Brevet FR2781502A1 — publié le 20000128

La présente invention concerne un procédé microbiologique de préparation de sphingolipides, en particulier, de tétraacétylphytosphingosine (TAPS), utilisant une nouvelle levure Pichia cifer-nii DSCC 7-25 dans des conditions de fermentation définies. De plus, cette invention concerne une nouvelle levure Pichia cifeii-il DSC(' 7-25 et son procédé d'isolement à partir de la souche parentale de Pichia cifenii ATCC 14091. Le terme "sphingolipides" désigne un groupe de lipides dérivés de sphingosine. De plus, les sphingolipides contiennent de la sphingosine, de la dihydrosphingosine ou de la phytosphingosine sous forme d'une base liée par une liaison amide à un acide gras. Les bases sphingosine et phytosphingosine peuvent être utilisées comme substances de départ dans la synthèse d'un groupe particulier de sphingolipides, à savoir, les céramides. Les céramides constituent le composant lipidique principal de la couche cornée, qui assure une fonction importante de barrière. Par conséquent, les produits cosmétiques pour la peau contenant des céramides ont pour fonction de conférer des propriétés de rétention d'eau à la peau. Actuellement, les préparations hétérogènes de sphingolipides pour des produits cosmétiques sont principalement extraites à partir de sources d'origine animale. De toute évidence, il s'agit là d'un procédé relativement coûteux à l'échelle industrielle. De plus, il s'est avéré que ces substances sont potentiellement dangereuses en raison, par exemple, de la présence éventuelle d'encéphalomyélite spongiforme bovine (BSE) dans le tissu bovin. Ainsi, l'industrie cosmétique a manifesté un intérêt croissant pour de nouvelles sources de sphingolipides purs, bien définis, qui sont obtenus à partir de sources autres que les tissus animaux. Il s'est avéré que des micro-organismes tels que les levures Pichia ciferrii, anciennement appelées Hansenula ciferrii et Endomycopsis cifenii (Stodola et Wickerham, 1960-, Wickerham et Stodola, 1960: Wickerham et coll., 1954; Wickerham, 1951), produisent des sphingolipides en tant que tels, ainsi que de la sphingosine, de la phytosphingosine et/ou leurs dérivés. Cette découverte fournit des sources de sphingolipides proprement dits et des substances de départ pour la production d'autres composés d'intérêt commercial qui pourraient offrir une alternative intéressante à l'utilisation de sources animales de ces composés. La voie de biosynthèse de la tétraacétylphytosphingosine (TAPS) dans Pichia cifenii a été décrite par Barenholz et coll. (1973). La voie de biosynthèse de la sphingosine et de la dihydrosphingosine est proposée par Dimari et coll. (1971). Barenholz et coli. (1971 & 1973) ont étudié le contexte métabolique de la production de TAPS et d'autres bases sphingolipidiques dans quatre souches de Pichia cifenii. Dans cette dernière étude, les profils de quatre enzymes microsomales spécifiques de la biosynthèse de bases acétylées de sphingosine d'un faible producteur (Pichia cifenii NRRL Y-1031, E-11, sexe b, 8-20-57) et d'un grand producteur (Pichia cifenii NRRL Y -1031. F-60-10) ont été comparés. Il s'est avéré que l'activité spécifique de la 3-cétodihydrosphingosine-synthétase et de la base à chaîne longue-acétyl-CoA-acétyltransférase a été respectivement multipliée par 5-10 et par 30, par rapport au faible producteur, alors que les activités de la palmityl-thiokinase et de la 3-cétodihydrosphingosineréductase étaient similaires. Ceci indique que dans le faible producteur, l'activité de la 3-cétodihydrosphingosine-synthétase et de la base à chaîne longue-acétyl-CoA acétyltransférase constitue les étapes limitantes de la synthèse de sphingosines acétylées. Dans les conditions de croissance définies, il s'est avéré que Pichia cifenii NRRL Y- 103 F-60-10 produit 300 umoles/L de bases sphingosine (environ 0,15 g/1), dont au moins 250 umoles/L étaient extracellulaires. Même lorsque les conditions de cultures ont été optimisées pour la production de TAPS, seul 0,485 g/1 de TAPS (0. 