Brevet FR2778744A1 — publié le 19991119

DOSAGE IMMUNOLOGIQUE DE LA CHROMOGRANINE A HUMAINE (CgA), ANTICORPS, REACTIFS ET TROUSSES UTILISABLES POUR CE DOSAGE DESCRIPTION Domaine technique La présente invention a pour objet un procédé de dosage immunologique de la chromogranine A humaine, qui permet en particulier de doser non seulement la chromogranine A sous forme intacte mais également les fragments majeurs de cette chromogranine A. Un tel dosage peut être utilisé en particulier pour le diagnostic et le suivi de pathologies telles que par exemple le phéochromocytome et les carcinoides intestinaux. Etat de la technique antérieure La chromogranine A (CgA) est une protéine d'un poids moléculaire de 48 kDa, d'un pI de 4,9, dont la forme humaine comporte 439 acides aminés comme il est décrit par Konecki et ai, 1987, dans la référence [1]. Elle appartient à la famille des granines avec lesquelles elle partage des similitudes structurales et physiologiques. La CgA présente tout comme la chromogranine B une conservation interespèce marquée qui suppose une fonction majeure. La CgA est largement représentée dans les sécrétagogues des cellules endocrines et neuroendocrines dont elle constitue avec les autres granines une des composantes principales. Elle intervient à ce niveau à la fois comme élément régulateur de la cosecrétion d'autres entités, comme les catécholamines dans la glande surrénale. La CgA joue en outre un rôle essentiel de prohormone par le biais de la libération de peptides actifs, consécutive à la dégradation protéolytique intra-granulaire et extra-matricielle. Sur la figure 1 annexée, on a représenté la séquence des 439 acides aminés décrite par Konecki et al, correspondant à la chromogranine A humaine. Sur la figure 2, on a représenté cette séquence de façon simplifiée, en identifiant sur cette figure certains des peptides susceptibles d'être libérés chez l'homme, soit les peptides: vasostatine/3 granine, chromostatine, pancréastatine, parastatine et prochromacine. La protéolyse touche les sites dibasiques numérotés et repérés par un astérisque sur la figure 2, qui sont répartis le long de la séquence de la CgA et sont au nombre de 10 dans la CgA humaine. Cette protéolyse a été décrite comme un phénomène récurrent de part et d'autre des extrémités de la protéine et il a été démontré qu'elle était spécifique des tissus et qu'elle conduisait à des différences importantes dans la distribution tissulaire des peptides produits. Le degré d'intensité et la nature de la protéolyse seraient donc responsables de la grande variabilité des fragments retrouvés dans les tissus, la circulation sanguine et l'urine. Les travaux récents de Corti et al dans la référence [2] ont confirmé cette diversité en montrant qu'il existe chez les patients atteints de phéochromocytome des formes circulantes de conformation différente et en proportions variables d'un individu à l'autre. De la même manière, il a été montré, à travers l'étude du peptide WE-14, que la CgA était protéolysée de façon différente dans les tissus normaux et les tissus néoplasiques du tractus gastro-entero- pancréatique. Outre sa mise en évidence dans les tissus normaux ainsi que dans les néoplasies correspondantes, de nombreuses études attribuent au dosage de la CgA un intérêt diagnostique. Les taux de CgA circulante sont significativement élevés dans les cas de phéochromocytome, de carcinoïde et de tumeur endocrine du pancréas. Ces données ont été confirmées puis élargies à d'autres pathologies: neuroblastome, tumeurs du tractus gastro-intestinal, hypertension essentielle. La présence de CgA a été démontrée dans un nombre important de pathologies neurodégénératives dont l'Alzheimer (voir la référence Munoz, Lab. Invest., 1991, vol. 64, pages 826-832 [15]). Certains auteurs ont également montré que la présence de CgA dans les cancers prostatiques pouvait être le signe d'une évolution défavorable, de même que dans les cas de cancer du rein. Le dosage de la CgA présente donc un grand intérêt. Le document US-A-4 758 522 [3] décrit un dosage immunologique de la CgA dans lequel la CgA est mesurée par compétition avec de la CgA radiomarquée pour les sites d'un anticorps anti-CgA humaine. Syversen et al dans la référence [4] ont décrit un dosage de la chromogranine A par la méthode ELISA utilisant un anticorps dirigé contre un fragment C-terminal de la CgA correspondant à la séquence des acides aminés n 210 à 439, et un dosage radio- immunologique de la pancréastatine. Corti et ai dans la référence [2] ont également décrit deux dosages de la CgA utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les séquences d'acides aminés 81 à 90 et 68 à 70 de la CgA humaine. Ces dosages prennent donc en considération certains fragments de la CgA, mais ils ne permettent pas de différencier le type de pathologie à partir des résultats du dosage. En effet, la protéolyse de la molécule et la multiplicité des fragments circulants supposent une configuration de dosage qui soit capable de détecter la majorité de ces entités. La présente invention a précisément pour objet un procédé de dosage immunologique de la CgA qui mesure les taux de la CgA intacte ainsi que les taux des fragments majeurs retrouvés au niveau de la circulation sanguine. Exposé de l'invention Selon l'invention, le procédé de dosage immunologique de la chromogranine A (CgA) humaine présente dans un échantillon comprend l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un épitope situé dans la région médiane de la CgA, ledit épitope étant situé dans la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé n 145 à l'acide aminé n 245 à partir de l'extrémité N- terminale de la CgA humaine. Selon l'invention, le terme dosage immunologique recouvre tous les types de dosage immunologique, en phase homogène ou en phase hétérogène, tels que par exemple les dosages par compétition, les dosages par la méthode sandwich, les dosages ELISA, RIA, et tout autre type de dosage mettant en oeuvre une réaction antigène-anticorps. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le dosage immunologique est un dosage par compétition entre la chromogranine A de l'échantillon et une quantité donnée de chromogranine A humaine (hCgA) marquée, pour les sites dudit anticorps. Pour mettre en oeuvre ce dosage, on ajoute à l'échantillon à doser une quantité de CgA humaine marquée et l'anticorps qui se lie spécifiquement à un épitope situé dans la région médiane de la CgA, puis on laisse incuber. De la sorte, on a une compétition entre la CgA de l'échantillon et la CgA marquée pour les sites de cet anticorps. Lorsqu'on réalise le dosage en phase hétérogène, en utilisant comme marqueur un radioélément, on peut séparer les complexes anticorps- hCgA formés par immuno-précipitation au moyen d'un anticorps approprié. En déterminant ensuite la radioactivité des complexes formés, on peut déterminer la concentration en CgA de l'échantillon en se référant à une courbe standard obtenue à partir d'échantillons standards de concentrations connues en CgA. On peut aussi réaliser le dosage en phase homogène en utilisant par exemple de la hCgA marquée et un anticorps apte à modifier le signal émis par la hCgA marquée. Dans ce dosage, on utilise avantageusement l'anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA humaine, ou l'anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 de la CgA humaine. Ces anticorps sont de préférence des anticorps monoclonaux. Pour réaliser ce dosage, on peut utiliser pour la préparation des échantillons standards et de la CgA marquée, de la CgA humaine purifiée provenant de cellules endocrines ou neuroendocrines d'origine humaine ou, de préférence, de la CgA humaine recombinante. Selon un second mode de réalisation de l'invention, le dosage immunologique est un dosage de type sandwich utilisant un premier anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un premier épitope situé dans la région médiane de la CgA humaine, et un second anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un second épitope différent du premier et situé également dans la région médiane de la CgA humaine, l'un des deux anticorps étant marqué. Dans ce second mode de réalisation de l'invention, on utilise deux anticorps spécifiques d'épitopes différents, situés dans la partie médiane de la CgA. Ce dosage peut être effectué en phase hétérogène en immobilisant le premier anticorps sur une phase solide et en utilisant un second anticorps marqué. Ce dosage peut également être effectué en phase homogène, en utilisant un premier anticorps marqué et un second anticorps apte à modifier le signal émis par le premier anticorps marque. A titre d'exemple, le premier anticorps peut être spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197, et le second anticorps peut être spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA. On peut aussi utiliser dans ce dosage un premier anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 et un second anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 de la CgA humaine. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, le dosage immunologique est un dosage de type sandwich utilisant un premier anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un épitope situé dans la région médiane de la CgA humaine et un second anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un second épitope situé dans la région de la CgA humaine allant de l'acide aminé n 250 à l'acide aminé n 301, l'un des deux anticorps étant marqué. Dans ce mode de réalisation de l'invention, le dosage peut être effectué en phase hétérogène en utilisant un premier anticorps immobilisé sur une phase solide et un second anticorps marqué, ou l'inverse. On peut aussi effectuer le dosage en phase homogène, en utilisant un premier anticorps marqué et un second anticorps apte à modifier le signal émis par le premier anticorps marqué, ou l'inverse. Comme premier anticorps, on utilise avantageusement un anticorps spécifique de la séquence d'acides aminés n 145 à 197 ou un anticorps spécifique de la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA humaine. Le procédé de l'invention est particulièrement intéressant pour le diagnostic et le suivi de pathologies telles que le phéochromocytome ou les tumeurs carcinoides, car ils permettent de discriminer positivement les sérums de patients atteints de phéochromocytome ou de tumeurs carcinoides par rapport aux sérums normaux. Pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, on peut utiliser des méthodes classiques de dosage immunologique en phase hétérogène, qui permettent de séparer les complexes CgA-anticorps de l'anticorps marqué en excès. On peut aussi utiliser dans l'invention des méthodes de dosage en phase homogène qui ne comportent pas une telle séparation. Les méthodes de dosage en phase homogène sont basées sur l'emploi d'un couple anticorps-antigène ou d'un couple de deux anticorps qui lorsqu'ils sont proches l'un de l'autre émettent un signal différent de celui qu'ils émettent séparément. Dans ce but, on peut utiliser en particulier un anticorps couplé à un composé luminescent accepteur d'énergie et un anticorps couplé à un composé luminescent donneur d'énergie. A titre d'exemple le composé luminescent accepteur d'énergie peut être l'allophycocyanine et le composé luminescent donneur d'énergie peut être un cryptate d'europium tel que ceux décrits dans EP-A-0 321 353 [11]. Une méthode de dosage en phase homogène particulièrement intéressante est la méthode TRACE décrite dans la référence [14]. Dans le cas des dosages en phase hétérogène, on utilise une phase solide sur laquelle est immobilisé l'anticorps non marqué utilisé pour le dosage. Les phases solides susceptibles d'être utilisées peuvent être de différents types. Ainsi, on peut utiliser des phases solides macroscopiques, constituées par des tubes, des billes