Brevet FR2769630A1 — publié le 19990416

UTILISATION D'ELICITINES POUR LE TRANSPORT DE LIPIDES L'invention est relative à l'utilisation de protéines de la famille des élicitines pour la fixation et le transport de molécules lipidiques. Les élicitines sont des protéines extracellulaires, qui ont été mises en évidence chez certaines espèces de champignons phytopathogènes de la classe des Oomycètes [cf. revue par P. RICCI, induction of the Hypersensitive Response and Systemic Acquired Resistance by Fungal Proteins : the Case of Elicitins , parue dans Plant-Microbes Interactions, Volume 3, édité par G. STACEY et N.T. KEEN, (éditions CHAPMAN et HALL) pp. 5375, (1997)]. il a été montré que des élicitines, lorsqu'elles étaient inoculées à une plante hôte, jouaient un rôle essentiel dans l'induction d'une réaction d'hypersensibilité se manifestant par - la formation de lésions nécrotiques localisées, situées non seulement au point d'inoculation, mais également au niveau de territoires foliaires distants de celui-ci ; et/ou - l'activation chez la plante de mécanismes de défense conduisant à l'acquisition d'une résistance systémique à large spectre. L'activité inductrice peut varier selon le type d'élicitine, et selon la plante concernée. Les élicitines ont d'abord été identifiées chez plusieurs espèces du genre Phytophthora. Des protéines étroitement apparentées, à la fois sur le plan structurel et sur le plan fonctionnel, ont ensuite été mises en évidence chez Pythium vexans [HUET et al., Molecular Plants/Microbes Interactions, 8:2, pp. 302-310 (1995)] . Les caractéristiques communes entre les élicitines de Phytophthora et les protéines similaires de Pythîum, définissent une famille de protéines, qui sera dénommée ci-après famille des élicitines . Cette famille regroupe des petites protéines très hydrosolubles, d'environ 10 kDa, qui, sous leur forme mature sécrétée, sont constituées d'une seule chaîne polypeptidique d'environ une centaine d'acides aminés, riche en résidus hydrophobes et contenant 6 résidus cystéine, formant 3 ponts disulfure intramoléculaires, qui confèrent à la protéine une structure tertiaire globulaire. On entend ici par riche en résidus hydrophobes une protéine où ces résidus hydrophobes (dans lesquels on inclut également les résidus cystéine engagés dans des ponts disulfure, et les résidus tyrosine) représentent au moins 50% environ du total des résidus acides aminés, les acides aminés apolaires représentant au moins 40 du total des acides aminés. Chez les protéines de la famille des élicitines, ces résidus hydrophobes représentent généralement entre 50 et 60W environ du total des résidus acides aminés, et les acides acides aminés apolaires représentent entre 40 et 50k environ du total des résidus acides aminés. Parmi les élicitines isolées à partir de champignons du genre Phytophthora, on distingue des élicitines acides (ou a-élicitines), dont le pI est compris entre 3 et 5, telles que la capsicéine et la parasiticéine, isolées respectivement de Phytophthora capsici et de Phytophthora parasitîca, et des élicitines basiques (p-élicitines), dont le pI est compris entre 7 et 9, telles que la cryptogéine de Phytophthora cryptogea et la cinnamomine de Phytophthora cinnamome. Les élicitines qui ont été identifiées chez Pythium vexans ont un pI comparable à celui des a-élicitines de Phytophthora. Des expérimentations effectuées chez le tabac ont montré que les élicitines basiques des Phytophthora sont actives à des concentrations 50 à 100 fois plus faibles, en ce qui concerne l'induction de nécroses distales, que les élicitines acides. Les élicitines acides de Pythium vexans ont une activité qui apparaît supérieure à celle des élicitines acides des Phytophthora (HUET et al., publication précitée). Le mode d'action proposé des élicitines implique la liaison à un récepteur membranaire spécifique, qui, par l'intermédiaire de la phosphorylation de protéines, et d'un réseau de seconds messagers, entraîne une cascade