024 g de TAPS/g de levure sèche) a été obtenu (Maister et coll., 1962). En utilisant la souche de groupe d'appariement F-60-10, Maister a réussi à produire jusqu'à 300 g/l. dans une fermentation par lots, à l'échelle pilote, en utilisant le glucose comme source de carbone, à 25 C. La TAPS produite est le D-D-érythroisomère, qui a la même stéréochimie que la phytosphingosine présente dans la peau humaine. La TAPS peut être facilement désacétylée en phytosphingosine. Cependant, les rendements en TAPS sont trop faibles pour avoir un quelconque intérêt pratique dans la production industrielle. Récemment, de nombreux chercheurs ont tenté d'améliorer la productivité en sphingolipides en utilisant des cellules mutantes de Pichia cifenii. Selon la description de WO 94/lOls (PCT/GB93/02230), une production maximale de 2700 mg/1 de TAPS a été rapportée en utilisant Pichia cifelTii NRRL Y-1031 F-60-10 dans une fermentation par lots avec une productivité en TAPS de 22.5 mg/JIll. En outre, dans WO 95/12683 (PCT/EP94/03652), des mutants dérivés de la souche de groupe d'appariement de Pichia ciferrii F-60-10 présentaient une augmentation de la productivité en TAPS de 40-60% par rapport à la souche parentale. D'autre part, EP 0 688 871 A2 décrivait la sélection et l'isolement d'un nouveau mutant de Pichia ciferrii F-60-10. A l'aide de ce mutant, il a été rapporté une production moyenne de TAPS de 500-1000 mg/l et une production maximale de 5000 mg/l alors même que la productivité en TAPS n'est que de 30-42 mg/l/h. Toutefois, aucune des souches de levure étudiées à ce jour, même Pichia ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, ne produit de quantité suffisante de bases sphingolipidiques, telles que la sphingosine, la phytosphingosine ou leurs dérivés, pour pouvoir constituer une source efficace, intéressante sur le plan économique, pour ces composés. Selon les premières études de Wickerham et de ses collaborateurs (Wickerham et Stodola, 1960), la production de sphingolipides, en particulier de TAPS, est liée à la sexualité des souches de Pichia cifenii. Un groupe d'appariement NRRL Y-1031. F-60-10 fortement producteur de TAPS était l'un des isolats de groupe d'appariement dérivés de la souche parentale NRRL Y-1031 (ATTC 14091) qui était diploïde. Ils ont également signalé qu'un groupe d'appariement d'un sexe (a) avait tendance à produire beaucoup plus de TAPS que l'autre sexe (b). Il semblerait, toutefois, qu'il existe un ou plusieurs facteurs génétiques autres que la sexualité qui affectent la production de sphingolipides. Le groupe d'appariement 11de la souche Y-1031 produisait beaucoup moins de TAPS que le groupe d'appariement F-60-10 de la souche Y-1 Os bien qu'il avait le même sexe que le groupe d'appariement F-60- 10. En se basant sur les précédentes découvertes décrites ci-dessus, on a déduit que les recombinaisons génétiques durant la méiose d'un Pichia cifewü diploïde, qui conduit à la formation de spores haploïdes, pourraient engendrer une nouvelle souche de Pichia cifenii de groupe d'appariement haploïde ayant un rendement de production de TAPS plus élevé que le groupe d'appariement F-60-10. De plus, on a employé un schéma de sélection qui favorise l'isolement de grand producteur de TAPS à partir des groupes de spores. Il a été démontré que l'ion calcium influe sur la biosynthèse des sphingolipides en modulant l'activité des enzymes clés impliquées dans la voie. Une déplétion des ions