Brevet FR2781158A1 — publié le 20000121

La présente invention concerne de nouvelles protéines modifiées immunogènes non immunosuppressives, leur procédé de préparation, leur application à titre de médicaments et les compositions pharmaceutiques les renfermant. On recherche toujours des composés actifs pour lutter contre le cancer qui est le fléau médical majeur de notre époque. De nombreuses thérapies ont été développées avec un succès variable puisqu'il y a encore une mortalité importante. Ces thérapies ont d'abord été l'exérèse chirurgicale pour les tumeurs solides, la radiothérapie, la chimiothérapie. Plus récemment des techniques de thérapie cellulaire ou de thérapie génique ont été développées. Parmi ces dernières techniques, beaucoup d'entre elles visent à stimuler le système immunitaire contre les cellules tumorales soit par réinjection de cellules immunitaires anti-tumeur, ou de gènes codant pour des protéines stimulant la réponse immunitaire, ou encore en vaccinant directement contre des antigènes identifiés comme spécifiques de la tumeur du type des MAGE. Ces techniques semblent avoir échoué car aucun succès clinique n'a été enregistré indiquant une prolongation importante de la survie des patients ou leur guérison totale. Les cancers sont des proliférations de cellules qui peuvent ensuite essaimer dans l'organisme pour former des métastases. Il est connu que le système immunitaire d'un individu normal élimine régulièrement les cellules cancéreuses naissantes (système de surveillance), et que la formation d'un cancer résulte d'une faillite du système de surveillance. La plupart des agents anticancéreux (chimiothérapie, radiothérapie) utilisés à ce jour luttent contre la réplication des cellules cancéreuses. Il est à noter que De Bruijn et al., dans Cancer Res. (1998) 58, pages 724-731 ont décrit l'utilisation de protéines E6 et E7 natives pour induire une réponse cellulaire cytotoxique (CTL) chez des souris pour les protéger contre l'implantation de cellules tumorales. Or la demanderesse a découvert avec étonnement, après de longues recherches, que des facteurs immunosuppressifs à action locale sont induits par les tumeurs et empêchent le système immunitaire d'agir efficacement, même si on le stimule. Ce phénomène d'échappement aux défenses immunitaires cellulaires de l'hôte par induction de leur paralysie in situ est une stratégie utilisée par de nombreux cancers et est nécessaire à leur survie. Initialement cette immunosuppression reste localisée au niveau de la tumeur, puisque l'individu est encore capable de se défendre contre les autres agressions telles que des infections. Cependant à un stade plus tardif, cette immunosuppression peut s'étendre, se généraliser, ainsi que l'attestent la dissémination de métastases et la grande vulnérabilité du cancéreux face aux infections ceci en dehors même des effets débilitants dus à la chimiothérapie ou radiothérapie. En résumé, cet échappement au contrôle du système immunitaire est dû à une paralysie du système immunitaire (immunosuppression), qui l'empêche de fonctionner normalement. Cette immunosuppression met en jeu des facteurs paralysants, qui sont produits par les cellules cancéreuses ou leur environnement. La paralysie locale des cellules du système immunitaire ou immunosuppression représente donc une arme majeure des cellules cancéreuses qui leur permet d'échapper au système immunitaire de l'hôte. Ainsi, des protéines relâchées par les cellules infectées agissent comme de véritables toxines sur les cellules immunitaires alentour, les dérèglent et bloquent in situ (de manière paracrine) les cellules du système immunitaire, protégeant les cellules infectées. En particulier, la demanderesse a découvert, après de longues recherches, dans le cas de l'ATL, du cancer du col utérin, et du sarcome de Kaposi, 3 protéines impliquées dans une immunosuppression locale au niveau de la tumeur: il s'agit de la protéine Tax de HTLV 1, de la protéine E7 du papilloma virus, et de la protéine Tat du VIH-1 dans le sarcome de Kaposi. Dans ce dernier cas, il existerait aussi une protéine du HHV8 immunosuppressive, qui expliquerait que le sarcome de Kaposi survient aussi chez des sujets non infectés par le VIH-1. Tat a été impliquée dans le sarcome de Kaposi, mais sans que les chercheurs n'identifient son rôle générateur d'immunosuppression locale qui favorise la génération de sarcomes de Kaposi. C'est pourquoi la présente demande a pour objet l'utilisation - d'une protéine modifiée caractérisée en ce que cette protéine est une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse ou un fragment de cette protéine et en ce que ses propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, notamment au moins 95 %, par un traitement chimique, ou - d'un anticorps contre une protéine immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse, pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation en tant qu'agent anti- immunosuppression locale. Etant donné que des cancers peuvent proliférer grâce à l'immunosuppression locale évoquée ci-dessus, les produits cidessus trouvent en partie leur emploi pour l'obtention d'un médicament destiné à son utilisation en tant qu'anticancéreux. Ces protéines modifiées sont des produits nouveaux. C'est pourquoi la présente demande a aussi pour objet des protéines modifiées caractérisées en ce qu'elles sont des protéines initialement immunosuppressives à action locale induites par les tumeurs cancéreuses ou des fragments de ces protéines et en ce que leurs propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 90 %, de préférence au moins %, notamment au moins 99 %, par un traitement chimique, à l'exception de Tat de VIH1; en effet, de tels dérivés du Tat sont décrits dans WO-A-96/27389 comme utilisables dans la lutte contre le SIDA. Mais ils ont aussi, selon les recherches de la demanderesse, des propriétés immunosuppressives locales induites par certaines tumeurs cancéreuses. Les protéines modifiées de la présente invention, parfois appelées ciaprès " protéines inactivées " ou " toxoïdes ", permettent de lutter contre les cancers par une approche complémentaire de celles de l'art antérieur et spécifique, visant la paralysie du système immunitaire induite par les substances immunosuppressives produites localement dans l'environnement des cellules cancéreuses et qui constituent une véritable barrière protectrice autour de la tumeur. Les protéines modifiées de la présente invention permettent de lutter en premier lieu contre ces facteurs immunosuppressifs par formation d'anticorps contre ces facteurs immunosuppressifs, pour permettre ensuite au système immunitaire d'agir efficacement. Il est important d'utiliser la molécule paralysante modifiée (inactivée) et non native (ou naturelle) afin qu'elle n'exerce plus d'effet immunosuppresseur sensible susceptible de bloquer le système immunitaire. Le traitement chimique peut être effectué à l'aide d'un agent de couplage tel qu'un aldéhyde, ou d'une protéine porteuse activée par un pré- traitement à l'aide d'un aldéhyde, de préférence le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde. On peut à cet égard se reporter à l'enseignement de WO-A- 96/27389. Le traitement chimique peut se faire notamment par carboxyméthylation. Un exemple de technique de carboxyméthylation est illustré ci-après dans la partie expérimentale. Le traitement chimique ci-dessus peut être complété par un traitement physique comme par exemple une irradiation et tout particulièrement une irradiation U.V., dans le but de diminuer l'effet immunosuppresseur résiduel des protéines modifiées immunogènes selon l'invention. Les protéines modifiées ci-dessus peuvent par exemple être préparées à partir d'une protéine ayant une séquence identique ou similaire à une séquence peptidique d'une protéine immunosuppressive, telle que la protéine Tat du VIH-1, la protéine E7 du papilloma virus ou la protéine Tax de HTLV1 ou d'un fragment de ces protéines et être obtenues par exemple par synthèse peptidique conventionnelle sur résine ou par génie génétique. Tous ces procédés sont bien connus de l'état de la technique. Afin de vérifier que la protéine immunosuppressive native est bien reconnue par des anticorps dirigés contre ladite protéine immunosuppressive modifiée ou son fragment modifié selon l'invention, on peut par exemple vérifier immunologiquement par Elisa en présence d'anticorps spécifiques, la formation de complexes antigènes-anticorps comme on le verra ci-après dans la partie expérimentale. Afin de déterminer si les propriétés immunogènes de la protéine immunosuppressive modifiée ou fragment ont été suffisamment conservées (c'est à dire si il ou elle a été inactivé(e) mais pas dénaturé) pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native, on peut par exemple immuniser des mammifères (lapins, rats, souris) à l'aide d'un composé immunogène selon l'invention et vérifier que les anticorps produits neutralisent les activités immunosuppressives de la protéine immunosuppressive, comme on le verra pour la protéine Tat du VIH-1, la protéine E7 du papilloma virus et la protéine Tax de HTLV1 dans la partie expérimentale. Afin de déterminer si la protéine immunosuppressive modifiée ou fragment a perdu au moins 80% de ses propriétés immunosuppressives, on peut par exemple étudier l'effet de la protéine immunosuppressive sur l'immunosuppression des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). La protéine immunosuppressive modifiée et immunogène peut dériver d'une quelconque des protéines immunosuppressives à action locale induites par les tumeurs; on retient particulièrement la protéine Tat du VIH-1, la protéine E7 du papilloma virus ou la protéine Tax de HTLV1. Par " dérivent " ou " dériver " d'une protéine immunosuppressive à action locale induite par les tumeurs, I'on entend que le composé immunogène peut être constitué de la totalité ou d'un fragment de la protéine immunosuppressive et peut comporter une ou plusieurs modifications dans les acides aminés de cette protéine ou fragment telles que des délétions, substitutions, additions, ou fonctionnalisations telles qu'acylation d'acides aminés, dans la mesure o ces modifications restent dans le cadre précisé ci- dessus (absence de toxicité, caractères immunologiques). Par exemple, en général le remplacement d'un résidu leucine par un résidu isoleucine ne modifie pas de telles propriétés; les modifications doivent généralement concerner moins de 30% d'acides aminés, de préférence moins de 20% et tout particulièrement moins de 10% de la protéine immunosuppressive. Il est important que la protéine ou fragment modifié ne soit pas dénaturé comme on peut le faire par exemple par un traitement physique comme la chaleur afin de préserver ses sites conformationnels pour que les anticorps induits par les dérivés modifiés soient actifs vis à vis de la protéine native. Dans des conditions préférentielles, les composés immunogènes de l'invention comportent au moins 50% de la totalité de la protéine immunosuppressive, de préférence au moins 70%, particulièrement au moins %, et tout particulièrement la totalité ou quasi-totalité de ladite protéine immunosuppressive. De manière générale, en ce qui concerne les modifications, I'homologie ou la similitude entre l'immunogène modifié et la protéine ou partie de protéine immunosuppressive native, ainsi que les dimensions du composé immunogène, de même que les modalités d'utilisation, ou de couplage du composé immunogène selon l'invention à une protéine immunogène telle que le toxoïde tétanique, on peut en particulier se référer à WO-A-86/06 414 ou à EP-A-0.220.273 ou encore à PCT/US.86/00831, équivalents, dont l'enseignement est incorporé ici par référence. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés immunogènes tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce que l'on soumet ladite protéine native initialement immunosuppressive ou ledit fragment à l'action d'un aldéhyde ou à une carboxyméthylation, pour obtenir le composé attendu que l'on isole. La réaction de carboxyméthylation permet de modifier les groupements thiols (groupements sulfhydryl) présents au niveau des résidus cystéines de l'enchaînement en acides aminés. Ces groupements réagissent avec l'acide iodoacétique ou l'iodoacétamide par une réaction de S-carboxyméthylation ou S-carboxyamidométhylation, respectivement. Par exemple, la protéine Tat possède 7 cystéines. Ces cystéines participent à la formation de ponts disulfure inter et intra-chaînes et contribuent à la formation d'oligomères. Le produit de la réaction est dans chaque cas un résidu Scarboxyméthylcystéinyl ou S-carboxyméthylamidocystéinyl. Un fragment peut comporter de 8 à 110 acides aminés par exemple, de préférence de 12 à 60 acides aminés et notamment de 12 à 40 acides aminés. Un tel fragment peut comporter aussi du ou des côtés C ou N terminal de 1 à 5 acides aminés supplémentaires c'est-à-dire différents du segment d'origine. Un fragment doit en outre comporter une cystéine au moins pour pouvoir faire l'objet de la carboxyméthylation. La réaction de carboxyméthylation peut aussi être réalisée avec d'autres agents chimiques comme l'acide performique, I'acide 3- bromopropionique, l'éthylénéimine, le bromure de (2-bromoéthyl) triméthylammonium, le 2-bromoéthane sulfonate, la 1,3-propanesulfone etc. ...DTD: Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci- dessus décrit, ladite protéine ou ledit fragment de départ se présente sous forme fusionnée à un marqueur (FP) lorsqu'on le soumet à la carboxyméthylation. Les protéines ou fragments de départ du procédé sont des produits connus, décrits dans la littérature, par exemple pour Tat de VIH-1 par Frankel A.D. et al. (Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus, Cell, 1988, 55: 1189- 93), pour le Tat par Tanaka et al. Int. J. Cancer, 1991, vol 48, pages 623-630, pour le E7 par Speidel et al, Eur. J. Immunol., 1997, 27, pages 2391-2399 ou même commerciaux (Immunodiagnostics Inc., Cat # 1002-2) ou peuvent être préparés de manière conventionnelle. On peut en particulier préparer les protéines ou fragments de départ cidessus par: 1) Synthèse par génie génétique ou par synthèse biochimique; 2) Purification Par génie génétique, on peut purifier les protéines produites par chromatographie d'affinité en utilisant par exemple des anticorps dirigés contre la protéine ou un de ses fragments; on peut aussi synthétiser la protéine fusionnée à un marqueur (FP) qui servira à l'accrochage à une colonne d'affinité. Dans d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit, lorsque la protéine ou fragment est fusionné à un marqueur (FP), il est soumis à: une concentration, par exemple, par ultrafiltration; - un désalage, par exemple, par gel filtration; - un traitement au bromure de cyanogène ou l'entérokinase pour cliver la protéine de fusion et libérer ainsi la protéine ou fragment; - une concentration et diafiltration; - une chromatographie par échange cationique; - une concentration par ultrafiltration, suivie par une filtration sur gel d'exclusion. La réaction au bromure de cyanogène ci-dessus permet de cliver les thioéthers. L'action du bromure de cyanogène sur les molécules polypeptidiques est sélective en effectuant un clivage au niveau des résidus méthionine existants. Cette réaction aboutit à la formation de 2 fragments polypeptides par résidu méthionine. Cette réaction peut être avantageusement couplée avec la réaction de carboxyméthylation précédemment décrite mais elle n'est pas nécessaire à l'inactivation. Dans d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit, on prépare la protéine ou le fragment attendu(e) couplé(e) à un composé permettant sa purification, par exemple à un fragment peptidique contenant plusieurs histidines, de préférence en séquence continue de 4, 5, notamment 6 histidines ou plus permettant la fixation à une colonne de Nickel. Dans la mesure o la présence de ce composé n'induit pas de toxicité et ne modifie pas défavorablement l'immunogénicité de la protéine ou de fragment, il n'est pas nécessaire de le cliver après purification. Toutefois, dans des conditions de réalisation préférée, on clive ce composé pour l'éliminer. Les protéines modifiées qui sont des protéines initialement immunosuppressives à action locale induites par les tumeurs cancéreuses et fragments et dont les propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 80 % par un traitement chimique, objet de la présente invention, possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques. Elles sont douées notamment de remarquables propriétés antagonistes des propriétés immunosuppressives des protéines immunosuppressives à action locale induites par une tumeur cancéreuse. Ces propriétés sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des protéines modifiées ci-dessus décrites à titre de médicament. C'est pourquoi l'invention a encore pour objet des médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués des composés immunogènes tels que définis ci-dessus, c'est à dire des composés immunogènes tels que définis ci- dessus pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal, ainsi que l'utilisation d'un tel composé immunogène pour la préparation d'un médicament curatif ou préventif destiné au traitement ou à la prévention des effets immunosuppressifs des protéines immunosuppressives ci-dessus, et notamment de la protéine Tat du VIH-1, la protéine E7 du papilloma virus et la protéine Tax de HTLV1. En effet, les composés selon l'invention ont perdu leurs propriétés immunosuppressives et peuvent donc être administrés chez l'homme comme on le verra ci-après dans la partie expérimentale. Les médicaments selon la présente invention trouvent leur emploi par exemple dans le traitement tant curatif que préventif de l'immunosuppression induite par les cancers, notamment des cancers induits par des virus comme, par exemple, I'ATL (Acute T cell leukemia) causé par le HTLV 1, ou le cancer du col utérin causé par le papilloma virus, ou encore le lymphome de Burkitt ou le sarcome de Kaposi causés par