Brevet FR2774395A1 — publié le 19990806

La présente invention concerne un procédé d'évaluation in vitro de substances génoprotectrices, telles que par exemple les produits anti-solaires. Les bienfaits ainsi que les méfaits du soleil visà-vis de l'épiderme sont bien connus aujourd'hui et sont fonction de l'intensité des rayonnements ultra-violet (W-A et UV-B). Les UV-A ont longtemps été considérés comme inoffensifs, car ils n'ont pas un effet immédiat sur les différentes couches cellulaires qui constituent la peau. Des découvertes récentes ont néanmoins montré que les UV-A déclenchaient la formation de radicaux libres dans le cytoplasme des cellules exposées. Les radicaux libres sont des molécules très réactives qui dégradent les constituants cellulaires tels que les lipides, protéines et acide désoxyribonucléique (ADN). Il y a alors formation de coupures simple brin dans les molécules d'ADN, lesquelles peuvent engendrer des mutations génétiques. Les W-B caractérisent l'ambivalence des effets du soleil sur la peau de l'homme. Les UV-B sont indispensables, car ils participent à la transformation du cholestérol en vitamine D (vitamine anti-rachitique), et à dose trop importante sont nocifs car ils lèsent directement l'ADN et peuvent être de ce fait carcinogènes, principalement lorsque les mécanismes de réparation deviennent défectueux. Des irradiations solaires répétées favorisent les altérations du génome des cellules de la peau, qui sont directement responsables des cancers de la peau. On distingue trois types de cancers: les cancers basocellulaires, qui ne métastasent jamais et guérissent toujours après ablation, les cancers spinocellulaires, qui métastasent parfois mais qui sont bien traités par chirurgie, et les mélanomes malins, qui tuent les personnes atteintes une fois sur quatre et dont la fréquence d'apparition dans la population double tous les dix ans. Les W-A et les W-B sont toutefois utiles puisqu'ils permettent à la peau de développer un bronzage qui constitue une protection naturelle contre les rayonnement W-A et UV-B. Lorsque les expositions solaires sont progressives, le bronzage apparait et offre une protection solaire équivalente à une crème ayant un indice de protection solaire de 8. I1 apparaît donc important qu'une petite quantité d'W atteigne les cellules épidermiques, sans que pour autant les effets nocifs destructeurs de l'ADN apparaissent aux niveaux des cellules de la peau. Pour éviter les effets nocifs du soleil, on peut utiliser par exemple des substances génoprotectrices, telles que par exemple les produits anti-solaires. Ces produits ou compositions antisolaires se présentent assez souvent sous la forme d'une émulsion de type huile-dansl'eau (H/E) ou eau dans l'huile (E/H), qui contient, à des concentrations diverses, un ou plusieurs filtres organiques classiques lipophiles et/ou hydrophiles, capables d'absorber sélectivement les rayonnements UV nocifs. Selon leur caractère lipophile ou au contraire hydrophile, ces filtres peuvent se répartir, respectivement, soit dans la phase grasse, soit dans la phase aqueuse de la composition finale. Ces filtres et leurs quantités étant sélectionnés en fonction de l'indice de protection recherché. L'indice de protection (IP), que l'on nommera dans la présente demande indice de protection solaire (IPS), s'exprime mathématiquement. L'IPS des produits anti-solaires, présentant des concentrations diverses en filtres, est évalué jusqu'à aujourd'hui par des procédés réalisés in vivo. Un des procédés d'évaluation in vivo de l'indice de protection solaire des produits anti-solaires, est la mesure , effectuée sur la peau d'une personne " cobaye ", du rapport qu'il y a entre le temps d'irradiation nécessaire pour atteindre le seuil érythématogène avec le filtre W, au temps nécessaire pour atteindre le seuil érythématogène sans le filtre W (Fédération des Industries de la Parfumerie, COLIPA, Méthode Colipa de détermination du Facteur de Protection solaire, octobre 1994). L'IPS s'exprime par la