Brevet FR2780650A1 — publié le 20000107

SOLUTIONS SALINES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET MEDICAMENTS A BASE DE CES SOLUTIONS L'invention a pour objet des solutions salines. Elle vise également leur procédé de préparation et les médicaments à base de ces solutions. On connaît déjà des solutions salines et leur mise en oeuvre en tant que médicaments. On peut citer à cet égard le sérum physiologique et les solutions d'eau de mer isotonique; ces produits sont utilisés entre autres pour le lavage des plaies, des yeux et fosses nasales obstruées par des sécrétions muqueuses ou mucopurulentes. La Société Demanderesse a mis au point de nouvelles solutions salines. Ces nouvelles solutions salines sont hypoosmotiques, et caractérisées: par un pH de 7,0 à 8,30, - par une résistivité de 52 à 370 Q et de préférence de 57 à 85 ú, - par une densité de 1, 002 à 1,008, - par une teneur en matière sèche de 0,5% à 1%, - par une osmolarité comprise entre 100 mOs et 305 mOs/kg (milliosmoles/kg), de préférence entre 140 et 240mOs/kg, et par une constitution chimique dont les principaux éléments résultent du tableau I ci-après: TABLEAU I Na de 600 à 2000 mg/l K de 6 à 40 mg/l Cl de 2000 à 5800 mg/l Ca de 200 à 300 mg/l |Mg de 1000 à 1200 mg/l S04 de 2000 à 3000 mg/l 2 2780650 L'invention vise également l'utilisation en tant que médicament des solutions salines conformes à l'invention. Elle a donc pour objet les médicaments caractérisés par le fait qu'ils sont à base des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention. Elle vise plus particulièrement: - l'utilisation des solutions salines conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des affections des voies respiratoires, et plus particulièrement aux traitements antiinflammatoires des muqueuses desdites voies respiratoires, - l'utilisation des solutions salines conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments destinés au traitement céruménolytique du conduit auditif externe, autrement dit à un traitement de dissolution des bouchons de cérumen. L'invention a donc pour objet: un médicament antiinflammatoire des muqueuses des voies respiratoires humaines à base d'une solution saline hypoosmotique selon l'invention, et - un médicament céruménolytique à base d'une solution saline hypoosmotique selon l'invention. Pour préparer les solutions hypoosmotiques, conformes à l'invention, on peut procéder comme indiqué ci-après. On utilise comme matière première une eau de mer prélevée par une profondeur de 5 à 10 mètres dans une zone à forts mouvements de courant, et caractérisée par une teneur en sels supérieure à 32 g/l. Cette eau est analysée, décantée puis rapidement: 3 2780650 - désodée par la technique d'électrodialyse jusqu'à ce que l'osmolarité soit amenée à une valeur comprise entre 100 et 305 mOs/kg, - filtrée, stockée dans des conditions stériles en cuve en acier inoxydable. Elle est de nouveau analysée à ce stade pour vérifier: - sa stérilité, - son osmolarité. Enfin, elle peut être conditionnée de façon stérile dans un local spécialement traité en atmosphère contrôlée. Les travaux qui sont à la base de l'invention sont décrits ci-après. Ils comportent des expériences montrant la supériorité des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention par rapport à trois produits de référence bien connus, à savoir le sérum physiologique, le tampon PBS et les eaux de mer isotoniques; cette supériorité se situe tant au niveau de leur activité anti-inflammatoire, qu'au niveau de leur toxicité: lesdites solutions se sont, en effet, révélées significativement moins toxiques que les trois produits de référence. Les toxicités respectives des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention, du sérum physiologique, du tampon PBS et de l'eau de mer isotonique ont été définies par le biais d'une étude comparative portant sur la viabilité cellulaire en présence des solutions hypoosmotiques d'une part et