Brevet FR2778921A1 — publié le 19991126

SOUCHES MUTANTES DE LACTOBACILLUS BULGARICUS DEPOURVUES D'ACTIVITE 3-GALACTOSIDASE. Ces souches et ferments peuvent être utilisés pour l'obtention de produits laitiers fermentés à partir de lait additionné de glucose. La présente Invention est relative à de nouveaux variants de bulgaricus et à leur utilisation pour la préparation de produits laitiers fermentés. Les yoghourts sont traditionnellement obtenus par fermentation du lait avec une association de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus. Au cours de la fermentation qui est effectuée à une température d'environ 40 à 45 C, ces bactéries utilisent principalement le lactose comme substrat énergétique, et produisent de l'acide lactique qui entraîne la coagulation du lait; lorsque le pH atteint une valeur d'environ 4,8 à 4,5, on met fin à cette étape de fermentation (également dénommée " acidification ") en refroidissant le produit. Celui-ci est ensuite maintenu au froid pendant la suite du processus de fabrication et de conditionnement, et jusqu'à sa consommation. Cependant, le refroidissement ne stoppe pas complètement la fermentation lactique; même lorsque le produit est maintenu à 4 C, on observe une augmentation progressive de son acidité au cours du temps. Ce phénomène, connu sous le nom de post- acidification, est responsable d'une dégradation des qualités organoleptiques du produit pendant sa conservation. La post-acidification résulte essentiellement de l'utilisation par les bactéries, et principalement par L. bulgaricus, du lactose restant dans le produit à l'issue de l'étape d'acidification contrôlée. Pour l'éviter, il a été proposé d'utiliser des souches de L. bulgaricus ne fermentant pas, ou très peu, le lactose. 2 2778921 Une des enzymes essentielles pour la fermentation du lactose est la J3-galactosidase, qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose. Il a donc été proposé, pour obtenir des souches non- postacidifiantes de L. bulgaricus, de produire des mutants artificiels, ou de sélectionner des mutants naturels, chez lesquels l'activité de cette enzyme était affectée. Par exemple, le Brevet EP 402 450 au nom de GENENCOR décrit l'obtention, par mutagénèse localisée du gène de la [3-galactosidase, de mutants conditionnels de L. bulgaricus, chez lesquels la P-galactosidase qui est active lors de la fermentation à 40 C, perd son activité à la température ou au pH correspondant aux conditions de conservation des produits laitiers fermentés. La Demande JP 90053437 décrit l'obtention d'un mutant artificiel de L. bulgaricus ayant complètement perdu la capacité de fermenter le lactose, et la sélection d'un mutant naturel, à capacité réduite de fermentation du lactose; ces mutants sont néanmoins capables, l'un comme l'autre, de se développer et d'acidifier normalement en présence de S. thermophilus, à condition que le milieu soit supplémenté en glucose. Les sous-cultures de ces mutants conservent leurs caractéristiques d'acidification, dans du lait dépourvu de glucose, après 10 repiquages. Le Brevet EP 0518 096, au nom de la SOCIETE DES PRODUITS NESTLE, propose d'utiliser pour la fabrication de yoghourt, des mutants faiblement postacidifiants de Lactobacillus bulgaricus préalablement sélectionnés sur le critère de la délétion d'un fragment du gène de la p-galactosidase. Le criblage et la caractérisation de ces mutants sont facilités, du fait que la présence de cette délétion peut être facilement vérifiés sur des profils de restriction. En outre, les délétions sont connues pour être des mutations irréversibles, ce qui permet d'obtenir facilement des souches mutantes stables à partir de la souche mère. Le Brevet EP 0518 096 décrit 2 types de mutants faiblement postacidifiants sélectionnés de la sorte. Les premiers ont une délétion touchant uniquement le gène de la P-galactosidase; lorsqu'ils sont associés à S. thermophilus et cultivés sur du lait, ils présentent, même en