Brevet FR2774393A1 — publié le 19990806

Souches de levure ayant le gène ATF2 interrompu et leurs applications. La formation de 3-oxo-delta4-stéroides & partir de précurseurs 3-hydroxy-delta5 dans la biosynthèse de toutes les classes d'hormones stéroïdes chez les mammifères est catalysée par le système enzymatique 3ss-hydroxy-delta5- stéroïde déshydrogénase (EC 1.1.1.145) et delta5-delta4stéroïde isomérase (EC 5.3.3.1), dénommé 3ss-HSD. La 3ss-HSD catalyse par exemple la transformation de la prégnénolone en progestérone, de la 17a-hydroxyprégnénolone en 17a-hydroxyprogestérone, de la déhydroépiandrostérone en delta4androstènedione ou du 5-androstene-3B-17P-diol en testostérone (Simard et al., 1996). La 3ss-HSD représente donc l'une des enzymes-clé de la voie de biosynthèse de l'hydrocortisone à partir du cholestérol dans le cortex adrénalien des mammifères (Figure 1). L'utilisation de microorganismes recombinants, en particulier de levures transformées permettant l'expression hétérologue de l'un ou plusieurs des enzymes de mammifères de cette voie de biosynthèse pour produire de l'hydrocortisone ou des intermédiaires de cette biosynthèse a été décrite par exemple dans la demande de brevet européenne EP 340878, le brevet US 5,137,822, Dumas et al., 1994 et Cauet et al., 1994. Lorsque la 3ss-HSD fonctionnelle est exprimée dans la levure, les cellules de levure transformées ne convertissent pas complètement les 3ss-hydroxystéroides en 3-oxostéroides correspondants, par exemple la prégnénolone en progestérone, mais accumulent un composé observé également dans le cas des cellules de la levure non transformée. L'identification du composé accumulé à l'ester 3ss-acétique du stéroïde de départ et la caractérisation de l'enzyme ayant une activité acyltransférase responsable de cette estérification (dénommée plus loin APAT pour "acétyl-coenzyme A prégnénolone acétyltransférase") sont décrits dans la présente demande. D'autre part, l'accumulation d'acétate de prégnénolone par une souche de levure transformée productrice de prégnénolone a été décrite dans la demande de brevet européenne EP 727489. Ces observations permettent de considérer que l'estéri- fication des 3ss-hydroxystéroides produite par la levure est indésirable puisqu'elle est responsable de réactions secondaires et de sous-produits conduisant à une diminution du rendement en 3-hydroxystéroides accumulés, par exemple en prégnénolone ou à une diminution du rendement de bioconversion de 3ss-hydroxy-delta5-stéroïdes en 3-oxo-delta4stéroïdes, notamment dans la production de la progestérone ou de la 17a-hydroxy-progestérone conduisant à une diminution de production ultérieure de l'hydrocortisone par la voie de biosynthèse déjà citée. A la suite des résultats obtenus mentionnés ci-dessus, la présente invention décrit la construction de souches de levure, ayant perdu l'activité APAT indésirable, par altération du gène codant pour cette activité et dont il résulte une stabilisation des 3P-hydroxystéroïaes en présence de celles-ci. Ces souches sont donc utilisables comme souches de départ pour construire des souches recombinantes capables de transformer des 3ss-hydroxystéroides en produits ultérieurs avec des rendements améliorés. L'invention décrit aussi la construction de souches de levure ayant perdu l'activité APAT par altération du gène codant pour cette activité et exprimant la 3ss-HSD, le cytochrome P450SCC ou le cytochrome P45017a de la voie de biosynthèse de l'hydrocortisone à partir du cholestérol. Les souches exprimant par exemple la 3ss-HSD permettent d'améliorer les rendements de bioconversion des 3ss-hydroxy-delta5- stéroïdes en 3-oxo-delta4-stéroides et sont donc utilisables dans les procédés de production améliorée de l'hydrocortisone ou de ses intermédiaires dans la levure. La présente invention a donc pour objet une souche de levure modifiée dans laquelle l'activité acétyl-CoA prégnénolone acétyltransférase (APAT) est éliminée par altération du gène codant pour cette activité et dont il résulte une stabilisation des 3ss-hydroxystéroides. L'altération du gène codant pour l'activité APAT peut être réalisée par exemple par insertion, délétion ou substitution d'une séquence d'ADN dans les éléments fonctionnels du gène, par exemple le promoteur ou la séquence codante pour la protéine ayant l'activité APAT. L'intégration de la séquence d'ADN ainsi altérée dans une souche hôte de levure peut être ensuite effectuée par exemple par la méthodologie de la recombinaison homologue et conduit à la génération de mutants chromosomiques de levure correspondant aux souches modifiées de l'invention dans lesquelles la disparition de l'activité APAT et la stabilisation des 3ss-hydroxystéroïdes sont mises en évidence, par exemple par culture des cellules en présence de prégnénolone et par mesure de la teneur en prégnénolone en fonction du temps en suivant des conditions opératoires décrites plus loin dans la partie expérimentale. Comme souches de levure hôtes utilisées pour l'invention, on peut citer notamment les souches de Saccharomyces telles que S. cerevisiae, les souches de Candida telles que C. maltosa, les souches de Kluyveromyces telles que K. lactis ou les souches de Pichia telles que P. pastoris. L'invention a particulièrement pour objet une souche de levure modifiée ci-dessus dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 de S. cerevisiae ou un homologue de celui-ci. Par gène ATF2, on entend le gène de S. cerevisiae identifié dans le génome de la levure sous le locus ATF2 ou YGR177c, de "Saccharomyces Genome Database" (SGD) ; (Cherry et al. http: I /genome-www. stanford. edu/Saccharomyces/) dont le cadre de lecture ouvert (ORF) dénommé YGR177c est traduit en séquence