Brevet FR2782166A1 — publié le 20000211

Réactif pour la mesure de l'hémoglobine et la détermination des leucocytes dans un échantillon de sang L'invention se rapporte aux analyses hématologiques. Elle concerne plus particulièrement un réactif pour la mesure de l'hémoglobine et la détermination des leucocytes dans un échantillon de sang. La mesure de la concentration de l'hémoglobine et la détermi- nation des leucocytes, en particulier de certaines sous- populations leucocytaires, est d'une importance primordiale dans le diagnostic de certaines pathologies, tant en médecine humaine qu'en médecine vétérinaire. L'hémoglobine est une chromo-protéine contenue dans les globules rouges (ou érythrocytes) du sang. La mesure de la concentration de l'hémoglobine nécessite donc d'utiliser un réactif de lyse cellulaire capable de procéder à la lyse des érythrocytes ou globules rouges afin de libérer l'hémoglobine en vue de sa mesure. Il est connu pour cela d'utiliser des réactifs contenant des ions cyanure capables de procéder à la lyse de l'érythrocyte et de transformer l'hémoglobine en un composé chromogène stable pour permettre sa détermination par mesure de colori- métrie. Un réactif de ce type est décrit en particulier dans le Brevet US 3 874 852. Ce réactif a pour inconvénient principal d'utiliser du cyanure. En outre, il ne permet pas d'identifier et de quantifier les sous-populations leucocy- taires contenues dans l'échantillon de sang à analyser. En effet, la détermination de sous-populations leucocytaires, en particulier des lymphocytes, des monocytes, des neutrophi- les et des éosinophiles, s'avère d'une importance primordiale pour l'identification de certaines pathologies. Différents réactifs, ne contenant pas de cyanure, ont déjà été proposés dans l'art antérieur pour la détermination des leucocytes dans un échantillon de sang. Des exemples de tels réactifs sont décrits par exemple dans le document EP 0 325 710. Si ces réactifs ont pour avantage de ne pas utiliser de cyanure, ils ont cependant pour inconvénient de ne pas permettre une identification et quantification précise des sous-populations leucocytaires du sang. Ainsi, le réactif selon EP 0 325 710 permet par exemple de déterminer les éosinophiles présents dans un échantillon de sang, sans toutefois permettre d'identifier de façon précise chacune des autres sous-populations leucocytaires. Par ailleurs, le document EP 0 424 871 décrit des réactifs permettant la différenciation de sous-populations leucocytai- res. Mais ces réactifs éprouvent parfois des difficultés à vaincre les résitances membranaires qui sont présentes en pathologie humaine et en biologie vétérinaire. L'invention a notamment pour but de surmonter les inconvé- nients précités. Elle vise en particulier à procurer un réactif d'analyse hématologique pour la mesure de l'hémoglobine et la détermi- nation des leucocytes dans un échantillon de sang qui permet notamment la lyse des érythrocytes ou globules rouges, ainsi que la mesure de l'hémoglobine, sans utilisation de composés cyanurés. L'invention vise également à procurer un tel réactif qui permet de réaliser la quantification des leucocytes ou globules blancs totaux, l'identification d'au moins une sous- population leucocytaire, et la quantification d'au moins une sous-population leucocytaire. Elle vise aussi à procurer un tel réactif qui peut être utilisé aussi bien en médecine humaine qu'en médecine vétérinaire. Par ailleurs, l'invention vise à procurer un tel réactif qui est capable de surmonter les difficultées d'analyse liées aux résistances membranaires que l'on rencontre en pathologie humaine ainsi qu'en biologie vétérinaire. L'invention propose à cet effet un réactif du type défini ci- dessus, lequel comprend: - au moins un détergent de type cationique; - un composé de type glycoside, en particulier une saponine; - au moins un sel inorganique et/ou un agent osmotique et/ou leucoprotecteur; et - un tampon organique et/ou inorganique propre à ajuster sélectivement