Brevet FR2762842A1 — publié le 19981106

La présente invention est relative à un procédé de détection de la présence de matières biologiques d'origine bovine dans un échantillon de matière organique. Elle a en outre pour objet des oligonucléotides pour la mise en oeuvre de ce procédé. En 1986, I'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB), ou maladie de " la vache folle ", fut mise en évidence pour la première fois dans le cheptel bovin britannique. Depuis, plus de 100.000 cas cliniques ont été identifiés chez le bétail. Cette maladie présente en Grande Bretagne une évolution endémique. Elle a été aussi observée dans différents pays européens: Irlande, Suisse, France, Danemark, io Allemagne - o elle évolue de façon sporadique. Le tableau clinique de la maladie est connu. L'agent infectieux responsable, appelé " prion " est caractérisé, entre autres propriétés, par une extrême résistance aux agents décontaminants classiques tels que la température, les radiations ou les détergents. Des études récentes ont par ailleurs montré la très grande résistance de i5 I'agent infectieux dans les conditions " naturelles " et en particulier sa persistance dans les pâtures. Ainsi, I'infectiosité peut persister dans le sol pendant au moins trois ans. Un des modes de transmission de l'agent infectieux est l'ingestion d'aliments contaminés, cette transmission pouvant par ailleurs se faire d'une espèce animale à l'autre. L'analyse des données épidémiologiques a permis de découvrir l'origine de l'épidémie anglaise, due à une contamination par l'agent infectieux de farines de viandes et d'os (FVO) utilisées pour la fabrication d'additifs alimentaires destinées à l'alimentation des vaches laitières. Ces farines sont des sous-produits des ateliers d'équarrissage, issus du traitement de carcasses et des déchets provenant des abattoirs. La structure du " prion " n'est pas connue à ce jour, et il n'existe aucun test permettant de le détecter. 2 2 Il est donc important de déterminer si une matière organique comprend des matières biologiques d'origine bovine, et est susceptible de contenir des " prions ". Dans le domaine agro-alimentaire, la caractérisation d'espèces animales a d'abord fait appel aux techniques biochimiques d'analyse des protéines (BARA et al. 1992, Trends in Food Science and Technology, 3, 69-72; SOTELO et al.1993 Trends in Food Science and Technology, 4, 395-401; HERNANDEZ et al. 1994 Food and Agricultural Immunology, 6, 95-104). Ces méthodes sont cependant peu spécifiques (électrophorèse) ou sont incompatibles avec la dénaturation des échantillons à analyser (immunoanalyse). Elles sont maintenant progressivement remplacées par les io techniques d'analyse de l'ADN, molécule moins sensible que les protéines aux conditions physico-chimiques dénaturantes. L'identification des principales espèces animales d'intérêt a tout d'abord été effectuée par la technique d'hybridation de sondes nucléiques (BUNTJER et al. 1995, Zeitschrift fuer Lebensmittel Untersuchung und Forschung 201 (6):577-582; MEYER et i5 al., 1994, Fleischwirtschaft 74 (11): 1237-1238; TSUMURA et al. 1992, Journal of Japanese Society of Food Science and Technology 39 (1) 60-63; EBBEHOJ et THOMSEN, 1991, Meat Science 30(4): 359-366; BAUER et al., 1987, Archiv fuer Lebensmittelhygiene 38 (6): 172-174; EBBEHOJ et THOMSEN, 1991, Meat Science (3): 221-234). Cette technologie, d'utilisation délicate, est maintenant supplantée par la méthode de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) qui a été utilisée pour caractériser, dans des aliments cuits ou transformés, des matières biologiques issues de diverses espèces animales. Les seules méthodes d'amplification par PCR décrites chez le boeuf (Bos taurus) font appel à l'amplification de la région de l'ADN mitochondrial (ADNmt) codant pour le cytochrome c au moyen d'amorces de PCR reconnaissant des séquences conservées chez les espèces vertébrées, puis à leur caractérisation au moyen d'enzymes de restriction (RFLP) ou par séquençage (MEYER et al. 1995, Journal of AOAC - International 78(6): 1542-1551; CHIKUNI et al. 1994, Animal Science and Technology, 65(6): 571-579; GUGLICH et al. 1994, J. Forensic. Sci. 39(2):353-61). L'organisation et la sequence complète de l'ADN mitochondrial (ADNmt) bovin sont connues (ANDERSON et al. 1982, Journal J. Mol. Biol. 156(4): 683-717). A partir de ces données, plusieurs travaux ont été consacrés à l'étude de la variabilité génétique du génome mitochondrial de bovidés domestiques par analyse de polymorphisme de restriction (CHEN et al. 1995, Comp-Biochem-Physiol-BBiochem- Mol-Biol. 111(4):643-9; KIKKAWA et al. 1995, Biochem-Genet. 