Brevet FR2778414A1 — publié le 19991112

PROCÉDÉ POUR LE SEQUEN AGE DE POLYMÈRES D'ACIDES NUCLEIQUES ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIOUE DE L'INVENTION La présente invention concerne des réactions de séquençage d'ADN, et en particulier des protocoles de réaction de séquençage améliorés utilisant des enzymes polymérases stables à la chaleur et présentant des taux d'erreur réduits. Le séquençage d'ADN peut s'effectuer dans deux environnements distincts: un environnement de recherche dans lequel chaque opération est assez particulière et dans lequel la séquence à déterminer n'est généralement pas connue avant que soit achevée la détermination des séquences, et un environnement de diagnostic dans lequel le même mode opératoire est répété sur de nombreux échantillons et o les séquences à déterminer sont généralement connues. Bien que les modes opératoires de base utilisés dans ces deux environnements puissent être les mêmes, les exigences quant à la rapidité, le rapport coût-efficacité et le faible risque d'erreur dans l'environnement de diagnostic rendent un grand nombre des techniques employées en réalité trop peu commodes pour qu'elles puissent être utilisées efficacement. Cela a limité la possibilité de recourir à des diagnostics fondés sur un séquençage, et a même conduit à se demander si le séquençage pourrait jamais être d'un bon rapport coût- efficacité pour une utilisation en diagnostic de routine. La technique de séquençage d'ADN idéale pour une utilisation dans un environnement de diagnostic devrait avoir les caractéristiques suivantes: (1) elle devrait être capable d'utiliser un échantillon contenant de l'ADN qui a été soumis à un prétraitement minimal seulement pour rendre l'ADN accessible pour le séquençage, (2) elle devrait nécessiter la combinaison de cet échantillon avec seulement un mélange réactionnel unique, ce qui réduirait le risque d'erreur et de contamination, et rendrait plus facile l'automatisation de la technique opératoire, et (3) elle devrait n'exiger qu'une courte durée pour que soit effectuée la détermination des séquences, abaissant ainsi les coûts marginaux en ce qui concerne les équipements et la main d'oeuvre nécessaires à la réalisation du test. Le séquençage d'ADN, qu'il soit destiné à la recherche ou au diagnostic, est généralement mis en oeuvre au moyen de techniques fondées sur la méthode de "terminaison de chaînes" décrite par Sanger et al. Proc. Nat '1 Acad. Sci. (USA) 74(12): 5463-5467 (1977). Fondamentalement, dans ce procédé, l'ADN à tester est isolé, rendu monobrin, et placé dans quatre récipients. Dans chaque récipient se trouvent les composants nécessaires pour la réplication du brin d'ADN, c'est-à- dire une ADN polymérase dépendante d'une matrice, une molécule d'amorce courte complémentaire d'une région connue de l'ADN à séquencer, et les désoxynucléotide triphosphates standard (dNTPs) communément représentés par les lettres A, C, G et T, dans un tampon favorisant l'hybridation entre l'amorce et l'ADN à séquencer et l'extension de chaîne de l'amorce hybridée. De plus, chaque récipient contient une faible quantité d'un type (c'est-à-dire d'une espèce) de didésoxynucléotide triphosphate (ddNTP), par exemple du didésoxyadénosine triphosphate (ddA). Dans chaque récipient, l'amorce s'hybride à un site spécifique sur l'ADN isolé. Les amorces sont ensuite allongées, avec une base à chaque fois pour former un nouveau polymère d'acide nucléique complémentaire des pièces isolées de l'ADN. Lorsqu'un didésoxynucléotide triphosphate est incorporé dans le polymère étendu, cela termine le brin de polymère et empêche qu'il soit étendu ultérieurement. Par conséquent, dans chaque récipient, un ensemble de polymères étendus ayant des longueurs spécifiques sont formés, qui indiquent les positions du nucléotide correspondant au didésoxynucléotide dans ce récipient. Ces ensembles de polymères sont ensuite évalués au moyen d'une électrophorèse sur gel pour en déterminer la séquence. Ainsi que l'ont observé Church et Gilbert, "dans une cellule de mammifères, l'ADN correspondant à n'importe quelle séquence de gènes est entouré par de l'ADN correspondant à plusieurs millions d'autres séquences." "The Genomic Sequencing Technique" dans Medical Genetics: Past, Present and Future, Alan R. Liss, Inc., p. 17-21. (1991). Il en va de même, dans une plus ou moins grande mesure, de tout échantillon d'ADN complexe, par exemple contenant des matériels génétiques microbiens, des matériels génétiques végétaux, des bibliothèques d'ADNc complètes, etc. Dans le passé, les techniques de séquençage d'ADN ont pris en charge cette complexité par addition d'étapes visant à purifier pratiquement l'ADN intéressant par rapport à d'autres espèces d'ADN présentes dans l'échantillon. Cette purification a été accomplie par clonage de l'ADN à séquencer avant son séquençage, ou par amplification d'une portion choisie du matériel génétique dans un échantillon pour enrichir la concentration d'une région intéressante par rapport à de l'autre ADN. Par exemple, il est possible d'amplifier une portion sélectionnée d'un gène en utilisant une amplification en chaîne par polymérase (ACP, ou "Polymerase Chain Reaction", qui est abrégé en PCR en anglais), comme décrit dans les brevets US Nos 4.683.194, 4.683.195 et 4.683.202. Ce procédé implique l'utilisation de paires d'amorces, une pour chaque brin de 1'ADN duplex ou double brin, qui hybride sur un site localisé près d'une région intéressante dans un gène. Une polymérisation par extension de chaîne (sans nucléotide de terminaison de chaîne) est ensuite effectuée dans des cycles répétitifs pour augmenter le nombre de copies de la région intéressante, de nombreuses fois. Les polynucléotides amplifiés sont ensuite séparés du mélange réactionnel et utilisés comme échantillon de départ pour la réaction de séquençage. Gelfand et al. ont décrit une enzyme thermostable, la "Taq polymérase", dérivée de l'organisme Thermus aquaticus, qui est utile dans le procédé d'amplification. (voir brevets US N 4.889.818, 5.352.600 et 5.079.352). La Taq polymérase a également été décrite comme étant utile dans le séquençage d'ADN lorsque certaines conditions spéciales sont remplies. Voir brevet US N 5.075.216. Des améliorations de la technique originale décrite par Sanger et al. incluaient des perfectionnements à l'enzyme utilisée pour étendre la chaîne d'amorce. Par exemple, Tabor et al. ont décrit des enzymes telles que de l'ADN polymérase de T7 qui a une aptitude améliorée au traitement et des niveaux accrus d'incorporation de didésoxynucléotides. (voir brevet US No 4.795.699 et le document EP-A-0 386 857). Plus récemment, Reeve et al. ont décrit une préparation d'enzymes thermostables, dénommée Thermo SequenaseT, ayant des qualités améliorées pour le séquençage d'ADN. Voir Nature 376: 796-797 (1995) et EP-A- 0 655 506. Pour le séquençage, le produit Thermo SequenaseT est utilisé avec un échantillon d'ADN amplifié contenant 0,5-2 gg d'ADN monobrin (ou 0,5 à 5 gg d'ADN double brin) dans 