Brevet FR2775480A1 — publié le 19990903

La présente invention concerne la collecte de sang et, plus particulièrement, concerne des tubes de prélèvement sous vide ou des tubes d'écoulement par gravité pour la collecte d'échantillons de sang et l'utilisation dans ceux-ci d'additifs pour prévenir la coagulation du sang dans la préparation de plasma sanguin ou de sang entier pour des essais tant chimiques qu'hématologiques. L'invention concerne aussi des déterminations diagnostiques qui utilisent l'enzyme protéase thrombine comme moyen d'amplification. Les échantillons de sang sont habituellement prélevés dans des tubes sous vide, tels que des tubes de collecte d'échantillon sous vide de marque VACUTAINER en verre (Becton Dickinson and Company). Une extrémité d'une aiguille à deux pointes est insérée dans une veine d'un patient. L'autre extrémité de l'aiguille troue ensuite un septum recouvrant l'extrémité ouverte d'un tube de collecte d'échantillon sous vide de telle sorte que le vide dans le tube aspire l'échantillon de sang dans le tube par l'intermédiaire de l'aiguille. En utilisant cette technique, on peut prélever plusieurs échantillons en utilisant une seule piqûre d'aiguille dans la peau. On a aussi proposé des tubes en matière plastique pour la collecte de sang. Le plastique offre plusieurs avantages du fait, par exemple, qu'il se casse moins que les tubes en verre, pèse moins lourd pour les expéditions, et est plus facilement mis au rebut par incinération. De façon similaire, les tubes de collecte d'échantillon conçus pour une collecte par gravité d'échantillons plus petits, comme un échantillon de sang de bébé, sont également utilisés avec les mêmes techniques. Un tel type de tube plus petit est le tube de collecte d'échantillon de marque MICROTAINER vendu par Becton Dickinson and Company. Des échantillons de sang collectés dans des tubes sous vide sont préparés pour un examen clinique dans un état soit coagulé, soit non coagulé (anticoagulé). Dans cette dernière catégorie, qui est l'objet de cette invention, on utilise des agents anticoagulants. Il y a plusieurs anticoagulants habituellement utilisés dans la technique. On peut généralement les classer dans les agents chélatants du calcium ou dans les inhibiteurs de thrombine. Les agents chélatants du calcium agissent en éliminant le calcium d'une solution dans le sang sous la forme d'ions libres. Ceci inhibe la coagulation parce que le calcium est un ion divalent nécessaire à la fonction enzymatique du sang. L'acide citrique, l'éthylènediaminetétraacétate (EDTA), les fluorures et les oxalates sont des anticoagulants chimiques qui rentrent dans la catégorie des agents chélatants du calcium. La thrombine est une sérine-protéase dérivant du sang qui convertit le fibrinogène en fibrine. La fibrine, à son tour, polymérise en un réseau qui provoque la gélification ou la coagulation du sang. En tant que telle la thrombine est une enzyme essentielle dans l'hémostase, et l'interruption de la fonction de la thrombine peut donc empêcher la coagulation du sang. Les inhibiteurs de thrombine interfèrent directement avec la fonction enzymatique de la thrombine en bloquant l'interaction avec le fibrinogène. L'hirudine et l'héparine (par l'intermédiaire du complexe antithrombine/héparine ATIII) sont des anticoagulants biochimiques rentrant dans la catégorie des inhibiteurs de thrombine. L'hirudine et l'héparine sont bien connues dans le domaine de l'hématologie. Les anticoagulants chélatants du calcium et inhibiteurs de thrombine ont des interférences caractéristiques avec une analyse clinique en aval. Par exemple, on utilise avec succès l'EDTA dans environ 35 % des tubes d'hématologie (formes tripotassique, disodique, dipotassique, et liquide), mais il peut induire une agrégation globulaire. L'EDTA n'est généralement pas utilisable dans des recherches diagnostiques d'acides nucléiques utilisant des réactions d'amplification d'ADN telles que l'amplification en chaine par polymérase (ACP), qui est importante dans les marchés en essor de l'analyse cellulaire et des tests de charge virale. Egalement, l'EDTA a un effet inhibiteur dans des déterminations de stimulation de cellules T. Les oxalates peuvent provoquer une contraction ou une dilatation des globules, ce qui complique les mesures de volume cellulaire. Les fluorures utilisés dans les dosages de glucose sont des anticoagulants relativement médiocres et peuvent provoquer une hémolyse. L'héparine ne peut pas être utilisée dans des tubes de coagulation parce que l'héparine interfère avec les enzymes de la cascade de coagulation ainsi qu'avec 'ACP. Le citrate est largement utilisé dans des déterminations