Brevet FR2783000A1 — publié le 20000310

La présente invention concerne un procédé de caractérisation de la totalité des fragments d'ADN d'un échantillon sous forme de faible taille, qui se trouvent souvent abîmés, et/ou à l'état de traces notamment dans les produits finis ou transformés. L'invention réside dans la pré-amplification de la totalité des fragments d'ADN avant une éventuelle amplification spécifique, et donc le procédé est particulièrement adapté à l'analyse, par hybridation moléculaire, en particulier sur puces à ADN, de la totalité de l'ADN provenant de tout type d'échantillon éventuellement d'une importante complexité et/ou ayant subi des traitements dénaturants. Diverses méthodes de caractérisation d'un échantillon complexe d'un point de vue biochimique, basées sur l'identification de séquences nucléotidiques, sont utilisées notamment dans le domaine agro-alimentaire. Ces méthodes peuvent s'appliquer aux matières premières telle qu'une simple graine, cependant elles montrent certaines limitations quant à l'analyse d'un produit contenant de nombreux éléments entrant dans sa composition et/ou ayant subi des traitements qui dénaturent les molécules à caractériser. Il est donc nécessaire d'enrichir et/ou de purifier le matériel contenu dans un échantillon d'intérêt si celui-ci possède des constituants traités ou conditionnés provenant d'origine diverses, comme c'est le cas pour les produits finis. Une fois le matériel nucléique obtenu, à un degré de pureté suffisant pour permettre son analyse, il doit être soumis à un ou plusieurs tests destinés à le caractériser par hybridation moléculaire. Toutefois, ces méthodes sont généralement restreintes aux laboratoires d'analyse du fait, soit de l'utilisation de radioactivité (bien que des méthodes comme la luminescence tendent à remplacer la radioactivité), soit du trop faible nombre d'échantillons analysables simultanément. Dans certains cas, ces techniques ne peuvent pas être utilisées du fait d'un manque de sensibilité, ce manque étant essentiellement dû à la faible quantité, et/ou à la mauvaise qualité, du matériel nucléique récupéré dans l'échantillon. La technique la plus couramment utilisée est la PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette méthode permet d'amplifier spécifiquement, au cours de nombreux cycles réactionnels (de l'ordre de 25 à 45) un acide nucléique compris entre 2 amorces spécifiques de séquences nucléotidiques connues. Ces amorces sont des oligonucléotides de l'ordre de 15 à 40 bases, dont la séquence s'apparie parfaitement avec les séquences flanquantes de la séquence à amplifier. Il est classique, à partir d'un échantillon nucléique, de n'amplifier qu'une seule séquence. Des PCR en "multiplex" ont été décrites dans [Apostolakos (1993) Anal. Biochem., 213, 277-284]. Dans des conditions particulières, il est possible dans un même tube réactionnel d'amplifier plusieurs séquences simultanément en utilisant plusieurs couples d'amorces. Le nombre de couples d'amorces dépasse rarement 3. En effet, au-delà, les amplifications perdent leur spécificité (apparition de produits d'amplification non attendus) ou une ou plusieurs amplifications ne fonctionnent pas ou peu, bien qu'un exemple de l'amplification en multiplex de 9 séquences ait été décrit [Edwards (1994) PCR Methods Applic., 3, S65-S75]. D'autres techniques, dérivées plus ou moins de la PCR, ont été développées : -La LCR (Ligase Chain Reaction), basée sur l'utilisation d'une ADN ligase thermostable [Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 189-193]. -La Gap-LCR est dérivée de la LCR. - L'ERA (End Run Amplification) est développée par Bcckman Instruments, son dérivé étant la GERA (Gap-ERA) [Adams (1994) Novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San-Francisco, CA, USA]. -La CPR (Cycling Probe Reaction), qui met en oeuvre un chimère ADN-ARN-ADN et la ribonucléase H [Duck (1990) BioTechniques, 9, 142-147] et est développée par la société ID Biochemical Corporation. - La SDA (Strand Displacement Amplification) [Walker (1992) Nucleic Acids Res., 20, 1691-1696], brevetée par la société Becton Dickinson, qui autorise une analyse en multiplex [Walker (1994) Nucleic Acids Res., 22, 2670-2677]. Cependant il est difficile d'analyser plus de 3 séquences simultanément par cette méthode. - La TAS (Transcription-based Amplification), [Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 86,1173-1177], utilise la Reverse Transcriptase et la T7 polymerase. La Self Sustained Sequence Replication s'apparente à la TAS [Gingeras (1990) Ann. Biol. Clin.,48, 498- 501]. -La NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) est assez similaire à la 3SR [Kievits (1991) J. Virol. Methods, 35, 273-286]. -Enfin, les propriétés de la Qss replicase (ARN polymérase-ARN dépendante isolée du bactériophage Qp) ont