Brevet FR2767830A1 — publié le 19990305

ff 2767830 Oligonucléotides permettant l'identification de précurseurs d'hormones polvpeptidiques amidées La présente invention a pour objet de nouveaux oligonucléotides et leur application comme sondes pour l'identification des ARNm codant pour les précurseurs d'hormones polypeptidiques amidées et, ainsi, l'identification de nouvelles hormones polypeptidiques amidées. L'invention concerne donc des oligonucléotides dont la séquence nucléotidique est décrite ci-après et une méthode d'identification des précurseurs d'hormones. Les hormones polypeptidiques amidées sont synthétisées sous forme d'un précurseur qui subit une maturation. Cette maturation consiste en une réaction d'amidation. La réaction d'amidation de l'extrémité C-terminale est une réaction caractéristique des hormones polypeptidiques amidées. Cette réaction, qui intervient sur le précurseur d'une ou plusieurs hormones, permet la maturation de l'hormone et assure également sa biostabilité dans le milieu physiologique: le groupement amide formé est moins vulnérable que la fonction acide libre. L'hormone est alors plus résistante aux carboxypeptidases, elle reste active plus longtemps dans la cellule et garde une aff'inité optimale avec son site récepteur. L'amidation a été largement décrite (" Peptide amidation ", Alan F. Bradbury et Derek G. Smyth, TIBS 16: 112-115, March 1991 et "Functional and structural characterization of peptidylamidoglycolate lyase, the enzym catalyzing the second step in peptide amidation", A.G. Katopodis, D.S. Ping, C.E. Smith and S.W. May, Biochemistry, 30(25): 6189-6194, June 1991), son mécanisme est le suivant: 1- clivage de la chaîne polypeptidique précurseur de l'hormone par une endoprotéase au niveau de deux acides aminés basiques qui sont l'arginine et/ou la lysine, 2 ensuite, se produisent deux clivages par la carboxypeptidase qui conduisent à l'intermédiaire glycine étendu, 3 - l'enzyme PAM (Peptidylglycine-ac-Amidating Monooxygenase) comprend deux activités enzymatiques distinctes: dans un premier temps, elle convertit l'intermédiaire glycine étendu en dérivé ac-hydroxyglycine, la sous unité de l'enzyme PAM qui intervient est la PHM (Peptidyl-glycine-ao-Hydrolylating Monooxygenase). Le dérivé obtenu sert de substrat à la deuxième sous unité de la PAM (notée PAL: Peptydil-a-hydroxyglycine c-Amidating Lyase) qui fixe la fonction amine de la glycine sur l'acide aminé immédiatement adjacent du coté N-terminal et libère le glyoxylate. -2- Cette réaction impose la présence d'un site de reconnaissance sur le précurseur de ou des hormones, site qui comporte toujours la séquence: glycine et deux acides aminés basiques (arginine ou lysine). Les hormones polypeptidiques amidées qui sont destinées à être sécrétées hors du réticulum endoplasmique sont connues pour comporter une séquence consensus signal d'une quinzaine à une trentaine d'acides aminés, cette séquence est présente à l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique. Elle est coupée plus tard par une enzyme signal peptidase, de sorte qu'on ne la retrouve plus dans la protéine une fois sécrétée. A l'heure actuelle, la découverte d'une nouvelle protéine n'est pas une chose aisée. L'isolement et la purification des protéines peuvent se faire par des techniques diverses: précipitation au point isoélectrique, extraction sélective par certains solvants, puis purification par cristallisation, distribution à contre courant, chromatographie d'adsorption, de partage ou par échange d'ions, électrophorèse... Cependant ces techniques sousentendent la connaissance des propriétés de la protéine à isoler. Par ailleurs, lorsqu'on dispose d'un échantillon pur d'une nouvelle protéine intéressante sur le plan thérapeutique, il reste encore de nombreuses étapes avant de disposer d'un micro- organisme génétiquement modifié capable de la synthétiser. La méthode proposée par la présente invention offre l'avantage, par l'utilisation d'une particularité de la séquence peptidique du précurseur de toutes hormones amidées connues à ce jour, de permettre la mise en évidence simultanée de plusieurs nouvelles hormones de cette catégorie. Cette recherche se fait par l'identification directe de la séquence nucléotidique codant pour lesdits précurseurs dans des banques d'ADNc préparées à partir de tissus dans lesquels les précurseurs de ces hormones sont susceptibles d'être synthétisés. La recherche par cette méthode est beaucoup moins contraignante que les techniques classiques de biochimie citées précédemment car: - elle peut conduire à isoler, suivant le même principe, plusieurs précurseurs distincts présents dans le même tissu; - elle permet de mettre en évidence, dans les mêmes conditions techniques, des précurseurs correspondant à des hormones ayant des propriétés biochimiques et biologiques très différentes; - elle