formule suivante: temps d'irradiation nécessaire au déclenchement de l'érythème avec produit anti-solaire IPS = -------------------------------------------- temps d'irradiation nécessaire au déclenchement de l'érythème sans produit anti-solaire Un autre procédé d'évaluation in vivo de l'indice de protection solaire des produits anti-solaires, est la mesure, après une série d'exposition W-A, de la quantité d'UV-A nécessaire pour provoquer l'apparition d'une pigmentation immédiate (pigmentation de Meirowski), avec et sans crème protectrice. La lecture s'effectue après deux heures d'attente (2nd Annual Meeting of the AMERICAN SOCIETY for PHOTOBIOLOGY, June 20-24, 1992- Marco Island, Florida (USA), Method for the UVA protection assessment of sunscreens based on residual immediate pigment darkenning). L'IPS s'exprime par la formule suivante: quantité d'W nécessaire à l'apparition de la pigmentation avec produit anti-solaire IPS = -------------------------------------~~~~~~~ quantité d'UV nécessaire à l'apparition de la pigmentation sans produit anti-solaire Cependant, il s'avère que l'érythème et la pigmentation immédiate ne sont pas directement dangereux pour l'épiderme. Comme nous l'avons expliqué précédemment, c'est la détérioration du génome des cellules de la peau qui est significativement importante à connaître. L'indice de protection solaire, tel que déterminé jusqu'à aujourd'hui, n'est donc pas approprié pour déterminer les risques génomiques réels des cellules. De plus, il n'existe aucun procédé d'évaluation des produits antisolaires vis-à-vis des effets nocifs des rayonnements W-A et W-B sur l'ADN des cellules de la peau. Il apparait donc nécessaire de mettre au point un procédé d'évaluation des produits anti-solaires par détermination de l'indice de protection génomique (IPG) de cellules mimant la structure de la peau. La présente invention propose de résoudre ce problème en fournissant un procédé d'évaluation d'une substance génoprotectrice, par exemple un produit antisolaire, caractérisé en ce que, in vitro: a) on dispose d'un échantillon d'une souche cellulaire dont le génome est susceptible d'être altéré sous l'effet d'un rayonnement W, b) on dispose d'un support d'essai comprenant un substrat transmettant ledit rayonnement W, revêtu ou non d'une couche de la substance à évaluer, c) on irradie l'échantillon cellulaire avec un rayonnement W, d'une part au travers du support d'essai sans ladite couche, et d'autre part au travers du support d'essai avec ladite couche, pour obtenir respectivement un échantillon cellulaire irradié témoin, et un échantillon cellulaire irradié de mesure, d) on détecte un paramètre représentatif de l'altération génomique des cellules sur les deuxdits échantillons cellulaires irradiés, e) et l'écart ou différence dudit paramètre, respectivement entre les deuxdits échantillons cellulaires irradiés, est représentatif de l'existence et/ou d'une valeur de l'altération génomique, corrélée avec la substance génoprotectrice. Par " substance génoprotectice " selon la présente invention, on entend toute substance solide ou liquide, capable de protéger le génome des cellules, lequel est susceptible d'être altéré par le rayonnement des W. On entend par exemple les vêtements à base de matières diverses, naturelles ou synthétiques, les matériaux qui font partie de l'environnement de l'homme et les produits anti-solaires sous différentes formes. Par " support d'essai " selon la présente invention, on entend tout support recouvrant l'échantillon cellulaire, suceptible de transmettre les rayonnements UV, et capable de mimer la structure de la peau humaine. Ce support peut comprendre par exemple un couvercle à base de plastique transparent recouvert avec un papier de type poreux et/ou adhésif, et/ou une ou des lamelles de verre dépolies transmettant les W-A et W-B tels que les lamelles commercialisées par Fisher. On peut immaginer tout type de support pouvant mimer la structure de la peau, tel que par exemple des tissus à base de