d'acides aminés dans la banque de données Mips, accessible sous le numéro d'accession S64491 (Hebling U., Hofmann B. et Delius H. (May 1996)) et dont la séquence est montrée à la figure 4. Ce gène code pour une protéine ayant l'activité APAT, comme cela est montré plus loin dans la partie expérimentale. Par gène homologue du gène ATF2, on entend un gène qui code pour une protéine ayant l'activité APAT et ayant une identité de séquence d'environ 60 % et plus avec la séquence de la protéine YGR177C. L'invention a plus particulièrement pour objet une souche de levure modifiée ci-dessus dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 et dénommée plus loin souche mutante atf2. L'invention a spécialement pour objet une souche de levure modifiée ci-dessus, dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion d'une séquence d'ADN ayant au moins un nucléotide. La séquence d'ADN qui est insérée dans le gène ATF2 de façon à perdre toute activité APAT peut être, par exemple un gène de sélection auxotrophe complétant une exigence nutritionnelle de la souche hôte telle que le gène URA3, le gène LEU2, le gène TRPl, le gène HIS3 ou le gène ADE2, par exemple un gène de sélection dominant tel qu'un gène de résistance & un antibiotique tel que G418, la phléomycine ou l'hygromycine B ou par exemple un gène rapporteur tel que le gène ssGAL. L'invention a plus spécialement pour objet une souche de levure modifiée ci-dessus, dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion du gène de sélection URA3. Les souches mutantes atf2 de l'invention, dépourvues d'activité APAT et dans lesquelles le gène URA3 a été inséré, dénommées plus loin atf2-::URA3, ont ainsi pu être sélectionnées par prototrophie & l'uracile. L'invention a tout spécialement pour objet les souches de S. cerevisiae modifiées dénommées TGY156 et TGY158, dont les constructions détaillées sont données plus loin dans la partie expérimentale. L'invention a aussi pour objet une souche de levure transformée dans laquelle l'activité acétyl-CoA prégnénolone acétyltransférase (APAT) est éliminée par altération du gène codant pour cette activité et exprimant au moins l'une des enzymes de mammifères de la voie de biosynthèse de lthydro- cortisone à partir du cholestérol choisie parmi - l'enzyme de clivage de la chaine latérale du cholestérol (P450SCC), - la 3ss-hydroxy-delta5-stéroide déshydrogénase/delta5-delta4stéroïde isomérase (3ss-HSD) et - la 17a-stéroide hydroxylase (P45017a). Les souches de levure transformées de l'invention peuvent être obtenues par exemple par transformation de souches mutantes atf2 de l'invention selon les méthodes connues, par exemple par transformation par un vecteur d'expression de P450SCC ainsi que d'ADX et d'ADR, par un vecteur d'expression de la 3p-HSD ou par un vecteur d'expression de P45017a. Les souches mutantes atf2 peuvent aussi être éventuellement co-transformées, par exemple par un vecteur d'expression de la 3ss-HSD et par un vecteur d'expression de P45017a ou être transformées par un vecteur de coexpression de la 3ss-HSD et de P45017a et être utilisées par exemple dans un procédé de bioconversion de la prégnénolone en 17ahydroxy-progestérone. Des vecteurs construits pour l'expression de P450SCC ainsi que d'ADX et d'ADR, de la 3ss-HSD ou de P45017a d'origine bovine ou humaine dans des souches de levure ont été décrits, par exemple par Dumas et al., 1994, dans la demande de brevet européenne EP 340878 ou dans le brevet US 5,137,822. L'invention concerne particulièrement une souche de levure transformée ci-dessus, dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 de S. cerevisiae ou un homologue de celuici. L'invention a plus particulièrement pour objet une souche de levure transformée ci-dessus, dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 et correspondant à une souche atf2 transformée. L'invention a tout particulièrement pour objet une souche de levure transformée ci-dessus, dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion d'une séquence d'ADN ayant au moins un nucléotide et a spécialement pour objet une souche de levure transformée, dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion du gène de sélection URA3 et correspondant & une souche atf2-::URA3 transformée. L'altération du gène de façon à perdre toute activité APAT, le gène ATF2 ou un homologue de celui-ci ainsi que les souches hôtes ont les significations indiquées précédemment. L'invention concerne tout spécialement une souche de levure transformée atf2-::URA3 ci-dessus exprimant P450SCC, ADX et ADR. L'invention concerne aussi tout spécialement une souche de levure transformée atf2-ss::URA3 ci-dessus exprimant la 3ss-HSD et en particulier la souche de S. cerevisiae transformée dénommée TGY158/pTG10862 dont une construction détaillée est décrite plus loin dans la partie expérimentale. L'invention concerne aussi tout spécialement une souche transformée atf2-A::URA3 ci-dessus exprimant P45017a ainsi qu'une souche de levure transformée atf2-::URA3 ci-dessus coexprimant la 3ss-HSD et P45017a. L'invention a aussi pour objet un procédé d'oxydation in vivo d'un substrat choisi parmi un stérol endogène, un stérol exogène ou un stéroïde exogène dans lequel on utilise une souche de levure transformée ci-dessus que, soit l'on cultive seule lorsque la souche génère le stérol endogène, soit l'on incube avec le stérol ou le stéroïde exogène et on isole éventuellement le composé oxydé obtenu. Par stérol endogène, on entend un stérol accumulé dans une souche de levure et qui est un substrat de l'enzyme de clivage de la chaîne latérale (P450SCC) lorsque la levure, après transformation par exemple par un vecteur d'expression de P450SCC, d'ADX et d'ADR, est cultivée en