ou une séquence présentant une identité d'au moins 60% avec 0o cette séquence. De manière avantageuse, un tel polynucléotide est présent, dans des conditions appropriées, sous forme de multicopies. Un polynucléotide est considéré comme étant présent sous forme de multicopies lorsqu'il est présent à raison de 200 à 300 copies par bactérie. En fonction des utilisations un oligonucléotide selon la présente invention peut néanmoins être présent sous un plus faible nombre de copies, par exemple à raison de 20 à 30 copies par bactérie. Un tel polynucléotide présente avantageusement une taille comprise entre 4 et 15 kb, et encore plus préférentiellement entre 6 et 9 2o kb. Il comprend une partie d'une séquence de régulation, qui peut être le gène tet/R (SEQ ID N 1), ou une séquence s'hybridant en conditions rigoureuses (stringentes) avec SEQ ID N 1, mais qui peut être celle de tout autre gène de régulation d'une bactérie du genre Clostridium, et en particulier les gènes botR/C ou botR/A ou parties de ces gènes, ou des séquences s'hybridant en conditions rigoureuses avec ces séquences. Un tel polynucléotide peut aussi comprendre deux, ou plus de deux séquences de régulation, jusqu'à 10 séquences de régulation. Il peut aussi comprendre au moins une séquence de régulation d'un opéron de synthèse de toxines produites par une bactérie du genre Clostridium, une séquence promotrice adaptée, et un gène de structure codant pour une protéine homologue ou hétérologue vis-à-vis de la séquence de régulation, ou une partie d'une de ces protéines. On entend par " protéine homologue " une protéine de structure issue du même microorganisme que la séquence de régulation. On entend par " protéine hétérologue " une protéine de structure issue d'un microorganisme différent que la séquence de régulation. Une " partie d'une protéine " peut être un fragment d'une toxine dépourvu d'activité toxique. On entend par " toxine " au sens de l'invention tout peptide, polypeptide ou protéine produit par une bactérie pathogène, et impliqué io dans ladite activité pathogène. Il peut s'agir d'un facteur directement responsable de la toxicité de la bactérie, ou participant à cette toxicité. Un " fragment " de toxine peut être constitué de toute partie d'une toxine, ayant conservé certains motifs immunogéniques de la toxine. En particulier, il a été décrit que les toxines bactériennes présentent souvent différents domaines fonctionnels distincts, et notamment un domaine impliqué dans l'activité toxique (site catalytique) distinct d'autres domaines impliqués dans la reconnaissance de sites ou dans des interactions avec des partenaires. Un " fragment " de toxine selon l'invention est constitué avantageusement d'un domaine dépourvu d'activité toxique, mais conservant un pouvoir immunogène. Un variant de toxine peut être constitué par exemple d'un dérivé résultant de modifications génétiques de la séquence codant pour ladite toxine ou fragment de toxine. De telles modifications génétiques sont par exemple des mutations, délétions, fusions, etc. Généralement, les mutations affectent de 1 à 10 résidus, de préférence de 1 à 5 résidus. Ces mutations sont des mutations modifiant l'acide aminé codé, et donc la séquence de la protéine. Les délétions peuvent être des délétions internes ou terminales. Elles peuvent affecter jusqu'à 40% de la séquence entière. Les fusions consistent à introduire des régions supplémentaires en 5' et/ou en 3' de la séquence, ou éventuellement à insérer de telles régions au sein de la séquence. Ces modifications peuvent être effectuées dans le but soit de diminuer, voire supprimer la toxicité de ces protéines, soit d'améliorer leur production ou leur stabilité par exemple. De telles modifications génétiques peuvent être réalisées selon les conditions classiques de la biologie moléculaire, et sont illustrées dans l'état de la technique. L'expression de tels gènes peut être gouvernée par le promoteur d'origine, mais ce promoteur peut être remplacé par tout autre promoteur permettant une expression du gène. Les polynucléotides selon la présente invention doivent en outre contenir des séquences permettant leur multiplication au sein des bactéries, ainsi que de manière générale leur fonctionnement. Ainsi, de tels polynucléotides doivent comprendre une origine 0o de réplication, qui selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention peut permettre d'obtenir un grand nombre de copies de ces vecteurs au sein d'une même bactérie. La séquence promotrice peut être celle du gène de la toxine iota ou du gène de régulation tetR ou d'un gène d'une toxine de Clostridium telle que citée ci-après. Un oligonucléotide selon l'invention peut être contenu dans un vecteur ou plasmide. Un tel vecteur peut être le pMRP309 (botR/A), le pMRP365 (tet/R), le pMRP319(botR/C), qui sont des plasmides obtenus par clonage des fragments d'ADN présentant les séquences SEQ ID N 16, SEQ ID N 12 et SEQ ID N 14 suivantes, dans le site Smal du vecteur pAT1 8. SEQ ID N 12: AAGCTTATTT TACATTAAAT TACTTTTATT GATAAAAATA TATTTTTTGT ATTTATATAG AGATTTTCTT TGTCATATAC TGTATAATAT TTATATAATA TTAATACATA ATATTATAAC TAAATTCAAA ATAGAAAGGA GGTTATCTTATGTTAAAAAG AAAAATTTAA AATACTATTT TCATTATTTG AAGATTGAAT CTTAAATAAA CTTGAATTAG GAGGGAGTAC CC ATG GTT ATG GAAAAT CTA TTT GTA AAA ATT AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT AAA GAA TTT GAA GTA ATT ATT ATA CAT TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA CTT ATT CGA AAG TAT AAT TTA GAA AGT CAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT CAT TTA TGG AAT ATA CTT AAA AAA ATT GAT TTG AAT AAA TTT AAT ACA GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGT AGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGT AAT AAA AAA AAT AGG GAT AAA AAA ATA ATA TAT AAC TCA GAA ATT ACA AAT ATA AAA TTA AAT TTA ATG GAA AAT AGT TGC TCA AAT TAT TTA AAC TTC GAA TTT AAT GAT TTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA AAT CAA AGA AAA ATT TTA TAT ATG AAA TTT TTT GAA TAT ATG AAA GAA TGT GAT ATA GCT AAG CTT CAT ATG AGT CGT CAA GCT GTA TAT AAA AAT AAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT AAT ATC TGCAGATAAA AATTATATTT AAAATTATTA ATAAATATCA AAATTAATAA 5 AGCTAGTTAT TCATACTGGC TACCTATATA AATATTTCTC GATTACTTAC AGAGGATGTC AATAATTTTG TGTAAACTAT CTAAAGAAAT ATATTGAAAT TTGTTGAGGT TTAGATAATA TTTTATTTAA ACCTTAATTT TCTTTTTATG TAATTATAGT GAATATAAAT TGTACAAAAA CTAGAGATAT TTCTAGA10 SEQ ID N 14: AAGCTTATTT TACATTAAAT TACTTTTATT GATAAAAATA TATTTTTTGT ATTTATATAG AGATTTTCTT TGTCATATAC TGTATAATAT TTATATAATA TTAATACATA ATATTATAAC TAAATTCAAA ATAGAAAGGA GGTTATCTTA TGTTAAAAAG AAAAATTTAA AATATATTTT CATTATTTGA AGATTGAATC TTAAATAAAC TTGAATTAGG AGGGAGTACC20 ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT ATG AAT GAT TTA TTT TAT GCT ATA GAA AAT TTA AAG CAT GAT AAC CAG CAC TTT AAC TTT ATT GAA ATG TCT CTA AAA AAA TAT ATT GAA AAA ACT TCT AAA AAG TAT AAT TTA TAT TAT GAT TAT TAT AAT GAT ATA CTG TAT CAT TTA TGG AAA GAA25 CTT ATT GAA ATT AAC TTA AAG AAT TTT AAT TCT GAA TTA GAT TTA AGA AAA TAT ATT AGT ACA AGT ATA AAA AGA TAT TGT ATA AAT ATT TGT AAG AAA AAA AAT AGG GAT AAG AAA ATT ATA TAT AAT TCA GAA GTA ACA TAT AAA AAA TTG GAT GT GGTA AAT GTT TAT TCT TTA TAT TGT GAT AAT TTC GAG TTT TTG GAT TTG ATA TCC ATA TTA AAC30 TAC AAG GAA AAG CAA ATT ATA TAT ATG AAA TTT TTT GAA GGT AGA AAA GAT AAT GAA ATA GCT ATA AGG CTT CGT TTA AGT CGT CAA TCT ATA TAT AAG ATT AGA ATT ACG TCT TTA AAA AAG TTG TAT CCT ATA GTA ATG CAA TTA GTT AAT ATT T GACTGCAGAT AAAAATTATA TTTAAAATTA TTAATAAATA TCAAAATTAA TAAAGCTAGT TATTCATACT35 GGCTACCTAT ATAAATATTT CTCGATTACT TACAGAGGAT GTCAATAATT TTGTGTAAAC TATCTAAAGA AATATATTGA AATTTGTTGA GGTTTAGATA ATATTTTATT TAAACCTTAA TTTTCTTTTT ATGTAATTAT AGTGAATATA AATTGTACAA AAACTAGAGA TATTTCTAGA SEQ ID N 16: GGTAGAAAAG TTCTTTCAAC TGGACATATA ATTCACCTCT TTATAAATTA GATGATAGTA CTCATATTAA ATCTTTGTTG ATATTAATTT TATGGGTTAC GAATATTCCA TTTCTGATTA TCATCTCCAT GATAATTAAA TACTTGAATA GCAGTTCCGT TTGCTGTTTG GCTGTTATAT AAATCTAGAT CCATACTTTT TATTTTATAA GCAGCTTTAT TAGAATCATA TATAAGTCTC CATCTTTCAA GGTAATTTCT AGTTTGTTGA AATAAGCTAA CGTTACCGGC AACTTGATAA AAAAATAAAT TAGTATCGGC CTTACAGGAG ATGGTAACAA TTITGTCATT TAATGAATTT TGGATTACTG AATAGTGTTC CATTATGATT CCTCCTTTAT TTAAGAATTA ATCTTACATA TAACATATAA CATAATCAAG TTATTTTTTG TAAACCTAAA ATTTAAATAT ATCAAATIT TATTAGTATG TTTACATAAT TGATTATGGA TATTTCGTAA AAATGGCTTA TTAAAAATTT AAAGGCAATT AGTTTATTTA TAGTATAATA AAACAATAAT ATGTATATTA TGGAGGGATA GTGGTAAAT ATG AAT AAG TTG TTT TTA CAA ATT AAA ATG TTA AAA AAT GAC AAC GAG GAG TTT CAA GAA ATT mT AAG CAT T GAA AAA ACT ATA AAT ATA TTT ACT AGA AAA TAT AAT ATA TAT GAT AAT TAC AAT GAT ATT TTG TAC CAT TTA TGG TAT ACA CTT AAA AAA GTT GAT TTG AGC AAT TTC AAT ACA CAA AAT GAT TTA GAG AGA TAT ATT AGT AGG ACT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGC AAT AAA AGA AAG ATT GAT AAG AAA ATA ATA TAT AAT TCA GAA ATT GCA GAT AAG AAA TTA AGC TTA ATA GCA AAT AGT TAT TCA AGT TAT TCA GAA T GAA TTT AAT GAT TTA ATA TCC ATA TTA CCT GAC GAT CAA AAG AAA ATT ATA TAT ATG AAA T GTT GAA GAT ATT AAG GAG ATA GAT ATA GCT AAA AAA CTT AAT ATA AGT CGT CAA TCT GTA TAT AAA AAT AAA ATA ATG GCT TTA GAG AGA TTA GAA CCC ATA TTG AAA AAA TTA ATT AAT ATG T AGTTATATT TTTAAAAAAT TMAGGTMA CAAAAAATAG TGTGGCTATG TTATATATAA ATGATAAGAA TATACTGAAA AATGTATCCA AAATTAAGG GGGCGTGTAT AGTAAATAAT TAAAAGTATG TGCGTTGAAA TAAATTTAGG AGAGTGGTTA GATATGAATA TAAATGACAA CTTAAGTATA AATTCCCCGG TAGATAATAA AAATGTT Le pMRP309 est un plasmide recombinant permettant l'expression du gène régulateur BotR/A de C. botulinum A sous contrôle de son propre promoteur. Le fragment d'ADN (nucleotides 2479 à 4425 de la séquence déposée à l'EMBL sous le numéro d'accès L42537) a été amplifié par PCR à partir de la souche de C. botulinum A 62 et cloné dans le vecteur pAT18 au site Smal. Ce fragment d'ADN contient les régions codantes pour les gènes de botR/A (dénommé aussi Orf21 ou OrfX) et le composant de 34 kDa de l'hémaglutinine (HA34). Le gène de I'hémaglutinine a été excisé par digestion aux sites Xbal et EcoRV (délétion des nucléotides 2664 à 3253) et religation du plasmide sur lui- même. Le site Xbal du vecteur avait été au préalable éliminé par coupure aux sites BamHI-Sall et religation du vecteur sur lui même. région 3450 - 3473 région promoteur du gène BotR/A région 3474 - 4210 région codante pour BotR/A (179 acides aminés) région 4211 -4425 partie 3' non codante du gène BotR/A La construction est