des virus de la famille herpès, respectivement l'Epstein-Barr (EBV) et le HHV8. Les composés immunogènes selon l'invention peuvent être utilisés comme suit: On administre à un patient un composé immunogène selon la présente invention, par exemple par voie sous-cutanée ou intramusculaire, en quantité suffisante pour être efficace sur le plan thérapeutique, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. La dose administrée peut aller par exemple de 10 à 1000 pg par voie sous-cutanée, une fois par mois pendant trois mois, puis périodiquement en fonction du taux des anticorps sériques induits, par exemple tous les 2-6 mois. L'invention a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques qui renferment au moins un composé immunogène précité, à titre de principe actif. A titre de médicaments, les composés immunogènes de l'invention peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées à n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie orale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet une composition pharmaceutique, curative ou préventive, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé immunogène nouveau tel que défini ci-dessus, c'est-à-dire à l'exception de la protéine Tat du VIH-1, ou ses fragments. Le composé immunogène peut être conditionné seul ou mélangé à un excipient ou mélange d'excipients pharmaceutiquement acceptables tel qu'un adjuvant. La présente demande a plus particulièrement pour objet un vaccin contenant à titre d'immunogène, une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse ou un fragment de cette protéine dont les propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 80 % par un traitement chimique. La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation d'une composition ci-dessus décrite, caractérisé en ce que l'on mélange, selon des méthodes connues en elles mêmes, le ou les principes actifs avec des excipients acceptables, notamment pharmaceutiquement acceptables. L'administration à un patient de composés immunogènes selon l'invention correspond à une immunothérapie active. Il peut être intéressant également de procéder à une immunothérapie passive, c'est à dire de fournir à un patient directement des anticorps dont il a besoin pour neutraliser les effets nocifs des protéines immunosuppressives à action locale induites par des tumeurs. Ces anticorps anti-protéines immunosuppressives peuvent être obtenus classiquement et à titre d'exemple après immunisation d'un mammifère, homme ou animal, à l'aide d'un composé immunogène tel que défini cidessus, par clonage de lymphocytes B humains transformés par le virus Epstein-Barr puis récupération des anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés, ou encore par recombinaison génétique à partir d'une librairie de phages. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet de tels procédés de préparation d'anticorps anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse et en particulier d'anticorps anti-protéine E7 du papilloma virus ou anti-protéine Tax de HTLV1, et notamment un procédé de préparation d'un anticorps ci-dessus caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère à l'aide d'un composé immunogène tel que défini ci-dessus, puis récupère les anticorps formés. La présente demande a encore pour objet un anticorps anti- protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse et en particulier des anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à partir de sujets humains ou de mammifères immunisés avec une protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse biologiquement inactivée mais immunogène, notamment la protéine E7 du papilloma virus ou la protéine Tax de HTLV1, ou leurs fragments. Ces anticorps administrés passivement, qu'ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou Fab de l'anticorps. Par " anticorps anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse", l'on entend des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments F(ab')2 ou Fab de ces anticorps ou encore des anticorps anti- protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse obtenus par construction génétique à partir d'une librairie de phages. Les anticorps xénogéniques proviennent d'animaux hyperimmunisés avec un composé immunogène selon l'invention, notamment avec la protéine E7 du papilloma virus ou la protéine Tax de HTLV1 ou ses dérivés (fragments peptidiques de la protéine E7 du papilloma virus ou de la protéine Tax de HTLV1 détoxifiés selon l'invention), et sont - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux, obtenus après hybridation selon la technique que Kohler et Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée myélomateuse, type x63, notamment x63AG3. Dans ce cas on préfère les anticorps équins ou de lapin. La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse, caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère, homme ou animal, avec un composé immunogène tel que défini ci-dessus. La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse, caractérisé en ce que l'on utilise des cellules B provenant d'individus immunisés par un composé immunogène selon la présente invention, lesdites cellules B étant transformées par le virus EBV et produisant des anticorps spécifiques anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse. Les cellules EBV + ci-dessus peuvent être cultivées de manière à produire les anticorps attendus. Ces cellules, comme on l'a vu, proviennent notamment de malades immunisés par une protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse native, ou par un composé immunogène selon l'invention. La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps selon l'invention monoclonaux, dirigés contre une protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse, effectivement immunosuppressive ou non, caractérisé en ce que l'on prépare des hybridomes de mammifère, notamment de souris à partir de splénocytes ou adénocytes notamment de souris immunisées par une protéine immunosuppressive native ou un