33 (1-2): 5160; BRADLEY et al. 1994, Anim-Genet. (4): 265-71; AMANO et al. 1994, AnimGenet. io 25(1): 29-36; SUZUKI et al. 1993, Anim-Genet 24(5): 339-43; LAN et al. 1993, I. CHUAN-Hsueh-Pao 20(5); 419-25; BHAT et al. 1990, Biochem- Genet 28 (7-8): 311-8) ou par séquençage (LOFTUS et al. 1994, Proc-Natl- Sci-USA 91(7): 2757-61; RON et al., (1993, Anim-Genet 24(3): 183-6). Le séquençage partiel de la région de l'ADNmt bovin codant pour l'ARN 12 S a été effectué par ailleurs pour diverses races bovines européennes (Bos taurus), africaines et indiennes (Bos indicus), (LOFTUS et al., 1994, précédemment cités). Des informations plus complètes sur les séquences de la région de contrôle de l'ADNmt (D loop) ont aussi été obtenues pour plusieurs de ces races (Bos indicus Butana, Bos indicus Hariana, Bos indicus Kenana, Bos indicus Tharparkar, Bos indicus White Fulani, Bos taurus Aberdeen Angus, Bos taurus Charolais, Bos taurus Friesian, Bos taurus Hereford, Bos taurus Jersey, Bos taurus N'Dama, Bos taurus Simmental) (BRADLEY et al. 1996 Proc-Natl-Acad. Sci. USA 93:5131-5135). Il ressort donc de l'étude de l'état de la technique que des travaux d'analyses de l'ADN génomique de certaines espèces et races bovines, ont déjà été effectués. Néanmoins, aucun des documents de l'état de la technique ne décrit de méthode spécifique et sensible d'amplification d'ADN bovin, permettant d'identifier des traces de matières biologiques d'origine bovine, applicable à toutes les races bovines et dans des matières organiques présentant des compositions très variées. 2 4 En effet, les seules techniques d'identification d'ADN bovin comprennent une amplification suivie d'une caractérisation au moyen d'enzymes de restriction (PCR- RLFP). Ces techniques présentent des inconvénients majeurs. Tout d'abord, elles nécessitent une étape de digestion de l'ADN amplifié, à l'aide d'enzymes de restriction, ce qui alourdit considérablement les protocoles. En outre, l'interprétation des résultats de ces techniques nécessite obligatoirement la comparaison par rapport à un échantillon témoin, issu de l'animal auquel on attribue l'origine de l'échantillon à tester. Enfin, il est difficile d'analyser des mélanges d'ADN issus de différents animaux, du fait du grand nombre de bandes, et des difficultés d'interprétation liées à cette io caractéristique. Le problème de l'identification de matières issues de toutes les espèces bovines est particulièrement crucial, car l'Encéphalite Spongiforme Bovine ne se limite pas aux races bovines européennes mais s'étend aux races africaines et indiennes. Le demandeur s'est donc attaché à résoudre ces problèmes. Il a montré que l'on pouvait détecter de manière spécifique et simple, et avec une grande sensibilité, la présence de matières biologiques d'origine bovine, quelle que soit la race bovine, dans des échantillons de matières biologiques, en amplifiant de manière spécifique une séquence déterminée du génome bovin. Dans sa forme la plus générale, la présente invention est donc relative à un procédé d'obtention d'un fragment d'ADN bovin unique et présentant une taille et une séquence déterminées, spécifique de la famille des bovidés, et en particulier de l'espèce Bos taurus, à partir d'un échantillon de matière organique, procédé dans lequel on amplifie par réaction de polymérisation en chaîne une séquence déterminée du génome bovin présente dans les génomes de toutes les espèces de ladite famille mais absente dans les génomes des autres espèces animales. La présente invention a en outre pour objet un procédé de détection de la présence de matières biologiques d'origine bovine dans un échantillon de matière organique caractérisé en ce que l'on détermine la présence d'ADN spécifique d'origine bovine dans ladite matière organique par amplification d'une séquence d'ADN déterminée du génome bovin. On entend par matière organique toute matière solide ou liquide que l'on suppose avoir au moins partiellement une origine organique. Avantageusement, la séquence d'ADN est d'origine mitochondriale. Le choix d'une séquence mitochondriale est particulièrement avantageux, car l'ADN, mitochondrial est plus résistant à la dégradation que l'ADN nucléaire. Il peut donc être plus sûrement détecté dans des matières organiques dans lesquelles l'ADN est soumis à divers facteurs physiques (température, pression.....) chimiques ou biochimiques i0 tendant à sa dégradation. En outre il y a environ 100 à 1000 copies d'ADN mitochondrial pour une copie d'ADN nucléaire, ce qui compense les éventuelles dégradations. Cette particularité se révèle particulièrement importante quand on cherche à détecter la présence de matières biologiques d'origine bovine dans des matières ]5 organiques qui ont subi de nombreuses transformations, telles