absence de stérol exogène. Les stérols endogènes utilisés pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention peuvent être par exemple l'ergosta 5-ène-3-ol, l'ergosta 5,24(28)-diène-3-ol ou l'ergosta 5,22-diène-3-ol. La demande de brevet européenne EP 727489 décrit l'accumulation de tels stérols dans une souche de levure et le clivage de leur chaîne latérale dans une culture de la souche après transformation par un vecteur d'expression de P450SCC, d'ADX et d'ADR. Une telle souche de levure, dans laquelle l'activité APAT est aussi présente, peut être modifiée au préalable pour obtenir une souche mutante atf2 selon l'invention, puis être transformée par un vecteur d'expression de P450SCC, d'ADX et d'ADR pour obtenir une souche mutante atf2 transformée selon l'invention. Par stérol exogène, on entend un stérol qui est un substrat de l'enzyme de clivage P450SCC par incubation avec une souche de levure transformée par un vecteur d'expression de P450SCC, d'ADX et d'ADR, par exemple le cholestérol ou le sitostérol. Une telle souche peut être par exemple une souche mutante atf2 transformée par un vecteur d'expression de P450SCC, d'ADX et d'ADR selon l'invention. Par stéroide, on entend un stéroide qui est un substrat de l'enzyme 3ss-HSD par incubation avec une souche de levure transformée par exemple par un vecteur d'expression de la 3ss-HSD, tel que la prégnénolone, la 17a-hydroxy prégnénolone ou la déhydroépiandrostérone ou un stéroide qui est un substrat de l'enzyme P45017a par incubation avec une souche de levure transformée par exemple par un vecteur d'expression de P450l7a, tel que la progestérone ou la prégnénolone. Une telle souche peut être par exemple une souche mutante atf2 transformée par un vecteur d'expression de la 3ss-HSD ou par un vecteur d'expression de P45017a selon l'invention. L'invention a particulièrement pour objet un procédé d'oxydation in vivo ci-dessus dans lequel le substrat est un stérol et dans lequel on utilise une souche de levure atf2-::URA3 transformée exprimant P450SCC, ADX et ADR et isole éventuellement le 3ss-hydroxystéroide obtenu. Le 3ss-hydroxystéroide obtenu par clivage de la chaîne latérale du stérol utilisé comme substrat est totalement sous forme libre, c'est-g-dire non accompagné de l'ester 3ss- acétique correspondant dans les cultures de souches atf2::URA3 exprimant P450SCC, ADX et ADR. L'invention fournit ainsi par exemple un procédé amélioré de production de prégnénolone non accompagnée d'acétate de prégnénolone dans une levure. L'invention a aussi particulièrement pour objet un procédé d'oxydation in vivo ci-dessus, dans lequel le substrat est un 3ss-hydroxystéroide et dans lequel on utilise une souche de levure atf2-::URA3 transformée exprimant la 3ss-HSD et isole éventuellement le 3-oxo-delta4-stéroide obtenu et a spécialement pour objet un procédé dans lequel le 3ss-hydroxystéroide est choisi parmi la prégnénolone ou la 17a-hydroxyprégnénolone. Le 3ss-hydroxystéroide utilisé comme substrat est stable lorsqu'on l'incube avec une souche atf2-::URA3 de l'invention transformée par un vecteur d'expression de 3-HSD. L'invention fournit ainsi un procédé amélioré de production de 3-oxo-delta4-stéroide dans une levure puisque la totalité du substrat 3B-hydroxy peut être oxydée en 3-oxo-delta4stéroide, comme cela est montré plus loin dans la partie expérimentale. L'invention a aussi particulièrement pour objet un procédé d'oxydation in vivo ci-dessus, dans lequel le substrat est un stéroïde et dans lequel on utilise une souche de levure atf2-::URA3 transformée exprimant P45017a et isole éventuellement le stéroide 17a-hydroxylé obtenu et a spécialement pour objet un procédé dans lequel le substrat stéroïde est la prégnénolone. La prégnénolone utilisée comme substrat est stable lorsqu'on l'incube avec une souche atf2-::URA3 transformée par un vecteur d'expression de P45017a. L'invention fournit donc aussi un procédé amélioré de production de 17a-hydroxy stéroïdes à partir de 3ss-hydroxystéroides puisque la totalité du substrat 3ss-hydroxy peut être 17a-hydroxylée. Les souches de levure mutantes atf2 transformées et le procédé de l'invention permettent de prévoir leur utilisation avantageuse dans la production améliorée de l'hydrocortisone ou de ses intermédiaires dans la levure. Des exemples de construction de souches de l'invention et de mise en oeuvre du procédé de l'invention sont décrits plus loin dans la partie expérimentale. Matériels et méthodes générales 1. Souches et milieux Les souches de S. cerevisiae utilisées pour la réalisation de l'invention sont la souche TGY73.4 (MATa, ura3-55, pral-l, prbl-l, prcl-l, cps 1-3, his) dérivée isogénique Leu+ de c13ABYS86 décrite par Achstetter et al., 1992 et la souche Fy1679 (MATa,ura3-52, trpl-63, leu2-51, his3-A200, fenl, GAL) décrite par Thierry et al., 1990. La croissance des souches est effectuée sur milieu complet YPD (Difco Laboratories) contenant 2 % de glucose à 280C selon les conditions décrites par F. Sherman, 1991. Pour la transformation de S. cerevisiae, les cellules sont rendues compétentes par la méthode å l'acétate de lithium. Les levures sont cultivées en routine sur un milieu minimum synthétique SD contenant 2 % de glucose (F. Sherman, 1991) avec addition des besoins nutritionnels & la concentration de 100 Zg/ml. La souche E. coli BJ5183 (D. Hanahan, 1983) a été utilisée pour la recombinaison in vivo et la souche E. coli C600, hsdR (Hubacek et al., 1970) a été utilisée comme souche receveuse pour les réactions classiques de ligation. 2. ManiDulation de l'ADN et recombinaison in vivo dans E. coli Les méthodes générales de biologie moléculaire utilisées sont décrites par Sambrook et al., 1989. La méthode pour la recombinaison in vivo a été décrite par E. Degryse, 1995 et E. Degryse, 1996. 