Brevet FR2782085A1 — publié le 20000211

La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et/ou de la résistance aux virus. La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors de la suppression tumorale et/ou lors du processus d'apoptose induit par le gène suppresseur p53. L'un des gènes suppresseurs les plus importants impliqués dans l'apoptose est le gène p53. Dans sa fonction normale, ce gène contrôle la croissance cellulaire et le processus d'apoptose ; en particulier, c'est ce gène qui bloque la croissance cellulaire et qui doit induire le processus apoptotique afin d'éviter le développement d'un cancer. On a ainsi mis en évidence que des souris nullizygotes pour le p53 étaient beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs. On a également mis en évidence le fait que, dans les cancers, le gène p53 était très souvent altéré et conduisait à la production de protéines incapables de véhiculer le message d'apoptose. C'est cette particularité qui a été mise en #uvre dans le cadre de la présente invention. En effet, la présente invention repose sur la constatation qu'il n'est pas possible, ou du moins qu'il paraît très difficile, de mettre en place une thérapie de substitution directe lors d'un dysfonctionnement du gène p53. En effet, le p53 muté comme il l'est dans le cancer va annuler l'effet physiologique du p53 normal. Il a donc fallu renoncer, du moins dans un premier temps, à une thérapie de substitution agissant directement au niveau de p53. La présente invention s'est donc attachée à étudier les gènes situés en aval de p53 afin de bipasser la difficulté évoquée précédemment. Afin d'isoler les gènes activés ou inhibés par le p53 normal (wild-type p53) on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une lignée maligne (K562) et une cellule dérivée (KS) avec une suppression du phénotype malin, plus particulièrement dans une cellule exprimant le p53 normal (KS) dans sa fonction et dans une cellule n'exprimant pas de p53 (K562). La comparaison des gènes exprimés (ARN messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre (les gènes peuvent être activés ou inhibés). On en déduit aisément que ces gènes sont impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence. Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode décrite en 1992 par Liang et Pardee (Differential display o eucaryotic mRNA by mean of a polymerase chaine reaction). L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à une fonction. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue et qui sont impliquées dans le processus de suppression du phénotype malin et/ou d'apoptose induit par le gène suppresseur p53 et/ou dans la résistance aux virus. Ainsi, la présente invention concerne de nouvelles séquences et les gènes les comportant ainsi que l'utilisation de ces séquences, tant au niveau du diagnostic qu'au niveau de la thérapie, de même que pour la réalisation de modèles destinés à tester des produits anti-cancéreux et anti-viraux. La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant : (a) une séquence selon l'une des IND. SEQ 1 à 15 ou un gène équivalent qui comporte : (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application notamment dans la suppression du cancer et/ou la résistance aux virus ainsi que dans le suivi thérapeutique. Il convient de rappeler que les séquences 1 à 15 ne constituent qu'une partie des gènes en cause mais que la présente invention couvre aussi bien la séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après. Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de l'ADN que de l'ARN ou des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont non naturels, soit pour améliorer leurs propriétés pharmacologiques, soit pour permettre leur identification. Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués précédemment). Ainsi, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques des gènes présentant une forte homologie avec les gènes mentionnés précédemment, de préférence une homologie supérieure à 80 % sur les parties essentielles desdits gènes, soit en général au moins 50 % de la séquence, de préférence l'homologie sera sur ces parties supérieure à 90 %. Enfin, lorsque lesdits gènes codent pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles. Les séquences selon la présente invention sont plus particulièrement les séquences qui sont induites ou inhibées lors de l'apoptose cellulaire, notamment celles induites par p53 et/ou p21 et/ou TSAP3 (HUMSIAH) et/ou antisensTSIP2 (antisens-PS1). En d'autres termes, ces séquences correspondent à des gènes dont l'expression cellulaire est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants anti-sens TSIP2. Lesdits gènes sont regroupés en TSAP ou "Tumor Suppressor Activated Pathway", et dénommés de TSAP 9 à TSAP 22 correspondant aux IND.SEQ l à 14, et en TSIP ou "Tumor Supprcssor Inhibitcd Pathvay", et dénommé TSIP 3, correspondant à IND.SEQ 15. Les caractéristiques des séquences sont rassemblées dans les tableaux ci-annexés. Les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes TSAP sont des séquences exprimées lors du processus d'apoptose alors que lorsqu'ils ne sont pas exprimés le processus d'oncogénèse se poursuit. Il est donc intéressant: - de détecter toute anomalie dans le gène correspondant, laquelle peut conduire à une plus grande susceptibilité à l'oncogénèse, et - de pouvoir prévoir une thérapie de remplacement. Il faut d'ailleurs rappeler que ces gènes peuvent intervenir dans d'autres processus que les processus de suppression tumorale ; en effet, p53 est en quelque sorte le gardien de l'intégrité du génome, dans ces conditions les gènes TSAP ou TSIP sont sans doute également impliqués dans cette fonction de contrôle, c'est donc l'ensemble des altérations possibles du génome qui peuvent être redevables de la détection et de la thérapie précédente. Au contraire, les gènes TSIP sont exprimés lors de l'oncogénèse et cette expression est diminuée voire inhibée lors de l'apoptose et de la suppression tumorale, il est donc là aussi intéressant de détecter l'éventuelle anomalie des TSIP et également de prévoir une thérapie d'inhibition/blocage. La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant le gène TSAP avec les éléments qui permettent son expression in vivo. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs particuliers, viraux ou non viraux, par exemple des adénovirus, rétrovirus, virus herpès ou poxvirus. La plupart du temps ces vecteurs sont utilisés sous forme défectifs qui serviront de véhicules d'expression de TSAP avec ou sans intégration. Les vecteurs peuvent être également synthétiques, c'est-à-dire mimer des séquences virales, ou bien être constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL. Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression tissus ou organes spécifiques, en effet, il n'est pas possible d'envisager d'activer un phénomène d'apoptose incontrôlé. La présente invention concerne donc l'ensemble des vecteurs décrits précédemment. La présente invention concerne également les cellules transformées par un vecteur d'expression tel que décrit précédemment ainsi que la protéine pouvant être obtenue par culture de cellules transformées. Les systèmes d'expression pour produire des protéines peuvent être aussi bien des systèmes eucaryotes tels que les vecteurs précédents que des systèmes procaryotes dans des cellules de bactéries. L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication de plusieurs gènes dans l'apoptose ; la surexpression de l'un des gènes par thérapie génique peut, pour certains d'entre eux, ne conduire à l'apoptose que les cellules dans lesquelles s'expriment déjà d'autres gènes déréglés, c'est-à-dire des cellules malignes. La présente invention concerne également, à titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques précédentes lorsqu'elle est induite lors de l'apoptose et/ou de la suppression tumorale, notamment des gènes TSAP 9 à TSAP 22, ou au contraire assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins une séquence cellulaire telle que décrite précédemment lorsqu'elle est inhibée lors de l'apoptose et/ou de la suppression tumorale, notamment TSIP 3. Il peut s'agir par exemple d'un nucléotide activé assurant le blocage de la séquence nucléotidique ou encore d'un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéine (s) codée (s) par la séquence nucléotidique. Par ailleurs, il est possible de prévoir d'autres approches que la thérapie génique, notamment l'utilisation de séquences nucléotidiques en stratégie sens ou antisens, c'est-à-dire pouvant bloquer l'expression de TSIP ou au contraire, agissant en amont, favorisant l'expression de TSAP. On peut également prévoir une stratégie de remplacement directe par apport de protéines correspondant à TSAP ou d'anticorps inhibiteurs correspondant à TSIP. Enfin, il est possible de prévoir l'utilisation de molécules non protéiques dont l'activité sera d'activer TSAP ou de mimer l'action de son produit d'expression ou bien d'inhiber TSIP ou bien de bloquer l'action de son produit d'expression. Ces produits peuvent être aisément testes sur les cellules modifiées qui sont décrites dans les exemples en introduisant les produits à tester dans la culture cellulaire et en détectant l'apparition du phénomène apoptotique. Dans les stratégies à ADN, ARN ou protéique les produits sont bien entendu élaborés en fonction des séquences qui sont décrites. La présente invention concerne en particulier l'utilisation des médicaments précédents en tant qu'agent anti-cancéreux. Mais le produit des gènes TSAP 9 à 22 et TSIP 3 est également utile comme agent antiviral, comme cela apparaîtra à la lecture de l'exemple. La présente invention concerne donc également l'utilisation des médicaments précédents comme agent antiviral. De plus, la présente invention concerne à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer, tout ou partie des séquences selon l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification, mais également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'invention ou les anticorps correspondants, éventuellement après culture. Les méthodes de diagnostic sont connues, il peut s'agir, par exemple, de techniques de microséquençage des parties variables après isolement et amplification éventuelle ou des méthodes de détection type RFLP ou d'amplification simple notamment. Les techniques différentielles peuvent, en particulier, permettre de mettre en évidence l'écart entre le TSAP ou TSIP normal et anormal. L'invention concerne également des modèles mettant en oeuvre les séquences précédentes. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de l'exemple ci-après. MATERIELS ET METHODES Cultures cellulaires Les cellules K562. KS. KS2 et KS3 ont été utilisées comme modèles. La lignée K562 est une lignée tumorale, dérivée d'une leucémie chronique de type érythromyéloïde. Elle est caractérisée notamment par un chromosome de Philadelphie qui contient la translocation (9,22), où il y a un réarrangement du gène bcr avec le proto-oncogène abl. Cette lignée a par ailleurs un caryotype anormal et surexprime les oncogènes myc et pim-l. Ces lignées sont décrites dans la référence A. Telerman et al. : Amodel for tumor suppression using H-1 parvovirus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 8702-8706, September 1993. En résumé, un monoclone de K562 a été infecté par le parvovirus H-1. Cette infection a causé une mort massive de la culture cellulaire. Après un maintien de cette culture pendant une période de deux mois, le clone KS a été isolé. La même expérience effectuée une seconde fois a fourni, après trois mois d'incubation, les clones KS2 et KS3. En employant la même approche, les inventeurs ont dérivé d'une population de cellules malignes U937 les lignées US3 et US4 qui sont résistantes au parvovirus H-l et qui présentent une suppression du phénotype malin. Ces lignées sont décrites dans la référence (7). Des cellules de leucémie myéloïde M1et des cellules M1ont été transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53 (LTR6). Ces cellules sont cultivées sur milieu RPMI 1640 avec 10 % FCS à 5 % de CO2 à 37 C (3). Pour la modification de la température, les cultures sont placées dans un second incubateur à 32 C. Lignée U937 transfectée par p21WAF1 : la partie codante complète du cDNA du gène p21WAF1 a été clonée dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, Californie. 