Brevet FR2779434A1 — publié le 19991210

La présente invention concerne une protéine dermique, la fibrilline, présentant une composition déterminée en acides aminés, un procédé de préparation de fibrilline d'origine marine ayant cette composition, et plus particulièrement un procédé de préparation de fibrilline à partir de cnidaires, notamment de méduses, ainsi que des compositions cosmétiques et pharmaceutiques la contenant. La fibrilline est une macromolécule non collagénique du tissu conjonctif qui est normalement insoluble dans ces tissus et a été purifiée à partir de milieu de culture de fibroblaste [" Fibrillin, A new 350-kD Glycoprotein, is a Component of Extracellular Microfibrils " Lynn Y. Sakai and ail; The Journal of Cell Biology, Vol. 103 (N 6, Pt.l) Dec. 1986 2499- 2509]. Son altération est à l'origine du syndrome de Marfan. La fibrilline est un des constituants majeur des microfibrilles du derme. Ces microfibrilles sont particu- lièrement abondantes dans les tissus élastiques o elles forment un échafaudage sur lequel l'élastine se dépose. Cette fonction d'accrochage de la fibrilline existe également dans d'autres tissus [" Extraction of extendable beaded strutures and their identification as fibrillin- containing extracellular matrix microfibrils " Kenne, D.R. and all; J. Histochem. Cytochem. 39, 441-449]. La fibrilline a une structure complexe comprenant une quarantaine de motif EGF (Epidermal Growth Factor) organisés en tandem [" Fibrillin binds calcium and is coded by cDNAs that reveal a multidomain struture and alternatively spliced exons at the 5' end " Corson, G.M. and all; Genomics 17, 476-484]. De plus, on sait que la fibrilline en fixant le LTBP-1 (Latent Transforming Growth Factor-Binding Protein-l) peut stocker du TGF-P (Transforming Growth Factor P 1 and 2). Ce dernier est reconnu pour favoriser la formation de la Matrice Extracellulaire et inhiber sa dégradation [" Fibrillin- Containing Microfibrils of Normal and Regenerating Skin content Latent Transforming Growth Factor-Binding Protein-l (LTBP-1) and are a Repository for Latent TGF-P1 " M. Raghunath and all, J. Invest. Dermatol. 110: 626, 1998]. On la retrouve chez tous les mammifères [" Fibrillin, A new 350-kD Glycoprotein, is a Component of Extracellular Microfibrils " Lynn Y. Sakai and all; The Journal of Cell 1o Biology, Vol. 103 (N 6, Pt.l) Dec. 1986 2499-2509] mais aussi chez les invertébrés comme les holothuries [" Morphology and biomechamiscs of the microfibrillar network of the sea cucumber dermis " Thurmond F.A. and all; J. Exp. Biol., 199, 1817-1828] et les méduses [" An Extracellular matrix protein of jellyfish homologous to mammalian fibrillins forms different fibrils depending on the life stage of the animal " Reber-Muller S. and all; Dev. Biol., 169, 662-672]. La fibrilline possède une structure et des fonctions qui semblent s'être remarquablement conservées tout au long de l'évolution. Ainsi les fibrillines de méduse et de l'homme présentent une très forte homologie [" An Extracellular matrix protein of jellyfish homologous to mammalian fibrillins forms different fibrils depending on the life stage of the animal " Reber-Muller S. and all; Dev. Biol., 169, 662-672]. La fibrilline permet à l'architecture des papilles dermiques de se maintenir, voire de se restaurer en cas de problème [" Age-related changes in the temporal and spatial distributions of fibrillin and elastin mRNAs and proteins in cutaneous wounds of healthy humans " Ashcroft GS; J. Pathol, 1997 Sept.]. Sa structure et sa synthèse sont altérées par les U.V [" UVB irradiation alters cellular responses to cytokines: rôle in extracellular matrix gene expression " Werth VP; J. Invest Dermatol., 1997 Mar.]