Brevet FR2778337A1 — publié le 19991112

Antagonistes des ligands du récepteur des arylhydrocarbures L'invention a pour objet des antagonistes du récepteur des arylhydrocarbures polycycliques et/ou halogénés toxiques et leurs applications, notamment, pour la prévention et le traitement des intoxications et pathologies induites par ces polluants. Les arylhydrocarbures polycycliques et/ou halogénés, désignés ci-après en abrégé par ligands AhR, constituent des toxiques environnementaux. Il s'agit par exemple d'hydrocarbures halogénés (HAHs), d'hydrocarbures polyaromatiques halogénés (PAHs), de biphényles polychlorés (PCBs), de polychlorodibenzodioxines (PCDD), dont la 2, 3, 7, 8-tétrachlorodibenzo (p)dioxine (TCDD), de polychloro- dibenzofuranes (PCDF), et de benzo(a)pyrène (BaP). Ces ligands AhR, et en particulier la dioxine, ont récemment reçu beaucoup d'attention du fait de leur résistance à la dégradation et de leur longue demi- vie de plus de 10 ans dans le sol et de 4 à 12 ans dans le corps humain (sang et graisses). Contrairement à une croyance répandue, l'exposition aux ligands AhR ne se limite pas à la vicinité des sites industriels, de décharge, ou d'accidents de pollution. Toute personne sur terre est continuellement exposée aux toxines activatrices du AhR provenant, entre autres, de la fumée de cigarette, des gaz d'échappement des moteurs à essence ou diesel, des émanations des fours industriels, de la viande cuite au barbecue, des produits laitiers et même du lait maternel (voir référence (1); les références bibliographiques sont données en fin de description). Il existe maintenant suffisamment de preuves expérimentales et cliniques pour démontrer un lien entre l'exposition aux ligands AhR et de nombreuses pathologies, telles que l'athérosclérose (2), certains cancers (3), (4), (5), la dépression immunitaire (6), les allergies et certaines maladies de la peau (7). En outre, les ligands AhR pourraient être impliqués dans l'étiologie de certaines stérilités ( (8), (9)), et de la diminution de la résistance aux infections virales (10) (11)). Les effets biologiques des ligands AhR sont médiés par le récepteur des arylhydrocarbures (AhR), une protéine de 108 kDa, membre de la famille bHLH/PAS, qui est présente dans le cytosol des cellules de mammifères, pratiquement dans tous les tissus (pour revue: (12)). Le complexe ligand/AhR est ensuite transporté dans le noyau par association avec une protéine nucléaire, ARNT ou "AhR nuclear translocator". Dans le noyau, ce complexe hétéromérique régule l'expression de certains gènes en se liant à l'ADN au niveau de séquences définies, les éléments de réponse à la dioxine (DRE), ou les éléments de réponse xénobiotiques (XRE), qui répondent à la séquence T/GNGCGTG. Ces éléments sont localisés dans les gènes sensibles comme les cytochromes P-450 CYPlA1, CYP1A2, CYPlB1, dénommés gènes de phase I. Ces protéines, en particulier CYPlA1 et CYPlB1, sont impliquées dans le métabolisme des HAHs, PAHs et des dioxines, souvent pour conduire à des composés plus cancérigènes. De plus l'induction de CYPlA1/AHH entraîne une augmentation de la production de radicaux libres oxygénés (ROS) qui provoquent la peroxydation des lipides, des lésions oxydatives de l'ADN et des tissus, et qui peuvent conduire à des phénomènes pathologiques de tératogénèse et carcinogénèse (13). Les ligands AhR induisent aussi les enzymes dits de phase II (glutathion-S-transférase, aldéhyde-3- déhydrogénase, NAD(P)H quinone réductase), qui sont responsables de la détoxification et de l'excrétion des molécules xénobiotiques. Cette induction semble avoir lieu par un mécanisme indirect mettant en jeu des éléments de réponse aux anti-oxydants dans les gènes concernés. Ainsi les ligands AhR induisent une réponse transcriptionnelle complexe qui peut simultanément provoquer des effets pathologiques et concourir à l'élimination des toxiques. Les inventeurs ont entrepris d'identifier de nouveaux ligands du récepteur AhR. Pour ce faire, ils ont transfecté de façon stable une lignée de cellules de cancer du sein, T-47D, avec un gène rapporteur (la trans- acétylase du chloramphénicol, ou CAT) placé sous le contrôle d'un élément de réponse à la dioxine ou DRE. La lignée T-47D est connue pour contenir un taux élevé de récepteur AhR (170 femtomoles/mg protéines). Une cinquantaine de molécules ont été sélectionnées sur la base de similitude structurale globale ou partielle avec la dioxine. Ces travaux ont montré la capacité de certains composés polyhydroxylés aromatiques à bloquer de manière spécifique la liaison des ligands AhR au récepteur AhR et l'induction consécutive des enzymes de phase I par lesquels les AhR exercent leurs effets nocifs. La plupart des composés ne se sont révélés ni agonistes, ni antagonistes de la dioxine. Ceux présentant une activité agoniste, exepté la quercétine, étaient en revanche dépourvus d'activité antagoniste. On mesurera donc l'intérêt des propriétés spécifiquement antagonistes des composés polyhydroxylés évoqués ci-dessus. Mettant à profit le mécanisme de compétition pour la liaison au récepteur AhR entre ces composés et les ligands AhR, l'invention a pour but de fournir des antagonistes de ce récepteur. Elle vise également les applications de ces composés polyhydroxylés, chez l'homme et l'animal, notamment dans les domaines thérapeutiques, alimentaires et, de manière générale, pour prévenir ou traiter les affections dues aux effets toxiques résultant d'une exposition aux ligands AhR. Les antagonistes des ligands du récepteur des arylhydrocarbures selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de stilbènes polyhydroxylés, monomères ou polymères, ou de leurs glycosides, ces composés étant sous forme racémique, ou d'isomères géométriques. L'étude de ces composés par les inventeurs a en effet montré qu'ils sont capables d'inhiber les effets transcriptionnels des ligands AhR par un mécanisme de compétition pour la liaison au récepteur AhR. