Brevet FR2781056A1 — publié le 20000114

L'invention concerne une bandelette de test pour la détection de substances, en immunochimie, après prélèvement d'échantillon par essuyage sur des surfaces, dans laquelle, entre une zone de distribution d'éluant 1, à une extrémité de la bandelette de test, et une zone de réaction 3, à l'extrémité opposée, se trouve une zone du conjugué 2, les zones se trouvant en liaison liquide les unes avec les autres, et dans laquelle un tronçon de la bandelette de test, dans la zone comprise entre la zone de distribution d'éluant 1 et la zone de réaction 3, sert à essuyer la surface et sert de zone de prélèvement d'échantillon 4. Par le document DE 44 39 429 C2, on connaît un procédé de détection de la contamination d'une surface par une substance à analyser, par essuyage de la substance à analyser sur la surface, avec une surface d'essuyage séparée de la bandelette de test, mise en contact de la surface d'essuyage et de la bandelette de test et, ensuite, distribution d'éluant, ces opérations étant suivies d'une réaction de liaison immunologique. Ce procédé connu et le dispositif qui lui est associé présentent l'inconvénient que, d'une part, il est nécessaire de disposer d'une surface d'essuyage séparée, pour prélever l'échantillon et que, d'autre part, un boîtier spécial, destiné à loger la bandelette de test et la surface d'essuyage est prévu pour leur mise en contact. En outre, la surface d'essuyage doit être mise en contact avec la bandelette de test à une pression minimale, sans pour cela entraver ou empêcher l'écoulement capillaire de liquide dans la bandelette de test. L'invention a donc pour but de fournir une bandelette de test de conception simple, qui soit adaptée au prélèvement sur des surfaces, par essuyage, sans que la surface d'essuyage soit une surface supplémentaire, séparée de la bandelette de test. Ce but est atteint grâce au fait qu'entre une zone de distribution d'éluant 1, à une extrémité de la bandelette de test, et une zone de réaction 3, à l'extrémité opposée, se trouve une zone du conjugué 2, les zones se trouvant en liaison liquide les unes avec les autres, et grâce au fait qu'un tronçon de la bandelette de test, dans la zone comprise entre la zone de distribution d'éluant 1 et la zone de réaction 3, sert à essuyer la surface et sert de zone de prélèvement d'échantillon 4. Ces dispositions présentent l'avantage essentiel que, d'une part, il n'est pas nécessaire de prévoir une surface d'essuyage séparée pour le prélèvement d'échantillon et que, d'autre part, un contact avec la bandelette de test n'est pas nécessaire, de sorte qu'on peut se passer d'un boîtier, pour loger et mettre en contact la surface d'essuyage et la bandelette de test. Avantageusement, la zone de distribution d'éluant 1 sert de zone de prélèvement d'échantillon 4, ou la zone de prélèvement d'échantillon 4 est placée entre la zone du conjugué 2 et la zone de réaction 3. Selon une forme préférée d'exécution, la bandelette de test est laminée sur une couche porteuse 5, et est éventuellement reliée à un support 6, de préférence rigide, qui ne recouvre pas la zone de prélèvement d'échantillon 4. L'invention concerne également un procédé de détection de substances au moyen d'une bandelette de test décrite ci-dessus, comprenant les étapes suivantes: a) la surface à analyser sur laquelle se trouve la substance à détecter est essuyée avec un tronçon de la bandelette de test, situé dans la zone comprenant la zone de distribution d'éluant 1 et la zone de réaction 3, b) un éluant liquide est répandu sur la zone de distribution d'éluant 1, de sorte que l'éluant liquide et la substance à détecter migrent en direction de la zone de réaction 3, c) la présence de la substance à détecter dans la zone de réaction 3 est mesurée sur la base d'une réaction de détection immunochimique. L'invention porte, en outre, sur l'utilisation d'une bandelette de test pour détecter des drogues, des substances toxiques de faible poids moléculaire, des protéines et/ou des substances allergènes, ou des substances présentes dans des liquides organiques d'êtres vivants. L'invention va maintenant être expliquée de façon plus détaillée à l'aide des figures, dans lesquelles: la figure 1 représente la structure de principe d'une bandelette de test destinée à la détection de substances, en immunochimie, la figure 2 