l'absence d'ajout de glucose, des propriétés de croissance et d'acidification comparables à celles de la souche sauvage dont ils sont issus. Les seconds présentent une délétion plus importante, s'étendant sur au moins lkb en aval du gène de la P-galactosidase; lorsqu'ils sont associés à S. thermophilus ils croissent plus lentement et acidifient beaucoup moins que la souche sauvage dont ils sont issus; l'ajout de glucose au milieu de culture n'a que peu d'influence sur leurs propriétés d'acldification et de post-acidification. Les mutants naturels chez lesquels la f-galactosidase est inactive sont beaucoup plus difficiles à sélectionner et à maintenir en cultures pures dans le cas de mutations ponctuelles que dans le cas de mutants de délétion; ceci s'explique par la probabilité plus faible qu'une mutation ponctuelle produise une protéine inactive, par la plus grande difficulté pour localiser et caractériser les mutations ponctuelles par des profils de restriction, et par le taux de réversion très important. La Demanderesse a maintenant trouvé d'autres mutants naturels de L. bulgaricus, ne portant pas de délétion dans le gène codant pour la [galactosidase, et présentant des caractéristiques technologiques avantageuses. Dans le cadre de la présente invention, un mutant non-sens, incapable d'assimiler le lactose, a été isolé à partir d'une culture d'un L. bulgaricus sauvage. Associé à S. thermophilus, en culture sur du lait, il croît et acidifie beaucoup plus lentement que la souche sauvage dont il est issu. En revanche, sa croissance et 4 2778921 son acidification sont quasi-normales lorsque le lait est supplémenté en glucose. La présente Invention a pour objet une souche mutante de L. bulgaricus dépourvue d'activité '[-galactosidase, caractérisée en ce qu'elle porte une mutation introduisant un codon non-sens dans l'une des séquences codantes de l'opéron lactose et en particulier celle codant pour la (3-galactosidase. Une souche de L. bulgaricus conforme à l'invention a été déposée selon le Traité de Budapest le 14 janvier 1998, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, à Paris, sous le numéro 1-1968. Cette souche présente les caractéristiques morphologiques et biochimiques suivantes: - Morphologie: Microorganisme Gram-positif, bacilles fins, pléomorphes, asporogènes, isolés ou en courtes chaînes, immobiles. - Métabolisme: homofermentaire, catalase (-) - Fermentation des sucres: D-glucose (+) D-fructose +), D-mannose (+), esculine (+). Les Inventeurs ont séquencé l'opéron lactose chez le mutant T-1968. La séquence correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1. Les séquences des produits de traduction (perméase et [-galactosidase) sont respectivement représentées sous les numéros SEQ ID NO:2 et SEQ ID N0:3 L'analyse de cette séquence fait apparaître deux mutations ponctuelles: l'une, au niveau du gène de la perméase (position 122 de la séquence SEQ ID NO:i), induit un changement d'acide aminé (Lys -> Asn); l'autre, au niveau du gène de la 3-galactosidase (position 4519 de la séquence SEQ ID NO:1), introduit un codon de terminaison. Bien que conservant ses sites actifs 2778921 (positions 464 et 531), la P-galactosidase produite par ce mutant est inactive. Les Inventeurs ont en outre constaté que cette mutation restait stable après plusieurs séries de repiquages sur un milieu de culture contenant du glucose. En revanche, sur un milieu de culture en absence de glucose, cette mutation non-sens réverte très rapidement à un taux d'environ 10 6 La présente invention englobe également des souches mutantes incapables d'assimiler le lactose, dérivées de la souche 1-1968. De telles souches peuvent par exemple être obtenues en induisant par mutagénèse dirigée, d'autres mutations dans l'opéron lactose de la souche 1-1968. La présente Invention a également pour objet un ferment lactique, en particulier un ferment du yoghourt, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de L. bulqaricus