Brevet FR2764701A1 — publié le 19981218

I1 est bien connu que de nombreuses substances utilisées dans notre alimentation,donnent lieu à des phénomènes de peroxydation,générant des radicaux libres,provoquant ainsi des altérations des chaînes lipidiques, des structures protéiniques et l'apparition de nouvelles molécules,comme les protéines associées aux hydrates de carbone (glycation) aux caractères toxiques.Tel est le cas pour les huiles et les graisses alimentaires chauffées. La nature des acides gras polyinsaturés issus de notre alimentation,contribue dans une large mesure à modifier les équilibres en induisant l'action peroxydante des neutrophiles dans les cellules endothéliales,cette augmentation de l'activité des neutrophiles,provoquant des dommages aux tissus correspondants. Il a été largement démontré,que l'acide arachidonique, principal acide gras des phospholipides des membranes cellulaires est facilement peroxydé,donnant lieu à une variété de substances comme les prostaglandines,les leucotriènes,les lipoxines et des molécules de faibles poids moléculaires comme le malondialdéhyde.Ces substances diffusant dans le sang sont nuisibles pour la santé,en commençant par provoquer des processus inflammatoires. On sait aujourd'hui que l'oxydation radicalaire,issue du processus oxydatif,provoque la fragmentation des protéines, avec formation de liaisons transversales,générant des agrégats et des pigments fluorescents,marqueurs de la dégradation oxydative. L'oxydation radicalaire,dans notre alimentation, peut être considérée comme permanente;toutefois,celle-ci est plus ou moins inhibée, selon les métabolismes,par nos antioxydants naturels: glutathion,tocophérols,caroténoïdes et vitamine C. Notre équilibre physiologique est donc en grande partie dépendant,de notre teneur en antioxydants,qui peuvent etre facilement "dépassés" par un processus oxydatif plus ou moins important,tel est le cas de l'agression par les peroxydes et hydroperoxydes alimentaires. I1 a été largement démontré que notre alimentation en viande et poisson,(riche en acides gras polyinsaturés),surtout cuisinés avec des corps gras,générait des peroxydes et des hydroperoxydes;ce type de préparation est donc un promoteur important de radicaux libres. Il a été observé récemment,que le four à micro ondes,accélérerait le processus oxydatif des aliments,comparativem?nt au four électrique. Or,contrairement à l'alimentation à base de viande ou de poisson, les fruits et legumes sont riches en antioxydants, pouvant ainsi détruire les peroxydes et inhiber la formation de radicaux libres; d'ailleurs lors d'un congrés de chimie qui s'est tenu à New York en 1991,il a été exposé que les fruits et légumes constituaient un arsenal d'antioxydants protégeant des risques de cancer.Aujourd'hui on estime que les antioxydants sont des anticarcinogènes universels,que les produits issus des végétaux alimentaires:le vin rouge, le thé, le chocolat et même le café, pourraient nous proteger, dans une certaine mesure des maladies.(Chemical & Engineering News 21 Avril 1997). On considère aujourd'hui,que les antioxydants végétaux,qui sont des flavonoïdes,(polyphénols) sont d'importants agents protecteurs de notre santé,en diminuant principalement les risques de cancer,sans pour autant en connaître le mécanisme. Suite aux expérimentations effectuées dans le cadre de la presente invention,il semblerait,en fait,que ce mécanisme soit lié aux propriétes antiradicalaires de ces polyphenols,qui peuvent être mesurées grâce à un radical libre,stable,comme le diphénylpicryl- hydrazile ou DPPH,qui en solution ethanolique,est d'une intense coloration violette, disparaissant par l'action de substances antiradicalaires.Ainsi à l'aide de ce réactif, nous avons pu déterminer les capacités antiradicalaires de nombreux aliments,soit directement sur leur broyat ou sur leur extrait. Les examens réalisés à partir de différents flavonoïdes