Brevet FR2777292A1 — publié le 19991015

NOUVELLES CONSTRUCTIONS POUR L'EXPRESSION CONTROLEE DE PROTEINES RECOMBINANTES DANS DES CELLULES PROCARYOTES. L'invencion comprend une nouvelle construction pour l'expression d'un gène codant pour une protéine recombinante d'intérêt placé sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp dans une cellule hôte procaryote, caractérisée en ce que la construction comprend une séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte, des vecteurs contenant ladite construction et les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs. L'invention a également pour objet les procédés de production desdites protéines recombinantes utilisant ces nouvelles constructions. La présente invention s'applique de manière générale à la production de protéines ou de polypeptides recombinants par des méthodes dites de l'ADN recombinant. Plus particulièrement, la présente invention concerne la production de protéines ou de polypeptides recombinants par des cellules hôtes transformées de type bactérien et dont l'expression est dirigée ou est sous le contrôle du promoteur / opérateur Ptrp de l'opéron tryptophane (Nichols & Yanofsky, 1983). Escherichia coli ( E. coli) est l'organisme le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé dans un but de production de protéines recombinantes. Différents systèmes d'expression sont employés dans E. coli et, parmi eux, le promoteur Ptrp de l'opéron tryptophane est considéré comme l'un des plus forts (Yansura & Bass, 1997). Cependann, tous les gènes recombinants ne sont pas exprimés avec la même efficacité par E. coli. Il a été décrit et observé que l'accumulation d'une protéine recombinante produite lors de la culture de cellules hôtes transformées pouvait rapidement conduire à une instabilité plasmidique, à une diminution voire même un 2 2777292 arrêt de la croissance cellulaire et à une diminution du rendement global en produit recombinant. Dans ce cas, il est important de disposer d'un système d'expression contrôlée et régulée permettant de diviser le procédé de production en deux phases, une première dite de croissance cellulaire o l'activité du promoteur est minimale, suivie d'une phase dite d'induction ou de dérépression privilégiant l'expression et l'accumulation de la protéine recombinante. Ptrp, le promoteur de l'opéron tryptophane d'E. coli, est adapté à la production de protéines recombinantes du fait de son caractère inductible. La répression au niveau de l'opérateur de Ptrp est assurée par le produit du gène régulateur trpR lorsque ce produit, également nommé aporépresseur trp, est lié au tryptophane (co-répresseur). L'absence de tryptophane rend la protéine TrpR incapable de se lier à l'opérateur, provoquant ainsi une dérépression de l'opéron tryptophane. Divers exemples d'expression de gènes hétérologues sous le contrôle de Ptrp montrent que la fuite d'expression y est trop importante pour permettre la production, dans des conditions satisfaisantes de protéines recombinantes, notamment celles qui sont toxiques pour la cellule (Yansura et Henner,1990). La protéine régulatrice TrpR est soumise à un mécanisme d'auto- régulation (Kelley & Yanofsky, 1982) et sa concentration tend vers une valeur moyenne de 120 molécules par cellule d'E. coli K-12 en présence d'un excès de tryptophane exogène (Gunsalus, Gunsalus Miguel, & Gunsalus, 1986). Cette concentration, si elle est suffisante pour réguler correctement l'activité de l'unique promoteur chromosomique Ptrp, peut s'avérer limitante face à plusieurs dizaines de vecteurs contenant le même promoteur. Quant au tryptophane, il peut aussi être un facteur limitant même s'il est apporté en excès dans le milieu de culture. Il existe en effet chez E. coli une activité tryptophanase codée par le gène tnaA et capable de dégrader le tryptophane en indole, le détournant ainsi de sa fonction régulatrice (Snell, 1975). De plus, la tryptophanase est inductible par le tryptophane, ce qui rend vaine toute tentative de compenser ce phénomène de dégradation par une augmentation de l'apport en tryptophane. Différentes approches visant à contrôler au mieux la fuite d'expression ont été envisagées et décrites. Cependant, certaines ont l'inconvénient d'être seulement applicables à l'échelle du laboratoire (Hasan & Szybalski, 1995; Suter- Crazzolara & Unsicker, 1995) ou de diminuer le rendement en produit recombinant (Stark, 1987). Par conséquent, il existe aujourd'hui un grand besoin à développer un système d'expression de protéines recombinantes d'intérêt contrôlée et utilisable à grande échelle et permettant en particulier de contrôler la fuite d'expression. Ceci est justement l'objet de la présente invention. L'invention concerne de nouvelles constructions basées sur le système d'expression Ptrp qui lorsqu'elles sont introduites dans une cellule hôte procaryote, de préférence de type bactérien, permettent de réduire l'expression résiduelle de gènes recombinants en début de culture, ces nouvelles constructions apportant un contrôle amélioré de la synthèse de protéines recombinantes. La présente invention a pour objet une construction pour l'expression d'un gène codant pour une protéine recombinante d'intérêt placé sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp dans une cellule hôte procaryote, caractérisée en ce que la construction comprend une séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte. Par protéine recombinante d'intérêt, on entend désigner toutes protéines, polypeptides ou peptides obtenus par recombinaison génétique, et susceptibles 4 2777292 d'être utilisés dans des domaines tels que celui de la santé humaine ou animal, de la cosmétologie, de la nutrition humaine ou animale, de l'agro-industrie ou de l'industrie chimique. Parmi ces protéines d'intérêt on peut citer en particulier