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, lesdits stilbènes sont trihydroxylés, et en particulier sont constitués par les 3, 5, 4' trihydroxystilbènes ou resvératrols, et notamment par le trans-resvératrol. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits stilbènes sont tetrahydroxylés. Des composés avantageux comprennent le 3, 4, 3', 5- tétrahydroxystilbène ou picéatannol et le 2, 3', 4, 5'- tétrahydroxystilbène ou oxyresvératrol. Dans encore un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits stilbènes sont dihydroxylés et comprennent, avantageusement, les 4, 4' - dihydro- xystilbènes. Les glycosides des stilbènes polyhydroxylés sont avantageusement des glucosides, des galactosides, des lactosides, des mannosides, des fructosides ou des picéosides. Le résidu sucre est sous forme monomère ou polymère. Des travaux antérieurs avaient porté sur l'étude du rôle de polyphénols présents dans le vin, dont le resvératrol, dans divers processus pathologiques. Des activités anti-cyclooxygénase, antioxydantes et anticancéreuse ont été évoquées, mais n'ont pas permis de déboucher sur l'élaboration de formes galéniques permettant la mise au point de traitements efficaces. On mesurera alors l'originalité de l'invention basée sur la mise en évidence d'un mécanisme complètement nouveau pour ces dérivés, l'inhibition du récepteur AhR, et qui permet le développement d'applications dans de nombreux domaines. Ainsi, l'étude des antagonistes de l'invention a montré qu'ils sont capables d'inhiber ex vivo et in vivo l'induction de gènes par les ligands AhR et les pathologies qui lui sont liées. En particulier, ces antagonistes sont capables de bloquer l'induction des enzymes de phase I par les ligands et de manière générale de protéger contre des effets transcriptionnels pathologiques liés à l'exposition à ces substances nocives. L'invention vise donc leur utilisation pour la prévention et le traitement d'affections provoquées par l'exposition aux ligands AhR. A ce titre, l'invention vise des préparations pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un composé de stilbène tel que défini ci-dessus en une quantité thérapeutiquement efficace et permettant d'obtenir un effet antagoniste vis-à-vis du récepteur d'arylhydrocarbures, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. D'une manière avantageuse, les stilbènes polyhydroxylés utilisés comme antagonistes selon l'invention présentent une grande innocuité et ne donnent pas lieu à des effets secondaires nocifs. Les préparations pharmaceutiques à base de ces antagonistes sont utilisables dans diverses pathologies impliquant des ligands AhR, comme l'athérogénèse, l'immunosuppression, le cancer, les infections virales telles que le SIDA, les allergies et maladies dermatologiques associées à la dioxine et aux ligands AhR ainsi qu'à l'ostéoporose. Divers travaux ont montré le rôle joué par les ligands AhR dans ces pathologies. Ainsi, il a été démontré que, dans le système cardiovasculaire, les ligands AhR peuvent présenter des propriétés athérogènes par la perturbation des fonctions des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins. Les ligands AhR induisent CYPlA1/AHH dans les cellules endothéliales de porc avec une DEs0 (dose induisant 50% du phénomène) de 180 rinM pour le BaP et 0.015 nM pour la TCDD (17). La stimulation de ces enzymes de phase I provoque une augmentation de la production de ROS (13) capable de provoquer des lésions membranaires dans les cellules endothéliales et la peroxydation des lipides. Les LDL oxydées formées par ce mécanisme font l'objet d'une endocytose non régulée par un récepteur membranaire dédié qui conduit à une hyperaccumulation dans les cellules endothéliales et à la formation de cellules d'aspect "mousse" (18). Outre les ligands AhR, l'acide arachidonique et les eicosanoides vasoactifs sont aussi des substrats pour CYPlAl/AHH. I1 a été proposé que c'est entre autres par la perturbation du métabolisme de l'acide arachidonique que les ligands AhR pourraient être athérogènes (19). Dans (2), les auteurs ont aussi montré que les ligands AhR peuvent léser les cellules endothéliales et modifier leur perméabilité, ce qui pourrait conduire à une incorporation accrue de déchets des cholestérol- lipoprotéines dans la paroi artérielle conduisant à la formation d'athérome. Dans le cas des PCBs, cet effet n'est observé qu'avec les congénères qui lient AhR et induisent CYPlAl. De plus, ces mêmes PCBs augmentent le stress