Brevet FR2774999A1 — publié le 19990820

L'invention concerne une polygalacturonase, des procédés pour sa préparation, des plasmides portant le matériel génétique nécessaire à l'expression de cette polygalacturonase ainsi que des souches de levure, en particulier de l'espèce Saccharomyces cerevisiae convenant à cette expression. Cette enzyme est secrétée dans le milieu de culture des souches selon l'invention. Les polygalacturonases sont des enzymes pectolytiques qui ont pour substrat privilégié les pectines, macromolécules glucidiques naturelles comportant des motifs composés d'acide D-galacturonique estérifié ou non par du méthanol et reliés entre eux par des liaisons ca (1-4). Plus précisément, les polygalacturonases (PG, EC.3.2.1) ont pour action de couper par hydrolyse enzymatique la chaîne glucidique des pectines au niveau des liaisons cc (1-4) de deux acides galacturoniques non estérifiés, réalisant ainsi leur dépolymérisation. Ces pectines, qui sont des composants importants de la lamelle moyenne et de la paroi primaire des cellules végétales, sont à l'origine de multiples problèmes pour la mise en oeuvre de procédés industriels, aussi bien dans le domaine de l'agro-alimentaire que dans celui du textile, et leur dégradation est bien souvent une étape utile voire indispensable. Des préparations d'enzymes pectolytiques sont utilisées depuis plus de 30 ans, notamment dans l'industrie des jus de fruits. En effet, lors de la production de jus de fruits ou de boissons fermentées à base de raisin ou de pomme, la présence de pectines rend les jus et les moûts troubles et leur confère une viscosité trop élevée. L'action d'une polygalacturonase (le plus souvent associée à d'autres enzymes) solubilise les pectines en suspension ce qui clarifie les jus et diminue la viscosité. La macération des fruits à l'aide de polygalacturonases associées à de faibles quantités de pectine estérase (PE, EC.3.1.1 catalysant la déméthoxylation des pectines) est particulièrement efficace pour la production de nectars de fruits. Ce traitement aboutit à une hydrolyse partielle des pectines des lamelles moyennes libérant ainsi des cellules intactes. Celles-ci vont alors se trouver en suspension dans un jus rendu visqueux. De la même façon, on utilise les polygalacturonases pour la fabrication de jus d'abricot, de carotte, de purées de pommes et de tomate et d'aliments à base de végétaux destinés aux bébés, dont elles améliorent en outre la digestibilité. Dans le cas particulier des fruits tropicaux ligneux comme les mangues, les fruits de la passion et les goyaves, les polygalacturonases associées à des cellulases permettent une liquéfaction totale des tissus végétaux. En oenologie, I'emploi d'enzymes pectolytiques améliore la clarté, la filtrabilité et les caractères organoleptiques des vins traités. Elles augmentent également le rendement en jus de goutte et l'extraction de la couleur au cours de la macération dont elles abaissent la durée. L'utilisation de ces enzymes s'est également étendue à l'amélioration de l'extraction des huiles alimentaires, comme l'huile d'olive ou l'huile de palme, et des huiles essentielles utilisées en parfumerie, comme l'huile d'écorce d'orange ou de citron.. Les enzymes pectolytiques sont également utilisées lors du dépulpage du café. En effet, les grains de café sont insérés dans une gangue à l'intérieur du fruit du caféier appelé cerise. Afin de séparer les grains de la gangue, une fermentation traditionnelle est souvent réalisée par trempage pendant 1 à 4 jours environ. Cette fermentation qui permet la digestion de la pectine et de l'hémicellulose est considérablement accélérée par adjonction d'enzymes pectolytiques. Le procédé de rouissage qui consiste en un trempage de végétaux (lin, chanvre,...) pour permettre la séparation des fibres repose lui aussi sur une hydrolyse de la pectine et de l'hémicellulose en présence de bactéries possédant les enzymes adéquates. Quant au bois fraîchement coupé, il n'absorbe pas spontanément les traitements de protection ou de coloration tels que la créosote ou les traitements cuivre-chrome-bore même lorsque ceux-ci sont appliqués sous pression. L'ajout d'enzymes pectolytiques associées à des cellulases lors de l'étape de trempage permet