que les farines utilisées pour l'alimentation du bétail, les composts, les engrais et les fumiers. Préférentiellement l'amplification de l'ADN est effectuée par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), comprenant une répétition d'un cycle constitué par les étapes suivantes: - séparation des brins à amplifier, par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon de matière organique, - hybridation des amorces à une température adéquate, et - élongation par une polymérase à une température adéquate. De manière particulièrement préférentielle, I'une des amorces est un oligonucléotide présentant une identité de séquence d'au moins 80% préférentiellement d'au moins 90% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides comprise dans la séquence SEQ ID N 1 suivante: TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT 2 6 2762842 Cette première amorce peut être en particulier un oligonucléotide, ou un mélange d'oligonucléotides, comprenant la séquence SEQ ID N 2 suivante: YTATCATTATGCTGG dans laquelle Y est T ou C. Elle est préférentiellement un oligonucléotide, ou un mélange d'oligonucléotides, présentant la séquence SEQ ID N 3 suivante: CATGCYTATCATTATGCTGG(PBR6) dans laquelle Y est T ou C. La seconde amorce est un oligonucléotide caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90%, avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides comprise dans la séquence SEQ ID N 4 suivante: ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG Un tel oligonucléotide est préférentiellement celui comprenant la séquence SEQ ID N 5 suivante: TAAGCAAGTACATGA ou encore préférentiellement celui présentant la séquence SEQ ID N 6 suivante: GCATATAAGCAAGTACATGA (PBF9) Cette seconde amorce peut aussi consister en un mélange d'oligonucléotides tels que décrits ci-dessus. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement avantageux de la présente invention, au moins une partie des étapes d'hybridation des cycles constituant la réaction d'amplification est effectuée à une température d'environ 51 C. Un tel mode de mise en oeuvre permet d'obtenir une plus grande spécificité d'amplification. Néanmoins, I'hybridation peut aussi être effectuée à une température différente, bien que comprise entre 50 et 55 C environ. La spécificité de la réaction s'en trouve cependant diminuée. On notera à ce sujet que le demandeur a résolu un certain nombre de problèmes techniques pour la mise en oeuvre de ce procédé. Tout d'abord, le choix 1o des amorces constituait un réel problème, car il fallait sélectionner des séquences d'une part communes aux différentes races bovines, et d'autre part s'hybridant de manière stable, dans des conditions physico-chimiques très variables représentatives de la grande variabilité des matières organiques susceptibles de contenir des matières biologiques d'origine bovine. En outre, le demandeur a trouvé qu'une température d'environ 51 C était particulièrement appropriée pour obtenir une amplification spécifique. Les températures des étapes de séparation des brins et d'élongation sont avantageusement respectivement d'environ 94 C et 72 C. Le procédé décrit ci-dessus est spécifique car il ne donne aucune réaction d'amplification détectable en présence d'ADN d'origine autre que bovine. Il ne donne naissance qu'à un fragment d'ADN comprenant environ 480 paires de bases. Ce fragment oligonucléotidique constitue un autre objet de la présente invention: Il présente avantageusement une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% avec la séquence SEQ ID N 8 suivante: GCATATAAGC AAGYACATRA YYYCTAYAVY AGTACATAAY RCATAYAATT ATTRAYYGTA CATAGTACAT TATRTCAAAY YCATYCTYRA YARYATATYT AYYATATAYY YCYTNCCAYTAGATCACGAG CTTAAYTACC ATGCCGCGTG AAACCARCAA CCCGCTRRGC AGNGGATCCCTCTTCTCGCT CCGGGCCCAT ARAYYGTGGG 2 8 GGTCGCTATY YARTGAAYTT TAYCAGGCAT CTGGTTCTTT CTTCAGGGCC ATCTCATCTA AARYRGTCCA TTCYTTCCTC TTAAATAAGA CATCTCGATG GACTAATGRC TAATCAGCCC ATGCTCACAC ATAACTGTGY TGTCATACAT TTGGTATTTT TTTATTTTGG GGGATGCTTG GACTCAGCTA TGGCCGTCAA AGGCCCTGAC CCGGAGCATC TATTGTAGCT GGACTTAACT GCATCTTGAG CACCAGCATA ATGATARGCR TG L'unicité du produit d'amplification représente un autre avantage de la présente invention, celle-ci permettant d'obtenir une sensibilité importante et facilitant îo grandement l'interprétation des résultats. Le procédé selon la présente invention présente donc un grand nombre d'avantages par rapport aux techniques d'identification d'ADN bovin déjà connues, qui utilisent toutes la technologie PCR-RFLP. Ainsi, le procédé selon la présente invention présente une grande simplicité d'interprétation, en raison de la production d'un seul et unique produit, spécifique de l'ADN bovin, et qui donc ne se