Brevet FR2782168A1 — publié le 20000211

NOUVELLES APPLICATIONS DES SARCOLECTINES ET DE LEURS DERIVES EN DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE L'invention a pour objet de nouvelles applications en diagnostic et thérapeutique des sarcolectines et de leurs dérivés oligopeptidiques. On sait que le terme "sarcolectine", SCL en abrégé, a été utilisé pour désigner les lectines identifiées dans les sarcomes ostéogéniques humains ou ceux induits chez le hamster (après inoculation du virus du sarcome de Moloney), o elles sont présentes selon des teneurs élevées. Les sarcolectines se trouvent également dans une grande variété de tissus normaux ou tumoraux chez les Vertébrés (primates, rongeurs, gallinacés). Elles peuvent aussi être détectées à la surface des cellules normales ou transformées d'origine humaine ou animale. Les fonctions biologiques de préparations purifiées de SCL revêtent une grande importance. Notamment, il a été démontré que les SCL - favorisent l'agglutination des cellules normales ou malignes, en raison de leur affinité pour les sucres liés à la membrane cellulaire, - inhibent la synthèse des protéines secondaires responsables de toutes les fonctions biologiques IFN- dépendantes qui conduisent à l'état anti-viral ou anti- prolifératif (il s'ensuit que l'état de sensibilité initial au virus est restauré dans les cellules qui peuvent être alors stimulées pour se répliquer. De plus dans les cellules traitées par SCL, on observe une diminution ou une suppression du caractère réfractaire à une deuxième induction par IFN), - stimulent l'ADN cellulaire dans toutes les cellules immuno-compétentes, ainsi que dans les cellules épithéliales et dans les fibroblastes. Dans la demande PCT/FR 96/01937, on a décrit notamment un clone d'ADNc codant pour une sarcolectine de kD constituant un agent thérapeutique de grand intérêt, notamment en tant que facteur de croissance cellulaire et agent de stimulation du système immunitaire. La séquence de cet ADNc et celle de la protéine déduite (SEQ ID N 1) sont données sur le document Liste de séquences en fin de description. Cette demande PCT rapporte également des oligopeptides correspondant à des régions de la sarcolectine de 55 kD, en particulier à la région 5', comme les fragments peptidiques 41-55 (SEQ ID N 2) ou encore 81 à 95 (SEQ ID N 3) dans la séquence de cette sarcolectine. Les anticorps dirigés contre les sarcolectines, et notamment contre la sarcolectine de 55 kD, et contre des oligopeptides correspondant à des régions de cette sarcolectine, constituent des agents de diagnostic permettant de déterminer qualitativement et quantitativement la présence de SCL dans un extrait biologique prélevé chez un patient et de la relier à une pathologie. En poursuivant leurs travaux sur les SCL, les inventeurs ont à présent mis en évidence l'excrétion à des taux élevés, par rapport à des témoins, de SCL dans le cas de pathologies infectieuses ou, de manière générale, de processus inflammatoires et ce, à tous les stades du développement de l'infection, et à des niveaux différents selon ce stade. Ces résultats ont permis de développer une méthode de diagnostic de ces pathologies et d'appréhender le mécanisme d'action des SCL, permettant ainsi de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement d'une infection ou de tout processus inflammatoire auquel la SCL participe. L'invention a donc pour but de fournir une méthode de diagnostic de pathologies inflammatoires et notamment de pathologies infectieuses comme le SIDA, de mise en oeuvre aisée et d'interprétation simple. Elle vise également à fournir un kit de diagnostic permettant de réaliser une telle méthode. Elle a également pour but de fournir des outils thérapeutiques particulièrement appropriés pour le traitement d'une pathologie infectieuse et plus généralement inflammatoire. La méthode de diagnostic in vitro d'une infection par VIH ou d'une pathologie inflammatoire est caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact d'un prélèvement biologique à analyser, avec une préparation d'anticorps anti-SCL, ou anti-oligopeptide de SCL, ou d'un fragment de tels anticorps, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec les SCL du prélèvement, - la mise en évidence de la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps, et - la comparaison des résultats obtenus avec un échantillon témoin d'un patient séronégatif. Comme le montrent les résultats donnés dans les exemples, cette méthode permet d'observer une augmentation importante des taux de SCL chez les patients durant toutes les phases qui suivent l'infection par VIH. En particulier les titres en SCL sont significativement élevés durant la séroconversion par rapport à ceux de témoins séronégatifs. Durant les stades précoces du SIDA, les titres en SCL augmentent avec la progression de l'immunodéficience chez le patient. De même les inventeurs ont mis en évidence une augmentation sérique de la SCL dans des pathologies inflammatoires telles que l'ostéite aiguë, le lupus, l'arthrite rhumatoide, ou la sclérose en plaque o les SCL ont été également détectées à taux élevé dans le liquide céphalo-rachidien. Comme prélèvement, on utilise un échantillon