Brevet FR2781159A1 — publié le 20000121

La présente invention est relative à un vaccin contre le syndrome PMWS (Porcine Multisystemic Wasting Syndrome ou Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome encore appelé syndrome de dépérissement généralisé de post-sevrage). Le PCV (pour "Porcine CircoVirus") a été à l'origine détecté comme contaminant non cytopathogène dans des lignées cellulaires de reins de porcs PK/15. Ce virus a été classé parmi les Circoviridae avec le virus de l'anémie du poulet (CAV pour Chicken Anemia Virus) et le virus PBFDV (Pscittacine Beak and Feather Disease Virus). Il s'agit de petits virus (de 15 à 24 nm) non enveloppés dont la caractéristique commune est de contenir un génome sous forme d'un ADN simple brin circulaire de 1,76 à 2,31 kb. On a d'abord pensé que ce génome codait pour un polypeptide d'environ 30 kDa (Todd et al., Arch Virol 1991, 117: 129- 135). Des travaux récents ont toutefois montré une transcription plus complexe (Meehan B. M. et al., 1997,78: 221-227). Par ailleurs, on ne connaît pas d'homologies significatives de séquence nucléotidique ni de déterminants antigéniques communs entre les trois types de circovirus connus. Le PCV issu des cellules PK/15 est considéré comme n'étant pas pathogène. On en connaît la séquence d'après B. M. Meehan et al., J Gen Virol 1997 (78) 221- 227. Ce n'est que très récemment que des auteurs ont pensé que des souches de PCV pourraient être pathogènes et associées au syndrome PMWS (Gupi P. S. Nayar et al., Can Vet J , vol. 38,1997: 385-387 et Clark E. G., Proc Am Assoc Swine Prac 1997: 499-501 ). Nayar et al. ont détecté de l'ADN de PCV chez des porcs présentant le syndrome PMWS par des techniques de PCR. Le syndrome PMWS détecté au Canada, aux Etats-Unis et en France se caractérise au plan clinique par une perte progressive de poids et par des manifestations telles que tachypnée, dyspnée et jaunisse. Au plan pathologique, il se traduit par des infiltrations lymphocytaires ou granulomateuses, des lymphadénopathies et, plus rarement, par des hépatites et néphrites lymphocytaires ou granulomateuses (Clark E. G., Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997 : ; La Semaine Vétérinaire n 26, supplément à La Semaine Vétérinaire 1996 (834) ; La Semaine Vétérinaire 1997 (857) : 54 ; P. S. Nayar et al., Can Vet J , vol. 38, 1997: 385-387). La déposante a réussi à isoler cinq souches nouvelles de PCV à partir de prélèvements pulmonaires ou ganglionnaires provenant d'élevages situés au Canada, aux Etats-Unis (Californie) et en France (Bretagne). Ces virus ont été mis en évidence dans des lésions de porcs atteints du syndrome PMWS, mais pas chez des porcs sains. La déposante a en outre séquence le génome de quatre de ces souches, à savoir les souches provenant du Canada et des Etats-Unis ainsi que deux souches française. Les souches présentent entre elles une très forte homologie au niveau nucléotidique dépassant 96 % et beaucoup plus faible avec la souche PK/15, environ 76 %. Les nouvelles souches peuvent donc être considérées comme représentatives d'un nouveau type de circovirus porcin, dénommé ici type Il, le type # étant représenté par la PK/15. Des préparations purifiées de cinq souches ont été déposées auprès de l'ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Royaume-Uni) le jeudi 2 octobre 1997: - n d'accès provisoire V97100219 (appelé ici Imp. 1008PCV) - n d'accès provisoire V97100218 (appelé ici lmp.1010PCV) - n d'accès provisoire V97100217 (appelé ici Imp. 999PCV). et, le vendredi 16 janvier1998 : - n d'accès provisoire V98 011608 (appelé ici Imp 1011-48285) - n d'accès provisoire V98 011609 (appelé ici Imp 1011-48121) La déposante a constaté que, dans un essai de reproduction expérimentale du syndrome de dépérissement, un parvovirus porcin associé au circovirus porcin pouvait conduire à une exacerbation de la maladie. La présente invention a pour donc objet une vaccination des porcs mettant en oeuvre un vaccin circovirus porcin, en particulier type 1 ou type Il, de préférence type II, associée à un vaccination avec un vaccin parvovirus porcin. On entend par là la vaccination avec soit un vaccin bivalent, soit l'utilisation simultanée chez le porc d'un vaccin circovirus porcin et d'un vaccin parvovirus porcin. La souche parvovirus de référence est la souche NADL-2 accessible auprès de la collection de l'ATCC sous la référence VR-742. La vaccination contre le parvovirus porcin est bien connue de l'homme de métier et des vaccins contre le parvovirus porcin sont diponibles dans le commerce. On peut citer à titre d'exemple : Parvovax# (vaccin inactivé contre la parvovirose porcine, distribué par MERIAL). La présente invention a donc pour objet une préparation antigénique dirigée contre le syndrome PMWS, comprenant au moins un antigène de circovirus porcin (de préférence circovirus de type II) et au moins un antigène de parvovirus porcin. Conformément à l'invention, l'antigène de circovirus porcin (de préférence circovirus de type Il) et l'antigène de parvovirus porcin comprennent, indépendamment l'un de l'autre, un antigène choisi dans le groupe consistant en antigène entier vivant atténué, antigène entier inactivé, antigène de sous-unité, vecteur vivant recombinant, vecteur ADN. On comprend que l'association selon l'invention peut recourir à l'utilisation de toute forme d'antigène ou préparation antigénique approprié, étant entendu qu'il n'est pas nécessaire d'utiliser pour une association donnée une même forme. La préparation antigénique pourra comprendre en outre, comme cela est connu en soi, un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire et éventuellement un adjuvant acceptable sur le plan vétérinaire. La présente invention a également pour objet un vaccin contre le syndrome PMWS, comprenant une quantité efficace de préparation antigénique circovirus + parvovirus telle que décrit ci-dessus, dans un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant acceptable sur le plan vétérinaire. La présente invention a encore pour objet un kit de vaccination contenant, conditionnés séparément, une préparation antigénique ou un vaccin contre le circovirus porcin et une préparation antigénique ou un vaccin contre le parvovirus porcin. Ce kit de vaccination peut reprendre les différentes caractéristiques énoncées ci-dessus pour les préparations antigéniques et vaccins. L'invention a également pour objet une méthode de vaccination contre le syndrome PMWS, comprenant l'administration d'un vaccin contre le circovirus porcin et d'un vaccin contre le parvovirus porcin ou l'administration d'un vaccin bivalent, comprenant dans la même formulation une préparation antigénique spécifique de chaque virus. Cette méthode de vaccination utilise notamment les vaccins tels que définis ci-dessus. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une préparation antigénique ou d'un vaccin contre le parvovirus, tel que notamment défini supra, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être utilisée dans le cadre de la prévention du syndrome PMWS, en association avec une préparation antigénique ou un vaccin contre le circovirus porcin. Pour la production de vaccins circovirus, les circovirus peuvent être obtenus après passages sur cellules, notamment lignées cellulaires, e. g. cellules PK/1 5. Les surnageants ou extraits de culture, éventuellement purifiés par des techniques standards, peuvent être utilisés comme préparation antigénique. Dans le cadre des préparations antigéniques et vaccins atténués, l'atténuation peut être effectuée selon les méthodes usuelles, e. g. par passage sur cellules, de préférence par passage sur des cellules de porc, notamment lignées, telles que cellules PK/15 ( par exemple de 50 à 150, notamment de l'ordre de 100, passages). Ces préparations et vaccins comprennent en général un véhicule ou diluant acceptable sur le plan vétérinaire, éventuellement un adjuvant acceptable sur le plan vétérinaire ainsi qu'éventuellement un stabilisateur de lyophilisation. Ces préparations antigéniques et vaccins comprendront de préférence de 103 à 107 TCID50 du virus atténué considéré. Il peut aussi s'agir de préparations antigéniques et vaccins à base d'antigène entier inactivé. Les préparations antigéniques et vaccins comprennent en outre un véhicule ou diluant acceptable au plan vétérinaire, avec éventuellement en plus un adjuvant acceptable au plan vétérinaire. Les circovirus selon l'invention, avec les fractions qui peuvent être présentes, sont inactivés selon les techniques connues de l'homme du métier. L'inactivation sera effectuée de préférence par voie chimique, e. g. par exposition de l'antigène à un agent chimique tel que formaldéhyde (formol), paraformaldéhyde, ss- propiolactone ou éthylène imine ou ses dérivés. La méthode d'inactivation préférée sera ici l'exposition à un agent chimique et en particulier à l'éthylène imine ou à la ss-propiolactone. De préférence, les préparations antigéniques et les vaccins inactivés selon l'invention seront adjuvés, avantageusement en étant présentés sous forme d'émulsions, par exemple eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Le caractère adjuvant pourra aussi provenir de l'incorporation au principe actif d'un composé adjuvant usuel. Parmi les adjuvants qui peuvent être utilisés, on peut citer à titre d'exemple l'hydroxyde d'alumine, les saponines (e.g. Quillaja saponin ou Quil A ; voir Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, édité par Michael F. Powel et Mark J. Newman, Plennum Press, New-York and London, p 210), l'Avridine# (Vaccine Design p 148), le DDA (Diméthyldioctadécylammonium bromide, Vaccine Design p 157), le Polyphosphazene (Vaccine Design p 204), ou encore des émulsions huile-dans-l'eau à base d'huile minérale, de squalane (e. g. émulsion SPT, Vaccine Design p 147), de squalène (e. g. MF59, Vaccine Design p 183), ou eaudans-l'huile à base d'huile métabolisable (de préférence selon WO-A-94 20071) ainsi que les émulsions décrites dans US-A-5 422 109. On peut aussi choisir des associations d'adjuvants, par exemple Avridine"' ou DDA associé à une émulsion. Ces préparations antigéniques et vaccins comprendront de préférence de 105 à 108 TCID50 du virus entier inactivé considéré. Les adjuvants du vaccin vivant pourront être choisis parmi ceux donnés pour le vaccin inactivé. On préférera les émulsions. A celles indiquées pour le vaccin inactivé, on peut rajouter celles décrites dans WO-A-9416681. Comme stabilisateur de lyophilisation, on peut citer à titre d'exemple le SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59,509, 950), des hydrates de carbone tels que sorbitol, mannitol, amidon, saccharose, dextran ou glucose, des protéines telles que albumine ou caséine, des dérivés de ces composés, ou des tampons tels que de phosphates de métaux alcalins. Les préparations antigéniques et vaccins selon l'invention pourront comprendre un ou des principes actifs (antigènes) d'un ou de plusieurs circovirus et/ou parvovirus selon l'invention. La déposante a en outre obtenu le génome de quatre des isolats de circovirus porcin de type Il identifiés SEQ ID NO: 1 à 4. La séquence de la souche PK-1 5 est donnée en SEQ ID NO: 5. Il va de soi que l'invention recouvre automatiquement les séquences équivalentes, c'est-à-dire les séquences ne changeant pas la fonctionnalité ni la spécificité de souche de la séquence décrite ni des polypeptides codés par cette séquence. Seront bien entendu incluses les séquences différant par dégénérescence du code. L'invention recouvre également les séquences équivalentes en ce sens qu'elles sont capables de s'hybrider à la séquence supra dans des conditions de stringence élevées et/ou ont une forte homologie avec les souches de l'invention. Ces séquences et leurs fragments pourront avantageusement être utilisés pour l'expression in vitro ou in vivo de polypeptides à l'aide de vecteurs appropriés. En particulier, des cadres ouverts de lecture, formant des fragments d'ADN selon l'invention, utilisables à cet effet ont été identifiés sur la séquence génomique des circovirus de type II. L'invention concerne tout polypeptide contenant au moins un de ces cadres ouverts de lecture (séquence en acides aminés correspondante). De préférence, l'invention concerne une protéine formée essentiellement par les COL4, COL7, COL10 ou COL13. Pour l'expression de sous-unités in vitro, comme moyen d'expression on aura de préférence recours à E. coli ou au baculovirus (US-A-4 745 051). On intègre la ou les séquences codantes ou leurs fragments dans le génome du baculovirus (e. g. le baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV) et ce dernier est ensuite propagé sur cellules d'insectes, e. g. Spodoptera frugiperda Sf9 (dépôt ATCC CRL 1711). On peut encore produire les sous-unités dans des cellules eucaryotes telles que levures (e. g. Saccharomyces cerevisiae) ou cellules de mammifères (e. g. CHO, BHK). L'invention a aussi pour objet l'utilisation en tant que sous-unités des polypeptides qui seront produits in vitro par ces moyens d'expression, puis éventuellement purifiés selon les techniques classiques. Les préparations antigéniques et les vaccins de sous-unité comprenant au moins un polypeptide tel qu'ainsi obtenu, ou fragment, dans un véhicule ou diluant acceptable