Brevet FR2781812A1 — publié le 20000204

Procédé d'identification spécifique de levures La présente invention a pour objet un procédé d'identification spécifique au niveau moléculaire de levures, plus spécialement un procédé de différenciation inter-espèces d'ADN de levures. Elle est également relative à des amorces oligonucléotidiques pour l'amplification dudit ADN, utiles pour la mise en oeuvre dudit procédé, ainsi qu'à un procédé d'obtention desdites amorces et à une trousse de détection de levures comprenant celles-ci. L'importance des levures, telle qu'en particulier Saccharomyces cerevisiae est bien connue notamment dans les fermentations alcooliques visant à transformer des moûts sucrés de fruits en solution hydro-alcoolique (ex. : vin). L'industrialisation de ces fermentations nécessite le contrôle de la flore assurant la fermentation. Ainsi, de nombreuses souches de levures sélectionnées sont proposées sur le marché pour de telles applications. Cependant, il existe naturellement d'autres espèces de levures qui peuvent avoir notamment deux types d'action au cours de la fermentation contributions aromatiques déviations organoleptiques, en particulier avec les levures dites de contamination. Il est donc important de pouvoir identifier d'éventuelles espèces levuriennes non-Saccharomyces cerevisiae, et ce afin de mieux maîtriser les procédés de fermentations et de contrôler la présence d'éventuelles levures de contamination. Il existe de nombreuses techniques d'identification d'espèces levuriennes. On connaît, par exemple, celle décrite par Barnett et al. dans "Yeast characteristics and identification", 2nd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1991. Cette technique nécessite un isolement préalable du microorganisme en culture pure puis l'étude de ses caractéristiques morphologiques et surtout physiologiques, l'ensemble de cette technique de caractérisation demandant une quinzaine de jours. D'autres méthodes ont été développées afin d'offrir une solution plus rapide et plus rationnelle pour la caractérisation et l'identification de levures. A titre d'exemple, on peut citer les galeries API, commercialisées par la société Biomérieux (France). Il reste que de tels tests ont une durée d'environ 5 jours, sont peu précis et fournissent parfois des résultats ambigus. Avec l'avènement des techniques de génie génétique, de nouvelles technologies sont apparues qui permettent l'identification moléculaire de microorganismes. Pour ce qui concerne les levures, la plupart de ces techniques visent la caractérisation intra-espèces plutôt qu'inter-espèces. Ainsi, la RAPD-PCR ( random amplified polymorphic DNA - polymerase chain reaction ) est une technique basée sur l'amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de séquences d'ADN comprises entre des amorces nucléotidiques définies de façon aléatoire. Cette technique peut permettre de générer après électrophorèse sur gel d'agarose des profils spécifiques d'espèces données. Cependant ceux-ci comportent souvent un grand nombre de bandes électrophorétiques, ce qui limite la reproductibilité et rend difficile l'interprétation des résultats. Par ailleurs des sondes dirigées contre des séquences d'ADN de levure codant pour les sous-unités 5S ou 18S de l'ARN ribosomique ont également été décrites. Cependant du fait du caractère universel de ces séquences, autrement dit de leur très grande conservation, elles sont retrouvées, au moins en partie, chez de nombreux microorganismes (levures, champignons, bactéries) et peuvent générer en conséquence de faux positifs lorsqu'elles sont mises en oeuvre dans des tests. Certains gènes ou séquences d'ADN retrouvés spécifiquement chez certaines espèces peuvent être utilisés comme cibles de sondes de détection. Mais ces techniques impliquent une très bonne connaissance du génome du microorganisme concerné, ce qui n'est généralement pas le cas. Au vu de l'état de la technique rappelé ci-dessus, il existe donc le besoin d'un procédé d'identification de certaines levures d'intérêt qui ne présente pas les inconvénients des procédés antérieurs rappelés ci-dessus et qui soit notamment rapide à mettre en oeuvre, facile à interpréter, et surtout qui permette la différenciation interespèces de levures. La