4 fractions aliquotes, et la combinaison de chaque fraction aliquote avec la préparation d'enzymes Thermo SequenaseT, un mélange de terminaisons de didésoxynucléotide contenant un ddNTP et les 4 dNTPs et une amorce marquée par un colorant qui hybride à l'ADN à séquencer. Le mélange est placé dans un appareil à cycles thermiques et on lui fait subir 20-30 cycles d'annelage, d'extension et de dénaturation pour produire des quantités mesurables de produits d'extension marqués par un colorant, ayant différentes longueurs qui sont ensuite évaluées par électrophorèse sur gel. Le document EP-A- 0 655 506 indique en outre que la Thermo SequenaseTM et des enzymes similaires peuvent être utilisées pour les réactions d'amplification. Malgré les observations de l'homme du métier selon lesquelles des enzymes utiles pour l'amplification peuvent également être employées pour le séquençage, et vice- versa, les efforts pour combiner la réaction d'amplification et la réaction de séquençage en une seule étape ont été limités. Ruano et Kidd, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 88: 2815-2819 (1991) et le brevet US N 5.427.911, décrivent un procédé qu'ils dénomment "amplification et séquençage couplés" (CAS) pour le séquencage d'ADN. Dans ce procédé, un échantillon est traité dans une première phase de réaction avec deux amorces et amplifié pendant un certain nombre de cycles pour réaliser une amplification par 10 000 à 100 000 fois. Un ddNTP est ensuite ajouté pendant la phase exponentielle de la réaction d'amplification, et la réaction est mise en oeuvre sur des cycles thermiques additionnels pour produire des fragments de séquence à chaînes terminées. Le procédé CAS ne satisfait pas aux critères indiqués plus haut pour un test de diagnostic idéal, car il nécessite une addition intermédiaire de réactifs (les réactifs ddNTP). Cela introduit une source d'erreurs ou de contaminations et accroît la complexité de l'appareillage, quel qu'il soit, qui serait utilisé pour une automatisation. Le problème des erreurs survenant lors de l'amplification a été abordé dans une approche envisageant l'incorporation dans les polymères en extension de nucléotides inhabituels (par exemple dUTP) qui sont soumis à une attaque enzymatique (par exemple avec de l'uracile- N-glycosylase) et à une dégradation. Voir brevet US N 5.418.149. De telles molécules peuvent être utilisées pratiquement selon les mêmes voies que celles employées pour l'amplification conventionnelle, mais peuvent être éliminées, en tant que produit de contamination des autres réactions, par incorporation d'une étape de prétraitement utilisant une enzyme appropriée pour dégrader les polymères d'acides nucléiques modifiés. L'un des objectifs de la présente invention consiste à procurer un procédé pour le séquençage d'échantillons d'ADN de complexité élevée, qui convient parfaitement pour une utilisation dans l'environnement du diagnostic et pour une automatisation et qui procure un moyen pour minimiser les erreurs provoquées par la contamination et le transfert de polymères d'acides nucléiques. Un autre objectif de l'invention est de procurer un procédé pour le séquençage d'ADN qui utilise un échantillon contenant de l'ADN, qui a été soumis uniquement à un prétraitement minimal pour rendre l'ADN accessible pour le séquençage, et qui procure un moyen pour minimiser les erreurs provoquées par la contamination et le transfert de polymères d'acides nucléiques. Encore un autre objectif de l'invention est de procurer un procédé pour le séquençage d'ADN qui n'exige de combiner un échantillon complexe contenant de l'ADN qu'avec un mélange réactionnel unique, réduisant ainsi les risques d'erreurs et de contaminations et augmentant la facilité avec laquelle le mode opératoire peut être automatisé. RESUMÉ DE L'INVENTION La présente invention procure un procédé pour le séquençage d'une région intéressante dans un échantillon d'ADN, dans lequel un ensemble unique de réactifs est ajouté à un échantillon ayant subi un traitement minimal pour produire des résultats de séquençage utiles. L'invention se fonde sur l'observation et la découverte surprenante de ce que l'addition d'un mélange réactionnel contenant la polymérase thermostable Thermo SequenaseM, deux amorces qui se fixent à des brins complémentaires d'une molécule d'ADN cible sur des sites encadrant la région intéressante, un mélange de nucléotide triphospha- tes (A C, G et T) et un didésoxynucléotide triphosphate à un échantillon d'ADN qui contient de l'ADN cible et non- cible en abondance relative pratiquement naturelle, y compris des échantillons d'ADN fortement complexes comme de l'ADN génomique humain, et le traitement de la combinaison au moyen de cycles multiples d'annelage, d'extension et de dénaturation conduisent à la production d'un mélange qui peut être chargé directement sur un gel pour analyse de séquences de la région intéressante. Le mélange réactionnel comprend également un nucléotide non conventionnel et une enzyme appropriée pour la dégradation des polymères d'acides nucléiques contenant le nucléotide non conventionnel. Un aspect de la présente invention est un procédé pour le séquençage d'une région sélectionnée d'un polymère d'acides nucléiques cible comprenant les étapes de (a) combinaison d'un échantillon en abondance naturelle contenant le polymère d'acides nucléiques cible avec un mélange réactionnel comprenant trois types de désoxynucléotide triphosphates, un nucléotide triphospha- te non conventionnel correspondant au quatrième type de base, un didésoxynucléotide triphosphate, une première et une deuxième amorces, une enzyme qui dégrade les polymères d'acides nucléiques comprenant le nucléotide non conventionnel, et une enzyme polymérase stable à la chaleur qui comprend des didésoxynucléotides dans un polymère d'acides nucléiques en extension à une vitesse ou taux qui n'est pas inférieur(e) à environ 0,4 fois la vitesse ou le taux d'incorporation des didésoxynucléotides pour' former un mélange réactionnel, les dites première et deuxième amorces se fixant aux brins sens et antisens respectivement, du polymère d'acides nucléiques cible en des points encadrant la région sélectionnée, (b) l'exposition du mélange réactionnel à une phase initiale dans laquelle l'enzyme qui dégrade les polymères d'acides nucléiques comprenant un nucléotide non conventionnel est active pendant une durée suffisante pour dégrader les polymères d'acides nucléiques contenant l'acide nucléique non conventionnel qui peut être présent dans l'échantillon, (c) l'exposition du mélange réactionnel à une pluralité de cycles de température dont chacun comprend au moins une phase de dénaturation à température élevée et une phase d'extension à température inférieure pour produire un mélange de produits comprenant des fragments de séquençage qui sont terminés par l'incorporation du didésoxynucléotide, et (d) l'évaluation du mélange de produits pour déterminer les longueurs des fragments de séquençage produits. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Fig. 1 illustre le procédé selon l'invention sous forme schématique; Figs. 2A et 2B montrent une comparaison d'opérations de séquençage effectuées avec de la Thermo SequenaseT en tant que polymérase dans le procédé selon l'invention avec les résultats obtenus avec l'utilisation d'autres polymérases thermostables dans une expérience comparative; Fig. 3 représente le tracé de la fig. 2A avec plus de détails; Fig. 4 illustre un mode de mise en oeuvre multi- colorants de l'invention; Fig. 5 illustre un deuxième mode de mise en oeuvre multi-colorants de l'invention; et Figs. 6A et 6B illustrent un troisième mode de mise en oeuvre multi-colorants de l'invention. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION La présente invention répond à la nécessité de disposer d'une technique de séquençage simple et aisément automatisée, qui peut être utilisée directement sur des échantillons qui contiennent des mélanges complexes d'ADN. Pour distinguer de tels mélanges des préparations d'ADN qui ont été séquencées dans le passé, on utilise dans la description et les revendications de la présente demande l'expression "échantillon en abondance naturelle" pour décrire un tel mélange. Telle qu'elle est utilisée ici, l'expression "échantillon en abondance naturelle" désigne un échantillon qui a été traité pour rendre l'ADN de l'échantillon accessible pour l'hybridation avec des amorces oligonucléotidiques, par exemple par lyse, centrifugation pour éliminer les débris cellulaires et digestion protéolytique pour exposer l'ADN, mais qui n'a pas été soumis à une étape de purification préférentielle ou d'amplification pour augmenter la quantité d'ADN cible par rapport à l'ADN non-cible présent dans l'échantillon initial. L'expression "en abondance naturelle" n'exige pas, en revanche, la présence de tout l'ADN de l'échantillon d'origine. Ainsi, un échantillon complexe contenant juste de l'ADN nucléaire, ou juste de l'ADN mitochondrial ou une certaine sous-fraction d'ADN nucléaire ou mitochondrial obtenu par isolement à partir d'un échantillon de tissu, mais non soumis à une amplification préférentielle, serait un échantillon "en abondance naturelle" au sens de l'expression concernée dans la description et les revendications de la présente demande. L'expression "en abondance naturelle" recouvre également un échantillon d'ADN préparé par conversion, par exemple par transcription inverse, d'une préparation d'ARNm total ou du génome d'un virus à ARN en ADNc, de l'ADN isolé à partir d'une colonie bactérienne individuelle en croissance sur une plaque ou à partir d'une culture bactérienne enrichie, et une préparation d'ADN viral o pratiquement la totalité du génome viral est isolée. L'expression "en abondance naturelle" n'englobe pas un échantillon dans lequel l'ADN isolé n'est pas une combinaison complexe de molécules d'ADN, et ainsi n'englobe pas, par exemple, une préparation de plasmide purifiée contenant uniquement une seule espèce de plasmide. Des échantillons ayant une abondance naturelle d'ADN de mammifères peuvent être préparés à partir d'échantillons de fluide, par exemple de sang, d'urine ou d'échantillon des tissus, par l'une quelconque des nombreuses techniques que sont, notamment, la lyse, la centrifugation pour éliminer les débris cellulaires et la digestion protéolytique pour exposer l'ADN, la précipitation de sel ou l'extraction standard de K-phénol par SDS-protéinase. Des échantillons ayant une abondance naturelle peuvent également être préparés au moyen de kits ou ensembles, par exemple le kit d'isolement d'ADN dénommé Gentra Pure Gene DNA Isolation Kit. Le procédé selon l'invention utilise les propriétés des enzymes telles que la Thermo SequenaseT, à savoir l'aptitude à incorporer des didésoxynucléotides dans un polynucléotide en extension à une vitesse qui n'est pas inférieure à environ 0,4 fois la vitesse d'incorporation des désoxynucléotides, pour procurer un procédé pour le séquençage d'un polymère d'acides nucléiques à partir d'un échantillon ayant une abondance naturelle dans un seul ensemble de réactions de thermocyclage qui peuvent être mises en oeuvre dans un récipient unique. Ainsi, le procédé selon l'invention est idéalement approprié pour être automatisé. La fig. 1 illustre la simplicité fondamentale et l'élégance du procédé selon l'invention sous forme d'un schéma logique. Comme indiqué sur la fig. 1, un échan- tillon contenant un polymère d'acides nucléiques cible, qui comprend une région à séquencer, est combiné avec un mélange réactionnel contenant deux amorces, un mélange de dNTP, un nucléoside triphosphate de terminaison de chaîne, c'est-à-dire un didésoxynucléotide triphosphate, et une polymérase thermostable ayant une affinité élevée pour l'incorporation de ddNTP dans un tampon approprié pour l'hybridation et la polymérisation dépendante de la matrice. Le mélange est mis en oeuvre pendant un nombre de cycles thermiques suffisant pour produire des quantités détectables de fragments de séquencage, généralement de 20 à 50 cycles. Pendant chaque cycle, les amorces donnent lieu chacune à un annelage au brin respectif de l'ADN cible présent dans l'échantillon, et l'extension de chaîne d'amorce utilisant les enzymes polymérases et les charges de nucléotide triphosphates se déroule jusqu'à ce qu'elle s'achève par l'incorporation d'un nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne. Cela conduit à la production de fragments de séquençage comparables à ceux formés dans une réaction de séquençage conventionnelle. L'analyse de ces fragments procure des informations concernant la séquence de la région sélectionnée de l'ADN cible. Ces produits d'extension qui ne sont pas achevés avant d'atteindre la région complémentaire de l'autre amorce peuvent servir de matrice pour la production de fragments de séquençage dans des cycles ultérieurs, bien que cela survienne généralement dans une très faible mesure. Enfin, le mélange de produits contenant des fragments à terminaison didésoxy est chargé sur un gel d'électrophorèse pour l'analyse des positions de la base correspondant aux nucléotide triphosphates de terminaison de chaîne dans le polymère d'acides nucléiques cible. La mise en oeuvre de l'invention peut être comprise dans le contexte d'un fragment d'ADN de 200 nt hypothétique ayant des quantités égales de chaque base. Cela signifie qu'il y a 50 circonstances de tronquage potentielles durant le cycle. Pour chaque cycle, une partie des produits est de longueur totale (et par conséquent, apte à hybrider avec une des deux amorces pour produire plus de fragments de séquençage) et une partie est tronquée sur les points o le ddNTP a été ajouté. Si chacune des circonstances de tronquage a une probabilité statistique pour survenir 1 fois sur 500 comme résultat de la concentration relative de ddNTP par comparaison avec le dNTP et de l'incorporation relative par l'enzyme, alors il se forme au total un produit de tronquage dans un peu moins de 10% des réactions. Le tableau 1 montre les quantités relatives de