d'attendrir le bois et de le rendre perméable aux traitements ultérieurs. On constate donc que les enzymes pectolytiques jouent un rôle de plus en plus important dans les différentes industries qui viennent d'être citées. Actuellement, la majorité des préparations commerciales d'enzymes pectolytiques utilisées dans l'industrie proviennent d'Aspergillus niger. Mais, ce micro-organisme produit simultanément de nombreuses enzymes, en particulier des oxydo-réductases, dont les activités sont souvent indésirables. Les autres micro-organismes pour lesquels une production d'enzymes pectolytiques dans le milieu de culture a pu être détectée ne sont pas exploitables industriellement pour les mêmes raisons ou du fait de la trop faible quantité d'enzyme obtenue. La présente invention a donc essentiellement pour but de remédier..aux inconvénients susmentionnés des préparations d'enzymes pectolytiques, ainsi que des procédés permettant de les obtenir en fournissant, notamment, un procédé de préparation d'une polygalacturonase qui puisse être mis en oeuvre dans l'industrie, ainsi que les moyens permettant cette mise en oeuvre. L'invention repose essentiellement sur l'isolement d'un segment d'ADN codant pour la polygalacturonase de Saccharomyces cerevisiae et sur le clonage de ce segment chez des micro-organismes, comme par exemple, des levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae qui produiront l'enzyme dans le milieu de culture en quantité importante. La source de l'ADN génomique utilisé est une souche de levure sauvage de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, isolée à partir de raisin par les présents inventeurs, et qui a été déposée le 8 juin 1994 à l'institut Pasteur à Paris sous le numéro I-1431. Cette souche (ci-après C.94) présente la propriété rare de sécréter dans son milieu de culture une polygalacturonase, une pectine estérase et une pectine lyase (PL, EC.4.2. 2 qui catalyse une réaction de 13-élimination entre deux résidus d'acide galacturonique méthyles au sein d'une pectine). Mais, cette souche produit de trop faibles quantités de polygalacturonase pour pouvoir être utilisée comme source d'enzyme dans un procédé industriel. En outre, la production simultanée de PE et de PL peut être gênante dans certaines applications o l'on souhaite utiliser la polygalacturonase seule. Les présents inventeurs ont donc isolé le gène codant pour la polygalacturonase issue de la souche C.94 pour pouvoir le cloner dans un micro-organisme hôte auparavant dépourvu d'activités pectolytiques et susceptible de produire la polygalacturonase en plus grande quantité que la souche C.94. Annexe à la description La séquence SEQ ID NO:1 représente une partie du fragment d'ADN obtenu par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) à partir de la souche C. 94. On y trouve, du nucléotide 1 au nucléotide 1083, une séquence qu'on appelle PGL1-1, et qui est un cadre ouvert de lecture (ORF) pour 361 acides aminés. La séquence SEQ ID NO:2 représente cette séquence PGL1-1 qui est le gêne de structure de la polygalacturonase selon l'invention, ainsi que la séquence correspondante des 361 acides aminés de cette polygalacturonase. Ce gène de structure est inclus dans le plasmide pPGLI-1 lui-même contenu dans la souche de levure Saccharomyces cerevisiae ura3Atrpl-4[pPGL1-1] déposée sous le numéro MUCL 40781 auprès des Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) à Louvain (Belgique). Cette souche a été déposée selon le traité de Budapest. Les dessins annexés illustrent l'invention: La figure 1 représente la succession des étapes de construction du plasmide pPGL1I-1 permettant l'expression de la polygalacturonase. La figure 2 représente la carte de restriction de la séquence nucléotidique SEQ ID NO:1. La réalisation pratique de l'invention passe par plusieurs étapes détaillées dans la figure 1. La première est l'amplification d'un fragment contenant le gène codant pour la polygalacturonase. Cette étape peut être réalisée grâce à la méthode dite de PCR décrite par Saïki et al. dans " Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase " Science 239 (1988) 487-481. Exemple 1: amplification par PCR d'un gène de la souche C.94 L'ADN génomique de la souche C.94 est la cible