Brevet FR2782731A1 — publié le 20000303

La présente invention est relative à un procédé pour produire une enzyme glucoamylase thermophile et à l'enzyme ainsi obtenue. Dans l'industrie amidonnière, la transformation de l'amidon en sirop de glucose est traditionnellement réalisée en deux étapes enzymatiques. La première étape, dite étape de liquéfaction, est actuellement mise en #uvre en présence d'une a-amylase thermostable produite par Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, à une température d'environ 90 C et à un pH de 6. La seconde étape, dite étape de saccharification, utilise une glucoamylase ou une a-glucosidase et une pullulanase thermosensible à une température de 60 C et à un pH de 4,5. On connaît, par ailleurs, des micro-organismes thermophiles appartenant à la classe des archaebactéries qui sont doués d'activité amylolytique tels que : Pyrococcus furiosius, Pyrococcus woesei, Thermococcus profundus. De même on sait que la souche du genre Thermococcus hydrothermalis (CNCMI 1319) est douée d'une activité amylolytique. Les procédés de l'art antérieur présentent l'inconvénient majeur de comporter deux étapes mettant en oeuvre deux types d'enzymes. Quant aux micro-organismes doués d'activité amylolytique, ils sont de culture assez délicate, mais surtout la production d'enzyme est trop faible pour être industriellement rentable. Ainsi un des buts de la présente invention est-il de fournir un procédé pour préparer une enzyme glucoamylase qui puisse être utilisée dans l'industrie amidonnière pour transformer l'amidon en sirop de glucose en une seule étape, et ce de manière industrielle. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par un procédé est pour produire une enzyme glucoamylase thermophile qui est, selon la présente invention, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : a) on fait digérer l'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis par une enzyme de restriction ; b) on récupère les fragments obtenus par électroélution ; c) on ligature chacun des deux types de fragment (500-1500 pb et 1500-9000 pb) par les plasmides PYME 1 et PYME 2 ; d) on transforme une souche de levure Saccharomyces cerevisiae ; e) on fait croître les levures transformées sur un milieu tel que seules celles transformées par un plasmide contenant un gène codant pour une a-glucosidase se développent ; f) on récupère les cellules sélectionnées à l'étape e), on les cultive et on récupère l'enzyme glucoamylase excrétée. Avantageusement, on fait digérer les bandes entre 500 et 1500 pb par 0,2 U d'enzyme de restriction et les bandes 1500 à 9000 pb par 0,06 U de cette enzyme, ces bandes étant obtenues par électrophorèse de l'ADN chromosomique. De préférence, à l'étape c), on ligature dans les plasmides PYME1 et PYME2 coupés par l'enzyme de restriction Bam HI, en utilisant une ligase T4 DNA. Avantageusement, on cultive à l'étape e) les levures Saccharomyces cerevisiae sur un milieu YNB et maltose sans glucose. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif ? doit permettre à l'homme du métier de refaire la présente invention. Selon la première, étape, étape a), du présent procédé, on fait digérer 8 g d'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis (CNCM 1-1319) par de 0,2 à 0,06 U de l'enzyme de restriction Sau3A commercialisée par la société BOEHRINGER MANNHEIM. Les fragments d'ADN sont ensuite séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,8 % [poids/volume, Agarose 0,8 % ; tampon TBE : Tris borate 0,09 M ; acide éthylènediaminotétra-acétique (EDTA) 0,002 M (pH 8,2) ; d'éthidium 1 g/l; 80 V, 1 h]. Les bandes entre 500 et 1500 pb sont récupérées pour la digestion par 0,2 U et les bandes entre 1500 et 9000 pb sont récupérées pour la digestion par 0,06 U d'enzyme Sau3A. La récupération des fragments est effectuée par électroélution, étape b) : le morceau de gel d'agarose contenant l'ADN est placé dans une cupule. L'ensemble est soumis à une électrophorèse pendant une heure sous une tension de 100 V. Sous l'effet du courant, l'ADN sort de l'agarose et s'accumule au fond de la cupule où on le récupère. Chacun des deux types de fragments (500-1500 pb et 1500-9000 pb) sont ligaturés, étape c), dans 2 plasmides nommés PYME1 et PYME2 (Yao, Marmur, Solliti 1993) coupés par l'enzyme de restriction Bam HI. La ligation des fragments est réalisée en utilisant l'enzyme T4 DNA, ligase de la Société EUROGENTEC avec un rapport fragment/vecteur de 20. La ligation d'un fragment coupé par Sau3A