sur le plan vétérinaire et éventuellement un adjuvant acceptable sur le plan vétérinaire. Pour l'expression in vivo en vue de la réalisation de vaccins vivants recombinants, on insère la ou les séquences codantes ou leurs fragments dans un vecteur d'expression approprié dans des conditions permettant l'expression du ou des polypeptides. Comme vecteurs appropriés, on peut utiliser des virus vivants, de préférence capables de se multiplier chez le porc, non pathogènes pour le porc (naturellement non pathogène ou rendu tel), selon les techniques bien connues de l'homme du métier. On pourra notamment utiliser des herpèsvirus du porc tels que le virus de la maladie d'Aujeszky, l'adénovirus porcin, des poxvirus, notamment virus de la vaccine, avipox, canarypox, swinepox. On peut aussi utiliser comme vecteurs des ADN plasmidiques (WO-A-90 11092, WO-A-93 19813, WO-A-94 21797, WO-A-95 20660). L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation des vecteurs et des vaccins vivants recombinants ou plasmidiques (vaccins polynucléotidiques ou ADN) ainsi réalisés, les vaccins comprenant en outre un véhicule ou diluant acceptable sur le plan vétérinaire. Dans le cadre des programmes de vaccinations associées, on peut aussi associer à la vaccination contre le circovirus porcin et le parvovirus porcin, une vaccination contre d'autres pathogènes du porc, notamment choisis parmi le PRRS (Porcine Reproductory and Respiratory Syndrome) et/ou la grippe porcine et/ou Actinobacillus pleuropneumoniae et/ou virus de la maladie d'Aujeszky et/ou peste porcine (Hog Choiera). De préférence, le programme de vaccination associera les vaccinations contre le circovirus et le parvovirus, et le PRRS et/ou la grippe porcine. On peut ainsi utiliser toute forme de vaccin appropriée en particulier tout vaccin commercial disponible, pour l'associer au vaccin contre le circovirus porcin tel que décrit ici. La présente invention a donc également pour objet les vaccins multivalents, les kits multivaccins, et les méthodes de vaccination associées permettant de mettre en oeuvre de tels programmes de vaccination associées. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de réalisation non limitatifs, pris en référence au dessin, dans lequel : Figure 1 : d'ADN du génome de la souche Imp 1011-48121 Figure 2 : d'ADN du génome de la souche Imp 1011-48285 Figure 3 : d'ADN du génome de la souche Imp 999 Figure 4 : d'ADN du génome de la souche Imp 1010 Figure 5 : des 4 séquences selon les figures 1 à 4 avec la séquence de la souche PCV PK/15 Liste des séquences SEQ ID SEQ ID NO: 1 séquence d'ADN du génome de la souche Imp 1011-48121 SEQ ID NO: 2 séquence d'ADN du génome de la souche Imp 1011-48285 SEQ ID NO: 3 séquence d'ADN du génome de la souche Imp 999 SEQ ID NO: 4 séquence d'ADN du génome de la souche Imp 1010 SEQ ID NO: 5 séquence d'ADN du génome de la souche PK/15 EXEMPLES Exemple 1 : Culture et isolement des souches de circovirus porcins: Des échantillons de tissus ont été récoltés en France, au Canada et aux USA à partir de poumons et de ganglions lymphatiques de porcelets. Ces porcelets présentaient des signes cliniques typiques du syndrome de dépérissement généralisé de post-sevrage. Pour faciliter l'isolement des virus, les échantillons de tissus ont été congelés à -70 C immédiatement après autopsie. Pour l'isolement viral, des suspensions contenant environ 15% d'échantillon de tissu ont été préparées dans un milieu minimum contenant des sels d'Earle (EMEM, BioWhittaker UK Ltd., Wokingham, UK), de la pénicilline (100 UI/ml) et de la streptomycine (100 g/ml)(milieu MEM-SA), par broyage des tissus avec du sable stérile au moyen d'un mortier et d'un pilon stériles. Cette préparation broyée a été alors reprise dans du MEM-SA, puis centrifugée à 3000 g pendant 30 minutes à + 4 C pour récolter le surnageant. Préalablement à l'ensemencement des cultures de cellules, un volume de 100 l de chloroforme a été ajouté à 2 ml de chaque surnageant et mélangé en continu pendant 10 minutes à température ambiante. Ce mélange a alors été transféré dans un tube de microcentrifugeuse, centrifugé à 3000 g pendant 10 minutes, puis le surnageant a été récolté. Ce surnageant a été ensuite utilisé comme inoculum pour les expériences d'isolement viral. Toutes les études d'isolement viral ont été réalisées sur des cultures de cellules PK/15, connues pour être non contaminées par le circovirus porcin (PCV), les pestivirus, les adénovirus porcins et le parvovirus porcin (Allan G. et al. Pathogenesis of porcine circovirus expérimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995.44. 49-64). L'isolement des circovirus porcins a été réalisé selon la technique suivante: Des monocouches de cellules PK/15 ont été dissociées par trypsination (avec un mélange trypsine-versène) à partir de cultures confluentes, et reprises en milieu MEM-SA contenant 15% de sérum foetal de veau non contaminé par du pestivirus (= milieu MEM-G) sous une concentration finale d'environ 400,000 cellules par ml. Des fractions aliquotes de 10 ml de cette suspension cellulaire ont alors été mélangées avec des fractions aliquotes de 2 ml des inoculums décrits ci-dessus, et les mélanges finaux ont été aliquotés en volumes de 6 ml dans deux flacons Falcon de 25 cm2. Ces cultures ont alors été incubées à + 37 C pendant 18 heures en atmosphère contenant 10% de CO2. Après incubation, le milieu de culture des monocouches semi-confluentes a été traité avec 300 mM de D-glucosamine (Cat # G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et al., Arch. Virol. 1987 96 39-57), puis l'incubation a été poursuivie pendant une période supplémentaire de 48-72 heures à +37 C. A la suite de cette dernière incubation, l'un des deux Falcons de chaque inoculum a subi 3 cycles successifs de congélation/décongélation. Les cellules PK/1 5 du Falcon restant ont été traitées avec une solution de trypsine-versène, resuspendues dans 20 ml de milieu MEM-G, puis ensemencées dans des Falcons de 75 cm2 à une concentration de 400,000 cellules/ml. Les flacons fraîchement ensemencés ont alors été "surinfectés" par addition de 5 ml du lysat correspondant obtenu après les cycles de congélation/décongélation. Exemple 2 : Préparation des échantillons de culture cellulaire pour détection des circovirus porcins par immunofluorescence ou par hybridation in situ. Un volume de 5 ml de la suspension "surinfectée" a été prélevé et ensemencé dans une boîte de Petri de 55 mm de diamètre contenant une lamelle de verre stérile et dégraissée. Les cultures en flacons et sur lamelles de verre ont été incubées à +37 C et traitées à la glucosamine comme décrit dans