Brevet FR2782729A1 — publié le 20000303

DESCRIPTION L'invention concerne une carte d'analyse permettant le dénombrement et la caractérisation des micro-organismes ou de tout autre élément biologique, tel qu'acides nucléiques, anticorps ou dans un échantillon biologique. L'invention concerne également un procédé de remplissage d'une telle carte ainsi que l'utilisation de cette carte. Par les termes " échantillon biologique >>, il faut comprendre un échantillon liquide issu du traitement physique, par exemple par homogénéisation, du traitement io chimique, tel qu'une dissolution dans un solvant, ou du traitement biologique, comme la digestion enzymatique, de produits solides ou liquides, pouvant être constitués de produits alimentaires, d'eaux, de sang. En dehors de la méthode traditionnelle de dénombrement sur boîtes de Pétri, on trouve dans l'état de la technique des méthodes non automatisées pour quantifier les micro-organismes, ces méthodes sont principalement basées sur la détermination du Nombre le Plus Probable (NPP). Le brevet US-A-5,700,655 décrit un dispositif de quantification de matériel biologique dans un échantillon liquide. Ce dispositif est constitué d'une plaque en plastique obtenue par thermoformage, elle- même constituée de puits de même taille et d'un couvercle permettant de préserver la stérilité. Le procédé consiste à déposer d'abord l'échantillon à analyser au centre de la plaque, puis le milieu réactionnel fourni avec le dispositif On agite le dispositif ainsi préparé, de manière à remplir équitablement tous les puits, puis on rejette le mélange réactionnel en excès. Enfin, on incube la plaque pendant une durée suffisante pour mettre en évidence la présence de germes dans un ou plusieurs puits. Toutefois, ce dispositif, comme les boîtes de Pétri traditionnelles, ne permet de tester qu'une seule dilution de l'échantillon. Sachant qu'il faut effectuer plusieurs dilutions de l'échantillon afin d'être sûr de pouvoir déterminer la concentration de 2 2782729 germes contenus dans ledit échantillon, il sera nécessaire de renouveler cette opération au moins une fois. De plus, ce dispositif possède un autre inconvénient majeur. Cet inconvénient consiste en la nécessité de rejeter le surplus de mélange réactionnel. En effet, cette opération s'effectuant par inclinaison de la plaque, il est probable que certains puits perdent une partie de leur contenu. La quantité de liquide ne sera donc plus identique dans les puits, et par conséquent la détermination de la quantité de germes sera faussée. Egalement, le rejet du surplus de mélange réactionnel entraîne la production de déchets potentiellement contaminés, qu'il faut retraiter. De même, ce rejet de surplus contamine l'extérieur du dispositif qui devient alors une source de contamination biologique pour l'opérateur et toutes autres surfaces qui entrent en son contact. Enfin, les puits étant disposés de façon concentrique, la lecture se fait aussi de façon concentrique, ce qui peut être source d'erreur, et ce d'autant plus que les puits positifs sont souvent dispersés sur la plaque. Enfin, le dispositif susmentionné conserve l'inconvénient essentiel de la boîte de Pétri, à savoir qu'il faut absolument qu'ils soient manipulés avec précaution et horizontalement, le temps que le milieu se gélifie, si cette fonction gélification est prévue, afin d'éviter la fuite d'échantillon ou le passage d'un puits à l'autre, ce qui induit des artefacts de manipulation. Le brevet US-A-5,518,892 montre un autre dispositif de quantification de micro-organismes dans un milieu liquide. Il s'agit d'un sac, fait dans un matériau et obtenu par thermoformage, qui possède une ouverture sur un de ses côtés. Le procédé consiste à former par chauffage, des compartiments imperméables sur la face inférieure du sac, permettant la séparation de différentes quantités de l'échantillon. Une fois les puits formés, on prépare le mélange réactionnel en additionnant l 'échantillon à analyser et le milieu réactionnelfourni avec le dispositif. On verse alors le mélange réactionnel dans le sac par l'ouverture prévue à cet effet. On vérifie que tous les puits sont bien remplis, puis, après scellement thermique, on incube le sac pendant une durée suffisante pour mettre en évidence la présence de micro-organismes 3 2782729 dans un ou plusieurs puits. Les puits peuvent être de même taille ou en trois séries de tailles différentes. Il est ainsi possible d'utiliser un seul sac pour simuler un ensemencement selon plusieurs dilutions. Cependant, ce système a certains inconvénients. Premièrement, et contrairement à un système de moulage par injection, industriel, automatisé et très précis, ce dispositif ne peut garantir une qualité de moulage optimale permettant d'obtenir des puits de contenance parfaitement identique, puisqu'il utilise à la base de simples feuilles de plastique qui sont mises en forme par thermoformage. Ceci est particulièrement important, lorsqu'on réalise un moulage avec des séries de puits de différents volumes notamment lorsque ceux-ci sont de petits volumes. Deuxièmement, on introduit le mélange réactionnel manuellement, la distribution dans les puits se fait donc de façon aléatoire. Ainsi, on ne peut pas être certain que le volume de mélange réactionnel distribué dans chaque puits soit le même, même si la taille des puits est parfaitement identique. Les résultats peuvent donc encore être faussés. Troisièmement, l'isolement des puits par scellement thermique s'effectue à des températures supérieures à 180 C, ce qui risque d'altérer de manière irréversible (destruction du matériel biologique à analyser et/ou évaporation de toute ou partie du liquide contenant ledit matériel) la fraction d'échantillon contenus dans les puits. Ceci est d'autant plus sensible que la taille des puits est petite, et qu'ils contiennent peu de liquide. Cette manipulation peut donc fausser les résultats du dénombrement et de la caractérisation. Conformément à la présente invention, la carte d'analyse proposée pallie à l'ensemble des inconvénients précédemment cités. Cette carte permet un remplissage de tous les puits, quelle que soit leur taille, qui est proportionnel d'un puits à l'autre, et qui n'impose pas de précaution de positionnement lors du remplissage. Par "proportionnel d'un puits à l'autre >>, il convient de comprendre que la proportionnalité existe entre deux puits de mêmes dimensions, la proportion sera alors sensiblement de 1 pour 1, ou de puits de dimensions différentes, dans certains cas, les proportions sont différentes de 1 pour 1. Il n'y a d'ailleurs aucun risque de contamination, d'une part, de l'échantillon avec 4 2782729 l'extérieur, puisque le liquide reste confiné, et d'autre part, entre les différents puits de la carte, puisqu'une séparation isolante est prévue entre chaque puits de ladite carte. A cet effet, la présente invention concerne, selon un premier mode de réalisation préféré, une carte d'analyse qui comprend un corps constitué par: - une zone d'injection dans la carte d'un liquide biologique à analyser, - un canal principal d'amenée du liquide biologique provenant de la zone d'injection, - au moins deux canaux secondaires situés dans le prolongement du canal principal, et - au moins un puits correspondant à chaque canal secondaire, caractérisée par le fait que chaque puits constitue un moyen de distribution, d'une quantité déterminée dudit liquide biologique, dans au moins deux cavités d'analyse terminales, via un canal terminal pour chaque cavité d'analyse. Selon un second mode de réalisation préféré de l'invention, la carte d'analyse qui comprend un corps constitué par: - une zone d'injection dans la carte d'un liquide biologique à analyser, - au moins deux canaux d'amenée du liquide biologique provenant de la zone d'injection, et - au moins un puits correspondant à chaque canal d'amenée, caractérisée par le fait que chaque puits constitue un moyen de distribution, d'une quantité déterminée dudit liquide biologique, dans au moins deux cavités d'analyse terminales, via un canal terminal pour chaque cavité d'analyse. Selon le premier mode de réalisation, un puits, faisant office de moyen de distribution principal du liquide biologique, est présent entre le canal principal, d'une part, et les canaux secondaires, d'autre part. Quel que soit le mode de réalisation, les volumes des canaux secondaires sont tous identiques. Dans un mode préférentiel de réalisation, les cavités d'analyse terminales sont d'au moins deux volumes différents. Préférentiellement, les cavités d'analyse terminales sont de trois volumes différents. 2782729 Le rapport existant entre deux cavités de volumes différents est compris entre 1/5 et 1/20, 1/50 et 1/200 ou 1/500 et 1/2000, et notamment 1/10, 1/100 ou 1/1000. Les cavités d'un même volume sont alignées ou disposées de manière concentrique pour faciliter la lecture optique manuelle et/ou automatique. La présente invention concerne également le procédé de remplissage d'une carte d'analyse, décrite ci-dessus, qui consiste à: - relier la zone d'injection de la carte à un volume d'un liquide biologique à analyser, générer une dépression au sein et/ou au voisinage de ladite carte, casser la dépression afin, d'une part, de transférer le liquide biologique dans les cavités d'analyse, et, d'autre part, d'isoler par un fluide les différentes fractions de l'échantillon, issues dudit liquide biologique, qui sont présentes dans chacune desdites cavités d'analyse, et - analyser le résultat obtenu afin de déterminer la quantité de micro-organismes ou de tout autre élément biologique, tel qu'acides nucléiques, anticorps, présent dans 1 5 l'échantillon biologique de départ. Une fois que la dépression est cassée, le fluide isolant est en contact avec le liquide biologique soit au niveau des canaux secondaires soit au niveau des cavités d'analyse. Le volume du liquide biologique à analyser est inférieur au volume total de toutes les cavités d'analyse. Le rapport entre le volume du liquide biologique à analyser et le volume total de toutes les cavités d'analyse est de 1/10 à 9/10, notamment de 4/10 à 6/10, et préférentiellement de 5/10. La présente invention concerne enfin une utilisation d'une carte d'analyse, telle que décrite ci-dessus, pour la numération de microorganismes suivant la technique du nombre le plus probable. Les figures ci-jointes sont données à titre indicatif et n'ont aucun caractère limitatif sur la portée de la présente invention. Ils constituent plusieurs modes particuliers de réalisation de ladite invention. 6 2782729 La figure 1 représente une vue de dessus d'un premier mode de réalisation d'une carte, selon l'invention, permettant le dénombrement et la caractérisation de micro- organismes dans un échantillon biologique. La figure 2 représente une vue de dessus d'un second mode de réalisation d'une carte, selon l'invention, permettant le dénombrement et la caractérisation de micro- organismes dans un échantillon biologique. La figure 3 représente une vue identique à celle de la figure 1, mais dans laquelle la carte a été utilisée pour effectuer le dénombrement et la caractérisation d'une population de micro-organismes. La figure 4 représente une vue identique à celle de la figure 1, mais dans laquelle la carte a été utilisée pour effectuer le dénombrement et la caractérisation d'une autre population de micro-organismes. La figure 5 représente une vue en perspective d'une carte d'analyse, telle que représentée aux figures 1 et 3, associée à un récipient, contenant l'échantillon biologique, par l'intermédiaire d'un tube. La figure 6 représente une vue en coupe selon A-A de la figure 5. La figure 7 représente une vue en coupe selon B-B de la figure 1. La figure 8 représente une vue en coupe identique à celle de la figure 7, mais dans laquelle la carte d'analyse est constituée par un autre mode de réalisation, qui est différent au niveau des cavités. La figure 9 représente une courbe montrant la variation de la pression au sein d'une cloche à vide o l'ensemble, formé par la carte, l'échantillon, le tube et le tuyau, est placé dans une position permettant par la suite le transfert dudit échantillon dans les cavités de ladite carte. Enfin, la figure 10 représente une vue identique à celle de la figure 1, mais dans laquelle la carte a été utilisée pour effectuer le dénombrement et la caractérisation d'un autre échantillon contenant des micro-organismes. La présente invention concerne essentiellement une carte d'analyse 1 ou 21 représentée sur les figures jointes. 