d'événements provoquant la destruction localisée de cellules, et parallèlement, l'induction de mécanismes de résistance. Jusqu'à présent, aucune fonction des élicitines, en dehors de l'activité sur les plantes mentionnée ci-dessus, n'était connue, et les seules utilisations qui aient été proposées pour ces protéines concernent la protection des plantes contre les parasites. Les Inventeurs ont maintenant constaté que les protéines de la famille des élicitines possédaient la propriété de fixer des molécules lipidiques, telles que des stéroïdes, et en particulier des stérols. La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins une protéine de la famille des élicitines pour la capture et la fixation de lipides, dans un système in vitro ou dans un végétal, ainsi que pour l'obtention d'un médicament capable de capturer et de fixer les lipides. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, lesdits lipides sont des stéroïdes, et en particulier de stérols. Au sens de la présente invention, on entend par protéine de la famille des élicitines non seulement les protéines déjà caractérisées chez Phytophthora et Pythium, mais également toute protéine présentant les caractéristiques structurales et fonctionnelles de la famille des élicitines, telles que définies ci-dessus. De telles protéines peuvent en particulier être obtenues à partir d'Oomycètes, tels que des Phytophthora ou des Pythium. Conformément à l'invention, les élicitines peuvent être utilisées pour extraire les molécules lipidiques mentionnées ci-dessus à partir d'un milieu les contenant. Ceci peut être effectué par mise en contact du milieu concerné avec une préparation contenant une ou plusieurs protéine(s) de la famille des élicitines, puis séparation du milieu appauvri en molécules lipidiques, et des élicitines ayant fixé ces molécules. Cette séparation peut éventuellement être facilitée en utilisant des élicitines liées à un support solide, par exemple une colonne de chromatographie, des microbilles, des membranes, etc. Les élicitines peuvent également être utilisées pour l'obtention de médicaments hypolipidémiants, de préférence hypocholestérolémiants. Les Inventeurs ont également constaté que les élicitines possédaient en outre la propriété de catalyser le transfert de molécules lipidiques telles que des stéroïdes, et en particulier des stérols vers, ou à partir de micelles, ou bien de bicouches lipidiques, telles que des liposomes ou des membranes naturelles ou artificielles. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, au moins une protéine de la famille des élicitines est utilisée pour stimuler le transfert des molécules lipidiques mentionnées ci-dessus, dans un système ín vitro ou dans un végétal. Par exemple, ce transfert peut être effectué, en une étape, par ajout de la ou des élicitine(s) à un milieu contenant les structures (micelles et/ou bicouches lipidiques) donneur et accepteur , ou bien en plusieurs étapes, en ajoutant la ou les élicitine(s), à un milieu contenant les structures donneur , puis en séparant dudit milieu la ou les élicitine(s) ayant fixé les molécules lipidiques, et en les ajoutant à un milieu contenant les structures accepteur . Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, au moins une protéine de la famille des élicitines est utilisée pour l'obtention d'un médicament capable de transférer des molécules lipidiques, telles que des stéroïdes et en particulier des stérols. L'activité de transfert est plus ou moins importante selon l'élicitine concernée, et ce, indépendamment de ses propriétés de fixation des molécules lipidiques. il est ainsi possible, selon que l'on souhaite, dans l'utilisation envisagée, privilégier la fixation des stérols ou leur transfert, de choisir l'élicitine la plus appropriée. Les capacités respectives de fixation et de transfert des stérols peuvent aisément être évaluées par 1' homme du métier en mettant en oeuvre les protocoles expérimentaux décrits en détail dans les exemples ciaprès. Contrairement