été évoquées avant la PCR [Haruna (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54,579-587] et cette enzyme a été utilisée en technique d'amplification à partir de 1983 [Miele (1983)J. Mol. Biol., 171,281 295]. Il apparaît au vu des documents cites supra, qu'il n'est pas possible de caractériser des centaines, et à plus forte raison des milliers de séquences nucléotidiques contenues dans une solution d'ADN, en un nombre d'étapes restreint. Il est néanmoins possible d'amplifier, dans un nombre d'étapes limité, et en utilisant un nombre d'amorces important (supérieur au nombre utilisé en multiplex), la quasi totalité de l'ADN contenu dans un extrait. Une des approches pourraient être la technique AFLP (Amplified Restriction Flagment Polymorphism ou Amplified Fragment Lenght Polymorphismn) qui consiste en l'utilisation d'enzymes de restriction pour digérer l'ADN en des sites précis, puis d'adapteurs se fixant précisément à ces sites de coupures, apportant en plus une séquence d'ADN suffisante pour permettre ensuite l'hybridation d'amorces. Dans un procédé commercialisé par exemple par la société Gibco-BRL, les enzymes EcoRI et MseI sont utilisés, puis 8 adapteurs/amorces de chaque site de coupure sont utilisés pour l'étape d'amplification. Cette méthode est toutefois restreinte à l'analyse d'ADN d'assez bonne qualité (généralement directement extrait d'un tissu ou d'un organisme). En effet, il est nécessaire pour que les amplifications aient lieu que les 2 adapteurs soient présents aux extrémités de l'ADN digéré, donc que l'ADN ait été digéré à ces sites. Dans le cas d'ADN issu d'un produit transformé, la taille de cet ADN est de l'ordre de quelques centaines de paires de bases (200 à 400). La probabilité de présence d'un site EcoRI (reconnaissant un site composé du palindrome de 6 paires de bases; GAATTC) est de 1/46, soit 1 site potentiel pour 4096 paires de bases. Les enzymes de restriction reconnaissant les sites les plus fréquents (4 paires de bases), comme MseI, vont par contre statistiquement couper l'ADN toutes les 256 paires de bases. Comme il est nécessaire de couper l'ADN 2 fois pour générer les 2 sites d'amorçage de la PCR, la probabilité de générer ces 2 sites, sur un fragment de quelques centaines de paires de bases est faible et les produits d'amplification ne reflètent pas l'ensemble de l'ADN de départ. De courtes séquences répétées, dispersées tout le long du génome, appelées "microsatellites", ont été utilisées pour amplifier, à l'aide d'amorces complémentaires à ces séquences microsatellites, les séquences comprises entre celles-ci [Zietkeiwicz (1994) Genomics, 20, 176 183 ; Weising(1995) PCR Methods Applic., 4, 249-2551. Ce type d'amplification permet surtout de réaliser du typage génétique "fingerprinting" basé sur une analyse qualitative des produits d'amplification [Thomas (1993) Theor. Appl. Genet. 86, 985-990]. Une forte proportion du génome peut ainsi être amplifiée, mais pas sa totalité, en particulier du fait que certaines séquences microsatellites sont trop éloignées pour permettre une amplification PCR. Trois méthodes ont été décrites, revendiquant l'amplification non spécifique de toutes les séquences nucléotidiques d'un échantillon [Lüdecke (1989) Nature, 338, 348-350 ou Kinzler (1989) Nucleic Acids Res., 17, 3645-3653 ; Zhang (1992) Proc. Natl. Acad ; Sci. USA, 89,5847-5851; et Grothues (1993) Nucleic Acids Res., 21, 1321-1322 ; et US 5,731,171]. Le principe de cette dernière méthode, s'inspirant des 2 autres et revendiquant une amélioration technique, repose sur l'utilisation d'un très grand nombre d'oligonucléotides de 10 à 20 bases, représentant toutes les séquences possibles, auxquels une séquence spécifique est associée en 3'. Au cours d'une première PCR, avec un petit nombre de cycles, ces oligonucléotides vont théoriquement s'apparier sur toutes les séquences et les cycles d'amplification vont incorporer la séquence spécifique à tous les fragments amplifiés. Après une filtration sur gel, ayant pour but de séparer les oligonucléotides libres de l'ADN, une seconde PCR utilisant un oligonucléotide complémentaire de la séquence spécifique est réalisée sur l'ADN. Selon les auteurs, ce procédé permet l'amplification de la totalité de l'ADN sur des échantillons de tailles variant de 400 paires de bases à 40 mégabases. Cependant, les oligonucléotides pouvant s'hybrider à toutes les séquences possibles, sur un même brin d'ADN, ne s'hybrident pas forcément aux extrémités et donc le fragment entier n'est pas amplifié. De surcroît, la température d'hybridation est de 30 C en ce qui concerne la première PCR avec ces oligonucléotides aléatoires (température en dessous de laquelle il est difficile de descendre avec les appareils à PCR). La température d'hybridation d'un oligonucléotide étant calculée sur la base de 2 C par A ou T