illustrée par la figure 16 qui représente les séquences des trois régions mentionnées ci-dessus. La partie insérée dans pAT18 correspond à la séquence SEQ ID N 16. Le plasmide pMRP365 contient la region codante pour le gène régulateur tetR sous contrôle du promoteur du gène de la toxine iota de C. perfringens et la partie 3' du gène de la toxine iota de C. perfringens. La région promoteur de gène de la toxine iota de C. perfringens io (nucléotides 1241 à 1464 de la séquence déposée à l'EMBL sous le numéro d'accès X73562) a été amplifiée par PCR à partir de la souche de C. perfringens E NCIB10748 en ajoutant un site HindIll à l'extrémité 5' et le site Ncol à la partie 3'. Les régions -10 et -35 du promoteur ont été déterminées par la technique d'extension d'amorce. La région codante du gène de TetR (nucléotides 56 à 604) a été amplifiée par PCR à partir de la souche de C. tetani CN655, en ajoutant un site Ncol en partie 5' au niveau du codon intial de traduction et un site Pstl en partie 3' juste en aval du codon de terminaison. Cette partie code pour 179 acides aminés. Le deuxième acide aminé Leu de la séquence initiale a été changé en Val du fait de l'introduction du site Ncol. La partie 3' du gène de la toxine iota de C. perfringens a été amplifiée par PCR (nucléotides 5504 à 5739 de la séquence X73562) en introduisant un site Pstl en partie 5' et un site Xbal en partie 3'. Cette partie non codante est indispensable pour l'expression de gènes de Clostridium dans les vecteurs navettes pAT18 ou pJIR750 transformés dans Clostridium. Les fragments d'ADN ont été agencés dans le vecteur navette pAT18 entre les sites Hindlll et Xbal. Région 1241 à 1464 Promoteur de la toxine iota de C. perfringens E Région 56 à 604 code pour les acides aminés 1 à 179 de la protéine régulatrice tetR de C. tetani. 1l Région 5504 à 5739 Partie 3' du gène de la toxine iota de C. perfringens E. La construction est illustrée par la figure 17 qui représente les séquences des trois régions mentionnées ci-dessus. La partie insérée dans pAT18 correspond à la séquence SEQ ID N 12. Le plasmide pMRP319 est un plasmide recombinant permettant l'expression du gène régulateur BotR/C de C. botulinum C sous contrôle du promoteur du gène de la toxine iota de C. perfringens. La région promoteur de gène de la toxine iota de C. perfringens 0o (nucléotides 1241 à 1464 de la séquence déposée à l'EMBL sous le numéro d'accès X73562) a été amplifiée par PCR à partir de la souche de C. perfringens E NCIB10748 en ajoutant un site HindIll à l'extrémité 5' et le site Ncol à la partie 3'. Les régions -10 et -35 du promoteur ont été déterminées par la technique d'extension d'amorces. 1 5 La région codante du gène BotR/C (dénommé aussi Orf22) correspondant aux nucléotides 302 à 841 (acides aminés 1 à 179) de la séquence de l'EMBL ayant le numéro d'accès X72793 a été amplifiée en générant à l'extrémité 5' le site Ndel et à l'extrémité 3' le site Pstl à partir de la souche de C. botulinum C468. Ce fragment d'ADN a été cloné 2o dans le vecteur pET28b (Novagen) et le fragment Ncol-Pstl a été incldu dans le plasmide pMRP319. De ce fait, le fragment Ncol-Ndel du vecteur pET28b reste en amont du gène de BotR/C. La partie 3' du gène de la toxine iota de C. perfringens a été amplifiée par PCR (nucléotides 5504 à 5739 de la séquence X73562) en introduisant un site Pstl en partie 5' et un site Xbal en partie 3'. Cette partie non codante est indispensable pour l'expression de gène de Clostridium dans les vecteurs navettes pAT18 ou pJIR750 transformés dans Clostridium. Les fragments d'ADN ont été agencés dans le vecteur navette pAT18 entre les sites Hindlll etXbal. Région 1241 à 1464 Promoteur de la toxine iota de C. perfringens E Région Ndel-Ncol de pET28b Région 302 - 841 Région codante de BotR/C (acides aminés 1 à 179). Région 5504 à 5739 Partie 3' du gène de la toxine iota de C.perfringens E La construction est illustrée par la figure 18 qui représente les séquences des quatre régions mentionnées ci-dessus. La partie insérée dans pAT18 correspond à la séquence SEQ ID N 14. Ces plasmides sont compris dans les bactéries E. Coli déposées le 12.Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n 1-2010 (pMRP309), 1-2012 (pMRP 365) et 1-2011 (pMRP319). is lis sont aussi compris dans les bactéries C. tetani CN655 déposées le 18 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n 1-2020 (pMRP309), 1-2022 (pMRP365) et 1-2021 (pMRP319). Un tel vecteur peut en outre porter un gène de structure codant pour une protéine hétérologue vis-à-vis de la séquence de régulation, ou pour une partie d'une protéine homologue, telle que la partie C-terminale de la toxine tétanique. La présente invention a de plus pour objet un microorganisme caractérisé en ce qu'il comprend au moins un vecteur, un polynucléotide ou une séquence tels que décrits ci-dessus. Avantageusement, un tel microorganisme porte un gène codant pour une protéine hétérologue, une protéine homologue ou des parties de ces protéines. Une protéine hétérologue peut être toute protéine de structure issu d'un microorganisme différent de celui de la séquence de régulation, et en particulier des toxines butyliques, ou des fragments de ces toxines, tels que des fragments correspondant fonctionnellement au fragment C de la toxine tétanique, ou des toxines de Clostridium ou des variants immunogènes mais non toxiques à usage vaccinal. Une protéine homologue peut être par exemple une partie dépourvue d'activité toxique, d'une toxine produite par une bactérie du genre Clostridium. Comme indiqué ci-dessus le polynucléotide peut comporter d'une part le gène de régulation et d'autre part un gène de structure codant pour une protéine homologue ou hétérologue ou une partie de ces protéines. Néanmoins, ces deux gènes peuvent être portés par des vecteurs indépendants, présents tous les deux au sein du microorganisme. De manière particulièrement avantageuse, un tel microorganisme est une bactérie du genre Clostridium choisie parmi C. absonum, C. baratii, C. bifermentans, C. chauvei, C. difficile, G. ghonii, C. lituseburense, C. novyi, C. perfringens, C. septicum, C. sordellii, C. subterminale et C. tetani. De manière préférentielle, un tel microorganisme appartient à l'espèce C. tetani, C. perfringens ou E. coli. Il peut être ainsi en particulier une souche de C.tetani, débarrassée du plasmide codant naturellement pour la toxine tétanique. L'utilisation des polynucléotides selon la présente invention, portant au moins une partie d'un gène de régulation, permet d'obtenir une augmentation importante des rendements de production en protéine dont la synthèse est mise sous le contrôle des séquences de régulation adéquates des gènes de synthèse des toxines, par rapport à des bactéries ne portant pas ces polynucléotides. De ce fait, il est possible de modifier les souches de C. tetani afin d'améliorer les rendements de production de la toxine tétanique, ou de produire d'autres protéines telles que des fragments de toxine tétanique qui ne sont plus toxiques mais qui retiennent l'immunogénicité de la toxine entière. Ainsi, la surexpression du gène tetR à l'aide d'un vecteur multicopies (100 à 200 copies pour pAT19) permet d'augmenter au minimum d'un facteur de 10 à 20 la production de toxine tétanique. Comme le gène de la toxine tétanique est porté sur un plasmide de grande taille chez les souches sauvages, des souches dérivées sans plasmide et non toxinogènes peuvent être facilement obtenues. Il est alors possible d'introduire, à l'aide d'un vecteur navette tel que pJIR750 décrit ci-après (marqueur de sélection: chloramphénicol), des gènes recombinants codant pour un fragment non toxique de toxine tétanique io (fragment Hc) ou pour une autre protéine, sous contrôle du promoteur du gène de la toxine tétanique. Le gène régulateur TetR est surexprimé par transformation de ces souches avec le vecteur pAT19 décrit ci-après (sélection: erythromycine) portant ce gène. Les deux vecteurs pJIR750 et pAT19 peuvent coexister. Une telle propriété présente un avantage considérable, dans le cas de production industrielle de l'une de ces protéines. En outre, I'utilisation de bactéries du genre Clostridium permet de récupérer les protéines dans le surnageant de culture, car ces protéines sont sécrétées par ces microorganismes. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de production d'une ou plusieurs protéines hétérologues ou homologues comprenant les étapes suivantes: - mise en culture d'un microorganisme tel que décrit cidessus, et - récupération desdites protéines. De manière avantageuse, ces protéines sont récupérées dans le surnageant de culture des microorganismes. Bien que la présente invention soit particulièrement destinée à la production de protéines d'intérêt pharmaceutique, ce procédé peut être utilisé pour toute protéine pouvant être exprimée, et si possible sécrétée par des bactéries du genre Clostridium. La présente invention est néanmoins particulièrement destinée à la production de protéines d'intérêt pharmaceutique. Plus particulièrement, I'invention est adaptée à la production des toxines ou variants suivants: Toxine bêta 2 de Clostridium peffringens ou tout fragment immunogène. Le profil d'hydrophilicité de la toxine bêta 2 fait apparaître plusieurs régions hydrophiles qui définissent des fragments particuliers au sens de l'invention. Ces régions sont notamment localisées au niveau des résidus d'acides aminés 40-55, 105- 120, 160-170, 175-188, 200-210 et 250-260. Par ailleurs, des fragments de la toxine bêta 2 dépourvus de toxicité sont notamment les fragments trypsiques de 24, 15 et 13 kDa. Toxine bêta 1 de Clostridium perfringens ou tout fragment immunogène. La séquence de cette toxine a été décrite par HUNTER et Io al. (1993, Infect. Immun. 61, 3958-3965). Toxines iota de Clostridium perfringens ou tout fragment immunogène. La séquence des gènes codant pour les toxines iota1 (gène la) et iota2 (gène lb) a été décrite par PERELLE et al. (1993, Infect. Immun. 61, 5147-5156). 1 5 Toxine alpha de C. novyi ou tout fragment immunogène. La séquence du gène de cette toxine (gène tcna) a été décrite par HOFMANN et al. (1995, Mol. Gen. Genet 247 670-679). Toxine alpha de C. septicum ou tout fragment immunogène. La séquence du gène de cette toxine a été décrite par BALLARD et al. (1995, Infect. Immun. 