de coagulation et c'est un anticoagulant de choix pour l'ACP, mais le citrate pose certains problèmes dans les cultures cellulaires ou virales. L'hirudine, qui est un anticoagulant puissant dérivant des sangsues, et les analogues synthétiques d'hirudine, ne sont pas encore largement utilisés dans l'industrie du fait de leur coût et de leur disponibilité. On a également développé des aptamères ou ligands acides nucléiques à la thrombine, qui inhibent la coagulation du sang (Kubik, M.F. et al., Nucl. Acids Res. 22, 2619 (1994) et Bock L.C. et al., Nature 355, 564 (1992)). Ces ligands acides nucléiques n'ont été utilisés dans aucun produit du commerce. Un autre problème de l'anticoagulation est celui de la réversibilité. Dans certains tests diagnostiques du sang, il est utile de potentialiser la cascade de coagulation en inversant l'état anticoagulé. Par exemple, lors de la détermination d'un dysfonctionnement de la coagulation du' sang, il est de pratique courante dans la technique d'utiliser du plasma sanguin citraté parce que l'état anticoagulé peut être rapidement inversé par addition de calcium exogène qui rétablit le taux calcique nécessaire à la fonction enzymatique du sang. L'anticoagulation de sang héparinisé peut être inversée par addition d'héparinase, une enzyme qui digère l'héparine et élimine le complexe héparine/ATIII inhibant la coagulation. Toutefois, contrairement au calcium et à l'héparine, on ne connaît aucun agent inversant pour l'hirudine. Ainsi, seule l'hirudine est appropriée pour des échantillons de sang anticoagulés de façon permanente. La réversibilité des effets de ligands acides nucléiques n'a également pas été démontrée dans la technique. Les déterminations sanguines seraient significativement simplifiées si on pouvait utiliser un échantillon de sang unique pour des applications au sang entier, au plasma et au sérum. Ainsi, on a besoin dans la technique d'un "anticoagulant universel" qui n'interfère pas avec des déterminations cliniques ou hématologiques en aval et qui soit réversible par addition d'un agent inverseur convenable. Afin de répondre à ce besoin dans la technique, la présente invention concerne un système pour l'anticoagulation réversible de sang utilisant un ligand acide nucléique qui fixe, ou se lie à la thrombine et un agent inverseur qui a une affinité pour le ligand acide nucléique plus forte que celle de la thrombine. Lorsqu'on l'utilise avec un échantillon de sang avant addition de l'agent inverseur, le ligand acide nucléique du système fixe la thrombine, et donc inhibe la conversion de fibrinogène en fibrine, et par conséquent empêche la coagulation du sang ou diminue de façon significative la vitesse de coagulation du sang (c'est-à-dire augmente le temps de coagulation). Ensuite, quand on souhaite que le sang coagule, on ajoute l'agent inverseur au système qui, du fait de son affinité plus forte pour le ligand acide nucléique, provoque la libération de thrombine à partir du ligand par l'intermédiaire d'une réaction de fixation compétitive. La thrombine libérée dans l'échantillon de sang convertit le fibrinogène en fibrine, permettant au sang de coaguler. Avantageusement le ligand acide nucléique est caractérisé comme suit: - il comprend SEQ ID NO:l, - il comprend SEQ ID NO:2, ou - c'est un ligand acide nucléique bidirectionnel; alors il comprend de préférence deux segments oligonucléotidiques ayant la séquence SEQ ID NO:5 liée à leurs extrémités 3' respectives à un groupe phosphodiester dont chacun est lié à une chaîne hexaéthylèneglycol, ou bien deux segments oligonucléotidiques ayant la séquence SEQ ID NO:6 liée à leurs extrémités 3' respectives à un groupe phosphodiester dont chacun est lié à un dérivé de glycérol. Un agent inverseur préféré est un oligonucléotide ayant une séquence complémentaire de celle du ligand acide nucléique et de polarité opposée à celle-ci. Avantageusement, il comprend SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4. L'agent inverseur peut aussi être éventuellement combiné avec un activateur de coagulation pour renforcer la vitesse de coagulation du sang après inversion de l'effet anticoagulant du ligand de thrombine. Un deuxième aspect de l'invention est l'utilisation du système dans une détermination diagnostique. Cette détermination est réalisée de telle sorte qu'un complexe de thrombine fixée à un ligand acide nucléique et de fibrinogène soluble soit mélangé avec un échantillon qui peut ou non contenir un analyte auquel on s'intéresse. De la thrombine active se libère du complexe en présence de l'analyte. La thrombine libérée convertit le fibrinogène en fibrine, et on utilise la gélification de fibrine