Brevet FR2776661A1 — publié le 19991001

L'invention concerne un des récepteurs transmembranaires du facteur neurotrophique NGF (facteur de croissance nerveux), le récepteur TrkA qui possède un domaine intracellulaire et un domaine extracellulaire. L'interaction de TrkA avec le NGF, par l'intermédiaire du domaine extracellulaire du récepteur, provoque l'autophosphorylation de celui-ci et l'activation de mécanismes cellulaires. La fonction principale de cette interaction réside dans la stimulation ou l'inhibition de la prolifération, de la différenciation cellulaire, ou de la mort de la cellule par apoptose. Certaines maladies neurodégénératives ainsi que certaines tumeurs néoplasiques sont associées à une expression anormale du récepteur TrkA par les cellules, responsable d'une prolifération et/ou différenciation excessive de ces dernières, et/ou la mort cellulaire. Des études ont été réalisées sur la possibilité de contrôler l'activité du facteur NGF par un effet agoniste ou stimulant vis-à-vis de cette activité, de ligands, tels qu'anticorps, spécifiques du récepteur TrkA. Ainsi, conformément au document WO-97/21732, il est décrit un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire du récepteur TrkA du NGF, et susceptible après fixation sur ledit récepteur soit d'imiter, soit d'inhiber le facteur NGF. Les auteurs de ces travaux ont en particulier obtenu un anticorps monoclonal (mAB)5C3 mimant le facteur NGF, et ils ont observé que la fixation dudit anticorps sur le récepteur TrkA entraînait notamment l'internalisation intracellulaire de ce dernier et/ou sa dimérisation. Outre l'étude de l'activité du récepteur, de tels anticorps peuvent être utilisés à la recherche d'agents pharmacologiques destinés à réguler l'activité du facteur NGF. La Demanderesse a maintenant déterminé une nouvelle approche du récepteur TrkA, pour le diagnostic, la prophylaxie et la thérapie de maladies neurodégénératives. Elle a en effet défini des déterminants antigéniques du récepteur TrkA. A partir des polypeptides ainsi déterminés, qui constituent un premier objet de l'invention, elle a obtenu des anticorps spécifiques dont la présence et la quantification vont permettre une cytolocalisation du récepteur TrkA tout en apportant une information sur la forme dudit récepteur, et donc sur l'activité du facteur NGF. La Demanderesse a en outre observé que selon le processus d'internalisation du récepteur TrkA par le facteur NGF, il se produit une translocation périnucléaire et une translocation nucléaire, cette dernière étant réservée au domaine extracellulaire du récepteur, seule partie de TrkA à être détectée dans le noyau de la cellule, alors que le domaine intracellulaire reste dans la région cytoplasmique. Les découvertes de la Demanderesse sont la base de l'invention présente dont les différents objets sont ci- après présentés. Un premier objet de l'invention est un polypeptide possédant une immunoréactivité vis-à-vis des anticorps dirigés contre la protéine TrkA et consistant en l'un quelconque des polypeptides suivants: le polypeptide commençant à l'acide aminé 71 et finissant à l'acide aminé 87 de la séquence de la protéine TrkA identifiée par SEQ ID NO: 1 et représentée sur l'unique figure, soit en abrégé le polypeptide 71-87, le polypeptide 99-118, le polypeptide 125-141, le polypeptide 265- 283, le polypeptide 379-392, le polypeptide 382-417, et les polypeptides équivalents possédant une immunoréactivité vis-à-vis desdits anticorps, identique ou similaire à celles des polypeptides de référence définis ci-dessus. Avant de déterminer d'autres objets de l'invention, divers termes employés dans la présente description sont définis. Selon l'invention, on entend par "une maladie neurodégénérative", une maladie dans laquelle un processus de mort cellulaire est associé aux troubles physiologiques et/ou cliniques. On classe notamment dans les maladies neurodégénératives, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, la GM1 gangliosidose. Par "polypeptide" selon l'invention, on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. A titre d'exemple de peptide de fusion, on peut citer le peptide obtenu avec la pénétratine (conformément à l'enseignement du document FR- A-2 739 621). Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Ainsi il peut être obtenu par des méthodes de synthèse classique, par exemple dans un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus. Un polypeptide de l'invention peut être glycosylé. En outre un polypeptide de l'invention peut être marqué par tout marqueur conventionnel, tel que marqueur radioactif, fluorescent, enzymatique ou analogue. L'immunoréactivité d'un polypeptide (ou polypeptide immunoréactif) vis-à-vis d'anticorps, définit, selon l'invention, le pouvoir antigénique du polypeptide, à savoir sa capacité à être reconnu spécifiquement par lesdits anticorps pour former un complexe immun, et/ou le pouvoir immunogène du polypeptide, éventuellement après couplage avec un haptène comme le KLH (Keyhole limpet haemocyanin), à savoir sa capacité à induire