Brevet FR2777351A1 — publié le 19991015

L'invention concerne un procédé et un dispositif de mesure de particules en suspension dans un liquide. Elle a en particulier des applications en hématologie, pour caractériser des cellules sanguines et fournir des résultats sur les paramètres que l'on cherche à mesurer à partir d'échantillons sanguins. Des analyses pratiquées en hématologie ont pour objet une identification et un comptage de plusieurs catégories de cellules, afin d'établir des diagnostics. Les cellules à reconnaître sont usuellement des globules rouges, des plaquettes et des globules blancs, ces derniers se répartissant en plusieurs familles telles que lymphocytes, monocytes, ou granulocytes. Des mesures de comptage sont traditionnellement effectuées en hématologie par impédancemétrie (ou effet Coulter). Pour cela, on injecte des échantillons sanguins dilués contenant des cellules dans un liquide conducteur à travers un orifice de petit diamètre, au niveau duquel est appliqué un courant électrique maintenu constant. Le passage d'une particule y provoque alors une variation transitoire de résistivité, représentative du volume occupé par la cellule traversante. Ce procédé de mesure par variation d'impédance permet de distinguer les cellules en fonction de leur volume. D'autres mesures mettent en oeuvre des moyens optiques. De telles mesures par faisceaux lumineux permettent des distinctions différentes de celles obtenues par impédancemétrie. Des mesures effectuées par ces deux moyens sont parfois effectuées corrélativement. Un dispositif permettant d'effectuer ce type de mesures sur échantillons sanguins et comportant ce type de capteurs sera ultérieurement appelé tête cytométrique. De tels dispositifs ne sont pas limités à des applications en hématologie mais peuvent aussi être 2 2777351 utilisés pour mesurer des caractéristiques de tout type de particules en suspension dans un liquide. En particulier, le calibrage de ce type de dispositif peut se faire avec des particules non biologiques en suspension dans un liquide. Quel que soit le type de capteur et la chaîne de conditionnement et de traitement du signal employée, des particules à caractériser le traversent avec une vitesse donnée. Chaque passage d'une particule provoque l'apparition d'un signal ou réponse qui croît, atteint une valeur crête, puis décroît. Cette réponse, qualifiée d'événement, est habituellement caractérisée par la valeur crête ou par une intégration temporelle du signal. On emploiera aussi le terme de capteur pour désigner l'ensemble capteur et sa chaîne de conditionnement et de traitement du signal. Une telle chaîne pouvant comporter des filtres, des intégrateurs ou tout autre dispositif électronique agissant sur le signal. Dans le cas d'un échantillon sanguin dilué, et qui est injecté dans la tête cytométrique, on le fait passer par un ou plusieurs capteurs. Un ensemble de cellules sanguines génère ainsi des événements dans chacun des capteurs utilisés. Des valeurs caractéristiques des événements sont mesurées, et réparties selon des plages de valeurs juxtaposées dites canaux. Un tel dispositif a été décrit dans le brevet FR-2 733 596 pour " procédé et dispositif d'identification de particules ". Les capteurs ne sont pas parfaits et doivent fonctionner dans une zone qui correspond à leur plage de fonctionnement optimal ou significatif ou zone de réponse optimale ou significative. Pour un capteur ayant une courbe de réponse sensiblement linéaire, cette zone optimale pourra être centrée sur la plage linéaire. Pour 3 2777351 un capteur ayant une courbe de réponse sensiblement sigmoïde, la zone optimale ou significative pourra être centrée sur le point d'inflexion de la courbe de réponse. Si les capteurs ne sont pas dans leur plage de fonctionnement optimal ou significatif, l'exploitation de la mesure est moins efficace. Dans le cas d'un appareil comportant une tête cytométrique, la dilution de l'échantillon et son débit d'injection dans la tête cytométrique sont choisis de telle façon que pour un appareil donné et pour des échantillons dans les normes, les capteurs soient, chacun, dans leur zone de réponse optimale ou significative. Ces conditions sont obtenues statistiquement à partir d'échantillons provenant d'une population représentative. Dans le cas des analyses en hématologie, il existe, par exemple, des normes pour le nombre de globules par unité de volume (ce nombre est ici représentatif de la dilution), pour la proportion en % ou pour la valeur absolue en nombre par unité de volume des différents types de globules. Ces dilution et débit d'injection sont donc standards pour l'appareil considéré. De ce fait, si un échantillon sort des normes, les capteurs