et le temps de gélification comme indicateurs, respectivement, de la présence et de la concentration d'analyte dans l'échantillon. Ainsi, l'invention concerne un procédé pour réaliser une anticoagulation utilisant le système précité, comprenant les étapes consistant à: (a) collecter un échantillon de sang; (b) ajouter le ligand acide nucléique à l'échantillon; et éventuellement (c) ajouter ensuite l'agent inverseur à l'échantillon. Un troisième aspect de cette invention est un assemblage pour collecte de sang qui utilise le système. L'assemblage contient un tube de collecte de sang, sous vide ou non, contenant le ligand acide nucléique de fixation de thrombine réversible. Un assemblage préféré est un tube en matière plastique ayant une extrémité fermée et une extrémité ouverte recouverte d'un septum ou d'une autre fermeture, ce tube en matière plastique pouvant ou non être sous vide. Enfin, l'invention concerne un récipient de collecte d'échantillon dans lequel le système décrit ci-dessus est utilisé pour l'anticoagulation réversible d'un échantillon de sang. Les divers objets, avantages et caractéristiques nouvelles de l'invention seront plus facilement appréciés à partir de la description détaillée qui suit, lue en relation avec les figures annexées, dans lesquelles: la Figure 1 est une représentation graphique de l'inhibition de la coagulation du plasma avec des quantités variables de deux ligands acides nucléiques; et la Figure 2 est une représentation graphique de la réversibilité des effets anticoagulants des ligands acides nucléiques qui fixent la thrombine. Bien que cette invention puisse être satisfaite par des modes de réalisation de nombreuses formes différentes, on va décrire ici en détail des modes de réalisation préférés de l'invention, en comprenant que la présente description n'est considérée qu'exemplaire des principes de l'invention et n'est pas destinée à limiter l'invention aux modes de réalisation illustrés et décrits. Le cadre de l'invention sera mesuré par les revendications annexées et leurs équivalents. On a récemment introduit une nouvelle classe d'anticoagulants fixant la thrombine, se basant sur la chimie des oligonucléotides (Bock, L.C. et al., Nature, 355, 564 (1992)) Ces molécules d'ADN ou d'ARN fixant des protéines ont été découvertes par criblage de bibliothèques combinées d'oligonucléotides sur le critère de l'activité de fixation de thrombine. Non contrairement aux anticoagulants de type hirudine et héparine conventionnels, on pense que ces oligonucléotides inhibent l'activité de thrombine par fixation à l'enzyme, bloquant ainsi la conversion de fibrinogène en fibrine. De façon similaire, on a aussi développé des ligands acides nucléiques bidirectionnels qui fixent la thrombine, comme le décrit plus complètement le brevet US 5 668 265 dont la description est spécifiquement incorporée ici à titre de référence. Les ligands acides nucléiques bidirectionnels sont également appelés oligonucléotides à polarité inversée, et sont décrits en tant que tels dans le brevet US 5 399 676, également incorporé ici à titre de référence. Toutefois, ce brevet ne décrit aucune activité de fixation de thrombine des oligonucléotides à polarité inversée. En bref, les ligands acides nucléiques bidirectionnels sont au moins deux oligonucléotides qui sont liés l'un à l'autre par l'intermédiaire d'un agent de liaison ou un fragment de couplage au niveau de leurs mêmes extrémités respectives (c'est-à-dire les extrémités ' ou 3'). Ainsi, les ligands acides nucléiques bidirectionnels ont au moins deux extrémités 5' ou extrémités 3'. Du fait de la présence de 3'- exonucléases dans le sang, des ligands acides nucléiques bidirectionnels avec des extrémités 3' raccordées à l'agent de liaison et, par conséquent, des extrémités 5' exposées, sont particulièrement utiles pour fixer la thrombine du fait de leur résistance à l'activité 3'- exonucléase. Les oligonucléotides fixant les protéines peuvent être sous la forme de chaînes allongées (brins) de molécules d'ADN ou d'ARN ou sous la forme de structures repliées plus complexes, stabilisées par des forces intermoléculaires entre les bases puriques et pyrimidiques constituant ces biopolymères (A-adénine, T=thymine, G=guanine, C=cytosine dans l'ADN; A, G, C et U=uracile dans i'ARN). De façon caractéristique, les ligands oligonucléotidiques ont des longueurs de chaine relativement courtes, constituées de 25 motifs de base ou moins. Des ligands oligonucléotidiques bidirectionnels ont environ la même longueur. En présence d'une séquence d'oligonucléotides complémentaire, la structure en simple brin du ligand unidirectionnel est défavorable, du point