63, 340-344). Toxines a et B de C. difficile ou tout fragment immunogène. La séquence du gène de ces toxines a été décrite dans la littérature, ainsi que différentes régions immunogènes par VON EICHEL-STREIBER et al. (1992, Mol. Gen. Genet 233, 260-268), VON EICHEL-STREIBER et al. (1989, J. Gen. Microbio. 135, 55-64); VON EICHEL-STREIBER et al. (1992, J. Bacteriol. 174, 6707-6710). Toxine epsilon de C. perfringens (WORTHINGTON et al.1973, Onderstepoort J. Vet. Res. 40(4) 145-152; HUNTER et al.1992, Infect. Immun. 60, 102-110). Entérotoxine de C. perfringens (McCLANE, Toxicon 34,1996, 1335-1343). Toxine de C. chauvoei (CRICHTON et al.1986, Australian Vet. J. 63, 68). Cytotoxine L de C. sordellii ou tout fragment immunogène. La séquence du gène de cette toxine a été décrite par GREEN et al. (1995, Gene 161, 57-61), ainsi que différentes régions immunogènes. En particulier, cette toxine est constituée d'une protéine de 270 kDa environ et différents fragments antigéniques ont été décrits. Toxine tétanique, toxine botulique, en particulier le fragment C de ces toxines qui est le fragment immunogène (MAKOFF et al.1989, Bio/Technology 7, 1043; FIGUEIREDO et ai. Infect. Immun. 63 1995, 3218- 3221; WELLS et al., 1993, Molecular Microbiol. 8, 1155-1162; BOUCHER et al., 1994, Infect. Immun. 62, 449-456; CLARE et al. 1991, Bio/Technology 9, 455; CLAYTON et al.1995, Infect. Immun.63, 2738- 1o 2742). Toxine de Bordetella pertussis ou tout autre toxine bactérienne. La présente invention a donc pour objet un vaccin ou un médicament caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide, une séquence, un vecteur, un microorganisme, ou une protéine obtenue par culture d'un microorganisme selon la présente invention, ou d'une protéine obtenue par culture de ce microorganisme. Un tel vaccin est particulièrement adapté aux infections par C. tetani. Elle est en outre relative à une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmacologiquement efficace d'un polynucléotide, d'une séquence, d'un vecteur, d'un microorganisme ou d'une protéine obtenue par culture de ce microorganisme, et des excipients pharmaceutiquement acceptables. Elle est enfin relative à l'utilisation de ces polynucléotides, séquences, vecteurs, microorganismes ou protéines obtenues par culture de ces microorganismes pour l'immunisation à l'encontre de maladies liées aux bactéries du genre Clostridium, ou pour le traitement de ces maladies. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples suivants. La figure 1 représente la séquence nucléotidique et la séquence en acides aminés déduite du gène tetR. * La figure 2 illustre les identités de séquence entre les différents gènes régulateurs et le gène tetR. La figure 3 illustre l'activité léthale de surnageants de culture des souches CN655 (souche sauvage, WT), CN655-OE surexprimant le gène tetR, CN655-botR/A surexprimant le gène BotR/A et CN655- BotR/C surexprimant le gène BotR/C sur des souris. L'activité léthale (LD50) de ces surnageants est mesurée en fonction de la densité optique à 600 nm de chaque culture. La figure 4 illustre la production de TeTx mise en évidence par Western Blot à l'aide d'anticorps anti TeTx, respectivement dans la source CN655 sauvage (figure 4A), la souche surexprimant le gène îo BotR/A (figure 4B), la souche surexprimant le gène BotR/C (figure 4C), et la souche surexprimant le gène tetR (figure 4D). Les surnageants de chacune des cultures ont été concentrés par précipitation. 20pg de protéines ont été chargés dans le puits 1 et des dilutions de moitié effectuées en série, ont été chargées dans les puits suivants (puits 2 à 4). Dans les figures 4B et 4D la bande supérieure correspond à la TeTx entière et la bande inférieure à la chaîne lourde H. La figure 5 représente une électrophorèse sur gel de polyacrylamide de protéines extracellulaires de la souche sauvage CN655 de C.tetani (puits 1) et de la souche recombinante surexprimant le gène tetR (puits 2). La bande identifiée par H correspond à la chaîne lourde de TeTx, tandis que L correspond à la chaîne légère. La figure 6 représente des hybridations ponctuelles (dot blots) d'ARNs messagers de la souche sauvage CN655 (WT), et des souches recombinantes surexprimant le gène tetR (OE), le gène botR/A, et le gène botR/C. L'hybridation est effectuée à l'aide de sondes spécifiques du gène TeTx. Les quantités d'ARNs messagers sont indiquées au- dessus de chaque colonne (20 pg, 10pg, 5 pg et 2,5 pg). La figure 7 est une représentation schématique du site codant pour les neurotoxines botuliniques de types A, B, C et D de C. botulinum et du type G de C.argentinense. La figure 8 illustre la stratégie utilisée pour construire le gène codant pour l'ARN messager anti-sens pour le gène botR/A. La figure 9 illustre la toxicité chez la souris de surnageants de culture respectivement de la souche sauvage 62, de la souche recombinante 62-OE surexprimant le gène botR/A et de la souche recombinante 62-AS produisant des ARNs messagers anti-sens pour le gène botR/A. La toxicité (LD 50) est mesurée en fonction de la densité optique des cultures. Les figures 10 à 10C illustrent respectivement la production de BoNT/A, dosée par hybridation de type Western, à l'aide d'anticorps anti- BoNT/A, respectivement par la souche sauvage 62 (figure 10A), par la souche 62-OE (figure 10B) et par la souche 62-AS (figure 10C). Le surnageant de chaque culture a été chargé dans les puits N I1 et des dilutions de moitié ont été chargées dans les puits suivants. Les flèches indiquent les positions correspondant à la neurotoxine entière (BoNT), la chaîne lourde (H) et la chaîne légère (L). La figure 11 illustre la production de protéines non toxiques NTNH, dosée par hybridation de type Western à l'aide d'anticorps anti- NTNH dans la souche sauvage (figure 11A), la souche 62-OE (figure 11B) et la souche 62-AS (figure 11C). Les figures 12A à 12C illustrent respectivement la production des protéines HA34 et de HA70 partiellement clivées par hybridation de type Western, respectivement dans la souche sauvage (figure 12A) dans la souche 62-OE (figure 12B) et dans la souche 62-AS (figure 12C). La figure 13 représente des dosages par dot blots d'ARNs messagers des souches sauvages 62 (wt), 62-OE (oe) et 62-AS (as) à l'aide de sondes spécifiques des gènes bont/A, ntnh, ha70, et ha34. La quantité totale d'ARN messager chargée dans chaque puits est indiquée (20 à 0,1 pg). La figure 14A représente un test de mobilité sur gel. Un fragment d'ADN marqué correspondant au promoteur ntnh (puits 2) a été mélangé avec un extrait cellulaire de la souche 62-OE (puits 3). La mobilité observée avec l'extrait cellulaire n'est plus observée lors de l'addition d'un excès d'ADN non marqué (puits 1). L'addition d'anticorps polyclonal dirigée contre BotR/C à l'extrait cellulaire et à l'ADN marqué augmente le retard du gel (puits 4). La figure 14B illustre la spécificité d'anticorps polyclonaux anti- BotR/C par hybridation de type Western. Les extraits cellulaires de la souche sauvage 62 (puits 1) et de la souche recombinante 62-OE (puits 2) ont été mis à migrer sur un gel PAGE-SDS puis transférés sur nitrocellulose et hybridés avec un anticorps anti-BotR/C. La figure 15 illustre l'immunoprécipitation de la protéine botR/A liée au promoteur des gènes ntnh (figure 15A) et ha (figure 15B), mais pas aux régions codantes du gène botR/A (figure 15C). Des extraits cellulaires de la souche 62-OE ont été incubés avec des fragments d'ADN marqués, des anticorps anti-BotR/C immunopurifiés et ont été immunoprécipités avec des billes d'agarose-protéine A (puits 1). Les bandes d'ADN marquées ont été visualisees par autoradiographie du gel 1o SDS-PAGE séchees (figures 15A à 15C) et les protéines ont été visualisées par hybridation de type Western avec des anticorps anti- BotR/C puis par chimioluminescence (figure 15D, figure 15E et figure F). Les témoins négatifs comprenant des fragments d'ADN marqués incubés avec des anticorps anti-BotR/C et dépourvus d'extrait cellulaire (puits 2) avec des extraits cellulaires et sans anticorps anti-BotR/C (puits 3) et avec des extraits cellulaires et des immunoglobulines de lapin non spécifiques (puits 4) ont été effectués. Des témoins positifs consistant en de l'ADN marqué mélangé avec l'extrait cellulaire sans l'immunoprécipitation par l'agarose-protéine A ont été effectués (puits 5). BotR/A a été immunoprécipité dans les trois dosages (figure 15D, figure E et figure 15F). Les fragments d'ADN des régions promotrices de ntnh et de ha ont été co-immunoprécipités avec BotR/A, tandis que le fragment d'ADN d'une taille identique de la région codante de bont/A (figure 15C) n'était pas immunoprécipité. Les figures 16, 17 et 18 illustrent les constructions respectivement des plasmides pMRP309, pMRP365 et pMRP319. Les matériels et méthodes utilisés sont les suivants. Matériels et méthodes Souches batériennes et plasmides. La souche de C. tetani CN655 et les souches recombinantes ont été cultivées dans du milieu contenant de la trypticase (30 9/l), de l'extrait de levure (20 9/l), du glucose (5 9/l) et de la cystéine HCI (0,5 9/l) (pH 7,2) dans des conditions anaérobies. L'ADN de Clostridium a été extrait et purifié comme décrit précédemment POPOFF et al. (1985, J. 1o Gen. Microbiol, 131:1697-1703). Techniques de bioloqie moléculaire. Les ligatures, transformations, séquençages et préparations d'ADN plasmidique à partir d'Escherichia coli ont été effectués selon les procédures habituellement utilisées et décrites par SAMBROOK et al., (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Transformation de C, tetani et de C. botulinum par électroporation. Des cellules compétentes de C.tetani CN655 ont été préparées en conditions anaérobies. Des bactéries d'une culture dans du TGY (100 ml) ont été centrifugées au milieu de leur phase de croissance exponentielle, lavées dans de l'eau distillée et suspendues dans 0,5 ml de Na2HPO4, pH 7,4, contenant MgCI2 (1 mM) et du saccharose (270 mM). L'ADN plasmidique (1 à 5 pg) produit dans la souche d'E.coli HB101, a été ajouté à 50 pl de suspension cellulaire. L'électroporation a été effectuée en conditions non-anaérobies en utilisant l'appareillage commercialisé sous la dénomination " gene pulser " par Bio-Rad (2,5 kV, 200 O et 25 mF) et en utilisant une cuvette hermétiquement scellée en atmosphère anaérobie. Les