Brevet FR2780791A1 — publié le 20000107

DESCRIPTION La présente invention concerne une méthode de dépistage ou de diagnostic permettant de mettre en évidence la présence d'un cancer de la prostate ou d'une hypertrophie bénigne de la prostate (BPH) chez un patient, et ceci sans réaliser de biopsie. En effet, l'antigène spécifique de la prostate, plus communément appelé PSA, est le principal marqueur du cancer de la prostate qui affectera, au cours de sa vie, un homme sur six en occident. Cetteprotéase de lafamille des kallikréines, principalement sécrétée par l'épithélium prostatique, est retrouvée à une concentration de 0,5 à 5 mglml dans le liquide séminal et à une concentration un million de fois moindre dans le sérum d'un patient. Ce taux de PSA sérique augmente notablement lors d'un cancer de la prostate et modérément lors d'altérations bénignes, telles que BPH, prostatite aiguë... Cependant, la zone de recouvrement entre les différentes pathologies est responsable d'un manque important de sensibilité et de spécificité. C'est ainsi que 30 à 45% des cancers confinés à la glande, qui constitue un stade précoce etpotentiellement curable, ne sont pas dépistés avec le seuil usuel de 4 nglml alors que trois patients sur quatre sont suspectés à tort. Par ailleurs, il a été montré récemment que dans le sérum, le PSA s'associait à des inhibiteurs de protéase, tels que l'[alpha]-1 antichymostrypsine (ACT), et que l'usage du ratio PSA libre sur PSA total permettait d'améliorer la spécificité du diagnostic. L'art antérieur montre donc qu'il existe des techniques permettant de diagnostiquer le développement d'un cancer de la prostate chez les patients. Ainsi, la demande de brevet WO-A-97/12245 revendique une méthode permettant de diagnostiquer un adénocarcinome de la prostate (CAP) sans biopsie. Cette méthode consiste à mesurer, dans le sérum ou dans le sang des patients, la quantité totale de PSA. Si cette valeur est comprise entre 2,5 et 20 nglml, on mesure également la concentration de PSA libre. On calcule ensuite le ratio PSA libre sur PSA total. Si ce ratio est inférieur à 7 %, le diagnostic s'oriente vers un adénocarcinome de la prostate. Toutefois, l'utilisation d'un seuil à 7 %, pour le diagnostic d'un cancer de la prostate, est controversée par de nombreux auteurs, comme le montre la publication de Lein et al. Relation of free PSA/total PSA in serum for differentiating between patients with prostatic cancer and benign prostate hyperplasia : cutoff should be used ? . Dans ce document, il a été montré qu'il est difficile, par le biais de ce ratio, de différencier systématiquement un cancer ou adénocarcinome de la prostate, d'une BPH. En outre la publication de Catalona et al., " Prostate Cancer Detection in Men With Serum PSA Concentrations of 2. 6 to 4.0 ng/ml and Benign Prostate Examination ", publiée dans JAMA du 14 Mai 1997-Vol 277, No. 18, démontre qu'une concentration inférieure à 4 ng/ml doit être prise en considération pour dépister précocement un cancer de la prostate. Par ailleurs, dans le liquide séminal, le PSA peut présenter des sites de clivages internes qui n'affectent pas sa structure tridimensionnelle du fait de l'existence de cinq ponts disulfures qui maintiennent la cohésion de la molécule. Le PSA ainsi clivé perd son activité enzymatique et sa capacité à s'associer aux inhibiteurs de protéase. Mais dans le sérum, aucune forme clivée n'est généralement mentionnée dans l'état de la technique. Aucune forme clivée n'a jusqu'à ce jour été rapportée en cas de pathologies bénignes de la prostate et l'intérêt des formes clivées n'a pas été exploré à des fins de diagnostic. Conformément à la présente invention, la méthode de diagnostic proposée permet de combler le manque d'efficacité des tests dans la zone de concentration de PSA totale supérieur à 2 ng/ml. A cette fin, les formes moléculaires de PSA sérique de patients atteints de cancer ou de BPH ont été cartographiées par électrophorèse bidimensionnelle, associé à la détection par chimiluminescence, afin d'observer l'ensemble des formes de PSA libre, complexé et clivé. Ainsi, les profils de sérum de cancéreux sont relativement homogènes, alors que ceux de BPH peuvent comporter une proportion relativement importante de formes clivées, et des