conforme à l'Invention telle que définie ci-dessus, de préférence associée à au moins une souche de S. thermophilus. Pour l'obtention d'un ferment conforme à l'invention, on peut utiliser n'importe quelle souche de S. thermophilus convenant pour la fabrication de yoghourt; le choix d'une ou plusieurs souches de S. thermophilus peut être effectué en fonction des caractéristiques additionnelles que l'on souhaite éventuellement conférer au produit fini. A titre d'exemple de souches de S. thermophilus pouvant être utilisées en association avec une souche de L. bulgaricus conforme à l'invention, on peut citer les souches suivantes, déposées auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, à Paris: - la souche déposée le 25 août 1994, sous le numéro 1-1470, et la souche déposée le 23 août 1995, sous G 2778921 le numéro 1-1620; ces 2 souches sont décrites dans la Demande Européenne publiée sous le numéro 96/06924; - les souches déposées le 30 décembre 1994, sous les numéros 1-1520 et 1-1521; ces 2 souches sont décrites dans la Demande Internationale PCT WO 96/20607: - la souche déposée le 24 octobre 1995 sous le numéro 1-1630; les caractéristiques de cette souche sont décrites dans la Demande Internationale PCT WO 96/01701. Ces souches peuvent être associées entre elles, ou avec une ou plusieurs autres souches industrielles de S. Lhermophilus. La ou les souche(s) de S. thermophilus sont associées avec la ou les souche(s) de L. bulgaricus conformes à l'invention de la même manière et dans les mêmes proportions que dans les ferments du yoghourt traditionnels; la population de bactéries L. bulgaricus conformes à l'invention peut par exemple représenter entre 10 et 90%, de préférence entre 20 et 50%, de la population bactérienne totale. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit laitier fermenté caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on fermente du lait à l'aide d'un ferment comprenant au moins une souche de L. bulgaricus conforme à l'Invention, en présence d'au moins un sucre assimilable par ladite souche; il peut s'agir notamment du fructose, du mannose, et de préférence, du glucose. Avantageusement ledit produit laitier fermenté est un yoghourt. Le procédé conforme à l'Invention est similaire aux procédés traditionnels de préparation du yoghourt en ce qui concerne les principales modalités de mise en oeuvre de l'étape d'acidification contrôlée; en particulier cette acidification est effectuée à une température comprise entre 20 et 45 C, et de préférence entre 30 et 45 C, et en " batch ", c'est à dire en une seule étape et en utilisant une seule cuve de fermentation. La durée de cette étape d'acidification contrôlée est généralement de l'ordre de 6 à 24 heures, et de préférence de l'ordre de 6 à 16 heures; elle est donc plus longue que dans le cas des procédés classiques de préparation de yoghourt (o elle est de 3 à 5 heures à 44 C). En effet, les souches de L. bulgaricus conformes à l'Invention, même associées à S. thermophilus, croissent et acidifient beaucoup plus lentement que les souches sauvages. En outre, la vitesse de croissance et d'acidification des souches de L. bulgaricus conformes à l'invention varie très significativement en fonction de la quantité de glucose ajoutée au lait. Cette propriété permet de contrôler leur croissance et leur acidification, par simple addition de la quantité souhaitée de glucose en début de fermentation. Les Inventeurs ont en outre observé que, lors de la mise en oeuvre de souches de L. bulgaricus ou de ferments conformes à l'Invention, l'acidification ralentit considérablement lorsque le pH atteint la zone de 4,8 à 4,5, (qui correspond à la zone de pH o l'on arrête l'acidification dans le cas d'un procédé traditionnel), et se stabilise, même si l'on maintient le lait à température de fermentation, à un pH plancher. La valeur de ce pH plancher dépend essentiellement de la quantité de glucose ajoutée. Cette propriété permet