matière naturelle ou synthétique, et même le produit VitroskinQ. Par évaluation " selon la présente invention, on entend la détermination de l'indice de la protection génomique de cellules susceptibles d'être altérées sous l'effet d'un rayonnement W. Par " paramètre représentatif de l'altération du génome" selon la présente invention, on entend tout paramètre permettant de mesurer ou de quantifier la destruction du génome cellulaire que l'on détermine par l'indice de protection génomique dans la présente invention. On pense notamment à la mesure de certaines protéines dites de stress, qui apparaissent lorsque la cellule subit des agressions diverses. On pense également à la détection des coupures simples brins de 1'ADN, par cassure du matériel génomique et réparation défectueuse par la cellule. Différents facteurs biochimiques peuvent donc être détectés par différentes techniques, telles que par exemple immunochimiques, immunoenzymatiques, et de coloration. Le procédé d'évaluation in vitro selon l'invention, par rapport aux procédés d'évaluation in vivo actuels, permet d'évaluer tout d'abord de manière simple, rapide et peu coûteuse les substances génoprotectrices, telles que notamment les produits anti-solaires, et apporte ensuite une mesure de la protection génomique, fiable et sure aux consommmateurs des produits antisolaires. Le procédé d'évaluation in vitro selon l'invention permet en outre d'éviter les éventuels dégats effectués sur la peau des personnes a cobaye " qui sont testées. En effet, dans la mesure où les dégats génomiques ne sont pas visibles à l'oeil nu, et que ceux-ci peuvent apparaitre avant les manifestations mesurées in vivo, les procédés actuellement employés peuvent s'avérer dangereux pour les personnes testées. De plus, le procédé selon l'invention permet d'obtenir des résultats constants, contrairement aux résultats variables des procédés actuellement utilisés qui sont fonction du type de peau de la personne testée. Certaines personnes sont plus sensibles que d'autres aux effets nocifs du soleil. Des études ont montré que les risques de mélanomes augmentent quand la peau est plus claire, et un test de dépistage de sujets à risque a été suggéré par l'utilisation du test des comètes, dont le contenu est incorporé dans la présente invention par référence (SINGH et al., a A simple technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells " Exptl. Cell Res., 175, 184-191), effectué sur les lymphocytes du sang ou les kératynocytes de la peau des sujets à risque (POUR LA SCIENCE, NO 226, Aout 1996). Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le paramètre représentatif de l'altération génomique des cellules est représenté par le nombre de coupure simple brin de l'ADN. Ce paramètre est spécifiquement bien adapté car il permet de visualiser les coupures simple brin de l'ADN, qui sont dues aux rayonnement W-A et UV-B. Pour le calcul des coupures de l'ADN, on préfère utiliser le calcul du Tail Moment (TM) que l'on définit comme étant le produit de la longueur de la comète (tête plus queue) par la quantité (8) dADN présente dans la queue. Les cellules testées dans le procédé selon la présente invention font plus particulièrement partie des cellules épidermiques qui constituent la peau. On peut également utiliser tous types de cellules d'origine animale ou humaine. On préfère utiliser des lignées immortalisées de cellules afin d'avoir des résultats toujours constants. Dans un mode de réalisation préférentiel selon l'invention, on utilise des cultures cellulaires provenant de mélanocytes d'origine humaine, de préférence provenant d une lignée immortalisée de mélanocyte d'origine humaine. De manière générale, les cellules sont mises en culture dans une bote de culture, avec une concentration comprise entre 104 et 106 cellules pour 75p1 d'agarose, puis après une phase de préparation décrite ci-après sont irradiées avec des rayonnement UV-A ou W-B, avec et sans protection par des produits anti-solaires. Les produits anti-solaires