amplifiable. On utilise deux amorces d'ADN contenant 18 bases chacune qui ont été synthétisées par la société EUROGENTEC (parc scientifique du Start Tilman 4102 - SERAING - BELGIQUE) et dont les séquences sont respectivement. : S1 5' ACA AAC GCA ATG ATT TCT 3': et A1 5'TCC TGC ATC TTT GTT CTG 3' Ces séquences ont été choisies sur la base de la séquence nucléotidique de l'ORF YJR 153W du chromosome X de la souche S288C. ng d'ADN génomique de la souche C.94 ont tout d'abord été dénaturés par chauffage à 95 C pendant 10 minutes dans 100 pl d'un milieu réactionnel contenant 50 mM de KCI, 10 mM de Tris-HCI (pH 9), 0,1% de Triton X100, 2, 5 mM de MgCI2, 200 pM de désoxy Nucléotide Tri Phosphates, 300 ng de chacune des amorces et 2 unités de Taq polymérase (PROMEGA, Madison, Wl, USA). Les cycles d'amplification consistent en une dénaturation à 95 C pendant 30 secondes, suivie d'une hybridation des amorces à 54 C pendant 30 secondes et d'une polymérisation à 72 C pendant 2 minutes. Ces cycles ont été réalisés dans le Thermal Cycler fabriqué par la société PERKIN ELMER et ont été répétés 30 fois. Après le dernier cycle, tous les échantillons ont été mis à incuber pendant 10 minutes à 72 C pour assurer une polymérisation complète. Le fragment obtenu après amplification a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose. Le pourcentage d'agarose est compris entre 1 et 2%. Les échantillons d'ADN sont chargés sur le gel après addition de 0,25 volume de tampon de charge (40% de glycérol, 0,25% de bleu de bromophénol). L'électrophorèse est conduite sous une tension constante (30-100 V) et en tampon TBE pH 7,9 (Tris base 89 mM, acide borique 89 mM, EDTA 2 mM) auquel on ajoute 1 pg/ml de bromure d'éthydium. Les fragments d'ADN sont ensuite visualisés par fluorescence sous lumière UV puis extraits du gel d'agarose par électroélution. Celle-ci est réalisée à l'aide de l'appareil HBS-Elutor (BIOMETRA) de chez EUROGENTEC. Le morceau de gel d'agarose contenant l'ADN est placé dans une des cupules prévues à cet effet, puis la cupule est soumise à une électrophorèse pendant 1 heure sous une tension de 100 V. Sous lI'effet du courant électrique, I'ADN sort de I'agarose et s'accumule dans le fonds de la cupule o on le récupère. Le fragment obtenu comporte 1 180 paires de bases (bp) et commence par la séquence de l'amorce S1 en position -9 / +9 par rapport au codon ATG marquant le début de la séquence codante PGLI-1. L'amorce A1 vient terminer le fragment en position +68 / +86 par rapport au codon stop TAA marquant la fin de la séquence codante PGLI1-1. Le séquençage a été effectué avec un séquenceur automatique ABI modèle 377 (commercialisé par la société ABI-PERKIN ELMER) en utilisant les amorces M1 3 (universelles et reverses) à marquage fluorescent ou des amorces synthétiques et la procédure de terminaison par colorant et/ou d'amorçage par colorant. L'ADN-polymérase Ampli-Taq FS (ABI-PERKIN ELMER) et la Thermosequencase (AMERSHAM) ont été utilisées pour les cycles de séquençage. Les fragments obtenus par PCR ont été purifiés sur une colonne Quiawell 8 (société QUIAGEN). La séquence des nucléotides a été compilée à l'aide du Sequencer Package (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml, USA). 7 2774999 Sur les 1 180 bp, on trouve un cadre ouvert de lecture pour 361 acides aminés, cadre qui est repris dans la séquence SEQ ID NO:2. On a ensuite établi la carte de restriction de la séquence nucléotidique SEQ ID NO:1 qu'on trouvera en Figure 2. Exemple comparatif 1: amplification par PCR d'un gène de la souche X2180-1B Dans cet essai, la cible amplifiable choisie est une souche de Saccharomyces cerevisiae dénommée X2180-1 B (MAT a; YEAST GENETIC STOCK CENTER) qui est connue pour son absence d'activité pectolytique (Gainvors et al. Yeast Vol.10 (1994), 1.311-1319) On opère de la même façon que dans l'exemple I avec les mêmes amorces. Là aussi, on obtient un fragment d'ADN comportant environ 1200 bp, dont une séquence nucléotidique proche de PGL1-1 qu'on appelle PGL1-2 et qui comporte environ1 086 bp. L'étape suivante de réalisation pratique de l'invention consiste, une fois le fragment d'ADN isolé, à l'intégrer dans un vecteur convenable qui pourra s'introduire dans un micro-organisme hôte. EXPRESSION