Brevet FR2777293A1 — publié le 19991015

La présente invention concerne un procédé d'électro-séparation d'une fraction nucléique à partir d'un lysat cellulaire, ainsi que tout dispositif, notamment à usage unique, pour la mise en oeuvre dudit procédé d'électro-séparation. Différents procédés, mais aussi dispositifs, ont été à ce jour proposés ou décrits, aux fins de séparer un matériel nucléique ou une fraction nucléique, à partir d'un lysat cellulaire. Par " séparation ", on entend de manière générique tout processus permettant d'enrichir ou concentrer un milieu, isoler ou déterminer (de manière qualitative et/ou quantitative) dans un milieu complexe, au moins un matériel nucléique, c'est à dire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou de l'acide ribonucléique (ARN). Conformément au document de la Société ISCO, dénommé ISCO Applications (Bulletin 54, " Electroelution of Nucleic Acids and Proteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 1989), il est décrit un dispositif d'électro-élution, et non d'électro- séparation comprenant: - un premier réservoir pour une première solution tampon, comportant deux compartiment opposés, fermés chacun par une membrane perméable, I'une de section importante, et l'autre de section faible, et présentant chacune un seuil de coupure permettant de retenir le matériel nucléique ou protéique d'intérêt, - un second réservoir pour une deuxième solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir par lesdites membranes, - deux électrodes en contact électrique avec la seconde solution tampon, générant un champ électrique traversant les deux membranes perméables, de celle de section importante à celle de section faible, et donc traversant la première solution tampon. Ce dispositif sert à concentrer une fraction nucléique ou protéique, déjà relativement pure mais diluée, en disposant cette fraction sur la membrane de section importante, et en recueillant sur la membrane de section faible la même fraction, mais concentrée. La concentration est obtenue du fait du transport des biomolécules par les lignes de champ électrique, qui se concentrent au niveau de la membrane de faible section. Il ne s'agit donc ni d'un procédé, ni d'un dispositif de séparation, au sens de la définition précédente, c'est à dire au sens o à partir d'un milieu complexe on sépare ou isole un matériel biologique d'intérêt. D'autre part, aux fins de séparer un matériel nucléique, on connaît la demande de brevet publiée sous le numéro WO 97/41219, qui divulgue un procédé pour capturer des acides nucléiques à partir d'un mélange constitué par exemple de cellules lysées. Le procédé nécessite de déposer une électrode dans le mélange, d'appliquer à l'électrode un voltage permettant d'attirer les acides nucléiques, puis d'enlever l'électrode recouverte par les acides nucléiques. L'électrode recouverte des acides nucléiques est alors plongée dans une solution permettant, par inversion du courant, de libérer les acides nucléiques qui sont ensuite directement amplifiables. Le voltage appliqué pour pouvoir effectuer une amplification est de préférence de 0,5 à 3 volts pendant environ 30 secondes. Ce procédé, bien qu'utile pour séparer des plasmides contenus dans des cellules E.coli lysées par chauffage, n'est pas adapté pour séparer l'ADN et/ou 'ARN d'un lysat plus complexe de cellules, notamment provenant d'un échantillon biologique. Au terme de cet inventaire, aucun procédé n'apparaît permettre de séparer de manière simple et efficace, un matériel nucléique d'un matériel non nucléique, notamment protéique, à partir d'un lysat cellulaire complexe. La présente invention se propose d'apporter une solution à ce problème non résolu. Pour ce faire, un premier objet selon l'invention est un procédé d'électro-séparation d'un échantillon biologique contenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, selon lequel: (a) on dispose d'une solution tampon, (b) on dispose d'une membrane perméable en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé permettant d'arrêter le matériel nucléique au moins, du côté de ladite solution tampon, (c) on établit un champ électrique, dont les lignes de force passent au sein de ladite solution tampon, et traversent la membrane perméable, (d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique généré par le champ électrique, le procédé ayant comme caractéristique: - d'appliquer le champ électrique pendant une durée définie, d'une part, par la présence du matériel nucléique au niveau de la membrane, et d'autre part, par le fait que le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou est en cours de migration, - de prélever le matériel nucléique. L'invention conçerne également un procédé d'électro-séparation d'un échantillon biologique contenant des cellules renfermant du matériel nucléique, selon lequel: (a) on dispose d'une solution tampon, (b) on dispose d'une membrane perméable en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé permettant d'arrêter le matériel nucléique au moins, du côté de ladite solution tampon, (c) on établit un champ électrique, dont les lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, (d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique généré par le champ électrique, caractérisé en ce qu'il consiste, - à appliquer un premier champ électrique pour lyser les cellules, - à appliquer un second champ électrique pendant une durée définie, d'une part, par la présence du matériel nucléique au niveau de la membrane, et d'autre part, par le fait que le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou est en cours de migration, - à prélever le matériel nucléique. Par "électro-séparation " dans la présente invention, on entend que des molécules présentes ensemble dans un milieu, et pouvant présenter des charges électriques identiques, sont distinguées les unes des autres dans ledit milieu en raison de leurs cinétiques respectivement différentes dans un même champ électrique. Le procédé selon l'invention apporte l'avantage essentiel d'obtenir rapidement et facilement une fraction nucléique exempte d'autres constituants, notamment protéines, directement amplifiable, à partir d'un lysat cellulaire. On connait les difficultés liées aux techniques d'amplification, notamment pour les échantillons de type respiratoire, en ce que la fraction à amplifier doit être exempte d'inhibiteurs. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les inhibiteurs protéiques des techniques d'amplification sont pratiquement éliminés. La fraction enrichie en matériel nucléique, comprenant l'ADN et/ou l'ARN, que l'on obtient par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est directement amplifiable par les techniques couramment utilisées, telles que notamment la technique PCR pour les ADN et la technique NASBA pour les ARN. Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, l'échantillon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière en contact avec la solution tampon. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes. Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, la durée de migration de la fraction nucléique est de 10 à 20 minutes, de préférence encore de 1 5 minutes. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la valeur de la molarité de la solution tampon est au moins égale à 0,1 mol/I, et préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 mol/I. La molarité de la solution tampon étant comprise entre 0,1 et 5 mol/l, on peut effectivement, soit ne mettre qu'une même solution tampon dans les deux compartiments, soit mettre deux solutions tampon différentes dans les deux compartiments. La molarité de la solution tampon peut être la même dans les deux compartiments et sera comprise entre 0,1 et 1 mol/li, de préférence encore de 0,1 mol/I. La molarité de la solution tampon peut être différente dans les deux compartiments et sera respectivement de préférence de 0,1 mol/I dans le premier compartiment et de 1 mol/I dans le second compartiment. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 150 V. Dans un autre mode de réalisation très préféré selon l'invention, la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, en suivant les lignes de force du champ électrique, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm. Le lysat cellulaire à partir duquel on effectue le procédé selon I'invention peut être un lysat cellulaire provenant d'une culture simple ou complexe, c'est à dire comprenant différentes cellules, ou peut être également un échantillon biologique, tel que notamment du sang, de l'urine et un crachat de type respiratoire. Le lysat cellulaire à partir duquel on obtient la fraction nucléique, soumis ensuite au procédé selon l'invention, peut être obtenu par différentes techniques de lyse, notamment la lyse par choc mécanique, par choc électrique et autres. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon biologique résulte directement de la lyse d'un échantillon cellulaire, notamment par voie mécanique ou électrique. Ce mode de réalisation est effectué dans le même dispositif, comme cela est revendiqué dans la revendication 2. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le lysat cellulaire est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire. Lorsque l'échantillon biologique est du sang, on préfère que le pH de la solution tampon soit de 7. La membrane récupérant la fraction enrichie en matériel nucléique présente un seuil de coupure prédéterminée, de préférence inférieure à 100 kDa. Lorsque l'échantillon biologique est du sang, la porosité de la membrane à la cathode sera de préférence supérieure à 10 kDa. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification. La lyse cellulaire sera de préférence encore effectuée par lyse électrique en présence de protéinase K et d'un détergent. Un second objet selon l'invention est un dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, comprenant un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage dudit support avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont celle du champ électrique. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend un moyen de réception de l'échantillon biologique; un réservoir pour la solution tampon, comportant un compartiment fermé par la membrane perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment avec le moyen de réception de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes de génération du champ électrique, I'une au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé par la membrane. Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le réservoir comprend un autre compartiment, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, les deux réservoirs communiquent respectivement avec des évents d'aération, et avec au moins un canal de remplissage. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, un puits intermédiaire est disposé et communique entre le moyen de réception de l'échantillon biologique et le premier réservoir. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu d'électrodes assurant une lyse dudit échantillon cellulaire. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse, et un compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le volume du compartiment de réception du lysat est supérieur au volume du compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique. Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre 1/2 et 1/50, notamment entre 1/5 et 1/20. Un troisième objet selon l'invention est l'utilisation du dispositif décrit ci-dessus pour électro-séparer une fraction d'acides nucléiques à partir d'un lysat cellulaire. Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour détecter et/ou identifier des acides nucléiques directement après amplification. La figure 1 représente shématiquement un appareil d'éléctroélution d'acides nucléiques et de protéines à partir de gel, et de concentration électrophorétique de macromolécules (Isco, Nebraska, USA) que l'on utilise dans un procédé différent, à savoir d'électro- séparation selon l'invention. Les compartiments A et B, dans lequel sont plongés deux électrodes négative et positive respectivement, sont remplis de tampon TBE lx; le compartiment C, comprenant une partie Cl et une partie C2, et le compartiment Cf sont remplis de tampon TBE 0.1x. Une membrane de dialyse est placée à l'interface des compartiments Cf et B (porosité 100 kDa), et Cl et A (porosité 10 kDa). La Figure 2 indique le pourcentage d'acides nucléiques de S. epidermidis récupérés dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par analyse avec un appareil Vidas (BioMerieux, France), selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unité relative de fluorescence. la Figure 3 présente la cinétique de récupération des protéines d'un lysat cellulaire. Le pourcentage des protéines du lysat bactérien est récupéré dans le compartiment Cf après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par dosage Bradford, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en densité optique (DO) à 595 nm. La Figure 4 présente la cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire. Le pourcentage d'acides nucléiques de Staphycoccus epidermidis est récupéré dans le compartiment Cf après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs électriques, déterminé par analyse avec un appareil Vidas, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unité relative de fluorescence. La Figure 5 présente l'amplification des acides nucléiques purifiés à partir d'un lysat cellulaire. La quantité d'amplicons produits par PCR à partir de 10 pI de molécules d'ADN est récupérée dans le compartiment Cf à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, après différents temps de migration, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unité relative de fluorescence. La Figure 6 présente la quantité d'amplicons produits par PCR après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous un champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 pI de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unité relative de fluorescence. La Figure 7 illustre la quantité d'amplicons produits par TMA après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 pli de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000. La Figure 8 indique le pourcentage de protéines du sang récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un échantillon clinique sanguin lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 3. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm. La Figure 9 indique le pourcentage de proteines d'un crachat récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un échantillon clinique de type respiratoire lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm. La Figure 10 montre l'élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présent dans l'échantillon clinique de type respiratoire. Elle indique la quantité d'amplicons ADN produits par PCR à partir de différentes quantités initiales d'ADN de S. epidermidis, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 10 #I d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unité relative de fluorescence. La Figure 11 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées et déposées dans le compartiment Cl. Chaque point représenté sur le graphe représente une valeur moyenne obtenue à partir de 13 crachats et aspirations bronchiques différents, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 pIl d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unité relative de fluorescence. La Figure 12 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées par chocs mécaniques et déposées dans le compartiment Cl, selon l'exemple 5. L'étude a été réalisée en parallèle sur 4 crachats différents. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 ul d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000. La figure 13 représente un dispositif à usage unique selon l'invention, vu en perspective. La figure 14 représente une vue de dessous du dispositif représenté à la figure 13. La figure 15 représente représente une vue de dessus du dispositif représenté à la figure 13. La figure 16 représente représente une vue en coupe, selon le trait de coupe représenté à la figure 15, du dispositif selon la figure 13. Exemple 1: Mode opératoire général pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention. Il Le mode opératoire est basé sur l'utilisation d'un appareil d'éléctroélution d'acides nucléiques selon la figure 1. Un volume d'échantillon biologique est déposé soigneusement au fond du compartiment Cl. Les deux électrodes du circuit sont reliées à un générateur. Une tension constante de 150 V est appliquée aux bornes du générateur. L'intensité du circuit varie de 15 à 20 mA et la température du tampon dans le compartiment C varie de 23 à 30 C. Les molécules biologiques initialement déposées au fond du compartiment Cl migrent dans le champ électrique ainsi créé, à vitesse définie en fonction de leur charge et de leur taille. Après différents temps de migration, la tension aux bornes du générateur est arrêtée et les molécules ayant migrées vers la cathode et de poids moléculaire apparent inférieur ou égal à 10 kDa sont recueillies dans le compartiment Cf dans un volume final de 200 pI. L'échantillon ainsi récupéré est conservé dans la glace avant analyse. L'échantillon biologique déposé dans le compartiment Cl peut être un matériel nucléique et/ou protéique purifié ou non, un lysat cellulaire, provenant d'un échantillon biologique tel que le sang, I'urine et un crachat de type respiratoire. Les lysats cellulaires étudiés ont été obtenus à partir de S. epidermidis, bactérie à paroi Gram+ (A054). Ces bactéries sont cultivées en milieu liquide BCC (Bouillon Coeur Cervelle, bioMerieux 41019). Avant lyse, elles sont mises en suspension, soit dans un prélèvement clinique (crachat liquéfié et décontaminé, sang, plasma, sérum....) soit en tampon de lyse (30 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI pH 7.2). 