Brevet FR2774473A1 — publié le 19990806

- 1 - La présente invention concerne un procédé de dosage des troponines dans les milieux biologiques permettant d'éviter les interférences dues à I'héparine. On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de trois protéines, les troponines 1, T et C. Ce complexe protéique permet 24- de contribuer à la régulation de la contraction du muscle par l'ion Ca2, en interagissant avec la myosine et l'actine. De façon plus précise, on sait que lorsqu'un influx nerveux arrive au niveau de la plaque motrice d'un muscle, il y a [( génération d'un potentiel d'action qui est transmis au réticulum sarcoplasmique. Le Ca2+ est alors libéré dans le cytosol et se fixe sur la troponine C, ce qui entraîne un renforcement de l'interaction entre la troponine I et la troponine C et, par suite, un changement de conformation du complexe troponine 1, T, C. Il y a alors libération des sites d'interaction actine - myosine, ce qui permet le mouvement de is contraction du muscle. Lorsque le muscle est endommagé, de manière irréversible que ce soit le muscle cardiaque, lors d'une nécrose myocardique consécutive à un infarctus du myocarde, ou que ce soit le muscle squelettique lors d'efforts physiques prolongés, les troponines alors libérées apparaissent (plus ou moins rapidement) dans la circulation sanguine. Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation (1991,) 83, pp. 902-912, ou de la troponine I dans Am. Heart J. (1987), 110, pp. 1333-1344, et Molecular Immunology (1992), 29 (2), pp. 271-278. De même, on a proposé le dosage de la troponine T cardiaque pour mesurer le succès de la thérapie thrombolytique suite à un infarctus du myocarde dans Br. Heart J., (1994),, pp. 242-248, ainsi que le dosage de la troponine I squelettique pour la mesure du dommage des muscles squelettiques (D. Rama et ai, Clinical Chemistry (1996), 42 no 12 p. 2033). Il est à noter que le dosage des -2- différentes troponines cardiaques et squelettiques est aujourd'hui un moyen très utile pour le diagnostic de diverses pathologies humaines et animales. Pour évaluer les différentes troponines cardiaques, on utilise d'habitude des prélèvements sanguins (sérum, plasma ou encore sang total). Toutefois, ce choix peut être limité par la méthode mise en oeuvre, puisqu'on sait que le sérum est un échantillon biologique inapproprié pour certaines méthodes d'évaluation de la troponine, par exemple avec des procédés d'évaluation rapide de la troponine T, et que le sang total ne permet pas toujours de procéder à un io dosage quantitatif. En ce qui concerne les immunoessais effectués avec du plasma contenant de l'héparine, souvent, on est confronté à des résultats peu fiables, même lorsque les méthodes utilisées sont très performantes. Ce problème est généralement rencontré dans le cas o la concentration des troponines dans le plasma est peu élevée (P. O. Collison et ai., Ann. Clin. Biochem. , (1995), 32, pp. 1t 454-458). En effet, on sait que la présence de l'héparine dans le prélèvement sanguin peut interférer lors des différents immunodosages et modifier ainsi de manière considérable le résultat final et, de ce fait, le diagnostic clinique du praticien. Or, le dosage des troponines est effectué pour le diagnostic ou le suivi des maladies graves ce qui impose l'obtention de résultats très précis. De ce fait, l'utilisation de matériel contenant de l'héparine (tubes héparinés etc.) doit être souvent évitée aussi bien pour effectuer les prélèvements biologiques que pour effectuer les immunodosages. Par ailleurs, avant une angioplastie ou après un infarctus du myocarde ou encore lors de certains traitements des affections cardio-vasculaires, on administre chez les patients des quantités importantes d'héparine et ce traitement est souvent prolongé au-delà de 24 heures. En fonction de la dose administrée, la concentration de l'héparine dans le plasma une heure après administration, peut varier entre 0,1 à 2 UI/ml. La présence de l'héparine dans les prélèvements sanguins due au traitement du malade constitue un problème important pour le dosage des troponines. -3- On connait un certain nombre de produits susceptibles soit de dégrader soit de capter I'héparine tels que l'héparinase 1, la L- histidine, le sulfate de protamine, des résines échangeuses de cations etc. Ces produits sont couramment utilisés en biologie comme inhibiteurs de I'héparine. Toutefois, leur utilisation lors de la mise en oeuvre d'un immunoessai, ne permet pas toujours obtenir la suppression des interférences dues a I'héparine et souvent leur présence lors de l'immunodosage peut générer des