biologique tel que le sang ou le sérum, ou des cellules par exemple d'une biopsie. L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions, notamment de durée, température, tampon, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps. La préparation d'anticorps est élaborée à partir d'anticorps anti-SCL monospécifiques. Comme anticorps anti-SCL monospécifiques, on aura recours, tout spécialement, à ceux formés contre une SCL purifiée, et particulièrement contre la SCL de 55 kD décrite dans la demande PCT mentionnée ci-dessus correspondant à SEQ ID N 1. De préférence, en raison de leur très forte spécificité, il est préconisé d'utiliser des anticorps dirigés contre des oligopeptides de SCL. Par "oligopeptides", on couvre selon l'invention, les produits naturels ou artificiels, à savoir des chaînes polypeptidiques courtes correspondant à une région telle que présente dans une sarcolectine et obtenue le cas échéant par voie de synthèse. Mais, on désigne également les oligopeptides altérés, par exemple par une modification chimique, mutation, suppression ou autre, dès lors qu'un tel produit altéré donne lieu à une réaction de reconnaissance spécifique avec un anticorps anti-oligopeptide naturel en opérant comme décrit dans les exemples. Des anticorps préférés sont dirigés contre des oligopeptides correspond à l'extrémité C-terminale de la SCL de 55 kD. Un anticorps particulièrement préféré pour la mise en oeuvre de la méthode de l'invention est constitué par un anticorps anti-oligopeptide 455-469 (SEQ ID N 4). D'autres anticorps monospécifiques permettant de détecter des titres anormalement élevés de SCL sont situés dans la région N-terminale de la SCL de 55 kD. De tels anticorps comprennent par exemple un anticorps anti- oligopeptide 41-55 (SEQ ID N 2). Dans une variante de mise en oeuvre de l'invention, on utilise des fragments des anticorps anti-SCL ou anti- oligopeptide de SCL, comme les fragments Fv, Fab, F(ab')2. Pour la révélation, on utilise des marqueurs, par exemple des marqueurs fluorescents, enzymatiques, radioactifs ou luminescents. L'invention fournit également des kits ou trousses pour la réalisation des tests de diagnostic définis ci- dessus. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils renferment - au moins un anticorps monospécifique anti-SCL ou anti-oligopeptide de SCL, ou leurs fragments comme défini ci-dessus, - les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la révélation de la réaction immunologique visée, ainsi qu'une notice d'utilisation. Les tests ELISA réalisés sur des sérums de patients avec différents anticorps anti-SCL montrent une élévation du taux de SCL chez les patients infectés ou présentant plus généralement un état inflammatoire. La révélation de cette protéine et sa quantification permettent donc d'établir un diagnostic avec une grande sensibilité et spécificité, tout particulièrement lorsqu'on utilise, comme anticorps anti- SCL, des anticorps dirigés contre des oligopeptides correspondant à la partie terminale de la SCL de 55 kD. En ce qui concerne l'infection par VIH, on note un taux élevé de SCL sérique durant toutes les phases après l'infection par VIH. Lorsqu'on compare les différentes phases de l'infection, on observe avec intérêt que durant la séroconversion, les titres en SCL sont élevés. Durant les phases précoces du SIDA, les titres en SCL augmentent avec la progression de l'immunodéficience chez le patient. Ces variations en SCL, selon les phases de l'infection, s'interprètent par des mécanismes d'interactions des SCL/IL- 2/IFNs mis en évidence par les inventeurs en se basant sur leurs travaux précédents concernant la signification physiologique des SCL et sur les connaissances apportées par la purification et le clonage des SCL. Prenant en compte la stimulation de la synthèse de l'ADN par les SCL et la régulation de cet effet, par inhibition, par les interférons, les inventeurs considèrent que les cellules T immunocompétentes sont gouvernées par une intervention séquentielle de SCL, IL-2, IFNy et IFNc. Comme décrit dans les exemples, les analyses par Western blots montrent que toutes ces protéines sont bien présentes dans des cultures sans sérum de PBMC. La concentration élevée en SCL dans la phase précoce de la séroconversion s'explique alors par les mécanismes suivants: - il apparaît que SCL stimule la synthèse de l'ADN cellulaire dans toutes les cellules immunocompétentes, en particulier les cellules T, ce qui induit une prolifération de cellules T pour compenser les pertes induites par VIH, et, simultanément, conduit à une activation de la synthèse des récepteurs IL-2 - en réponse à la stimulation de la synthèse de l'ADN, les IFNs sont synthétisés pour un mécanisme de rétro-inhibition, ce qui arrête la propagation de l'infection et favorise la différenciation des cellules T, SCL et IL-2 compensant ainsi les pertes. Avec la progression de la maladie et la destruction croissante de cellules T, la synthèse de SCL augmente et le déséquilibre entre SCL et les interférons de type I se trouve aggravée. Ce développement déjà sévère est de plus compliqué, non seulement parce que ces IFN sont incapables de promouvoir des réponses cellulaires, mais également