300 pl de cette suspension cellulaire ont été lysés en suivant essentiellement deux protocoles: - Protocole de lyse par chocs mécaniques: 90 pivl de billes de verre de diamètre compris entre 90 et 150 pm, 3 billes de fer de diamètre 2 mm et 5 billes de verre de diamètre 3 mm sont placés dans un tube Falcon en présence de 300/1 de la suspension cellulaire, comme décrit dans le brevet (FR n 9712164). 6 mg /ml final de protéinase K (PK) (E.C. 3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 1092766) peut être ajoutée à la suspension cellulaire. Le tube fermé est vortexé pendant deux minutes, à puissance maximale de l'appareil (Reax 2000, Heidolph). La suspension bacterienne ainsi traitée et récupérée est déposée immédiatement dans le compartiment C1 du dispositif décrit dans la Figure 1. Si la PK est présente dans la solution cellulaire, une incubation supplémentaire de 15 minutes à 37 C est réalisée. - Protocole de lyse par choc électrique: 300 pI de la suspension cellulaire sont déposés dans une cuve d'électroporation caractérisée par une distance entre les deux électrodes de 2 mm, en présence de 0.01 à 6 mg /ml final de PK. La cuve est placée dans un circuit électrique dont les paramètres sont choisis comme suit: tension 500 V, résistance 186 Ohms, capacité de 500 ou 1500 pjFD. Après lancement d'une impulsion électrique, la décharge électrique se réalise en quelques millisecondes entre les deux électrodes. Le lysat ainsi récupéré est déposé immédiatement dans le compartiment A du dispositif décrit dans la Figure 1 (FR n 9706835). Le pourcentage d'acides nucléiques recueilli à la cathode après migration est déterminé par mesure de DO (densité optique) de l'échantillon récupéré à 260 nm. Le pourcentage recueilli est égal au rapport de la valeur de DO à 260 nm après migration, sur la valeur de DO à 260 nm avant migration. De même, la quantité de protéines recueillies à la cathode après migration est déterminée par dosage Bradford et lecture de DO à 595 nm. Le pourcentage de protéines recueillies est égal au rapport de la quantité protéique récupérée sur la quantité initiale. La quantité des acides nucléiques récupérés à la cathode après migration est vérifiée sur gel d'agarose 0.8%; 10 pI de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous voltage constant (150 V) et le gel est coloré au bromure d'ethidium (BET) avant observation sous rayonnement ultra-violet. En parallèle, les protéines récupérées à la cathode après migration peuvent être observées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE 10%); 5 à 10 pl de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous intensité constante (25 mA), et le gel est coloré au bleu de Coomassie. La quantité d'acides nucléiques récupérés à la cathode est déterminée par détection spécifique selon une technique d'hybridation dite sandwich en utilisant l'appareil Vidas commercialisé par bioMérieux (France). Des sondes oligonucléotidiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis (EP 0632269) ont été choisies. Les oligonucléotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence: 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID N :1) et 5'GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID N :2). La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatase alcaline5 (AKP). L'hybridation spécifique de ces sondes avec les acides nucléiques libérés dans le lysat est fonction de la quantité d'acides nucléiques présents, mais aussi de leur accessibilité pour les sondes utilisées. Deux protocoles d'amplification spécifique des molécules d'ADN et d'ARN de S. epidermidis ont été réalisés à partir des échantillons recueillis après migration: un protocole POR pour l'amplification de l'ADN et un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr1 6S. -Protocole PCR: la technique de POR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR Strategies, Ed: Innis, Gelford et Sninsky Academic press 1995, pp 17-31. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes: Amorce 1: 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' SEQ ID N :3 Amorce 2: 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' SEQ ID N :4 Les cycles de température suivants ont été utilisés 1 fois 3 minutes à 94 C 2 minutes à 65 C fois 1 minute à 72 C 1 minute à 94 C 2 minutes à 65 C 1 fois 5 minutes à 72 C -Protocole TMA: la technique de TMA suivie est celle décrite parPasternack et al., Journal of Clinical Microbiol. 1997, 35: 676. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes: Amorce 1: 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA-3' Amorce 2: 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTT TGTCACCGGCAGTCAACTTAGA -3' pl ou 50 I1 d'échantillon recueilli sont utilisés pour chaque essai PCR et TMA, respectivement. Les amplicons produits par PCR sont observés sur gel d'agarose 0.8% et quantifiés sur Vidas selon le protocole35 décrit ci-dessus. Les amplicons produits par TMA sont détectés et quantités sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection spécifiques de S. epidermidis, selon la méthode décrite par P. Cros et a/., Lancet 1992, 240:870. La sonde de détection est couplée à la " Horse Radish Peroxidase " (HRP). Les deux sondes présentent les séquences suivantes: Sonde de capture: 5'- GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' (SEQ ID N :7) Sonde de détection: 5'- GACATCCTCTGACCCCTCTA -3' (SEQ ID N :8) ExemDle 2: Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire. Une suspension de Staphylococcus epidermidis (1-5.109 b./300p1l) est lysée par choc mécanique ou par choc électrique comme décrit dans le protocole général ci-dessus. 