oxydatif et la peroxydation des lipides dans les cellules endothéliales en culture, phénomène qui a été corrélé dans le temps avec l'induction de CYPlAl et qui pourrait être le mécanisme des lésions cellulaires. On a également rapporté que les ligands AhR, comme la dioxine, sont de puissants immunosuppresseurs (6) et sont tumorigènes chez les rongeurs. A la suite de l'immunosuppression par les ligands AhR, on observe une diminution de la résistance aux agents infectieux (11). Les ligands AhR peuvent induire l'immunosuppression par de nombreux mécanismes: (20) à (28). Le rôle des ligands AhR dans l'immunosuppression est soutenu par la présence du récepteur AhR, de ARNT ainsi que du gène inductible CYPlAl/AHH dans les lymphocytes (23). Les ligands AhR sont également connus pour stimuler la réplication des virus (29). Il est généralement admis que l'activation des virus VIH-1 latents par les ligands AhR est un phénomène important dans la progression du syndrome humain d'immunodéficience acquise (SIDA) (29) et (10). Les ligands AhR activent l'expression du VIH-1 par l'induction de CYP lAl ainsi que par l'activation du facteur NF-kappa B (29) et (10). Les gènes de ces deux protéines contiennent des sites DRE médiant l'activation du gène par le récepteur AbhR, de même que le promoteur présent dans le LTR (long terminal repeat) du virus VIH. De plus, les deux voies de pénétration du VIH dans les lymphocytes, les protéines membranaires CXCR4 et CD4 contiennent aussi des DRE dans les promoteurs de leurs gènes (voir tableau 2 dans les exemples). Les ligands AhR sont également responsables d'allergies et de maladies dermatologiques. Les hydrocarbures et la dioxine présents dans la fumée d'échappement de moteur diesel augmentent la production d'IgE par les lymphocytes B (30), ce qui contribue au développement d'affections allergiques de la peau et des voies respiratoires. De plus, le gène de l'immunoglobuline E contient un DRE (tableau 2). La surproduction d'IgE est un trait caractéristique des phénomènes d'allergie. Les ligands AhR sont de puissants inducteurs de la chloracné. Dans tous les accidents industriels o ces composés ont été impliqués, (RFA, 1953; USA, 1964; Japon, 1968; Italie, 1976; Chine, 1977-79), la chloracné fut considérée comme le symptôme spécifique majeur de l'intoxication (7) et fut observée chez la majorité des personnes exposées. Cette éruption acnéiforme s'observe à la suite d'une altération des processus de différenciation des cellules basales des glandes sébacées et des kératinocytes (31). Ces cellules expriment des taux croissants du récepteur AhR durant leur différenciation (32). De plus, les ligands AhR eux-même augmentent la différenciation terminale des kératinocytes (31). Les ligands Ahr doivent alors induire des modifications cutanées spécifiques en activant le Il récepteur AhR, ce qui conduit à la modification de l'expression des gènes sensibles dans la peau. Enfin, de nombreuses données épidémiologiques montrent que le tabagisme est un facteur de risque de l'ostéoporose chez l'homme comme chez la femme (32) et (33). Ceci est confirmé par la relation proportionnelle quantitative qui existe entre le tabagisme et la diminution de la densité osseuse (34), 35 et (36) et par la corrélation entre tabagisme et risques de fractures (34), (37). Les ligands AhR présents dans le tabac pourraient exercer un effet négatif sur l'os de trois manières: 1) effet anti-estrogénique direct (voir (38) pour revue); 2)effet toxique direct sur l'os puisque le tissu osseux contient des récepteurs AhR (39); 3) effet toxique direct sur la fonction ovarienne: Les femmes qui fument font une ménopause plus précoce de 1 à 4 ans que que celle ne fumant pas. Des expériences sur animaux démontrent un effect toxique direct du benzo(a)pyrène et des autres ligands AhR sur les oocytes. De plus, la présence constante de sites DRE dans les gènes impliqués dans l'inflammation tels que IgE, cytokines, chemokines, leurs récepteurs ainsi que la NO synthase inductible, suggère un rôle du récepteur AhR et de ses ligands dans les pathologies inflammatoires provoquées par une production excessive d'IgE et/ou d'oxyde nitreux NO par les cellules mononucléaires infiltrées dans les tissus à la suite de la sécrétion de chemokines chimio-attractives par ces tissus. On peut citer par exemple les dermatites atopiques, l'arthrite rhumatoide, les maladies neurodégénératives (sclérose en plaque, sclérose amyotrophique), diabète, et avortements à répétition. La présence de DRE dans les gènes des chemokines et/ou de leurs récepteurs renforce le lien entre ligands AhR, inflammation et états fébriles. La fièvre est provoquée par l'interaction de pyrogènes bactériens ou viraux avec les cellules immunocompétentes conduisant à la sécrétion d'une cascade de cytokines. Les cytokines dont l'association avec les états fébriles a été démontrée sont le TNF-a, IL-l, IL-6, IL-8 et le Macrophage Inflammatory Peptide ( MIP-l). En outre, la fièvre périodique de la malaria semble être médiée par la sécrétion de TNF et de MIP-1 sous le contrôle de l'hémozoine. Le tableau 4 montre que les gènes codant pour les récepteurs de IL-l, IL-8 et RANTES/MIP-l contiennent tous des DRE dans leur régions