et acides phénols,caractérisant les substances antioxydantes des fruits et légumes ont montré leur haute capacité antiradicalaire.Ainsi,le tableau ci-dessous,nous indique la rapidité de décoloration d'une solution à 0,2 mg,de DPPH,en moins de 30 secondes. En mg de substances . En mg de substances Kaempfêrol 0,2 Quercétine 1,8 Juglone 0,3 Rutine 0,8 Naringine 0,3 Xanthine 1,5 Epigallocatéchine 0,1 Tanin 0,1 Acide chlorogénique 0,1 Acide caféique 0,1 Acide férulique 0,5 Acide pyrocatéchique 0,2 l'examen de différentes boissons a donné les résultats exprimés dans le tableau ci-dessous: Nature des boissons Volume pour Nature des boissons Volume pour neutraliser 0,5 mg de DPPH 0,5 mg de DPPH The (infusion à 2%) 0,2 ml (exprimé en anhydre) 0,004 mg Vin de Bordeaux 0,5 ml Jus d'orange (boite) 0,2 ml Jus de pomme (sous vide) 2,2 ml Bière 3,8 ml Glutathion (solution à 1%) 2,0 ml Glutathion (solution à 1%) 2,0 ml On remarquera la forte activité du tanin, conférant au vin de Bordeaux des proprietés antiradicalaires,surpassées, toutefois par celles du thé. A titre comparatif,des mesures ont été effectuees sur des produits biologiques de référence (acétylcysteine et glutathion). Le temps de décoloration du DPPH est lié à la concentration de la substance antiradicalaire. 10 mg de substance Quantité de Temps en secondes 10 mg de substance Quantite de Temps en secondes dans lOml d'eau substance pour decoloration Acétylcystéine i mg 2 Acetylcysteine 1 mg 2 " " 0,5 10 11 0,3 20 Glutathion 8,0 20 " " 6,0 60 6,0 60 Les mesures de l'activité antiradicalaire,réalisées sur une cinquantaine de fruits et de légumes frais montrent,que les agrumes,le Kiwi,les fraises sont doués d'une forte activité,quant aux légumes,on constate des résultats très variables selon leur nature,l'activité la plus importante ayant été obtenue avec le poivron vert et rouge. Il a été d'autre part constaté que la cuisson à l'eau des légumes ne réduisait pas ou peu l'activité antiradicalaire. Ainsi qu'il a été souligné précédemment,notre alimentation nous apporte des quantités non négligeables de peroxydes. A titre d'exemples, le tableau ci-après nous montre la quantité de peroxydes (exprimée en microgrammes d'oxygène) de différents aliments: Pour i g. Indices de peroxydes Pour 1 g. Indices de peroxydes En microgrammes de 02 /g 02 /g Saucisse frite (broyat) 88 Saumon fumé 200 Huile d'arachide 40 Huile d'arachide chauffée 360 Huile d'olive 140 Huile d'olive chauffée 440 La durée du chauffage produit une élévation sensible de l'indice de peroxydes de l'indice de peroxydes L'expérimentation a montré que,lg.d'huile d'olive accusant un Indice de peroxydes (I.P) de 14 (exprimé en ml de solution de Thiosulfate N/200) mélangé avec 1 ml de solution de poivron vert,soit 170 mg d'extrait sec,conduit à la disparition des peroxydes,tandis que 23 mg de BHT ne ramènent l'indice qu'à 10,6.La même opération effectuée avec de l'huile de foie de morue d'un I.P.de 18,additionné de 1 ml d'extrait,de poivron vert,montre un I.P de 4,0,tandis que 23 mg de BHT,ne ramènent l'indice qu'à 16,7. Grâce à ce qui a été précédemment décrit et aux expérimentations effectuées,cela a conduit à la réalisation de la présente invention, qui d'une part,permet de mesurer l'activité antiradicalaire des végétaux,et d'autre part de pouvoir réaliser à partir de ces mesures,une sélection d'extraits végétaux,utilisables comme compléments alimentaires,destinés à combattre les radicaux libres,qu'ils viennent de l'alimentation ou de la fumée du tabac,promoteur de carcinogénèse pulmonaire. Dans le cadre de l'invention,on utilisera avantageusement les fruits et légumes,les feuilles ou les graines,présentant la capacité antiradicalaire la plus élevée;ce que l'on trouve dans la peaudes agrumes: orange, pamplemousse, citron, par exemple et plus particulièrement dans le poivron.Le thé sera également avantageuse utilisé en raison de sa teneur en acide