Brevet FR2767141A1 — publié le 19990212

La présente invention a pour objet un dispositif pour la culture de bactéries lactiques destinées à être administrées à des animaux, en particulier pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale et prévenir et/ou traiter un déséquilibre de la flore intestinale. Les bactéries lactiques largement utilisées en agro-alimentaire pour la préparation de denrées allant du yaourt aux produits carnés sont également utilisées depuis quelques années en élevage pour leur action bénéfique sur l'équilibre de la flore intestinale de l'animal hôte. Ces actions bénéfiques sont principalement marquées chez les jeunes animaux qui naissent axéniques (sans flore intestinale) et chez qui une flore spécifique s'établit de manière séquentielle durant les premiers jours qui suivent la naissance. Durant les périodes à risque de déséquilibre digestif (transition alimentaire, suite de traitement antibiotique, entérites...), I'administration de bactéries lactiques est également un moyen de prévention efficace voire un moyen de traitement. Les bactéries lactiques sont principalement utilisées chez l'animal sous forme déshydratée (lyophilisées ou atomisées) afin d'améliorer leur conservation. Elles sont soit incorporées dans l'aliment, soit incorporées dans l'eau de boisson, ou enfin pulvérisées sur les animaux (volailles à l'éclosion des oeufs) après mise en suspension. Ces formes déshydratées de bactéries lactiques présentent un certain nombre d'inconvénients. Elles ont des durées de conservation à température ambiante limitées. Elles doivent être conservées au froid et il est souvent nécessaire de les surdoser pour obtenir la concentration voulue dans l'aliment ou dans l'eau de boisson, ce qui représente des surcoûts importants. D'autre part, les bactéries lactiques doivent se réhydrater, soit in vivo dans le cas d'une incorporation dans l'aliment, soit directement dans l'eau de boisson. Cette revivification est brutale et parfois même fatale aux microorganismes. Elle retarde leur activité in vivo. Le dispositif selon l'invention permet de produire à moindre coût, à température ambiante et dans des conditions non stériles, un bouillon de culture stabilisé et très concentré en bactéries lactiques vivantes, beaucoup plus efficaces pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale saine que les germes déshydratés utilisés habituellement, dont l'apport réel est souvent aléatoire compte tenu de leur instabilité au stockage et lors de la réhydratation. La présente invention a pour objet un dispositif pour la culture de bactéries lactiques destinées à être administrées à des animaux, en particulier pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale et prévenir et/ou traiter un déséquilibre de la flore intestinale, comprenant, dans une enceinte fermée, munie d'un orifice de remplissage, un milieu nutritif déshydraté, permettant la culture sélective de bactéries lactiques, ledit milieu nutritif étant préensemencé avec des bactéries lactiques déshydratées. De manière avantageuse, le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre un indicateur de pH acide dans ladite enceinte, dont au moins une partie des parois est transparente, permettant ainsi de visualiser le virage de l'indicateur. Le dispositif selon l'invention est mis en oeuvre de maniére simple par remplissage de l'enceinte avec de l'eau, par exemple de l'eau du robinet. De manière avantageuse, au moins une partie transparente des parois latérales de ladite enceinte porte des niveaux de remplissage imprimés permettant de visualiser le niveau d'eau à ajouter. Le remplissage de l'enceinte avec de l'eau jusqu'à un niveau indiqué permet de démarrer la culture. L'indicateur de pH éventuellement contenu dans le milieu permet de vérifier le bon déroulement de la culture et indique à l'utilisateur le moment à partir duquel le produit peut être utilisé, à savoir après la phase exponentielle de croissance des bactéries lactiques. Cet indicateur de pH est un indicateur coloré couvrant la zone de 3,5 à 7,5 et peut être notamment: - le pourpre de bromocresol (pH 5,2 jaune à 6,8 mauve), - le vert de bromocresol (pH 3,8 jaune à 5,4 bleu), - le rouge de méthyle (pH 4,2 rose à 6,2 jaune), - le rouge de chlorophénol (5,2 jaune à 6,8 rouge). Dans la pratique, selon la température ambiante (15 à 35"C), la culture arrive à maturité après environ 24 à 48 heures. La culture peut être conservée sans perte majeure à température ambiante au moins cinq jours et au réfrigérateur (4"C) au moins deux