Brevet FR2782325A1 — publié le 20000218

PROCÉDÉ D'IDENTIFICATION DE SEQUENCES POLYNUCLEOTIDIQUES ET/OU DES PROTEINES CORRESPONDANTES A PARTIR D'UN ECHANTILLON D'ACIDES NUCLEIQUES La présente invention a pour objet une méthode d'isolement et de criblage de gènes sans création de banques d'expression in vivo. Plus particulièrement l'invention se rapporte à un procédé d'identification de séquences polynucléotidiques et/ou des protéines correspondantes à partir d'un échantillon d'acides nucléiques, par expression protéique in vitro après transcription et traduction de fragments d'ADN. La recherche de nouveaux gènes et/ou des protéines pour lesquelles ils codent constituent un objectif majeur de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. En effet, la thérapie génique et cellulaire ou la création d'animaux et de plantes transgéniques, suscitent de nouveaux espoirs pour la santé et l'alimentation humaine ou animale, mais nécessitent entre autres, d'identifier de nombreux gènes et/ou de nouvelles activités protéiques. Ainsi, il existe de nombreuses techniques d'isolement et de criblage de gènes par clonage et expression. On estime que la probabilité d'avoir le gène recherché dans une banque d'ADN génomique peut se calculer à l'aide de la loi de distribution de Poisson (1). Plus précisément, le nombre N de clones indépendants à cribler pour avoir 99% de chances de le trouver est égale à : Ln(l-P) / Ln(l-I/G) où I est la taille de l'insert et G la taille du génome en paires de bases. On considère généralement que pour avoir 99% de chances d' isoler la séquence voulue, le nombre de clones à cribler dans la banque doit être tel que le nombre de paires de bases criblées dans les clones (I x N) représente 5 fois la taille totale du génome (9) . Les procédés de l'art antérieur d'isolement et de criblage de gènes par clonage et expression présentent de nombreux inconvénients : - la toxicité cellulaire des produits de transcription et de traduction, qui peuvent induire des recombinaisons génétiques pour pallier à ces problèmes de toxicité, - la faible représentativité de la banque utilisée, - la faible compatibilité entre la séquence du gène cloné et la ponctuation d'expression du vecteur utilisé, - des niveaux d'expression très variables, - des problèmes d'usage des codons, - des problèmes de repliement, de modifications post-traductionnelles, - le problème posé par l'influence de l'état physiologique d'une cellule sur le niveau d'expression des protéines lorsqu'on cherche l'activité protéique directement dans des extraits cellulaires d'origine, - une grande difficulté d'automatisation. La présente invention vise précisément à offrir une méthode d'identification de séquences polynucléotidiques et/ou de protéines correspondantes ne présentant pas les inconvénients ci-dessus. Ce but est atteint grâce à un procédé d'identification de séquences polynucléotidiques et/ou des protéines correspondantes à partir d'un échantillon d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la préparation de fragments d'acides nucléiques à partir dudit échantillon d'acides nucléiques, b) l'insertion de chacun desdits fragments dans un vecteur de façon à créer des vecteurs recombinants, c) l'isolement de chaque vecteur recombinant ou d'une partie de ce vecteur recombinant par tout moyen approprié, d) le traitement in vitro du vecteur ou d'une partie du vecteur recombinant isolé à l'étape (c) pour obtenir des transcrits, e) le test d'une propriété des transcrits obtenus à l'étape (d) ou des protéines pour lesquelles ils codent par tout moyen approprié. On entend selon la présente invention par vecteur recombinant le vecteur dans lequel a été introduit un fragment, et par partie de ce vecteur, la partie du vecteur recombinant contenant le fragment obtenu à l'étape (a). Le procédé de l'invention offre l'avantage de pouvoir réaliser : - un test des propriétés des transcrits de l'étape (d), lorsque ceux-ci présentent des propriétés avantageuses de type tRNA, rybozyme, ou - un test des propriétés des protéines codées par lesdits transcrits. Dans le cas où l'on teste les propriétés des protéines codées par les transcrits obtenus à l'étape (d), le procédé de l'invention comprend à l'étape (e) le traitement desdits transcrits in vitro avec un extrait cellulaire permettant leur traduction en protéine, puis le test d'une propriété desdites protéines par tout moyen approprié, comme un test d'activité enzymatique, un test immunologique, un test d'affinité, etc.... L'étape (d) de transcription et la phase de traduction de l'étape (e) du vecteur recombinant ou d'une partie de ce vecteur sont aussi désignées conjointement réaction d'Expression Protéique In Vitro, désigné aussi réaction EPIV. La réaction EPIV peut être simultanée, ce qui signifie que la phase de traduction de l'étape (e) est réalisée simultanément avec la transcription de l'étape (d), ou décomposée en deux étapes distinctes, (d) de transcription et (e) de traduction. Le découplage des étapes (d) et (e) permet d'optimiser les rendements de chaque étape, et ainsi de produire des quantités plus importantes de protéines, ce qui trouve toute son utilité dans le cas d'enzymes de faible activité spécifique. Le découplage entre la transcription et la traduction permet également d'éviter les problèmes de dégradation de la matrice ADN par les nucléases si celle-ci a été préparée par PCR. En effet, les composants de la réaction de transcription sont moins contaminés par des nucléases, contrairement aux extraits de traduction. Le découplage permet en outre l'emploi d'extraits de traduction différents selon l'origine de l'ADN criblé. En effet, la phase de traduction du transcrit à l'étape (e) est avantageusement réalisée avec un extrait cellulaire de la même origine ou d'une origine proche de celle de l'échantillon d'acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemple, l'utilisation d'un extrait de traduction d'un organisme extrêmophile pour le criblage d'une banque d'ADN du