Brevet FR2776668A1 — publié le 19991001

PROCEDE DE CULTURE EN MILIEU LIQUIDE DE SCHIZOPHYLLUM COMMUNE Fr. POUR ISOLER LE pfi-1,3-GLYCANE p-1,6-RAMIFIE ET COMPOSITION POUR APPLICATION EXTERNE CONTENANT LE p-1,3-GLYCANE fi-1,6-RAMIFIE OBTENU PAR LEDIT PROCEDE. CONTEXTE DE L'INVENTION 1. Domaine de l'invention La présente invention concerne un procédé de culture en milieu liquide de Schizophyllum commune Fr. pour isoler le f-l,3-glycane 8-l,6-ramifié et une composition pour application externe contenant le 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié obtenu par ledit procédé. 2. Description de la technique antérieure La peau a une fonction de protection contre les environnements qui l'entourent tels que les variations de température ou d'humidité, les ultraviolets, les matériaux polluants. Toutefois, la fonction normale de la peau peut être déprimée par des stimulations et des sollicitations physiques ou chimiques excessives ou par des carences en éléments nutritifs provoquant un vieillissement et une détérioration de la peau. Ainsi, dans le domaine des cosmétiques, pour préserver la beauté et la santé de la peau en évitant cette hypergasie, on a utilisé des matériaux physiologiquement actifs issus d'animaux, de plantes ou de micro-organismes comme ingrédients cosmétiques. Ainsi, par exemple, il a été rapporté que des extraits de champignons possèdent une capacité de rétention d'humidité, une capacité d'inhibition de la formation de mélanine et une capacité de faire écran aux ultraviolets et, de ce fait, ils peuvent être incorporés dans une composition cosmétique afin de lui conférer un effet de blanchiment de la peau ou une action antioxydante. En particulier, un extrait de Schizophyllum commune Fr. permettant d'obtenir une activité de blanchiment de la peau et un effet de rétention d'humidité excellents a été présenté dans JP-5-286843A. Toutefois, son composant actif n'a pas encore été identifié. En d'autres termes, il faut d'autres recherches pour déterminer quel est le composant de l'extrait de Schizophyllum commune Fr. qui peut produire une action cutanée effective. Ces autres recherches peuvent comprendre l'amélioration de méthodes d'isolation effective et pure de principes actifs. Par conséquent, les présents inventeurs ont réalisé des études approfondies dans le but d'identifier les principes actifs de l'extrait de Schizophyllum commune Fr. qui confèrent une action cutanée effective. Le résultat est la découverte que le 8-l,3-glycane /-1,6- ramifié obtenu par culture liquide de Schizophyllum commune Fr. peut inhiber la formation de mélanine, favoriser la biosynthèse des cellules cutanées et du collagène, et guérir les brûlures provoquées par une exposition excessive au soleil. De plus, ils ont découvert que le rendement en 8- 1,3-glycane >-1,6-ramifié peut être augmenté en ajoutant du charbon actif ou du glucose dans le milieu liquide. Ils ont également découvert que le rendement en /-1,3-glycane 8-1,6-ramifié peut être davantage augmenté en ajoutant à la fois du charbon actif et du glucose dans le milieu liquide. RESUME DE L'INVENTION Par conséquent, la présente invention a pour objet de proposer un procédé de culture liquide de Schizophyllum commune Fr. pour isoler le B-l,3-glycane 8-1,6-ramifié. De plus, un autre objet de la présente invention est de proposer une composition pour application externe contenant du 8-1,3-glycane f-l,6-ramifié obtenu en tant que principe actif à l'aide du présent procédé et capable de retarder le vieillissement de la peau, de conférer un effet de blanchiment de la peau et de guérir efficacement les lésions cutanées. L'objet de la présente invention est atteint par un procédé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (1) préparer du mycélium de Schizophyllum commune Fr.; (2) cultiver ce mycélium sur un milieu liquide à pH 4,0 - 8,5 comprenant de 1 à 10 % en poids de glucose, de 0,1 à 1 % en poids d'extrait de levure, de 0,05 à 0,5 % en poids de (NH4)2HP04 ou (NH4)2SO4, de 0,05 à 0,5 % en poids de KH2PO4, et de 0,005 à 0,2 % en poids de MgSO4 7H20; (3) isoler le B-l, 3-glycane 6-l,6-ramifié du milieu liquide; et (4) purifier le 6-l,3- glycane /-1,6-ramifié La présente invention propose également un procédé de culture comprenant en outre une étape consistant à ajouter un charbon actif dans le milieu liquide au cours de l'étape (2). La présente invention propose également un procédé de culture comprenant en outre une étape consistant à ajouter un glucose dans le milieu liquide au cours de l'étape (2). La présente invention propose également un procédé de culture comprenant en outre une étape consistant à ajouter à la fois du charbon actif et du glucose dans le milieu liquide au cours de l'étape (2). De plus, la présente invention propose une composition pour application externe caractérisée en ce qu'elle contient le 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié obtenu par le présent procédé en une quantité de 0,00001 à % en poids, ramenée au poids total de la composition. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 est un graphique montrant la croissance de mycélium de Schizophyllum commune Fr. (*) et la quantité de 8-1,3-glycane 8-1,6ramifié produite (O) en fonction du temps de culture. La figure 2 est un spectre d'absorption infrarouge du 8-1,3-glycane 81,6-ramifié obtenu par le présent procédé. La figure 3 est un spectre de résonance magnétique nucléaire du 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié obtenu par le présent procédé. La figure 4 est un graphique montrant la croissance de mycélium de Schizophyllum commune Fr. (+) et la quantité de 8-1,3-glycane 8-1,6ramifié produite (E) en fonction du temps de culture dans le procédé comprenant la deuxième étape de culture dans laquelle on ajoute à la fois du charbon actif et du glucose dans le milieu liquide. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Schizophyllum commune Fr. est un champignon pourrissant le bois qui appartient au genre Agaricales Tricholomatacées Schizophyllum des basidiomycètes dans la classification de Singer R. (The Agaricales in modern taxonomy, 1975) et qui excrète du,-l,3-glycane 6-1,6-ramifié vers le milieu extracellulaire. Il peut être obtenu à l'état sauvage et il est identifié par la morphologie ou les caractéristiques taxinomiques suivantes: sa fructification a une taille de 1,0 à 3,0 cm, elle est dépourvue de stipe et présente une forme de coquille avec des lamelles longitudinales et une marge hirsute. Les lamelles sont blanches mais deviennent gris clair ou brun violacé clair à maturité. Sa chair a tendance à se flétrir mais elle revit en absorbant de l'humidité. La sporée est blanche. Le spore est de forme cylindrique avec une taille de 4 x 1,5 um à 6 x 2 pum et présente un aspect lisse et blanc. Schizophyllum commune Fr. se trouve en grappes sur les arbres morts ou les souches de feuillus. Son régime et sa forme sont décrits plus en détail dans "Illustrated Book of Korean Fungus" (Sam soon KIM et al., YooPoong Press, 1990) et dans "The Agaricales in modern taxonomy" (Singer R., 1975). Les liaisons glucose de type / tels que les liaisons 8-1,3,]-1,4 et /- 1,6 sont généralement appelées 6-glycane sans distinction spécifique. Mais, en fait, le type de liaison est très variable suivant son origine, de sorte qu'il possède des propriétés physiques ou chimiques et une fonction biologique différentes. En d'autres termes, le 6-glycane a suivant son origine une composition différente en termes de sucres constituants, de degré de ramification, de poids moléculaire ou de structure tridimensionnelle. Ainsi, par exemple, le,-glycane de Ganoderma licidum est principalement isolé à partir de la paroi cellulaire et accessoirement du milieu extracellulaire et possède une liaison de glucose, mannose et galactose. Le 8-glycane de Coriolus versicolor est principalement isolé à partir de la paroi cellulaire et possède des liaisons 8-1,3 et >-1,4. Le 8-glycane de Lentinus edodes est isolé de la paroi cellulaire et il s'agit de 8-1,3- glycane 8-1,6-ramifié ayant deux liaisons 8-1,6 ramifiées sur chacune des cinq liaison 8-1,3 de la chaîne principale. Le]- glycane de Pleurotus ostreatus est isolé à partir de la paroi cellulaire et possède une liaison de glucose, mannose et galactose. Le 5- glycane de Phellinus linteus est isolé à partir de la paroi cellulaire et possède une liaison de 70 à 90% de glucose, et de mannose et de galactose. De plus, le 3- glycane de Saccharomyces cerevisiae est isolé à partir de la paroi cellulaire et possède une liaison hétérogène avec une petite ramification qui le rend insoluble. En revanche, le 8-glycane isolé de Schizophyllum commune Fr. conformément à la présente invention a été identifié comme étanE un 6-1, 3-glycane 8-1,6-ramifié homogène possédant une liaison 8-1,6 ramifiée sur chacune des trois liaisons >-1,3 de la chaîne principale et composé uniquement de glucose, avec un poids moléculaire élevé de 2.000.000 à 5.000.000. Il est isolé du milieu extracellulaire et possède des propriétés polysaccharidiques stables et neutres. Le procédé de culture liquide de Schizophyllum commune Fr. pour isoler le 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié va être décrit plus en détail. (1) Etape de préparation du mycélium de Schizophyllum commune Fr. Le mycélium de Schizophyllum commune Fr. peut être préparé en cultivant des spores du type sauvage de Schizophyllum commune Fr.. Dans le détail, les spores du type sauvage de Schizophyllum commune Fr., après plusieurs lavages avec de l'eau distillée, sont ensemencés sur un milieu gélosé à base d'extrait de levure et de malt (3 g d'extrait de levure, 3 g d'extrait de malt, 5 g de peptone, 10 g de glucose, 15 g de gélose, 1 1 d'eau distillée) et maintenus à une température de 24 C pendant 7 jours pour générer le mycélium. Le mycélium ainsi généré est cultivé dans des tubes à essais obliques contenant le même milieu gélosé à l'extrait de levure et de malt puis maintenu à une température de 4 C pour être repiqué tous les mois. (2) Etape de culture du mycélium sur un milieu liquide Le mycélium est homogénéisé en conditions aseptiques et ensuite ensemencé en une quantité de 0,0001 à 10 % (V/V), de préférence 3 % (V/V) sur un milieu liquide à un pH de 4,0 à 8,5, de préférence à pH 6,5, comprenant de 1 à 10 % en poids de glucose, de préférence 3 % en poids; de 0,1 à 1 % en poids d'extrait de levure, de préférence 0,3 % en poids; de 0,05 à 0,5 % en poids de (NH4)2HPO4 ou de (NH4)2SO4, de préférence 0,05 % en poids; de 0,05 à 0,5 % en poids de