Brevet FR2777908A1 — publié le 19991029

CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE LA ss-GLUCOSIDASE D'ORIGINE FONGIQUE BGII. La présente Invention est relative au clonage de séquences d'acide nucléique codant pour une ss-glucosidase d'origine fongique faiblement inhibée par le glucose, et à l'utilisation desdites séquences pour la production de cette enzyme par génie génétique. Les ss-D-glucoside glucohydrolases, couramment dénommées ss-glucosidases, catalysent l'hydrolyse des alkyl- et aryl-ss-D-glucosides, ainsi que celle de différents oligosaccharides, et du cellobiose. L'utilisation de ces enzymes a été proposée par exemple dans l'industrie agro-alimentaire pour augmenter la qualité organoleptique de produits dérivés de fruits, en libérant des molécules responsables de l'arôme par l'hydrolyse enzymatique de leurs précurseurs glycosidiques non-odorants, ou bien en éliminant des glycosides responsables de saveurs non désirées (par exemple la naringine, responsable de l'amertume des jus d'agrume). Il a également été proposé d'utiliser des ss-glucosidases pour le recyclage de la cellulose par saccharification enzymatique. En effet, le cellobiose (ss-D-glucose (144) glucose), formé à partir de la cellulose sous l'action des cellulases (endo-ss-1,4- glucanase : EC 3.2.1.4, et exo-cellobiohydrolase EC 3.2.1.91), inhibe ces dernières enzymes. L'hydrolyse du cellobiose par une ss-glucosidase au fur et à mesure de sa formation, permet donc d'éviter son accumulation dans le milieu, et d'augmenter le taux de saccharification. Cependant, l'activité de la plupart des ss-glucosidases est fortement inhibée par le glucose, et également par le cellobiose, ce qui constitue un obstacle important à leur utilisation. Il a donc été entrepris de rechercher des ss-glucosidases moins sensibles à l'inhibition par le glucose, afin de les utiliser dans les applications ci-dessus. L'équipe des Inventeurs a ainsi précédemment produit à partir de champignons filamenteux, comme Aspergillus niger et Aspergillus oryzae, une B-glucosidase très faiblement inhibée par le glucose. Cette enzyme, dénommée BGII, fait l'objet de la Demande PCT WO 97/02341, au nom de L'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (Inventeurs : GÜNATA et al.), qui indique qu'elle est présente dans des fractions correspondant à une masse moléculaire estimée à environ 30 000, obtenues par chromatographie d'exclusion à partir du milieu de culture d'Aspergillus oryzae ; la protéine obtenue par chromatographie d'échange d'ions possède un point isoélectrique d'environ 4,2, et son pH optimum est compris entre 4,5 et 6,0. La constante d'inhibition (Ki) de cette enzyme pour le glucose est de l'ordre de 1M. Elle est également peu inhibée par la gluconolactone, et possède un large spectre d'activité sur différents ss-D- glucosides. La purification, à partir de la levure Candida pel ta ta, d'une ss-glucosidase possédant des propriétés similaires a ultérieurement été décrite par une autre équipe [SAHA et BOTHAST, Appl. Environ. Microbiol. 62, 3165-3170 (1996)]. Une analyse plus poussée de la ss-glucosidase EGIT, effectuée par les Inventeurs, a permis de préciser ses caractéristiques. La masse moléculaire de la protéine purifiée par chromatographie d'échange d'ions, déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, est de 43 kDa, son activité est optimale à un pH de 5, et une température de 500C. Elle est active sur les ss-1,3-, ss-1,6- et ss-1,4-glucosides ainsi que sur les a-1,3, a-1,4 et a-l,6-glucosides. Sa constante d'affinité (Km) pour le pNPssG a été évaluée à 0,55 mM, sa constante d'inhibition pour le glucose à 1,36 M, et sa constante d'inhibition pour la gluconolactone à 12,5 mM. Son activité est stimulée par 1'éthanol. Les propriétés de cette enzyme sont rappelées de manière plus détaillée dans l'exemple 1 ci-après. La ss-glucosidase BGII est produite en faible quantité par les Aspergillus. Il est indiqué dans la Demande PCT WO 97/02341, que cette production peut être augmentée en utilisant de la quercétine en tant que source de carbone pour la culture des Aspergillus. Pour contrôler encore mieux l'obtention et l'utilisation de la BGII, les Inventeurs ont maintenant entrepris de cloner le gène codant pour cette enzyme, afin d'optimiser son expression. Les Inventeurs ont ainsi isolé un fragment d'ADN génomique du gène de la BGII (ce gène est dénommé ci-après EXG1). La séquence de ce fragment est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; la séquence polypeptidique de son produit de traduction est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2 La présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII. Au sens de la présente invention, on entend par : ss-glucosidase de type BGII une ss-glucosidase possédant le spectre