Brevet FR2764988A1 — publié le 19981224

L'invention concerne un composé conjugué comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive, et au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par un premier matériel biologique, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique. Par molécule organique, on entend une molécule de taille variable ; ainsi on comprend aussi bien une petite molécule telle qu'un haptène, qu'une macromolécule comme un polymère. A titre d'exemple d'un haptène, on peut citer une hormone, une vitamine telle que la biotine ou un médicament. Un polymère tel qu'employé selon l'invention est un polymère sous forme particulaire ou linéaire. I1 peut s'agir d'un homopolymère notamment choisi parmi la polylysine et la polytyrosine, ou bien d'un copolymère notamment choisi parmi les copolymères d'anhydride maléique, les copolymères de N-vinyl-pyrrolidone, les polysaccharides, naturels ou synthétiques, les polynucléotides et les copolymères d'acides aminés comme les enzymes. Avantageusement, c'est un copolymère choisi parmi le copolymère anhydride maléique / méthyl-vinyléther, le copolymère N-vinyl-pyrrolidone / Nacryloxysuccinimide, le poly-6-aminoglucose, et les enzymes comme la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline ou leurs dérivés porteurs d'au moins une fonction réactive. Par fonction réactive de la molécule organique, on entend soit une fonction reactive notamment choisie parmi les fonctions ester, halogénocarbonyle, sulfhydrile, disulfure, époxyde, halogénoalkyle et aldéhyde ; soit une fonction activable par un agent activant comme les carbodiimides ou des composés homo- ou hétérobifonctionnels. A titre d'exemple, une fonction activable est notamment choisie parmi les fonctions acide, amine et hydroxyle. Les sites de liaison par covalence du matériel protéique considéré dans la présente invention, consistent avantageusement en des sites riches en acides aminés choisis parmi la lysine, l'histidine, le tryptophane, la cystéine et les dérivés de ceux-ci. Par dérivés des acides aminés précités, on comprend que ces acides aminés peuvent être chimiquement modifiés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent la spécificité du site de liaison par covalence. A titre d'exemple, on peut citer le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions amines, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy. Les sites de liaison par covalence peuvent exister naturellement dans le matériel protéique. Ou bien ils peuvent être "importés" préalablement dans le matériel protéique, selon des techniques bien connues de l'homme du métier telles que celle employée pour la purification des protéines par le procédé IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) sur des résines (1,2). A titre d'exemple, de tels sites peuvent être incorporés dans un matériel protéique et notamment une protéine, par génie génétique pour obtenir des protéines recombinantes. Les sites peuvent se présenter sous la forme de suites desdits acides aminés, identiques ou différents, contigus ou non, mais voisins. Avantageusement, ledit site de liaison par covalence comprend de 3 à 10 acides aminés, contigus ou non contigus, pour une structure primaire ordonnée du matériel protéique comprenant au moins 30 acides aminés. A titre de variante préférée, il consiste en au moins 3 résidus lysine, de préférence au moins 6 résidus lysine, plus particulièrement, ces résidus sont contigus. Le ou les sites décrits ci-dessus peuvent se trouver à un endroit quelconque de la structure primaire du matériel protéique. De préférence, il est situé sur l'extrémité N- ou C-terminale du matériel protéique. Le composé conjugué de la présente invention comprend un ou plusieurs matériels protéiques, qui peuvent bien évidemment être identiques ou différents. L'invention concerne aussi les applications du composé conjugué défini précédemment, en particulier pour la fixation d'un matériel biologique. Par fixation d'un matériel biologique selon l'invention, on comprend la séparation, l'isolement, la détection et/ou quantification de ce matériel, l'enrichissement d'une fraction en matériel biologique, selon une méthode de fixation spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative. Ainsi d'autres objets de l'invention sont les suivants (1) un réactif pour la fixation d'un premier matériel biologique, comprenant un composé conjugué de l'invention ; ce réactif peut être fixé, directement ou indirectement sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence et/ou être marqué (2) un réactif pour la fixation d'un premier matériel biologique, comprenant au moins deux composés conjugués