parce que l'excès de SCL peut induire une perte du caractère réfractaire physiologique à une induction répétée d'IFN dans les mêmes cellules. L'excès de ces IFNs non utilisés, qui peut s'accumuler dans le sérum peut alors endommager certaines cellules. On mesure l'importance de la connaissance de ce mécanisme qui permet d'élaborer des moyens d'action de grande efficacité pour contrôler l'ensemble des situations, ajustées selon les résultats de tests réalisés, o les SCL jouent un rôle pivot dans la régulation de l'expansion clonale de cellules T en association avec IL-2, IFNa et IFNy. L'invention vise donc également l'utilisation de SCL pour l'élaboration de médicaments capables d'induire la synthèse in vitro et in vivo de récepteurs de IL-2 et de contribuer de manière active à la prolifération de cellules T. Elle vise en outre l'utilisation de SCL pour l'élaboration de médicaments immunostimulants capables Il d'induire in vitro et in vivo la production d'IFNx, IFNP et d'IFNy. L'invention vise l'utilisation des SCL pour l'élaboration de médicaments capables d'induire des IFNs dans les PBMC et dans les cellules somatiques en général. Conformément à l'invention, il est prévu des kits de traitement des infections et des états inflammatoires en général comprenant des médicaments à administration séquentielle constitués à titre de principes actifs par des quantités efficaces du point de vue thérapeutique, respectivement d'une part, d'au moins une SCL, d'autre part d'un ou plusieurs types d'interférons (IFNx, IFNP, IFNy), ces kits renfermant des notices d'utilisation des médicaments. De manière appropriée, on administre dans le cadre d'un traitement thérapeutique, les médicaments à base de SCL comme principe actif, à des doses efficaces pour induire in vivo les IFNs et, après induction unique, on administre les préparations d'IFNs associées à des amino- acides butyriques, pendant 3 à 4 semaines, puis, après arrêt de quelques jours, on procède à une nouvelle induction à l'aide des SCL, le cycle pouvant être alors répété à plusieurs reprises. Comme amino-acides butyriques, on citera l'acide a- amino butyrique, l'acide x-amino isobutyrique et l'acide gamma-amino butyrique (GABA). Les kits définis ci-dessus et le traitement décrit sont applicables également à des pathologies tumorales. L'invention concerne également l'utilisation des oligopeptides définis ci-dessus, en particulier ceux correspondant à la région N-terminale de la SCL de 55 kD, et notamment l'oligopeptide 41-55, pour l'élaboration de médicament à effet anti- inflammatoire, pour inhiber l'action de SCL par compétition sur des récepteurs membranaires et amplifier les effets anti-SCL des IFNs ou des acides a-amino butyriques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, en se référant aux figures 1 à 11 qui représentent, respectivement, - la figure 1, un histogramme montrant les titres en SCL de sérums d'un groupe de patients séronégatifs et de 3 groupes de patients infectés se trouvant respectivement à des stades différents de la maladie, - la figure 2, les réponses immunes en ELISA chez des patients séropositifs, en utilisant des anticorps anti-oligopeptides de SCL, dirigés contre 3 différentes régions du polypeptide comme indiqué, - la figure 3, les réponses immunes en ELISA de 12 sérums de malades des groupes CDC III ou IV et de 12 sérums témoins, - la figure 4, la photo d'un Western blot de 6 sérums de malades à des stades avancés comparés à des témoins, - la figure 5, la prolifération des cellules T dans un milieu conditionné sans sérum après 36h à 37 C, - la figure 6, l'histogramme montrant la stimulation de la synthèse d'ADN dans des milieux conditionnés sans sérum, et l'inhibition spécifique de cet effet par l'oligopeptide 41-55, par compétition pour les récepteurs membranaires, - la figure 7, les histogrammes montrant l'effet de milieux conditionnés sans sérum sur la prolifération de cellules H9 et l'inhibition de cet effet par le NANA inhibiteur spécifique des SCL, - la figure 8, les effets d'un milieu conditionné sans sérum sur la synthèse d'ADN de cellules H9 traitées par des anticorps anti-IFNx ou anti-IFN , comparée à des témoins constitués par le milieu conditionné seul ou additionné d'IgG. - la figure 9, un schéma illustrant le mécanisme de la prolifération des cellules T, impliquant SCL, IL-2 et IFNs, - les figures 10A à 10C, les photos des Westerns blots illustrant les données présentées dans le tableau 1, et - la figure 11, l'étude du taux de survie de souris avec un sarcome en présence d'immunostimulants et d'inhibiteurs de SCL. Méthodes générales: Essai ELISA On utilise la technique habituelle. La liaison des antigènes est obtenue en incubant les plaques à 92 puits, pendant environ 14 heures, à 4 C ou à température ambiante. Le matériau non lié est éliminé et les plaques sont lavées avec du Tween 2% et à 3 reprises avec de l'eau sans TweenR. Pour éliminer les liaisons non spécifiques, on utilise de l'albumine de sérum bovin à raison de 2 à 5% dans PBS. A titre de témoins, on met en oeuvre 3 préparations: i) un témoin négatif, à la plus forte concentration en antigène, ne renfermant pas d'anticorps anti-55 kD ou d'anticorps de lapin