mais sans s'y limiter: - une cytokine et notamment une interleukine, un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoïétique (G- CSF, GM-CSF), une hormone telle que l'hormone de croissance humaine ou l'insuline, un neuropeptide, - un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur von Willebrand, l'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine, - une enzyme et notamment la trypsine, une ribonucléase et la 0-galactosidase, - un inhibiteur d'enzyme telle que l'cl anti- trypsine et les inhibiteurs de protéases virales - une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, tels que les produits d'expression de gènes supresseurs de tumeurs, par exemple le gène P53, une protéine capable de stimuler une réponse immunitaire ou un anticorps, tels que par exemple les protéines, ou leurs fragments actifs, de la membrane externe de bactérie Gram négatif, en particulier les protéines OmpA de Klebsiella ou la protéine G du virus respiratoire syncytial humain, - une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives, - une protéine susceptible d'être contenue dans une composition cosmétique telle que la substance P ou une superoxyde dismutase, - une protéine alimentaire - une enzyme capable de diriger la synthèse de composés chimiques ou biologique, ou capable de dégrader certains composés chimiques toxiques, ou encore toute protéine ayant une toxicité vis à vis du micro- organisme qui la produit, en particulier si ce micro-organisme est la bactérie E. coli, comme par exemple, mais sans s'y limiter, la protéase du virus VIH- 1, la protéine ECP (ECP pour "Eosinophile Cationic Protein") ou les protéines 2B et 3B du poliovirus. Par séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte, on entend désigner une séquence nucléique capable de modifier ledit gène de telle sorte que cette modification entraîne la perte de l'activité tryptophanase de ladite cellule hôte, le produit d'expression dudit gène modifié étant incapable de dégrader le tryptophane en indole, le détournant ainsi de sa fonction régulatrice. Parmi lesdites séquences nucléiques capables d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque une desdites séquences nucléiques est introduite dans ladite cellule hôte, on préfère une séquence nucléique codant pour une tryptophanase TnaA inactivée obtenue par mutation telle que par substitution, insertion et/ou délétion d'au moins un nucléotide de la séquence nucléique codant pour une tryptophanase TnaA active. L'invention comprend une construction selon l'invention, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est une bactérie Gram négative, de préférence appartenant à l'espèce E. coli. L'invention concerne également une construction selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre en amont de ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte, tout ou partie de la séquence nucléique du promoteur Ptna de l'opéron tryptophanase. 6 2777292 De préférence l'invention est relative à une construction selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte comprend un fragment muté de la séquence codante de ladite tryptophanase TnaA. De manière préférée, l'invention est relative à une construction selon l'invention, caractérisée en ce que ledit fragment muté est obtenu par l'insertion d'un codon stop à une position telle que la séquence du fragment muté ainsi obtenu code pour un fragment protéique dépourvu d'activité tryptophanase. De manière tout aussi préférée, l'invention est relative à une construction selon l'invention, caractérisée, caractérisée en ce que ledit fragment muté est un fragment muté de la séquence codante de la tryptophanase TnaA de ladite cellule hôte. Pour ce qui concerne la séquence nucléique codant pour la tryptophanase TnaA de E. coli, et à son promoteur Ptna, on se référera dans la présente description à la séquence publiée par Deeley et Yanofsky (1.981). Pour ce qui concerne les séquences nucléiques codant pour le promoteur/opérateur Ptrp de l'opéron tryptophane, on se référera à la séquence publiée par Yanofsky et al. (1981). L'invention concerne également une construction selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte comprend une séquence nucléique comprenant tout ou partie de la séquence d'un promoteur suivie en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp. De préférence l'invention est relative à une construction selon l'invention, caractérisée en ce que ledit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp est tout ou partie du promcteur Ptna de l'opéron tryptophanase d'E. coli. De manière également préférée, l'invention comprend une construction selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp, est la séquence codant pour l'aporépresseur TrpR de l'opéron tryptophane d'E. coli ou un de ses fragments biologiquement actifs telle que celle décrite par Gunsalus et Yanofsky (1980). On entend désigner par une séquence nucléique comprenant tout ou partie de la séquence d'un promoteur, une séquence nucléique comprenant toute la séquence d'un promoteur, ou un de ses fragments biologiquement actifs, capable de diriger ou de contrôler l'expression d'un gène qui lui est relié de manière fonctionnelle. On entendra désigner dans la présente description par fragment biologiquement actif d'un promoteur, toute séquence d'un fragment dudit promoteur, lequel fragment est capable de diriger ou de contrôler l'expression du gène situé en aval dudit fragment, ledit gène étant relié de manière fonctionnelle audit fragment. On entendra désigner dans la présente description par fragment biologiquement actif de l'aporépresseur TrpR de l'opéron tryptophane, tout fragment dudit aporépresseur ayant conservé son activité répresseur Par séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique agissant négativement sur le promoteur