Brevet FR2774094A1 — publié le 19990730

Procédé de purification de sulfoquinovosyldiacylglycérol par chromatographie de partage centrifuge. La présente invention concerne le domaine des procédés de séparation et de purification. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de purification d'un sulfolipide appartenant à la classe des glycolipides constitué par le 6 sulfo-ot-D-quinovopyranosyl (1-3')-1',2'-diacyl-sn-glycérol, ci-après dénomé "sulfoquinovosyldiacylglycérol" (en abrégé SQDG). Le SQDG est un constituant lipidique des membranes photosynthétiques. Ce composé est localisé dans les membranes chloroplastiques de tous les organismes photosynthétiques : végétaux chlorophylliens, algues, cyanobactéries. Ce composé se caractérise par l'association de deux acides gras, estérifiés en position 1 et 2 du sn-glycérol, et du quinovose en position 3. Le quinovose est un des hexoses isomère du glucose qui n'est trouvé que dans cette molécule et dans aucun autre glucide ou polysaccharide ni aucune glycoprotéine. Ce composé est par ailleurs porteur d'un radical sulfate en position 6 qui lui confère une charge négative. Il peut être représenté par la formule développée (I) suivante: dans laquelle Ri et R2 représentent des acides gras identiques ou différents. Ce composé est trouvé à l'état naturel en quantités parfois abondantes notamment dans les membranes de certaines micro-algues, telles que Porphyridium cruentum ou Skeletonema costatum, mais aussi chez certains végétaux supérieurs tels que les épinards. Les sulfolipides (ou plus particulièrement le SQDG) représentent une classe moléculaire parmi les lipides. On peut cependant distinguer différents types moléculaires selon la nature des deux acides gras estérifiés sur le glycérol. Certaines molécules pourront porter deux acides gras identiques alors que d'autres porteront deux acides gras différents, soit par la longueur de leur chaîne carbonée, soit par le nombre de doublesliaisons. Compte-tenu des modes de biosynthèse des molécules lipidiques qui ont été élucidés chez les plantes supérieures et chez certaines cyanobactéries, il convient de distinguer parmi les types moléculaires de sulfolipides ceux qui contiennent des acides gras à 18 carbones en position 1 du glycérol et des acides gras à 16 carbones en position 2, de ceux qui contiennent des acides gras à 18 carbones en positions 1 et 2 du glycérol. Les premiers types moléculaires sont les seuls présents chez les cyanobactéries et sont liés au métabolisme dit procaryotique des lipides. Ils sont retrouvés dans les chloroplastes et résultent alors du métabolisme lipidique interne aux chloroplastes mais ils sont accompagnés du second type moléculaire qui résulte, lui, d'une interaction métabolique entre chloroplastes et cytoplasme. Ainsi, le choix d'un organisme pour l'extraction sélective de sulfolipides conditionne les types moléculaires qui seront obtenus. Les cyanobactéries ne conduisent qu'à des sulfolipides contenant les associations 1-C18 / 2 C16 plus ou moins insaturées alors que les végétaux supérieurs conduisent à des mélanges d'associations 1-C18/2-C16 plus ou moins insaturées avec des associations 1 C18/2-C18 plus ou moins insaturées. Quant aux algues brunes ou rouges, elles offrent l'exceptionnelle particularité de présenter, en plus des végétaux supérieurs, des associations 1-C20/2-C20 plus ou moins insaturées. En conséquence, selon la source dont il provient, le SQDG pourra présenter des radicaux d'acides gras différents. On entend toutefois dans la présente description le terme "sulfoquinovosyldiacylglycérol" (SQDG) comme visant tout sulfoquinovosyldiacylglycérol, quel que soit la nature des acides gras rentrant dans sa composition. L'activité antivirale du SQDG a été mise en évidence in vitro par Gustavson et al. en 1989 dans le cadre de recherches sur le virus responsable du SIDA (HIV). Ces travaux sont décrits dans l'article intitulé "AIDS-antiviral sulfolipides from cyanobacteria (blue green algae)" paru dans J. Natl. Cancer. I. 81, 1254-1258. L'activité du SQDG sur d'autres virus, tels que influenza B et influenza H2N2 (virus responsables de la grippe), Herpex simplex (virus responsable de l'herpès) et le virus responsable de la fièvre jaune a également été prouvée. D'autres études ont également prouvé l'activité anti-tumorale in vitro du SQDG. Compte-tenu du grand intérêt biomédical potentiel de ce composé, il est souhaitable de disposer d'un procédé permettant de le