. s La fibrilline n'a jamais été utilisée en cosmétique et en usage pharmaceutique. Le brevet US-A-5648061 décrit un modèle de photo vieillissement utilisant des souris transgéniques chez lesquelles l'expression génétique de l'élastine et de la fibrilline est augmentée. Ce modèle n'utilise donc pas directement la fibrilline mais insiste sur son importance en tant que marqueur du photo vieillissement. On sait que les cnidaires sont des organismes relativement simples, du type métazoaire, contenant essentiellement de l'eau et du collagène, dont les méduses sont la phase principale. La composition en acides aminés du collagène des méduses a été analysée [voir par exemple S. Kimura et al., "Le collagène comme principal constituant comestible de la méduse", J. of Food Science, vol 48, pp. 1758-1760 (1983)]. L'utilisation du collagène de cnidaires, ou de méduses, dans des compositions cosmétiques a été décrit dans le brevet FR-A-2714063. Or, il a été constaté, à la suite des travaux réalisés par les inventeurs, qu'il était également possible d'obtenir de la fibrilline à partir des méduses utilisées pour préparer le collagène. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation de la fibrilline utilisable dans l'industrie des produits cosmétiques et pharmaceutiques, à partir de cnidaires, permettant d'obtenir une fibrilline de bonne qualité. L'invention a également pour objet la fibrilline obtenue par ledit procédé, présentant une composition déterminée en acides aminés, ainsi que des compositions cosmétiques et pharmaceutiques la contenant. Suivant la présente invention, le procédé de préparation de fibrilline utilisable dans des compositions pharmaceutiques et cosmétiques, consiste à effectuer un lavage de cnidaires, suivi d'une extraction neutre, d'une séparation de phase, et d'une précipitation saline. o0 Il est préférable de traiter des cnidaires préalablement congelés, que l'on broie avant et/ou après l'étape de lavage. L'étape d'extraction s'effectue en milieu neutre, par exemple en milieu faiblement salin de pH compris entre 5 et 8, suffisant pour mettre en suspension les glycoprotéines de structures. L'étape de précipitation saline, après séparation de phase suivant une technique classique, peut s'effectuer par exemple au moyen d'une solution aqueuse de chlorure de sodium, en concentration appropriée, de telle sorte que la force ionique du milieu soit comprise entre 1 et 4. Il est préférable, conformément à l'invention, que la température ne dépasse pas 15 C environ dans les extracteurs, afin d'éviter une dénaturation des glyco-protéines de structures. Le procédé conforme à la présente invention présente l'avantage d'être utilisable directement à l'échelle indus- trielle. Il permet de traiter simplement, par lots ou en continu, des quantités importantes de méduses, pouvant aller de quelques dizaines à plusieurs centaines de kilogrammes. Ainsi, à partir d'environ 600 kg de méduses, on peut préparer près de 2 à 5 kg de fibres essorées contenant les glycoprotéines de type fibrilline. Le matériel fibreux est rincé puis décontaminé par de l'alcool de degré alcoolique compris entre 60 et 90 %, par exemple de l'alcool à 70 %, pendant environ 1 à 5 heures. Les suspensions de fibrilline sont ensuite préparées à partir de ce matériel fibreux à l'aide d'eau déminéralisée. De plus, le procédé de l'invention utilise des cnidaires entiers, notamment des méduses, et non des sous-produits ou des 1 fragments d'organismes. La fibrilline obtenue conformément à la présente invention se distingue en ce que sa composition en acides aminés est comparable à celle de la fibrilline de vertébrés. Elle comprend au moins 0,5 % de cystine. De préférence, la teneur en cystine est comprise entre 0,5 % et 4,0 %. Les essais de tolérance effectués avec la fibrilline de l'invention sur les flancs rasés et préparés de lapins albinos, suivant une méthode usuelle, ont montré un indice d'irritation cutanée primaire inférieur à 0,4, significatif de l'absence d'irritation cutanée. De même, les essais d'irritation oculaire ont montré que la fibrilline de l'invention est très faiblement irritante (indice d'irritation maximale à 1 heure égal à 7,6). Les compositions cosmétiques préparées conformément à la présente invention ont fait apparaître d'intéressantes propriétés, notamment en ce qui concerne l'effet de stimulation de la cicatrisation des plaies, de