Ptrp, on préfère les ribonucléotidiques choisis parmi les séquences suivantes: a) 5' AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC- 3' b) 5' - AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AGCACAACGC GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC AGG-3' c) 5' - AUTJUCAGUACG AAAALUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUU-3' 8 2777292 d) 5' - AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG ULUUCCGGUC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG-3' e) 5' - AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUU- 3' f) 5 ' - AUUCGCGUCU ACGGCUUCAU CGUGUUGCGC AUUCAGUACG AAAAUUGCUU UCAUAAUUCU AGAUACCCUU UUUACGUGAA CUUAGCACAA CGCGCCUGUC ACCGGAUGUG UUUUCCGGUC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACAGG-3' g) 5' - CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC-3' h) 5' - CUUCGCGUCC UGAUGAGUCC GUGAGGACGA AACGGCUUCC AGCACAACGC GCCUGUCACC GGAUGUGUUU UCCGGUCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC AGG- 3' Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur contenant une construction selon l'invention. De manière préférée, le vecteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pMAK705[tnaAt] ou du vecteur pMAK705[Ptna::trpR::3'tna]. L'invention concerne également une cellule hôte procaryote, de préférence une bactérie de l'espèce E. coli., transformée par un vecteur selon l'invention. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production de protéine recombinante dans une cellule hôte utilisant une construction selon 1 'invention. L'invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'invention, dans lequel ladite construction est introduite dans l'ADN de la cellule hôte procaryote. On préfère un procédé de production de protéines recombinantes selon l'invention, dans lequel ladite construction est introduite dans l'ADN de la cellule hôte procaryote par un vecteur selon l'invention, de préférence selon la méthode d'intégration chromosomique décrite dans l'exemple 1 ou 2. 9 2777292 L'invention a en outre pour objet un procédé de production de protéines recombinantes selon l'invention, dans lequel ladite construction est introduite sans autre élément d'ADN qui permettrait d'y associer un avantage sélectif. De manière préférée, l'invention comprend un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'invention, dans lequel ladite construction est introduite au locus de l'opéron tryptophanase d'E. coli, de préférence au locus du gène tna, mieux encore au locus du gène tnaA. On préfère un procédé de production de protéines recombinantes d'intérêt selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la transformation d'une cellule procaryote par un vecteur selonl'invention, et l'intégration de ladite construction dans l'ADN de ladite cellule hôte; b) la transformation de ladite cellule procaryote par un vecteur contenant un gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt c) la culture de ladite cellule transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante; et d) la récupération de la protéine recombinante à partir du milieu de culture ou de ladite cellule transformée. L'invention a en outre pour objet un procédé de production de protéines recombinantes d'intérêt selon l'invention, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre entre l'étape a) et b) du procédé ci-dessus, une étape de résolution et de criblage. L'invention est relative en outre à un procédé de production de protéines recombinantes d'intérêt selon l'invention, dans lequel le contrôle de l'expression des protéines recombinantes avant induction du promoteur Ptrp est obtenu par l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de o 2777292 nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'invention. Enfin, l'invention comprend également un procédé de production selon l'invention, dans lequel l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'invention est obtenue par tout moyen permettant d'exercer un effet inhibiteur ou activateur sur ledit promoteur. De préférence, l'invention comprend un procédé de production selon l'invention, dans lequel l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'invention est obtenue soit: a) par le choix d'une source de carbone appropriée dans le milieu de culture; soit b) par l'ajout de tryptophane dans le milieu de culture; ou par une combinaison de a) et b). Les systèmes de constructions, de vecteurs, les cellules hôtes procaryotes transformées par lesdits vecteurs ainsi que les procédés de l'invention décrits ci-dessus et qui seront exemplifiés dans les exemples ci- après ici entrent dans le cadre du contrôle de la production de protéines recombinantes dans des cellules procaryotes. Ils sont adaptés à l'expression de gènes homologues ou hétérologues placés en aval du promoteur / opérateur Ptrp. Deux mutants sont plus particulièrement décrits ci-après pour illustrer l'invention. Ils portent les noms ICONE 100 et ICONE 200 (ICONE pour Improved Cells for Over- and Non- leaky Expression). Les modifications introduites dans la lignée ICONE présentent les caractéristiques suivantes: 1) elle sont intégrées dans le chromosome de l'hôte, 2) étant générées par une technique de mutagenèse dirigée, elles sont ciblées à un endroit unique de l'ADN ils} 2777292 bactérien, parfaitement connu puisqu'il s'agit de l'opéron tna situé à 83 min sur la carte physique du génome d'E. coli K-12. En cela, les conséquences sur le plan physiologique pour l'hôte sont parfaitement identifiées. En particulier, la possibilité que des fonctions cryptiques soient réactivées suite à l'intégration chromosomique - comme cela est suspecté dans le cas de la mutagenèse aléatoire - est écartée, 3) la technologie employée dans ces exemples pour l'intégration chromosomique (Hamilton et al. (1989)) exclut la possibilité que