représente une variante d'exécution d'une bandelette de test selon la figure 1, avec une zone de prélèvement d'échantillon (4), la figure 3 représente une variante d'exécution d'une bandelette de test selon la figure 1, la zone de prélèvement d'échantillon (4) et la zone de distribution d'éluant (1) étant identiques, la figure 4 représente une variante d'exécution d'une bandelette de test selon la figure 3, comportant une couche porteuse (5) laminée dessus, et la figure 5 est une variante d'exécution d'une bandelette de test selon la figure 3, comportant un support (6) rigide, lié à la bandelette de test. La bandelette de test, agissant par capillarité, selon le principe de la chromatographie, peut se présenter en une ou plusieurs parties et comprend, dans une forme d'exécution de base (voir figure 1), une zone de distribution d'éluant 1, une zone du conjugué 2 et une zone de réaction 3, qui se trouvent en liaison liquide les unes avec les autres. Après application dosée d'un éluant sur la zone de distribution d'éluant 1, des partenaires de liaison spécifiques marqués, qui se déposent dans la zone du conjugué 2, sont resolubilisés et arrivent, par capillarité, dans la zone de réaction 3. Dans la zone de réaction 3, la substance à analyser, c'est-à-dire la substance à détecter, qui est dissoute dans l'éluant, est détectée à l'aide d'une réaction de liaison spécifique, de préférence sous forme de réaction en phase solide. La zone de prélèvement d'échantillon 4, qui sert de surface d'essuyage fait, selon l'invention, partie intégrante de la bandelette de test. Dans ce cas, la zone de prélèvement d'échantillon 4 peut être identique à la zone de distribution d'éluant 1, à la zone du conjugué 2 ou à la zone de réaction 3, ou ne représenter qu'une partie de cette zone. Selon une forme d'exécution préférée, la zone de prélèvement d'échantillon 4 constitue un élément supplémentaire entre la zone du conjugué 2 et la zone de réaction 3 (voir figure 2). Dans ce cas, la zone de prélèvement d'échantillon 4 se trouve en liaison liquide avec la zone du conjugué 2 et la zone de réaction 3 qui lui fait suite. Après l'application de l'éluant sur la zone de distribution d'éluant 1, la substance à analyser, qui est concentrée dans la zone de prélèvement d'échantillon 4, du fait de l'opération d'essuyage, est dissoute dans l'éluant, du fait de l'écoulement de liquide par capillarité. La substance à analyser dissoute peut ainsi être détectée dans la zone de réaction, à l'aide du partenaire de liaison marqué. Selon une forme de réalisation préférée, la zone de prélèvement d'échantillon 4 est identique à la zone de distribution d'éluant 1 (voir figure 3). La substance à analyser, qui est concentrée dans la zone de prélèvement d'échantillon 4, du fait de l'opération d'essuyage, est dissoute dans l'éluant, après application de l'éluant sur la zone de distribution d'éluant 1, et est détectée dans la zone de réaction 3, à l'aide de partenaires de liaison marqués. La zone de prélèvement d'échantillon 4 peut être constituée dans tous les types de matériaux fibreux et/ou poreux, susceptibles de recevoir la substance à analyser lors d'une opération d'essuyage et qui présentent des propriétés de capillarité, comme, en particulier, les fibres de verre, la cellulose, les matières synthétiques ou la silice. On utilisera, de préférence, des matériaux dont le diamètre de pores est compris entre 0,1 im et 100 pm, et qui présentent un taux d'absorption d'eau linéaire de 1 mm/min à 20 cm/min. On préfère, en particulier, des matériaux caractérisés par un diamètre de pores compris entre 2 pm et 25 pm, et par un taux d'absorption d'eau linéaire situé entre 1 cm/min et 10 cm/min. L'épaisseur de couche du matériau peut varier entre 100 pm et 0,5 cm. Les fibres polyester et/ou les fibres de cellulose se sont avérées être des matériaux particulièrement adaptés. La superficie de la zone de prélèvement d'échantillon 4 est habituellement comprise entre 0,1 et 5 cm2. Les dimensions préférées de la zone de prélèvement d'échantillon 4 se situent entre 0,5 et 4 cm (longueur) et 0,25 et 1 cm (largeur). Comme éluant, on utilise, de préférence, de l'eau ou des solutions aqueuses tamponnées d'une valeur de pH comprise entre 4 et 12, qui peuvent contenir jusqu'à 50 % en volume d'un solvant organique. En outre, I'éluant peut contenir entre 0,01 et 10 % en volume