et de 4 C pour G ou C, un oligonucléotide constitué d'une combinaison de 10 A ou T s'hybride à 20 C et donc ne s'hybridera pas, ou très mal à 30 C. En utilisant une telle température, la richesse en A/T de l'oligonucléotide ne devrait pas excéder 50% de la séquence. Ce problème est d'ailleurs soulevé dans cette publication, qui précise en outre qu'un nombre de séquences est au minimum sous représentées et donc implicitement que certaines séquences ne sont pas amplifiés. Le risque de n'amplifier que partiellement une séquence particulière augmente de façon inversement proportionnelle à la quantité de cette séquence dans le milieu de départ et l'apparition de faux négatifs est un problème pour l'analyse fiable d'un échantillon. L'amplification des ARNm totaux de cellules a été décrit notamment de la page 120 à 121 de "La PCR, un procédé de réplication in vitro", Daniel Larzul, Collection Génie Génétique, Ed. Lavoisier. Cette méthode bénéficie du fait que la majorité des ARNm possède une queue poly (A) l'extrémité 3'. Un oligonucléotide poly(dT) sert d'amorce lors de la première étape d'amplification, puis un poly(dG) est ajouté à l'extrémité 3' du brin nouvellement synthétisé par la terminal transférase, et sert de site d'ancrage pour une amorce poly(dC). Bien que l'amplification des ARNm totaux possède certaines caractéristiques assez similaires à la présente invention, cette technique n'est pas a priori directement applicable pour accomplir l'objectif de la présente invention. En effet, après dénaturation des brins obtenus par élongation à partir de poly(dC), on fait agir la taq polymérase avec une amorce poly (dG). Onobtient ainsi deux produits qui ne sont pas amplifiables puisque deux nouvelles amorces poly(dC) aurait une polarité 3' - 5', ce qui ne peut pas servir de susbtrat aux polymérases. La méthode selon l'invention permet de surmonter cette difficulté notamment grâce à la réalisation d'une dénaturation/renaturation qui autorise l'appariement des deux brins 5'-poly(dG)-séquence à amplifier-3'. La polymérase synthétise des extrémités poly(dC) qui servent ensuite d'ancrage aux amorces poly(dG) qui possèdent cette fois la bonne polarité 5' - 3'. Toutefois, la technique de l'invention n'est valable que pour l'amplification de brins relativement petits. La détection de produit d'ADN amplifié, par PCR ou d'autres méthodes, fait généralement appel à une analyse électrophorétique. Des méthodes de détection en microplaques 96 puits ont également été décrites. Le produit d'amplification PCR est dénaturé et hybridé dans un puits de microplaque sur lequel est fixé un oligonucléotide de capture [Running (1990) BioTcchniqucs, 8, 276-277] ou un ADN simple-brin contenant une séquence de capture [Kawai (1993) Anal. Biochem., 209, 63-69]. Une au moins des amorces utilisées dans la PCR est par exemple biotinylée et la détection de l'hybridation est réalisée par addition de streptavidinc couplée à une enzyme telle que la peroxydase, puis d'un substrat chromogène de l'enzyme. Des variantes commerciales de ce test utilisent des détections autres telles que la fluorescence. En utilisant un oligonucléotide de capture fixé sur les puits, une amorce de PCR biotinylée et un standard interne d'amplification, il a même été possible de réaliser de la PCR quantitative [Berndt (1995) Anal. Biochem., 225, 252- 257]. La technique de capture de produits d'ADN amplifiés n'est pas restreinte à la PCR puisqu'elle a par exemple été adaptée, par la société Applied Biosystems, à la détection de Mycobactcrium tuberculosis par LCR [Winn-Decn (1993) Mol. Cell. Probes, 7, 179 186]. Ces méthodes, quantitatives ou non, ne renseignent, à partir d'une PCR, que sur la présence ou l'absence d'une séquence ADN cible au départ. Une variante permet à partir d'une seule PCR sur le locus HLA-DR d'identifier, d'une façon semi-automatique, 30 typages différents grâce à l'utilisation de 20 sondes oligonucléotidiques de capture et 2 sondes de détection couplées à la péroxydase [Cros (1992) Lancet, 340, 870-873]. Un test similaire, également appliqué au typage HLA, est commercialisé par la société Perkin Elmer. Parallèlement à l'utilisation de microplaques, des puces à ADN (ou "DNA chips"), destinées à identifier des séquences d'ADN, ont été décrites et commercialisées. Le principe de cette technique consiste à identifier des séquences d'acide nucléique (ADN ou ARN) dans un échantillon sur la base d'une hybridation moléculaire. La puce porte, greffée sur une surface adéquate, des centaines ou milliers d'oligonucléotidcs d'intérêt. L'ADN de l'échantillon est dénaturé et mis dans des conditions d'hybridation avec la puce. Toutefois, deux contraintes principales apparaissent dans ce procédé : (1) le phénomène d'hybridation doit pouvoir être détecté ; (2) la quantité d'ADN hybridée doit répondre aux contraintes de