même organisme ou d'un autre autre organisme extêmophile (thermophiles, halophiles, acidophiles, etc...) ou encore un extrait de traduction de cellules eucaryotes pour le criblage d'une banque d'ADN eucaryote. Ces extraits respectifs sont susceptibles d'améliorer l'efficacité du procédé. Mais ce traitement peut aussi être réalisé avec un extrait universel comme par exemple un extrait d'E. coli. Il est également possible d'ajouter à l'extrait de traduction de l'étape (e) une ou plusieurs substances favorisant un repliement plus efficace des protéines exprimées, comme par exemple des chaperons, des détergents, etc.... Le test d'une propriété des protéines synthétisées à l' étape (e) peut être réalisé par tout moyen approprié permettant par exemple de détecter la ou les activités enzymatiques recherchées. Cette forme de mise #uvre sera plus particulièrement appliquée lors de la recherche de nouvelles enzymes aux propriétés originales, comme par exemple des enzymes thermostables, actives à haute température, en milieu acide, en milieu à forte concentration saline, etc..., à partir d'un échantillon d'ADN issu d'organisme(s) extrêmophile(s). Ces enzymes extrêmophiles, souvent actives dans des conditions proches des conditions physiologiques des souches qui les produisent (températures, salinité, pH, etc...) sont des outils particulièrement intéressants pour de nombreux procédés industriels (industries de l'agro-alimentaire, de la nutrition animale, du papier, des détergents, du textile, etc...), où elles peuvent se substituer à leurs homologues mésophiles . Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il est totalement indépendant de l'expression in vivo des protéines. Les hôtes cellulaires, comme des micro-organismes, ne sont utilisés que pour l'isolement et l'amplification des fragments hétérologues. En conséquence, le procédé de l'invention permet d'éviter tous les problèmes rapportés précédemment avec les méthodes de clonage par expression de l'art antérieur. En particulier, le procédé de l'invention trouve tout son intérêt dans l'identification d'un gène exprimant une protéine cytotoxique. Dans ce sens, le vecteur de l'étape (b) est un vecteur ne permettant pas l'expression de protéines in vivo. A titre d'exemple d'un tel vecteur on peut citer : pBR322, pUC18, pUC19 ou pACYC184. Avantageusement, les fragments préparés à l'étape (a) du procédé de l'invention sont obtenus par l'action d'une ou plusieurs endonucléases sur l'échantillon d'acides nucléiques ou sur les produits de PCR dudit échantillon d'acides nucléiques. Dans le mode particulier de réalisation du procédé de l'invention où l'échantillon d'acides nucléiques ne nécessite pas de fragmentation, l'étape (a) consiste à préparer les fragments de cet échantillon pour l'étape (b), par exemple par extraction, et/ou purification et/ou préparation des extrémités pour l'insertion dans le vecteur. Les fragments préparés à l'étape (a) ont avantageusement une taille de l'ordre de 5 kb. En effet, la taille moyenne d'un gène procayote est d'environ 1000 paires de bases. En utilisant des fragments de 5000 paires de bases, il est possible d'obtenir des clones portant le gène complet avec leur propre site de fixation du ribosome. L'échantillon d'acides nucléiques à partir duquel sont préparés les fragments de l'étape (a) peut provenir d'un ou plusieurs organismes procaryotes ou cellules d'eucaryotes, ou encore de virus, identiques ou différents. Il peut s'agir par exemple d'un échantillon d'acides nucléiques d'un micro-organisme ou d'un mélange de micro-organismes, ou de cellules eucaryotes de tissus ou d'organismes identiques ou différents. Mais l'échantillon d'acides nucléiques peut également être constitué d'une séquence ou d'une banque d'acide(s) nucléique(s). Dans le cas d'une banque d'ADN eucaryote, la réaction de transcription peut être complétée par une réaction de splicing et de maturation in vitro des ARNm en ajoutant un extrait nucléaire au mélange réactionnel. Le procédé de l'invention est tout particulièrement destiné à identifier de nouveaux gènes et/ou les protéines qui y sont associées à partir d'ADN génomique. A l'étape (b) du procédé de l'invention, chaque fragment est inséré dans un vecteur au niveau d'un site de clonage ou d'une cassette de restriction. Selon une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, le vecteur est caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur d'ARN polymérase d'un côté du site de clonage et un terminateur d'ARN polymérase de l'autre côté. Il est aussi possible de concevoir un vecteur comprenant un site de clonage encadré par deux promoteurs d'ARN polymérase identiques ou différents et flanqués de part et d'autre du ou des terminateurs d'ARN polymérase correspondants. Dans le cas où le vecteur ne possède pas de promoteur(s) et de terminateur(s) d'ARN polymérase, ou dans le cas ou les promoteur(s) et terminateur(s) d'ARN polymérase ne sont pas adéquats pour réaliser l'étape (d), ces promoteur(s) et terminateur(s) peuvent être insérés à l'étape (c) du procédé de l'invention par tout moyen approprié. Une mise en #uvre avantageuse de cette insertion consiste à réaliser une PCR avec un jeu d'amorces portant les séquences des promoteur(s) et terminateur(s). Selon une forme de mise en #uvre avantageuse du procédé de l'invention, les promoteur(s) et terminateur(s) sont de type forts comme par exemple les promoteur(s) et terminateur(s) de la T7 ARN polymérase. L'isolement du vecteur recombinant de l'étape (c) peut être réalisé par transformation de cellules hôtes par l'ensemble des vecteurs recombinants obtenus à l' étape (b) de façon à créer une banque de clones,puis en ce qu'on réalise une extraction du vecteur ou d'une partie du vecteur recombinant contenu par chaque clone de la banque par tout moyen approprié. L'extraction du vecteur recombinant ou d'une partie de vecteur recombinant flanquée de promoteur(s) et terminateur(s) d'ARN polymérase peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, comme