produits de longueur totale et de terminaison de chaîne théoriquement formées après 10, 20 et 30 cycles d'une réaction selon l'invention en utilisant ce polynucléotide de 200 nt, en supposant divers rapports entre le produit tronqué et le produit de longueur totale. -- __ TABLEAU 1 rapport de rapport de rapport de tronquage = 0,1 tronquage = 0,3 tronquage = 0,5 cycles _ tronqué de longueur tronqué de longueur tronqué de longueur totale totale totale 32 613 86 202 57 57 41,000 376.000 17.400 40,462 3.300 3.300 25,6x106 230x106 3,5x106 8,2x106 190.000 190.000 Les quantités absolues et relatives des nucléotide triphosphates et des nucléotide triphosphates de terminaison de chaîne peuvent être optimisées pour l'enzyme particulière employée. Dans la pratique effective, on a trouvé que des résultats utiles sont obtenus avec la Thermo SequenaseTM lorsque la réaction est mise en oeuvre pendant 35 à 45 cycles, en utilisant un rapport molaire de didésoxy:désoxy de 1:100 à 1:300. En général, chaque nucléotide triphosphate est inclus dans le mélange réactionnel à des concentrations de 250 gM à 1,5 mM et le nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne est inclus à une teneur de 0,5 gM à 30 gM pour produire des compositions dans lesquelles le rapport molaire du nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne au nucléotide triphosphate correspondant est de 1:50 à 1:1000, de préférence de 1:100 à 1:500. Cela permet d'obtenir l'incorporation d'un nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne dans une proportion de 30 à pratiquement 100% des chaînes de polymères en extension formées pendant le traitement du mélange réactionnel dans le cycle thermique. Un facteur clé pour que le procédé selon l'invention se déroule avec succès est l'utilisation de Thermo SequenaseTM ou d'une enzyme comparable en tant que polymérase thermostable dans le mélange réactionnel. De telles enzymes sont caractérisées par une affinité élevée pour l'incorporation de didésoxynucléotides dans la chaîne nucléotidique en extension. En général, aux fins de la présente invention, la polymérase utilisée doit être l'une de celles qui incorporent des didésoxynucléotides dans un polymère d'acides nucléiques en extension à une vitesse qui n'est pas inférieure à environ 0,4 fois la vitesse d'incorporation des désoxynucléotides. La Thermo SequenaseTm est connue pour favoriser l'incorporation de didésoxynucléotides, et elle convient pour être utilisée selon l'invention. Tabor et al. ont également décrit des enzymes ayant une faculté accrue à être mises en oeuvre, et des niveaux élevés et accrus d'incorporation de didésoxynucléotides. (voir EP 0 655 506). La société Roche commercialise une polymérase sous la dénomination TAQ-FS qui satisfait également à ces critères. Les figs. 2A et 2B et la fig. 3 illustrent l'importance de cette caractéristique de l'enzyme polymérase employée. Les figs. 2A et 3 représentent un tracé de données de séquençage pour un échantillon de patient hétérozygote réel avec ADN en abondance naturelle, qui a été obtenu avec utilisation de Thermo SequenaseTM et d'amorces encadrant l'exon 2 du gène de Von Hippel-Lindau dans un procédé selon l'invention. Des pics importants, bien définis, correspondant aux fragments de terminaison ont été obtenus, permettant ainsi une évaluation de séquences de l'échantillon très directe. En outre, les pics pour les pics homozygotes sont tous d'à peu près la même taille, et on peut aisément les distinguer des pics des bases sur des localisations hétérozygotes. On a obtenu ce résultat en effectuant le test dans un réacteur unique, avec un seul mélange réactionnel non augmenté, dans un total de 45 cycles thermiques. Des résultats comparables peuvent être obtenus si l'on utilise moins de cycles réactionnels, par exemple 35 cycles, comme indiqué dans l'exemple 1 ci-après. Au contraire, la fig. 2B représente le tracé obtenu lorsqu'une combinaison de Vent and SequithermTM a été utilisée à la place de la Thermo SequenaseTM sur un total de 45 cycles thermiques. Dans ce tracé, les pics pour les fragments de terminaison sont beaucoup plus petits et moins bien définis. En outre, les pics sont très variables en hauteur et n'ont pas permis l'identification de pics hétérozygotes sur la base de la hauteur des pics. La réalisation de la même expérience avec de la Taq polymérase seule a conduit à un tracé des données ne contenant pas de pics utilisables. Dans le procédé selon l'invention, un échantillon avec abondance naturelle contenant, ou censé contenir, une séquence d'ADN cible est combiné dans un mélange réactionnel avec une polymérase appropriée, les quatre types de désoxynucléotide triphosphates, un didésoxy- nucléotide triphosphate et une première et une deuxième amorces. Les amorces utilisées dans le procédé selon la présente invention peuvent être constituées par une quelconque paire d'amorces qui hybrident avec les brins sens et antisens de l'ADN cible encadrant une région sélectionnée qui est à séquencer, et qui n'hybrident pas toutes les deux en des points voisins dans l'ADN humain ou tout autre ADN qui se trouve potentiellement dans l'échantillon. Tel qu'il est utilisé ici, le terme "encadrant" doit être compris comme désignant le positionnement des amorces sur les extrémités 5' de la région sélectionnée de chaque brin d'ADN, de telle sorte que l'extension des amorces conduit à une réplication de la région située entre les amorces. Les amorces sont de préférence choisies de telle sorte que la paire d'amorces encadre une région d'environ 500 bp ou moins, bien que des amorces enserrant des régions d'ADN plus larges puissent être utilisées avec des ajustements du mélange de séquençage (généralement, une augmentation de la quantité relative de désoxynucléotide triphosphates) pour augmenter la quantité de fragments de séquençage plus longs produits. Les amorces peuvent être choisies pour hybrider avec des régions fortementconservées qui sont les mêmes dans tous les variants de l'ADN cible ou peuvent être préparées en tant qu'amorces dégénérées pour prendre en compte des variations de séquence connues sur le site de l'amorce. Ainsi, les première et deuxième amorces selon l'invention peuvent être chacune une espèce oligonucléotidique particulière ou peuvent être constituées d'un ensemble d'amorces oligonucléotidiques ayant des séquences semblables, mais non identiques. L'une des amorces ou les deux peuvent être marquées avec un marqueur détectable sur son extrémité 5', en particulier un marqueur fluorescent tel que la fluorescéine ou un colorant de cyanine tel que Cy 5.5. Si des marqueurs sont utilisés dans les deux amorces, les marqueurs choisis doivent être distincts du point de vue spectroscopique, c'est-à-dire qu'ils doivent présenter soit un spectre d'excitation différent, soit un spectre d'émission différent, de telle sorte que l'on puisse distinguer l'une des amorces de l'autre. Lorsque les deux amorces sont marquées avec des marqueurs détectables différents, par exemple avec deux fluorophores