d'activité de la ss-glucosidase BGII telle que définie ci-dessus, (c'est à dire active sur les ss-1,3-, ss-1,6- ss-1,4-, a-1,3, a-1,4 et a-1,6-glucosides) et peu sensible à l'inhibition par le glucose, c'est à dire dont la constante d'inhibition (Ki) pour le glucose est supérieure à environ 900 mM ; ceci englobe, outre les différents variants et formes alléliques de la ss-glucosidase exocellulaire BGII d'Aspergillus oryzae ou d'Aspergillus niger, les ss-glucosidases de même type d'autres organismes, en particulier d'autres champignons, et tout particulièrement des Ascomycètes. Selon un mode de réalisation préféré d'un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, il comprend une séquence codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2, ou pour un fragment d'au moins 24 acides aminés consécutifs dudit polypeptide. La présente invention a également pour objet des fragments d'acide nucléique s'hybridant spécifiquement, en conditions stringentes, avec le fragment de séquence SEQ ID NO: 1, et en particulier des fragments d'acide nucléique d'au moins 18 pb homologues ou complémentaires de tout ou partie d'une séquence spécifique à l'un des exons dudit fragment. Ces fragments peuvent en particulier être utilisés comme sondes d'hybridation, et/ou amorces d'amplification, pour cribler des banques d'ADN génomique ou d'ADNc, en particulier des banques d'ADN de champignons, et tout particulièrement d'ascomycètes, afin d'isoler et cloner les séquences codant pour des ss-glucosidases de type BGII. La présente invention a également pour objet un procédé de clonage d'une séquence d'acide nucléique codant pour une ss-glucosidase de type BGII telle que définie ci-dessus, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la sélection d'un fragment d'ADN contenant ladite séquence, par hybridation dudit fragment avec au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus. La présente invention englobe également les fragments d'ADN susceptibles d'être isolés par ce procédé, et contenant une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII. Ces fragments d'ADN peuvent être utilisés pour transformer des cellules-hôtes eucaryotes ou procaryotes, en particulier afin d'y exprimer ladite 13-glucosidase. Des cellules et organismes hôtes utilisables pour exprimer une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII obtenue conformément à l'invention sont par exemple des bactéries telles que Escherichia coli, ou des champignons, tels que Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Aspergillus, Kluveromyces, Pi chia, Yarrowia, Hansenula, etc. Pour l'expression d'une ss-glucosidase de type BGII, la séquence codant pour cette enzyme peut être placée sous contrôle de ses propres séquences de régulation de la transcription, ou sous contrôle de séquences hétérologues, actives dans la cellule-hôte. Selon l'utilisation envisagée, on peut par exemple exprimer une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII sous contrôle d'un promoteur constitutif, ou, au contraire sous contrôle d'un promoteur inductible. La présente invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils résultent de l'insertion d'au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, dans un vecteur approprié. Ces vecteurs recombinants sont utilisables pour transformer des cellules-hôtes, conformément à l'invention. Des séquences de contrôle et des vecteurs appropriés pour l'expression de séquences d'intérêt dans différents types de cellules-hôtes sont connus en eux mêmes. A titre d'exemples non limitatifs, on pourra notamment utiliser, pour cloner et exprimer chez E. coli une ss-glucosidase de type BGII, des vecteurs de type pUC, qui permettent le clonage de gènes d'intérêt sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG (isopropyl13-D-thiogalactopyranoside) ; les clones positifs peuvent être sélectionnés par révélation grâce à X-Glc (5-bromo4-chloro-3-indolyl ss-D-glucopyranoside) donne un produit de dégradation bleu ; ou bien des vecteurs de type pQE (QIAGEN), qui permettent l'expression de polypeptides flanqués à l'une de leurs extrémités de 6 résidus histidine (6xHis tag), qui peuvent ensuite être purifiés par chromatographie d'affinité sur une colonne Ni-NTA, ou des vecteurs de type pET (NOVAGEN). Pour l'expression chez des champignons filamenteux, on placera de préférence le gène codant pour la protéine BGII sous contrôle d'un promoteur fort, tel que gp % , pcbCp, ou penDEp d'A. nidulans ou glapi d'A. niger. On peut par exemple utiliser des systèmes tels que ceux décrits par RADZIO et KÜCK [Process Biochem., 32, pp. 529-539, (1997)]; GOUKA et al. [Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 1-11, (1997)] ; GOMI et al. [Agric. Biol. Chem., 51, pp. 2549-2555, (1987)] et CHRISTENSEN [Aspergillus