sensibilité du système de détection. Pour répondre à la première contrainte, l'ADN est généralement marqué à l'aide d'un marqueur fluorescent. Il faut néanmoins citer, comme alternative, le système de détection GENFET: il s'agit d'un dispositif d'une constitution proche de celle d'un transistor à effet de champ (FET) développé au laboratoire de physico-chimie des interfaces (Ecole Centrale, Lyon, France). L'hybridation dans ce cas conduit à une modification de la densité de charge du semi-conducteur à l'interface du semi-conducteur à l'interface Si et Si02, cette modification étant mesurée. Pour répondre à la seconde contrainte, l'ADN de l'échantillon est généralement amplifié par PCR. Dans ce cas, l'utilisation d'amorces d'amplification couplées, par exemple à un marqueur fluorescent, ou l'incorporation de nucléotide(s) fluorescent(s) répond aux 2 contraintes simultanément. Néanmoins, l'intérêt de la puce réside dans sa capacité à fournir à partir d'un échantillon d'ADN des centaines ou milliers d'informations. La recherche de mutations ponctuelles en est un bon exemple : hybride un produit d'amplification sur une puce comprenant de nombreuses séquences de capture nucléotidiques contenues dans le fragment amplifié, chaque séquence de capture différant par une base. On peut ainsi, dans les conditions d'hybridation pour lesquelles seuls les produits d'amplification de séquence parfaitement complémentaire s'hybrident, déterminer, selon les séquences de capture hybridées quelle est la séquence du produit d'amplification et en déduire la présence d'une éventuelle mutation par rapport à un allèle de référence. La puce présente alors un grand intérêt car le schéma général de l'expérimentation est : préparation d'ADN - une amplification - une hybridation sur la puce. Dans ce schéma, l'analyse de l'étape "puce à ADN" porte sur une seule amplification de l'ADN (avec un seul couple d'amorces) car toutes les sondes de capture portées par la puce ont pour cibles un seul produit d'amplification. Si on veut concevoir une puce portant des sondes de capture ayant pour cible des multiples produits d'amplification, il sera nécessaire, soit d'utiliser les techniques AFLP, microsatellites (ou une technique dérivée) pour amplifier la totalité de l'ADN génomique, soit de procéder à de multiples amplifications, ce qui, du fait du grand nombre de manipulations en amont de l'étape "puce", rend son intérêt en tant qu'outil de criblage ou caractérisation à haut débit peu intéressant. Une amplification globale de l'ADN d'un échantillon, de type AFLP, serait a priori compatible avec les possibilités de criblage de la puce. Or, l'AFLP n'est pas adaptée à l'amplification de petits fragments d'ADN contenus dans un échantillon complexe, tel que les produits finis agro-alimentaire. En conséquence, le procédé selon l'invention permet la caractérisation de l'ensemble des fragments d'ADN d'un échantillon, qui se sont de faibles tailles, se trouvent souvent abîmés, et/ou à l'état de traces dans les produits finis ou transformés ou lors de prises d'échantillons en divers endroits. De plus, le procédé de la présente invention, valable pour de l'ADN de petite taille, est également applicable à de l'ADN de grande taille dont on peut réduire la taille. L'avantage que procure l'invention réside dans la préamplification de la totalité des fragments d'ADN avant une éventuelle amplification spécifique, et donc le procédé est particulièrement adapté à l'analyse, par hybridation moléculaire, en particulier sur puces à ADN, de la totalité de l'ADN provenant de tout type d'échantillon éventuellement d'une importante complexité et/ou ayant subi des traitements dénaturants. Ainsi, aucun document de l'art antérieur ne décrit, ni ne suggère la présente invention telle que définie ci-après. Description de l'invention La présente invention concerne un procédé d'amplification de la totalité des fragments d'ADN d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) Extraction de l'ADN et réduction le cas échéant de la taille des fragments d'ADN extraits, par cassure physique ou enzymatique de manière à obtenir une longueur moyenne comprise entre environ 25 et 500 pb, de préférence de 100 à 300 pb. b) Addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3' des fragments d'ADN. c) Dénaturation et appariement avec une amorce poly(dY) complémentaire du poly(dX) de l'étape b). d) Synthèse par une ADN polymérase en présence des quatre dNTP. Les échantillons selon l'invention peuvent provenir de n'importe quelle source, de tout produit, matière ou substance, soit à l'état naturel ou qui ont subi des traitements, des transformations, et/ou des conditionnements. En ce qui concerne un nouvel échantillon dont l'état n'est pas connu à l'avance, l'expérimentateur peut, selon sa préférence, choisir une technique d'analyse de