KH2PO4, de préférence 0,1 % en poids; et de 0,005 à 0,2 % en poids de MgSO4 7H20, de préférence 0,05 % en poids. Ensuite, on effectue la culture liquide du mycélium en maintenant le milieu à une température de 20 à C, de préférence à 28 C, sous agitation à 100 à 400 tr/min, de préférence à 200 tr/min, et sous aération de 0,3 à 2 V/V/min, de préférence 1 V/V/min, dans une cuve de fermentation pendant 3 à 7 jours, de préférence 5 jours. Le graphique de la figure 1 indique que la productivité du 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié commence à augmenter après 2 jours de culture et atteint un maximum après 5 jours de culture. On peut comprendre que les 2 premiers jours de culture servent à la croissance du mycélium et la culture au-delà de cette durée sert à produire le 8-l,3-glycane 6-1,6-ramifié. Par ailleurs, dans la partie ultérieure de la culture, il peut se produire une certaine décomposition du p- 1,3-glycane /-1,6-ramifié. Par conséquent, il est préférable de réaliser la culture pendant 5 jours. (3) Etape d'isolement du 8-1,3-glycane p-1,6-ramifié à partir du milieu liquide Le 6-l,3-glycane >-1,6-ramifié peut être isolé par adsorption au moyen d'une poudre de charbon actif. Dans le détail, lorsque la culture est terminée, on ajoute la poudre de charbon actif au milieu liquide en une quantité de 0,1 à 6 %, de préférence de 1 %, puis on agite le mélange pour éliminer les composants non nécessaires tels que les pigments et les protéines. Ensuite, on filtre le mélange par pressage afin d'obtenir une solution contenant du 3-l,3-glycane f- 1,6-ramifié. A ce moment, l'adsorption avec la poudre de charbon actif peut se faire après le filtrage à la presse. (4) Etape de purification du 6-l,3-glycane]-1,6- ramifié La purification du 8-l,3-glycane f-l,6-ramifié peut être réalisée par précipitation à l'alcool éthylique. Dans le détail, la solution obtenue est soumise à une filtration fine au moyen de filtres équipés de membranes ayant des micropores de 1 pm et 0,45 un, donnant un filtrat décoloré ou brun clair. A ce filtrat, on ajoute de l'alcool éthylique afin de précipiter le 8-l,3- glycane 8-l,6-ramifié. Pour purifier le B-l,3-glycane 6- 1,6-ramifié, la précipitation à l'alcool éthylique peut être répétée 2 à 5 fois. La quantité d'alcool éthylique à ajouter se situe de préférence dans la plage de 3 à 4 fois, de préférence de 3,5 fois le volume du filtrat et elle peut être réduite à mesure que la précipitation à l'alcool éthylique est répétée. Lorsque la précipitation à l'alcool éthylique est répétée deux fois ou plus, la quantité d'alcool éthylique à ajouter lors de la précipitation finale peut être équivalente en volume à celle du filtrat d'origine. Ensuite on récupère les précipités et on les sèche à l'air chaud à une température de 20 à 100 C afin d'éliminer les composants volatils tels que l'alcool éthylique. Pour finir, le produit peut être lyophilisé à une température de -70 C puis broyé pour donner du 8-1,3-glycane 8-1,6-ramifié sous forme de poudre. Dans l'étape de culture (2), comme on peut le voir sur la figure 1, certains matériaux décomposant le 8- 1,3-glycane /-1,6-ramifié et inhibant la croissance du mycélium peuvent être produits en tant que sous- produits en même temps que le 8-1,3-glycane 8-1,6- ramifié. Ces matériaux sont identifiés comme étant de l'endo-1,3-]glycanase et la SIF (substance induisant la fructification). L'endo-l,3bêtaglycanase {Prokop et ai., Can. J. Microbiol. Rev., vol. 40, n 1, page 18} peut décomposer le /-1,3-glycane /-1,6-ramifié, réduisant le rendement en 8-1,3-glycane /-1,6-ramifié. Et la SIF, par exemple la (4E,8E)-N-D-2'-hydroxy- palmitoyl-1-O-/-D-glycopyranosyl-9-méthyl-4,8- sphinga- diénine et la (4E,8E)-N-D-2'-hydroxystéaroyl-l-O-/-D- glycopyranosyl-9-méthyl-4,8-sphingadiénine {Mizushima et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 249, page 17} peut inhiber la croissance du mycélium, réduisant la productivité du 8-1,3-glycane /-1,6- ramifié {Wessels, 1978, Genetics and Morphogenesis in the Basidiomycetes, pages 81-104, Academic.Press; Prokop et al., 1992, Experimental Mycology, vol. 16, pages 197-206}. Il a été rapporté que ces sous- produits sont produits pendant la phase tardive de la culture de Schizophyllum commune Fr.. Par conséquent, les présents inventeurs ont réalisé d'autres études afin d'éliminer ces sous-produits et augmenter ainsi le rendement en /-1,3-glycane /-1,6- ramifié. Le résultat en est la découverte que l'objet 1l peut être réalisé en ajoutant du charbon actif au milieu liquide pendant l'étape de culture (2). En l'occurrence, les sous-produits peuvent être éliminés par adsorption sur le charbon actif sans influence néfaste sur la croissance du mycélium et sur la production de 6-l,3-glycane 8-l,6-ramifié. Il est préférable d'ajouter le charbon actif après 2 à 4 jours de culture en une quantité de 0,1 à 5 %. Après cet ajout, la culture peut se poursuivre pendant 1 à 4 jours supplémentaires. L'addition de charbon actif permet d'augmenter le rendement en /-l,3glycane 6-1,6-ramifié d'environ %. Par ailleurs, le rendement en 3-l,3-glycane /-1,6- ramifié peut être encore augmenté par un apport de glucose pendant la culture afin de produire du /-1,3- glycane 8-1,6-ramifié. Dans le détail, un rapport C/N élevé