oryzae as a host for production of industrial enzymes, pp. 251-259 ; in K.A. Powell, A. Renwick, and J.F.Peberdy (ed.), The genus Aspergillus. Plenum Press, New York, (1994)]. Pour l'expression dans des levures telles que S. cerevisiae, on peut par exemple utiliser des systèmes d'expression tels que ceux décrits par BITTER et al. [Methods Enzymol., 153, pp. 516-544, (1989)] ou TUITE [Expression of heterologous genes, pp. 169-212. In M.F. Tuite, and S.G. Oliver (ed.), Biotechnology Handbooks, Vol. 4, Saccharomyces., Plenum Press, New York, (1991)] . Le gène codant pour la protéine BGII peut être placé sous contrôle d'éléments de régulation tels que les promoteurs constitutifs forts et terminateurs des gènes ADH ou PGK ; on peut également utiliser un promoteur fort induit en phase stationnaire de croissance [RIOU et al., Yeast, 13, pp. 903-915, (1997)]. Pour obtenir la sécrétion de la protéine BGII on peut utiliser comme séquence signal le facteur a (MFal) de S. cerevisiae [VAN RENSBURG et al, J. Biotechnol., 55, pp. 43-53, (1997)], ou bien la séquence signal des gènes EXG1 de S. cerevisiae [CID et ai., Yeast, 10, pp. 747-756, (1994)] ou XOG1 de C. albicans [DEL MAR GONZALEZ et al., Microbiology-UK, 143, pp. 3023-3032, (1997)]. La sélection des souches peut se faire au niveau du gène ura3. On peut également exprimer BGII dans d'autres levures que S. cerevisiae [GELLISSEN et al., Gene, 190, pp. 87-97, (1997)] et cloner le gène par expression chez S. cerevisiae selon la méthode de JACOBS et al. [Gene, 198, pp. 289-296, (1997)]. Les fragments d'ADN, vecteurs recombinants, et cellules transformées obtenus conformément à la présente invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre pour toutes les applications où il est nécessaire de disposer d'une ss-glucosidase peu sensible à l'inhibition par le glucose, et en particulier dans toutes les utilisations de la BGII qui sont décrites dans la Demande PCT WO 97/02341 mentionnée ci-dessus. Par exemple, des cellules transformées obtenues conformément à la présente invention, exprimant une ss-glucosidase de type milE, peuvent être utilisées pour la production industrielle de cette enzyme, qui peut être récupérée à partir du milieu de culture cellulaire. Elles peuvent également être utilisées directement, pour la synthèse d'alkyl-glucosides, pour l'hydrolyse de ss-D- glucosides précurseurs d'arôme dans des jus de fruits, pour la désamérisation des jus d'agrumes, ou pour l'hydrolyse enzymatique de la cellulose ou de ses dérivés. En outre, les ss-glucosidases de type BGII peuvent être avantageusement utilisées dans le cadre de la fabrication de boissons fermentées telles que le vin ou la bière, non seulement pour améliorer la libération des arômes, mais également pour éliminer des glucanes présents dans le mélange fermentaire. En effet, dans le vin, ces glucanes préviennent la sédimentation naturelle des particules dans le moût de raisin et entraînent le colmatage des membranes lors des étapes de filtration des moûts fermentés (VAN RENSBURG et ai., 1997) ; dans la bière, on trouve en particulier des 13-1,3-1,4-glucanes, provenant des céréales utilisées comme matière première, et qui causent les mêmes problèmes. La dégradation de ces glucanes en sucres fermentescibles par les endo-13-1,3- glucanases et les exo-ss-1,3-glucanases des levures de vin et de bière est limitée par le spectre d'action de ces enzymes. Les propriétés de la BGII mises en évidence par les Inventeurs, à savoir son activité non seulement sur des liaisons ss-1,3 et ss-1,6, mais également sur des liaisons ss-1,4, ainsi que la stimulation de cette activité par l'éthanol, rendent donc son utilisation dans ce domaine particulièrement intéressante. Cette utilisation peut être mise en oeuvre par exemple en ajoutant une préparation de BGII (éventuellement associée à une ou plusieurs autres enzymes possédant une activité endo-glucanase) au vin ou à la bière, après la fermentation alcoolique, et avant la filtration ; on peut également effectuer la fermentation alcoolique en présence d'au moins un microorganisme transformé exprimant une ss-glucosidase de type milE, et éventuellement une ou plusieurs autres enzymes possédant une activité endo-glucanase : il peut par exemple s'agir d'une souche de S. cerevisiae exprimant le gène EXG1 d'A. oryzae, en synergie avec le gène BGL2 de S. cerevisiae [MRSA et ai., J. Bacteriol., 175, pp. 2102-2106, (1993)]. La présente Invention sera mieux comprise à laide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant l'isolement d'un fragment d'ADN conforme à l'Invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE I : PURIFICATION A HOMOGENEITE ET CARACTERISATION DE LA ss-GLUCOSIDASE BGII La ss-glucosidase BGII est préparée à partir de la souche 12559 d'A. oryzae provenant