semaines à partir du virage de l'indicateur coloré. De manière avantageuse, L'enceinte utilisée peut être un sac souple, de préférence en plastique, éventuellement muni d'un soufflet lui permettant un minimum d'encombrement, un plus grand volume de remplissage et un maintien en position verticale après remplissage. Cette enceinte peut être en outre munie d'une soupape permettant l'évacuation des gaz éventuellement formés, d'un orifice de vidange et d'une poignée. Afin d'assurer la fermeture hermétique de l'enceinte, les orifices de remplissage et de vidange peuvent être notamment des goulots munis d'un bouchon avec opercule. De manière avantageuse, L'enceinte peut avoir un volume utile de 1 à 10 litres. On a représenté sur la figure 1 annexée une enceinte utilisée dans le dispositif selon l'invention. Cette enceinte 1 réalisée en matière plastique transparente a la forme d'un bidon Cette enceinte 1 est munie à la partie supérieure d'un orifice de remplissage 2 fermé par un bouchon 3, et d'une poignée 4. Une paroi latérale transparente 5 de l'enceinte porte des graduations 6 indiquant les niveaux de remplissage. Le milieu de culture utilisé peut notamment comprendre des sources de carbone dont des glucides à un taux de 2 à 6 % en poids par rapport à la quantité d'eau à ajouter, des sources d'azote, des macro-éléments et oligo-éléments, des sels alcalins de l'acide acétique en quantité suffisante pour obtenir 0,7 à 2,0 % en poids du groupe acétate par rapport à la quantité d'eau à ajouter, et des composés tampons assurant un pH de 4 à 6. La forte concentration en acétate permet l'inhibition du développement de germes autres que les bactéries lactiques dans le milieu de culture. L'acétate de sodium est particulièrement préféré à cet effet. Le milieu nutritif contient des sels alcalins de l'acide acétique en quantité suffisante pour garantir une teneur de 0,7 à 2,0 % en poids du groupe CH3COO par rapport à la quantité d'eau. Ceci signifie que pour 1,0 % en poids d'acétate de sodium, on obtient un taux de 0,7 % en poids du groupe CH3COO dans le milieu nutritif aqueux. Le terme de groupe CH3COO a été choisi pour les raisons formelles d'une définition exacte de la quantité puisque les ions d'acétate peuvent se présenter dans les solutions aqueuses tant sous leur forme non protonée que sous leur forme protonée en tant qu'acide acétique. Outre les monosaccharides tels que glucose, fructose et galactose, les sources de carbone appropriées peuvent être, entre autres, le saccharose, la mélasse, le lactose, les extraits de malt, les dextrines et/ou l'amidon. Les glucides à fermentation rapide et directe n'exigeant aucune décomposition enzymatique préalable en monomères, c'est-à-dire les monosaccharides, sont préférés. Parmi ceux-ci, on préfère le glucose en particulier. Les sources d'azote adéquates sont, par exemple, les protéines, les peptones, la farine de soja, les extraits de levure et le sulfate d'ammonium. Quant aux macro-éléments, on peut utiliser notamment les phosphates, le potassium ou les sels de magnésium. Les sels de manganèse, molybdène, zinc, cuivre ou cobalt, sont préférentiellement ajoutés en leur qualité doligo-éléments. Le tamponnage de l'acide lactique produit lors de la reproduction des lactobactéries, est obtenu grâce à un taux élevé de composés tampons. Les composés tampons sont ajoutés au milieu nutritif en quantité suffisante pour assurer que le pH ne soit pas inférieur à 4 après deux jours de repos à 20"C sous addition de lactobactéries. Les sels d'hydrogénophosphate sont utilisés de préférence comme composés tampons, de préférence à un taux de 0,4 à 1,2 % en poids par rapport à la quantité d'eau à ajouter, de préférence à un taux de 0,8 %. Le phosphate bipotassique est le sel d'hydrogénophosphate préféré. Le milieu nutritif utilisé dans le dispositif selon l'invention peut être notamment dérivé du milieu développé par Rogosa, Mitchell et Wiseman (J. Bact., 1951, vol. 62:132; et J. Dental Research, 1951, vol. 30:682). Il peut contenir ou non de la peptone de caséine. Ce milieu nutritif est préensemencé avec des bactéries lactiques déshydratées, préférentiellement à une teneur de 102 à 108 UFC (unités formant colonies) par ml de milieu complémenté en eau. De manière avantageuse, l'inoculum permet d'obtenir au démarrage de la culture, 105 à 107 UFC/ml. Les bactéries lactiques utilisées peuvent être choisies notamment parmi les genres Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus ou Enterococcus. Les Lactobacillus sont utilisés préférentiellement