3,5 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies). Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, décrivent notamment une suppression du phénotype malin. Lignée U937 transfectée par TSIP2 (PS1) en position antisens : la partie codante complète du cDNA du gène TSIP2 (PSI) a été clonée en position antisens dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies). Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, décrivant notamment un ralentissement de la croissance, une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin, ont été décrites dans la référence (8). Lignée U937 transfectée par TSAP3 (HUMSIAH): la partie codante complète du cDNA du gène TSAP3 a été clonée dans le vecteur pBK-RSV (Stratagene, La Jolla, Californie). 3 millions de cellules U937 ont été transfectées avec 20 microgrammes d'ADN/30 microgrammes Lipofectin (Life Technologies). Les transfectants stables ont été sélectionnés à l'aide de 1,5 mg/ml de G418 (Sigma). Les caractéristiques de cette lignée, comportent notamment une activation de l'apoptose et une suppression du phénotype malin. Etude des ADNc différentiels Pour effectuer les tests dans des conditions expérimentales standards et pour obtenir une reproductivité totale des résultats, les modifications suivantes au protocole d'origine (1) ont été effectuées : On utilise toujours des ARNm polyA+ purifiés deux fois sur colonne d'oligodT utilisant Fast Track (Invitrogen, San Diego CA). Après transcription réverse (M-MLV Reverse Transcriptase, Gibco BRL) sur 0,05 g de polyA+ utilisant 20 M de chacun des dNTP (Boehringer-Mannheim), aucun dNTP additionné n'est ajouté au mélange de PCR final. Un hot start à 94 C pendant 5 minutes est effectué avant la PCR (GeneAmp PCR system 9600 Pcrkin Elmer Cctus). Les échantillons sont refroidis rapidement sur de l'eau glacée. Un touch down (2) de 10 cycles de 50 C à 40 C est effectué (94 C 30 secondes - 50 C 1 minute - 72 C 30 secondes), suivi par 35 cycles (94 C 30 secondes - 40 C 1 minute - 72 C 30 secondes) et une extension finale de 5 minutes à 72 C. Les produits de la PCR sont séparés sur gels de polyacrylamide à 6 % non dénaturant (4). Les gels sont exposés sans séchage. Chaque présentation différentielle est effectuée en comparant M1S6 et LTR6 à 37 C et après 4 heures d'incubation des deux lignées cellulaires à 32 C. La procédure de présentation différentielle est répétée dans 3 expériences différentes pour confirmer une parfaite reproductibilité. Les bandes exprimées différentiellement sont découpées à partir du gel, éluées et réamplifiées (1). Les produits de PCR sont sous-clonés en utilisant le système TA-cloning (Invitrogen, San Diego CA) en suivant les indications fournies. Pour chaque réaction de ligation, 10 clones recombinants sont séquences en utilisant le système automatique ABI. Extraction des ARN, analyses et sondes Northern blots L'ARN total est extrait avec du Trizol (Life Technologies). Les ARN polyl+ sont préparés en utilisant le kit OligotexdT (Qjagen, CA). 