anti- oligopeptide, ou on remplace ces derniers par du sérum de lapin normal; ii) un témoin positif: 2 dilutions en série d'albumine de sérum bovin utilisé comme antigène de référence pour exclure une liaison non spécifique due à SCL, On utilise un anticorps de lapin marqué à la peroxydase commercialisé par Amersham et comme chromogène l'o- phénylènediamine X 490 (Abbot). Western Blot Pour la détection des SCL dans les échantillons, on a recours à des SDS-PAGE on opérant selon les techniques classiques. Le gel est coloré par du bleu de Coomassie. Les marqueurs de taille moléculaire (Amersham) sont de 97400 à 14400. Le gel est transféré sur une membrane de nitrocellulose, puis incubé pendant environ 14 heures avec des anticorps hautement spécifiques dirigés contre la protéine de 55 kD ou des anticorps monoclonaux du commerce. Pour effectuer l'immunodétection, des IgG anti- lapins purifiées marquées à la peroxydase sont diluées à 1/4000 dans un tampon PBS renfermant 1% de lait écrémé et mises à incuber à température ambiante pendant environ 90 minutes. On utilise ECL pour le marquage chimioluminescent. La membrane est ensuite lavée 6 fois avec du PBS et séchée avant visualisation en utilisant le protocole d'empreintes Western ECL Amersham. Exemple 1: Etude d'une population - Collecte des sérums Les sérums de la population étudiée ont été recueillis en 1994-1995 et testés en ELISA en utilisant des anticorps anti-SCL mono-spécifiques. On dispose de: 1) de 60 témoins VIH-séronégatifs (patients du même hôpital et de groupes d'âges comparables) 2) de patients infectés par VIH à différents stades de la maladie (définition établie par le "Communicable Disease Centre", CDC Atlanta, G.A.) classés comme suit selon la progression de la maladie: - 13 patients séroconvertis de classe CDC II, - 15 patients de classe CDC III avec une lympho- adénopathie généralisée, avec ou sans symptômes communs, non traités à 1'AZT, - 16 patients traités à l'AZT correspondant à des cas plus avancés, la plupart de classe CDC III Z ou CDC IV, avec des infections opportunistes ou des tumeurs secondaires. Pour chaque groupe étudié, le titre en SCL a été calculé (valeur moyenne et déviation standard). L'interprétation des résultats se fonde sur une analyse statistique en utilisant le coefficient de corrélation et le test Student. - Etude de la réactivité avec des anticorps mono- spécifiques dirigés contre des SCL purifiées 10. obtention des SCL purifiées et d'anticorps dirigés contre ces SCL On purifie des SCL de placenta humain proche du terme, lyophilisé, selon les méthodes standards, et on effectue des contrôles par SDS-PAGE Le gel est coloré avec du nitrate d'argent, ce qui permet de suivre les différentes étapes de la purification réalisée, en opérant comme décrit dans ladite demande PCT, avec la succession d'étapes de chromatographie sur 1) Séphacryl S200; 2) DEAE-cellulose; 3) CM- trisacryl et récupération du produit du pic 14; 4) CM- trisacryl et récupération du produit du pic 2 (SCLs); ) chromatographie d'affinité NANA (acide N-acétyl neuranimique). La préparation est ensuite transférée sur nitrocellulose colorée avec du rouge Ponceau. Les bandes obtenues sont découpées, congelées dans de l'azote liquide, réduites en fine poudre et inoculées dans un ganglion lymphatique situé dans la zone poplitéale de lapin blanc de Nouvelle Zélande. Les anticorps sont ensuite récupérés selon les techniques habituelles. Résultats obtenus avec des anticorps dirigés contre les SCL purifiées On rapporte sur la figure 1, l'histogramme montrant les titres SCL dans les 4 groupes de sérums étudiés. La densité optique DO est mesurée à 490 nm. L'examen de la figure montre que: i) par rapport aux témoins, on détecte une augmentation très significative de l'antigène SCL dans tous les sérums des patients infectés par VIH. ii) les titres en SCL sériques varient selon le stade de l'infection. Dans tous les cas, on trouve une augmentation très importante de la teneur en SCL du sérum (p SCL (AZT(+)). La première série d'expériences a été complétée en sélectionnant des sérums plus spécifiques, dirigés contre les oligopeptides de SCL, correspondant à des domaines différents du gène clone. - Etude de la réactivité avec des anticorps anti- oligopeptides obtention d'oligopeptides de SCL et d'anticorps dirigés contre ces oligopeptides On prépare des oligopeptides à partir de l'extrémité N-amino 41-55, à partir de la portion de la région 81- 95 de l'hélice a et de l'extrémité carboxyle 455-469 du clone de 55 kD de SCL. Ces trois oligopeptides sont élaborés par voie de synthèse (assemblage par synthèse peptidique en phase solide, étape par étape, en utilisant la stratégie F moc- ter-butyle et comme résine de départ la résine F moc-Lys (Boc)-Wang PS réticulée avec 1% de DVB (0,5 meq par lot R4140). On forme des anticorps contre ces oligopeptides chez des lapins et on les purifie avant utilisation. ELISA Dans un test ELISA, on a tout d'abord étudié les réponses immunes de 7 patients avec des sérums VIH positifs, avec les 3 anticorps anti-oligopeptides. Les résultats sont présentés sur la figure 2. On constate que dans tous les cas l'anticorps dirigé contre l'oligopeptide terminal 455- 