purifier, à partir d'extraits de produits naturels tels que, notamment, ceux mentionnés ci-dessus. Il est bien connu d'obtenir la fraction lipidique totale de produits d'origine naturelle, constituée de phospholipides, de glycolipides et de lipides neutres et, à partir de cette fraction, d'isoler la fraction contenant seulement les glycolipides. La fraction lipidique totale peut ainsi être obtenue par la méthode décrite par Bligh et Dyer en 1959 ("A rapid method of total extraction and purification" - Can. J. Biochem. Phys. 37,911917-). L'isolement des glycolipides peut être obtenu quant à lui par la méthode décrite en 1976 par Rouser et al. (Lipid Chomat. Anal. 3,713). Chez les microalgues, la fraction glycolipidique, est essentiellement constituée de trois types de composés, à savoir: - le monogalactosyldiacylglycérol, en abrégé : MGDG; - le digalactosyldiacylglycérol, en abrégé : DGDG ; et, - le sulfoquinovosyldiacylglycérol. A partir de cette fraction contenant l'ensemble des glycolipides, il est possible de séparer et de purifier chaque classe de glycolipides par des procédés classiques de chromatographie et notamment par chromatographie sur couche mince. Toutefois, ces méthodes classiques, bien que permettant d'aboutir en général à des produits purs présentent de nombreux inconvénients. En premier lieu, de tels procédés ne peuvent être mis en oeuvre qu'en procédant manuellement au traitement des plaques de chromatographie afin d'isoler la partie de cellesci où le SQDG a migré. On comprend qu'une telle opération est longue et délicate à mettre en oeuvre et rend impossible l'industrialisation du procédé. Ce problème est accru par le fait que ces techniques ne permettent de traiter que des quantités très limitées d'extraits et présentent donc une productivité faible. Enfin, on notera que de telles méthodes impliquent, d'une part, l'utilisation de supports solides coûteux et qu'il faut traiter après utilisation et, d'autre part, l'emploi de solvants chlorés dont l'utilisation n'est pas sans risque ou non applicable en industrie. Le principal objectif de la présente invention est de fournir un procédé pouvant être mis en oeuvre industriellement et permettant d'obtenir le sulfoquinovosyldiacylglycérol avec un degré de pureté très élevé, en pratique proche de 100%. Un autre objectif de l'invention est de décrire un tel procédé qui puisse être mis en oeuvre en l'absence de solvant chloré et sans support solide. Encore un objectif de l'invention est de divulguer un tel procédé présentant un intérêt économique accru par rapport aux techniques classiques de chromatographie. Ces différents objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé de purification de sulfoquinovosyldiacylglycérol à partir d'un extrait de glycolipides totaux provenant d'un produit d'origine naturelle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à soumettre ledit extrait de glycolipides totaux à une chromatographie de partage centrifuge. La chromatographie de partage centrifuge est une technique de séparation basée sur la séparation de solutés en fonction de leur coefficient de partage entre les phases immiscibles d'un système de solvants. Cette technique met donc en oeuvre deux phases liquides : une phase liquide stationnaire dans laquelle percole une phase liquide mobile, et présente par conséquent l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation de supports solides. Une telle technique présente également l'avantage, par rapport aux technologies classiques de chromatographie, de permettre la séparation de quantités beaucoup plus importantes d'extraits. Enfin, on notera que la chromatographie de partage centrifuge induit une consommation plus réduite en solvants en regard d'autres techniques chromatographiques, d'où son intérêt économique accru. On notera qu'il avait déjà été envisagé d'utiliser la chromatographie de partage centrifuge pour purifier des taxoides (désacétyl-lO baccatine III et taxotère). Une telle technique est décrite dans la demande de brevet FR2703049. Il a également été proposé par les Déposants, d'utiliser cette technique pour purifier des phospholipides, notamment la phosphatydylcholine, présentant une teneur élevée en acide gras polyinsaturés à longue chaîne, à partir d'un extrait de phospholipides totaux provenant d'un produit d'origine naturelle. Une telle technique est décrite dans la demande de brevet FR2750133. Toutefois, ces taxoides et ces phospholipides sont des molécules de formules