Brevet FR2782007A1 — publié le 20000211

La présente invention a pour objet l'utilisation des calix(n)arènes pour le traitement des maladies fibrotiques. Les tissus conjonctifs (os, cartilage, peau, tendon etc...) sont essentiels à l'intégrité structurale des vertébrés, les molécules de la matrice extracellulaire assurant le soutien des tissus et organes. La matrice extracellulaire a de nombreuses implications en pathologie incluant plusieurs maladies fibrosantes du foie, du rein, du poumon et de la peau où son dépôt excessif et ectopique entraîne les phénomènes de cicatrisation, et/ou nécrose et des dysfonctionnements organiques. Les composants macromoléculaires de la matrice extracellulaire comprennent les collagènes, les protéoglycanes, l'élastine, d'autres glycoprotéines structurales, des enzymes extracellulaires et des facteurs de croissance, la plupart d'entre eux interagissant avec une grande diversité de récepteurs de la surface cellulaire. L'assemblage des collagènes et de l'élastine en fibres insolubles, responsables de l'intégrité structurale des tissus conjonctifs est stabilisé par la formation de liens covalents intra- et inter-moléculaires. La formation de ces liens covalents est assurée par l'action d'une enzyme extracellulaire, la lysyloxydase et par une glycosylation non enzymatique. La réticulation initiée par la lysyl oxydase est un facteur essentiel dans les pathologies fibrosantes du foie (Konishi et al., (1985) Gastroenterol. 89, 709-715; Wakasaki et Ooshima, 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun., 166,1201-1204, Murawaki et al., 1991, Hepatology 14,1167- 1173 ; Sommer et al., 1993 Lab. Invest. 69,460-470, Ricard-Blum et al., 1993 Cell. Mol. Biol 39,723-727 ) de la peau (Ricard-Blum et al 1996 Gastroenterol.111, 172-182), du poumon (Counts et al., 1981 Pharmacol. Exp. Therap.219, 675-678 ; Hameleinen et al., 1995, 270,21590-21593 ) et toutes les autres formes de fibrose (Ma et al., (1995) J. Oral Pathol. Med. 24, 407-412 ). Elle joue également un rôle important dans la réaction stromale et intervient de ce fait dans l'invasion tumorale (Peyrol et al., 1997 Amer. J. Pathol. 150, 497-507 ). La lysyl oxydase est sécrétée dans la matrice extracellulaire sous forme d'un précurseur de 50 Kda et transformée en protéine mature de 30 kDa par coupure enzymatique de la partie N-terminale du pro-peptide . Quatre variants de l'enzyme ont été décrits. Cette enzyme a été isolée et caractérisée à partir de divers tissus conjonctifs (Kagan, Biology of extracellular matrix, 321-398 1986 ; et Trackman, Am. J. respir. Cell. Mol. Biol, 5, 206- 210, 1991). Des inhibiteurs spécifiques de la lysyl oxydase ont été décrits tels que le 3 amino-propionitrile ((3APN; K,= 6 m) (Kagan, 1994 précédemment cité). Malheureusement, l'utilisation du ssAPN dans le traitement des maladies fibrosantes est exclue en raison de sa toxicité . Diverses diamines ont aussi été décrites comme inhibiteurs de la lysyl oxydase (Gacheru et al. J. Biol. Chem. 264, 12963-12969 (1989)). Les calix(n)arènes sont une catégorie d'oligophénols cycliques provenant de la réaction entre des phénols para-substitués et des formaldéhydes en présence d'une base. Ils ont récemment été décrits comme pouvant être utilisés pour le traitement des thromboses, et comme agents antiviraux. Ainsi, le brevet US 5 409 959 décrit une méthode de traitement de la thrombose consistant à administrer par la voie intra-veineuse ou subcutanée ou par inhalation une quantité efficace de calix(n)arènes. Le brevet US 5 441 983 quant à lui décrit l'administration de calix(n)arènes pour traiter des infections dues à des virus à enveloppe tels que les virus de l'herpès ,VSH-1 ou VSH-2. L'administration par injection et l'administration topique de ces composés sont décrites. Les inventeurs ont montré qu'il était possible de traiter les maladies fibrotiques par des calix(n)arènes. La présente invention est donc relative à l'utilisation des calix(n)arènes pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies fibrotiques. On entend par maladie fibrotique selon la présente invention, toute pathologie des tissus fibreux générant une fibrose, et en particulier des pathologies aboutissant à une dégénérescence des tissus fibreux. De telles pathologies peuvent être: * les fibroses aiguës dues à des traumas: # cicatrisation suite à des opérations chirurgicales (de l'abdomen, des yeux, des mains, de la colonne vertébrale, ainsi qu'arthroplastie et angioplastie), # infections (fibrose pulmonaire) # blessures (mains) # brûlures (cicatrisation hypertrophique) # traitements par radiations ionisantes et chimiothérapie # traitements avec les lasers (cornée) *les fibroses chroniques des organes majeurs: # foie # poumons # reins # coeur # peau *d'autres