Brevet FR2782523A1 — publié le 20000225

DISPOSITIF DE MESURE RAPIDE DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE La présente invention concerne un dispositif de mesure rapide d'une activité enzymatique dans un aliment solide comprenant (i) un récipient destiné à contenir l'échantillon à tester, (ii) un réactif propre à l'enzyme dont on veut mesurer l'activité et (iii) un tampon permettant la mise en solution de l'enzyme. L'aliment est de préférence un aliment solide et non traité préalablement à la mesure. Les aliments destinés aux animaux d'élevage sont usuellement additionnés d'enzymes dont le rôle est principalement une meilleure digestibilité de la ration alimentaire. Ces enzymes sont le plus souvent pulvérisées sous forme liquide sur les aliments, tel que notamment décrit dans le brevet EP 0789291. Les enzymes peuvent aussi être additionnées sous forme de poudre dans l'aliment. Deux problèmes se posent alors, le premier est de vérifier l'uniformité de la répartition des enzymes ajoutées à l'aliment, le second est d'évaluer de façon rapide et facile l'activité de la ou des enzymes ajoutées aux aliments. Ces problèmes sont en particulier soulevés par les fabricants d'aliments et les éleveurs voulant vérifier la qualité des aliments qu'ils veulent donner à leurs animaux. Jusqu'à présent, l'activité enzymatique pouvait être mesurée en laboratoire, ce qui entraînaient des contraintes en terme de logistique et de délais, ces contraintes étaient gênantes en cas de besoin d'un résultat immédiat. La présente invention répond à ce problème en proposant un dispositif de mesure de l'activité enzymatique de n'importe quel aliment enrichi en enzyme destiné à l'alimentation animale. Ce dispositif, dont la mesure repose sur une réaction colorimétrique, permet à la fois une mesure qualitative de l'activité enzymatique de l'échantillon testé et une mesure semi-quantitative de cet échantillon. La figure 1 représente unt moyen de mise en oeuvre de l'invention sous forme d'un dispositif de mesure de l'activité enzymatique se présentant sous la forme d'une colonne.. La description suivante peut se lire au regard de la figure ci-dessus mentionnée. Le dispositif objet de la présente invention comprend un récipient destiné à contenir l'échantillon à tester, un réactif propre à l'enzyme dont on veut mesurer l'activité et un tampon permettant la mise en solution de ladite enzyme. Le récipient de ce dispositif peut être, de façon non limitative, une colonne (figure 1) composée d'une partie inférieure étroite graduée (11) et d'une partie supérieure large en forme d'entonnoir (12) facilitant l'introduction des différents réactifs dans la colonne ainsi que leur mélange lors de l'agitation. La colonne peut aussi être munie d'un système d'ouverture et de fermeture étanche (13) telle qu'un bouchon relié au corps de la colonne par une languette (13 1). Le récipient peut aussi être constitué d'un tube à usage unique (figure 2). Le récipient peut être en matière synthétique telle qu'un plastique à usage unique. De façon préférée, le récipient peut comporter une excroissance sécable (14) à sa base permettant l'écoulement de la partie liquide de son contenu. L'excroissance est avantageusement surmontée d'un étranglement (141) retenant les morceaux d'aliments solides. La mesure de l'activité enzymatique est basée sur la réaction de coloration de la méthode Azo. Le principe de la réaction de coloration de la méthode Azo repose sur l'hydrolyse enzymatique d'un substrat caractéristique d'une enzyme lié à un chromophore. La réaction produit des oligomères solubles qui colorent en bleu le milieu. L'absorbance du milieu peut être mesurée à 590 nrn. Le réactif utilisé dans le dispositif est le substrat de la réaction catalysée par l'enzyme lié à un chromophore. Ainsi, la réaction d'hydrolyse enzymatique libère le substrat chromophore. Le dispositif comprend également un tampon permnnettant la mise en solution des enzymes qui ont été pulvérisées sur l'aliment ainsi que le maintien des enzymes à leur pH optimum. On peut citer, à titre d'exemple et de façon non restrictive, le dispositif de mise en évidence de l'activité des xylanases. Pour la mesure de l'activité des xylanases, le réactif utilisé est l"'Oat spelt Xylan Remazol Brillant Blue R" ou le "Xylazyme AX" (vendus par la société Megazyme et constitué d'araboxylane d'avoine ou dc blé lié à un colorant). Le tampon utilisé est choisi parmni les tampons acide acétique/acétate de sodium; chlorhydrate de glycine/glycinc; acide aconitique/hydroxyde de sodium; acide formique/formate de sodium. On peut encore citer le dispositif de mise en évidence de l'activité des 3- glucanases qui repose également sur la réaction de coloration de la méthode Azo. Parmi les substrats utilisables on peut citer le 1,3: 1,4-[3-D)-glucan avec Rcmazol Brillant Blue R et le Beta-Glucazyme vendu par la société Megazymc et constitué de béta glucane associé à de l'Azurine. Le tampon utilisé est choisi parmi les tampons acide acétiquc/acétate de sodium; chlorhydrate de glycine/glycine; acide aconitique/hydroxyde de sodium; acide formique/formnnate de sodium. Pour la mesure de l'activité de la cellulase, le substrat utilisé est sous forme d(le tablettes Cellazyme (commercialisée par la société Megazyme). Ces tablettes sont constituées de substrats à base de cellulose et ou de cellulose et de xyloglucanes polymérisés avec un colorant azurine. Dans un