CHEZ LA BACTERIE E. COLI DH5ct Exemple 2: construction d'un plasmide recombinant comprenant PGL1-1 Le fragment d'ADN amplifié provenant de C.94 et contenant PGL1 -1, est modifié par le fragment de Klenow et par une T4 kinase (EUROGENTEC). Il est ensuite cloné, à l'aide d'une T4 ligase (EUROGENTEC), dans le plasmide pKS (commercialisé par la société STRATAGEN) préalablement linéarisé à l'aide de l'enzyme de restriction Smal (STRATAGEN). Il en résulte un plasmide de 4 141 bp qu'on appelle pPGS100 et qui est ensuite introduit par électroporation selon la méthode décrite par Becker et Guarente dans " Met. Enzym. " (1992) 194, 182 (25 pF, 12,5 kV/cm, 2 000 Q) dans une souche de la bactérie E. coli DH5(x (F p80dlacZA M15 A (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1hsdR17 (rk, mk)supE44X-thi- 1gyrA S relA1; BETHESDA RESEARCH LABORATORIES, Gaithesburg, MD). La souche d'E. coli ainsi modifiée est cultivée à 37 C en boîte de Pétri dans un milieu de Luria et Bertani contenant 10 g/I de bactotryptone (BIOKAR DIAGNOSTICS), 5 g/I d'extrait de levure (DIFCO), 5 g/l de NaCI, pg/ml d'ampicilline, 40 pg/ml de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- l0 galactoside) et 40 pg/ml d'isopropylthiogalactoside (IPTG commercialisé par EUROGENTEC). La présence de l'antibiotique ampicilline dans le milieu de culture permet, de façon classique, de sélectionner uniquement les bactéries transformées par le plasmide pPGS100 qui comprend le plasmide pKS porteur d'un gène de résistance à cet antibiotique. Afin de savoir si la souche d'E. coli DH5ax modifiée produit ou non une polygalacturonase extracellulaire, on introduit dans son milieu de culture (milieu solide constitué de 6,7 g de Yeast Nitrogen Base (DIFCO), de 0,5% d'agarose, de 1% de glucose dans un tampon phosphate 50mM (pH 5,5)) de l'acide polygalacturonique jouant le rôle de pectine, à raison de 1%. Après croissance, on inonde la boîte avec du rouge de ruthénium (0,1%) qui est un colorant spécifique des pectines. L'apparition d'un halo décoloré autour de la bactérie serait le signe d'une production de polygalacturonase qui a dégradé l'acide polygalacturonique. On n'observe aucun halo autour de la bactérie transformée par pPGS100. Ceci pourrait s'expliquer par l'absence d'un système de sécrétion adapté qui ferait qu'une polygalacturonase éventuellement produite dans la cellule resterait emprisonnée dans le périplasme. CONSTITUTION D'UN PLASMIDE NAVETTE BACTERIE LEVURE On isole ensuite un fragment d'ADN contenant la séquence PGLI-1, susceptible de coder pour une polygalacturonase, à partir du plasmide pPGS100 contenu dans la souche de bactérie E. coli DH5cx modifiée, à l'aide de deux enzymes de restriction BamHI et HindIll (EUROGENTEC). On clone ensuite le fragment d'ADN obtenu dans un plasmide pVT102U, vecteur navette qui a lui aussi été digéré au préalable par les deux enzymes BamHl et HindIll. Le vecteur pVT1 02U est décrit par Vernet et al. dans D.Y. (1987) Gene 52, 225-233. On obtient alors un plasmide recombinant qu'on appelle pPGL1-1, et dont on vérifie la bonne construction en déterminant sa séquence. de nucléotides. Ce nouveau plasmide recombinant est destiné à être introduit dans une levure dépourvue d'activités pectolytiques dont on. espère qu'elle exprimera le gène de la polygalacturonase, et ce. en:fournissant degrandes quantités d'enzyme. L'homme du métier serait bien entendu à même de procéder à la construction directe d'un plasmide recombinant à partir du fragment obtenu par PCR et d'un vecteur convenable. Exemple comparatif 2: construction d'un plasmide recombinant comprenant PGL1-2 EXPRESSION CHEZ LA BACTERIE E. COLI DH5ax De la même façon que dans l'exemple 2, le fragment d'ADN amplifié contenant PGL1-2 et provenant de X2180-1B, est modifié par le fragment de Klenow et par la T4 kinase. Il est ensuite cloné, à l'aide de la T4 ligase, dans le plasmide pKS préalablement linéarisé à l'aide de l'enzyme de restriction Smal. Il en résulte là aussi un plasmide de 4 141 bp qu'on appelle pPGX100 et qui est ensuite introduit par électroporation (25 pF, 12,5 kV/cm, 2 000 D) dans la souche de la bactérie E. coli DH5a, comme dans l'exemple 2. Cette souche d'E. co/i modifiée est cultivée dans le même milieu que celui