3. Test de l'activité enzvmatiaue APAT L'activité acétyltransférase de l'APAT a été déterminée par mesure de l'incorporation de [3H]acétate dans la prégnénolone à partir de [3H]acétyl-CoA (New England Nuclear). Le milieu de réaction (500 Ml) contient du [3H]acétyl-CoA (20 pM, 25 Ci/mole) et de la prégnénolone (Sigma) (30 MM). La prégnénolone est ajoutée en solution dans 2 Zl de mélange tyloxapol (Sigma)/éthanol (1:1) dans un tampon phosphate de potassium (20mM) & pH 7,0. Après incubation pendant 15 minutes à 300C, la réaction est stoppée par addition de 2 ml de dichlorométhane. Les stéroides sont extraits avec du dichlorométhane, puis séparés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (noté plus loin RP-HPLC) dans des conditions d'élution isocratiques avec de l'acétonitrile sur une colonne Ultrasphère ODS (Beckman) à 450C sur un chromatographe HP 1090 (Hewlett Packard) couplé à un radiodétecteur FLO-One 500 (Packard) qui permet de mesurer la quantité de [3H]acétate de prégnénolone formée. Une unité APAT est définie comme la quantité d'enzyme qui produit 1 nmole d'acétate de prégnénolone par minute & 300C, dans les conditions décrites ci-dessus. 4. Détermination de la concentration en protéine La concentration en protéine a été mesurée en utilisant la trousse "protein assay kit" (Bio-Rad) avec de l'albumine de sérum de boeuf comme standard. Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention. La figure 1 représente la voie de biosynthèse de l'hydrocortisone à partir du cholestérol, chez les mammifères. Les figures 2A et 2B illustrent la bioconversion de la prégnénolone en acétate de prégnénolone chez S. cerevisiae. L'analyse est faite par RP-HPLC à 205 nm La figure 2A montre la cinétique de formation de l'acétate de prégnénolone et de disparition de la prégnénolone à des intervalles de temps sur 12 h d'incubation. La figure 2B montre le profil en stéroïdes à t=0 et & t=10 h par rapport à un profil de standards de prégnénolone et d'acétate de prégnénolone. La figure 3 illustre la purification de l'APAT par chromatographie sur MonoP HR 5/20 (A) montre le profil de l'activité APAT présente dans les fractions 10 à 20. (B) montre l'analyse par SDS-PAGE des fractions 14, 15 et 16 réunies et concentrées par coloration au bleu de Coomassie (ligne 2) en présence de marqueurs de poids moléculaire (ligne 1). La flèche indique la bande de PM apparent de 62kDa. La figure 4 représente la séquence en acides aminés en code à une lettre de la protéine YGR177c. Les peptides séquencés à partir de la protéine APAT purifiée et digérée par la trypsine sont soulignés. La figure 5 représente la stratégie d'interruption du gène ATF2 par association au gène URA3 par la méthode de double fusion PCR. Les barres vides et les barres pleines représentent les séquences d'ATF2 et d'URA3 respectivement. La figure 6 illustre l'effet de l'interruption du gène ATF2 dans S. cerevisiae sur l'acétylation de la prégnénolone. La présence de prégnénolone acétate est mise en évidence par RP-HPLC à 205 nm à partir de cultures de 16 h de la souche parente TGY 73.4 (A) ou de la souche mutante TGY 158 (B). Les figures 7A, 7B et 7C représentent le schéma de construction des plasmides d'expression de la 3ss-HSD humaine chez la levure, pTG10832 et pTG10862. La figure 7A décrit l'obtention du fragment MscI-MluI contenant la séquence codante pour la 3ss-HSD humaine. La figure 7B décrit l'obten- tion du fragment NotI contenant le bloc d'expression CYClp/3ss-HSD/PGKt. La figure 7C décrit l'obtention du plasmide pTG10832 et du plasmide pTG10862. (Abréviations des enzymes de restriction : S,SalI ; N,NotI ; BII,BglII M,MluI, C,ClaI ; NO, site NcoI perdu ; XbaIO, site XbaI perdu). La figure 8 représente une carte de restriction du plasmide pTG10832. La figure 9 représente une carte de restriction du plasmide pTG10862. EXEMPLES 1 : Identification de I'activit8 APAT de la levure. A - Acétylation in vivo de la prégnénolone par la levure. La souche TGY73.4 a été cultivée à 280C dans 10 ml de milieu YPD inoculé à A600=0,1 à partir d'une préculture de 24 h et dans lesquels ont été ajoutés 100 Zl d'une solution de prégnénolone à 10 mg/ml dans un mélange tergitol (Sigma)/ éthanol (1:1). Les stéroïdes formés ont été identifiés sur des aliquots de 250 Al de bouillon prélevés à intervalles de temps pendant 10 h. Après extraction avec 2 ml de dichlorométhane, les phases organiques ont été évaporées sous azote, puis les résidus obtenus ont été redissous dans de l'acétonitrile. Les stéroides ont été analysés par RP-HPLC sur une colonne Ultrasphère ODS (Beckman) avec successivement comme éluant : acétonitrile à 60 % dans l'eau pendant 10 mn, puis acétonitrile variant de 60 à 80 % dans l'eau pendant 5 mn, puis acétonitrile à 80 % pendant 5 mn au débit de 1 ml/mn, & 450C et avec une détection à 205 nm. Les chromatogrammes obtenus (figure 2B) montrent que la prégnénolone est métabolisée en un produit plus apolaire et ayant un TR identique à celui de la prégnénolone acétate standard. La figure 2A montre que la prégnénolone est rapidement convertie par la levure en son métabolite. Après traitement alcalin (KOH à 6 % dans du méthanol), le métabolite observé libère un produit ayant un TR identique à celui de la prégnénolone. L'identification du métabolite & l'acétate de prégnénolone a été ensuite confirmée par spectrométrie de masse. B - Purification de l'enzyme ayant l'activité APAT. La souche TGY73.4 a été cultivée en fermenteur de 10 litres dans le milieu Kàppeli (Fiechter et al., 1981) enrichi en glucose & 160 g/l à 300C jusqu'à A600=30. Les cellules ont été séparées par centrifugation, lavées à l'eau puis remises en