par mini préparation ou par PCR. Une alternative avantageuse consiste à réaliser cette PCR avec des oligonucléotides protégés en 5' des attaques nucléasiques (nucléases contenues dans le milieu de traduction) par des groupements phosphorothioates. Selon une forme particulière de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on effectue un tri des vecteurs ou des parties de vecteurs recombinants contenus dans les clones obtenus à l'étape (c). Pour cela, on réalise une réaction EPIV pour chacun des clones de la banque obtenus à l'étape (c) en incorporant dans le mélange réactionnel de la phase de traduction de l'étape (e) un marqueur de synthèse protéique (tRNA biotinylé, acide aminé modifié, etc...). Chaque produit de la réaction EPIV est alors analysé, par exemple par ELISA, pour la présence d'une protéine exprimée. Les clones pour lesquels la réaction EPIV est négative sont déterminés. Ces clones ne possèdent pas d'ORF sur leur insert. Suite à cette procédure de pré-criblage, ces clones sont éliminés des criblages ultérieurs d'identification de nouvelles activités enzymatiques. Une telle procédure de pré-criblage permet un gain de temps et de réactifs dans le cas d'un criblage répétitif, et non simultané de la même banque. Selon une forme de mise en oeuvre particulière, le procédé de l'invention est réalisé entièrement sur membrane. Pour cela, les colonies transformées par les vecteurs recombinants sont transférées séparément les unes des autres sur une même membrane, puis lysées in situ (3) afin que chaque colonie puisse libérer sur la membrane les copies du vecteur recombinant qu'elle contient. Une autre forme de mise en #uvre du même type consisterait à déposer séparément les uns des autres sur une même membrane chaque vecteur ou partie de vecteur recombinant. Il est alors envisageable de déposer quelques gouttes des réactifs permettant de réaliser une réaction EPIV à chaque emplacement comportant de l'ADN déposé selon l'une des techniques décrites ci-dessus. Le test d'une propriété pourrait être mené directement sur la membrane après un éventuel lavage de celle-ci. L'invention a également pour objet : - une séquence d'acide nucléique non encore connue constituant un gène identifié et sélectionné par le procédé de l'invention, ainsi - qu'un vecteur contenant cette séquence, un hôte cellulaire transformé par cette séquence d'acide nucléique ou par ce vecteur, ou - une protéine codée par cette séquence. L'invention concerne également toute banque constituée : - de séquences d'acide nucléique isolées par le procédé de l'invention, - de vecteurs contenant lesdites séquences, - d'hôtes cellulaires transformés par une de ces séquences ou par un de ces vecteurs, ou - de protéines codées par lesdites séquences. Le procédé de l'invention offre l'avantage par rapport aux méthodes de l'art antérieur d'être automatisable. Cette automatisation peut être menée, par exemple de la façon suivante : - Chaque vecteur recombinant de la banque constituée à l'étape (b) peut être mis en culture sur un support, dans un puit de micro plaque par un robot de type Colony Picker. - Cette culture peut servir à une étape d'extraction plasmidique réalisée par un robot de type Biorobot 9600 (QIAGEN), ou à une étape d'amplification PCR mise en #uvre par une machine de type MultiProbe (PACKARD), sur un thermocycleur automatique de type PTC 200 ou PTC 225 (couvercle robotisé - MJ RESEARCH). - La purification éventuelle des produits PCR peut être menée par l'automate BioRobot 9600. - La réaction EPIV des étapes (d) et (e) peut être entièrement gérée par le robot MultiProbe. Les tests des propriétés des transcrits obtenus à l'étape (d) peuvent être effectués sur le Multiprobe et la lecture des résultats est obtenue sur un lecteur correspondant. Si la réaction de transcription est découplée de la réaction de traduction, la purification des ARNm peut être réalisée par le BioRobot 9600. - Les tests d'activité des protéines synthétisées à l'étape (e) sont effectués par le MultiProbe, et la lecture des résultats est obtenue sur un lecteur (spectrophotométrie, colorimétrie, fluorimétrie, etc... en fonction du test réalisé) de micro plaques ou par tout autre moyen approprié. En conséquence, l'invention concerne aussi un dispositif comprenant un agencement d'un ou plusieurs supports, de robots et d'un lecteur desdits supports pour la réalisation des étapes du procédé de l'invention et de ses variantes. Tout vecteur présentant les caractéristiques définies précédemment peut être utilisé dans le procédé de l'invention. On peut citer à titre d'exemple, un vecteur représenté à la figure 2 et construit de la façon suivante : - Une origine de réplication plasmidique . - Un site de clonage encadré par deux promoteurs identiques, comme celui de la T7 ARN polymérase, ou de tout autre promoteur fort d'ARN polymérase, tel que Qss, T3, SP6, etc..., et flanqués de part et d'autre du terminateur de la même ARN polymérase. Une telle construction permet de transcrire un fragment d'ADN inséré dans le site de clonage, quel que soit son sens d'insertion. La probabilité de trouver un bon clone est donc multipliée par deux. La taille moyenne d'un gène procaryote est d'environ 1000 pb. En utilisant des fragments de 5000 pb environ pour générer la banque, il est fort probable d'obtenir des clones portant des gènes complets, avec leur propre site de fixation du ribosome (ou RBS pour Ribosome Binding Site). Avec ce système de double promoteur, le gène est situé au pire à 2000 bases du début de l'ARNm, ce qui permet une expression efficace de la protéine correspondante par le procédé de l'invention (comme rapporté dans la partie expérimentale ci-après sur l'activité -lactamase). - Eventuellement des séquences spécifiques de part et d'autre des terminateurs, servant de sites d'hybridation pour une amplification par PCR du fragment d'acide nucléique porté par le vecteur. - Un gène de sélection constitué par un gène de tRNA (4) . Eventuellement, en parallèle, un gène de résistance à un antibiotique (ou un autre type de gène de sélection) est inséré dans le site de clonage. Cette sélection antibiotique n'est utilisée que pour l'amplification préparative du vecteur de clonage. En effet, lors de l'insertion de chacun desdits fragments de l'étape (b), un fragment d'ADN se substitue à ce gène de résistance. Ce système présente l'avantage de ne pas dépendre d'une sélection antibiotique, qui pose des problèmes de contamination et de dégradation de l'antibiotique, et permet d'obtenir un vecteur recombinant ne possédant pas d'autre ORF que celle éventuellement introduite par le fragment hétérologue. D'autre part, il permet d'évaluer très rapidement le taux de clones négatifs, en pratiquant un étalement parallèle d'une fraction de la banque sur milieu minimum et sur milieu contenant l'antibiotique de sélection. Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet de rechercher des propriétés de nouveaux acides nucléiques et/ou des nouvelles activités protéiques dans des prélèvements bruts. En effet, il évite d'isoler chaque microorganisme présent dans ce prélèvement. L'isolement des microorganismes contenus dans un prélèvement est connu pour donner des résultats limités, car seulement quelques pour cent de la diversité des microorganismes présents sont récupérés. En outre, le procédé de l'invention offre un gain de temps considérable. La méthode de l'invention permet de réaliser un meilleur résultat, puisque la biodiversité criblée est de l'ordre de 100%, dans un délai de 5 à 10 jours. Alors que les méthodes de l'art antérieur permettent d'isoler de l'ordre de 5% de la biodiversité présente dans un prélèvement en plusieurs semaines voir plusieurs mois, et autant de temps est nécessaire pour cribler ces souches en vue de détecter une activité protéique testée. Le procédé de l'invention est également avantageux pour rechercher de nouvelles activités protéiques dans un germe ou une cellule donnée. Selon le procédé de l'invention, une banque génomique ou d'ADNc peut être facilement préparée et criblée. Outre sa rapidité, le procédé de l'invention permet de s'affranchir de la physiologie cellulaire. Il est ainsi possible de détecter les activités protéiques sans avoir à résoudre des problèmes de culture et d'états physiologiques. Ce procédé trouvera toute son utilité dans l'identification d'activités protéiques à intérêt industriel à partir d'organismes extrêmophiles isolés, ou encore d'un prélèvement brut desdits organismes. Enfin, le procédé de l'invention trouve un intérêt dans le domaine de la génomique. De par sa conception, il permet d'identifier de nouveaux gènes sans passer par le séquençage, car il permet de passer directement de l'ADN d'une cellule à la détection des propriétés des protéines qui peuvent être exprimées. Appliqué à la totalité de l'ADN génomique d'un organisme, le procédé du CEPIV permet d'accéder à la caractérisation du phénotype total de cet organisme, ce qui introduit la notion de "phénomique". D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples de réalisation de l'invention qui suivent et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 est un représentation schématique d'un exemple de mise en oeuvre du procédé de l'invention. La figure 2 représente un exemple de carte d'un vecteur de clonage pour la construction d'une banque selon le procédé de l'invention. La figure 3 représente les cartes des plasmides pADH, pTEM, pET26-Tfu2 et pGFP utilisés dans le cadre des exemples de réalisation du procédé de l'invention. La figure 4 représente l'activité de l'intéine 2 d'une ADN polymérase de Thermococcus fumicolans (Tfu) produite in vivo. Piste 1 : échelle 1Kb. Piste 2 : réaction sans enzyme. Piste 3 : réaction avec intéine 2. La figure 5 représente l'activité de la GFP produite par réaction EPIV (émission de fluorescence suite à une exposition à environ 400 nm) avec des extraits de traduction de mésophile. Tube A : réaction EPIV avec de l'eau (témoin). Tube B : réaction EPIV avec le vecteur pGFP. La figure 6 représente l'activité de l'intéine 2 de la Tfu ADN polymérase produite par réaction EPIV avec des extrait de traduction de type mésophile. Piste 1 : échelle 1Kb. Piste 2 : T- (réaction sans enzyme). Piste 3 : Blanc (réaction avec extrait EPIV sans ADN). Piste 4 : T+ (réaction avec intéine 2 produite in vivo). Piste 5 Essai (réaction avec intéine 2 produite par EPIV (pET26-Tfu2)). La figure 7 représente l'activité de la GFP produite par réaction EPIV avec des extraits de traduction de type thermophile (émission de fluorescence suite à une exposition à environ 400 nm). Tube A : réaction EPIV avec de l'eau (témoin). Tube B : réaction EPIV incubée à 37 C. Tube C : réaction EPIV incubée à 45 C. Tube D : réaction EPIV incubée à 50 C. Tube E : réaction EPIV incubée à 60 C. Tube F : réaction EPIV incubée à 70 C, Tube G : réaction EPIV incubée à 80 C. I - Materiel. 1) Souches et plasmides. Le vecteur pET26b+ fait partie de la famille des vecteurs pET développée par Studier et Moffatt (10) et commercialisée par la société NOVAGEN. Ce vecteur permet d'exprimer des gènes sous le contrôle du promoteur du phage T7. Le vecteur PINPOINTTM (PROMEGA) porte le gène cat (codant pour la chloramphénicol acétyl-transférase) sous contrôle du promoteur de l'ARN polymérase du phage T7. Le vecteur pHS2-22-21 a été construit en introduisant par PCR inverse le site de coupure reconnu par l'intéine 2 de la Tfu ADN polymérase (8) positionné dans le site de polyclonage du plasmide pUC19. La souche XL1-Blue [TnlO proA+B+ laclq # (lacZ) M15/recA1 endAl gyrA96 (NaI) thi hsdRl7 (rK m/) supE44 relAl lac] a été employée pour l'amplification de l'ADN plasmidique. 