autorise l'identification concomitante de toutes les hormones peptidiques pouvant être contenues dans le même précurseur. -3- De ce fait, cette invention permet un gain de temps et d'argent non négligeable dans un secteur o les dépenses de Recherche et Développement représentent une proportion très importante du chiffre d'affaires. La présente invention permettra également l'étude pharmacologique de substances actives ayant un rôle physiologique fondamental dans l'organisme des mammifères: les hormones et plus particulièrement les neurohormones polypeptidiques amidées. Disposant en premier lieu des ADNc correspondant aux substances actives, il sera alors possible d'introduire par génie génétique le vecteur cloné pour mener la synthèse des hormones ayant une application thérapeutique par des micro-organismes. L'invention a d'abord pour objet un oligonucléotide OX simple brin pouvant s'hybrider dans des conditions douces avec un oligonucléotide OY de séquence Y 1-Y2-Y3-Y4-Y5, dans laquelle Y1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Y1 est supprimé, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 et Y4 représentent indépendamment un trinucléotide codant pour Arg ou Lys, et Y5 représente une séquence nucléotidique de 1 à 21 nucléotides ou Y5 est supprimé. On entend par nucléotide une unité monomère de l'ARN ou de I'ADN ayant la structure chimique d'un ester phosphorique de nucléoside. Un nucléoside résulte de la liaison d'une base purique (purine, adénine, guanine ou analogues) ou d'une base pyrimidique (pyrimidine, cytosine, uracile ou analogues) avec le ribose ou le désoxyribose. Un oligonucléotide est un polymère de nucléotides désignant une séquence amorce, une sonde ou un fragment d'ARN ou d'ADN. Les oligonucléotides cités peuvent être obtenus par synthèse, il existe une méthode automatisée de référence qui est décrite dans les publications suivantes: "DNA synthesis" de S.A. Narang, Tetrahedron, 39, 3 (1983) et "Synthesis and use of synthetic oligonucleotides" de K. Itakura, J.J. Rossi et R.B. Wallace, Annu. Rev. Biochem., 53, 323 (1984). De préférence, OX peut s'hybrider dans des conditions stringentes avec OY. De façon plus préférentielle, OX peut s'hybrider avec un oligonucléotide OY de séquence Y2-Y3-Y4-Y5. De façon encore plus préférentiellement, OX peut s'hybrider avec un oligonucléotide OY de séquence Y1-Y2-Y3-Y4 ou Y2-Y3-Y4. Particulièrement, OX peut s'hybrider avec un oligonucléotide OY tel que Y5 représente une séquence nucléotidique Y6-Y7-Y8-Y9 dans laquelle Y6 représente un trinucléotide -4- codant pour Ser, Thr, ou Tyr, Y7 représente un trinucléotide codant pour un acide aminé quelconque, Y8 représente un trinucléotide codant pour Glu ou Asp et Y9 représente une séquence nucléotidique comprenant de 1 à 12 nucléotides. Plus particulièrement, OX peut s'hybrider avec un oligonucléotide OY tel que Y1 et Y9 sont supprimés. Tout particulièrement, OX peut s'hybrider avec un oligonucléotide OY dans lequel Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 représente un trinucléotide codant pour Lys, Y4 un trinucléotide codant pour Arg et Y5 une séquence de 3 trinucléotides codant pour Ser-Ala-Glu. Cette séquence a été déterminée grâce à une étude statistique sur 27 sites d'amidation connus et a conduit à définir sur 6 positions un motif donné d'acides aminés: Gly-Lys- Arg-Ser-Ala-Glu. En raison de la dégénérescence du code génétique et du nombre élevé de codons correspondant à la Gly (4 codons), à l'Arg (6 codons) et à la Ser (6 codons), la séquence de l'oligonucléotide a été construite à l'aide de deux procédés permettant de prendre en compte cette dégénérescence: - utilisation à certaines positions de l'inosine, nucléotide dont la base azotée, l'hypoxanthine, s'apparie indifféremment avec les 4 bases azotées constitutives de 1'ADN, - variation, à certaines positions, de la nature de la base azotée incorporée générant ainsi un nombre de combinaison d'oligonucléotides proportionnel au nombre de bases différentes introduites. La présente invention a également pour objet un oligonucléotide OY comportant de 9 à 42 nucléotides de séquence Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, dans laquelle Y1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Y1 est supprimé, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 et Y4 représentent indépendamment un trinucléotide codant pour Arg ou Lys, et Y5 représente une séquence nucléotidique de 1 à 21 nucléotides ou Y5 est supprimé. De préférence, l'invention a pour objet un oligonucléotide OY tel que Y1 est supprimé ou tel que Y5 est supprimé. L'invention a particulièrement pour objet un oligonucléotide OY tel que Y5 représente une séquence nucléotidique Y6-Y7-Y8-Y9, dans laquelle Y6 représente un trinucléotide codant pour Ser, Thr ou Tyr, Y7 représente un trinucléotide codant pour un acide aminé -5- quelconque, Y8 