200 pl de chaque lysat sont déposés au fond du compartiment C1. Le champ électrique est appliqué pendant différents temps entre les deux électrodes. Les quantités d'acides nucléiques ou de protéines présentes dans l'échantillon recueilli dans le compartiment Cf sont déterminées par analyse avec un appareil Vidas ou dosage Bradford, respectivement. La qualité des molécules récupérées a été appréciée sur gel d'agarose ou d'acrylamide en présence de SDS. -Lvsat cellulaire obtenu par choc mécanique: Les acides nucléiques du lysat ont migré dans le compartiment Cf progressivement au cours du temps, comme montré à la figure 2. Après 60 minutes, la totalité du matériel nucléique du lysat est récupéré, quelque soit la présence ou non de protéinase K pendant l'étape de lyse. Ce résultat est en faveur d'une bonne libération et accessibilité des acides nucléiques dans le lysat. Les molécules d'ADN récupérées ont le même profil de migration sur gel d'agarose 0.8% qu'avant migration dans le lysat. En présence de protéinase K pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 3, seul un pourcentage négligeable de protéines est récupéré après 60 minutes, tandis qu'en absence de protéase, environ 50% de protéines sont récupérées. -Lysat cellulaire obtenu par choc electrique. En présence de PK pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 4, les acides nucléiques du lysat migrent progressivement jusqu'à la cathode. Après 60 minutes, un pourcentage important d'acides nucléiques est récupéré. La récupération du matériel nucléique présent initialement dans ce lysat est similaire à celle du matériel présent initialement dans un lysat obtenu par choc mécanique (cf. ci-dessus). Par contre, en absence de PK pendant l'étape de lyse, aucun acide nucléique ne peut être détecté dans le compartiment Cf, même après 60 minutes de migration (analyse Vidas et gel d'agarose 0.8%). Sur gel d'agarose, les molécules d'ADN et d'ARN du lysat récupérées sont observables séparément après migration, alors qu'elles ne le sont pas initialement dans le lysat. -Amplification des acides nucléiques purifiés à partir de lvsat cellulaire Les bactéries S. epidermidis diluées dans 300 Il de tampon de lyse sont lysées par choc mécanique en absence de PK, comme décrit dans le protocole général de l'exemple 1. 200p1 du lysat sont déposés au fond du compartiment Cl. Un champ électrique est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps. Le matériel nucléique qui a migré dans le compartiment Cf est amplifié par PCR (10 pl par essai) ou TMA (50 u1 par essai). La quantité d'amplicons produite est analysée par hybridation spécifique sur Vidas ou microplaque, respectivement. -Amplification PCR des molécules d'ADN récupérées après migration: Pour 104 bactéries initiales lysées déposées dans le compartiment Cl, différentes quantités d'amplicons sont produites, en fonction du temps de migration. Pour 15 minutes de migration, comme représenté à la figure 5, les molécules d'ADN récupérées permettent une production optimale d'amplicons par PCR. Avant 15 minutes, une quantité inférieure de molécules d'ADN sont récupérées. Pour 20 minutes et après, une quantité supérieure de molécules d'ADN sont récupérées, mais de qualité moins adaptée à une amplification PCR optimale. Plus la migration dure, plus la structure de l'acide nucléique peut être altérée. Afin d'obtenir une amplification PCR optimale, un compromis entre quantité et qualité des molécules d'ADN récupérées à la cathode doit être respecté. Ce résultat a été confirmé en utilisant des suspensions initiales de S. epidermidis plus concentrées (105-106 bactéries initiales /200p1). Comme représenté à le figure 6, I'ADN d'un nombre supérieur ou égal à 1. 103 bactéries initiales (/200p1) peut être amplifié et détecté après lyse mécanique des cellules et migration des constituants du lysat sous champ électrique; soit 102 molécules d'ADN ou bactéries par essai PCR, étant donné que le matériel migré est récupéré dans 200 pI et que 10 pI de ce matériel est utilisé pour chaque essai PCR. 102 molécules d'ADN correspond à la limite de sensibilité du protocole PCR, de façon générale. Ce résultat démontre une grande sensibilité de récupération des molécules d'ADN bactérienne après lyse cellulaire par choc mécanique et purification des molécules d'ADN intracellulaire par champ électrique en solution. - Amplification TMA des molécules d'ARN récupérées après migration: Comme représenté à la figure 7, I'ARN de au moins 40 bactéries initiales (/200pI) peut être détecté après lyse des bactéries, migration des constituants cellulaires sous champ électrique et amplification spécifique des ARNr16S de S. epidermidis; soit 10 bactéries initiales par essai TMA, compte tenu que le matériel nucléique migré est récupéré dans 200 pl final et que 50 pI sont ajoutés par essai TMA. Ce résultat témoigne d'une grande sensibilité de récupération des molécules d'ARNr 16S bactérien après lyse par choc mécanique et purification des acides nucléiques du lysat par champ électrique. Exemple 3: Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir d'un échantillon sanguin. L'échantillon sanguin est utilisé sans pré-traitement préalable. pI de cet échantillon clinique est déposé au fond du compartiment C1. Un voltage de 150 V est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps, puis le matériel récupéré à l'électrode positive dans le compartiment Cf est analysé par dosage de protéines selon la méthode de Bradford, et sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE %). Dans cet exemple, le pH du tampon TBE utilisé pour la migration a été fixé à pH 7.0, le point isoélectrique de l'hémoglobine étant égal à 7.0. Des membranes de 50 ou 100 kDa ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B. Comme cela est représenté à la figure 8, après minutes de migration, un pourcentage négligeable de protéines est récupéré avec la membrane de 100 kDa, et 10% des protéines sont récupérées avec la membrane de 50 kDa. A pH 7.0, seulement 10% des protéines sanguines chargées négativement à pH 7.0 ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa et inférieur à 100 kDa. Un pourcentage négligeable de protéines sont récupérées après 15 minutes de migration, en