de vue énergétique, par rapport à une structure en double hélice allongée formée par un appariement de bases complémentaires. De façon similaire, la structure en simple brin du ligand acide nucléique bidirectionnel est défavorable, du point de vue énergétique, par rapport à une structure en double hélice allongée formée en présence d'une séquence d'oligonucléotides complémentaire, qui, dans ce cas, devra aussi en général être bidirectionnelle afin de maintenir la complémentarité standard (c'est-à- dire antiparallèle) de Watson-Crick sur des régions à polarité de séquences inversée. Par exemple, l'oligonucléotide présentant une complémentarité de Watson-Crick avec le composé ligand acide nucléique bidirectionnel 5GGTTGGTTG3' X3 TTGGTTGG5' sera 3 CCAACCAAC5 Y5'AACCAACC3, o X et Y sont des composés de liaison (tels qu'un groupe phosphodiester, glycérol, hexaéthylèneglycol, etc), et X peut ou non être identique à Y. Si le ligand acide nucléique contient une liaison 3'- 3', alors la séquence complémentaire va contenir une liaison 5'-5', et réciproquement. Toutefois, de façon caractéristique, on trouve que les molécules d'oligonucléotides à chaîne allongée et à double brin sont incapables de fixer les protéines. La présente invention est un système qui utilise la - formation spontanée d'ADN double brin pour inactiver la fixation de protéines d'un ligand ADN simple brin, comme l'illustrent les réactions chimiques suivantes: (1) SSF + protéine = SSF-protéine (2) SSF-protéine + CSSF = DSF + protéine o SSF représente le ligand acide nucléique simple brin, CSSF est la séquence complémentaire de SSF, et DSF est la forme à double brin obtenue par appariement de SSF avec CSSF. Dans l'équation (1), le ligand SSF se fixe à la protéine produisant un complexe ligand/protéine inactivé (SSF-protéine). Dans l'équation (2), la protéine active est libérée du complexe protéinique inactif par appariement de SSF avec CSSF lors de la formation de DSF. Le DSF n'est pas un ligand protéinique et la protéine libérée du complexe SSF-protéine est dans son état actif natif. Un système tel que défini pour les propos de la présente invention comprend des réactifs ou composants qui ont des activités différentes mais apparentées lorsqu'ils sont mis en contact ou utilisés avec un échantillon courant ou appliqués à celui-ci. Un tel système est utilisé dans diverses applications à des fins différentes. Le système de la présente invention est exemplaire en ce sens qu'il comprend deux réactifs, un ligand acide nucléique fixant la thrombine et un agent inverseur. Dans les équations ci-dessus, le ligand est SSF et l'agent inverseur est CSSF. Ces deux réactifs du système ont des activités différentes mais apparentées lorsqu'ils sont mis au contact d'un échantillon commun de sang. De façon spécifique, le ligand (SSF) provoque l'anticoagulation du sang, et l'agent inverseur (CSSF) a l'activité apparentée d'inversion de l'anticoagulation du sang. Comme expliqué plus en détail ci-dessous, le système spécifique de la présqnte invention est utilisé dans diverses applications, y compris des trousses de diagnostic ou des récipients de collecte de sang ou d'échantillon, sous vide ou non. Dans l'application du système tel que représenté par la stratégie des équations (1) et (2) ci-dessus à l'anticoagulation réversible du sang, la protéine des fractions (1) et (2) est l'enzyme thrombine, SSF est un ligand oligonucléotidique à la thrombine, et CSSF est la séquence complémentaire de ce ligand oligonucléotidique. On collecte un échantillon de sang dans un tube ou un autre récipient ou cuvette contenant une certaine quantité de SSF qui va fixer toute la thrombine potentiellement présente dans l'échantillon de sang. On sait bien, dans la biochimie du sang, que la thrombine est générée à partir de prothrombine sur une base molaire équivalente. Comme la concentration de prothrombine dans le sang normal est d'environ 1,4 AM (Putnam, F.W., dans The Plasma Proteins, 2ème édition, F.W. Putnam, Ed., Academic Press, New York, 1975, pages 58 à 94), la concentration de thrombine maximale qui peut être générée est aussi d'environ 1,4 iM. De préférence, le rapport molaire SSF/prothrombine devrait être de 0,1 à 100 et tout spécialement de 1 à 10. La quantité réelle de SSF nécessaire dépend de la capacité de fixation du ligand thrombine et de la quantité de prothrombine libérée durant la collecte et le stockage de l'échantillon de sang. Alors que la première est spécifique de la nature chimique du ligand thrombine, la dernière dépend de la viabilité du sang et de la nature chimique du récipient dans lequel est stocké le sang. De préférence, l'échantillon de sang est