ou des ailettes réalisés en polymère ou en d'autres matériaux. Les polymères susceptibles d'être utilisés sont par exemple le polystyrène, les polyamides, le polypropylène, les polyoxyméthylènes et les copolymères de styrène. On peut aussi utiliser des phases solides microscopiques finement divisées, par exemples des poudres et des agrégats en polymère, en protéine ou en d'autres matériaux. Dans l'invention, le terme " marqué ", appliqué à la CgA humaine dans le premier mode de réalisation de l'invention ou aux différents anticorps dans le second mode de réalisation, signifie que la CgA ou les anticorps ont été modifiés par un élément marqueur qui peut être, par exemple, un radioélément, un élément fluorescent, un élément luminescent, une enzyme, un chromophore fluorescent, un chromophore absorbant la lumière, l'avidine et la biotine. L'invention concerne également les anticorps monoclonaux spécifiques d'un épitope situé soit dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197, soit dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234, de la chromogranine A humaine, et des réactifs immunologiques comportant l'un des anticorps lié à un marqueur détectable ou fixé sur une phase solide. L'invention concerne de plus des trousses de dosage immunologique de la CgA humaine comportant les anticorps monoclonaux précités. Elle concerne encore une trousse de dosage immunologique de la CgA humaine, qui comprend: - un premier anticorps, et - un second anticorps, l'un des deux anticorps étant un anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 245 à partir de l'extrémité Nterminale de la CgA humaine, et l'autre anticorps étant spécifique d'un épitope différent de la CgA humaine. Selon un premier mode de réalisation des trousses, le premier anticorps et le second anticorps sont choisis parmi les anticorps spécifiques d'épitopes situés dans les séquences d'acides aminés n 145 à 197 et n 219 à 234 de la CgA humaine. Selon un second mode de réalisation des trousses, l'un des anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 ou dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234, et l'autre anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 250 à 301 de la CgA humaine. De préférence, lorsque la trousse est destinée à un dosage en phase hétérogène, l'un des anticorps est immobilisé sur une phase solide et l'autre anticorps est couplé à un marqueur détectable. Le marqueur détectable est par exemple l'iode 125. De préférence, lorsque la trousse est destinée à un dosage en phase homogène, l'un des anticorps est couplé à un composé luminescent donneur d'énergie et l'autre anticorps est couplé à un composé luminescent accepteur d'énergie. Avantageusement, le composé luminescent donneur d'énergie est un cryptate d'europium et le composé luminescent accepteur d'énergie est l'allophycocyanine. Selon l'invention, les anticorps utilisés pour le dosage peuvent être des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir des fragments peptidiques de la chromogranine A humaine obtenus par protéolyse de la CgA humaine ou par synthèse peptidique, par immunisation in vivo ou in vitro. Dans ce cas, il est nécessaire de coupler le fragment peptidique à une protéine de transport telle que l'hémocyanine de la patelle (KLH), pour obtenir des anticorps chez l'animal. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus à partir d'hybridomes selon la technique de H. Kohler et C. Milstein décrite dans Nature, 1975, 256, pages 495-497. Dans ce cas, on réalise une ou plusieurs immunisationS de souris avec la chromogranine A totale ou avec des fragments peptidiques correspondant aux épitopes voulus, associés à une protéine porteuse, puis on prélève la rate des animaux et on effectue une fusion cellulaire des splénocytes avec des cellules de myélome. On effectue ensuite un criblage des hybridomes produits pour sélectionner les clones produisant les anticorps spécifiques des épitopes de la CgA humaine. De préférence, selon l'invention, on utilise des anticorps monoclonaux. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, d'exemples de réalisation donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Brève description des dessins La figure 1 illustre la séquence des 439 acides aminés de la CgA humaine mature. La figure 2 illustre de façon simplifiée la séquence d'acides aminés de la CgA humaine avec les fragments obtenus par protéolyse et leur emplacement sur cette protéine. Les astérisques et les numéros qui leur sont associés indiquent les sites de clivage dibasiques. Les anticorps dirigés contre certains épitopes sont répertoriés en dessous. La figure 3 représente le spectre obtenu lors la chromatographie liquide à haute performance de CgA humaine recombinante après protéolyse par l'endoprotéase Lys-C. La figure 4 est un diagramme représentant la distribution des différentes populations testées par un dosage par compétition (RIA) conforme à l'invention. Le nombre de cas testés est donné au-dessus de chaque groupe d'essai. Les lignes indiquent la médiane pour chaque groupe d'essai. La figure 5 est un diagramme illustrant les résultats obtenus avec trois dosages de type sandwich par rapport au dosage par compétition en utilisant des anticorps différents. Les résultats sont exprimés sous la forme du rapport de concentration des plasmas pathologiques sur la valeur du 95è percentile d'une population normale (n=20). Les lignes indiquent la médiane pour chaque groupe d'essai. La figue 6 représente la courbe obtenue, soit la concentration en CgA humaine d'un échantillon (en ng/ml) en fonction de la fluorescence détectée (F), en mettant en oeuvre un dosage en phase homogène conforme à l'invention. La figure 7 est un histogramme illustrant la teneur en CgA trouvée par le dosage de la figure 6 sur différents plasmas. La description qui suit illustre la préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes différents de la CgA humaine et la sélection des anticorps utiles pour le dosage immunologique de la chromogranine A humaine. I) - Production des anticorps monoclonaux 1 - Isolement et purification de la CgA humaine. On utilise la méthode décrite par O'Connor et al dans la référence [6] pour purifier la hCgA à partir de glandes surrénales humaines de patients atteints de phéochromocytome. La séparation finale de la protéine est effectuée par électrophorèse sur gel 2-D en utilisant la technique originale de 0'Farrel décrite dans la référence [7] et modifiée par Bader et Aunis comme il est décrit dans la référence [8]. La CgA est électroéluée à partir des gels. On produit également de la CgA humaine recombinante (rhCgA) à partir d'une souche de E. Coli BL21 (DE3) exprimant rhCgA comme il est décrit par Taupenot et al dans la référence [9]. 