Brevet FR2781885A1 — publié le 20000204

DISPOSITIF ET PROCEDE ELECTROSTATIQUES DE DETECTION IMMUNOLOGIQUE FINE L'objet de la presente invention est d'obtenir un signal qualitatif ou quantitatif de la presence,à des doses infinitesimales,d'une substance dans les fluides d'un echantillon,doses impossibles à detecter avec les technologies actuellement disponibles,pourtant connues comme extrêmement sensibles comme la Radio-immuno-analyse.La technique surnommée PCR (Polymerase Chain Reaction) parvient à detecter des quantités infimes de fragments de materiel chromosomique (ARN ou ADN)mais n'est pas capable de doser les proteines comme les nouvelles generations de marqueurs tumoraux ou de cytokines circulant à des taux inferieurs au picogramme par millilitre (un milliardième de gramme). Le procédé objet de la presente invention est basé sur l'attraction ou la repulsion electrique exercée par deux ou plusieurs electrodes planes extrêmement fines,sur des immunoglobulines (Ig) selon que ces immunoglobulines sont liées ou non à leur antigène specifique.Une microgoutte d'echantillon à tester est deposée sur le dispositif (voir mode operatoire plus loin),absorbée immediatement par le papier isolant.Puis on depose un volume de solution d'anticorps marqués qui vont se melanger à la gouttelette d'echantillon prealablement deposée.Si l'antigène recherché est present dans la gouttelette d'echantillon,il va être rapidement capté par les anticorps marqués.Les electrodes vont savoir alors faire la difference entre un anticorps complexé à l'antigène et un anticorps qui n'a pas rencontré d'antigène dans la gouttelette. Ces electrodes peuvent être parcourues par un courant electrique negatif, dans ce cas elles captent les sites NH2 (chargé positivement) des immunoglobulines qui ne se sont pas liées à un antigène,et laissent s'ecouler vers la zone-signal les immunoglobulines dont le site NH2 est cette fois saturé et masqué par un antigène.Ces Ig peuvent alors être detectées et mesurées dans la zone-signal,lorsqu'elles ont été prealablement preparées avant le dosage (conjuguées à une enzyme ou un marqueur radio-actif ou tout autre moyen). Mais ces electrodes peuvent egalement être parcourues par un courant positif,repoussant cette fois-ci les sites NH2 des Ig site resté libre de toute liaison à un antigène.Elles vont par contre fixer les complexes Ig + antigenes qui presentent tous un nombre suffisant de charges negatives,alors captées par cette electrode positive.Se produit donc une inversion du signal à la fin du dosage: le signal n'est fourni que par les Ig restées libres de tout antigène.Comme il va être decrit plus loin,cette inversion est utile dans certains cas (dosages d'anticorps et non plus d'antigenes,par exemple). Il peut y avoir combinaison des deux types d'electrodes dans des proportions variables.Ceci permet alors de pratiquer des dosages semiquantitatifs: les electrodes negatives captent toutes les Ig libres et les electrodes positives,plus petites,captent une partie seulement des complexes Ig + antigène,cette partie des complexes correspondant au taux physiologique d'antigène à ne pas depasser.S'il y a excès de cet antigène,les electrodes positives ne pourront pas capter tous les complexes formés et un signal sera alors fourni,indiquant l'excès de cet antigène au dessus des taux physiologiques. Un autre aspect très interessant de cette invention est la rapidité du dosage.Entre la depose de l'echantillon puis de la solution d'anticorps marqués et l'apparition du resultat,il ne s'ecoule guère plus de 5 à 10 secondes.La raison en est que l'attraction ou la repulsion des anticorps est instantanée alors que si cette reaction etait entièrement immunologique (attraction du complexe anticorps+antigene par un second anticorps prealablement fixé par exemple),elle aurait alors necessite une incubation.En fait dans cette invention,la reaction immunologique se produit dans le materiau isolant immédiatement après la depose.Cette reaction immunologique a été accelerée 10.000 fois par l'addition de reactifs appropriés (comme le polyethylene glycol 8000 par exemple).La reaction qui se produit ensuite entre les electrodes n'est donc plus immunologique mais electrique,donc instantanée, ce qui confère à cette invention une qualité qui sera hautement appreciée dans les dosages en urgence (enzymes myocardiques dans l'infarctus,annonce d'une embolie imminente en dosant le D- Dimere ou les facteurs de la coagulation après la chirurgie osseuse ou dans les phlebites,etc) Enfin l'extrême sensibilité est dûe à plusieurs raisons: 1 - les materiaux utilisés sont tous inertes (materiel poreux ou electrodes) et ne fixent pas la moindre molecule de proteine comme le font les methodes Elisa responsables d'un bruit de fond important qui interdit les dosages sensibles. 