Brevet FR2781673A1 — publié le 20000204

Utilisation d'un glucuronane en tant qu'agent immunostimulant, procédé de préparation Domaine de l'invention La présente invention concerne une nouvelle utilisation, en tant qu'agent immunostimulant, d'un produit connu, à savoir un glucuronane à enchaînement P(l-4) selon la publication WO-A-93/18174. Elle concerne également un nouveau procédé de préparation d'un glucuronane à enchaînement P(l-4) selon ladite publication ayant un poids moléculaire moyen en poids (Mw) de 5000 à 60000 Da. Art antérieur Dans la publication WO-A-93/18174 précitée, on a décrit en tant que produits industriels des dérivés polymères de l'acide D-glucuronique à enchaînement P(l-4) qui sont utiles notamment en tant qu'agents gélifiants, épaississants, hydratants, stabilisants, chélatants et/ou floculants d'une part, et qui sont particulièrement intéressants en cosmétique, d'autre part, ces dérivés polymères étant choisis parmi (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement P(l-4) de formule dans laquelle n est un nombre tel que le poids moléculaire moyen en poids (Mw) soit compris entre environ 5000 et environ 700000 Da, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges. Selon le procédé de ladite publication WO-A-93/18174 précitée, on prépare un polysaccharide (PS) du type glucuronane de formule 1 partiellement acétylé suivant une technique comprenant : (i) la fermentation d'une souche de Rhizobium meliloti (autre nomenclature : Sinorlaizobium meliloti) NCIMB 40472 sur un milieu nutritif, (ii) la filtration du milieu de fermentation pour écarter les cellules de ladite souche et recueillir le filtrat, (iii) l'isolation d'un glucuronane de poids moléculaire moyen en poids élevé (PS ; 700000 Mu > 100000) par précipitation dudit filtrat au moyen (a) d'un alcool (notamment EtOH ou iPrOH) ou d'une cétone (notamment MeCOMe) ou (b) en milieu acide aqueux (pH 3), puis (iv) le cas échéant, l'hydrolyse en milieu acide ou par voie enzymatique dudit PS pour obtenir un oligosaccharide (OS ; 100000 > Mw # 5000). De l'article de G. de RUITER et al., Carbohydrate Polymers, 1992, 18, pages 1-7, on sait que des OS du type acide D-polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) et ayant un Mw compris entre 5500 et 10000 ont été obtenus à partir de moisissures appartenant à l'ordre des mucorales. On sait que les liposaccharides (LPS) peuvent stimuler dans les monocytes la production de cytokines. D'une manière générale, les PS et OS différents des LPS n'agissent pas en tant qu'agents immunostimulants. Cependant, de façon ponctuelle, on sait de l'article de M. OTTERLEI et al., J. Immunother. , 1991, 10 (No. 4), pages 286-291 que des alginates stimulent la production de TNF-a (facteur a de nécrose tumorale), 11-1(interleukine-1) et 11-6 (interleukine-6) par les monocytes, que des D-polyglucoses à enchaînement (3(1-3) et aminés stimulent la production de 11-1par les macrophages humains, et que des arabinogalactanes stimulent la sécrétion de TNF-a par les macrophages. Parmi les alginates, qui sont des PS ou OS constitués de séquences homopolymères d'acide mannuronique (M), de séquences homopolymères d'acide guluronique (G) et de séquences alternées d'acide mannuronique et d'acide guluronique (MG), ledit article de M. OTTERLEI et al. enseigne que ceux ayant une teneur élevée en acide mannuronique sont les plus actifs en ce qui concerne la production de TNF-a, 11-1et 11-6 par les monocytes. But de l'invention On se propose de fournir, selon un premier aspect de l'invention, une nouvelle solution technique, non décrite ni suggérée par l'art antérieur, pour résoudre le problème de la stimulation de la production de cytokines par les cellules. Selon un second aspect de l'invention, on se propose de fournir un nouveau procédé de préparation d'un OS du type D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) et ayant un Mw de 5000 à 60000 Da, qui donne des rendements supérieurs à ceux de