retrouve pas dans les produits d'amplification d'ADN d'autres espèces. Il n'est donc pas nécessaire, contrairement à la technique PCR- RFLP, de comparer l'ADN testé amplifié, à un témoin constitué par l'ADN de l'animal dont on suppose que l'ADN testé est originaire. La lecture des profils de migration des produits d'amplification obtenus avec le procédé selon la présente invention consiste donc simplement à déterminer la présence d'une seule et unique bande de migration dans le gel. En l'absence d'une telle bande, on peut considérer qu'il n'y a pas de traces détectables d'ADN bovin. La présence d'une bande signifie au contraire que l'ADN bovin est présent dans l'échantillon, et donc que l'échantillon en question contient de la matière biologique d'origine bovine. Le produit d'amplification peut être mis en évidence par toute méthode connue de l'homme du métier, et, en particulier, par simple électrophorèse sur un gel d'agarose. Il est néanmoins préférentiellement mis en évidence par hybridation avec une sonde comprenant une partie oligonucléotidique et un marqueur. L'oligonucléotide constituant cette sonde comprend au minimum environ 15 nucléotides, préférentiellement au minimum environ 20 nucléotides. Au moins une partie de sa séquence présente une identité d'au moins 80%, préférentiellement 90%, avec la séquence SEQ ID No 7 suivante: CTTGATAGTATATCTATTATATATTCC (BH1) Le marqueur peut être tout marqueur connu de l'homme du métier, mais est o préférentiellement la digoxygénine (DIG). L'utilisation de la sonde décrite ci-dessus pour mettre en évidence le produit de la réaction d'amplification est particulièrement avantageuse, car elle permet de confirmer l'origine bovine de ce produit d'amplification, et donc d'améliorer encore la spécificité et la sensibilité du procédé. La présente invention est en outre relative à des oligonucléotides complémentaires des oligonucléotides décrits ci-dessus. L'homme du métier pourra avantageusement se référer au manuel général de SAMBROOK et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY., ou l'une de ses récentes rééditions, pour la mise en oeuvre des techniques de biologie moléculaire de la présente invention. La présente invention permet de détecter la présence de composés d'origine bovine dans les produits utilisés en production agro- alimentaire et dans l'industrie des cosmétiques, tels que les viandes cuites ou crues, les granulés et farines utilisés pour l'alimentation du bétail, les composts, engrais et fumiers, les produits à base de sang, de poudre d'os, de cuir, de guano, les gélatines et les graisses animales. La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. La figure 1 représente un gel d'agarose, coloré par du bromure d'éthidium. Les ADN de boeuf, de cheval, de mouton, de porc, de canard, de poulet et de dinde 2 10 (respectivement puits 2 à 8) ont été amplifiés à l'aide des amorces PBF9 et PBR6. Le puits I correspond à un témoin négatif. Le produit d'amplification migre en formant une bande de 480 paires de bases. La figure 2 est un autre gel d'agarose sur lequel ont été mis à migrer les produits d'amplification de l'ADN de différentes races européennes bovines: bleu-blanc- belge (puits 2 et 3). Limousine (puits 4 et 5), Charolaise (puits 6 à 10), Normande (puits 11 et 12), Prim'holstein (puits 13 à 16), Blonde d'aquitaine (puits 17 à 20), Frisonne (puits 21), Croisée (puits 22 et 23) et Parthenaise (puits 24). Le puits 1 correspond à un témoin négatif. La figure 3 représente le transfert par la technique Southern du gel d'agarose de la figure 1, hybride à l'aide de la sonde BH1 marquée. La figure 4 est un gel d'agarose de produits d'amplification d'aliments pour bétails présentant des taux d'incorporation de farine bovine respectivement de 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,75; 0,06; 0,05; 0,01% de farine bovine (respectivement puits 2 à 11). Le puits 1 correspond à un témoin négatif. La figure 5 est un transfert par la méthode Southern du gel représenté sur la figure 4, et hybride par la sonde BH1 marquée. EXEMPLE 1 EXTRAIT ET DOSAGE DE L'ADN DE DIFFERENTES MATIERES ORGANIQUES. Afin de pouvoir mettre au point une méthode de détection par amplification génique de composés d'origine bovine dans les produits utilisés en production agro- alimentaire et dans l'industrie des cosmétiques, les expériences décrites dans ce premier exemple ont été réalisées avec divers types d'échantillons représentant des sources potentielles de dissémination de l'ESB. Les échantillons sélectionnés se répartissent en 12 groupes de produits finis, ou de produits entrant dans la composition des produits finis: Amendements, composts Engrais Guano Fumiers, fientes Terreau