Brevet FR2778408A1 — publié le 19991112

Anticorps recombinants fluorescents La présente invention a pour objet de nouveaux anticorps recombinants fluorescents, un procédé de production de ces anticorps ainsi que leur utilisation en immunofluorescence. La plupart des tests rapides de diagnostic de molécules biologiques ou chimiques sont effectués à l'aide d'anticorps dont la specificité de reconnaissance permet de prouver la présence du produit recherché appelé antigène ou haptène. Les anticorps sont des protéines ou immunoglobulines, fabriquées par les cellules lymphocytaires B chez les mammifères et permettent au système immunitaire de reconnaître et d'éliminer les antigènes. La force d'interaction des anticorps avec leur cible est un élément-clé de ce processus. De plus, la diversité des anticorps produits par les cellules B est de l'ordre de 107 chez un individu non immunisé, ce qui traduit une quasi-infinie possibilité de reconnaissance d'antigènes à l'aide de ces molécules. Ces propriétés, associées à celle de la possibilité d'immortalisation de cellules B produisant des immunoglobulines de spécificité donnée (Kôhler G. & C. Milstein (1975) Nature 256, 495-497), font des anticorps un outil de choix pour réaliser in vitro des tests très sensibles de dépistage d'antigènes, généralement noyés dans une soupe biologique. Les tests courants (ELISA, western blot, immunocytochimrnie, immunofluorescence...) font ainsi appel à l'utilisation de deux types d'anticorps: des anticorps de spécificité précise pour la reconnaissance de l'antigène et des anticorps anti- immunoglobulines contenant un marqueur qui permettent de visualiser de façon indirecte la formation du complexe antigène-anticorps (Harlow E. & D.P. Lane (1989) "Antibodies: a Laboratory Manual", cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Ces tests, dits indirects, nécessitent toujours deux étapes d'incubation et présentent une bien meilleure sensibilité que ceux, dits directs, réalisés à l'aide d'un lot unique d'anticorps à la fois marqué in vitro et capables de fixer l'antigène car le marquage chimique altère de façon très variable la réactivité des anticorps. Les anticorps peuvent être maintenant produits à faible taux de façon recombinante à l'aide de bactéries de type Escherichia coli (E.coli) sous la forme de fragments Fab ou fragments simple-chaîne (scFv) contenant les domaines protéiques nécessaires et suffisants à la fixation de l'antigène. En effet, le clonage des ADNc de ces segments variables des anticorps permet, après insertion de leur séquence nucléotidique dans un vecteur d'expression procaryote, de sélectionner par criblage des colonies bactériennes exprimant la spécificité voulue. Cette approche de fabrication de fragments d'anticorps peut être avantageusement utilisée pour produire par fusion génétique des molécules directement marquées soit avec une enzyme, soit à la biotine et ce, sans perte apparente de capacité de liaison à l'antigène (Weiss E. & G. Orfanoudakis (1994) J. Biotechnol. 33, 43-53, Weiss E., J. Chatellier & G. Orfanoudakis (1995) Prot. Exp. & Purif. 5,509- 517). Ces fragments d'anticorps bifonctionnels recombinants permettent ainsi de réaliser des tests de diagnostic présentant une seule étape d'incubation. Néanmoins, l'utilisation d'enzymes requiert l'introduction de substrats spécifiques à ces enzymes et des étapes de lavage après chaque incubation, sources de longues manipulations supplémentaires. De plus, le taux de production de tels immunoconjugués recombinants chez E. coli reste faible. Leur utilisation dans les tests de diagnostic actuels est en conséquence limitée. Le demandeur, après de longues recherches, a maintenant découvert de nouveaux immunoconjugués ou anticorps recombinants ne présentant pas les inconvénients ci-dessus mentionnés. En effet, ces nouveaux immunoconjugués permettent d'effectuer des tests de diagnostic nécessitant une seule étape d'incubation et présentant une sensibilité de détection comparable à celle de la méthode indirecte. De plus, l'utilisation de ces immunoconjugués permet d'éviter, lors de leur révélation, l'apport dc substrats supplémentaires et les étapes de lavage après chaque incubation. La demanderesse a également découvert, de façon surprenante, que ces anticorps pouvaient être produits à un taux de production au moins aussi important, sinon plus important que celui des immunoconjugués produits jusqu'alors. Un objet de l'invention est donc constitué par de nouveaux anticorps recombinants fluorescents. D'autres objets de l'invention