la longueur de fragments d'ADN parmi toutes les méthodes couramment utilisées dans le domaine technique. On entend par "le cas échéant", une situation dans laquelle les fragments extraits d'un échantillon ont conservés une taille assez importante (environ supérieure à 500 pb en moyenne). Il est alors nécessaire de procéder à une réduction de la taille des fragments. Ce cas de figure peut survenir lors de l'analyse de matières premières non transformées. On entend par poly(dX) une séquence comprenant au moins une répétition de n'importe quelle base, par exemple une répétition de dG, dC, dA, ou dT. On entend par poly(dY) une séquence comprenant au moins une répétition de n'importe quelle base, ladite séquence étant complémentaire à poly(dX). Le procédé décrit supra peut s'arrêter à l'étape d) ou bien continuer par les étapes par les étapes suivantes si une plus ample amplification est souhaitable: e) Dénaturation, puis lente renaturation pour apparier les brins complémentaires synthétisés à l'étape d) portant des extrémités protubérantes poly(dY). f) Synthèse par une ADN polymérase des poly(dX) complémentaires desdites protubérances , éventuellement en présence uniquement de dXTP. g) Succession de cycles de type PCR consistant en la dénaturation, l'appariement de l'amorce poly (dY), la synthèse par une ADN polymérase. Il est avantageux dans les procédés de l'invention d'amplifier des fragments d'ADN qui possèdent une longueur moyenne comprise entre 100 et 300 pb, de préférence égale à 200 pb. L'addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3' desdits fragments d'ADN telle que mentionnée à l'étape c) est effectuée de préférence par une terminal transférase. Avant cette addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3', des extrémités 3'-OH libres peuvent être générées par la nucléase Pl. Afin d'assurer la détection, l'oligonucléotide est modifié de façon à être révéléble, ainsi il est possible de marquer radioactivement, par un groupe fluorescent ou luminescent l'oligonucléotide poly(dX) ou poly (dY). Une autre solution peut consister à incorporer au cours d'une des étapes de synthèse au moins un nucléotide marqué. Un aspect complémentaire de la présente invention concerne un procédé de caractérisation d'un échantillon consistant en l'hybridation des fragments d'ADN obtenus à partir d'un procédé tel que décrit supra sur une ou plusieurs séquences nucléique de type ADN, ARN, ou PNA (Peptide Nucleic Acid) portées sur un support solide, et en la visualisation du signal émis par le ou les fragment (s) hybridé (s) . L'ADN porté sur le support peut également contenir des désoxycytidines modifiées (N-4-ethyl-2'-deoxycytidine; d4EtC) de façàn à standardiser l'hybridation ; dans ce cas, un appariement dC-dG a la même stabilité qu'un appariement dA-dT (Nguyen et al. (1977), Nucleic Acid Res., 25,3059-3065 ; brevet déposé par Appligène- Oncor, Illkirch, France). De préférence, le support solide peut être une puce à ADN, ARN ou PNA, une microplaque, ou un film, par exemple un film de nitrocellulose. Certaines de ces techniques de détection sont décrites en détail notamment dans [Running (1990) BioTcchniqucs, 8, 276- 277], [Kawai (1993) Anal. Biochem., 209, 63-69], quantitative [Berndt (1995) Anal. Biochem., 225, 252-257], [Winn-Deen (1993) Mol. Cell. Probes, 7, 179 186], [Cros (1992) Lancet, 340, 870-873], incorporées dans la description par référence. La présente invention vise également l'utilisation d'un procédé tel que mentionné supra pour l'identification d'un produit, d'une substance, et/ou d'une matière, à l'état naturel ou qui a subi des traitements, des transformations, et/ou des conditionnements, pour l'identification de son origine et/ou de son appartenance. Le procédé selon l'invention permet aussi l'identification et/ou la quantification de contaminants dans un produit, une substance, et/ou une matière, à l'état naturel ou qui a subi des traitements, des transformations, et/ou des conditionnements. Par exemple, le produit peut provenir du corps humain ou animal, il peut être une sécrétion humaine, éventuellement à l'état de trace. Le produit peut-être un extrait végétal, ou animal, éventuellement transgénique. Dans ce cas de figure le procédé de l'invention permet de détecter rapidement la présence de transgènes. Avantageusement, le produit peut-être un produit agroalimentaire ou pharmaceutique et le contaminant un microorganisme telle qu'une bactérie, un virus, ou un champignon. Un exemple des différentes étapes du procédé d'amplification selon l'invention est illustré à la figure 1. La présente invention vise également l'ensemble des éléments contenus dans les revendications ci-après; ces éléments sont incorporées dans la description. Description détaillée Le procédé selon l'invention consiste à ajouter à tous les fragments d'ADN contenus