7 2782729 Deux modes particuliers sont représentés, à savoir un premier mode de réalisation d'une carte d'analyse 1 sur les figures 1, 3, 4, 5 et 10 et un second mode de réalisation de la carte d'analyse 21 sur la figure 2. Si on se réfère maintenant aux figures 1 et 3, la carte d'analyse 1 est essentiellement constituée d'un seul élément monobloc constitué par le corps 2 de la carte d'analyse 1. Ce corps 2 comporte une zone d'injection 3 d'un liquide biologique à analyser 4. Cette zone d'injection 3 peut être sur n'importe quelle face du corps 2 que ce soit sur la face représentée sur la figure 1 ou 3, ou au verso, ou encore sur une paroi latérale. C'est par exemple le cas sur les figures 5 et 6, o la zone d'injection 13 est en position latérale. Sur la figure 5, la carte 1 n'est pas remplie par l'échantillon 4, contenu dans le tube 32, mais est relié à ce liquide 4 par l'intermédiaire d'un tuyau souple 33. L'ensemble ainsi formé est prêt à être positionné dans une chambre à vide. La figure 6 représente une coupe selon A-A de la figure 5. Le canal d'amenée 5 constitue une chicane pour se diriger au centre du corps 2 de la carte 1, puis se prolonge au sein de ladite carte 1 en direction de l'une de ses surfaces latérales afin de constituer la zone d'injection 3. La liaison existante entre le corps 2 de la carte 1 et le tuyau 33 est assurée par une rainure circulaire 14, située dans le corps 2, et par un épaulement 15 du tuyau 33 coopérant avec la rainure 14. Bien entendu, pour se faire, le corps 2 est de forme sensiblement parallélépipédique. Ce corps 2 est donc monobloc et comporte un certain nombre de rainures et de cavités 9, 10 ou 11 situées en son sein. Ces cavités peuvent être constituées par des trous traversants, comme c'est le cas en figure 7, ou par des trous borgnes, comme c'est le cas en figure 8. L'isolement de ces rainures et de ces trous borgnes par rapport à l'extérieur est effectué par l'application d'un film transparent adhésif 35 qui vient se coller sur la surface dudit corps 2. En ce qui concerne les rainures, on note tout d'abord qu'il existe un canal principal d'amenée 5 qui est situé en aval de la zone d'injection 3. En aval de ce canal 8 2782729 , est présent un puits 12 qui fait office de moyen de distribution principal du liquide biologique 4 à analyser. En fait, le canal principal 5 est situé entre la zone d'injection 3 et le puits 12. De la même façon, il existe des canaux secondaires 6, qui relient ce puits 12 à un ensemble de puits 7, o chaque puits 7 correspond à un canal 6. Ces puits 7 font office de moyens de distribution. Au niveau de ces puits 7, est présent un certain nombre de canaux terminaux 8, chaque canal 8 reliant un puits 7 à une cavité d'analyse terminale 9, 10 ou 11. En fait, il y a trois types de cavités d'analyse terminales sur ces figures, à savoir, des cavités d'analyse terminales 9 de grande taille, des cavités d'analyse terminales 10 de taille moyenne et enfin des cavités d'analyse terminales 11 de petite taille. On comprend donc bien que les cavités situées sur le corps 2 de la carte d'analyse 1 sont, d'une part, les rainures qui sont constituées par le canal principal 5, les canaux secondaires 6 et les canaux terminaux 8 et, d'autre part, les trous borgnes qui sont constitués par la zone d'injection 3, le puits 12, les puits 7 et l'ensemble des cavités d'analyse 9, 10 et 11. Les cavités d'analyse 9, 10 et 1 1 de tailles différentes permettent de se dispenser de la nécessité d'effectuer des dilutions. Ainsi, en fonction de la quantité de liquide, qui sera présente dans cette cavité d'analyse 9, 10 ou 11, on aura un nombre de micro- organismes qui sera plus ou moins important. En fonction du milieu de culture à ajouter, il sera donc possible de faire croître certains micro-organismes qui en fonction de leur présence ou de leur absence dans chaque cavité 9, 10 ou 1 1 permettront d'avoir une modification de la densité optique, l'apparition ou la disparition d'une fluorescence ou d'une couleur (effet chromogène). Ceci permettra de détecter la présence ou l'absence de micro-organisme(s) et également d'effectuer une quantification. Des exemples seront exposés plus loin. Selon un second mode de réalisation représenté à la figure 2, la carte d'analyse 21 est plus simple puisqu'elle est représentée sous forme étoilée avec une zone d'injection 23 située au centre du corps 22 monobloc de la carte d'analyse 21. En fait, cette zone d'injection 23 correspond sensiblement au puits 12 de la figure 1 puisque 9 2782729 c'est de cette zone 23 que part un certain nombre de canaux d'amenée 25 qui transmettent la diffusion du liquide biologique à analyser 4, non représenté sur cette figure 2, en périphérie de la carte d'analyse 21. Chaque canal d'amenée 25 relie la zone d'injection 23 à un puits 27 faisant office de moyen de distribution. Après ce puits 27, sont présents plusieurs canaux terminaux 28, chaque canal terminal 28 reliant directement un puits 27 à une cavité d'analyse terminale 29, 30 ou 31 qui comporte, à l'instar du mode de réalisation de la figure 1, trois tailles différentes allant de la grande taille référencée 29 à la petite taille référencée 31 en passant par la taille moyenne référencée 30. Sur cette figure 2, les cavités d'analyse 29, 30 et 31 sont situées en arc de cercle ce qui facilitent la lecture par un système automatique. Ainsi, il y a mise en rotation de la carte 21 afin que les cavités 29, 30 ou 31 se retrouvent à tour de rôle en face de la tête de lecture, non représentée sur les figures. Par contre, sur les figures 1 et 3, la lecture est linéaire du fait de l'alignement des différentes cavités d'analyse 9, 10 et 11. De plus, il y a une séparation entre les grandes cavités 9, les cavités moyennes 10 et les petites cavités 11 qui sont superposées les unes au-dessus des autres ce qui, tout en restant adapté à un système de lecture automatique, facilite la lecture visuelle. Conformément aux figures 7 et 8, les cavités 9, 10 et 11 peuvent être de différentes formes. Ainsi selon la figure 7, la cavité est traversante, c'est-à-dire que le cloisonnement de chaque cavité nécessite la présence de deux films transparents adhésifs 35. Il est possible également d'avoir un seul film 35 qui prenne en sandwich la carte I. Cette structure est particulièrement adaptée à une lecture automatisée de la densité optique. Dans le cas de la figure 8, la cavité est constituée par un trou borgne, un seul film 35 est utilisé pour cloisonner l'espace de ladite cavité. Le film transparent adhésif 35 est d'une utilisation intéressante car, après son perçage ou son retrait, il permet à un opérateur d'avoir un accès direct au contenu des cavités 9 à 11 et 29 à 31. 