aux protéines de transfert de lipides capables de transférer des stérols, connues jusqu'à présent, [FISCHER et al., Biochemistry, 24 , pp. 3322-3331, (1985) ; SCHROEDER et al., J. Biol. Chem., 265, pp. 151-157, (1990) ; SCHROEDER et al., Lipids, 25, pp. 669-674, (1990) ; WOODFORD et al., Chem. Phys. Lipids, 76, pp. 73-84, (1995) ; FROLOV et al., J. Biol. Chem., 271, pp. 16075-16083, (1996)] qui sont toutes des protéines intra-cellulaires, les élicitines sont des protéines sécrétées, extra-cellulaires. Ceci facilite leur obtention et leur purification à partir de milieux de culture, qui peuvent soit être des cultures de champignons les produisant naturellement, soit des cultures de cellules transformées par des gènes d'élicitines. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés des élicitines dans le cadre de la fixation et du transfert des stérols. I : PROPRIETES DE FIXATION DES LIPIDES Produits Une élicitine basique, la cryptogéine, et 3 élicitines acides, la cactoréine, la capsicéine, et la parasiticéine, ont été préparées selon le protocole décrit par BONNET et al., Eur. J. Plant. Pathol., 102, pp.181-192, (1996), mises en solution dans de l'eau, et conservées à -300C jusqu'à utilisation. Les phospholipides, le 2-ptoluidinonaphtalène-6-sulfonate (TNS) et les stérols sont commercialisés par SIGMA. Les stérols et le TNS sont solubilisés dans l'éthanol. Tampon I : 175 mM de mannitol, 0,5 mM de Cal2, 175 mM de K2SO4, et 5 mM de MES, pH7 mesures de fluorescence Les mesures de fluorescence sont effectuées sous agitation, à 250C à l'aide d'un spectrofluorimètre SHIMAZU RF 5001 PC, dans une cuve de fluorimétrie, dans 2 ml de tampon I. L'intensité de fluorescence est exprimée en unités arbitraires (u.a.). Pour le DHE (déhydroergostérol) et le TNS, les longueurs d'onde d'excitation ont été respectivement fixées à 325 et 355 nm, et les longueurs d'onde d'émission à 370 et 430 nm. La fluorescence des élicitines seules est négligeable. EXEMPLE 1 : DEMONSTRATION DE L'INTERACTION DES ELICITINES AVEC LE DEHYDROERGOSTEROL. Detection de l'interaction L'interaction des élicitines avec le DHE a éte détectée par l'observation des modifications du spectre d'émission de fluorescence du DHE en présence des différentes élicitines, dans le tampon I. En l'absence d'élicitines, les maxima d'émission du DHE après excitation à 325 nm sont de 370, 402, et 424 nm. L'addition de chacune des élicitines dans le même tampon provoque une augmentation marquée du maximum d'émission à 370 nm. La forme des spectres d'émission de fluorescence émise de tous les complexes élicitine-DHE est similaire. Ces résultats sont illustrés par la Figure 1, qui représente les spectres d'émission de fluorescence du mélange DHE-élicitine. Les spectres de fluorescence sont enregistrés 5 minutes après l'addition d'élicitine (2 pM) au DHE (1 pM) dans du tampon I. La longueur d'onde d'excitation est de 325 nm. 1. DME sans élicitine 2. EHE + capsicéine 3. DHE + parasiticéine 4. DHE + cactoréine 5. DHE + cryptogéine. Les modifications du spectre d'émission de fluorescence du DHE en présence d'élicitines montrent que le DHE interagit avec ces protéines. Cinétique de l'interaction, et effet du DH La cinétique de l'interaction DHE-élicitine a été étudiée pour chacune des élicitines mentionnées cidessus. Les résultats sont illustrés par la Figure 2A, qui représente la cinétique de l'interaction élicitine DHE, dans les conditions suivantes : 1,6 \iM de DHE et 2 pM de 1'élicitine testée sont ajoutées dans le tampon I ;la longueur d'onde d'excitation est de 325 nm, et l'émission est mesurée à 370 nm. Ces résultats montrent que la cinétique diffère quelque peu selon 1'élicitine concernée. Dans les conditions expérimentales décrites ci-dessus, le taux initial d'interaction est élevé dans le cas de la cryptogéine et de la cactoréine, et atteint un plateau après 100 secondes et 200 secondes respectivement. La fluorescence augmente graduellement pour la capsicéine et la