dans un échantillon une chaîne constituée d'un seul type de nucléotide à l'extrémité 3' de cet ADN. Cette succession de nucléotides peut servir directement à la détection, après hybridation sur les sondes de capture portées par la puce, ou servir dans une étape suivante de base commune à tous les fragments pour un marquage ou une amplification. L'enzyme préférentiellement utilisé est la terminal transférase (EC 27731; enzyme extraite en particulier thymus de veau, également appelée terminal désoxynucléotidyl transférase). Cet enzyme a la propriété de catalyser, indépendamment de la séquence d'ADN, l'addition de désoxyribonucléosides triphosphates ("dNTP") aux extrémités 3'-hydroxyles (3'OH) d'ADN simple- ou double brin. Ainsi, par exemple, l'incubation d'ADN avec la terminal transférase, en présence de désoxycytidine triphosphate (dCTP), conduira à la synthèse, aux 2 extrémités 3'OH de tous les fragments d'ADN, d'une chaîne poly (dC). les conditions adaptées, ce type de marquage présente en particulier l'avantage de marquer uniformément toutes les molécules d'ADN, et donc de ne pas introduire de biais dans la représentativité relative de toutes les molécules d'ADN. Il est pris en compte que l'ADN puisse avoir subi des traitements l'ayant cassé de telle sorte que des extrémités 3'phosphate (3'P) aient été générées. Dans ce cas, l'addition de dNTP aux extrémités de l'ADN par la terminal transférase n'est pas possible. Dans un procédé avantageux selon l'invention, l'ADN est préalablement traité par la nucléase Pl (EC 31301 ; enzyme extraite en particulier de Pénicillium citrinum) qui possède en particulier une activité 3'-nucléotidase enlevant les 3'-phosphates de l'ADN pour générer des extrémités 3'-hydroxyles (3'OH). Ainsi, tous les fragments d'ADN traités seront potentiellement substrats de la terminal transférase. Les nucléotides incorporés par la terminal transférase peuvent être marqués de façon à être détectés par des techniques classiques comme la radioactivité, la fluorescence ou l'électrochimiluminescence. Ainsi, de tels fragments, hybridés sur la puce seront identifiés, l'hybridation de l'ADN par la séquence cible apportant la spécificité d'hybridation, l'élongation dNTP marqué permettant la détection au site d'hybridation. Cette réalisation est dépendante de la sensibilité de détection du système puce et de la quantité d'ADN de départ. Un des aspects remarquable de l'invention est le fait que l'élongation sert de site d'appariement à une amorce de polymérisation, complémentaire de la séquence d'élongation, commune à tous les fragments d'ADN. Par exemple, suite à une élongation poly (dC), amorce de polymérisation poly(dG) sera utilisée. Dans un tel procédé avantageux, l'amorce de polymérisation peut être marquée pour la détection de l'hybridation du brin d'ADN nouvellement synthétisé ou bien un nucléotide marqué va être incorporé au cours de la polymérisation pour la détection de l'hybridation du brin d'ADN nouvellement synthétisé. L'incorporation du nucléotide marqué est réalisée en une seule étape de synthèse du brin d'ADN, copie de l'ADN matrice, à partir de l'amorce complémentaire de l'élongation dNTP de la terminal transférase, grâce à l'action d'une quelconque ADN polymérase présentant l'activité enymatique requise. L'incorporation du nucléotide marqué peut également être réalisée au cours d'une succession d'étapes de synthèse du brin d'ADN, copie de l'ADN matrice, à partir de l'amorce complémentaire de l'élongation dNTP de la terminal transférase. Il s'agit dans ce cas d'une réaction de polymérisation en chaîne de type PCR. L'oligonucléotide complémentaire de l'élongation peut, en plus de la succession d'une même base, comporter à son extrémité 5' une séquence, non complémentaire de la séquence d'élongation, qui lors des étapes de polymérisation de PCR va reconstituer une séquence double brin reconnue par une enzyme de restriction. Bien que cela ne soit pas nécessaire, la présence d'un site de restriction, générant préférentiellement des extrémités cohésives, peut faciliter un clonage des séquences amplifiées. Le produit généré est ensuite hybridé sur une séquence nucléique de type ADN, ARN ou PNA (Peptide Nucleic Acid), porté sur tout type de support, préférentiellement de type puce à ADN, voire microplaque, et le signal généré par l'éventuelle hybridation mesuré par toute technique possible. Dans le domaine de l'agro-alimentaire, le procédé de l'invention concerne entre autres les produits de départ comme la viande et les végétaux (ou les produits issus de végétaux sous toutes leurs formes), les produits intermédiaires et les produits finis. Dans d'autres domaines, comme celui de la pharmacie, ceci concerne notamment la lécithine, le sirop de glucose, les produits de fermentation. Pour la suite de la description, on se référera à la légende de la figure 1 présentée ci-dessous. Légende de la figure 1 Le flèches en trait épais indiquent les deux brins, en sens opposés, de l'ADN. Les petits traits verticaux indiquent que les deux brins sont appariés. 