2 - Marquage de la CgA purifiée ( 12I-hCgA) Les CgA purifiées native et recombinante sont marquées avec Na'25I selon la méthode à la chloramine T de Hunter et Greenwood à une activité spécifique de 1500 kBq pg-1. L'iode libre est éliminé par filtration sur gel Sephadex-G25 (Pharmacia Biotech). Les fractions de protéine radiomarquée sont mélangées et diluées dans du PBS, pH 7,2 contenant 45 mmole/l de NaN3, 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA). 3 - Immunisations Des souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines sont respectivement immunisées par voie intrapéritonéale avec 10 pg de hCgA ou de rhCgA purifiée obtenue précédemment dans de l'adjuvant complet de Freund. Les doses intrapéritonéales suivantes sont effectuées dans de l'adjuvant incomplet de Freund à des intervalles d'un mois. Les immunisations des souris sont suivies par titrage du sérum par immunoprécipitation avec 125I-hCgA obtenue précédemment. 4 - Production et criblage des hybridomes On injecte ensuite par voie intraveineuse aux souris 10 pg de hCgA dans une solution de NaCl à 0,9 % trois jours avant la fusion cellulaire. On isole les cellules de la rate et on les fusionne avec des cellules de myélome P3-X63-Ag 8.653 en présence de polyéthylène glycol à 37 % (poids moléculaire 1540) On identifie les clones positifs par immunoprécipitation avec 125I-hCgA. Les anticorps provenant de clones positifs sont produits à partir d'ascites de souris et purifiés en utilisant le gel sépharose- protéine A. Onze fusions ont été réalisées avec des souris immunisées contre la hCgA. Seulement deux d'entre elles ont abouti et généré 8 clones. Les deux fusions avec les animaux immunisés contre la protéine hCgA recombinante ont produit 16 clones de seconde génération. Au total 17 IgG1, 6 IgG2a et 1 IgG2b possédant des titres variant de 2 à 3236 ng/ml ont été produits pour être caractérisés. - Identification des anticorps monoclonaux. Les différentes familles d'épitopes de CgA ont été identifiées en testant les combinaisons possibles d'anticorps sur l'appareil Biacore selon les instructions du fabricant. Tous les anticorps testés ont été dilués dans HEPES à 50 mmol/l, EDTA 15 mmol/l, NaCl 0,75 M, pH 7,4, et injectés à raison de 50 pg/ml. Le même tampon a été utilisé pour la CgA humaine recombinante, diluée à 20 pg/ml. Cette analyse sur Biacore a permis de déterminer que les 24 anticorps testés se répartissent en huit groupes épitopiques comme il est indiqué dans le tableau 1. L'un d'entre eux (groupe 3) peut néanmoins être subdivisé en raison d'inhibitions partielles existant entre les anticorps de ce groupe. La stoechiométrie de la réaction anticorps immobilisé -rhCgA varie de 0,157 à 0,621 mole d'antigène/mole d'anticorps (voir tableau 1). 6 - Identification des anticorps avec les peptides dérivés de la CgA recombinante humaine (rhCgA). On fait digérer 2 nmol de rhCgA pendant 2 h à 37 C avec l'endoprotéinase Lys-C à un rapport protéine/protéinase de 1000: 1 dans 100 mmole/l de TRIS-HCl, pH 8,3. Les peptides dérivés de rhCgA produits sont alors séparés par HPLC sur une colonne de gel Macherey NAGEL 300-5C18 (250 mm x 4 mm). On mesure l'absorbance à 214 nm, et on utilise comme système solvant 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'eau (solvant A) et 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile (solvant B). On élue les peptides à un débit de 0,7 ml/min en utilisant des gradients successifs du solvant B dans le solvant A de 0 à 25 % pendant minutes et de 25 à 75 % pendant 50 minutes. Chaque fraction de pic est collectée et concentrée par évaporation mais pas jusqu'à siccité complète. La figure 3 illustre les fractions recueillies en sortie de colonne en fonction du temps qui sont numérotées de 1 à 6. La séquence des peptides purifiés est déterminée par dégradation automatique d'Edman sur un microséquenceur 473 A d'Applied Biosystems. Des échantillons purifiés par HPLC sont chargés sur des filtres de fibres de verre pré-cyclés et traités au polybrène. Les acides amino-phénylthiohydantoïne sont identifiés par chromatographie sur une colonne C-18 (PTH C-18, 2,1 mm x 200 mm). L'analyse par spectrométrie de masse est effectuée selon le processus décrit par Goumon et ai dans la référence [10]. On utilise ces fractions pour identifier les anticorps monoclonaux obtenus précédemment. Dans ce but des parties aliquotes des fractions sont réparties sur des feuilles de nitrocellulose. Les membranes sont lavées rapidement avec NaCl/Pi (25 mM de phosphate de sodium pH 7,5 contenant 0,9 % de NaCl) et mises à incuber pendant 2 heures à la température ambiante avec les anticorps monoclonaux dilués au 1/1000 dans NaCl/Pi. Le second anticorps est une IgG anti-souris conjuguée à la phosphatase alcaline. La réaction enzymatique prend place dans 100 mmol/l de TRIS-HCl, pH 8,5, 100 mmol/l de NaCl, 50 mmol/l de MgCl2 contenant 0,4 mmol/l de nitro-bleu de tétrazolium et 0,38 mmol/l de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate. On teste un anticorps monoclonal de chacun des groupes du tableau 1, soit les anticorps CGS04, CGS06, CGS10, CGS30, CGS17, CGS21 