sont appliqués à des concentrations entre 0,5 et 3 mG/cm2, de préférence entre 1 et 2 mg/cm2, voire même 1 ou 2 mg/cm2. Dans un mode de réalisation préféré, la substance génoprotectrice à évaluer, telle que notamment un produit anti-solaire, est appliquée sur le support d'essai recouvert d'un matériau de type papier microporeux et/ou adhésif, de préférence microporeux et adhésif. Ce matériau permet de mimer d'autant plus la structure de la peau et permet ainsi d'obtenir des mesures de l'indice de protection génomique se rapprochant le plus de la réalité de la peau de l'homme. Les doses d'UV-A et d'UV-B délivrées pour évaluer l'indice de protection génomique ont été déterminées de façon à trouver sur les cellules protégées avec la crème des Tail Moment supérieurs à ceux trouvés avec des cellules témoin non irradiées, et de façon à obtenir un Tail Moment inférieur à 200 avec les cellules témoin irradiées. Le TM est de préférence compris entre 10 et 200. L'indice de protection génomique est calculé selon l'équation suivante: (TMc - TMt) - (TMs - TMt) IPG = --------------------------- X 100 (TMs - TMt) avec TMc = Tail Moment des cellules irradiées sans protection TMt = Tail Moment des cellules non irradiées, témoin TMs = Tail Moment des cellules irradiées avec protection Dans un mode de réalisation selon l'invention, la dose d'UV-A délivrée est comprise entre 0,05 et 2 J/cm2 et la dose d'UV-B délivrée est comprise entre 10 et 500 mJ/cm2. Dans un mode préférentiel selon l'invention, la dose d'UV-A délivrée est comprise entre 0,6 et 1 J/cm2 et la dose d'W-B délivrée est comprise entre 40 et 80 mJ/cm2. Dans un mode de réalisation très préférentiel selon l'invention, la dose d'UV-A délivrée est de 0,8 J/cm2 et la dose d'UV-B délivrée est de 60 mJ/cma. Le procédé selon la présente invention permet de tester des produits anti-solaires simples ou complexes, comprenant un ou plusieurs filtres. Les produits peuvent être sous différentes forme, telles que notamment un crème, une mousse, une lotion ou un spray. Les exemples suivants permettent d'illuster l'invention dans un mode de réalisation particulier, mais l'homme du métier est à même, par ses connaisances et les techniques de la biochimie, de mettre en oeuvre des modes différents de réalisation, tout en restant dans l'étendue de la protection définie par les revendications jointes. La figure 1 représente la relation entre l'IPS pour les W-A et l'IPG. La figure 2 représente la relation entre l'IPS pour les W-A et W-B et l'IPG. Exemple 1 On utilise dans son principe le test des comètes avec des mélanocytes humains. Les différents tampons utilisés dans la méthode décrite sont: Le tampon de lyse, constitué de: solution A: 2,5 M NaCl 146,37,2 mg 100 mM Na2EDTA 37,2 mg 10 mM TRIS 1,2 mg pH 10 avec 12 mg NaOH (solide) 1% Na Sarcosinate 10 mg Compléter avec 990 ml d'eau Milli-Q, stériliser par filtration. Le jour de l'expérience ajouter: solution A 45 ml 1% Triton X-100 0,5 ml 10% DMS 5 ml Le tampon d'électrophorèse, constitué de solutions stock: (1) 10 N NaOH (40 g/100 ml) (2) 200 mM Na2EDTA (7,4 g/100 ml) Tampon lx (à préparer pour chaque expérience) (1) 30 ml (2) 5 ml eau Milli-Q 965 ml Le tampon de neutralisation, constitué de TRIS 48,5 g Eau Milli-Q 1000 g Ajuster le pH avec de l'HCl concentré. Stériliser par filtration. L'appareil utilisé pour irradier les cellules est un appareil Vilber LourmatE équipé de trois lampes biosun émettant à 254 nm, 312 nm et 365 nm, ayant une puissance de 20 Watt. On programme l'appareil, à la longueur d'onde souhaitée, l'énergie nécessaire pour obtenir un TM compris entre 10 et 200. La méthode comprend les étapes suivantes: - les mélanocytes sont mis en culture dans un milieu liquide spécifique, tel que le milieu MCDB153 (commercialisé par SIGMA), pour atteindre une concentration déterminée permettant par la suite de prélever 105 cellules, - on aspire le milieu de culture lorsque la concentration désirée a été atteinte, - on utilise des lames de verre dépolies (commercialisées