le pH du réactif, soit à une valeur sensible- ment neutre (pH compris entre 5 et 8), soit à une valeur basique (pH compris entre 8 et 12). Ainsi, le réactif hématologique de l'invention comprend au moins quatre composants principaux qui permettent d'atteindre les buts indiqués ci-dessus. Le détergent de type cationique exerce une fonction de lyse des globules rouges ou érythrocytes, ce qui permet de libérer l'hémoglobine qui peut être ensuite déterminée par mesure d'absorbance. Les détergents ioniques (anioniques et cationiques) sont principalement utilisés pour dissocier les complexes protéi- ques et solubiliser les protéines des membranes. Ils sont dits dénaturants. En outre, ils ont une action rapide et non spécifique sur les populations cellulaires du sang (érythrocytes et leucocytes). Le composé de type glycoside, en particulier une saponine, contribue à la lyse des globules rouges. En outre, il exerce une fonction de stabilisation à l'égard de l'hémoglobine, ce qui permet de la doser à une longueur d'ondes définie; en particulier, ce composé contribue à détruire les membranes résistantes des globules rouges. Les saponines, encore appelées saponosides, sont des glycosi- des ayant la capacité de lyser spécifiquement les érythrocy- tes, mais cette lyse est moins rapide que celle obtenue en présence des détergents ioniques. Lorsque les saponines sont utilisées en association avec d'autres détergents, elles permettent d'obtenir une lyse plus rapide, plus spécifique des érythrocytes, ce qui limite l'altération des leucocytes. Par ailleurs, la structure chimique de ce type de composés, caractérisée par des squelettes carbonés à cycles multiples, permet la stabilisation physico-chimique des dérivés d'oxyda- tion de l'hémoglobine. Le sel inorganique intervient dans l'activité détergente. En outre, il est nécessaire a la mise en oeuvre d'une mesure par résistivité. L'agent osmotique joue essentiellement un rôle leucoprotec- teur, lorsque le réactif est utilisé à pH neutre, pour favoriser la différenciation des sous-populations leucocytai- res. Enfin, le tampon est un constituant clé car le pH du réactif est une caractéristique importante. En effet, suivant la valeur du pH, le réactif permet l'identification d'une ou plusieurs sous-population leucocytaire. Lorsque le pH du réactif est ajusté à une valeur sensiblement neutre (pH compris entre 5 et 8), il est possible de quanti- fier et d'identifier les trois sous-populations leucocytaires suivantes: lymphocytes, monocytes et neutrophiles. Lorsque le pH du réactif est ajusté à une valeur basique (pH compris entre 8 et 12), il permet en plus d'identifier et de quantifier les polynucléaires éosinophiles. Ainsi, pour les applications nécessitant l'identification des polynucléaires éosinophiles, il faudra ajuster le pH du réactif à une valeur basique. Par contre, si l'identification des éosinophiles n'est pas requise, le pH du réactif sera ajusté à une valeur sensible- ment neutre. Dans le réactif de l'invention, le détergent est avantageuse- ment choisi parmi les composés suivants: - les amines primaires, les acétates et chlorhydrates d'amines grasses; - les sels d'ammonium quaternaires et le bromure de trimé- thylcéthyl ammonium; - les amides de diamines substituées, cationisées par le sulfate d'éthyle, la diéthanolamino-propylamine, le diéthyla- mino-propylamide; et - les amides de diéthylènetriamine cyclisés. Le détergent est avantageusement présent à une concentration comprise entre 0 et 50 g/l, et plus particulièrement d'envi- ron 18 g/l. Parmi les composés de type glycoside, on préfère tout particulièrement les saponines, encore appelées saponosides, qui peuvent être soit triterpéniques, soit stéroïdiques. Dans le réactif de l'invention, le composé de type glycoside est avantageusement présent à une concentration comprise entre 0,5 et 20 g/l, et plus particulièrement d'environ 2g/l. Le sel inorganique est avantageusement choisi parmi les composés suivants: chlorure, sulfate ou fluorure de sodium