de réduire, voire d'éliminer la phase de refroidissement utilisée dans les procédés traditionnels de fabrication du yoghourt pour stopper la fermentation. Elle supprime en outre la nécessité de mesurer le pH pour déterminer le moment optimal d'arrêt de la fermentation; pour un ferment et une quantité de glucose ajouté déterminés, il est possible, sans risque de sur- acidification, d'arrêter la 8 2778921 fermentation au bout d'une durée donnée, calculée en fonction du temps nécessaire pour atteindre le pH plancher. Ceci permet de mieux contrôler la régularité du pH final et la texture du produit en fin de fermentation. Avantageusement, pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, et selon le degré d'acidification auquel on souhaite parvenir, la quantité de glucose ajoutée au lait préalablement à la fermentation est comprise entre 0,5 et 10 g/l, de préférence entre 0,5 et 5 g/l. Le produit fermenté obtenu de la sorte peut être conservé plusieurs heures à une température proche de la température de fermentation, sans baisse du pH, ce qui permet de supprimer les installations de stockage intermédiaire au froid et d'augmenter la capacité des cuves de fermentation. La mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention permet de réduire la postacidification dans les produits fermentés au cours de leur conservation à plus long terme. Le degré de postacidification peut varier selon la composition du ferment et la quantité de glucose utilisée. Cependant la postacidification est toujours nettement inférieure à celle observée dans le cas des yaourts obtenus avec les ferments et les procédés traditionnels. Par exemple, des expérimentations effectuées par les Inventeurs ont montré que dans les mêmes conditions de conservation (28 jours de conservation à C), le SpH (différence entre le pH à J0 et le pH à J28) était compris entre 0,05 et 0,4 dans le cas des produits obtenus à l'aide d'un ferment conforme à l'invention, alors qu'il était toujours supérieur à 0,7 dans le cas de ferments témoins dans lesquels la souche de L. bulgaricus conforme à l'invention était remplacée par une souche sauvage. Cette faible post-acidification s'accompagne d'une bonne survie des souches du ferment; la population de L. bulgaricus en fin de conservation, dans le produit fermenté obtenu conformément à l'invention n'est que légèrement inférieure à celle du produit témoin. La présente invention a également pour objet les produits laitiers fermentés susceptibles d'être obtenus en mettant en oeuvre un procédé conforme à 1 invention. Ces produits peuvent se conserver pendant plus longtemps et à température plus élevées que les produits obtenus par les procédés traditionnels, et possèdent des caractéristiques organoleptiques qui restent stables au cours de la conservation. EXEMPLE 1: DOSAGE BIOCHIMIQUE DE L'ACTIVITE BETA-GALACTOSIDASE D'UN MUTANT CONFORME A L'INVENTION. L'activité 3-galactosidase de la souche 1-1968 a été comparée à celle de la souche sauvage de L. bulgaricus (dénommée ci- après LbS) dont elle est issue. On cultive les bactéries pendant une nuit sur milieu MRS agar (MERCK) à 37 C, en jarre d'anaérobiose (MERCK) en présence d'un fixateur d'oxygène (AnaérocultA, MERCK). Une ose de 10 microlitres (NUNC) de bactéries est resuspendue dans 1 millilitre d'eau stérile. Les bactéries sont lysées par 2 cycles d'agitation forte, 20 secondes à 5000 rotations par minute en présence de microbilles de verre (0,5 mm de diamètre, BIOSPEC PRODUCTS), puis rajout de 0,15 ml de chloroforme. On agite l'ensemble pendant 30 minutes à 37 C, puis on complète à 2 ml avec de l'eau stérile à 4 C. L'activité bêta-galactosidase est alors mesurée: à partir de 0,2 ml de la suspension cellulaire on rajoute 1,2 ml de tampon NaH2PO4 0,067M; pH6,8; 0,05 ml de L-cystéine (SIGMA) à tO 0,05 ml de O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside 2778921 (SIGMA). La réaction enzymatique est arrêtée après 0, 2, ou 10 min. par 1 ml