composé immunogène selon l'invention, et de cellules de myélome, de préférence de lignée x63, selon les procédés bien connus de l'état de la technique (Kohler et Milstein). La présente demande a également pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse, par la technologie de recombinaison génétique, caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci- dessus. La présente demande a encore pour objet des fragments F(ab')2 ou Fab desdits anticorps; ceux-ci peuvent être obtenus par digestion enzymatique par exemple. La présente invention a tout autant pour objet un procédé d'immunisation passive de sujets cancéreux, utilisant des anticorps spécifiques antiprotéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse et spécialement antiprotéine E7 du papilloma virus ou anti-protéine Tax de HTLV1 neutralisant ou bloquant les effets nocifs de cette protéine et pouvant être préparés comme indiqué ci-dessus, ou des fragments F(ab')2 ou F(ab) de ces anticorps. La présente demande a également pour objet un procédé d'immunisation active caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus avantageusement associé à un adjuvant d'immunité minéral, huileux ou de synthèse, ou encore un composé immunogène tel que défini ci-dessus, avantageusement couplé ou associé à une protéine augmentant son immunogénicité. Ces immunisations peuvent être réalisées tant à titre curatif qu'à titre préventif. A titre d'immunogène pour tous les procédés ci-dessus et ci- apres, on utilise de préférence un dérivé de la protéine E7 du papilloma virus ou de la protéine Tax de HTLV1. L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif curatif ou préventif, au moins un anticorps anti-protéine immunosuppressive d'une tumeur cancéreuse tel que défini ci- dessus ou obtenu selon les procédés ci-dessus. L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un composé immunogène ou d'un anticorps ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des effets immunosuppressifs locaux d'une protéine à action immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse. En résumé et notamment, la présente invention a pour objet I'usage à titre préventif, ou curatif chez le sujet cancéreux d'anticorps spécifiques de manière à bloquer l'action immunosuppressive d'une protéine à action immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse et notamment de la protéine Tat du VIH-1, de la protéine E7 du papilloma virus ou de la protéine Tax de HTLV1. Ces anticorps spécifiques pourront provenir: 1. du sujet lui-même, induits par une immunisation active (vaccination) avec une protéine immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse privée desdits effets immunosuppressifs mais immunogène ( on a préservé les propriétés susceptibles d'induire la formation des anticorps, lorsque la protéine est présentée et préparée de manière appropriée, couplée ou non à un "carrier", agrégée ou non, en présence ou non d'adjuvant) ou 2. d'un organisme étranger, allo- ou xénogénique, administré au sujet par immunisation passive (sérothérapie). Ces anticorps administrés passivement, pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou Fab de l'anticorps. L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques. a) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif une protéine initialement immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse mais privée desdits effets immunosuppressifs et immunogène selon l'invention. b) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif des anticorps anti-protéine à action immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse produits à partir d'organismes immunisés contre ladite protéine ou ses fragments F(ab')2 ou Fab, selon l'invention. En outre l'invention propose également un kit comprenant une composition pharmaceutique vaccinale qui en plus du principe actif (protéine initialement immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse mais privée desdits effets immunosuppressifs et immunogène ou ses dérivés ou anticorps anti-protéine immunosuppressive locale d'une tumeur cancéreuse) peut comprendre un adjuvant et/ou un autre immunogène à propriétés anticancéreuses. Enfin l'invention propose une composition pharmaceutique sous une forme galénique conventionnelle. En particulier on associe le principe actif selon l'invention en quantité suffisante pour être efficace d'un point de vue thérapeutique avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Pour diminuer la charge immunosuppressive produite par la tumeur et améliorer encore mieux la réponse immunitaire, on pourra associer à cette immunisation anti-suppressive des moyens plus classiques visant à diminuer la taille de la tumeur comme la chimiothérapie, la radiothérapie, I'exérèse chirurgicale ou encore l'adjonction de gènes suppresseurs des tumeurs apportés par des techniques de la thérapie génique (ADN véhiculés par des vecteurs viraux, vecteurs lipidiques etc.. ) ou encore comme l'immunisation active contre des protéines sans action immunosuppressive locale comme les MAGE ou des protéines de structure comme celles du papilloma virus. On pourra aussi associer d'autres immunisations anti- suppressives par exemple en immunisant contre des cytokines susceptibles de médier l'action suppressive sur les cellules immunitaires ou associer des immunisations contre des antigènes tumoraux classiques (non immunosuppressifs). L'avantage de ces associations est qu'elles permettront au système immunitaire de mieux répondre à l'immunisation anti- immunosuppressive et par conséquent de mieux se reconstituer. Pour résumer, à l'immunisation contre un facteur immunosuppressif paracrine présenté sous forme inactivée immunogène on pourra associer des méthodes plus classiques comme radiothérapie, chimiothérapie exérèse chirurgicale ou traitement par gènes suppresseurs ou encore des immunisations contre les cytokines médiant I'action immunosuppressive des cellules immunitaires ou contre des antigènes tumoraux. Les exemples qui suivent illustrent la présente demande