ou de potassium. Ce sel inorganique est avantageusement présent à une concen- tration comprise entre 1 et 15 g/l, et plus particulièrement d'environ 8 g/l. L'agent osmotique et/ou leucoprotecteur du réactif de l'invention est avantageusement choisi parmi le mannitol, le D-glucose et les composés analogues. Cet agent osmotique et/ou leucoprotecteur est avantageusement présent à une concentration comprise entre 0 et 30 g/l, et plus particulièrement d'environ 2,5 g/l. Le tampon organique et/ou inorganique est avantageusement choisi parmi les composés suivants: - triéthanolamine; - phosphates hydrogénés de sodium et potassium; - acide N-[2-acétamido]-2 iminodiacétique; - acide N-[carbamoylméthyl] iminodiacétique; - 2 amino-2-méthyl 1,3 propanediol; glycine; - carbonate de sodium; - acide citrique; et - tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Ce tampon est avantageusement présent à une concentration comprise entre 0 et 2% en poids. Dans une première forme de réalisation de l'invention, le tampon ajuste le pH du réactif à une valeur comprise entre 5 et 8. Dans une autre forme de réalisation, ce tampon ajuste le pH du réactif à une valeur comprise entre 8 et 12. L'invention sera décrite maintenant en référence aux exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 On prépare un réactif à partir des composés ci-dessous, et dans les concentrations indiquées: Composés Concentration Chlorure de sodium 9 g/l C15 H34 NCl (détergent cationique) 12 g/l Saponine triterpénique 2 g/1 Carbonate de sodium (tampon) 2 g/l (0,2% en poids) Les composés sont mélangés et le pH est ajusté à une valeur basique comprise entre 8 et 12, à savoir 10,5. A l'aide du réactif ainsi préparé on procède à deux analyses hématologiques en utilisant un automate d'hématologie commer- cialisé sous la marque ABX-Micros par la société française ABX. Pour cela, on mélange au préalable un volume déterminé de l'échantillon de sang à analyser avec des volumes déterminés d'un diluant et du réactif ci-dessus. Dans l'exemple, on effectue des mesures sur du sang animal. Les résultats des mesures effectuées sur deux échantillons de sang différents sont représentés sur les figures 1 et 2. Sur ces figures on a représenté le nombre de leucocytes en fonction d'une intensité relative. On constate l'existence de 4 sous-populations leucocytaires. Il s'agit ici d'une analyse résistive si bien que l'on observe de droite à gauche, délimitées par des curseurs, les sous-populations suivantes: les lymphocytes (LYM), les monocytes (MO), les granulocytes (GRA) et les polynucléaires éosinophiles (EOS). L'automate fournit les résultats de comptage suivants, qui indiquent, pour chaque sous-population leucocytaire, le nombre de cellules comptées et le pourcentage correspondant. ANALYSE 1 (figure 1) LYM: 3956 cellules 53,23% MO: 420 cellules 5,65% GRA: 2576 cellules 34,65% EOS: 481 cellules 6,47% ANALYSE 2 (figure 2) LYM: 1071 cellules 9,34% MO: 805 cellules 7,00% GRA: 8906 cellules 77,52% EOS: 706 cellules 6,14% Ainsi le réactif du présent exemple permet d'identifier et de quantifier chacune des quatre sous-populations indiquées ci- dessus. EXEMPLE 2 On utilise le même réactif que dans l'exemple 1 et on procède à des analyses analogues sur deux échantillons différents de sang humain. Les mesures sont effectuées au moyen d'un auto- mate hématologique ABX-Véga de la société ABX. Les résultats sont représentés sur les figures 3 et 4. Pour l'échantillon correspondant à la figure 3, l'analyse permet d'identifier et de quantifier les quatre sous-popula- tions suivantes: les lymphocytes (LYM), les monocytes (MO), les granulocytes (GRA) et les polynucléaires éosinophiles (EOS). Ces derniers représentent 5% de la population totale. Dans le cas de l'échantillon correspondant à la figure 4, l'analyse permet d'identifier et de quantifier les trois sous-populations suivantes: les lymphocytes (LYM), les monocytes (MO) et les granulocytes (GRA). En outre l'analyse révèle que l'échantillon ne contient pas de