de tampon Na2CO3 10%, et on effectue une mesure de la DO à 400 nanomètres sur le surnageant, après centrifugation du milieu réactionnel. Les activités galactosidase de la souche-mère LbS et du mutant 1-1968 conforme à l'Invention mesurées en fonction du temps sont représentées sur la Figure 1. Ces résultats montrent que la f-galactosidase est totalement inactive chez le mutant conforme à l'Invention. EXEMPLE 2: STABILITE DU MUTANT 1-1968 DE L. BULGARICUS La stabilité du mutant 1-1968 a été testée dans des milieux contenant comme sources de carbone soit un mélange de glucose et de lactose, soit du lactose seulement. Une culture de 1-1968 obtenue sur milieu MRS contenant du glucose est mise en sous-culture sur du lait stérilisé additionné d'autolysat de levure (2g/l), et supplémenté ou non avec du glucose (20g/l) Lorsqu'un pH de 5,2 (coagulation du lait) est atteint, on prélève des échantillons de chaque sous-culture, sur lesquels on analyse la capacité des bactéries à fermenter les sucres, ainsi que la présence d'activité [-galactosidase (test sur plaque X-gal: colonies blanches = -galactosidase moins; colonies bleues = P-galactosidase plus). Les résultats sont illustrés par le Tableau I ci-dessous. il11 2778921 TABLEAU I Milieu Lait + glucose Lait (20g/1) Temps pour 6h00 20h00 atteindre pH 5.2 Fermentation des glucose, fructose, lactose, glucose, sucres mannose fructose, mannose % colonies Test sur plaque X- 100% Colonies blanches gal blanches 80% colonies bleues Ces résultats montrent qu'en présence de glucose, la souche 1-1968 ne réverte pas vers une souche capable d'utiliser le lactose. En revanche dans un milieu contenant du lactose comme seule source de carbone, on observe une réversion rapide de la souche 1-1968 vers l'état original. EXEMPLE 3: PROPRIETES D'ACIDIFICATION, DE POSTACIDIFICATION ET DE SURVIE DU VARIANT 1-1968 DE L. BULGARICUS EN SYMBIOSE AVEC S. THERMOPHILUS: CAS D'UN PROCEDE DE FABRICATION D'UN YOGHOURT FERME (FERMENTATION EN ETUVE VENTILEE) On prépare des ferments de yoghourt associant la souche 1-1968 conforme à l'Invention avec différentes souches industrielles de S. thermophilus (les souches de S. thermophilus utilisées sont dénommées ci-après ST1, ST2 et ST3). A titre de comparaison, on prépare des ferments associant la souche-mère LbS, et les mêmes souches de S. thermophilus. Pour la préparation des ferments, les souches sont ensemencées séparément à 1% sur la composition suivante: Composition pour 1 litre 135 g de poudre de lait écrémé 2 g d'autolysat de levure 920 ml d'eau distillée g de glucose (pour la souche 1-1968 uniquement) Hydratation: 10 min Pasteurisation: 30 min à 95 C Le lait est ensuite refroidi à 44 C et inoculé, puis incubé à 44 C jusqu'à obtention d'une acidité de 85 D (degrés Dornic) pour les streptocoques et de 80 D pour les lactobacilles. Les cultures sont ensuite réunies pour obtenir un ferment constitué à 80% de Streptococcus thermophilus et à 20% de Lactobacillus bulgaricus. Les ferments ainsi obtenus sont utilisés pour inoculer la préparation suivante: Composition pour 1 litre: 99% de lait 0, 1, ou 2 g/l de glucose Hydratation: 10 min Pasteurisation: 10 min à 95 C Le lait est ensuite refroidi à 44 C et inoculé à 1%. Pour chaque expérimentation, la composition du ferment et la quantité de glucose ajoutée sont indiquées dans le Tableau II ci-dessous:. 13 2778921 TABLEAU II Expérience Glucose g/I Souches Pourcentage 1 0 ST3 64 % ST2 16 % LbS 20 % 2 0 ST3 64 % ST2 16 % 1-1968 20 % 3 1 ST3 64 % ST2 16 % 1-1968 20 % 4 0 ST 1 80 % LbS 20 % 0 ST 1 80 % 1-1968 20 % 6 2 ST 1 80 % 1-1968 20 % Apres inoculation, le lait est réparti en ballons et incubé à une température de 44 C. Le profil d'acidification est suivi pendant l'incubation. Les produits sont décaillés à pH 4,6 par refroidissement en cellule froide (16 heures à 4 C). Les produits sont ensuite soumis à un test de conservation à 10 C. Dans ce test, on mesure le pH et l'acidité Dornic après 1, 14, 21 