interférences additionnelles (E. W. Nielsen et al., J. Immunological Methods, (1994), 173, pp. 245-251). I() Il a maintenant été trouvé qu'il est possible éviter les interférences dues à l'héparine lors des immunoessais des différentes troponines. Grâce à l'invention, on est maintenant capable d'effectuer le dosage des troponines sur des échantillons biologiques héparinés ou provenant des malades traités à I'héparine avec une très grande précision, sans diminution des valeurs réelles trouvées dans la circulation sanguine et ceci indépendamment du procédé immunologique utilisé. La présente invention concerne plus spécialement un procédé de dosage immunologique de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et 2o des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC) dans un échantillon biologique contenant de I'héparine, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage immunologique en présence de bromure d'hexadiméthrine (polybrène). La quantité du polybrène mise en oeuvre lors de l'immunodosage de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC) peut varier en fonction du procédé de l'immunodosage utilisé. De manière avantageuse, le rapport [concentration molaire du polybrène mis en oeuvre / concentration molaire de I'héparine présente dans l'échantillon à se analyser] peut être de 1 à 1000. Selon le dosage, il peut être plus spécialement de -4- à 300, de préférence de 60 à 180 ou encore seulement de 1 à 10, de préférence de 4 à 10. Le polybrène peut être ajouté directement dans le prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir I'héparine ou il peut être encore ajouté dans un des réactifs de l'immunodosage tels que solutions tampons, solution du réactif conjugué etc. On préfère additionner le polybrène dans des solutions tampons utilisées lors de l'immunodosage. Le terme solution tampon inclut toute solution utilisée lors des premières étapes d'immunodosage présente I) en même temps que l'échantillon plasmatique. Les solutions de lavage sont exclues de ce terme. La présente invention peut être mise en oeuvre avec tout procédé immunologique permettant l'évaluation de la troponine I (cardiaque ou In squelettique), T ou C, et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC). Selon l'invention, on préfère des procédés immunoenzymatiques permettant le dosage de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C ou de dimères ou de trimères de ces dernières dans un échantillon biologique, qui utilisent le polybrène pour supprimer les interférences dues à I'héparine. Parmi ces procédés, on préfère les procédés de type sandwich. Les procédés de type sandwich peuvent être réalisés en un ou plusieurs temps (deux temps, trois temps etc.) et mettre en oeuvre deux ou plusieurs anticorps monoclonaux ou polyclonaux. 2S5 On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. C. Larue et ai dans Mol. Immunol. (1992), 29(2), pp. 271-278 et Clin. Chem. (1993), 39/6, pp. 972-979 décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H202. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, -5- selon les auteurs, est de 0,2 pg/l. Une trousse de dosage mettant en oeuvre cette méthode est disponible dans le commerce (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). La limite de détection de cette trousse est de l'ordre de 0,03 à 0,04 pg/l (J. Mair et al. Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19-38) Un autre procédé immunoenzymométrique de la troponine I est décrit par Bodor et al. Ce procédé permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 115 à 3,1 pg/l (Bodor et al, C/lin. Chem. (1992), 38/11, p. 2203-2214; Adams J. et ai, Circulation (1993), 88(1), pp. 101-106). Ce dosage I( utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm. La demande de brevet WO 96/22535 décrit également un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque. Ce procédé utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent, choisi parmi des dérivés d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane et peut être réalisé soit par un système manuel (kit de dosage de diagnostic), soit par un système automatisé. Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un temps, soit un dosage en deux temps. On connaît aussi le procédé immunoenzymatique utilisé pour le dosage quantitatif automatisé de la troponine I et commercialisé par Dade Diagnostics, Munich Allemagne (L.P. Kuhr et al, Eur. J. Chem. Clin. Biochem.