utilisant indifféremment une membrane de 50 ou 100 kDa. Ces conclusions ont été vérifiées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-PAGE 10%. La porosité de la membrane sera préférentielement supérieure à 10 kDa, afin de ne pas obtenir un pourcentage trop élevé de protéines. Exemple 4: Cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de type respiratoire. Avant utilisation, I'échantillon respiratoire est fluidifié, décontaminé selon le protocole standard au N-acetyl-L-cysteine et à la soude (NALC/NaOH); puis il est inactivé 20 minutes à 95 C. Dans cet exemple, le tampon TBE utilisé pour la migration a un pH égal à 8.3 ou 7.0, et des membranes de différentes tailles de pores ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B: 10, 50 ou 100 kDa. Comme cela est représenté à la figure 9, à pH 8.3, 10% des protéines sont récupérées après 30 minutes, et 70-80% après 60 minutes avec des membranes de 50 ou 10 kDa, ce qui suggère que 70-80% des protéines du crachat sont chargées négativement à ces pH et ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa. A pH 7.0, environ 0% des protéines sont récupérées après 30 ou 60 minutes de migration, quelque soit la taille des pores de la membrane utilisée (dans la limite de sensibilité des techniques de détection utilisées). A ce pH, les 55-60% des protéines préalablement récupérées à pH 8.0 ne sont plus chargées négativement. Avec les membranes de 10 ou 50 kDa, un pourcentage négligeable des protéines du crachat est récupéré après 15 minutes de migration. On a vérifié ce point sur gel de polycrylamide en présence de SDS-PAGE 10%. ExemDle 5: Levée d'inhibition de protocoles d'amplification par les échantillons de type respiratoire après migration Les échantillons de type respiratoire sont inhibiteurs des réactions PCR et TMA. 200 pI de ces échantillons ont été déposés au fond du compartiment Cl du système décrit Figure 1. Un voltage de 150 V constant a été appliqué entre les deux électrodes pendant 15 minutes. Une membrane de séparation entre Cf et B de 10 kDa a été choisie. Après migration, I'échantillon récupéré dans le compartiment Cf (200 pI) a été supplémenté avec différentes quantités d'acides nucléiques purifiés de S. epidermidis. 10 pI ou 50 pI de cette solution ont été utilisés pour chaque essai PCR ou TMA, respectivement. Comme représenté à la figure 10, jusqu'à 102-103 copies initiales d'ADN peuvent être amplifiées dans 10 /I d'échantillon migré. Ce résultat démontre que le crachat migré a perdu son caractère inhibiteur de la PCR. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'amplification TMA. 1-5.109 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 pl de crachat fluidifié, décontaminés et inactivés comme décrit dans l'exemple 4 cidessus. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc mécanique en absence de PK, et le lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le schéma présenté à la Figure 1. La quantité d'acides nucléiques bactériens récupérés dans le compartiment Cf après migration a été quantifiée par analyse Vidas spécifique de l'espèce bactérienne étudiée. L'expérience a été réalisée à partir de différents crachats. En moyenne, 80% d'acides nucléiques S. epidermidis sont récupérés. Ce résultat indique que les molécules de la matrice du crachat ne gênent pas la migration des molécules d'ADN et d'ARN du lysat bactérien dans le champ électrique, dans ces conditions. Au contraire, il semble que l'environnement soit propice à une meilleure récupération et/ou migration de ces molécules. Amplification PCR: Les bactéries S. epidermidis ont été ensemencées dans 300 pl de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé, puis lysées par choc mécanique en absence de PK comme décrit dans l'exemple 1. 200 pI du lysat a migré pendant 15 minutes sous 150V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B. Le matériel nucléique présent dans l'échantillon a été amplifié par PCR (10 pI par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Comme représenté à la figure 11, jusqu'à 104-103 bactéries initiales lysées (/200pl de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 molécules d'ADN /10p1I d'essai PCR). Ce résultat, d'une part confirme un très bon rendement de récupération des molécules d'ADN bactérien du lysat dans le crachat, et d'autre part démontre une très bonne élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présents dans les crachats. Amplification TMA: De même que pour l'étude de l'amplification PCR décrite ci- avant, les bactéries S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 pI de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé puis lysées par choc mécanique en absence de PK. 200 pl du lysat a migré pendant 15 minutes sous 150V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et A. Les molécules d'ARNr présentes dans l'échantillon récupéré ont été amplifiées par TMA (50 pI par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par hybridation spécifique sandwich sur microplaque. Comme représenté à la figure 12, au moins 10o6-105 bactéries initiales lysées (/200p1 de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ARN (soit au moins 5.104-5.103 bactéries initiales /50 pI d'essai TMA). Ce résultat démontre l'élimination des inhibiteurs de la TMA initialement présents dans les crachats. ExemDle 6: Electro-séparation après lyse par chocs électriques. 1-5.10e S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 pI de crachat fluidifié, décontaminé et inactivé comme décrit dans l'exemple 4. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc électrique en présence de 10-2 mg/ml final de PK et 2% final de LLS (Lithium Lauryl Sulfate, Sigma). 