de l'invention, l'un des deux étant marqué ; de même ce réactif peut être fixé, directement ou indirectement sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence ; ce réactif est particulièrement destiné à la technique "sandwich"; (3) un réactif pour la fixation d'un second matériel biologique susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, comprenant un composé conjugué de l'invention et le premier matériel biologique ; ce réactif peut être fixé, directement ou indirectement sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence et/ou être marqué Le support solide peut se présenter sous toutes formes appropriées telles qu'une plaque, un cône, une bille éventuellement radioactive et/ou fluorescente et/ou magnétique et/ou conductrice, une barrette, un tube de verre, un puits, une feuille, une puce ou analogue. il est choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrènebutadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs dérivés. Un marqueur préféré pour le marquage d'un réactif de l'invention est choisi dans le groupe consistant en une protéine, une enzyme, un anticorps, un peptide, un haptène tel que la biotine et l'iminobiotine, un composé fluorescent tel que la rhodamine, un composé radioactif, un composé chémioluminescent, un composant d'électrodensité, un composant magnétique et analogues. Quand on désigne dans la présente description un matériel biologique, par premier matériel ou second matériel, on ne signifie aucune notion d'ordre, notamment d'ordre dans la fixation dudit matériel. Cette expression sert uniquement à désigner deux matériels qui peuvent être différents, sans exclure le fait qu'ils peuvent être identiques. L'invention concerne aussi (4) un kit pour la détection d'un premier matériel biologique, comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive, et au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par le premier matériel biologique, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique pour former un composé conjugué (5) un kit pour la détection d'un second matériel biologique susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive ; au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par le premier matériel biologique, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique pour former un composé conjugué ; et ledit premier matériel biologique. Selon la présente invention, on définit en outre différents procédés de fixation d'au moins un matériel biologique contenu dans un échantillon - un procédé de fixation d'au moins un premier matériel biologique, comprenant les étapes consistant à (a) disposer d'un réactif (1) ou d'un kit (4), (b) mettre en contact l'échantillon avec ledit réactif ou ledit kit, (c) détecter la formation d'un composé complexe entre le composé conjugué et le premier matériel biologique ; ce procédé peut comprendre en outre l'étape (d) consistant à mettre en contact ledit composé complexe avec un réactif (1) marqué - un procédé de fixation d'au moins un second matériel biologique contenu dans un échantillon et susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) disposer d'un réactif (2) ou d'un kit (5), (b) mettre en contact l'échantillon avec ledit réactif ou ledit kit, (c) détecter la formation d'un composé complexe composé conjugué / premier matériel biologique / second matériel biologique ; ce procédé peut comprendre en outre l'étape (d) consistant à mettre en contact ledit composé complexe avec un réactif (3) marqué Un échantillon tel qu'on l'entend selon l'invention, comprend tout échantillon susceptible de contenir un matériel biologique, notamment un échantillon tel que celui obtenu à partir d'un fluide biologique, un échantillon d'origine alimentaire, ou une culture cellulaire. L'échantillon consiste en tout ou partie d'un autre échantillon, en particulier il peut consister en un aliquote, une dilution. Le composé conjugué défini selon la présente invention peut aussi être destiné à la vectorisation de molécules à intérêt thérapeutique, comme un médicament, un gène synthétique, un oligonucléotide antisens ou un plasmide. il peut aussi être utilisé en thérapie génique. Les caractéristiques et avantages des différents objets de l'invention sont ci-après illustrées, à l'appui des Exemples 1 à 4 et des Figures 1 à 5. La Figure 1 représente un graphe traduisant le rendement de couplage par liaison covalente entre la protéine RH24K (en clair) et la protéine RH24 (en foncé) et le copolymère, pour différentes conditions de couplage ; Acet = acétate ; Phos = phosphate ; Bor = borate ; Carb = carbonate. La Figure 2 représente un graphe de comparaison entre la stabilité en fonction du