décrit dans l'exemple 2. Afin de savoir si elle produit ou non une polygalacturonase extracellulaire, on utilise la méthode au rouge de ruthénium décrite précédemment. On n'observe aucun halo autour de la bactérie transformée. CONSTITUTION D'UN PLASMIDE NAVETTE BACTERIE LEVURE On isole ensuite un fragment d'ADN contenant la séquence PGL1-2 à partir du plasmide pPGX100 et à l'aide des enzymes de restriction BamHl et Hindlll, et on clone le fragment d'ADN obtenu dans le plasmide pVT102U préalablement digéré par les mêmes enzymes... On obtient un plasmide recombinant qu'on appelle pPGL1-2, et dont on vérifie la bonne construction en déterminant sa séquence- de nucléotides. Une fois les plasmides recombinants construits, on les introduit donc chacun dans une levure dépourvue d'activités pectolytiques. TRANSFORMATION DE LA LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Exemple 3: essai avec la souche transformée ura3Atrpl -4[pPGL1 -11 Le micro-organisme hôte est une souche dérivée de Saccharomyces cerevisiae FL 100 (ATCC 28583) appelée ura3Atrpl-4 dans laquelle on introduit le plasmide pPGL1-1 par électroporation (25 pF, 12,5 kV/cm, 2 000 Q) selon la méthode de Becker et Guarente déjà mentionnée. Cette souche transformée est cultivée à 30 C dans un milieu SD se composant de 6,7 g/I de Yeast Nitrogen Base (DIFCO) sans acides aminés, 10 g/I de glucose, et 50 pg/ml de tryptophane. Ce milieu ne permet que la croissance des souches qui ont été transformées. La souche avant transformation a été cultivée à 30 C dans le milieu Yeast Peptone Glucose, Il contenant 10 g/I de bactopeptone (BIOKAR DIAGNOSTICS), 10 g/I d'extrait de levure (DIFCO) et 20 g/I de glucose. Afin de savoir si la souche ura3Atrpl-4[pPGL1-1] produit ou non une polygalacturonase extracellulaire, on utilise la méthode au rouge de ruthénium décrite précédemment. Au bout d'une journée, on constate que la levure transformée est entourée d'un large halo. Exemple comparatif 3: essai avec la souche transformée ura3Atrp14[PPGL1-21 On utilise la même souche-hôte que dans l'exemple 3, dans laquelle on introduit par électroporation (25 pF, 12,5 kV/cm, 2 000 Q) le plasmide pPGL1-2. On cultive la souche transformée dans le même milieu que celui utilisé dans l'exemple 3 et on utilise la méthode décrite précédemment-sur milieu solide et avec coloration par le rouge de ruthénium. On n'observe aucun halo autour de la levure, qui ne produit donc pas de polygalacturonase extracellulaire. SECRETION DE LA POLYGALACTURONASE CLONEE Afin d'étudier l'expression de la polygalacturonase par la souche ura3Atrpl-4[pPGL1-1], les présents inventeurs ont utilisé la méthode de Cruickshank et Wade décrite dans " Detection of pectic enzymes in pectin- acrylamide gels " Anal. Biochem. 107 (1980) 177-181, en remplaçant la procédure d'incubation par une incubation directe dans un tampon acétate contenant du rouge de ruthénium. Le milieu de culture utilisé pour la croissance de la souche transformée contient 6,7 g/I de Yeast Nitrogen Base (DIFCO) sans acides aminés, 1% de glucose, 50 pg/ml de tryptophane dans un tampon phosphate 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 5,5). 12 2774999 PRODUCTION DE LA POLYGALACTURONASE RECOMBINANTE EN AEROBIE ET EN ANAEROBIE On fait incuber une partie des cultures à 30 C dans des conditions aérobies et l'autre partie dans des conditions anaérobies. Pour chacun des deux types de culture, on recueille ensuite 1 ml de milieu de culture qu'on centrifuge pendant 5 minutes à 1000 g pour éliminer les cellules de levure. Les protéines présentes dans le liquide surnageant sont précipitées par addition de 3 ml d'acétone à 4 C. On les récupère sous forme de culot par centrifugation à 4000 g pendant 5 minutes, à une température de 4 C. Ce culot est ensuite dissous dans un tampon acétate 50 mM (pH 4) puis analysés par zymogramme, c'est à dire par électrophorèse sur gel selon la méthode de Laemmli décrite dans " Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 " Nature 227 (1970) 680- 685, dans des conditions non dénaturantes, sur des gels contenant 10% d'acrylamide et 0,1% d'acide polygalacturonique. La séparation électrophorétique est effectuée à 4 C et à tension constante (150 V). Après migration, le gel est immergé dans