stocké dans un tube en matière plastique hydrophobe qui ne stimule pas une coagulation rapide du sang. Des exemples de tubes en matière plastique hydrophobe sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans le brevet US 5 318 806 de Montgomery et al., dont la description est incorporée ici à titre de référence. Au contraire, il faudra énormément plus de SSF si l'échantillon de sang est stocké dans des tubes en verre simple qui sont connus pour stimuler la coagulation du sang. Lors du mélange de SSF avec l'échantillon de sang, toute thrombine disponible ou produite à partir de prothrombine est inactivée par sa fixation au SSF qui est présent en une concentration en excès par rapport à la thrombine. Le sang anticoagulé résultant peut ensuite être utilisé pour des déterminations hématologiques ou chimiques de sang entier ou de plasma sanguin. Comme des déterminations subséquentes sur un sérum produit à partir de sang coagulé peuvent aussi être souhaitées, l'anticoagulation qui résulte du complexe de SSF et de thrombine peut être inversée par addition de CSSF. Le rapport en moles CSSF/SSF est de préférence de 0,01 à 10, et tout spécialement de 0,1 à 1. L'agent inverseur peut éventuellement être un mélange de CSSF et d'un agent activateur de coagulation pour renforcer -la vitesse de coagulation après inversion de l'état anticoagulé. Les activateurs de coagulation comprennent, mais sans s'y limiter, le verre pilé ou les morceaux de matière plastique ayant subi une activation en surface par voie chimique. Des exemples d'activateurs de coagulation sont connus de l'homme du métier et sont décrits dans le brevet US 5 344 611 de Vogler et al. et le brevet US 5 318 806 de Montgomery et al., les deux étant incorporés ici à titre de référence. D'autres activateurs de coagulation comprennent des activateurs de coagulation biochimiques tels que l'acide ellagique ou la thrombine elle-même. L'agent inverseur peut être éventuellement supporté ou immobilisé sur une bille ou particule support ou pulvérisé dans le tube ou récipient de collecte de sang. L'agent inverseur n'est pas nécessairement limité- à des séquences oligonucléotidiques complémentaires de SSF. L'agent inverseur peut être choisi parmi n'importe quel matériau ayant une affinité de fixation au SSF supérieure à celle de la thrombine, tels que des complexes inorganiques ou des protéines connus pour fixer des oligonucléotides. Des exemples de tels matériaux comprennent les protéines de fixation d'ADN simple brin telles que décrites par Chase, J.W. & Williams, K.R., Ann. Rev. Biochem. 56, 103 (1986); le cuivre(II), le mercure(II), l'argent(I), comme décrit par Eichhorn, G.L. & Shin, Y.A., J. Amer. Chem. Soc. 90, 7323-7328 (1968) et Dale, R.M.K. et al., Biochemistry 14, 2447-2457 (1975); et les complexes du platine tels que décrits par Lippard, S.J., Acc. Chem. Res. 11, 211-217 (1978). Lorsqu'on utilise le système de la présente invention en tant que détermination diagnostique conformément aux équations (1) et (2) cidessus, la protéine est l'enzyme thrombine, SSF est un ligand oligonucléotidique à la thrombine, et CSSF est la séquence complémentaire à ce ligand oligonucléotidique, qui est aussi l'analyte de la détermination diagnostique. Dans une telle application diagnostique, du complexe SSF-protéine et du SSF en excès sont ajoutés à un mélange de fibrinogènes contenant l'échantillon faisant l'objet de l'analyse. Dans le cas o le CSSF est présent en une concentration suffisante pour libérer la protéine (thrombine) du complexe SSF-protéine, la thrombine libre produit de la fibrine polymère à partir de fibrinogène à une vitesse dépendante de la concentration de libération. Il apparaîtra facilement à l'homme du métier que la fibrine polymère peut être détectée par des techniques sensibles telles que, mais sans s'y limiter, la dispersion de lumière, la viscosité, ou des approches conductiométriques qui sont classiquement utilisées pour déterminer un dysfonctionnement de la coagulation du sang. On appréciera aussi que la vitesse de production de fibrine polymère va dépendre de la concentration de thrombine libre, et est par conséquent en rapport direct avec la concentration de CSSF et de SSF en excès, ajoutés à la solution d'analyte au commencement de la détermination diagnostique. L'invention est davantage décrite par les exemples suivants qui sont proposés à titre d'illustration et ne sont pas destinés à limiter l'invention d'une quelconque façon. Dans ces exemples tous les pourcentages sont en poids s'ils concernent des solides et en volume s'ils concernent des liquides, et toutes les températures sont en degrés Celsius, sauf mention contraire. Exemple 