d'autres séquences s'insèrent dans l'ADN bactérien. Notamment, les mutants ne portent pas de gène de résistance à un antibiotique. Dans le cas o ils seraient utilisés à l'échelle industrielle, ils offrent au producteur et au législateur la garantie qu'ils n'auront pas d'avantage sélectif en cas de dissémination accidentelle dans l'environnement. Selon un aspect de l'invention, un premier type de mutant ou cellule transformée nommé ICONE 100 est décrit, qui porte une mutation dans le gène tnaA entraînant une perte de l'activité tryptophanase. Le phénotype associé à cette mutation est l'absence de dégradation du tryptophane. Ce type de mutant, après transformation par un vecteur rapporteur et culture sur un milieu favorisant habituellement l'activité tryptophanase, s'avère supérieur à l'isolat dont il est issu en termes de contrôle de la répression par le tryptophane. Selon un autre aspect de l'invention, un second type de mutant nommé ICONE 200 est décrit, qui porte une cassette d'expression du gène trpR sous le contrôle du promoteur de la tryptophanase Ptna, intégrée au locus du gène tnaA. L'utilisation du locus tna comme cible pour l'intégration entraîne chez la bactérie hôte une perte de l'activité tryptophanase qui se traduit comme décrit précédemment par une incapacité à convertir le tryptophane en indole. Par ailleurs, la présence de la cassette Ptna::trpR dans le chromosome confère à ce nouveau gène trpR les caractéristiques de Ptna, c'est à 12 2777292 dire une sensibilité à la répression catabolique (Isaacs, Chao, Yanofsky, & Saier. 1994; Botsford & DeMoss. 1971) et l'inductibilité par le tryptophane (Stewart & Yanofsky. 1985). Cette dernière propriété constitue une innovation dans laquelle le promoteur Ptrp plasmidique est contrôlé au niveau de la transcription par un promoteur chromosomique, Ptna, qui lui est antagoniste. De manière surprenante, après transformation par un vecteur d'expression et culture en fermenteur, ICONE 200 s'avère supérieur à l'isolat dont il est issu en termes de contrôle de la répression par le tryptophane. Les bactéries présentant une des caractéristiques mentionnées ci-dessus sont utiles pour la production maîtrisée de molécules recombinantes. Aussi, la présente invention a également pour objet l'utilisation desdites bactéries transformées dans un procédé de production de protéines recombinantes. Dans les exemples ci-dessous, l'avantage apporté par les deux mutants est clairement démontré en utilisant comme protéine recombinante la P-galactosidase d'Escherichia coli. Un autre aspect de l'invention réside dans les caractéristiques des mutations introduites. Celles-ci sont parfaitement définies, contrôlées sur le plan génétique et biochimique, ciblées au locus tna d'E. coli et exemptes de marqueur de sélection. Les microorganismes mutants ou transformés de l'invention sont construits à partir de procaryotes, plus précisément de bactéries Gram- négatives appartenant à l'espèce Escherichia. coli. Les propriétés du promoteur de l'opéron tryptophanase d'E. coli (inductible par le tryptophane, sensible à la répression catabolique) ont été utilisées pour diriger la synthèse transitoire d'un médiateur agissant négativement sur l'expression dirigée par Ptrp. Cependant, il est connu que d'autres espèces bactériennes, en particulier celles qui colonisent le tractus intestinal des animaux, sont capables de synthétiser une tryptophanase inductible par le 13 2777292 tryptophane (Snell. 1975). Par conséquent, d'autres souches que E. coli conviennnent pour Pratiquer les méthodes décrites et y produire des protéines recombinantes. Les exemples et les figures qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légqendes des figures: FIGURE 1: cinétiques de croissance des souches RV308, ICONE 100 et ICONE 200 x pVA-3gal DO 580 nm correspond à la mesure de la densité optique mesurée par spectrophotométrie. FIGURE 2: cinétiques d'activité 3-gal des souches RV308, ICONE 100 et ICONE 200 x pVA-3gal Les bactéries transformées par un vecteur contenant le gène de la 0-galactosidase sous le contrôle du promoteur Ptrp sont cultivées en fermenteur. L'activité p- galactosidase est mesurée par incubation d'un extrait cellulaire en présence d'ONPG (substrat spécifique de la 0-galactosidase). L'invention repose sur l'introduction stable de mutations dans le génome de la souche hôte. Toutes les modifications présentées dans les exemples ci- après sont introduites au locus tna d'E. coli, constitué schématiquement de l'enchaînement suivant: A) promoteur Ptna, B) séquence codante du gène tnaA (tryptophanase), C) région inter- génique D) séquence codante du gène tnaB (tryptophane-perméase), E) terminateur de transcription. Plus précisément, les modifications portent sur l'élément (B). Celui-ci est remplacé au profit d'un élément (b) dont les caractéristiques dans les diverses constructions sont les suivantes: 14 2777292 Tableau 1: nature des mutations portées par ICONE 100 et ICONE 200 Nom du mutant Nature de l'élément (b) séquence codante de tnaA ICONE 100 interrompue en position + 221 par un codon stop et un site de restriction XbaI séquence codante du gène ICONE 200 trpR codant pour l'aporépresseur de Ptrp Exemple 1: construction du mutant ICONE 100 Un fragment d'ADN noté tnaAT est amplifié par PCR. Il s'étend des positions - 275 à + 1054 par rapport au premier nucléotide de la séquence codante de tnaA. Ce fragment qui chevauche le promoteur Ptna et tnaA est amplifié par réaction PCR en deux parties. La partie I s'étend de la position -275 à la position +220. Elle est amplifiée à l'aide des oligonucléotides Trp5 (sens) et Trp2 (anti-sens) dont la séquence est: Trp5: 5'-CGGGATCCGTGTGACCTCAAAATGGTT-3' BamHI Trp2: 3'- CTACGCGCCGCTGCTTCGGATTAGATCTCG-5' (anti-sens) stop XbaI La partie II se situe dans la séquence codante de tnaA, immédiatement en 3' de la partie I. Elle s'étend des positions + 221 à + 1054. Elle est amplifiée à l'aide des oligonucléotides Trp3 et Trp4: Trp3: 5'-CGTCTAGACAGCGGCAGTCGTAGCTAC-3' XbaI Trp4: 3'CCTTCTCTAACCGCAACAGTTCGAACG-5' (anti-sens) HindIII 2777292 Les réactions de PCR sont effectuées en utilisant comme matrice des colonies d'E. coli K-12 lysées dans le tampon de la Taq polymérase (AmpliTaq Gold CETUS, USA). Les produits d'amplification sont précipités à l'éthanol puis digérés avec les enzymes de restriction appropriées (BamHI - XbaI pour la partie I, XbaI - HindIII pour la partie II). Une analyse sur gel d'agarose coloré au BET permet de vérifier que les fragments ont la taille attendue (Deeley & Yanofsky. 