chimiques différentes du sulfoquinovosyldiacylglycérol auquel s'intéresse la présente invention. Cette différence rend non évidente l'utilisation de la technique de chromatographie par partage centrifuge pour d'autres composés que les taxoides ou les phospholipides. De façon préférentielle, ladite étape de chromatographie de partage centrifuge selon l'invention est mise en oeuvre avec un système solvant formé d'un premier solvant choisi dans le groupe constitué par l'heptane et l'isooctane, d'un deuxième solvant constitué par l'acétate d'éthyle et d'un troisième solvant constitué par l'acétonitrile. De façon préférée entre toutes, ledit premier solvant est l'heptane, ce composé présentant l'avantage d'être moins coûteux que l'isooctane. Selon une caractéristique préférentielle de l'invention, ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 19 à 21 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol. De façon préférée entre toutes, le système solvant est utilisé avec les proportions suivantes : heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 20 % vol, acétonitrile 30 % vol. Selon une variante de l'invention, ledit produit à partir duquel est obtenu la fraction de glycolipides est une micro-algue. Avantageusement, ladite micro-algue est choisie dans le groupe constitué par Porphyridium cruentum et Skeletonema costatum. Comme précisé ci-dessus, de telles micro-algues présentent l'avantage de renfermer des quantités importantes de sulfoquinovosyldiacylglycérol. L'invention couvre également le sulfoquinovosyldiacylglycérol purifié obtenu selon le procédé décrit ci-dessus. Enfin, l'invention couvre également l'utilisation du sulfoquinovosyldi acylglycérol purifié en tant que standard dans une méthode chromatographique. Un tel sulfoquinovosyldiacylglycérol présente en effet l'avantage de montrer une pureté chromatographique d'environ 100 % qui le rend tout a fait adapté pour être utilisé en tant qu'étalon dans les méthodes de caractérisation par chromatographie. L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente, seront plus facilement compris grâce à la description qui va suivre d'un exemple non limitatif de mise en oeuvre du procédé qu'elle propose. Cet exemple de mise en oeuvre de l'invention a consisté, à partir d'une fraction contenant les glycolipides extraits de la diatomée marine Skeletonema costatum, à purifier le sulfoquinovosyldiacylglycérol contenu dans cette fraction. Dans un premier temps, on a donc isolé les lipides totaux contenus dans une pâte algale de Skeletonema costatum obtenue par centrifugation et contenant environ 10 % de matière sèche, dont approximativement 12 % de composés lipidiques, en mettant en oeuvre la méthode de Bligh et Dyer (voir Can. J. Biochem. Phys., vol. 37, pp 911-917). Le fractionnement des lipides totaux en lipides neutres, glycolipides et phospholipides a été ensuite effectué par chromatographie sur colonne ouverte de gel de silice selon la méthode décrite par Rouser et al. Dans ce cadre, un extrait lipidique contenant environ lg de lipides totaux a été déposé sur une colonne préparée à partir de 30 g de silice (silica gel 60, 70-230 mesh, commercialisé par la société MERCK) préalablement suspendue dans du chloroforme et les lipides neutres ont été élués par 11 de chloroforme et les glycolipides par 1,5 l d'un mélange acétone / méthanol (9:1, v:v). Les solvants de la fraction glycolipidique ont été évaporés au rotovapor et les traces résiduelles ont été éliminées sous azote. Dans un second temps, le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur la fraction de glycolipides totaux, grâce à un appareil de chromatographie de partage centrifuge KROMATON m (commercialisé par la société SEAB, Villejuif, France). Cet appareil permet au choix de travailler en version analytique (colonne de volume 200 ml), en version préparative (à un volume de 400 ml ou 11) ou en version production (à un volume de 2 1 ou 2,4 1). Dans le cadre du présent exemple de réalisation, la colonne de 200 ml a été utilisée. On notera que la présente invention pourra être mise en oeuvre avec d'autres types d'appareils que le KROMATON III, fonctionnant soit en mode hydrodynamique, soit en mode hydrostatique. Selon l'invention, on a utilisé un système solvant constitué de trois solvants, à savoir l'heptane, l'acétate d'éthyle et l'acétonitrile dans les proportions volumiques suivantes: heptane: 50 % ; acétate d'éthyle: 20 % ; acétonitrile: 30%. Les essais ont été