Granulés pour bétail Farines pour bétail Cuirs Os et poudres d'os Il Plumes Sang Gélatines, Graisse Il est nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse d'un échantillon quelconque par PCR de disposer de techniques d'extraction. Etant donné la diversité des échantillons testés, plusieurs techniques sont mises en oeuvre: 1) Extraction d'ADN par la méthode au phénol/chloroforme. Cette méthode s'adresse préférentiellement aux échantillons dont la teneur en composants d'origine animale est majoritaire (farines, granulés, os, sang, plumes, cuirs.....). On incube 0,5 g de poudre pendant trois heures à 56 C dans 2,5 ml de tampon de lyse de composition suivante: Tris 100 mM, pH8 NaCI 100 mM sarcosinate de sodium 1%. contenant 200 pg/ml de protéinase K, permettant de dégrader les protéines et de libérer les acides nucléiques. Le lysat est ensuite extrait par un volume de phénol/chloroforme 1/1 pour éliminer la partie protéique du lysat. Une deuxième extraction est effectuée. La phase aqueuse est ensuite extraite par 1 volume de chloroforme. L'ADN est alors précipité par 0,6 volume d'isopropanol et 0,1 volume d'acétate d'ammonium 2M à -20 C pendant un minimum de 2 heures. Il est ensuite récupéré par centrifugation (15 mn à 12000 rpm) puis lavé par de l'éthanol à 70 C (conservé à - C). Après évaporation de l'alcool résiduel (1 à 2 heures sous la hotte), I'ADN est dissous dans de l'eau pour préparation injectable (eau PPI; le volume d'eau est fonction de la quantité d'ADN récupéré). 2) Extraction selon la méthode au CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium). Cette méthode décrite par MURRAY ( Nucleic Acid Res. 8 (19), 4321-4325 (1980)) s'adresse préférentiellement aux échantillons contenant des débris d'origine 2 12 végétale en mélange avec des produits d'origine animale (fumiers, composts, amendements, engrais, terreau). lg d'échantillon est incubé à 3 heures à 56 C dans 2,5 ml de tampon de lyse dont la composition est: Tris 10 mM pH8 EDTA 0,1 mM dodécylsulfate de sodium 1% protéinase K 100 pg/ml 450 pII de NaCI 5 M et 375 pi de CTAB 10% NaCI 0,7 M, préchauffés à 65 C, sont io ajoutés et le tout incubé 20 mn à 65 C. Un volume de chloroforme est alors ajouté. Après agitation et centrifugation (10 mn à 12000 rpm à 4 C), la phase aqueuse est récupérée et réextraite une deuxième fois pour la rendre claire. Elle est de nouveau extraite par un volume de phénol/chloroforme. La suite de l'extraction s'effectue comme indiqué dans le paragraphe 1. 3) Dosage quantitatif de l'ADN extrait. La méthode de dosage utilisée est celle de LABARCA, (1980 Analytical Biochemistry 102, 344-352). Elle est basée sur la réaction d'intercalation d'une molécule, le Hoechst 33258 (2-(2-4 hydroxyphenyl)benzydalozyl)-6-(1méthyl-4- pipérazyl)-benzymidazol, 3HCI) dans la double hélice de l'ADN que l'on désire doser. Irradié à 356 nm, le complexe Hoechst 33258/ADN émet un signal de fluorescence caractéristique (458 nm). L'émission de fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN en solution; la lecture s'effectue au moyen d'un fluorimètre (DyNA quantHoeffer). L'ADN de l'échantillon à doser est ajouté dans 2 ml de tampon Tris 10mM, pH 7,4, EDTA lmM, NaCI 0,2 M contenant 1 pg de H33258/ml. Par étalonnage de l'appareil à l'aide d'une solution d'ADN standard de concentration connue, la quantité d'ADN extrait de l'échantillon est mesurée. Le tableau 1 ci-après montre que les techniques décrites permettent de mettre en évidence dans tous les échantillons de I'ADN en quantité suffisante pour être analysé par la méthode PCR selon la présente invention. EXEMPLE 2: AMPLIFICATION PAR PCR DE SEQUENCES D'ADNmt BOVIN A PARTIR DE L'ADN EXTRAIT DES ECHANTILLONS. 1) Purification de I'ADN extrait sur silice. Pour pouvoir effectuer la réaction de PCR dans des conditions réactionnelles optimales, il est nécessaire de purifier au préalable l'ADN extrait. La purification décrite io ci-dessous fait appel à une technique décrite par BOOM et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503). pI d'ADN brut, obtenu par l'une ou l'autre des méthodes détaillées dans l'exemple 1, sont dilués dans 4001pl d'un tampon obtenu par addition à 100 ml d'un tampon Tris 0,1 mM-pH 6,4 de 120g de thiocyanate de guanidinium, de 22 ml d'EDTA 0,2 M-pH8 et de 2,6 ml de Triton X100. Cette solution est incubée 5 mn à température ambiante avec 300p1l de silice (Wizard DNA clean up System Promega ref A7280: silice et minicolonnes). La silice est lavée sur colonne avec 2 ml d'isopropanol à 80%. La colonne est centrifugée 2 mm à 12000 rpm pour éliminer l'alcool résiduel, 50pI d'eau PPI préchauffée à 70 C sont ajoutés pour éluer I'ADN fixé sur la silice (incubation de 5 à 30 mn à 70 C). L'éluat contenant l'ADN récupéré par centrifugation (12000 rpm, 2 mn) est prêt à être utilisé pour la PCR. Si nécessaire une deuxième purification sur silice est effectuée. 