Brevet FR2778527A1 — publié le 19991119

l 2778527 Nouvelle méthode de production de tocophérols dans les plantes, et plantes obtenues La présente invention concerne une nouvelle méthode de production de tocophérols dans les plantes, et les plantes obtenues à forte teneur en tocophérols. ) La vitamine E et les tocophérols sont des composants essentiels dans les organismes vivants, en particulier végétaux ou animaux, notamment par leurs propriétés antioxydantes. Ils sont d'ailleurs couramment employés en alimentation humaine ou animale, de même qu'en cosmétique. Il est aujourd'hui connu que le niveau d'expression de tocophérols, en particulier de vitamine E dans les plantes, peut être modulé et contrôle err contrôlant l'expression d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse des tocophérols, la para hydroxyphényl pyruvatc dioxygénase, ci-après HPPD (WO 97/27285). Cette HPPD se trouve dans de nombreux organismes vivants, unicellulaires, en particulier bactériens, ou pluricellulaires, en particulier dans les plantes o elle est exprimée dans le cytoplasme cellulaire pour produire de l'homogentisate à partir de l'acide para hydroxyphényl pyruvique (WO 96/38567). Il a d'ailleurs été constaté que les enzymes de plantes étaient des enzymes cytoplasmiques, ne comprenant pas de séquence de type " peptide de transit >> susceptibles de conduire à l'expression d'une protéine mature dans les chloroplastes (Garcia I. & al. (1997) Biochem. J. 325:761-769). L'HPPD est par ailleurs la cible de nombreux herbicides, et il a été constaté que sa surexpression dans des plantes généticalement modifiées par l'intégration dans le génome desdites plantes de gènes codant pour une HPPD sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés pour l'expression de ladite HPPD, permettait d'obtenir une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de cette cnzyme (WO 96/38567). Dans les cellules végétales transformées avec les gènes ci-dessus, il va y avoir une activité HPPD supérieure à cclle normalement trouvée dans une ccllulc végétale du même type non transformée. Cette activité supplémentaire va entraîner la production d'une plus grande quantité d'homogentisatc dans la cellule. Cet homogentisate a deux devenir possibles dans une cellule végétale. Il peut soit être dégradé dans le cytoplasme, soit être transporté dans le chloroplaste pour être utilisé comme précurseur de molécules indispensables au bon fonctionnement de l'appareil chloroplastiquc. Toutefois, si cette surproduction d'homogentisate a lieu dans le cytoplasme une grande quantité de cet homogentisate supplémentaire sera dégradé via l'homogentisate dioxygénase, limitant fortement la possilité d'augmenter de manière substantielle la quantité de tocophérols et de vitamine E produits dans la plante transformée. Bien que l'enzyme naturelle soit une enzyme cytoplasmique, on a maintenant trouvé que le fait d'exprimer une HPPD dans les chloroplastes des plantes permettaient d'augmenter substanticllemcnt la teneur en tocophèrols et en vitamine E desdites plantes transformées, tant vis à vis des plantes non transformées (IIPPD native uniquement) que vis à vis des plantes transformées assurant une surexpression d'"HPPD dans le cytoplasme uniquement, décrites dans l'état de la technique (WO 97/27285). La présente invention concerne donc nouveau procédé de production de tocophérols dans des plantes génétiquement modifiées, lequel procédé consiste à cultiver une plante génétiquement modifiée appropriée pour effectuer la surexpression d'une HPPD dans les chloroplastes des cellules végétales des dites plantes génétiquement modifiées. L'HPPD sureprmimée dans les chloroplastes selon l'invention peut être de différentes origines, notamment d'origine bactérienne ou de plantes, en particulier de Pseudomonas sp, d'Arahidopsis, de carotte, de blé, etc. Plusieurs séquences protéiques d'HPPD et les séquences nucléotidiques codant pour lesdites séquences protéiques, les moyens de les isoler sont décrites dans la littérature, notamment dans la demande de brevet WO 96//38567, dont le contenu est incorporé ici par référence. Il peut également s'agir d'HPPD ayant subi au moins une mutation dans leur région C-terminale, telles que décrites dans la demande de brevet FR 97 14264, dont le contenu est incorporé ici par référence. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, I'HPPD peut être surexprimée dans les chloroplastes par la surexpression dans le cytoplasme d'une protéine de fusion comprenant un peptide de transit lié à l'HPPD à son extrémité N-terminale (peptidc dc transit/HPPD). Les peptides de transit utiles selon l'invention et leurs séquences codantes comprennent tous Ics peptides de transit de précurseurs cytoplasmiques de protéines ou de polypeptides à localisation plastidiale de plantes, préférentiellement chloroplastiques. Il s'agit notamment du peptide de transit dc la petite sous unité de la ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxigénase ou de la protéine de liaison chlorophyllienne a/b décrits avec leurs séquences codantes dans le brevets UIS 5,728,925, dont le contenu est incorporé ici par refércnce. Il s'agit également du peptide de transit de l'EPSPS de plante décrit dans le brevet US 4,940,835, dont le contenu est incorporé ici par référence. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le peptide de transit est un peptide de transit multiple constitué par un premier peptide de transit un d'un précurseur cytoplasmique d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale, une partie de la partie mature N terminale d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale, puis un deuxième peptide de transit d'un précurseur cytoplasmique d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale. De manière préférentielle, le premier et deuxième peptide de transit sont différents. Par ditffrent, on entend selon l'invention des peptides de transit provenant de précurseurs cytoplasmiques de protéines ou polypeptides à localisation l o plastidiale différents, ou des peptides de transit provenant de mêmes précurseurs de protéines ou polypeptides, mais de plantes différentes. Les peptides de transit multiples selon l'invention sont notamment décrits dans le brevet US 5, 633,448 dont le contenu est incorporé ici par référence. De manière préférentielle, le peptide de transit multiple est le peptide de transit optimisé décrit avec sa séquence codante dans le brevet US 5,633,448, comprenant le peptide de transit de la petite sous unité RuBisCO de tournesol, une séquence de 22 acides aminés de la petite sous unité de la RuBisCO de maiïs et le peptide de transit de la petite sous unité de la RuBisCO de maïs. La séquence d'ADN codant pour le peptide de transit optimisé associée à la séquence codant pour une HPPD de Pxeudomonas est représentée par l'identificateur de séquence n l (SEQ ID NO 1), et notamment décrite dans la demande de brevet WO 96/38567. Les gènes chimères comprenant unetelle séquence, les vecteurs de transformation des plantes, les cellules végétales transformées les contenant et les plantes régénérées à partir de ces cellules transformées sont décrits dans la demande de brevet WO 96/38567. Il est entendu que la transformation et la régénération des plantes selon un mode particulier préférentiel dépendra de la plante sélectionnée dans laquelle on souhaite surexprimmer l'HPPD dans les chloroplastes. Il est entendu que les techniques de transformation et de régénération des plantes est maintenant bien connue de l'homme du métier. Ces transformations sont effectuées en particulier par l'introduction de particules accélérées enrobées d'ADN dans les cellules végétales, par l'introduction de l'ADN dans les cellules végétales au moyen d'une agitation du milieu contenant les deux en présence d'aiguilles, par les techniques d'électroporation ou encore au moyen de cellules d'Agrobactérium appropriées. Ces techniques sont notamment décrites dans les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US ,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US ,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5, 484,956, US ,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5, 204,253, US ,405,765, EP 270 615. EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128. Les