promotrices. Les préparations pharmaceutiques de l'invention pourraient alors jouer un rôle modérateur au cours des fièvres induites par l'interaction de ces cytokines avec leurs récepteurs. En dernier lieu, la présence de sites DRE dans la séquence codante de la protéine PrP (ou prion de la maladie de Creutzfeld-Jacob) chez l'humain comme chez les bovins et dans le promoteur du gène de la préséniline (maladie d'Alzheimer) suggère que les ligands AhR puissent induire ou aggraver ces maladies neurodégénératives. En contrepartie, ces maladies pourraient être améliorées par administration de préparations pharmaceutiques selon l'invention. L'invention vise donc l'utilisation des préparations pharmaceutiques définies ci-dessus pour prévenir les troubles associés aux infections virales induites ou favorisées par les ligands AhR, comme le rhume ou la grippe, ou pour traiter les polyposes nasales, pour traiter l'activation des infections virales latentes par les ligands AhR, telle que le SIDA induit par VIH. L'invention vise également leur utilisation pour la prévention de l'encéphalite spongiforme causée par la protéine PrP (prion) chez l'humain et les bovins. L'invention vise encore l'utilisation de ces préparations pharmaceutiques pour la prévention de l'ostéoporose chez la femme à tous les âges de la vie et en particulier en post-ménopause et chez la femme âgée. Elle vise en outre leur utilisation pour le traitement des états inflammatoires causés par la production excessive d'oxyde nitreux et/ou d'IgE: notamment de dermatites atopiques, arthrite rhumatoide, ostéo-arthrite, les maladies neurodégénératives (sclérose en plaques, sclérose amyotrophique) et diabète. L'invention est également appropriée pour le traitement de dermatites, acné, lésions d'hyperkératose, eczéma, ainsi que pour le vieillissement de la peau et les rides. L'utilisation desdites préparations pharmaceutiques pour réduire les états fébriles associés aux maladies infectieuses, virales et parasitaires entre également dans le champ de l'invention. De même l'invention concerne l'utilisation de ces préparations pharmaceutiques pour le traitement des pathologies gynécologiques et endocriniennes telles que l'endométriose, les fibromes (léiomyomes), la pré- éclampsie et les avortements à répétition. L'invention a également pour objet l'utilisation desdites préparations pharmaceutiques pour la prévention et le traitement de la maladie d'Alzheimer. Selon un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des antagonistes définis ci-dessus pour la préparation de médicaments pour les indications thérapeutiques évoquées plus haut. Dans les diverses applications thérapeutiques évoquées ci- dessus, lesdites préparations pharmaceutiques se présentent sous des formes appropriées pour l'administration par voie orale, telles que gouttes, gélules, sirop, sirop alcoolique, par voie nasale, telle que spray ou gouttes, par voie parentérale, dans un solvant approprié, ou encore par voie topique, telle que crème, pommade, shampooing ou lotion, les véhicules pharmaceutiquement acceptables étant à base d'huiles admises à la pharmacopée ou d'éthanol (de 10 % à 100 %). On peut également avoir recours à une préparation lipidique telle que Intralipid R La posologie dans les différentes formes et pour l'application quotidienne, sera établie, de manière classique, selon le type d'effets à traiter. A titre d'exemple, on administrera les préparations à base desdits antagonistes à raison de 0,1 mg à 5 g/jour, notamment de 20 mg à 200 mg/jour, en particulier de 10 à 100 mg/jour. Les effets inhibiteurs desdits stilbènes vis-à-vis des ligands AhR sont également avantageusement mis à profit en diététique. L'invention vise également l'utilisation des antagonistes définis ci-dessus comme additifs alimentaires. Elle vise ainsi des aliments caractérisés en ce qu'ils renferment au moins un antagoniste tel que défini ci-dessus en une quantité lui permettant d'exercer un effet inhibiteur vis-à-vis de ligands AhR, de manière à prévenir leurs effets nocifs. Ces aliments sont destinés à l'adulte ou à l'enfant. Ces additifs sont incorporés dans l'alimentation, par exemple dans le lait en poudre, les préparations liquides ou solides (céréales) ou les aliments en conserve. L'incorporation peut être réalisée durant l'élaboration des aliments ou lors de leur conditionnement, ou en utilisant des préparations avec les antagonistes déjà formulées, permettant d'effectuer la supplémentation désirée. Les antagonistes utilisés selon l'invention sont particulièrement appropriés pour une supplémentation diététique de l'alimentation des enfants en bas âge nouveaux nés, nourrissons et très jeunes enfants. La dose utilisée sera réduite par rapport à celle retenue pour un adulte, en tenant compte du poids de l'enfant et de son alimentation, de manière à obtenir une concentration plasmatique efficace (de l'ordre du micromolaire). Les antagonistes de l'invention présentent également un grand intérêt pour lutter contre les effets du tabagisme, qui correspond à une exposition chronique aux ligands AhR. Les ligands AhR sont présents dans la fumée de cigarette, en particulier des polychloro-dibenzo-p-dioxines (PCDD), dont la dioxine (TCDD), et