et 28 jours de conservation. Les résultats d'acidification (temps pour atteindre un pH de 4,6 et valeur du pH à 24h) sont présentés dans le tableau III ci- dessous TABLEAU III Expérience Temps pour Temps pour pH à 24h atteindre atteindre pH 4,6 (min) pH 4,5 (min) 1 215 236 3,67 2 550 778 4,33 3 416 507 4,26 4 225 241 3,67 660 >1500 4,54 6 390 465 4,35 Les résultats du test de conservation à 10 C (suivi du pH et de l'acidité Dornic), et de la survie 14 2778921 (populations de S. thermophilus et L. bulgaricus) à 28 jours sont présentés dans le tableau IV ci-dessous: TABLEAU IV Expérience Temps de pH Acidité Streptococcus Lactobacillus stockage Dornic thermophilus bulgaricus (jours) cellules/ml cellules/ml 1 1 4,41 101 7,25E+08 3,35E+08 1 14 3,98 140 ND ND 1 21 3,95 145 ND ND 1 28 3,9 148 7,35E+08 3,30E+08 2 1 4,5 93 5,60E+08 2,90E+07 2 14 4,23 110 ND ND 2 21 4,18 112 ND ND 2 28 4,19 114 5,65E+08 1,87E+07 3 1 4,49 96 6,90E+08 7,45E+07 3 14 4,14 115 ND ND 3 21 4,15 117 ND ND 3 28 4,15 120 8,65E+08 6,30E+07 4 1 4,39 105 6,30E+07 4,40E+08 4 14 3,91 145 ND ND 4 21 3,9 151 ND ND 4 28 3,85 157 4,70E+08 6,40E+08 1 4,6 85 9,05E+08 6,70E+07 14 4,58 80 ND ND 21 4,53 80 ND ND 28 4,61 79 9,40E+08 7,00E+07 6 1 4,51 89 1,05E+09 1,96E+08 6 14 4,38 90 ND ND 6 21 4,39 96 ND ND 6 28 4,42 90 1,62E+09 1,91 E+08 ND: Non Déterminé Ces résultats montrent que les yoghourts réalisés avec les symbioses associant la souche 1-1968 à une ou deux souches de S. thermophilus présentent une postacidification extrêmement réduite par rapport aux mêmes symbioses avec la souche-mère LbS, tout en conservant une population abondante en fin de fermentation et une bonne survie pendant 28 jours à 10 C. L'arrêt de l'acidification et le maintien du pH aux alentours de 4,6 à 4, 5 pendant au moins 24 heures à 44 C permet dans le cadre de la fabrication de yoghourt brassé, de réduire, voire d'éliminer la phase de refroidissement en cuve qui est habituellement mise en oeuvre. 2778921 LISTE DE SEQUENCES NOMBRE DE SEQUENCES: 3 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5059 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:122..1873 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1877..4519 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GCTTGTCTCA CGCTTGTCGT ACGCGGCCGG TGCCTTTGGC AACGACGTCT TCTACGCGAC 60 TCTGTCAACC TACTTTATCG TCTTCGTCAC CACCCACCTC TTTAATGCCG GTGACCACAA 120 G ATG ATC TTT ATC ATC ACC AAC TTG ATC ACC GCC ATC CGG ATC GGG 166 Met Ile Phe Ile Ile Thr Asn Leu Ile Thr Ala Ile Arg Ile Gly 1 5 10 15 GAA GTC CTG CTC GAC CCC TTG ATC GGT AAC GCC ATC GAC CGG ACC GAA 214 Glu Val Leu Leu Asp Pro Leu Ile Gly Asn Ala Ile Asp Arg Thr Glu 25 30 AGC CGG TGG GGG AAG TTC AAG CCC TGG GTT GTG GGC GGG GGG ATC ATC 262 Ser Arg Trp Gly Lys Phe Lys Pro Trp Val Val Gly Gly Gly Ile Ile 40 45 AGC TCA TTA GCC CTC TTA GCC CTC TTT ACC GAC TTT GGC GGC ATT AAC 310 Ser Ser Leu Ala Leu Leu Ala Leu Phe Thr Asp Phe Gly Gly Ile Asn 55 60 CAA AGC AAC CCC GTT GTT TAC TTA GTA ATC TTC GGT ATT GTT TAC TTG 358 Gln Ser Asn Pro Val Val Tyr Leu Val Ile Phe Gly Ile Val Tyr Leu 70 75 ATT ATG GAT ATC TTC TAC TCA TTT AAA GAC ACT GGC TTC TGG GCC ATG 406 Ile Met Asp Ile Phe Tyr Ser Phe Lys Asp Thr Gly Phe Trp Ala Met 85 90 95 ATC CCG GCC TTG TCC CTG GAT TCC CGG GAA AGA GAG AAG ACC TCC ACC 454 Ile Pro Ala Leu Ser Leu Asp Ser Arg Glu Arg Glu Lys Thr Ser Thr 105 110 16 2778921 TTC GCC AGA GTC GGC TCC ACC ATC GGG CCC AAC CTG GTC GGG GTA GTC 502 Phe Ala Arg Val Gly Ser Thr lie Gly Ala Asn Leu Val Gly Val Val 120 125 ATC ACC CCA ATC ATC CTC TTC TTC TCG GCC AGC AAG GCC AAC CCC AAC 550 Ile Thr Pro Ile Ile Leu Phe Phe Ser Ala Ser Lys Ala Asn Pro Asn 135 140 GGG GAT AAG CAG GGC TGG TTC TTC TTT GCC TTG ATC GTG GCC ATT GTC 598 Gly Asp Lys Gln Cly Trp Phe Phe Phe Ala Leu Ile Val Ala Ile Val 150 155 GGC ATC TTG ACC TCA ATT ACC GTT GGT CTT GGT ACT CAC GAA GTA AAA 646 Gly Ile Leu Thr Ser Ile Thr Val Gly Leu Gly Thr His Glu Val Lys 165 170 175 TCC GCC CTG CGG GAA AGC AAT GAA AAG