maladies fibro-prolifératives: # sclérodermie # pathologies chéloïdes # athérosclérose La présente invention est particulièrement destinée au traitement topique de la peau, notamment la cicatrisation de la peau. Préférentiellement, les calix(n)arènes sont choisis pour leur capacité à inhiber substantiellement l'activité lysyl oxydase. De manière avantageuse, ces molécules présentent une concentration inhibant à 50% l'activité lysyloxydase (IC50) inférieure à 100 mM et préférentiellement inférieure à 10 mM. Les calix(n)arènes particulièrement adaptés au traitement des maladies fibrotiques, sont ceux présentant la formule 1 suivante: dans laquelle: - R1 représente un groupe alkyle, alkylamide, acyle, aryle, carboxyle, sulfonyle ou phosphonyle, éventuellement substitué - R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe acyle, ou un groupe amide, éventuellement substitué, - n est un nombre entier compris entre 4 et 8, et leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables. Les groupes alkyle et acyle sont préférentiellement des groupes en C1 à C10, encore plus préférentiellement en C2 à C6, éventuellement substitués. Préférentiellement, le groupe aryle est un groupe en C5 à C20 , encore plus préférentiellement en C5 à C10. Il est avantageusement un groupe phényle, biphényle, ou phényle substitué par un groupe carbohydrate. Un tel carbohydrate peut être un résidu glycosyle, maltosyle, mannosyle ou galactosyle. Avantageusement les groupes phényles sont substitués en position para. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention, le groupe R1 représente un groupe S03H, éventuellement sous forme de sel. De manière préférentielle, n est égal à 6. Un composé pouvant être utilisé de manière particulièrement avantageuse pour traiter les maladies fibrotiques est celui dans lequel n est égal à 6, R1 représente un groupe S03H et R2 un atome d'hydrogène. Préférentiellement, les calix(n)arènes sont mis sous la forme de sels de lithium, de sodium, de potassium, de rubidium ou de césium. Les composés répondant à la formule générale 1 peuvent être fabriqués comme décrits par ARENA et al.(1992, Supramolecular Chemistry 1,19-24) par réaction de phénols substitués en position para par le groupe R1 d'un aldéhyde en présence d'une base, suivie d'une terbutylation et d'une substitution électrophile en présence de H2S04. Certains de ces composés sont commercialisés. En particulier, le calix(6)arène dans lequel n est égal à 6, R1 représente S03H et R2 un atome d'hydrogène , qui constitue un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention est commercialisé par la Société ACROS (Geel West - Belgique) sous la référence 29 026-0010. Les voies d'administration de ces composés dépendent des pathologies à traiter. Ces modes d'administrations sont déterminés par l'homme du métier. Une méthode de traitement des maladies fibrotiques comprend en substance une étape d'administration au sujet à traiter d'une dose thérapeutiquement efficace d'un ou plusieurs calix-n-arènes. Cette administration peut être effectuée de manière topique s'il s'agit par exemple d'une maladie de peau. Elle peut être néanmoins effectuée de toute manière connue de l'homme du métier, et notamment par injection, de manière sous-cutanée, ou par inhalation. Les doses de calix(n)arènes administrées aux patients sont à évaluer en fonction de la pathologie à traiter, et de divers autres paramètres connus de l'homme du métier, tel que le poids du patient. A titre indicatif, le traitement de maladies fibrotiques cutanées est effectué par application d'une dose comprise entre 1 g et 1g de calix(n)arènes, dans un véhicule approprié. Un avantage particulier des calix(n)arènes est leur faible toxicité par rapport aux inhibiteurs connus de la lysyl-oxydase. La présente invention est en outre relative à un procédé d'inhibition de l'activité lysyl oxydase comprenant la mise en contact de la lysyl oxydase et d'un calix(n)arène. Elle a aussi pour objet un procédé d'utilisation des calix(n)arènes pour inhiber l'activité lysyl oxydase. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par l'exemple qui suit. La figure illustre l'inhibition de l'activité de la lysyl-oxydase par un calix (6) arène selon l'invention ( n = 6; R2 = H; R1 = S03Na). EXEMPLE : Inhibition de la Ivsvl oxydase par un calix(6) arène selon l'invention (n = 6, R2 = H: Ri = SO3Na). Matériels et méthodes. 1. Purification partielle de la lysyl-oxydase d'aorte bovine Ce protocole est inspiré de celui de (WILLIAMS et KAGAN, Anal. Biochem. 149,430-437, 1985), et de (KAGAN et al. Biochem. J. 177,203- 214 (1979)), qui a été sensiblement modifié. Toutes les étapes sont effectuées à 4 C ou dans la glace. De l'aorte bovine foetale broyée est rincée par du tampon NaCI 0,12M, NaPi 16 mM, pH 7,7 puis par du NaPi 16 mM, pH 7,7 (tampon PB). La lysyl oxydase est extraite du résidu par de l'urée 4 M (concentration finale dans le tampon PB). Le surnageant obtenu après centrifugation à 10. 