différents, comme c'est le cas dans le procédé décrit par Wiemann et al., "Simultaneous On-Line DNA Sequencing on Both Strands with Two Fluorescent Dyes", Anal. Biochem 224: 117-121 (1995), la séquence des deux brins de l'échantillon peut être déterminée dans une seule réaction. Le mélange formant la charge de nucléotide triphosphate est un mélange standard de trois des quatre bases désoxynucléotidiques conventionnelles (A, C, G et T), plus un nucléotide non conventionnel correspondant à la quatrième base dans un tampon approprié pour l'extension d'amorce dépendante de la matrice avec l'enzyme employée. Comme le comprendra aisément l'homme du métier, les concentrations spécifiques des nucléotide triphosphates et la nature du tampon varient en fonction de l'enzyme employée. On peut employer selon l'invention des tampons et des concentrations de réactifs standard pour diverses enzymes polymérases connues. L'expression "nucléotides non conventionnels" désigne des nucléotide triphosphates non naturels ou de type analogue qui peuvent être polymérisés d'une manière dépendant de la matrice pour donner les fragments de séquençage. Des formes non naturelles des nucléotides modifiés sont notamment les nucléotides alkylés et les nucléotides modifiés par alkylhydroxylation. Des exemples spécifiques de nucléotides modifiés sont notamment, mais sans y être limités, la N-7 méthylguanine, la désoxyuridine, la désoxyinosine, la désoxy-5,6- dihydroxythymine (d'ADN traité au 0sO4), la 5',6'- dihydroxydihydrothymine et la désoxy-3'-méthyladénosine. Les nucléotides non conventionnels peuvent également comprendre des formes naturelles des nucléotides qui ne sont pas incorporées de façon conventionnelle dans 1'ADN. Ainsi, aux fins de la présente invention, l'uracile et l'hypoxanthine sont des nucléotides non conventionnels. Une caractéristique importante des nucléotides non conventionnels utilisés selon l'invention, est l'existence d'une enzyme qui dégrade les polynucléotides contenant les nucléotides non conventionnels pour les rendre inappropriés, en tant que substrats, pour la poursuite de la formation de fragments de séquençage à des températures inférieures à celles normalement associées à la production de fragments de séquençage utilisant une polymérase thermostable. Un mélange réactionnel selon l'invention comprend une enzyme appropriée, d'ordinaire une glycosylase. Des exemples d'enzymes spécifiques sont notamment: l'uracile-Nglycosylase, l'hypoxanthine-ADN glycosylase, la 3-méthyladénine-ADN glycosylase I et II, l'hydroxyméthyl uracile-ADN glycosylase et les foramido- pyrimidine ADN glycosylases. L'enzyme est de préférence une enzyme thermolabile, de façon à ce qu'elle soit active pour la destruction des polynucléotides de transport avant la première réaction de séquençage, mais inactive apres. Dans la sélection des conditions de réaction, il faut veiller à ce que la température ne soit pas abaissée après la synthèse des fragments de séquençage à une température qui permette une dégradation significative des produits souhaités avant l'analyse. Le mélange réactionnel utilisé selon la présente invention comprend également au moins un type (ou une espèce) de nucléotide triphosphates de terminaison de chaîne. Des réactions séparées pour les quatre types de bases différents peuvent être mises en oeuvre soit en même temps, soit successivement. La mise en oeuvre simultanée des quatre bases est en accord avec la pratique conventionnelle pour le séquençage. Toutefois, une forme de mise en oeuvre préférée de la présente invention combine la méthodologie en récipient unique selon la présente invention avec le "séquençage à piste unique" qui est décrit dans la demande de brevet US N 08/577.858 au nom de la même cessionnaire. Dans le séquençage à piste unique, la détermination des positions de l'un seulement (ou en tous cas, de moins de quatre) des nucléotides d'une séquence cible est fréquemment suffisante pour qu'on établisse la présence ou qu'on détermine la nature qualitative d'un micro-organisme cible en procurant une empreinte digitale, ou code à barres, de la séquence cible qui peut être suffisante pour la distinguer de toutes les autres variétés de séquences connues. On augmente le passage en réduisant le nombre de réactions et d'opérations d'électrophorèse requises pour identifier une séquence. En sélectionnant l'ordre des bases testées et l'analyse intermédiaire, il peut ne pas être nécessaire de traiter la totalité des quatre bases pour déterminer la présence et la nature qualitative spécifique d'un micro- organisme cible quelconque présent dans l'échantillon. Le présent procédé peut être utilisé en combinaison avec n'importe quel type de système de détection qui soit compatible avec le marqueur employé sur les amorces. Par exemple, un séquenceur A.L.F. de la société Pharmacia peut être employé lorsque l'on utilise des amorces marquées par la fluorescéine, tandis qu'un Visible Genetics MicroGene Blaster convient lorsque le marqueur utilisé est Cy5.5. Lorsque l'on utilise des marqueurs multiples, l'échantillon peut être traité dans des instruments multiples, ou bien il peut être évalué sur un instrument qui est capable de détecter les signaux à partir de marqueurs multiples. Un exemple d'un tel instrument est le séquenceur Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems Inc.) qui détecte et fait la distinction entre quatre colorants dans une seule piste. Des colorants pouvant être distingués par spectroscopie qui sont reconnus dans le séquenceur Prism 377 sont les colorants FAM, ROX, TAMRA et JOE, connus de l'homme du métier. La possibilité de détection multi-colorants conduit à une large gamme d'applications pour l'invention, permettant d'améliorer la précision du séquençage et d'améliorer le rendement des instruments. Par exemple, la fig. 4 illustre un procédé pour l'obtention de séquences aussi bien avant ("forward") qu'inverses ("reverse") d'une séquence d'acide nucléique cible utilisant deux amorces, chacune avec un marqueur pouvant être distingué par spectroscopie. L'échantillon avec abondance naturelle est mélangé avec des amorces avant et inverse, chacune avec un marqueur pouvant être distingué (1 et 2). La réaction est mise en oeuvre avec quatre réactions de terminaison, une pour chacun des A, C, G et T. Chaque produit mis à réagir est mis dans un puits unique d'un instrument de séquençage automatisé qui détecte et distingue au moins les deux marqueurs employés. Les résultats de la détection à partir du marqueur 1 sont combinés pour donner la séquence avant. Les résultats de la détection à partir du marqueur 2 sont combinés pour la séquence inverse. Les deux séquences peuvent être utilisées pour être contrôlées réciproquement et pour corriger toutes ambiguïtés dans la désignation des bases. En outre, la séquence opposée peut être utilisée pour confirmer la séquence proximale vis-à-vis d'une amorce, si l'on trouve de façon empirique qu'elle est difficile à déterminer, sur des séquenceurs d'ADN automatisés disponibles dans