spots légèrement plus basiques sans forme clivée. Il est donc démontré que l'augmentation du ratio PSA libre sur PSA total en cas de BPH peut être lié à l'existence de PSA clivé, enzymatiquement inactif et incapable de se lier à l'ACT, ou être en relation avec du PSA libre légèrement basique qui pourrait correspondre à la forme zymogène inactive. A cet effet, la présente invention concerne une première méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans le sang, le sérum, l'urine ou le liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA libre total, c'est-à-dire clivé ou non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA libre total, et - diagnostiquer que le patient est : # atteint d'un adénocarcinome de la prostate, lorsque ce rapport est inférieur ou égal à une valeur de référence, ou # atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate, lorsque ce rapport est supérieur à la valeur de référence. Dans ce premier cas, la valeur de référence est comprise entre 4 et 12 % et préférentiellement entre 7 et 9 %. La présente invention concerne également une deuxième méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate specific antigen) présente dans le sang, le sérum, l'urine ou le liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA libre total, c'est-à-dire clivé ou non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre non clivé, - calculer la proportion de PSA libre non clivé par rapport au PSA libre total, et - diagnostiquer que le patient est : # atteint d'un adénocarcinome de la prostate, lorsque ce rapport est supérieur ou égal à une valeur de référence, ou # atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate, lorsque ce rapport est inférieur à la valeur de référence. Dans ce deuxième cas, la valeur de référence est comprise entre 88 et 96 % et préférentiellement entre 91 et 93 %. La présente invention concerne encore une troisième méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate specific antigen) présente dans le sang, le sérum, l'urine ou le liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA libre non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA libre non clivé, et - diagnostiquer que le patient est : # atteint d'un adénocarcinome de la prostate, lorsque ce rapport est inférieur ou égal à une valeur de référence, ou # atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate, lorsque ce rapport est supérieur à la valeur de référence. Dans ce troisième cas, la valeur de référence est comprise entre 4 et 14 % et préférentiellement entre 7 et 10 %. La présente invention concerne aussi une quatrième méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate specific antigen) présente dans le sang, le sérum, l'urine ou le liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA total, c'est-à-dire complexé et libre (clivé ou non clivé), - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA total, et - diagnostiquer que le patient est : # atteint d'un adénocarcinome de la prostate, lorsque ce rapport est inférieur ou égal à une valeur de référence, ou # atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate, lorsque ce rapport est supérieur à la valeur de référence. Dans ce quatrième cas, la valeur de référence est comprise entre 0,1 et 2 % et préférentiellement entre 0,5 et 1 %. La présente invention concerne une cinquième méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate specific antigen) présente dans le sang, le sérum, l'urine ou le liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA total complexé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA complexé, et - diagnostiquer que le patient est : # atteint d'un adénocarcinome de la prostate, lorsque ce rapport est supérieur ou égal à une valeur de référence, ou # atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate, lorsque ce rapport est inférieur à la valeur de référence. Dans ce cinquième cas, la valeur de référence est comprise entre 0,1et 2,2 % et préférentiellement entre 0,7 et 1,2 %. La présente invention concerne enfin une méthode de diagnostic d'un adénocarcinome ou d'une pathologie bénigne de la prostate chez un patient, qui utilise la combinaison d'au moins deux méthodes telles que décrites ci-dessus. Quelle que soit la méthode de diagnostic