régénération des tissus, d'assouplissement et d'adoucissement de la peau. De plus, la fibrilline présente des propriétés filmogènes et hydratantes. Il a été également rapporté que ces compositions cos- métiques amélioraient les rides et les vergetures. La peau, ainsi traitée est également plus ferme. Ces compositions cosmétiques contenant de la fibrilline peuvent, grâce à cette dernière, protéger la fibrilline naturellement présente dans le derme de l'utilisateur des effets délétères des U.V par un effet de leurre. En effet la fibrilline, ainsi interposée entre la source UV et les microfibrilles cutanées prend à son compte les photons destructeurs qui, ainsi stoppés, ne vont plus pouvoir atteindre leur cible dermique. Une émulsion peut également libérer la fibrilline qu'elle 1Q contient qui devient disponible pour les protéases endogènes. Ces protéases en hydrolysant la fibrilline vont petit à petit libérer les motifs EGF dont cette dernière est constituée. Ces facteurs de croissance ainsi libérés à la demande vont stimuler le processus naturel du renouvellement cellulaire dermique et épidermique. Ce processus peut être particulièrement utile en cas de cicatrisation ou de brûlure, moment o la peau lésée libère beaucoup de protéase et o elle a besoin d'une augmentation de la prolifération cellulaire. De plus, en régulant le TGF A, la fibrilline contribue à améliorer la cicatrisation. Les compositions à base de fibrilline suivant l'invention peuvent être présentées sous les formes usuelles de crème, émulsions, pommades ou gels. La fibrilline selon l'invention s'applique non seulement dans le domaine des compositions cosmétiques, mais aussi dans celui des compositions pharmaceutiques o elle peut être utilisée isolément ou en association avec du collagène, notamment pour le traitement de patients atteints ou susceptibles de développer un syndrome de Marfan, et pour permettre la libération progressive de facteur de croissance du type EGF (Epidermal Growth Factor). Suivant les techniques classiques, ces compositions peuvent contenir des excipients et supports usuels et peuvent se présenter sous forme de crème, de gel, d'émulsion, de pommade ou de patch à appliquer sur la peau, ou sous forme de comprimé ou de gélule destinés à être utilisés per os. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatifs, décrivent la préparation de fibrilline conformément à l'in- vention, ainsi que des compositions adaptées à une utilisation en cosmétique. ro Exemple 1 On concasse 600 kg de méduses congelées, que l'on laisse reposer en chambre froide (4 C) jusqu'à décongélation complète. Après lavage à l'eau, on procède à un broyage puis à une extraction en milieu salin neutre (chlorure de sodium 0,15 M - hydrogénophosphate disodique 0,01M - Triton X 100 0,2 % - pH 7,4) dans un extracteur de 5m3. L'extraction est réalisée pendant environ 1 heure, sous faible agitation au moyen d'un agitateur rotatif (50 trs/min) à une température comprise entre 12 et 15 C. Après séparation de phase (élimination de débris...) la suspension de biomolécules est précipitée par addition de chlorure de sodium. Les fibres de fibrillines précipitées en milieu salin (force ionique 2) sont essorées pour obtenir 2 à 5 kg de fibres à 5 % de protéines. Après rinçage des fibres à l'alcool (éthanol à 70 % - 2 heures), les suspensions aqueuses dosées à 0,1 %, 0,2 % ou plus (0,6 %) de fibrillines sont préparées à l'aide d'eau déminéralisée. On obtient ainsi un extrait de fibrillines se présentant sous forme de liquide visqueux légèrement opalescent, miscible à l'eau, de pH voisin de 4,0. La composition en acides aminés des glycoprotéines de structure de type fibrilline de la fibrilline suivant l'in- vention est la suivante, comparée à celle de la fibrilline des vertébrés. Fibrilline suivant Fibrilline de l'invention vertébrés Acide aspartique 10,60 12,87 Thréonine 4,92 6,48 Sérine 6,50 7,23 Acide glutamique 10,04 12, 01 Proline 8,90 7,38 Glycine 16,00 12,73 Alanine 10, 11 4,23 Valine 2,35 4,15 Cystine 3,18 3,94 Méthionine 1,14 1,38 Isoleucine 