469 donne une réponse beaucoup plus intensive par rapport à l'anticorps anti- oligopeptide 41-55. Les anticorps de la partie terminale sont donc choisis pour la poursuite des expérimentations. Dans une autre série d'expérimentation, dont les résultats sont rapportés sur la figure 3, on a comparé 12 sérums pris au hasard choisis parmi des cas de SIDA progressant rapidement (rp) et considérés comme appartenant au groupe CDC III ou IV. Les 12 témoins sont VIH négatifs. Dans les sérums de SIDA 8/12 les sérums ont des unités DO de 1000 ou plus. Les résultats montrent, par rapport aux témoins VIH négatifs, une augmentation significative des teneurs en SCL dans les sérums des patients malades (coefficient de corrélation r = 0,85021613, correspondant à p Tous les anticorps anti-oligopeptides reconnaissent la molécule complète. Western Blot Les données quantitatives hautement spécifiques obtenues permettent de mettre en évidence le rôle de SCL dans le processus d'infection dépendant de VIH. Il est donc important d'identifier SCL dans les sérums en utilisant des Western blots pour évaluer la taille et la spécificité de la molécule SCL. Les résultats obtenus sur six cas de SIDA avancé sont rapportés sur la figure 4 o - la piste 1: correspond au sérum d'un adulte séronégatif de VIH (1:100); - la piste 2: à des milieux de PBMC provenant de culture conditionnée: le troisième passage contient 2% de sérum; on utilise le premier passage sans sérum en présence de IL2 (100 UI/ml). On observe la bande de sarcolectine de 55 kD, ainsi que celle de 65 kD considérée comme le résultat de la liaison non spécifique de SCL sur des molécules d'albumine résiduelle. Aucune autre bande n'est décelée sur le gel SDS correspondant. Ainsi, la seule protéine détectée dans le milieu sans sérum est bien SCL; - les pistes 3 et 4: à des échantillons de biopsie d'ostéosarcome, maintenus dans un milieu sans sérum; - les pistes 7 à 12: sérum 1/100 provenant de cas avancés de SIDA du Kinshasa. On note: i) dans tous les échantillons la bande de 55 kD très forte comparée à celle obtenue avec le sérum VIH négatif. La bande de 65 kD est pratiquement absente dans la piste 10 tandis que la bande de 55 kD est majoritaire. Ce cas a été considéré comme étant très sévère. ii) dans tous les cas de SIDA, la bande de 30 kD observée seulement dans les pistes correspondant à des cas sévères suggère une réactivité croisée avec un dimère de galactose liant une lectine (galectine). - Etude de SCL dans un milieu conditionné de PBMC PBMC On purifie des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC en abrégé pour Peripheral Blood Mononuclear Cells) par centrifugation de sang de donneurs sains, selon un gradient Ficoll de densité. Activation des PBMC Les PBMC sont mis en suspension, à raison de 2x106 cellules/ml, dans un milieu de culture RPMI complémenté avec 10% de sérum humain de groupe AB (SAB) et 5 gg/ml de PHA-P, et maintenu pendant 48 h à 37 C. Les cellules sont ensuite lavées à deux reprises. Préparation de milieu conditionné sans sérum On lave les PBMC ou les cellules de la lignée H9 à deux reprises et on les maintient pendant 5 jours dans 10% de SAB (passage la). La concentration cellulaire est de lx106 cellules/ml. Le milieu de culture est changé tous les 2 jours. Au sixième jour (passage 2a), les cellules sont lavées 2 fois et transférées dans un milieu de culture HL-l de lymphocytes, complémenté avec 1% de SAB. Pour le passage 3a, on procède au lavage de 4x106.cellules/ml 2 fois, et on maintient les cellules dans le milieu de culture HL-l sans sérum, pendant 6 jours. Les cellules sont comptées tous les 2 jours. Au passage 4a, les cellules sont maintenues pendant 9 jours. Au dernier passage (5a), on ajoute du milieu sans sérum et on ajuste la concentration cellulaire à 9x106 cellules/ml. Tous les lavages cellulaires sont effectués dans le RPMI et toutes les cultures de PBMC, après l'activation par PHA initiale, sont cultivées en l'absence de tout autre protéine exogène, à l'exception de 100 UI/ml de IL-2 recombinante, qui est maintenue dans le milieu. Le milieu conditionné pour les 4 passages est congelé à -20 C, ou bien immédiatement utilisé dans un essai. Les concentrations/ml en cellules T et en protéines sont indiquées pour chaque passage. On contrôle également la présence de SCL par agglutination de cellules Bouan 14B traitées par du l0 formol, par ELISA, ou par Western blot. TABLEAU 1 Passage n 2a 3a 4a 5a conc. en sérum 0,01 0 0 0 NO cellules T/ml 106 4x106 9x106 5x106 Protéine gg/ml Bradford 375 375 500 500 ELISA cpm X490 N.D. 1000 1024 640 Agrégation des cellules 128 64 32 N.D. Bouanl4 B Protéinase K N.D. N.D. N.D.: non déterminé Dans les passages 2a, 3a et 4a, on observe dans les cellules une agglutination des cellules Bouan 14 B, avec une légère diminution entre chaque passage. On notera que de belles agglutinations sont également fréquemment observées dans les nouvelles cultures de cellules T venant de proliférer, même en l'absence de sérum. La fonction d'agglutination cellulaire, due à SCL, disparaît lorsque le milieu, au passage 4a, est digéré par la protéinase K. Enfin, la présence de titres comparables de SCL dans le milieu, dans tous les passages