chlorogenique,ellagique et (-)-épigallo-catechine-3- A titre d'exemples non limitatifs,on procédera à la préparation d'extraits végétaux,en utilisant les peaux d'agrumes particulièrement riches en flavonoïdes et acides phénols,ou des légumes comme le poivron, qui seront réduits en petites particules par un système adéquat.Le volume obtenu étant additionné d'un volume égal d'éthanol ou d'autres solvants appropriés,permettant d'extraire les actifs,sous agitation.On laisse 24 heures au repos;on sépare les particules par filtration, le filtrat ainsi obtenu est distillé sous vide,jusqu'à obtention d'un extrait déshydraté (lyophilisat par exemple). Les extraits,seront alors identifiés par la chromatographie des polyphénols et par leur activité antiradicalaire déterminée par le DPPH.Cette activite sera exprimée en unités,basées sur le nombre de mg de DPPH décolorés par 1 g de substance,dénommée UNITES ANTIRADICALAIRES ou U.A.R.Une unité antiradicalaire correspondant à 1 mg de DPPH. A titre d'exemples non limitatifs,on exprimera en unités antiradicalaires le nombre de mg de DPPH neutralisés par les extraits. Les chiffres ci-après montrent l'importante activité d'extraits obtenus selon l'invention,par rapport à un antioxydant de référence biologique: le glutathion. Pour Ig de substance mg de DPPH Pour Ig de substance mg de DPPH neutralises neutralisés Glutathion 25 (U.A.R) Poivron vert 104 Poivron rouge 69 Ecorce d'orange 51 Thé (anhydre) 125 Kiwi 24 Epinards 12 Epinards 12 Ainsi,on considérera qu'un gramme de glutathion correspond à 25 unités antiradicalaires (U.A.R),le poivron vert à 104 U.A.R,le thé à 125 U.A.R. Les produits issus des fruits,des légumes,de feuilles ou de graines, obtenus dans le cadre de l'invention,pourront être utilisés avantageusement,comme protecteurs alimentaires à partir d'extraits liquides stabilisés,ou d'extraits déshydratés (lyophilisats),sous forme de comprimés,de gélules ou de toute autre présentation,afin de combattre l'agression oxydative de multiples aliments ou d'exercer une protection contre les effets carcinogènes du tabac. Les bioflavonoïdes des légumes,des fruits,et du thé,étant considérés comme agents de prévention de cancers par exemple,provoqués par la nicotine-nitrosamine (4 méthylnitrosamino)-(3-pyridyl)-1-butanone,connue sous l'abreviation de NNK.(Chemical & Engineering News 1991 69 (37) 27). REVENDICATIONS 1-Procédé de détermination du niveau en substances antiradicalaires de fruits,de légumes,de feuilles ou de graines, destinés à l'alimentation,caractérisé en ce que l'on mesure le niveau en substances antiradicalaires des fruits ou des legumes,de feuilles ou de graines en ayant recours à un radical stable tel:le diphénylpicrylhydrazile,conduisant à une évaluation colorimétrique permettant de choisir le végétal,dont l'activité est la plus élevée. 2-Procedé selon la revendication 1,caractérisé en ce que les végétaux ainsi que leurs extraits sont titrés en unités antiradicalaires ou U.A.R,correspondant au nombre de milligrames de diphénylpicrylhydrazyle neutralisé par lg de substance. 3-Utilisation du procédé selon les revendications 1 ou 2 pour la préparation d'extraits de fruits,légumes,feuilles,ou graines, présentant un haut niveau antiradicalaire,caractérisée en ce que ces végétaux sont traités par de l'méthanol ou d'autres solvants appropriés,permettant d'extraire les substances actives;le filtrat étant distillé sous vide jusqu'à obtention d'un extrait sec,tel un lyophilisat. 4-Utilisation des extraits préparés selon la revendication 3 comme compléments alimentaires,sous forme solide (gélules,comprimés) ou sous forme d'une solution stabilisée,afin d'assurer ou d'augmenter les moyens de défense de l'organisme contre l'agression radicalaire de multiples produits consommés dans notre alimentation ou encore,pour combattre et inhiber l'effet des radicaux libres de la fumée du tabac,promoteur de carcinogénèse pulmonaire.