représente un trinucléotide codant pour Glu ou Asp et Y9 représente une séquence nucléotidique comprenant 1 à 12 nucléotides. L'invention a plus particulièrement pour objet un oligonucléotide OY tel que Y1 et Y9 sont supprimés. L'invention a tout particulièrement pour objet un oligonucléotide OY, caractérisé en ce que Y1 est supprimé, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 représente un trinucléotide codant pour Lys, Y4 un trinucléotide codant pour Arg et Y5 une séquence de trois trinucléotides codant pour Ser-Ala-Glu. La présente invention concerne aussi un oligonucléotide simple brin OZ, caractérisé en ce qu'il comprend de 15 à 39 nucléotides et est capable de s'hybrider avec une séquence consensus signal caractéristique des hormones polypeptidiques amidées, ladite séquence ayant pour formule Z1Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 dans laquelle Z1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Z1 est supprimé, Z2 et Z3 représentent deux trinucléotides codant pour Leu, Z4 et Z5 représentent deux trinucléotides codant pour deux acides aminés quelconques, Z6 représente un trinucléotide codant pour Leu, et Z7 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Z7 est supprimé. Dans cette invention, on entendra par hormone, les hormones polypeptidiques amidées du système endocrinien, et plus particulièrement les neurohormones. La séquence consensus signal est une séquence portée par les précurseurs des protéines qui sont sécrétées par les cellules après leur maturation. La présente invention concemrne enfin un ensemble d'oligonucléotides OX ou OZ tel qu'il constitue une librairie combinatoire. Dans l'invention décrite, on entend par librairie combinatoire un ensemble d'oligonucléotides synthétisés en prenant pour modèle une séquence nucléotidique codant pour une séquence d'acides aminés dont certains peuvent être variables. Du fait de la dégénérescence du code génétique, on obtiendra un ensemble d'oligonucléotides différents. Un autre objet de l'invention est une méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale arnidée, caractérisée par les étapes successives suivantes: 1 - obtention d'une banque d'ADN; -6- 2 hybridation d'un ou plusieurs oligonucléotides OX avec ladite banque d'ADN; 3 - identification de la ou les séquences d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide OX; 4 - identification dans cette ou ces séquences d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminal amidée. On préférera une méthode telle que la banque d'ADN est une banque d'ADNc. L'ADN complémentaire (ADNc) est une chaîne nucléotidique dont la séquence est complémentaire de celle d'un ARNm, la réaction conduisant aux ADNc monocaténaire est catalysée par la transcriptase inverse. L'ADNc bicaténaire peut être obtenu par action de l'ADN polymérase, il est ensuite inséré à l'aide d'une ligase dans un plasmide ou un vecteur dérivé du bactériophage A. Une banque d'ADNc regroupe les ADNc correspondant aux ARNm cytoplasmiques extrait d'une cellule donnée. La banque est dite complète lorsqu'elle comprend au moins un clone bactérien pour chaque ARNm de départ. L'hybridation a lieu lorsque deux oligonucléotides ont des séquences nucléotidiques substantiellement complémentaires, ils peuvent s'associer sur leur longueur par établissement de liaisons hydrogène entre bases complémentaires. On préférera particulièrement une méthode telle que l'oligonucléotide OX est délectable à l'aide d'un agent de marquage, tel que le 32p ou la digoxygénine. Les agents de marquage radioactif des nucléotides les plus couramment utilisés sont les éléments qui émettent des rayons 5, par exemple, 3H, 12C, 32p, 33p et 35S. Le marquage de l'oligonucléotide se fait par l'addition à son extrémité 5' d'un groupement phosphate apporté par le (y-32P)-ATP, cette réaction est catalysée par l'enzyme T4-polynucléotide kinase. Le marquage par la digoxygénine est immunoenzymatique, la digoxygénine est associée à une base azotée et incorporée à l'oligonucléotide. Sa présence est révélée par l'utilisation d'un anticorps dirigé contre la digoxygénine et couplé à une phosphatase alcaline. La révélation utilise la couleur développée par un substrat hydrolysé par la phosphatase alcaline. D'autres techniques de marquage peuvent être employées: oligonucléotides modifiés chimiquement pour qu'ils contiennent un agent de complexation des métaux (on utilise -7- souvent des complexes du lanthanide), un groupe contenant de la biotine ou ester d'acridine, un composé fluorescent (fluorescine, rhodamine, Texas red) ou autre. On préférera tout particulièrement une méthode d'identification de précurseur d'hormone polypeptidique amidée telle que l'étape d'hybridation utilise une librairie combinatoire d'oligonucléotides OX. L'invention a encore pour objet une méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale amidée, qui comprend les étapes suivantes: 1 - obtention d'une banque d'ADN; 2 - utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un ensemble d'oligonucléotides OX et un autre ensemble d'oligonucléotides OZ; 3 - identification de la séquence d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec l'oligonucléotide OX et qui atét amplifiée par la réction de PCR; 4 - identification dans cette séquence d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale amidée. On entend par fragment d'intérêt la séquence d'ADNc codant pour le précurseur d'une ou plusieurs hormones polypeptidiques amidées. La réaction d'amplification de 1'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) nécessite une préparation d'ADN dénaturé par chauffage à 95 C. Ensuite, cette préparation est appariée à un excès de deux oligonucléotides complémentaires aux brins opposés de l'ADN, de part et d'autre de la séquence à amplifier. Chaque oligonucléotide sert ensuite d'amorce à une DNA polymérase (extraite de bactéries thermophiles du type Thermus aquatitus: Taq polymérase) pour la copie de chacun des brins de 1'ADN. Ce cycle peut être répété, de manière automatisée, par dénaturations-renaturations successives. Il existe de nombreuses références détaillant les protocoles du PCR: Brevets US n 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159 et 4.965.188, "PCR technology: principles and applications for DNA amplification", H. Erlich, ed. Stockton Press, New York (1989) et "PCR protocols: a guide to methods and applications", Innis et al., eds. Academic Press, San Diego, California (1990). De préférence, ladite banque d'ADN est une banque d'ADNc. Plus préférentiellement, ledit oligonucléotide OX est détectable à l'aide d'un agent de marquage tel que le 32p ou la digoxygénine. -8- On préférera particulièrement une méthode d'identification de précurseur d'hormone polypeptidique amidée telle que l'étape d'amplification utilise une librairie combinatoire d'oligonucléotides OX et une autre librairie combinatoire d'oligonucléotides OZ. Un autre objet de l'invention est une méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale amnidée, qui comprend les étapes suivantes: 1 - obtention d'une banque d'ADN; 2 utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un ensemble d'oligonucléotides OX; 3 - identification de la séquence d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec l'oligonucléotide OX et qui atét amplifiée par la réction de PCR; 4 - identification dans cette séquence d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale amidée. Le but de cette méthode est de caractériser les séquences nucléotidiques codant pour des précurseurs présentant plus d'un site d'amrnidation. is De préférence, ladite banque d'ADN est une banque d'ADNc. Plus préférentiellement, ledit oligonucléotide OX est détectable à l'aide d'un agent de marquage tel que le 32p ou la digoxygénine. On préférera particulièrement une méthode d'identification de précurseur d'hormone polypeptidique amidée telle que l'étape d'amplification utilise une librairie combinatoire d'oligonucléotides OX. Une autre méthode proposée par la présente invention pour l'identification du précurseur d'un polypeptide ayant une extrémité C- terminale amidée, est caractérisée par les étapes suivantes: 1 - obtention d'une banque d'ADN; s 2 - utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un oligonucléotide OX et un autre oligonucléotide simple brin capable de s'hybrider en conditions douces ou stringentes avec une séquence consensus universelle contenue dans la séquence du vecteur plasmidique dans lequel sont clonés les ADN de la dite banque d'ADN, tels que les primers T3, T7, KS, SK, M13, Reverse; -9- 3 - identification de la séquence d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide OX; 4 - identification dans cette séquence d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale amidée. La séquence consensus universelle est une séquence portée par le vecteur dans lequel est cloné l'ADN de la banque. Cette séquence peut servir d'amorce pour le séquençage. Les séquences nucléotidiques de ces primers sont disponibles dans: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., "Molecular cloning, a laboratory manual", 2nd edition, 1989, Colel Spring Harbor Laboratory Press. La réaction du PCR nécessite que deux oligonucléotides se fixent sur l'ADNc cloné dans un vecteur pour que son amplification ait lieu. Dans le cas o l'on ne connaît qu'une seule séquence propre au fragment d'ADN à amplifier, une solution pour contourner ce problème est d'utiliser un oligonucléotide qui pourra s'hybrider avec une séquence nucléotidique propre au vecteur dans lequel a été cloné l'ADNc, telle qu'une séquence consensus universelle. De préférence, ladite banque d'ADN est une banque d'ADNc. On préférera un oligonucléotide OY détectable à l'aide d'un agent de marquage tel que le 32p ou la digoxygénine. On préférera plus particulièrement une étape d'amplification utilisant une librairie combinatoire d'oligonucléotides OX. -10- EXEMPLE: La méthode décrite par l'invention a été validée par son application sur une hormone déjà isolée. La neurohormone choisie est la cholécystokinine (CCK) qui est le neuromédiateur quantitativement le plus important représenté dans le cerveau. 