effectués en dissolvant 100 mg de la fraction glycolipidique dans 5 ml de phase mobile et en injectant ce mélange dans la colonne analytique de l'appareil cité ci-dessus. La phase mobile est la phase inférieure du système de solvant. Une inversion du sens chromatographique (Dual mode) est réalisée au tube 20 après l'équilibre. Le SQDG est alors obtenu dans la phase mobile supérieure. La vitesse de rotation a été fixée à 500 tr / mn. Le débit de la phase mobile a été fixé à 2 ml / mn. La température de l'enceinte du chromatographe a été maintenue à 20"C grâce aux moyens de régulation de l'appareil. Le fractionnement a été réalisé toutes les 2 mn. Après évaporation des solvants sous azote, les fractions purifiées ont été reprises dans un mélange de benzène/éthanol 4:1 (v:v) et stockées à - 4"C. L'analyse des fractions de SQDG obtenues après séparation a été effectuée par chromatographie planaire sur couche mince effectuée sur deux plaques de silice (commercialisées par la société MERCK sous la référence 60 F254) préalablement lavées à l'isopropanol et séchées à 100 "C pendant 30 mn. On a utilisé un système éluant constitué du mélange chloroforme / méthanol / eau dans les proportions volumiques 65:25:4 (v I v/v). La révélation de la première plaque a été est réalisée par trempage rapide de celle-ci dans une solution de primuline. Après séchage, l'observation de la séparation a été réalisée sous UV à 366 nm. La révélation de la seconde plaque a été effectuée par pulvérisation d'une solution d'orcinol à 2 mg/ml dans de l'acide sulfurique à 70 %. Cette solution est spécifique des sucres qui donnent une couleur brune après chauffage à 100"C pendant 10 à 15 mn. Une photographie de la plaque après révélation est représentée à la figure 1. Sur cette figure, la tâche de gauche correspondant au SQDG purifié, la tâche du milieu correspond à un standard de monogalactosyldiacylglycérol, et la tâche de droite représente un standard de digalactosyldiacylglycérol. Les zones des dépots ont été symbolisées par trois traits pleins tandis que le front de solvant a été symbolisé par une ligne pointillée. L'identification des composés a été effectuée par comparaison avec le comportement chromatographique de standards. L'analyse et la caractérisation de la fraction purifiée a permis d'observer une pureté chromatographique de l'ordre de 100 % pour ce composé. Le présent exemple de réalisation de l'invention n'a pas pour objet de réduire la portée de l'invention. I1 pourra donc y être apporté de nombreuses modifications sans sortir de son cadre tel que défini par les revendications annexées. En particulier, on notera que le procédé selon l'invention pourra bien sûr être mis en oeuvre sur d'autres produits que ceux mentionnés dans cet exemple. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification de sulfoquinovosyldiacylglycérol à partir d'un extrait de glycolipides totaux provenant d'un produit d'origine naturelle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à soumettre ledit extrait de glycolipides totaux à une chromatographie de partage centrifuge. 2. Procédé de purification selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de chromatographie de partage centrifuge est mise en oeuvre avec un système solvant formé d'un premier solvant choisi dans le groupe constitué par l'heptane et l'isooctane, d'un deuxième solvant constitué par l'acétate d'éthyle et d'un troisième solvant constitué par l'acétonitrile. 3. Procédé de purification selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit premier solvant est l'heptane. 4. Procédé de purification selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes: heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 19 à 21 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol. 5. Procédé de purification selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 20 % vol, acétonitrile 30 % vol. 6. Procédé de purification selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ledit produit est une micro-algue. 7. Procédé de purification selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite microalgue est choisie dans le groupe constitué par Porphyridium cruentum et Skeletonema costatum. 8. Sulfoquinovosyldiacylglycérol purifié caractérisé en ce qu'il a été obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7. 9. Utilisation du sulfoquinovosyldiacylglycérol purifié selon la revendication 8 pour constituer un standard dans une méthode chromatographique.