0lo 2782729 Pour simplifier le mode de réalisation des figures 1 et 3, il serait tout à fait possible d'injecter le liquide biologique à analyser 4 directement au niveau du puits 12 et ainsi il ne serait pas nécessaire d'avoir la zone d'injection 3 et le canal principal d'amenée 5. Nous nous référerons maintenant à la figure 1 bien que ce qui sera exposé ci- après concerne également l'autre mode de réalisation représenté à la figure 2. Afin que les volumes distribués dans chaque cavité d'analyse 9, 10 ou 11 soient identiques ou proportionnelles pour chaque cavité 9, 10 ou 1 1 de volumes identiques ou différents, les différents canaux secondaires 6 sont tous d'un volume identique. Ainsi, comme on le remarque bien sur la figure 1, les canaux secondaires 6 situés au centre de la carte d'analyse 1 sont d'une longueur plus faible que ceux situés sur les côtés. Il conviendra donc de jouer sur leur largeur ou sur leur profondeur afin que les volumes soient constants entre tous ces canaux 6. De la même façon, la longueur des canaux terminaux 8 est identique pour chaque cavité d'analyse 9, 10 ou 11 de volume identique. En fait, il existe également une proportionnalité entre les petites cavités 11 et les grandes cavités 9 ainsi qu'avec les cavités moyennes 10. Ainsi, le rapport existant entre deux cavités de volumes différents, sur les figures représentées, sont de 1 pour 10 entre les cavités 10 et 9 et les cavités 1 1 et 10 et de 1 pour 100 entre les cavités 1 1 et 9. Cette proportionnalité peut également se retrouver au niveau des canaux terminaux 8, ces canaux terminaux 8 étant de dimensions différentes en fonction du fait qu'ils alimentent des cavités de grande taille 9, des cavités de taille moyenne 10 ou enfin des cavités de petite taille 11. Un dernier point en considération de la structure des cartes d'analyse 1 et 21, tous les canaux, qu'il soient principaux 5, d'amenée 25, secondaires 6, terminaux 8 ou 28, ne se croisent pas les uns avec les autres afin d'éviter toute contamination d'une quantité de l'échantillon située dans une cavité d'analyse par rapport à une quantité de l'échantillon située dans une autre cavité d'analyse. Pour se faire, les points l' l 2782729 d'intersection de ces différents canaux entre eux, sont toujours réalisés par l'intermédiaire de puits faisant office non seulement de moyen de distribution mais également de volume tampon empêchant toute contamination après l'introduction de l'échantillon 4. Le procédé de remplissage d'une carte d'analyse 1 ou 21, consiste donc à: - relier la zone d'injection 3 ou 23 de la carte 1 ou 21 à un volume de liquide biologique 4 à analyser, - générer une dépression au sein et/ou au voisinage de ladite carte 1 ou 21, - casser progressivement la dépression de sorte que, d'une part, le liquide biologique 4 soit transféré dans les cavités d'analyse 9, 10 et/ou 11 ou bien 29, 30 et/ou 31, et, d'autre part, l'air vienne isoler les différentes fractions de l'échantillon, issues dudit liquide biologique 4, qui sont présents dans chacune desdites cavités d'analyse 9, 10 ou 11 oubien29,30 ou31. De ce fait, une fois que la dépression est cassée, l'air vient en contact avec les fractions de l'échantillon biologique 4, soit au niveau des canaux terminaux 8 selon les figures 1 et 3, ou des canaux terminaux 28 selon les figures 2 et 4, soit au niveau des cavités d'analyse 9, 10 et 11 ou bien 29, 30 et 31. Ceci créé une séparation physique entre les bactéries. Bien entendu, ceci n'est réalisable que si le volume de liquide biologique 4 est en rapport avec le volume total des cavités d'analyse ainsi qu'éventuellement du volume des canaux terminaux 8 ou 28. En lieu et place de l'air, on peut utiliser n'importe quel fluide, gazeux ou liquide, qui pourra assurer cette fonction d'isolement. Il y a lieu de veiller à cette occasion à ce que le fluide soit substantiellement inerte par rapport aux composés biologiques contenus dans l'échantillon, et non missible avec ledit échantillon. Si le fluide est un liquide, comme par exemple de l'huile, il doit être d'une densité plus faible que l'échantillon biologique. Dans ce cas, la carte 1 doit être maintenue sensiblement en position verticale, comme représenté en figure 5, le fluide isolant, non représenté sur les figures, étant en position supérieure à l'échantillon biologique, contenu dans chaque cavité. 12 2782729 Mais il est possible d'utiliser d'autres techniques pour isoler ou séparer physiquement les cavités 9, 10 et 11 ou 29, 30 et 31. Ainsi, on peut ajouter à l'échantillon biologique 4 et au milieu de culture, permettant la croissance microbienne, un gélifiant, tel que de la peptine. Dans ce cas et lorsque le gélifiant a fait son oeuvre, il n'y a plus de nécessité à maintenir la carte 1 en position sensiblement verticale. Enfin, l'isolement desdites cavités 9, 10 et 11 ou 29, 30 et 31 peut être réalisée par l'obstruction des canaux terminaux 8. On peut utiliser par exemple une colle comme fluide isolant, ou on peut les obstruer par une compression physique. Dans un mode particulièrement intéressant de remplissage par le procédé selon l'invention, le volume de liquide biologique 4 à analyser est inférieur au volume total de toutes les cavités d'analyse 9, 10 et 11 ou bien 29, 30 et 31. Ce rapport entre le volume de liquide biologique 4 et le volume total de toutes les cartes d'analyse 9, 10 et 11 est préférentiellement de un pour deux. Le remplissage des cavités 9, 10 et 11 ou 29, 30 et 31 s'effectue simultanément, d'ailleurs, à un instant du remplissage donné, le rapport entre le volume de liquide présent dans chaque taille de cavité petite, moyenne ou grande sur le volume total de chaque taille de cavité, respectivement petite, moyenne ou grande, est constant pour la totalité des cavités 9, 10 et 1 1 ou 29, 30 et 31 de la carte 1 ou 21. La procédure permettant de dénombrer les micro-organismes contenus dans un échantillon biologique 4 peut être utilisée dans le domaine alimentaire. Dans l'exemple présenté ci-après, la procédure est la suivante. Elle consiste tout d'abord à préparer un échantillon 4 liquide. Ainsi, pour un poids de sensiblement 10 grammes d'un produit alimentaire, on ajoute dans un sac Stomacher avec filtre 90 ml d'eau peptonée. On homogénéise l'échantillon dans le sac Stomacher pendant 1 à 2 minutes. On obtient ainsi une première dilution 10-'. On effectue des dilutions supplémentaires en transférant I ml du liquide contenu dans ledit sac Stomacher dans un flacon contenant 49 ml d'un milieu de culture, puis on homogénéise. La dilution est alors de 2. 