utilisée, proposée ci-dessus, la méthode est mise en #uvre lorsque la concentration en PSA total dans le sang ou dans le sérum est supérieure à 2 ng/ml. Selon un mode préférentiel de réalisation, ce procédé de mise en #uvre consiste à: - détecter la présence et quantifier le PSA libre sous forme clivée et/ou sous forme non clivée, et - déterminer si ledit patient est atteint d'un adénocarcinome de la prostate ou d'une hypertrophie bénigne de la prostate ou autre. Préalablement, on fait migrer les protéines issues du sang, du sérum, l'urine ou du liquide séminal du patient. Préférentiellement, la migration s'effectue par électrophorèse bi-dimentionnelle. Préalablement, on dose le taux de PSA total. De plus, la détection s'effectue par chimiluminescence après révélation par Western Blot. Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. La figure 1 représente un tableau comparatif du positionnement de sérums de différents patients en fonction, d'une part, de leur concentration en PSA total, compris entre 2,1 et 30 ng/ml (axe des abscisses), et, d'autre part, de leur ratio PSA libre sur PSA total (axe des ordonnées). Ce tableau est tiré d'un article Free to total ProstateSpecific Antigen (PSA) ratio is superior to total-PSA in differentiating Benign Prostate Hypertrophy from prostate cancer , Vol. 156,1964-1968, dec 1996 selon P. J. Van Cangh et al. Les ronds noirs représentent les cas de cancer et les ronds blancs les cas de BPH. La figure 2 représente une électrophorèse bi-dimensionnelle, où la migration de PSA, sous différentes formes, s'effectue en fonction, d'une part, du point isoélectrique en abscisse, et d'autre part, du poids moléculaire en ordonnée. La figure 3 représente une électrophorèse bi-dimensionnelle d'un sérum d'un patient atteint d'une BPH, le sérum contenant 3,9 ng/ml de PSA. Enfin, la figure 4 représente une électrophorèse bi-dimensionnelle d'un sérum d'un patient atteint d'un adénocarcinome, le sérum contenant 4000 ng/ml de PSA. La présente invention concerne une méthode de diagnostic du cancer de la prostate ou de pathologie bénigne de la prostate, telle que BPH, grâce au traitement de 100 l d'échantillon de la façon suivante : - ajout de 50 l de solution en eau de Sulfate Dodecyl de Sodium (SDS) à 10 % et de Dithiothreitol (DTT) à 2,3 % ; - chauffage pendant 5 minutes dans un bain marie porté à ébullition ; - dilution dans QSP 350 l de solution en eau d'urée 8,3 M, Thiouré 2 M, sulfonate de 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-l -propane (CHAPS) 4 %, DTT 100 mM, Servalyte 4-9 (Serva, Heidelberg, Allemagne) 2 %, Orange G 0,1g/1 ; - réhydratation en tube à essai sous huile de paraffine pendant 6 à 72 heures à température ambiante d'une bande sèche d'Immobiline ayant un gradient de pH immobilisé non linéaire entre pH=3 et pH=10 (Pharmacia, Uppsalla, Suède) à l'aide des 500 l d'échantillon dilué ; - migration et focalisation des protéines de l'échantillon en fonction de leur point isoélectrique dans la bande d'Immobiline à l'aide du système Multiphore II (Pharmacia) conformément aux recommandations du fournisseur à 15 C et pendant 100 kV/h à plus ou moins 10 % à 6000 V afin de réaliser une séparation selon la première dimension ; - congélation de la bande d'Immobiline focalisée à -30 C (facultatif) ; - équilibration de la bande d'Immobiline pendant une durée de 15 minutes dans une solution Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 1,5 M, acide chlorhydrique pH=8,8 additionné d'urée 6 M, SDS 2 %, Glycérol 30 %, Bleu de Bromophénol 50 mg/ml et DTT 10 mg/ml ; - équilibration de la bande d'Immobiline pendant 15 minutes en solution Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 1,5 M, acide chlorhydrique pH=8,8 additionné d'urée 6 M, SDS 2 %, Glycérol 30 %, Bleu de Bromophénol 50 mg/ml et lodoacétamide 480 mg/ml ; - égouttage pendant 5 à 10 minutes sur un papier buvard humide de l'excès de solution d'équilibration en déposant sur la tranche la bande d'immobiline ; - dépôt de la bande d'Immobiline au sommet d'un gel de polyacrylamide C=2,8 %, T=12 % de 16 x 20 cm ; - recouvrement de la bande d'Immobiline par une solution fondue d'agarose à 0. 