1. 1. Préparation de la matrice d'ADN servant aux réactions de PCR à partir d'une banque commerciale Lambda Zapp II (Rat Brain cDNA Library Vector. réf. 936 501) de STRATAGENE (Lafolla. U.S.A.). Cette banque d'ADNc Stratagene contient le clonage des ADNc de cellules de cerveau de rat. 1.1.1. Libération des ADNc clonés sous forme de phagemides Bluescript (Stratagene, Lajolla, U.S.A.). Elle se fait en suivant le protocole suivant: on met en contact pendant 15 minutes à 37 C, 250 l de la banque d'ADNc à 2.108 PFU/ml, 200 B1 de bactéries XL, blue (génotype: recAl endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacIqZAM15 TnlO (Tetr)]c - cf. Bullock, Fernandez, Short, Biotechniques, 5, 376-379 (1987) - densité optique à 600 nm: D.O. = 2,5) et 1 p de phage ExAssistTM (cf. Hay, B., Short, J., Strategies, 5, 16-18 (1992)) à 1010 PFU/ml. Puis l'ensemble est incubé sur 50 ml de milieu LB (composition: pour 1 litre d'eau physiologique stérile, on mélange 10 g de NaCi, 5 g d'extrait de levure et 10 g de Bactotryptone) pendant 3 heures sous agitation à 37 C. Le bouillon de culture est centrifugé puis le sumrnageant est inactivé par chauffage à C pendant 20 minutes. 1.1.2. Obtention des ADNc sous forme d'une banque de plasmides double brin. Cette étape nécessite 15 minutes d'incubation à 37 C de 100 pl du surnageant inactivé et pl de bactéries SOLRTM (génotype: el14-(McrA-) A(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbcC recB recJ uvrC umuC::Tn5 (Kanr) lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1 XR [F proAB lacIqZAM15]C Su- (nonsuppressing) - cf. Hay, B., Short, J.M., Strategies, 5(1), 16-18 (1992) - D.O. = 1 à 600 nm). Après addition de 50 gl d'ampicilline (à 100 mg/ml) et de ml de milieu LB, le tout est mis à incuber à 37 C sous agitation pendant une nuit. Les plasmides sont préparés à partir de 50 ml de culture avec le protocole et les colonnes QIAGEN Plasmid Midi Kit de QIAGEN (les colonnes QIAGEN contiennent une résine d'échange anionique possédant à sa surface des groupes diéthylaminoéthanol chargés positivement, lesquels interagissent avec les phosphates du squelette de l'ADN). On a ainsi obtenu une solution d'ADN à 1,37.g/pl. -11- 1.2. Amplification d'une portion du précurseur de la CCK à partir de la banque de plasmides ainsi préparée. 1.2.1. Etablissement des séquences des deux oligonucléotides nécessaires à la réaction de PCR. L'un de ces deux nucléotides contiendra la séquence complémentaire à celle codant pour le site d'amidation de la CCK, ce site est connu et a pour séquence GlyArg-Arg-Ser-Ala- Glu. Cet oligonucléotide, que l'on nommera oligo CCK amid, a pour séquence nucléotidique: ' CTCAGCACTGCGCCGGCC 3' Le second oligonucléotide, noté oligo CCK 5', correspond à la séquence consensus signal: ' GTGTGTCTGTGCGTGGTG 3' La taille du produit d'amplification attendu est de 315 paires de bases, c'est la distance existant entre les séquences correspondant à ces deux oligonucléotides sur la séquence précurseur de la CCK. 1.2.2. Réaction de PCR. On prépare une dilution D1 contenant 1 gl d'enzyme Taq polymérase Goldstar 5 U/fl (cf. Reynier, P., Pellissier, J.F., Harle, J.R., Malthiéry, Y., Biochemical and Biophysical Research Communications, 205(1), 375-380 (1994)), 1 Ill d'un tampon 10 fois concentré en Taq polymérase standard et 8 gp1 d'eau. Puis on mélange 1 g1 d'oligo CCK 5' à 250 ng/pl, 1 gl d'oligo CCK amid à 250 ng/gl, 1 11 dNTP à 10 mM chacun, 1 gl d'ADN banque ADNc à 250 ng/Itl, 5 l1 de tampon fois concentré de l'enzyme Taq polymérase, 2 p1 MgCl2 à 25 mM, 1 pl1 de la dilution D1 et 37 Ill d'eau. Les conditions d'amplification sont les suivantes: on effectue d'abord un traitement thermique de 5 minutes à 95 C, puis on renouvelle 30 cycles. Les dénaturations se font pendant 45 secondes à 95 C, l'hybridation pendant 30 secondes à 60 C et l'élongation pendant 1 minute à 72 C. Enfin, un cycle supplémentaire est mené avec une élongation de minutes à 72 C. -12- 1.2.3. Résultats. Les résultats sont lus par migration sur gel d'agarose à 0,8% de 1/10 du produit de la réaction de PCR. En présence de bromure de 3,8-diamino-5-éthyl-6- phénylphénanthridinium (bromure d'éthydium), on visualise sur le gel une bande unique, intense, de taille légèrement supérieure au marqueur de poids moléculaire 300. 