peut améliorer la productivité du B-1,3-glycane 6-1,6-ramifié tandis qu'un rapport C/N bas peut favoriser la croissance du mycélium. Par conséquent, dans le cadre de la présente invention, le milieu liquide peut être amené à un rapport C/N relativement bas en réduisant la quantité initiale de la source de carbone, soit en comparaison de 1 à 3 % de glucose et de 0,3 à 0,5 % d'extrait de levure pendant la culture de croissance du mycélium et à un rapport C/N relativement élevé en apportant du glucose pendant la culture de production du >-1,3- glycane 6-1,6-ramifié. Il est préférable d'effectuer l'apport de glucose lorsque la production de >-1,3- glycane >-1,6-ramifié commence à augmenter rapidement ou que la croissance du mycélium commence à ralentir, c'est-à-dire après 3 à 5 jours de culture, en une quantité de 1 à 10 %. Après cet apport, la culture peut se poursuivre pendant 1 à 3 jours supplémentaires. L'apport de glucose permet d'augmenter le rendement en 8-1,3-glycane /1,6-ramifié d'environ 38 %. De plus, le rendement en 8-1,3-glycane /-1,6- ramifié peut être encore augmenté en ajoutant à la fois du charbon actif et du glucose au milieu liquide. Cet ajout se fait de préférence après 3 à 5 jours de culture. Il est préférable que le milieu initial contienne de 1 à 3 % de glucose et de 0,3 à 0,5 % d'extrait de levure en tant que source de carbone afin d'abaisser le ratio C/N. La quantité de charbon actif et de glucose à ajouter est de 0,1 à 5 % et de 1 à 10 %, respectivement. Après cet ajout, la culture peut se poursuivre pendant 1 à 5 jours supplémentaires. L'ajout permet d'augmenter le rendement en 8-1,3- glycane /-1,6-ramifié d'environ 60 %. Le graphique de la figure 4 indique que la productivité du /- 1,3-glycane /-1,6-ramifié commence à augmenter après 2 jours de culture et qu'elle atteint un maximum après 6 jours de culture. On peut voir que l'addition de charbon actif et de glucose permet d'augmenter la productivité et d'allonger la période de production, ce qui se traduit par une augmentation du rendement en /-1,3-glycane /-1,6-ramifié. Le /-1,3-glycane /-1,6-ramifié obtenu par le procédé ci-dessus, comme le montrent les exemples ci- après, peut favoriser la biosynthèse des cellules cutanées et du collagène, guérir les brûlures provoquées par une exposition excessive au soleil et inhiber la formation de mélanine. Sur la base de ces résultats, la présente invention est en mesure de proposer une composition pour application externe contenant du 6-l, 3-glycane /-1,6- ramifié comme ingrédient actif. Cette composition permet de retarder le vieillissement de la peau, de conférer un effet de blanchiment de la peau et de guérir efficacement les lésions cutanées. La composition peut contenir le /-1,3-glycane,-1,6- ramifié en une quantité de 0,00001 à 10 % en poids, quantité qui peut être choisie en fonction des formulations ou des buts ultimes de la composition. De plus, la composition pour application externe peut être formulée de manière non limitative sous forme de cosmétique tel qu'un adoucissant pour la peau, une eau de toilette nourrissante, des crèmes de massage, un tampon ou un gel, et sous forme de produit à usage topique tel que pommade, gel, crème, timbre (patch) ou spray. Egalement, les compositions peuvent contenir en plus d'autres composants d'utilisation classique qui peuvent être choisis en fonction de la formulation. MODES DE REALISATION PREFERES DE L'INVENTION La présente invention va être illustrée de manière plus détaillée au moyen des exemples ci-après. Toutefois, il reste entendu que ces exemples sont donnés à titre purement illustratif et ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention, qui est délimitée de manière adéquate par les revendications ci-jointes. [Préparation 1] On cultive du mycélium de Schizophyllum commune Fr. dans des tubes à essai obliques contenant un milieu gélosé à base d'extrait de levure et de malt {3 g d'extrait de levure, 3 g d'extrait de malt, 5 g de peptone, 10 g de glucose, 15 g de gélose, 1 1 d'eau distillée} puis on l'homogénéise en conditions aseptiques. Ensuite, on ensemence le mycélium à raison de 3 % (V/V) dans un milieu liquide à pH 6,5 contenant 3 % en poids de glucose, 0,3 % en poids d'extrait de levure, 0,05 % en poids de (NH4)2HPO04, 0,1 % en poids de KH2PO4 et 0,05 % en poids de MgSOq4 7H20. La culture en milieu liquide se fait en maintenant le milieu à une température de 28 C sous agitation à 200 tr/min et avec aération de 1 V/V/min dans une cuve de fermentation de 30 litres pendant 5 jours. A la fin de la culture, la concentration du mycélium est d'environ 4,0 g/l et la concentration de 6-1,3-glycane 8-1,6- ramifié est d'environ 9,5 g/l (voir la figure 1). Ensuite, on ajoute au milieu liquide du charbon actif en poudre (Jeil Chemical Co., Ltd., Corée) en une quantité de 1,0 % et on agite le mélange pendant 30 minutes. Ensuite, on filtre le mélange par pressage pour obtenir une solution contenant du 8-1,3-glycane 8- 1,6-ramifié. On filtre une nouvelle fois la solution sur des filtres équipés de membranes microporeuses de 1 pm et 0,45 pm, dans cet ordre, ce qui donne un filtrat décoloré ou brun clair. A ce filtrat, on ajoute 3,5 fois son volume d'alcool éthylique et on laisse le mélange pendant une nuit à la