parasiticéine, et atteint le plateau au bout de 5 minutes. L'effet du pH sur l'interaction entre le DHE et 2 élicitines, une basique, la cryptogéine, et une acide, la capsicéine, a été analysé. La cinétique de fluorescence de l'interaction élicitine/DHE a été déterminée dans du tampon I, ajusté à différents pH compris entre 4,5 et 8. La figure 2B illustre l'effet du pH sur l'interaction de la cryptogéine 0 ou de la capsicéine g avec le DHE. L'intensité de fluorescence est enregistrée 100 secondes (dans le cas de la cryptogéine) ou bien 300 secondes (dans le cas de la capsicéine) après l'addition de l'élicitine au DHE. Ces résultats montrent que l'intensité de fluorescence du complexe DHE-cryptogéine change de façon notable entre pH 4,5 et pH 5,5, puis demeure constante. Un effet similaire est observé pour la capsicéine, en dépit de son point isoélectrique différent, et d'une cinétique plus lente. Paramètres de la liaison DHE/élicitine L'augmentation de la fluorescence du DHE lors de la liaison aux élicitines est utilisée pour déterminer les paramètres de liaison du DHE. Le DHE est ajouté à du tampon I, à des concentrations variant de 0,2 à 3,8 pM. L'intensité de fluorescence (Fo) est mesurée. 2 FM de chaque élicitine sont alors ajoutés et l'intensité de fluorescence (F) du mélange est mesurée après stabilisation. On détermine la différence AF = F-Fo, ce qui permet d'établir des courbes de titration représentant AF en fonction de la concentration en DHE. D'autre part, la titration d'une concentration constante (0,25 pM) de DHE, par chaque élicitine jusqu'à atteindre un plateau de fluorescence permet de déterminer la quantité de DHE lié. Pour déterminer les constantes de dissociation et le nombre de sites de liaison, des courbes représentant 1/[DHE lié] en fonction de 1/[DHE libre] ont été tracées sur la base de l'équation suivante I/Cb = (Kd/NA).1/Cf + 1/NA dans laquelle Cb et Cf sont respectivement les concentrations de DHE lié et de DHE libre, Kd est la constante de dissociation, A est la concentration d'accepteur, et N le nombre de sites de liaison. Les constantes de dissociation du complexe élicitine-DHE (Kd), la stoechiométrie de l'interaction (N) et l'intensité relative de fluorescence du DHE (Qb) lié sont représentés dans le tableau I ci-dessous TABLEAU I Elicitine Kd(llM) N(mol/mol) Qb(a. u./,uM ) Cactoréine O,i + 0,02 0,86 + 0,08 13,2 Caps ceinte 0,55 + 0,11 Q85+0,14 + 0,14 11,8 Cryptogéine O 56 + 0,04 0,90 + 0,10 12,5 Parasiticéine 0,58 +0,14 1,16 + 0,25 10,3 Ces résultats montrent que toutes les élicitines étudiées ont la même stoechiométrie de liaison, c'est-à-dire une molécule de stérol par molécule d'élicitine, et des constantes de dissociation du même ordre de grandeur (entre 0,11 et 0,58 pM) Ces paramètres de liaison peuvent être comparés avec ceux de plusieurs protéines animales intracellulaires connues pour leur capacité à fixer les lipides. Par exemple, la protéine de transport de stérol SCP2 [SCHROEDER et al., J. Biol. Chem., 265, pp. 151-157, (1990)] fixe le DHE avec une constante de dissociation apparente de 1,2 à 1,5 AM, et une stoechiométrie d'environ 0,8 à 1 molécule de stérol par molécule de protéine. La protéine de transfert de stérol SCP, dont la structure est différente de la précédente, fixe le DHE avec une constante de dissociation de 0,88 pM et une stoechiométrie similaire [FISCHER et al, Biochemistry, 24, pp. 33223331, (1985)]. Une protéine du foie de rat, qui possède la propriété de fixer les acides gras, semble avoir une affinité plus élevée avec une constante de dissociation de 0,29 pM, et une stoechiométrie de 0,9 site de liaison par molécule de protéine ; d'autre part, la sérum albumine bovine a une affinité plus faible (Kd = 2,9 pM) et 6 à 7 sites de liaison par molécule de protéine [SCHROEDER et al., publication précitée]. Ces résultats montrent que les élicitines testées ont des paramètres de liaison du même ordre que ceux des protéines capables de fixer les stérols connues précédemment. EXEMPLE 