(1997), 35(5), p. 399-404). Une trousse permettant le dosage immunoenzymatique de la troponine T est aussi disponible dans le commerce. Il s'agit de la trousse " Troponine T / ES 300 Analyzer " commercialisée par Boehringer Mannheim, Mannheim Allemagne (N. Genseret al, Clin. Chem. Acta (1997), 265, pp. 207-217; 3) H. Baum et ai, C/lin. Chem. (1997), 43/10, p. 1877-1977). -6- La demande de brevet WO 96/33415 décrit également des procédés d'immunodosage de type sandwich permettant d'évaluer les quantités des troponines I et T ou de complexes de troponines 1, C et/ou T dans les milieux biologiques. Un procédé de dosage immunoenzymatique de la troponine I squelettique est décrit par Rama et al dans Clin. Chem. (1996), 42 n0 2, p. 2033. Les procédés immunoenzymatiques pour l'évaluation de la troponine 1 1, cardiaque ou squelettique, T ou C en protéines individuelles, dimériques ou tridimériques, cités ci-dessus sont donnés à titre d'exemple et ne constituent pas une liste exhaustive des procédés immunoenzymatiques des troponines connus par l'homme du métier. Le procédé selon l'invention peut être appliqué comme indiqué ci- dessus à tout type de procédé immunologique des troponines. Par exemple, le procédé selon l'invention peut être appliqué lors des immunoessais (par exemple tels que décrits par C. Larue et al dans L'information 2 cardiologique (1991) vol. XV n 1, pp. 17-21) et les fluoroimmunoessais (L. Bellanger et ai, Clin. Chem. (1997), vol 43 n 6, p. S159, n 240). L'utilisation du polybrène lors de dosage immunologique de la troponine I (cardiaque ou squelettique), T ou C, et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC), pour éviter les interférences dues à l'héparine fait partie de la présente invention. L'invention vise aussi des trousses d'immunodosage de la troponine 1, (cardiaque ou squelettique), T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre -7- elles sous forme de dimères (IT, IC ou TC) ou sous forme de trimère (ITC), contenant parmi les réactifs d'immunodosage du polybrène. Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer I'invention. EXEMPLE I I( Dosage de la troponine I cardiaque en utilisant des sérums et Piasmas surchargés d'héparine - traitement des échantillons avec différents inhibiteurs de l'héparine. Des sérums humains contenant éventuellement de la troponine I ont été surchargés en héparine une partie des sérums sans héparine a été conservée comme témoin et dosée en même temps. Différents inhibiteurs de I'héparine (héparine lithium) ont été testés notamment l'héparinase I (heparinase I from Flavobacterium heparinum Sigma réf. H 2519), la L- histidine (Sigma réf. H 8000), 20. le sulfate de protamine (protamine sulfate grade X from salmon Sigma réf. P 4020), I'antithrombine III (antithrombine III from human plasma Sigma réf. A 7388) et les résines échangeuses de cations QSFF (Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech réf. 17051001) et DEAE (DEAE Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech réf. 17070901). Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access immunoassay, système commercialisé par Beckman. La trousse utilisée est la trousse Access-Troponine I, commercialisée par la même société. Le dosage est effectué de la manière suivante: dans la cupule du dosage sont introduits 50 pl de l'échantillon à doser, 25 pI d'une solution - 8- d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 pl d'une solution d'acide succinique 0,1 M contenant l'inhibiteur de l'héparine et 50 pI du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 8El-phosphatase alcaline (concentration: 5 pg/ml). Après incubation pendant 5 minutes à 37 C, sont introduits 50 pl de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI-070/60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux antitroponine I cardiaque de souris 1 1 E12. Les anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 8E1 WIc et 1 1 E12 font partie de la trousse Troponine I. Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 37 C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8 on ajoute ensuite 200 pI de substrat Lumi-Phos 530. Ce substrat fait aussi partie de la trousse Access- 1 Troponine I. La révélation est effectuée à 37 C et on mesure la luminescence générée par la réaction avec un luminomètre. Le temps total d'analyse est de 15 minutes. Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine. On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 pg/l. Les résultats de cette étude sont donnés dans les tableaux I à VI ci- après. -9- TABLEAU I: Essai avec I'héparinase I Sans Héparinase I |Héparinase I héparinase I 2 Ul/mi 7 Ul/ml Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/mi) C** (ng/ml) Sérum négatif en Tnl* 0,005 0,000 0,008 Sérum négatif en TnI+héparine 0,005 0,000 0,011 UI/ml Extrait de TnI+diluant 7,929 8.646 9,148 Extrait de TnI+ héparine 30UI/ml 2,225 2,506 '.742 Extrait de TnI+ héparine 60UI/ml 1,913 2,052.,2 05 Sérum positif en TnI+diluant 1,002 1,03 5 0,975 Serum positif en TnI+héparine 0,231 0,252 0,331 UI/ml] _ Sérum positif en TnI+ héparine 0,175 0,216 0,286 UI/ml ' I * TnI = Troponine I **C = concentration en troponine I TABLEAU Il: Essai avec la L-histidine I() Sans L-histidine L- histidine L-histidine x 1000'** x 3000*** Echantillon C** (ng/ml)I C** (ng/mi) C** (ng/ml) Sérum négatifen TnI* 0,014 0,011 0.016 Sérum négatif en TnI+héparine 20UI/ml 0,012 0,011 0,010 Sérum négatif en Tnl+héparine 40UI/mli 0,015 0,013 0,014 Extrait de TnI+diluant 5,440 5,312 ' 4.794 Extrait de TnI+ héparine 20UI/ml 1,723 1,721 1.617 Extrait de TnI+ héparine 40UI/ml 1,497 1, 403 1.498 Sérum positif en TnI+diluant 0,861 0,872_ 0,925 Sérum positifen TnI+héparine 20UI/ml 0,256 0,264 0.317 Sérum positif en TnI+héparine 40UI/mlI 0,213 0,249 0.290 * TnI = Troponine I * C = concentration en troponine I ** mol L- histidine / mol héparine -10- TABLEAU III Essai avec le sulfate de protamine (protamine) Sans Protamine Protamine protamine x 1** x 5*** Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C (ng/mi) Sérum négatif en TnI* 0, 010 0,000 [ 0.000 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml 0, 020 0,000 0,000 Extrait de TnI+diluant 0,310 02 000 0,050 Extrait de TnI+ héparine 40UI/ml 0,070 0,00 0,000 Sérum positif en TnI+diluant 0,570 0,340 0,100 Sérum positif en TnI+héparine 40UI/ml 0,120 0,05 j 0.000 * TnI = Troponine I * C = concentration en troponine I *** mol sulfate de protamine / mol héparine TABLEAU IV Essai avec l'antithrombine III Sans Antithrombine Antithrombine antithrombine III 11 11I 2UI/ml 7UI/ml Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) C** (ng/ml) Sérum négatif en TnI* 0,000 0,000 0,000 Sérum négatif en TnI+héparine 0,000 0,000 0,000 U1/ml Extrait de TnI+diluant 11,600 12,130 11,370 Extrait de TnI+ héparine 30UI/ml 2,800 3,130 2.830 Sérum positif en TnI+diluant 0,800 0,830 0,830 Sérum positif en TnI+héparine 0,200 0,200 0,280 UI/ml * TnI = Troponine I ** C = concentration en troponine I - 11 - TABLEAU V Essai avec la résine échangeuse de cations QSFF Echantillon C** (ng/ml) Sérum negatif en TnI* r 0, 000 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml 0.010 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml+résine 50mg 0,000 Sérum négatif en TnI+résine SOmg 0.000 Sérum positif en TnI+diluant 0,950 Sérum positif en TnI+héparine 40UI/ml 0, 180 Serum positif en TnI+héparine 40UI/ml+résine 50mg 0,110 Sérum positif en TnI+résine 50mg 0,960 Extrait de TnI+diluant 5,270 Extrait de TnI+ héparine 40UI/ml 1.580 Extrait de TnI+ héparine 40UIml+résine 50mg 1,240 Extrait de TnI+résine 50mg 5,160 * TnI = Troponine I ** C = concentration en troponine I TABLEAU Vl Essai avec la résine échangeuse de cations DEAE Echantillon C** (ng/ml) Sérum négatif en TnI* 0, 010 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml 0,010 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml+résine mg 0,018 Sérum négatifen TnI+résine 1 mg 0.014 Sérum positifen TnI+diluant 0.910 Sérum positif en TnI+héparine 40UI/mlI 0, 200 Sérum positif en TnI+héparine 40UI/ml+résine I mg 0.310 Sérum positifen TnI+résine Img 0,410 Extrait de TnI+diluant 6,080 Extrait de TnI+ héparine 40UI/ml 1,540 Extrait de TnI+ héparine 40U/ml+résine l mg 2,610 Extrait de TnI+résine lmg 3,600 I() * TnI = Troponine I ** C = concentration en troponine I -12 - Les résultats de cette étude démontrent que ni les inhibiteurs de I'héparine utilisés ni les résines échangeuses de cations ne permettent d'inhiber les interférences dues à l'héparine. Par ailleurs, il a été observé que le sulfate de protamine I entraîne une augmentation importante du bruit de fond (résultats non mentionnés dans le tableau III). EXEMPLE II Dosage de la troponine I cardiaque avec un kit immunoenzymatique en utilisant le polybrène pour éviter les interférences dues à l'héparine Pour l'immunodosage, il a été utilisé la trousse Troponine I Pasteur Ji (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). Le dosage est effectué de la manière suivante: Dans des tubes en polystyrène revêtus d'anticorps monoclonaux anti- troponine I cardiaque de la souris 8E1, on introduit 150 pIl d'une solution de tampon succinate comportant du polybrène et contenant du Tween 20 à 0,2 %, 2 des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon , 50 pl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 1 1E12- peroxydase, et 200 pl d'échantillon à doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage. Pour