température ambiante pour qu'il précipite. On récupère le précipité et on le dissout dans de l'eau distillée de manière à obtenir une solution de volume équivalent à celui du filtrat initial. A cette solution, on ajoute 2 fois son volume d'alcool éthylique et on laisse le mélange pendant une nuit à la température ambiante pour qu'il précipite. On récupère à nouveau le précipité et on le sèche à l'air chaud à 80 C. Pour finir, on lyophilise le produit à - 70 C et on le broie dans un broyeur pour obtenir la poudre. Le composé pulvérulent est identifié au moyen d'un spectrophotomètre infrarouge (Biorad, FTS-40) et d'un spectrophotomètre à résonance magnétique nucléaire (Varian Gemini 2000, 300 MHz, FT-RMN). Les résultats sont illustrés sur la figure 2 et la figure 3, respectivement. Sur la figure 2, l'anomère f montrant que le composé est principalement du 8-glycane est confirmé à 889,4 nm et, sur la figure 3, il est confirmé que ce composé a une structure homogène avec un /-1,6-D-glucose ramifié sur chacun des trois 8-1,3- D-glucoses. RMN 13C (ppm): C-6 (61,15), C-4 (68,58), C-6 (70,25), C-2 (72,74), C-2 (73,80), C-3 (74,81), C-5 (76,40), C-3 (86,44), C-1 (103,11). Par ailleurs, on mesure la pureté du 6-l,3-glycane -1,6-ramifié avec le BGSTER, un kit utilisant la réaction du lysat d'amibocytes de limule et du /- glycane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Le résultat obtenu est une pureté de 99,2 % pour ce composé. [Préparation 2] Après homogénéisation en conditions aseptiques, on ensemence du mycélium de Schizophyllum commune Fr. à raison de 3 % (V/V) dans un milieu liquide à pH 6,5 comprenant 3 % en poids de glucose, 0,3 % en poids d'extrait de levure, 0,05 % en poids de (NH4)2SO4, 0,1 % en poids de KH2PO4 et 0,05 % en poids de MgSO4 7H20. La culture liquide s'effectue en maintenant le milieu à une température de 28 C sous agitation à 200 tr/min et aération de 1 V/V/min dans une cuve de fermentation de litres pendant 3 jours. Ensuite, on ajoute au milieu du charbon actif en poudre (Jeil Chemical Co., Ltd., Corée) à raison de 0,5 % et on poursuit la culture pendant 3 jours supplémentaires dans les mêmes conditions. A la fin de la culture, la concentration du mycélium est de 3,8 g/l environ et la concentration du f-l,3-glycane f-l,6-ramifié est de 12,3 g/l environ (voir la figure 4). Ensuite, on filtre la culture par pressage et on y ajoute du charbon actif en poudre (Jeil Chemical Co., Ltd., Corée) à raison de 0,5 %. Ensuite, on agite le mélange pendant 30 minutes. Ensuite, on suit le même mode opératoire que celui décrit dans la préparation 1 pour purifier le /-1,3- glycane /-1,6-ramifié. Le produit obtenu est identifié comme étant du 8- 1,3-glycane /-1,6-ramifié d'une pureté mesurée de 99,5 %. [Préparation 3] Après homogénéisation en conditions aseptiques, on ensemence du mycélium de Schizophyllum commune Fr. à raison de 3 % (V/V) dans un milieu liquide à pH 6,5 comprenant 2 % en poids de glucose, 0,4 % en poids d'extrait de levure, 0,05 % en poids de (NH4)2HPO4, 0,1 % en poids de KH2PO4 et 0,05 % en poids de MgSO4 - 7H20. La culture liquide s'effectue en maintenant le milieu à une température de 28 C sous agitation à 200 tr/min et aération de 1 V/V/min dans une cuve de fermentation de 30 litres pendant 4 jours. Ensuite, on ajoute au milieu du glucose à raison de 0,3 % et on poursuit la culture pendant 2 jours supplémentaires dans les mêmes conditions. A la fin de la culture, la concentration du mycélium est de 4,5 g/l environ et la concentration du B-l,3-glycane f-1,6-ramifié est de 13,1 g/l environ. Ensuite, on suit le même mode opératoire que celui décrit dans la préparation 1 pour isoler et purifier le /-l,3-glycane f-l,6-ramifié. Le produit obtenu est identifié comme étant du P- 1,3-glycane 8-l,6-ramifié d'une pureté mesurée de 99,4 %. [Préparation 4] Après homogénéisation en conditions aseptiques, on ensemence du mycélium de Schizophyllum commune Fr. à raison de 3 % (V/V) dans un milieu liquide à pH 6,5 comprenant 2 % en poids de glucose, 0,4 % en poids d'extrait de levure, 0,05 % en poids de (NH4)2S04, 0,1 % en poids de KH2PO4 et 0,05 % en poids de MgSO4 * 7H20. La culture liquide s'effectue en maintenant le milieu à une température de 28 C sous agitation à 200 tr/min et aération de 1 V/V/min dans une cuve de fermentation de litres pendant 4 jours. Ensuite, on ajoute au milieu du charbon actif à raison de 0,5 % et du glucose à raison de 3 % et on poursuit la culture pendant 2 jours supplémentaires dans les mêmes conditions. A la fin de la culture, la concentration du mycélium est de 4,5 g/l environ et la concentration du 6-1,3-glycane 6-1,6- ramifié est de 15,1 g/l environ. Ensuite, on suit le même mode opératoire que celui décrit dans la préparation 1 pour isoler et purifier le ]-1,3-glycane /-1,6-ramifié. Le produit obtenu est identifié comme étant du /- 1,3-glycane /-1,6-ramifié d'une pureté mesurée de 99,6 %. Prolifération de fibroblastes On cultive des fibroblastes humains dans du milieu d'Eagle modifié Dulbecco (DMEM) contenant 2,5 % de sérum de veau foetal et on les ajoute ensuite dans des microplaques de 96 puits à raison de 5.000 cellules par puits. On prépare les échantillons suivants: /-1,3-glycane /-1,6-ramifié de la préparation 1: 1 % de solution et ses