sont aussi l'ADN codant pour ces nouveaux anticorps recombinants, un vecteur contenant cet ADN tout comme des cellules hôtes transformées par ce vecteur. Un autre objet de l'invention est constitué par un procédé de production d'anticorps recombinants fluorescents. L'invention a encore pour objet l'utilisation de ces anticorps recombinants fluorescents en immunofluorescence et un procédé de détection les mettant en oeuvre. D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lecture de la description et des exemples qui suivent. L'anticorps recombinant de la présente invention est essentiellement caractérisé par le fait que ledit anticorps contient au moins un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et au moins un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène peut notamment correspondre à des fragments d'immunoglobulines contenant les domaines protéiques nécessaires à la fixation de l'antigène. Ces derniers peuvent, par exemple, correspondre à un fragment scFv, qui correspond à une protéine de fusion entre le domaine VH, partie variable de la chaîne lourde, (partie N-terminale) et le domaine VL, partie variable de la chaîne légère, (partie C-terminale) d'un anticorps monoclonal. Un autre exemple de domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène est un fragment Fab (fragment antigen binding) obtenu lors du clivage de la molécule d'immunoglobuline notamment par la papaine. Le fragment Fab est constitué par une chaîne légère et par une des deux moitiés de la chaîne lourde de l'immunoglobuline. Les domaines protéiques permettant la reconnaissance d'un antigène préférentiellement utilisés dans le cadre de la présente invention sont les fragments scFv. Le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence peut correspondre à toute protéine pouvant émettre de la lumière lorsqu'elle reçoit un rayonnement. Cette protéine peut, par exemple, être une protéine clonée à partir de la méduse Aequorea victoria qui peut conserver ses propriétés de fluorescence naturelle lorsqu'exprimée dans des bactéries (Chalfie M., Y. Tu, G. Euskirchen, W. Ward & D.C. Prasher (1994) Science 263, 802-805; Inouye S. & F.I. Tsuji (1994) FEBS Lett. 341, 277-280). En effet, des bactéries surexprimant cette protéine et illuminées en lumière bleue ou par des rayons ultra-violets (UV) émettent un intense signal de fluorescence verte. Cette protéine, appelée green fluorescent protein (GFP), a été depuis sa première description essentiellement utilisée pour des études de localisation et de trafic intracellulaires, à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes. Ce domaine protéique peut également correspondre à des GFP provenant d'autres méduses ou à des variants de la GFP tels que la GFPuv (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol 14,315-319) ou à une GFP mutée. Au sens de la présente invention, une GFP mutée correspond à: - un mutant de la GFP dont les propriétés de fluorescence de la GFP sont améliorées. De tels mutants peuvent notamment correspondre à la GFP dans laquelle la sérine (Ser 65) du chromophore a été substituée par une thréonine permettant d'obtenir une GFP présentant une fluorescence six fois plus intense, une résistance accrue à la photolyse et une insensibilité à la photoisomérisation; - un mutant de la GFP dont le spectre d'absorption et/ou d'émission est déplacé vers d'autres longueurs d'ondes; par exemple une GFP mutée, dont la tyrosine 66 de la GFP a été substituée par une histidine émet une fluorescence bleue. Un autre exemple de mutant correspond à la GFP dans laquelle la thréonine 203 a été remplacée par la tyrosine, mutant qui émet alors une lumière jaune d'une longueur d'onde supérieure à 520 nanomètres; - un mutant de la GFP dont la séquence nécessaire à l'expression de la protéine a été améliorée, tel que par exemple, la protéine appelée hRGP (humanized, red shifted green fluorescent protein) obtenue en modifiant certains codons de la GFP, mieux traduite que la GFP dans les cellules humaines. Ce domaine protéique peut également comprendre d'autres protéines associées à la protéine fluorescente comme par exemple une photoprotéine telle que l'aéquorine. Dans le cadre de la présente invention, la GFPuv est préférentiellement utilisée comme domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Un peptide de jonction peut relier le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Ce peptide doit notamment permettre de faciliter la formation post-traductionnelle du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et du domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Ce peptide de jonction peut notamment correspondre à un peptide de 5 à 30 acides aminés et plus particulièrement de 10 à 20 acides aminés. Un peptide de jonction préféré de la présente invention est le peptide de séquence suivante: ADAAPTVTSEDPRVPVEK. Les domaines protéiques et les peptides modifiés, comme par exemple par une substitution, délétion ou insertion ne modifiant pas ou améliorant les fonctions des peptides ou des protéines, par exemple de façon à augmenter la stabilité ou de favoriser le repliement fonctionnel, sont aussi compris dans le cadre de la présente invention. Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, le peptide de jonction relie l'extrémité C-terminale du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène à l'extrémité N- terminale du domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. La présente invention a aussi pour objet une séquence d'ADN codant pour un anticorps recombinant fluorescent tel que défini ci- dessus. Cette séquence d'ADN comprend notamment les séquences codantes pour le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène, le domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence et pour le peptide de jonction. La séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène peut correspondre à la séquence codante des domaines protéiques permettant la reconnaissance d'un antigène tels que décrits ci-dessus. Elle peut par exemple correspondre à l'ADNc d'un fragment Fab ou scFv. La séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence peut correspondre à la séquence codante de l'un quelconque des domaines protéiques permettant l'émission d'un signal de fluorescence tels que décrits ci-avant. Ces deux séquences codantes peuvent également être modifiées de façon à faciliter la formation post-traductionnelle des domaines protéiques correspondants. Ces séquences peuvent être directement accolées ou reliées entre elles par des séquences de jonction. Au sens de la présente invention, les séquences d'ADN codantes comprennent aussi les séquences dégénérées, les variants alléliques et les séquences mutées qui ne modifient pas ou qui améliorent les fonctions des séquences peptidiques codées, par exemple de façon à permettre d'augmenter la production des anticorps recombinants, d'augmenter leur stabilité ou de favoriser leur repliement fonctionnel. Ces modifications de la séquence d'ADN peuvent être effectuées en utilisant des techniques connues de l'homme du métier. De même, les techniques de mutation sont connues de l'homme du métier. Un autre objet de l'invention est aussi un vecteur contenant une séquence d'ADN codant pour un anticorps recombiné telle que définie ci- dessus et un promoteur de transcription permettant d'induire l'expression de cette séquence d'ADN dans une cellule hôte. La séquence d'ADN comprenant l'information génétique nécessaire pour l'expression des anticorps de la présente invention peut être comprise dans tout vecteur couramment utilisé par l'homme du métier. Ce vecteur pourra être adapté en fonction des cellules, eucaryotes ou procaryotes, dans lesquelles la production d'anticorps est effectuée. Préférentiellement, pour les procaryotes, ce vecteur est un plasmide comprenant au moins une origine de réplication et un gène marqueur permettant de sélectionner les cellules recombinées. Préférentiellement, pour les cellules eucaryotes, ce vecteur comporte un gène marqueur permettant de sélectionner les cellules recombinées et, facultativement, une origine de réplication eucaryote. De tels vecteurs sont, par exemple le vecteur pcDNA/Amp, commercialisé par la société In Vitrogen, qui comporte l'origine de réplication du virus SV40 et une cassette de clonage permettant d'insérer le gène d'intérêt en aval du promoteur fort hCMV (human cytomegalovirus). D'autres vecteurs, dont les divers éléments génétiques nécessaires à la réplication et à la transcription sont issus d'SV40 (pZeoSV, pSG5), du virus d'Epstein-Barr (pREP), du virus du sarcome de rous (pRc/RSV), du MMTV (pMAMneo) peuvent aussi être utilisés dans le cadre de la présente invention. Les vecteurs utilisables dans le cadre de la présente invention comporteront notamment un promoteur de transcription en amont des séquences codantes. Ces promoteurs de transcription sont couramment utilisés par l'homme du métier et sont, par exemple, les promoteurs arabinose ou lactose. Un objet de l'invention est également une cellule hôte transformée avec un vecteur tel que défini ci-dessus. Les