de la collection du Centraalbureau Voor Schimmel Cultures (CBS, Pays-Bas). Cette souche est conservée sur milieu solide PDA ("Potato Dextrose Agar", DIFCO). Pour la production de l'enzyme, elle est cultivée sur un milieu de base contenant les composés suivants (p/v) : 0,28 NaNO3, 0,2% KCl, 0,1% KH2PO4, 0,1% NH4NO3, 0,18 (NH4)H2PO4, 0,05% MgSO4, 7H2O, 0,05% extrait de levure (DIFCO). Ce milieu est stérilisé 20 minutes à 1200C. La source de carbone utilisée (quercétine) est stérilisée à part (20 minutes, 1200C), puis mélangée au milieu minimum à une concentration finale de 0,5% (p/v). Les cultures, après ensemencement par spores d'A. oryzae/ml, en suspension dans une solution de TWEEN 80 à 0,15% (p/v), sont réalisées à 280C, sous agitation (125 tours/minute) . Des prélèvements sont effectués à différents temps tout au long des cultures pour suivre la cinétique de production de l'enzyme. Les prélèvements sont centrifugés (10000 g, 5 minutes) . Le surnageant de culture est utilisé pour le dosage de l'activité 13-glucosidase. Le dosage de l'activité ss-glucosidase s'effectue par incubation pendant 30 minutes à 500C de 1 à 100 l d'échantillon enzymatique dans un volume final réactionnel de 1 ml contenant 5 mM de p-nitrophénol ss-glucopyranoside (pNPBG) dans le tampon acétate 0,1 M, pH5. L'activité ss-glucosidase est déterminée par l'estimation de la quantité de p-nitrophénol (pNP) libérée après addition de 2 ml de Na2CO3 et lecture de l'absorbance à 400 nm. Elle est exprimée en unité par ml de solution enzymatique (U/ml). Une unité correspond au nombre de micromoles de pNP libérées par minute dans les conditions précitées (pmol/min). La cinétique de production de la ss-glucosidase totale extracellulaire, estimée par l'hydrolyse du pNPssG, est suivie lors du développement du champignon. Lorsque le maximum d'activité est atteint, après 14 jours de culture, les protéines totales contenues dans le filtrat de culture ont été précipitées avec 85 % (p/v) de sulfate d'ammonium. Cet extrait brut concentré a alors subi deux étapes de purification : une chromatographie d'exclusion et une chromatographie d'échange d'anions. - Chromatographie d'exclusion L'extrait brut concentré est déposé sur une colonne de filtration (1,6 X 90 cm) garnie d'ULTROGEL AcA44 (IBF), présentant un seuil d'exclusion de 10 à 130 kDa, préalablement équilibrée avec du tampon acétate 10 mM, pH 6, contenant 50 mM de NaCl et 8 mM d'EDTA, à 40C. L'élution est réalisée avec le même tampon sous un débit constant de 20 ml/h. L'éluat récupéré est fractionné à l'aide d'un collecteur automatique (PHARMACIA) réglé sur 2,5 ml/fraction. Le profil chromatographique fait apparaître 2 pics d'activité distincts, correspondant aux ss-glucosidases BGI et BGII décrites dans la Demande PCT WO 97/02341. Les fractions présentant le pic d'activité BGII sont regroupées, concentrées et dessalées par ultrafiltration sur membrane CENTRIPLUS PM 10 (AMICON). - Chromatographie d'échange d'anions Les fractions du pic BGII, regroupées à l'issue de la chromatographie de filtration, concentrées et dessalées, sont injectées sur une colonne TSK DEAE-5PW (BECKMAN) (7,5 X 75 mm) équilibrée avec un tampon citrate-phosphate 10 mM, pH 6, contenant 1 mM d'EDTA. La chromatographie est réalisée en CLHP (Chromatographie Liquide à Haute Pression). Après injection de l'échantillon, la colonne est lavée pendant 10 minutes avec le même tampon, puis encore 10 minutes avec le même tampon contenant 0,13 M de NaC1. La BGII est alors éluée avec un gradient linéaire de 0,13 à 0,25 M de NaCl, pendant 15 minutes. Des fractions de 1 ml sont collectées sous un débit constant de 2 ml/minute. L'élution des protéines contenues dans 1'effluent de la colonne est suivie à 280 nm. Les fractions correspondant à l'activité BGII sont regroupées, concentrées et dessalées par ultrafiltration sur membranes CENTRIPLUS PM 30 (AMI CON). La chromatographie d'échange d'anions sur TSK DEAE-5PW en CLHP des fractions du pic BGII a permis de purifier l'enzyme à homogénéité. L'activité BGII est éluée entre 0,198 et 0,212 M de NaCl, avec un maximum à 0,203 M. Cette solution d'enzyme est utilisée comme préparation purifiée pour la suite des expérimentations. Les résultats de la purification sont résumés dans le Tableau I ci-dessous. TABLEAU I Etape Protéines Activité Activité Taux de totales totale specifique Rendemen de purification (mg) (U) (U/mg) t purification (%) Filtrat de culture 193,8 1142 5,9 100 1 Sulfate 80,4 1040 12,9 91 2,2 d'ammonium ULTROGEL AcA 44 2,4 140 58,3 12,5 9,9 TSK DEAE-5PW 0,05 53,3 1066 4,5 176,9 A partir de dix litres de filtrat de culture sur quercétine, 50 microgrammes de BGII pure ont été obtenus, correspondant à 4,5% de l'activité -glucosidase totale sécrétée par le champignon et à 0,026% des protéines