1.3. Sous clonage du produit PCR dans un vecteur permettant le séquençage. Le vecteur utilisé est le pGEM T-easy Vector (commercialisé par PROGEMA Corporation, Madison, U.S.A., réf. A 1380 - séquence donnée en annexe I). Les étapes sont les suivantes: - purification de la bande correspondante au produit PCR par électroélution, - ligation durant une nuit à 16 C avec 1 gl de vecteur pGEM T-easy à ng/gl, 1 gl de tampon ligase concentré 10 fois, - 3.tl de produit extrait de la bande purifié estimée à 20 ng/gl, - on complète avec de l'eau jusqu'à 10 pi. Les bactéries JM 109 (génotype: e14-(McrA-) recAl endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK. mK+) supE44 relA1 A(lac-proAB) [F traD36 proAB lacIqZAM15] - cf. YanishPerron, C., Viera, J., Messing, J., Gene, 33, 103-199 (1985)) sont rendues compétentes par un traitement préalable au CaC12 puis transformées par un choc thermique de 45 secondes à 42 C avec 1/5 de la ligation. Les cellules sont ensuite mises en culture sur le milieu LB- ampicilline en boîte de Pétri pendant toute une nuit à 37 C. On prépare l'ADN plasmidique de quelques clones recombinant. Puis le sous clonage est vérifié par la digestion enzymatique avec Eco RI. 1.4. Séquencage. Il est effectué par la technique classique des didésoxynucléotides de SANGER sur le vecteur pGEM T-easy Vector ayant incorporé le produit PCR de 315 paires de bases (préparé à grande échelle par le kit QIAGEN tip 100). L'amorce utilisée pour le séquençage est l'oligonucléotide universel T7 présent sur le plasmide pGEM T-easy Vector. -13- 1.5. Résultat. Le séquence brute suivante est obtenue: GTG TGT CTG TGC GTG GTG ATG GCA GTC CTG GCA GCA GGC GCC CTG GCG CAG CCG GTA GTC CCT GTA GAA GCT GTG GAC CCT ATG GAG CAG CGG GCG GAG GAG GCG CCC CGA AGG CAG CTG AGG GCT GTG CTC CGA CCG GAC AGC GAG CCC CGA GCG CGC CTG GGC GCA CTG CTA GCC CGA TAC ATC CAG CAG GTC CGC AAA GCT CCC TCT GGC CGC ATG TCC GTT CTrt AAG AAC CTG CAG GGC CTG GAC CCT AGC CAC AGG ATA AGT GAC CGG GAC TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTC GGC CGG CGC AGT GCT GAG lO La traduction en acides aminés de la séquence obtenue aboutit à: VCLCVV MAVLAAGALA QPVVPVEAVD PMEQRAEEAP RRQLRAVLRP DSEPRARLGA LLARYIQQVR KAPSGRMSVL KNLQGLDPSH RISDRDYMGW MDFGRRSAE permet bien de retrouver la séquence nucléotidique du précurseur de la CCK (dont la séquence a été fournie par la banque de données Swiss Prot n p01355). L'abréviation des acides aminés est la suivante: Alanine A Leucine L Argine R Lysine K Acide aspartiqueD Méthionine M Asparagine NPhénylalanine F Cystéine C Proline P Acide glutamiqueE Sérine S Glutarnine Q Thréonine T Glycine G Tryptophane W Histidine H Tyrosine Y -14Isoleucine I Valine V 4. + 2767830 ANNEXE I Séquence du plasmide pGEM -T Easy Vector Le plasmide pGEM -T Easy Vector, dont la séquence est reproduite ci-dessous, a été linéarisé avec EcoR V à la base 60 de cette séquence (indiquée par une astérisque). On lui a ajouté un T aux deux extrémités 3'. Le T ajouté n'est pas inclus dans cette séquence. La séquence reproduite ci-après correspond à I'ARN synthétisé par la T7 ARN polymérase et est le complémentaire de I'ARN synthétisé par la SP6 ARN polymérase. 1. GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCGGCCGCG 51 GGAATTCGAT*ATCACTAGTG AATTCGCGGC CGCCTGCAGG TCGACCATAT 101 GGGAGAGCTC CCAACGCGTT GGATGCATAG CTTGAGTAT CTATAGTGTC 151 ACCTAAATAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAT 201 TGTTATCCGC TCCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG 251 TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC 301 GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA 351 TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC 401 CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG 451 CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG 501 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA 551 CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG 601 ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA 651 GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC 701 TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT 751 CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG 801 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA 851 GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG 901 TAAGACAJCGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC 951 AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA 1001 CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC 1051 CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC 1101 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG 1151 AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG 1201 CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA 1251 AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAATGAA GTTTTAAATC 1301 AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA 1351 TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT 1401 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC 1451 TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA& CCCACGCTCA