risquent de sortir de leur zone de réponse optimale ou significative. Par exemple, s'il est sollicité trop fréquemment, un capteur risque de manquer des mesures par exemple parce que la résolution temporelle du capteur est limitée. Habituellement, un traitement statistique permet la correction du phénomène dit de coïncidence. Une telle méthode a également ses limites. Classiquement, on ne peut mesurer la concentration en globules blancs que jusqu'à environ 100 000 cellules par mm3. Au delà ces valeurs, le capteur sort de sa plage de réponse significative et il est aujourd'hui indispensable de 4 2777351 répéter l'analyse après une prédilution manuelle de l'échantillon. Cette solution entraîne un certain nombre d'inconvénients. Dans tous les cas, du temps est perdu car les mesures initiales sont rejetées et une manipulation supplémentaire de l'échantillon, longue et source d'erreurs s'avère nécessaire. Cette manipulation supplémentaire peut être source d'accidents et de contamination du personnel par les produits biologiques et/ou chimiques. Les tubes contenant les échantillons sanguins sont fermés par des bouchons qui doivent être ouverts... Les coûts sont augmentés par l'utilisation de personnel spécialisé qui doit être prévu pour le cas o des manipulations seraient nécessaires. Des consommables supplémentaires doivent aussi être utilisés. La présente invention a pour objet de surmonter ces inconvénients, grâce à un procédé et un dispositif qui permettent d'augmenter considérablement la plage de mesure optimale ou significative. L'objectif de l'invention est donc de diminuer sensiblement les coûts, la durée et les risques de l'examen de sang, sans diminuer la fiabilité des résultats. L'invention concerne un procédé et un dispositif de mesure de particules en suspension dans un liquide dans un appareil comportant une tête cytométrique, ladite suspension étant injectée dans ladite tête avec un débit d'injection grâce à l'action d'une pompe, ladite tête comportant un ou plusieurs capteurs fournissant des réponses lors de la mesure des particules et ayant une réponse significative pour une plage de fréquence de mesure déterminée, les réponses étant traitées et servant à fournir des résultats dans ledit appareil. Selon l'invention: 2777351 - si les premières réponses sont significatives, les mesures se poursuivent au même débit d'injection de façon à fournir un résultat, dans le cas contraire, si les premières réponses ne sont pas significatives, le débit d'injection est modifié afin de ramener les réponses dans la plage de réponse significative et & poursuivre les mesures de façon à fournir un résultat. Selon différents modes de réalisation de l'invention présentant chacun des avantages particuliers comporte les étapes et moyens suivants pouvant être utilisés selon diverses combinaisons techniquement possibles: - le procédé se décomposant en: étape 1: une mesure E de la réponse du capteur pour le débit d'injection initial d de la suspension est réalisée, étape 2: la comparaison de la mesure E à deux bornes P1 et P2 définissant une plage de réponse significative du capteur avec P1 P2, étape 3: si Pi P2, le débit d'injection de la suspension est modifié, le coefficient k de correction du débit d'injection étant calculé de telle façon qu'à ce nouveau débit d'injection d'=d/k, le capteur fonctionne dans sa plage de réponse significative. - la mesure E de la réponse du capteur se fait par le comptage d'un nombre n de cellules dans une durée de temps par le capteur et k est calculé par k*nl 6 2777351 significative dudit capteur en nombre de particules comptées dans ladite durée de temps. - la mesure E de la réponse du capteur est faite à partir d'un nombre Ne de mesures unitaires, une mesure unitaire correspondant à l'ensemble des réponses traitées dans une unité de temps. - à partir de la mesure globale constituée du nombre Nt de mesures unitaires faites sur la suspension, un nombre Nu desdites mesures unitaires est utilisé pour obtenir la mesure utile qui servira à fournir le résultat pour le paramètre avec Nu - le dispositif de mesure comporte des moyens de traitement des réponses provenant des capteurs, et comporte des moyens de contrôle de la pompe en fonction des réponses fournies par les capteurs. - la pompe est un système pousse-seringue. - la tête de mesure comporte au moins un capteur impédancemétrique. - la tête de mesure comporte au moins un capteur optique. - la suspension injectée est un échantillon sanguin dilué. Grâce à la présente invention, un gain de temps important par rapport aux solutions antérieures est obtenu. Il n'est plus nécessaire de modifier la dilution de la suspension et de la faire repasser dans la tête de mesure. Les