des trois produits de référence d'autre part des cellules respiratoires humaines, c'est à dire des cellules que l'on rencontre dans les muqueuses respiratoires. A4 2780650 Pour faire cette étude, on a utilisé des cellules épithéliales glandulaires respiratoires humaines issues de prélèvements bronchiques humains. On a ensemencé ces cellules épithéliales respiratoires à la même densité cellulaire dans des plaques de culture de 12 puits. On les a cultivées pendant 48 heures dans un milieu de culture DMEM/F12 supplémenté d'une part avec 2% d'un nutriment constitué par le produit commercialisé sous la marque ULTROSER G et d'autre part avec une dose d'antibiotiques suffisante pour éviter la contamination bactérienne; on obtient ainsi des cultures en monocouche homogènes et confluentes, soit 310 000 cellules par puits de culture après 48 heures de culture. Au moment o la confluence est atteinte, les cellules sont lavées avec une solution physiologique (PBS/Ca2', pH 7.4) et mises en présence d'une part de huit solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention et d'autre part des trois produits de référence, à savoir le sérum physiologique, le tampon PBS et l'eau de mer isotonique désignée par K; on a également utilisé un quatrième produit de référence, à savoir le milieu de culture cellulaire DMEM/F12. Les huit solutions hypoosmotiques testées sont caractérisées respectivement par des résistivités égales à 57,30 Q, 64,93 Q, 74,34 Q, 84,90 Q, 107 Q, 134,40 Q, 192,30 Q et 361 Q et désignées respectivement par les lettres J, I, H, G F, E, D et C. Les principaux éléments constitutifs des solutions hypoosmotiques G, H, I et J apparaissent dans le tableau II ci-après. 2780650 TABLEAU II Constituants Unités G H I J Sodium (Na) mg [ 600 765 1130 1370 Potassium (K) m/l 6,9 11,2 20,8 27,4 Chlorures (CI) 2556 2930 3797 4248 Calcium (Ca) |mg/1 265 290 3101 330 Magnésium (M) Mm1 1100 1130 1200 1200 Sulfates (SO4)mg/l 2570 2570 2570 2600 A l'issue de plusieurs périodes de contact cellulaire, à savoir 16 heures et 24 heures, on a évalué la viabilité cellulaire en présence des milieux dont il vient d'être question. Cette viabilité cellulaire est exprimée par le pourcentage de cellules viables à la fin de chaque période d'incubation dans les solutions salines hypoosmotiques selon l'invention testées, dans le sérum physiologique, dans le tampon PBS et dans le milieu K, par rapport au nombre de cellules viables dans le milieu de culture DMEM/F12 servant de milieu de référence. Elle a été évaluée à l'aide du test d'exclusion dit au bleu de Trypan, en solution à 0,4%, suivi d'un comptage cellulaire avec une cellule de Malassez. Conformément au test en question, les cellules sont détachées du support de culture en utilisant de la trypsine; les cellules vivantes sont ensuite comptées dans une solution aqueuse à 0,4% de bleu de Trypan, ce qui est rendu possible par le fait que le bleu de Trypan est un colorant cellulaire qui ne pénètre pas à l'intérieur d'une cellule vivante, seules les cellules non viables laissant entrer le bleu de Trypan. Le nombre de cellules vivantes dans le milieu de culture DMEM/F12 étant par définition rapporté à 100, il 6 2780650 est possible d'exprimer la viabilité cellulaire dans les autres milieux, en pourcentage par rapport au milieu de culture. Les résultats enregistrés sont réunis dans les figures 1 et 2 qui montrent respectivement les résultats enregistrés après 16 heures et 24 heures de contact, à savoir le pourcentage de cellules vivantes après contact avec chacune des solutions hypoosmotiques conformes à l'invention et chacun des produits de référence, étant rappelé que la viabilité dans le milieu de culture DMEM/FI2 est de 100%. Les pourcentages en question sont réunis dans le tableau III TABLEAU III l______ ___Pourcentage d cellules viables C D | E F G | 11 | I 9 K DMh PBS DME physio- __ _ _ __ _ __ _ _ __ __ __ _ _ __ _ _ _M1o igiue 16 57 60 64 80 94 l 91 95 82 79 100 72 66 heures 24 29 43 44 45 60 62 70 62 59 100 49 0 heures _ L'examen des figures 1 et 2 et du tableau III montre que les solutions salines hypoosmotiques préférentielles conformes à l'invention, c'est-à-dire les solutions G, H, I et J permettent une meilleure viabilité cellulaire sur des périodes d'incubations de 16 et 24 heures de contact que les produits de référence. Pour la mise en évidence de l'activité anti- inflammatoire des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention, on procède comme indiqué ci- apres. 