CCGGCTCCAG 1501 ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT 1551 CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC 1601 TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGGCATTG 1651 CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC 1701 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA 1751 AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG 1801 CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT 1851 GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA 1901 GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT 1951 CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC 2001 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT 2051 GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT 2101 CTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT 2151 GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AATGTTGAA TACTCATACT 2201 CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA 2251 GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG 2301 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGTA TGCGGTGTGA AATACCGCAC 2351 AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGAAATTGTA AACGTTAATA 2401 TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATATTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC 2451 CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAA3 AATAGACCGA 2501 GATAGGGTTG AGG'tGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA 2551 ACGTGGACTC CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA CGGGCGATGGC 2601 CCACTACGTG AACCATCACC CAAATCAAGT TSTTTGCGGT CGAGGTGCCG 2651 TAAAGCTCTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT AGAGCTTGAC 2701 GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA 2751 GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC 2801 CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC ATTCGCCATT 2851 CAGGCTGCGC AACTGTtGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 2901 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA 2951 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT 3001 GTAATACGAC TCACTATA Revendications 1. Oligonucléotide OX simple brin, caractérisé en ce qu'il comprend de 9 à 42 nucléotides et est capable de s'hybrider dans des conditions douces avec un oligonucléotide OY de séquence Y1-Y2-Y3-Y4-YS, dans laquelle Y1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Y1 est supprimé, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 et Y4 représentent indépendamment un trinucléotide codant pour Arg ou Lys, et Y5 représente une séquence nucléotidique de 1 à 21 nucléotides ou Y5 est supprimé. 2. Oligonucléotide OX selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de 9 à 42 nucléotides et est capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec un oligonucléotide OY de séquence Y1-Y2-Y3Y4-Y5, dans laquelle YI représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Y1 est supprimrné, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 et Y4 représentent indépendamment un trinucléotide codant pour Arg ou Lys, et Y5 représente une séquence nucléotidique de 1 à 21 nucléotides ou Y5 est supprimé. 3. Oligonucléotide OX selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Y1 est supprimé dans l'oligonucléotide OY. 4. Oligonucléotide OX selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que Y5 est supprimé dans l'oligonucléotide OY. 5. Oligonucléotide OX selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que, dans OY, Y5 représente une séquence nucléotidique Y6-Y7-Y8-Y9, dans laquelle Y6 représente un trinucléotide codant pour Ser, Thr, ou Tyr, Y7 représente un trinucléotide codant pour un acide aminé quelconque, Y8 représente un trinucléotide codant pour Glu ou Asp et Y9 représente une séquence nucléotidique comprenant de 1 à 12 nucléotides. 6. Oligonucléotide OX selon la revendication 5, caractérisé en ce que Y1 et Y9 sont supprimés dans l'oligonucléotide OY. 7. Oligonucléotide OX selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il peut s'hybrider avec ledit oligonucléotide OY dans lequel Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 représente un trinucléotide codant pour Lys, Y4 un trinucléotide codant pour Arg et Y5 une séquence de 3 trinucléotides codant pour Ser-Ala-Glu. 8. Oligonucléotide simple brin OY, caractérisé en ce qu'il comprend de 9 à 42 nucléotides de séquence Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, dans laquelle Y1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Y1 est supprimé, Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 et Y4 représentent indépendamment un trinucléotide codant pour Arg ou Lys, et Y5 représente une séquence nucléotidique de 1 à 21 nucléotides ou Y5 est supprimé. 9. Oligonucléotide OY selon la revendication 8, caractérisé en ce que Y1 est supprimé 10. Oligonucléotide OY selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que Y5 est supprimé. 