risques liés à la manipulation du sang et des échantillons biologiques dans le cas d'un appareil de mesure biologique n'existent plus. Un avantage financier est aussi obtenu par l'économie de consommables. La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit d'un mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention et de réalisation du 7 2777351 dispositif de l'invention donné à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux dessins annexés. Ce mode correspond à la mesure de suspensions biologiques et plus particulièrement l'utilisation d'échantillons sanguins dilués dans une tête cytométrique. La Figure i est un schéma d'un dispositif à tête cytométrique selon l'invention. La Figure 2 est une vue schématique d'une tête cytométrique utilisé dans le dispositif de la Figure 1. La figure 3 représente un organigramme pour la mise en oeuvre du procédé selon un mode de réalisation de l'invention. Un dispositif à tête cytométrique selon l'invention, représenté sur la Figure 1, comprend une tête cytomètrique 1 destiné à réaliser des mesures sur des échantillons comportant des cellules biologiques. Il comprend également une unité de traitement des réponses 2 reliée à la tête cytomètrique 1, et recevant en entrée les réponses des capteurs de la tête cytométrique. L'unité de traitement 2 qui comporte des moyens de calcul électronique fournit l'information k vers l'unité de contrôle 3. L'unité de contrôle 3 commande le dispositif de pompage qui est sur la figure 1, un pousse-seringue 18 destiné à assurer l'injection des échantillons dans la tête cytométrique par l'intermédiaire d'un circuit fluidique 19. Physiquement, l'unité de traitement du signal et l'unité de contrôle peuvent être séparées ou regroupées. Elles sont constituées d'éléments électroniques classiques permettant d'effectuer des opérations analogiques et digitales. En particulier, l'unité de traitement assure le calcul du coefficient de correction k qui est envoyé à l'unité de contrôle. 8 2777351 La tête cytométrique 1, détaillée sur la Figure 2, comprend une enceinte 4 d'axe 15 contenant un injecteur 5 destiné au passage d'une suspension de cellules biologiques qui sont plus précisément, dans l'exemple présenté, des cellules sanguines. L'injecteur 5 est inclus dans une chambre d'écoulement 6 à l'intérieur de l'enceinte 4, qui contient un liquide entraîneur 8 et qui est terminé par une buse 7. L'injecteur 5 et la chambre d'écoulement 6 sont dirigés suivant l'axe 15, et permettent d'obtenir un écoulement axial, la suspension de cellule dans son parcours étant manchonnée par le liquide entraîneur. La buse 7 concentre le flux dans la direction 15. Elle est terminée à son extrémité 9 par un orifice de très petite taille, typiquement de l'ordre d'une fraction de millimètre de diamètre et permettant la mesure de l'impédance électrique. La tête cytométrique 1 comporte également un capteur optique 20. Celui- ci comprend un dispositif optique 10. Un élément optique 14 comporte intérieurement une chambre 12, ouverte en deux extrémités opposées selon l'axe 15 et centrées autour d'un point 11. L'élément optique 14 est fixé à l'enceinte 4 de façon que la buse 7 débouche dans la chambre 12 par l'une des extrémités de celle-ci, et que le flux de cellules passe par le point 11 central de la chambre 12. Un dispositif de sortie 13 est fixé à l'élément optique 14. Le flux de cellules sort de la chambre 12 par l'intermédiaire du dispositif de sortie 13. Le capteur optique 20 comporte également une diode laser 23 apte à émettre un faisceau lumineux 22 qui est focalisé sur le flux de cellules, au point 11 central de la chambre 12, dans laquelle il pénètre par l'élément optique 14. Le capteur optique 20 comporte aussi un ensemble de détection (non représenté), qui mesure la lumière diffusée par les cellules. 9 2777351 Le volume délimité par l'enceinte 4 et la chambre 12 est rempli d'un liquide électriquement conducteur 16. Ce liquide 16 lave en permanence le dispositif optique 10 et évite des recirculations de cellules devant le faisceau lumineux 22. La tête cytométrique 1 comprend également un capteur d'impédance 25, constitué par des moyens électroniques de mesure 27 reliés à l'injecteur 5 formant une première électrode, et une seconde électrode 26. L'électrode 26 est O10 disposée dans le volume délimité par l'enceinte 4, rempli du liquide électriquement conducteur 16. Les moyens électroniques 27 et l'électrode 26 permettent de compter électriquement le nombre de cellules à travers l'orifice 9 et d'en mesurer électriquement le volume, selon une méthode impédancemétrique (dite de Coulter). En fonctionnement, on injecte une suspension de cellules biologiques dans l'injecteur 5. Parvenu à