calcium par addition d'EGTA qui chélate les ions calcium dans le milieu de sélection empêche les cellules de levure de croître, probablement en raison du fait qu'elle empêche la synthèse de sphingolipides dans la cellule. Par conséquent, de nouveaux isolats haploïdes qui peuvent croître dans ces environnements de sélection sont des grands producteurs possibles de TAPS. Le but de la présente invention est de fournir de nouveaux isolats de Pichia cifenii, qui ont été déposés auprès du Korean Culture Center of Microorganism sous le numéro d'ordre K.CCM-10131 le 30 juin 1998 conformément au traité de Budapest, pour préparer de la tétraacétylphytosphingosine (TAPS) avec une productivité élevée. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé permettant une production maximale de TAPS en utilisant un nouveau isolat, Pichia cifenii DSCC 7-25 (KCCM-1013 1), ledit procédé comprenant les étapes de: i) fermentation avec la souche de levure jusqu'à ce que la concentration maximale de TAPS dans le milieu de fermentation atteigne 5--15 g/l, dans laquelle a) la composition du milieu YMgl comprend de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, de la peptone, du glycérol contenant du CaCl2 et du citrate; b) la température de culture est de 2228 C; c) la vitesse d'agitation du milieu est de 400-600 tours/min; ii) transfert de la masse de fermentation dans une cuve de vieillissement: iii) séparation de la TAPS à l'aide de solvant organique; et iv) purification de la TAPS par chromatographie sur colonne de gel de silice. L'autre but de la présente invention consiste à fournir le procédé permettant une production maximale de TAPS en utilisant une nouvelle souche de Pichia cifenii DSC(' 7-25 (KCCM-10131), caractérisé en ce que la fermentation est une fermentation par lots, et en ce que la composition du milieu YMgl comprend 0,2 0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0.2-0.4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0.7% (poids/volume) de peptone. z12,0% (poids/volume) de glycérol contenant z15 mmoles de CaCI2 et 0,4-0,7% (poids/volume) de citrate. Le but de la présente invention est encore de fournir le procédé permettant une production maximale de TAPS en utilisant une nouvelle souche de Pichia cifenii DSCC 7-25 ((CCM-101 l), caractérisé en ce que la fermentation est une fermentation par lots alimentés, et en ce que la composition du milieu YMgl comprend 0,3-0,5% (poids/volume) d'extrait de levure, 0, 0,5% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 15,0 18,0% (poids/volume) de glycérol contenant 10-20 mmoles de CaCl2 et 0.5 0,9% (poids/volume) de citrate. La figure 1 représente la production de TAPS dans une fermentation par lots alimentés, utilisant DSC'C 7-25. La nouvelle souche de Pichia ciferrii DSCC 7-25 utilisée dans la présente invention est isolée selon les procédés suivants qui ne comprennent aucune étape de mutagénèse. La souche parentale de levure diploïde Pichia ciferrii ATCC-14091 est cultivée dans le milieu YMgl [0.2 0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,20,4% (poids/volume) d'extrait de malt. 0, î-0,7% (poids/volume) de peptone, 2. 5 3,5% (poids/volume) de glycérol] sous agitation, et est étalée dans le milieu de sporulation [3--7% d'extrait de malt et 4 5% de gélose]. Ensuite, on obtient des spores en forme de chapeau, puis on sélectionne les spores uniques par choc thermique et à l'aide d'enzymes de dégradation de la paroi cellulaire, telles que la glusulase ou Zymolyase, qui hydrolysent la paroi cellulaire des cellules végétatives mais pas celle des spores. Ce traitement enrichit efficacement les spores à par-tir des cultures cellulaires sporulées, et en particulier, à partir des cultures cellulaires faiblement