2 - le marquage des anticorps obeit à un cahier des charges très sevère: pas de polymeres ni agregats d'anticorps (source de faible sensibilité), marquage intensif (un anticorps peut supporter jusqu'à cinq molecules d'enzymes de marquage),etc 3 - la zone signal contient les reactifs les plus sensibles et les plus rapides à reagir avec le marquage des anticorps qui y parviennent 4 - enfin la haute selectivité des electrodes ne laisse libre aucun des anticorps "piegeable" mais surtout ne piege aucunement la moindre molecule d'anticorps "non-piegeable" susceptible de fournir le signal.Ce qui fait que le moindre signal ne peut que provenir d'un anticorps marqué et non d'un bruit de fond. L'ART ANTERIEUR Tout l'art anterieur concerne des dispositifs deja preparés immunologiquement (par immobilisation d'un premier anticorps) pour un diagnostic precis:l'on peut citer les puits des plaques Elisa,revêtues avec des premiers anticorps pour capter un antigène qui sera reconnu ensuite par un second anticorps,le tout etant revélé ensuite par un troisieme anticorps anti- Ig,bref,ceci après au moins six lavages et 3 heures d'incubation. Les tests rapides apparus dans les années 80 utilisent des microbilles prealablement revêtues par un premier anticorps et qui migrent sur une surface de nylon pour s'arreter eventuellement sur une premiere ligne (presence d'antigenes) de seconds anticorps,avant de s'arreter en tous cas sur une deuxieme ligne de troisiemes anticorps.Le tout se fait en plusieurs minutes,ne dose qu'un minimum de 7 nanogrammes d'antigène par ml d'echantillon et ne salt pas detecter les anticorps seriques. L'objet de la presente invention n'est pas non plus une electrophorèse qui se caracterise par une migration plus ou moins longue entre deux pôles electriques (l'un au depart et l'autre à l'arrivée),en fonction du poids moleculaire,de proteines differentes.Il existe des techniques plus ou moins sophistiquées de gel pris entre deux electrodes et qui permet de separer un groupe de proteines en bandes differentes selon leur poids moleculaire.Dans la presente invention,il ne s'agit nullement de separer ou de faire migrer differemment des poids moleculaires differents;il s'agit plutôt de capter ou refouler des immunoglobulines selon qu'elles sont liees ou non à leur antigène specifique.Le poids moleculaire ne joue aucun rôle puisque la technique fonctionne aussi parfaitement avec des fragments Fab issus d'IgG (les plus legeres) qu'avec des IgM reputées plus lourdes Le seul art anterieur proche de cette invention en ce qui concerne seulement l'aspect universel,est le brevet français No 90-12661 (PCT/FR91/00891)qui decrit un dispositif supportant des anticorps anti-immunoglobulines de souris,dits anti- idiotypes, qui parviennent à pieger tout anticorps de souris qui ne s'est pas lié à un antigene recherché.Ces anti- immunoglobulines de souris sont fixées sur u1n support poreux qui filtre de haut en bas ou d'arrière vers l'avant,l'echantillon associé aux anticorps marqués provenant de souris (et pas d'un autre hôte).Mais sur le plan technique et procédé,la difference est très importante puisque ce brevet français decrit un piegeage immunologique a7ors que l'invention decrit ici un piegeage electrique non immunologique,par des electrodes.Le materiel poreux separant les electrodes n'est qu'un moyen d'isoler,à sec,les deux electrodes et d'assurer un ecou]lment programmé et non brutal,des fluides à analyser.Ce materiel poreux (papier,etc) est inerte et ne joue strictement aucun autre rôle (et notemment ne supporte aucun materiel immunologique) En ce qui concerne les biocapteurs,il s'agit d'electrodes sur lesquelles a deja été fixé un premier reactif specifique de la substance recherchée,avec laquelle il va provoquer la formation d'un courant electrique mesurable.Par exemple une electrode sur laquelle a été