de détergents ioniques et non-ioniques. Afin de faciliter l'opération d'essuyage pour l'utilisateur et afin d'empêcher que la bandelette de test ne soit endommagée lors de l'essuyage, la bandelette de test, selon une autre forme d'exécution, peut être laminée sur une couche porteuse 5 plane, rigide (voir figure 4). Ainsi, la bandelette peut être bien guidée manuellement, lors de l'essuyage, et ne se plie ou ne se casse pas. On préfère, en particulier, un support 6 de bandelette rigide, qui reçoit la bandelette de test de telle sorte que la zone de prélèvement d'échantillon 4 soit dégagée et non recouverte pas le support 6 (voir figure ). Ceci présente l'avantage que, lors de l'opération d'essuyage, seule la zone de prélèvement d'échantillon 4 vient en contact avec la surface sur laquelle il faut prélever l'échantillon, et que la bandelette de test est protégée des sollicitations mécaniques. Une fois l'échantillon prélevé, la bandelette de test peut être retirée du support 6, afin d'être analysée. On préfère, en particulier, une forme de réalisation dans laquelle le support 6 de bandelette de test est fabriqué en matériau transparent, dans la partie o se trouve la zone de réaction 3, ou présente un évidement de telle sorte que la réaction de détection puisse être détectée visuellement. Ceci présente l'avantage que la bandelette peut rester dans le support 6 lors de l'analyse. Il est possible d'incorporer, dans la bandelette de test, des récepteurs synthétiques et biologiques, comme des récepteurs à membrane, des enzymes et des anticorps. Les réactions de détection sur la base de l'action réciproque anticorps-antigènes sont bien connues de l'homme de l'art, en immunochromatographie ou en immunoconcentration. Dans ce cas, un partenaire de liaison spécifique est immobilisé dans la zone de réaction 3. Le couplage à la phase solide peut être par adsorption, ionique, covalent ou réalisé par fixation du partenaire de liaison spécifique à, par exemple, la protéine A, I'avidine ou des particules de latex. En fonction du format de détection immunochimique, la réaction en phase solide est constituée par la formation du complexe à partir du partenaire de liaison immobilisé, de la substance à détecter et du partenaire de liaison marqué (test bilatéral), ou du complexe à partir du partenaire de liaison immobilisé et du partenaire de liaison marqué (test compétitif). Comme partenaires de liaison, on utilise des anticorps, qui peuvent être monoclonaux ou polyclonaux, ou leurs fragments. Dans le test compétitif, outre les anticorps spécifiques ou leurs fragments, on utilise comme partenaire de liaison la substance à détecter, ou des dérivés de la substance à détecter, qui peuvent être couplés à des macromolécules. Dans le test compétitif, on préfère des formes d'exécution dans lesquelles le partenaire de liaison marqué est lié à travers une zone d'interception et dans lesquelles les partenaires de liaison marqués qui s'adsorbent sont indiqués. Ce principe est connu en chromatographie par adsorption. Les partenaires de liaison sont déposés dans la zone du conjugué 2. Comme substances de marquage, on peut utiliser des enzymes, des fluorogènes, des isotopes radioactifs ou des particules colorées comme composants donnant des signaux. Pour le procédé selon l'invention, il est particulièrement indiqué d'utiliser des marqueurs optiques directs, tels que des colloïdes métalliques ou des particules de latex colorées, ainsi que des fluorogènes. L'invention va maintenant être décrite, à titre d'exemple, pour le cas de la détection de traces de drogue sur des surfaces. Les bandelettes de test immunochromatographiques utilisées ici se basent sur le format compétitif et correspondent à la structure représentée à la figure 4. Les matériaux nécessaires pour fabriquer les bandelettes de test, ainsi que les anticorps spécifiques des drogues et les conjugués drogues/protéines peuvent se trouver dans le commerce et sont connus de l'homme de l'art. Pour constituer la zone de prélèvement d'échantillon 4 (servant simultanément de zone de distribution d'éluant 1), on a utilisé un tissu de fibres de polyester d'une longueur de 2 cm et de 0,5 cm de largeur. a) Préparation de la surface de l'échantillon Sur une plaque de verre, on a versé respectivement 10 pi1 d'une solution méthanolisée de drogue, en différentes concentrations. Le solvant