10'3, soit au 1/500. 13 2782729 Sachant que le volume des cavités 9 de grande de taille est de 200 pl, des cavités 10 de moyenne taille est de 20 pl, et des cavités 11 de petite taille est de 2 pil, étant donné qu'il y a vingt cavités 9, 10 ou 11 de chaque taille, le volume total desdites cavités 9, 10 ou 11 est de 4440 pi. Il convient de noter que ces chiffres n'ont rien d'obligatoires. Il est par exemple tout à fait possible d'avoir un nombre de cavités 9, 10 et 11 qui est variable d'une taille de cavités à l'autre. Pour respecter le rapport entre le volume de liquide biologique 4 et de un pour deux précédemment établi, on transfère donc 2 220 pI de ce flacon dans un tube 32. Un tuyau souple 33 est soit présent au niveau de la carte 1 et forme avec celle-ci le consommable, soit relié à celui- ci avant son utilisation. On place le tube 32 verticalement sur un support et on relie, par le tuyau 33 souple, le contenu du tube 32 à la zone d'injection 3 de la carte 1. Puis on place l'ensemble, ainsi constitué et représenté à la figure 5, sous vide afin que le liquide 4 contenu dans ledit tube 32 soitprêt à être transféré en totalité à l'intérieur des cavités d'analyse 9, 10 ou 11. Ensuite, on casse la dépression progressivement, c'est-à-dire en au moins 10 secondes. Ainsi, la figure 9 montre bien que la dépression exercée pour obtenir un vide adéquat, même partiel, doit être de sensiblement de 850 millibars et est atteinte en une minute. De même, le retour à la pression normale s'effectue progressivement en une minute. Ensuite, on retire l'ensemble du dispositif de la chambre réalisant le vide. On ferme hermétiquement la carte d'analyse 1 en coupant et en scellant au niveau du tuyau 33, à l'endroit o celui-ci affleure la surface latérale de ladite carte 1, et on retire ensuite le tube 32. Puis, on laisse la carte en position verticale. Ce dernier point n'est pas d'une absolue nécessité. Dans cette position, on incube les différentes cartes I pendant environ 24 heures à 30 C. On a ainsi réparti dans chacune des cavités 9, 10 et 11 respectivement 100, 10 et I p1 de l'échantillon biologique. Enfin, il est possible de lire la carte 1 en comptabilisant le nombre de cavité(s) d'analyse 9, 10 et/ou 11 qui a été modifié au niveau de sa densité optique ou de sa coloration, dans le cas de l'utilisation d'un marqueur fluorescent ou chromogène. Dans tous les cas de figure, cela correspond à un développement du type de micro- 14 2782729 organismes que l'on voulait révéler. En fonction du nombre de cavités d'analyse 9 de grande taille, de cavités 10 de taille moyenne et de cavités 11 de petite taille qui ont changé d'aspect, il est possible de se reporter au tableau 1, qui suit, pour déterminer la quantité exacte du micro-organisme à l'intérieur de l'échantillon de départ. On calcule le nombre le plus probable (NPP) de bactéries dans un échantillon par une méthode statistique, expliquée par R. J. Parnow (1972). Cependant, cette méthode donne la totalité des combinaisons existantes pour les trois nombres de tubes positifs, or il y a des combinaisons qui sont hautement improbables ou statistiquement incorrectes. Par exemple, il est inconcevable de n'avoir aucun positif dans les cavités contenant 100!xl d'échantillon (première dilution) et d'en avoir vingt dans les cavités contenant 1 fil d'échantillon (troisième dilution). Ainsi on associe la probabilité d'apparition à chaque combinaison de positif(s). On utilise pour cela la méthode de J. C. De Man (1975), puis toujours selon cet auteur, on définit différentes combinaisons de positifs: * la catégorie 1 rassemble toutes les combinaisons de la plus haute probabilité, dont la somme des probabilités est de 95%, * la catégorie 2 rassemble toutes les combinaisons dont la somme des probabilités représente les 4% suivants, et ò la catégorie 3 rassemble toutes les combinaisons dont la somme des probabilités représente le 1% restant. Dans le tableau 1 suivant, les combinaisons de la catégorie I sont seules à figurer, avec les NPP qui y sont associées. Le tableau ne tenant compte d'aucune dilution, il faut donc multiplier le NPP trouvé dans ce tableau 1 par le facteur total de dilution pour obtenir le niveau de contamination de l'échantillon initial. 2782729 Nombre de Nombre de Nombre de cavités positives NPP cavités NPP cavités positives NPP positives QI 10PI1óPI__ OyI PI 100pl- lO pI 1I 1JI 0 1 O0 0,45 11 3 0 8,89 16 4 1 17,9 1 0 |0 0,46 11 4 0 9,60 16 5 0 18,0 1 1 0 0,92 12 0 0 7,78 16 5 1 19,1 2 0 0 0,94 12 1 0 8,49 16 6 0 19,2 2 1 0 1,42 12 1 1 9,19 17 0 0 14,5 2 2 0 1,90 12 2 0 9,22 17 1 0 15,6 3 0 0 1,45 12 2 1 9,92 17 1 1 16,7 3 1 0 1,94 12 3 0 9,95 17 2 0 16,8 3 2 0 2,43 12 4 0 10,7 17 2 1 17,9 4 0 0 1,99 13 0 0 8,81 17 3 0 18,0 4 1 0 2,49 13 1 0 9,57 17 3 1 19,1 4 2 O 3,00 13 1 1 10,3 17 4 0 19,2 0 0 2,55 13 2 0 10,4 17 4 1 20,4 1 0 3,07 13 2 1 11,1 17 5 0 20,5 2 0 3,60 13 3 0 11,1 17 5 1 21,8 6 0 0 3,15 13 3 1 11,9 17 6 0 21,9 6 0 1 3,68 13 4 0 11,9 17 6 1 23,2 6 1 0 3,69 13 5 0 12,8 17 7 0 23,3 6 12 0 4,24 1 14 0 0 9,96 18 1 0 17,9 6 3 0 4,78 14 1 0 10,8 18 2 0 19,3 7 0 0 3,79 14 1 1 11,6 18 2 1 20,6 7 1 0 4,35 14 2 0 11,6 18 3 0 20,7 7 2 0 4,91 14 2 1 12,4 18 3 1 22,1 7 3 0 5,49 14 3 0 12,5 18 4 0 22,2 8 0 0 4,47 14 3 1 13,3 18 4 1 23,6 8 1 0 5,05 14 4 0 13,4 18 5 0 23,8 8 1 1 5,63 14 5 0 14,3 18 5 1 25,3 8 2 0 5,64 15 0 0 11,3 18 6 0 25,5 8 13 O0 6,24 15 1 0 12,2 18 6 1 27,0 9 0 0 5,20 15 1 1 13,0 18 7 0 27,2 9 1 0 5,81 15 2 0 13,1 18 7 1 28,9 9 1 1 6,41 15 2 1 14,0 18 8 0 29,1 9 2 0 6,43 15 3 0 14,0 19 1 0 20,9 9 3 10 7,05 15 3 1 14,9 19 2 0 22,6 0 0 5,99 