5 % en tampon Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane mM, glycine 192 mM, SDS 1 %, à pH=8,4 ; - migration en fonction de leur poids moléculaire des protéines précédemment focalisées dans la bande d'Immobiline au sein du gel de polyacrylamide à l'aide du système Protean II xi (Bio-Rad, Hercules, Etats Unis d'Amérique) conformément aux recommandations du fournisseur afin de réaliser une séparation selon la deuxième dimension ; - transfère des protéines du gel bi-dimensionnel vers une membrane Immobilon-P (Millipore, Bedford, Etats Unis d'Amérique) à l'aide du système Trans-blot (Biorad) dans une solution d'acide sulphonique 3-[cyclohexylamino]-1-propane (CAPS) 10 mM, méthanol 10 % à pH=11pendant 16 à 24 heures à 400 mA ; - passivation pendant 1 heure des sites de fixation restés libres sur la membrane à l'aide de la solution TNTL (solution de Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 15 mM, NaCl 0,14 M, Tween 20 à 0,5 ml/1, pH=8,0 additionnée de 5 % de lait écrémé lyophilisé) ; - incubation pendant 1 heure de la membrane dans une dilution à 10 ug/ml d'anticorps monoclonal de souris clone 13C9E9D6G8 (Bio-Mérieux) en solution TNTL ; - lavage de la membrane 3 fois 10 minutes en solution TNTL ; - incubation pendant 1 heure de la membrane dans une dilution au 1/5000 d'anticorps polyclonal de chèvre anti Fc de souris couplé à la peroxydase du raifort (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Etats Unis d'Amérique) en solution TNTL ; - lavage de la membrane 2 fois 10 minutes en solution TNTL ; - lavage de la membrane 10 minutes en solution Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane 0.1M, acide chlorhydrique pH=7.6 ; - révélation à l'aide du substrat chimiluminescent de la peroxydase du raifort Super Signal Ultra (Pierce, Rockford, Etats Unis d'Amérique) selon les recommandations du fournisseur ; - détection de la lumière émise à l'aide du système FluorS Multi-Imager (Bio-Rad) pendant 1 minute à 1 heure avec une échelle de 4096 niveaux de gris ; - quantification des formes de PSA libre clivé et non clivé à l'aide du logiciel MultiAnalyst (Bio-Rad) ; - calcul des proportions de PSA libre clivé par rapport au PSA libre total, ou du PSA libre non clivé par rapport au PSA libre total, ou du PSA libre clivé par rapport au PSA libre non clivé, ou du PSA clivé par rapport au PSA total, ou du PSA clivé par rapport au PSA complexé. - détermination du diagnostic du cancer de la prostate selon les valeurs de référence précédemment décrites. La présente invention concerne donc une méthode de diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate mais également une méthode permettant de différencier un patient atteint d'un adénocarcinome de la prostate, d'un patient atteint d'une pathologie bénigne de la prostate, comme par exemple une hypertrophie bénigne de la prostate (BPH). Ainsi, comme cela est bien représenté à la figure 1, des ronds noirs et des ronds blancs sont représentés. Les ronds noirs représentent des cas de cancers alors que les ronds blancs concernent des BPH. On remarque essentiellement qu'il y a un mélange total entre les cas de cancers et les cas de BPH. Il est donc difficile avec un rapport de PSA libre sur PSA total de calculer réellement s'il y a cancer ou BPH. On remarque néanmoins un point important à savoir que tous ces cas de cancers et de BPH sont situés au-dessus d'une concentration de 2,1 ng/ml de PSA total. En règle générale, il sera donc logique de penser qu'en dessous de ce seuil, les cas de cancers ou de BPH sont très peu fréquents. Les patients présentant une concentration de PSA total inférieur à 2 ng/ml sont considérés comme étant sains. La présente invention consiste donc à différencier cancer et BPH. Pour se faire, on effectue des électrophorèses bi-dimensionnelles comme cela est représenté par exemple sur la figure 2. On remarque trois protéines ou polypeptides de tailles différentes sur cette électrophorèse. Il y a tout d'abord en partie supérieure une protéine de sensiblement 34 kD, à plus ou moins 20 %, qui correspond en fait à la protéine de PSA non clivée. En dessous deux masses sont représentées, à savoir sensiblement 26 kD et 21 kD, à plus ou moins 20 %, qui correspondent chacune à une forme clivée du PSA. Il existe une certaine proportion, entre les formes clivées et non clivées du PSA libre, qui peut être utilisée pour différencier cancer et