le commerce. La fig. 5 illustre l'utilisation de marqueurs multiples d'un format différent. Dans ce cas, à supposer que l'instrument puisse distinguer entre 4 marqueurs, 4 gènes ou fragments de gène dans un échantillon unique peuvent être séquences simultanément. Quatre paires d'amorces sont ajoutées à l'échantillon d'ADN génomique du patient. Chaque paire est spécifique d'une cible différente, éventuellement 4 exons du même gène intéressant (P. Q, R et S). Un membre de chaque paire est conjugué à un marqueur détectable (1, 2, 3 ou 4) et chaque marqueur peut être distingué des autres. Ce mélange est subdivisé dans 4 tubes pour réaction de terminaison, respectivement pour ddA, ddC, ddG et ddT, et traité par voie thermique. Les produits de la réaction de terminaison sont chargés dans une piste et l'on emploie alors le procédé décrit dans la demande de brevet US N 08/634.284 cédée à la même cessionnaire que la présente invention. Les résultats de chaque marqueur sont combinés pour donner la séquence de l'exon pour laquelle cette amorce est spécifique. Un autre mode de réalisation tire avantage du fait qu'une seule réaction de terminaison de ddA identifie les nucléotides A de chaque brin, la fig. 6A identifiant ainsi la base complémentaire (dans ce cas T) dans le brin opposé. (c'est-à-dire que les sites de terminaison A sur le brin opposé correspondent aux sites nucléotidiques T dans le premier brin). La base complémentaire peut être localisée dans les sites "manquants" du brin opposé. Il faut noter que la séquence du brin opposé doit être inversée avant qu'elle puisse être ajoutée dans les sites manquants, étant donné qu'elle commence à l'extrémité opposée du gène cible et que l'extension de chaîne s'effectue dans la direction opposée. Dans la fig. 6B, une seconde réaction de terminaison est ajoutée pour ddC. Cela permet l'identification de C et de son complément G dans chaque brin. Lorsque ces résultats sont ajoutés à la première réaction, on obtient une séquence d'ADN complète. Ainsi, sur la base de 2 réactions de terminaison employant chacune un terminateur de chaîne ddNTP, on peut obtenir la séquence complète à 4 bandes. La désignation par leurs bases et la compilation des séquences illustrées dans les figures 6A et 6B peuvent être facilitées par l'utilisation d'un logiciel GeneObjects (Visible Genetics Inc., Toronto) et l'emploi de techniques décrites dans les demandes de brevets US Nos 08/497.202 et 08/670.534. Le procédé selon la présente invention est avantageusement appliqué dans de nombreux contextes, notamment: (1) la détection des mutations ayant une importance sur le plan médical, dans des échantillons provenant d'un patient humain, d'un animal, d'une plante ou d'un micro-organisme, (2) la détermination du type HLA à l'appui de techniques de transplantation, (3) la détection et l'identification de micro-organismes, en particulier de micro-organismes pathogènes, dans un échantillon, et (4) des réactions de séquençage in situ pour produire des fragments de séquençage dans un spécimen histologique, qui sont ensuite enlevés d'une localisation sélectionnée sur la préparation des tissus et chargés dans un gel pour analyse de séquences. Cette dernière approche est particulièrement utile pour l'évaluation d'échantillons archivés dans des études rétrospectives, lorsque l'évolution d'un état maladif est connue, mais que la mutation qui en est potentiellement la cause ne l'est pas. Ce procédé peut être utilisé avec des amorces marquées pour le séquençage d'une base unique (ou le séquençage de bases multiples en utilisant des échantillons de tissus multiples). Le procédé de base selon l'invention peut également être renforcé par diverses modifications sans que l'on sorte du cadre de la présente invention. Par exemple, on peut obtenir des améliorations dans la reproductibilité et la sensibilité en utilisant une combinaison d'une enzyme ayant une affinité élevée pour l'incorporation de didésoxynucléotide triphosphates dans le polymère en extension, par exemple une Thermo SequenaseTM, et d'une enzyme ayant une faible affinité pour l'incorporation de didésoxynucléotide triphosphates dans le polymère en extension, par exemple de la Taq polymérase, dans des conditions dans lesquelles les 2 enzymes catalysent activement la polymérisation donnant l'extension d'amorce dépendante de la matrice. Ainsi qu'on l'a noté plus haut, l'enzyme de forte affinité produit pratiquement entièrement des produits de terminaison, avec une très faible quantité des polymères qui soient effectivement étendus jusqu'à une longueur totale. Par ailleurs, l'enzyme de faible affinité produit presque exclusivement un produit de longueur totale, avec relativement peu de produits de terminaison. L'addition de faible affinité au mélange réactionnel augmente la sensibilité du procédé en produisant plus de matière de longueur totale à séquencer, sans accroître la durée du traitement ou sans ajouter d'étapes de traitement. On peut maîtriser l'accroissement de sensibilité en faisant varier le rapport entre les enzymes de forte affinité et de faible affinité présentes dans le mélange. Il faut toutefois noter que la mise en oeuvre d'une enzyme de faible affinité pour former un produit de longueur totale a également pour conséquence la formation d'un pic de produits de longueur totale marqué, très intense. Ce pic peut rendre l'analyse des bases difficile près de l'extrémité de la séquence. Afin de conserver le bénéfice de la sensibilité accrue, tout en ayant moins de produits de longueur totale, il peut être souhaitable d'utiliser une enzyme de faible affinité qui soit plus thermolabile que la Taq polymérase, de façon à ce que l'enzyme de faible affinité soit pratiquement inactivée vers la fin des premiers 15 à 25 cycles. Cela pourrait permettre la production de fragments plus longs dès le début du test et la production de plus de fragments terminés plus tard dans le test. Le mélange réactionnel selon l'invention peut également comprendre d'autres additifs qui renforcent la formation des fragments de séquençage. Par exemple, un produit dénommé anticorps TaqStartTM est un anticorps monoclonal qui se lie aux et bloque les activités de la Taq polymérase. Cet anticorps est ajouté à des réactions par ACP utilisant de la Taq polymérase pour bloquer l'activité enzymatique, pendant le démarrage à température ambiante pour empêcher ou réduire la formation de produits d'amplification non spécifiques. L'anticorps TaqStartT peut être utilisé selon la présente invention avec de la Thermo SequenaseTM pour réduire les réactions d'extension d'amorce non spécifiques. Le procédé selon l'invention peut également être utilisé conjointement avec les techniques de Johnson & Johnson connues sous la dénomination "PCR IN A POUCH", décrites dans le brevet US N 5.460.780. Bien que le procédé préféré pour le séquençage de polymères d'acides nucléiques selon l'invention fasse intervenir l'utilisation d'une technique en une seule étape telle que décrite plus haut, l'invention englobe également