l'hydrolyse selon ladite publication WO-A-93/18174 précitée. Objet de l'invention Selon la nouvelle solution technique de l'invention, l'on recommande une nouvelle utilisation d'un produit polysaccharidique, caractérisée en ce que l'on fait appel à un glucuronane choisi parmi (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement P(l-4) de formule dans laquelle n est un nombre tel que le poids moléculaire moyen en poids (Mw) soit compris entre environ 5000 et environ 700000 Da, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges, en tant que substance stimulant la production d'une cytokine, et destiné à la préparation d'un agent biologiquement ou thérapeutiquement immunostimulant, ledit glucuronane étant un oligosaccharide (OS ; 100000 > Mw 5000) ou un polysaccharide (PS ; 700000 Mw # 100000). Selon l'invention l'on recommande également un procédé de préparation d'un OS du type D-polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) et ayant un Mw de 5000 à 60000 Da, ledit procédé, qui comprend : (1 ) la fermentation d'une souche de Rhizobium meliloti (autre nomenclature : Sinorhizobium meliloti) NCIMB 40472 produi- sant exocellulairement un glucuronane qui est un PS du type D- polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) et ayant un Mw tel que 700000 Mw # 100000, (2 ) l'hydrolyse enzymatique dudit PS pour obtenir un glucuronane qui est un OS du type D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) et ayant un Mw de 5000 à 60000 Da, et (3 ) l'isolation dudit OS, étant caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique de l'étape (2 ) est effectuée dans le milieu de fermentation de l'étape (1 ) en présence des bactéries de la souche NCIMB 40472 intervenant en tant que source de glucuronane lyase. Abréviations Par commodité, les abréviations et acronymes suivants ont été utilisés dans le texte de la présente invention. Ac acétyle ANA alginate de A. nodosum contenant 46 % en poids d'unité acide a-L-guluronique (produit testé dans M. OTTERLEI et al.) Bu n-butyle dp degré de polymérisation Et éthyle EtO éthyloxy GL-1 glucuronane de formule I selon l'invention, où les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées et qui a un Mw de 200000 Da GL-2 glucuronane de formule I selon l'invention, où les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées et qui a un Mw de 350000 Da iBu isobutyle iBuO isobutyloxy iPr isopropyle iPrO isopropyloxy LPS lipopolysaccharide M2 milieu nutritif aqueux de production, préféré selon l'invention, contenant 1 g/1 d'extrait de levure, 1 g/1 de K2HPO4, 0,2 g/1 de MgSO4.7H,0 et 10 g/1 de glucose, fructose ou saccharose Me méthyle MeO méthyloxy Mw poids moléculaire moyen en poids NCIMB National Collection of Industrial and Marine Bacteria, (il s'agit d'un organisme britannique agréé pour le dépôt de souches) OS oligosaccharide Pr n-propyle PS polysaccharide RT température ambiante (15-25 C) sBu s. -butyle sBuO s.-butyloxy tBu t.-butyle tBuO t.-butyloxy Description détaillée de l'invention Les glucuronanes selon l'invention comprennent donc les acides polyglucuroniques de formule I, leurs esters, leurs éthers et leurs mélanges. Plus précisément, ledit glucuronane est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C,-C, - les esters des acides polyglucuroniques de formule I dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les esters des acides polyglucuroniques de formule 1 dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste acyle aliphatique en C2-C4, - les éthers des acides polyglucuroniques de formule 1 dans lesquels l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, - les éther-esters des acides polyglucuroniques de formule 1 dans lesquels (i) le reste OH d'au moins un groupe acide carboxylique COOH est remplacé par un reste alkoxy en C1-C4, et (ii) l'atome d'hydrogène d'au moins un groupe alcool OH est remplacé par un reste alkyle en C1-C4, et - leur mélanges. Les groupes alkoxy précités en C1-C4 peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes MeO, EtO, PrO, iPrO, BuO, iBuO, sBuO et tBuO. Les groupes alkyle précités en C1-C4 peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes Me, Et, Pr, iPr, Bu, iBu, sBu et tBu. Les groupes acyle aliphatiques en C2-C4 peuvent être à chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, ils comprennent les groupes Ac, COEt, COPr, COiPr. Le glucuronane préféré selon l'invention a un Mw de 100000 à 500000 Da (et mieux 200000 à 350000 Da) et est choisi parmi l'ensemble constitué par - les acides polyglucuroniques de formule I, et - leurs esters dans lesquels les fonctions alcool OH sont partiellement O-acétylées, chaque cycle acide glucuronique de la formule 1 compor- tant statistiquement jusqu'à 33 % en poids de groupes O-CO-CH3 (i.e. OAc) par rapport au poids du cycle unitaire acide glucuronique. Dans ce dernier cas, la fonction acétyloxy est localisée soit en position 2, soit en position 3, soit encore en positions 2 et 3 du cycle acide glucuronique. Bien entendu, il est possible d'éliminer ladite fonction acétyloxy. La désacétylation est réalisée (comme indiqué dans WO-A- 93/18174 précité) à un pH supérieur à 8,0 à RT (le pH supérieur à 8,0 étant obtenu au moyen d'une base forte notamment un hydroxyde de métal alcalin comme NaOH ou KOH). Ainsi, 7-8 heures à RT et à pH 11 suffisent pour désacétyler le composé polymère comportant jusqu'à 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids du cycle acide glucuronique. La souche qui convient pour la préparation exocellulaire des OS et PS utiles comme agents immunostimulants est la souche Rhizobium meliloti NCIMB 40472 visée dans WO-A-93/18174. Les glucuronanes utiles selon l'invention interviennent en tant qu'agents immunostimulants. Selon une première variante ils sont, d'un point de vue biologique, destinés à la préparation d'au moins une cytokine par une cellule productrice. La cellule productrice peut être une bactérie comportant un plasmide qui a été modifié pour comporter un vecteur d'expression codant pour une cytokine protéinique telle que TNF-a, 11-1 ou 11-6 ; dans ce cas l'amélioration du rendement de la production d'une telle cytokine par un glucuronane selon l'invention est faible. En revanche, quand la cellule productrice est une cellule eucaryote connue pour générer des cytokines, les rendements de production avec les glucuronanes sont nettement améliorés. Selon une seconde variante, les agents immunostimulants sont, d'un point de vue thérapeutique, particulièrement intéressants pour la production in vivo des cytokines que l'organisme ne fournit pas en quantité suffisante, d'une part, ou pour la production in vitro desdites cytokines devant être administrées aux patients, d'autre part. Les cellules productrices sont dans ce cas des cellules eucaryotes, notamment les monocytes, les macrophages, les cellules T, voire encore d'autres cellules souches. Ainsi, les glucuronanes selon l'invention sont utiles à la préparation de médicaments immunostimulants destinés à une utilisation en thérapeutique vis-à-vis des désordres liés à une insuffisance immunostimulatoire, notamment en cas d'inflammation. Parmi les cytokines, dont on veut favoriser la production à partir des cellules eucaryotes productrices, on peut citer notamment TNF-a, 11-1 et 11-6. Le procédé de préparation des OS selon l'invention comprend l'utilisation d'un ou plusieurs enzymes fournis par la souche NCIMB 40472 elle-même, le ou lesdits enzymes étant ou agissant en tant que glucuronane lyase. Ledit procédé comporte la conservation de ladite souche et la fragilisation de sa paroi pour profiter de la libération de ladite glucuronane lyase ou du produit enzymatique d'activité glucuronane lyasique lors de l'hydrolyse enzymatique. En pratique l'hydrolyse enzymatique est effectuée par incubation à pH 7, pendant 40 à 60 h, de préférence pendant 48 h, et à une température de 25-35 C, de préférence à 30 C. Selon un premier mode de