BPH. Ainsi, dans le cas de la figure 3, le patient est atteint d'une BPH et son sérum contient bien entendu plus de 2,1 ng/ml de PSA total, soit très exactement 3,9 ng/ml. Lorsqu'on rapporte cette concentration de PSA total sur la figure 1, on remarque qu'il y a, à ce niveau, à la fois des cas de BPH et des cas de cancers. Il s'avère que lorsque l'on fait la mesure du PSA libre total, c'est-à-dire clivé ou non clivé, que l'on mesure également le PSA libre clivé, on peut faire un ratio PSA libre clivé sur PSA libre total qui permet de diagnostiquer que le patient est atteint soit d'un cancer lorsque ce rapport est inférieur ou supérieur à une valeur de référence, soit d'une pathologie bénigne de la prostate lorsque ledit est rapport est supérieur ou inférieur à cette valeur. De telles valeurs ont déjà été décrites ci-dessus et une telle méthode de diagnostic peut être appliquée également : # à un rapport entre le PSA libre non clivé par rapport au PSA libre total, ou # à un ratio entre le PSA libre clivé par rapport au PSA libre non clivé, ou # à un ratio entre le PSA libre clivé par rapport au PSA total, ou enfin # à un ratio entre le PSA libre clivé et le PSA complexé. En règle générale, cette méthode est à mettre en #uvre lorsque la concentration, dans le sang ou dans le sérum, en PSA total est supérieure ou égale à 2 ng/ml. Le procédé consiste donc à faire migrer les protéines issues du sang, du sérum, de l'urine ou du liquide séminal du patient, à détecter la présence et à quantifier le PSA libre sous forme clivée ou sous forme non clivée et à déterminer si le patient est sain ou atteint d'un adénocarcinome de la prostate ou d'une autre pathologie bénigne de la prostate en fonction des résultats obtenus précédemment. La migration s'effectue généralement par électrophorèse bi-dimensionnelle et la détection par chimiluminescence avec révélation par Western Blot. Néanmoins, il est tout à fait possible d'envisager une technique utilisant des anticorps, qui sont soit spécifiques du PSA libre sous forme clivée soit spécifiques du PSA libre sous forme non clivée soit éventuellement du PSA lié, et qui ne nécessite pas une migration préalablement à la détection desdites formes. Sérum Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Pathologie BPH BPH Cancer Cancer Cancer Cancer TPSA 3,9 7,5 11 713 3120 4000 bPSA 3,03 6,67 9,79 609 2969 3433 fPSA 0,87 0,83 1,21 104 151 567 ncPSA 0,67 0,74 1,21 101,50 144,78 545,45 cPSA 0,20 0,09 0,00 2,50 6,22 21,55 fPSA/TPSA 22,31 11,07 11,00 14,59 4,84 14,18 ncPSA/TPSA 17,09 9,87 11,00 14,24 4,64 13,64 cPSA/TPSA 5,22 1,20 0,00 0,35 0,20 0,54 ncPSA/bPSA 21,99 11,10 12,36 16,67 4,88 15,89 cPSA/bPSA 6,72 1,34 0,00 0,41 0,21 0,63 ncPSA/fPSA 76,60 89,20 100,00 97,60 95,88 96,20 cPSA/fPSA 23,4 10,8 0 2,4 4,12 3,8 cPSA/ncPSA 30,55 12,11 0,00 2,46 4,30 3,95 Le tableau ci-dessus permet de visualiser rapidement les ratios qui peuvent exister entre : - le PSA total, ci-après référencé TPSA, - le PSA lié à des inhibiteurs de protéases, telles que l'ACT, ci-après référencé bPSA, - le PSA libre, ci-après référencé fPSA, - le PSA libre non clivé, ci-après référencé ncPSA, et - le PSA libre clivé, ci-après référencé cPSA. Il s'agit d'une étude comparative entre les sérums de six patients différents. Afin de bien comprendre le tableau ci-dessus, il convient de noter que les concentrations de PSA total (TPSA), PSA libre (fPSA), PSA clivé (cPSA) et PSA non clivé (ncPSA) sont exprimées en ng/ml. Les ratios, pour leur part, sont exprimés en pourcentage. Lorsque l'on prend en compte le ratio fPSA/TPSA, on remarque que seul les patients 1 et 5 ont un ratio caractéristique, c'est-à-dire qu'il pourrait permettre de distinguer un cas de cancer d'une cas de BPH. Dans les autres cas, les ratios sont compris entre 11,00 et 14,59. Une discrimination n'est donc pas possible entre cancer et BPH. Un exemple particulièrement frappant est le cas des patients 2 et 3. Le patient 2 est atteint d'une BPH avec un ratio de 11,07, alors que le patient 3 est atteint d'un cancer avec un ratio de 11,00. L'utilisation du rapport fPSA/TPSA est dans ce cas inadaptée à la distinction entre BPH et cancer. Ceci montre bien les limites de cette technique. Si par contre, on utilise les rapport existants entre