2) Réactifs. Les enzymes de restriction et de modifications rapportées dans le tableau I ci-dessous ont été utilisées selon les recommandations des fournisseurs. Tableau I Enz e Concentration Fournisseur Sca I 10 U/ l Appligene Oncor Sal I 8 U/ l New England Biolabs Nde I 20 U/ l New En land Biolabs Bam HI 20 U/ l New En land Biolabs Eco RI 20 U/ l New En land Biolabs T7 RNA 50 U/pl New England Biolabs polymérase T4 DNA ligase 400 U/ l New En land Biolabs Les tampons utilisés sont décrits dans le tableau II ci-dessous. Tableau II Tampons Composition T Tris HCl 10 mM pH 8,0 T7 RNA Tris HCl 400 mM pH 7,9,60 mM MgCl2, 20 polymérase mM spermidine, 100 mM DTT (10X) IT2 (10X) Tris-OAc 500 mM pH 8,0,750 mM Mg(OAc)2, 100 mM NH40Ac TADH (2X) glycine 100 mM, NaOH pH 10, 20 mM butanol 1,0,9 M NaCl, 4 mM NADP BETA NaP 50 mM pH 7,0,100 ug/ml nitrocéphine, 0,25 mM DMSO Ligation 10X Tris HCl 500 mM pH 7,5,100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP, 250 g/ml BSA II - Préparation et test des plasmides. 1) Constructions. Le gène de l'intéine 2 de la Tfu ADN polymérase (itfu2) (numéro d'accession dans Genbank: Z69882) a été inséré entre les sites de restriction Nde I et Sal I du vecteur pET26b+ afin de créer le plasmide pET26-Tfu2 (8) représenté à la figure 3. De la même façon, le gène de l'alcool deshydrogénase (adh) de Thermococcus hydrothermalis (numéro d'accession Y14015 dans Genbank), de la -lactamase TEM-1 (bla) d'Escherichia coli (11), et de la Green Fluorescent Protein (gfp) de Aequorea victoria (6) ont été insérés respectivement entre les sites de restriction Nde I et Bam HI, Nde I et Eco RI et Nde I et Eco RI du vecteur pET26b+, pour créer les plasmides pADH, pTEM et pGFP représenté à la figure 3. Pour chacun de ces quatre gènes, le site de restriction Nde I est superposé avec le codon ATG de l'initiation de la traduction. Chaque construction a été vérifiée par plusieurs analyses du profil de restriction. 200 l de cellules XL1-Blue chimiocompétentes (2) ont été transformées avec 10 ng de chaque plasmide par un choc thermique (3), et les cellules ainsi transformées ont été étalées sur milieu LB solide contenant 60 ug/ml de kanamycine et 12,5 ug/ml de tétracycline. A partir d'un clone de chacune de ces transformations, une maxipréparation d'ADN plasmidique a été réalisée avec une colonne de type TIP100 (QIAGEN). Après précipitation à l'isopropanol, chaque ADN plasmidique a été repris dans 100 l de tampon T. La concentration de ces ADN plasmidiques pET26-Tfu2, pADH, pTEM et pGFP a été évaluée (par un dosage spectrophotométrique à 260 nm) respectivement à 275 ng/ul, 460 ng/pl, 500 ng/pl et 375 ng/ul. La pureté de chaque ADN plasmidique a été vérifiée en déposant 0,2 l de chacun des vecteurs sur gel d'agarose TBE 1%. 2) Tests in vivo de l'expression - tests de l'activité. - pTEM : 200 l de cellules BL21 DE3 (pLysS) chimiocompétentes ont été transformées avec 10 ng du plasmide pTEM par un choc thermique, et les cellules ainsi transformées ont été étalées sur milieu LB solide contenant 60 pg/ml de kanamycine, 20 pg/ml de chloramphénicol, 32 pg/ml d'IPTG et 100 pg/ml d'ampicilline. Après une nuit d'incubation à 37 C, de très nombreuses colonies ont pu être observées sur la boite de Pétri, révélant ainsi que le gène TEM-1 du plasmide pTEM est exprimé et fonctionnel, et qu'il confère une résistance à l'ampicilline. - pGFP : 200 l de cellules BL21 DE3 (pLysS) chimiocompétentes ont été transformées avec 10 ng du plasmide pGFP par un choc thermique, et les cellules ainsi transformées ont été étalées sur milieu LB solide contenant 60 pg/ml de kanamycine, 20 pg/ml de chloramphénicol et 32 pg/ml d'IPTG. Après une nuit d'incubation à 37 C, de très nombreuses colonies ont pu être observées sur la boite de Pétri. La totalité de ces colonies ont réagi à une excitation aux ultraviolets (à environ 400 nm) en émettant une lumière fluorescente verte, ce qui a permis de vérifier que le gène gfp du plasmide pGFP est exprimé et fonctionnel. - pET26-Tfu2 : 200 l de cellules BL21 DE3 (pLysS) chimiocompétentes ont été transformées avec 10 ng du plasmide pET26-Tfu2 par un choc thermique, et les cellules ainsi transformées ont été étalées sur milieu LB solide contenant 60 pg/ml de kanamycine et 20 ug/ml de chloramphénicol. Une culture réalisée à partir d'un clone de cette transformation a été induite à D0600nm = 0,5 avec 0,5 mM d'IPTG pendant deux heures à 37 C. Après centrifugation, le culot bactérien a été repris dans du tampon phosphate de sodium 20 mM pH 7,5, et la lyse cellulaire a été obtenue grâce à plusieurs cycles de congélation/décongélation. L'intéine 2 a ensuite été purifiée sur une colonne QFast-Flow avec un gadient de NaCl. L'activité de cette enzyme a été testée selon le protocole suivant:! l de la fraction d'élution la plus concentrée en enzyme pure a été diluée cent fois. Un l de cette dilution a été incubé 15 minutes à 70 C avec 3 l de tampon IT2 et 220 ng du plasmide pHS2-22-21, linéarisé avec l'enzyme de restriction Sca I, dans un volume final de 30 ul. 15 l de ce mélange de digestion ont été déposés sur un gel d'agarose TBE 1%. Après migration et coloration au bromure d'éthidium, le gel a été exposé aux ultra violets. Comme montré à la figure 4, l'analyse de ce gel révèle la présence de deux bandes de respectivement 934 pb et 1752 pb, correspondant à la coupure du vecteur pHS2-22-21 (linéarisé Sca I) par l'intéine 2. Le gène itfu2 du plasmide pET26-Tfu2 est donc exprimé et son produit, l'intéine 2, est actif. - pADH : 200 l de cellules BL21 DE3 (pLysS) chimiocompétentes ont été transformées avec 10 ng du plasmide pADH par un choc thermique, et les cellules ainsi transformées ont été étalées sur milieu LB solide contenant 60 ug/ml de kanamycine et 20 ug/ml de chloramphénicol. Une culture réalisée à partir d'un clone de cette transformation a été induite à D0600nm=0,6 avec 1 mM d'IPTG pendant trois heures à 37 C. Après centrifugation, le culot bactérien a été repris dans du tampon phosphate de sodium 50 mM - MgCl2 10 mM pH 8,0, et la lyse cellulaire a été obtenue en incubant 30 minutes sur la glace en présence de 1 mg/ml de lysozyme, 10 ug/ml de RNAse A et 100 ug/ml de DNAse I. Le surnageant de centrifugation de cette étape d'extraction a été incubé 30 minutes à 50 C, et centrifugé à nouveau. Le surnageant de cette dernière étape a servi d'extrait enzymatique pour les dosages d'activité. Un témoin négatif a été constitué en parallèle en réalisant une extraction similaire sur une culture de cellules BL21 DE3 (pLysS) ne portant aucun plasmide. L'activité alcool déshydrogénase a été testée en suivant spectrophotométriquement la cinétique de réduction du NADP en NADPH à 340 nm. Pour cela, 10 l de l'extrait enzymatique, ou du témoin, ont été incubés à 50 C pendant cinq minutes avec 500 l de tampon TADH et 490 l d'eau. Dans ces conditions, une activité de 15,6 UDO/min/ul d'extrait enzymatique a été détectée, contre 0 UDO/min/ul pour le témoin. Le gène adh du plasmide pADH est donc exprimé et son produit, l'alcool deshydrogénase, est actif. III - Essais d'Expression Protéiaue In Vitro (EPIV) avec un extrait de traduction préparé à partir de souches mésophiles (37 C). 