prealablement fixée de la Glucose Oxydase,peut detecter la presence de D-Glucose par le peroxyde formé responsable d'une mobilisation d'electrons,mesurée alors dans un appareillage approprié.Dans l'invention objet du brevet decrit ici,les electrodes ne supportent aucun reactif et ne fournissent aucun renseignement à un quelconque appareillage.Elles ne font que jouer pendant le court instant o des fluides les mettent en contact,leur rôle electrique de repulsion ou d'attraction.C'est le resultat de la migration des fluides après le passage entre ces electrodes,qui fournit un signal et non les electrodes. DESCRIPTION Le dispositif sera donc composé (Planche I - figures 1 et 2) de deux electrodes (1) très fines,separées par du materiel poreux (2) quelconque (papier,nylon,nitrocellulose,etc).L'electrode superieure est perforée à une extremité (à gauche sur la figure 2) d'un orifice (3) laissant apparaitre du materiel poreux qui va recevoir dans un premier temps la goutte d'echantillon à tester et dans un deuxième temps la solution d'anticorps marqués specifiques de l'antigène recherché.Cette solution est contenue dans la pipette qui accompagne tout dispositif (Planche II- fig 1).Dès qu'elle est deposée,elle joue alors le rôle de contacteur entre les electrodes qui vont alors jouer leur rôle selectif au fur et à mesure que les fluides migrent entre les electrodes,vers l'autre extremité (5) du dispositif pour y fournir le signal (7) dû au marquage des Ig parvenues en 7 après avoir echappé aux electrodes. Près de l'orifice (3) o a été deposé l'echantillon,se trouve une petite zone- signal (6) recevant les fluides dans tous les cas (absence ou presence d'antigenes).En se colorant ou en emettant un signal quelconque,elle atteste de la bonne conservation des reactifs et permet dans le cas de mesure par un appareillage,de faire une difference exacte entre le taux de marquage avant et après la filtration entre les deux electrodes.Cette petite zone- signal peut aussi être au verso du dispositif. Ce dispositif peut donc être de la taille d'une "puce" semblable à celle d'une carte de credit.Elle peut être inserée dans l'epaisseur de la carte ou dans une bande destinée à un lecteur quantitatif comme les lecteurs de glycemie. Par ailleurs,la source electrique,en dehors d'une micro-pile classique, peut être plus simplement un micro-capteur de type solaire qui exigera de proceder au dosage sous une source lumineuse ou à la lumière en tout cas.Enfin,certaines electrodes à base d'hydroxyapathite,sont capables d'offrir un puissant electro-statisme propre,sans avoir recours à une source electrique. Cette "puce" peut egalement être inserée à l'extremité d'une bande qui sera simplement plongée dans le tube contenant la solution d'anticorps marqués,une fois que la gouttelette d'echantillon aura été prealablement deposée sur l'orifice 3. Elle peut egalement être integrée en series,à des automates capables de traiter ainsi des dizaines d'echantillons en même temps. La pipette d'anticorps marqués (Planche II - figure 1) est en plastique transparent dont le bouchon (8) se casse par simple rotation.Elle contient le volume suffisant de solution d'anticorps marqués (9) pour mouiller,en progressant de l'arrière vers l'avant,la totalité du materiau fibreux de separation et amener les fluides vers la zone signal.Cette pipette est le seul element du dispositif à être specifique de la substance recherchée,puisqu'elle contient les anticorps marqués specifiques de cette substance.Ce sont ces anticorps qui vont être ou non piégés par les electrodes.Ces dernières sont identiques pour tous les dispositifs et ne supportent aucun reactif chimique ou bilogique et encore moins immunologique.Elles sont donc universelles et peuvent être produites en très grandes series par des procédés robotiques.La seule difference entre un diagnostic de grossesse ou d'hepatite ou de marqueur tumoral,sera donc cette pipette. Pour prelever la gouttelette d'echantillon,il faut un autre element: une micro-pipette (10) precise et graduée,capable de prelever une certaine quantité seulement d'echantillon (quelques microlitres) et de la deposer sur l'orifice 3.Mais cette micropipette peut très avantageusement être associée à la pipette d'anticorps,par exemple à l'autre extremité de cette dernière: le premier geste sera donc de prelever