Exemple 1. Fabrication de Protéine Tat inactivée par traitement chimique. Préparation On cultive 2 ml de la bactérie déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de Paris le 26 Décembre 1997 sous le N I 1964 qui est une bactérie E coli dans laquelle on a inséré par transfection un plasmide recombinant contenant un gène codant pour un polypeptide comportant un fragment constitué de 6 histidines, associé au gène de la protéine Tat, dans 400 ml d'un milieu de culture de base (extrait de levure 5g/l, tryptone lg/l, chlorure de sodium 1g/Il) et 40 ml d'une solution 1 (CaCI22H2O: 0,175 g/l, MgSO47H2O: 5,9 g/l, glucose: 6 g/Il). On incube ainsi la culture à C pendant 10 heures à 250 tr/mn. La préfermentation ci-dessus est suivie d'une fermentation dans des conditions analogues, en maintenant le niveau d'oxygène dissous à un niveau de 70 % de la saturation par régulation de l'agitation. Lorsque la densité optique mesurée à 650 nm atteint la valeur de 6, on ajoute 100 ml d'une solution stérile à 3,75 % d'IPTG (isopropyle,-dthiogalactopiranoside) dans de I'eau désionisée. En même temps, on supplémente le milieu avec une solution stérile d'extrait de levure à 25 %. On ajoute alors une solution comprenant MgSO47H2O: 8,5 g/l, glucose: 300 g/il, (NH4)2SO4: 106 g/I, oligo-éléments, en maintenant la concentration de glucose au delà de 2 g/I. On récolte alors la masse bactérienne 4 heures après l'introduction de l'IPTG. On procède à une diafiltration contre un tampon tris 0,1 M, NaH2PO4 0,1 M, ditriothéitol 1 Mm, pH 8,0, par filtration à contre-courant (seuil 0,3 pm). Trois litres du produit brut ci-dessus sont lysés par 4 passages à une surpression de 500 bars. Le lysat est alors centrifugé pendant 15 mn à 4 C et 5000 tr/mn. On ajoute alors au surnageant une quantité suffisante d'urée pour obtenir une solution 8 M et on ajuste le pH à 8. On procède alors à une purification par chromatographie d'affinité sur une colonne nickel-NTA agarose (Qiagen) préalablement équilibrée avec 600 ml de tampon A (urée 8M, NaH2PO4 0,1 M, tris-HCI 0,1 M, DTT 1 Mm, pH 8,0). Une fois chargée, la colonne a été lavée avec 250 ml de tampon A. On élue alors la protéine en utilisant un gradient discontinu pour obtenir la protéine fusionnée attendue. On concentre la solution ainsi obtenue sur membrane Amicon à seuil de coupure de 3000 daltons pour obtenir une concentration finale de mg/ml. On obtient ainsi un éluat brut renfermant la protéine recombinante fusionnée de VIH-1 Tat attendue. On a produit ainsi une protéine de fusion Tat fusionnée génétiquement avec un fragment peptidique riche en histidines qui permet son accrochage au nickel en vue d'une purification. L'éluat ainsi obtenu sera soumis à la réaction de carboxyméthylation. Préparation du toxoïde Tat Stade A: Carboxyméthylation On ajuste une solution de la protéine Tat fusionnée à un fragment peptidique riche en histidine préparée à la préparation 1 ci- dessus pour obtenir les concentrations suivantes: Urée 8M, Tris HCI 0, 3M, Ditriothéitol, 10 mM, pH 8,4. Sous atmosphère inerte, on ajoute 2,6 g d'acide iodoacétique à ml de la solution ci-dessus. Cette solution est incubée à 37 C à l'abri de la lumière et sous atmosphère inerte pendant 90 mn. La réaction est bloquée par addition de 1 ml de P- mercaptoéthanol à 98% et l'incubation est poursuivie pendant 60 minutes dans les mêmes conditions que ci-dessus. La solution résultant de l'étape précédente est concentrée à l'aide d'un concentrateur Amicon (Cat#8400) sur membrane YM3 (seuil de 3000 D) jusqu'à une concentration de 10 mg/ml. On la désale alors par passage dans une colonne Cellufine GH25 (MATREX) équilibrée à l'aide de 300 ml d'une solution d'urée 4M, 0,1M HCI. Stade B-Purifications L'éluat est alors ultrafiltré et traité au bromure de cyanogène pour cliver au niveau de la méthionine la partie amino terminale du produit carboxyméthylé. Du bromure de cyanogène est ajouté en excès sous atmosphère inerte, dans la proportion d'environ 50 moles de bromure de cyanogène par mole de méthionine. Cette solution est conservée dans un récipient clos pendant 24h à 37 C. L'excès de bromure de cyanogène est chassé par évaporation sous pression réduite. La solution obtenue est alors concentrée, diafiltrée contre du tampon acide acétique-acétate de sodium 0,05M, pH 5 en utilisant un diafiltreur Amicon muni d'une membrane YM3 (seuil 3000 KD). La quantité de produit inactif obtenu en solution est de l'ordre de 450 mg. Cette solution est filtrée sur une colonne échangeuse d'ions SP- Sépharose FF préalablement équilibrée avec 200 ml de tampon A et le produit est élué par un gradient de NaCI. L'éluat est à nouveau concentré par diafiltration dans le même système Amicon, et la fraction obtenue est purifiée par gel filtration sur colonne de Sephacryl S (Pharmacia) équilibrée avec du tampon phosphate pH 7,4. Le produit final est filtré sur membrane à 0,22 pm et stocké à 4 jusqu'à utilisation. Ce produit a été soumis aux analyses ci-dessous, et a fait l'objet des tests pharmacologiques. Analyses. - Quantité totale de produit inactivé dosée par le test de Bradford: 150 mg. - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SulfoDodécylSulfate-PAGE, coloration argent (Phast System, Pharmacia, gel homogène à 20%): bande unique avec un poids moléculaire compatible avec celui attendu. Pas d'autres bandes détectables à des poids supérieurs ou inférieurs. - Electrophorèse par gradient isoélectrique (Phast System, Pharmacia, GEL IEF 3-9): une seule bande visible. - Western Blot (Phast System, Pharmacia, anticorps monoclonal de l'hybridome 5G 1): une seule bande observée et absence de matériel agrégé ou dégradé. - Activité biologique (induction du gène CAT dans la lignée HELA-HIV-1LTR CAT): aucune activité détectable. - Séquençage de la partie N-terminale en utilisant la technique standard de séquençage d'Edman avec un séquenceur Applied Biosystems (model 477A): les 20 premiers acides aminés obtenus coïncident avec la séquence attendue E-P-V-D-P-R-L-E-P-W-K-H-P-G-S-Q-P-K-T-A - Endotoxines (test LAL selon le protocole USP XXIII): moins de 0,5 unités endotoxique par mg de protéine. - Stérilité (selon le protocole USP XXIII): répond aux normes. - Mesure du degré de substitution: en utilisant le réactif d'Ellman pour déterminer les groupements sulfhydriles libres par comparaison avec une courbe standard mesurant les cystéines. Comparant le Tat natif au Tat carboxyméthylé, on a trouvé que seulement 0,03 % des cystéines restaient actives dans le Tat carboxyméthylé, soit 1 cystéine active pour 3330 cystéines inactives. Un simple calcul montre que pour avoir une molécule Tat avec 7 cystéines actives dans ces conditions, il faudrait plusieurs kg de protéine Tat. L'inactivation est donc quasi-totale. Cette méthode conduit à la production de Tat non- immunosuppresseur, appelé Tat-toxoïde, comme on le verra ci-après. Exemple 2. Fabrication de Protéine E7 inactivée par traitement chimique. Des essais utilisant le glutaraldéhyde ont permis de produire une protéine E7 inactivée dans les tests d'immunosuppression. Le traitement par le glutaraldéhyde s'effectue de la façon suivante:. une solution d'E7 à 1 mg/ml en phosphate disodique 70 mM à pH 8,2 est additionnée de glutaraldéhyde à concentration finale 0,026M ou 0,0026M. On laisse la réaction s'accomplir durant des temps variables allant de 1 mn à 3 heures à la température ambiante. A la fin de chaque temps de réaction, la réaction est bloquée par addition de glycine à concentration finale 100 mM. Les différents prélèvements sont dialysés pendant 16h, à 4 C, contre 100 fois leur volume de PBS. La dialyse est répétée 2 fois. On constate dans tous les cas que dès après 1 heure de traitement par le glutaraldéhyde, I'effet immunosuppressif d'E7 a disparu ainsi que mesuré dans le test d'immunosuppression. Il convient d'optimiser les conditions de la réaction afin de préserver au maximum I'immunogénicité de la protéine: ceci se fait en testant les préparations selon la méthode utilisée dans l'expérimentation 3. Des essais ont aussi été réalisés avec le formaldéhyde. à la concentration finale de 33 mM, et l'inactivation est testée de 1 heure à plusieurs jours. La réaction est bloquée par addition de glycine, avant d'être dialysée de façon répétée contre du PBS. Les protéines inactivées obtenues, ou E7-toxoïdes, sont soumises au test d'immunosuppression. Exemple 3. Fabrication de protéine Tax inactivée par traitement chimique. La protéine Tax a été produite par génie génétique et obtenue à la concentration de 1 mg/ml. L'application du même protocole d'inactivation, utilisant la carboxyméthylation, a conduit à l'obtention d'un produit dérivé Tax- toxoïde inactif dans le test d'immunosuppression. Exemple 4 On a préparé une composition injectable répondant à la formule composé de l'exemple 1 50 pg excipient q.s. pour une ampoule terminée à 0,5 ml (détail de l'excipient: adjuvant ISA 51 (Seppic)) Exemple 5 On a préparé une composition injectable répondant à la formule composé de l'exemple 2. 100 pg excipient q.s. pour une ampoule terminée à 1 ml (détail de l'excipient: adjuvant ISA 51 (Seppic)) Etude pharmacologique Experimentation 1. Test d'immunosuppression. On a obtenu de la protéine Tat purifiée à la concentration de I mg/ml comme préparé par Frankel A.D. et al. (Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus, Cell, 1988, 55: 1189-93). On prend des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) d'un sujet sain purifiées par Ficoll que l'on met en culture à 1 millions de cellules par ml dans des micropuits en présence d'antigènes de rappel PPD (Mérieux, dilution au 1/1000) dans du RPMI, sérum SAB 10%. On ajoute de la protéine Tat à dose décroissante: 10 mg/ml, 3 mg/ml, 1 mg/ml etc. Pour obtenir des résultats plus marqués, il est parfois nécessaire de préincuber les cellules 2h dans le RPMI avec la protéine Tat avant de rajouter le sérum, ceci parce que la protéine peut parfois se lier à des composants du sérum et ainsi..DTD: inactiver sa capacité d'agir sur les cellules. On ajoute de l'IL2 après 48h. Enfin après 5 jours, on mesure dans les puits la prolifération cellulaire par le test d'incorporation de thymidine tritiée. Les résultats sont les suivants: Prolifération des PBMCs (coups par minute) Sans addition de Tat 28 000 Tat (10 pg/ml) 8 000 Tat (3 pg/ml) 13 000 Tat (1 pg/ml) 21 000 Tat (0,3 pg/ml) 26 000 Cas de la protéine E7 du papilloma virus. On a réalisé la même expérience qu'avec Tat avec de la protéine E7 du papilloma virus purifiée obtenue de Speidel et al, Eur. J. Immunol., 1997, 27, pages 2391-2399. Les résultats ont été similaires: Prolifération des PBMCs (coups par minutes) Sans addition de CE7 29 000 E7 (10pg/ml) 6 000 E7 (3 pg/ml) 10 000 E7 (1 pg/ml) 11 000 E7 (0,3 pg/ml) 16 000 Cas de la protéine Tax de HTLV-1. On a aussi réalisé la même expérience qu'avec Tat avec de la protéine Tax de HTLV-1 purifiée obtenue de Tanaka et al. Int. J. Cancer, 1991, vol 48, pages 623-630 Les résultats ont été similaires: Prolifération des PBMCs (coups par minutes) Sans addition de Tax 25 000 Tax (10 pg/ml) 7 000 Tax (3 pg/ml) 15 000 Tax (1 pg/ml) 21 000 Tax (0,3 pg/ml) 26 000 Ces résultats montrent que les protéines natives ci-dessus sont capables d'induire une immunosuppression dose-dépendante et ont la capacité de démobiliser le système immunitaire. Expérimentation 2. Absence d'activité suppressive des toxoïdes dans le test d'immunosuppression. On a testé dans les mêmes conditions que celles décrites dans I'expérimentation 1, les protéines modifiées par traitement chimique des exemples 1, 2 et 3. On n'a pas pu mettre en évidence d'effet immunosuppressif pour ces produits: Prolifération des PBMCs (% par rapport au contrôle) Contrôle 100 Tat Inactivé(10pg/ml) 95 Tat natif (10pg/ml) 20 E7 Inactivée 105 E7 natif 25 Tax Inactivé 100 Tax natif 25 Expérimentation 3. Immunogénicité des protéines des exemples 1, 2 et 3 Des toxoïdes préparés selon les exemples 1, 2 et 3 ont été utilisés pour immuniser des souris. Le protocole d'immunisation est celui classiquement utilisé: les souris sont injectées (en im) avec 100 pI d'émulsion (1:1) en adjuvant complet de Freund contenant 20 pg de produit aux jour 0 avec rappel en adjuvant incomplet de Freund de 5 pg aux jours 21 et 35. Le sérum des souris est prélevé aux jours -2 et 40 et analysé par ELISA sur des plaques sensibilisées avec la protéine native correspondante (non traitée chimiquement) et avec les toxoïdes préparés aux exemples 1, 2 et 3. Les sérums ont été testés à une dilution au 1/500. Les résultats obtenus ont été comparables pour les 3 produits testés ici, Tat-toxoïde, Tax-toxoïde et E7-toxoïde. Ces résultats, exprimés en densité optique, obtenus sur 3 souris immunisées (1 à 3) et 3 souris non immunisées (4 à 6), sont rapportés dans le tableau suivant: Protéine native Protéine Inactivée Souris 1 J-2 0,2 0,2 J40 2,1 2,1 Souris 2 J-2 0,15 0,2 J40 2,2 2,2 Souris 3 J-2 0,2 0,1 J40 1,9 2,1 Souris 4 J-2 0,15 0,15 J40 0,1 0,1 Souris 5 J-2 0,1 0,1 J50 0,1 0,15 Souris 6 J-2 0,2 0,2 J40 0,1 0,1 Ces résultats montrent que les souris immunisées par le toxoïde produisent des anticorps capables de reconnaître de la même façon la protéine native et le toxoïde. D'autre part cela confirme l'innocuité de l'immunisation par les toxoïdes car les souris ont très bien toléré l'immunisation. * Expérimentation 4. Immunisation chez l'homme par le produit de l'exemple 1. sujets séronégatifs ont subi une immunisation avec la protéine Tat inactivée immunogène de l'exemple 1 dans de l'adjuvant incomplet de Freund (Isa 51, Seppic) suivie d'un premier rappel environ 3 semaines après et d'un deuxième rappel environ 15 jours après. Une réponse immunitaire anti protéine Tat native a pu être objectivée par tests ELISA. La Figure 1 présente les réponses anti-Tat des 5 sujets immunisés, déterminées par ELISA sur plaques cotées par la protéine Tat native, après l'immunisation au Tat toxoïde chez les 5 sujets et les différents rappels. La figure 2 présente les titres obtenus après toutes les immunisations, et ceci comparé à 2 contrôles non immunisés. On voit donc que le toxoïde peut être utilisé chez l'homme et provoque une réponse immunitaire qui produit une réaction croisée avec la protéine Tat native. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une protéine modifiée caractérisée en ce que cette protéine est une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse ou un fragment de cette protéine et en ce que ses propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 80 %, par un traitement chimique, à l'aide d'un agent de couplage tel qu'un aldéhyde ou d'une protéine porteuse activée par un pré-traitement à l'aide d'un aldéhyde, lui permettant d'être reconnue par des anticorps dirigés contre ladite protéine modifiée, et de conserver des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ou bloquant ladite protéine native, pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation comme agent anti-immunosuppression locale en tant qu'anticancéreux. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé immunogène dérive d'une des protéines immunosuppressives suivantes: - la protéine Tat du virus VIH-1 - la protéine Tax d'un virus HTLV-1 - la protéine E7 du papilloma virus. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le composé immunogène est carboxyméthylé. 4. Un composé immunogène caractérisé en ce qu'il est une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par les tumeurs cancéreuses ou un fragment de cette protéine et en ce que ses propriétés immunosuppressives sont inactivées d'au moins 80 % par un traitement chimique, à l'exception de Tat de VIH1 ou d'un fragment de cette protéine. 5. Un composé immunogène tel que défini à la revendication 4 caractérisé en ce qu'il dérive d'une des protéines immunosuppressives suivantes: - la protéine Tax d'un virus HTLV-1 - la protéine E7 du papilloma virus. 6. Un composé immunogène tel que défini à la revendication 4 ou caractérisé en ce qu'il est carboxyméthylé. 7. Un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 4 à 6 pour son utilisation dans une méthode de traitement du corps humain ou animal. 8. Procédé de préparation d'un composé tel que défini à l'une des revendications 4 et 5 caractérisé en ce que l'on soumet une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse ou un fragment de cette protéine à un traitement chimique à l'aide d'un aldéhyde, sélectionne puis purifie le composé attendu. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le traitement chimique comprend un traitement à l'aide d'un aldéhyde suivi d'un couplage à une protéine porteuse. 10. Procédé de préparation d'un composé tel que défini à l'une des revendications 4 à 6 caractérisé en ce que l'on soumet une protéine initialement immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse ou un fragment de cette protéine à une carboxyméthylation, sélectionne puis purifie le composé attendu. 11. Procédé de préparation d'un anticorps anti-protéine immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse à I'exception de Tat de VIH1 caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère à l'aide d'un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 4 à 6. 12. Un anticorps anti-protéine immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse à l'exception de Tat de VIH1 obtenu par immunisation d'un mammifère à l'aide d'un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 4 à 6. 13. Un fragment F (ab')2 ou F(ab) d'un anticorps tel que défini à la revendication 12. 14. Utilisation d'un anticorps contre une protéine immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation comme agent anti- immunosuppression locale. 15. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps ou fragment tel que défini à l'une des revendications 12 et 13. 16. Une composition vaccinale renfermant - un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 4 à 6. 17. Une composition pharmaceutique renfermant - un anticorps anti-protéine immunosuppressive à action locale induite par une tumeur cancéreuse à l'exception de Tat de VIH1.