des PAHs, dont le benzo(a)pyrène (BaP). La somme de tous ces produits est équivalente à 4,3 pg/kg de poids corporel pour 20 cigarettes par jour. Chez le grand fumeur, la charge peut aller jusqu'à 0,05 mg/kg. Tous ces composés présents dans la fumée de cigarette sont capables d'induire l'expression de CYPlA1/AHH dans les poumons (4), le placenta, les reins (41), les ovaires et les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins. L'induction de CYPlA1/AHH et des autres enzymes de la phase I conduit à la production de ROS qui provoquent des lésions oxydatives sur l'ADN (43). La métabolisation des hydrocarbures polyaromatiques par CYP1Al/AHH résulte en outre en la production d'intermédiaires carcinogènes très réactifs (43) qui se lient à l'ADN pour former des adducts covalents. Le tabagisme a été mis en cause directement dans l'occurrence d'au moins huit types différents de cancers humains dans le poumon, la vessie, le tractus intestinal, et les lymphocytes (pour revue, voir (44)). Les ligands AhR ont été impliqués dans la génèse du cancer du poumon, par l'identification d'un polymorphisme génétique de CYPlAl. En outre, le tabagisme est une cause directe de 1' ischémie cardiaque, la principale cause de mortalité dans le monde occidental (44). Il existe aussi des données épidémiologiques qui relient le tabagisme à l'accélération du SIDA (10) ainsi qu'à l'ostéoporose (33), (34), (35). On met à profit les propriétés avantageuses des antagonistes de l'invention en les utilisant pour imprégner les filtres de cigarette, afin de délivrer une dose d'antagoniste proportionnelle à la concentration de toxiques absorbée avec la fumée, et conduisant à une concentration sanguine permettant de bloquer l'induction de CYDPlAl et des autres enzymes de phase I. Les stilbènes polyhydroxylés utilisés selon l'invention sont obtenus par extraction à partir de végétaux, notamment en ce qui concerne les glycosides, ou par voie de synthèse. Les isomères géométriques, lorsqu'ils existent sont séparés selon les techniques classiques. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent qui se rapportent, à titre illustratif, au trans-resvératrol, qui sera appelé Resvératrol. Dans ces exemples, les figures 1 à 6 représentent: - les figures 1A et lB, les courbes d'induction (nombre de fois) d'un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un élément de réponse à la dioxine, transfecté dans la lignée T-47 D, en fonction de la concentration en TCDD, en présence de TCDD seule ou de TCDD+ Resvératrol (1A), et d'inhibition de l'' induction par TCDD (en %) de ce gène en fonction de la concentration en Resvératrol, (lB), - la figure 2, l'inhibition par le Resvératrol de l'induction de CYplA1 par TCDD dans les cellules T-47D, - la figure 3, les courbes de compétition de liaison au récepteur AhR entre TCDD, cNF, le Resvératrol, l'indole-3- carbinol, dans le cytosol de foie de lapin, - la figure 4, l'activité estrogénique de l'oestradiol comparé à celle du Resvératrol, à différentes concentrations, sur un gène rapporteur oestrogéno-dépendant transfecté de façon transitoire dans les cellules T-47D, - la figure 5, la régulation de l'activité NAD(P)H quinone réductase par TCDD et ses antagonistes dans les cellules T-47D, et - la figure 6, la répression de l'induction du promoteur du LTR de VIH (VIH-LTR-CAT) par TCDD dans les cellules T-47D. Inhibition de l'induction de la transcription des enzymes de phase I par les ligands AhR. On transfecte de manière stable la lignée T-47D de cellules de cancer du sein avec un gène rapporteur, la trans-acétylase du chloramphénicol, CAT en abrégé, placé sous le contrôle d'un élément de réponse à la dioxine. On rapporte sur la figure 1A, en fonction de la concentration en TCDD (-log M) (nombre de fois), l'induction de CAT en présence de TCDD seule (courbe) et de TCDD avec 10- M de Resvératrol (courbe P). L'examen des résultats obtenus montre l'effet inhibiteur de Resvératrol vis-à-vis de l'induction de la transcription des enzymes de phase I par TCDD. La figure lB donne l'inhibition par le Resvératrol de l'induction en % de CAT en fonction de la concentration en TCDD (-log M). On constate que l'inhibition observée est dose-dépendante. Inhibition de l'induction de la protéine CyplAl par la dioxine. On mesure l'expression de la protéine CYPlAl in vivo en réponse à une concentration efficace de TCDD (10 0 M), en présence ou en l'absence de Resvératrol. Les cellules T-47D sont cultivées dans le DMEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal et traitées 48h par l'éthanol seul (témoin), 10- M dioxine (TCDD), -6 M Resvératrol (ResV), une combinaison de dioxine et Resvératrol (TCDD + ResV), 10-6 M a-naphthoflavone ( le kit Renaissance (DuPont). La figure 2 correspond à la photo du Western blot. La flèche montre la bande spécifique de CyplA1, les astérisques signalent des bandes non-spécifiques. On observe que le Resvératrol à une concentration de 10-6 M inhibe l'induction de la protéine CYPlAl d'environ 60%. L'effet inhibiteur du Resvératrol est légèrement inférieur à celui de l'antagoniste classique de la dioxine, l'alpha-7,8-benzoflavone (ou anaphthoflavone; aCNF). En revanche, ce dernier composé, à la différence