suspension dans 4 litres de tampon Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 à 40C (tampon A) contenant 1 mM de PMSF. Les cellules ont été soumises a un éclatement dans un homogénéiseur Manton Gaulin sous une pression de 1000 psi. Le lysat cellulaire obtenu a été centrifugé & 12.000 xg pendant 15 mn à 40C, puis du chlorure de zinc a été ajouté au surnageant à une concentration finale 40 mM. Le pH a été ajusté å 5.5 avec HCl 1N et la précipitation a été réalisée pendant 30 mn à 40C. Après centrifugation à 10.000 xg pendant 10 mn à 40C, le précipité isolé a été remis en suspension dans 3 litres de tampon A contenant de l'EDTA 100 mM et du PSFM 1 mM. Après élimination de l'EDTA par diafiltration sur une cartouche Y1OS10 (Amicon) contre 30 litres du tampon A, le rétentat a été chargé à la vitesse de 35 ml/mn et & 40C sur une colonne de 1,5 litres de DEAE-Sephacel (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A. Après lavage de la colonne avec le tampon A, puis avec le tampon A contenant du NaCl 0,15M, l'activité APAT a été éluée avec le tampon A contenant du NaCl 0,4M. Les fractions de DEAE-Sephacel contenant l'activité APAT, mesurée comme indiqué ci-dessus dans "Matériels et Méthodes générales", ont été réunies, additionnées de NaCl à la concentration finale de 2M, puis chargées à la vitesse de 15 ml/mn et à 40C sur une colonne de 500 ml de Phényl-Sepharose (Pharmacia) préalablement équilibrée dans le tampon A contenant du NaCl 2M. Après lavage de la colonne avec le tampon A contenant NaCl 0,5M, l'activité APAT est éluée avec 1,5 litres d'un gradient linéaire de cholate de sodium variant de o a 1 % dans le tampon A. Les fractions contenant l'activité APAT ont été réunies, puis concentrées par ultrafiltration sur une membrane YM10 (Amicon), puis conservées à -800C jusqu'à utilisation. L'ensemble du procédé a été répété une fois de façon & préparer du matériel en quantité suffisante pour continuer la purification. Le matériel purifié & partir des deux préparations cidessus a été décongelé, puis chargé & la vitesse de 4 ml/mn et & 40C sur une colonne de 100 ml de Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) préalablement équilibrée dans le tampon A. Après lavage de la colonne avec le meme tampon, l'activité APAT a été éluée avec 500 ml d'un gradient linéaire de NaCl variant de 0 à 1M dans le même tampon. Les fractions de Q-Sepharose contenant l'activité APAT ont été réunies puis chargées directement & la vitesse de 2,5 ml/mn et a 40C sur une colonne de 7 ml de cholate de sodium immobilisé sur des billes de Sepharose (Pharmacia) équilibrée préalablement avec du tampon A contenant du NaCl 0,5M. Après lavage de la colonne avec le même tampon, l'activité APAT a été éluée avec 100 ml d'un gradient linéaire de cholate de sodium variant de 0 & 1 % dans le même tampon. Les fractions contenant l'activité APAT ont été réunies, concentrées par ultrafiltration sur une membrane vM10 (Amicon) jusqutà une concentration en protéine de 1,8 mg/ml, puis conservées à -800C. L'activité APAT a été ainsi purifiée environ 500 fois sur la base de l'activité spécifique et avec un rendement d'environ 16 % comme montré au tableau suivant Stade Activité Protéine Activité Purifi- Rendement APAT spécifique cation (unités) (mg) (unités/mg) Surnageant 12.000 g 8 057 42 242 0,19 1 100 Précipitation au 10 453 28 040 0,37 1,9 129 zinc DEAE-Sephacel 6 399 5 009 1,28 6,7 79 Phényl-Sepharoee 3 316 489 6,78 35,7 41 Q-Sepharose Plusieurs bandes ont été révélées par coloration au bleu de Coomassie avec une bande majoritaire d'un PM apparent de 62kDa (figure 3(B), identique au PM déterminé par filtration sur gel de Superose 6 (Pharmacia) et correspondant à l'activité APAT. C - Propriétés de 1'APAT. a) Spécificité de substrat Selon la méthode indiquée ci-dessus pour l'acétyl CoA et la prégnénolone, en utilisant différents donneurs d'acyle ou différents substrats stéroïdes, l'APAT semi-purifiée transfert l'acétate sur des 3ss-ol, delta4 ou delta5-stéroides avec une efficacité comparable alors que le transfert est faible sur les estrogènes et non détectable sur les stérols et avec une préférence marquée pour l'acétyl-CoA comme donneur d'acyle. Le tableau suivant, dans lequel pour a) les essais sont effectués avec 30 ZM de chaque stéroïde testé et 100 AM de [3H]acétyl-CoA et pour b) les essais sont effectués avec 100 MM de chaque donneur d'acyle et 30 MM de [3H) prégnénolone, montre les résultats obtenus Substrat a) Activité relative (z) Substrat b) Activité relative (z) Prégnénolone 100 acAtyl-CoA 100 17a-OH prégnénolone 89 propionyl-CoA 33 DHEA 104 butyryl-CoA 16 4-pregnine-3ssol-20-one 70 hexanoyl-CoA 18 5ss-pregnane-3ssol-20-one 1,8 olFoyl-CoA non détecté 17ss-oestradiol 5 oestrone 2,5 cholestérol 0,6 ergostérol 0,4 b) Inhibition L'activité APAT est fortement inhibée par les réactifs des groupements sulfhydryles tels que NEM et DTNB. L'inhibition est complète en présence de chlorure de zinc (1 mM). D - Séquence partielle en acides aminés. La séquence partielle en acides aminés a été déterminée après digestion à la trypsine sur des coupes de gel selon la méthode décrite par Rosenfeld et al. (1992). A partir des deux tiers du concentrat obtenu ci-dessus puis séparé par SDS-PAGE, la bande 62kDa a été découpée puis incubée avec de la trypsine (Promega). Les peptides générés ont été ensuite séparés par RP-HPLC sur une colonne Vydac 218TP (1,5 x 125 mm) à la vitesse de 100 pl/mn, en utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile variant de 0 à 60 % en 80 mn, puis de 60 à 100 % en 20 mn dans une solution de TFA & 0,1 % dans l'eau puis ont été soumis à un séquençage en acides aminés. La séquence N-terminale a été déterminée sur un séquenceur