Brevet FR2781356A1 — publié le 20000128

Procédé pour marquer les globules rouges au moyen d'un colorant fluorescent hydrosoluble La présente invention concerne un procédé pour marquer les globules rouges d'un échantillon de sang au moyen d'un colorant fluorescent hydrosoluble. La présente invention concerne également un procédé pour mesurer la vitesse et le débit du flux sanguin dans un vaisseau sanguin d'un patient, avec mise en ouvre du procédé selon le premier aspect de l'invention. On connait (voir Yang Y, Kim S, J Kim. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology 1997, 104;1670- 1676), un procédé pour marquer des globules blancs d'un échantillon de sang humain à la fluorescéine. On connaît également, d'après le même document, un procédé pour mesurer la vitesse du flux sanguin dans un vaisseau sanguin d'un patient, avec mise en oeuvre du procédé de marquage précité. Ainsi, le marquage à la fluorescéine et la réinjection de leucocytes autologues chez l'homme permettent une bonne visualisation des leucocytes marqués, au moyen d'un ophtalmoscope laser à balayage, dans les vaisseaux principaux de la rétine. On sait qu'un ophtalmoscope laser à balayage est un appareil de visualisation de la fluorescence de la rétine dont la longueur d'onde d'illumination correspond à la longueur d'onde d'excitation d'un colorant fluorescent prédéterminé, dans cet exemple la fluorescéine. L'ophtalmoscope émet un rayon laser de très courte durée, et observe la lumière réémise par fluorescence par les globules blancs marqués par ce colorant. En comparant deux images successives, on observe le défilement de chaque cellule marquée dans les vaisseaux rétiniens. Des mesures et calculs de vitesses cellulaires sont possibles. Aucun effet secondaire n'a été rapporté. Le procédé de marquage des leucocytes à la fluorescéine est simple: il suffit de séparer par centrifugation les leucocytes des autres constituants d'un échantillon de sang, et d'ajouter une solution de fluorescéine: les leucocytes absorbent cette solution et deviennent fluorescents. Ils peuvent alors être réinjectés dans le sang du patient. Toutefois, ce procédé est sans effet sur les globules rouges. En outre, les leucocytes peuvent dans certaines circonstances adhérer à la paroi des petits vaisseaux, et donc être ralentis, voire arrêtés pour un laps de temps variable, alors que les autres composants du sang poursuivent leur trajet. Par conséquent, la vélocité des leucocytes dans les petits vaisseaux peut ne pas refléter le flux sanguin réel. Il existe donc un besoin pour un procédé permettant de marquer également les globules rouges. Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients des procédés connus, et de proposer un procédé permettant de marquer les globules rouges d'un échantillon de sang au moyen d'un colorant fluorescent hydrosoluble. Suivant l'invention, le procédé du type précité est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on sépare les globules rouges des autres constituants dudit échantillon de sang; b) on dilue les globules rouges dans une solution diluée de chlorure de sodium en présence dudit colorant; c) on centrifuge cette solution; d) on élimine le surnageant pour recueillir les globules rouges marqués par ledit colorant. De façon surprenante, on obtient ainsi des globules rouges marqués par ledit colorant, ce qui ne pouvait pas être obtenu par le procédé selon l'art antérieur. On peut supposer que c'est le gradient osmolaire entre ladite solution diluée et l'intérieur des globules rouges qui permet le franchissement de la paroi de ces globules rouges par de l'eau chargée de fluorescéine dissoute et le transfert de fluorescéine à l'intérieur de ces derniers, ce qui n'était pas possible par contact direct. Suivant un autre aspect de l'invention, le procédé pour mesurer la vitesse du flux sanguin dans un vaisseau sanguin d'un patient, est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: A) on marque les globules rouges d'un échantillon de sang dudit patient par mise en ouvre du procédé selon le premier aspect de l'invention; B) on réinjecte les globules rouges ainsi marqués dans le sang dudit patient; C) on observe, au moyen d'un appareil laser à balayage du type ophtalmoscope permettant la visualisation de la fluorescence du tissu observé, la vitesse de défilement de chaque globule rouge dans ledit vaisseau. D'autres particularités et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée ci-après. Au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple non limitatif, la figure 1 est une courbe représentant l'évolution de la vitesse d'un globule rouge marqué selon le procédé de la présente invention et traversant la macula. Suivant la présente invention, le procédé pour marquer les globules rouges d'un échantillon de sang au moyen d'un colorant fluorescent hydrophile est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on sépare les globules rouges des autres constituants dudit échantillon de sang; b) on dilue les globules rouges dans une solution diluée de chlorure de sodium en présence dudit colorant; c) on centrifuge cette solution; d) on élimine le surnageant pour recueillir les globules rouges marqués ledit colorant. On utilise avantageusement, en guise de colorant, du fluorescéinate de sodium, qui est utilisé de façon routinière chez l'homme pour les angiographies rétiniennes classiques, et dont l'innocuité chez l'homme a été prouvée. Les inventeurs ont mis au point et mis en euvre le protocole expérimental suivant de marquage combiné des leucocytes et des globules rouges contenus dans un échantillon de sang humain. 