et CGS32 produits précédemment, contre chaque fraction aliquote des fragments de rhCgA séparés par chromatographie liquide haute performance. Le tableau 2 illustre la corrélation entre les différentes fractions et les anticorps reconnaissant ces fractions. Dans le tableau 2, on a donné également la masse des fragments isolés dans chaque fraction, leur position à partir de l'extrémité N-terminale de la chromogranine A ainsi que leur séquence N-terminale. Les anticorps CGS17 et CGS21 reconnaissent le domaine C-terminal de la protéine avec une haute spécificité pour les régions 339-355 et 356-400. Les anticorps CGS04 et CGS10 sont directement testés en Western-blot et les fragments immuno-détectés sont situés dans la région C-terminale de CgA (340-394 et 395-439). Les anticorps CGS06, CGS20 et CGS30 sont spécifiques de la partie médiane de la protéine et correspondent aux fragments 198-245, 246-303 et -197, respectivement. Finalement, on remarque que l'anticorps CGS32 est fortement réactif avec un fragment important qui va de 10 à 400. Parallèlement la séquence de l'épitope de l'anticorps CGS06 a été précisée par des peptides synthétiques. En effet, la séquence 198-245 montre une forte proportion d'acides glutamiques, région particulièrement hydrophile et potentiellement immunogène. Elle comporte notamment une première zone de 9 acides glutamiques contigus (210-218) et surtout une séquence de 3 acides glutamiques encadrée par deux prolines (227-232). Deux peptides, biotinylés en position N-terminale, correspondant aux séquences 207- 234 et 219-245 ont été synthétisés. Ces peptides ont été immobilisés sur des tubes préalablement revêtus avec de la streptavidine. Les anticorps radiomarqués CGS30, CGS06, et CGS20 (2 kBq par ml) ont été incubés pendant 4 heures à température ambiante sous agitation avec chacun des peptides. Les tubes ont ensuite été lavés, puis comptés. Les deux anticorps CGS20 et CGS30 ne reconnaissent aucun des deux peptides. En revanche, CGS06 montre une fixation significative sur les deux séquences. La séquence minimale déduite correspond donc à la région 219-234, zone qui englobe le site poly-Glu 227-232 mentionné plus haut. De la même manière, l'épitope de CGS20 a été précisé par rapport à la séquence de la pancréastatine. Dans ce cas, un peptide synthétique correspondant à la pancréastatine (séquence 250-301 de la CgA humaine), a été rajouté en quantités croissantes dans la deuxième incubation des dosages immunoradiométriques suivants: CGS06/CGS30* et CGS06/CGS20*. Dans le premier cas aucune inhibition du signal n'est visible, prouvant ainsi que ni CGS06, ni CGS30ne reconnaissent la séquence 250- 301. Pour le système CGS06/CGS20* en revanche, une inhibition croissante est obtenue lorsque les quantités de peptide introduit augmentent (86 % d'inhibition pour 0.5 pg de peptide par tube). CGS20 reconnaît donc bien la séquence 250-301 de la CgA humaine, séquence correspondante à la pancréastatine. Sur la figure 2, on a illustré la position de ces anticorps par rapport à la molécule totale de la chromogranine A en indiquant par ailleurs les séquences reconnues par ces anticorps. Selon l'invention, on a trouvé que les anticorps CGS06, CGS20 et CGS30 permettaient de réaliser des dosages immunologiques spécifiques, reproductibles et précis. Les anticorps CGS30 et CGS06 peuvent être utilisés dans un dosage immunologique par compétition. Les anticorps CGS06, CGS20 et CGS30 peuvent être couplés deux à deux pour réaliser un dosage de type sandwich. Les exemples qui suivent illustrent des dosages de ce type. Exemple 1: Dosage radioimmunologique de la chromogranine A humaine. Dans cet exemple, on utilise pour le dosage l'anticorps CGS06 qui est spécifique de la région allant de l'acide aminé 219 à l'acide aminé 234 de la chromogranine A. Pour effectuer ce dosage, on prépare des échantillons standards de chromogranine humaine recombinante (rhCgA) dilués dans du sérum humain normal. Les concentrations en rhCgA des échantillons standards vont de 0 jusqu'à 1 600 ng/ml. On utilise par ailleurs de la rhCgA marquée à l'iode 125 comme il a été décrit précédemment. Pour effectuer le dosage, on introduit dans un tube 50 pl de l'échantillon standard ou de l'échantillon à doser, 300 pl de hCgA radiomarquée à raison de 2 kBq par tube et 150 pl de la solution d'anticorps CGS06 purifiée à raison de 80 ng/ml. On réalise une première incubation pendant 24 heures à la température ambiante sous agitation légère. On sépare ensuite les complexes liés pendant 20 minutes à la température ambiante en ajoutant 75 pl d'immunoglobulines anti-souris de mouton diluées au 1/10è dans du PBS et 50 pl de sérum humain normal. On ajoute 1 ml de polyéthylène glycol à 6 % (poids moléculaire 6000) et on sépare les complexes précipités par centrifugation à 2000 g pendant 15 minutes. On détermine ensuite leur radioactivité dans un compteur gamma. On obtient à partir des échantillons standards la courbe standard et on détermine la concentration en chromogranine A de l'échantillon à doser en repérant la valeur trouvée sur cette courbe standard. La limite de détection déterminée par la répétabilité de la mesure au niveau du standard 0 (Bmax-2o pour n=10 mesures) a été calculée à 14 ng/mL. Le dosage en 10 points de 2 sérums de concentration 243 et 450 ng/mL, a permis d'évaluer une précision intra-essai de 0.9 % sur les deux échantillons. Parallèlement, le test de précision inter-essai réalisé par le dosage de ces mêmes sérums dans 3 expériences différentes montre un CV de 4,5 et 6,4 % respectivement. Ce dosage a été testé sur une série de 46 plasmas EDTA provenant de sujets sains, ainsi que sur 211 autres plasmas de patients atteints de pathologie neuroendocrine ou non. La figure 4 illustre les résultats obtenus avec cet essai sur les différents plasmas testés. Sur cette figure on a indiqué la nature des pathologies et le nombre de cas dans chaque groupe de patients. L'analyse