l'extrémité de l'injecteur 5, le flux de cellules est entraîné et manchonné par le liquide entraîneur 8 vers l'extrémité 9 de la buse 7. Elles traversent ensuite la chambre 12 et sont finalement évacuées par le dispositif de sortie 13. Le nombre de cellules dans les mesures doit être suffisamment grand pour être représentatif. Par exemple, ce nombre est fixé à au moins 10.000, la durée d'analyse étant comprise entre 5 et 20 secondes. Un mode de mise en oeuvre du procédé avec l'organigramme, figure 3, correspondant est décrit par la suite. Dans ce cas, les capteurs fonctionnent en dispositifs de comptage et sont considérés comme ayant une courbe de réponse linéaire. Une mesure unitaire correspond à l'ensemble des signaux traités dans une unité de temps. Ces signaux traités correspondent aux cellules de l'échantillon qui ont été détectées par les capteurs. on 2777351 appelle mesure globale, le nombre total Nt des mesures unitaires correspondant à un échantillon, Nt peut être par exemple égal à 40. La durée d'une mesure unitaire étant par exemple de 250 ms, la durée totale des mesures pour un échantillon est alors de 10 s. Le résultat fourni par la machine provient de la-1 mesure utile qui est constituée de Nu mesures unitaires. Dans ce mode, Nu Sur la figure 3, j est une variable de comptage des mesures unitaires qui est initialisée à zéro au début du passage de l'échantillon. Mu (j) correspond à la Jème mesure unitaire. Au début du passage de la suspension cellulaire dans la tête cytométrique au débit d'injection initial v, un certain nombre Ne de mesures unitaires sont faites et utilisées pour calculer le nombre de cellules comptées pendant une unité de temps, soit E le résultat de ce calcul, Ne peut être, par exemple, égal à 4. Un test est effectué consistant en une comparaison entre E et deux bornes P1 et P2 d'une plage de réponse significative du capteur. Ces bornes correspondent à des valeurs pour lesquelles les capteurs fonctionnent dans leurs plages de réponse significative et la correction ne sera effectuée que si E est en dehors de cette plage de réponse. Si E est compris entre les bornes P1 et P2, aucune correction de débit d'injection n'est effectuée. Les mesures unitaires restant à effectuer sur l'échantillon se dérouleront au débit d'injection initiale d. Dans un tel cas, on a Nu=Nt, le résultat provient de l'ensemble des mesures unitaires effectuées sur l'échantillon. Si E est en dehors de la plage de valeurs définies par P1 et P2, le débit d'injection d de l'échantillon dans la tête cytométrique est modifiée en d'. Un facteur k de correction du débit est prédéterminé ou calculé: d'=d/k. Il 2777351 La valeur de k peut aussi être déterminée par un asservissement avec une boucle itérative de façon à ramener E entre P1 et P2. Dans la tête cytométrique, le diamètre du flux cellulaire et, par là, le nombre de cellules par unité de longueur du flux dépend, pour une dilution donnée, du débit d'injection imposée par la pompe, du diamètre de l'orifice, et du différentiel de pression de part et d'autre de cet orifice. La vitesse de passage des cellules dans l'orifice dépend du différentiel de pression de part et d'autre de cet orifice. Ainsi, par exemple, en agissant sur cette différence de pression, on peut contrôler la vitesse de passage des cellules traversant le dispositif. Pour un différentiel de pression donné, un diamètre d'orifice donné, un taux de dilution donné, la fréquence de passage des cellules dans le dispositif peut être ajustée en jouant sur le débit d'injection de la suspension de particules imposée par la pompe (ou pousse- seringue). Le débit d'injection est ajusté et les mesures se poursuivent au débit d'injection d'. Dans ce mode, le nombre Nt de mesures unitaires effectuées sur chaque échantillon est le même pour tous les échantillons. Si le débit est modifié, Nu=Nt-Ne, mesures unitaires sont utilisées pour fournir le résultat. k peut prendre les valeurs suivantes: - k d, - k=l, le débit d'injection reste constant, - k>l, le débit d'injection est diminué: d' Des limites pourront être fixées pour la valeur du coefficient de correction k. Ces limites dépendront de 12 2777351 facteurs tels que la courbe de réponse du capteur ou de facteurs externes tels que les performances du dispositif de pompage, les caractéristiques de la tête cytométrique (pression de travail maximum), des fluides utilisées (viscosité) etc. Les bornes P1, P2 pour le capteur sont classiquement stockées dans des mémoires électroniques. Elles pourront éventuellement être modifiées en fonction du résultat des opérations de calibrage effectuées sur la machine. Le dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention selon un mode de réalisation comporte