dilutions successives; /-1,3- glycane /-1,6-ramifié de la préparation 4: 1 % de solution et ses dilutions successives; GluCare S, /-glycane isolé à partir de levure (Cosmoferm): 1 % de solution et ses dilutions successives; et le filtrat avant précipitation à l'alcool éthylique dans la préparation 1: 100 % et sesdilutions au 1/10 successives. Après avoir ajouté chaque échantillon dans chaque puits, on maintient la plaque de 96 puits à 37 C pendant 4 jours. A l'issue de la culture, on ajoute 0,2% de bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5- diphényltétrazolium (MTT) à raison de 50 4l/puits. On maintient une nouvelle fois la plaque à 37 C pendant 4 jours pour obtenir du formazane. Après avoir dissous le formazane dans du diméthylsulfoxyde, on mesure l'absorbance à 570 nm au moyen d'un lecteur de microplaques. On évalue la prolifération des fibroblastes en comparant l'absorbance avec celle du groupe témoin sans échantillon traité. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 1. Tableau 1 Conc. des Prép. 1 Prép. 4 GluCare S Conc. (%) Filtrat de éch. () la prép. 1 4 x10-7 5 5 0 1 x10-2 5 4 x10-6 6 5 0 1 x10-1 10 4 x 10-5 5 7 1 1 x 10 15 4 x10-4 6 7 3 1 x101 17 8x 10-4 15 16 5 1 102 14 4 x 10-3 34 28 7 4 x10-2 40 35 7 4 x10-1 38 34 5 Comme le montre le tableau 1, le traitement avec le GluCare S se traduit par une augmentation maximale de 7 % de la prolifération des fibroblastes. Par contre, le traitement avec le 6-1,3-glycane i-1l,6-ramifié isolé à partir de Schizophyllum commune Fr. donne une augmentation maximale de 40 %. Toutefois, le filtrat avant purification de f-1,3-glycane 8-l,6-ramifié (extrait de Schizophyllum commune Fr.) est moins efficace en ce qui concerne la prolifération des fibroblastes. Prolifération de kératinocytes On suit le même mode opératoire que celui décrit dans l'exemple expérimental 1 en utilisant des kératinocytes à la place des fibroblastes afin d'évaluer la prolifération des kératinocytes. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 2. Tableau 2 Conc. des Prép. 1 Prép. 4 GluCare S Conc. (%) Filtrat de éch.(%) la prép. 1 4 x 10-7 5 3 O 1 X 10-2 5 4 x10-6 5 3 0 1 x 10-1 10 4 x 10-5 7 5 1 1 x 10 0 13 4 x10-4 il11 10 3 1 x 101 8 8 x 10-4 19 15 10 1 x102 6 4 x 10-3 20 19 12 4 x 10-2 19 16 11 4 x10-1 18 15 8 Comme le montre le tableau 2, le traitement avec le GluCare S se traduit par une augmentation maximale de 12 % de la prolifération des kératinocytes. Par contre, le traitement avec le f-1,3-glycane 6-1,6-ramifié isolé de Schizophyllum commune Fr. donne une augmentation maximale de 20 %. Toutefois, le filtrat avant purification de 8-l,3-glycane 6-1,6-ramifié (extrait de Schizophyllum commune Fr.) est moins efficace en ce qui concerne la prolifération des kératinocytes. Biosynthèse du collagène des fibroblastes On cultive des fibroblastes sur une microplaque de 24 puits contenant le même milieu et traités avec les mêmes échantillons que dans l'exemple expérimental 1, pendant 3 jours. A l'issue de la culture, on ajoute à chaque puits 0,5 ml de DMEM et 10 pCi de L-[2,3,4,5- 3H]-proline. Au bout de 24 heures, on recueille le milieu et les cellules contenues dans chaque puits et on les lave avec de l'acide trichloracétique à 5 %, puis on les répartit dans deux tubes à essai. Dans l'un des tubes à essai, on ajoute 1 unité/pl de collagénase de type I et on maintient le tube à essai à 37 C pendant 90 minutes. On incube l'autre tube à essai à 4 C. Ensuite, on ajoute à chaque tube à essai 0,05 ml d'acide trichloracétique à 50 % et on les maintient à 4 C pendant 20 minutes. On centrifuge la solution ainsi obtenue à 12.000 tr/min pendant 10 minutes puis on mesure la décroissance par minute (dpm) du surnageant et du précipité au moyen d'un compteur de scintillations pour liquides. On calcule la biosynthèse relative de collagène (BRC) à l'aide de l'équation suivante: BRC = [dpm du collagène/{(collagène total - dpm du collagène) x 5,4 + dpm du collagène}] x 100. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 3. Tableau 3 Conc. des Prép. 1 Prép. 4 GluCare S Conc. (%) Filtrat de éch. (%) la prép. 1 4 x10-6 5 0 0 0 0 4 x10-5 S 5 5 1 x 10-2 0 4 x10-4 il 8 3 1 x 10-1 5 4 x 10-3 22 21 5 1 x 10 12 4 x 10-2 32 30 5 1 x 101 10 4 x 10-' 24 23 3 1 x 102 6 Comme le montre le tableau 3, le traitement avec le GluCare S se traduit par une augmentation maximale de % de la biosynthèse du collagène des fibroblastes. Par contre, le traitement avec le 6-1,3-glycane f-1,6- ramifié isolé de Schizophyllum commune Fr. donne une augmentation maximale de 32 %. Toutefois, le filtrat avant purification de 8- 1,3-glycane 8-1,6-ramifié (extrait de Schizophyllum commune Fr.) est moins efficace pour favoriser la biosynthèse du collagène. Effet de guérison de lésions cutanées dues à une exposition excessive au soleil On mesure la couleur de la peau au moyen d'un Chromameter CM2002 avant exposition à un rayonnement UV. On mesure la DEM sur le bras d'un volontaire au moyen d'un simulateur solaire puis on l'expose à un rayonnement UV produisant une DEM de 1,5 afin de provoquer un érythème. Six, 8, 10, 12, 16 et 24 heures après l'exposition, on applique au sujet 20 ul des mêmes échantillons (1 % de B-l,3-glycane B-l,6-ramifié et 100 % du filtrat) que dans l'exemple expérimental 1. On