dans un plasmide coupé par l'enzyme BamHI permet de restaurer le site BamHI. Ces deux plasmides sont identiques sauf pour l'orientation des sites de clonage inverse dans PYME2 par rapport à PYME1. Ce sont des plasmides navettes E. ColilSaccharomyces cerevisiae possédant le gène codant pour une résistance à l'ampicilline et un marqueur d'auxotrophie chez la levure : le gène ura 3 ; sont des plasmides d'expression. Quatre banques d'expression comptant 13.000 clones indépendants ont donc été ainsi construites. Chacune de ces banques a servi à la transformation, étape d), d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae TCY70 (Chow T 1987) (mal 1S : LEU3, ura3). Cette souche, dont le gène codant pour la maltase (mal IS) a été interrompu par le marqueur d'auxotrophie LEU2, est incapable de croître sur un milieu contenant du maltose comme seule source carbonée. Les cellules ont été transformées par la méthode à l'acétate de lithium décrite par Gietz et al, (1992). Lors de l'étape e), les cellules ont ensuite été cultivées en milieu YNB (Yeast Nitrogen Base) composé de Yeast Nitrogen base W/O Amino acids (6,7 g/l, société DIFCO) et de maltose glucose free (20 g/l, société ROQUETTE). Ainsi seules les cellules transformées avec un plasmide contenant un gène codant pour une aglucosidase pourront croître. Les plasmides contenus dans les cellules de levure TCY70 transformées poussant sur maltose sont extraits par la méthode décrite par Hoffmann et Winston (1987). Les cellules sont récupérées à partir de 5 ml de culture. Elles sont lavées avec 1 ml de tampon TE (Tris HCI 10mM ; pH8 ; EDTA 1 mM). Elles sont ensuite remises en suspension dans 0,1 ml de tampon TE, puis 0,2 ml de tampon de lyse sont additionnés (Triton X-100 2 % ; Sodium Dodécyl Sulfate 1 % ; NaCI0,1M TriHCI pH8 10mM ; EDTA 1 mM) ainsi que 0,2 ml de billes de verre de diamètre 0,4- 0,6 mm (SIGMA) et 0,2 ml de mélange phénol/chloroforme (1 :1 v/v). L'ensemble est agité sur vortex 2 minutes puis centrifugé (5 minutes ; 15. 000 g ; 4 C). La phase aqueuse est récupérée et un volume de chloroforme lui est ajouté pour éliminer les traces de phénol. Après une nouvelle centrifugation, la phase aqueuse est récupérée. Elle contient les plasmides des levures étudiées. La fraction contenant ces plasmides est utilisée pour transformer la couche E.coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithesburg, MD) par la méthode au CaCI2 (Cohen et al , 1972). Cela est nécessaire afin d'amplifier le nombre de plasmide qui est faible chez la levure. Les cellules E.coli transformées sont cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) additionné d'ampicilline (50 g/ml). Les plasmides contenus dans la bactérie sont extraits avec la méthode de Holmes et Quigley (1981). Une colonie de levure TCY70 poussant sur maltose a été étudiée. Le plasmide qu'elle contient possède un insert d'ADN génomique de 1970 pb (p41 F2). Ce plasmide p41 F2, lorsqu'il sert à transformer la souche TCY70, permet de nouveau la croissance sur maltose alors que la même transformation avec le plasmide PYME1 vide ne permet aucune croissance. L'insert de 1970 pb semblait donc posséder un gène codant pour une enzyme capable de dégrader le maltose en glucose utilisable par les cellules de levure. L'insert du plasmide p41F2 nommé AG1970 a été séquence (figure 1). Le séquençage a été réalisé avec un séquenceur automatique ABI modèle 377 (ABIPerkin Elmer) de la société EUROGENTEC (Seraing, Belgique). Dans ce fragment, une phase ouverte de lecture (ORF pour Open reading frames) de 579 nucléotides (figure 2) codant pour une protéine de 193 aa (figure 3) possède des homologies de séquence avec des glucoamylase, a-glucosidase, isomaltase. La séquence de cette protéine est différente de celle déterminée par séquençage de l'a-glucosidase déjà décrite dans la souche Thermococcus hydrothermalis (Legin, thèse de doctorat, 1997) (figure 4). Cette protéine est donc bien une nouvelle a-glucosidase. Les cellules de levure transformées par p41 F2 sont capables de croître sur milieu supplémenté en maltose, maltotriose, pullulane, amidon ou amylose comme seule source carbonée alors que la souche TCY70 transformée par le plasmide PYME vide en est incapable. La souche Saccharomyces cerevisiae transformée par le plasmide p41 F2, (étape f), a été cultivée en milieu YNB plus maltose. Le surnageant de culture a été récupéré par centrifugation (5. 