duResvératrol, présente des effets agonistes autant qu'antagonistes à la concentration de 10 M alors que le resvératrol est un pur antagoniste. Ces résultats confirment que le Resvératrol est capable de bloquer l'induction de gènes sensibles aux ligands AhR, tels que CYP1Al/AHH et les autres enzymes de phase I. Etude de l'activité antagoniste du Resvératrol On a mesuré la capacité du Resvératrol de déplacer la dioxine radioactive (dioxine [2,6, di3H], 28 Ci/mmole, Terrachem, Kansas, USA) de son récepteur en comparaison avec d'autres ligands tels que l'a-NF ou l'indole-3- carbinol. On a utilisé un cytosol de foie de lapin pour ces études de compétition, car le lapin possède un récepteur AhR dont l'affinité est identique à celle du récepteur humain, à la différence du récepteur de souris. On rapporte sur la figure 3 le % de liaison spécifique au récepteur AhR en fonction de la concentration (M) en dioxine marquée au tritium ( J), en présence de concentrations croissantes de a- naphtoflavone (o), de Resvératrol (), et d'indole-3- carbinol (13 C). On observe que dans ce modèle, la dioxine et l' a- NF déplacent la dioxine marquée de son récepteur avec un Kd apparent de 3.10-9 M. Le Resvératrol déplace aussi la dioxine, bien qu'avec une affinité plus faible (6.10 6M). Le Resvératrol montre une affinité plus forte que l'autre ligand naturel, l'indole-3-carbinol. Ces résultats démontrent que le Resvératrol exerce ses effets antagonistes par compétition pour le récepteur AhR. Etude d'effets de type stéroïdien On a transfecté de façon transitoire les cellules T-47D avec différentes constructions CAT sous contrôle de l'élément de réponse à l'estradiol (ERE) du gène de la vitellogénine ou celui, plus faible, du gène du récepteur de la progestérone, ainsi que des éléments de réponse à la progestérone (PRE) et aux androgènes (ARE) du virus murin MMTV et d'un élément de réponse à la vitamine D (VDRE) synthétique. La figure 4 donne l'induction de CAT pour l'oestradiol (E2) 10- M, le Resvératrol (ResV) 10-7 M, x 107 M, 106 M, 5 x 10-6 M, 10-5 Met 5 x 10'5 M. Le Resvératrol n'a exercé aucun effet sur les PRE, ARE ou VDRE. Le Resvératrol a présenté un faible effet estrogénique sur 1'ERE du gène de la vitellogénine, équivalent à 1/500.000 ème de l'effet de l'estradiol. La courbe dose-réponse montre qu'on observe à partir de 10- 5 M de Resvératrol un effet équivalent au 1/5ème de celui de 10-l1 M d'estradiol. Cette concentration d'estradiol est celle retrouvée dans le sang des humains de sexe masculin. Régulation de l'activité NAD(P)H quinone réductase par la dioxine et ses antagonistes dans les cellules T-47D. Les cellules T-47D ont été cultivées pendant 72 h en l'absence (ctl) ou en présence de dioxine 10-9 M (TCDD), Resvératrol 10- M (Res), x-naphthoflavone 10-6 M ( NF), isolément ou selon les combinaisons indiquées. L'activité NQOR correspondante exprimée en nanomoles de cytochrome c réduit, par mg de protéines, par min, est donnée sur la figure 5. Il est intéressant de noter que ni le Resvératrol ni l'a-NF ne répriment l'induction indirecte des enzymes de phase II provoquée par la dioxine ou la NAD(P)H quinone réductase. Cet effet bénéfique est ainsi conservé. Des résultats similaires sont obtenus pour la GST- Ya. Etude de l'inhibition par le Resvératrol de l'induction d'autres gènes par les ligands AbhR. On a recherché, dans les banques de données EMBL et GENBANK, les gènes humains contenant des DRE dans leurs régions promotrices, en utilisant les consensus T/GNGCGTG dans les deux orientations possibles. En dehors des gènes des enzymes de phase I, on a découvert une population restreinte de gènes contenant un ou plusieurs DRE et donc susceptibles d'être régulés par les ligands AhR et le Resvératrol. Ces gènes sont présentés dans les tableaux 1, 2 et 3 en fonction de leur association à des mécanismes physiologiques ou des états pathologiques distincts. Le tableau 1 montre les gènes impliqués dans les régulations hormonales, le métabolisme des lipides, les maladies génétiques ou dégénératives, les cancers. Le tableau 2 montre les gènes des cytokines et de leurs récepteurs qui sont impliqués dans le chimiotactisme et l'inflammation. Le tableau 3 montre les virus et certaines protéines cellulaires qui interagissent avec eux. 2778337 Tableau I GENES Numéro d' SITES LOCALISATION COMMENTAJIRE ACCESSION (Nbre) Recepteur des U10430 8 promoteur Glucocorticoides Enzvmes NOS inductible X97821 4 promoteur NOS endothéliale U24214 1 promoteur Cyclooxygénase 2 U20548 1 promoteur PG H Synthase U44805 1 promoteur PG endoperoxide synthase M31812 1 promoteur -Lipoxygénase M38191 5 promoteur, cds -lipoxygénase U63384 1 promoteur Phospholipase A2 Ul 1239 2 promoteur Thromboxane A2 recepteur D15054 1 promoteur I Recepteurs PDGF chaine A U40769 2 promoteur IGF-1 recepteur M69229 6 promoteur VEGF recepteur D64016 2 promoteur Gènes impliqués en pathologie humaine Protéine APC U02509 2 promoteur, cds polypes du colon Protéine APC D13981 1 exon spécifique du supplémentaire cerveau Protéine APC D13980 1 5' UTR multiple variants Prion Humain D00015 2 cds [Prion bovin] D26150 1 intron 1 gène bovin Ob (leptine) U43589 2 promoteur obésité préséniline L76518 1 promoteur Alzheimer GADD pl 53 S40707 2 promoteur lésions de l'ADN Oncogènes WT lb S77896 1 promoteur Tumeurs de Wilm WNT-SA U39837 3 promoteur PCNA J05614 1 promoteur p53 J04238 17 complete gene apoptose et cycle cellulaire p53 3J04238 1 promoteur c-Ha-Ras M13221 1 promoteur c-jun U60581 3 promoteur c-myc p64 M13930 4 promoteur c-raf M38134 2 promoteur ATF 3 U37542 2 promoteur Tableau 1: Gènes humains contenant des DRE dans leur séquences régulatrices. Le gène du Prion bovin est aussi mentionné. Cds: séquence codante. UTR: région non traduite. 