1981). Le fragment tnaAT est généré en liguant les deux fragments I et II au site XbaI. Il diffère de la séquence naturelle par la présence d'un codon stop en position + 221 suivi d'un site de restriction XbaI. Ce fragment tnaAT est cloné aux sites BamHI / HindIII dans le vecteur pRIT28 (Hultman, Stahl, Hornes, & Uhlen. 1989) et séquencé. Le fragment tnaAT est sous-cloné dans le vecteur pMAK705 (Hamilton, Aldea, Washburn, Babitzke, & Kushner. 1989), donnant pMAK705[tnaAT]. La méthode employée pour générer un réarrangement génétique chez E. coli est celle décrite par Hamilton et al. (1989). Elle est basée sur l'emploi du vecteur suicide pMAK705 qui porte une origine de réplication thermosensible, fonctionnelle à 30 C mais inactive au- delà de 42 C, ainsi que le gène de résistance au chloramphénicol (CMP). E. coli RV308 (Maurer, Meyer, & Ptashne. 1980) est transformé par 4 pg du vecteur pMAK705[tnaAT] et le mélange de transformation est étalé sur boîtes de milieu LB + CMP 20 kg/ml. Après incubation une nuit à 30 C, trois clones sont repiqués en milieu liquide LB + CMP 20 pg/ml et incubés à 30 C sous agitation jusqu'à atteindre une DO à 580 nm voisine de 1. Les suspensions sont ensuite étalées sur milieu LB + CMP jg/ml et incubées à 44 C et à 30 C. Les colonies qui se développent à 44 C (= co-intégrants) sont porteuses d'une intégration chromosomique du vecteur, cette intégration étant favorisée par l'existence d'homclogies 16 2777292 de séquence entre le chromosome et].'insert porté par le vecteur. La phase dite de résolution consiste à favoriser l'excision du vecteur par un mécanisme de recombinaison entre des séquences répétées présentes sur le chromosome. Quelques clones isolés à 44 C sont cultivés en milieu liquide LB + CMP 20 Mg/ml à 30 OC pendant trois jours en renouvelant le milieu régulièrement. Les suspensions sont ensuite diluées, étalées sur milieu gélosé LB + CMP 20 Mg/ml et incubées à 30 OC jusqu'à l'apparition de colonies individualisées. Plusieurs dizaines de colonies sont repiquées en double sur milieu gélosé LB + CMP 20 Mg/ml à 30 OC et 44 C. Les colonies qui ne se développent pas à 44 C sont retenues et criblées par une réaction de PCR indiquant si la résolution du vecteur a conservé le codon stop et le site XbaI au locus tna. Les oligonucléotides utilisés sont Trp6 (sens) et Trp7 (anti- sens), respectivement homologues à la mutation désirée et à une partie du terminateur de tnaA: Trp6: 5'-CGACGAAGCCTAATCTAGA-3' stop XbaI Trp7: 3'-CCGATATTCCTACAATCGG-5' (anti-sens) Sur dix-huit clones criblés, neuf donnent un fragment d'amplification de la taille attendue indiquant la présence du codon stop suivi du site XbaI dans le gène tnaA. Les neuf autres clones ne donnent pas de produit d'amplification, probablement parce que l'étape de résolution a restauré sur le chromosome le gène tnaA non muté. Parmi les neuf clones positifs, quatre sont prélevés et soumis à un curage du plasmide par repiquages successifs en absence de pression de sélection. Après quelques jours de culture, on obtient des clones redevenus sensibles au chloramphénicol. 17 2777292 La présence de la mutation inactivant tnaA est confirmée de deux manières différentes: d'abord, une amplification par PCR à l'aide des oligonucléotides Trp5 et Trp4 suivie d'une digestion par XbaI montre que le site de restriction, absent chez E. coli RV308, est présent dans le gène tnaA des mutants; ensuite, par une culture des mutants dans un milieu riche en tryptophane suivie du test à l'indole (ajout du réactif de Kovacs dans le milieu de culture), on montre que les mutants n'ont pas généré d'indole alors que la souche RV308 d'origine produit de l'indole dans les mêmes conditions. On en déduit que la mutation introduite entraîne une perte de l'activité tryptophanase. Un clone est sélectionné en vue d'une conservation sous forme congelée. Il est nommé ICONE 100. Exemple 2: construction du mutant ICONE 200 Un fragment d'ADN est construit in vitro par amplification PCR de trois sous-unités: La première sous-unité située dans le promoteur Ptna s'étend des positions - 511 à +3 par rapport au premier nucléotide de la séquence codante de tnaA. Elle est amplifiée à partir des oligonucléotides TrpR1 (biotinylé en 5') et TrpR2: TrpR1: 5'-CTGGATCCCTGTCAGATGCGCTTCGC-3' BamHI TrpR2: 3'-CTTCCTAATACATTACCGGGTTG-5' (anti-sens) La seconde sous- unité correspond à la séquence codante du gène trpR d'E. coli. Elle est amplifiée à partir des oligonucléotides TrpR3 et TrpR4 (bioCinylé en '): TrpR3: 5'-GTAATGGCCCAACAATCACC-3' start 18 2777292 TrpR4: 3'-CACAACGACTTTTCGCTAACTGACGTCAG-5' (anti-sens) PstI La troisième sous-unité correspond à la séquence située immédiatement en 3' de la séquence codante de tnaA. Elle contient la région intergénique de l'opéron tna et une partie du gène tnaB codant pour la tryptophane-perméase. Elle est amplifiée à partir des oligonucléotides TrpR5 et TrpR6: TrpR5: 5'CGCTGCAGTTAATACTACAGAGTGG-3' PstI TrpR6: 3'- CCAGCTAATGAGGTAAGTTCGAAC-5' (anti-sens) HindIII Les fragments amplifiés sont purifiés selon la méthode GeneClean (BiolOl, La Jolla, CA, USA). Les sous-unités I et II sont fusionnées de la manière suivante. Dans deux tubes séparés, chaque sous- unité est mise en incubation avec 30 M1 de billes marquées à la streptavidine (Dynabeads, DYNAL, Norvège). Après 20 min à 37 C et 5 min à température ambiante, l'ADN fixé est dénaturé par 50 pl de NaOH 0,15 M. Les ADN simple-brin récupérés dans chaque surnageant sont mélangés à parts égales et soumis à une réaction d'hybridation et d'extension en présence de la Taq polymérase (AmpliTaq Gold, CETUS, USA) suivant cinq cycles de PCR. Le produit de la réaction est amplifié dans une réaction PCR à l'aide des oligonucléotides TrpR1 et TrpR4. Le produit d'amplification purifié par GeneClean est digéré par BamHI et PstI. Le fragment ainsi isolé est cloné dans le vecteur pRIT28 pour donner pRIT28[Ptna ::trpR], puis séquencé. 