polynucléaires éosinophiles (taux de 0%). EXEMPLE 3 On utilise un réactif analogue à ceux des exemples 1 et 2, mais ajusté à un pH neutre, à savoir de 7,6%. On procède à des analyses analogues sur un échantillon de sang humain. Les mesures sont effectuées au moyen d'un automate hématologique ABX-Véga de la société ABX. Les résultats des mesures sont représentés à la figure 5. Seules les trois principales sous-populations leucocytaires suivantes sont mises en évidence: les lymphocytes (LYM), les monocytes (MO) et les granulocytes (GRA). EXEMPLE 4 On utilise un réactif analogue à celui de l'exemple 3, donc ajusté à un pH neutre. On procède à des analyses analogues sur un échantillon de sang humain. Les mesures sont effec- tuées au moyen d'un automate hématologique du type ABX-Micros de la société ABX. Les résultats des mesures sont représentés à la figure 6. Comme dans l'exemple 3, seules les trois principales sous- populations leucocytaires suivantes sont mises en évidence: les lymphocytes (LYM), les monocytes (MO) et les granulocytes (GRA). Revendications 1. Réactif pour la mesure de l'hémoglobine et la détermina- tion des leucocytes dans un échantillon de sang, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un détergent de type cationique; - un composé de type glycoside, en particulier une saponine; - au moins un sel inorganique et/ou un agent osmotique et/ou leucoprotecteur; et - un tampon organique et/ou inorganique propre à ajuster sélectivement le pH du réactif, soit à une valeur sensible- ment neutre (pH compris entre 5 et 8), soit à une valeur basique (pH compris entre 8 et 12). 2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le détergent est choisi parmi les composés suivants: - les amines primaires, les acétates et chlorhydrates d'amines grasses; - les sels d'ammonium quaternaires et le bromure de trimé- thylcéthyl ammonium; - les amides de diamines substituées, cationisées par le sulfate d'éthyle, la diéthanolamino-propylamine, le diéthyla- mino-propylamide; et - les amides de diéthylènetriamine cyclisés. 3. Réactif selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le détergent est présent à une concentration comprise entre 0 et 50 g/1. 4. Réactif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé de type glycoside est choisi parmi les saponines (ou saponosides). 5. Réactif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé de type glycoside est présent à une concentration comprise entre 0,5 et 20 g/l. 6. Réactif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le sel inorganique est choisi parmi les composés suivants: chlorure, sulfate ou fluorure de sodium ou de potassium. 7. Réactif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le sel inorganique est présent à une concentration comprise entre 1 et 15 g/1. 8. Réactif selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'agent osmotique et/ou leucoprotecteur est choisi parmi le mannitol, le D-glucose et analogues. 9. Réactif selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent osmotique et/ou leucoprotecteur est présent à une concentration comprise entre 0 et 30 g/l. 10. Réactif selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le tampon organique et/ou inorganique est choisi parmi les composés suivants: - triéthanolamine; - phosphates hydrogénés de sodium et potassium; - acide N-[2-acétamido]-2 iminodiacétique; - acide N-[carbamoylméthyl] iminodiacétique; - 2 amino-2-méthyl 1,3 propanediol; glycine; - carbonate de sodium; - acide citrique; et - tris (hydroxyméthyl) aminométhane. 11. Réactif selon l'une des revendications 1 à 10, caracté- risé en ce que le tampon organique et/ou inorganique est présent à une concentration comprise entre O et 2% en poids. 12. Réactif selon l'une des revendications 1 à 11, caracté- risé en ce que le tampon ajuste le pH du réactif à une valeur comprise entre 5 et 8. 13. Réactif selon l'une des revendications 1 à 11, caracté- risé en ce que le tampon ajuste le pH du réactif à une valeur comprise entre 8 et 12.