plantes génétiquement modifiées appropriées pour effectuer une surcxpression de l'HPPD dans les chloroplastes sont en particulier décrites dans la demande de brevet WO 96/38567, dont le contenu est incorporé ici par référence. Sclon un autre mode préférentiel de réalisation de l'invention, I'HPPD peut être 0o surexprimée dans les chloroplastes en introduisant dans le génome chloroplastique desdites plantes un gène codant pour une HPPD sous le contrôle d'éléments de régulation fonctionnels dans les chloroplastes. Les techniques d'insertion de gènes dans les chloroplastes, comme les éléments de régulations appropriés à l'expression desdits gènes dans les chloroplastes sont bien connus de l'homme du métier, et notamment décrits dans les brevets et demandes de brevet suivants: US 5,693,507, US 5,451,513 et WO 97/32977. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, les plantes appropriées pour le procédé selon l'invention sont choisies parmi les plantes monocotylédones ou dicotylédones, en particulier potagères ou de grande culture, notamment choisies parmi les tomates, les céréales, les plantes oléagineuses, et plus particulièrement parmi le maïs, le colza, le soja, le tournesol. Certaines plantes peuvent être modifiées de manière à avoir une teneur en huiles spécifiques différentes de celle trouvées naturellement dans les plantes, de manière à obtenir des plantes à plus haute valeur ajoutée ct à modifier leurs qualités nutritionnelles. Il s'agit notamment de produire des maïs à plus forte teneur en huiles, ou encore des tournesols, des sojas ou des colzas enrichis en acides gras essentiels à santé humaine ou animale. Ces plantes à teneur en huiles modifiées peuvent être obtenues par des méthodes conventionnelles de croisement et de sélection, ou encore par introduction dans le génome desdites plantes d'un ou plusieurs gênes hétérologues dont l'expression permet de modifier le contenu en huiles tant qualitatif que quantitatif. De telles plantes transformées sont notamment décrites dans les brevets suivants: US 5,378,758, US 5,434,283, US5,476,524, US 5,545,821, US 5,602,311, US 5,625,130, US 5,638,637, US 5,668,299 ou US 5,710,366. Les gènes codants pour des protéines susceptibles de modifier le contenu en huiles des plantes, et les plantes transformées les contenant sont notamment décrits dans les brevets et demandes de brevet suivants: WO 98/06862, WO 98/05758, WO 97/48793, WO 97/16559, JP 9 065 882, WO 97/12047, WO 97/07222, WO 96/31609, WO 96/24674, WO 96/02652, JP 6 090 766, WO 93/11245, WO 91/18985, WO 91/13972, US 5,706,603, US 5,704,160, US 5,689,050, US 5, 663,068, US 5,639,790, US 5,614,393, US 5,589,619, US 5,530,186, US 5,512,482, US 5, 500,361, US 5.498,544 ou US 5,254,801. Pour des plantes modifiées de manière à produire des teneurs en huiles à haute valeur ajoutée (tant par la qualité que par la quantité des huiles produites) il cst nécessaire de protéger efficacement les huiles produites, en particulier contre leur oxydation qui les rendraient inexploitatbles ct/ou leur ferait pedre toute valeur. Il a été ainsi constaté pour certains maïs modifiés de manière à produire de grandes quantités d'huiles, tels que ceux décrits dans le brevet US 5,704,160, un phénomène d'oxydation accéléré desdites huiles et de rancissement, qui rendaient les grains de ces maïs inexploitables, en particulier pour l'alimentation animale. En augmentant la production de tocophérols et de vitamine E dans de telles plantes modifiées, il est possible de protéger lesdites huiles produites contre les phénomènes d'oxydation. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la plante dans laquelle IHPPD est surexprimée dans les chloroplastes est une plante à teneur en huiles modifiée telle que décrite ci-dessus. Le gène codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD, ou pour l'expression directe d'HPPD dans les chloroplastes peut être introduit dans les dites plantes soit directement en employant les techniques usuelles du génie génétique, notamment décrites ci-dessus, soit par croisement et sélection avec une plante mère comprenant ledit gène. Dans le cas de plantes modifiées par les techniques de génie génétique de manière à exprimer une ou plusieurs protéines modifiant son contenu cn huiles, tant qualitatif que quantitatif, le ou les gènes codant pour lesdites protéines modifiant le contenu en huiles peuvent être introduits dans le génome de ladite plante simultanément avec le gène codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les gènes seront introduits simultanément et associés dans un même vecteur, en particulier un même plasmide, de manière que les gènes soient toujours associés dans le génomc de la plante transformée. Dans ce cas, non seulement le gène codant pour la protéine de fusion peptide de transit/HPPD permettra de préserver de l'oxydation les huiles de la plante obtenue, et donc sa valeur, mais également du fait de ses propriétés de tolérance à certains herbicides décrites dans la demande de brevet WO 96/38567, il facilitera la sélection des plantes à haute valeur ajoutée dans les programmes de sélection des semenciers. Après culture des dites plantes génétiquement modifiées de manière à surexprimer HPPD dans les chloroplastes, les tocophérols et la vitamine E peuvent être extraits et purifiés, totalcment ou en partie, selon les méthodes usuelles, tant des feuilles que des graines des plantes cultivées. Dans le cas des plantes modifiées de manière à modifier leur teneur en huiles, les tocophérols et la vitamine E peuvent être extraits simultanément avec les huiles des dites plantes cultivées, assurant simultanément la préservation des dites huiles contre les phénomènes d'oxydation et l'enrichissement des dites huiles avec des molécules à hautes valeur ajoutée essentielles à la santé animale et humaine, et à leur alimentation. Selon un mode de réalisation de l'invention, les plantes cultivées ou leurs graines peuvent être employées telles quelles, sans extraction préalable de la vitamine E et des tocophérols comme élément alimentaire, seul ou en mélange destiné à l'alimentation humaine ou animale. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1: Teneur en vitamine E de tabacs modifiés Les tabacs modifiés CY et CO décrits dans les exemples 2 à 5 de la demande de brevet WO 96/38567 ont été cultivés. La teneur en vitamine E dans les feuilles des tabacs cultivés est mesurée après extraction de la vitamine E. Les analyses montrent une teneur en vitamine supérieure pour le tabac CO avec localisation de l'HPPD dans les chloroplastes. L'analyse a été faite de la manière suivante: extraction qualitative non altérante mence à l'aide d'un système de solvant type hexane:isopropanol 3:2 (v/v), mais d'autres mélange sont utilisables. Puis dosage des tocophérols par CLHP selon divers protocoles comme entre autre celui référencé IUPAC 2.432. Exemple 2: Tencur en vitamine E d'un soja modifié Des tissus soja, variété Jack et variété Chapman ont été transformés comme suit Les tissus de soja sont transformés par la technique de bombardement de particules (Finer et Mc Mullen, 1991, In vitro Cell. Dev. Biol. 27P: 175-182.). La régénération du soja est obtenue selon le protocole décrit par Finer et Mc Mullen, 1991. Des suspensions embryogènes sont initiées à partir de cotylédons zygotiques immatures; ces suspensions sont rendues compétentes à la transformation par repiquages successifs sur un milieu contenant du 2.4 D. Les tissus de soja sont alors transformés par la technique de bombardement de particules. La sélection des tissus se fait sur un milieu contenant l'hygromycine comme agent de sélection à la dose de 30 ppm. La régénération des cals embryogènes en plantes fertiles est obtenue par une conversion des cals en embryons par retrait du 2,4 D. Ces embryons sont ensuite enracinés et mis à germer sur un milieu approprié. Les leunes plantes sont transférées en serre. Nous avons obtenu selon ce procédé des sojas Jack et Chapman. Ils comprenent un gène codant pour une protéine de fusion OTP/HPPD, décrite par l'identificateur de séquence n 1, sous le contrôle d'éléments de régulation comprenant un promoteur Double histone et de l'activateur de transcription TEV et un terminateur Nos (construit identique à celle