mode préféré de réalisation de la présente invention, le réactif se présente sous une forme solide. Avantageusement, pour faciliter la mise en solution de l'enzyme on peut ajouter au substrat contenant l'agent chromophore un tensioactif. Cc tensioactif est choisi notamment parmi le laurylsulfate de sodium ou le dodécylsulfate de sodium. Selon un meilleur moyen de mise eni oeuvre de l'invention la mesure est réalisé en quatre étapes: - introduction dans le récipeint (1) de 10 ml d'échantillon dont on veut mesurer l'activité enzymatique, pour un échantillon solide, il faut remplir de solide jusqu'à la graduation 10 ml; - introduction du réactif sous la forme d'une bille solide; - introduction du tampon spécifique jusqu'à la graduation 20 ml; - après fermeture de la colonne avec le bouchon, cette dernière cst agitée vigoureusement à plusieurs reprises; On peut éventuellement ajouter une étape supplémentaire de séparation de la phase liquide et de la phase solide (par centrifugation ou filtration) pour récupérer la phase liquide et mesurer l'intensité de la coloration par spectrophotométrie ou simplement par comparaison avec une échelle colorée.. L'apparition d'une coloration bleue après un temps de réaction de 4 à 8 heures confirme la présence d'enzymes actives, l'intensité de la coloration est proportionnelle à l'activité des enzymes présentes dans l'échantillon. Un autre avantage de la présente invention est de pouvoir effectuer une mesure semi-quantitative de l'activité enzymatique. La phase liquide colorée de la colonne peut être récupérée par coupure de l'excroissance sécable de la colonne. L'intensité de sa coloration peut alors être comparée avec une courbe d'étalonnage de DO. En plus d'être rapide, la méthode de mesure est très simple et le dispositif peut être utilisé n'importe o sans nécessiter d'équipement spécial. Par exemple, un fabricant ou un éleveur peut faire une mesure de contrôle dès la fabrication de l'aliment. La présente invention sera plus compètement décrite à l'aide des exemples suivants qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention. Exemples Deux séries d'essais ont été menées sur du Rovabio xylan LC (mélange de xylanase et béta glucanase de Pénicillium funiculosum) et sur du Rovabio xylanase TRLC (xylanase de Trichodernma reesei) dont l'activité xylanase est comprise entre.350 et 550 uAXC /ml. On estime que le traitement de pulvérisation de la composition liquide sur les aliments conduit à un taux de 70 à 110 uAXC/kg d'aliment. Le tampon utilisé est le tampon acétate maintenant un pH à 4.7. La pulvérisation peut être effectuée sur l'aliment pulvérulent ou sous forme granulé. échantillon Activité (avant observation à D.O. à 590 nm D.O. à 590 nm observation à ajustement) 3 heures à 4h30 à 8h 8h11 xylanase TRLC 1336 bleu: +++ >3,0 >3.0 bleu: -++ sur granulés xylanase TRLC 886,7 bleu: + 1,567 2,685 bleu ++ sur granulés xylanase TRLC 1469,25 bleu: + 1,429 2,652 bleu: ++ sur granulés xylanase poudre 631,4 pas de 0,201 0,666 bleu: - avant granulation coloration xylanasc LuC sur xylanas LC sur 1144 bleu: +4+ 2,309 2,376 bleu + granulés xylanase kC sur xylanase LC sur1386,7 bleu: 1,382 2,484 bleu ± granulés xylanase LC sur xylanase LC sur1450,5 bleu: +++ 2, 872 2.85 bleu ±++ granulés xylanase lC sur xylaasC sur 1330,5 bleu: ++ 1.233 2,096 bleu ±: granulés REVENDICATIONS - I - Dispositif de mesure d'activité enzymatique d'un échantillon alimentaire solide caractérisé en ce qu'il comprend un récipient destiné à contenir l'échantillon à tester, un réactif propre à l'enzyme dont on veut mesurer l'activité et un tampon permnncttant la mise en solution de ladite enzyme. - 2 - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon à tester est un aliment solide de préférence non traité. - 3 - Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit récipient est un tube ou une colonne graduée à usage unique munie d'un système d'ouverture et de fermeture étanche. - 4 - Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit récipient comporte une excroissance sécable à sa base permettant l'écoulement de la partie liquide de son contenu. - 5 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé cn cc que le réactif est le substrat de l'enzyme lié à un chlromophore. - 6 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif se présente sous forme solide ou liquide. - 7 - Dispositif selon la revendication 1, caractérisée en ce que le tampon utilisé pour mesurer l'activité de l'enzyme est choisi parmi les tampons acide acétique/acétate de sodium; chlorhydrate de glycine/glycine; acide aconitique/hydroxyde de sodium; acide formique/formate de sodium. - 8 - Utilisation du dispositif selon la revendication 1 pour mesurer l'activité enzymatique quantitativement caractérisé en ce qu'on compare la coloration obtenue avec une courbe étalon. - 9 - Procédé de mesure de l'activité enzymatique d'un aliment caractérisé en ce que on introduit dans le dispositif selon les revendications I à 5, 0l O ml d'échantillon dont on veut mesurer l'activité enzymatique, on introduit du réactif sous la forme d'une bille solide; on introduit du tampon spécifique jusqu'à la graduation mi; après fermeture de la colonne avec le bouchon, cette dernière est agitée vigoureusement à plusieurs reprises; on sépare la phase liquide de la phase solide, on récupére la phase liquide et on mesurer l'intensité de la coloration par comparaison avec une éhelle colorée.