par Fisher, référence 12-544-5CY), on en prépare deux par produit à tester, - on dépose 85 pl d'agarose liquide sur une lame, on pose une lamelle dessus et on met le tout sur de la glace pendant 3 minutes pour solidifier, - on enlève ensuite délicatement la lamelle pour reprendre 105 cellules précédemment cultivées dans 75 il d'agarose liquide, puis on pose une lamelle et on met sur la glace pendant 5 minutes pour solidifier, - on enlève délicatement la lamelle et on dépose 75 îl d'agarose liquide que l'on recouvre d'une lamelle et que l'on met sur la glace pendant 5 minutes pour solidifier, - on enlève délicatement la lamelle et on place les couvercles recouverts par un papier poreux adhésif type TRANSPORE 3M (commercialisé par 3M), - on irradie les cellules avec des doses croissantes d'UV-A en utilisant l'appareil cité ci-dessus, - on lyse les cellules avec le tampon de lyse, pendant une heure à 40C dans l'obscurité, - après 20 minutes, on place les lames recouvertes d'agarose dans une cuve à électrophorèse pendant 20 minutes (25 V et 0,3 A), - on égoutte les lames sur du papier, puis on dépose à trois reprise et à 5 minutes d'intervalle 10 ml de tampon de neutralisation avec du bromure d'éthidium, - on met au repos dans une chambre humide en attendant la lecture, - on effectue la lecture au microscope à fluorescence et l'analyse est effectuée par le logiciel KOMET 3.1; on effectue la lecture 2 fois sur 50 noyaux, - on calcule alors l'IPG. Le tableau I montre les résultats obtenus de rayonnement W-A croissant sur des mélanocytes, sans protection de crème solaire. Tableau I Paramètres Tail Moment contrôle 0,1J/cm2 0,2J/cm2 0,4J/cm2 0,8J/cm2 moyenne 7,68 10,09 14,70 20,00 48,62 SE 0,93 1,36 1,80 2,38 4,12 Valeur de T 1,46 3,47 5 I 4,82 9,69 probabilité NS 0,0006 0,000003 Le contrôle est effectué sur des cellules non irradiées SE : écart moyen Comme on peut le voir, les effets des W-A sont directement proportionnels aux doses reçues. La corrélation de la dose reçue sur la réponse Tail Moment est également vérifiée pour les W-B. ExemPle 2 Différents produits solaires ont été testés avec un rayonnement de 0,8 J/cm2 pour les UV-A et de 60 mJ/cm2 pour les W-B. La méthode comprend les étapes suivantes: - les mélanocytes sont mis en culture dans un milieu liquide spécifique, tel que le milieu MCDB153, pour atteindre une concentration déterminée permettant par la suite de prélever 105 cellules, - on aspire le milieu de culture lorsque la concentration désirée a été atteinte, - on utilise des lames de verre dépolies commmercialisées par Fisher, référence 12-544-5 CY, on en prépare deux par produit à tester, - on dépose 85 pl d'agarose liquide sur une lame, on pose une lamelle dessus et on met le tout sur de la glace pendant 3 minutes pour solidifier, - on enlève ensuite délicatement la lamelle pour reprendre 105 cellules précédemment cultivées dans 75 pl d'agarose liquide, puis on pose une lamelle et on met sur la glace pendant 5 minutes pour solidifier, - on enlève délicatement la lamelle et on dépose 75 Zl d'agarose liquide que l'on recouvre d'une lamelle et que l'on met sur la glace pendant 5 minutes pour solidifier, - on enlève délicatement la lamelle et on place les couvercles recouverts par un papier poreux adhésif type TRANSPORE 3M (commercialisé par 3M), eux mêmes recouverts d'une couche de crème pour obtenir 1 à 2 mg/cm2, - on irradie les cellules avec l'appareil utilisé dans l'exemple 1, à des doses fixes de 0,8 J/cm2 pour les UV-A (365 nm) ou 60 mJ/cm2 pour les W-B (312 nm), - on met les cellules a incuber pendant une heure si les cellules ont été irradiées avec des W-B, - on lyse les cellules avec le tampon de lyse, pendant une heure à 40C dans l'obscurité, - après 20 minutes, on place les lames recouvertes d'agarose dans une cuve à électrophorèse pendant 20 minutes (25 V et 0,3 A), - on égoutte les lames sur du papier, puis on dépose à trois reprises et à 5 minutes d'intervalle 10 ml de tampon de neutralisation et du bromure d'éthidium, - on met