temps (en jours), du composé conjugué polymère (AMVE) / protéine (RH24K) (courbe ) et celle de la protéine RH24K libre (courbe ). La Figure 3 représente un schéma résumant la technique de détection "sandwich". La Figure 4 représente un graphe traduisant l'immunoréactivité des composés conjugués polymère / RH24 (courbe ), et polymère / RH24K (courbe ), vis-à-vis d'un anticorps monoclonal. La Figure 5 représente un graphe traduisant l'immunoréactivité des composés conjugués polymère / RH24 (courbe ), et polymère / RH24K (courbe ), vis-à-vis d'un sérum. Exemple 1 : Expression et purification de la RH24K: Le pMH24 (Cheynet et al. 1993) a été modifié par insertion d'un adaptateur synthétique en 3' du gène de la p24 en vue d'exprimer la RH24K, correspondant à la RH24 qui présente sur son extrémité C-terminale un site spécifique de liaison par covalence dénommé "queue polylysine" et constitué par 6 résidus lysine contigus. L'adaptateur a préalablement été réalisé par hybridation de deux oligonucléotides ayant respectivement les séquences suivantes SEQ ID NO: 1 5' GGGAAGAAGA AGAAGAAGAA GTCTGTCGAC GAATCTCT 3' SEQ ID NO: 2 5' CTAGAGAGAT TCGTCGACAG ACTTCTrCTT CTTCTTC'UCC C 3' en tampon Tris 10 mM NaCl 50 mM, DTE 1 mM, MgCl2 10 mM pH 7,5, par chauffage à 700C pendant 5 minutes puis refroidissement lent d'abord à 370C pendant 30 minutes puis à température ambiante pendant 30 minutes. Cet adaptateur a ensuite été cloné entre les sites SmaI et XbaI du pMH24 en 3' du gène de la RH24. Le plasmide résultant, le pMH24K3', a été amplifié dans la souche bactérienne E. coli XLI (recAl, endAl, gyrA96, thi-l, hsdRI7, supE44, relAl, lac [F' proAB, lacIPZ & M15, TnlO(tetr)] puis séquencé par la méthode Taq Dye Deoxy Terminator Matrix Standart (Applied Biosystem). La séquence obtenue ainsi que la séquence correspondante sur la protéine obtenue en C-terminal sont données ci-dessous: SmaI S'ATG ccc GGG AAG AAG AAG AAG AAG AAG Nter Met... [247 acides aminés]...Pro Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys XbaI TCT GTC GAC GAA TCT CTC TAG A 3' Ser Val Asp Glu Ser Leu Cter La protéine est exprimée sous le contrôle du promoteur Tac dans la souche bactérienne E. coli XLI (voir ci-dessus). Une préculture de E. coli XLI, contenant le vecteur d'expression, est préalablement effectuée pendant une nuit à 370C dans du Luria broth (LB) en présence d'ampicilline (amp; 50 pg/ml) et de tétracycline (tet; 12 pg/ ml) afin d'ensemencer du milieu LB-amp-tet (1/40 au 1/25); ce dernier est mis en culture jusqu'à obtenir une DO à 600 nm de 0,6. L'expression de la protéine est alors induite par addition dans le milieu de isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration de 1 mM pendant 2h30 à 370C sous agitation. Après centrifugation à 5000 tours/min (rotor JA21, Beckman) pendant 10 minutes à 40C, les bactéries sont reprises dans un tampon Tris-HCl 50 mM EDTA, 1 mM NaCl 100 mM MgC12 10 mM pH 8 (3 ml/g de biomasse) en présence d'inhibiteur de protéase (aprotinine 2 Zg/ml et leupeptine 2 pg/ml) puis lysées par sonication à 0 C. La fraction soluble est reprise par centrifugation à 10 000 tours/min (rotor JA21, Beckman) pendant 15 minutes à 4"C puis déposée sur une colonne d'affinité par chélation métallique en vue de la purification de la RH24K (Chelating Sepharose Fast Flow no. 17057501). Le gel a préalablement été chargé en Zn2+ suivant les recommandations du fournisseur puis équilibré en tampon phosphate de sodium 67 mM NaCl pH 7,8 en vue de la purification. Après dépôt du surnageant, la colonne est successivement lavée par un tampon phosphate de sodium 67 mM NaCl pH 7,8 puis acétate d'ammonium 200 mM NaCl 0,5 M pH 6. La RH24K est éluée par l'acétate d'ammonium 200 mM NaCl 0,5 M pH 4. Les fractions recueillies sont dialysées contre du tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7,8. La protéine purifiée est caractérisée par électrophorèse sur SDS-PAGE et par passage en gel filtration / HPLC. Sa pureté est supérieure à 90 % donc comparable à la pureté de la RH24. Analysée en spectrométrie de masse, son poids moléculaire est de 28027 compatible avec le poids moléculaire théorique 27992. La protéine est reconnue par des anticorps anti-p24 polyclonaux et monoclonaux en Western Blot et en ELISA. ExemPle 2 : Couplage de la RH24R et de la RH24 sur le copolymère AMVE A une solution de protéine dans un tampon approprié, à la concentration de 1 g/l, on ajoute 5 l de solution de polymère à la concentration de 1 g/l. Le milieu réactionnel est agité 3 heures à 370C. L'avancement de la réaction est suivi en HPLC, sur une colonne d'exclusion stérique Waters avec comme phase mobile un tampon phosphate 0,1 M pH 6,8. Les