bactéries ont été diluées dans du TGY, incubées durant 3 heures à 37 C et étalées sur de l'agar TGY contenant pg/ml d'érythromycine dans des conditions anaérobies. L'électroporation des cellules de la souche de C.botulinum A NCTC 2916 et 62 a été effectuée comme indiqué précédemment pour les souches de C.tetani. Les témoins de transformation sont pGK12 et pAT19 qui peuvent être transférés dans diverses bactéries Gram-positive. L'efficacité de transformation de la souche NCTC2916 de C.botulinum par le plasmide pGK12 est de 102 à 103, et de 10 à 102 transformant par pg d'ADN pour le plasmide pAT19 isolé à partir de la souche d'Escherichia coli HB101. Construction du plasmide d'expression du gène BotR/A Un fragment d'ADN contenant le gène BotR/A et sa région promotrice (entre les positions 3250 et 4426 numérotées selon la séquence du site de la neurotoxine botulique de la souche NCTC2916 correspondant au numéro L42537 de GenBank tel que décrit par HENDERSON et al.,( 1996, FEMS Microbiol. Lett. 140, 151-158)) a été amplifié par PCR à l'aide des amorces présentant les séquences SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 à partir de la souche de C. botulinum NCTC2916 et a été inséré dans le plasmide pUC18 au site Smal. Le fragment a été éliminé par digestion avec KpnI-Pstl et a été ensuite inséré entre les sites Kpnlet Pstl de pAT19. Le plasmide résultant (pMR309) a été transformé dans la souche 62 de C.botulinum et a donné naissance à la souche 62-OE. Le plasmide pMRP309 a fait l'objet d'un dépôt, dans la souche SURe d'Escherichia coli auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur le 12 Mai 1998 sous le N 1-2010. Construction des plasmides pour l'expression des gènes tetR et botR/C. Un fragment d'ADN contenant les régions codant pour le gène TetR a été amplifié par la technique d'amplification PCR à partir de la souche CN655 de C tetani à l'aide des amorces présentant les séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 suivantes (P516 et P517): SEQ ID N 3 NCOI (P516) CCATGG TTA TGG AAA-ATC TAT TTG TAA AAA SEQID N 4 Pstl (P517) CTGCAG CTA TAT ATT AAT TAA TTT ATT TAC TAT AGG Le produit d'amplification coupé par Ncol et Pstl a été clone dans un vecteur multicopies pAT19 en aval du promoteur du gène de la toxine iota de C.perfringens et en amont de la partie 3' du gène ibp de la toxine iota comme décrit ci-dessus pour l'expression du gène BotR/A (pMRP306). Le plasmide résultant pMRP365 a été transféré dans la souche C.tetani CN655 donnant naissance à la souche CN655-OE. La souche d'Escherichia coli SURe contenant pMRP365 a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur le 12 Mai 1998 sous le n 1-2012. Une construction similaire a été effectuée avec BotR/C. La région codante de BotR/C a été amplifiée par PCR à partir de la souche de C. botilinum 468 HAUSER et al. ( 1994, Mol. Gen. Genet, 243:631-640), en utilisant les amorces de séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 suivantes: SEQID N 5 (P392) CATATG AATGATTTATTTTATGCTATAG SEQ ID N06 (P326) CTGCAGTCAAATATTAACTAATTGCATTAC Le produit d'amplification a été ensuite cloné et a donné naissance à pMRP319. Le plasmide résultant a été transféré dans la souche CN655 de C.tetani et la souche résultante a -été appelée CN655-BotR/C. La souche d'Escherichia coli SURe contenant ce plasmide a été déposée auprès de la CNCM le 12 Mai 1998 sous le n 1-2011. Construction d'un vecteur codant les ARNs messagers anti-sense pour le gène BotR/A. Un fragment nucléotidique de 73 paires de bases contenant le site de liaison du ribosome et les 18 premiers codons 5' du gène BotR/A a été amplifié par la méthode PCR et a été inséré dans une orientation inverse dans le plasmide pAT19 en aval du promoteur du gène de la toxine iota de C.perfringens, et en amont de l'extrémité 3' du gène lb de la toxine iota décrit dans l'article de PERRELLE et al..(1993, Infect. Immun., 61, 5147-5156), comme le montre la figure 8. Le plasmide recombinant pMRP306 a été introduit dans la souche 62 de C. botulinum par électroporation. La souche recombinante a été appelée 62-AS. Isolement de I'ARN et dot blots d'ARN. L'ARN total a été extrait à partir de cultures de C.tetani en milieu de phase de croissance en utilisant du Trizol (GIBCO BRL, Cergy, Pontoise, France). Le culot bactérien d'une culture de 10 ml a été lavé deux fois dans de l'eau distillée et suspendu dans 200 ml de Tris-HCI 10 mM (pH 7)-EDTA (10 mM) saccharose (20%), contenant 1 mg de lysozyme. Le mélange a été incubé durant 30 mn à 37 C et centrifugé. Le culot a été suspendu dans 1 ml de Trizol et incubé durant 5 mn à température ambiante. Les étapes suivantes ont été effectuées selon les recommandations du fabricant. Des dilutions en série de l'ARN total dans du SSCx20 ont été transférées sur des membranes de Hybond N+ (Amersham, Paris, France), ont été incubées à 60 C durant deux heures dans un tampon rapide d'hybridation (Amersham) et les fragments amplifiés par PCR correspondant au gène tetx marqués au 32p en utilisant le kit Megaprime (Amersham). Les membranes ont été lavées dans du SSC x 0,1- SDS (0,1%) à 60 C et exposées au rayonnement X. PAGE et immunotransferts. 1o Les protéines ont été précipitées à partir des surnageants de cultures (densité optique 1,8) de la souche sauvage et des souches recombinantes de C. tetani à l'aide d'acide trichloroacétique à 10%. Les précipités ont été récupérés par centrifugation et ont été lavés avec de l'acétone. Les protéines solubilisées dans du Tris-HCI 50 mM, pH 8, et des dilutions en série ont été mises à migrer sur un gel d'acrylamide à % SDS-PAGE. Le procédé d'immunotransfert est celui décrit par BURNETTE et ai. (1981, Anal. Biochem., 112, 115-203). Les protéines, séparées à l'aide du gel SDS-PAGE, ont été transférées sur des feuilles de nitrocellulose (Hybond C, Amersham). Les feuilles de nitrocellulose ont été incubées durant 1 heure dans un tampon salin de phosphate contenant 5% de lait en poudre et ont été incubées durant une nuit à température ambiante avec des anticorps anti-Tetx de lapin avec une dilution 1:400. Les anticorps liés ont été détectés à l'aide de protéine A marquée par la peroxydase et du kit de chimioluminescence commercialisé par Amersham. Electrophorèse et immunoprécipitation. La souche 62-OE de C.botulinum a été mise en culture dans du TGY jusqu'à obtenir une densité optique de 0,6 à 600 nm. Les cellules bactériennes ont été centrifugées et resuspendues dans du HEPES 10 mM, pH 7,8, contenant KCI (10 mM), EDTA (100 mM), EGTA (100 mM), PMSF (0,5 mM) et DTT (1 mM). Les bactéries ont été traitées par ultrasons durant 4 minutes et centrifugées. Le surnageant est constitué de l'extrait cellulaire. Des fragments d'ADN de 194 et 82 paires de bases correspondant aux régions promotrices des gènes ntnh et ha34 ont été amplifiés par PCR en utilisant les amorces présentant les séquences SEQ ID N 7 à 10 suivantes: SEQ ID N 7 io (P369) CAAGATTTTTATTATCTACCGGGG SEQ ID N 8 (P419) GGTTTACAAAAAATAGTGTGGCTATG SEQ ID N 9 (P259) CATTATGATTCCTCCTTTATTTAA SEQ ID N 10 (P530) ATTTTAGGTTTACAAAAAATAAC Les amorces présentant les séquences SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ont été utilisées pour amplifier la région promotrice de ntnh, tandis que les amorces présentant les séquences SEQ ID N 9 et SEQ ID N 10 ont été utilisées pour amplifier la séquence promotrice du gène ha34. Les amorces ont été marquées par du [Y32P]ATP en utilisant o0 une polynucléotide kinase (Pharmacia), avant l'amplification par la méthode PCR. Les produits d'amplification ont été extraits par un mélange phénolchloroforme et précipités par de I'éthanol (HURME et al. 1996, J. Biol. Chem., 271, 12626-12631). Les culots d'ADN ont été dissous dans de l'eau et la radioactivité a été comptée. Les extraits cellulaires (10 pg de protéines totales) ont été rajoutés aux fragments d'ADN marqués radioactivement (1-10 ng, 10000 cpm) dans du TBE x 5 (Tris-HCI, 89 mM, pH 8,3, borate 89 mM, EDTA (2 mM); contenant MgCI2 (1 mM) NaCI, (50 mM) glycérol (5%), 4pg d'ADN de sperme de saumon et 2 pg de sérum albumine bovine acétylée (BSA) dans un volume total de 30 pl. Le mélange a été incubé durant 20 minutes à 37 C puis chargé sur un gel à 5 % de polyacrylamide (29:1 acrylamide-bisacrylamide) et soumis à une électrophorèse dans du TBE x 5 à 10 V.cm'1 durant 4 heures à 4 C. Les gels ont été séchés et autoradiographiés. Après une étape de préincubation de 20 min en présence de 1 pg d'ADN non marqué, les sondes marquées ont été ajoutées. Des anticorps anti BotR/C ont été ajoutés à une dilution de 1:100 dans le milieu réactionnel. Les anticorps anti-BotR/C ont été obtenus en utilisant la protéine BotR/C fusionnée à His-tag dans le vecteur pET28b (Novagen), produite dans la souche d'Escherichia coli BL21 et purifiée sur une colonne Ni. Pour l'immunopurification des anticorps anti-BotR/C, l'extrait cellulaire de la souche de C.botulinum 62-OE a été soumis à une électrophorèse sur PAGE 10% SDS 0,1%, et transféré sur nitrocellulose. La bande de 21 kD a été considérée comme le seuil (cut off). La réaction a été bloquée par incubation dans du PBS contenant 5% de lait puis dans du sérum 1:10 anti BotR/C. Après lavage avec du PBS, les anticorps spécifiques ont été élués avec de l'acide acétique 0,1 M et neutralisés avec du Tris-HCI 3M à pH8. Les immunoprécipitations ont été effectuées en incubant des fragments d'ADN amplifiés par PCR et marqués au 32p comme décrit ci- dessus (2x105 cpm), I'extrait cellulaire de C.botulinum 62-OE (10 pg de protéines totales) dans un tampon B Tris-HCI 20 mM, pH 7,5, contenant MgCI2 10 mM et 250 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dans un volume final de 60 pl, durant 20 min à température ambiante. A titre de témoin négatif des fragments d'ADN de la région codante du gène bont/A (positions 3638 à 3769 de la séquence M30196) ont été amplifiés par PCR. Les anticorps anti-botR/C immunopurifiés (400 ng) ont été ajoutés dans chaque échantillon et ont été incubés durant 4 min à température ambiante. De l'agarose-protéine A (Sigma) (20 pg) a été ajouté et a été incubé durant 1 h à 4 C. Les billes ont été isolées par centrifugation puis lavées trois fois avec le tampon B. Elles ont été mélangées avec 15 pl de tampon d'échantillon, chauffées à 100 C durant deux minutes et o0 chargées sur un gel PAGE 10% SDS-0,1%. Les expériences ont été effectuées en double. Un gel a été séché et exposé au rayon X durant 4 jours afin de visualiser l'ADN 32p, et l'autre gel a été transféré sur de la nitrocellulose, hybride avec les anticorps anti- BotR/C immunopurifiés et les protéines ont été détectées à l'aide d'une trousse de chimioluminescence. Toxicité chez la souris. Des dilutions de moitié en série des échantillons (0,5 ml), dans du tampon phosphate sodium 50 mM (pH 3) contenant 0,2% (poids/volume) de gélatine, ont été injectées au travers du péritoine (i.p.) dans des souris de 18 à 20 g. Quatre souris ont été utilisées pour chaque dilution. Les souris ont été observées après quatre jours et le nombre de morts a été compté. EXEMPLE 1 Caractérisation du gène tetR et surexpression de ce gène dans C. tetani. 