30 g de l'ARN total ou 2 g d'ARN polyA+ sont séparés sur agarose 1 % 1 x MOPS/2 % gel de formaldéhyde, transférés sur membrane de nylon (Hybond N+, Appligène, France) comme cela a été décrit précédemment (5). Les Northern blots sont hybridés avec des sondes marqués au P32 sur les inserts TSAP et TSIP et lavés comme décrit précédemment (5). Pour vérifier l'induction de la fonction du p53 sauvage, les Northern blots sont hybridés avec une sonde cycline G (6). A titre de contrôle pour la quantité d'ARNm chargée, les bots sont hybridés avec une sonde GAPDH. Différents Northern blots (Clontech CA) sont utilisés dans des conditions identiques et hybridés pour contrôle avec une sonde P-actine. Les Northern blots sont exposés pendant 10 jours à - 80 C. Exemple 1 Le but recherché est de caractériser les voies moléculaires qui mènent à la suppression du cancer. De façon à élaborer un modèle, on a fait l'hypothèse suivante : s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-1, les cellules qui étaient résistantes, cette résistance pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Ceci a pu être démontré pour les cellules KS sélectionnées à partir des cellules érythro-leucémiques K562. Contrairement à la lignée parentale K562, les clones KS, KS2 et KS3 sont résistants à l'effet cytopathique du parvovirus H-l. En outre, les cellules KS, KS2 et KS3 ont une réduction de leur tumorigénicité de 90 %, alors que cultivées dans du "soft agar", ces mêmes lignées KS ont une réduction de leur tumorigénicité in vivo lorsqu'injectées dans des souris immunodéprimées Scid-Scid. Au niveau moléculaire, on a pu remarquer que cette suppression du phénotype malin allait de pair avec une réexpression du gène suppresseur p53. 15 ADNc exprimés de manière différentielle entre les cellules K562 et KS ont été isolés. TSAP 9 est homologue aux chaperonines. Le Tableau 1 rassemble les molécules caractérisées, en reprenant les amorces ainsi que les tailles des mRNAs détectés par Northern blot. De ces 15 molécules, toutes sont induites dans les cellules KS, hormis TSIP 3, dont l'expression est inhibée durant la suppression du phénotype malin. Dans des expériences de transfection, on a également pu démontrer que la résistance à l'effet cytopathique du parvovirus H-1 allait de pair avec une fonction intacte du gène p53 et que des cellules transfectées avec des mutants p53 devenaient sensibles à l'effet cytopathique du parvovirus H-l. Les 15molécules que nous avons isolées codent donc des gènes dont la surexpression ( TSAP 9 - TSAP 22) ou l'inhibition ( TSIP 3) est associée non seulement à la suppression du cancer mais également à la résistance au parvovirus H-l. Ces gènes codent par conséquent pour des molécules faisant 5 10 15 20 25 30 partie des voies moléculaires de la suppression du cancer et sont de potentiels gènes suppresseurs. Afin de mieux cerner les voies d'activation p53/p21, les inventeurs ont étudié : - l'activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle p53 thermosensible développé dans Moshe Oren, - l'activation de ces TSAP / inhibition des TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène p21, - l'activation des nouveaux TSAP/ inhibition des TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène TSAP3, et - l'activation de ces nouveaux TSAP/TSIP dans le modèle où les cellules U937 sont transfectées par le gène TSIP2 (PSI) en position antisens. Le Tableau 1 ci-après rend compte de résultats d'expressions différentielles analysées par Northern blot des différentes sondes (TSAP9TSAP22, TSIP3) du modèle K562/KS ainsi que des autres modèles U937/US3US4, c'est-à-dire dans un modèle de suppression tumorale dans lequel le gène p21 est activé par la voie p53 indépendante. Ces ADNc sont donc activés dans deux systèmes cellulaires différents de suppression tumorale (le modèle d'érythroleucémie K562/KS et le modèle myélomonocytaire U937/US). D'après ce tableau, on constate que dans la majeure partie des cas, les gènes exprimés différentiellement dans le modèle K562/KS sont également exprimés différentiellement dans le modèle U937/US3-US4. Il existe donc une machinerie moléculaire de la suppression tumorale commune à différents types de cancer. Cette conclusion est également valable pour le modèle Ml/LTR-6. Il faut noter dans ce dernier cas que l'absence de signaux dans certains TSAPTSIP est probablement due au fait que les expérimentations ont été réalisées dans deux systèmes hétérologues (des sondes humaines sur de l'ARN de souris). TABLEAU 1 O.ONKA AMORCES SONDE ADNc MODELE EXPRESSION 3' ET 5' * K562/KS HOMOLOGIE K562/KS