2 : INTERACTION DE LA CRYPTOGEINE AVEC DES PHYTOSTEROLS. La liaison de stérols non-fluorescents, ce qui est le cas des stérols d'origine végétale, aux élicitines, a été mesurée indirectement en observant leur action sur la fluorescence des complexes formés entre les élicitines et une sonde fluorescente, le TNS. La fluorescence du TNS seul, en solution dans l'eau, est négligeable. Lorsque l'on ajoute de la cryptogéine on observe un accroissement de la fluorescence à 430 nm. L'interaction du TNS avec la cryptogéine est plus rapide que celle du DHE. L'étude des paramètres de liaison cryptogéine/TNS fait apparaître une constante de dissociation de 1,45 + 0,07 pM, et une stoechiométrie de 1,4 + 0,03 sites de liaison par molécule de cryptogéine. La cryptogéine a donc une affinité plus faible pour le TNS que pour le DHE. L'influence de différents stérols sur la fluorescence du mélange cryptogéine-TNS a été étudiée. La figure 3 représente les courbes de cinétique d'extinction, par différents stérols, de la fluorescence du TNS fixé à la cryptogéine, établies dans les conditions suivantes A une solution 7 pM de TNS dans du tampon I, on ajoute 2,5 pM de cryptogéine, et le mélange est incubé pendant 2 minutes. On ajoute ensuite 1,2 pM de stérol à tester, et la fluorescence est mesurée pendant 200 secondes. La longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde d'émission sont respectivement de 355 et 430 nm. L'addition d'un stérol à la cryptogéine préincubée avec du TNS induit une importante décroissance de la fluorescence du TNS à 430 nm, qui se stabilise après 1 à 3 minutes. La cinétique de cette extinction est rapide dans le cas du cholestérol, et plus lente dans le cas du campestérol, du stigmastérol, et du ss-sitostérol ou du DHE. Pour étudier le mécanisme induisant cette diminution de la fluorescence, la cryptogéine a été préincubée avec du stigmastérol et les courbes de titration du complexe par le TNS ont été comparées avec celles de la cryptogéine sans stigmastérol. Les formes de ces courbes de titration sont différentes, alors que les valeurs maximales obtenues en présence d'un excès de TNS sont similaires. Ceci suggère comme mécanisme le plus probable une compétition entre le TNS et le stérol, et un déplacement du TNS lié, résultant d'une constante d'association plus importante du stérol. La figure 3A représente les courbes de titration de fluorescence de la cryptogéine avec le TNS Q cryptogéine seule (2,5 pM) cryptogéine pré incubée pendant 5 minutes avec du stigmastérol (2,5 pM). La figure 3B représente les courbes de titration de l'extinction de la fluorescence du TNS fixé à la cryptogéine par différents stérols. Le complexe TNScryptogéine a été titré en présence de cholestérol O, de campestérol , de ss-sitostérol , de déhydroergostérol g et de stigmastérol O, dans le tampon I. L'intensité de la fluorescence du TNS est mesurée après stabilisation du signal, c'est-à-dire au bout de 2 ou 3 minutes. I1 a été vérifié qu'aucune interaction directe entre les stérols et le TNS n'intervenait. Par exemple, quand du cholestérol seul (3 pM) est ajouté à du TNS (7 FM), on n'observe aucun changement dans la fluorescence. Ces résultats montrent que tous les stérols étudiés se fixent à la cryptogéine avec des courbes doseréponse similaires, mais aucun d'entre eux ne peut totalement éteindre la fluorescence du TNS. EXEMPLE 3 : ISOLEMENT D'UN COMPLEXE CRYPTOGEINE STIGMASTEROL. Afin de vérifier que les résultats de fluorimétrie reflètent bien la formation d'un complexe stérol-élicitine, un complexe stigmastérol-cryptogéine a été préparé, puis isolé par filtration sur gel. La cryptogéine a été dissoute dans du tampon I (970 pg pour 948 p1 de tampon) et une solution de stigmastérol dans l'méthanol a été ajoutée lentement (52 pl d'une solution à 1 mg/ml). Après incubation pendant 20 mn, le complexe cryptogéine-stigmastérol est séparé du stérol en excès par filtration sur gel, sur une colonne SEPHADEX G-25 (PHARMACIA) de 125 mg