cellules procaryotes ou eucaryotes pouvant être utilisées dans le cadre de l'invention sont des cellules dans lesquelles il est possible d'exprimer l'information génétique décrite ci-dessus et dans lesquelles la formation post-traductionnelle du domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et du domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence est possible. Comme cellules procaryotes, on peut citer, entre autres, les cellules d'E.coli, de Bacillus subtilis ou les souches non pathogènes de Salmonella ou de Staphylococcus. Comme cellules eucaryotes, on peut notamment citer les cellules CHO ou COS. Dans le cadre de la présente invention, les cellules procaryotes sont préférentiellement utilisées, et plus préférentiellement celles d'E. coli. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de production d'anticorps recombinants tel que défini ci-dessus essentiellement caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cellules procaryotes ou eucaryotes l'information génétique nécessaire pour l'expression desdits anticorps comprenant au moins une séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et une séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence, lesdites séquences étant en amont d'un promoteur de transcription, puis à induire l'expression desdits anticorps et à isoler ces derniers. Pour introduire dans ces cellules l'information génétique telle que définie ci-dessus, il est par exemple possible de les transformer par électroporation. Il est aussi possible d'effectuer une transformation par la méthode au Ca C12. Conformément au procédé de la présente invention, l'expression des anticorps recombinants fluorescents de l'invention peut être intracellulaire ou extracellulaire. Le choix du site d'expression se fera de manière à obtenir des domaines protéiques actifs et de façon à obtenir un taux de production des anticorps optimal. Le choix du site d'expression des anticorps pourra être contrôlé en introduisant dans l'information génétique ou en y délétant des séquences signal connues de l'homme du métier codant pour un peptide - signal permettant d'exporter dans le milieu extracellulaire les anticorps recombinants. Lorsque les anticorps de la présente invention sont produits par des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment d'E. coli, l'expression desdits anticorps est préférentiellement intracellulaire. Pour induire l'expression des anticorps, il suffira d'ajouter au milieu de culture le produit de régulation du promoteur utilisé. Par exemple, le promoteur arabinose est induit en présence d'arabinose. Pour isoler les anticorps recombinants, il est possible, lorsque la production est intracellulaire, de lyser les cellules par exemple par sonnication et de recueillir le lysat ainsi obtenu. Facultativement, avant la préparation du lysat, les cultures peuvent être incubées de 1 à 3 jours en chambre froide. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, avant la préparation du lysat, les cultures induites sont incubées à 4 C pendant 48 heures. Une purification, par exemple, par affinité, peut ensuite facultativement être réalisée sur le lysat obtenu. Il est aussi possible de réaliser une purification sur support hydrophobe. Lorsque la production est extracellulaire, le liquide extracellulaire pourra être récolté, et facultativement, purifié. Les méthodes de purification effectuées sont celles connues de l'homme du métier. La présente invention a également pour objet l'utilisation des anticorps recombinants décrits ci-dessus en immunofluorescence. Les anticorps de la présente invention peuvent être utilisés, par exemple, en immunofluorescence indirecte. Dans ce cas, après avoir mis en présence l'antigène et un anticorps spécifique de cet antigène, on procède à une nouvelle étape d'hybridation consistant à détecter les couples anticorps-antigène formés en utilisant des anticorps recombinants fluorescents de la présent invention possédant un domaine peptidique capable de reconnaître l'anticorps spécifique de l'antigène et possédant un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. Préférentiellement, les anticorps recombinants fluorescents sont utilisés en immunofluorescence directe. Cette méthode consiste à fixer directement l'anticorps recombinant fluorescent sur la préparation antigènique étudiée. Cette méthode directe présente l'avantage de pouvoir être réalisée en une seule étape d'hybridation. Deux types d'anticorps recombinants, permettant l'émission de deux signaux fluorescents différents, peuvent