Brevet FR2782010A1 — publié le 20000211

NOUVELLE UTILISATION D'UN COMPOSE D'ARSENIC VIS-A-VIS DE LA LEUCEMIE MEGACARYOCYTAIRE OU PLAQUETTAIRE Domaine de l'invention La présente invention a trait à une nouvelle utilisation d'un composé d'arsenic, en tant que substance apoptotique, vis-à-vis des maladies liées à une hyperprolifération mégacaryocytaire ou plaquettaire, notamment la leucémie mégacaryocytaire (également dénommée leucémie à mégacaryocytes) et la thrombocytémie essentielle maligne. Art antérieur L'apoptose est le processus qui conduit une cellule à sa mort naturelle. Le mécanisme de ce processus implique (i) l'activation dans le noyau cellulaire d'endonucléases endogènes qui fragmentent le DNA, (ii) la rétraction cytoplasmique (en anglais : "cytoplasmic shrinkage"), (iii) la condensation de la chromatine (en anglais : "chromatin condensation"), (iv) la formation de bulles ou pustules au niveau de la membrane cellulaire (en anglais : "membrane blebbing") et (v) la formation de corps apoptotiques. On sait de l'article de Guo-Qiang CHEN et al., Blood, 1997, 89, 3345, que As203 agit sur la différenciation cellulaire aux doses (d) inférieures (0,1 1 gM zig d (en abrégé APL) aux doses moyennes (0,5 gM :5 d On sait du résumé de R. RIVI et al., Blood, 1996, 88, 68a (abstract), et de l'article de A. KOENIG et al., Blood, 1997, 90, 562, que le mélarsoprol, qui est un composé d'arsenic répondant à la nomenclature systématique de 2-[4-[(4,6-diamino-1,3,5-triazin-2-yl)amino]phényl]- 1,3,2-dithiarsolane-4-méthanol, a été testé en tant que substance apoptotique sur plusieurs lignées de cellules leucémiques (leucémie promyélocytaire aiguë, leucémie myéloïde et leucémie lymphoïde) à des doses supérieures à 1 M. Selon ledit résumé de R. RIVI et al., le mélarsoprol présenterait, aux doses étudiées, un spectre d'activité plus large que As203 vis-à-vis desdites lignées de cellules leucémiques. En bref, l'art antérieur (i) ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un composé d'arsenic vis-à-vis des désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires ou plaquettaires, et (ii) ne décrit ni ne suggère l' administration d'un composé d'arsenic à une dose inférieure à celle à partir de laquelle AS203 agit sur l'apoptose de lignées de cellules nonmégacaryocytaires, telles que les cellules APL. But de l'invention Selon l'invention, l'on se propose de fournir une nouvelle solution technique pour guérir et prévenir les désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires ou plaquettaires, et en particulier la leucémie mégacaryocytaire et la thrombocytémie essentielle maligne. Objet de l'invention La nouvelle solution préconisée par l'invention consiste à faire appel à un composé d'arsenic qui n'avait pas encore été envisagé vis-à-vis desdits désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires ou plaquettaires. Ainsi selon l'invention l'on recommande une nouvelle utilisation d'une substance apoptotique, caractérisée en ce que l'on fait appel à un composé d'arsenic en tant que substance apoptotique pour la préparation d'un médicament destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires ou plaquettaires. Description détaillée de l'invention Le composé d'arsenic selon l'invention peut être un composé organique ou minéral. Parmi les composés d'arsenic qui conviennent on peut mentionner notamment As203 et le mélarsoprol, le composé le plus intéressant étant ici As203. De plus, le composé d'arsenic selon l'invention est utilisé à une dose très nettement inférieure à la dose maximale non létale (DLo). Il intervient en tant que substance apoptotique à une dose (0,1 M # d As203, qui est le composé d'arsenic préféré selon l'invention, induit aux faibles doses (0,1 1 iM :5 d (0,5 ,M S d Globalement, ces résultats démontrent que As203 inhibe sélectivement la croissance et induit l'apoptose de lignées de cellules mégacaryocytaires, tandis que les cellules progénitrices hématopoïétiques humaines sont moins sensibles audit composé d'arsenic. En conséquence, As203 est particulièrement utile dans le traitement des désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires et plaquettaires, notamment vis-à-vis de la leucémie mégacaryocytaire et de la thrombocytémie essentielle maligne. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation et d'essais pharmacologiques. L'ensemble de ces éléments n'est pas limitatif mais est donné à titre d' illustration. Exemple 1 - Formulation 1 En clinique l'on peut faire appel à une composition aqueuse contenant en solution 0,1 % (p/v) de As203 (i. e. 10 mg dans 10 ml). Cette composition peut être diluée au moment de l'emploi avec un sérum physiologique. Exemple 2 - Formulation 2 L'on fait appel à une solution aqueuse de AS203, qui est constituée par du sérum physiologique et élaborée à partir de la formulation 1 de l'exemple 1 à partir de 10 mg de As203 dans 10 ml d'eau et de 500 ml d'un sérum physiologique convenant pour administration IV et contenant 5 % p/v de glucose. Essais Pour entreprendre les essais rapportés ci-après, les lignées cellulaires HEL (mégacaryocytaire), Meg-01 (mégacaryocytaire), HL60 (leucémie lymphoïde, lignée ayant des caractéristiques promyélocytaires) et NB4 [lignée cellulaire isolée de cellules APL et comportant une translocation t(15,17) entraînant la production d'une protéine de fusion] ont été cultivées sur milieu RPMI 1640 (EUROBIO, Les Ulis, France) additionné de 10 % v/v de sérum f#tal de veau (FCS), 2mM de L-glucosamine et 1 % p/v de pénicilline/streptomycine, les lignées cellulaires UT7 (mégacaryocytaire) et M07e (mégacaryocytaire) ont été cultivées sur milieu a (EUROBIO, Les Ulis, France) additionné de 10 % v/v FCS, 2mM de L-glucosamine, 1 % p/v de pénicilline/streptomycine et 2,5 ng/ml de GM-CSF (facteur stimulant de colonies de granulocyte-macrophage), et les lignées cellulaires ZR75 et MCF7 (lignées cellulaires de cancer du sein), ont été cultivées sur milieu IMDM (milieu de DULBECCO modifié selon ISCOVE, fabriqué par la société EUROBIO, Les Ulis, France) additionné de 10 % v/v de FCS, 2mM de L-glucosamine, 1 % p/v de pénicilline/streptomycine, 50 ng/ml de rhIL-3 et 50 ng/ml de CSF (facteur stimulant de colonies). Les cellules CD34+ de sang de cordon humain ont été isolées comme indiqué dans l' article de J. THIELE et al. , Leuk. Lymphoma, 1995, 16, 483. Essai A Dans une première série d'expériences, on a évalué l'induction de l'apoptose dans plusieurs lignées cellulaires, à savoir les lignées de cellules mégacaryocytaires (HEL, Meg-01, UT7 et M07e), la lignée de cellules leucémiques à promyélocytes (NB4), la lignée de cellules de leucémie lymphoïde à caractéristiques promyélocytaires (HL60), les lignées de cellules cancéreuses (ZR75 et MCF7) et la lignée de cellules de sang de cordon humain (CD34+). Les cellules sont incubées avec As203 aux concentrations de 0 M (témoins), 0,5 M, 1,0 M et 2 M pendant 24 heures à 37 C. L'apoptose a été déterminée selon l'essai TUNEL et le pourcentage de cellules apoptotiques a été évalué en comptant plus de 500 cellules sur chaque plaque préparative. Les résultats (moyenne de 3 mesures indépendantes par lignée cellulaire et par dose) sont consignés dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU Pourcentage de cellules apoptotiques après incubation avec As203 pendant 24 heures à 37 C As203 cellules 0 M 0,5 M 1,0 M 2,0 M NB4 6,9 2,3 19,8 5,8 41,6 8,6 60,3 8,9 HEL 6,1 ~ 3,5 18,5 4,1 23,9 4,2 52,0 5,2 Meg-01 7,2 1,3 30,1 5,1 43,6 6,6 59,5 4,8 UT7 13,2 ~ 2,2 21,9 3,3 45,3 3,2 60,4 5,1 M07e 12,3 ~ 2,1 25,3 3,5 39,8 5,1 58,4 2,9 HL60 1,6 ~ 0,9 2,5 1,6 4,2 1,5 8,7 1,8 ZR75 4,2 ~ 2,0 6,1 2,1 6,1 2,2 7,4 2,4 MCF7 4,1 ~ 2,1 6,1 2,2 6,1 2,1 7,4 2,5 CD34+ 3,7 ~ 1,8 5,1 1,3 8,6 3,3 11,2 3,9 Note les résultats obtenus pour les cellules NB4, HEL, Meg-01, UT7 et M07e sont statistiquement significatifs aux doses de 0,5 M, 1,0 M et 2,0 M de As203 par rapport aux témoins (0 M), p Essai B Dans une seconde série d'expériences, l'étude de As203 sur la viabilité de lignées de cellules mégacaryocytaires (HEL, Meg-01, M07e et UT7) a été entreprise. Le protocole opératoire utlisé est le suivant. Les cellules (5 x 105 cellules/ml) sont incubées avec AS203 aux concentrations de 0 j.tM (témoins), 0,5 liM, 1,0 j.tM et 2,0 j.tM pendant 24 heures à 37 C. La viabilité des cellules a été mesurée selon l'essai d'exclusion au bleu de Trypan. Les résultats obtenus (moyenne de trois expériences par lignée cellulaire et par dose) sont consignés dans le tableau II ci-après. TABLEAU II Pourcentage de la viabilité de cellules traitées avec As203 pendant 24 heures à 37 C AS203 cellules 0 M 0,5 M 1,0 M 2,0 M HEL 100 4,9 88,4 5,4 70,1 4,7 57,9 4,9 (a) (b) (b) Meg-01 100 6,1 86,1 4,7 73,4 5,5 56,1 5,7 (a) (b) (b) UT7 100 8,2 79,8 7,3 63,8 6,2 50,8 7,4 (a) (b) (b) M07e 100 7,7 82,3 8,1 66,1 4,8 53,4 6,8 (a) (b) (b) Notes (a) statistiquement significatif (p 0,05) par rapport aux témoins ; (b) statistiquement significatif (p 0,01) par rapport aux témoins. Remarque Les différences inter-doses (pour 0,5 M, 1,0 M et 2,0 M) sont également significatives (p 0,05). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une substance apoptotique, caractérisée en ce que l'on fait appel à un composé d'arsenic en tant que substance apoptotique pour la préparation d'un médicament destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des désordres hyperprolifératifs mégacaryocytaires ou plaquettaires. 2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le composé d'arsenic est AS203, 3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le composé d'arsenic est le mélarsoprol. 4. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit désordre hyperprolifératif mégacaryocytaire est la leucémie mégacaryocytaire. 5. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que ledit désordre hyperprolifératif plaquettaire est la thrombocytémie essentielle maligne.