DIFFERENTIELLE mRNA kb TSAP 9 T11AA-9 K26 D3 Chaperonin# 2,6 TSAP 10 T11AA-9 K25.0 A11 1,6 TSAP 11 TIIAA-9 K25.0 B7 EST 2,9 TSAP 12 T11AA-9 K27.1 C7 EST 5,5 TSAP 13 T11AA-23 K25.1 F3 EST 1,8 TSAP 14 T11AC-5 K33.2 F10 EST 2,5 TSAP 15 T11AG-19 K22 E3 EST 1,6 TSAP 16 T11GC-2 K12.1 F5 2,8 TSAP 17 T11GC-12 K16.1 C7 1,8 TSAP 18 T11GG-5 K3.1 D2 EST 2,0 TSAP 19 T11GG-23 K5.2 E 10 EST 1,5 TSAP 20 T11GG-23 K5.1 A12 1,7 TSAP 21 T11GG-23 K5.1 A1 EST 2,1 TSAP 22 T11GG-5 K3.1 A12 EST 2,8 TSIP3 T11AC-5 K33.1 B11 EST 9,5 * les chiffres et les séquences des amorces en 5' correspondent à ceux rapportés par Bauer et al. 0 HUMKG1DD ARNm humain pour l'ORF (équivalent humain de la chaperonine de souris contenant le gène TCP-1(t-complexe polypeptide). TABLEAU 1 (suite) TSAP 9 EXP. DIFF 2,0 TSAP 9 EXP. DIFF. 2,6 TSAP 10 NO EXP. DIFF. 1,6 TSAP 10 NO SIGNAL 1,6 TSAP 11 NO EXP. DIFF 2,8 TSAP 1 NO SIGNAL 2,9 TSAP 12 NO SIGNAL TSAP 12 NO SIGNAL 5,5 TSAP 13 EXP. DIFF. 1,5 TSAP 13 EXP. DIFF. 1,8 TSAP 14 EXP. DIFF. 2,8 TSAP 14 EXP. DIFF. 2,5 TSAP 15 EXP. DIFF. 1,8 TSAP 15 NO SIGNAL 1,6 TSAP 16 EXP. DIFF. 2,0 TSAP 16 EXP. DIFF. 2,8 TSAP 17 EXP. DIFF. 1,9 TSAP 17 EXP. DIFF. 1,8 TSAP 18 NO EXP. DIFF. 1,8 TSAP 18 EXP. DIFF. 2,0 TSAP 19 EXP. DIFF. 1,6 TSAP 19 NO SIGNAL 1,5 TSAP 20 EXP. DIFF. 1,9 TSAP 20 NO SIGNAL 1,7 TSAP 21 EXP. DIFF. 1,9 TSAP 21 EXP. DIFF. 2,1 TSAP 22 EXP. DIFF. 2,6 TSAP 22 EXP. DIFF. 2,8 TSIP 3 NO SIGNAL TSIP 3 NO SIGNAL 9,5 EXP DIFF. = Expression différentielle NO EXPR. DIFF. = Pas d'expression différentielle Le Tableau 2 ci-après résume l'expression différentielle de certains clones TSAP et TSIP dans différentes lignées de transfectants. Il se dégage de ce tableau que, dans la majeure partie des cas, les transfectants p21ou transfectants TSAP3 ou transfectants antisens-TSIP2 sont capables d'activer la machinerie moléculaire de la suppression tumorale commune aux systèmes U937/US et K562/KS. TABLEAU 2 C1.ONK 'l'1L\NSI'lK'TANTS 1'21 'l'1L\:'IiS.....:eI'AN'I'S 'l'SAI'J 't'ItANSh'h:Cl'AN'l'S'l'SII'2 EXPRESSION EXPRESSION ANTISENS DIFFERENTIELLE DIFFERENTIELLE EXPRESSION DIFFERENTIELLE TSAP9 OUI OUI OUI TSAP10 NON NON NON TSAP 11 NON NON NON TSAP 12 NON NON NON TSAP13 OUI OUI OUI TSAP14 OUI OUI OUI TSAP 15 OUI OUI OUI TSAP 16 NON OUI NON TSAP17 OUI NON NON TSAP18 NON OUI OUI TSAP 19 NON NON NON TSAP20 ND* ND* ND* TSAP21 OUI NON OUI TSAP22- OUI OUI OUI TSIP3 OUI OUI OUI 5 * Non déterminé LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : JEAN DAUSSET - CEPH (B) RUE : RUE JULIETTE DODU (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : (ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES ASSOCIEES A LA SUPRESSION DES CANCERS ET A LA RESISTANCE AU PARVOVIRUS H-l (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL : PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: NOM/CLE : TSAP9 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1: TCGGTCATAG TCTGGATGGG ATTCATGATA TGAAGCAACA GCATGTCATA GAAACCTTGA 60 TTGGCAAAAA GCAACAGATA TCTCTTGCAA CACAAATGGT TAGAATGATT TTGAAGATTG 120 ATGACATTCG TAAGCCTGGA GAATCTGAAG AATGAAGACA TTGAGAAAAC TATGTAGTAA 180 GATCCACTTC TGTGATTAAG TAAATGGATG TCTCGTGATG CGTCTACAGT TATTTATTGT 240 TACATCCTTT TCCAGACACT GTAGATGCTA TAATAAAAAT AGCTGTTTGG TTAAAAAAAA 300 AAA 303 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (NOM/CLE: TSAP10 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 2 : TCGGTCATAG ATATGGAGTG GAAATTTGGA GTGACATCTG GGAGCAGCGA ATTGGAGAAA 60 GTGGGAAGTA TATTTTTACA ACTAAAGTTG GTGGTTAAAA AAAAAAA 107 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: NOM/CLE : TSAP11 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 3 : TCGGTCATAG CGGTTCCAAG ATTAGCTTCT ACTGCTTCCT GTAGCTTGGC TAATATACTC 60 TGCTTTACAG CTGATGATAT GGTGTTGTTA AAAAAAAAAA 100 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: NOM/CLE : TSAP12 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 4 : TCGGTCATAG TAAATTCAGC ATGAAAGAGA ATATTACAGA AAAGACAGCA GCAGAAGCAT 60 TAGCATTATC TAATATTTAT ATATGTTATC AACATAACAC AGCAGTAAAA GGTTTAAATG 120 CATATCAATG