de l'acide maleique 0,1M afin de l'équilibrer à un pH compatible avec l'activité de la polygalacturonase (voir p. 13). Puis, il est mis à incuber pendant 1-2 heures dans un tampon acétate mM (pH 4) contenant 0,02% de rouge de ruthénium. Après révélation, on constate que la polygalacturonase codée par le gène PGL1-1 est produite aussi bien en aérobie qu'en anaérobie. On constate également que les conditions d'aérobie augmentent la production de l'enzyme. SUREXPRESSION DU GENE Afin de vérifier que la souche ura3Atrpl-4[pPGL1-1] surexprime bien le gène, on compare sa production de polygalacturonase avec celle de la souche C.94. On constate que la souche ura3Atrpl-4[pPGL1-1] fournit de à 1000 fois plus de polygalacturonase que la souche d'origine C.94. Le but essentiel de la présente invention, à savoir la possibilité de produire cette enzyme de façon industrielle, est donc bien atteint. En outre, la souche ura3Atrpl-4[pPGL1-1] ne produisant pas d'autre enzyme que la polygalacturonase, celle-ci peut être obtenue sans aucune autre activité enzymatique et a fortiori sans activité enzymatique indésirable. La polygalacturonase produite grâce à la transformation de la souche- hôte par le plasmide recombinant a ensuite été étudiée pour établir ses caractéristiques. PH OPTIMAL DE LA POLYGALACTURONASE Le milieu de culture contenant l'enzyme secrétée a été analysé par électrophorèse en présence de substrat (méthode du zymogramme). Après une électrophorèse effectuée dans les conditions décrites précédemment, le gel est séparé en bandes et chaque bande est mise à incuber dans des tampons 50 mM de pH variés allant de 1,1 à 11,0, pendant 7 heures à 30 C. Les réactions sont stoppées par une incubation d'une heure dans de l'acide maléique 0,1M et les bandes sont révélées avec du rouge de ruthénium. On constate que la polygalacturonase est active pour des pH allant de 3 à 5,5, l'optimum se situant entre 3 et 4. On pourra noter que ce pH d'activité est particulièrement intéressant car proche de celui de la plupart des jus de fruits et des liquides alimentaires, d'o une utilisation particulièrement efficace dans l'agro-alimentaire. Pour mémoire, on rappellera que les préparations pectolytiques issues d'Aspergillus niger présentent un pH optimal d'activité de 5,5. TEMPERATURE OPTIMALE D'ACTIVITE DE LA POLYGALACTURONASE L'activité enzymatique a été mesurée à différentes températures, afin de déterminer l'optimum en utilisant la technique précédemment décrite du zymogramme et en faisant incuber les bandes de gel à différentes températures dans du tampon acétate 50 mM (pH 4) pendant 20 heures. Il apparaît que la polygalacturonase est active de 4 C à 50 C avec un maximum entre 22 et 40 C ce qui la rend utilisable dans la plupart des procédés d'élaboration de jus de fruits et dans les vinifications. STABILITE DE LA POLYGALACTURONASE La solution enzymatique est mise à incuber à des températures variant de 4 C à 80 C pendant 5 minutes. Les différents essais sont ensuite soumis à la technique du zymogramme en faisant incuber les bandes de gels à 30 C dans un tampon acétate 50 mM (pH 4). On constate que l'activité de la polygalacturonase ne décroît pas jusqu'à 50 C. SPECTRE D'ACTIVITE La polygalacturonase agit sur des pectines dont le degré d'estérification varie entre 0 et 80%, ce qui recouvre la majorité des pectines naturelles. Actuellement, pour dégrader les pectines dont le degré d'estérification est supérieur à 50-65%, il faut la présence d'au moins deux enzymes pectolytiques voire de trois. L'ensemble de ces caractéristiques montre que la polygalacturonase obtenue peut être utilisée de façon très large aussi bien pour clarifier des jus de fruits et des moûts contenant des pectines, que pour améliorer les vinifications ou que pour traiter du bois ou des matières textiles, ainsi que dans le domaine agro-alimentaire. PROCEDE DE FABRICATION INDUSTRIELLE On cultive la souche de levure transformée à l'aide d'un milieu adéquat tel que celui décrit en p.10 dans l'exemple 3 dans un fermenteur classique. Puis, le milieu de culture est débarrassé des micro-organismes par passage sur un filtre à bandes. Le filtrat est ensuite soumis à une ultrafiltration avec un seuil de coupure de 30 000 Da. Le filtrat obtenu est