26 2778337 Tableau 2 GENES Numéro d' LOCALISATION SITES COMMNIENTAIRE ACCESSION (Nbre) Interleukines, Chemokines TNF E01052 cds 1 IL 7 MN129048 promoteur 1 IL 10 X73536 promoteur 1 IL 1-RA U65590 gene (introns) 4 RANTES S64885 promoteur I LIGHT AF03581 cds 1 tnf-like LIT AF033854 cds 1 CD40 ligand D31793 promoteur 1 gp39 tnf-like SCM 1 alpha D63790 cds 2 MDC U83171 cds 1 Eotaxine U46572 cds 1 chemokine STCP-1 U82992 cds 2 T- cell chemokine Netrine-2 like U86758 cds 16 Récepteurs IL-1 récepteur 1 AF054830 cds 1 [ IL-1 récepteur 2 X59770 cds 1 IL-2 récepteur a U57613 promoteur 3 IL-2 récepteur b X53093 promoteur 1 IL-8 récepteur a U11870 promoteur 3 IL-8 récepteur b U11866 promoteur 1 IL 10 récepteur U00672 cds 1 CXCR4 AF005058 promoteur, cds 9 HIV co-récepteur DARC Y14873 5'UTR 3 CCR6 U45984 cds 1 TNF récepteur p75/80 U53483, promoteur, 6 S63368 cds RANTES/MIIP 1 récepteur L 10918 cds 2 DR3 AF026070 cds 1 tnf-like récepteur decoy récepteur 2 AF029761 5'UTR I tnf-like récepteur interferon y récepteur 2 U68755 promoteur 3 VEGF récepteur D64016 promoteur 2 Protéines d'Adhésion connexine 32 L47127 5'UTR 1 connexine43 U64573 promoteur,cds 3 ICAM (CD54) M65001 promoteur, cds 4 Gènes en relation. Ig E M55420 cds 2 région variable IgE S71428 cds 4 isoforme CD23 p45 X06049 promoteur 1 IgE récepteur NF-IL3 S79880 cds 1 NF Kappa B p65 L01459 promoteur 2 NFKappa B p50 S57113 promoteur 1 I kappa B alpha U08468 promoteur 2 RANKL AF0190047 cds 1 Tableau 2: Gènes associés au chimiotactisme et à l'inflammation et contenant des DRE dans leur régions régulatrices. Cds: séquence codante. UTR: région non traduite. 27 2778337 Tableau 3 VIRUS HUMAINS Numéro d' LOCALISATION SITES COMNENTAIRE et seènes associes ACCESSION (Nbre) Cvtomegalovirus IE- N1 M64941 promoteur 1 HTLV- 1 S76263 5 'LTR HTLV-I S76263 gêne TAX HTLV-4 X06392 5'LTR 2 HIV 1 isolat BRU (LAV- K02013 3' LTR 1 présent dans tous les 1) isolats HIV 2 U22047 génome 2 HIV2 EHO U27200 génome 1 CD4 U01066 promoteur 1 HIV récepteur CD4 S79267 cds 2 HIV récepteur CXCR4 AF005058 promoteur, cds 9 HIV co-récepteur Papilloma Virus (HIPV) X52061 génome Icr 1 "long control region" HPV 11 J04351 génome 2 HPV 16 M33616 génome 1 région 3' 1-IPV 25 D50264 promoteur 1 gène E6 -HPV 33, 47, 58 59 génome Poliovirus 1 X70509 5'UTR 1 Rhinovirus lB D00239 génome 2 Rhinovirus 2. 14, 89 génome Herpes virus HSV1 U18080 génome I1 IE transactivateur Herpes virus HSV1 M13885 génome 1 segment "a" Hepatite A virus K02990 génome 1 Hepatite B virus X98077 génome 1 Hepatite C virus D30613 génome 4 Adenovirus type 2 J01917 génome 21 Adenovirus type 12 J01910 génome 1 TR droit Adenovirus type 12 X14757 promoteur 1 gène E1A Adenovirus type 19A X95259 early region 3 1 protéine liant les complexes HLA Adenovirus type 41 M18289 génome I E1A gene Virus svncitial respiratoireM 17212 cds 1 protéine d'ancrage Influenza virus, génome: sites Protéines M1, M2 tous sous-types. multiple dans matrix, divers gènes hémagglutinine, neuraminidase, I___|ARN polymerase Tableau 3: Génomes viraux ou gênes contenant des DRE's. UTR: région non traduite. LTR: longue région répétée terminale. IE: gènes d'expression immédiate précoce. Cds: séquence codante. TR: séquence répétée terminale Pour tester cette hypothèse, selon laquelle les gènes possédant des DRE dans leur promoteur seraient généralement sensibles aux ligands AhR et que cet effet pourrait être inhibé par le Resvératrol, on a choisi comme modèle représentatif le promoteur de la séquence répétée (LTR) de VIH-1, qui contient un DRE typique. On a transfecté les cellules T-47D avec une construction CAT contenant ce promoteur (-452/+77). Les cellules ont ensuite été traitées par la dioxine (109 M) ou le Resvératrol (106 M), seuls ou en association (p = 0,01). La dioxine a induit le promoteur de VIH par un facteur de 3 et cette induction a été totalement supprimée par le Resvératrol. Ces résultats démontrent donc que des concentrations de Resvératrol, de l'ordre de celles utilisables en thérapeutique humaine, sont capables de bloquer l'induction des enzymes de phase I et du promoteur du VIH par les ligands AhR. De la même manière, le Resvératrol s'avère capable de protéger contre d'autres effets transcriptionels pathologiques liés à l'exposition à ces substances nocives. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1/ Bock, K. W. (1994). Aryl hydrocarbon or dioxin receptor: biologic and toxic responses. Rev Physiol Biochem Pharmacol 125, 1-42. 2/ Toborek, M., Barger, S. W., Mattson, M. P., Espandiari, P., Robertson, L. W., and Hennig, B. (1995). Exposure to polychlorinated biphenyls causes endothelial cell dysfunction. J Biochem Toxicol 10, 219-226. 