totales contenues dans les dix litres de filtrat de culture. - Détermination de la pureté de l'enzyme et de sa masse moléculaire Après la chromatographie d'échange d'anions, la pureté de la protéine a été vérifiée et sa masse moléculaire déterminée - par filtration sur gel en conditions nondénaturantes ; on observe une seule bande, correspondant à une masse moléculaire évaluée à 40 kDa par comparaison avec des marqueurs de masse moléculaire connue (SIGMA) - par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) sur un gel d'acrylamide à 10% et coloration au nitrate d'argent (Kit AMERSHAM). On observe également une seule bande, dont la masse moléculaire a été évaluée à 43 kDa à l'aide de marqueurs de masses moléculaires connues (BIORAD). Ceci indique que la BGII est une protéine monomérique. - DH et température d'activité optimale La température optimale et le pH optimal ont été déterminés comme décrit dans la Demande PCT WO 97/02341. L'activité BGIX est maximale pour une température de 500C, et un pH de 5. Les courbes d'activité sont représentées sur les figures 1A (activité à pH 5 ,en fonction de la température) et 1B (activité à 500C en fonction du pH). Les figures 1A et 1B représentent également respectivement les courbes de stabilité (O) de la BGII purifiée à homogénéité après 4 heures d'incubation à pH 5 à des températures variant de 20 à 800C, et après 24 heures d'incubation à 200C à des pH variant de 2,5 à 8. Ces courbes montrent que dans ces conditions, la BGII purifiée est stable jusqu'à 450C, et montre encore 50% d'activité à 500C, et qu'elle est stable entre pH 4 et 6,5 et conserve encore 608 de son activité à pH 2,5. La stabilité à plus long terme de la BGII purifiée à homogénéité a également été testée à 4"C et à pH 5. Dans ces conditions elle demeure stable pendant plus de 6 mois. En outre, rajoutée à un moût de raisin à pH 2,9, et incubée à 200C, comme indiqué dans la Demande PCT WO 97/02341, elle conserve la majeure partie de son activité après une semaine. -pI Le pI de l'enzyme pure, mesuré par isoélectrofocalisation, a été évalué à 4,2. - Inhibition par le glucose ou la 8-gluconolactone L'effet inhibiteur du glucose ou de la 6-gluconolactone sur la BGII purifiée à homogénéité, a été déterminé, dans les conditions optimales de l'activité BGII (500C, pH 5, 30 minutes), en utilisant le même protocole expérimental que celui décrit dans la Demande PCT WO 97/02341. La constante d'inhibition (Ki) de la BGII pour le glucose vis-à-vis du pNPssG, déterminée par la représentation de DIXON, a été évaluée à 1,36 M, et la constante d'inhibition pour la 6-gluconolactone, a été évaluée de la même manière à 12,5 mM. - Spectre d'activité: Les mesures d'activité de la BGII vis-à-vis de différents substrats, décrites dans la Demande PCT WO 97/02341 ont été confirmées ou complétées avec la préparation de BGII purifiée à homogénéité. L'hydrolyse des substrats a été estimée par mesure de la libération de pNP à 400 nm ou par mesure des sucres réducteurs à 540 nm [MILLER, Anal. Chem. 21, 426-428, (1959)]. Le Tableau II ci-dessous résume les résultats obtenus pour différents saccharides ou arylglycosides. TABLEAU II Liaison du Taux Substrat groupe glycosyl d'hydrolyse inital (%) Saccharides (2 mg/ml) Laminaribiose [3-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,3)Glc 100 Gentiobiose [6-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,,6)Glc 100 Cellobiose [4-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,4)Glc 87.8 Cellotriose [4-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,4)Glc 75 Cellotetraose [4-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,4)Glc 62 Cellpentaose [4-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,4)Glc 48 Xylobiose [4-O-ss-D-xylopyranosyl-D-xylose] ss(1,4)Xyl 43 Lactose [4-O-ss-D-galactopyranosyl-D-glucose] ss(1,4)Gal 73 Sophorose [2-O-ss-D-glucopyranosyl-D-glucose] ss(1,2)Glc 26 Nigérose [3-O-&alpha;-D-glucopyranosyl-D-glucose] &alpha;(1,3)Glc 72 Isomaltose [6-O-&alpha;-D-glucopyranosyl-D-glucose] &alpha;(1,6)Glc 70 Maltose [4-O-&alpha;-D-glucopyranosyl-D-glucose] &alpha;(1,4)Glc 68 Sucrose [1-O-&alpha;-D-glucopyranosyl-ss-D- &alpha;(1,2)Glc 0 fructofuranoside] Tréhalose [1-O-&alpha;-D-glucopyranosyl-&alpha;-D-glucose] &alpha;(1,1)Glc 0 Laminamarine [ss-(1,3)-D-glucane] (soluble) ss(1,3)Glc 11 Salicine [2-hydroxymethyl-phényl-ss-D-glucose] ssGlc 0 Aryl-glycosides (5 mM) p-Nitrophényl-ss-D-glucise ssGlc 100 p-Nitrophényl-ss-D-xyloside ssXyl 50 p-Nitrophényl-ss-D-galactoside ssGal 8.2 p-Nitrophényl-&alpha;-D-glucoside &alpha;Glc 1.6 p-Nitrophényl-ss-D-cellobioside ssGlc 3.3 p-Nitrophényl-ss-D-gentiobioside ssGlc 3.2 p-Nitrophényl-ss-D-maltopyranoside ssGlc 1.8 p-Nitrophényl-&alpha;-L-maltopyranoside &alpha;Glc 1.3 p-Nitrophényl-&alpha; -L-arabinofuranopyranoside &alpha;Ara 1.5 p-Nitrophényl-ss-D-glucuronide ssGlcA 2.5 Ces résultats montrent que la BGII présente un large spectre d'activité puisqu'elle est capable d'hydrolyser efficacement des ss-D-glucosides présentant des liaisons de différents types, tels que le laminaribiose (ss-1,3), le gentiobiose (ss-1,6), et les cellooligosaccharides (ss-1,4). Bien que la BGII hydrolyse le maltose (a-1,4) à 68% du taux d'hydrolyse optimale du laminaribiose, elle semble toutefois plus spécifique des liaisons ss ; en particulier, elle n'hydrolyse pas le pNPaG. Par contre, elle hydrolyse le pNP-ss-xyloside (pNPssX), à 50% du taux d'hydrolyse optimale du pNPBG, et le xylobiose, à 43% du taux d'hydrolyse optimale du laminaribiose. Les constantes d'affinité (Km) de la BGII visà-vis du pNPssG (Km=0,55 mM), du laminariobiose (Km=3,5 mM), du gentiobiose (Km=5 mM), du cellobiose (Km=7 mM), et du géranyl p-O-glucoside (Km=15,8 mM) ont été déterminées par la représentation de LINEWEAVER-BURK. Le taux décroissant d'hydrolyse des cellooligosaccharides (cellobiose à cellopentaose) et l'hydrolyse beaucoup plus faible de polysaccharides solubles tels que la laminarine, montrent que la BGII possède une activité exoglucosidase. L'hydrolyse d'autres 13-glucanes solubles et insolubles par la BGII est beaucoup plus faible que celle du laminaribiose (de 0 à 15). Cependant, un effet synergique de la BGII avec les ss-glucanases a été mis en évidence comme suit De la cellulose (SIGMACELL type 50, Sigma), ou bien de la laminarine, du curdlane, du pustulane, du lichenane, du laminarane ou du glucane de levure (provenant tous de chez SIGMA) sont hydrolysés, en utilisant les mêmes conditions que celles des expérimentations résumées dans le Tableau II, par un mélange obtenu par addition de 0,1 U/ml de BGII pure à une préparation commerciale de laminarase (0,1 U/ml, Sigma) ou de cellulase (0,1 U/ml, Sigma). On constate que l'hydrolyse du substrat et la production de glucose à partir de celui-ci sont augmentées de 20 à 1008 par rapport à celles observées, dans les mêmes conditions, avec la SGII seule. - Inhibiteurs et activateurs Les effets de différents cations, ainsi que ceux d'inhibiteurs et activateurs potentiels, sur l'activité de la BGII ont été étudiés. On observe une inactivation de l'enzyme en présence des ions Ag2+, Hg2+ Cru2+ Zon2+ et Fe3+, ainsi qu'en présence d'inhibiteurs tels que le SDS, le NBS, le DEPC, la castanospermine, la déoxynojirimycine, et la méthyldéoxynojirimycine. En revanche l'activité enzymatique n'est pas (ou peu) affectée par d'autres substances telles que l'EDTA, le pCMB, le dicyclohexyl carbodiimide, le réactif K de Woodward, le DTT, le DMSO, et le N-acétylimidazole. La présence de cations tels que Ca , Mg , ou Co2+, n'est pas nécessaire à l'activité enzymatique. Celle-ci est toutefois significativement stimulée par Mn2+ : l'hydrolyse du substrat pNPssG est augmentée de 77%, en présence de 5 mM de Mn L'éthanol stimule l'activité de la BGII cette stimulation est maximale pour des concentrations en éthanol du même ordre que celles rencontrées dans le vin : l'hydrolyse du pNPDG est ainsi augmentée de 30% en présence de 15% (v/v) d'éthanol, et de 15% en présence de 20% (v/v) d'éthanol. EXEMPLE II : ISOLEMNT DU GENE EXG1 DE LA ss-GLUCOSIDASE BGII - Séquençage partiel de la protéine Le séquencage de la protéine BGII a été entrepris à partir de la préparation de protéine purifiée à homogénéité décrite dans l'exemple 1 ci-dessus. L'extrémité N-terminale de la protéine étant en partie bloquée, un premier séquencage n'a abouti qu'à une séquence de 7 acides aminés N-terminaux. Pour obtenir des informations complémentaires sur la séquence, la protéine BGII a été digérée avec l'endo H (endo-peptidase de S. aureus), ce qui a permis de séquencer 4 petits peptides supplémentaires. Les séquences peptidiques obtenues sont présentées dans le Tableau III ci-dessous. TABLEAU III N-terminale F D Y N G E N C-terminale: &num;13 S F V S A G D D Q R &num;15 A V E W A G A A G L K &num;34 G A I Q W Q Q G D T V E Q &num;35 Y L G S D T V A A I E A I N E P N I P G G La comparaison de la séquence du peptide &num;35 avec les bases de données à l'aide du logiciel BLAST [ALTSCHUL et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10, (1990)], a révélé l'existence d'homologies avec une exo-ss-1,3- glucanase de S. cerevisiae. - Isolement d'un fragment du gène de la BGII Des amorces oligonucléotidiques dégénérées ont été dérivées à partir des séquences de 7 acides aminés N-terminaux de la protéine BGII, et de 6 acides aminés C-terminaux du peptide &num;35. La séquence de l'oîigonucléotide dégénéré dérivé de la séquence peptidique N-terminale de BGII est la suivante 5' TT(CT)GA(CT)TA(CT)AA(CT)GGC GA(AG)AA 3' son Tm est de 54,80C. La séquence de