sporulées. Pour la sélection des dérivés de levure à spore unique obtenus, les cellules sélectionnées sont cultivées dans le milieu YMgl en boîte [0.2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt. 0.3 - 0.7% (poids/volume) de peptone, 2.5 ,5% (poids/volume) de glycérol et 2- rio mmoles d'EGTA], puis les cellules sont sélectionnées suivant la quantité de sphingolipides libérés. Enfin, on isole Pichia cifen'ii DSCC 7-25 comme étant la cellule qui libère le plus de sphingolipides comparée aux autres cellules d'après l'analyse par CCM et par HPLC. Ces isolats ont été déposés auprès du Korean Culture Center of Microorganism sous le numéro d'ordre K.CCM-1013 1. Ce qui suit décrit des procédés de fermentation pour produire TAPS à l'aide de la levure Pichia cifenii DSCC 7-25 sélectionnée. La levure Pichia cifenii DSCC 7-25 sélectionnée est ensemencée dans le milieu de culture. puis on obtient des cellules concentrées. Les cellules ensemencées sont cultivées dans le milieu YMgl avec la souche de levure jusqu'à ce que la concentration maximale de TAPS dans le milieu de fermentation atteigne 5-7 g/1. En outre, la composition du milieu YMgl comprend 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt. 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 8,0-12% (poids/volume) de glycérol contenant 5-15 mmoles de CaCl2, 0,4-0.7% (poids/volume) de sérine et 0,4-0,7% (poids/volume) de citrate. La formation de sphingolipides est régulée par la concentration en cation calcium (Ca++) car l'activité de la sérine-palmitoyl-transférase (SPT) est stimulée par l'addition de cation calcium dans le milieu. Cependant, dans le cas de Pichia cifenii NRRL Y-1031. la production de sphingolipides diminue quand on ajoute du cation calcium dans le milieu. D'autre part, l'addition de sérine dans le milieu augmente la production de TAPS, étant donné que les sphingolipides sont biosynthétisés par la réaction entre la sérine et le palmitoyl-CoA. Par conséquent, la sérine est aussi un facteur limitant de la biosynthèse des sphingolipides. Suivant l'addition de cation calcium et de serine dans le milieu de fermentation, la productivité en TAPS a été augmentée de 4-5 fois comparée à celle en l'absence de ces composés dans le milieu. Les conditions de fermentation sont optimales lorsque la température de culture est de 22#28 C et que la vitesse d'agitation du milieu est de 400- 600 tours/min. Après la fermentation, la biomasse renfermant les sphingolipides est transférée dans une cuve de vieillissement. Ensuite, la biomasse fermentée est vieillie pendant 2 jours à 3#5 C. On fait précipiter les cellules et on les fait déposer au fond de la cuve, puis on extrait les sphingolipides à l'aide de solvant organique. Enfin, plus de 95% de TAPS purifiée sont obtenus par chromatographie sur colonne de gel de silice. La TAPS obtenue peut être convertie en sphingosine ou en phytosphingosine par désacétylation dans une solution basique telle que KOH ou NaOH. En utilisant cette sphingosine ou cette phytosphingosine, on peut obtenir le céramide et ses dérivés par une réaction de N-acylation avec un acide gras. L'acide gras utilisé dans cette réaction est un acide gras saturé ou insaturé quelconque ayant 6 40 atomes de carbone et 0-3 doubles liaisons. De plus, cette réaction s'effectue par une réaction enzymatique ou une réaction chimique. Dans le cas d'une réaction chimique, on peut utiliser comme réactif de liaison le carbodiimide, le carbodiimidazole, la 1.2dihydroquinolone et/ou l'hydroxybenzotriazole. Les exemples suivants servent à expliquer de façon plus précise la présente invention. Toutefois, le cadre de la présente invention ne se limite pas aux exemples suivants. EXEMPLE 1 Isolement de Pichia ciferrii DSCC 