5' et 3' définissent les extrémités de l'ADN selon la nomenclature. Les C représentent l'addition de désoxycytidine-5'-monophosphate (le nombre de C ajouté n'est pas un paramètre dont dépend étroitement le succès de l'amplification. L'appariement C :G n'est pas associé à des petits traits verticaux, cet appariement étant connu de l'homme du métier. Le brin néosynthétisé de l'étape 4) est présenté par un trait fin et celui de l'étape 7) est présenté par un trait en pointillé suivi d'une flèche. 1) Extraction de l'ADN d'un échantillon, réduction le cas échéant de la taille des fragments d'ADN extraits, par cassure physique ou enzymatique de manière à obtenir une longueur moyenne comprise entre environ 25 et 500 pb, et éventuel traitement à la nucléase P1. 2) Addition d'un oligonucléotide poly(dC) aux extrémités 3' des fragments d'ADN. 3) Dénaturation et appariement avec une amorce poly(dG) complémentaire du poly(dC). 4) Synthèse par une ADN polymérase en présence des quatre dNTP. 5) Dénaturation, puis lente renaturation pour apparier les brins complémentaires synthétisés à l'étape précédente portant des extrémités protubérantes poly(dG). 6) Synthèse par une ADN polymérase des poly(dC) complémentaires desdites protubérances , éventuellement en présence uniquement de dCTP. 7) Succession de cycles de type PCR consistant en la dénaturation, appariement de l'amorce poly(dG), et synthèse. Exemple 1: Pre-amplification pour la détection sur une puce à ADN Etape 1: -L'ADN, extrait d'un l'échantillon pris sur un produit alimentaire, est réduit à des fragments de taille moyenne d'environ 200 paires de bases en passant la solution dans une aiguille (le nombre de passages de la solution d'ADN à travers l'aiguille et le diamètre de l'aiguille sont deux paramètres qui définissent la taille moyenne de l'ADN en provoquant des cassures aléatoires de l'ADN). - L'ADN est ensuite quantifié au spectrophotomètre à une longueur de 260nm, ou par d'autres techniques telles que la fluorescence associée au Picogreen (Pierce). - Les cassures de l'ADN ayant pu générer en particulier des extrémités 3'OH mais également 3'P, l'ADN est ensuite soumis à l'action de la nucléase P1 (EC 31301) qui va enlever les phosphates éventuels aux extrémités 3', générant ainsi des extrémités 3'OH. Etape 2: -L'ADN est ensuite soumis pendant un temps précis à une quantité définie de terminal transférase (EC 27231), en présence d'un désoxyribonucléotide triphosphate (dCTP), ce qui a pour effet d'ajouter aux extrémités une chaîne de désoxyribonucléotide monophosphate (dCMP). Etape 3: - L'ADN est ensuite dénaturé à la chaleur, préférentiellement à une température voisine de 100 C, en présence d'un oligonucléotide de séquence complémentaire de chaque séquence d'élongation de l'étape 2 et mis à refroidir de façon à permettre l'appariement d'un oligonucléotide oligo(dG). Etape 4: -L'oligonucléotide va servir d'amorce de synthèse, à partir des 2 extrémités des fragments d'ADN, et la séquence nucléotidique des brins matrices de l'ADN va être synthétisée par une ADN polymérase, en présence des 4 dNTP. A cette étape, on introduit un marquage de l'ADN par l'utilisation de nucléotides marqués, ou portant un haptène directement ou indirectement révélable. Etape 5: -L'ADN est une nouvelle fois dénaturé, puis dénaturé lentement, ce qui a pour effet un appariement des brins complémentaires nouvellement synthétisés portant une extrémité oligo(dG) protubérante en 5'. Etape 6: - Ces extrémités 5' protubérantes sont ensuite complétées par l'action d'une polymérase, en présence de dCTP. L'ensemble du processus peut s'arrêter à cette étape, mais dans cet exemple on poursuit d'avantage l'amplification car l'ADN est à l'état de trace dans l'échantillon. Etape 7: - l'ADN ainsi formé sert de matrice à une amplification de type PCR en utilisant comme unique amorce l'oligonucléotide utilisé à l'étape 2 (oligo(dG)). Etape 8: - L'ensemble du processus ayant eu pour effet d'amplifier d'un facteur au minimum supérieur à 2, la totalité de l'ADN de l'échantillon, en ayant également incorporé un marqueur dans cet ADN, celui ci est ensuite dénaturé et des séquences spécifiques sont recherchées par hybridation sur une sonde de capture fixée sur une puce à ADN (telle que les puces commercialisées par Affymetrix, Cis Bio International/ LETI). Exemple 2: Préamplification aspécifique et amplification spécifique. L'ensemble des produits d'amplification aspécifiques subissent une nouvelle amplification spécifique à l'aide d'amorces spécifiques. Dans ce cas, le marquage peut avoir lieu à cette étape et les produits d'amplification spécifiques être