l'oligonucléotide dégénéré dérivé de la séquence peptidique C-terminale de &num;35 est la suivante 5' AT(CT)CC(CT)GC(CT)AC(CT)GT(CT)TC 3' son Tm est de 540C. Ces amorces ont permis d'amplifier par PCR (30 sec 940C, 30 sec 500C, 1 min 720C, 35 cycles), à partir de 1'ADN génomique total d'A. oryzae, un fragment d'ADN de 601 pb. Après le clonage direct du fragment PCR dans le vecteur pGEM-T (PROMEGA), et son séquencage, la séquence nucléique a été traduite en séquence polypeptidique. La séquence polypeptidique déduite obtenue de la sorte contenait, dans sa partie N-terminale, 5 acides aminés sur 7 de la séquence N-terminale de BGII déterminée par séquencage direct de la protéine. En revanche, la partie C-terminale de la séquence polypeptidique déduite ne correspondait pas à celle du peptide &num;35. Les Inventeurs ont alors recherché dans la séquence nucléique la présence de séquences d'épissage et d'introns, et ont ainsi localisé un intron entier de 64 pb à l'intérieur du fragment amplifié. Après élimination de la séquence de l'intron, la séquence polypeptidique C-terminale déduite contenait 19 des 21 acides aminés de la séquence peptidique &num;35. Ayant ainsi vérifié que le fragment d'ADN génomique récupéré par PCR correspondait bien à une partie du gène de la mABI, les Inventeurs ont alors comparé cette séquence avec celles présentes dans les bases de données, à l'aide du logiciel BLAST. Cette comparaison a fait apparaître des homologies avec des exo-ss-1,3-glucanases de différentes levures, telles que Paracoccidioides brasiliensis [CISALPINO et al., J. Biol. Chem. 271, 4553-4560, (1996)], Candida albicans [CHAMBERS et al., J. Gen. Microbiol. 139, 325-334, (1993)], S. cerevisiae [MUTHUKUMAR et al., J. Bacteriol. 175, 386-394, (1993)] [VAZQUEZ de ALDANA et al., Gene 97, 173-182, (1991)], et du champignon filamenteux Agaricus bisporus [VAN de RHEE et al., Curr. Genet. 30, 166-173, (1996)], et aussi avec une endo-p-1,6-glucanase d'un autre champignon filamenteux, Trichoderma harzianum [LORA et ai., Mol. Gen. Genet. 247, 639-345, (1995)]. - Isolement du gène entier Sachant que la protéine présente une masse moléculaire de 43 kDa, et que les gènes déjà isolés chez Aspergillus oryzae présentent en moyenne 4 à 6 introns de 50 à 80 pb [UNKLES, In: Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi. J.R. Kinghorn and G. Turner (Eds), Blackie Academic and Professional, Glasgow, pp. 28-53, (1992)1, la taille totale du gène correspondant à la BGII peut être estimée à environ 1500 pb. Pour cloner la totalité du gène, l'ADN génomique total d'A. oryzae est digéré avec plusieurs enzymes de restriction, et des profils de restriction sont établis par transfert de Southern blot. Pour chacune des enzymes de restriction testées, l'AON digéré est séparé par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1S, transféré sur une membrane de nylon (AMERSHAM), et hybridé avec le fragment PCR de 601 pb, marqué au 32P utilisé comme sonde. Les sites de restriction présents sur le fragment PCR ont par ailleurs été déterminés à partir de sa séquence. Il est ainsi possible de choisir l'enzyme de restriction la mieux adaptée pour obtenir un fragment contenant la totalité du gène de la BGII. Ce gène est ensuite récupéré par PCR inverse, à partir des fragments de 2,5 à 5 kb obtenus par digestion avec l'endonucléase choisie, puis purifiés et circularisés. On utilise comme amorces de PCR deux oligonucléotides choisis à partir de la séquence de 601 pb déjà disponible, ce qui permet d'amplifier spécifiquement les fragments d'ADN comprenant la séquence totale du gène EXG1. Ces fragments d'ADN sont ensuite séquencés après clonage dans le vecteur pGEM-T. Le gène entier ainsi récupéré pourra directement être inséré dans un vecteur d'expression, et exprimé chez Aspergillus. - Isolement de l'ADNc En parallèle, les ARN totaux d'A. oryzae cultivés sur quercétine ont été isolés et les ARN messagers (ARNm) purifiés. Les ADNc sont préparés par transcription inverse, et l'ADNc spécifique correspondant au gène recherché est amplifié à l'aide d'amorces oligonucléotidiques dérivées du fragment de 601 pb du gène de la BGII. L'ADNc ainsi amplifié est cloné dans le vecteur pAMP10 (GIBCO-BRL) et séquencé. La séquence codante ainsi obtenue peut être exprimée chez des microorganismes, tels que E. coli et S. cerevisiae. LISTE DE SEQUENCES (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 601 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Aspergillus oryzae (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:1..367 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: intron (B) EMPLACEMENT:368..431 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: exon (B) EMPLACEMENT:432..601 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:join(l..367, 