réalisation, l'hydrolyse enzymatique comprend (i) l'acidification du milieu de fermentation jusqu'à pH 3, (ii) la neutralisation, au plus tard 0,30 h après l'acidification, du milieu résultant avec une base, de préférence un hydroxyde de métal alcalin tel que NaOH ou KOH à une concentration de 1M à 3M, puis (iii) l'incubation en régulant le pH à 7 par addition de ladite base à une concentration de 1M. Selon un second mode de réalisation l'hydrolyse enzymatique comprend (i) l'addition de Na2SO4 au milieu de fermentation, puis (ii) l'incubation en régulant le pH à 7 par addition d'une base, de préférence un hydroxyde de métal alcalin tel que NaOH ou KOH à une concentration de 1M. Le matériau de départ est le milieu de fermentation obtenu selon la préparation II de ladite publication WO-A-93/18174 précitée. Le procédé de l'invention offre l'avantage d'éviter l'isolation du PS, d'une part, et de fournir de meilleurs rendements en OS, d'autre part. L'isolation des OS obtenus selon le procédé de la présente invention est réalisée selon une méthode connue en soi, en particulier l'une de celles décrites dans ladite publication WO-A-93/18174 précitée. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation et de résultats d'essais d'immunostimulation. Bien entendu l'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration. Exemple 1 On part du milieu de fermentation obtenu à l'issue de la préparation II de WO-A-93/18174 qui comprend les PS produits de façon exocellulaire, les bactéries de la souche NCIMB 40472 et le milieu nutritif M2. On ajuste à pH 3 ledit milieu de fermentation au moyen d'acide sulfurique (H2SO4 de 0,1 à 1 M) que l'on ajoute par fraction pendant une durée totale supérieure ou égale à 0,08 h (de préférence pendant une durée totale de 0,10 à 0,20 h). On neutralise, au plus tard 0,30 h après l'acidification, le milieu résultant jusqu'à pH 7,0 au moyen de KOH (1M à 3M). On incube ensuite pendant 48 h à 30 C en ajustant le pH à 7,0 par addition de KOH 1M. Les OS obtenus qui ont un Mw de 5000 à 50000 Da peuvent être isolés comme indiqué dans ladite publication WO-A- 93/18174 précitée. Exemple 2 On part du milieu de fermentation obtenu à l'issue de la préparation II de WO-A-93/18174 qui comprend les PS produits de façon exocellulaire, les bactéries de la souche NCIMB 40472 et le milieu nutritif M2. On ajoute audit milieu de fermentation Na2SO4 (5 à 25 g/1). On incube ensuite pendant 48 h à 30 C en ajustant le pH à 7,0 par addition de KOH 1M. Les OS obtenus qui ont un Mw de 5000 à 50000 Da peuvent être isolés comme indiqué dans ladite publication WO-A-93/18174 précitée. Exemple 3 L'isolation des OS des exemples 1 et 2 ci-dessus est réalisée comme suit. Les bactéries de la souche NCIMB 40472 sont éliminées du milieu les contenant par filtration ou centrifugation selon les modalités opératoires décrites dans la préparation V de WO-A-93/18174. Les molécules de OS ayant un Mw compris entre 20000 et 50000 Da, d'une part, et les molécules de OS ayant un Mw compris entre 5000 et 20000 Da, d'autre part, sont purifiées et isolées par ultrafiltration sur membrane à seuil de coupure sélectif selon les modalités données dans la préparation IX de WO-A-93/18174. On obtient ainsi un rendement en masse d'environ 60 % pour les molécules de masse moyenne (Mw compris entre 20000 et 50000 Da) et d'environ 40 % pour les molécules de masse faible (Mw compris entre 5000 et 20000 Da). Une durée d'incubation prolongée (i. e. supérieure à 60 h) conduit à une augmentation du rendement en molécules de masse faible. Exemple 4 - Essais - Des essais de production de cytokines ont été mis en #uvre sur gel selon les modalités opératoires décrites dans l'article de M. OTTERLEI et al. précité, les cellules productrices étant des monocytes de sang humain. La production de cytokines (TNF-a, Il-1et 11-6) à partir de monocytes a été testée en présence de glucuronane selon l'invention, à savoir GL-1 (Mw de 200000 Da) et GL-2 (Mw de 350000 Da). Les résultats obtenus, comparés à la production des mêmes cytokines à partir de monocytes en présence d'alginate (ANA) ou de LPS connus pour avoir un effet sur la production desdites cytokines, mettent en évidence que : # GL-1 et GL-2 ont une activité supérieure à LPS et ANA, dans la production de 11-6 et TNF-a, et # GL-1 et GL-2 ont une activité comparable à ANA, dans la production de Il-1. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un produit polysaccharidique, caractérisée en ce que l'on fait appel à un glucuronane choisi parmi (a) les acides D-polyglucuroniques à enchaînement P(l-4) de formule dans laquelle n est un nombre tel que le poids moléculaire moyen en poids (Mw) soit compris entre environ 5000 et environ 700000 Da, (b) les esters correspondants, (c) les éthers correspondants, et (d) leurs mélanges, en tant que substance stimulant la production d'une cytokine, et destiné à la préparation d'un agent biologiquement ou thérapeutiquement immunostimulant, ledit glucuronane étant un oligosaccharide (OS ; 100000 > Mw bzz 5000) ou un polysaccharide (PS ; 700000 > Mw ;::= 100000). 2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit glucuronane est destiné à la préparation d'au moins une cytokine par une cellule eucaryote. 3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit glucuronane est destiné à la préparation d'un médicament immunostimulant. 4. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit glucuronane est un PS ayant un Mw compris entre 100000 et 500000 Da et mieux entre 200000 et 350000 Da. 5. Utilisation suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit glucuronane est un acide D-polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) selon la formule 1 où les groupes de la fonction alcool OH sont partiellement acétylés. 6. Utilisation suivant la revendication 5, caractérisée en ce que, dans ledit glucuronane de formule I, les atomes d'hydrogène des fonctions alcool OH sont partiellement remplacés par des groupes acétyle, ledit glucuronane comportant statistiquement jusqu'à 33 % en poids de groupe OAc par rapport au poids du cycle unitaire acide glucuronique. 7. Procédé de préparation d'un OS du type D-polyglucuronique à enchaînement (3(1-4) et ayant un Mw de 5000 à 60000 Da, ledit procédé, qui comprend : (1 ) la fermentation d'une souche de Rhizobium meliloti (autre nomenclature : Sinorhizobium meliloti) NCIMB 40472 produi- sant exocellulairement un glucuronane qui est un PS du type D-polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) et ayant un Mw tel que 700000 > Mw # 100000, (2 ) l'hydrolyse enzymatique dudit PS pour obtenir un glucuronane qui est un OS du type D-polyglucuronique à enchaînement ss(1-4) et ayant un Mw de 5000 à 60000 Da, et (3 ) l'isolation dudit OS, étant caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique de l'étape (2 ) est effectuée dans le milieu de fermentation de l'étape (1 ) en présence des bactéries de la souche NCIMB 40472 intervenant en tant que source de glucuronane lyase. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique est effectuée par incubation à pH 7, pendant 40 à 60 h, de préférence pendant 48 h, et à une température de 25-35 C, de préférence à 30 C. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisée en ce que l'hydrolyse enzymatique comprend (i) l'acidification du milieu de fermentation jusqu'à pH 3, (ii) la neutralisation, au plus tard 0,30 h après l'acidification, du milieu résultant avec une base, de préférence un hydroxyde de métal alcalin tel que NaOH ou KOH à une concentration de 1M à 3M, puis (iii) l'incubation en régulant le pH à 7 par addition de ladite base à une concentration de 1M. 10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'hydrolyse enzymatique comprend (i) l'addition de Na2SO4 au milieu de fermentation, puis (ii) l'incubation en régulant le pH à 7 par addition d'une base, de préférence un hydroxyde de métal alcalin tel que NaOH ou KOH à une concentration de 1M.