19 2777292 La sous-unité III est digérée par les enzymes PstI et HindIII puis clonée dans pRIT28 pour donner pRIT28[3'tna], puis la séquence est vérifiée par séquençage ADN (ABI 373A, Perkin Elmer, USA). Le vecteur pRIT28[Ptna::trpR] est digéré par les enzymes PstI et HindIII puis ligué en présence de la sous-unité III elle-même isolée à partir de pRIT28[3'tna] par double digestion PstI/HindIII. Le vecteur résultant est nommé pRIT28[Ptna: :trpR::3'tna]. L'insert est transféré dans pMAK705 après double digestion par les enzymes BamHI et HindIII. Le plasmide résultant est nommé pMAK705[Ptna: trpR::3'tna]. L'intégration de la fusion Ptna::trpR::3'tna au locus tna d'E. coli RV308 est réalisée dans des conditions analogues à celles décrites dans l'exemple 1. Brièvement, la souche est transformée par le vecteur pMAK705[Ptna::trpR: :3'tna] puis soumise aux étapes d'intégration et de résolution. Le criblage des colonies en fin de résolution fait appel à des conditions légèrement différentes de celles de l'exemple 1. Le locus tna est amplifié par PCR à partir des oligonucléotides TrpRll et TrpR7: TrpRll: 5'-GGGCAGGTGAACTGCTGGCG-3' TrpR7: 3'-GGTGCCGTTATAAGGGTCGGAC-5' (anti-sens) TrpRll s'hybride avec la séquence de Ptna en amont (5') de TrpRl, et TrpR7 s'hybride avec la séquence de tnaB, en aval (3') de TrpR6. Le produit d'amplification a une taille différente suivant que le gène placé en aval de Ptna est tnaA (situation rencontrée dans RV308) ou trpR (situation recherchée chez les mutants). Une colonie possédant trpR au locus tna est conservée et nommée ICONE 200. Une analyse de sa séquence chromosomique montre qu'elle possède le gène trpR immédiatement en aval du promoteur Ptna. Une culture en présence de tryptophane 2777292 atteste l'absence de formation d'indole, ce qui est une conséquence logique de la perte du gène tnaA. Exemple 3: fuite d'expression en présence de succinate + tryptophane Cet exemple décrit les capacités relatives de E. coli RV308, ICONE 100 et ICONE 200 à contrôler l'expression d'une protéine recombinante sous le contrôle du promoteur Ptrp. A cet effet, nous avons construit un vecteur d'expression noté pVA-3gal dans lequel la séquence codant pour la 0-galactosidase d'E. coli est placée en aval du promoteur Ptrp. Le vecteur d'origine utilisé pour cette construction est pVAABP308 (Murby, Samuelsson, Nguyen, et al. 1995). Chacune des trois souches est transformée par le vecteur pVA-Pgal. Les transformants obtenus sont cultivés individuellement dans un milieu complet (Tryptic Soy Broth (DIFCO) 30 g/l, Yeast Extract (DIFCO) 5 g/l) pendant une nuit à 37 C. Un aliquot de ces précultures est transféré dans 60 ml de milieu M9.YE.SUCC (solution de sels M9 1X (DIFCO), Yeast Extract (DIFCO) 5 g/l, succinate de sodium 20 g/l). Après un temps d'incubation à 37 C permettant d'atteindre la phase exponentielle de la croissance, un prélèvement est effectué sur chaque culture. La croissance est estimée par la Densité Optique à 580 nm de la suspension bactérienne. Le niveau d'activité 3-galactosidase est mesuré dans chaque culot cellulaire. Pour cela, 1 ml de culture est centrifugé 3 min à 12000 g. Le culot cellulaire est repris dans 900 gl de tampon (Tris- HCl 50 mM pH 7,5 - EDTA 1 mM NaCl 100 mM - lysozyme 400 Mg/ml) et incubé 15 min à 37 C. 100 MI de SDS (1% dans Tris-HCl 50 mM pH 7,5) sont ajoutés et l'échantillon est placé 5 min à température ambiante. Le35 dosage s'effectue en mélangeant 30 Mi d'échantillon, 204 j1 de tampon (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 - MgCl2 1 mM) et 66 pl d'ONPG (4 mg/ml dans Tris-HCl 50 mM pH 7,5). Le 21 2777292 mélange réactionnel est placé en incubation à 37 C. La réaction est stoppée par l'ajout de 500 il de Na2CO3 1 M. La DO à 420 nm rapportée au temps d'incubation est proportionnelle à l'activité 0-galactosidase présente dans l'échantillon. Sachant que E. coli RV308 a une délétion complète de l'opéron lac (Maurer, Meyer, & Ptashne. 1980), l'activité 0galactosidase mesurée est uniquement due à l'expression du gène porté par le vecteur pVA-3gal. Le tableau 2 résume les résultats obtenus avec chacune des souches RV308, ICONE 100 et ICONE 200. Tableau 2: croissance des souches RV308, ICONE 100 et ICONE 200 et fuite d'expression (moyenne et écart-type sur trois expériences) DO 580 nm P3-GAL (U/ml) RV308 2,47 0,01 0,93 0,09 ICONE 100 3,69 0,24 0,21 0,03 ICONE 200 2,43 0,03 0,02 0,00 Les résultats du tableau 2 montrent que les mutants de la lignée ICONE se développent au moins aussi bien que la souche RV308 dont ils sont issus. Les mutations introduites n'ont donc pas d'effet négatif sur la croissance. Par ailleurs, l'activité 3-galactosidase mesurée est différente chez les trois souches. ICONE 100 possède une activité intracellulaire environ 4,5 fois inférieure à celle de RV308. Dans des conditions - succinate comme source de carbone - o l'activité du promoteur Ptna est maximale (Botsford & DeMoss. 