l'exemple 1. Les cultures sur lamelles de verre ont été récoltées de 24 à 48 heures après le traitement à la glucosamine et fixées, soit avec de l'acétone pendant 10 minutes à température ambiante, soit avec 10% de formaldéhyde tamponné pendant 4 heures. Suite à cette fixation, toutes les lamelles de verre ont été stockées à -70 C, sur gel de silice, avant leur utilisation pour les études d'hybridation in situ et les études de marquage immunocytochimique. Exemple 3 : Techniques de détection de séquences PCV par hybridation in situ L'hybridation in situ a été réalisée sur les tissus prélevés sur les porcs malades et fixés au formaldéhyde et également sur les préparations de cultures de cellules inoculées pour l'isolement viral (voir exemple 2) et fixées sur lamelles de verre. Des sondes génomiques complètes correspondant aux circovirus porcin PK/15 (PCV) et au virus de l'anémie infectieuse du poulet (chicken anemia virus = CAV) ont été utilisées. Le plasmide pPCV1, contenant la forme réplicative du génome PCV clonée sous la forme d'un insert unique de 1,7 kilopaires de bases (kpb) (Meehan B. et al. Sequence of porcine circovirus DNA : with plant circoviruses. J. Gen. Virol. 1997.78. 221-227) a été utilisé comme source d'ADN viral spécifique pour PCV. Un plasmide analogue, pCAA1, contenant la forme réplicative 2,3 kpb du circovirus aviaire CAV a été utilisé comme contrôle négatif. Les stocks de glycérols respectifs de ces deux plasmides ont été utilisés pour la production et la purification des plasmides selon la technique de lyse alcaline (Sambrook J. et al. Molecular cloning : A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New york. 1989) afin qu'ils servent ensuite de matrices pour la préparation des sondes. Les sondes circovirus représentatives des génomes complets du PCV et de CAV ont été produites à partir des plasmides purifiés décrits ci-dessus (1//g pour chaque sonde) et d'amorces hexanucléotidiques au hasard en utilisant un kit commercial de marquage non radioactif ("DIG DNA labelling kit" , Boehringer Mannheim, Lewes, UK) selon les recommandations du fournisseur. Les sondes marquées à la digoxigénine ont été reprises sous un volume de 50-100 NI d'eau stérile avant leur utilisation pour l'hybridation in situ. Les échantillons de tissus de porcs malades, inclus dans la paraffine et fixés au formaldéhyde, ainsi que les préparations de cultures de cellules infectées, fixées au formaldéhyde, ont été préparées pour la détection des acides nucléiques PCV selon la technique suivante : Des sections de 5 m d'épaisseur ont été découpées à partir des blocs de tissus inclus dans la paraffine, déparaffinés, puis réhydratés dans des solutions successives d'alcool à concentration décroissante. Les sections de tissus et les cultures de cellules fixées au formaldéhyde ont été incubées respectivement pendant 15 minutes et 5 minutes à +37 C dans une solution de protéinase K à 0,5% en tampon Tris-HCI 0,05M, EDTA 5 mM (pH 7,6). Les lames ont été alors placées dans une solution de glycine à 1 % en eau distillée autoclavée, pendant 30 secondes, lavées deux fois avec un tampon PBS (phosphate buffer saline) 0,01 M (pH 7,2), et enfin lavées pendant 5 minutes en eau distillée stérile. Elles ont été finalement séchées à l'air libre et mises en contact avec les sondes. Chaque préparation tissu/sonde a été recouverte avec une lamelle propre et dégraissée, puis placée dans un four à +90 C pendant 10 minutes, mise ensuite en contact avec un bloc de glace pendant 1 minute, et enfin incubée pendant 18 heures à +37 C. Les préparations ont été ensuite immergées brièvement dans un tampon sel de sodium-citrate (SSC) 2X (pH 7,0) pour éliminer les lamelles protectrices, puis lavées 2 fois pendant 5 minutes en tampon SSC 2X et enfin lavées 2 fois pendant 5 minutes en tampon PBS. Après ces lavages, les préparations ont été immergées dans une solution d'acide maléique 0,1M, NaCI 0,15 M (pH 7,5) (tampon maléique) pendant 10 minutes, puis incubées dans une solution de 1 % de réactif bloquant (Cat # 1096176, Boehringer Mannheim UK, Lewis, East Sussex, UK) en tampon maléique pendant 20 minutes à +37 C. Les préparations ont alors été incubées avec une solution au 1/250 d'un anticorps monoclonal anti-digoxigénine (Boehringer Mannheim), dilué en tampon bloquant, pendant 1 heure à +37 C, lavées en PBS et enfin incubées avec un anticorps biotinylé anti-immunoglobuline de souris pendant 30 minutes à +37 C. Les préparations ont été lavées en PBS et l'activité péroxydase endogène a été bloquée par un traitement avec une solution de péroxyde d'hydrogène à 0,5% en PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Les préparations ont été lavées une nouvelle fois en PBS et traitées avec un substrat 3-amino-9-diéthylcarbazole (AEC) (Cambridge Bioscience, Cambridge, UK) préparé extemporanément. Après un dernier lavage à l'eau de ville, les préparations ont été contrecolorées avec de l'hématoxyline, "bleuies" sous eau de ville, et montées sous lamelles microscopiques avec un liquide de montage (GVA Mount, Cambridge Bioscience, Cambridge, UK). Les contrôles d'expérience ont inclus l'utilisation d'une sonde négative non pertinente (CAV) et d'une sonde positive (PCV) sur des échantillons provenant de porcs malades et de porcs non malades. Exemple 4 : Technique de détection du PCV par immunofluorescence Le criblage initial de toutes les préparations de culture cellulaire fixées à l'acétone a été réalisé par une technique d'immunofluorescence indirecte (IFI) utilisant une dilution au 1 /100 d'un pool de sérums de porcs adultes. Ce pool de sérums comprend des sérums de 25 truies adultes d'Irlande du Nord et est connu pour contenir des anticorps contre une grande variété de virus porcins, y compris PCV : parvovirus porcin, adénovirus porcin, et virus PRRS. La technique IFI a été réalisée par un contact du sérum (dilué en PBS) avec les cultures cellulaires pendant une heure à +37 C, suivi de deux lavages en PBS. Les cultures de cellules sont alors colorées avec une dilution au 1/80 en PBS d'un anticorps de lapin antiimmunoglobuline de porc conjugué à de l'isothiocyanate de fluorescéine pendant une heure, puis lavées en PBS et montées en tampon glycérol préalablement à l'observation microscopique sous éclairage ultra-violet. Exemple 5 : Résultats de l'hybridation in situ sur les tissus de porcs malades L'hybridation in situ, utilisant une sonde génomique PCV, réalisée sur des tissus prélevés sur des porcelets français, canadiens et californiens présentant des lésions de dépérissement généralisé et fixés au formaldéhyde, a révélé la présence d'acides nucléiques PCV associés aux