en raison de leur fort pouvoir d'acidification, ainsi que de leurs effets bénéfiques sur l'équilibre de la flore intestinale et leur innocuité. On peut utiliser notamment les bactéries lactiques choisies parmi Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus homochiochii et Lactobacillus helveticus. Ces espèces présentent de bons rendements de culture à 15"C. La présente invention a également pour objet un procédé de culture de bactéries lactiques dans lequel le dispositif décrit précédemment est mis en oeuvre par remplissage de l'enceinte avec de l'eau. La culture obtenue par le procédé ci-dessus fait également partie de l'invention. Elle peut être utilisée pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale chez les animaux nouveaux-nés et les jeunes animaux et/ou prévenir et/ou traiter un déséquilibre de la flore intestinale chez les animaux, ladite culture de bactéries lactiques étant administrée aux animaux, notamment par incorporation dans la boisson ou les aliments, tels que notamment les aliments de gavage, les soupes ou tout autre aliment liquide ou pâteux, ainsi que dans les lactoremplaceurs. Plus particulièrement, la culture sous forme de bouillon peut être administrée aux volailles par: - pulvérisation du bouillon de culture sur les ceufs avant éclosion ou directement sur les nouveaux-nés après éclosion; - incorporation dans l'eau de boisson des animaux d'élevage durant les premiers jours de vie et après antibiothérapie, - incorporation dans les aliments de gavage. La culture selon l'invention peut être également administrée aux porcs par: - incorporation du bouillon de culture dans l'eau de boisson au démarrage et après antibiothérapie; - incorporation dans les soupes. La culture selon l'invention peut être également administrée aux bovins par incorporation dans les lactoremplaceurs. La présente invention présente de nombreux avantages. Le dispositif permet une bonne conservation des bactéries lactiques déshydratées constituant l'inoculum du milieu. La concentration de l'inoculum diminue en fonction des conditions et de la durée de stockage. Cependant, même après une perte partielle importante d'inoculum, la faible quantité restante suffit à faire démarrer la culture après hydratation et permet toujours d'obtenir après 24 à 48 heures de culture une concentration en bactéries lactiques supérieure à 1.1 09 UFC/ml. Cette technique permet donc de s'affranchir en grande partie des problèmes de conservation des bactéries lactiques lyophilisées. Le procédé de culture est par ailleurs très simple à mettre en oeuvre : il suffit de remplir l'enceinte avec de l'eau, par exemple de l'eau du robinet, pour démarrer la culture. Cette simplicité d'usage est particulièrement avantageuse pour l'exploitant agricole. Le milieu de culture sélectionné est sélectif et évite donc le développement d'autres germes contaminants. Un indicateur de pH intégré indique à l'utilisateur le stade de maturité de la culture. La culture est prête à l'emploi 24 à 48 heures après son démarrage et peut être conservée durant cinq jours à température ambiante et durant deux semaines à 4"C. En outre, les bactéries lactiques obtenues par cette méthode ont un métabolisme actif, contrairement aux bactéries déshydratées en état de dormance qui ont une période de latence importante une fois ingérées par l'animal. Ce stade physiologique des bactéries obtenues selon l'invention favorise une bonne efficacité sur l'équilibre de la flore intestinale. Enfin, durant la culture, la concentration en bactéries lactiques est multipliée par un facteur minimum de 10. Cette technique permet donc de produire facilement et à bon marché une biomasse importante. L'exemple suivant illustre la présente invention sans la limiter. EXEMPLE: Milieu de culture: Le milieu de culture contient, en g/l du milieu complémenté en eau - Peptone de caséine 10 g - Extrait de levure 15 g acétate de sodium 19 g - Citrate d'ammonium 2,5 g - Sulfate de magnésium 0,15 g - Sulfate de manganèse 0,05 g - Phosphate bipotassique 8g - Glucose 40 g - Pourpre de bromocresol 0,005 g - Lactobacillus alimentarius (activité 5.1010 UFC/gramme) 0,2 g La teneur en lactobactéries dans le milieu est donc de 1.107 UFC/ml de milieu complémenté en eau. Enceinte de culture: L'enceinte de culture est un sac transparent muni d'un orifice de remplissage, stable en position verticale grâce à un soufflet à sa base, d'un volume utile de 5 litres. Les niveaux de remplissage sont imprimés sur l'une des faces du sac, alors que l'autre face porte les mentions