3/ Kleman M, Gustafsson J-A. (1996). Interactions of procarcinogenic heterocyclic amines and indolocarbazoles with the dioxin receptor. Biol Chem 377:741-762. 4/ Bartsch, H., Petruzzelli, S., De Flora, S., Hietanen, E., Camus, A. 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REVENDICATIONS 1/ Antagonistes de ligands du récepteur d'arylhydrocarbures, caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de stilbènes polyhydroxylés, monomères ou polymères ou des glycosides correspondants, ces composés étant sous forme racémique, ou d'isomères géométriques. 2/ Antagonistes selon la revendications 1, caractérisés en ce que lesdits stilbènes sont trihydroxylés, et en particulier sont constitués par les 3, 5, 4'- trihydroxystilbène cis et trans ou resvératrols, et notamment par le trans resvératrol. 3/ Antagonistes selon la revendication 1, caractérisés en ce que lesdits stilbènes sont tétrahydroxylés et en particulier comprennent les 3, 4, 3', 5-tétrahydroxystilbènes ou picéatannols, et les 2, 3', 4, 5'-tétrahydroxystilbènes ou oxyresvératrols. 4/ Antagonistes selon la revendication 1, caractérisés en ce que lesdits stilbènes sont dihydroxylés et comprennent les 4, 4'-dihydroxystilbènes. / Antagonistes selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisés en ce que lesdits glycosides sont des glucosides, des galactosides, des mannosides. 6/ Utilisation des antagonistes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la prévention ou le traitement d'affections provoquées par l'exposition à des ligands arylhydrocarbures. 7/ Préparations pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 5, en une quantité thérapeutiquement efficace et permettant d'obtenir un effet antagoniste vis-à-vis de ligands du récepteur d'arylhydrocarbures, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous une forme pour l'administration par voie orale, nasale, parentérale ou topique. 9/ Préparations pharmaceutiques selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de gélule, gouttes, sirop, sirop alcoolique, pour une administration par voie orale, de spray ou gouttes pour une administration par voie nasale, de solution pour une administration par voie parentérale et de crème, pommade, ou shampooing ou de lotion pour une application par voie topique, le véhicule comprenant une huile ou un alcool pharmaceutiquement acceptable. / Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisées en ce qu'elles sont administrées à raison de 0,1 mg à 5 g/jour, notamment de 20 à 200 mg/jour, et en particulier de 10 à mg/jour. 11/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées comme médicaments anti-viraux, pour prévenir les troubles associés aux infections virales induites ou favorisées par les ligands AbhR, comme le rhume ou la grippe, ou pour traiter les polyposes nasales, pour traiter l'activation des infections virales latentes par les ligands AhR, telle que le SIDA induit par VIH. 12/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la prévention de l'encéphalite spongiforme causée par la protéine PrP (prion) chez l'humain et les bovins. 13/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour la prévention de l'ostéoporose chez la femme à tous les âges de la vie et en particulier en post-ménopause et chez la femme âgée. 14/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour le traitement des états inflammatoires causés par la production excessive d'oxyde nitreux et/ou d'IgE, notamment de dermatites atopiques, arthrite rhumatoide, ostéo- arthrite, les maladies neurodégénératives (sclérose en plaques, sclérose amyotrophique) et diabète. / Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour réduire les états fébriles associés aux maladies infectieuses, virales et parasitaires. 16/ Preparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 pour le traitement des pathologies gynécologiques et endocriniennes telles que l'endométriose, les fibromes (léiomyomes), la pré- éclampsie et les avortements à répétition. 17/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, pour la prévention et le traitement de la maladie d'Alzheimer. 18/ Préparations pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 pour le traitement des dermatites, acné, lésions d'hyperkératose, eczéma, ainsi que le vieillissement de la peau et des rides. 19/ Utilisation des antagonistes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation de médicaments destinés aux indications thérapeutiques visées dans l'une quelconque des revendications 11 à 18. / Utilisation des antagonistes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comme additifs alimentaires, en particulier pour supplémenter la nourriture des nouveaux nés, nourrissons et très jeunes enfants, dans laquelle les antagonistes sont mis en oeuvre en une quantité leur permettant d'exercer un effet inhibiteur vis-à-vis de ligands AhR, de manière à prévenir les effets nocifs de ces ligands. 21/ Utilisation des antagonistes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour imprégner les filtres de cigarettes, afin de délivrer une dose d'antagoniste proportionnelle à la concentration de toxiques absorbée avec la fumée, et conduisant à une concentration sanguine permettant de bloquer l'induction de CYPlA1 et des autres enzymes de phase I.