1) Caractérisation du gène tetR La séquence nucléotidique et la séquence en acides aminés déduite de cette séquence nucléotidique (respectivement séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2) du gène TetR sont représentées sur la figure 1. La protéine déduite a une masse moléculaire calculée de 21.562 Da et est composée de-178 acides aminés. Elle montre une similarité de séquence de 50 à 65% avec les protéines correspondantes des souches de C. botulinum, comme il ressort de l'alignement de séquences de la figure 2. Cette protéine présente les caractéristiques des protéines se liant à l'ADN. 2) Surexpression du gène tetR dans C.tetani Afin d'analyser la fonction de la protéine, le gène tetR a été surexprimé dans C.tetani. Le gène tetR de C. tetani a été mis sous contrôle du promoteur du gène de la toxine iota de C. perfringens cloné dans le vecteur navette pAT19 (marqueur de sélection: érythromycine). Un segment de 200 bp correspondant à la partie 3' du gène de la toxine iota est inséré en partie 3' du gène tetR (plasmide pmRP365). Le gène tetR pourrait aussi être mis sous contrôle de son propre promoteur par: - amplification par PCR du promoteur de tetR (143 nucléotides en amont de l'atg de tetR) en générant un site HindIll en partie 5' et Ncol en partie 3', et - remplacement du fragment Hindll-Ncol (promoteur du gène de la toxine iota) de pmRP365 par le fragment amplifié Hindll-Ncol (promoteur de tetR). La région codante de tetR a donc été amplifiée par PCR et clonée dans le vecteur contenant le promoteur du gène iap de C.perfringens. Le plasmide résultant, pMRP365 a été transféré par électroporation dans C. tetani CN655, donnant naissance à la souche CN655-OE. La production de TeTx a été suivie chez la souche sauvage (CN655) et la souche recombinante (CN655-OE) par détermination de la léthalité chez la souris. Comme le montre la figure 3, I'activité dans les surnageants de culture durant la phase exponentielle de croissance est 6 à 8 fois supérieure dans la souche CN655-OE, par rapport à la souche sauvage. L'augmentation de la production de TeTx dans la souche CN655-OE est confirmée par hybridation de type Western (Western blot) en utilisant des anticorps spécifiques contre TeTx, comme le montre la figure 4. Ces résultats indiquent que le gène tetR, présent en nombre de copies important et en position trans dans C.tetani, induit une augmentation de la production de TeTx. Aucune autre protéine 0o extracellulaire ne sembleavoir été surproduite comme le montre la figure 5. Les ARNs messagers spécifiques du gène TeTx ont été cherchés par la technique d'hybridation ponctuelle (dot blot) dans la souche sauvage et dans la souche recombinante CN655-OE. La quantité d'ARN messager spécifique de TeTx est approximativement quatre fois supérieure dans la souche recombinante par rapport à la souche sauvage, comme le montre la figure 5. Ce résultat est en accord avec l'augmentation du niveau de TeTx dans le surnageant de culture mesuré par l'activité léthale chez la souris et l'immunohybridation. Ces résultats montrent clairement que le gène tetR active l'expression de TeTx au niveau transcriptionnel. EXEMPLE 2 Surexpression des gènes botR/A et botR/C dans C.tetani Les gènes TetR et BotR présentant une homologie importante, il a semblé intéressant de déterminer si ces gènes sont fonctionnellement identiques. Il avait été montré que le plasmide pMRP309 contenant le gène botR/A sous le contrôle de son propre promoteur induit une augmentation significative de la production de botNT/A et des protéines non toxiques (ANTP), ainsi que des ARNs messagers correspondant dans C.botulinum. La souche CN655 de C.tetani a été transformée par électroporation avec le plasmide pMRP309 donnant naissance à la souche CN655-BotR/A. Une augmentation comparable de Tetx, dosée par le test de léthalité de la souris et par immunohybridation a été observée durant la phase exponentielle de croissance de CN655-BotR/A et CN655-OE, comme le montrent les figures 3 et 4. L'activité léthale chez la souris des surnageants de culture de CN655-OE et CN655- BotR/A est approximativement 8 fois supérieure à l'activité des surnageants de la souche sauvage, comme le montre la figure 3. La surproduction de Tetx dosée par immunohybridation est 16 fois supérieure dans CN655-OE et 8 fois supérieure dans CN655- BotR/A, par rapport à la souche sauvage, comme l'illustre la figure 4. De plus, la quantité d'ARNs messagers du gène Tetx est 4 fois supérieure dans les deux souches, comme l'illustre la figure 6. Ceci montre que BotR/A permet de réguler de manière positive le gène Tetx dans C. tetani. L'effet de BotR/C qui présente moins de parenté avec TetR (identité de 50%) que BotR/A (identité de 60%) a été analysé chez C.tetani. Le plasmide pMRP319 correspondant au vecteur pAT19 contenant la région codante de botR/C, sous le contrôle du promoteur du gène iap a été transféré dans la souche CN655 par électroporation, donnant naissance à la source CN655-botR/C. La production de Tetx, dosée par l'activité léthale chez la souris est trois fois supérieure dans la souche CN655- BotR/C que dans la souche sauvage, et huit fois supérieure si elle est dosée par l'immunohybridation (figures 3 et 4). Aucune augmentation significative du taux d'ARN messager spécifique de Tetx n'est détectée dans le surnageant de culture de la souche CN655-BotR/C, comme l'illustre la figure 6. Ces résultats montrent que BotR/C stimule l'expression du gène Tetx, mais de manière moins importante que le gène BotR/A. EXEMPLE 3 Activité du gène de régulation BotR/A 1) Surexpression du gène botR/A dans la souche A 62 de C. botulinum. Le gène botR/A a été surexprimé dans C.botulinum en l'insérant sous le contrôle de son propre promoteur dans un vecteur à 1o grand nombre de copies pAT19. Le plasmide recombinant a été utilisé pour transformer la souche 62 par électroporation et a donné naissance à la souche 62-OE. Le niveau de transcription du gène botR/A dans la souche 620E est supérieur à celui obtenu dans la souche sauvage 62, comme le montrent les dosages d'ARNs messagers effectués par dot blot avec le gène botR/A marqué par du 32p. La toxicité du surnageant de culture vis-à-vis des souris durant la phase de croissance de la souche sauvage et de la souche 62-OE est illustrée par la figure 9. La souche recombinante surexprimant botR/A en trans est plus léthale vis-à-vis des souris (5 à 12 fois) que la souche sauvage. L'activité léthale chez les souris est due à la présence de BoNT/A dans le surnageant de culture du sérotype A de C.botulinum. Il a en outre été montré par hybridation de type Western (figure 10) qu'il y a 16 à 32 fois plus de BoNT/A dans le surnageant de culture de la souche 62-OE que dans celui de la souche sauvage, après purification partielle par précipitation par de l'acide. Afin de déterminer si botR/A régule aussi l'expression du gène antp, des hybridations de type Western ont été effectuees sur les surnageants de culture partiellement purifiés par précipitation acide de la souche 62- OE et de la souche sauvage. Un anti-sérum dirigé à I'encontre des protéines non toxiques NTNH a permis de détecter deux bandes de tailles respectives de 106 et 13 kDa, correspondant aux protéines NTNH ayant subi une maturation. Ces bandes sont moins intenses pour la souche 62-OE que pour la souche sauvage, comme le montre la figure 11. De même, I'hybridation de type Western avec des anticorps dirigés contre des composants de type hémagglutinine montre que les protéines HA34 et HA70, qui sont partiellement clivées en HA52 sont surproduites dans la souche 62-OE, comme l'illustre la figure 12. Le niveau de surproduction de HA70 et de.HA52 dans la 1o souche 62-OE est de 8 à 16 fois supérieur à celui de la protéine HA34. Une bande faible correspondant à HA34 fusionne partiellement avec la bande immédiatement au-dessus, et est observée dans les puits 1 et 2 de l'hybridation de type Western de la souche sauvage (figure 12A) tandis que la bande HA34 est bien plus visible (figure 12B, puits 1 et 2) avec la souche 62-OE. Ceci montre que la surexpression de botR/A en trans est responsable de la surproduction de BoNT/A et des protéines ANTPs. Les taux d'ARNs messagers pour les protéines BoNT/A et ANTPs, mesurés par dot blot, sont de manière significative supérieurs 2o dans la souche 62-OE, par rapport à la souche sauvage, comme l'illustre la figure 13. Les niveaux d'ARNs messagers pour les protéines boNT/A, NTNH et HA70 sont 8 fois supérieurs dans la souche 62-OE par rapport à la souche sauvage 62. Ceci est cohérent avec la toxicité supérieure vis-à-vis de souris, et les niveaux supérieurs de NTNH et de HA70 détectés par immunohybridation pour la souche 62-OE. 2) Inhibition partielle de l'expression du gène botR/A et effet sur la production des protéines boNT/A et ANTP. Des ARNs messagers anti-sens ont été utilisés pour inhiber I'expression du gène botR/A. Le fragment d'ADN utilisé pour produire des ARNs messagers anti-sens (figure 8) contient le site de liaison au ribosome et les 18 premiers codons du gène botR/A, et ne forme aucune structure secondaire. La toxicité du surnageant de culture de la souche 62-AS qui 1o contient le plasmide pMRP306 est 4 à 10 fois inférieure a celle de la souche sauvage. Cette diminution de la toxicité est plus significative dans l'étape précoce de culture (figure 9). L'inhibition du gène boNT/A est aussi observée dans la souche 62-AS par immunohybridation comme l'illustre la figure 10. Des niveaux inférieurs de NTNH et de HA35 ont été mesurés dans la souche 62-AS (figures 11 et 12). Cependant, la diminution en HA70 et HA52 est moins marquée. Les tests de détection par dot blot des ARNs messagers montrent que la transcription des gènes boNT/A et antp est partiellement inhibée (d'un facteur 4 à 16), comme le montre la figure 13. 