d'étiquetage et des témoins de couleur permettant de suivre l'évolution de la culture. On introduit dans cette enceinte 463 g de milieu tel que défini cidessus (tolérance +5%). Mise en culture: L'utilisateur, par exemple l'exploitant agricole, complète le milieu de culture, directement dans le sac décrit ci-dessus, avec de l'eau du robinet n'excédant pas 35 "C, jusqu'au niveau "5 L". Le sac est agité pour homogénéiser la solution, qui prend une couleur mauve. Le sac est laissé à température ambiante entre 15 et 35 "C. L'obtention d'une couleur seuil (jaune-vert) correspondant au pH 5,3 indique la maturité de la culture (atteinte d'une concentration en lactobacilles > germes/ml). Cette maturité est atteinte en 24 heures dans un local à 20 "C. A partir de l'obtention de cette couleur seuil, le produit peut être administré aux animaux. Le produit peut être conservé pendant 5 jours à température ambiante, et 2 semaines au réfrigérateur (4 "C). REVENDICATIONS 1. Dispositif pour la culture de bactéries lactiques destinées à être administrées à des animaux, en particulier pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale et prévenir et/ou traiter un déséquilibre de la flore intestinale, comprenant, dans une enceinte fermée munie d'un orifice de remplissage, un milieu nutritif déshydraté, permettant la culture sélective de bactéries lactiques, ledit milieu nutritif étant préensemencé avec des bactéries lactiques déshydratées. 2. Dispositif selon la revendication 1, comprenant en outre, un indicateur de pH acide dans ladite enceinte, au moins en partie transparente. 3. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel ladite enceinte comprend des parois latérales au moins en partie transparentes, ladite partie transparente portant des niveaux de remplissage imprimés. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enceinte est un sac en plastique éventuellement muni d'un soufflet lui permettant en particulier un maintien en position verticale après remplissage. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit milieu nutritif déshydraté comprend des sources de carbone dont des glucides à un taux de 2 à 6 % en poids par rapport à la quantité d'eau à ajouter, des sources d'azote, des macro-éléments et oligoéléments, des sels alcalins de l'acide acétique en quantité suffisante pour obtenir 0,7 à 2,0 % en poids du groupe acétate par rapport à la quantité d'eau à ajouter, et des composés tampons assurant un pH de 4 à 6. 6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel ledit milieu nutritif contient du glucose comme source de carbone. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, dans lequel ledit milieu nutritif contient de l'acétate de sodium comme sels alcaiins de l'acide acétique comme composés tampons. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel ledit milieu nutritif contient comme composés tampons des sels d'hydrogénophosphate à un taux de 0,4 à 1,2 % en poids par rapport à la quantité d'eau à ajouter. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit milieu nutritif est constitué, en g/l de milieu complémenté en eau, de: - Extrait de levure 15 - Acétate de sodium 19 - Citrate d'ammonium 2,5 - Sulfate de magnésium 0,15 - Sulfate de manganèse 0,05 - Phosphate bipotassique 8 glucose 40 ainsi qu'éventuellement de peptone de caséine à une concentration de 10 g/l. 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit milieu nutritif est préensemencé avec des bactéries lactiques à une teneur de 102 à 108 UFC/ml de milieu complémenté en eau. 11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites bactéries lactiques sont choisies parmi les genres Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus ou Enterococcus. 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lesdites bactéries lactiques sont choisies parmi Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus homochiochii et Lactobacillus helveticus. 13. Procédé de culture de bactéries lactiques qui consiste à introduire de l'eau dans un dispositif, selon l'une quelconque des revendications précédentes, et à laisser la culture se développer jusqu'au virage de l'indicateur de pH acide. 14. Culture obtenue par le procédé selon la revendication 13. 15. Utilisation de la culture selon la revendication 14 pour favoriser l'implantation d'une flore intestinale chez les animaux nouveaux-nés et les jeunes animaux et/ou prévenir et/ou traiter un déséquilibre de la flore intestinale chez les animaux, ladite culture de bactéries lactiques étant administrée aux animaux.