lésions, dans plusieurs des lésions étudiées. Aucun signal n'a été observé lorsque la sonde génomique PCV a été utilisée sur des tissus prélevés sur des porcs non malades ou lorsque la sonde CAV a été utilisée sur les tissus de porcs malades. La présence d'acide nucléique PCV a été identifiée dans le cytoplasme et le noyau de nombreuses cellules mononucléaires infiltrant les lésions dans les poumons des porcelets californiens. La présence d'acide nucléique PCV a également été mise en évidence dans les pneumocytes, les cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires, et dans les cellules endothéliales des petites artérioles, veinules et vaisseaux lymphatiques. Chez les porcs malades français, la présence d'acide nucléique PCV a été détectée dans le cytoplasme de nombreux lymphocytes folliculaires et dans les cellules mononucléaires intrasinusoïdales des ganglions lymphatiques. L'acide nucléique PCV a également été détecté dans des syncytia occasionnels. En fonction de ces résultats de détection, des échantillons de poumons de porcs californiens, de ganglions lymphatiques mésentériques de porcs français, et d'organes de porcs canadiens ont été choisis aux fins d'isolement des nouvelles souches de circovirus porcin. Exemple 6 : Résultats de la culture cellulaire des nouvelles souches de circovirus porcin et détection par immunofluorescence Aucun effet cytopathique (ECP) n'a été observé dans les cultures de cellules inoculées avec les échantillons prélevés sur les porcelets francais (souche Imp.1008), californiens (souche Imp.999) et canadiens (souche Imp.1010) montrant des signes cliniques du syndrome du dépérissement généralisé. Cependant, l'immuno-marquage des préparations provenant des cultures de cellules inoculées, après fixation à l'acétone et avec un pool de sérums polyclonaux de porcs, a révélé une fluorescence nucléaire chez de nombreuses cellules dans les cultures inoculées à partir des poumons de porcelets californiens (souche Imp.999), à partir des ganglions lymphatiques médiastinaux des porcelets français (souche Imp.1008), et à partir d'organes des porcelets canadiens (souche Imp. 1010). Exemple 7 : Extraction de l'ADN génomique des circovirus porcins Les formes réplicatives des nouvelles souches de circovirus porcin (PCV) ont été préparées à partir de cultures de cellules PK/15 infectées (voir exemple 1) (10 Falcons de 75 cm2) récoltées après 72-76 heures d'incubation et traitées à la glucosamine, comme décrit pour le clonage de la forme réplicative du CAV (Todd. D. et al. Dot blot hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe. J. Clin. Microbiol. 1991.29. 933-939). L'ADN double brin de ces formes réplicatives a été extrait selon une modification de la technique de Hirt (Hirt B. Sélective extraction of polyoma virus DNA from infected cell cultures. J. Mol. Biol. 1967.36. 365-369), comme décrit par Molitor (Molitor T. W. et al. Porcine parvovirus DNA : of the genomic and replicative form DNA of two virus isolates. Virology. 1984.137. 241-254). Exemple 8 : Carte de restriction de la forme réplicative du génome de la souche Imp.999 de circovirus porcin. L'ADN (1-5 g) extrait selon la technique de Hirt a été traité par la nucléase S1 (Amersham) selon les recommandations du fournisseur, puis cet ADN a été digéré par différentes enzymes de restriction (Boehringer Mannheim, Lewis, East Sussex, UK) et les produits de la digestion ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% en présence de bromure d'éthidium comme décrit par Todd et al. (Purification and biochemical characterization of chicken anemia agent. J. Gen. Virol. 1990.71. 819-823). L'ADN extrait des cultures de la souche Imp.999 possède un site unique EcoRI, 2 sites Sacl et ne possède pas de site Pstl. Ce profil de restriction est donc différent du profil de restriction présenté par la souche PCV PK/15 (Meehan B. et al. Séquence of porcine circovirus DNA : affinitieswith plant circoviruses. 1997. 78. 221-227) qui possède au contraire un site Pstl et ne possède pas de site EcoRI. Exemple 9 : Clonage du génome de la souche Imp.999 de circovirus porcin Le fragment de restriction d'environ 1,8 kpb généré par digestion de la forme réplicative double brin de la souche PCV Imp.999 avec l'enzyme de restriction EcoRI a été isolé après électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% (voir exemple 3) en utilisant un kit commercial Qiagen (QIAEXII Gel Extraction Kit, Cat # 20021,QIAGEN Ltd., Crawley, West Sussex, UK). Ce fragment de restriction EcoRl- EcoRI a été ensuite ligaturé avec le vecteur pGEM-7 (Promega, Médical Supply Company, Dublin, Ireland), préalablement digéré par les mêmes enzymes de restriction et déphosphorylé, en suivant les techniques standards de clonage (Sambrook J. et al. Molecular cloning : A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New york. 1989). Les plasmides obtenus ont été transformés dans une souche hôte Escherichia coli JM109 (Stratagene, La Jolla, USA) selon les techniques standards. Le fragment de restriction EcoRI-EcoRI de la souche PCV Imp.999 a également été cloné dans le site EcoRI du vecteur pBlueScript SK+ (Stratagene Inc. La Jolla, USA). Parmi les clones obtenus pour chaque souche hôte, au moins 2 clones contenant les fragments de la taille attendue ont été sélectionnés. Les clones obtenus ont alors été cultivés et les plasmides contenant le génome complet de la souche Imp.999 ont été purifiés en petit volume (2 ml) ou en grand volume (250 ml) selon les techniques standards de préparation et de purification des plasmides. Exemple 10 : Séquençage de l'ADN génomique (forme réplicative double brin) de la souche PCV Imp.999. La séquence nucléotidique de 2 clones EcoRI Imp.999 (clones pGEM-7/2 et pGEM-7/8) a été déterminée selon la technique des didéoxynucléotides de Sanger en utilisant le kit de séquençage "AmpliTaq DNA polymerase FS" (Cat # 402079 PE Applied Biosystems, Warrington, UK) et un appareil de séquençage automatique Applied BioSystems ABI373A selon les recommandations du fournisseur. Les réactions de séquençage initiales ont été faites avec les primers universels M 13 "forward" et "reverse". Les réactions de séquençage suivantes ont été générées selon la technique de "marche sur l'ADN". Les oligonucléotides nécessaires à ces séquençages ultérieurs ont été synthétisés par Life Technologies (Inchinnan Business Park, Paisley, UK). Les séquences générées ont été assemblées et analysées au moyen du logiciel MacDNASIS version 3. 