432..601) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAT TAC AAT GGC GAG AAG GTC CGC GGT GTC AAC CTG GGT GGA TGG CTT 48 Asp Tyr Asn Gly Glu Lys Val Arg Gly Val Asn Leu Gly Gly Trp Leu 1 5 10 15 GTG CTT GAG CCT TGG ATT ACA CCT TCA ATT TTC GAT GCC GCT GGT GCC 96 Val Leu Glu Pro Trp Ile Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ala Ala Gly Ala 20 25 30 GAG GCC GTC GAC GAG TGG TCA TTG ACT AAG ATT CTG GGC AAG GAA GAG 144 Glu Ala Val Asp Glu Trp Ser Leu Thr Lys Ile Leu Gly Lys Glu Glu 35 40 45 GCT GAA GCC CGC TTG TCC GCT CAC TGG AAG TCT TTC GTC TCT GCG GGC 192 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala His Trp Lys Ser Phe Val Ser Ala Gly 50 55 60 GAT TTC CAG CGA ATG GCT GAT GCC GGA CTG AAC CAC GTC CGA ATC CCC 240 Asp Phe Gln Arg Met Ala Asp Ala Gly Leu Asn His Val Arg Ile Pro 65 70 75 80 ATT GGC TAC TGG GCT CTT GGA CCC CTC GAA GGA GAC CCT TAC GTC GAT 288 Ile Gly Tyr Trp Ala Leu Gly Pro Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Val Asp 85 90 95 GGT CAG CTA GAA TAC CTT GAC AAG GCG GTA GAA TGG GCT GGA GCG GCG 336 Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Asp Lys Ala Val Glu Trp Ala Gly Ala Ala 100 105 110 GGC CTC AAA GTT CTG ATC GAC CTT CAC GGT G GTAAGTGTCC TTTGGGCTGA 387 Gly Leu Lys Val Leu Ile Asp Leu His Gly 115 120 ACATCCAAAC ATGGGAGTCT AAGCATGGCT AACAATCTGG CCAG CA CCG GGA TCT 442 Ala Pro Gly Ser 125 CAG AAT GGA TTC GAC AAC AGC GGT CGG AGA GGA GCC ATC CAA TGG CAA 490 Gln Asn Gly Phe Asp Asn Ser Gly Arg Arg Gly Ala Ile Gln Trp Gln 130 135 140 CAA GGG GAC ACT GTT GAG CAG ACC CTT GAT GCC TTC GAC CTG CTG GCC 538 Gln Gly Asp Thr Val Glu Gln Thr Leu Asp Ala Phe Asp Leu Leu Ala 145 150 155 GAG CGG TAC CTT GGC TCC GAC ACC GTG GCT GCC ATC GAA GCT ATC AAC 586 Glu Arg Tyr Leu Gly Ser Asp Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala Ile Asn 160 165 170 GAG CCC AAC ATA CCC 601 Glu Pro Asn Ile Pro 175 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 179 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Asp Tyr Asn Gly Glu Lys Val Arg Gly Val Asn Leu Gly Gly Trp Leu 1 5 10 15 Val Leu Glu Pro Trp Ile Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Glu Ala Val Asp Glu Trp Ser Leu Thr Lys Ile Leu Gly Lys Glu Glu 35 40 45 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala His Trp Lys Ser Phe Val Ser Ala Gly 50 55 60 Asp Phe Gln Arg Met Ala Asp Ala Gly Leu Asn His Val Arg Ile Pro 65 70 75 80 Ile Gly Tyr Trp Ala Leu Gly Pro Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Val Asp 85 90 95 Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Asp Lys Ala Val Glu Trp Ala Gly Ala Ala 100 105 110 Gly Leu Lys Val Leu Ile Asp Leu His Gly Ala Pro Gly Ser Gln Asn 115 120 125 Gly Phe Asp Asn Ser Gly Arg Arg Gly Ala Ile Gln Trp Gln Gln Gly 130 135 140 Asp Thr Val Glu Gln Thr Leu Asp Ala Phe Asp Leu Leu Ala Glu Arg 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Ser Asp Thr Val Ala Ala Ile Glu Ala Ile Asn Glu Pro 165 170 175 Asn Ile Pro REVENDICATIONS 1) Fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour une p-glucosidase de type milB. 2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2, ou pour un fragment d'au moins 24 acides aminés consécutifs dudit polypeptide. 3) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement, en conditions stringentes, avec le fragment de séquence SEQ ID NO: 1. 4) Procédé de clonage d'une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection d'un fragment d'ADN comprenant ladite séquence, à l'aide d'au moins un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3. 5) Fragment d'ADN comprenant une séquence codant pour une ss-glucosidase de type BGII, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 4. 6) Vecteur recombinant, comprenant un insert constitué par un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 3, ou 5. 7) Cellule transformée par un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 1 à 3, ou 5. 8) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, pour la production d'une ss-glucosidase de type BGII. 9) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, exprimant une ss-glucosidase de type BGII, pour la synthèse d'alkyl-glucosides. 10) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, exprimant une ss-glucosidase de type BGII, pour l'hydrolyse de ss-D-glucosides précurseurs d'arôme. 11) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, exprimant une ss-glucosidase de type BGII, pour la désamérisation de jus d'agrumes. 12) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, exprimant une ss-glucosidase de type BGII, pour l'hydrolyse enzymatique de la cellulose ou de ses dérives. 13) Utilisation d'une cellule transformée selon la revendication 7, exprimant une ss-glucosidase de type BGII pour l'élimination des glucanes lors de la préparation d'une boisson fermentée.