aussi être utilisés. Il est donc possible d'obtenir des molécules de détection associant une spécificité donnée de reconnaissance à celle d'un marquage différentiel de couleur, ce qui permet de détecter plusieurs cibles à la fois en une seule étape d'incubation et est très utile en particulier dans des expériences de co-localisation intracellulaire. Un autre objet de l'invention est aussi un procédé de détection d'un antigène comportant au moins une étape au cours de laquelle ledit antigène est hybridé à un anticorps recombinant tel que défini ci-dessus et contenant un domaine protéique permettant la reconnaissance dudit antigène. Ce procédé peut, par exemple, consister en un procédé d'immunofluorescence directe ou en un procédé d'immunofluorescence indirecte, ledit antigène étant dans ce dernier cas l'anticorps utilisé pour la première hybridation anticorps-antigène. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant présenter un caractère limitatif. Exemple 1 la. Anticorps recombinants fluorescents "scFv lFl-GFPuv": Le fragment peptidique scFv 1F1 correspond à un fragment d'anticorps simple- chaîne 1F1 dirigé contre l'oncoprotéine E6 du virus HPV16. La figure 1-A décrit la séquence peptidique du fragment scFv 1Fl. Ce fragment scFv lF1 comporte dans le sens Nt --> Ct, le domaine VH de l'anticorps 1FI, un peptide de jonction et le domaine VL de l'anticorps monoclonal WFl. Le C-terminus du domaine VH est associé au N-terminus du domaine VL par le biais du peptide de jonction dont la séquence a été soulignée dans la figure 1-A. Le fragment peptidique "GFPuv" correspond à celui de la GFPuv décrit par Crameri (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319). Le C-terminus du fragment peptidique scFv 1F1 est associé au N-terminus de la GFPuv par le biais d'un peptide de jonction de 18 résidus suivant: ADAAPTVTSEDPRVPVEK. lb. Anticorps recombinants fluorescents "scFv 1F4-GFPuv": Le fragment peptidique scFv 1F4 correspond à un fragment d'anticorps à simple chaîne 1F4 dirigé contre l'oncoprotéine E6 du virus HPV16. La figure 1-B décrit la séquence peptidique du fragment scFv 1F4. Ce fragment scFv 1F4 comporte dans le sens Nt -> Ct le domaine VH de l'anticorps 1F1, un peptide de jonction et le domaine VL de l'anticorps monoclonal 6F4. Le C- terminus du domaine VH est associé au N-terminus du domaine VL par le biais du peptide de jonction dont la séquence a été soulignée dans la figure 1-B. Le fragment peptidique "GFPuv" correspond à celui de la GFPuv décrit par Crameri (Crameri A., E.A.Whitehorn, E. Tate & W.P.C. Stemmer (1996) Nature Biotechnol. 14, 315-319). Le C-terminus du fragment peptidique scFv 1F4 est associé au N-terminus de la GFPuv par le biais d'un peptide de jonction de 18 résidus suivant: ADAAPTVTSEDPRVPVEK. Exemple 2 Production des anticorps recombinants "scFvlFl-GFPuv" et "scFv 1F4-GFPuv" chez E. coli. Dans les figures 2-A, 2-B, 3 et 4: - XhoI, XbaI, SacI, SpeI et Eco RI désignent des sites de restriction; - ColEl ori, M13 ori et Amp R, désignent respectivement l'origine de réplication chez E. coli, l'origine de réplication M13 et le gène de résistance à l'ampicilline; - la séquence "VH" correspond à la séquence codante du segment VH de l'anticorps 1F1; la séquence "VL" correspond à la séquence codante du segment VL de l'anticorps 1F1; -la séquence "GFPuv" code la GFPuv; - la séquence "liaison" correspond à la séquence codante du peptide de jonction, dont la séquence est soulignée dans la figure 1-A; - la séquence "Lac Z" code la [3-galactosidase; - la séquence "rmBTlT2" représente une séquence terminateur de transcription; - P BAD représente le promoteur arabinose; la séquence "ara C" désigne le gène qui code pour la protéine AraC qui joue le rôle de répresseur du promoteur BAD en absence d'arabinose et le rôle d'inducteur transcriptionel en présence d'arabinose; - la séquence "signal" correspond à la séquence codante pour le peptide signal; - la séquence "tag" code pour un peptide marqueur; - "RBS" désigne le site de liaison du ribosome. Le plasmide plFl-GFPuv, représenté à la figure 2-A, a été obtenu en fusionnant la séquence codante de la GFPuv à l'extrémité C-terminale du scFvlFl codé par le plasmide pscFewlF1. Le plasmide pscFewlFl, représenté sur la figure 2-B, est un plasrnide obtenu en clonant séquentiellement les séquences codantes VH et VL de l'anticorps iFl dans pscFew, pscFew étant dérivé de pGE20 (G. Orfanoudakis, B. Karim, D. Bourel & E. Weiss (1993) Bacterially expressed Fabs of monoclonal antibodies neutralysing TNF in vitro retain full binding and biological activity. Molec. Immunol. 