la gamme étalonnage, on utilise du sérum humain contenant de 0 à 1,74 pg/I de troponine I cardiaque humaine purifiée. On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante: - on renverse le contenu des tubes dans un récipient et on éponge les tubes sur un papier absorbant, - 13 - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6,8 contenant du Tween 20 à 0,1 % et 0,3 % de Kathon, en maintenant la température de la solution de lavage au plus à 8 C. On répète cette étape 4 fois. Après avoir procédé au lavage et éliminé toute trace de la solution utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 600 pI d'un mélange constitué de 1 partie de tetraméthylbenzydine et 100 parties de tampon citrate contenant 4% de DMSO et 0,03% d'eau oxygénée. tff On laisse à température ambiante et à l'obscurité pendant 15 minutes et on mesure l'absorbance à X = 450 nm. Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau VII. TABLEAU VII Sans Polybrène polybrène x10** Echantillon C** (ng/ml) C** (ng/ml) Sérum négatif en TnI* 0,000 0,020 Sérum négatif en TnI+héparine 40UI/ml 0,000 0,000 Extrait de TnI+diluant 0,950 0,990 Extrait de TnI+ héparine 40UI/ml 0,410 1.040 Sérum positif en TnI+diluant 1,160 1,240 Sérum positif en TnI+héparine 40UIml 0,480 1,170 *TnI = Troponine I ** C = concentration en Troponine I *** mol polybrène / mol héparine Les résultats du tableau VII démontrent que le polybrène permet d'éviter les interférences dues à l'héparine. Une concentration molaire 10 fois supérieure à celle de l'héparine présente dans l'échantillon est nécessaire lorsque -14- le dosage de la troponine I est effectué avec la trousse Troponine I Pasteur (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). EXEMPLE III Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé o Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access immuoassay, système commercialisé par Beckman. Le procédé de l'immunodosage est celui décrit dans l'exemple I. Des plasmas de cinq patients contenant de l'héparine ont été Is analysés. Les résultats de cette étude sont donnés dans le tableau VIII. De cette étude il ressort que lorsque le système automatisé décrit ci-dessus pour le dosage de la Troponine I est employé, il est nécessaire d'utiliser de 60 àa 120 mol de polybrène par mol d'héparine présente dans l'échantillon. TABLEAU VIII Sans polybrène Polybrène Polybrène Polybrène mols/mol 90 mols/mol 120 mois/mol d'héparine d'héparine d'héparine Echantillon C* (ng/ml) C* (ng/ml) C* (ng/ml) C* (ng/ml) 1 0,139 0,649 0,800 0,868 2 0,066 0,439 0,520 0,595 3 0,044 0,441 0,541 0,585 4 0,046 0,486 I 0,660 0,736 0,085 0,367 0,471 0,570 * C = concentration en Troponine I -15 - REVENDICATIONS > 1. Procédé de dosage immunologique de la troponine 1, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimére ITC dans un échantillon biologique contenant de l'héparine, caractérisé en ce que l'on effectue le dosage immunologique en présence de polybrène. I) 2. Procédé de dosage immunologique de la troponine 1, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC selon la revendication 1 caractérisé en ce que le rapport [concentration molaire du polybrène mis en oeuvre 1In/ concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de 1 à 1000. 3. Procédé de dosage immunologique selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le rapport [concentration molaire du polybrène mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de 1 à 10, de préférence de 4 à 10. 4. Procédé de dosage immunologique selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le rapport [concentration molaire du polybrène mis en oeuvre / concentration molaire de l'héparine présente dans l'échantillon à analyser] est de à 300, plus spécialement de 60 à 180. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le polybrène est additionné dans des solutions utilisées lors des premières étapes du dosage immunologique. - 16- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dosage de la troponine 1, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC est un procédé immunoenzymatique. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le procédé immunoenzymatique est de type sandwich. o 8. Utilisation du polybrène lors de dosage immunologique de la troponine 1, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC pour éviter les interférences dues à l'héparine. Ji 9. Trousses d'immunodosage de la troponine 1, cardiaque ou squelettique, T ou C et des troponines 1, T ou C associées entre elles sous forme de dimères IT, IC ou TC ou sous forme de trimère ITC contenant parmi les réactifs d'immunodosage du polybrène.