3) Liaison du gène BotR/A et de la région promotrice des gènes ntnh et ha34. Dans les toxinotypes A de C.botulinum, les complexes géniques codant pour la toxine botulique sont organisés en deux opérons polycistroniques, comme l'illustre la figure 7. Les régions promotrices des gènes ntnh- bont/A et ha34 présentent des séquences à -35 et à -10 conservées en amont de chaque opéron. Comme BotR/A active l'expression des deux opérons, la protéine pourrait directement interagir avec les régions promotrices des gènes ntnh-bont/A et ha34, régulant ainsi leur transcription. Afin de mettre en évidence ce processus, des expériences de retardement de la mobilité sur gel ont été effectuées avec BotR/A surproduite dans la souche 62-OE et des fragments d'ADN correspondant aux régions promotrices des gènes nt-nh et ha34. L'extrait cellulaire de la souche 62-OE surexprimant le gène botR/A retarde le fragment d'ADN du promoteur de ntnh (figure 14A) et de ha34. La spécificité de ce test a été mise en évidence par compétition avec de l'ADN non marqué (figure 14A). De plus, des anticorps polyclonaux anti-BotR/C, qui reconnaissent seulement BotR/A dans l'extrait cellulaire du toxinotype A de C. botulinum (figure 14B) ont été utilisés pour confirmer la spécificité i des effets de BotR/A dans l'extrait cellulaire de la souche 62-OE. Une augmentation de la mobilité a été observée quand l'ADN marqué et l'extrait de 62-OE ont été incubés en présence d'anticorps anti-BotR/C (figure 14A, puits 4), tandis que les anticorps dirigés à l'encontre d'un extrait de Clostridium n'induisent aucun retard dans la mobilité de l'ADN 2o marqué. Des expériences additionnelles montrant la liaison de BotR/A avec l'ADN du promoteur ont été effectuées par immunoprécipitation en utilisant des anticorps immunopurifiés spécifiques de BotR/C qui réagissent de manière croisée avec BotR/A. Une co-immunoprécipitation de botR/A et des fragments d'ADN correspondant aux régions promotrices de ntnh et de ha34 a été observée, tandis qu'un fragment d'ADN de taille similaire à celle de la région codant pour bont/A n'a pas été immunoprécipité dans les mêmes conditions, comme l'illustre la figure 15. EXEMPLE 4 Construction d'un plasmide pour l'expression du fragment C de la toxine tétanique. La séquence nucléotidique correspondant au fragment C terminal de la toxine tétanique a déjà été clonée et utilisée dans des bactéries Figueiredo et al., (1995, Infect. Immun., 63, 3218-3221; Clare et al., 1991, Biotechnology, 9, 455-460). o0 La construction d'un plasmide permettant l'expression de ce fragment C dans C.tetani peut être effectuée par le procédé comprenant les étapes suivantes: - Amplification de la région promotrice du gène de la toxine tétanique (140 nucléotides en amont du codon ATG du gène de la toxine tétanique) en générant un site Sphl en partie 5' et les sites Ncol-Pstl en partie 3' dont Ncol correspondant à l'ATG initial. - Clonage du fragment Sphl-Pstl dans les sites correspondant du polylinker du vecteur pJIR750 (marqueur de sélection: chloramphénicol). Amplification par PCR de la partie 3' du gène de la toxine tétanique codant pour la partie C-terminale (50 kDa) de la toxine tétanique et les 250 nucléotides non codant en aval du codon stop de ce gène, en générant un site Ncol en partie 5' et en phase avec la séquence codante, et un site Pstl en partie 3'. - Clonage du fragment Ncol-Pstl dans les sites correspondant du plasmide recombinant pMRP365. * - Transformation par électroporation d'une souche de C. tetani ayant perdu son plasmide de grande taille portant le gène de la toxine tétanique et de ce fait non toxinogène, avec le plasmide pMRP365 ou le plasmide équivalent avec tetR sous contrôle de son propre promoteur. Sélection des transformants en chambre anaérobie sur des boîtes d'érythromycine (10 mg/ml). Repiquage d'un clone transformant et vérification de son contenu en plasmide recombinant. - Transformation du clone obtenu avec le plasmide contenant le gène du fragment C et sélection en chambre anaérobie sur boites de Pétri contenant de l'érythromycine (10 mg/ml) et du chloramphénicol (20 mg/ml). Repiquage d'un transformant et vérification de son contenu en plasmides recombinants. - Contrôle de la production du fragment C par électrophorèse en gel de polyacrylamide et Western blot avec des anticorps anti toxine tétanique à partir du surnageant de culture de la souche recombinante. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT PASTEUR (B) RUE: 25 RUE DU DOCTEUR ROUX (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75015 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 17 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 916 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:141..678 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AACTATATTA ATATACACAT CCTCGGTAAT ATATCAATAC AATACATGTA ATTAATAATG 60 TTTTTTGTAA AAGTTTAAGC TTAGTGGTTT ACTTTCAAAA TATAATAAAA CGTTAATTAT 120 AGAAAAGTGA AAGTAAGGTG ATG CTT ATG GAA AAT CTA TTT GTA AAA ATT 170 Met Leu Met Glu Asn Leu Phe Val Lys Ile 1 5 10 AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT AAA GAA TTT GAA GTA ATT ATT ATA CAT 218 Lys Thr Leu Lys Asn Asn Asn Lys Glu Phe Glu Val Ile Ile Ile His 20. 25 TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA CTT ATT CGA AAG TAT AAT TTA GAA AGT 266 Phe Lys Asn Thr Val Asn Ile Leu Ile Arg-Lys Tyr Asn Leu Glu Ser 35 40 CAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT CAT TTA TGG AAT ATA CTT AAA AAA ATT 314 His Tyr Asn Asp Ile Leu Tyr His Leu Trp Asn Ile Leu Lys Lys Ile 50 55 GAT TTG AAT AAA TTT AAT ACA GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGT 362 Asp Leu Asn Lys Phe Asn Thr Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr Ile Ser 65 70 AGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGT AAT AAA AAA AAT AGG 410 Arg Ser Leu Lys Arg Tyr Cys Leu Asp Ile Cys Asn Lys Lys Asn Arg 80 85 90 GAT AAA AAA ATA ATA TAT AAC TCA GAA ATT ACA AAT ATA AAA TTA AAT 458 Asp Lys Lys Ile Ile Tyr Asn Ser Glu Ile Thr Asn Ile Lys Leu Asn 100 105 TTA ATG GAA AAT AGT TGC TCA AAT TAT TTA AAC TTC GAA TTT AAT GAT 506 Leu Met Glu Asn Ser Cys Ser Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp 115 120 TTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA AAT CAA AGA AAA ATT TTA TAT ATG AAA 554 Leu Ile Ser Ile Leu Pro Glu Asn Gln Arg Lys Ile Leu Tyr Met Lys 130 135 TTT TTT GAA TAT ATG AAA GAA TGT GAT ATA GCT AAG CTT CAT ATG AGT 602 Phe Phe Glu Tyr Met Lys Glu Cys Asp Ile Ala Lys Leu His Met Ser 145 150 CGT CAA GCT GTA TAT AAA AAT AAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA 650 Arg Gln Ala Val Tyr Lys Asn Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu 160 165 170 CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT AAT ATA T AGTTTTTATA ATTTAATTAT 698 Pro Ile Val _Asn Lys Leu Ile Asn Ile GAATAATATT CTTAAGATAA AAAGTAAATT TTTAAAAAAT TTAAATTTTC AGTTTACAAA 758 AAATAACCTG ATTATGTTAT ATGTAATTGT AAAAAACATA TAAAAAATCA GAAAAATTTA 818 GGAGGTATAT TATTAATGGA TTAAATAATA ATTTTTTAAT TTACTTTTGA TTAATAAATA 878 TTAAATGTTT ATTTTAATTA GGAGATGATA CGTATGCC 916 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 179 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Leu Met Glu Asn Leu Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn 1 5 10 15 Asn Lys Glu Phe Glu Val Ile Ile Ile His Phe Lys Asn Thr Val Asn 25 30 Ile Leu Ile Arg Lys Tyr Asn Leu Glu Ser His Tyr Asn Asp Ile Leu 40 45 Tyr His Leu Trp Asn Ile Leu Lys Lys Ile Asp Leu Asn Lys Phe Asn 55 60 Thr Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr Ile Ser Arg Ser Leu Lys Arg Tyr 70 75 80 Cys Leu Asp Ile Cys Asn Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys Ile Ile Tyr 90 95 Asn Ser Glu Ile Thr Asn Ile Lys Leu Asn Leu Met Glu Asn Ser Cys 105 110 Ser Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp Leu Ile Ser Ile Leu Pro 120 125 Glu Asn Gln Arg Lys Ile Leu Tyr Met Lys Phe Phe Glu Tyr Met Lys 135 140 Glu Cys Asp Ile Ala Lys Leu His Met Ser Arg Gln Ala Val Tyr Lys 150 155 160 Asn Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu Pro Ile Val Asn Lys Leu 170 175 Ile Asn Ile (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CCATGGTTAT GGAAAATCTA TTTGTAAAAA 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 36 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: CTGCAGCTAT ATATTAATTA ATTTATTTAC TATAGG 36 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 28 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CATATGAATG ATTTATTTTA TGCTATAG 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CTGCAGTCAA ATATTAACTA ATTGCATTAC 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ'ID NO: 7: CAACATTTTT ATTATCTACC GGGG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ARN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GGTAGAAAAG TTCTTTCAAC TGAC 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GGTTTACAAA AAATAGTGTG GCTATG 26 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CATTATGATT CCTCCTTTAT TTAA 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ATTTTAGGTT TACAAAAAAT AAC 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1016 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:233..769 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: AAGCTTATTT TACATTAAAT TACTTTTATT GATAAAAATA TATTTTTTGT ATTTATATAG 60 AGATTTTCTT TGTCATATAC TGTATAATAT TTATATAATA TTAATACATA ATATTATAAC 120 TAAATTCAAA ATAGAAAGGA GGTTATCTTA TGTTAAAAAG AAAAATTTAA AATACTATTT 180 TCATTATTTG AAGATTGAAT CTTAAATAAA CTTGAATTAG GAGGGAGTAC CC ATG 235 Met GTT ATG GAA AAT CTA TTT GTA AAA ATT AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT 283 Val Met Glu Asn Leu Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Asn 190 195 AAA GAA TTT GAA GTA ATT ATT ATA CAT TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA 331 Lys Glu Phe Glu Val Ile Ile Ile His Phe Lys Asn Thr Val Asn Ile 205 210 CTT ATT CGA AAG TAT AAT TTA GAA AGT CAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT 379 Leu Ile Arg Lys Tyr Asn Leu Glu Ser His Tyr Asn Asp Ile Leu Tyr 215 220 225 CAT TTA TGG AAT ATA CTT AAA AAA ATT GAT TTG AAT AAA TTT AAT ACA 427 His Leu Trp Asn Ile