GGTACCATGT CTAAAAATTA CTATAGTACC TATTTAGTGT ATTGGATATT 180 TTTCTTAAAG AGTGTTTGCT GTAACTAGAA CAGCATAATA CATGATTTAG TACAGTTAAT 240 TCTTATTGAT TAAATAATGT ATTTATGTAC TGAAGAAAGT GAAAAGGAGA CAGATATTTT 300 TTGCTTCATT TTGATTCCAG ATTTAACATT TAAATGAAGA TTCCAAAGGA CCATGACATG 360 TCATTATTTA ACTGAAATGG GCTTCAAAAT ATTTAAAAGA CGGTATGATT TGTATCTAAA 420 CAGCAAGGTG GCACCAGATA CACGTAATGC TACTGGCCTA TGACCGA 467 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: NOM/CLE : TSAP13 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 5 : AAAGCAGAGG GGTTTATTAT AGGAACATTC TCAAACCGCA ACGGAAAAGA TGTCCGTACA 60 GGTGGATGGG GATGGAGATC CACCTCGGAG TACACAGACT TCAGGGGGCC TCCTGCCTGG 120 CACGTTCTTT CTCTCCCGTA TCACCTATGA CCGA 154 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 6 : GGAACCAATC CTAAAGAATA TTCTTACATA TAATAAAGAA TTCCCATTTG ATGTTCAGCC 60 TGTCCCATTA AGAAGAATTT TGGCACCTGG TAAAAAAAAA AA 102 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 7 : GATTCTTTTA ATATTTTCAC AATGTTAAAA CTAAAACTGA GCTCTAGGCT ATGATC 56 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 8 : TGGATTGGTC CAGGATTGGG GTTTTGCTAG TCCATAGCAA TTCGAAGGGC AGTGGGCTAG 60 TGTTATGAGA ATATTGGCAA AAAAAAAAAA 90 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 9 : CTGCTTGATG TAGGAGGGAT TAAGTTAGTA TTTCCCGTAT CGACCAAGAC AAAATTACAA 60 TATACGCATA ACAAAGACAA ACACCAGTTA CTTGGCTCAA TATCCAAGTT TTAACCTAGC 120 AAAAAAAAAA A 131 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 10 : GGAACCAATC CCAACACAAC TGGATTCTAC TGAAATTACC ACATATTTGA GGTCCACAAG 60 CACAAGTATA GATCTAATGC AAACTGGGCT CAGATTAGCA GATCCATGCC AAAAAAAAAA 120 A 121 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 444 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 11 : TTTTTTTTTT TGGGACAGTC TTGCTGTATT GCCCAGGCTG GAGTGTGGTG GCACAATCAC 60 AGCTCATTGC ATCCTCAATC ACCCAGGCCT AAGCAATCCT CCCACCTTGT AGCTGGGACT 120 ACAGCTCACA GCACACCTGG CTAAAATTTT TTTTTTGTTG AGACGGATTC TCTATGTTGC 180 CCAGGCTGGT CTCAGGCTCC TGGGCTCAGA TGGTCCTCCT GCCTCAGCTT CCAAAGGCAC 240 AGGCCAAGTT GTAGCTTTGT CCCTTGCCAT CATGCCCAAC AAGAGGTTCT ATACCTTTTA 300 ATGAATTGAC TTTCATAAAT TGGTTATGTT GGTGGGCAAG TTCTTTAAGC TGGAAATTGT 360 AAATTCCTCC TGAAATGTTT TTTCATGCAG TTACCATGAA CTAATACTAC AATAAAGGAT 420 GGTCTTGGGT GCCAAAAAAA AAAA 444 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 12 : GATCTGACTG TAGGGACTAT ATTCATTACT GCTGGACTAT GCTGCTTTCC CCAACCCCCT 60 AGGATTTTAA AAATAGCACG CTGCACTTGA AACAGGGGAA GACACTGTAT AACATCCAAA 120 TGTTCTTCTT CCCTAGAGGC CAAAAAAAAA A 151 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 13 : GATCTGACTG TAGGGTGAAT GTCTGAGGCC TGCCTCCTAA TAAAGACTCA AGGAGGAAGT 60 CAATTGGGCA TCTGCTAATA GAATGAACTC ATGATGGAAA CTTCAGTTCA TTTACTTTGT 120 CCTGAAAATT CCCTGGTTCT GTTCCATTTT GAGCGAAATT GGCCTTGGGA AAAACCACGT 180 TCTTCCTTTC CGATTCTTCA TCCGGTCTAC GCTATGCAAT TCCTCCCCAA AAAAAAAAAA 240 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 14 : GGAACCAATC AGTAATTTTA AGGTTTTGTT TGTTCTAAAT GTAAGAGTTC AGACTCACAT 60 TCTATTAAAA TTTAGCCCTA AAATGACAAG CCTTCTTAAA GCCTTATTTT TCAAAAGCGC 120 CCCCCCCATT CTTGTTCAGA TTAAGAGTTG CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAGAAAAAGA 180 AAAAAAAGAG AAAGAAATGA GAAAGAAATG AGCTTCTAGA TCAATTAGCA GTGTGTGTGT 240 GTGTGTGCCA AAAAAAAAAA 260 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 15 : GGAACCAATC CAAATGCCCA TCAATGATAG ACTAGATAAA GAAAATATAG TACATATGCA 60 CCATGTAATA CTATGCAGCC GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGACAGACAA GGCCAAGGCC 120 AGGCACGGTG GGTAAAAAAA AAAA 144 REFERENCES (1) Liang P. & Pardcc A.B. (1992) Science, 257, 967-971 (2) Don R.H., Cox P. T., Wainwright 13 J., Baker K. & Mattick J S. (1991) Nucl. Acids Rcs , 19, 4008 (3) Yonish-Rouach E., Rcsnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A. & Oren M. (1991) Nature 352, 345-347 (4) Bauer D., Muller H., Reich J., Riedel H., Ahrenkiel V., Warthoe P. & Strauss M. (1993) Nucl. Acids Res. 21, 4272-4280 (5) Sambrook J., Fritsch E. F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning : a laboratory manual (6) Okamoto K. & Beach D. (1994) EMBO J., 13, 4816-4822 (7) NemaniM., Linares-Cruz G., Bruzzoni-Giovanelli H., Roperch J.