2) La réaction de PCR La PCR a été mise en oeuvre avec les deux amorces oligonucléotidiques PBF9 et PBR6 présentant respectivement les séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 6. Les amplifications ont été réalisées dans un volume total de 50 pl contenant: pl d'un tampon Taqx10 (dépourvu de Mg++) commercialisé avec l'enzyme pl d'un mélange dATP, dCTP, dGTP et dTTP (2 mM chacun) 3 pI de MgCI2 25 mM 0,5 pl d'albumine 20 mg/ml pl de chacune des amorces PBF9 et PBR6 (10 pM chacun) 10 pI d'ADN de matrice de génome (de 100 ng à 1 pg) 0,2 pI de Taq ADN polymérase (5 unités/pI) 16,3 pl d'eau distillée stérile. A l'exception de la matrice de génome, des amorces et de la Taq ADN polymérase, toutes les matières précédentes constituent la solution tampon de base io préparée en volume et conservée à -20 C. Toutes les amplifications ont été réalisées avec un appareil de commande de cycle thermique " Perkin-Elmer " avec le programme suivant de température: " Programme PCR ". 1 cycle initial comprenant 5 mn à 94 C 9 cycles comprenant 30 s à 94 C s à 55 C (puis une température diminuée de 0,5 C chaque cycle jusqu'à 51 C) s à 72 C 32 cycles comprenant 30 s à 94 C s à 51 C s à 72 C 1 cycle final comprenant 7 mn à 72 C de quelques minutes à plusieurs heures à 4 C. Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5%, sous tension constante de 130 V pendant 45 mn, et à l'aide de bromure d'éthidium pour la visualisation des amplifiats obtenus. La réaction de PCR utilisant le couple d'amorces PBF9/PBR6 a été effectuée sur une série d'extraits d'ADN obtenus à partir de divers tissus animaux et végétaux. On observe un produit d'amplification unique (fragment d'une longueur de 480 paires de base - 480 pb-) pour les tissus bovins, et aucun produit pour tous les autres ADN testés (figure 1). Ainsi, les amorces PBF9 et PBR6 conviennent pour l'identification de l'ADN spécifique de bovin dans une application PCR. s En plus de ces résultats, la technique PCR utilisant ces deux amorces a été appliquée sur de l'ADN extrait de tissus d'animaux de races européennes bovines variées (Blanc-Bleu Belge, Limousine, Charolaise, Normande, Prim'Holstein, Charolaise croisée Normande, Blonde Aquitaine, Parthenaise). Tous les échantillons ont donné le même profil (un fragment unique de 480 pb) indiquant que la méthode io peut être appliquée quelle que soit l'origine de l'ADN bovin analysé (figure 2). EXEMPLE 3: CARACTERISATION DE L'ADN AMPLIFIE DANS LA REACTION DE PCR PAR LA TECHNIQUE DITE DE " La confirmation du caractère " bovin " du produit d'amplification PCR (480 pb) est obtenue par l'hybridation à ce produit d'une sondeoligonucléotidique correspondant à la séquence d'identification BH1 (SEQ ID N 7). La sonde BH1 utilisée à cet effet est marquée à la digoxygénine (DIG) au moyen d'un kit commercial (" Dig oligonucléotide 3'-end labeling kit - ref 1362 372 " Boehringer). Après transfert par capillarité sur membrane de nylon, les produits d'amplification sont dénaturés avant fixation covalente à la membrane par UV. Après incubation de la membrane dans un tampon d'hybridation contenant la sonde BH1 marquée, il est procédé à des lavages, puis la sonde est révélée par un système anticorps anti-DIG couplés à la phosphatase alcaline en présence de chlorure de nitro blue tetrazolium et de 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl-phosphate. Les produits d'amplification sont ainsi caractérisés dans cette réaction par l'apparition d'une coloration brun-violet. On constate, par utilisation de l'analyse par hybridation/transfert de type " Southern ", que la sonde BH1 s'hybride spécifiquement à la séquence d'ADNmt 2 16 2762842 bovin amplifiée au moyen des amorces PBF9 et PBR6, et pas à de l'ADNmt ou de l'ADN génomique d'autres espèces animales et végétales (figure 3). EXEMPLE 4- UTILISATION DES TECHNIQUES PCR ET " SOUTHERN " POUR LA DETECTION DE FARINES ANIMALES D'ORIGINE BOVINE DANS LES ALIMENTS DU BETAIL. Les procédés des exemples 1, 2 et 3 ont été appliqués sur des échantillons d'aliments pour bétail (sous forme de farines ou de granulés), ne contenant pas de produits d'origine bovine, et auxquels a été incorporée expérimentalement de la farine de sous-produits bovins à des taux variant de 5 à 0,01%. Un signal spécifique, proportionnel au taux d'incorporation, a été obtenu par amplification PCR utilisant les amorces PBF9 et PBR6, sur tous les échantillons comprenant au moins 0,1% de farine d'origine bovine. L'application de la technique " Southern " avec la sonde oligonucléotidique