cPSA/bPSA, cPSA/TPSA, ncPSA/fPSA, cPSA/fPSA et cPSA/ncPSA, on remarque qu'il existe un différence importante entre les ratios des patients 1 et 2 atteints d'une BPH et les patients 3 à 6 atteints d'un cancer. Ces rapports qui utilisent les formes clivées et/ou non clivées du PSA sont donc bien plus représentatifs de l'état réel d'un patient. Ainsi, dans le cadre des exemples tirés du tableau, avec le rapport cPSA/TPSA, dans le cas d'une BPH le rapport est toujours supérieur ou égal à 1,2 % et dans le cas d'un cancer le rapport est toujours inférieur à 0,54 %. Avec le rapport cPSA/bPSA, dans le cas d'une BPH le rapport est toujours supérieur à 1,34 % et dans le cas d'un cancer le rapport est toujours inférieur à 0,63 %. Avec le rapport ncPSA/fPSA, dans le cas d'une BPH le rapport est toujours inférieur à 89,2 % et dans le cas d'un cancer le rapport est toujours supérieur à 95,88 %. Avec le rapport cPSA/fPSA, dans le cas d'une BPH le rapport est toujours supérieur à 10,8 % et dans le cas d'un cancer le rapport est toujours inférieur à 4,12 %. Enfin, avec le rapport cPSA/ncPSA, dans le cas d'une BPH le rapport est toujours supérieur à 12,11% et dans le cas d'un cancer le rapport est toujours inférieur à 4,3 %. Les rapports, qui ne sont pas représentatifs, sont constitués par les rapports ncPSA/TPSA, ncPSA/bPSA et fPSA/TPSA puisque les ratios de trois patients 3,4 et 6, atteints de cancer, se situent dans l'intervalle délimité par les ratios des patients 1 et 2, atteints d'une BPH. De ce fait, il peut être particulièrement intéressant d'utiliser une combinaison des différents rapports cPSA/TPSA, cPSA/bPSA, ncPSA/fPSA, cPSA/fPSA et cPSA/ncPSA, voire la totalité de ces rapports, pour différencier une pathologie bénigne de la prostate par rapport à un cancer de la prostate. Nous disposons de trois variables indépendantes : # A = bPSA, c'est-à-dire le PSA complexé ou lié à des inhibiteurs (ACT...) # B = ncPSA, c'est-à-dire le PSA libre non clivé # C = cPSA, c'est-à-dire le PSA libre clivé avec des concentrations telles que A B C En conséquence, les différents ratios peuvent être écrits de la façon qui suit et conduire aux approximations suivantes : Il apparaît donc que les ratios 1, 2 et 4 conduisent au même type de réponse. Le ratio 1 a déjà été décrit dans l'état de la technique, qui a été discuté précédemment, et conduit à de nombreux diagnostics erronés, par conséquent, les ratios 2 et 4 ne sont pas intéressants. Les ratios 6,7 et 8 sont reliés par une relation mathématique exacte ce qui revient à dire qu'ils permettent d'aboutir à une réponse identique. Les ratios 3 et 5 conduisent à une réponse équivalente différente des ratios précédents. Les ratios 3 et 5 à 8 sont donc représentatifs. REVENDICATIONS 1. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans un échantillon de sang, de sérum, d'urine ou de liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à - mesurer le niveau de PSA libre total, c'est-à-dire clivé ou non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA libre total, et - distinguer deux cas, à savoir : # ce rapport a une valeur inférieure ou égale à une valeur de référence ou de différenciation, telle que trouvée chez des patients affectés par un adénocarcinome de la prostate # ce rapport a une valeur supérieure à la valeur de référence, telle que trouvée chez des patients affectés par une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate 2. Méthode, selon la revendication 1, caractérisée en ce que la valeur de référence est comprise entre 4 et 12 % et préférentiellement entre 7 et 9 % 3. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans un échantillon de sang, de sérum, d'urine ou de liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA libre total, c'est-à-dire clivé ou non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre non clivé, - calculer la proportion de PSA libre non clivé par rapport au PSA libre total, et - distinguer deux cas, à savoir : # ce rapport a une valeur supérieure ou égale à une valeur de référence ou de différenciation, telle que trouvée chez des patients affectés par un adénocarcinome de la prostate # ce rapport a une valeur inférieure à la valeur de référence, telle que trouvée chez des patients affectés par une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate 4. Méthode, selon la revendication 3, caractérisée en ce que la valeur de référence est comprise entre 88 et 96 % et préférentiellement entre 91 et 93 %. 5. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans un échantillon de sang, de sérum, d'urine ou de liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à - mesurer le niveau de PSA libre non clivé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA libre non clivé, et - distinguer deux cas, à savoir . # ce rapport a une valeur inférieure ou égale à une valeur de référence ou de différenciation, telle que trouvée chez des patients affectés par un adénocarcinome de la prostate # ce rapport a une valeur supérieure à la valeur de référence, telle que trouvée chez des patients affectés par une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate 6. Méthode, selon la revendication 5, caractérisée en ce que la valeur de référence est comprise entre 4 et 14 % et préférentiellement entre 7 et 10 %. 7. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans un échantillon de sang, de sérum, d'urine ou de liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à : - mesurer le niveau de PSA total, c'est-à-dire complexé et libre (clivé ou non clivé), - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA total, et - distinguer deux cas, à savoir # ce rapport a une valeur inférieure ou égale à une valeur de référence ou de différenciation, telle que trouvée chez des patients affectés par un adénocarcinome de la prostate # ce rapport a une valeur supérieure à la valeur de référence, telle que trouvée chez des patients affectés par une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate 8. Méthode, selon la revendication 7, caractérisée en ce que la valeur de référence est comprise entre 0,1et 2 % et préférentiellement entre 0,5et 1 % 9. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient humain mâle, sans pratiquer de biopsie prostatique, qui utilise la protéine PSA (prostate spécifie antigen) présente dans un échantillon de sang, de sérum, d'urine ou de liquide séminal du patient, caractérisée en ce qu'elle consiste à - mesurer le niveau de PSA complexé, - mesurer le niveau de tout ou partie du PSA libre clivé, - calculer la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA complexé, et - distinguer deux cas, à savoir : # ce rapport a une valeur supérieure ou égale à une valeur de référence ou de différenciation, telle que trouvée chez des patients affectés par un adénocarcinome de la prostate # ce rapport a une valeur inférieure à la valeur de référence, telle que trouvée chez des patients affectés par une pathologie bénigne de la prostate, telle qu'une hypertrophie bénigne de la prostate 10. Méthode, selon la revendication 9, caractérisée en ce que la valeur de référence est comprise entre 0,1et 2,2 % et préférentiellement entre 0,7 et 1,2 % 11. Méthode d'analyse en vue du diagnostic d'un adénocarcinome ou d'une pathologie bénigne de la prostate chez un patient, qui utilise la combinaison d'au moins deux méthodes, chaque méthode étant constituée par l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ou bien 3 ou 4, ou bien 5 ou 6, ou bien 7 ou 8, ou bien 9 ou 10 12. Méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1, caractérisée en ce qu'elle est mise en #uvre lorsque la concentration en PSA total dans le sang ou dans le sérum est supérieure à 2 ng/ml 13. Procédé utilisant une méthode, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste à . - détecter la présence et quantifier le PSA libre sous forme clivée et sous forme non clivée, et - déterminer la valeur de la proportion de PSA libre clivé par rapport au PSA libre total, par rapport à une valeur de référence. 14. Procédé, selon la revendication 13, caractérisé en ce que préalablement on fait migrer les protéines issues du sang, du sérum, l'urine ou du liquide séminal du patient. 15. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la migration s'effectue par électrophorèse bidimensionnelle. 16. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que préalablement on dose le taux de PSA total. 17. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 13 ou 16, caractérisé en ce que la détection s'effectue par chimiluminescence après révélation par Western Blot