de protéine Model 477A couplé à un analyseur HPLC de PTH-amino acids (Applied Biosystems). Parmi les échantillons séquencés, deux pics x et y donnent une séquence non ambiguë constituée respectivement des 10 et 16 acides aminés suivants pour le pic x : ISEQFKKDDF pour le pic y : LIELISPVIIPLGNPK Les deux séquences peptidiques ainsi obtenues ont été utilisées pour cribler la base de données du génome de S. cerevisiae. Une protéine de 62kDa dont la séquence contient exactement les séquences des deux peptides ci-dessus a pu être identifiée (Mips, accession S64491, Hebling et al., May 1996). Cette protéine dont la séquence est montrée s la figure 4 et dont la fonction n'a pas été décrite serait codée par un gène au locus YGR177c. Sur la base d'une identité d'environ 37 % de séquence en acides aminés entre la protéine de l'invention ayant une activité acyltransférase et le produit du gène ATF1 chez S. cerevisiae décrit par Fujii et al. (1994) et auquel a été attribué une activité alcool acétyltransférase, nous utiliserons la dénomination ATF2 pour le gène codant pour la protéine responsable de l'activité APAT chez S. cerevisiae. EXEMPLE 2 : Construction de souches de levure ayant le gêne ATF2 interrompu par le gêne URA3 et ayant perdu l'activait APAT (atf2-::URA3). A) Ciblage du gêne ATF2. Le gène URA3 de S. cerevisiae a été introduit par substitution d'une partie choisie du gène ATF2 de S. cerevisiae permettant une sélection ultérieure des souches mutantes par prototrophie & l'uracile. Le marqueur de sélection URA3 a été associé au gène ATF2 par double fusion PCR selon la méthode décrite par Amberg et al., 1995. La stratégie suivie montrée à la figure 5 comprend au total 4 réactions de PCR. Les deux premières réactions (noté PCR1) permettent respectivement d'amplifier les régions 5' et 3' flanquant le site d'insertion du marqueur URA3 dans le gène cible ATF2 interrompu et la troisième réaction (noté PCR2) permet d'amplifier le gène marqueur URA3. La double fusion (noté PCR3) permet enfin l'association des régions 5' et 3' du gène cible ATF2 au gène marqueur URA3 (noté 5'ATF2 URA3-3'ATF2). Dans un premier temps, un échantillon de cellules entières de la souche Fy1679 utilisée comme source d'ADN du gène cible ATF2 a été amplifié dans le tampon PCR contenant du dNTP 2 mM (Pharmacia) dans les conditions suivantes : 25 cycles ; 930C, 30 sec ; 540C, 2 mn ; 680C, 3 mn suivi d'une élongation de 5 mn à 720C ; polymérase Ampli Taq (Perkin Elmer). D'une part, la région 5' du gène ATF2 a été amplifiée par PCR en utilisant comme amorces directe et indirecte les oligonucléotides ayant les séquences suivantes OTG10841 : AAAAGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC et OTG10844 ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC qui contiennent une région homologue à la région 5' de la séquence du gène ATF2 (SGD : YGR177c) et en ajoutant un site de restriction SalI pour l'OTG10841. D'autre part, la région 3' du gène ATF2 a été amplifiée par PCR en utilisant comme amorces directe et indirecte les oligonucléotides ayant les séquences suivantes OTG10846 CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG et OTG10842 AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG qui contiennent des régions homologues à la région 3' de la séquence du gène ATF2 (SGD : YGR177c) et en ajoutant un site de restriction MluI pour l'OTG10842. Dans un deuxième temps, le gène URA3 de S. cerevisiae a été amplifié par PCR en utilisant comme amorce directe l'oligonucléotide ayant la séquence OTG10843 GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTTT TTTTTATTCTTTTTTTTG qui contient une séquence homologue à la région 5' de la séquence du gène URA3 publiée (Rose et al., 1984 ; GenBank YSCODCD accession : K02207 ; SGD : YEL02lw) associée & une séquence homologue à la région 5' du gène ATF2 (complémentaire & l'OTG10844) et comme amorce indirecte l'oligonucléotide ayant la séquence OTG10845 CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAC TC qui contient une séquence homologue & la région 3' du gène URA3 associée à une séquence homologue à la région 3' du gène ATF2 (complémentaire & l'OTG10846). Un échantillon de 20 ng d'ADN du gène URA3, isolé & partir du vecteur navette E. coli-levure pTG10021 (Degryse et al., 1995) par digestion avec l'enzyme de restriction HindIII a été amplifié dans les conditions indiquées ci-dessus. Les produits de PCR respectivement obtenus ont été purifiés en utilisant la trousse "Geneclean kit" (Bio 101 Inc, La Jolla, USA), puis soumis a la réaction de double fusion en utilisant comme amorces les oligonucléotides OTG10841 et OTG10842 ci-dessus dans les conditions d'amplification utilisées pour les réactions préalables de PCR avec un programme de 20 cycles. Après purification du produit final de fusion qui contient les régions flanquantes du gène ATF2 fusionnées au gène URA3 fonctionnel, la présence du gène URA3 a été confirmée par digestion avec l'enzyme de restriction EcoRV qui montre la présence de ce site dans le matériel amplifié. B) Génération de souches de levure atf2-À::URA3. Le produit de fusion obtenu ci-dessus a été transformé directement dans les cellules compétentes de la souche Fy1679 ou de la souche TGY73.4 et les transformants ont été sélectionnés par croissance sur le milieu SD (F. Sherman, 1991) en présence des exigences nutritionnelles de la souche et en absence d'uracile. A partir de clones isolés, la nouvelle association entre la région 5' du gène ATF2 et le gène URA3 (5'ATF2-URA33'ATF2) a été montrée par amplification par PCR sur des cellules entières en utilisant les amorces OTG10841 et OTG10845 ci-dessus. L'absence de l'activité APAT a été ensuite montrée in vitro selon le test décrit & partir d'homogénat celullaire, comparativement a la souche parente qui montre une activité APAT marquée. Les souches répondant & ces critères ont ainsi été caractérisées comme des souches mutantes atf2 noté atf2::URA3. Une souche mutante ainsi obtenue à partir de la souche parente Fy1679 a été dénommée TGY156 et une souche mutante obtenu à partir de la souche parente TGY73.4 a été dénommée TGY158. Un échantillon de la souche TGY156 a été déposée à la CNCM le 2 février 1998 sous le numéro I-1977. Un échantillon de la souche TGY158 a été déposée à la CNCM le 2 février 1998 sous le numéro I-1976. C) Stabilisation de la prégnénolone in vivo dans les cultures de souches de levure atf2-::URA3. Les cellules de la souche TGY158 obtenue ci-dessus ont été inoculées & A600=0,1 dans le milieu YPD (Difco) contenant 100 g/ml de prégnénolone. Après 16 heures d'incubation à 280C, les stéroides ont été extraits avec du dichlorométhane et analysés par RP-HPLC comme indiqué ci-dessus. La figure 6(B) montre que le mutant TGY158 a perdu la capacité d'estérifier la prégnénolone alors que dans les mêmes conditions de culture, la souche parente TGY73.4 convertit la prégnénolone en prégnénolone acétate (figure 6(A)). Ces résultats permettent de conclure que le produit du gène ATF2 est responsable de l'estérification de la prégnénolone par la levure alors que l'interruption du gène ATF2 n'a pas conduit à des modifications apparentes de la croissance cellulaire dans des conditions normales. EXEMPLE 3 : Construction d'une souche de levure ayant le gêne ATF2 interrompu par le gène URA3 et exprimant la 3ss-H8D Des plasmides 2 portant une séquence d'ADNc codant pour la 3ss-HSD humaine sous le contrôle du promoteur CYC1 de S. cerevisae ou du promoteur TEF1 de S. cerevisae et portant le gène de résistance à G418 ont été construits selon le schèma des figures 7A à 7C, puis transformés dans des souches de levure mutantes atf2-::URA3. Dans un premier temps, un vecteur de transfert pTG10095 contenant la séquence d'ADNc codant pour la 3ss-HSD humaine type II décrit par E. Rhéaume et al., 1991 flanquée par les sites SalI et MluI et située en aval du promoteur de levure GALlO/CYCi a été généré de la façon suivante La séquence codante pour la 3P-HSD a été sousclonée par E. Rhéaume et al., 1991 comme un fragment de restriction SalI-NotI dans les mêmes sites du vecteur Bluescript II (Stratagène). Le vecteur obtenu décrit par E. Rhéaume et al., 1991 contient un site NotI localisé à l'extrémité 3' de la séquence codante pour la 3ss-HSD. Ce vecteur a été ensuite digéré par l'enzyme de restriction NotI, puis traité par le fragment de Klenow en présence de dNTP afin de remplir les extrémités cohésives, puis religaturé en présence de l'oligo- nucléotide ayant la séquence suivante OTG4461 : CACACGCGTGTG, préalablement phosphorylé et hybridé sur lui-même, de façon à introduire un site MluI. Le vecteur pTG10082 (fig. 7A) ainsi obtenu contient la séquence codante pour la 3ss-HSD contenant un site BglII et bordée par les sites SalI et MluI tandis que le site NotI a été perdu. Ce vecteur contient encore la région naturelle 5' non codante identifiée par la présence d'un site BglII. Afin de rapprocher le site SalI de 1'ATG initiateur en amont duquel on désire introduire le promoteur GALlO/CYCi, le vecteur pTG10082 a été digéré par l'enzyme de restriction MscI dont le site est situé dans la région 5' non codante et juste en amont de 1'ATG initiateur et par l'enzyme de restriction MluI. Le fragment MscI-MluI de 1,8 kb contenant la séquence codante pour la 3ss-HSD (fig. 7A) a été isolé puis ligaturé dans le plasmide pTG10033 (E. Degryse et al., 1995) contenant le promoteur GALlO/CYCi, préalablement digéré par l'enzyme de restriction SalI, puis traité par le fragment de Klenow en présence de dNTP, puis digéré par l'enzyme de restriction MluI. Le vecteur pTG10095 (fig. 7B) est ainsi obtenu. Dans un second temps, le vecteur de recombinaison pTG10260 contenant le plasmide 2 de levure, un replicon, une cassette d'expression CYClprom-PGXterm et le marqueur de sélection LEU2 (fig. 7B), a été construit. Ce vecteur est identique au vecteur pTG10159 décrit (E. Degryse et al., 1995), & l'exception du site XbaI contenu dans la région 2 qui a été remplacé par un marqueur XbaIO obtenu par remplissage du site naturel XbaI en présence du fragment de Klenow, puis par religature. Le plasmide d'expression pTG10268 a été ensuite généré par recombinaison homologue par introduction du block d'expression contenant le promoteur GALlO/CYClp, obtenu & partir du plasmide pTG10095 préparé ci-dessus puis digéré par l'enzyme de restriction NotI, dans le plasmide pTG10260 préalablement digéré par les enzymes de restriction SalI et MluI. Le plasmide pTG10268 (figure 7B) contient la séquence codante pour la 3P-HSD humaine type II sous le contrôle du promoteur CECI. Le plasmide d'expression pTG10862 contenant la séquence codante pour la 3ss-HSD sous le contrôle du promoteur TEFl a été ensuite construit de la façon suivante (figure 7C) Le plasmide pTG10832 (figure 8) a d'abord été construit par recombinaison homologue entre le fragment NotI obtenu & partir du plasmide pTG10268 préparé ci-dessus, puis digéré par l'enzyme de restriction NotI et le plasmide de recombinaison pTG10164 (E. Degryse et al., 1995) préalablement digéré par les enzymes de restriction SalI et MluI. Le plasmide d'expression pTG10862 a été ensuite obtenu par introduction du promoteur TEF1, contenu dans le fragment ClaI-SalI isolé a partir du plasmide pTG10085 (E. Degryse et al., 1995), à la place du promoteur CYCl excisé par digestion du plasmide pTG10832 construit ci-dessus par les enzymes de restriction ClaI et SalI. Le plasmide pTG10862 ainsi