2. (Cat # 22020101, Appligene, Durham, UK). Les différents cadres ouverts de lecture ont été analysés au moyen de l'algorithme BLAIR. disponible sur le serveur du "National Centre for Biotechnologie Information (NABI, Bethesda, MD, USA). La séquence complète (fragment EcoRI-EcoRI) est présentée à la SEQ ID NO : 3 (Figure 3). Elle donne la séquence totale de cette souche, que l'on a fait débuter arbitrairement au début du site EcoRI, soit le G comme premier nucléotide. On a procédé d'une manière similaire pour l'obtention de la séquence des trois autres isolats selon l'invention (voir SEQ ID NO : 1, 2 et 4 et figures 1, 2 et 4). La taille du génome de ces quatre souches est : Imp 1011-48121 1767 nucléotides Imp 101 1-48285 1767 nucléotides Imp 999 1768 nucléotides Imp 1010 1768 nucléotides Exemple 11 : Analyse de la séquence de la souche PCV Imp.999. Lorsque la séquence générée à partir de la souche Imp.999 a été utilisée pour une recherche d'homologie vis-à-vis des séquences contenues dans la banque de données GenBank, la seule homologie significative qui ait été détectée est une homologie d'environ 76 % (au niveau acide nucléique) avec la séquence de la souche PK/15 (Numéros d'accès Y09921 et U49186) (voir figure NI 5). Au niveau acides aminés, la recherche d'homologie de la traduction des séquences dans les 6 phases avec les banques de données (algorithme BLAS. X sur le serveur NABI) a permis de mettre en évidence une homologie de 94 % avec le cadre ouvert de lecture correspondant à la réplicase théorique du virus BBTV similaire aux circovirus de plantes (numéro d'identification GenBank 1841515) codée par la séquence GenBank U49186. Aucune autre séquence contenue dans les banques de données ne montre d'homologie significative avec la séquence générée à partir de la souche PCV Imp.999. L'analyse des séquences obtenues à partir de la souche Imp.999 cultivée à partir de lésions prélevées sur des porcelets californiens présentant des signes cliniques du syndrome de dépérissement généralisé montre clairement que cet isolat viral est une nouvelle souche de circovirus porcin. Exemple 12 : Analyse comparative des séquences L'alignement des séquences nucléotidiques des 4 nouvelles souches PCV a été fait avec la séquence de la souche PCV PK/15 (figure 5). Une matrice d'homologie prenant en compte les quatre nouvelles souches et la souche antérieure PK/15 a été réalisée. Les résultats sont les suivants : 1 : Imp 1011-48121 2 : Imp 1011-48285 3 : Imp 999 4 : Imp 1010 5 : PK/15 1 2 3 4 5 1 1,0000 0,9977 0,9615 0,9621 0,7600 2 1,0000 0,9621 0,9632 0,7594 3 1,0000 0,9949 0,7560 4 1,0000 0,7566 5 ~~~~ 1,0000 L'homologie entre les deux souches françaises Imp 1011-48121 et Imp 1011-48285 est supérieure à 99 % (0,9977). L'homologie entre les deux souches nord-américaines Imp 999 et Imp 1010 est aussi supérieure à 99 % (0,9949). L'homologie entre souches françaises et souches nord-américaines est un peu supérieure à 96 %. L'homologie de toutes ces souches avec PK/15 tombe à une valeur comprise entre 75 et 76 %. On en déduit que les souches selon l'invention sont représentatives d'un nouveau type de circovirus porcin, distinct du type représenté par la souche PK/1 5. Ce nouveau type, isolé de porcs présentant le syndrome PMWS, est dénommé circovirus porcin de type II, la PK/15 représentant le type I. Les souches appartenant à ce type Il présentent une remarquable homogénéité de séquence nucléotidique, alors même qu'elles ont été isolées dans des régions géographiques très éloignées. Exemple 13 : Analyse des protéines codées par le génome des nouvelles souches PCV. La séquence nucléotidique de l'isolat Imp. 1010 a été considérée comme représentative des autres souches de circovirus associées au syndrome de dépérissement généralisé. Cette séquence a été analysée plus en détail à l'aide de l'algorithme BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990.215. 403-410) et d'une combinaison de programmes de l'ensemble de logiciels MacVector 6. 0 (Oxford Molecular Group, Oxford OX4 4GA, UK). Il a été possible de détecter 13 cadres ouverts de lecture (ou COLs) d'une taille supérieure à 20 acides aminés sur cette séquence (génome circulaire). Ces 13 COLs sont les suivants : Nom Début Fin Brin Taille du COL Taille protéine (nucléotides (nt)) (acides aminés (aa)) COL1 103 210 sens 108 nt 35 aa COL2 1180 1317 sens 138 nt 45 aa COL3 1363 1524 sens 162 nt 53 aa COL4 398 1342 sens 945 nt 314 aa COL5 900 1079 sens 180 nt 59 aa COL6 1254 1334 sens 81 nt 26 aa COL7 1018 704 antisens 315 nt 104 aa COL8 439 311 antisens 129 nt 42 aa COL9 190 101 antisens 90 nt 29 aa COL10 912 733 antisens 180 nt 59 aa COL11 645 565 antisens 81 nt 26 aa COL12 1100 1035 antisens 66 nt 21 aa COL13 314 1381 antisens 702 nt 213 aa Les positions de début et de fin de chaque COL se réfèrent à la séquence présentée sur la figure N 4 (SEQ ID N 4), du génome de la souche 1010. Les limites des COLs 1 à 13 sont identiques pour la souche 999. Elles le sont aussi pour les souches 1011-48121 et 1011-48285, sauf pour les COLs 3 et 13 : COL3 1432-1539, sens, 108 nt, 35aa COL1 3 314-1377, antisens, 705 nt, 234 aa. Parmi ces 13 COLs, 4 présentent une homologie significative avec des COLs analogues situés sur le génome du virus cloné PCV PK-15. Chacun des cadres ouverts de lecture présents sur le génome de tous les isolats de circovirus associés au syndrome de dépérissement généralisé a été analysé. Ces 4 COLs sont les suivants : Nom Début Fin Brin Taille du Taille protéine Masse COL (nt) (acides aminés) moléculaire COL4 398 1342 sens 945 nt 314 aa 37,7 kDa COL7 1018 704 antisens 315 nt 104 aa 11,8 kDa COL10 912 733 antisens 180 nt 59 aa 6,5 kDa COL13 314 1381 antisens 702 nt 233 aa 27,8 kDa Les positions de début et de fin de chaque COL se réfèrent à la séquence présentée sur la figure N 4 (SEQ ID N 4). La taille du COL (en nucléotides = nt) inclut le codon stop. La comparaison entre l'organisation génomique des isolats PCV Imp. 1010 et PCV PK-15 a permis l'identification de 4 COLs conservés dans le génome des deux virus. Le tableau ci-dessous présente les degrés d'homologie observés : COL Imp. 1010/COL PCV PK-15 Pourcentage d'homologie COL4/COL1 86 % COL13/COL2 66,4% COL7/COL3 61,5 % (au niveau du recouvrement (104 aa) COL10/COL4 83 % (au niveau du recouvrement (59 aa) La plus grande identité de séquence a été observée entre le COL4 Imp. 1010 et le COL1 PK-15 (86% d'homologie). Ceci était attendu dans la mesure où cette protéine est probablement impliquée dans la réplication de l'ADN viral et est essentielle pour la réplication virale (Meehan et al. J. Gen. Virol.1997. 78. 221- 227 ; Mankertz et al. J. Gen. Virol. 1998.79. 