quelques microlitres d'echantillon à l'aide de la micro-pipette (10) située à droite de l'ensemble (Planche II - figure 1),de deposer cet echantillon dans l'orifice 3,ensuite casser par rotation le bouchon (8) situé à gauche de la pipette,du côté de la solution d'anticorps (9),et enfin de vider cette dernière dans l'orifice 3. Dans une autre variante,la pipette d'anticorps (sans la micropipette de prelevement) peut être integrée à la carte sous forme d'un reservoir qui se deverserait (par pression de doigt par exemple) dans l'orifice 3 dès que la gouttelette d'echantillon a été deposée à l'aide d'une micropipette (10) fournie separément. Enfin,cette pipette d'anticorps marqués possède une propriété importante: elle servira aussi bien à detecter des antigènes (voir plus loin un exemple de dosage de l'antigène HBs de l'hepatite) que des anticorps seriques (voir un exemple de dosage des anticorps du VIH). Alors que dans tout l'art anterieur,les reactifs de dosage des antigènes ne sont jamais les mêmes que ceux utilisés pour la detection des anticorps seriques. La zone-signal (7) est un carré de materiau poreux (nylon blanc par exemple) supportant des reactifs susceptibles de transformer la moindre molecule de marqueur des anticorps qui lui parvient,en un signal (colorimetrique ou fluorescent ou chimioluminescent ou radio-actif ou autre). Elle est tout naturellement à l'extremité des electrodes mais elle peut être n'importe o dans le dispositif,pourvu que les fluides lui parviennent après leur passage entre les electrodes.Une variante très interessante (fig 2 - Planche II) consiste à perforer non plus seulement l'electrode superieure mais l'ensemble du dispositif (electrode superieure,le papier de separation et l'electrode inferieure), de colmater au verso l'orifice de cette electrode inferieure par un adhesif transparent quelconque,et d'amener la zone-signal sous cet adhesif transparent.Les fluides sortis de l'extremité des electrodes, sont aspirés par une bande poreuse quelconque,vers cette nouvelle zone signal.La coloration sera vue de dessus,à travers l'adhesif transparent, à l'endroit même du trou de depose 3.Cela simplifie le dispositif qui ne presentera plus qu'un orifice pour deposer l'echantillon et voir le resultat dans les quelques secondes qui suivent,à l'endroit même de la depose.La seule limite à cette interessante variante concerne les echantillons particulierement epais,colorés,visqueux,qui peuvent gêner la lecture du resultat par transparence.Mais dans le cas o la mesure du signal se fait par le verso (comme les bandelettes de dosage de la glycemie) avec par exemple un micro-rayon laser,cette variante deviendrait alors trsè attractive. Ces exemples ne sont pas limitatifs, ils sont indicatifs du potentiel de cette invention. EXEMPLES DE DOSAGE 1 - DETECTION DE L'ANTIGENE HBs de l'HEPATITE B dans LE SERUM Materiel: Une pipette sterile de 100 pl d'anticorps monoclonaux marqués Peroxydase concentrés à 2 pg/ml mesurant 8mm de large et 5 cm de long,portant une etiquette (HBs Ag Detection),presentant un embout de 1 cm de long et 1 mm de diametre interieur,et munie d'une ppipette de prelevement avec index de volume (trait) soit environ 4-5 pl d' echantillon à tester.- Un dispositif dont la zone signal est composée de Tetra-Methyl Benzidine,substrat de la Peroxydase. Protocole: on depose dans l'orifice 3, un volume de 4 pl de serum connu comme positif en antigène HBs (10 ng/ml) puis les pl d'anticorps Resultats: 10 secondes après la depose,apparait le fluide dans la fenêtre du resultat,puis après 5 secondes,une coloration pale bleue qui fonce en un bleu intense en 5 secondes.Total du temps: 20 secondes. Tests de sensibilité: on dilue le même serum 1000 fois: nouveau taux d'HBs: 10 picogrammes/ml.On refait la même manipulation: la coloration apparaît dans les mêmes delais,mais legerement moins intense. On dilue à nouveau 10 fois: 1 picogramme /ml.Coloration bleue bien visible mais qui a mis 10 secondes de plus pour apparaitre. Nouvelle dilution de 10 fois: 0,1 picogrammes/ml: coloration bleue mais qui a mis 30 secondes de plus pour être bien visible. Nouvelle dilution de 10 fois: 10 Millipicogrammes/ml: la coloration est bleue pâle mais elle a mis 1 minute de plus pour apparaître par rapport au dernier test: total de la durée pour avoir un signal avec 10 millipicogrammes: 2 minutes. (coloration bleue bien visible au bout de 5 minutes) Nouvelle dilution 10 fois: 1 Millipicogramme/ml.Très discrète coloration après 5 minutes. Ininterpretable à l'oeil nu.Possibilité d'evaluation par appareillage bien etalonné. 