d'autres utilisations des nucléotides non conventionnels pendant la préparation de fragments de séquençage pour fournir un mécanisme pour la réduction du risque de contamination par transport, dans les laboratoires effectuant des réactions de séquençage par addition d'une étape préliminaire de dégradation avant chaque technique opératoire de séquençage. Ainsi, au sens le plus large, l'invention concerne un procédé pour le séquençage de polymères d'acides nucléiques dans un échantillon, dans lequel l'échantillon est combiné avec un mélange réactionnel contenant un nucléotide non conventionnel, 3 bases nucléotidiques conventionnelles, au moins un type d'un nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne, une enzyme polymérase, et une enzyme pour la dégradation des polynucléotides contenant la base non conventionnelle. La réaction de séquençage peut être effectuée en tant qu'étape unique sur de l'ADN en abondance naturelle, comme décrit plus haut, ou peut être effectuée sur un échantillon préalablement amplifié (de préférence, avec utilisation d'un nucléotide non conventionnel). Les fragments de séquençage peuvent être obtenus au moyen d'une méthode connue quelconque, notamment le séquencage avec cycles, la méthode CAS, le séquençage bidirectionnel ou le séquençage conventionnel sur une extension. L'invention est maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1 Amplification d'ADN par ACP avec du dUTP et de l'uracile- n-glycosylase Mélange maître d'ACP Tampon de dilution de HK-UNG 10 1l HK-UNG 1 jl Tampon II de lOX ACP 55 gl MgC12 25 mM 66 1l Mélange de dNTP 66 Bl Amorces d'ACP 13 1l Eau stérile 284 1 ADN Polymérase AmpliTaq à 5 U/,i 2,8,l avec Tarrpon de dilution de HK-UNG dans Tris-HC1 50 nM (pH 7,5), NaCl 100 rrM, EDTA 0,1 mM, DIT 1 nM et 0,1% de Triton X-100. HK-UN est de l'uracile-N-glycosylase thermlabile, Epicentre Technologies Tanpon II de lOX ACP: Tris-HC1 100 rM pH 8,3 à 25 C; KCl 500 rrM Mélange de dNTP: dATP 2,5 rrM, dCTP 2,5 rarM, dGTP 2,5 rM et dUTP 2,5 irM Arorces d'ACP: 2,0 DM d'amrorce CT1590, 2,0 t d'amorce KLl- Cy5.5 Arrmorce KL1-Cy5.55'-TCC GGA GCG AGT TAC GAA GA-3', marquée avec Cy5.5 Amorce CT15905'-ATG CCC GGG ATT GGT TGA TC-3', non marquée 45 p1 du mélange maître d'ACP ont été placés dans un tube d'ACP à paroi mince pl d'un plasmide reccrbinant (pUC8 contenant le plasmide caché de Chlarrydia trachcaatis, serovar Li) à 400 copies/p Le tube a été obturé et placé dans un cycleur thermique. L'ACP a été démarrée dans les conditions suivantes: 37 C 15 min C 15 min 94 C 5 min 37 cycles cacrre suit 94 C 30 s 61 C 30 s 72 C 45 s puis 72 C 5 min maintien à 4 C Séquencçage de 1 'arplicon contenant le dUTP par CLIP avec dUTP Mélange maître de CLIP Tanpon de séquençage 22 pl Amorces de CLIP 12 il Thermo Sequenase à 32 U/gl 2, 2 pl Eau stérile 84,8 pi avec Tanpon de séquençage Tris-HCl 260 rrM pH 9,1 à 25 C; MgC12 39 nM dans ddH2O Armrces de CLIP: 2,0 W d'amorce Cr1431F-Cy5.5, 2,0 M d'amorce CT1538R Amorce CT11431F-Cy5.55' -GTG CAT AAA C=T CIG A3GG AT-3', marquée avec Cy5.5 Amorce CT1538R5'-CTA AAC GC CCT CIC AAG TC-3', non marquée 11.l du mélange maître de CLIP ont été ajoutés dans un tube; 2 Al de l'amplicon contenant du dUTP, créé par la réaction d'ACP susdite, ont été ajoutés aux 11 l1 de mélange maître de CLIP, pour donner le mélange maître échantillon; 20.l d'huile minérale stérile ont été ajoutés dans quatre tubes d'ACP à paroi mince de 200 gl 3.l du mélange maître échantillon ont été ajoutés dans chacun des quatre tubes contenant l'huile minérale 3 gl de mélange de séquençage de A (750 pM de dATP, 750 gM de dCTP, 750 pM de dGTP, 750 pM de dUTP, 2,5 WM de ddATP) ont été ajoutés au premier des quatre tubes 3 gl de mélange de séquencage de C (750 gM de dATP, 750 pM de dCTP, 750 PM de dGTP, 750 AM de dUTP, 2,5 pM de ddCTP) ont été ajoutés au deuxième des quatre tubes 3 Al de mélange de séquençage de G (750 UM de dATP, 750 pM de dCTP, 750 LM de dGTP, 750 pM de dUTP, 2,5 pM de ddGTP) ont été ajoutés au troisième des quatre tubes 3 pl de mélange de séquençage de T (750 IM de dATP, 750 p.M de dCTP, 750 aM de dGTP, 750 pM de dUTP, 2,5 gM de ddTTP) ont été ajoutés au quatrième des quatre tubes Les tubes ont été obturés et placés dans un cycleur thermique. Les réactions de séquençage ont été démarrées dans les conditions suivantes: 94 C 5 min 37 cycles comme suit 94 C 10 s C 15 s C 45 s puis C 5 min maintien à 4 C Les tubes ont été sortis du cycleur thermique, et 6 p1 de colorant de charge ont été ajoutés à chaque tube (A, C, G et T). On a fait migrer 2 Bl de chacun des tubes contenant le colorant de charge sur un séquenceur MICROGENE BLASTER à 50 C en 20 minutes sous une tension de 1300 volts. Après l'opération, les bases ont été déterminées. EXEMPLE 2 Séquençage d'un amplicon de VIH contenant du dTTP par CLIP avec dUTP Mélange maître de CLIP Tampon de séquençage 18,5 gl HK-UNG 1,0 pl Amplicon contenant du dTTP 5,0 1l AmpliTAQ FS à 15 U/pl 4,0 pl Eau stérile 69,5 pl avec Tanpon de séquençage: Tris-HCl 260 rM pH 8,3 à 25 C; MgC12 32,5 rM dans ddH2O Anplicon contenant du dTTP: un amplicon de 1,3 kb à une concentration de 100 ng/pl, contenant la séquence de la protéase de VIH- 1 HK-UNS: uracile-N-glycosylase therfolabile, Epicentre Technologies 7 p1 de rMlange de terminaison de A (640 nM de dATP, 640 rM de dCTP, 640 mM de dGTP, 640 mM de dUTP, 1 gM de ddATP, 163 mM d'amorce PR170F-Cy5.5, 163 mM d'amorce PR170F-A-Cy5.5, 131 nM d'amorce PR543R-Cy5.0, 200 nM d'anomDrce PR543R) ont été ajoutés dans un tube d'ACP à paroi mince de 200 pl. 7 p1 de mélange de terminaison de C (640 WM de dATP, 640 rM de dCTP, 640 mM de dGTP, 640 rm de dUTP, 2 pM de ddCTP, 163 rrM d'amorce PR170F-Cy5.5, 163 rM d'amorce PR170F-A-Cy5.5, 131 nM d'anorce PR543R-Cy5.0, 200 nM d'amorce PR543R) ont été ajoutés dans un tube d'ACP à paroi mince de 200 pl. 7 p1 de mélange de terminaison de G (640 WM de dATP, 640 WE de dCTP, 640 mM de dGTP, 640 rrM de dUTP, 21 M de ddGTP, 163 nrM d'anorce PR170F-Cy5. 