1 Préparation de ligands oligonucléotidiques fixant la thrombine On prépare, pratiquement de la façon décrite par Bock, L.C. et al., Nature, 355, 564 (1992), des oligonucléotides de structure 5GGTTGGTGTGGTTGG3 (SEQ ID NO:1), connue pour fixer et inhiber la thrombine (appelés ci-après "ligand consensus"), en utilisant une chimie des phosphoramidites standard sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems. On utilise des modifications mineures du même mode opératoire pour préparer une molécule variante 5'ATGGTTGGTGTGGTTGGTCGAGCTAGATCTTCAGTACGT3 (SEQ ID NO:2), appelée ciaprès "ligand à extension homopolymérique". Cette molécule contient à l'intérieur de celle-ci une sous-séquence (soulignée) identique à la séquence de ligand consensus. La sous-séquence de ligand consensus est responsable des propriétés de fixation de thrombine du ligand à extension homopolymérique. On prépare de façon similaire le complément de Watson-Crick du "ligand à extension homopolymérique": ACGTACTGAAGATCTAGCTCGACCAACCACACCAACCAT3 (SEQ ID NO:3), appelé ci-après "oligonucléotide complémentaire" ou "complément". Bien que cette molécule soit parfaitement complémentaire du "ligand à extension homopolymérique", elle contient aussi la sous- séquence S'CCAACCACACCAACC3 (SEQ ID NO:4), qui est parfaitement complémentaire du ligand consensus. Le complément peut donc s'hybrider au ligand consensus ainsi qu'au ligand à extension homopolymérique. Si on interprète ceci en termes de stratégie des équations (1) et (2) de l'invention, SSF correspond au ligand consensus ou à extension homopolymérique et CSSF correspond à l'oligonucléotide complémentaire respectif. En utilisant des procédés similaires, on prépare des ligands oligonucléotidiques bidirectionnels en raccordant deux copies des séquences suivantes à un composé lieur par l'intermédiaire de leurs extrémités 3' respectives: 5'- GGTTGGT-3' (SEQ ID NO:5); 5'-GGTTGGTT-3' (SEQ ID NO:6) et '-GGTTGGTTG- 3' (SEQ ID NO:7). De façon spécifique, on prépare ces oligonucléotides à polarité de séquences inversée, raccordés par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester unique, pratiquement de la façon décrite par van de Sande, J.H. et al., Science 241, 551 (1988). On prépare les composés par synthèse en phase solide sur un synthétiseur d'ADN Applied Biosystems en utilisant une chimie de couplage de phosphoramidites standard avec certains réactifs spéciaux, comme décrit ci-dessous. Pour préparer des oligonucléotides contenant des liaisons internucléotidiques 3'-3', on réalise la synthèse d'abord dans la direction 5'-+3', en commençant avec des colonnes CpG 5'-dérivées (dG-4'lcaa CpG, 1 Dimol, Glen Research) et des 5'-phosphoramidites (dT-5"-CE phosphoramidite et dG-5'-CG phosphoramidite de Glen Research). On répète des cycles de couplage subséquents dans la direction 5'->3' jusqu'à ce que le premier des deux segments bidirectionnels soit complet. On inverse la direction de synthèse de 5'-+ 3' à 3'->5' en remplaçant simplement les 5'-phosphoramidites par des 3'- phosphoramidites standard (ABI). La première liaison formée après l'inversion de la direction de synthèse est une liaison internucléotidique 3'-3'. On répète des couplages subséquents dans la direction 3'-+5' (formant des liaisons 3'-5') jusqu'à ce que le deuxième des deux segments bidirectionnels soit complet. Après la synthèse et après une détritylation, on libère les oligonucléotides des colonnes CpG et on les déprotège par traitement avec de l'ammoniaque concentrée (12 à 14 heures, 56 C). Puis on purifie les oligomères par électrophorèse sur gel dénaturant, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Par ce procédé, on prépare les composés bidirectionnels suivants:GGTTGGT3-pLlp-3 -TGGTTGG5 et 'GGTTGGTT3'-pL2p-3TTGGTTGGs o Li représente la chaîne hexaéthylèneglycol (-CH2CH2- (OCH2CH2)4-OCH2CH2-) liée à chaque extrémité à une liaison phosphodiester p, o p = -O-PO(O)-O- o les atomes d'oxygène soulignés sont attachés directement à l'une ou l'autre extrémité de la chaîne hexaéthylèneglycol ou en position 5' ou 3' des fragments pentose des nucléotides flanquants, et L2 représente le dérivé glycérol (-CH2- CH(OH)-CH2-) lié à chaque extrémité à un segment oligonucléotidique par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester p comme décrit ci-dessus. Exemple 2 Inhibition de la conversion par la thrombine de fibrinogène en fibrine Cet exemple démontre l'inhibition de la conversion par la thrombine de fibrinogène en fibrine dans du plasma entier de porc appauvri en plaquettes (P4) par les ligands préparés dans l'Exemple 1. On prépare du P4 en séparant les globules du sérum par centrifugation de