381-384). L'identité de séquence entre le COL13 Imp. 1010 et le COL2 PK-15 est moins forte (66,4% d'homologie), mais chacun de ces deux COLs présente bien une région basique N-terminale très conservée, qui est identique à la région Nterminale de la protéine structurale majeure du circovirus aviaire CAV (Meehan et al. Arch. Virol. 1992.124. 301-319). De plus grandes différences sont observées entre COL7 Imp. 1010 et COL3 PK-15 et entre COL10 Imp. 1010 et COL4 PK-1 5. Dans chaque cas, il existe une délétion de la région C-terminale des COL7 et COL10 de l'isolat Imp. 1010 lorsqu'on les compare aux COL3 et COL4 de PCV PK-15. La plus haute homologie de séquence est observée au niveau des régions N-terminales de COL7/COL3 (61,5% d'homologie au niveau du recouvrement) et de COL10/COL4 (83% d'homologie au niveau du recouvrement). Il apparaît que l'organisation génomique du circovirus porcin est assez complexe suite à l'extrême compacité de son génome. La protéine structurale majeure est probablement issue d'un épissage entre plusieurs cadres de lecture situés sur le même brin du génome du circovirus porcin. On peut donc considérer que tout cadre ouvert de lecture (COL1 à COL13) tel que décrit dans le tableau cidessus, peut représenter tout ou partie d'une protéine antigénique codée par le circovirus porcin de type Il et est donc potentiellement un antigène utilisable pour le diagnostic spécifique et/ou pour la vaccination. L'invention concerne donc toute protéine comprenant au moins un de ces COLs. De préférence, l'invention concerne une protéine formée essentiellement par les COL4, COL7, COL10 ou COL13. Exemple 14 : Caractère infectieux du génome PCV cloné à partir des nouvelles souches. Le plasmide pGEM-7/8 contenant le génome complet (forme réplicative) de l'isolat Imp.999 a été transfecté dans des cellules PK/15 selon la technique décrite par Meehan B. et al. (Characterization of viral DANS from cells infected with chicken anemia agent : séquence analysis of the cloned replicative form and transfection capabilities of cloned genome fragments. Arch. Virol. 1992.124. 301- 319). L'analyse par immunofluorescence (voir exemple 4) réalisée sur le premier passage après transfection sur cellules PK/15 non contaminées a montré que le plasmide du clone pGEM7/8 était capable d'induire la production de virus PCV infectieux. La disponibilité d'un clone contenant un matériel génétique PCV infectieux permet toute manipulation utile sur le génome viral afin de produire des virus PCV modifiés (soit atténués chez le porc, soit défectifs) utilisables pour la production de vaccins atténués ou recombinés, ou pour la production d'antigènes pour des trousses de diagnostic. Exemple 15 : Production des antigènes PCV par culture in vitro La culture des cellules PK/15 non contaminées et la multiplication virale sont réalisées selon les mêmes modalités qu'à l'exemple 1. Les cellules infectées sont récoltées après trypsination après 4 jours d'incubation à 37 C et numérées. Le passage suivant est inoculé avec 400 000 cellules infectées par ml. Exemple 16 : Inactivation des antigènes viraux En fin de culture virale, les cellules infectées sont récoltées et lysées par ultrasons (Branson Sonifier) ou à l'aide d'un broyeur colloïdal de type rotor-stator (UltraTurrax, IKA). La suspension est ensuite centrifugée à 3700 g pendant 30 minutes. La suspension virale est inactivée par 0,1% d'éthylène imine pendant 18 heures à +37 C ou par 0, 5 % de bêta-propiolactone pendant 24 heures à + 28 C. Si le titre du virus avant inactivation est insuffisant, la suspension virale est concentrée par ultrafiltration en utilisant une membrane avec un seuil de coupure de 300 kDa (Millipore PTMK300). La suspension virale inactivée est conservée à +5 C. Exemple 17 : Préparation du vaccin sous forme d'émulsion à base d'huile minérale. Le vaccin est préparé selon la formule suivante : - suspension de circovirus porcin inactivé : 250 ml - Montanide# ISA 70 (SEPPIC): 750 ml La phase aqueuse et la phase huileuse sont stérilisées séparément par filtration. L'émulsion est préparée par mélange et homogénéisation des ingrédients à l'aide d'un émulseur à turbine Silverson. Une dose de vaccin contient environ 107,5 DICT50. Le volume d'une dose de vaccin est de 0,5 ml pour administration par voie intradermique, et de 2 ml pour administration par voie intramusculaire. Ce vaccin est utilisé dans un programme de vaccination contre le syndrome de dépérissement en association avec le vaccin Parvovax. Exemple 18 : Préparation du vaccin sous forme d'émulsion à base d'huile métabolisable. Le vaccin est préparé selon la formule suivante : - suspension de circovirus porcin inactivé : 200 ml - Dehymuls HRE 7 (Henkel) : 60 ml - Radia 7204 (Oleofina) : 740 ml La phase aqueuse et la phase huileuse sont stérilisées séparément par filtration. L'émulsion est préparée par mélange et homogénéisation des ingrédients à l'aide d'un émulseur à turbine Silverson. Une dose de vaccin contient environ 107,5 DICT50. Le volume d'une dose de vaccin est de 2 ml pour administration par voie intramusculaire. Ce vaccin est utilisé dans un programme de vaccination contre le syndrome de dépérissement en association avec le vaccin Parvovax#. Exemple 19 : Résultats d'immunofluorescence indirecte vis-à-vis des souches de virus PCV US et française et du contaminant PK/15 avec un sérum hyperimmun (PCV-T), un panel d'anticorps monoclonaux F99, préparés à partir de PK/15 et un sérum hyperimmun préparé à partir de la souche canadienne (PCV-C) ~~~~~~~~~~~ VIRUS PK/15 USA France PCV-T antiserum # 6 400 200 800 PCV-C antiserum 200 # 6,400 # 6,400 F99 1 H4 # 10 000 100 100 F99 4B10 # 10 000 100 F99 2B7 10000 100 F99 2E12 # 10 000 100 F99 1 C9 # 10 000 100 100 F99 2E1 # 10 000 100 100 F99 1 H4 # 10 000 100 * inverse de la dernière dilution du sérum ou de l'anticorps monoclonal qui donne une réaction positive en immunofluorescence indirecte. Exemple 20 : Reproduction expérimentale du syndrome de dépérissement Protocole 1 Des porcelets gnotobiotiques de 3 jours obtenus par césarienne et maintenus en isolateur ont été inoculés avec des solutions virales de PCV. Les virus PCV de type Il utilisés ont été l'isolat Imp 1010 et le virus obtenu à partir d'homogénéisats de ganglions lymphatiques provenant de porcs malades. 