obtenu (figure 9) et contenant la séquence d'ADNc codant pour la 3ss-HSD humaine type II a été transformé respectivement dans la souche parente TGY73.4 ou dans son mutant atf2-::URA3 correspondant & la souche TGY158 obtenue à l'exemple 2 ainsi que dans la souche parente FY1679 ou dans son mutant atf2-A::URA3 correspondant à la souche TGY156 obtenue & l'exemple 2. Les transformants ont été isolés comme indiqué ci-dessus sur le milieu YPD contenant du G418 à 250 Mg/ml. Les colonies-candidates ainsi obtenues ont été ensuite précultivées sur le milieu SD contenant les éléments nutritionnels nécessaires pour chaque souche (histidine et uracile pour la souche TGY73.4 ; histidine pour TGY 158 ; tryptophane, histidine, leucine et uracile pour la souche FY1679 tryptophane, histidine et leucine pour la souche TGY156 ; à la concentration de 100 Zg/ml chacun), puis inoculées dans un milieu contenant de 100 Ag/ml de prégnénolone. Après 24 h de croissance et bioconversion å 28"C, les stéroïdes ont été extraits et mesurés par RP-HPLC comme indiqué ci-dessus. Les résultats obtenus, mesurés sur 3 clones de chaque souche, sont montrés dans le tableau suivant Souche Plasmide Prégnénolone Progestérone (g/ml) (Hg/ml) TGY73.4 pTG10862 1 0 TGY158 .. 94 15,2 FY1679 .. 1 1,3 TGY156 .. 100 13 Ces résultats montrent que le substrat prégnénolone est récupéré presque quantitativement dans les souches mutantes TGY156 ou TGY158 dans lesquelles un début de bioconversion de la prégnénolone en progestérone est observée alors que la disparition de la prégnénolone est complète dans les souches parentes TGY73.4 ou FY1679 qui ne produisent pas ou très peu de la progestérone, mais accumulent de l'acétate de prégnénolone comme cela a été montré à l'exemple 2. Un échantillon de la souche transformée TGY158/pTG10862 a été déposée à la CNCM le 2 février 1998 sous le numéro I-1978. 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REVENDICATIONS 1) Souche de levure modifiée dans laquelle l'activité acétyl- CoA prégnénolone acétyltransférase (APAT) est éliminée par altération du gène codant pour cette activité et dont il résulte une stabilisation des 3ss-hydroxystéroides. 2) Souche de levure modifiée selon la revendication 1 dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 de S. cerevisiae ou un homologue de celui-ci. 3) Souche de levure modifiée selon la revendication 2 dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2. 4) Souche de levure modifiée selon la revendication 3 dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion d'une séquence d'ADN ayant au moins un nucléotide. 5) Souche de levure modifiée selon la revendication 4 dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion du gène de sélection URA3. 6) Souches de S. cerevisiae modifiées selon la revendication 5 dénommées TGY156 et TGY158. 7) Souche de levure transformée dans laquelle l'activité acétyl-CoA prégnénolone acétyltransférase (APAT) est éliminée par altération du gène codant pour cette activité et exprimant au moins l'une des enzymes de la voie de biosynthèse de l'hydrocortisone à partir du cholestérol choisie parmi - l'enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol (P450SCC), - la 3ss-hydroxy-delta5-stéroïde déshydrogénase/delta5-delta4- stéroide isomérase (3ss-HSD) et - la 17a-stéroïde hydroxylase (P45017a). 8) Souche de levure transformée selon la revendication 7 dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2 de S. cerevisiae ou un homologue de celui-ci. 9) Souche de levure transformée selon la revendication 8 dans laquelle le gène altéré est le gène ATF2. 10) Souche de levure transformée selon la revendication 9 dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion d'une séquence d'ADN ayant au moins un nucléotide. 11) Souche de levure transformée selon la revendication 9 dans laquelle le gène ATF2 est altéré par insertion du gène de sélection URA3. 12) Souche de levure transformée selon la revendication 11 et exprimant P450SCC, ADX et ADR. 13) Souche de levure transformée selon la revendication 11 et exprimant la 3ss-HSD. 14) Souche de S. cerevisiae transformée selon la revendication 13, dénommée TGY158/pTG10862. 15) Souche de levure transformée selon la revendication 11 et exprimant P45017a. 16) Souche de levure transformée selon la revendication 11 et coexprimant la 3ss-HSD et P45017a. 17) Procédé d'oxydation in vivo d'un substrat choisi parmi un stérol endogène, un stérol exogène ou un stéroide exogène dans lequel on utilise une souche de levure transformée selon l'une des revendications 7 à 16 que, soit l'on cultive seule lorsque la souche génère le stérol endogène, soit l'on incube avec le stérol ou le stéroïde exogène et on isole éventuellement le composé oxydé obtenu. 18) Procédé d'oxydation in vivo selon la revendication 17 dans lequel le substrat est un stérol et dans lequel on utilise une souche de levure transformée selon la revendication 12 et isole éventuellement le 3ss-hydroxystéroide obtenu. 19) Procédé d'oxydation in vivo selon la revendication 17 dans lequel le substrat est un 3ss-hydroxystéroide et dans lequel on utilise une souche de levure transformée selon la revendication 13 et isole éventuellement le 3-oxo-delta4stéroïde obtenu. 20) Procédé d'oxydation in vivo selon la revendication 19 dans lequel le 3ss-hydroxystéroïde est choisi parmi la prégnénolone ou la 17a-hydroxyprégnénolone. 21) Procédé d'oxydation in vivo selon la revendication 17 dans lequel le substrat est un stéroïde et dans lequel on utilise une souche de levure transformée selon la revendication 15 et isole éventuellement le stéroïde 17a-hydroxylé obtenu. 22) Procédé d'oxydation in vivo selon la revendication 21 dans lequel le substrat stéroïde est la prégnénolone.