mesure la couleur de la peau avant et après traitement avec les échantillons au moyen du Chromameter CM2002. En affectant à la couleur de la peau avant exposition au rayonnement UV un indice de "100", on calcule la valeur relative sous la forme d'un "indice d'érythème" dont la signification statistique est vérifiée par le test d'Anova (p tableau 4. Tableau 4 (Unité: indice d'érythème) Heure Témoin (eau Préparation 1 GluCare S Filtrat de la distillée) préparation 1 O 100,00 100,00 100,00 100,00 16 197,85 163,60 193,51 180,65 24 193,58 155,01 189,32 178,28 48 174,98 135,87 165,25 160,56 Comme le montre le tableau 4, le traitement avec le GluCare S donne une efficacité maximale de 5,56 % pour guérison des lésions cutanées tandis que le traitement avec le,-1,3-glycane 6-1,6-ramifié isolé de Schizophyllum commune Fr. donne une efficacité de guérison maximale de 22,35 %. Toutefois, le filtrat avant purification de 8-1,3- glycane >-1,6-ramifié (extrait de Schizophyllum commune Fr.) est moins efficace pour guérir les lésions cutanées. Effet de blanchiment Sur le bras de dix volontaires sains de sexe masculin, on applique des rubans opaques percés de six trous de 1,5 cm de diamètre et on les expose à un rayonnement UV avec une lampe TL20W/09UV (Philips) et une lampe TL20W/12UV (Philips) à un niveau de 200 mJ/cm2. Deux semaines plus tard, on applique deux fois par jour pendant 2 mois au sujet 0,1 % du 8-l,3- glycane 8-1,6-ramifié de la préparation 4, 0,1 % de GluCare S et une dilution à 25 % du filtrat de la préparation 1 avant précipitation à l'alcool éthylique. Avant et après traitement avec les échantillons, on mesure la couleur de la peau à intervalles constants à l'aide du Chromameter CM2002. On calcule la différence de blancheur (AL) par rapport à la blancheur de la peau avant application des échantillons. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 5. Tableau 5 Durée Durée (Unité: AL) d'application de l'échantillon Témoin Prép. 4 GluCare S Filtrat de la (jours) préparation 1 0 0 0 0!0 0,25 0,95 0,31 0,61 0,50 2,15 0,52 1,50 1,00 2,65 1,35 2,00 1,74 3,52 2,12 2,54 2,37 4,2 2,75 2,90 2,93 4,71 3,20 3,35 Comme le montre le tableau 5, le B-1,3-glycane f- 1,6-ramifié isolé de Schizophyllum commune Fr. est le plus efficace pour améliorer le blanchiment de la peau. Amélioration des rides de la peau Afin d'évaluer l'aptitude de la composition contenant du B-1,3- glycane 6-1,6-ramifié à améliorer les rides de la peau, on réalise l'expérience suivante. Dix (10) volontaires sains âgés de 35 à 45 ans utilisent des crèmes nourrissantes de l'exemple 1 et de l'exemple comparatif 1. * Matériau (Unité: en poids) Exemple 1 Ex. comp. 1 /J-l, 3-glycane 4-l,6-ramifié de 0,1 l'exemple de préparation 1 Cire d'abeille 3,0 3,0 I Polysorbate 60 1,5 1,5 Huile de ricin durcie au PEG 60 2,0 2,0 Sesquioléate de sorbitane 0,5 0,5 Paraffine liquide 10,0 10,0 Squalane 5,0 5,0 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 5,0 Glycérine 5,0 5,0 Butylène glycol 3, 0 3,0 Propylène glycol 3,0 3,0 Triéthanolamine 0,2 0,2 Conservateur qsp qsp Pigment qsp qsp Parfum qsp qsp Eau distillée qsp 100 % qsp 100 % Sur le côté droit du visage, on applique les crèmes nourrissantes de l'exemple 1 et sur le côté gauche on applique les crèmes nourrissantes de l'exemple comparatif 1, pendant une durée de 3 mois. On évalue l'amélioration des rides de la peau en comparant les rides des pattes d'oie avant et après utilisation des crèmes. On prend une empreintes des rides des pattes d'oies et on les mesure à l'aide d'un système Visiometer (C+K) dans une pièce à température et humidité constantes contrôlée à une température de 24 C et une humidité relative de 40 %. On calcule l'amélioration des rides de la peau à l'aide de l'équation suivante: Amélioration des rides (A%) = {(Tdi - Tdo) / Tdo} x 100 (dans laquelle Tdi est la valeur des rides de la peau mesurée après utilisation des crèmes et Tdo est la valeur des rides de la peau mesurée avant utilisation des crèmes). Le résultat obtenu est une amélioration de 3,1 + 2,2 % pour le côté gauche du visage contre une amélioration de 15 4,1 % pour le côté droit du visage. Les compositions pour application externe contenant du,-l,3-glycane f-1,6-ramifié vont être illustrées plus en détail grâce aux formulations 1 à 9. Toutefois, il reste entendu que ces formulations sont données à titre purement illustratif et ne doivent pas être interprétées comme limitant la portée de la présente invention, qui est délimitée de manière adéquate par les revendications ci-jointes. (Formulation 1) Lotion pour la peau Matériaux % en poids 6-l,3-glycane 6-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 1 0,1 Glycérine 3,0 Butylène glycol 2,0 Propylène glycol 2,0 Polymère de carboxyvinyle 0,1 Ether nonylphénylique de PEG 12 0,2 Polysorbate 80 0,4 Ethanol 10,0 Triéthanolamine 0,1 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 2) Lait ("milk lotion") Matériaux % en poids 6-l,3-glycane 8-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 4 0,1 Squalane 5,0 Cire d'abeilles 4,0 Polysorbate 60 1,5 Sesquioléate de sorbitane 1,5 Paraffine liquide 0,5 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 3,0 Butylène glycol 3,0 Propylène glycol 3,0 Polymère de carboxyvinyle 0,1 Triéthanolamine 0,2 