sang entier citraté de porc (Environnental Diagnostics Inc.). On ajoute environ 0,5 ml de P4 à des tubes à essais en verre de 13 x 100 mm (Fisher) et on les équilibre à la température ambiante dans un bain d'eau pendant 15 minutes. Après équilibre, on ajoute des quantités variables des ligands tant consensus qu'à extension homopolymérique dans de la solution salée, conjointement avec suffisamment de diluant de type solution salée pour porter le volume total à 0,55 ml. Les quantités ajoutées de chaque ligand sont présentées sur la Figure 1. A ce moment, on ajoute 50 pi de CaCl2 0,4 M pour amorcer la coagulation et on bouche rapidement les tubes. On mélange le contenu des tubes sur un mélangeur par inversion de laboratoire et on note le temps de coagulation pour chaque type de tube par un changement brutal du mélange de fluides associé à une transition d'un état liquide à un état de gel. La Figure 1 illustre les résultats de la détermination de temps de coagulation pour les ligands consensus et à extension homopolymérique, mettant en évidence l'inhibition de la thrombine dans le plasma. En bref, le temps de coagulation augmente quand la concentration des ligands tant consensus qu'à extension homopolymérique augmente. On démontre une inhibition similaire de la thrombine dans le plasma avec les ligands oligonucléotidiques bidirectionnels préparés dans l'Exemple 1 en utilisant la méthodologie suivante. On prépare du plasma entier de porc appauvri en plaquettes de porc (PPP) en séparant les globules du sérum par centrifugation de sang entier citraté de porc (Environmental Diagnostics Inc.). On ajoute environ 0,5 ml de PPP à des tubes à essai en polystyrène de 12 x 75 mm (FALCON, Becton Dickinson) et on les équilibre à la température ambiante dans un bain d'eau pendant 15 minutes. Après équilibre, on ajoute 25 pl de thrombine bovine (Sigma) à 250 pg/ml dans de la solution salée, conjointement avec diverses quantités de composés ligand acides nucléiques bidirectionnels préparés dans l'Exemple 1 dans de la solution salée et suffisamment de diluant du type solution salée pour porter le volume total à 0,6 ml. A ce moment, on ajoute 50 pl de CaCl2 0,4 M pour amorcer la coagulation et on bouche rapidement les tubes. On mélange le contenu des tubes sur un mélangeur par inversion de laboratoire et on note le temps de coagulation pour chaque type de tube. Ces deux composés acides nucléiques bidirectionnels présentent aussi une inhibition de thrombine exogène dans le plasma. Exemple 3 Inversion rapide d'inhibition de thrombine Cet exemple montre l'inversion rapide de l'état anticoagulé induit par de la thrombine fixée à un ligand et l'initiation de la coagulation de P4 par la thrombine libérée de l'état lié en présence d'un agent inverseur. On prépare du P4 comme décrit dans l'Exemple 2, et on réalise le mesure du temps de coagulation également comme dans l'Exemple 2. Dans cet exemple, le volume total final (0,5 ml de P4, 50 pl de CaCl2 0,4 M, le ligand consensus facultatif de l'Exemple 1, le ligand à extension homopolymérique facultatif de l'Exemple 1, le complément facultatif (agent inverseur) à la séquence de ligand, et le diluant du type solution salée), est maintenu constant à 0,625 ml, par ajustement des volumes de diluant du type solution salée. Dans le témoin sans ligand ou complément ajouté, on ajoute 75 pl de diluant du type solution salée à 0,5 ml de P4 avec 50 p1 de solution de CaCl2. Pour des expériences avec ligand ajouté, on n'ajoute que 62,5 pl de diluant du type solution salée conjointement avec 12,5 pl d'une solution 500 pM de ligand consensus ou à extension homopolymérique. Dans des expériences inversées o on ajoute tant un ligand qu'un complément (agent inverseur), on n'ajoute que 37,5 pl de diluant du type solution salée aux tubes, les 25 pl restants étant réservés à l'addition subséquente d'une solution 500 iM de complément (agent inverseur). Les résultats de cet exemple sont présentés sur la Figure 2 dans laquelle le bâton de gauche représente le temps de coagulation de P4 dans des tubes en verre (tubes témoins). Ceci montre que la thrombine est libérée à partir de prothrombine présente dans le P4 par contact avec la surface du tube à essai en verre. L'addition de ligands à extension homopolymérique et consensus au P4 inhibe la coagulation, comme l'illustrent les deux bâtons suivants, ce qui est en accord avec les données de l'Exemple 2, par fixation à la thrombine produite à partir de prothrombine par contact avec la surface du tube en verre. Si on interprète ceci en termes de l'équation (1) de cette invention, SSF + thrombine = SSF-thrombine, o SSF est le ligand soit consensus soit à