200 pI de lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le shéma présenté à la figure 1. Le matériel nucléique récupéré après migration (200 pI) a été amplifié par PCR spécifique de S. epidermidis (10 pI/essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Jusqu'à 104-105 bactéries initiales lysées (/ml) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100molécules d'ADN/10 pI d'essai PCR, ce qui représente la limite de sensibilité de la technique PCR utilisée). Conformément aux figures 13 à 16, on décrit ci-après un dispositif à usage unique, c'est- à-dire consommable, jetable, après emploi, permettant de mettre en oeuvre le procédé d'électro-séparation décrit et exemplifié précédemment. Un tel dispositif comprend un support 1, ou base, ayant généralement une forme parallèlépipédique, comprenant notamment une face supérieure lb, une face inférieure lc et un flanc latéral la, montrés sur les Figures 13 et 14. De manière générale dans ce support 1, sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes requis pour l'électro-séparation, ainsi que des moyens d'interfaçage correspondant au flanc la du support 1 avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support 1, dont l'échantillon biologique traité, le milieu liquide aqueux (tampons) et la fraction enrichie en matière nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électro-séparation, dont celle du champ électrique. De manière non représentée, à titre d'exemple, les deux faces la et lb du dispositif, ou cartes, sont revêtues d'un film transparent, étanche, adhérant au support, et fermant les différents conduits et cavités représentés en surface aux figures 13 et 14. Ce dispositif comprend encore: - un moyen de réception 2 de l'échantillon biologique traité - un premier réservoir 3 pour un premier milieu liquide aqueux (tampons TBE dilué à 10 fois), comportant lui-même un compartiment 31 fermé par une membrane 4 perméable, ayant par exemple une capacité de l'ordre de 100 pi, ainsi qu'un autre compartiment 32, ayant une capacité de 1 ml, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir d'échantillons biologiques; cet autre compartiment est disposé en amont du compartiment selon le sens de circulation du matériel nucléique, sous l'effet du champ électrique, et communique lui-même avec le moyen de réception 2 de l'échantillon biologique - un second réservoir 5 pour un second milieu liquide aqueux (par exemple tampon TBE, une fois concentré), identique ou différent du premier liquide aqueux, séparé du premier réservoir 3, uniquement par la membrane 4 - deux électrodes 61 et 62 pour générer un champ électrique, communiquant avec deux plots 63 et 64 de contact électrique sur le flanc la; I'une des électrodes, à savoir 61, ou cathode, est au contact du premier milieu liquide aqueux dans le premier réservoir 3, et l'autre électrode 62, ou anode, est au contact du second milieu aqueux dans le second réservoir 5 - un moyen d'extraction 9 de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment 31 fermé par la membrane 4 Les deux réservoirs 3 et 5 communiquent respectivement avec des évents d'aération 33 et 53, et avec au moins un canal de remplissage 34 communiquant en ce qui le concerne avec le second réservoir 5. Un puits intermédiaire 7 est disposé et communique entre le moyen de réception 2 de l'échantillon biologique et le premier réservoir 3. Ce puits n'est pas obligatoire, puisque le lysat peut être déposé directement dans le compartiment 32. Ce puits 7 est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire pour obtenir une fraction soumise ensuite à électro-séparation; ces moyens sont des électrodes 81 et 82, permettant d'exposer l'échantillon à une ou plusieurs impulsions électriques, conformément au procédé décrit par ailleurs dans la demande de brevet français 97 06835 du 29/05/97 au nom de la Demanderesse. Ces électrodes 81 et 82 communiquent respectivement avec des plots de contact électrique 83 et 84 prévus sur le flanc la. Il existe donc deux circuits électriques, l'un associé aux électrodes 81 et 82, et l'autre associé aux électrodes 61 et 62. I - Préparation du dispositif Avant de démarrer toute réaction, on remplit les réservoirs 3 et de tampon. Ce dernier peut être constitué par un tampon TBE (Tris- Borate-EDTA) dont la concentration varie d'un réservoir à l'autre. On remplit le premier réservoir 3, supérieur, par le moyen de réception 2, avec du tampon dilué dix fois, et le second réservoir 5, inférieur, par le canal 34 avec du tampon une fois concentré. On perce les évents d'aération 33 et 53 au niveau des films étanches recouvrant les faces la et lb, afin de permettre à l'air de s'échapper lors du remplissage des réservoirs. 1) Lyse L'échantillon est introduit dans le moyen de réception 2 à l'aide d'une pipette, manuellement ou par un automate. Le volume de l'échantillon est compris entre O et 1 ml. Il arrive alors dans le puits intermédiaire 7 de lyse. La lyse est réalisée grâce à une décharge électrique de 500 V pendant environ 1 seconde, entre les électrodes 81 et 82. Dans le cas o le volume d'échantillon est supérieur à 50 pI, plusieurs étapes de lyse sont réalisées les unes après les autres, les fractions lysées étant transférées au fur et à mesure dans le compartiment 32 de réception. 2) Electro-séparation Une fois l'échantillon lysé et transféré en totalité dans le compartiment 32 de départ de l'électro-séparation, le premier circuit électrique des électrodes 81 et 82 est ouvert, le deuxième des électrodes 61 et 62 est fermé. Les constituants du lysat chargés négativement vont alors migrer jusqu'à l'anode 62. Les acides nucléiques étant fortement négatifs migreront plus vite. On pourra donc les récupérer sélectivement au-dessus de la membrane 4, au niveau du compartiment de réception 31 par le canal de prélèvement 9. Le courant imposé pour cette migration est compris entre O et mA, sous une tension de 150 V. La durée optimale de migration est d'environ 15 minutes. Afin de récupérer les acides nucléiques, on vide le réservoir 3 supérieur jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liaison fluidique entre le compartiment 32 et le compartiment de réception 31. On prélève alors avec une pipette, par le canal 9, les 100 pli de tampon contenus dans