2 - DOSAGE SEMI-QUANTITATIF DU D-DIMERE DANS LE SERUM Le taux physiologique du D-Dimere est de 0,4 microgrammes maximum.Il augmente à la veille de la lyse fibrineuse d'un caillot de sang, annonçant le risque d'une embolie (chirurgie osseuse,pelvienne, cardiologie,etc).Ce dosage est de type predictif negatif c'est à dire que 100 % des tests negatifs ne font pas d'embolie alors que 60% seulement des positifs font une embolie.C'est donc un excellent test d'exclusion du risque d'embolie. Le problème qui se pose est de savoir comment neutraliser 0,4 gg/ml de D-Dimere.Pour cela on dispose les electrodes negatives normalement (elles vont capter tous les anticorps non liés à du D-Dimere) puis on additionne au dispositif de petites electrodes positives (5mm de long) programmées pour capter l'equivalent de 0,4 pg/ml de D-Dimere liés à leurs anticorps monoclonaux. Plusieurs serums vont être testés a - Serum A: etalonné à 0,4 pg/ml de D-Dimere.La zone signal se mouille en quelques secondes et aucune coloration ne se produit même au bout de 5 minutes. b - Serum B: dosé en laboratoire par Elisa: taux de D-Dimere : 0,76 pg/ml:coloration bleu d'abord pâle en 5 secondes puis bleu bien visible au bout de 20 secondes. c - Serum C provenant d'un patient qui venait de faire une embolie pulmonaire: taux de D-Dimère: 5,67 pg/ml: coloration bleue intense, immediate,l seconde après que la zone signal se soit mouillée 3 DETECTION D'ANTICORPS SERIQUES CONTRE LE VIRUS HIVl+2 Principe: Le dispositif est cette fois,prealablement prepare pour ce diagnostic,par depôt dans l'orifice 3,de peptides du virus VIH,sechés avant l'emballage du dispositif.A l'inverse du dosage d'antigènes,qui utilise le même support quelque soit l'antigène recherché (seule varie la pipette d'anticorps marqués specifique de l'antigène recherché),la detection d'anticorps seriques va donc utiliser des supports specifiques prealablement preparés pour un diagnostic precis). La pipette d'anticorps contient 100 pl d'immunoglobulines monoclonales marquées par de la phosphatase alcaline,de très grande affinité et hautement specifiques des peptides viraux deposes en 3. La zone signal contient les substrats de la phosphatase alcaline Mode operatoire: On depose quelques microlitres de serum seropositif,les anticorps seriques anti-VIH se complexent rapidement aux peptides viraux prealablement deposés en 3.Les anticorps marqués deposés dans un deuxième temps ne trouvent plus de peptides viraux libres et ne seront pas piégés par les electrodes (dans ce cas: electrodes positives).Ils vont donc migrer vers la zone signal pour une coloration attestant de la seropositivité de l'echantillon. On dilue 1000 fois le serum seropositif et on recommence: coloration bleue moins intense que la precedente. On dilue 100 fois cette dernière solution de serum soit au total une dilution de 100.000 fois: coloration bleue bien visible,mais après 2 minutes. Si l'echantillon est sero-negatif,les quelques microlitres deposés en 3 ne contiennent aucun anticorps serique.Les peptides viraux prealablement deposes en 3 restent libres.La depose d'anticorps marqués dans un deuxième temps entraine la formation immediate de complexes anticorps marqués + peptides viraux,complexes qui seront piégés par des electrodes positives.Il n'y aura aucune coloration de la zone-signal. REVENDICATIONS I - Procédé de detection immnulogique fine basé sur la capacité pour deux electrodes fines,chargées positivement, piegeant instantanément les complexes anticorps + antigène decouvert dans l'echantillon et laissant libres les anticorps non liés à un antigène,et caracterisé en ce qu'au cours d'une première etape,l'echantillon à tester est deposé sur un materiau poreux inerte separant les deux electrodes,puis mis en contact dans une seconde etape avec une solution d'anticorps marqués. L'ensemble echantillon + anticorps marqués migre pendant quelques secondes entre les deux electrodes jusqu'à l'extremité de ces dernières, pour mouiller une zone-signal contenant des reactifs.C'est au cours de cette migration entre les deux electrodes que se produit la selection entre anticorps marqués restés libres (et qui vont induire un signal dans la zone-signal) et anticorps marqués qui se sont complexés à un antigène decouvert dans l'echantillon,ces complexes etant piégés electrostatiquement et non immunologiquement,par les dites electrodes. 