ACC ACT TTG AAG CAG GTC TTT 694 Ser Ala Leu Arg Glu Ser Asn Glu Lys Thr Thr Leu Lys Gln Val Phe 185 190 AAG GTC CTG GGG CAA AAC GAC CAG CTC CTC TGG CTG GCC TTT GCC TAC 742 Lys Val Leu Gly Gln Asn Asp Gin Leu Leu Trp Leu Ala Phe Ala Tyr 200 205 TGG TTT TAC GGC CTG GGT ATC AAC ACC CTG AAC GCT CTG CAA CTT TAC 790 Trp Phe Tyr Gly Leu Gly Ile Asn Thr Leu Asn Ala Leu Gln Leu Tyr 210 215 220 TAC TTC TCA TAC ATC TTA GGC GAT CCC CGC GGC TAC AGC CTG CTT TAC 838 Tyr Phe Ser Tyr Ile Leu Gly Asp Ala Arg Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr 225 230 235 ACC ATC AAC ACC TTT GTC GGT TTA ATC TCT GCA TCC TTC TTC CCA TCA 886 Thr Ile Asn Thr Phe Val Gly Leu Ile Ser Ala Ser Phe Phe Pro Ser 240 245 250 255 CTG GCC AAG AAG TTC AAC AGA AAT CGC CTC TTC TAC GCC TGC ATC GCG 934 * Leu Ala Lys Lys Phe Asn Ar-g Asn Arg Leu Phe Tyr Ala Cys Ile Ala 260 265 270 GTG ATG CTG TTA GGG ATC GGG GTC TTC TCC GTG GCC AGC GGT TCT CTG 982 Val Met Leu Leu Gly Ile Gly Val Phe Ser Val Ala Ser Gly Ser Leu 275 280 285 GCC CTG TCC CTT GTT GGG GCA GAA TTC TTC TTT ATT CCG CAG CCT CTG 1030 Ala Leu Ser Leu Val Gly Ala Glu Phe Phe Phe Ile Pro Gln Pro Leu 290 295 300 GCC TTC CTG GTC GTT TTG ATG ATC ATC TCT GAC GCT GTT GAA TAC GGC 1078 Ala Phe Leu Val Val Leu Met Ile Ile Ser Asp Ala Val Glu Tyr Gly 305 310 315 CAG CTG AAA ACT GGC CAC AGA GAC GAA GCT TTG ACC CTG TCT GTC CGG 1126 Gin Leu Lys Thr Gly His Arg Asp Glu Ala Leu Thr Leu Ser Val Arg 320 325 330 335 17 2778921 CCA TTG GTC GAT AAG CTG GGC GGG GCC TTG TCC AAC TGG TTT GTT TCC 1174 Pro Leu Val Asp Lys Leu Giy Gly Ala Leu Ser Asn Trp Phe Val Ser 340 345 350 TTG ATT GCC TTA ACT GCC GGC ATG ACC ACT GGG GCG ACT GCC TCA ACA 1222 Leu Ile Ala Leu Thr Ala Gly Met Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ser Thr 355 360 365 ATT ACA GCT CAT GGC CAG ATG GTC TTC AAG TTA GCT ATG TTT GCC TTA 1270 Ile Thr Ala His Gly Gln Met Val Phe Lys Leu Ala Met Phe Ala Leu 370 375 380 CCG GCA GTC ATG CTC TTG ATC GCT GTT TCT ATT TTC GCC AAA AAG GTC 1318 Pro Ala Val Met Leu Leu Ile Ala Val Ser Ile Phe Ala Lys Lys Val 385 390 395 TTC TTG ACT GAA GAA AAG CAC GCG GAA ATC GTC GAC CAG CTG GAA ACT 1366 Phe Leu Thr Glu Glu Lys His Ala Glu Ile Val Asp Gln Leu Glu Thr 400 405 410 415 CAA TTC AGC CAA AGC CAT GCC CAA AAG CCG GCG CAA GCT GAA AGC TTC 1414 Gin Phe Ser Gln Ser His Ala Gln Lys Pro Ala Gln Ala Glu Ser Phe 420 425 430 ACT TTG GCC AGC CCA GTC TCC GGA CAA TTA ATG AAC CTG GAC ATG GTT 1462 Thr Leu Ala Ser Pro Val Ser Gly Gln Leu Met Asn Leu Asp Met Val 435 440 445 GAC GAC CCG GTC TTT GCC GAC AAA AAG TTA GGC GAC GGC TTT GCC CTG 1510 Asp Asp Pro Val Phe Ala Asp Lys Lys Leu Gly Asp Gly Phe Ala Leu 450 455 460 GTG 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CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu 1 5 10 15 Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro 25 30 Z0Iiú 50ú IeA nlD neq naq f aS AID eIV UTS IAL na 'IA naJ q 6BV IPA U{O iAú 00ú 56Z 06Z neq usv o0d sAq nID PIV iaS di. l eI l leA O2d n@q dsV eIV naq S8Z 08Z SLZ IqIL qd nid naq UlD nlD as 6zV ajI oId AID nGq sAq nhi eu leA OLZ S9Z 09Z naq dsv AID nlD ieS dsv EiV leA n ao nq sAq aqd 2@S eIV us Old ssz 0 qE t nGq 61V jAL eIV alI usJ eIV nTD leA nTED nq s/q i D s/q uID uZL 0tZ SZ 0 úZ SZZ us dsv iL4 naq.iS eIV iLqi naq s/q naq dsv nhD naq SiH naq 6B OZE SIZ 0IE Old s/q eTV UID na q 1L1 A i@s 6 aiqd naq /i î S]s N 6 a d:i SOZ OOZ 561 qId ds uID dsv niD naq d. 1as Ppv 2as Jas Xi s/q AiL naq eiV 061 581 081 1eA eIV naq 64us us us nID sAq sAq naq aqd s/q iiL TeA N a4qd SLI OLI S91 nID jS oid -iqL aa ias dsv nID XID ' L /1D TeA Iv d SIH /ID usv 091 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Gqd us5 Ia/ 0-d /TO uID ID usv nTd l T 09 5 0s d: ds aII naq djL ds XiD dsv naq aS ulD IA naq -'s qaS s/J AID ni n nGq n fl nIaD ulD iS ulo Tqd iS nl1 sTH dsv ias siH uI /1 dsv s-q îeA nID n@q s/q naq usv elV iaL naI eîI s/q TeA 909 009 96S us el neq s/q O2d -iS nloD iqL 6-z dsv eIV ald TeA neq ID us 069 s8s 085 XID s/D Gqd nID I/j