000 g pendant 30 minutes est dilué deux fois dans du PB puis incubé avec de la DEAE-cellulose pendant 3 heures. La résine est mise en colonne et rincée successivement par du tampon PB contenant de l'urée 2M , du tampon PB puis du tampon PB contenant du NaCI 0,4 M. La lysyl oxydase est éluée à partir de la DEAE-cellulose par de l'urée 6M dans du tampon PB. Les fractions présentant une absorbance à 280 nm sont réunies et dialysées pendant une nuit contre du tampon PB en présence de gel de Bleu de Cibacron (Biorad). Le gel est ensuite mis en colonne, et après des rinçages successifs par du tampon PB, du tampon PB-NaCI 1 M et à nouveau du tampon PB, la lysyl oxydase est éluée du gel de Bleu de Cibacron par de l'urée 6 M dans du tampon PB. L'éluat, appelé EB1 est centrifugé pour éliminer les agrégats, filtré (0,45 m) puis concentré par ultrafiltration avec une membrane ayant un seuil de 10. 000 Da. Cette fraction concentrée (1,7 mg/ml de protéines) est diluée dans différents milieux pour le dosage de l'activité. 2) Dosage de l'activité de la lysyl-oxydase Le dosage a été effectué comme décrit par CRONSHAW et al. (Matrix 13, 255-266, 1993) et SHACKLETON et HULMES (Anal Biochem., 185, 359-362,1990), d'une manière sensiblement modifiée. 100 l de 3H élastine suspendus dans un tampon de dosage (0,1 M Na2B407, 0,15 M NaCI, pH 8,0) sont mis dans un tube de microcentrifugeuse. 700 l du tampon de dosage, et 100 l de lysyl oxydase sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité à l'aide d'un vortex, puis incubé à 37 C durant des durées variables. Après incubation, la réaction est arrêtée en plaçant le tube de microcentrifugeuse dans de la glace puis en ajoutant 100 l, d'acide trichloracétique à 50% (Poids/Volume). L'élastine est ensuite récupérée par centrifugation à 12. 000 g durant 5 minutes à 2 C. 700 l du surnageant sont transférés dans un microconcentrateur (Amicon Microcon 3), qui est centrifugé à 14. 000 g durant 2 heures à 20 C . Durant la centrifugation les molécules de faible poids moléculaire passent à travers la membrane d'ultrafiltration (seuil de 3. 000 kDa) et sont récupérés dans la chambre inférieure du microconcentrateur. Afin de mesurer le relarguage du tritium, 400 l de l'ultrafiltrat sont mélangés avec 3,6 ml du réactif Aquasafe 300 Plus commercialisé par la Société Zineser Analytic ( MAIDENHEAD, Grande-Bretagne), puis le comptage est effectué dans un compteur à scintillation liquide durant 10 minutes. Résultats : La figure illustre l'inhibition de l'activité lysyl-oxydase par le calix(6)arène (n = 6, R1 = S03Na, R2 = H). Ce produit est obtenu par mise en solution dans un tampon adéquat du sulfonate (n = 6, R1= S03H, R2= H) commercialisé par la Société ACROS (GEEL WEST , Belgique) sous la référence 29.026-0010. La concentration en calix(6)arène, nécessaire pour inhiber 50% de l'activité de lysyl-oxydase est de 1,2 mM. REVENDICATIONS 1. Utilisation des calix(n)arènes pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies fibrotiques. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que les calix(n)arènes inhibent substantiellement l'activité lysyl oxydase. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que les calix(n)arènes présentent la formule 1 suivante: dans laquelle: - R1 représente un groupe alkyle, alkylamide, acyle, aryle, carboxyle, sulfonyle ou phosphonyle, éventuellement substitué, - R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe acyle ou un groupe amide, éventuellement substitué, - n est un nombre entier compris entre 4 et 8, et leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables. 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que R1 représente un groupe S03H. 5. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4 caractérisée en ce que n est égal à 6. 6. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisée en ce que R2 est un atome d'hydrogène. 7. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 6 caractérisée en ce que le calix-n-arène est tel que n est égal à 6, R1 est un groupe S03H et R2 est un atome d'hydrogène. 8. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisée en ce que le sel pharmaceutiquement acceptable est un sel de lithium, de sodium, de potassium, de rubidium ou de césium. 9. Procédé d'inhibition de l'activité lysyl oxydase comprenant la mise en contact de la lysyl oxydase et d'un calix-n-arène. 10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le calix-narène présente la formule 1 selon la revendication 3. 11. Utilisation des calix(n)arènes pour inhiber l'activité lysyl oxydase.