alors éventuellement soumis à une microfiltration tangentielle avec un seuil de coupure de 20 000 Da. Le rétentat est enfin séché par atomisation dans un sécheur industriel, ou par tout autre procédé de séchage adéquat. Un fermenteur de 1000 litres permet ainsi de recueillir en moyenne entre 200 et 250 grammes de poudre active. Il va de soi que les différents modes de réalisation de.l'invention qui ont été décrits ci-dessus ont été donnés à titre. d'exemples purement indicatifs et nullement limitatifs, et que de nombreuses modifications peuvent être facilement apportées par l'homme de l'art sans pour autant sortir du cadre de l'invention. SEQ ID NO:1 1) INFORMATIONS CONCERNANT SEQ ID NO:1 i) CARACTEÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE: A) LONGUEUR: 1 086 paires de base B) TYPE: acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS: double brin D) CONFIGURATION: linéaire ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN génomique iii) HYPOTHÉTIQUE: non iv) ANTI-SENS: non vi) ORIGINE: A) ORGANISME: Saccharomyces cerevisiae B) SOUCHE: C.94 xi) DESCRIPTION DE SÉQUENCE: SEQ ID NO:1 ATGATTTCTG CTAATTCATT ACTTATTTCC ACTTTGTGCG CTTTTGCGAT CGCAACACCT 60 TTGTCAAAAA GAGATTCCTG TACCCTAACA GGATCTTCTT TGTCTTCACT CTCAACCGTG 120 AAAAATGTA GCAGCATCGT TATTAAAGAC. TTAACTGTCC. CAGCTGGACA GACTTTAGAT.. 180 TTAACTGGGT TAAGCAGTGG TACTACTGTT ACGTTTGAAG GCACAACCAC -ATTTCAGTAC 240 AAGGAATGGA GCGGCCCTTT AATTTCAATC TCAGGGTCTA AAATCAGCGT TGTTGGTGCT 300 TCGGGACATA CCATTGATGG TCAAGGAGCT AAATGGTGGG ATGGCTTAGG TGATAGCGGT 360 AAAGTCAAAC CGAAGTTTGT AAAGTTGGCG TTGACGGGAA CGTCTAAGGT CACCGGATTG 420 AATATTAAAA ATGCTCCACA CCAAGCCTTC AGCATCAATA AATGTTCAGA TTTAACCATC 480 AGTGACATAA CAATTGATAT CAGAGACGGT GATTCGGCTG GTGGTCATAA TACGGATGGG 540 TTTGATGTTG GTAGTTCTAG TAACGTCTTA ATTCAAGGAT GTACTGTTTA TAATCAGGAT 600 GACTGTATTG CTGTGAATTC CGGTTCAACT ATTAAATTTA TGAACAACTA CTGCTACAAT 660 GGCCATGGTA TTTCTGTAGG TTCTGTTGGT GGCCGTTCTG ATAATACAGT CAATGGTTTC 720 TGGGCTGAAA ATAACCATGT TATCAACTCT GACAACGGGT TGAGAATAAA AACCGTAGAA 780 GGTGCGACAG GCACAGTCAC TAATGTCAAC TTTATCAGTA ATAAAATTAG CGGCATAAAA 840 AGTTATGGTA TTGTTATCGA AGACGATTAT TTGAATGGTA AGACTACTGG AACTGCTACA 900 GGTGGCGTTC CCATTTCGAA TTTAGTAATG AAGGATATCA CCGGGAGCGT GAACTCCACA 960 GCGAAGAGGG TTAAMAATTTT GGTGMAAAAC GCTACTAACT GGCAATGGTC TGGGGTGTCA 1020 ATTACCGGTG GTTCTTCCTA TTCTGGATGT TCTGGAATCC CATCTGGATC TGGTGCAAGC 1080 TGTTAA 1086 17 2774999 SEQ ID NO:2 1) INFORMATIONS CONCERNANT SEQ ID NO:2 i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE: A) LONGUEUR: 1 083 paires de base B) TYPE: acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS: double brin D) CONFIGURATION: linéaire ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN génomique iii) HYPOTHÉTIQUE: non iv) ANTI-SENS: non vi) ORIGINE: A) ORGANISME: Saccharomyces cerevisiae B) SOUCHE: C.94 ix) CARACTÉRISTIQUE: A) NOM / CLÉ: séquence codante B) LOCALISATION: 1..1 083 D) AUTRES INFORMATIONS: gène codant pour une polygalacturonase. xi) DESCRIPTION DE SÉQUENCE: SEQ ID NO:2 ATG ATT TCT GCT AAT TCA TTA CTT ATT TCC ACT TTG TGC CCT TTT GCG 48 Met lie Ser Ala Asn Ser Leu Leu lie Ser Thr Leu Cys Ala Phe Ala 1 5 10 15 ATC GCA ACA CCT TTG TCA AAA AGA GAT TCC TGT ACC CTA ACA GGA TCT 96 lie Ala Thr Pro Leu Ser Lys Arg Asp Ser Cys Thr Leu Thr Gly Ser 25 30 TCT TTG TCT TCA CTC TCA ACC GTG AAA AAA TGT AGC AGC ATC GTT ATT 144 Ser Leu Ser Ser Leu Ser Thr Val Lys Lys Cys Ser Ser lie Val lie 40 45 AAA GAC TTA ACT GTC CCA GCT GGA CAG ACT TTA GAT TTA ACT GGG TTA 192 Lys Asp Leu Thr Val Pro Ala Gly Gln Thr Leu Asp Leu Thr Gly Leu 55 60 AGC AGT GGT ACT ACT GTT ACG TTT GAA GGC ACA ACC ACA TTT CAG TAC 240 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Phe Glu Gly Thr Thr Thr Phe GIn Tyr 70 75 80 AAG GAA TGG AGC GGC CCT TTA ATT TCA ATC TCA GGG TCT AAA ATC AGC 288 * Lys Glu Trp Ser Gly Pro Leu lie Ser lie Ser Gly Ser Lys lie Ser 90 95 GTT GTT GGT GCT TCG GGA CAT ACC ATT GAT GGT CAA GGA GCT AAA TGG 336 Val Val Gly Ala Ser Gly His Thr lie Asp Gly Gin Gly Ala Lys Trp 105 110 TGG GAT GGC TTA GGT GAT AGC GGT AAA GTC AAA CCG AAG TTT GTA AAG 384 Trp Asp Gly Leu Gly Asp Ser Gly Lys Val Lys Pro Lys Phe Val Lys 120 125 TTG GCG TTG ACG GGA ACG TCT AAG GTC ACC GGA TTG AAG ATT AAA AAT 432 Leu Ala Leu Thr Gly Thr Ser Lys Val Thr Gly Leu Asn lie Lys Asn 135 140 GCT CCA CAC CAA GCC TTC AGC ATC AAT AAA TGT TCA GAT TTA ACC ATC 480 Ala Pro His Gin Ala Phe Ser lie Asn Lys Cys Ser Asp Leu Thr lie 150 155 160 AGT GAC ATA ACA ATT GAT ATC AGA GAC GGT GAT TCG GCT GGT GGT CAT 528 Ser Asp lie Thr lie Asp lie Arg Asp Gly Asp Ser Ala Gly Gly His 170. 