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 3) Crèmes nourrissantes Matériaux % en poids -l,3-glycane p-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 2 0,1 Cire d'abeilles 10,0 Polysorbate 60 1,5 Huile de ricin durcie au PEG 60 2, 0 Sesquioléate de sorbitane 0,5 Paraffine liquide 10,0 Squalane 5,0 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 5,0 Butylène glycol 3,0 Propylène glycol 3,0 Triéthanolamine 0,2 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 (Formulation 4) Crèmes de massage Matériaux en poids /-l,3-glycane 3-1,6- ramifié de l'exemple de prép. 3 0,1 Cire d'abeilles 10,0 Polysorbate 60 1,5 Huile de ricin durcie au PEG 60 2,0 Sesquioléate de sorbitane 0,8 Paraffine liquide 40,0 Squalane 5,0 Triglycéride caprylique/caprique 4,0 Glycérine 5,0 Butylène glycol 3,0 Propylène glycol 3,0 Triéthanolamine 0,2 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 5) Tampons Matériaux % en poids fi-1,3-glycane f-l,6-ramifié de l'exemple de prép. 1 0,1 Alcool polyvinylique 13,0 Carboxyméthylcellulose sodique 0,2 Glycérine 5,0 Allantoïne 0,1 Ethanol 6,0 Ether nonylphénylique de PEG 12 0,3 Polysorbate 60 0,3 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 6) Gel Matériaux % en poids 0-1,3- glycane f-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 4 0,1 Ethylène diamine acétate de sodium 0,05 Glycérine 5,0 Polymère de carboxyvinyle 0,3 Ethanol 5,0 Huile de ricin durcie au PEG 60 0, 5 Triéthanolamine 0,3 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 7) Pommade Matériaux % en poids 6-1,3-glycane /-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 4 0,1 Cire d'abeilles 10,0 Polysorbate 60 5,0 Huile de ricin durcie au PEG 60 2,0 Sesquioléate de sorbitane 0,5 Vaseline 5,0 Paraffine liquide 10,0 Squalane 5,0 Beurre de karité 3,0 Triglycéride caprylique/caprique 5,0 Glycérine 10,0 Propylène glycol 10,2 Triéthanolamine 0,2 Conservateur qsp Pigment qsp Parfum qsp Eau distillée qsp 100 % (Formulation 8) Pommade type gel Matériaux % en poids /-l,3-glycane 6-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 4 3,0 Acide polyacrylique (Carbopol 940) 1,5 Isopropanol 5,0 Hexylène glycol 25, 0 Triéthanolamine 1,7 Eau déminéralisée _ qsp 100 % (Formulation 9) timbre (Patch) Matériaux % en poids f-1,3-glycane 6-1,6-ramifié de l'exemple de prép. 4 0,1 Hexylène glycol 20,0 Diéthylamine 0,7 Acide polyacrylique (Carbopol 934P) 1,0 Sulfite de sodium 0,1 Laurate de polyoxyéthylène (E.O = 9) 1,0 Ether de cétyle et de stéaryle du 1,0 polyhydroxyéthylène (Cetomacrogol 1000) Huile de paraffine visqueuse 2,5 Ester caprylique / ester caprique (Cetiol LC) 2,5 Polyéthylène glycol 400 3,0 Eau déminéralisée qsp 100 % REVENDICATIONS 1. Procédé de culture en milieu liquide de Schizophyllum commune Fr. pour isoler le /-1,3-glycane 8-1,6-ramifié, comprenant les étapes consistant à: (1) préparer du mycélium de Schizophyllum commune Fr.; (2) cultiver le mycélium sur un milieu liquide à pH 4,0 à 8,5 comprenant de 1 à 10 % en poids de glucose, de 0,1 à 1 % en poids d'extrait de levure, de 0,05 à 0,5 % en poids de (NH4)2HPO4 ou de (NH4)2S04, de 0,05 à 0,5 % en poids de KH2PO4 et de 0,005 à 0,2 % en poids de MgSO4 7H20; (3) isoler le 6-l,3-glycane 6-1,6-ramifié à partir du milieu liquide; et (4) purifier le 8-l,3-glycane /-1,6-ramifié. 2. Procédé selon la revendication 1, comprenant en outre une étape consistant à ajouter du charbon actif dans ledit milieu liquide en une quantité de 0,1 à 5 % après 2 à 4 jours de culture et à poursuivre la culture pendant 1 à 4 jours supplémentaires. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit milieu liquide comprend de 1 à 3 % en poids de glucose, de 0,3 à 0,5 % en poids d'extrait de levure, de 0,05 à 0,5 % en poids de (NH4)2HPO4 ou de (NH4)2S04, de 0,05 à 0,5 % en poids de KH2PO4 et de 0,005 à 0,2 % en poids de MgSO4 7H20 et ce procédé comprend en outre une étape consistant à ajouter du glucose dans ledit milieu liquide en une quantité de 1 à 10 % après 3 à 5 jours de culture et à poursuivre la culture pendant 1 à 3 jours supplémentaires. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit milieu liquide comprend de 1 à 3 % en poids de glucose, de 0,3 à 0,5 % en poids d'extrait de levure, de 0,05 à 0,5 % en poids de (NH4)2HPO4 ou de (NH4)2SO4, de 0,05 à 0,5 % en poids de KH2PO4 et de 0,005 à 0,2 % en poids de MgSOq4 7H20 et le procédé comprend en outre l'étape consistant à ajouter à la fois de 0,1 à 5 % de charbon actif et de 1 à 10 % de glucose dans ledit milieu liquide après 3 à 5 jours de culture et à poursuivre la culture pendant 1 à 5 jours supplémentaires. 5. Composition pour application externe contenant du /- l,3-glycane f-l,6-ramifié obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 en une quantité de 0,00001 à 10 % en poids. 6. Composition selon la revendication 5, dans laquelle ladite composition possède une formulation cosmétique choisie dans le groupe comprenant une lotion pour la peau, un lait, une eau de toilette nourrissante, des crèmes de massage, des crèmes nourrissantes, des tampons et des gels. 7. Composition selon la revendication 5, dans laquelle ladite composition possède une formulation topique choisie dans le groupe comprenant une lotion, une pommade, un gel, une crème, un timbre ("patch") et un spray.