présente invention vise en particulier à satisfaire ce besoin et fournit à cet effet un procédé d'identification spécifique d'au moins une espèce de levure, caractérisé en ce que - on soumet l'ADN de la ou des souches d'une ou de plusieurs espèces de levure, dont on doit vérifier l'appartenance à une ou plusieurs espèces données, dite(s) espèce (s) de référence, à une amplification notamment telle qu'obtenue par PCR, à l'aide d'un couple d'amorces élaborées à partir d'oligonucléotides dont les séquences sont comprises dans, ou sont homologues des régions ITS de l'ADNr de la ou des espèces de référence, et spécifiques de toutes les souches de cette ou de ces espèces, - on sépare les produits d'amplification et on compare les résultats obtenus respectivement avec ces produits et, en opérant dans les mêmes conditions, avec les produits d'amplification des ADN de la ou des souches de référence, la présence de produits spécifiques de l'espèce de référence ou de l'une des espèces de référence étant significative de l'appartenance de la souche à cette espèce. Une technique de séparation courante consiste à faire migrer les produits d'amplification sur un gel d'agarose. On compare alors les profils des produits d'amplification avec celui de la ou des espèces de référence pour vérifier la présence dans le profil de bande (s) spécifique(s) de l'espèce de référence ou de l'une des espèces de référence. D'une manière avantageuse et surprenante, les inventeurs ont constaté qu'en choisissant des amorces spécifiques d'une espèce donnée de levure, dans les régions ITS indiquées ci-dessus, ou des séquences homologues, le profil PCR obtenu par migration sur un gel d'agarose comportait, de façon caractéristique, un nombre réduit de bandes, voire fréquemment une seule bande. L'expression "Séquence homologue", telle qu'utilisée dans la description, signifie que la séquence oligonucléotidique peut différer par mutation, dégénérescence, suppression, modification chimique et autre altération de la séquence naturellement présente dans la région intergénique ITS considérée. Quelle que soit l'altération, la séquence correspondante pour être conforme à l'invention, doit être suffisamment complémentaire de séquences de régions ITS de la souche à étudier pour permettre l'amplification de ces régions comme décrit dans les exemples, et l'obtention de produits de PCR ayant une migration en gel d'agarose semblable à celles des produits PCR obtenus avec des amorces élaborées à partir de fragments des régions ITS elles-mêmes. Il est donc possible, par comparaison de profils de produits PCR amplifiés avec les amorces spécifiques d'une espèce donnée, d'identifier très rapidement l'appartenance ou non à cette espèce. En particulier, l'invention fournit ainsi les moyens de discriminer rapidement des espèces de levures non Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, pour identifier spécifiquement l'appartenance, par exemple, à Kloeckera apiculata, on utilise avantageusement pour l'amplification un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes, KA4 : 5' GAATTATCATTGTTGCTCGAG 3' KA3c: 5' ATTAAAAGCAACCCTTTGC 3', ou à des séquences homologues. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, pour identifier spécifiquement l'appartenance à Torulaspora delbrueckii, on utilisera avec avantage, pour l'amplification, un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes TD2 : 5' GGAACATGTCTTTCTCG 3' TD3c: 5' CTTTGAGAGTATTGTTCGC 3', ou à des séquences homologues. Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, pour identifier spécifiquement l'appartenance à Brettanomyces intermedius, on utilise pour l'amplification un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes Brett 2B : 5' ACACGTGGATAAGCAAGG 3' ITS4B : 5' GGTCAAACTTGATAACTGG 3', ou à des séquences homologues. Les conditions pour réaliser l'amplification seront choisies par l'homme du métier de manière à obtenir des rendements et une spécificité d'amplification satisfaisants. Les séquences oligonucléotidiques définies ci-dessus et leur utilisation comme amorces dans un procédé de PCR, font également partie de l'invention. Selon un autre aspect, l'invention vise également un procédé d'obtention d'une paire d'amorces spécifiques d'une espèce de levure donnée. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à - amplifier notamment par PCR des régions intergéniques d'espacement ou régions ITS d'espèces de levures à l'aide d'un couple d'amorces ayant les séquences suivantes : ITS 1 : 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3' ITS4 : 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3', ou des séquences homologues, - séparer les produits d'amplification par exemple par électrophorèse sur gel d'agarose, puis extraire et purifier ces produits, - séquencer les produits purifiés, notamment l'extrémité 5' de ces produits, - isoler des séquences spécifiques de chaque espèce de levure considérée, et - établir, à partir de tout ou partie desdites séquences, lesdites amorces spécifiques des espèces de levures, ou des séquences homologues. Ce procédé est avantageusement appliqué à des espèces comprenant Kloeckera apiculata, Brettanomyces intermedius, Candida famata, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii. Les conditions d'amplification permettant d'obtenir des rendements et une spécificité d'amplification satisfaisants seront aisément déterminées par l'homme du métier, un ensemble de conditions étant donné à titre illustratif dans l'exemple 1. Ce procédé permet d'obtenir des amorces hautement spécifiques d'une espèce de levure donnée et donc utilisables pour effectuer des discriminations inter-espèces. Selon encore un autre aspect, l'invention vise des trousses pour la différenciation inter-espèces de levures. Ces trousses sont caractérisées en ce qu'elles comprennent : - les amorces nécessaires à l'amplification des ADNr de souches de levures, - les réactifs pour l'amplification, et - une notice d'emploi. Des trousses conformes à l'invention comprennent par exemple - un moyen d'amplification dudit ADN cible constitué par une paire ou un mélange de paires d'amorces spécifiques d'au moins une espèce de levure de référence telle qu'indiquée plus haut, - les réactifs nécessaires à l'amplification, - au moins un témoin, et - une notice d'emploi. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent qui font référence aux figures 1 à 4, représentant respectivement : - la Figure 1, l'organisation particulière des séquences répétées directes de l'ADN ribosomique de levure, - la Figure 2, les profils obtenus par PCR de l'ADN ribosomique de 6 souches de levures appartenant à différentes espèces à l'aide des amorces ITS1et ITS4, - la Figure 3, les profils obtenus par PCR de l'ADN ribosomique de 10 souches de levures appartenant à l'espèce K. apiculata, à l'aide des amorces KA4 et KA3c (M : marqueur de poids moléculaire 100 pb), et - la Figure 4, les profils obtenus par PCR de F ADN ribosomique de 7 souches de levures référencées 1 à 7, appartenant à différentes espèces, à partir des amorces KA4 et KA3c (M : marqueur de poids moléculaire 100 pb). Exemple 1 : Détection de l'espèce Kloeckera apiculata 1. Amplification des régions ITS de souches de levures appartenant à différentes espèces de souches. Les souches utilisées sont données dans le tableau 1 suivant : Espèce Code Origine Kloeckera apiculata ATCC # 66165 ATCC Brettanomyces intermedius BiOl UC DAVIS (USA) Candida famata Cf01 Institut technique du vin (France) Metschnikowia pulcherrima MpOl UC DAVIS (USA) Torulaspora delbrueckii ATCC # 26814 ATCC Zygosaccharomyces bailii ATCC # 66825 ATCC L'ADN des souches est extrait suivant la méthode décrite par Hoffman et Winston dans Gene 57,267-272, 1998. On évalue par fluorimétrie la concentration en ADN avant de procéder à la réaction de PCR. On utilise environ 100 à 300 ng d'ADN. Comme amorces, on utilise des oligonucléotides complémentaires des régions conservées ITS1et ITS4 pour amplifier la région ITS. La localisation de ces amorces dans la structure de la région génomique 18S - 26S de l'ADNr des levures est donnée sur la figure 1, où "- " indique les régions intergéniques et " # " les régions ribosomales. Les séquences du couple d'amorces utilisé sont les suivantes : ITS 1 : 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3' ITS4 : 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' Les conditions pour la réalisation de la PCR comprennent les étapes suivantes : - 5 min de dénaturation à 94 C, suivies de 30 cycles