les moyens suivants qui sont des éléments d'un appareil destiné à fournir des résultats à partir de mesures sur des cellules d'échantillons sanguins dilués. - Une tête cytométrique comportant un ou plusieurs capteurs pouvant fournir des signaux, lesdits capteurs étant du type impédancemétrique et/ou optique. - des moyens de traitement des signaux. ce sont des moyens électroniques analogiques et numériques classiques. En particulier, des moyens de calcul électroniques dont des mémoires pouvant stocker les différents éléments nécessaires aux tests et calculs de k. - une pompe préférentiellement dispositif pousse- seringue, assurant l'injection des échantillons sanguins dans la tête cytométrique. Ladite pompe est commandée par des moyens de contrôle électroniques classiques. - un circuit fluidique entre la pompe et la tête cytométrique. - une liaison entre les moyens de traitement des signaux et les moyens de contrôle de la pompe assure l'exploitation du coefficient k de correction du débit. Les moyens de contrôle et de traitement peuvent être physiquement constitués de modules électroniques séparés ou au contraire regroupés. 13 2777351 Tout dispositif et appareil permettant la mise en oeuvre du procédé de l'invention et qui seraient envisagés d'une manière évidente par l'homme du métier font partie de cette description. De plus, la description détaillée et les exemples fournis sont simplement illustratifs et indicatifs et ne sauraient limiter la portée de l'invention. 14 2777351 REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure de particules en suspension dans un liquide dans un appareil comportant une tête cytométrique, ladite suspension étant injectée dans ladite tête avec un débit d'injection grâce à l'action d'une pompe, ladite tête comportant un ou plusieurs capteurs fournissant des réponses lors de la mesure des particules et ayant une réponse significative pour une plage de fréquence de mesure déterminée, les réponses étant traitées et servant à fournir des résultats dans ledit appareil, caractérisé en ce que si les premières réponses sont significatives, les mesures se poursuivent au même débit d'injection de façon à fournir un résultat, et dans le cas contraire, si les premières réponses ne sont pas significatives, le débit d'injection est modifié afin de ramener les réponses dans la plage de réponse significative et à poursuivre les mesures de façon à fournir un résultat. 2. Procédé de mesure selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'elle comporte les étapes suivantes: étape i: une mesure E de la réponse du capteur pour le débit d'injection initial d de la suspension est réalisée, étape 2: la comparaison de la mesure E à deux bornes Pl et P2 définissant une plage de réponse significative du capteur avec Pl P2, le débit d'injection de la suspension est modifié, le coefficient k de correction du débit d'injection étant calculé de telle façon 2777351 qu'à ce nouveau débit d'injection d'=d/k, le capteur fonctionne dans sa plage de réponse significative. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mesure E de la réponse du capteur se fait par le comptage d'un nombre n de particules dans une durée de temps par le capteur et que k est calculé par k*nl comptées dans ladite durée de temps. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la mesure E de la réponse du capteur est faite à partir d'un nombre Ne de mesures unitaires, une mesure unitaire correspondant à l'ensemble des réponses traitées dans une unité de temps. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à partir de la mesure globale constituée du nombre Nt de mesures unitaires faites sur la suspension, un nombre Nu desdites mesures unitaires est utilisé pour obtenir la mesure utile qui servira à fournir le résultat pour le paramètre avec Nu Nt. 6. Dispositif de mesure comportant une tête de mesure dans laquelle est injectée une suspension de particules, une pompe assurant l'injection de la suspension, munie d'un ou plusieurs capteurs fournissant des réponses qui peuvent être traitées, des moyens de traitement des réponses provenant des capteurs, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de contrôle de la pompe en fonction des réponses fournies par les capteurs. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que la pompe est un système pousse-seringue. 16 2777351 8. Dispositif selon l'un des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la tête de mesure comporte au moins un capteur impédancemétrique. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la tête de mesure comporte au moins un capteur optique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la suspension injectée est un échantillon sanguin dilué. 1N