la production de tels anticorps. Un polypeptide équivalent à un polypeptide de référence diffère de ce dernier par des modifications de la séquence d'acides aminés qui lui confère néanmoins une immunoréactivité identique, similaire, voire supérieure à5 celle du polypeptide de référence. Par anticorps dirigé contre la protéine TrkA, on comprend un anticorps dirigé contre tout ou partie de la protéine TrkA. Un polypeptide de l'invention tel que défini ci- dessus a une séquence peptidique qui consiste avantageusement en l'une quelconque des séquences choisies parmi SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 8, identifiées en fin de description. Il peut en outre être glycosylé. L'invention concerne également un procédé pour détecter, dans un échantillon biologique, tout ou partie de la protéine TrkA, sous une forme liée ou non au facteur de croissance nerveux (NGF), procédé selon lequel on met en contact l'échantillon avec un anticorps dirigé contre au moins un fragment de la protéine TrkA, et on détecte le complexe immun formé entre ledit anticorps et ledit fragment, ledit anticorps étant choisi dans le groupe constitué des anticorps provoquant au moins l'une quelconque des phénomènes suivants: translocation cytoplasmique, périnucléaire ou nucléaire de tout ou partie du récepteur TrkA, suppression de la translocation nucléaire de TrkA, suppression du clivage protéolytique de TrkA et interférence dans la signalisation cellulaire telle que activité agoniste ou antagoniste. Selon une variante préférée de ce procédé, les anticorps sont choisis parmi ceux interagissant spécifiquement avec au moins l'un quelconque des polypeptides suivants: le polypeptide 71-87, le polypeptide 99-118, le polypeptide 125-141, le polypeptide 265-283, le polypeptide 379-392 et le polypeptide 382-417. L'invention concerne aussi un procédé pour détecter, dans un échantillon biologique, un anticorps dirigé contre au moins un fragment immunoréactif de la protéine TrkA, cette dernière étant sous forme liée ou non au facteur de croissance nerveux (NGF), procédé selon lequel on met l'échantillon biologique en contact avec un composé comprenant au moins un fragment immunoréactif, et on détecte la formation d'un complexe immun entre le composé et l'anticorps, ledit fragment immunoréactif consistant en un polypeptide de l'invention. La mise en évidence d'un anticorps conformément au procédé précité peut révéler une dérégulation du fonctionnement biologique du récepteur TrkA, éventuellement associé à une maladie neurodégénérative. Avantageusement le procédé de l'invention est appliqué à un échantillon biologique choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien, une biopsie de tissu, des cellules, un extrait cellulaire. La formation des complexes précités peut être détectée par différents formats de bio-essais classiques bien connus de l'homme du métier, tels que les techniques d'immunoprécipitation, immunocytochimiques, immuno- enzymatiques (ELISA, Western). Enfin l'invention concerne les utilisations suivantes: - l'utilisation d'un polypeptide de l'invention, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative, - l'utilisation d'un anticorps spécifique d'un polypeptide de l'invention, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative, l'utilisation d'un fragment nucléotidique, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative, selon laquelle ledit fragment nucléotidique est choisi parmi les fragments qui codent pour un polypeptide de l'invention.5 Exemple: Protocole de détection de l'internalisation du récepteur TrkA dans la cellule Des cellules PC12 exprimant le récepteur TrkA (B.B. Rudkin, P. Lazarovici, B.Z. Levi, Y. Abe, K. Fujita, G. Guroff, 1989, Cell cycle-specific action of nerve growth factor in PC12 cells: differentiation without proliferation. EMBO J. 8:3319-3325) ont été mises en culture. Les cellules PC12 sont récoltées à l'aide d'une agitation mécanique dans solution saline de tampon phosphate (PBS), puis sont utilisées en l'état (c'est-à- dire sans perméabilisation, ni fixation) ou bien après fixation pendant 15 minutes à température ambiante dans du paraformaldéhyde 1 %. Les cellules sont traitées avec un tampon de blocage (albumine de sérum bovin à 2 % (BSA)20 (Sigma, St Louis, MO), sérum de veau foetal (Gibco/BRL), PBS exempt de Ca2+ et de Mg2+ (TechGen International, France) ou milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et de l'azide de sodium comme conservateur), puis elles sont exposées à des dilutions appropriées d'anticorps de25 l'invention dans le tampon de blocage pendant 20 minutes sur de la glace. Après trois lavages dans du PBS, les cellules sont exposées à un second anticorps marqué par de l'isocyanate de fluorescéine ou par de la phycoérythrine, employé à des dilutions de 1/200 dans du tampon de blocage pendant 20 minutes sur de la glace. Les observations microscopiques sont faites à l'aide d'un microscope à fluorescence Olympus Vanox AH2. LISTAGE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: (B) RUE: (C) VILLE: (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: (ii) TITRE DE L'INVENTION: (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 790 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine TrkA (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:l: cf figure (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA du rat (71-87) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2: LYX1ENQX2X3L QX4LEX5X6DL o X1 représente I ou V, X2 représente Q ou R, X3 représente H ou D, X4 représente H ou R, X5 représente L ou F, X6 représente R ou E. (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA de l'humain et du rat (99-118) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: VKSGLRFVAP DAFHFTPRLS (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA de l'humain et du rat (125-141) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: NALESLSWKT VQGLSLQ (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA (265-283) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CWAENDVGRA EVSVQVX1VS o X1 représente S ou N. (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 14 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA de l'humain et du rat (379-392) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: MDNPFEFNPE DPIP (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 35 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA (382-417) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: PFEFNPEDPI PDTNSTSX1DP VEKKDETPFG SVAVG o X1 représente R ou G. (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 41 résidus d'acide aminé (B) TYPE: acides aminés (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide de la protéine TrkA (382-417) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: PFEFNPEDPI PVSFSPVDTN STSX1DPVEKK DETPFGSVAV G o X1 représente R ou G. REVENDICATIONS 1. Polypeptide possédant une immunoréactivité vis- à-vis des anticorps dirigés contre la protéine TrkA et consistant en l'un quelconque des polypeptides suivants: le polypeptide commençant à l'acide aminé 71 et finissant à l'acide aminé 87 de la séquence de la protéine TrkA identifiée par SEQ ID NO: 1, soit en abrégé le polypeptide 71-87, le polypeptide 99-118, le polypeptide 125-141, le polypeptide 265-283, le polypeptide 379-392, le polypeptide 382-417, et les polypeptides équivalents possédant une immunoréactivité vis- à-vis desdits anticorps, identique ou similaire à celles des polypeptides précités.15 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en l'une quelconque des séquences peptidiques choisies parmi SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 8. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est glycosylé. 4. Procédé pour détecter, dans un -échantillon biologique, tout ou partie de la protéine TrkA, sous une forme liée ou non au facteur de croissance nerveux (NGF), caractérisé en ce qu'on met en contact l'échantillon avec un anticorps dirigé contre au moins un fragment de la protéine TrkA, et on détecte le complexe immun formé entre ledit anticorps et ledit fragment, ledit anticorps étant choisi dans le groupe constitué des anticorps provoquant au moins l'une quelconque des phénomènes suivants: translocation cytoplasmique, périnucléaire ou nucléaire de tout ou partie du récepteur TrkA, suppression de la translocation nucléaire de TrkA, suppression du clivage protéolytique de TrkA et interférence dans la signalisation cellulaire telle que activité agoniste ou antagoniste. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les anticorps sont choisis parmi ceux interagissant spécifiquement avec au moins l'un quelconque des polypeptides suivants: le polypeptide 71-87, le5 polypeptide 99-118, le polypeptide 125-141, le polypeptide 265-283, le polypeptide 379-392 et le polypeptide 382-417. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les anticorps sont choisis parmi ceux interagissant spécifiquement avec au moins un polypeptide10 défini à la revendication 2 ou 3. 7. Procédé pour détecter, dans un échantillon biologique, un anticorps associé à une dérégulation du fonctionnement biologique du récepteur TrkA, procédé selon lequel on met l'échantillon biologique en contact avec un15 composé comprenant au moins un fragment immunoréactif, et on détecte la formation d'un complexe immun entre le composé et l'anticorps, ledit fragment immunoréactif consiste en un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3. 8. Procédé selon la revendication 5 ou 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sérum, le liquide céphalo-rachidien, une biopsie de tissu, des cellules, un extrait cellulaire. 9. Utilisation d'un polypeptide défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative. 10. Utilisation d'un anticorps spécifique d'un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative. 11. Utilisation d'un fragment nucléotidique, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie neurodégénérative, selon laquelle ledit fragment nucléotidique est choisi parmi les fragments qui codent pour un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3.