introduite dans les tabacs modifiés CO de l'exemple 1 et représenté schématiquement dans la figure suivante). Représentation schématique du gane de l'OTP/HPPD Promoteur double histone Activateur de transcription (TEV) Peptide de transit optimisé Region codante de I'HPPD * Terminateur nos Ces sojas modifiés, avec une forte activité HPPD dans les plastes, ont montré une tolérance à de très fortes teneurs en isoxaflutole (herbicide inhibiteur d'HPPD). La teneur en vitamine E dans les feuilles et les graines de ces sojas transformés est très nettement supérieure à la teneur en vitamine E des sojas non transformés correspondants. LISTE DE SEQUENCES (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1449 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: OTP (B) EMPLACEMENT:1..372 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: HPPD (B) EMPLACEMENT:373..1446 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: ATG GCT TCG ATC TCC TCC TCA GTC GCG ACC GTT AGC CGG ACC GCC CCT 48 Met Ala Ser Ile Ser Ser Ser Val Ala Thr Val Ser Arg Thr Ala Pro 1 5 10 15 GCT CAG GCC AAC ATG GTG GCT CCG TTC ACC GGC CTT AAG TCC AAC GCC 96 Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn Ala 25 30 GCC TTC CCC ACC ACC AAG AAG GCT AAC GAC TTC TCC ACC CTT CCC AGC 144 Ala Phe Pro Thr Thr Lys Lys Ala Asn Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser 40 45 AAC GGT GGA AGA GTT CAA TAT ATG CAG GTG TGG CCG GCC TAC GGC AAC 192 Asn Gly Gly Arg Val Gln Tyr Met Gln Val Trp Pro Ala Tyr Gly Asn 55 60 AAG AAG TTC GAG ACG CTG TCG TAC CTG CCG CCG CTG TCA ATG GCG CCC 240 Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Ser Met Ala Pro 70 75 80 ACC GTG ATG ATG GCC TCG TCG GCC ACC GCC GTC GCT CCG TTC CAG GGG 288 Thr Val Met Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro Phe Gln Gly 90 95 CTC AAG TCC ACC GCC AGC CTC CCC GTC GCC CGC CGC TCC TCC AGA AGC 336 Leu Lys Ser Thr Ala Ser Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser Ser Arg Ser 105 110 CTC GGC AAC GTC AGC AAC GGC GGA AGG ATC CGG TGC ATG GCA GAT CTA 384 Leu Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met Ala Asp Leu 120 1 TAC GAA AAC CCA ATG GGC CTG ATG GGC TTT GAA TTC ATC GAA TTC GCG 432 Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe Ile Glu Phe Ala 10 15 20 TCG CCG ACG CCG GGT ACC CTG GAG CCG ATC TTC GAG ATC ATG GGC TTC 480 Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu Ile Met Gly Phe 30 35 ACC AAA GTC GCG ACC CAC CGT TCC AAG AAC GTG CAC CTG TAC CGC CAG 528 Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His Leu Tyr Arg Gln 45 50 GGC GAG ATC AAC CTG ATC CTC AAC AAC GAG CCC AAC AGC ATC GCC TCC 576 Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn Ser Ile Ala Ser 60 65 TAC TTT GCG GCC GAA CAC GGC CCG TCG GTG TGC GGC ATG GCG TTC CGC 624 Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly Met Ala Phe Arg 75 80 GTG AAG GAC TCG CAA AAG GCC TAC AAC CGC GCC CTG GAA CTC GGC GCC 672 Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Leu Gly Ala 90 95 100 CAG CCG ATC CAT ATT GAC ACC GGG CCG ATG GAA TTG AAC CTG CCG GCG 720 Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala 110 115 ATC AAG GGC ATC GGC GGC GCG CCG TTG TAC CTG ATC GAC CGT TTC GGC 768 Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile Asp Arg Phe Gly 125 130 GAA GGC AGC TCG ATC TAC GAC ATC GAC TTC GTG TAC CTC GAA GGT GTG 816 Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val 140 145 GAG CGC AAT CCG GTC GGT GCA GGT CTC AAA GTC ATC GAC CAC CTG ACC 864 Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile Asp His Leu Thr 155 160 CAC AAC GTC TAT CGC GGC CGC ATG GTC TAC TGG GCC AAC TTC TAC GAG 912 His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala Asn Phe Tyr Glu 170 175 180 AAA TTG TTC AAC TTC CGT GAA GCG CGT TAC TTC GAT ATC AAG GGC GAG 960 Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Glu 190 195 TAC ACC GGC CTG ACT TCC AAG GCC ATG AGT GCG CCG GAC GGC ATG ATC 1008 Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met Ile 205 210 CGC ATC CCG CTG AAC GAA GAG TCG TCC AAG GGC GCG GGG CAG ATC GAA 1056 Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gln Ile Glu 215 220 225 GAG TTC CTG ATG