7-25 Une souche diploïde de Pichia ciferrii ATCC-14091 est cultivée dans le milieu YMgl [0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,20,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3- 0,7% (poids/volume) de peptone, 2,5-3,5% (poids/volume) de glycérol] sous agitation à 25 C pendant trois jours. Ensuite, les cellules obtenues sont étalées et cultivées dans 0,1-0.5 ml de milieu de sporulation [37% d'extrait de malt et 4-5% de gélose] à la température ambiante pendant 7 10 jours. On obtient alors des spores en forme de chapeau. Le rendement de sporulation est de 6-8%. Les spores obtenues sont enrichies par une combinaison de traitement thermique et de traitement à la Zymolyase pour la sélection. Le traitement thermique est réalisé sur 1#2 ml de suspension de spores (6-10 x 107 cellules/ml) à 55 C pendant 1-5 minutes et suivi d'un traitement à la Zymolyase 60 000 (10 mg/ml) pendant 0,5 à 2 heures à 30 C. La première sélection est réalisée pour isoler les colonies différentes des cellules parentales au niveau de leur forme, de leur couleur et de leur taille. 50 colonies sont sélectionnées parmi les 400 colonies cultivées à partir du groupe de spores enrichies. Pour la deuxième sélection servant à isoler les dérivés de levure à spore unique obtenus, les cellules sélectionnées sont cultivées dans un milieu YMgl en boîte [0,2 0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 2,5-3,5% (poids/volume) de glycérol et 2#30 mmoles d'EGTA] à 25 C pendant 4 jours. Ensuite, les cellules sont sélectionnées selon la quantité de sphingolipides libérés. Le tableau suivant indique la quantité de TAPS produite par les souches secondaires sélectionnées. Tableau 1. Quantité de TAPS produite par les isolats haploïdes dans le milieu YMgl Souche Quantité de TAPS produite (mg/1) 14091 120 2-28 94 7-24 93 7-25 319 7-28 199 7-29 184 7-40 116 7-44 83 F-60-10 241 Enfin, on isole Pichia ci terriDSCC 7-25 comme étant la cellule qui libère le plus de sphingolipides comparée aux autres cellules d'après l'analyse par CCM et par HPLC. Le rendement de production de TAPS par Pichia cifenii DSCC 7-25 est 30% supérieur à celui de la souche F-60-10 qui est connue pour être la meilleure souche pour la production de TAPS. EXEMPLE 2 Comparaison de Pichia ciferrii DSCC 7-25 et de Pichia cifenii F-60-10 La productivité en TAPS dans la présente invention est mesurée par rapport à celle de Pichia cifenii DSCC 7-25. Il est décrit dans ce qui suit les résultats de la comparaison entre Pichia cifenii DSCC 7-25 et Pichia cifenii F-60-10. Tableau 2. Résultats de la comparaison entre Pichia ciferrii DSCC 7-25 et Pichia ciferrii F-60-10 DSCC 7-25 F-60-10 Temps de doublement (heure) 1,5 3,0 Concentration de biomasse (g/l) 29,7 15 Titre de TAPS (mg/1) 319a 241b Rendement spécifique en TAPS 10,7 16,1 (mg/gdw) Productivité volumétrique (mg 4,6 1,7 de TAPS/L/H) * Condition de fermentation: milieu YMgl (3% de glycérol), 25 C, 250 tours/min. a : le nombre d'heures jusqu'à la fin de la fermentation était de 70 heures b: le nombre d'heures jusqu'à la fin de la fermentation était de 144 heures. Comme le montre le tableau ci-dessus, la souche DSCC 7-25 possède une bien meilleure productivité volumétrique grâce à laquelle le coût de production est déterminé. EXEMPLE 3 Optimisation des conditions de fermentation pour Pichia cifenii DSCC 7-25 - effet synergique de CaCl2 et de la serine sur la production de TAPS On cultive au préalable la souche haploïde sélectionnée Pichia cifenii DSCC 7-25 dans le milieu de culture, et on obtient des cellules concentrées. Les cellules obtenues sont cultivées dans le milieu YMgl à 30 C et à 250 tours/min pendant 3 jours. La composition du milieu YMgl comprend 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 