de variance en comparant deux à deux la population normale et chacune des autres populations montre que dans chaque cas, les taux de CgA sont significativement plus élevés dans les plasmas pathologiques (p autres tumeurs neuroendocrines (p Dans ce dosage, les taux de CgA trouvés ont été les suivants: - 40 ng/ml pour le pool (NP) de plasmas des sujets sains. - 675 nm/ml pour le pool (PP) de plasmas des sujets atteints de phéochromocytome et - 1600 ng/ml pour le pool (CP) de plasmas des sujets atteints de tumeurs carcinoïides intestinales. Exemple 2: Dosage de la chromogranine A par une méthode sandwich. Pour ce dosage, on utilise deux anticorps différents, le premier anticorps est l'anticorps CGS06 spécifique de la séquence d'acides aminés 219-234 et le second anticorps est l'anticorps CGS30 spécifique de la séquence d'acides aminés 145 à 197. Le premier anticorps est amené à une concentration de 10 pg/ml dans du PBS, pH 7,5, et on revêt des tubes de polystyrène avec cet anticorps. Le second anticorps CGS30 est marqué à l'iode au moyen de Na'25I en utilisant la méthode à la chloramine T, décrite précédemment pour le marquage de rhCgA, à une activité spécifique de 400 kBq/pg. Les standards sont les mêmes que ceux décrits précédemment dans l'exemple 1. Le tampon utilisé pour l'essai est constitué de Na2HPO4/KH2PO4 50 mmol/1, EDTA 1 mmol/l, NaN3 mmol/l, BSA 1 %, pH 7,0. Pour chaque dosage, on introduit 1 ml de tampon d'essai et 50 pl d'échantillon standard ou d'échantillon à doser dans les tubes revêtus de l'anticorps CGS06. On laisse incuber pendant 18 heures à la température ambiante. On lave alors les tubes deux fois avec 2 ml d'une solution de Tween 20 à 0,3 %. On ajoute alors 1 ml de l'anticorps CGS30 marqué dans chaque tube et on laisse incuber pendant 2 heures à la température ambiante sous agitation douce. On lave de nouveau les tubes comme précédemment décrit et on détermine leur radioactivité sur un compteur gamma. Comme dans l'exemple 1, on obtient une courbe d'étalonnage à partir des échantillons standards de concentrations connues, et on détermine la concentration en chromogranine A de l'échantillon à doser en se référant à la courbe standard. Pour vérifier la spécificité du dosage, on effectue celui-ci sur un pool normal (NP) et sur deux pools pathologiques obtenus à partir de plasmas EDTA provenant respectivement de patients atteints de phéochromocytome (PP) ou de carcinoïdes intestinaux (CP). On évalue cette spécificité en déterminant les rapports de concentration de CgA entre le pool pathologique PP ou CP et le pool NP. Dans le cas de cet exemple, les rapports de concentration en CgA PP/NP et CP/NP sont les suivants: PP/NP = 9,9 CP/NP = 18, 2 Dans le cas du dosage de l'exemple 1, les rapports étaient les suivants: PP/NP = 16,9 CP/NP = 40 A titre comparatif, le pourcentage de liaison obtenu pour l'échantillon standard à 1200 ng/ml est de ,51. Cette combinaison d'anticorps permet donc d'obtenir un signal élevé et de différencier les deux pools pathologiques. Dans le tableau 3 annexé, on a donné les résultats obtenus en effectuant le même dosage sandwich avec des couples d'anticorps différents. Ces résultats montrent que les deux anticorps CGS06 et CGS30 de la partie médiane de la CgA associés entre eux ou à l'anticorps CGS20 donnent un signal satisfaisant et permettent de discriminer les deux pools pathologiques. A titre comparatif, on a effectué le même dosage en utilisant d'autres anticorps du tableau 2, mais ceux-ci n'ont pas donné de résultats satisfaisants. Ainsi, lorsqu'on utilise CGS21 ou CGS10 comme second anticorps marqué, il est impossible de discriminer le pool pathologique PP du pool NP, le rapport PP/NP n'étant pas supérieur à 2, voire inférieur à 1. D'autres combinaisons telles que CGS21/CGS06*, CGS21/CGS30* ou CGS32/CGS06* ne sont pas intéressantes car elles ne permettent pas de différencier les deux pools pathologiques entre eux, les rapports PP/NP et CP/NP étant voisins. Sur la figure 5, on a illustré les résultats des dosages immunologiques des exemples 1 et 2 conformes à l'invention et de deux autres dosages utilisant la méthode sandwich comme dans l'exemple 2, mais avec la combinaison d'anticorps CGS06/CGS29* marqué et la combinaison CGS06/CGS04* marqué. Les deux anticorps CGS29 et CGS04 reconnaissent la partie C-terminale de la CgA. L'anticorps CGS29 partage le même épitope que CGS10. Sur cette figure, les résultats sont exprimés sous la forme du rapport de concentration du plasma pathologique sur la valeur du 95ème percentile de la population normale (n = 20). Les droites indiquent la médiane pour chaque groupe. Cette figure montre que l'on obtient des résultats équivalents avec les exemples 1 et 2. En revanche, avec le couple CGS06/CGS04* la corrélation est dégradée et un certain nombre d'échantillons ont un niveau de CgA abaissé de manière très importante. Dans le cas du dosage avec CGS06/CGS29*, le phénomène est encore amplifié, on a une diminution très importante des concentrations mesurées, le taux de CgA étant indétectable dans 50 % de la population. Ainsi, les meilleurs résultats sont obtenus avec les anticorps de la région médiane de la CgA, conformément à l'invention. Exemple 3: Dosage de la chromogranine A par une méthode sandwich en phase homogène. Pour ce dosage, on utilise deux anticorps différents, le premier anticorps est l'anticorps CGS06 spécifique de la séquence d'acides aminés 219-234 et le second anticorps est l'anticorps CGS30 spécifique de la séquence d'acides aminés 145 à 197. Le premier anticorps CGS06 a été conjugué à du cryptate d'europium qui est un composé donneur d'énergie. Le second anticorps CGS30 a été conjugué à l'allophycocyanine qui est un composé accepteur d'énergie. Le cryptate d'europium utilisé est le cryptate Eu trisbipyridine diamine (TBP (Eu2+) cryptate). Il est décrit dans le document EP-A-321 353 [11] et répond à la formule: NH2 NH2 I I fHC2H4 2H4 I I NH NH l