30, 1519- 1528). Puis, le segment scFvlFl-GFPuv du plasmnide plFl-GFPuv a été amplifié par PCR (Polymerase Chain Reaction) avec les amorces 5'AAAATGGCTAGCCAGGTGAACTCTCGAGTCCGGet 'TATGCAGAATTCATTATITGTAGAGCTCATCCATGC de manière à isoler un segment scFvlFl-GFPuv ne comprenant pas de séquence signal ou séquence "pel B", de façon à obtenir une expression intracellulaire. Puis cet amplificat, ainsi que le plasmide pBAD-GFPuv commercialisé par la société Clontech, ont été digérés par les enzymes de restriction NheI et EcoRI, puis ligués in vitro avec l'ADN ligase, commercialisée par Amersham. Le plasmide ainsi obtenu, nommé pBAD1F1-GFPuv-ApelB est représenté à la figure 3. Le détail de la fusion scFv-GFPuv a été représenté sur la figure 4. La séquence nucléotidique du peptide de jonction est indiquée en italique. Des cellules XL-1 blue d'E. coli, commercialisées par la société Stratagène, ont ensuite été transformées avec ce plasmide pBADlFl1-GFPuv-ApelB par électroporation. Les colonies obtenues après transformation avec ce vecteur pBAD-1F1GFPuv-ApelB sur boîte de Pétri contenant de l'arabinose, après avoir été incubées pendant 48 heures à 4 C, sont fluorescentes sous illumination aux UV. Des colonies scFvlF4-GFP ont été obtenues en utilisant le même protocole, mais en partant du plasmide pscFewlF4, obtenu en remplaçant le segment VL de pscFewlFl par la séquence codante du domaine VL de l'anticorps 6F4. Les cellules ainsi obtenues ont été lysées par sonnication et les protéines présentes dans le surnageant de lyse ont été analysées par western-blot. I1 a été constaté que les produits de fusion scFvlFl-GFP et scFvlF4-GFP avaient un poids moléculaire apparent de taille attendue, d'environ 60 kDa. L'activité de liaison à E6 des scFv-GFP (lFl et 1F4) contenus dans le surnageant de lyse des bactéries induites a été testée par dot-blot. Des quantités variables de protéines purifiées MBP (Maltose Binding Proteine) et MBP-E6 ont été immobilisées sur languette de nitrocellulose, puis incubées en présence de la préparation bactérienne. La fixation des scFv-GFP anti E6 a été révélée à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapin anti-GFP commercialisés par la société Clontech et d'imrnmunoglobulines de chèvres anti-anticorps de lapins marquées à la phosphatase alcaline, commercialisée par la société Dakopatts. La coloration de la fixation des réactifs est obtenue par incubation des languettes dans une solution de NBT/BCIP, commercialisée par la société Promega. La fixation des molécules scFv-GFP sur les protéines purifiées MPE-E6 a été aisément détectée. La bi-fonctionnalité des scFv-GPF exprimés dans ces conditions a été mise en évidence en observant au microscope à fluorescence ces anticorps recombinants interagissant spécifiquement avec le peptide de E6 immobilisé sur des billes d'agarose. La protéine MBP fusionnée à la séquence peptidique de E6 reconnue par les anticorps a été fixée covalemment sur des billes d'agarose activées au CNBr, commercialisées par la société Pharmacia, puis incubée au froid pendant 16 heures avec agitation en présence de lysat bactérien contenant les produits scFvlFl-GFP ou scFvlF4-GFP. Après lavage en conditions douces, les billes ont été montées entre lame et lamelle et observées au microscope à fluorescence avec le filtre FITC. Une intense couleur verte répartie principalement à la surface des billes a été visualisée dans ces conditions démontrant ainsique les conditions établies de production de scFv-GFP permettaient d'obtenir des molécules bi- fonctionnelles. Pour démontrer que les molécules responsables de cette fluorescence étaient bien celles précédemment révélées sur western-blot, les protéines présentes sur les billes traitées pour l'observation au microscope ont été analysées sur gel SDS-PAGE- (électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec dodécylsulfate de sodium). Il a été observé que les peptides retenus correspondent d'un point de vue poids moléculaire apparent exclusivement au produit scFv-GFP identifié à l'aide d'anticorps anti-GFP. Exemple 3 Test d'immunofluorescence directe: détection en une étape de la protéine E6 exprimée dans des cellules en culture. Des cellules COS fixées en présence d'acétone /méthanol ont été incubées avec un échantillon de molécules scFvlFl-GFP et scFvlF4-GFP purifiées par affinité sur billes. Les cellules COS utilisées sont une lignée transformée de cellules de rein de singe qui expriment transitoirement le polypeptide E6. Après cette unique