2.5-3.5% (poids/volume) de glycérol contenant 10 mmoles du CaCl2 et 0,5% (poids/volume) de sérine. La formation de sphingolipides est régulée par la concentration en cation calcium (Ca++), car l'activité de la sérine-palmitoyl-transférase (SPT) est stimulée par l'addition de cation calcium dans le milieu. Cependant, dans le cas du groupe d'appariement F-60-10 de Pichia ciferrii NRRL Y -1031, la production de sphingolipides diminue si l'on ajoute du cation calcium dans le milieu. Le tableau suivant montre l'effet de l'ion calcium sur la production de TAPS chez Pichia cifenii OSEZ 7-25 et Pichia cifenii F-60- 10. Tableau 3. Effet du cation calcium sur la production de TAPS Souche Production de TAPS (mg/1) Effet sans CaCl2 CaC12 ( 10 mM) DSCC 7-25 396 744 +1,9 F-60-10 241 43 -5,6 D'autre part, l'addition de sérine dans le milieu augmente la production de TAPS car les sphingolipides sont biosynthétisés grâce à la réaction entre la serine et le palmitoyl-CoA. Le tableau suivant montre l'effet du cation calcium et de la serine sur la productivité en TAPS chez Pichia cifenii DSCC 7-25. Tableau 4. Rendement de production de TAPS Milieu YMgl + Rendement de production de TAPS mg/l mg/gdw mg/l/h Néant 284 22,3 3,94 * CaCI2 8)6 58,3 Il,33 ** Sérine 784 54,8 10,88 CaCl2 + Sérine 1065 88,2 14,79 *CaCl2 10 mM, ** Sérine 5 g/l EXEMPLE 4 Optimisation des conditions de fermentation pour Pichia cifenii DSCC 7-25 : fermentations par lots et par lots alimentés à l'échelle pilote Les conditions de fermentation sont encore optimisées afin d'obtenir un rendement maximal de production de TAPS dans une fermentation à l'échelle pilote de 500 L. Les conditions optimisées englobent la température de culture qui est de 22-28 C et la vitesse d'agitation du milieu qui est de 200-250 tours/min. De plus, on examine d'autres facteurs physiologiques qui influent sur la production de TAPS ainsi que sur la biosynthèse de lipide et on détermine les concentrations et les conditions optimales pour chacun des éléments. Ces éléments englobent le pH, la concentration en ion magnésium et en ion calcium, les acides organiques tels que le citrate. Tableau 5. Rendement de production de TAPS dans des conditions optimisées Souche Pichia ciferrii DSCC 7-25 Mode de fermentation Par lots ( 1 ) Par lots alimentés (2) Temps de doublement 1,5 1,5 (heure) Concentration de biomasse 41,6 85 (g/l) Titre de TAPS 6206 14000 (mg/l) Rendement spécifique en TAPS 149,2 164,7 (mg/l) Productivité volumétrique 51,7 129,6 (mg de TAPS/L/h) Conditions de fermentation: Temp. 25 C, agitation 210 tours/min, aération 0,2 vvm et pH initial 7,5. (1): le nombre d'heures jusqu'à la fin de la fermentation était de 120 heures (2) : le nombre d'heures jusqu'à la fin de la fermentation était de 108 heures. Etant donné que la production de TAPS par la levure Pichia cifenii est associée à la croissance, il a été mis en évidence qu'un supplément d'une partie des substances nutritives incluant le glycérol conduit à une accumulation de TAPS et de ses dérivés dans la culture jusqu'à la déplétion des substances nutritives. En utilisant une fermentation par lots alimentés, dans laquelle le glycérol a été ajouté progressivement dans le bouillon de fermentation jusqu'à une concentration de 180 g/1, le rendement de production de TAPS et de ses dérivés obtenu a atteint 14 g/1, comme le montrent le tableau 5 et la figure 1. Après la fermentation, la biomasse renfermant les sphingolipides est transférée dans une cuve de vieillissement. Ensuite, la biomasse fermentée est vieillie pendant 2 jours à 3 5 C. On fait précipiter les cellules et on les fait déposer au fond de la cuve, puis on extrait les sphingolipides par un procédé qui est pratiquement le même que celui publié par Wickerham et coll., ( 1962). Enfin, on obtient plus de 95% de TAPS purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice. Références 1. Wickerham L. J. (1951) U.S. Dept. Agr. Tech. Bull. N 1029, p. 56 2. Wickerham L. J. et Burton K.A. (1954) J. Bacteriol. 