sans sérum 3a, 4a et 5a, démontre clairement que SCL est synthétisée en continu par les cellules T en cours de prolifération. Etude des interactions SCL/IFNs/IL-2 Stimulation de la synthèse d'ADN decellules de H9 T dans un milieu conditionné sans sérum On détermine la capacité de SCL dans le milieu à stimuler la synthèse d'ADN par incorporation de thymidine 3H. Les cellules de la lignée H9 sont mises en culture pendant 24 h en présence de différentes dilutions de milieu conditionné. On utilise des plaques à 96 puits pour les cultures. Pour les 8 dernières heures, on ajoute 0,5 MCi de thymidine 3H par puits. A la fin du temps de culture, on récolte les cellules et on mesure l'incorporation de thymidine dans l'ADN cellulaire dans un compteur Kontron Betamatic pour évaluer la prolifération cellulaire. Les résultats obtenus après 2 passages sans sérum, mais en présence de 100 UI de IL-2 recombinante, montrent qu'on n'observe aucune albumine résiduelle dans le milieu. Lorsqu'on met à incuber la préparation pendant 36h à 37 C, on détecte une augmentation significative de la synthèse d'ADN dans les cellules H9 T (figure 5). Pour élucider le mécanisme de cette expansion clonale importante de cellules T, on procède alors aux essais suivants: On opère dans des conditions identiques à celles données ci-dessus, mais à 2 concentrations de milieu conditionné, correspondant à des dilutions de 1/2 et de 1/4. La figure 6 présente les résultats obtenus avec les cellules H9 T, le milieu conditionné, et le milieu conditionné additionné de l'oligopeptide 41-55, respectivement aux dilutions de 1/4 (8) et 1/2 (0). D'une manière intéressante, on observe, à la dilution 1/4, une stimulation de la synthèse d'ADN à des niveaux significativement supérieurs à ceux obtenus à la dilution 1/2, ce qui suggère l'implication d'une ou plusieurs protéines avec des fonctions d'inhibition de croissance cellulaire, combinée(s) à SCL dans le milieu conditionné. Pour démontrer la spécificité de cet effet, attribué conformément à l'invention à SCL, on utilise l'oligopeptide 41-55. On constate une diminution significative de la stimulation de l'expansion de la croissance des cellules T sous l'effet de l'oligopeptide. Les résultats donnés sur la figure 6 confortent les arguments en faveur de l'implication de SCL. Ces résultats correspondent à 3 essais en parallèle avec H9, du milieu conditionné seul et du milieu conditionné additionné de NANA. On constate que l'addition de NANA au milieu conditionné (M.C.) inhibe l'effet de stimulation de SCL sur la synthèse d'ADN. Ainsi, en se liant à NANA, SCL inhibe bien la synthèse d'ADN, dépendante de SCL, par inhibition, par compétition, aux récepteurs. Dans une autre série d'expériences, on traite le milieu conditionné par un anticorps monospécifique anti-IFN alpha ou anti-IFN.gamma, pour étudier l'implication de IFN alpha et de IFN gamma dans la régulation de la réplication des cellules T. Chez les témoins, on cultive les cellules H9 avec du milieu seul, et dans les préparations étudiées en parallèle, avec un milieu contenant des IgG normales. Il ressort que dans cet essai l'addition de milieu conditionné sans sérum ne stimule que faiblement l'incorporation de thymidine 3H. Lorsqu'on ajoute l'anticorps anti-IFN alpha, on augmente la stimulation d'ADN, mais un niveau réellement important n'est atteint qu'en présence de l'anticorps anti-IFN.gamma. Ces résultats montrent que ces anticorps sont en fait impliqués indirectement dans le résultat du rendement de la stimulation en ADN. Ainsi, il est proposé, selon l'invention que SCL et IL-2 représentent respectivement le déclencheur et le facteur de croissance dans ces mécanismes, alors que la synthèse des IFN constitue une réponse en retour. Le schéma illustrant ces interactions chronologiques, qui gouvernent, de manière coordonnée, l'expansion clonale des cellules T est représenté sur la figure 9: i) SCL, qui doit agir directement sur les cellules cibles, induit les récepteurs SCL, ce qui permet d'initier le cycle de croissance; ii) sous l'effet conjugué de SCL et IL-2, IFN alpha et IFN gamma sont libérés en réponse à un mécanisme de rétro-inhibition; iii) il en résulte un arrêt de la croissance dans l'interphase et la différenciation cellulaire est favorisée. D'autres cycles de croissance sont facilités puisque SCL peut bloquer l'action des IFNs après l'établissement de l'état antiviral. SCL, seul antigène clairement détectable dans le milieu conditionné sans sérum en gel SDS, (coloration par le bleu de Coomassie) ou par la réaction spécifique en Western Blot La SCL de 55kD a été détectée dans tous les sérums humains étudiés. Quelques molécules peuvent se lier et migrer en même temps en électrophorèse, comme l'albumine, donnant lieu à un artefact de 65kD. SCL est également parfois détectée sous forme dimère. Tous les gels électrophorétiques ont été effectués deux fois, l'un transféré pour un Western blot, et l'autre utilisé comme témoin. On a utilisé le milieu conditionné établi à partir de PBMC avec des concentrations progressivement réduites en sérum à chaque passage, puis sans sérum. En étudiant les bandes polypeptidiques, en utilisant d'abord une concentration en sérum de 