dsV:qL Ozd 6i dsv dsv aqd dsv /ID XID Xij SLS OLS 99S naq naq sTH /I dsv s/q nhD naq JI UID ds- 9II diL dsy dlj aIj 09 SSS OSS0 SfS G4d /ID AID UI9 XL STH Oid I/j s/q nhd nea eI p qL j ei/ IV eIV OS SEú5 OCES naq ds XID IeA IaS Us XID q@N eV SiH eI iiL niD IeA ias;I SZS OS ss15 aqd Oid sAq eIV oid sAq usV itq naq iZL niD niD GII IeA s/q elv 019 SOS 00S oid eI i/j qaw 6iv iaS nID alI uID îqj eI ds ds aud sAXq 6f 96f 06f 98f us SH I IA I I STH IAI n i SH uID leA 6w aqil old dsv eIV sq 08b SLf OLf S99 6IV TeA /Lj ds eIV;aw UID ev -qd IeA Jqú AIE 1 i V L i/j iS nID 09f Ssf OS9 usv XID naq iS d.l alI neq alI aS elV STH usv s/q ds' 6 j V 9W qW usV s/q i'A 6L ias naq ias v AID naq dúL sTH UID dsv 0úE S E 0 t dsv AID ozd IeA usV aqa iaS Oid dsv nl STH /10 AID îeA s/q niD 51f 01f 901' dIL qLI AID SIH i@S nID nGq ust eI nTD dsv a[I îeA il/ naq AID o0t 96E 06E 98E i/j s/q dsv soD n@q 1 v i/j aGd naq iaS uol us Oid i/j STH aS 08ú SL8 OAL s/D 6Lv IeA er1 usv GII usv i@s 6L s/q:aW iql s/q 9II ds dil 99E 09ú SSú aII GN dsv nID nlD iqi aII p v 6Li AID naq s/q îas ds aqd nhi ú S t 0 t,ú STH Liv usv eVu AID s/q qd IeA eli 6iv ulD 1ID usv neq i/AL aw Súú 0úú SZú aDI /I1 dsv sAq u q nl qd us D d us LI M n D ulD 6II i 3îS 9LLZ gz 27 2778921 610 615 620 Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr 625 630 635 640 Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg 645 650 655 Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu 660 665 670 Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val 675 680 685 Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr 690 695 700 Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro 705 710 715 720 Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys 725 730 735 Gly Asn Asn Phe Glin ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val 740 745 750 Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe 755 760 765 Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly 770 775 780 Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys 785 790 795 800 Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala 805 810 815 Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu 820 825 830 Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala 835 840 845 Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro 850 855 860 Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser 865 870 875 880 28 2778921 REVENDICATIONS 1) Souche mutante de L. bulgaricus dépourvue d'activité P-galactosidase, caractérisée en ce qu'elle porte une mutation non-sens, dans au moins l'une des séquences codantes de l'opéron lactose 2) Souche mutante de L. bulgaricus selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence codante est la séquence codant pour la 3-galactosidase. 3) Souche mutante de L. bulgaricus selon une quelconque des revendications 1 ou 2, déposée le 14 janvier 1998, auprès de la CNCM sous le numéro 1-1968. 4) Ferment lactique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de L. bulgaricus selon une quelconque des revendications 1 à 3. ) Ferment lactique selon la revendication 4 caractérisé en ce que ladite souche de L. bulgaricus est associée à au moins une souche de S. thermophilus. 6) Procédé de préparation d'un produit laitier fermenté, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on fermente du lait à l'aide d'un ferment lactique comprenant au moins une souche de L. bulgaricus selon une quelconque des revendications 1 à 3, en présence d'au moins un sucre assimilable par ladite souche 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit sucre assimilable est le glucose. 8) Procédé selon une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'arrêt de la fermentation s'effectue sans refroidissement dudit produit laitier. 9) Produit laitier fermenté susceptible d'être obtenu par un procédé selon une quelconque des revendications 6 à 8. À,noq6of un zsa,Tnpoid ?P;l Gnb GD Uz3 u ST3DT '6 UOTOjDTpUGAvl PI uoIgs g;uagu; 1TaI1i MTnpoúd (01 I6ZLL 6