5 groupes ont été constitués. Les porcelets ont tous été inoculés à l'âge de trois jours par voie oronasale avec 1,5 ml de solution virale selon le schéma suivant: Groupe Nombre Virus Dose A 6 Homogénéisât de ganglions lymphatiques ND B 5 Imp. 1010 (bas passage) 102 TCID50 C 4 Imp. 1010 (haut passage) 102 TCID50 D 2 Lysat de cellules PK 15 indemnes de virus PCV E ~~~ 3 Résultats de l'épreuve expérimentale : Pendant la période d'observation de 5 semaines, les porcelets n'ont pas développé de signes cliniques, sauf un animal du groupe B qui a présenté un fort abattement. A l'autopsie, les porcs des groupes A, B, C présentent une hyperplasie des ganglions lymphatiques (taille 2 à 10 fois supérieure à celle des animaux des groupes D et E), en particulier des ganglions sous-maxillaires, bronchiques, mésentériques, iliaques et fémoraux. Cette hyperplasie est liée à une forte expansion des zones corticales par infiltration par des monocytes et des macrophages. Les porcelets des groupes A, B, C présentent également une hyperplasie du tissu lymphoïde bronchique. Un porcelet de chacun des groupes A, B, C présente une pneumonie. Le porcelet du groupe B, présentant un fort abattement, et un porcelet du groupe A présentent un ulcère gastrique. Par ailleurs, tous les animaux des groupes A, B, C présentent une myosite au niveau de la tunique musculaire de l'estomac et de l'intestin. La plupart des animaux des groupes A, B, C présentent une myocardite, une hépatite multifocale avec infiltration de lymphocytes, de macrophages et d'éosinophiles, ainsi qu'une néphrite interstitielle corticale et médullaire. Un porcelet du groupe C a un foie de taille supérieure à la normale avec à sa surface des foyers clairs disséminés. Aucune lésion n'a été observée chez les porcelets des groupes D et E. Du circovirus a été isolé des organes des porcs des groupes A, B et C. Exemple 21 : Reproduction expérimentale du syndrome de dépérissement Protocoles 2 et 3 Des porcelets conventionnels, mais isolés de leur mère dès la naissance, ont été inoculés avec des solutions virales de PCV type Il, de parvovirus porcin, ou avec un mélange des deux virus. Les virus PCV type Il utilisés ont été les isolats Imp. 1010 et Imp. 1011(souche 48121). Le virus PPV utilisé est un isolat d'origine canadienne Imp. 1005. Ce virus présente une séquence (1/3 du génome séquence) identique à celle d'autres souches de parvovirus porcin connues (PPV souche NADL-2 et souche Kresse). Deux protocoles expérimentaux ont été réalisés. Protocole 2 3 groupes ont été constitués avec des porcelets âgés de 3 jours. Les porcelets ont tous été inoculés par voie oronasale avec 1 ml de solution virale selon le schéma suivant : Groupe Nombre Virus Dose A 5 lmp.1010 107 TCID50 B 5 Imp. 1010 + Imp.1005 5x106 TCID50 C (témoin) 2 --- ---i Résultats de l'épreuve expérimentale : Groupe A : 2porcelets sont morts 21 jours après l'inoculation et un porcelet a été euthanasie 24 jours après l'inoculation. Groupe B : 1porcelet est mort 23 jours après l'inoculation et un porcelet a été euthanasie 24 jours après l'inoculation. Les autopsies réalisées sur les porcelets morts après infection ont montré la présence de lésions macroscopiques importantes : présence de liquide dans la cavité pleurale, oedème des poumons, hémorragies au niveau des reins, lésions blanchâtres en tête d'épingle sur les reins, nécrose hépatique. Ces lésions sont identiques à celles observées chez les cas du terrain. Les autopsies réalisées sur les porcelets sacrifiés n'ont pas révélé de lésions macroscopiques. Les examens histologiques pratiqués sur les organes prélevés sur les porcelets des groupes A et B morts après infection, ainsi que chez les porcs sacrifiés de ces 2 groupes, ont montré un tableau typique et complet des lésions de cas de dépérissement du porcelet observées chez les animaux du terrain : nécrose hépatique, nécrose des ganglions lymphatiques, nécrose pancréatique, nécrose en foyer et hémorragies sévères au niveau des reins, présence de syncytia dans les poumons, nécrose sévère des hépatocytes avec présence d'inclusions nucléaires. Il est à noter qu'une quantité massive d'antigène PCV a été retrouvée au niveau de toutes ces lésions (porcs morts ou sacrifiés), mais que la présence d'antigène PPV n'a pas pu être mise en évidence dans ces mêmes lésions. Aucune lésion n'a pu être mise en évidence chez les porcelets témoins du groupe C. Protocole 3 4 groupes ont été constitués avec des porcelets âgés de 4 semaines. Les porcs ont tous été inoculés par voie oronasale avec 1 ml de solution virale selon le schéma suivant : Groupe Nombre Virus Dose A (témoin) 2 B 4 Imp.1005 (PPV) 105,3 TCID50 C 4 Imp. 1011 (PCV) 105 TCID50 D 4 Imp1005 + Imp. 1011 105+ 5x104 TCID50 Résultats de l'épreuve expérimentale : 1 porcelet "témoin" et 2 porcelets de chaque groupe expérimental (B, C et D) ont été euthanasiés et autopsiés 2 semaines après inoculation. Des lésions immunohistologiques significatives ont été observées chez les deux porcelets du groupe D (co-infection PCV + PPV). Il est à noter qu'il n'a pas été possible de retrouver la présence de parvovirus porcin dans ces lésions, bien qu'une séroconversion vis-àvis du parvovirus porcin ait été observée chez tous les porcs du groupe D. Aucune lésion macroscopique ou histologique n'a pu être observée chez le porcelet témoin et chez les porcelets des autres groupes. Il apparaît donc que l'association PCV + PPV permet de reproduire les lésions histologiques typiques du syndrome de dépérissement du porcelet. Suite à ces deux protocoles expérimentaux, on constate que l'inoculation de PCV seul comme du mélange PCV + PPV conduit à une reproduction plus ou moins sévère du syndrome de dépérissement du porcelet, mais seul le circovirus porcin peut être détecté au niveau des lésions. Par contre une infection expérimentale avec le PPV seul (groupe B du protocole 3) ne permet pas d'induire des lésions macroscopiques ou histologiques ; toutefois, en présence de PCV, on constate l'apparition de lésions chez des porcs âgés de 4 semaines (groupe D du protocole 3). REVENDICATIONS 1. Préparation antigénique dirigée contre le syndrome PMWS, comprenant au moins un antigène de circovirus porcin et au moins un antigène de parvovirus porcin. 2. Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène de circovirus porcin de type II. 3. Préparation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'antigène de circovirus porcin et l'antigène de parvovirus porcin comprennent, indépendamment l'un de l'autre, un antigène choisi dans le groupe consistant en antigène entier vivant atténué, antigène entier inactivé, antigène de sous-unité, vecteur vivant recombinant, vecteur ADN. 4. Vaccin contre le syndrome PMWS, comprenant une quantité efficace d'une préparation antigénique selon l'une des revendications 1 à 3, dans un véhicule ou excipient acceptable sur le plan vétérinaire, et éventuellement un adjuvant acceptable sur le plan vétérinaire. 5. Kit de vaccination contenant, conditionnés séparément, un vaccin contre le circovirus porcin, de préférence de type Il, et un vaccin contre le parvovirus porcin.