composés comme suit : . dénaturation à 95 C pendant 30 s, . hybridation à 55 C pendant 30 s, et . élongation à 72 C, pendant 90 s. Les produits PCR obtenus sont séparés sur gel d'agarose 1,5 % NuSieve (FMC) dans un tampon 0,5 x TBE. Les profils PCR de l'ADN des 6 souches des levures étudiées sont données sur la figure 2 où les pistes 1 à 6 correspondent respectivement à : Kloeckera apiculata, Brettanomyces intermedius, Candida famata, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii. La piste M correspond aux marqueurs de poids moléculaires. On constate que les tailles des régions amplifiées sont comprises entre 380 pb pour M pulcherrima et 830 pb pour T. delbrueckii. 2. Extraction, purification des produits de PCR, et séquençage. Les fragments d'ADN sont extraits du gel d'agarose et purifiés sur colonne QuiageneR, selon les recommandations du fabricant. L'extrémité 5' est séquencée en utilisant la technique des didéoxynucléotides. L'analyse de la séquence est lue automatiquement sur analyseur de séquence ABI 370 A. 3/ Elaboration d'amorces spécifiques de l'espèce K. apiculata. La comparaison entre elles des séquences des régions ITS amplifiées des 6 souches étudiées a permis d'établir 2 séquences de 20 bases utilisées pour définir des amorces, KA4 et KA3C, spécifiques de l'espèce K. apiculata. Les séquences de ces amorces sont les suivantes : KA4 : 5' GAATTATCATTGTTGCTCGAG 3' KA3c : 5' ATTAAAAGCAACCCTTTGC 3' 4/ Amplification de l'ADN de souches appartenant à l'espèce K. apiculata L'amplification est réalisée sur l'ADN de 10 souches de l'espèce K. apiculata. On procède comme défini dans 1) pour l'amplification de l'ADN des 6 souches de levures d'espèces différentes, mais l'hybridation est réalisée à 61 C. Les profils PCR sont donnés sur la figure 3 (M = marqueur de poids moléculaire (100 pb)). On constate que chaque souche analysée présente un unique fragment de 630 pb, qui apparaît donc caractéristique de l'espèce considérée. L'amplification à partir des amorces KA4 et KA3c de l'ADN des 6 souches d'espèces différentes étudiées sous 1) et de Saccharomyces cerevisae (piste 7) conduit à des produits PCR ne fournissant un signal positif (amplification effective) que pour la souche appartenant à l'espèce K. apiculata comme le montre la figure 4. Ces résultats mettent bien en évidence la spécificité des amorces KA4 et KA3c pour la détection de l'espèce K. apiculata. Exemple 2 : de l'espèce Torulaspora delbrueckii On opère comme décrit dans l'exemple 1 pour définir un couple d'amorces spécifiques, ce qui conduit à élaborer le couple d'amorces TD2 et TD3c répondant aux séquences suivantes : TD2 : 5' GGAACATGTCTTTCTCG 3' TD3c : 5 ' CTTTGAGAGTATTGTTCGC 3'. Les conditions d'amplification sont telles que définies pour l'identification spécifique de l'espèce K. apiculata, mais avec une température d'hybridation de 60 C. Exemple 3 : de l'espèce Brettanomyces intermedius L'application du protocole décrit dans l'exemple 1 conduit à élaborer le couple d'amorces Brett 2B et ITS4B suivant : Brett 2B : 5' ACACGTGGATAAGCAAGG 3' ITS4B : 5' GGTCAAACTTGATAACTGG 3' Les conditions d'amplification sont celles données pour l'identification spécifique de l'espèce K. apiculata, mais la température d'hybridation est de 62 C. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'identification spécifique d'au moins une espèce de levure, caractérisée en ce que - on soumet l'ADN de la ou des souches d'une ou de plusieurs espèces de levure, dont on doit vérifier l'appartenance à une ou plusieurs espèces données, dite(s) espèce(s) de référence, à une amplification notamment telle qu'obtenue par PCR, à l'aide d'un couple d'amorces élaborées à partir d'oligonucléotides dont les séquences sont comprises dans ou sont homologues des régions ITS de l'ADNr de la ou des espèces de référence, et spécifiques de toutes les souches de cette ou de ces espèces, - on sépare les produits d'amplification et on compare les résultats obtenus respectivement avec ces produits et, en opérant dans les mêmes conditions, avec les produits d'amplification des ADN de la ou des souches de référence, la présence de produits spécifiques de l'espèce de référence ou de l'une des espèces de référence étant significative de l'appartenance de la souche à cette espèce. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation des produits d'amplification est réalisée par migration sur un gel d'agarose, on compare le profil des produits d'amplification par migration sur gel d'agarose avec celui de la ou des espèces de référence, la présence dans le profil de bande(s) spécifique(s) de l'espèce de référence ou de l'une des espèces de référence étant significative de l'appartenance de la souche à cette espèce. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, pour identifier spécifiquement l'appartenance à Kloeckera apiculata, on utilise pour l'amplification un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes, KA4 : 5' GAATTATCATTGTTGCTCGAG 3' KA3c: 5' ATTAAAAGCAACCCTTTGC 3', ou à des séquences homologues. 4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min de dénaturation à 94 C suivies de 30 cycles composés de la façon suivante : - Dénaturation à 95 C pendant 30 s, - Hybridation à 61 C pendant 30 s et - Elongation à 72 C pendant 90 s. 5/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, pour identifier spécifiquement l'appartenance à Torulaspora delbrueckii, on utilise pour l'amplification un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes TD2 : 5' GGAACATGTCTTTCTCG 3' TD3c: 5' CTTTGAGAGTATTGTTCGC 3', ou à des séquences homologues. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée comme défini dans la revendication 4, mais à une température d'hybridation de 60 C. 7/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, pour identifier spécifiquement l'appartenance à Brettanomyces intermedius, on utilise pour l'amplification un couple d'amorces répondant aux séquences suivantes Brett 2B : ACACGTGGATAAGCAAGG 3' ITS4B : 5' GGTCAAACTTGATAACTGG 3', ou à des séquences homologues. 8/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'amplification est réalisée dans les conditions suivantes définies dans la revendication 4, mais à une température d'hybridation de 62 C 9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la discrimination de souches nonSaccharomyces cerevisiae. 10/ Séquences oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'il s'agit de 5' GAATTATCATTGTTGCTCGAG 3' 5' ATTAAAAGCAACCCTTTGC 3' 5' GGAACATGTCTTTCTCG 3' 5' CTTTGAGAGTATTGTTCGC 3' 5' ACACGTGGATAAGCAAGG 3' 5' GGTCAAACTTGATAACTGG 3', ou des séquences homologues. 11/Utilisation des séquences oligonucléotidiques selon la revendication 10, en tant qu'amorces de PCR. 12/ Procédé d'obtention d'une paire d'amorces spécifiques d'une espèce de levure donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - amplifier notamment par PCR des régions intergéniques d'espacement ou régions ITS d'espèces de levures à l'aide d'un couple d'amorces ayant les séquences suivantes : ITS 1 : 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3' ITS4 : 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' - séparer les produits d'amplification par exemple par électrophorèse sur gel d'agarose, puis extraire et purifier ces produits, - séquencer les produits purifiés, notamment l'extrémité 5' de ces produits, - isoler des séquences spécifiques de chaque espèce de levure considérée, et - établir, à partir de tout ou partie desdites séquences, lesdites amorces spécifiques des espèces de levures, ou des séquences homologues. 13/ Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que les conditions d'amplification PCR sont les suivantes : - 5 min. de dénaturation à 94 C, suivie de 30 cycles composés des étapes suivantes : - Dénaturation à 95 C pendant 30 s, - Hybridation à 55 C pendant 30 s, et - Elongation à 72 C pendant 90 s. 14/ Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé ence qu'il est appliqué aux espèces Kloeckera apiculata, Brettanomyces intermedius, Candida famata, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii. 15/ Trousses pour la différenciation inter-espèces de levures, caractérisées en ce qu'elles comprennent : - un moyen d'amplification de l'ADN cible de levures constitué par une paire, ou un mélange de paires d'amorces, spécifique (s) de la ou des espèces de levure par rapport à laquelle ou auxquelles l'appartenance doit être vérifiée, - les réactifs nécessaires à l'amplification, - au moins un témoin, et - une notice d'emploi.