Brevet FR2767537A1 — publié le 19990226

Gène codant pourl'androctonine. vecteur le contenant et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour l'androctonine, un vecteur la contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme. L'invention concerne plus particulièrement la transformation des cellules végétales et des plantes. I'androctonine produite par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique. Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies. On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques. L'androctonine est un peptide produit par les scorpions de l'espèce Androctonus australis. Sa préparation par synthèse chimique est décrite par Ehret-Sabatier & coll., de même que ses propriétés antifongiques et antibactériennes in vitra. Après avoir d'abord identifié le gène de l'androctonine, on a également trouvé qu'il pouvait être inséré dans un organisme hôte, en particulier une plante, pour exprimer l'androctonine et conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus. L'invention a donc d'abord pour objet un fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine, un gène chimère comprenant ledit fragment codant pour l'androctonîne ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier dans les plantes et un vecteur pour la transformation des organismes hôtes contenant ce gène chimère, et l'organisme hôte transformé. Elle concerne aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellules en particulier régénérée à partir de cette cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour l'androctonine au moyen d'un vecteur approprié. Par androctonine, on entend selon l'invention tout peptide comprenant essentiellement la séquence peptidique de 25 acides aminés décrite par Ehret-Sabatier & cois. ainsi que les séquences homologues équivalentes dans lesquelles certains acides aminés sont remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique décrite par Ehret-Sabatier & coll., on entend non seulement landroctonine mature décrite dans cette demande et définie par l'identificateur de séquence n" 1 (SEQ ID NO 1), mais également une telle séquence comprenant à l'une ou l'autre de ses extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à son expression et ciblage dans un organisme hôte, en particulier une cellule végétale ou une plante. La présente invention concerne donc d'abord un fragment d'acide nucléique, en particulier d'ADN, codant pour l'androctonine. n peut s'agir selon l'invention d'un fragment isolé de Androctonus australis, ou encore un fragment dérivé, adapté pour l'expression de l'androctonine dans l'organisme hôte où le peptide sera exprimé. le fragment d'acide nucléique peut être obtenu selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel & coll. Selon la présente invention, on entend par fragment d'acide nucléique une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, en particulier ADNc, notamment double brin. Selon un mode de réalisation de l'invention, le fragment d'acide nucléique codant pour l'androctonine est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n" 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence, plus particulièrement la partie codante de cette SEQ ID NO1, correspondant aux bases 1 à 75. Par homologue , on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par l'identificateur de séquence n" 1 et codant pour l'androctonine. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par l'identificateur de séquence n" 1 et l'homologue peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit d'un fragment d'ADN de taille inférieure à 100 acides nucléiques, réalisable par synthèse. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de l'androctonine résultante. La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végéales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins un fragment d'ADN codant pour l'androctonine tel que défini ci-dessus. Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou suppérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'androctonine. n s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, ou de préférence des cellules végétales et des plantes. Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences. On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc. Les éléments de régulation nécessaires à l'expression du fragment d'ADN codant pour l'androctonine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier. Le fragment d'acide nucléique selon l'invention peut également comprendre une séquence d'acide nucléique fusionnée en 5' et/ou en 3' à la séquence codant pour l'androctonine, de manière à obtenir une protéine de fusion protéine-androctonine , dont la coupure par les systèmes enzymatiques de l'organisme hôte permet la libération de l'androctonine. Cette protéine fusionnée à l'androctonie peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'androctonie de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de tissus ou dans la matrice extracellulaire. Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial. lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être un signal N-terminal ou prépeptide , éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique. ou un peptide d'adressage vacuolaire ou propeptide . Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par la machinerie cellulaire des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal. L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes. Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inducible par les pathogènes comme PR-la du tabac ou AoPRT-L d'asperge, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698. Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, ctest à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909. Comme peptide de transit, on peut citer le peptide signal du gène PR-la du tabac décrit par Cornelissen & coll., réprésenté avec sa séquence codante par l'identificateur de séquence n" 2. La séquence codant pour la protéine de fusion peptide signal PR-la-androctonine et cette protéine de fusion sont également partie de la présente invention. Cette séquence est notamment décrite par l'identificateur de séquence n" 3, plus particulièrement la partie codante de cette séquence, correspondant aux bases 12 à 176. Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrohactenum tumetåcien.v, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317. Selon la présente invention, le gène chimère peut également comprendre un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. I1 pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, comme la pénicilline, ou encore un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes. La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transforrnés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide. L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention. Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante. La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant une quantité efficace d'un gène chimère comprenant une séquence codante pour l'androetonine définie ci-dessus. La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques ou bactériennes. De ce fait, la séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut être intégrée avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies androctonine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea, Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Clndosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinnamomi. Dans ce cas, le gène chimère pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides. La séquence d'ADN codant pour l'androctonine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides. De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103. Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour l'androctonine, d'autres séquences hétérologues codant pour d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique. Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour l'androctonine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt. Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pourl'androctonine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt. Parmi les séquences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer celle codant pour la drosomycine, décrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et par Fehlbaum & coll. (1994), et dans la demande de brevet non publiée FR 97 09115 déposée le 24juillet 1997. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation de la séquence codant pour l'androctonine, du gène chimère, du vecteur d'intégration et des plantes transformées. Les figures I à 5 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques. Exemple 1: Construction des gènes chimères Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & coll. pRPA-MD-P: Création d'un plasmide contenant le signal peptide du gène PR-la du tabac. Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 1 et Oligo 2 ciaprès, sont hybridés à 65 "C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30"C pendant 30'. Oligol: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' Oligo2: 5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3' Après hybridation entre l'Oligo 1 et l'Oligo 2, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et NaeI et cloné dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour peptide signal du gène PR-la du tabac (SEQ ID NO 2). pRPA-PS-PRla-andro: Création d'une séquence codant pour l'androctonine fusionée au signal peptide PR-la sans région non transcrite en 3'. Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 3 et Oligo 4 selon les conditions opératoires décrites pour pRPA-MD-P. Oligo3: 5' AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG GTGG 3' Oligo4: 51 CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 3' Après hybridation entre l'Oligo 3 et l'Olîgo 4, 1'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin à partir de l'extrémité 3' de chaque oligo. Cet oligonucléotide double brin contenant la partie codante de l'androctonine (SEQ ID NO 1) est ensuite cloné directement dans le plasmide pRPA-MD-P qui a été digéré avec l'enzyme de restriction Napel. L'orientation correcte du clone obtenu est vérifiée par séquençage. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine située entre les sites de restriction Nicol à l'extrémité N-terminale et Scat, Sacll et BamHI à l'extrémité C-terminale (SEQ ID NO 3). pRPA-RD-238: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine. Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du Dr. Jim Carrington (Texas A & M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll., 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la ss-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de l'ARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985). Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction NcoI et BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-PS-PRla-andro est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétise une protéine de fusion PR- i a-androctonine. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. PR-laandroctonine représente la région codante pour la protéine de fusion PR-la-androctonine de pRPA-RD-230. L'androctonine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action du peptide signal PR-la. pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié. Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complementaires Oligo 5 et Oligo 6 ci-après. sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P. OligoS: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3' Oligo6: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3' L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et Hindlll et rendu bouts francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrnbactenum tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 3. pRPA-RD-233: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-androctonine de pRPA-RD-230 dans pRPA-RD-195. Le plasmide pRPA-RD-230 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Hindili et déphosphorylé avec la phosphatase intestinale de veau. pRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-1SOA (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909). Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRI de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et un site de clonage multiple entre ces deux gènes. La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 4. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD174. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-MD-P. Oligo7: 5' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3' Oligo8: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3' L'oligonucléotide double brin hybridé (95 paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme de restriction Xmal, et le grand fragment d'ADN est purifié. Les deux fragents d'ADN obtenus sont ensuite liés. On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection. La structure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 5 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" et "LB" ont la même signification que pour la figure 4. pRPA-RD-236: Création d'un vecteur d'Agrobaaertum tumefaciens contenant la construction du gène codant pour l'androctonine dirigée vers la matrice extracellulaire. La plasmide pRPA-RD-233 est digéré avec les enzymes de restriction PmeI et Asci et le fragment d'ADN contenant le gène de PR-la-androctonine est purifié. Le plasmide pRPA-RD-184 est digéré avec les même enzymes de restriction. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-androctonine est ensuite liée dans pRPA-RD184. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion PR-la-androctonine qui conduit à l'expression de l'androctonine dans la matrice extracellulaire de la plante. Exemi > ie 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés. 2.1- Transformation Le vecteurs pRPA-RD-236 est introduit dans la souche d'Agrobacterium rurnfilciens EH101 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll. (1985). 2.2- Régénération La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/i de saccharose ainsi que 200 llg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et régénérées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/l de saccharose contenant 0,05 mg/l d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. 2.3- Tolérance au bromoxynil Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour la construction pRPA-RD-236. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare. Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont ensuites employées dans différentes expérimentations qui montrent que l'expression de l'androctonine par les plantes transformées les rend résistantes aux agressions fongiques. KEFERENCES Ausubel F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons. Bevan, M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385. Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597. Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544. Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231. Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907. Komari & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94. Rothstein & coll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105. Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314. Odell, J.T. & coll. (1985). Nature 313:810-812. LISTE DE SEQUENCES II) INFRMTTONS GENERALES: (ici) NOMBRE DE SEQUENCES: 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 110 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1..75 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG GGT GGT TGC 48 Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys 1 5 10 15 TAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG 95 Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr 20 25 TGTCGACGGA TCCGG 110 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 106 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:12..101 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GCGTCGACGC C ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT 50 Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu 1 5 10 CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 98 Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg 15 20 25 GCC GGCGA 106 Ala 30 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 211 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NON/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:12..176 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GCGTCGACGC C ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT 50 Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu 1 5 10 CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 98 Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg 15 20 25 GCC AGG TCC GTG TGC AGG CAG ATC AAG ATC TGC AGG AGG AGG GGT GGT 146 Ala Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly 30 35 40 45 TGC TAC TAC AAG TGC ACT AAC AGG CCA TAC TGAGCTCGGC GAGGCGAACG 196 Cys Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr 50 55 TGTCGACGGA TCCGG 211 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 75 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 1" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 60 CTCTTCTTCT TTTCC 75 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 72 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 2" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60 AAAGATGGAA GC 72 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléeotide synthétique 3" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG GTGG 44 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 97 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 4" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG GCCTGTTAGT GCACTTGTAG 60 TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 97 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 85 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 5" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60 CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucl,ique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 6" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60 TAGAGG 66 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire Il ;, TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 7" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 93 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucléotide synthétique 8" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60 GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 93 REVENDICATIONS 1. Fragment d'acide nucléique. caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant pour l'androctonine. 2. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence nucléotidique de type ADN, en particulier ADNc. 3. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique de type ADN est la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n" 1 (SEQ ID NO 1), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence. 4. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique de type ADN est la partie codante de la SEQ ID NO 1, correspondant aux bases 1 à 75. 5. Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique fusionnée en 5' et/ou en 3' à la séquence codant pour l'androctonine, de manière à obtenir une protéine de fusion protéine-androctonine . 6. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la protéine est un peptide signal ou un peptide de transit. 7. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le peptide signal est le peptide signal du gène PR-la du tabac. 8. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN décrite par l'identificateur de séquence n" 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou une séquence complémentaire de ladite séquence. 9. Fragment d'acide nucléique selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la partie codante de la SEQ ID NO 3, correspondant aux bases 12 à 176. 10. Protéine de fusion protéine-androctonine , caractérisée en ce que la protéine est un peptide signal ou un peptide de transit. 11. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que le peptide signal est le peptide signal du gène PR-la du tabac. 12. Protéine de fusion selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est décrite par I'identificateur de séquence n" 3 (SEQ ID NO 3). 13. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les plantes, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins un fragment d'ADN codant pour l'androctonine tel que défini dans les revendications 1 à 9. 14. Gène chimère selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les cellules végétales et les plantes. 15. Gène chimère selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend également un marqueur de sélection. 16. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte craractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication et au moins un gène chimère tel que défini dans les revendications 13 à 15. 17. Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. 18. Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide. 19. Organismes hôtes transformés, caractérisés en ce qu'ils contiennent une quantité efficace d'un gène chimère selon les revendications 13 à 15. 20. Organisme hôte transformé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit de cellules végétales ou de plantes. 21. Organisme hôte transformé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une plante contenant des cellules transformées. 22. Organisme hôte selon la revendication 21, caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir des cellules transformées. 23. Cellule végétale transformée, caractérisée en ce qu'elle contient un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon les revendications 13 à 15. 24. Plante transformée résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellule végétale transformée selon la revendication 23. 25. Plante transformée selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle est résistante aux maladies causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea, Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora cinnamomi. 26. Procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales ou des plantes, caractérisé en ce que l'on insère dans ledit organisme hôte au moins un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon l'une des revendication 13 à 15. 27. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies fongiques ou bactériennes, caractérisé en ce que l'on insère dans la plante au moins un fragment d'acide nucléique selon les revendications 1 à 9 ou un gène chimère selon les revendications 13 à 15. 28. Procédé selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que le, gène chimère est inséré au moyen d'un vecteur selon l'une des revendications 16 à 18.