2 - Procédé selon la revendication 1 caracterisé en ce que le fonctionnement de ces electrodes (piegeage des complexes anticorps marqués + antigenes et repulsion des anticorps restés libres) peut être inversé en inversant la charge des electrodes: chargées cette fois-ci negativement,elles piegent les anticorps restés libres et laissent libres les complexes anticorps marqués + antigène qui sont alors revelés dans la zone signal. 3 - Procédé selon les revendications 1 et 2 caracterisé en ce qu'il est possible de pratiquer des dosages semi-quantitatifs en associant les deux types d'electrodes dans des proportions apropriées: les electrodes positives piegent tous les anticorps marqués restés libres,tandis que les electrodes negatives, plus courtes,ne piegent qu'une certaine quantité seulement de complexes anticorps marqués + antigenes correspondant à la quantité physiologique.En cas d'excès de ces antigènes,un excès de complexes se forme et delivre un signal semi- quantitatif positif.Alors que si ces antigenes circulent à des taux normaux,il n'y aura pas d'excès de complexes et donc pas de signal. 4 - Procédé selon les revendications I et 2,caracterisé en ce qu'il permet de detecter des anticorps seriques,même complexés à leurs antigenes naturels,grace à l'adjonction prealable dans le dispositif,de peptides viraux. - Procédé selon les revendications I et 2,caracterisé en ce que la totalité des materiaux utilisés (la pipette contenant les anticorps marqués,les electrodes et leur papier de separation) sont chimiquement et immunologiquement inertes,ne fixant pas de proteine ou d'anticorps,ce qui entraine l'absence totale de bruit de fond 6 - Procédé selon les revendications I et 2,caracterisé en ce que le marquage des anticorps utilisés,etant sans agregats,est totalement complementaire du fonctionnement des electrodes.En cas de polymeres ou d'agregats d'anticorps,il est evident que les electrodes ne peuvent agir sur les sites masqués des anticorps agrégés. 7 - Procédé selon les revendications 1 et 2,caracterisé en ce que le marquage des anticorps obeit à un ratio molecules de marquage/par molecule d'anticorps très elevé,pouvant atteindre la valeur de 5. -/0 8 - Procédé selon les revendications 5,6 et 7,caracterisé en ce que le caractere inerte des materiaux,la structure monomerique des anticorps et le ratio de marquage puissant de ces derniers,aboutit à une extrême sensibilité du procédé: 10 Millipicogrammes par millilitre d'echantillon si on utilise une lecture colorimetrique,UN millipicogramme si on utilise un appareillage plus sensible que l'oeil humain. 9 - Dispositif de detection immunologique fine caracterisé en ce qu'il comporte trois elements distincts: - un element en plastique transparent composé: - à une extremité,d'une micropipette pour le prelevement de quelques microlitres d'echantillon (sang total,serum,ou tout autre fluide biologique à tester) - à l'autre extremité,d'une pipette contenant la solution d'anticorps marqués devant être deposés à la suite de l'echantillon - un second element comprenant les deux electrodes separées par un materiau inerte,un carré de materiau poreux impregné des reactifs et destiné à absorber les fluides à la fin de leur migration entre les electrodes. - enfin un troisieme element servant de support au precedent.Il peut prendre l'aspect d'une carte de credit perforée pour recevoir l'echantillon et le contenu de la pipette,ainsi qu'une fenêtre pour montrer la zone-signal.Le second element serait alors placé sous la carte.Mais ce support peut aussi prendre l'aspet d'une bande à l'extremité de laquelle se trouve le second element,afin de l'inserer facilement dans un appareillage-lecteur. - Dispositif selon la revendication 9 caracterisé en ce que la pipette d'anticorps peut être incorporée,sous forme d'un reservoir interne,à la carte contenant les electrodes et la zone signal: il suffirait alors de presser le dit reservoir,une fois deposée la gouttelette d'echantillon,pour faire ecouler la solution d'anticorps dans le dispositif.