Leu Lys Lys Ile Asp Leu Asn Lys Phe Asn Thr 230 235 240 GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGT AGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC 475 Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr Ile Ser Arg Ser Leu Lys Arg Tyr Cys 245 250 255 260 TTA GAT ATT TGT AAT AAA AAA AAT AGG GAT AAA AAA ATA ATA TAT AAC 523 Leu Asp Ile Cys Asn Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys Ile Ile Tyr Asn 265 270 275 TCA GAA ATT ACA AAT ATA AAA TTA AAT TTA ATG GAA AAT AGT TGC TCA 571 Ser Glu Ile Thr Asn Ile Lys Leu Asn Leu Met Glu Asn Ser Cys Ser 280 285 290 AAT TAT TTA AAC TTC GAA TTT AAT GAT TTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA 619 Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp Leu Ile Ser Ile Leu Pro Glu 295 300 305 AAT CAA AGA AAA ATT TTA TAT ATG AAA TTT TTT GAA TAT ATG AAA GAA 667 Asn Gln Arg Lys Ile Leu Tyr Met Lys Phe Phe Glu Tyr Met Lys Glu 310 315 320 TGT GAT ATA GCT AAG CTT CAT ATG AGT CGT CAA GCT GTA TAT AAA AAT 715 Cys Asp Ile Ala Lys Leu His Met Ser Arg Gln Ala Val Tyr Lys Asn 325 330 335 340 AAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT 763 Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu Pro Ile Val Asn Lys Leu Ile 345 350 355 AAT ATC TGCAGATAAA AATTATATTT AAAATTATTA ATAAATATCA AAATTAATAA 819 Asn Ile AGCTAGTTAT TCATACTGGC TACCTATATA AATATTTCTC GATTACTTAC AGAGGATGTC 879 AATAATTTTG TGTAAACTAT CTAAAGAAAT ATATTGAAAT TTGTTGAGGT TTAGATAATA 939 TTTTATTTAA ACCTTAATTT TCTTTTTATG TAATTATAGT GAATATAAAT TGTACAAAAA 999 CTAGAGATAT TTCTAGA 1016 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 179 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire - (ii) TYPE DE MOLECULE: protine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: Met Val Met Glu Asn Leu Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn 1 5 10 15 Asn Lys Glu Phe Glu Val Ile le e Ile His Phe Lys Asn Thr Val Asn 25 30 Ile Leu Ile Arg Lys Tyr Asn Leu Glu Ser His Tyr Asn Asp Ile Leu 40 45 Tyr His Leu Trp Asn Ile Leu Lys Lys Ile Asp Leu Asn Lys Phe Asn 55 60 Thr Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr Ile Ser Arg Ser Leu Lys Arg Tyr 70 75 80 Cys Leu Asp Ile Cys Asn Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys Ile Ile Tyr 90 95 Asn Ser Glu Ile Thr Asn Ile Lys Leu Asn Leu Met Glu Asn Ser Cys 105 110 Ser Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp Leu Ile Ser Ile Leu Pro 120 125 Glu Asn Gln Arg Lys Ile Leu Tyr Met Lys Phe Phe Glu Tyr Met Lys 135 140 Glu Cys Asp Ile Ala Lys Leu His Met Ser Arg Gln Ala Val Tyr Lys 150 155 160 Asn Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu Pro Ile Val Asn Lys Leu 170 175 Ile Asn Ile (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1078 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:291..828 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: AAGCTTATTT TACATTAAAT TACTTTTATT GATAAAAATA TATTTTTTGT ATTTATATAG 60 AGATTTTCTT TGTCATATAC TGTATAATAT TTATATAATA TTAATACATA ATATTATAAC 120 TAAATTCAAA ATAGAAAGGA GGTTATCTTA TGTTAAAAAG AAAAATTTAA AATATATTTT 180 CATTATTTGA AGATTGAATC TTAAATAAAC TTGAATTAGG AGGGAGTACC ATGGGCAGCA 240 GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT ATG AAT 296 Met Asn GAT TTA TTT TAT GCT ATA GAA AAT TTA AAG CAT GAT AAC CAG CAC TTT 344 Asp Leu Phe Tyr Ala Ile Glu Asn Leu Lys His Asp Asn Gln His Phe 190 195 AAC TTT ATT GAA ATG TCT CTA AAA AAA TAT ATT GAA AAA ACT TCT AAA 392 Asn Phe Ile Glu Met Ser Leu Lys Lys Tyr Ile Glu Lys Thr Ser Lys 205 210 AAG TAT AAT TTA TAT TAT GAT TAT TAT AAT GAT ATA CTG TAT CAT TTA 440 Lys Tyr Asn Leu Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Asn Asp Ile Leu Tyr His.Leu 215 220 225 TGG AAA GAA CTT ATT GAA ATT AAC TTA AAG AAT TTT AAT TCT GAA TTA 488 Trp Lys Glu Leu Ile Glu Ile Asn Leu Lys Asn Phe Asn Ser Glu Leu 230 235 240 245 GAT TTA AGA AAA TAT ATT AGT ACA AGT ATA AAA AGA TAT TGT ATA AAT 536 Asp Leu Arg Lys Tyr Ile Ser Thr Ser Ile Lys Arg Tyr Cys Ile Asn 250 255 260 ATT TGT AAG AAA AAA AAT AGG GAT AAG AAA ATT ATA TAT AAT TCA GAA 584 Ile Cys Lys Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys Ile Ile Tyr Asn Ser Glu 265 270 275 GTA ACA TAT AAA AAA TTG GAT GCT GTA AAT GTT TAT TCT TTA TAT TGT 632 Val Thr Tyr Lys Lys Leu Asp Ala Val Asn Val Tyr Ser Leu Tyr Cys 280 285 290 GAT AAT TTC GAG TTT TTG GAT TTG ATA TCC ATA TTA AAC TAC AAG GAA 680 Asp Asn Phe Glu Phe Leu Asp Leu Ile Ser.Ile Leu Asn Tyr Lys Glu 295 300 305 AAG CAA ATT ATA TAT ATG AAA TTT TTT GAA GGT AGA AAA GAT AAT GAA 728 Lys Gln Ile Ile Tyr Met Lys Phe Phe Glu Gly Arg Lys Asp Asn Glu 310 315 320 325 ATA GCT ATA AGG CTT CGT TTA AGT CGT CAA TCT ATA TAT AAG ATT AGA 776 Ile Ala Ile Arg Leu Arg Leu Ser Arg Gln Ser Ile Tyr Lys Ile Arg 330 335 340 ATT ACG TCT TTA AAA AAG TTG TAT CCT ATA GTA ATG CAA TTA GTT AAT 824 * Ile Thr Ser Leu Lys Lys Leu Tyr Pro Ile Val Met Gln Leu Val Asn 345 350 355 ATT T GACTGCAGAT AAAAATTATA TTTAAAATTA TTAATAAATA TCAAAATTAA 878 Ile TAAAGCTAGT TATTCATACT GGCTACCTAT ATAAATATTT CTCGATTACT TACAGAGGAT 938 GTCAATAATT TTGTGTAAAC TATCTAAAGA AATATATTGA AATTTGTTGA GGTTTAGATA 998 ATATTTTATT TAAACCTTAA TTTTCTTTTT ATGTAATTAT AGTGAATATA AATTGTACAA 1058 AAACTAGAGA TATTTCTAGA 1078 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 179 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: Met Asn Asp Leu Phe Tyr Ala Ile Glu Asn Leu Lys His Asp Asn Gln 1 5 10 15 His Phe Asn Phe Ile Glu Met Ser Leu Lys Lys Tyr Ile Glu Lys Thr 25 30 Ser Lys Lys Tyr Asn Leu Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Asn Asp Ile Leu Tyr 40 45 His Leu Trp Lys Glu Leu Ile Glu Ile Asn Leu Lys Asn Phe Asn Ser 55 60 Glu Leu Asp Leu Arg Lys Tyr Ile Ser Thr Ser Ile Lys Arg Tyr Cys 70 75 80 Ile Asn Ile Cys Lys Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys Ile Ile Tyr Asn 90 95 Ser Glu Val Thr Tyr Lys Lys Leu Asp Ala Val Asn Val Tyr Ser Leu 105 110 Tyr Cys Asp Asn Phe Glu Phe Leu Asp Leu Ile Ser Ile Leu Asn Tyr 120 125 Lys Glu Lys Gln Ile Ile Tyr Met Lys Phe Phe Glu Gly Arg Lys Asp 135 140 Asn Glu Ile Ala Ile Arg Leu Arg Leu Ser Arg Gln Ser Ile Tyr Lys 150 155 160 Ile Arg Ile Thr Ser Leu Lys Lys Leu Tyr Pro Ile Val Met Gln Leu 170 175 Val Asn Ile (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1361 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix)CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:610..1144 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: GGTAGAAAAG TTCTTTCAAC TGGACATATA ATTCACCTCT TTATAAATTA GATGATAGTA 60 CTCATATTAA ATCTTTGTTG ATATTAATTT TATGGGTTAC GAATATTCCA TTTCTGATTA 120 TCATCTCCAT GATAATTAAA TACTTGAATA GCAGTTCCGT TTGCTGTTTG GCTGTTATAT 180 AAATCTAGAT CCATACTTTT TATTTTATAA GCAGCTTTAT TAGAATCATA TATAAGTCTC 240 CATCTTTCAA GGTAATTTCT AGTTTGTTGA AATAAGCTAA CGTTACCGGC AACTTGATAA 300 AAAAATAAAT TAGTATCGGC CTTACAGGAG ATGGTAACAA TTTTGTCATT TAATGAATTT 360 TGGATTACTG AATAGTGTTC CATTATGATT CCTCCTTTAT TTAAGAATTA ATCTTACATA 420 TAACATATAA CATAATCAAG TTATTTTTTG TAAACCTAAA ATTTAAATAT ATCAAATTTT 480 TATTAGTATG TTTACATAAT TGATTATGGA TATTTCGTAA AAATGGCTTA TTAAAAATTT 540 AAAGGCAATT AGTTTATTTA TAGTATAATA AAACAATAAT ATGTATATTA TGGAGGGATA 600 GTGGTAAAT ATG AAT AAG TTG TTT TTA CAA ATT AAA ATG TTA AAA AAT 648 Met Asn Lys Leu Phe Leu Gln Ile Lys Met Leu Lys Asn 185 190 GAC AAC GAG GAG TTT CAA GAA ATT TTT AAG CAT TTT GAA AAA ACT ATA 696 Asp Asn Glu Glu Phe Gln Glu Ile Phe Lys His Phe Glu Lys Thr Ile 200 205 AAT ATA TTT ACT AGA AAA TAT AAT ATA TAT GAT AAT TAC AAT GAT ATT 744 Asn Ile Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Ile Tyr Asp Asn Tyr Asn Asp Ile 210 215 220 TTG TAC CAT TTA TGG TAT ACA CTT AAA AAA GTT GAT TTG AGC AAT TTC 792 Leu Tyr His Leu Trp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Asp Leu Ser Asn Phe 225 230 235 240 AAT ACA CAA AAT GAT TTA GAG AGA TAT ATT AGT AGG ACT TTA AAA AGA 840 Asn Thr Gln Asn Asp Leu Glu Arg Tyr Ile Ser Arg Thr Leu Lys Arg 245 250 255 TAT TGC TTA GAT ATT TGC AAT AAA AGA AAG ATT GAT AAG AAA ATA ATA 888 Tyr Cys Leu Asp Ile Cys Asn Lys Arg Lys Ile Asp Lys Lys Ile Ile 260 265 270 TAT AAT TCA GAA ATT GCA GAT AAG AAA TTA AGC TTA ATA GCA AAT AGT 936 Tyr Asn Ser Glu Ile Ala Asp Lys Lys Leu Ser Leu Ile Ala Asn Ser 275 280 285 TAT TCA AGT TAT TCA GAA TTT GAA TTT AAT GAT TTA ATA TCC ATA TTA 984 Tyr Ser Ser Tyr Ser Glu Phe Glu Phe Asn Asp Leu Ile Ser Ile Leu 290 295 300 CCT GAC GAT CAA AAG AAA ATT ATA TAT ATG AAA TTT GTT GAA GAT ATT 1032 Pro Asp Asp Gln Lys Lys Ile Ile Tyr Met Lys Phe Val Glu Asp Ile -50 305 310 315 320 AAG GAG ATA GAT ATA GCT AAA AAA CTT AAT ATA AGT CGT CAA TCT GTA 1080 Lys Glu Ile Asp Ile Ala Lys Lys Leu Asn Ile Ser Arg Gln Ser Val 325 330 335 TAT AAA AAT AAA ATA ATG GCT TTA GAG AGA TTA GAA CCC ATA TTG AAA 1128 Tyr Lys Asn Lys Ile Met Ala Leu Glu Arg Leu Glu Pro Ile Leu Lys 340 345 350 -AAA TTA ATT AAT ATG T AGTTTATATT TTTAAAAAAT TTTAGGTTTA 1174 Lys Leu Ile Asn Met CAAAAAATAG TGTGGCTATG TTATATATAA ATGATAAGAA TATACTGAAA AATGTATCCA 1234 AAATTTAAGG GGGCGTGTAT AGTAAATAAT TAAAAGTATG TGCGTTGAAA TAAATTTAGG 1294 AGAGTGGTTA GATATGAATA TAAATGACAA CTTAAGTATA AATTCCCCGG TAGATAATAA 1354 AAATGTT 1361 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 178 acides amins (B) TYPE: acide amin (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: Met Asn Lys Leu Phe Leu Gln Ile Lys Met Leu Lys Asn Asp Asn Glu 1 5 10 15 Glu Phe Gln Glu Ile Phe Lys His Phe Glu Lys Thr Ile Asn Ile Phe 25 30 Thr Arg Lys Tyr Asn Ile Tyr Asp Asn Tyr Asn Asp Ile Leu Tyr His 40 45 Leu Trp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Asp Leu Ser Asn Phe Asn Thr Gln 55 60 Asn Asp Leu Glu Arg Tyr Ile Ser Arg Thr Leu Lys Arg Tyr Cys Leu 70 75 80 Asp Ile Cys Asn Lys Arg Lys Ile Asp Lys Lys Ile Ile Tyr Asn Ser 90 95 Glu Ile Ala Asp Lys Lys Leu Ser Leu Ile Ala Asn Ser Tyr Ser Ser 105 110 Tyr Ser Glu Phe Glu Phe Asn Asp Leu Ile Ser Ile Leu Pro Asp Asp 120 125 Gln Lys Lys Ile Ile Tyr Met Lys Phe Val Glu Asp Ile Lys Glu Ile 135 140 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Asn Ile Ser Arg Gln Ser Val Tyr Lys Asn 150 155 160 Lys Ile Met Ala Leu Glu Arg Leu Glu Pro Ile Leu Lys Lys Leu Ile 170 175 Asn Met REVENDICATIONS 1. Polynucléotide comprenant tout ou partie d'au moins une séquence de régulation d'un opéron de synthèse de toxines produites par une bactérie du genre Clostridium, sous une forme isolée du reste des gènes compris dans ledit opéron. 2. Polynucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite séquence de régulation est la séquence d'un opéron de synthèse de toxines de C.botulinum ou C. tetani, ou une séquence présentant une identité d'au moins 60% avec cette séquence. 3. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il est présent, sous forme multicopies dans des bactéries. 4. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence de régulation est la séquence SEQ ID N 1 suivante, ou une séquence s'hybridant en conditions rigoureuses, (ou stringentes), avec la séquence SEQ ID N 1. AACTATATTA ATATACACAT CCTCGGTAAT ATATCAATAC AATACATGTA ATTAATAATG TTTTTTGTAA AAGTTTAAGC TTAGTGGTTT ACTTTCAAAA TATAATAAAA CGTTAATTAT AGAAAAGTGA AAGTAAGGTG ATG CTT ATG GAA AAT CTA TTT GTA AAA ATT AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT AAA GAA TTT GAA GTA ATTATTATA CAT TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA CTT ATT CGA AAG TAT AATTTA GAA AGTCAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT CATTTA TGG AAT ATA CTTAAA AAA ATTGAT TTG AAT AAA M AAT ACA GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGTAGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGT AATAAA AAA AAT AGG GAT AAA AAA ATA ATA TAT AACTCA GAA ATT ACA AATATA AAA TTA AATTTA ATG GAA AAT AGTTGC TCA AAT TATTTA AAC TTC GAA TTT AAT GATTTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA AAT CAA AGA AAA ATTTTA TAT ATG AAATTT iTTT GAA TAT ATG AAA GAA TGT GAT ATA GCTAAG CTT CAT ATG AGTCGT CAA GCT GTA TAT AAA AATAAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT AAT ATA T AGTTTTTATA ATTTAATTAT GAATAATATT CTTAAGATAA AAAGTAAATT TTTAAAAAAT TTAAATTTTC AGTTTACAAA AAATAACCTG ATTATGTTAT ATGTAATTGT AAAAAACATA TAAAAAATCA GAAAAATTTA GGAGGTATAT TATTAATGGA TTAAATAATA ATTTTTTAAT TTACTTTVGA TTAATAAATA TTAAATGTTT ATTTTAATTA GGAGATGATA CGTATGCC 5. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence de régulation est celle du gène botR/C ou botR/A ou d'une séquence s'hybridant en conditions rigoureuses avec la séquence d'un de ces gènes. 6. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences de régulation, lesdites séquences étant la séquence SEQ ID N 1 ou celles du gène BotR/C ou du gène BotR/A, des parties de ces séquences ou des séquences s'hybridant avec les séquences de ces gènes en conditions rigoureuses (ou stringentes). 7. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'au moins une séquence de régulation est associée à un gène de structure codant pour une protéine hétérologue vis-à-vis de la séquence de régulation, une protéine homologue, ou une partie d'une de ces protéines. 8. Polynucléotide selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit gène de structure code pour la toxine de C.tetani, le fragment C de cette toxine, une toxine de C. botulinum ou un fragment de cette toxine, une toxine ou un fragment de cette toxine de Clostridium. 9. Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence de régulation d'un opéron de synthèse de toxines produites par une bactérie du genre Clostridium, une séquence promotrice adaptée, et un gène de structure codant pour une protéine homologue ou hétérologue, ou une partie d'une de ces protéines. 10. Polynucléotide selon la revendication 9 caractérisé en ce 3o que ladite séquence promotrice est celle du gène de la toxine iota, ou du gène de régulation tetR ou d'un gène d'une toxine de Clostridium. 11. Vecteur ou plasmide caractérisé en ce qu'il contient au moins une partie d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 10. 12. Plasmide selon la revendication 11 appelé pMRP309, compris dans la bactérie E.Coli déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur sous le n 1-2010, ou dans la bactérie C. tetani déposée le 18 Mai 1998 s sous le n 1-2020 auprès de cette Collection. 13. Plasmide selon la revendication 11 appelé pMRP319 compris dans la bactérie E. Coli déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur sous le n 1-2011, ou dans la bactérie C. tetani déposée le 18 Mai 1998 0o sous le n 1-2021 auprès de cette Collection. 14. Plasmide selon la revendication 11 appelé pMRP365 compris dans la bactérie E.Coli déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n 1-2012, ou dans la bactérie C. tetani déposée le 18 Mai 1998 s 5sous le n 1-2022 auprès de cette Collection. 15. Séquence comprenant au moins une partie substantielle du gène de régulation tetR présentant la séquence SEQ ID N 1 suivante, ou s'hybridant en conditions rigoureuses avec cette partie. SEQ ID N I: AACTATATTA ATATACACAT CCTCGGTAAT ATATCAATAC AATACATGTA ATTAATAATG TTTTTTGTAA AAGTTTAAGC TTAGTGGTTT ACTTTCAAAA TATAATAAAA CGTTAATTAT AGAAAAGTGA AAGTAAGGTG ATG CTT ATG GAA AAT CTA TTT GTA AAA ATT AAG ACA TTA AAA AAT AAT AAT AAA GAA TTT GAA GTA ATT ATTATA CAT TTC AAA AAT ACT GTA AAT ATA CTT ATT CGA AAG TAT AAT TTA GAA AGTCAT TAT AAT GAT ATC TTA TAT CAT TTA TGG AAT ATA CTT AAA AAA ATT GAT TTG AAT AAA TTT AAT ACA GAA AAT GAT TTA CAC AAA TAT ATT AGTAGA TCT TTA AAA AGA TAT TGC TTA GAT ATT TGT AAT AAA AAA AAT AGG GAT AAA AAA ATA ATA TAT AAC TCA GAA ATT ACA AAT ATA AAA TTA AATTTA ATG GAA AAT AGTTGC TCA AAT TAT TTA AAC TTC GAA TTT AAT GATTTA ATA TCC ATA TTA CCT GAA AAT CAA AGA AAA ATT TTA TAT ATG AAAT TTT GAA TAT ATG AAA GAA TGT GAT ATA GCTAAGCTT CAT ATG AGTCGT CAA GCT GTA TAT AAA AAT AAG GTT TTA GCA TTA AAA AAA TTA GAA CCT ATA GTA AAT AAA TTA ATT AAT ATA T AGTTTTTATA ATTTAATTAT GAATAATATT CTTAAGATAA AAAGTAAATT TTTAAAAAAT TTAAATTTTC AGTTTACAAA AAATAACCTG ATTATGTTAT ATGTAATTGT AAAAAACATA TAAAAAATCA GAAAAATMTA GGAGGTATAT TATTAATGGA TTAAATAATA ATTTTTTAAT TTACTTTTGA TTAATAAATA TTAAATGTTT ATTTTAATTA GGAGATGATA CGTATGCC 16. Séquence selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de l'extrémité 3' de la séquence SEQ ID N 1. 1o 17. Protéine ou peptide présentant une identité de séquence d'au moins 60% avec une protéine ou un peptide comprenant une partie substantielle de la séquence SEQ ID N 2 suivante: Met Leu Met Glu Asn Leu Phe Val Lys lie Lys Thr Leu Lys Asn Asn Asn Lys Glu Phe Glu Val lie lie lie His Phe Lys Asn Thr Val Asn lie Leu lie Arg Lys Tyr Asn Leu Glu Ser His Tyr Asn Asp lie Leu Tyr His Leu Trp Asn lie Leu Lys Lys lie Asp Leu Asn Lys Phe Asn Thr Glu Asn Asp Leu His Lys Tyr lie Ser Arg Ser Leu Lys Arg Tyr Cys Leu Asp lie Cys Asn Lys Lys Asn Arg Asp Lys Lys lie lie Tyr Asn Ser Glu lie Thr Asn lie Lys Leu Asn Leu Met Glu Asn Ser Cys Ser Asn Tyr Leu Asn Phe Glu Phe Asn Asp Leu lie Ser lie Leu Pro Glu Asn Gin Arg Lys lie Leu Tyr Met Lys Phe Phe Glu Tyr Met Lys Glu Cys Asp lie Ala Lys Leu His Met Ser Arg Gin Ala Val Tyr Lys Asn Lys Val Leu Ala Leu Lys Lys Leu Glu Pro lie Val Asn Lys Leu lie Asn lie 18. Protéine ou peptide présentant une identité de séquence d'au moins 60% avec une protéine ou un peptide comprenant une partie substantielle de la séquence constituée par l'enchaînement des acides aminés en positions 125 à 175 de la séquence SEQ ID N 2. 19. Microorganisme caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide, un vecteur ou une séquence selon l'une des revendications 1 à 16. 20. Microorganisme selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il porte une séquence codant pour une protéine homologue ou hétérologue, ou une partie d'une de ces protéines. 21. Microorganisme selon la revendication 20 caractérisé en ce que la partie de la protéine hétérologue, ou de la protéine homologue est une partie dépourvue de toxicité d'une toxine produite par une bactérie. 22. Microorganisme selon l'une des revendications 20 et 21 caractérisé en ce que la protéine hétérologue, la protéine homologue ou leurs parties sont codées par un gène porté par un vecteur indépendant 0o du vecteur portant le gène de régulation. 23. Microorganisme selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce qu'il est de l'espèce C.tetani, C. perfringens,C. botulinum ou E.coli. 24. Microorganisme selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2010 déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'institut Pasteur. 25. Microorganisme selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2011 déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. 26. Microorganisme selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2012 déposée le 12 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. 27. Microorganisme selon l'une des revendications 19 et 23 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2020 de C. tetani déposée le 18 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. 28. Microorganisme selon l'une des revendications 19 et 23 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2021 de C. tetani déposée le 18 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. 29. Microorganisme selon l'une des revendications 19 et 23 caractérisé en ce qu'il est la souche 1-2022 de C. tetani déposée le 18 Mai 1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur. 30. Procédé de production de protéines hétérologues ou homologues a partir d'un microorganisme selon l'une des revendications s 19 à 29 comprenant les étapes suivantes: - mise en culture dudit microorganisme, et - récupération des protéines produites. 31. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que lesdites protéines sont récupérées dans le surnageant de culture des microorganismes. 32. Vaccin ou médicament caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide, un vecteur ou une séquence selon l'une des revendications 1 à 16, ou un microorganisme selon l'une des revendications 19 à 29 ou une protéine obtenue par culture de ce 1 5 microorganisme. 33. Vaccin ou médicament selon la revendication 32 contre les infections de C.tetani caractérisé en ce qu'il contient au moins une protéine obtenue par le procédé selon l'une des revendications 30 et 31. 34. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide, un vecteur ou une séquence selon l'une des revendications 1 à 16, ou un microorganisme selon l'une des revendications 19 à 29, ou une protéine obtenue par culture de ce microorganisme, en quantités pharmacologiquement efficaces, ainsi que des excipients pharmaceutiquement acceptables. 35. Utilisation d'un polynucléotide d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16, ou un microorganisme selon l'une des revendications 19 à 29, ou d'une protéine obtenue par culture de ce microorganisme, pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin pour l'immunisation à l'encontre de maladies liées aux bactéries du genre Clostridium, ou pour la thérapie à l'encontre de ces maladies.