4 ug de chaque vecteur ont été précipités en présence d'un dixième de volume d'acétate de sodium 3M pH 6,0, et de deux volumes d'éthanol absolu glacial. Les culots de précipitation ont été rincés à l'éthanol à 70% pour éliminer toute trace de sels. Chaque ADN précipité a été resuspendu dans 4 l de tampon T. Cet ADN est incubé deux heures à 37 C dans un mélange d'expression protéique in vitro contenant 0,1 mM de chacun des 20acides aminés, 20 l d'extrait "S30 Premix" et 15 l de "T7 S30 extract" (PROMEGA) dans un volume final de 50 ul. Les extraits "S30 Premix" et "T7 S30 extract" contiennent tous les éléments nécessaires à une réaction de transcription in vitro couplée à une réaction de traduction, notamment : T7 ARN polymérase, CTP, UTP, GTP, ATP, tRNAs, EDTA, acide folique et sels appropriés. L'extrait de traduction a été réalisé selon la procédure décrite par Zubay (12) à partir d'une souche d'Escherichia coli B déficiente en endoprotéinase OmpT et en protéase Ion, ce qui assure une meilleure stabilité des protéines exprimées in vitro. Un témoin négatif a été constitué en incubant de l'eau stérile ultra pure à la place de l'ADN dans le mélange de transcription-traduction. Le témoin positif a été conçu en incubant 2 ug du plasmide PINPOINTTM . Les réactions EPIV ont été conservées sur la glace jusqu'à ce que l'activité enzymatique de chaque échantillon ait pu être évaluée. IV - DOSAGE DES ACTIVITES. 1) Enzymes de mésophiles. a) Activité GFP. La figure 5 montre le tube contenant le produit de la réaction EPIV avec le vecteur pGFP qui a été exposé aux ultra violets à environ 400 nm, à côté du tube contenant la réaction témoin. Seul le tube contenant la réaction EPIV du plasmide pGFP a émis une lumière fluorescente verte. La réaction EPIV a donc permis la production d'une protéine GFP ayant une activité de fluorescence. b) Activité P-lactamase. L'activité p-lactamase a été évaluée en suivant spectrophotométriquement la cinétique de dégradation de la nitrocéphine, une céphalosporine chromogénique, à 486 nm (5). Pour cela, 5,10 ou 20 l de la réaction EPIV avec le vecteur pTEM sont incubés 2 minutes à 37 C dans du tampon BETA qsp 1 ml. L'activité moyenne de la réaction EPIV avec le vecteur pTEM a pu être estimée à 8,9 UDO/min/ul d'extrait, contre 0,6 UDO/min/ul d'extrait avec la réaction EPIV témoin. La réaction d'expression protéique in vitro a donc permis la synthèse d'une P-lactamase active, capable de dégrader la nitrocéphine in vitro. Le vecteur témoin PINPOINTTM porte le gène bla sous contrôle de son promoteur endogène. Pourtant, l'activité P-lactamase de la réaction EPIV avec ce vecteur a été testée et évaluée à 6 UDO/min/ul d'extrait. Il convient de remarquer que l'ajout de rifampicine à 1 ng/ul, inhibiteur de l'ARN polymérase de E. coli, ne modifie pas significativement l'expression in vitro de la sslactamase avec le vecteur PINPOINTTM. Le gène bla du vecteur PINPOINTTM, situé à 2123 pb en aval du promoteur T7 est donc transcrit et traduit efficacement. Ceci implique qu'un gène situé à 2000 pb en aval d'un promoteur T7 est efficacement transcrit et traduit lors d'une réaction EPIV. 2) Enzymes de thermophiles. a) Activité Intéine 2. La réaction EPIV avec le vecteur pET26-Tfu2 a été testée afin de savoir si une intéine 2 active pouvait être produite. Pour cela, 5 L de cette réaction EPIV ont été incubés 20 minutes à 70 C avec 220 ng de vecteur pHS2-22-21, linéarisé par Sca I, et 3 L de tampon IT2 dans un volume final de 30 L. Un témoin négatif a été constitué en remplaçant les 5 L de la réaction EPIV par de l'eau. Le témoin positif contenait 1 L de la fraction purifiée d' intéine 2 produite in vitro diluée au 1/1000ème. Enfin, un témoin de spécificité a été réalisé en incubant 5 l de la réaction EPIV n'ayant pas reçu d'ADN. Après incubation, les quatre essais ont subi une extraction au phénol-chloroforme et une précipitation à l'éthanol absolu, suivie d'un rinçage à l'éthanol à 70 % afin d'éliminer les sels. Chaque culot de précipitation a été repris dans 10 l de tampon T, et 8 l ont été déposés sur un gel d'agarose TBE 1%. Après migration et coloration au bromure d'éthidium le gel a été exposé aux ultra violets pour analyser les profils de restriction. L'apparition de bandes à 934 et 1752 pb sur la piste 5 de la figure 6, identiques aux bandes de la piste 4 (témoin positif) révèle que l'intéine 2 est bien produite par la réaction EPIV, et que cette enzyme est active. De plus, la réaction EPIV est spécifique puisque aucune bande de digestion ne peut être observée sur le témoin de la piste 3. b) Activité alcool déshydrogénase. L'activité alcool déshydrogénase a été testée en suivant spectrophotométriquement la cinétique de réduction du NADP en NADPH à 340 nm. Pour cela, 5,10 ou 15 l de la réaction EPIV avec le vecteur pADH, ou sans ADN, ont été incubés à 50 C pendant cinq minutes avec 500 l de tampon TADH dans un volume final de 1 ml. Dans ces conditions, l'activité moyenne de la réaction EPIV avec le vecteur pADH a été estimée à 2,3 UDO/min/pl d'extrait, contre 0,32 UDO/min/ul d'extrait pour le témoin (réaction EPIV avec de l'eau). L'ADH de Thermococcus