extension homopolymérique. Les quatrième et cinquième bâtons montrent que lorsque l'agent inverseur (complément du ligand à extension homopolymérique) est ajouté à des tubes identiques à ceux représentés par les deuxième et troisième bâtons (au moment o il y a coagulation dans les tubes en verre témoins), il se produit une coagulation rapide au lieu de rester dans un état anticoagulé temporaire. Si on interprète ceci en termes de la stratégie de l'équation thrombine + CSSF = thrombine + DSF, et la thrombine libérée convertit rapidement le fibrinogène en fibrine, provoquant la coagulation du p4. Le dernier bâton de la Figure 2 est le résultat d'une expérience témoin qui montre que le complément n'est pas un ligand de thrombine et donc n'inhibe pas la coagulation de façon significative au-delà des valeurs témoins. On s'attend à une inversion similaire de l'inhibition de thrombine par les composés acides nucléiques bidirectionnels avec des agents inverseurs complémentaires appropriés. Le cadre de l'invention décrite ici n'est pas limité aux modes de réalisation décrits ici. Des modifications, adaptations et opportunités appropriées appliquant les enseignements présentés ici dans des cas individuels peuvent être employées et comprises par l'homme du métier dans le cadre de l'invention telle qu'elle est revendiquée ci-dessous. LISTAGE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: Becton Dickinson and Company (B) RUE: 1Becton Drive (C) VILLE: Franklin Lakes (D) ETAT: NJ (E) PAYS: US (F) CODE POSTAL: 07417 (ii) TITRE DE INVENTION: Système d'anticoagulation réversible de sang, récipient de collecte et procédé utilisant ce système. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 7 (v) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: disquette (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (vi) DONNEES RELATIVES A LA DEMANDE EN COURS: (A) NUMERO DE LA DEMANDE: (B) DATE DE DEPOT: (C) CLASSIFICATION: (viii) MANDATAIRE: (A) NOM: Cabinet GERMAIN & MAUREAU (C) REFERENCE/NUMERO DOSSIER: P-3078 (BEC5) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:l: GGTTGGTGTG GTTGG 15 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2: ATGGTTGGTG TGGTTGGTCG AGCTAGATCT TCAGTACGT 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 39 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3: ACGTACTGAA GATCTAGCTC GACCAACCAC ACCAACCAT 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4: CCAACCACAC CAACC 15 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 7 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5: GGTTGGT 7 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6: GGTTGGTT (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 9 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:7: GGTTGGTTG 9 REVENDICATIONS 1. Système d'anticoagulation réversible de sang, comprenant un ligand acide nucléique qui fixe la thrombine et un agent inverseur qui a une affinité pour le ligand acide nucléique supérieure à celle de la thrombine. 2. Système selon la revendication 1, dans lequel le ligand acide nucléique comprend SEQ ID NO:1. 3. Système selon la revendication 1, dans lequel le ligand acide nucléique comprend SEQ ID NO:2. 4. Système selon la revendication 1, dans lequel l'agent inverseur comprend un oligonucléotide ayant une séquence complémentaire de la séquence du ligand acide nucléique. 5. Système selon la revendication 4, dans lequel l'agent inverseur comprend SEQ ID NO:3. 6. Système selon la revendication 4, dans lequel l'agent inverseur comprend SEQ ID NO:4. 7. Système selon la revendication 1, dans lequel le ligand acide nucléique est un ligand acide nucléique bidirectionnel. 8. Système selon la revendication 7, dans lequel le ligand acide nucléique bidirectionnel comprend deux segments oligonucléotidiques ayant la séquence SEQ ID NO:5 liée à leurs extrémités 3' respectives à un groupe phosphodiester dont chacun est lié à une chaîne hexaéthylèneglycol. 9. Système selon la revendication 7, dans lequel le ligand acide nucléique bidirectionnel comprend deux segments oligonucléotidiques ayant la séquence SEQ ID NO:6 liée à leurs extrémités 3' respectives à un groupe phosphodiester dont chacun est lié à un dérivé de glycérol. 10. Récipient de collecte d'échantillon dans lequel le système de la revendication 1 est utilisé pour l'anticoagulation réversible d'un échantillon de sang. 11. Procédé pour réaliser une anticoagulation réversible de sang utilisant le système de la revendication 1, comprenant les étapes consistant à: (a) collecter un échantillon de sang; (b) ajouter le ligand acide nucléique à l'échantillon; et éventuellement (c) ajouter ensuite l'agent inverseur à l'échantillon.