15 4 0 15,0 19 2 1 24,2 1 0 6,63 15 4 1 15,9 19 3 0 24,4 1 -1 7,25 15 5 0 16,0 19 3 1 26,1 2 0 7,27 16 0 0 12,8 19 4 0 26,3 3 O0 7,93 16 1 0 13,7 19 4 1 28,2 4 0 8,59 16 1 1 14,7 19 4 2 30,1 i1 0 0 6,84 16 2 0 14,8 19 5 0 28,4 11 1 0 7,52 16 2 1 15,7 19 5 1 30,4 i1 1 1 8,17 16 3 0 15,8 19 5 2 32,5 11 2 O0 8,20 16 3 1 16,8 19 6 0 30,7 11 2 1 8,87 116 4 -0 16,9 19 61 32,8 16 2782729 Nombre de Nombre de Nombre de cavités NPP cavités NPP cavités positives NPP positives positives100ó10 100Pó 10OP lpli 100p= 10Pi 1pl 19 6 2 35,0 20 12 0 79,2 20 18 6 263 19 7 0 33,1 20 12 1 86,3 20 18 7 282 19 7 1 35,4 20 12 2 93,6 20 18 8 302 19 7 2 37,9 20 12 3 101 20 18 9 323 19 8 O 35,8 20 12 4 109 20 19 1 216 19 8 1 38,3 20 13 0 89,6 20 19 2 233 19 9 0 38,8 20 13 1 97,2 20 19 3 252 19 9 1 41,5 20 13 2 105 20 19 4 273 2 0 27,5 20 13 3 113 20 19 5 295 2 1 29,7 20 13 4 121 20 19 6 320 3 0 30,0 20 13 5 130 20 19 7 347 3 1 32,5 20 14 0 101 20 19 8 377 4 0 32,9 20 14 1 110 20 19 9 410 4 1 35,7 20 14 2 118 20 19 10 446 4 2 38,7 20 14 3 127 20 19 11 487 5 0 36,2 20 14 4 136 20 20 1 262 5 1 39,3 20 14 5 145 20 20 2 287 5 2 42,7 20 15 0 115 20 20 3 315 6 0 39,9 20 15 1 124 20 20 4 348 6 1 43,5 20 15 2 133 20 20 5 385 6 2 47,4 20 15 3 143 20 20 6 429 6 3 51,6 20 15 4 153 20 20 7 480 7 0 44,3 20 15 5 163 20 20 8 542 7 1 48,3 20 15 6 173 20 20 9 616 *7 2 52,7 20 16 0 130 20 2010 702 7 3 57,5 20 16 1 140 20 20 11 802 8 0 49,3 20 16 2 150 20 2012 918 8 1 54,0 20 16 3 161 20 20 13 1050 8 2 59,0 20 16 4 172 20 20 14 1200 8 3 64,3 20 16 5 184 20 20 15 1390 9 0 55,3 20 16 6 196 20 20 16 1610 9 1 60,5 20 17 0 148 20 20 17 1900 9 2 66,1 20 17 1 160 20 20 18 2300 9 3 72,0 20 17 2 172 0 20 2019 3000 10 0 62,2 20 17 3 184 10 1 68,1 20 17 4 197 10 2 74,2 20 17 5 210 10 3 80,7 20 17 6 224 10 4 87,3 20 17 7 239 11 0 70,2 20 18 1 184 11 1 76,6 20 18 2 198 11 2 83,4 20 18 3 213 11 3 90,3 20 18 4 228 11 974 20 18 5 245 17 2782729 Tableau 1: Tableau des différentes combinaisons de cavités positives pour déterminer la concentration initiale dans l'échantillon par la technique du Nombre le Plus Probable (NPP) Il est tout à fait possible que la distribution des micro-organismes, surtout s'ils sont peu nombreux, ne se fasse pas aussi régulièrement que dans les exemples ci- dessous. Si l'on se réfère à la figure 3, on remarque que l'ensemble des cavités d'analyse 9 présente une croissance microbienne. Par contre, au niveau des cavités d'analyse 11 de petite taille, aucune croissance n'est repérée. Dans le cas des cavités 10 de taille moyenne, seulement onze des cavités, sur les vingt, présentent une croissance. Si l'on se reporte alors au tableau 1, la combinaison 20/11/0 donne une Unité Formant Colonie par gramme de produit (UFC/g) de 70 UFC/g. Connaissant la dilution de départ, qui est de 1/500, il est possible de déduire que la concentration initiale en micro-organismes était de 70 x 500, c'est-à-dire 35000 UFC/g. Selon la figure 4, dix-huit des cavités d'analyse 9 présentent une croissance microbienne. De même, trois des cavités d'analyse 10 et une des cavités d'analyse 11 présentent une croissance. On en déduit, de la même façon que pour l'exemple précédent, que la concentration de départ était de 22 x 500, soit 1 1000 UFC/g. Selon la figure 10, six des vingt cavités d'analyse 9 présentent une croissance microbienne. A l'opposé, aucune des cavités 11 n'est modifiée, alors que seules deux des cavités d'analyse 10 présentent une croissance. On en déduit donc que pour cet échantillon dilué 500 fois, la concentration initiale était de 2100 UFC/g. A la lecture du tableau, on comprend que pour un échantillon dilué 500 fois, il sera possible de déterminer une concentration initiale en microorganismes comprise entre 225 et 1,5 x I0o6 UFC/g, avec une seule carte d'analyse 1 ou 21, alors que l'état de la technique utilise généralement quatre consommables pour obtenir une telle amplitude dans les résultats. Il est également possible de déterminer une concentration qui serait inférieure ou supérieure à ces valeurs sans toutefois connaître la concentration exacte. Il 18 2782729 est alors possible de faire une nouvelle dilution adaptée au précédent résultat afin d'avoir un résultat final précis. Il est bien entendu possible d'avoir une carte d'analyse différente, qui comporte quatre, cinq tailles différentes de cavités, voire plus, et ce afin d'augmenter le champ d'investigation de la carte. Bien entendu, il est possible de faire de la numération d'autres entités biologiques telles que les acides nucléiques (ADN ou ARN), les anticorps, les antigènes. La révélation peut être réalisée par des anticorps anti- entités biologiques qui sont marqués. Il est possible d'ajouter dans le tube 32 un liquide, non missible, de densité plus faible que l'échantillon 4 qui sera aspiré après ledit échantillon 4 et qui servira d'isolant entre les différentes quantités réparties dans chaque cavité. Il est également possible d'avoir deux tubes 32, l'un contenant l'échantillon biologique, l'autre contenant le fluide isolant, et de plonger le tuyau 33 alternativement dans le premier tube 32 puis dans le second tube 33. Il est enfin possible d'avoir sur la carte 1 deux tuyaux 33. Le volume total des cavités 9, 10 et 11 étant de 4440 il, le volume de l'échantillon 4 étant de 2220 gil, le volume du liquide isolant pourra être de 2220 il. Il pourra être inférieur si l'on désire qu'il y ait de l'air dans la carte 1 une fois scellée, ou supérieur si l'on veut être sûr du remplissage complet de la carte par l'échantillon 4 et le liquide isolant. Dans ce dernier cas, cette technique peut être intéressante pour la croissance de micro- organismes anaérobies. Afin de déterminer exactement le volume de l'échantillon 4 qui doit être transféré dans la carte 1, trois possibilités existent qui ne font pas appel à une automatisation. La première possibilité concerne le remplissage du tube 32 par la quantité exacte de l'échantillon 4. Le tuyau souple 33 ayant son extrémité libre 34 au niveau le plus inférieur dudit échantillon 4, la totalité de l'échantillon 4 est transférée. 