1971), la délétion du gène de la tryptophanase conduit donc à une réduction de la fuite d'expression, probablement en limitant la dégradation du tryptophane intracellulaire (co-répresseur). Dans ces mêmes conditions, le niveau de 22 2777292 fuite d'expression chez ICONE 200 est encore diminué d'un facteur 10 par rapport à ICONE 100. L'activité du promoteur Ptrp plasmidique est donc minimale chez ICONE 200. D'une part, la perte de l'activité tryptophanase donne à la bactérie la possibilité de mieux contrôler Ptrp comme cela est démontré pour ICONE 100. Mais ICONE possède une seconde caractéristique qui la distingue d'ICONE 100 sur le plan génétique et lui donne au niveau expérimental un avantage supplémentaire en termes de contrôle de l'expression. Ainsi, dans des conditions o Ptna est actif, ICONE 200 a la possibilité de diriger la surexpression de l'aporépresseur TprR et par conséquent la fuite d'expression mesurée au niveau du promoteur Ptrp plasmidique est réduite d'un facteur proche de 50 par rapport à la souche d'origine RV308. Exemple 4: fuite d'expression en présence de qlycérol + tryptophane Cet exemple démontre l'avantage apporté par le mutant ICONE 200 dans un milieu de culture et des conditions de fermentation proches de celles qui pourraient être utilisées industriellement pour produire des protéines recombinantes avec le système Ptrp. Chacune des trois souches RV308, ICONE 100 et ICONE est transformée par le vecteur pVA-3gal. Les transformants obtenus sont cultivés individuellement dans ml de milieu complet (Tryptic Soy Broth (DIFCO) 30 g/l, Yeast Extract (DIFCO) 5 g/l) pendant une nuit à 37 C. La suspension cellulaire obtenue est transférée stérilement dans un fermenteur (modèle CF3000 de Chemap, capacité 3,5 1) contenant 1,8 litres du milieu suivant (concentrations pour 2 litres de culture finale): glycérol 90 g/l, (NH4)2S04 5 g/l, KH2PO4 6 g/l, K2HPO4 4 g/l, Na3-citrate 2H20 9 g/l, MgSO4 7H20 2 g/l, extrait de levure 1 g/l, CaCl2 2H20 30 mg/l, ZnSO4 7H20 8 mg/l, CoCl2 6H20 7 mg/l, Na2MoO4 2H20 7 mg/l, MnSO4 1H20 10 23 2777292 mg/l, H3B03 2 mg/l, CuS04 5H20 8 mg/l, FeC13 6H20 54 mg/l, antimousse 0, 06 %, tétracycline 8 mg/l, tryptophane mg/1. Le pH est régulé à 7,0 par ajout d'ammoniaque. Le taux d'oxygène dissous est maintenu à 30% de la saturation par asservissement de la vitesse d'agitation puis du débit d'aération à la mesure de 1'02 dissous. Lorsque la Densité Optique de la culture atteint une valeur comprise entre 40 et 45, on procède à l'induction par l'ajout de 25 mg/1 d'acide indole-acrylique (SIGMA). Une analyse en cinétique de la densité optique de la culture (DO à 580 nm de la suspension) et de l'activité 0-galactosidase intracellulaire (voir exemple 3) est effectuée. Les figures 1 et 2 illustrent respectivement les cinétiques de croissance et d'activité - galactosidase des trois cultures. Les données présentées en figure 1 confirment l'observation de l'exemple 3: les trois souches ont des cinétiques de croissance comparables. Les mutants de la lignée ICONE ont de ce point de vue conservé le potentiel de croissance de E. coli RV308 et ils demeurent donc des candidats potentiels pour une utilisation industrielle. Les données de la figure 2 montrent l'impact des mutations portées par les souches ICONE sur l'expression de la 3-galactosidase en fermenteur. Clairement, sur un milieu à base de glycérol, la présence ou l'absence de l'activité tryptophanase n'a pas d'effet sur le contrôle de l'expression comme en atteste la première partie des courbes RV308 et ICONE 100, même si l'on constate que le tryptophane exogène disparaît plus rapidement dans la culture RV308 que dans celle d'ICONE 100 (données non présentées). En revanche, le mutant ICONE 200 présente de meilleures capacités à contrôler l'expression en début de culture: l'activité P-galactosidase reste faible pendant les 18 premières heures de culture puis commence à augmenter à partir de t = 20 h, moment o la concentration en tryptophane extracellulaire devient nulle (données non présentées). La deuxième partie de la 24 2777292 courbe concernant ICONE 200 montre que l'activité - galactosidase augmente régulièrement pour atteindre un niveau en fin de culture proche de celui obtenu avec RV308. En cela, nous démontrons que le système de5 régulation présent chez ICONE 200 apporte un contrôle transitoire du promoteur Ptrp plasmidique. Ce contrôle, exercé par le tryptophane et/ou la source de carbone, devient inopérant dans la deuxième partie de la culture et ne vient pas s'opposer à une expression maximale de la protéine recombinante. 2777292 Bibli ographie Botsford, J.L., & DeMoss, R.D. (1971). Catabolite repression of tryptophanase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 105, 303-312. Deeley, M.C., & Yanofsky, C. (1981). Nucleotide sequence of the structural gene for tryptophanase of Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology, 147, 787-796. Gunsalus, R.P., Yanofsky, C. (1980). Nucleotide sequence and expression of E. coli trpR, the structural gene for the trp aporepressor. Proceeding of the National Academy os Sciences, USA, 77, 12, 7117-7121. Gunsalus, R.P., Gunsalus Miguel, A., & Gunsalus, G.L. (1986). Intracellular Trp repressor levels in Escherichia coli. 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Maurer, R., Meyer, B.J., & Ptashne, M. (1980). Gene regulation at the right operator (OR) of bacteriophage lambda. I. OR3 and autogenous negative control by repressor. Journal of Molecular Biology, 139, 147-161. Murby, M., Samuelsson, E., Nguyen, T.N., Mignard, L., Power, U., Binz, H., Uhlen, M., & Stahl, S. (1995). Hydrophobicity engineering to increase solubility and stability of a recombinant protein from respiratory syncytial virus. European Journal of Biochemistry, 230, 38-44. Nichols, B.P., & Yanofsky, C. (1983). Plasmids containing the trp promoters of Escherichia coli and Serratia marcescens and their use in expressing cloned genes. Methods in Enzymology, 101, 155-164. Snell, E.E. (1975). Tryptophanase: structure, catalytic activities, and mechanism of action. Advances in Enzymology and Related Areas of Mo].ecular Biology, 42, 287-333. Stark, M.J.R. (1987). 