67 : 303-308 3. Wickerham L. J. et Stodola F.H. ( 1960) J. Bacteriol. 80 : 484-491 4. Stodola F. H. et Wickerham L.J. (1960) J. Biol. Chem. 235 (9): 2584-2585 5. Barenholz Y., Edelman 1 et Gatt S. (1971) Biochem, /?//7/.s/c. Actua 248: 458-465. 6. DiMari S. J. et coll. (1971) Arch. Biochem. Biophys. 143: 553-565 7. Barenholz Y., Gadot N. et Gatt S. (1973) 3ruchem, Biophysic. Acta 306:341-345. 8. Maister H. G. et coll. (1962) Appl. Microbiol. 10: 401-406. REVENDICATIONS 1. Procédé pour une production maximale de TAPS, utilisant une nouvelle souche de Pichia cifenii DS('C' 7-25 (KCCM-10131), comprenant les étapes de: i) fermentation avec la souche de levure jusqu'à ce que la concentration maximale de TAPS dans le milieu de fermentation atteigne 5--15 g/l, dans laquelle a) la composition du milieu YMgl comprend de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, de la peptone, du glycérol contenant du CaCl2 et du citrate; b) la température de culture est de 22~28 C; c) la vitesse d'agitation du milieu est de 400-600 tours/min; ii) transfert de la masse de fermentation dans une cuve de vieillissement; iii) séparation de la TAPS à l'aide de solvant organique; et iv) purification de la TAPS par chromatographie sur colonne de gel de silice. 2. Procédé pour une production maximale de TAPS utilisant une nouvelle souche de Pichia cifenii DSCC 7-25 (KCCM-10131) selon la revendication 1, dans lequel la fermentation est une fermentation par lots, et la composition du milieu YMgl comprend 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone. 8,0--12.0% (poids/volume) de glycérol contenant 5-15 mmoles de CaCl2 et 0.4 0,7% (poids/volume) de citrate. 3. Procédé pour une production maximale de TAPS utilisant une nouvelle souche de Pichia ciferrii DSCC 7-25 (KCCM-10131) selon la revendication 1, dans lequel la fermentation est une fermentation par lots alimentés, et la composition du milieu YMgl comprend 0,3-0,5% (poids/volume) d'extrait de levure, 0.3 0,5% (poids/volume) d'extrait de malt. 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 15,0-18,0% (poids/volume) de glycérol contenant 10-20 mmoles de CaCl2 et 0,5-0,9% (poids/volume) de citrate. 4. La levure sélectionnée Pichia cifenii DSCC 7-25 (KCCM- 10131). 5. Procédé d'isolement de nouvelles descendances haploïdes de la souche parentale sporulée de Pichia cifenii ATCC 14091, dont est isolée la levure Pichia ciferrii oser 7-25 (KCCM-10131), ledit procédé comprenant les étapes : i) de mise en culture de la levure parentale diploïde Pichia cifenii ATCC 14091 dans le milieu YMgI [0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone. 2,5-3,5% (poids/volume) de glycérol] sous agitation; ii) d'étalement dans le milieu de sporulation [3-7% d'extrait de malt et 4-5% de gélose]: iii) d'obtention de spores uniques en forme de chapeau et de sélection des spores par l'intennédiaire d'un procédé d'enrichissement qui consiste en un choc thermique et un traitement à la Zymolyase: iv) de mise en culture des cellules sélectionnées dans le milieu YMgl en boîte [0,2 0,4% (poids/volume) d'extrait de levure, 0,2-0,4% (poids/volume) d'extrait de malt, 0,3-0,7% (poids/volume) de peptone, 2,5-3,5% (poids/volume) de glycérol et 2#30 mmoles d'EGTA]: v) de sélection des cellules selon la quantité de sphingolipides libérés; et vi) d'isolement de Pichia cifenii DSCC 7-25 comme étant la cellule qui libère le plus de sphingolipides d'après l'analyse par CCM et par HPLC.