le compartiment 31. Le prélèvement peut se faire manuellement ou par l'intermédiaire de l'automate. On peut prévoir de récupérer aussi les protéines purifiées. Pour cela, il faut effectuer deux passes successives d'électro-purification, la première permettant de récupérer la fraction enrichie en acides nucléiques et la deuxième la fraction enrichie en protéines. Dans ce cas précis, les acides nucléiques doivent être récupérés entre les deux passes, et sans vider le réservoir 3 supérieur du tampon qui contient les protéines qui n'ont pas fini de migrer. Un dispositif tel que précédemment décrit peut ne comprendre que trois électrodes. En effet, les deux cathodes 61 et 81, respectivement affectées au circuit d'électro-séparation et au circuit de lyse, deviennent la cathode commune aux deux circuits. Dans ce cas, la lyse de l'échantillon biologique s'effectue dans le compartiment 32. Un tel dispositif peut être utilisé sur la tranche. Il sera alors facile de l'intégrer dans un automate grâce à ce gain de place. REVENDICATIONS 1. Procédé d'électro-séparation d'un échantillon biologique contenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, selon lequel: (a) on dispose d'une solution tampon, (b) on dispose d'une membrane perméable en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé permettant d'arrêter le matériel nucléique au moins, du côté de ladite solution tampon, (c) on établit un champ électrique, dont les lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, (d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique généré par le champ électrique, caractérisé en ce qu'il consiste, - à appliquer le champ électrique pendant une durée définie, d'une part, par la présence du matériel nucléique au niveau de la membrane, et d'autre part, par le fait que le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou est en cours de migration, - à prélever le matériel nucléique. 2. Procédé d'électro-séparation d'un échantillon biologique contenant des cellules renfermant du matériel nucléique, selon lequel: (a) on dispose d'une solution tampon, (b) on dispose d'une membrane perméable en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé permettant d'arrêter le matériel nucléique au moins, du côté de ladite solution tampon, (c) on établit un champ électrique, dont les lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, (d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique généré par le champ électrique, caractérisé en ce qu'il consiste, - à appliquer un premier champ électrique pour lyser les cellules, - à appliquer un second champ électrique pendant une durée définie, d'une part, par la présence du matériel nucléique au niveau de la membrane, et d'autre part, par le fait que le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou est en cours de migration, - à prélever le matériel nucléique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière en contact avec la solution tampon. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la valeur de la molarité de la solution tampon est au moins égale à 0,1 mol/l, et préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 mol/I. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 150 V. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire. 9. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique. 10. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification. 11. Dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage (la, lb, lc) dudit support avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont celle du champ électrique. 12. Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen de réception (2) de l'échantillon biologique; un réservoir (3) pour la solution tampon, comportant un compartiment (31) fermé par la membrane (4) perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment (31) avec le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir (5) pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes (61, 62) de génération du champ électrique, I'une (61) au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre (62) au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction (9) de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé (31) par la membrane. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le réservoir (3) comprend un autre compartiment (32), pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment (31) selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique. 14. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que les deux réservoirs (3,5) communiquent respectivement avec des évents d'aération (33,53), et avec au moins un canal de remplissage (34). 15. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que un puits intermédiaire (7) est disposé et communique entre le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique et le premier réservoir (3). 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire. 17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu d'électrodes (81,82) assurant une lyse dudit échantillon cellulaire. 18. Dispositif selon la revendication 1 1, caractérisé en ce qu'il comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment (32) de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse (7), et un compartiment de réception (31) de la fraction enrichie en matériel nucléique. 19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que le volume du compartiment de réception (32) du lysat est supérieur au volume du compartiment de réception (31) de la fraction enrichie en matériel nucléique. 20. Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre Y1/2 et 1/50, notamment entre 1/5 et 1/20. 21. Utilisation du dispositif selon les revendications 11 à 20, pour électro-séparer une fraction ou la totalité des acides nucléiques à partir d'un lysat cellulaire. 22. Utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon les revendication 1 à 10 pour détecter et/ou identifier des acides nucléiques directement après amplification.