BH1 sur les produits d'amplification précédemment obtenus permet une détection spécifique des échantillons contenant de la farine de viande, avec cette fois-ci un taux limite de détection ramené à 0,05% (figure 4). EXEMPLE 5 UTILISATION DES TECHNIQUES PCR ET " SOUTHERN " POUR LA DETECTION DE PRODUITS D'ORIGINE BOVINE DANS TOUS LES ECHANTILLONS. Les procédés des exemples 1, 2 et 3 ont été appliqués sur des échantillons variés, susceptibles de contenir des taux variables des produits d'origine bovine, tels que les viandes cuites ou crues, les granulés et farines utilisés pour l'alimentation du bétail, les composts, engrais et fumiers, les produits à base de sang, de poudre d'os, de cuir, de guano, les gélatines et graisses animales. Un signal spécifique a été obtenu avec tous les échantillons testés contenant des produits d'origine bovine (tableau 2 ci-après). On note une parfaite corrélation entre la présence reconnue de produit d'origine bovine dans les échantillons et le signal de PCR (présence de l'amplifiat de 480 pb s'hybridant avec la sonde BH1 marquée). Tableau]:Dosage aul H33258 d'ADN extrait des échantillons Résultats exprimés eCn ilg d'ADN extrait à partir de 0),5 g de produit Catégorie Extraction Phénol/Chloroforme Extraction CTAB de Produit I ALiment* 1(5.5 228.4 2 Aliment 42,5 345.2 3 Aliment 34,2 53.4 4 Compost 3.6 287.4 Compost 6.4 47,19 6 Cuir (0,4 0,6 7 Cuir 0.12 0,8 8 Engrais 10,2 57.6 9 Engrais 0(95 3.05 Engrais (),5 1. 2 11 Farine 291.4 346,2 12 Farine 439. 6 3(9,2 13 Farine 322 278 14 Farine 1 502.3 468.95 Farine I 198.6 154 16 Farine 21(2 189,2 17 Fientes 86.9 8 6.94 18 Fumier (.9 8.78 19Fumier 1.1 14.6 Fumier 12.3 I. 1 21 Fumier j4.6 24,()9 22 Graisse 0, (), I)1 () 23 Gélatine (.01.t)l _ _ 24 Guano 34,9 33.i,2 Os.7 149.7 26 Os 12.1 2.4 27 Os 114.6 6,7 28 Plumes 1(0)6.7 333.8 29 Plumes 128,2 257, 4 Sane 10(74.5 1 147.8 31 Sano 7. 47 1().7 31 Terreau 10.65 2,13 Terreau T5.42 18.79 Aliment granulé pour hétail Tnhleni 2: Détection de produits d'origine bovin par la méthode de I>CR utilisant les amorCes PBF9 et PBR6 Nature de Présence (?) ou absence (A) Réaction de PCI l'échantillon connue de sous-produits + présence de l'amplifint analysé par d'origine bovinc dans de 480 bp; -: absence de PCR l'échantillon analysé. dc l'anipliriat 1 Aliment " + 2 Aliment + 3 Aliment + 4 Compost A Compost F + 6 Cuir P + 7 Cuir P + 8 Encrais P + 9 Encrais A lU Engrais A - [ 1 Farine A 12 Farine p + 13 Farine + 14 Farine + Farine P + 16 Farine + 17 Fientes A 18 Fumier + 19 Fumier A Fumier P + 21 Fumier p + 22 Graisse P + 23 GdlJatine P + 24 Guano A Os P + 26 Os I P _ + 270s - P + 28 Plumes A 29 Plumes A Sang P + 31 Sanm P + 31 Tirreau p + Ten'eau A *Aliment zranulé oour bétail LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT PASTEUR DE LILLE (B) RUE: 1, rue du Professeur Calmette (C) VILLE: LILLE (E)PAYS: FRANCE *(F) CODE POSTAL: 59019 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE DETECTION DE LA PRESENCE DE MATIERES BIOLOGIQUES D'ORIGINE BOVINE, et OLIGONUCLEOTIDE POUR SA MISE EN OEUVRE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomrnique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TAATGTCCAT GCTTATCATT ATGCTGGTGC TCAAGATGCA GTT 43 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: allele (B) EMPLACEMENT:replace(1, "c") (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: TTATCATTAT GCTGG 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: allele (B) EMPLACEMENT:replace(6, "c") (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CATGCTTATC ATTATGCTGG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 46 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: ATTATATGCC CCATGCATAT AAGCAAGTAC ATGACCTCTA TAGCAG 46 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TAAGCAAGTA CATGA 15 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GCATATAAGC AAGTACATGA 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CTTGATAGTA TATCTATTAT ATATTCC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 482 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GCATATAAGC AAGYACATRA YYYCTAYAVY AGTACATAAY RCATAYAATT ATTRAYYGTA 60 CATAGTACAT TATRTCAAAY YCATYCTYRA YARYATATYT AYYATATAYY YCYTNCCAYT 120 AGATCACGAG CTTAAYTACC ATGCCGCGTG AAACCARCAA CCCGCTRRGC AGNGGATCCC 180 TCTTCTCGCT CCGGGCCCAT ARAYYGTGGG GGTCGCTATY YARTGAAYTT TAYCAGGCAT 240 CTGGTTCTTT CTTCAGGGCC ATCTCATCTA AARYRGTCCA TTCYTTCCTC TTAAATAAGA 300 CATCTCGATG GACTAATGRC TAATCAGCCC ATGCTCACAC ATAACTGTGY TGTCATACAT 360 TTGGTATTTT TTTATTTTGG GGGATGCTTG GACTCAGCTA TGGCCGTCAA AGGCCCTGAC 420 CCGGAGCATC TATTGTAGCT GGACTTAACT GCATCTTGAG CACCAGCATA ATGATARGCR 480 TG 482 REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un fragment unique et déterminé d'ADN bovin, spécifique de la famille des bovidés, à partir d'un échantillon de matière organique, procédé dans lequel on amplifie par réaction de polymérisation en chaîne une séquence déterminée du génome bovin, présente dans le génome de toutes les espèces de ladite famille mais absente dans le génome des autres espèces animales. 