175 AAT ACG GAT GGG TTT CGAT GTT GGT AGT TCT AGT AAC GTC TTA ATT CAA 576 Asn Thr Asp Gly Phe Asp Val Gly Ser Ser Ser Asn Val Leu.lie Gin 185 190 GGA TGT ACT GTT TAT AAT CAG GAT GAC TGT ATT GCT GTG AAT TCC GGT 624 Gly Cys Thr Val Tyr Asn Gin Asp Asp Cys ile Ala Val Asn Ser Gly 200 205 TCA ACT ATT AAA TTT ATG AAC AAC TAC TGC TAC AAT.GGC.CAT GGT ATT 672 Ser Thr lie Lys Phe Met Asn Asn Tyr Cys Tyr Asn Gly His Gly lle 210 215 220 TCT GTA GGT TCT GTT GGT GGC CGT TCT GAT AAT ACA GTC AAT GGT TTC 720 Ser Val Gly Ser Val Gly Gly Arg Ser Asp Asn Thr Val Asn Gly Phe 225 230 235 240 TGG GCT GAA AAT AAC CAT GTT ATC AAC TCT GAC AAC GGG TTG AGA ATA 768 Trp Ala Glu Asn Asn His Val lie Asn Ser Asp Asn Gly Leu Arg lle 245 250 255 AAA ACC GTA GAA GGT GCG ACA GGC ACA GTC ACT AAT GTC AAC TTT ATC 816 Lys Thr Val Glu Gly Ala Thr Gly Thr Val Thr Asn Val Asn Phe lle 260 265 270 AGT AAT AAA ATT AGC GGC ATA AAA AGT TAT GGT ATT GTT ATC GAA GAC 864 Ser Asn Lys lie Ser Gly lie Lys Ser Tyr Gly lie Val lie Glu Asp 275 280 285 SO JaS elv' A19 JaS À1O JeS OJd 9li L L9L Wd VDD IDE.LD0L VDD LDI VDD DJN OSú Snú Otú 19 J'eS sOk A19 JaS JAJ JaS JaS A19 A19 Jqil a11 JaS leA XI) JOS 990[ VD9 LD.L9L 9. D V L L.L DD LDL 99 L99D DDV. Lv VDL 3L9 999 LDL SúE 0úM SZú djL ul d iJ usv JlI eIV usy sK-1 le\ na-1 all ski leA 6Jv ski ely 800L 39L WVD D99L DvV LY LD 9 Dvv W 9v L 9..LL L.V v ID 99Ev 9qw 939 Jq.L JaS usV leA JaS I19 Jqi all dsv s-l 1a9v leA nael usV Jas all 096 vDv DDL nW 9L9D 39 999 DD Div Ivq 9/ D.TV V.E)9 vii, 1v 9DI LúV 00ú 96Z 06Z OJd lea\ I9 ÀI9 JqJ. elV Jq. I. t9 JqJ. JqL1 sÀ-1 AI9E usV nle JA.L dsv Z1,6 DDD LL9 D9D 99 J VDV ID9 IDv V9D LDV &LDV 9qw L99 JV 9LL. IVI V9 666tLLZ REVENDICATIONS 1. Polygalacturonase caractérisée en ce qu'elle peut être préparée par expression du gène de structure selon SEQ ID NO:2 introduit par génie génétique dans le génome d'un micro-organisme. 2. Polygalacturonase caractérisée en ce qu'elle peut être préparée par expression du plasmide pPGLI-1 contenu dans la levure Saccharomyces cerevisiae déposée sous le numéro MUCL 40781 auprès des Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) à Louvain (Belgique). 3. Plasmide recombinant qui contient le gène de structure selon SEQ ID NO:2. 4. Plasmide pPGLI1-1, contenu dans la levure Saccharomyces cerevisiae déposée sous le numéro MUCL 40781 auprès des Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) à Louvain (Belgique). 5. Souche de levure produisant une polygalacturonase, en particulier de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, caractérisée par sa teneur en un gène de structure selon SEQ ID NO:2, introduit dans son génome par génie génétique. 6. Souche de levure produisant une polygalacturonase, en particulier de I'espèce Saccharomyces cerevisiae, caractérisée par sa teneur en un plasmide selon l'une ou l'autre des revendications 3 et 4. 7. Souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae déposée sous le numéro MUCL 40781 auprès des Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) à Louvain (Belgique). 8. Procédé de préparation d'une polygalacturonase caractérisé en ce que l'on cultive de manière usuelle une levure selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, et en ce que l'on récupère, à partir du surnageant surnageant de la culture, la polygalacturonase formée. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit surnageant de culture est soumis à une ultrafiltration avec un seuil de coupure de 30 000 Da, suivie éventuellement d'une microfiltration tangentielle avec un seuil de coupure de 20 000 Da, et d'un séchage par atomisation ou par un autre procédé de séchage industriel. 10. Utilisation de la polygalacturonase selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2 pour la clarification de jus de fruits et de moûts contenant des pectines. 11. Utilisation de la polygalacturonase selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2 dans le domaine agro-alimentaire.