1) Prélever 40 ml de sang total dans quatre tubes de 10 ml contenant chacun 1,5 ml de citrate acide de dextose formule A (ACD-A). 2) Sédimentation: le sang des tubes est transféré dans une seringue de 50 ml contenant 8 ml de Plasmagel (ROGER BELLON FRANCE). Bien homogénéiser et poser la seringue de façon à ce qu'elle soit inclinée de pendant 30 minutes, et verticale (piston en bas) pendant les 30 minutes suivantes, pour laisser le sang sédimenter. 3) Transfert du surnageant Maintenir la seringue verticale Adapter une tubulure sur l'extrémité de la seringue et pousser doucement le piston de la seringue en maintenant la seringue verticale pour recueillir tout le surnageant contenant les leucocytes en évitant le passage de globules rouges dans la tubulure. Prélever 5 ml au fond de la seringue contenant les globules rouges concentrés. Les placer dans un autre tube à centrifugation. 4) Marquage des leucocytes: Adjonction de 20% en volume d'une solution à 10% de fluorescéinate de sodium dans le tube contenant le surnageant. Centrifugation 5 minutes à 900 T/mm. Le surnageant est enlevé autant que possible, et la fluorescéine présente sur les parois du tube est lavée au chlorure de sodium. Eponger sur compresse les leucocytes. Puis les leucocytes sont doucement remis en suspension dans 2 ml de chlorure de sodium à 0,9% dans une seringue. 5) Marquage de globules rouges: 1 ml de fluorescéinate de sodium à 10% est mélangé à 5 ml de concentré de globules rouges, puis on ajoute 30 ml de chlorure de sodium à 0,9%. Homogénéiser doucement et laisser reposer 1 minute à température ambiante à l'abri de la lumière. Puis centrifugation à 900T/pendant 5 minutes. On évacue le surnageant. On aspire dans une seringue 2 ml de globules rouges ainsi marqués. Les leucocytes ainsi marqués ont été réinjectés dans le sang du patient correspondant en vue d'un examen de la circulation rétinienne au moyen d'un ophtalmoscope laser à balayage (HEIDELBERG RETINA ANGIOGRAPH, HEIDELBERG ENGINEERING, HEIDELBERG, ALLEMAGNE) centré sur la zone maculaire et dont la mise au point a été estimée satisfaisante lorsque les petits vaisseaux de la macula ont été clairement visibles. On a injecté les leucocytes marqués dans la veine saphène, et on a enregistré les images, à la cadence de vingt images par seconde environ, chaque fois qu'un leucocyte marqué apparaissait sur l'écran. Ceci a permis d'enregistrer le transit d'au moins un leucocyte marqué dans chaque veine principale de la rétine. Les globules rouges marqués ont été injectés au moins cinq minutes après la fin de l'expérience menée avec les leucocytes, et le même processus expérimental a été suivi pour cette seconde série d'essais. A la fin, on a injecté du fluorescéinate de sodium directement dans le sang du patient pour obtenir des images fixes des vaisseaux de la rétine en vue de mesurer leur diamètre intérieur. On a calculé la vitesse des cellules marquées en mesurant le déplacement de chaque cellule entre deux images consécutives, compte tenu de l'intervalle de temps séparant ces deux images. Si l'on admet que chaque vaisseau est parallèle à la rétine, que la vitesse d'une cellule marquée est équivalente à la vitesse moyenne du flux sanguin dans le vaisseau correspondant, et que la contribution des petits vaisseaux irriguant la rétine dans les environs immédiats du disque est négligeable, on peut mesurer le débit total du flux sanguin rétinien en ajoutant les débits estimés pour chacune des veines principales de la rétine. On a ainsi représenté à la figure 1 la variation de la vitesse d'un globule rouge marqué lors de son transit dans la zone maculaire, de l'artériole à la veinule, en portant en abscisse le numéro de l'image correspondante et en ordonnée la vitesse du globule mesurée depuis l'image précédente. Cette figure montre clairement le ralentissement du globule à l'approche du vaisseau capillaire, et son accélération ultérieure dans la veine. On a ainsi décrit un procédé de marquage de globules rouges utilisant uniquement des compositions qui peuvent être utilisés en toute sécurité en injection intraveineuse. Ce procédé est basé sur la diffusion passive d'un composé non toxique, le fluorescéinate de sodium. Alors que la membrane des globules rouges du sang n'est pas perméable à la fluorescéine dans les conditions normales, la présente invention montre que lorsqu'ils sont placés en milieu hyposmotique, des globules rouges accumulent de l'eau et des molécules hydrosolubles