rendements de couplages rapportés sur la figure 1 montrent que la protéine modifiée se couple préférentiellement au polymère et dans un plus large spectre de conditions expérimentales. Exemple 3 : Effet de la nature du polymère sur le rendement de coulage L'effet de la nature du comonomère entrant dans la composition du polymère est évalué dans les mêmes conditions que celles décrites ci dessus. Les résultats sont rapportés dans le tableau cidessous. TABLEAU Polymère Rendement de couplage (%) AMVE 65 poly(méthylvinylether/anhydride maléique) PEAM 86 poly (éthylène/anhydride maléique) SAM 49 poly(styrène/anhydride maléique) NVPAM 36 poly(N-vinylpyrrolidone/anhydride maléique) L'effet du comonomère est assez prononcé puisque les rendements de couplage varient dans un domaine compris entre 36 et 86 % selon la nature du comonomère. ExemPle 4 : Stabilité comParée des composés conjugués protéines/polymères vis-à-vis de la protéine seule Les composés conjugués ont été stockés à 370C dans le milieu de couplage et analysés par chromatographie d'exclusion stérique afin d'évaluer la quantité de protéine résiduelle dans le milieu de couplage. Les résultats sont rapportés dans le graphe représenté sur la Figure 2. Le couplage sur polymère confère ainsi à la protéine une meilleurs stabilité au stockage. ExemPle 5 : Biotinylation orientée de la RH24K Les composés conjugués réalisés sont des p24 (RH24 ou RH24K) biotinylées qui seront utilisés en détection dans le test sandwich antigène p24, conformément au schéma représenté sur la Figure 3. Les couplages de la biotine sont effectués sur la RH24K et sur la RH24, contrôlés, puis analysés en test sandwich antigène de manière à définir des conditions de couplage favorables à la RH24K. Les protéines sont utilisées à une concentration de 1 mg/ml. Différents tampons ont été testés sur la base des tampons testés lors des couplages p24 I AMVE : borate 0,1 M pH 9,2, Tris 0,1 M pH 7,2, phosphate 0,1 M pH 7,2 et carbonate 0,1 M pH 8,5. Les rapports biotine / p24 suivants ont été testés: 5/1, 10/1, 25/1, 50/1, 100/1. Les couplages ont été incubés pendant 1 heure à 37"C. Les composés conjugués p24 / biotine ont été utilisés en détection suivant le schéma représenté sur la Figure 3 avec des anticorps monoclonaux et un sérum positif. Les composés conjugués RH24 / biotine et RH24K / biotine montrent une activité en test sandwich antigène avec les anticorps monoclonaux et le sérum positif. A titre d'illustration, les Figures 4 et 5 montrent sous la forme de graphe, les réponses comparées des composés conjugués obtenus avec la RH24K et la RH24 à différents taux de fonctionnalisation en biotine. La Figure 4 concerne les résultats obtenus avec un anticorps monoclonal, test pratiqué en plaque de micro-titration. La Figure 5 représente les résultats obtenus sur sérum avec l'automate d'immunoanylyse Vidas de bioMérieux. La RH24K présente un signal supérieur à celui de la RH24 quelles que soient les conditions expérimentales testées. On observe un rapport biotine / p24 optimal de 25 / 1 pour les anticorps monoclonaux, et de 10 / 1 pour le sérum. BIBLIOGRAPHIE (1) Porath J., Carlsson., Olsson., Belfrage J., Nature, 258, 598 (1975) (2) Porath J., Trends Anal. Chem., 7, 254 (1988) (3) Cheynet, Protein Expression and Purification, 4, 367 372 (1993) REVENDICATIONS 1. Composé conjugué comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive, et au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par un premier matériel biologique, caractérisé en ce que ledit matériel protéique possède un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique. 2. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule organique est un haptène. 3. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule organique est un polymère, particulaire ou linéaire. 4. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les homopolymères tels que la polylysine, la polytyrosine ; et les copolymères tels que les copolymères d'anhydride maléique, les copolymères de N-vinyl-pyrrolidone, les polysaccharides, naturels ou synthétiques, les polynucléotides et les copolymères d'acides aminés comme les enzymes. 5. Composé conjugué selon la revendication 4 caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi le copolymère anhydride maléique / méthyl-vinyl-éther, le copolymère N-vinyl-pyrrolidone / N-acryloxysuccinimide, le poly-6-aminoglucose, la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline. 6. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit site de liaison par covalence consiste en un site riche en acides aminés choisis parmi la lysine, l'histidine, le tryptophane, la cystéine et les dérivés de ceux-ci. 7. Composé conjugué selon la revendication 6, caractérisé en ce que le site de liaison est placé sur l'extrémité N- ou C-terminale du matériel protéique. 