2, 87 5,43 Leucine 5,14 4,21 Tyrosine 1,69 3,40 Phénylalanine 2,79 3,25 Histidine 0,78 1,44 Lysine 4,37 3,32 Arginine 5,14 5, 30 Hydroxyproline 0 0 Hydroxylysine 1,44 Non déterminé L'analyse de la composition en acides aminés a été effectuée par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions de la protéine hydrolysée, suivant une technique classique. Les résultats de l'analyse indiqués ci-dessus montrent que la fibrilline obtenue suivant la présente invention contient environ 3 % de cystine. La présence de cystine est particulièrement intéres-sante, conformément à l'invention, car elle améliore considérablement la qualité cosmétologique des compositions cosmétiques préparées avec la fibrilline de l'invention en raison de l'affinité de la cystine pour la kératine de la peau. Exemple 2 On prépare une émulsion huile dans eau en mélangeant les composants suivants, suivant la technique usuelle: is Propylène glycol 2,0 g PEG 400 3,0g Conservateur 0,3 g Carbopol 941 0,2 g Myristate d'isopropyle 1,0 g Alcool cétylique 3,0 g Acide stéarique 3,0 g Huile de germe de mais 2,0 g Parfum 0,5 g Fibrilline de l'invention (à 0,6 %) 4,0 g Eau déminéralisée, quantité suffisante pour 100,0 g On utilise la fibrilline en solution aqueuse à 0,6 %. Exemple 3 On prépare une émulsion eau dans huile en mélangeant les composants indiqués ci-après, suivant la technique usuelle: Protegin 19,0 g Huile de vaseline 11,0 g Glycérine 4,0 g Sulfate de magnésium 0,5 g Parfum 0,6 g Conservateur 0,2 g Fibrilline de l'invention (à 0,6 %) 2,0 g Eau déminéralisée, quantité suffisante pour 100,0 g On utilise la fibrilline en solution aqueuse à 0,6 %. Exemple 4 On prépare un gel hydro-alcoolique en mélangeant les composants suivants, suivant la technique usuelle: Carbopol 941 1,0 g Triéthanolamine 1,0 g Ethanol à 95 % 60,0 g Glycérol 3,0 g Propylène glycol 1,0 g Collagène de méduse (à 0,6 %) 1,0 g Fibrilline de l'invention (à 0,6 %) 1,0 g Eau déminéralisée, quantité suffisante pour 100,0 g On utilise la fibrilline et le collagène issus tous les deux de méduse. Il 2779434 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de fibrilline comprenant au moins 0,5% de cystine, utilisable dans des compositions pharmaceutiques et cosmétiques, ou comme biomatériau, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer un lavage de cnidaires, suivi d'une extraction neutre, d'une séparation de phase, et d'une précipitation saline. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on traite des cnidaires, notamment des méduses, préalablement congelées, que l'on broie avant et/ou après l'étape de lavage. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction neutre est réalisée en milieu faiblement salin à un pH compris entre 5 et 8. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la précipitation saline est réalisée au moyen d'une solution aqueuse de chlorure de sodium, en concentration telle que la force ionique du milieu soit comprise entre 1 et 4. 5. Fibrilline utilisable dans des compositions pharmaceutiques et cosmétiques, caractérisée en ce que sa composition en acides aminés comprend au moins 0,5 % de cystine. 6. Fibrilline selon la revendication 5, caractérisée en ce que la teneur en cystine est comprise entre 0,5 % et 4,0 %. 7. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle contient de la fibrilline selon l'une quelconque des reven- dications 5 et 6, associée à un support acceptable en cosmétique. 8. Composition cosmétique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de crème, de gel, d'émulsion ou de pommade. 9. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient de la fibrilline selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, associée à un support acceptable en pharmacie. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de crème, de gel, d'émulsion, de pommade ou de patch à appliquer sur la peau ou sous forme de comprimé ou de gélule destinés à être utilisés per os. 11. Composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce qu'elle associe du collagène et de la fibrilline.