19 2782729 La deuxième possibilité concerne le remplissage de la carte 1 par une quantité d'échantillon 4 déterminée par la position de l'extrémité libre 34 immergée dans ledit échantillon 4, au sein dudit tube 32. L'échantillon 4 aspiré correspond à la colonne de liquide 4 située audessus de ladite extrémité 34, et seule cette colonne de liquide supérieure est transférée. Enfin, la troisième possibilité concerne le remplissage du tube 32 par une quantité très importante d'échantillon. Le transfert en cassant la dépression est réalisé jusqu'à ce que le manipulateur retire directement ou indirectement l'extrémité 34 du tuyau souple 33 de l'échantillon 4, tout en permettant la continuation du transfert des fractions dudit échantillon 4 vers les cavités 9, 10 et 11. Il est donc aisé de comprendre que, lorsque le transfert de l'échantillon 4 s'effectue, le prélèvement a lieu, dans un premier temps, au niveau dudit échantillon 4. C'est donc le niveau de l'échantillon 4 qui diminue jusqu'à ce que l'extrémité libre 34 du tuyau souple 33 se retrouve dans le fluide isolant. C'est alors, dans un second temps, ce fluide qui est transféré vers la carte 1. Du fait de sa densité plus faible que celle de l'échantillon 4 et de la position de ladite carte 1, comme représentée à la figure 5, ledit fluide va faire office de barrière physique et biologique pour les différentes petites quantités d'échantillon 4 distribuées dans les cavités 9, 10 et 11. Il est également tout à fait possible d'utiliser un agent gélifiant dans le milieu. Cette technique peut faciliter l'isolation entre les différentes cavités 9, 10 et 11 ou 29, et 31 par un fluide gazeux, tel que de l'air. Pour contrôler que le volume distribué dans chaque cavité 9, 10 ou 1 1 est sensiblement identique entre cavités de mêmes tailles et entre cavités de tailles différentes, des tests ont été réalisés. Ainsi avec les cavités 11 de petite taille, trois essais ont été réalisés pour les vingt puits. Les tests ont été réalisés à partir de 2 220 pil d'eau déminéralisée avec une dépression de 875 millibars. Les résultats sont représentés sur le tableau 2 et sont les suivants 2782729 1er essai 2me essai 3m essai 1èe cavité 0,95 1,01 1,01 2èm cavité 0,95 1,02 1,06 3me cavité 0,98 1,02 1,04 4me cavité 0,97,97 0,99 1,04 ème cavité 0,98 1,04 1,00 6' cavité 0,98 1,03 1,03 7èm cavité 0,99 1,03 0,99 8ème cavité 0,99 1,04 0,99 9ème cavité 0,94 1,02 1,00 èe cavité 0,94 1,05 1,02 1 1me cavité 0,98 1,02 0,99 12ème cavité 0,91 1,05 1,02 13ème cavité 1,01 1,01 0,96 14ème cavité 1,00 1,02 1,04 èm cavité 0,96 1, 02 1,01 16ème cavité 1,02 1,03 0,99 1 7m cavité 1,02 1,03 0,99 18me cavité 1,02 1,00 1,02 19èm cavité 1,01 0,99 1,01 me cavité 1,01 1,01 1,02 Moyenne 0,98 1,02 1,01 Ecart type 0,032 0,018 0,025 Coefficient de variation 3.3% 1,7% 2,4% Tableau 2 Test de répartition de l'échantillon biologique dans des cavités de petite taille De même avec les cavités 10 de taille moyenne, trois essais ont été réalisés pour les vingt puits. Les tests ont été réalisés à partir de 2220 pl d'eau déminéralisée avec une dépression de 875 millibars. Les résultats sont représentées sur le tableau 3 et sont les suivants: 21 2782729 1eri 2è | 23me essai 3 essai 1ère cavité 8,8 9,1 10,1 2me cavité 12,5 10,5 10,1 3èm cavité 9,6 9,4 10,5 4me cavité 10,6 10,9 9,3 ème cavité 10,8 9,1 8,6 6me cavité 10,5 10,3 10,6 7ème cavité 10,0 9,6 9,4 8ème cavité 10,7 11,3 10,8 9ème cavité 9,3 10,0 10,7 oème cavité 10,2 10,3 9,9 i11me cavité 9,9 9,4 10,3 12me cavité 9,1 10,3 11,5 13m cavité 9,3 9,1 10,1 14me cavité 9,7 8,7 9,2 m' cavité 11,5 11,6 11,3 16ème cavité 10,7 9,7 7,7 17tm cavité 9,5 10,3 10,5 18ème cavité 9,9 9,2 11,0 19'me cavité 11,1 9,4 11,8 me cavité 9,7 8, 4 10,2 Moyenne 10,2 9,8 10,2 Ecart type 0,897 0,834 0,985 Coefficient de variation 8.8% 8, 5% 9,7% Tableau 3: Test de répartition de l'échantillon biologique dans des cavités de taille moyenne De manière identique aux deux cas précédents, trois essais, avec les cavités 9 de grande taille, ont été réalisés pour les vingt puits. Les tests ont été réalisés dans les mêmes conditions que précédemment, c'est-à-dire à partir de 2220 gl d'eau déminéralisée avec une dépression de 875 millibars. Les résultats sont présentés dans le tableau 4 qui suit: 22 2782729 1er essai 2me essai 3m' essai Ir cavité 93,2 98,7 97,8 2ème cavité 101,5 101,1 100,2 3ème cavité 97,9 99,6 95,3 4èm cavité 100,4 103,2 99, 8 èm cavité 98,5 98,4 98,9 6ème cavité 101, 7 100,8 99,7 7me cavité 103,8 101,9 101,4 8me cavité 100,3 97,0 101,9 9m cavité 102, 4 102,8 99,9 me cavité 99,1 99,8 99,9 11 ècavité 105,5 101,4 99,8 12m cavité 100,7 103,1 99,2 13ème cavité 100,9 99,8 100,3 14ème cavité 104,2 101,0 102,4 ème cavité 95,7 98,5 102,5 16èm cavité 102,6 98,1 98,5 17ème cavité 103,2 99,3 98,4 18ème cavité 102,6 101,7 98,5 19ème cavité 102,2 95,4 95,9 ème cavité 101,1 97,6 104,3 Moyenne 100,9 100,0 99,7 Ecart type 2,904 2,123 2,133 Coefficient de variation 2.9% 2,1% 2,1% Tableau 4: Test de répartition de l'échantillon biologique dans des cavités de grande taille On remarque d'une part que le volume présent dans chaque puits ou cavité 9, 10 ou 11 de même taille est relativement constant, puisque la moyenne entre les trois essais est sensiblement constante, que l'écart type et le coefficient de variation sont faibles. En fait, l'écart type est constant quel que soit le volume de ce fait il y a une diminution du coefficient de variation, qui est proportionnelle à l'augmentation du volume de liquide contenu dans l'échantillon. En fait ces résultats sont dus aux problèmes de précision des mesures de liquides présents dans chaque puits ou cavité 9, ou 11, après la distribution de l'échantillon de départ. 23 2782729 Quoiqu'il en soit ces résultats sont particulièrement intéressants, et permettent l'utilisation de la méthode de calcul de la concentration de tout élément biologique, tel qu'acides nucléiques, anticorps ou microorganismes, présent dans ledit échantillon biologique 4 de départ. La carte d'analyse 1 peut également être utilisée dans le domaine médical pour effectuer des numérations de micro-organismes dans les liquides biologiques. L'exemple suivant décrit le protocole pouvant être employé dans le cadre d'une analyse d'urine pour effectuer la numération des gènes urinaires. On réalise une dilution de l'urine prélevée en transférant (après homogénéisation) du récipient de prélèvement, une dose calibrée de 10pl dans un tube contenant 5ml d'un milieu de culture. Après l'homogénéisation, on obtient une dilution à 2. 