8. Composé conjugué selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit site de liaison par covalence comprend de 3 à 10 acides aminés, contigus ou non contigus, pour une structure primaire ordonnée du matériel protéique comprenant au moins 30 acides aminés. 9. Composé conjugué selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit site de liaison par covalence consiste en au moins 3 résidus lysine, de préférence au moins 6 résidus lysine. 10. Composé conjugué selon la revendication 9, caractérisé en ce que les résidus lysine sont contigus. 11. Composé conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fonction réactive de la molécule organique est choisie parmi les fonctions ester, acide, halogénocarbonyle, sulfhydrile, disulfure, époxyde, halogénoalkyle et aldéhyde. 12. Réactif pour la fixation d'un premier matériel biologique, comprenant un composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 13. Réactif selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est fixé, directement ou indirectement, sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence. 14. Réactif selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que le composé conjugué est marqué. 15. Réactif selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux composés conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, l'un des deux étant marqué. 16. Réactif pour la fixation d'un second matériel biologique susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, comprenant un composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à Il et le premier matériel biologique. 17. Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est fixé, directement ou indirectement, sur un support solide, par adsorption passive ou par covalence. 18. Réactif selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que le composé conjugué est marqué. 19. Réactif selon la revendication 14 ou 18, caractérisé en ce que le conjugué est marqué par un marqueur choisi dans le groupe consistant en une enzyme, une protéine, un peptide, un anticorps, un haptène tel que la biotine, l'iminobiotine, un composé fluorescent tel que la rhodamine, un composé radioactif, un composé chémioluminescent, un composant d'électrodensité, un composant magnétique et analogues. 20. Kit pour la détection d'un premier matériel biologique, comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive, et au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par le premier matériel biologique, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique pour former un composé conjugué. 21. Kit pour la détection d'un second matériel biologique susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, comprenant une molécule organique ayant au moins une fonction réactive ; au moins un matériel protéique susceptible d'être reconnu spécifiquement par le premier matériel biologique, ledit matériel protéique possédant un site spécifique de liaison par covalence à la fonction réactive de la molécule organique pour former un composé conjugué ; et ledit premier matériel biologique. 22. Procédé de fixation d'au moins un premier matériel biologique contenu dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (a) disposer d'un réactif selon la revendication 12 ou 13, ou d'un kit selon la revendication 20, (b) mettre en contact l'échantillon avec ledit réactif ou ledit kit, (c) détecter la formation d'un composé complexe entre le composé conjugué et le premier matériel biologique. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape (d) consistant à mettre en contact ledit composé complexe avec un réactif selon la revendication 14. 24. Procédé de fixation d'au moins un second matériel biologique contenu dans un échantillon et susceptible d'interagir avec un premier matériel biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : (a) disposer d'un réactif selon la revendication 16 ou 17, ou d'un kit selon la revendication 21, (b) mettre en contact l'échantillon avec ledit réactif ou ledit kit, (c) détecter la formation d'un composé complexe composé conjugué / premier matériel biologique / second matériel biologique. 25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape (d) consistant à mettre en contact ledit composé complexe avec un réactif selon la revendication 18. 26. Utilisation d'un composé conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour la vectorisation de molécules à intérêt thérapeutique telle qu'un médicament, un gène synthétique, un oligonucléotide antisens ou un plasmide.