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Construction pour l'expression d'un gène codant pour une protéine recombinante d'intérêt placé sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp dans une cellule hôte procaryote, caractérisée en ce que la construction comprend une séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte. 2. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est une bactérie Gram négative. 3. Construction selon la revendication 1, caractérisée en ce que la cellule hôte procaryote est E. coli. 4. Construction selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre en amont de ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte, tout ou partie de la séquence nucléique du promoteur Ptna de l'opéron tryptophanase. 5. Construction selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte comprend un fragment muté de la séquence codante de ladite tryptophanase TnaA. 6. Construction selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit fragment muté est obtenu par l'insertion d'un codon stop à une position telle que L9 2777292 la séquence du fragment muté ainsi obtenu code pour un fragment protéique dépourvu d'activité tryptophanase. 7. Construction selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que ledit fragment muté est un fragment mutée de la séquence codante de la tryptophanase TnaA de ladite cellule hôte. 8. Construction selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique capable d'inactiver le gène codant pour une tryptophanase TnaA lorsque ladite séquence nucléique est introduite dans ladite cellule hôte comprend une séquence nucléique comprenant tout ou partie de la séquence d'un promoteur suivie en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp. 9. Construction selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp est tout ou partie du promoteur Ptna de l'opéron tryptophanase d'E. coli. 10. Construction selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que ladite séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp est la séquence codant pour l'aporépresseur TrpR de l'opéron tryptophane d'E. coli ou un de ses fragments biologiquement actifs. 11. Vecteur contenant une construction selon l'une des revendications 1 à 10. 2777292 12. Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pMAK705[tnaAt] ou du vecteur pMAK705[Ptna::trpR::3'tna]. 13. Cellule hôte procaryote transformée par un vecteur selon l'une des revendications 11 à 12. 14. Cellule hôte procaryote selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'E. coli. 15. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte utilisant une construction selon l'une des revendications 1 à 10. 16. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendication 15, dans lequel ladite construction est introduite dans l'ADN de la cellule hôte procaryote. 17. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendication 15 ou 16, dans lequel ladite construction est introduite dans l'ADN de la cellule hôte procaryote par un vecteur selon la revendication 11 ou 12. 18. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 15 à 17, dans lequel ladite construction est introduite dans l'ADN de la cellule hôte procaryote selon la méthode d'intégration chromosomique décrite dans l'exemple 1 ou 2. 19. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 15 à 18, dans lequel ladite construction est introduite sans autre élément d'ADN qui permettrait d'y associer un avantage sélectif. 31 2777292 20. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 15 à 19, dans lequel ladite construction est introduite au locus de l'opéron tryptophanase d'E. coli. 21. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 15 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a)la transformation d'une cellule procaryote par un vecteur selon la revendication 11 ou 12, et l'intégration de ladite construction dans l'ADN de ladite cellule hôte; b)la transformation de ladite cellule procaryote par un vecteur contenant un gène codant pour ladite protéine recombinante d'intérêt c)la culture de ladite cellule transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante; et d)la récupération de la protéine recombinante à partir du milieu de culture ou de ladite cellule transformée. 22. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendications 21, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre entre l'étape a) et b), une étape de résolution et de criblage. 23. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon l'une des revendications 15 à 22, dans lequel le contrôle de l'expression des protéines recombinantes avant induction du promoteur Ptrp est obtenu par l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'une des revendications 8 à 10. 24. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt selon la revendication 23, dans lequel 32 2777292 l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'une des revendications 8 à 10 est obtenue par tout moyen permettant d'exercer un effet inhibiteur ou activateur sur ledit promoteur. 25. Procédé de production selon la revendication 24, dans lequel l'induction dudit promoteur suivi en 3' d'une séquence nucléique codant pour une molécule de nature ribonucléotidique ou protéique agissant négativement sur le promoteur Ptrp selon l'une des revendications 8 à 10 est obtenue soit: a)par le choix d'une source de carbone appropriée dans le milieu de culture; soit b)par l'ajout de tryptophane dans le milieu de culture; ou c) par une combinaison de a) et b)