équilibrée avec le tampon I. L'élution des fractions renfermant la protéine est effectuée avec le tampon I, et suivie par mesure de absorption dans 1'UV à 280 nm ; le stérol en excès adsorbé sur la colonne de SEPHADEX est élué par addition d'éthanol au tampon I. Le tableau II ci-dessous regroupe les résultats de deux expériences indépendantes effectuées avec un rapport initial protéine/stérol respectif de rapport initial protéine-stérol 1/1,6a et 1/1,3b. TABLEAU II Quantité Quantité récupérée Rapport initiale cryptogéine 1 stigmastérol nmoles nmoles Fraction 1 2 3 cryptogéinea 97 99 0 0 stigmastérola 155 92 O 66 | 108 cryptogéinb 97 96 0 0 stigmastérolb 126 103 0 41 93 a : rapport initial protéine/stérol = 1/1,6 b : rapport initial protéine/stérol = 1/1,3 La fraction 1 contient le complexe stigmastérol-cryptogéine. La totalité de la cryptogéine initiale est récupérée dans cette fraction. Le rapport molaire cryptogéine-stigmastérol dans le complexe est compris entre 1,08 et 0,93. Ces résultats confirment la stoechiométrie mesurée par fluorimétrie. II - PROPRIETES DE TRANSFERT DES LIPIDES. EXEMPLE 4 : STIMULATION PAR LES ELICITINES DU TRANSFERT DE STEROLS ENTRE DES MICELLES. Pour tester l'activité de transfert de stérols des élicitines, on a mesuré la fluorescence du DHE dans des micelles mixtes, formées à partir de 2 types de micelles contenant respectivement du DHE, ou bien un stérol non-fluorescent. Dans l'eau, le DHE se présente sous forme de micelles avec une concentration critique micellaire de 0,025 pM. Le rendement quantique de fluorescence du DHE sous forme de micelles est faible, du fait d'une autoextinction provoquée par l'interaction entre molécules de DHE. Quand des micelles de stérol non-fluorescent sont ajoutés à des micelles de DHE, un transfert spontané des stérols provoque la formation de micelles mixtes. Ceci conduit à une dilution et à une séparation des molécules de DHE, d'ou résulte une augmentation de la fluorescence du DHE. La figure 4 représente le transfert des stérols entre des micelles de DHE et des micelles de stigmastérol, spontané, ou bien stimulé par les élicitines, et évalué par mesure de la fluorescence du DHE. Les micelles sont préparées dans du tampon II : 10 mM MES (pH 7), 0,02â azide de Na. Les micelles donneur contiennent 0,63 pM de DHE, les micelles accepteur contiennent 3 pM de stigmastérol, dans du tampon II. Le transfert micellaire stimulé est induit par addition de 0,5 ptM de l'élicitine à tester. En début d'expérimentation, toutes les molécules de DHE sont présentes dans des micelles donneur . Quand un excès de micelles de stigmastérol est ajouté à des micelles de DHE dans du tampon II, la fluorescence du DHE augmente progressivement (figure 4, courbe du bas), reflétant l'échange spontané de stérols entre les micelles, qui conduit à une dilution du DHE. Ceci est confirmé en mélangeant préalablement les 2 stérols dans l'éthanol, et en les ajoutant aux mêmes concentrations que ci-dessus : la fluorescence du DHE dans des micelles mixtes est 8 fois plus importante que celle observée dans les micelles ne contenant que du DHE (figure 4, courbe stigmastérol-DHE ) . L'addition de cryptogéine au mélange de donneur (DHE) et d'accepteur (stigmastérol) stimule notablement l'échange, et la fluorescence du DHE atteint un maximum au bout de 4 minutes environ. Les autres élicitines testées sont également capables de promouvoir l'échange des stérols entre les micelles, mais dans une moindre mesure. La cactoréine est moins efficace que la cryptogéine, et l'effet de la capsicéine est très faible. L'augmentation de la fluorescence (9 unités arbitraires en présence de cryptogéine) observée dans cette expérimentation après addition des élicitines au mélange de micelles de DME et de stigmastérol reflète bien la dilution du DHE dans les micelles de stigmastérol, et non la fluorescence du complexe DHEélicitine, qui dans les mêmes conditions, ne représente que 2 unités arbitraires en présence de cryptogéine. En outre, la contribution du complexe DHE-élicitine à la fluorescence totale est négligeable, car il existe une compétition entre le stigmastérol et le DHE pour la fixation à la cryptogéine, et les expérimentations ont été effectuées en présence d'un excès de stigmastérol. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant du cholestérol, à la place du stigmastérol, dans les micelles accepteur EXEMPLE 5 : STIMULATION PAR LES ELICITINES DU TRANSFERT DE STEROLS ENTRE DES MEMBRANES ARTIFICIELLES. Préparation des liposomes Deux types de liposomes ont été préparés : des liposomes donneur contenant de la phosphatidylcholine, de la phosphatidylsérine, et du DHE, des liposomes accepteur contenant de la phosphatidylcholine, de la phosphatidylsérine, et du cholestérol. Les phospholipides et les stérols sont dissous dans du chloroforme. Pour chaque essai, 4,4 mg de phosphatidylcholine, 0,8 mg de phosphatidylsérine et 1,5 mg de stérol (cholestérol ou DHE) sont mélangés ; les solvants sont évaporés sous azote. Ensuite, 1 ml de tampon d'échange (tampon II) est ajouté à la préparation. Le mélange est passé au vortex sous azote, puis soniqué pendant 3 fois 5 minutes à 400C. La suspension de liposomes est centrifugée (150 000 g, 1 heure), et le surnageant contenant les vésicules unilamellaires est utilisé pour les mesures. Le rendement en vésicules unilamellaires, estimé sur la base de la fluorescence du DHE avant et après centrifugation, est d'environ 60%. Etude du transfert de stérols. Le transfert moléculaire de DHE entre les liposomes est visualisé par l'augmentation de la polarisation de fluorescence à l'état stationnaire du DHE dans le mélange donneur/accepteur. Les mesures de polarisation de fluorescence sont effectuées à 250C avec un spectrofluorimètre KONTRON SFM-25 équipé de polariseurs. Les intensités des composantes horizontales et verticales sont déterminées pendant 10 minutes. Les valeurs obtenues en l'absence de DHE sont soustraites. Grâce au transfert d'énergie entre les molécules d La concentration totale des vésicules dans le tampon II est de 140 pg/ml, et la concentration d'élicitine est de 1 pM. O = vésicules donneur + cryptogéine Q = transfert spontané = vésicules donneur + vésicules accepteur + cryptogéine À = vésicules donneur + vésicules accepteur + capsicéine = vésicules donneur + vésicules accepteur + cactoréine = = vésicules donneur + vésicules accepteur + parasiticéine. Ces résultats montrent que - quand on ajoute 1 pM de cryptogéine à 140 pg par ml de liposomes donneur seuls, on n'observe aucun changement de polarisation. - le transfert spontané de stérol provoque une augmentation de polarisation de fluorescence de 0,20 à 0,28. - l'addition d'élicitines au mélange de liposomes donneur et accepteur stimule l'échange des stérols entre les membranes liposomales. Comme dans le cas des expériences de transfert entre micelles, parmi les élicitines testées, c'est la cryptogéine qui stimule le plus efficacement, l'échange de stérol entre membranes artificielles. La cactoréine est moins efficace, et la parasiticéine et la capsicéine ne le sont que faiblement. La présence de phosphatidylsérine augmente la charge de surface négative, ce qui est susceptible d'accroître considérablement l'échange stimulé par une protéine basique de transport de stérols. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'au moins une protéine de la famille des élicitines pour la capture et la fixation de molécules lipidiques, dans un système in vitro ou dans un végétal 2) Utilisation d'au moins une protéine de la famille des élicitines pour l'obtention d'un médicament capable de capturer et de fixer les molécules lipidiques. 3) Utilisation selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites molécules lipidiques sont des stéroïdes, en particulier des stérols. 4) Utilisation selon une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre le transfert desdites molécules lipidiques par ladite protéine de la famille des élicitines.