1%, suivi de deux passages dans un milieu Hi sans sérum, on trouve de manière constante que seulement les bandes révélées par coloration avec du bleu de Coomassie sont également marquées par l'anticorps spécifique anti-SCL dans les Western blots. Les résultats des Western blots sont donnés sur les figures 10A à 10C. Sur la figure 10A, la piste A correspond au milieu + sérum 10%. La piste B représente SCL + 1% de sérum. Les pistes C, D;E montrent la molécule de 55 kD dans des passages sans sérum ultérieurs. A chaque passage, les cellules ont été lavées au moins 2 fois pour exclure toute présence d'albumine dans les préparations. Dans les trois passages sans sérum, on ne peut détecter que la bande 6555kD, identifiée comme étant SCL. Dans la figure 0lB, qui donne les résultats d'une autre expérience o l'on utilise le premier passage sans sérum, sans les deux lavages successifs entre le 1er et 2ième passage, on observe une double bande sédimentant, respectivement dans les régions de 65kD et de 55kD, ce qui suggère que quelques molécules de SCL liées à de l'albumine résiduelle sont présentes dans le milieu. Dans une troisième expérience, dont les résultats sont illustrés sur la figure lOC ( culture des cellules en présence de milieu contenant 1% de sérum et transfert dans un milieu sans sérum), on observe en plus des deux bandes notées précédemment, une troisième bande de 90-10OkD, qui doit représenter un dimère de SCL. On rapporte sur la figure 11 les résultats relatifs à l'étude de taux de survie de souris Swiss sur lesquelles on a greffé un sarcome TG 180. Les symboles des courbes correspondent aux conditions suivantes: - *témoins; --- immunostimulant + milieu; -A- immunostimulant + acide a amino isobutyrique-galactose + IFN; -X- immunostimulant + acide a amino isobutyrique galactose. On constate chez les témoins une diminution rapide du taux de survie qui devient nul avant le 40ème j our. L'utilisation d'immunostimulant, en l'occurrence Coryne- bacterium parvum, mais qui peut être remplacé conformément à l'invention par SCL, permet d'augmenter la durée de la survie à un peu plus de 48 jours, aucun animal ne survivant au-delà En revanche l'addition, en plus de l'immunostimulant, d'inhibiteurs de SCL conduit à réduire le taux de mortalité sur la même période. Exemple 2: Etude du taux de SCL dans le sérum et le liquide céphalo- rachidien (LCR) au cours de la sclérose en plaque. On rapporte dans le tableau qui suit les mesures qui ont été effectuées sur les prélèvements LCR (essais 1 à 4) et le sérum (5a et 5b) d'un patient atteint de sclérose en plaque, comparé à un sérum de référence. TABLEAU 2 Cas nO titre en SCL en ml/protéine 1 2560 2,4 x 106 2 160 3 160 6,4 x 105 4 160 a 81920 b 81920 sérum de référence 10.240 Ces résultats montrent le taux très élevé de SCL dans LCR et le sérum comparé au témoin et permettent ainsi d'établir un diagnostic de pathologie inflammatoire. LISTE DE SEQUENCES *(1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: A.D.B.E.A ASSOCIATION POUR LE DEVELOPPEMENT DE LA BIOTHERAPIE EXPERIMENTALE ET APPLIQUEE HOPITAL SAINT VINCENT DE PAUL (B) RUE: 74-82 AVENUE DENFERT ROCHEREAU (C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75674 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROTEINES DE TYPE LECTINE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1831 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTISENS: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:62..1469 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAATTCCGGC GAGTGCGCGC TCCTCCTCGC CCGCCGCTAG GTCCATCCCG GCCCAGCCAC 60 C ATG TCC ATC CAC TTC AGC TCC CCG GTA TTC ACC TCG CGC TCA GCC 106 Met Ser Ile His Phe Ser Ser Pro Val Phe Thr Ser Arg Ser Ala 1 5 10 15 GCC TTC TCG GGC CGC GGC GCC CAG GTG CGC CTG AGC TCC GCT CGC CCC 154 Ala Phe Ser Gly Arg Gly Ala Gln Val Arg Leu Ser Ser Ala Arg Pro 25 30 GGC GGC CTT GGC AGC AGC AGC CTC TAC GGC CTC GGC GCC TCG CGG CCG 202 Gly Gly Leu Gly Set Ser Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro 40 45 CGC GTG GCC GTG CGC TCT GCC TAT GGG GGC CCG GTG GGC GCC GGC ATC 250 Arg Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Ile 55 60 CGC GAG GTC ACC ATT AAC CAG AGC CTG CTG GCC CCG CTG CGG CTG GGC 298 Arg Glu Val Thr Ile Asn Gln Ser Leu Leu Ala Pro Leu Arg Leu Gly 70 75 GCC GAC CCC TTC TCC CAG CGG GTG CGC CAG GAG GAG AGC GAG CAG ATC 346 Ala Asp Pro Phe Ser Gln Arg Val Arg Gln Glu Glu Ser Glu Gln Ile 85 90 95 AAG ACC CTC AAC AAC AAG TTT GCC TCC TTC ATC GAC AAG GTG CGG TTT 394 Lys Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe 105 110 CTG GAG CAG CAG AAC AAG CTG CTG GAG ACC AAG TGG ACG CTG CTG CAG 442 Leu Glu Gln Gln Asn Lys Leu Leu Glu Thr Lys Trp Thr Leu Leu Gln 120 125 GAG CAG AAG TCG GCC AAG AGC AGC CGC CTC CCA GAC ATC TTT GAG GCC 490 Glu Gln Lys Ser Ala Lys Ser Ser Arg Leu Pro Asp Ile Phe Glu Ala 135 140 CAG ATT GCT GGC CTT CGG GGT CAG CTT GAG GCA ATG CAG GTG GAT GGG 538 Gln Ile Ala Gly Leu Arg Gly Gln Leu Glu Ala Met Gln Val Asp Gly 150 155 GGC CGC CTG GAG CAG GGG CTG CGG ACG ATG CAG GAT GTG GTG GAG GAC 586 Gly Arg Leu Glu Gln Gly Leu Arg Thr Met Gln Asp Val Val Glu Asp 165 170 175 TTC AAG AAT AAG TAC GAA GAT GAA ATT AAC CGC CGC ACA GCT GCT GAG 634 