000 g ; 10 minutes) et concentré 100 fois puis diafiltré avec du tampon citrate phosphate 100 mM pH 5,5 à l'aide d'une unité Amicon et d'une membrane de type YM ayant un seuil de coupure de 10 kDa (Amicon, France). Les levures récupérées par centrifugation puis reprises avec un centième de volume initial dans un tampon citrate phosphate 100 mM pH 5,5 sont broyées avec des billes de verre de diamètre 400-600 nm. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (10. 000 g pendant 30 minutes à 4 C) et le surnageant obtenu sert d'extrait cellulaire. Chacune des deux fractions a été utilisée pour mesurer l'activité enzymatique sur différents substrats à 80 C (température optimale de croissance de Thermococcus hydrothermalis). Les milieux réactionnels (200 NI) sont constitués successivement de 0,5 % de susbstrat (maltose ou maltotriose ou maltotétraose ou amidon ou amylose), de 10 l de solution enzymatique (extrait cellulaire ou surnageant concentré diafiltré) et de tampon citrate phosphate pH 5,5. Les incubations ont été de 15 minutes puis, après refroidissement dans la glace, soit les sucres réducteurs formés ont été dosés par la méthode à l'acide 3,5dinitrosalycylique (Bernfeld, 1955), soit le glucose formé a été dosé par la méthode enzymatique Trinder (Société SIGMA). Le calcul d'activité de l'enzyme a été réalisé en retranchant à l'essai d'hydrolyse réalisé les valeurs de deux essais témoins : un témoin enzyme (réaction réalisée sans substrat) et un témoin substrat (réaction réalisée sans solution enzymatique). Les résultats ont montré que l'enzyme produite est capable d'hydrolyser l'ensemble des substrats essayés et ce avec les deux solutions enzymatiques (extrait cellulaire et surnageant). Les résultats positifs de dosage du glucose formé montrent que le produit de dégradation est du glucose. L'action sur des substrats de tailles différentes montrent que cette enzyme est une glucoamylase. Le fait que l'activité enzymatique soit présente dans le surnageant de culture indique que l'enzyme est sécrétée. Cela permet donc, pour sa production à l'échelle industrielle, une récupération aisée de cette enzyme. De plus, l'enzyme est plus facile à purifier car il y a moins de protéines et d'activités enzymatiques indésirables dans le surnageant par rapport au milieu intracellulaire. L'étude des propriétés physico-chimiques de l'a-glucosidase a été faite et en paticulier l'acitivité en fonction du pH et de la température. Deux tampons ont été utilisés pour une gamme totale de pH allant de 2 à 9. Le tampon citrate-phosphate (acide citrique 0,05 ; de sodium dibasique 0,1 M) pour les pH allant de 2 à 7 et le tampon Tris-HCI (hydroxyméthyl aminométhane 0,2 M ; HCI 0,2 M) pour les pH de 7 à 9. Le mode opératoire est le même que celui utilisé pour les mesures d'activités en utilisant le maltose comme substrat. Les résultats ont montré que l'optimum de pH est compris entre 5,0 et 6,5 (figure 5). La température optimale a été déterminée comme précédemment à pH 5,5. Les milieux sont incubés à des températures variant de 30 C à 125 C. Ces expériences ont montré que l'activité maximale est obtenue pour des températures comprises entre 70 C et 95 C (figure 6). REVENDICATIONS 1. Procédé pour produire une enzyme glucoamylase thermophile, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes suivantes : a) on fait digérer l'ADN chromosomique de la souche Thermococcus hydrothermalis par une enzyme de restriction ; b) on récupère les fragments obtenus par électroélution ; c) on ligature chacun des deux types de fragment (500-1500 pb et 1500-9000 pb) dans les plasmides PYME 1 et PYME 2 ; d) on transforme une souche de levure Saccharomyces cerevisiae ; e) on fait croître les levures transformées sur un milieu tel que seules celles transformées par un plasmide contenant le gène codant pour une a-glucosidase se développent ; f) on récupère les cellules sélectionnées à l'étape e), on les cultive et on récupère l'enzyme glucoamylase excrétée. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on fait digérer les bandes entre 500 et 1500 pb par 0,2 U d'enzyme de restriction et les bandes 1500 à 9000 pb par 0,06 U de cette enzyme, ces bandes étant obtenues par électrophorèse de l'ADN chromosomique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'à l'étape c), on ligature par les plasmides PYME1 et PYME2 coupés par l'enzyme de restriction Bam HI, en utilisant une ligase T4 DNA. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on cultive à l'étape e) les levures Saccharomyces cerevisiae sur un milieu YNB et maltose sans glucose.