10-3 soit au 1/500. On transfert ensuite 2220 il de cette dilution le tube 32. La carte 1 est ensuite remplie puis incubée et enfin lue de la même façon que dans les exemples décrits précédemment. La température d'incubation sera cependant plus élevée et proche de 37 C. En utilisant ce protocole, on peut donc dénombrer les germes urinaires lorsque la contamination de l'urine est comprise entre 225 UFC/ml et 1,5. 106 UFC/ml. 24 2782729 REFERENCES 1. Carte d'analyse 2. Corps de la carte d'analyse 1 3. Zone d'injection dans la carte I 4. Liquide ou échantillon biologique à analyser 5. Canal principal d'amenée 6. Canaux secondaires 7. Puits correspondant à chaque canal 6 ou moyen de distribution 8. Canaux terminaux 9. Cavités d'analyse terminales, de grande taille, correspondant à un canal 8 10. Cavités d'analyse terminales, de taille moyenne, correspondant à un canal 8 11. Cavités d'analyse terminales, de petite taille, correspondant à un canal 8 12. Puits ou moyen de distribution principal 13. Zone d'injection latérale 14. Rainure circulaire dans le corps 2 15. Epaulement du tuyau 33 coopérant avec la rainure 14 21. Carte d'analyse 22. Corps de la carte d'analyse 21 23. Zone d'injection dans la carte 21 25. Canaux d'amenée 27. Puits correspondant à chaque canal 25 ou moyen de distribution 28. Canaux terminaux 29. Cavités d'analyse terminales, de grande taille, correspondant à un canal 28 30. Cavités d'analyse terminales, de taille moyenne, correspondant à un canal 28 31. Cavités d'analyse terminales, de petite taille, correspondant à un canal 28 32. Tube contenant l'échantillon 4 33. Tuyau reliant la zone 3 au tube 32 34. Extrémité libre du tuyau 33 35. Film transparent adhésif 2782729 REVENDICATIONS 1. Carte d'analyse (1) qui comprend un corps (2) constitué par: - une zone d'injection (3) dans la carte (1) d'un liquide biologique (4) à analyser, - un canal principal d'amenée (5) du liquide biologique (4) provenant de la zone d'injection (3), - au moins deux canaux secondaires (6) situés dans le prolongement du canal principal (5), et - au moins un puits (7) correspondant à chaque canal secondaire (6), caractérisée par le fait que chaque puits (7) constitue un moyen de distribution, d'une quantité déterminée dudit liquide biologique (4), dans au moins deux cavités d'analyse terminales (9, 10 ou 11), via un canal terminal (8) pour chaque cavité d'analyse (9, 10 ou 11). 2. Carte d'analyse (21) qui comprend un corps (22) constitué par: - une zone d'injection (23) dans la carte (21) d'un liquide biologique à analyser, - au moins deux canaux d'amenée (25) du liquide biologique provenant de la zone d'injection (23), et - au moins un puits (27) correspondant à chaque canal d'amenée (25), caractérisée par le fait que chaque puits (27) constitue un moyen de distribution, d'une quantité déterminée dudit liquide biologique, dans au moins deux cavités d'analyse terminales (29, 30 ou 31), via un canal terminal (28) pour chaque cavité d'analyse (29, o0u31). 3. Carte, selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'un puits (12), faisant office de moyen de distribution principal du liquide biologique (4), est présent entre le canal principal (5), d'une part, et les canaux secondaires (6), d'autre part. 26 2782729 4. Carte, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que les volumes des canaux secondaires (6) ou des canaux d'amenée (25) sont tous identiques. 5. Carte, selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisée par le fait que les cavités d'analyse terminales (9, 10 et/ou 11 ou bien 29, 30 et/ou 31) sont d'au moins deux volumes différents. 6. Carte, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait o que les cavités d'analyse terminales (9, 10 et/ou 11 ou bien 29, 30 et/ou 31) sont de trois volumes différents. 7. Carte, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée par le fait que le rapport existant entre deux cavités de volumes différents (9 et 10 ou 10 et 11 ou 9 et 11 ou bien 29 et 30 ou 30 et 31 ou 29 et 31) est compris entre 1/5 et 1/20, 1/50 et 1/200 ou 1/500 et 1/2000, et notamment 1/10, 1/100 ou 1/1000. 8. Carte, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que les cavités (9, 10 et/ou 11 ou bien 29, 30 et/ou 31) d'un même volume sont alignées ou disposées de manière concentrique pour faciliter la lecture. 9. Procédé de remplissage d'une carte d'analyse, telle qu'exposée selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il consiste à: - relier la zone d'injection (3 ou 23) de la carte (1 ou 21) à un volume d'un liquide biologique (4) à analyser, - générer une dépression au sein et/ou au voisinage de ladite carte (1 ou 21), - casser la dépression afin, d'une part, de transférer le liquide biologique (4) dans les cavités d'analyse (9, 10 et/ou 11 ou bien 29, 30 et/ou 31), et, d'autre part, d'isoler par un fluide les différentes fractions de l'échantillon, issues dudit liquide biologique (4), 27 2782729 qui sont présentes dans chacune desdites cavités d'analyse (9, 10 ou 11 ou bien 29, 30 ou 31), et - analyser le résultat obtenu afin de déterminer la quantité de micro-organismes ou de tout autre élément biologique, tel qu'acides nucléiques, anticorps, présent dans l'échantillon biologique (4) de départ. 10. Procédé, selon la revendication 9, caractérisé en ce que, une fois que la dépression est cassée, le fluide isolant est en contact avec le liquide biologique (4) soit au niveau des canaux secondaires (6) ou des canaux d'amenée (25) soit au niveau des o10 cavités d'analyse (9, 10 et/ou 1 ou bien 29, 30 et/ou 31). 1l. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que le volume du liquide biologique (4) à analyser est inférieur au volume total de toutes les cavités d'analyse (9, 10 et 1 1 ou bien 29, 30 et 31). 12. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le rapport entre le volume du liquide biologique (4) à analyser et le volume total de toutes les cavités d'analyse (9, 10 et ll ou bien 29, 30 et 31) est de 1/10 à 9/10, notamment de 4/10 à 6/10, et préférentiellement de 5/10. 13. Utilisation d'une carte d'analyse (1 ou 21), selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la numération de micro-organismes suivant la technique du nombre le plus probable.