-P., Tuynder M., Bougueleret L., Cherif D., Medhioub M., Pasturaud P., Alvaro V., Der Sarkissan H., Cazes L., Le Paslier D., Le Gall I., Israeli D., Dausset J., Sigaux F., Chumakov I., Oren M., Calvo F., Amson R. B., Cohen D. and Telerman A., Activation of the human homologue of the Drosophila sina gène in apoptosis and tumor suppression, Proc Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 9039-9057 (8) Roperch J. -P., Alvaro V., Prieur S., Tuynder M., Nemani M., Lethrosne F., Piouffre L., Gendron M-G., Israeli D., Dausset J., Oren M., Amson R., and Telerman A., Inhibition of presenilin 1 expression is promoted by p53 and p21 WAF-1 and results in apoptosis and tumor suppression, Nature Medicine (1998) 4, 835-838. REVENDICATIONS 1) Séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant: (a) une séquence selon l'une des IND. SEQ 1 à 15ou un gène équivalent qui comporte: (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est induite ou inhibée lors de l'apoptose et/ou suppression tumorale. 2) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'apoptose et/ou la suppression tumorale est (sont) par p53 et/ou p21. 3) Séquence selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi TSAP 9 à TSAP 22 ou un gène équivalent. 4) Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'apoptose et/ou la suppression tumorale est (sont) par p53 et/ou p21. 5) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle correspond au gène TSIP 3 ou un gène équivalent. 6) Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est inhibée lors de l'apoptose et/ou la suppression tumorale. 7) Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est activée par l'un au moins des transfectants choisi dans le groupe comprenant les transfectants p21, les transfectants TSAP3 et les transfectants antisens TSIP2. 8) Vecteur d'expression cellulaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 7. 9) Vecteur d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus herpès ou d'un poxvirus. 11) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à acide nucléique nu. 12) Vecteur selon l'une des revendications Sali, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique. 13) Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 8 à 12. 14) Protéine pouvant être obtenue par culture de cellule transformée selon la revendication 13 et codée par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7. 15) A titre de médicament, un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12 ou une protéine selon la revendication 14. 16) A titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3 ou de leurs produits. 17) A titre de médicament selon la revendication 15, un vecteur nucléotidique assurant l'expression cellulaire de ladite séquence. 18) A titre de médicament, un composé assurant l'inhibition de l'expression cellulaire d'au moins un gène cellulaire selon l'une des revendications 1,4 à 7 ou de leurs produits. 19) A titre de médicament selon la revendication 18, un nucléotide activé assurant la blocage de la séquence nucléotidique. 20) A titre de médicament selon la revendication 18, un anticorps monoclonal dressé contre la ou les protéines codées par la séquence nucléotidique. 21) A titre de médicament destiné au traitement du cancer, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20. 22) A titre d'agent antiviral, un médicament selon l'une des revendications 15 à 20. 23) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers, tout ou partie des séquences selon l'une des revendications 1 à 7 à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification. 24) A titre d'agent de diagnostic, notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivant des cancers, un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'une des revendications 1 à 7 ou les anticorps correspondants. 25) Modèle pour la mise en évidence de médicament anti-cancéreux, et/ou antiviral des cellules selon la revendication 13.