détectés de la même façon que décrit ci-dessus. Plus généralement, la nouvelle amplification peut également être réalisée à l'aide d'amorces non spécifiques, de séquences dégénérées, ou de type microsatellites. Le procédé de l'invention est dans cet exemple une méhode de pré-amplification de la totalité de l'ADN de l'échantillon avant une amplification plus spécifique de séquences d'intérêts. On peut ainsi détecter des fragments de séquences à l'état de trace, même à partir d'échantillon difficile à analyser. Exemple 3 :Analyse quantitative. Dans des conditions de PCR quantitative (en particulier quand le nombre de cycles d'amplification est tel que la quantité de chaque produit d'amplification est proportionnelle à la quantité d'ADN de départ), en utilisant l'amorce d'amplification marquée, le signal lu après hybridation, sur une puce à ADN par exemple, permettra de quantifier, en absolu ou en relatif selon les conditions, la quantité d'une séquence précise d'ADN dans l'échantillon de départ. L'hybridation sur un oligonucléotide de capture complémentaire de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé (ou du nucléotide utilisé dans l'élongation), selon l'orientation de ces oligonucléotides de capture, permet une détection de l'ensemble des produits amplifiés et autorise donc la quantification relative de l'hybridation spécifique d'une séquence particulière. On peut également procéder à une PCR quantitative en utilisant le système SunRise décrit par la société Intergene (Purchase, USA). Revendications 1. Procédé d'amplification de la totalité des fragments d'ADN d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) Extraction de l'ADN et réduction le cas échéant de la taille des fragments d'ADN extraits, par cassure physique ou enzymatique de manière à obtenir une longueur moyenne comprise entre 25 et 500 pb. b) Addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3' des fragments d'ADN. c) Dénaturation et appariement avec une amorce poly(dY) complémentaire du poly(dX) de l'étape b). d) Synthèse par une ADN polymérase en présence des quatre dNTP. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on continue l'amplification par les étapes suivantes : e) Dénaturation, puis lente renaturation pour apparier les brins complémentaires synthétisés à l'étape d) portant des extrémités protubérantes poly(dY). f) Synthèse par une ADN polymérase des poly(dX) complémentaires desdites protubérances , éventuellement en présence uniquement de dXTP. g) Succession de cycles de type PCR consistant en la dénaturation, l'appariement de l'amorce poly (dY), la synthèse. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce les fragments d'ADN possèdent une longueur moyenne comprise entre 100 et 300 pb, de préférence égale à 200 pb. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3' desdits fragments d'ADN est effectuée par une terminal transférase. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que des extrémités 3'-OH libres sont générées par la nucléase P1 avant l'addition d'un oligonucléotide poly(dX) aux extrémités 3' desdits fragments. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'oligonucléotide poly(dX) ou poly(dY) est modifié pour être révélable. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'au moins un nucléotide marqué est incorporé au cours d'une des étapes de synthèse. 8. Procédé de caractérisation d'un échantillon consistant en l'hybridation des fragments d'ADN obtenus à partir d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 7 sur une ou plusieurs séquences nucléique de type ADN, ARN, ou PNA portée (s) un support solide, et en la visualisation du signal émis par le ou les fragment (s) hybridé(s) . 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce le support solide est une puce à ADN, ARN ou PNA, une microplaque, ou un film de nitrocellulose. 10. Utilisation du procédé selon l'une des revendication 7 à 8 pour l'identification de d'un produit, d'une substance, et/ou d'une matière, à l'état naturel ou qui a subi des traitements, des transformations, et/ou des conditionnements, pour l'identification de son origine et/ou de son appartenance. 11. Utilisation du procédé selon l'une des revendication 7 à 8 pour l'identification et/ou la quantification de contaminants dans un produit. 12. Utilisation selon la revendication 10 caractérisé en ce que le produit est une sécrétion humaine, éventuellement à l'état de trace. 13. Utilisation selon la revendication 11 caractérisé en ce que le produit est un extrait végétal, ou animal, éventuellement transgénique. 14. Utilisation selon la revendication 11caractérisé en ce que le produit est un produit agro-alimentaire ou pharmaceutique. 15. Utilisation selon la revendication 11 caractérisé en ce que le contaminant est un micro-organismes telle qu'une bactérie, un virus, ou un champignon.