2. Procédé de détection de la présence de matière biologique d'origine bovine dans un échantillon de matière organique, caractérisé en ce que l'on détermine la présence d'ADN spécifique d'origine bovine dans ladite matière organique par 1o amplification d'une séquence d'ADN déterminée du génome bovin. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la séquence amplifiée du génome bovin est d'origine mitochondriale. 4. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides comprise dans la séquence SEQ ID N 1 suivante: TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT 5. Oligonucléotide selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID N 2 suivante: YTATCATTATGCTGG dans laquelle Y est T ou C. 6. Oligonucléotide selon l'une des revendications 4 et 5 caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID N 3 suivante: CATGCYTATCATTATGCTGG 2 24 2762842 dans laquelle Y est T ou C. 7. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90%, avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides comprise dans la séquence SEQ ID N 4 suivante: ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG 8. Oligonucléotide selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend la io séquence SEQ ID N 5 suivante: TAAGCAAGTACATGA 9. Oligonucléotide selon l'une des revendications 7 et 8 caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID N 6 suivante: GCATATAAGCAAGTACATGA 10. Amorce caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides selon l'une des revendications 4 à 9. 1 1. Oligonucléotide comprenant au minimum environ 15 nucléotides, préférentiellement au minimum environ 20 nucléotides, et dont au moins une partie de sa séquence présente une identité d'au moins 80%, préférentiellement 90%, avec la séquence SEQ ID N 7 suivante: CTTGATAGTATATCTATTATATATTCC 12. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il est complémentaire de l'oligonucléotide selon la revendication 11. 13. Sonde caractérisée en ce qu'elle comprend un oligonucléotide selon l'une des revendications 11 et 12. 14. Oligonucléotide selon l'une des revendications 4 à 9, 11 et 12 caractérisé en ce qu'il est sous forme simple brin. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), comprenant une répétition du cycle des étapes suivantes: - séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de l'échantillon, - hybridation avec une ou plusieurs amorces comprenant un ou plusieurs oligonucléotides selon l'une des revendications 4 à 6 et une ou plusieurs amorces comprenant un ou plusieurs oligonucléotides selon l'une des revendications 7 à 9 et - élongation par une polymérase. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la température d'hybridation des amorces d'au moins une partie des cycles est d'environ 51 C. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, 15 et 16 caractérisé en ce que la séquence amplifiée est détectée par hybridation avec une sonde. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que ladite sonde comprend au moins en partie l'oligonucléotide selon l'une des revendications 11 et 12 et un marqueur. 19. Fragment d'ADN susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et 15 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend environ 480 paires de bases. 20. Fragment selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides comprise dans la séquence SEQ ID N 8 suivante: 2 26 2762842 GCATATAAGC AAGYACATRA YYYCTAYAVY AGTACATAAY RCATAYAATT ATTRAYYGTA CATAGTACAT TATRTCAAAY YCATYCTYRA YARYATATYT AYYATATAYY YCYTNCCAYTAGATCACGAG CTTAAYTACC ATGCCGCGTG AAACCARCAA CCCGCTRRGC AGNGGATCCCTCTTCTCGCT CCGGGCCCAT ARAYYGTGGG GGTCGCTATY YARTGAAYTT TAYCAGGCAT CTGGTTCTTT CTTCAGGGCC ATCTCATCTA AARYRGTCCA TTCYTTCCTC TTAAATAAGA CATCTCGATGGACTAATGRCTAATCAGCCCATGCTCACACATAACTGTGY TGTCATACATTTGGTATTTTTTTATTTTGGGGGATGCTTGGACTCAGCTA TGGCCGTCAAAGGCCCTGACCCGGAGCATCTATTGTAGCTGGACTTAACT GCATCTTGAG CACCAGCATA ATGATARGCR TG 21. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et 16 à 19 pour la détection de matières biologiques d'origine bovine dans des produits utilisés en production agro-alimentaire et dans l'industrie des cosmétiques, tels que les viandes cuites ou crues, les granulés et les farines utilisés pour l'alimentation du bétail, les composts, les engrais et fumiers, les produits à base de sang, de poudre d'os, de cuir, de guano, les gélatines et les graisses animales.