a été amené à s'évaporer à température ambiante, ce qui a permis d'obtenir des surfaces d'une superficie d'environ 2 cm2, avec différentes quantités de drogue. b) Essuyage et détection des drogues La surface contaminée a été essuyée pendant 10 secondes, en exerçant une légère pression, avec la zone de prélèvement d'échantillon 4 de la bandelette de test immunochromatographique, spécifique de la substance à analyser concernée. Ensuite, la réaction immunochromatographique a été déclenchée en appliquant 150 Il de tampon au phosphate (80 mM, pH 7,6) sur la zone de distribution d'éluant 1. Au bout de 5 minutes, la réaction de coloration a été évaluée visuellement. Dans ce cas, I'intensité de coloration, dans la zone de réaction 3, est indirectement proportionnelle à la concentration de drogue. 7 Comme le montre le tableau ci-dessous, il a été possible, grâce au procédé de détection selon l'invention, de détecter des quantités très faibles de drogue. Type de drogue et quantité (ng) Réaction de coloration (évaluation visuelle) d-amphétaminesulfate (amphétamines) 62,5 16 + O ++ Alprazolame (Benzodiazépine) 62,5 0 ++ Morphine-3B-Glucoronide (Morphine- Métabolite) 31_ 8 + 0 ++ Benzoylecgonine (Cocaïne- Métabolite) + 0 ++ Légende - Pas de réaction de coloration (échantillon négatif) + Faible réaction de coloration (échantillon faiblement positif) + + Forte réaction de coloration (échantillon positif) L'invention peut aussi bien être utilisée pour détecter des drogues que des substances toxiques ou allergènes, des réactions de détection immunochimiques spécifiques entrant à chaque fois en jeu. Le prélèvement d'échantillons peut aussi bien être réalisé sur les surfaces d'objets que sur des êtres vivants, ce qui permet d'analyser également des substances présentes dans des liquides organiques ou des sécrétions. Revendications 1. Bandelette de test pour la détection de substances, en immunochimie, après prélèvement d'échantillon par essuyage sur des surfaces, présentant les caractéristiques suivantes: a) entre une zone de distribution d'éluant (1), à une extrémité de la bandelette de test, et une zone de réaction (3), à l'extrémité opposée, se trouve une zone du conjugué (2), les zones se trouvant en liaison liquide les unes avec les autres, b) un tronçon de la bandelette de test, dans la zone comprise entre la zone de distribution d'éluant (1) et la zone de réaction (3), sert à essuyer la surface et sert de zone de prélèvement d'échantillon (4). 2. Bandelette de test selon la revendication 1, caractérisée en ce que la zone de distribution d'éluant (1) sert de zone de prélèvement d'échantillon (4). 3. Bandelette de test selon la revendication 1, caractérisée en ce que la zone de prélèvement d'échantillon (4) est placée entre la zone du conjugué (2) et la zone de réaction (3). 4. Bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est laminée sur une couche porteuse (5). 5. Bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1, 2 ou 4, caractérisée en ce qu'elle est reliée à un support (6), de préférence rigide, qui ne recouvre pas la zone de prélèvement d'échantillon (4). 6. Procédé de détection de substances au moyen d'une bandelette de test, selon au moins l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes: a) la surface à analyser, sur laquelle se trouve la substance à détecter, est essuyée avec un tronçon de la bandelette de test, situé dans la zone comprenant la zone de distribution d'éluant (1) et la zone de réaction (3), b) un éluant liquide est répandu sur la zone de distribution d'éluant (1), de sorte que l'éluant liquide et la substance à détecter migrent en direction de la zone de réaction (3), c) la présence de la substance à détecter dans la zone de réaction (3) est mesurée sur la base d'une réaction de détection immunochimique. 7. Utilisation d'une bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1 à 5 pour détecter des drogues. 8. Utilisation d'une bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1 à 5 pour détecter des substances toxiques de faible poids moléculaire. 9. Utilisation d'une bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1 à 5 pour détecter des protéines et/ou des substances allergènes. 10. Utilisation d'une bandelette de test selon au moins l'une des revendications 1 à 5 pour détecter des substances présentes dans des liquides organiques d'êtres vivants.