telles que de la fluorescéine. Lorsque ces globules sont revenus à une osmolarité normale, il reste dans ceux-ci suffisamment de fluorescéine pour permettre la visualisation de cette dernière, et donc des globules marqués, au moyen d'un ophtalmoscope laser à balayage. Des mesures en cytométrie de flux ont confirmé l'augmentation de la fluorescence individuelle des cellules marquées selon ce procédé. Ce procédé de marquage des globules rouges peut ainsi être mis en ouvre dans un procédé pour mesurer la vitesse et le débit de flux sanguin dans les vaisseaux principaux comme dans les capillaires. Ces procédés ont été décrits ci-dessus pour l'étude de l'hémodynamique rétinienne au moyen d'un ophtalmoscope laser à balayage permettant la visualisation de la fluorescence du fond de l'oeil. Ils sont utilisables ou transposables dans d'autres parties du corps présentant des vaisseaux visibles sensiblement parallèles à la surface absorbée, par exemple la conjonctive ou le lit inguéal, l'ophtalmoscope étant alors remplacé par un appareil du même type ayant la même fonction permettant la visualisation de la fluorescence du tissu en question, qui s'étend sensiblement perpendiculairement à l'axe de l'appareil d'observation. On a décrit ci-dessus le marquage à la fluorescéine des leucocytes et des globules rouges, ce qui oblige à réinjecter séparément ces deux types de cellules pour les visualiser séparément et indépendamment les uns des autres. On peut également utiliser un autre colorant, le vert d'indocyanine, en remplacement de la fluorescéine ou en combinaison avec elle, afin de pouvoir déterminer avec certitude la nature d'une cellule fluorescente vue dans un vaisseau. Dans un tel cas, les leucocytes seraient marqués par exemple à la fluorescéine, les globules rouges seraient marqués au vert d'indocyanine selon le procédé décrit ci-dessus, les deux types de cellules ainsi marquées seraient réinjectées en même temps pour être observées en même temps en utilisant deux longueurs d'onde d'excitation différentes projetées simultanément sur le fond de l'oeil. On pourrait également inverser les colorants, sachant que le vert d'indocyanine est plus difficilement soluble dans une solution dilué de chlorure de sodium que le fluorescéinate de sodium. Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation que l'on vient de décrire, et on peut apporter à ceux-ci de nombreux changements et modifications sans sortir du domaine de l'invention. On peut notamment appliquer les procédés ci- dessus aux animaux. On peut évidemment modifier les volumes, proportions, taux de dilution, vitesses et durées de centrifugation, décrits ci-dessus, qui sont classiques, en restant dans le domaine des chiffres admissibles par les cellules visées et par le patient concerné. On peut également utiliser d'autres colorants. REVENDICATIONS 1. Procédé pour marquer les globules rouges d'un échantillon de sang au moyen d'un colorant fluorescent hydrosoluble, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on sépare les globules rouges des autres constituants dudit échantillon de sang; b) on dilue les globules rouges dans une solution diluée de chlorure de sodium en présence dudit colorant; c) on centrifuge cette solution; - d) on élimine le surnageant pour recueillir les globules rouges marqués par ledit colorant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, en guise de colorant, du fluorescéinate de sodium. 3. Procédé selon la revendication 1 ou.2, caractérisé en ce qu'on utilise, en guise de colorant, du vert d'indocyanine. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lors de l'étape a), on recueille les constituants du sang autres que les globules rouges, on ajoute un colorant fluorescent, puis on centrifuge et on élimine le surnageant pour recueillir les leucocytes marqués par ledit colorant fluorescent. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on marque séparément les globules rouges et les leucocytes au moyen de fluorescéinate de sodium. 6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on marque séparément les globules rouges au moyen d'un colorant fluorescent par exemple le fluorescéinate de sodium et les leucocytes au moyen d'un autre colorant fluorescent, par exemple le vert d'indocyanine. 7. Utilisation pour mesurer la vitesse du flux sanguin dans un vaisseau sanguin d'un patient, d'un appareil laser à balayage du type ophtalmoscope permettant la visualisation de la fluorescence du tissu observé, notamment de la rétine, afin d'observer la vitesse de défilement dans ledit vaisseau de globules rouges marqués par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Utilisation selon la revendication 7 pour observer la vitesse de défilement de globules rouges et de leucocytes marqués par mise en ouvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, pour mesurer le débit du flux sanguin dans au moins un vaisseau sanguin d'un patient par calcul de ce débit à partir du diamètre intérieur dudit vaisseau et de la vitesse du flux sanguin dans ledit vaisseau.