5, 163 rM d'amorce PR170F-A-Cy5.5, 131 nM d'amorce PR543R-Cy5.0, 200 nM d'amorce PR543R) ont été ajoutés dans un tube d'ACP à paroi mince de 200 pl. 7 p1 de mélange de terminaison de T (640 WM de dATP, 640 Wm de dCTP, 640 WM de dGTP, 640 WM de dUTP, 2 pM de ddTTP, 163 mM d'anorce PR170F-Cy5.5, 163 nm d'amorce PR170F-A-Cy5.5, 131 rM d'amorce PR543R-Cy5.0, 200 nM d'arorce PR543R) ont été ajoutés dans un tube d'ACP à paroi mince de 200 p1, avec Amorce PR170F-Cy5.5: 5'-GAG CCR ATA GAC AAG GAA YTR TAT- 3', marquée avec Cy5.5 Amorce PR17OF-A-Cy5.5: 5'-GAG MCG ATA GAC AAG GRV CTG TAT- 3', marquée avec Cy5.5 Amorce PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3', marquée avec Cy5.0 Amorce PR543R-Cy5.5: 5'-ACT TTT GGG CCA TCC ATT CCT-3', non marquée 5 g1 du mélange maître de CLIP ont été ajoutés à chacun des quatre tubes contenant les mélanges de terminaison. Les tubes ont été obturés et placés dans un cycleur thermique. Les réactions de séquençage ont été démarrées dans les conditions suivantes: 37 C 15 min C 15 min 94 C 5 min cycles de ce qui suit 94 C 20 s 56 C 20 s C 90 s puis C 5 min maintien à 4 C Les tubes ont été sortis du cycleur thermique, et 12 1l de colorant de charge ont été ajoutés dans chaque tube (A, C, G et T). On a fait migrer 2 gl de chacun des tubes contenant le colorant de charge sur un Clipper (séquenceur automatisé à deux colorants) à 54 C en 35 minutes sous une tension de 1400 volts. Après l'opération, les bases ont été déterminées dans les deux orientations (avant et inverse). EXEMPLE 3 Séquençage de cycles Séquençage M13 avec dUTP Mélange maître de séquençage HK-UNG dilué au 1/10 1,0 B1 Tampon de séquençage 2,0 Al Amorce à 3 gM 1,0 g1 ADNss de M13 1,0.l Thermo Sequenase à 3,2 U/gl 2,5 g1 Eau stérile 5,5 1 avec Tampon de séquençage: Tris-HCl 260 mM pH 8,3 à 25 C: MgC12 39 mM dans ddH2O Amorce M13 Universal-Cy5.5: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3', marquée avec Cy5.5 ADNss de M13: ADN monobrin (M13) à 200 ng/gl HK-UNG: uracile-Nglycosylase thermolabile, Epicentre Technologies Fraction aliquote de 3 gl de mélange de terminaison de A (750 pM de dATP, 750 pM de dCTP, 750 pM de dGTP, 750 BM de dUTP, 2,5 gM de ddATP) dans un tube à paroi mince de 200 gi Fraction aliquote de 3 gl de mélange de terminaison de C (750 pM de dATP, 750 pM de dCTP, 750 pM de dGTP, 750 IIM de dUTP, 2,5 gM de ddCTP) dans un tube à paroi mince de 200 Fraction aliquote de 3 pl de mélange de terminaison de G (750 gM de dATP, 750 pM de dCTP, 750 gM de dGTP, 750 pM de dUTP, 2,5 iM de ddGTP) dans un tube à paroi mince de 200 pi Fraction aliquote de 3 1 de mélange de terminaison de T (750 pM de dATP, 750 vM de dCTP, 750 AM de dGTP, 750 pM de dUTP, 2,5 gM de ddTTP) dans un tube à paroi mince de 200 IL1 Fraction aliquote de 3 Al du mélange maître de séquençage dans chacun des tubes de terminaison. On a obturé les tubes et on les a placés dans un cycleur thermique. On a démarré la réaction de séquençage dans les conditions suivantes: 37 C 15 min C 15 min 94 C 2 min cycles comme suit 94 C 40 s 50 C 20 s 72 C 60 s puis 72 C 2 min maintien à 4 C On a extrait les tubes du cycleur thermique et on a ajouté 6 g1 de colorant de charge dans chaque tube (A, C, G et T). On a fait migrer 2 g1 de chacun des tubes contenant le colorant de charge sur un séquenceur MICROGENE BLASTER à 54 C en 35 minutes sous une tension de 1400 volts. Après l'opération, on a analysé les données pour déterminer la séquence. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la détermination de la position d'au moins une espèce choisie de nucléotides dans une région intéressante dans un polymère d'acides nucléiques cible, comprenant les étapes de combinaison de l'échantillon avec un mélange réactionnel pour synthétiser des produits d'allongement de chaîne indiquant les positions de l'espèce de nucléotides choisie dans la région intéressante et l'évaluation des produits ainsi obtenus, dans lequel le mélange réactionnel qui est combiné avec l'échantillon comprend un nucléotide non conventionnel et une première enzyme, ladite première enzyme étant efficace pour dégrader les polynucléotides incorporant le nucléotide non conventionnel. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel des polymères d'acides nucléiques cible et non-cible sont présents dans l'échantillon en abondance relative pratiquement naturelle. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le mélange réactionnel comprend en outre une enzyme polymérase stable vis-à-vis de la chaleur, qui incorpore des didésoxynucléotides dans un polymère d'acides nucléiques en voie d'allongement à une vitesse qui n'est pas inférieure à 0,4 fois la vitesse d'incorporation des désoxynucléotides. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le mélange réactionnel comprend en outre au moins deux amorces oligonucléotidiques qui, lorsqu'elles sont hybridées à l'ADN cible, sont orientées de façon à permettre un allongement de chaîne en direction de chacune d'elles sur la région intéressante. 5. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes de: (a) combinaison de l'échantillon dans le mélange réactionnel avec la première et la seconde amorces, d'un mélange de charge de nucléotide triphosphate, d'un nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne et d'une enzyme polymérase stable vis-à-vis de la chaleur, lesdites première et seconde amorces se liant aux brins sens et antisens, respectivement, du polymère d'acides nucléiques cible sur des positions encadrant la région choisie; (b) incubation du mélange réactionnel pendant une durée suffisante pour permettre la dégradation de tous les polymères d'acides nucléiques, y compris le nucléotide non conventionnel, par la première enzyme; (c) exposition du mélange réactionnel après l'étape d'incubation à une pluralité de cycles de température dont chacun comprend au moins une phase de dénaturation à température élevée et une phase d'allongement à température plus basse, produisant ainsi une pluralité de fragments terminés, et (d) évaluation des fragments terminés produits pendant les cycles additionnels pour déterminer les positions de l'acide nucléique correspondant au nucléotide triphosphate de terminaison de chaîne dans la région choisie, caractérisé en ce que l'échantillon contient un polymère d'acides nucléiques cible et un polymère d'acides nucléiques non-cible, en abondance naturelle et que la polymérase est une polymérase qui incorpore des didésoxynucléotides dans un polymère d'acides nucléiques en allongement à une vitesse qui n'est pas inférieure à 0,4 fois la vitesse d'incorporation des désoxynucléotides. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel des polymères d'acides nucléiques cible et non-cible sont présents dans l'échantillon en abondance relative pratiquement naturelle. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le rapport molaire du didésoxynucléotide triphosphate par rapport au désoxynucléotide triphosphate correspondant dans le mélange réactionnel est de 1:50 à 1:1000. 8. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le rapport molaire du didésoxynucléotide triphosphate par rapport au désoxynucléotide triphosphate correspondant est de 1:100 à 1:300. 9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel au moins l'une des amorces est marquée avec un marqueur fluorescent. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel les amorces sont marquées chacune avec un marqueur fluorescent différent. 11. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme est une glycosylase. 12. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le nucléotide non-conventionnel est du dUTP. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'enzyme est une glycosylase. 14. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le mélange réactionnel comprend en outre une deuxième enzyme polymérase ayant une faible affinité pour l'incorporation de didésoxynucléotide triphosphates par comparaison avec les désoxynucléotide triphosphates. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la deuxième polymérase est de la Taq polymérase.