étape de traitement, les billes sont alors observées au microscope à fluorescence. Cette expérience a clairement démontré qu'une incubation avec les fragments d'anticorps associés avec la GFP par fusion génétique permet de détecter sans équivoque par fluorescence la protéine E6 exprimée et localisée dans le noyau des cellules COS transfectées. Cette expérience de marquage direct a aussi été réalisée avec des extraits bruts bactériens contenant les molécules scFv-GFP. Dans ce cas, le signal vert nucléaire est un peu moins visible car il est noyé dans un intense bruit de fond de couleur jaune présent au niveau de toutes les structures cellulaires. Enfin, il est à noter que le microscope et les équipements annexes utilisés pour cette visualisation de la coloration nucléaire des cellules COS avec les scFv-GFPs purifiés sont les mêmes que ceux qui sont utilisés en routine pour des détections classiques par immunofluorescence indirecte; il peut donc en être déduit que la sensibilité de détection avec le produit recombinant en une seule étape est comparable à celle de la méthode indirecte. REVENDICATIONS 1. Anticorps recombinant, caractérisé en ce que ledit anticorps contient au moins un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et au moins un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence. 2. Anticorps recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène est un fragment scFv. 3. Anticorps recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine protéique permettant l'émission d'un signal fluorescent correspond à la GFP, à la GFP uv, à la hRGP ou à une GFP mutée. 4. Anticorps recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène est relié au domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence par un peptide de jonction. 5. Anticorps recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence peptidique du peptide de jonction est ADAAPTVTSEDPRVPVEK. 6. Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle code pour un anticorps recombinant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN selon la revendication 6 et un promoteur de transcription permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN selon la revendication 6 dans une cellule hôte. 8. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un vecteur selon la revendication 7. 9. Procédé de production d'anticorps recombinants tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cellules procaryotes ou eucaryotes l'information génétique nécessaire pour l'expression desdits anticorps comprenant au moins une séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène et une séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence, lesdites séquences étant en amont d'un promoteur de transcription puis à induire l'expression desdits anticorps et à isoler ces derniers. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence codante pour un domaine protéique permettant la reconnaissance d'un antigène correspond à une séquence codante d'un fragment scFv. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que la séquence codante pour un domaine protéique permettant l'émission d'un signal de fluorescence correspond à la séquence codante de la GFP, de la GFP uv, de la hRGP ou d'une GFP mutée. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que les anticorps tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 sont produits intracellulairement par des cellules procaryotes. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les anticorps tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 sont produits par des cellules d'E. coli. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'information génétique nécessaire pour l'expression desdits anticorps est comprise dans un vecteur comprenant au moins une origine de réplication et un gène marqueur. 15. Utilisation d'anticorps recombinants tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits anticorps recombinants sont utilisés en immunofluorescence. 16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont utilisés en immunofluorescence indirecte. 17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que deux types d'anticorps recombinants, permettant l'émission de deux signaux fluorescents différents, sont utilisés. 18. Procédé de détection d'un antigène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape au cours de laquelle ledit antigène est hybridé à un anticorps recombinant tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 contenant un domaine protéique permettant la reconnaissance dudit antigène.