l O-C C=O NN Eu3N N N Le conjugué CGS06-cryptate est préparé par la méthode décrite par Lopez et al dans Clin. Chem., 39, 1993, pages 196-201 [12]. Le conjugué CGS30-allophycocyanine (APC) est préparé par la méthode décrite dans W092/01225 [13]. On utilise pour le dosage les tampons suivants: - tampon conjugué: PO4 50 mM pH 7,0, BSA 0,1 %, EDTA 1,5 mM, immunoglobulines de souris normale 1,5 mM, KF 600 mM, Kathon 0,1 %, tampon d'incubation: P04 50 mM pH 7,0, BSA 1%, EDTA 1,5 mM, sérum humain normal 10 %, Kathon 0,1%. * On introduit dans chaque puits d'une microplaque noire à 96 puits, et dans cet ordre: - 100 pl de conjugué CGS06-cryptate dilué dans le tampon conjugué, à une concentration de 0,5 pg/ml, - 100 4l de conjugué CGS30-APC dilué dans le tampon conjugué, à une concentration de 5 pg/ml, et - 100 pl de calibrateur ou d'échantillon à doser dilué dans le tampon d'incubation. On laisse incuber pendant 1 heure à 37 C, puis on mesure la fluorescence de chaque puits à 620 et 665 nm sur un appareil dédié, comme il est décrit par Mathis dans Clin. Chem. 39, 1993, pages 1953-1959 [14]. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 6 qui représente la concentration en CgA (en ng/ml) en fonction du signal détecté. Sur la figure 7, on a représenté les taux de CgA humaine trouvés dans le plasma de trois sujets sains Si, S2 et S3 et ceux trouvés dans les plasmas de trois patients pathologiques Pl, P2 et P3. Les chiffres indiquent le taux de CgA trouvé dans chaque cas (en ng/ml). On remarque ainsi que ce dosage permet de discriminer les plasmas des sujets sains de ceux des sujets pathologiques. Références citées [1]: Konecki et al J. Biol. Chem., 262, 1987, pages 17026-17030. [2]: Corti et al, Br. J. Cancer, 73, 1996, pages 924-932. [3]: US-A-4 758 522. [4]: Syversen et al, Acta Oncologica, 32, n 2, 1993, pages-161-165. [5]: Kohler et Milstein, Nature, 1975, 256, pages 495-497. [6]: 0'Connor et al, New Engl. J. Med., 1984, 311, pages 764-770. [7]: 0'Farrel, J. Biol. Chem. 72, 1975, pages 248-254 [8]: Bader et Aunis. Neuroscience, 8, 1983, pages 165-181. [9]: Taupenot et al, Regul Pept., 56, 1995, pages 71-88. [10]: Goumon et al, Eur J. Biochem.,235, pages 516-525. [11]: EP-A-0 321 353. [12]: Lopez et al Clin. Chem., 39, 1993, pages 196-201. [13]: WO 92/01225 [14]: Mathis, Clin. Chem. 39, 1993, pages 1953-1959. [15]: Munoz, Lab. Invest., 1991, vol. 64, pages 826-832. Tableau 1 Anticorps Isotype Stoechiométrie Groupe épi topique CGS01 IgG1 0,431 1 CGS03 IgG1 n.t. CGS04 IgG2b 0,365 CGS12 - IgG1 0,364 CGS06 IgG2a 0,503 2 CGS08 IgG1 0,457 CGS10 IgG1 0,182 3a CGS05 IgG1 0,157 CGS23 IgG2a 0,604 CGS24 IgG2a 0,521 CGS25 IgG2a 0, 553 CGS26 IgG2a 0,356 CGS29 IgG1 0,621 3b CGS34 IgG1 0,536 CGS35 IgG1 0,539 3c CGS30 IgG2a 0,327 4 CGS31 IgG1 0,198 CGS33 IgG1 0,383 CGS36 IgG1 0,184 CGS17 IgG1 0,162 5 CGS19 IgG1 0,361 CGS20 IgG1 0,254 6 CGS21 IgG1 0,183 7 CGS32 IgG1 0,262 8 Tableau 2 Fraction Anticorps Séquence N-terminale Masse Séquence d'acides (a) aminés du fragment i CGS17 Arg Leu Glu Gly Gln Glu Glu 2053,9 339-355 2 CGS30 Ala Glu Gly Asn Asn Gin Ala 5635,8 145-197 3 CGS20 Gly Ile Arg Lys Gly Glu Ser Arg Ser 6224,8 246-3033) 4 CGS06 Gly Leu Ser Ala Glu Pro Gly 5265,4 198-2452) CGS21 Leu Xaal) Phe Arg Ala Arg Ala 5145, 8 356-400 6 CGS32 Gly Xaa 1) Thr Glu Val Met Lys Xaal) Ile Val 43532 10-400 * CGS04 Leu Glu Gly Gln Glu Glu n.d. 340-394 * CGS10 Gly Tyr Pro Glu Glu Lys n.d. 395-439 1) Xaa = acide aminé inderterminé. 2) La séquence a été précisée à l'aide de peptides synthétiques. On a pu montrer que la séquence reconnue se limite en réalité à la région 219-234. 3) De même, on a pu déterminer que l'anticorps CGS20 reconnait un épitope plus restrictif correspondant à la séquence 250-301 (pancréastatine humaine). Tableau 3 Combinaison d'anticorps Pourcentage de Rapport des concentrations liaison avec en CgA standard 1200 ng/ml ler anticorps sur2nd anticorps PP/NP CP/NP phase solide marqué à 25I CGS06 CGS30* 65,51 9,9 18,2 CGS30 CGS06* 57,56 16,0 25,0 CGS06 CGS20* 12,8 4,0 23,2 CGS20 CGS06* 25,43 2,0 15,6 CGS30 CGS20* 22,04 5,6 21,8 CGS20 CGS30* 43,22 2,6 12,8 REVENDICATIONS 1. Procédé de dosage immunologique de la chromogranine A (CgA) humaine présente dans un échantillon utilisant au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un épitope situé dans la région médiane de la CgA, ledit épitope étant situé dans la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé n 145 à l'acide aminé n 245 à partir de l'extrémité N-terminale de la CgA humaine. 2. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le dosage est effectué en phase homogène ou en phase hétérogène. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le dosage immunologique est un dosage par compétition entre la chromogranine A de l'échantillon et une quantité donnée de chromogranine A marquée, pour les sites dudit anticorps. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA humaine. 5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 de la CgA humaine. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel la chromogranine A marquée est marquée par un marqueur du groupe comprenant les radio-isotopes, les éléments luminescents, les enzymes, les chromophores fluorescents, les chromophores absorbant la lumière, l'avidine et la biotine. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le marqueur est l'iode 125. 8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le dosage immunologique est un dosage de type sandwich utilisant un premier anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un premier épitope situé dans la région médiane de la CgA humaine, et un second anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un second épitope différent du premier et situé également dans la région médiane de la CgA humaine, l'un des deux anticorps étant marqué. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le dosage est effectuée en phase hétérogène, le premier anticorps étant immobilisé sur une phase solide et le second anticorps étant marque. 10. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le dosage est effectué en phase homogène, le premier anticorps étant marqué et le second anticorps étant apte à modifier le signal émis par le premier anticorps marque. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel le premier anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197, et le second anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel le premier anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 de la CgA humaine, et le second anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 de la CgA humaine. 13. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le dosage immunologique est un dosage de type sandwich utilisant un premier anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un épitope situé dans la région médiane de la CgA humaine et un second anticorps monoclonal ou polyclonal qui se lie spécifiquement à un second épitope situé dans la région de la CgA humaine allant de l'acide aminé n 250 à l'acide aminé n 301, l'un des deux anticorps étant marqué. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le dosage est effectué en phase hétérogène, le premier anticorps étant immobilisé sur une phase solide et le second anticorps étant marqué. 15. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le dosage est effectué en phase hétérogène, le premier anticorps étant marqué et le second anticorps étant immobilisé sur une phase solide. 16. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le dosage est effectué en phase homogène, le premier anticorps étant marqué et le second anticorps étant apte à modifier le signal émis par le premier anticorps marqué. 17. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le dosage est effectué en phase homogène, le second anticorps étant marqué et le premier anticorps étant apte à modifier le signal émis par le second anticorps marqué. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, dans lequel le premier anticorps est spécifique de la région allant de l'acide aminé n 145 à l'acide aminé n 197 de la CgA humaine, ou de la région allant de l'acide aminé n 219 à l'acide aminé n 234 de la CgA humaine. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 18, dans lequel l'anticorps marqué est marqué par un marqueur du groupe comprenant les radio-isotopes, les éléments luminescents, les enzymes, les chromophores fluorescents, les chromophores absorbant la lumière, l'avidine et la biotine. 20. Procédé selon la revendication 9 ou 14, dans lequel le marqueur est l'iode-125. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10, 16 et 17, dans lequel l'anticorps marqué est marqué par un composé luminescent donneur d'énergie et l'anticorps apte à modifier le signal émis par l'anticorps marqué est un anticorps couplé à un composé luminescent accepteur d'énergie. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel le composé luminescent donneur d'énergie est un cryptate d'europium et le composé luminescent accepteur d'énergie est l'allophycocyanine. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, dans lequel le(s) anticorps sont des anticorps monoclonaux. 24. Anticorps monoclonal capable de se lier spécifiquement à un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234 à partir de l'extrémité N- terminale de la chromogranine A humaine. 25. Anticorps monoclonal capable de se lier spécifiquement à un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 à partir de l'extrémité N- terminale de la chromogranine A humaine. 26. Réactif immunologique comprenant l'anticorps monoclonal de la revendication 24 ou 25 couplé à un marqueur détectable. 27. Réactif immunologique selon la revendication 26, dans lequel le marqueur détectable est choisi parmi les radioisotopes, les composés luminescents donneurs d'énergie et les composés luminescents accepteurs d'énergie. 28. Réactif immunologique selon la revendication 27, dans lequel le marqueur détectable est un cryptate d'europium ou l'allophycocyanine. 29. Réactif immunologique comprenant l'anticorps monoclonal de la revendication 25 ou 26 fixé sur une phase solide. 30. Trousse de dosage immunologique de la chromogranine A humaine comportant l'anticorps monoclonal de la revendication 25 ou 26. 31. Trousse de dosage immunologique de la chromogranine A (CgA) humaine comprenant un - premier anticorps, et - un second anticorps, l'un des deux anticorps étant un anticorps spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 245 à partir de l'extrémité N- terminale de la CgA humaine, et l'autre anticorps étant spécifique d'un épitope différent de la CgA humaine. 32. Trousse selon la revendication 31, dans laquelle le premier anticorps et le second anticorps sont choisis parmi les anticorps spécifiques d'épitopes situés dans les séquences d'acides aminés n 145 à 197 et n 219 à 234 de la CgA humaine. 33. Trousse selon la revendication 31, dans laquelle l'un des anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 145 à 197 ou dans la séquence d'acides aminés n 219 à 234, et l'autre anticorps est spécifique d'un épitope situé dans la séquence d'acides aminés n 250 à 301 de la CgA humaine. 34. Trousse selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, dans laquelle l'un des anticorps est immobilisé sur une phase solide et l'autre anticorps est couplé à un marqueur détectable. 35. Trousse selon la revendication 34, dans laquelle le marqueur détectable est l'iode 125. 36. Trousse selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, dans laquelle l'un des anticorps est couplé à un composé luminescent donneur d'énergie et l'autre anticorps est couplé à un composé luminescent accepteur d'énergie. 37. Trousse selon la revendication 36, dans laquelle le composé luminescent donneur d'énergie est un cryptate d'europium et le composé luminescent accepteur d'énergie est l'allophycocyanine.