7 2780650 Il est connu que sous l'action de certains agents pro-inflammatoires d'origine bactérienne, tels que par exemple le lipopolysaccharide de P. aeruginosa (LPS, sérotype 10, utilisé à la concentration de 1 ag/ml) à l'unité U314, INSERM, Reims, les cellules concernées libèrent des médiateurs chimiques tels que l'interleukine 8, qui déclenchent les phénomènes inflammatoires. Pour lutter contre l'apparition des phénomènes inflammatoires au niveau des muqueuses respiratoires, il s'agit donc de limiter la libération de ces médiateurs proinflammatoires. Et c'est cette limitation qui se produit très fortement de façon surprenante et inattendue lorsqu'après la susdite stimulation par des agents pro-inflammatoires, on incube les cultures cellulaires concernées dans les solutions salines isoosmotiques utilisées selon l'invention, démontrant ainsi leur importante activité anti-inflammatoire. Les expériences correspondantes réalisées par la Société Demanderesse, ont été effectuées sur des cultures de cellules sécrétoires glandulaires isolées de la sous- muqueuse bronchique humaine. Pour ce faire, on cultive les cellules en question dans un milieu de culture, par exemple le milieu de culture RPMI1640, additionné de 2% de milieu ULTROSER G, puis on élimine le milieu de culture, après avoir atteint une confluence de 90% et après avoir introduit l'agent proinflammatoire. Après lavage des cellules ainsi traitées, on les réincube: 8 2780650 - dans le même milieu de culture RPMI1640 seul qui joue le rôle de milieu de contrôle, - dans le sérum physiologique (milieu de référence), - dans l'eau de mer isotonique (milieu de référence), - dans les solutions salines hypoosmotiques selon l'invention testées, à savoir celles désignées par H, I et J. La production d'interleukine-8 par les cellules épithéliales glandulaires est estimée par méthode de dosage ELISA (en utilisant le kit de dosage vendu sous la marque MEDGENIX DIAGNOSTIC, Belgique) après une période de temps de contact d'une heure dans les surnageants des milieux identifiés ci-dessus. Les résultats enregistrés d'une part pour les trois solutions hypoosmotiques H, I et J conformes à l'invention et d'autre part pour les produits de référence constitués par le milieu de culture DMEM/F12 le sérum physiologique et l'eau de mer isotonique sont: - de 282 pg/ml/heure dans le cas du milieu DMEM/F12, - de 76 pg/ml/heure dans le cas du sérum physio- logique, - de 42 pg/ml/heure dans le cas d'eau de mer isotonique, - de 29 pg/ml/heure dans le cas de la solution J, - de 16 pg/ml/heure dans le cas de la solution I, et - de 7 pg/ml/heure dans le cas de la solution H, ce qui montre la supériorité des solutions conformes à l'invention du point de vue de l'activité anti- inflammatoire par rapport aux produits de référence. 9 2780650 Ces résultats sont confirmés par des expériences réalisées sur la culture d'une lignée cellulaire de l'épithelium respiratoire de surface (ligne respiratoire 16-HBE). Dans la pratique, et dans le cadre de leur utilisation pour l'obtention de médicaments pour le traitement des affections des voies respiratoires humaines, les solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention peuvent être administrées sous forme d'aérosols ou de nébulisats ou par instillation sous forme de gouttes. Il s'agit de médicaments destinés au traitement des manifestations inflammatoires survenant dans les affections rhinopharyngées et