au repos dans une chambre humide en attendant la lecture, - on effectue la lecture au microscope à fluorescence et l'analyse est effectuée par le logiciel KOMET 3.1; on effectue la lecture 2 fois sur 50 noyaux, - on calcule alors l'IPG. Les indices de protection solaire notés sur les produits solaires testés sont désignés dans la colonne IPS et W-A. Le test de la première colonne est celui de la mesure de l'érythème et celui de la deuxième colonne celui effectué par la méthode appelée pigmentation immédiate persistante. Les résultats rapportés correspondent à ceux donnés sur le produits solaire testé. Tableau II IPS W-A IPG W-B | IPG UV-A produit 1 15 7 26 57 produit 2 50 10 43 61 produit 3 60 12 45 61 produit 4 75 15 83 78 produit 5 30 15 40 79 produit 6 44 NC 58 11 Comme on peut le voir, il n'existe pas de corrélation entre l'IPS évalués pour les W-A et W-B et les valeurs obtenues d'IPG par la méthode selon l'invention pour les W-B, ni entre la méthode d'évaluation de l'IPS dans l'W-A et l'IPG évalué dans l'W-A. Cette méthode permet de déterminer un IPG pour chaque produits solaires, ce qui permet d'une part aux fabriquants de déterminer pour ses produits un indice précis et fiable de protection génomique, et permet d'autre part aux consommateurs de connaître l'indice de protection du produit qu'ils utilisent. Un produit ayant un IPG de 100 protège complètement la peau des dégats génomiques, c'est un produit type écran total. REVENDICATION8 1. Procédé d'évaluation d'une substance génoprotectrice, par exemple un produit anti-solaire, caractérisé en ce que, in vitro: a) on dispose d'un échantillon d'une souche cellulaire dont le génome est susceptible d'être altéré sous l'effet d'un rayonnement W, b) on dispose d'un support d'essai comprenant un substrat transmettant ledit rayonnement W, revêtu ou non d'une couche de la substance à évaluer, c) on irradie l'échantillon cellulaire avec un rayonnement W, d'une part au travers du support d'essai sans ladite couche, et d'autre part au travers du support d'essai avec ladite couche, pour obtenir respectivement un échantillon cellulaire irradié témoin, et un échantillon cellulaire irradié de mesure, d) on détecte un paramètre représentatif de l'altération génomique des cellules sur les deuxdits échantillons cellulaires irradiés, e) et l'écart ou différence dudit paramètre, respectivement entre les deuxdits échantillons cellulaires irradiés, est représentatif de l'existence et/ou d'une valeur de l'altération génomique, corrélée avec la substance génoprotectrice. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce le paramètre représentatif de l'altération génomique des cellules est le nombre de coupure simple brin de l'ADN desdites cellules. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la souche cellulaire provient d'un mélanocyte d'origine humaine. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration des mélanocytes est comprise entre 104 et 106 cellules pour 75 pl d'agarose, de préférence est de 105 cellules pour 75 Ml d'agarose. 5. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la substance à évaluer est appliquée sur le support d'essai recouvert d'un matériau de type papier microporeux et/ou adhésif. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la substance à évaluer est appliquée à une concentration de 0,5 à 3 mg/cm2, de préférence de 1 à 2 mg/cm2, voire 1 ou 2 mg/cm2. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance à évaluer est sous forme de crème, de mousse, de lotion ou de spray. 8. Procédé selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on délivre une dose d'W-A comprise entre 0,05 et 2 J/cma et/ou une dose d'W-B comprise entre 10 et 500 mJ/cm2. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la dose d'UV-A délivrée est comprise entre 0,6 et 1 J/cm2 et la dose d'UV-B délivrée est comprise entre 40 et 80 mJ/cm2. 10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la dose dlW-A délivrée est de 0,8 J/cms et la dose d'UV-B délivrée est de 60 mJ/cm2.