Phe Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Arg Arg Thr Ala Ala Glu 185 190 AAT GAG TTT GTG GTC CTG AAG AAG GAT GTG GAT GCT GCC TAC ATG AGC 682 Asn Glu Phe Val Val Leu Lys Lys Asp Val Asp Ala Ala Tyr Met Set 200 205 AAG GTG GAG CTG GAG GCC AAG GTG GAT GCC CTG AAT GAT GAG ATC AAC 730 Lys Val Glu Leu Glu Ala Lys Val Asp Ala Leu Asn Asp Glu Ile Asn 210 215 220 TTC CTC AGG ACC CTC AAT GAG ACG GAG TTG ACA GAG CTT CAG TCC CAG 778 Phe Leu Arg Thr Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Gln Ser Gln 225 230 235 ATC TCC GAC ACA TCT GTG GTG CTG TCC ATG GAC AAC AGT CGC TCC CTG 826 Ile Ser Asp Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu 240 245 250 255 GAC CTG GAC GGC ATC ATC GCT GAG GTC AAG GCG CAG TAT GAG GAG ATG 874 Asp Leu Asp Gly Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Glu Met 260 265 270 GCC AAA TGC AGC CGG GCT GAG GCT GAA GCC TGG TAC CAG ACC AAG TTT 922 Ala Lys Cys Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ala Trp Tyr Gln Thr Lys Phe 275 280 285 GAG ACC CTC CAG GCC CAG GCT GGG AAG CAT GGG GAC GAC CTC CGG AAT 970 Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Asn 290 295 300 ACC CGG AAT GAG ATT TCA GAG ATG AAC CGG GCC ATC CAG AGG CTG CAG 1018 Thr Arg Asn Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Ala Ile Gln Arg Leu Gln 305 310 315 GCT GAG ATC GAC AAC ATC AAG AAC CAG CGT GCC AAG TTG GAG GCC GCC 1066 Ala Glu Ile Asp Asn Ile Lys Asn Gln Arg Ala Lys Leu Glu Ala Ala 320 325 330 335 ATT GCC GAG GCT GAG GAG CGT GGG GAG CTG GCG CTC AAG GAT GCT CGT 1114 Ile Ala Glu Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ala Leu Lys Asp Ala Arg 340 345 350 GCC AAG CAG GAG GAG CTT GAA GCC GCC CTG CAG CGG GCC AAG CAG GAT 1162 Ala Lys Gln Glu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp 355 360 365 ATG GCA CGG CAG CTG CGT GAG TAC CAG GAA CTC ATG AGC GTG AAG CTG 1210 Met Ala Arg Gln Leu Arg Glu Tyr Gln Glu Leu Met Ser Val Lys Leu 370 375 380 GCC CTG GAC ATC GAG ATC GCC ACC TAC CGC AAG CTG CTG GAG GGC GAG 1258 Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu 385 390 395 GAG AGC CGG TTG GCT GGA GAT GGA GTG GGA GCC GCC AAT ATC TCT GTG 1306 Glu Ser Arg Leu Ala Gly Asp Gly Val Gly Ala Ala Asn Ile Ser Val 400 405 410 415 ATG AAT TCC ACT GGT GGC AGC AGC AGT GGC GGT GGC ATT GGG CTG ACC 1354 Met Asn Ser Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ile Gly Leu Thr 420 425 430 CTC GGG GGA ACC ATG GGC AGC AAT GCC CTG AGC TTC TCC AGC AGT GCG 1402 Leu Gly Gly Thr Met Gly Ser Asn Ala Leu Ser Phe Ser Ser Ser Ala 435 440 445 GGT CCT GGG CTC CTG AAG GCT TAT TCC ATC CGG ACC GCA TCC GCC AGT 1450 Gly Pro Gly Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Ile Arg Thr Ala Ser Ala Ser 450 455 460 CGC AGG AGT ACC CGC GAC TGAGTCGC CTCCCACCAC TCCACTCCTC 1496 Arg Arg Ser Thr Arg Asp CAGCCACCAC CCACAATCAC AGCCATTGCC GAGGCTGAGG AGTGTGGGGA GCTGGCGCTC 1556 AAGGATGCTC GTGCCAAGCA GGAGGAGCTG GAAGCCGCCC TGCAGCGGGC CAAGCAGGAT 1616 ATGGCACGGC AGCTGCGTGA GTACCAGGAA CTCATGAGCG TGAAGCTGGC CCTGGACATC 1676 GAGATCGCCA CCTACCGCAA GCTGCTGGAG GGCGAGGAGA GCCGGTTGGC TGGAGATGGA 1736 GTGGGAGCCG TGAATATCTC TGTGATGAAT TCCACTGGTG GCAGTAGCAG TGGCGGTGGC 1796 ATTGGGCTAG CCCTCGGGGG AACCATGGGC AGCAA 1831 (3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro Arg Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr 1 5 10 15 (4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Asp Pro Phe Ser Gln Arg Val Arg Gln Glu Glu Ser Glu Gln Ile 1 5 10 15 (5) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GGT CCT GGG CTC CTG AAG GCT TAT TCC ATC CGG ACC GCA TCC GCC AGT Gly Pro Gly Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Ile Arg Thr Ala Ser Ala Ser CGC AGG AGT ACC CGC GAC TGAGTCGC CTCCCACCAC TCCACTCCTC Arg Arg Ser Thr Arg Asp REVENDICATIONS 1/ Méthode de diagnostic in vitro d'une infection par VIH ou d'une pathologie inflammatoire caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact d'un prélèvement biologique à analyser, avec une préparation d'anticorps anti-SCL, ou anti-oligopeptide de SCL, ou d'un fragment de tels anticorps, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec les SCL du prélèvement, - la mise en évidence de la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps, et - la comparaison des résultats obtenus avec un échantillon témoin d'un patient séronégatif. 2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on met en oeuvre des anticorps anti-SCL monospécifques dirigés contre une SCL purifiée. 3/ Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les anticorps sont dirigés contre SCL de 55 kD (SEQ ID NO 1). 4/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise des anticorps anti-oligopeptides correspondant à l'extrémité C- carboxyle de la SCL (SEQ ID n 1). / Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'on utilise l'anticorps anti-oligopeptide 455-469 (SEQ ID N 4). 6/ Kits ou trousses pour la réalisation d'un test de diagnostic du SIDA. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils renferment - au moins un anticorps monospécifique anti-SCL ou anti-oligopeptide de SCL, ou leurs fragments comme défini ci-dessus, - les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la révélation de la réaction immunologique visée, ainsi qu'une notice d'utilisation.