CAG TTC AAC GGC GAA GGC ATC CAG CAC GTG GCG TTC 1104 Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln His Val Ala Phe 230 235 240 CTC ACC GAC GAC CTG GTC AAG ACC TGG GAC GCG TTG AAG AAA ATC GGC 1152 Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys Ile Gly 245 250 255 260 ATG CGC TTC ATG ACC GCG CCG CCA GAC ACT TAT TAC GAA ATG CTC GAA 1200 Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu 265 270 275 GGC CGC CTG CCT GAC CAC GGC GAG CCG GTG GAT CAA CTG CAG GCA CGC 1248 Gly Arg Leu Pro Asp His Giy Glu Pro Val Asp Gln Leu Gln Ala Arg 280 285 290 GGT ATC CTG CTG GAC GGA TCT TCC GTG GAA GGC GAC AAA CGC CTG CTG 1296 Giy Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu 295 300 305 CTG CAG ATC TTC TCG GAA ACC CTG ATG GGC CCG GTG TTC TTC GAA TTC 1344 Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val Phe Phe Glu Phe 310 315 320 ATC CAG CGC AAG GGC GAC GAT GGG TTT GGC GAG GGC AAC TTC AAG GCG 1392 Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Lys Ala 325 330 335 340 CTG TTC GAG TCC ATC GAA CGT GAC CAG GTG CGT CGT GGT GTA TTG ACC 1440 Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg Gly Val Leu Thr 345 350 355 GCC GAT TAA 1449 Ala Asp i1 REVENDICATIONS 1. Procédé de production de tocophérols dans des plantes génétiquemlent modifiées, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une plante génétiquement modiflée appropriée pour effectuer la surexpression d'une hvdroxvphényl pyruvate dioxvygénasc (I IPPD) dans les chloroplastes des cellules végétales desdites plantes génétiquement modifiées. P. rocédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I'HPPD est surexprimée dans les chloroplastcs par la production dans le cytoplasme d'une protéine de fusion comprenant un pcptidc de transit lié à I'HPPD à son extrémité N-terminale (peptide de transit/HPPD). 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le peptide de transit comprend un peptide de transit d'un précurseur cytoplasmique d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale de plantes, préférentiellement chloroplastiques. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le peptide de transit comprend le peptide de transit de la petite sous unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase ou de la protéine de liaison chlorophyllienne a/b ou lc peptide de transit de l'EPSPS de plante. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le peptide de transit est un peptide de transit multiple constitué par un premier peptide de transit d'un précurseur cytoplasmique d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale, une partie de la partie mature N terminale d'une protéine ou d'un polypcptide à localisation plastidiale, puis un deuxième peptide de transit d'un précurseur cytoplasmique d'une protéine ou d'un polypeptide à localisation plastidiale. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le peptide de transit multiple est le peptide de transit optimisé comprenant le peptide de transit de la petite sous- unité de la RuBisCO de tournesol, unc séquence de 22 acides aminés de la petite sous unité de la RuBisCO de maïs et le peptide de transit de la petite sous-unité de la RuBisCO de maïs. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la protéine de fusion peptide de transit/HPPD a la séquence décrite par l'identificateur de séquence n I (SEQ ID NO 1). 8. Procédé selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que la plante est 1n choisie parmi les tomates, les céréales, les plantes oléagineuses, et plus particulièrement parmi le maïs, le colza, le soja, le tournesol. 9. Procédé selon l'unc decs revendications I à 8, caractérisé cn ce que la plante est une plante à teneur en huile modifiée. 10. Procédé selon l'unc des revendications 1 à 9, caractérisé eCll cc quc les tocophlrols sont extraits et purifiés, totalement ou en partie. 1 1. Procédé selon l'une des rcvcndications 1 à 10, caractérisé en ce quc les plantcs cultivécs ou leurs graines sont employées telles quclles, sans extraction préalable dc la vitaminc E ct des tocophérols comme éléments alimentaircs, seuls ou en mélanges destinés à l'alimentation humaine ou animale.