pulmonaires. Les solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention peuvent être présentées sous la forme d'Aérosols pour administration nasale et buccale à action locale exerçant son effet sur la muqueuse bronchique et la muqueuse nasale. La posologie habituelle peut être de 2 bouffées espacées d'une trentaine de secondes, répétées deux à trois fois par jour en inhalation buccale selon l'état et l'âge du patient. Dans le cas d'une inhalation nasale, elle est habituellement d'une à deux bouffée dans chaque narine 3 à 4 fois par jour selon l'état et l'âge du patient. Dans le cadre de leur utilisation pour l'obtention de médicaments pour le traitement céruménolytique du conduit auditif externe, s'agissant alors de médicaments céruménolytiques, les solutions salives hypoosmotiques conformes à l'invention, peuvent être appliqués par 2780650 pulvérisation ou par instillation sous forme de gouttes dans le conduit auditif externe de l'oreille. En présence de bouchons de cérumen, on peut avantageusement les appliquer à raison de deux pulvérisations ou instillations quotidiennes pendant une période 3 à 4 jours. A titre d'hygiène régulière, on peut les appliquer avantageusement deux à trois fois par semaine, et plus dans le cas des porteurs de prothèses auditives, afin de favoriser le bon fonctionnement de l'appareil. il 2780650 REVENDICATIONS 1. Solutions salines caractérisées par le fait qu'elles sont hypoosmotiques et caractérisées: - par un pH de 7,0 à 8,30, - par une résistivité de 52 à 370 Q et de préférence de 57 à 85 Q, - par une densité de 1,002 à 1,008, - par une teneur en matière sèche de 0,5% à 1%, - par une osmolarité comprise entre 100 mOs et 305 mOs/kg (milliosmoles/kg), de préférence entre 140 et 240mOs/kg, et par une constitution chimique dont les principaux éléments résultent du tableau I ci-après: TABLEAU I Na de 600 à 2000 mg/1 K de 6 à 40 mg/1 C1 de 2000 à 5800 mg/1 Ca de 200 à 300 mg/l Mg de 1000 à 1200 mg/1 SO4 [ de 2000 à 3000 mg/1 2. Médicament caractérisé par le fait qu'il est à base d'une solution saline hypoosmotique et caractérisé - par un pH de 7, 0 à 8,30, - par une résistivité de 52 à 370 Q et de préférence de 57 à 85 Q, - par une densité de 1,002 à 1,008, - par une teneur en matière sèche de 0,5% à 1%, - par une osmolarité comprise entre 100 mOs et 305 mOs/kg (milliosmoles/kg), de préférence entre 140 et 240mOs/kg, et par une constitution chimique dont les principaux éléments résultent du tableau I ci-après: 12 2780650 TABLEAU I Na de 600 à 2000 mg/1 K de 6 à 40 mg/1 Cl de 2000 à 5800 mg/1 Ca de 200 à 300 mg/1 Mg de 1000 à 1200 mg/1 S04 de 2000 à 3000 mg/1 3. Utilisation des solutions salines selon la revendication 1 pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des affections des voies respiratoires, et plus particulièrement aux traitements antiinflammatoires des muqueuses desdites voies respiratoires. 4. Utilisation des solutions salines selon la revendication 1 pour l'obtention de médicaments destinés au traitement céruménolytique du conduit auditif externe, autrement dit à un traitement de dissolution des bouchons de cérumen. 5. Médicament antiinflammatoire des muqueuses des voies respiratoires humaines à base d'une solution saline hypoosmotique selon la revendication 1. 6. Médicament céruménolytique à base d'une solution saline hypoosmotique selon la revendication 1. 7. Procédé de préparation des solutions salines hypoosmotiques selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on utilise comme matière première une eau de mer prélevée par une profondeur de 5 à 10 mètres dans une zone à forts mouvements de courant, et caractérisée par une teneur en sels supérieure à 32 g/l, cette eau étant analysée, décantée puis rapidement: 13 2780650 - désodée par la technique d'électrodialyse jusqu'à ce que l'osmolarité soit amenée à une valeur comprise entre 100 et 305 mOs/kg, - filtrée, stockée dans des conditions stériles en cuve en acier inoxydable.