hydrothermalis (numéro d'accession Y14015 dans Genbank) a donc été produite sous forme active lors de la réaction EPIV. V - Essai d'expression protéique in vitro (EPIV) à haute température avec un extrait de traduction préparé à partir d'organismes thermophiles. Un essai d'expression protéique in vitro avec des extraits de traduction préparés à partir d'une souche thermophile a été réalisé. Pour cela, la réaction EPIV a été découplée en deux étapes. Au préalable, une réaction d'amplification génique a été effectuée à l'aide d'amorces protégées en 5' par des groupements phosphorothioates, de façon à amplifier le gène de la GFP (ainsi que le promoteur et le terminateur de la T7 RNA polymérase) porté par le vecteur pGFP. Ce produit PCR a été purifié avec le système Wizard PCR Preps (PROMEGA), puis précipité à l'éthanol en présence d'acétate de sodium, pour ensuite être resuspendu dans 30 l de tampon T. La concentration de ce fragment PCR a été évaluée par un dosage spectrophotométrique à 260 nm à 250 ng/pl. 1) Réaction de transcription. La réaction de transcription a alors pu être réalisée en incubant à 37 C pendant 150 minutes 3,7 pg de ce fragment PCR avec 50 l de tampon T7 RNA pol., 10 l de MgCl2 0,5 M, 5 l de DTT 1 M, 10 l de chaque NTP 100 mM, 2,5 l de RNAsine (40U/pl) et 30 l de T7 RNA polymérase dans un volume final de 500 l. Les ARNm obtenus par cette réaction ont été précipités directement à l'aide de chlorure de lithium, puis reprécipités à l'aide d'acétate de sodium dans l'éthanol absolu. Le culot ainsi obtenu a été resuspendu dans 30 l d'eau ultra pure, et 0,5 l de RNAsine ont été ajoutés pour éviter toute dégradation éventuelle des ARNm. La concentration de ces ARNm a été évaluée par un dosage spectrophotométrique à 260 nm à 10 ug/ul. 2) Réaction de traduction. Des extraits de traduction ont été préparés à partir d'une souche de Thermococcus selon les procédures décrites par Zubay (1973) (12) et Pratt (1984) (7), à partir de 30 g de cellules, à ce détail près que le cassage des cellules a été effectué au moyen d'un Cell Disrupter One Shot (Constant Systems LTD) à 30 kPSI. La réaction de traduction a été réalisée en incubant deux heures à 37 C ou 45 C ou 50 C ou 60 C ou 70 C ou 80 C 15 l d'extrait de traduction de thermophile avec 1,5 l de tRNA à 16 mg/ml, 2,6 l de Mg(OAc)2 0,25 M, 2,3 l de KAc 2 M, 8 l d'AcP 0,25 M, 12,5 l d'une solution contenant lmM de chaque amino acide, 1 l d'ARNm de la GFP précédemment préparés et 7,5 l d'une solution de traduction (270 mM Tris acétate pH 8,2, 12 mM DTT, 6, 5 mM ATP, 5, 4 mM GTP, 0,07 mg/ml acide folique, 6,5 mM EDTA). Un blanc a été constitué en remplaçant les ARNm de la réaction par 1 l d'eau stérile, et le tout à été incubé deux heures à 37 C. Après incubation, les tubes ont été refroidis à température ambiante pendant une demi heure. La figure 7 montre les tubes contenant le produit des réactions EPIV avec l'ARNm du gène de la GFP traduit grâce à un extrait de traduction de thermophile, et exposés aux ultra violets à environ 400 nm, à côté d'un tube contenant la réaction témoin. Seuls les tubes incubés à haute température (tubes E, F et G) ont émis une lumière fluorescente verte. Les extraits de traduction de thermophile utilisés ont donc permis de réaliser une synthèse à haute température (dans des conditions proches des conditions physiologiques de la souche dont ils sont extraits). De tels extraits pourraient être utilisés avantageusement pour la traduction et donc le criblage de gènes de souches thermophiles. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) Clark L. et Carbon J. , 1976, A colony bank containing synthetic ColEl hybrids représentative of the entire E. coli genome, Cell, 9,91-99. 2) Hanahan D., (1985), Techniques for transformation of Escherichia coli, dans DNA cloning : a practical approach, Glover D.M. (Ed), IRL Press, Oxford vol I, 109-135. 3) Maniatis T., Fristch E. F. et Sambrook J., (1982), Molecular cloning. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 4) Normanly J., Masson J.-M., Kleina L.G., Abelson J. et Miller J. H., 1986, Construction of two Escherichia coli amber suppressor genes : tRNAPheCUA and tRNACysCUA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,6548-6552. 5) O'Callaghan C.H., Morris A., Kirby S.M. et Shingler A.H., 1972, Novel method for detection of beta-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate, Antimicrob. Agents Chemother., 1, 283-288. 6) Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W.W., Prendergast F.G et Cormier M. J., 1992, Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein, Gene, 111,229-233. 7) Pratt J. M., 1984, Coupled transcriptiontranslation in prokaryotic cell-free systems, Transcription and Translation : A practical approach, Hames B. D. and Higgins S. J. Eds, JRL Press. 8) Saves I., Ozanne V. Dietrich J. et Masson J.-M (soumis). Only one inteine of Tfu DNA polymerase exhibits endonuclease activity with twenty one base pair homing. 9) Seed B., Parker R.C. et Davidson N., 1982, Représentation of DNA séquences in recombinant DNA libraries prepared by restriction enzyme partial digestion, Gene, 19,201-209. 10) Studier F. W. et Moffatt B. A., 1986, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol, 189,113-130. 11) Sutcliffe J. G., 1978, Nucleotide séquence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,3737-3741. 12) Zubay G., 1973, In vitro synthesis of protein in microbial systems, Ann. Rev. Genet., 7,267- 287. REVENDICATIONS 1) Procédé d'identification de séquences polynucléotidiques et/ou des protéines correspondantes à partir d'un échantillon d'acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la préparation de fragments d'acides nucléiques à partir dudit échantillon d'acides nucléiques, b) l'insertion de chacun desdits fragments dans un vecteur de façon à créer des vecteurs recombinants, c) l'isolement de chaque vecteur recombinant ou d'une partie de ce vecteur recombinant par tout moyen approprié, d) le traitement in vitro du vecteur ou d'une partie du vecteur recombinant isolé à l'étape (c) pour obtenir des transcrits, e) le test d'une propriété des transcrits obtenus à l'étape (d) ou des protéines pour lesquelles ils codent par tout moyen approprié. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que dans le cas où l'on teste les propriétés des protéines codées par les transcrits obtenus à l'étape (d), l'étape (e) comprend le traitement desdits transcrits in vitro avec un extrait cellulaire permettant leur traduction en protéines puis le test d'une propriété desdites protéines. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la phase de traduction de l'étape (e) est réalisée simultanément avec la transcription de l'étape (d). 4) Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que la phase de traduction du transcrit à l' étape (e) est réalisée avec un extrait cellulaire de la même origine ou d'une origine proche de celle de l'échantillon d'acides nucléiques. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'extrait cellulaire est un extrait de traduction d'un organisme extrémophile. 6) Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que la phase de traduction du transcrit à l' étape (e) est réalisée avec un extrait universel comme par exemple un extrait d'E. coli. 7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'extrait de traduction de l'étape (e) comprend une ou plusieurs substances favorisant un repliement plus efficace des protéines exprimées. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le test d'une propriété des protéines synthétisées à l' étape (e) est réalisé par tout moyen permettant de détecter la ou les activité(s) enzymatiques recherchées. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur de l'étape (b) est un vecteur ne permettant pas l'expression de protéines in vivo. 10) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fragments préparés à l'étape (a) ont une taille de l'ordre de 5 kb. 11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon d'acides nucléiques à partir duquel sont préparés les fragments de l'étape (a) provient d'un ou plusieurs organismes procaryotes ou cellules eucaryotes, ou encore de virus, identiques ou différents. 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon d'acides nucléiques à partir duquel sont préparés les fragments de l'étape (a) est de l'ADN génomique. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur de l'étape (b) comprend un promoteur d'ARN polymérase d'un coté du site de clonage et un terminateur d'ARN polymérase de l'autre coté. 14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur de l'étape (b) comprend un site de clonage encadré par deux promoteurs d'ARN polymérase identiques ou différents et flanqué de part et d'autre du ou des terminateurs d'ARN polymérase correspondant. 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que dans le cas où le vecteur de l'étape (b) ne possède pas de promoteur(s) et de terminateur(s) d'ARN polymérase, ou dans le cas ou les promoteurs et terminateur(s) d'ARN polymérase ne sont pas adéquats pour réaliser l'étape (d), ces promoteur (s) etterminateur(s) sont insérés à l'étape (c) par tout moyen approprié. 16) Procédé selon l'une des revendication 13 à 15, caractérisé en ce que les promoteur(s) et terminateur(s) sont ceux de la T7 ARN polymérase. 17) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'isolement du vecteur recombinant de l'étape (c) est réalisé par transformation de cellules hôtes par l'ensemble des vecteurs recombinants obtenus à l'étape (b) de façon à créer une banque de clones, puis par extraction du vecteur ou d'une partie de vecteur recombinant contenu par chaque clone de la banque par tout moyen approprié. 18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'on effectue un tri des vecteurs ou des parties de vecteurs recombinants contenus dans les clones obtenus à l'étape (c) . 19) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le tri est effectué par une réaction EPIV pour chacun des clones de la banque obtenus à l'étape (c) en incorporant dans le mélange un marqueur de synthèse protéique, puis en ce que l'on analyse chaque produit de la réaction EPIV pour la présence d'une protéine exprimée de façon à déterminer les clones qui ne possèdent pas d'ORF sur leur insert. 20) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est réalisé sur membrane. 21) Une séquence d'acide nucléique non encore connue constituant un gène identifié et sélectionné par un procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 20. 22) Un vecteur contenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 21. 23) Un hôte transformé par une séquence d'acide nucléique selon la revendication 21 ou un vecteur selon la revendication 22. 24) Une protéine codée par une séquence d'acide nucléique selon la revendication 21. 25) Une banque constituée respectivement de séquences d'acide nucléique selon la revendication 21, de vecteurs selon la revendication 22, d'hôtes transformés selon la revendication 23, ou de protéines codées par les séquences d'acide nucléique selon la revendication 24. 26) Un dispositif comprenant un agencement d'un ou plusieurs supports, de robots et d'un lecteur desdits supports pour la réalisation des étapes d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 27) Un vecteur susceptible d'être utilisé à l'étape (b) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et 16 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend : - une origine de réplication plasmidique, un site de clonage encadré par deux promoteurs d'ARN polymérase identiques et flanqués de part et d'autre du terminateur d'ARN polymérase correspondant, - éventuellement des séquences spécifiques de part et d'autre des terminateurs, servant de sites d'hybridation pour une amplification par PCR du fragment d'acide nucléique porté par le vecteur, - un gène de sélection constitué par un gène de tRNA, et éventuellement en parallèle, un gène de sélection inséré dans le site de clonage.