11. Oligonucléotide OY selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que Y5 représente une séquence nucléotidique Y6-Y7-Y8-Y9, dans laquelle Y6 représente un trinucléotide codant pour Ser, Thr, ou Tyr, Y7 représente un trinucléotide codant pour un acide aminé quelconque, Y8 représente un trinucléotide codant pour Glu ou Asp et Y9 représente une séquence nucléotidique comprenant de 1 à 12 nucléotides. 12. Oligonucléotide OY selon la revendication 11, caractérisé en ce que Y1 et Y9 sont supprimés. 13. Oligonucléotide OY selon la revendication 12, caractérisé en ce que Y2 représente un trinucléotide codant pour Gly, Y3 représente un trinucléotide codant pour Lys, Y4 un trinucléotide codant pour Arg et Y5 une séquence de 3 trinucléotides codant pour Ser-Ala- Glu. 14. Ensemble d'oligonucléotides OX selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il constitue une librairie combinatoire. 15. Méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale amnidée, caractérisée par les étapes successives suivantes: - obtention d'une banque d'ADN; - hybridation d'un ou plusieurs oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 avec ladite banque d'ADN; - identification de la ou les séquences d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; - identification dans cette ou ces séquences d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-termrinale amrnidée. 16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'étape d'hybridation utilise une librairie combinatoire selon la revendication 14. 17. Méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale amidée, caractérisée par les étapes successives suivantes: - obtention d'une banque d'ADN; - utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un ensemble d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et d'un autre ensemble d'oligonucléotides simple brin OZ, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 15 à 39 nucléotides et sont capables de s'hybrider en conditions douces ou stringentes avec une séquence consensus signal caractéristique des hormones polypeptidiques amidées, ladite séquence ayant pour formule Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 dans laquelle Z1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Z1 est supprimé, Z2 et Z3 représentent deux trinucléotides codant pour Leu, Z4 et Z5 représentent deux trinucléotides codant pour deux acides aminés quelconques, Z6 représente un trinucléotide codant pour Leu, et Z7 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Z7 est supprimé; - identification de la ou les séquences d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; - identification dans cette ou ces séquences d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale arnidée. 18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'étape d'amplification utilise une librairie combinatoire selon la revendication 14 ou une librairie combinatoire d'oligonucléotides simple brin OZ, lesdits oligonucléotides OZ étant caractérisés en ce qu'ils comprennent de 15 à 39 nucléotides et sont capables de s'hybrider en conditions douces ou stringentes avec une séquence consensus signal caractéristique des hormones polypeptidiques amrnidées, ladite séquence ayant pour formule Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 dans laquelle Z1 représente une séquence nucléotidique de 1 à 12 nucléotides ou Z1 est supprimé, Z2 et Z3 représentent deux trinucléotides codant pour Leu, Z4 et Z5 représentent deux trinucléotides codant pour deux acides aminés quelconques, Z6 représente un trinucléotide codant pour Leu, et Z7 représente une séquence nucléotidique de I à 12 nucléotides ou Z7 est supprimé. 19. Méthode d'identification du précurseur d'un peptide ayant une extrémité C-terminale arnidée, caractérisée par les étapes successives suivantes: - obtention d'une banque d'ADN; - utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un ensemble d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; - identification de la ou les séquences d'ADN de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7; - identification dans cette ou ces séquences d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale amidée. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'étape d'amplification utilise une librairie combinatoire selon la revendication 14. 21. Méthode d'identification du précurseur d'un polypeptide ayant une extrémité C- terminale amidée, caractérisée par les étapes suivantes: -obtention d'une banque d'ADN; - utilisation de la technique PCR pour amplifier le fragment d'intérêt à l'aide d'un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et un autre oligonucléotide simple brin capable de s'hybrider en conditions douces ou stringentes avec une séquence consensus universelle contenue dans la séquence du vecteur plasmidique dans lequel sont clonés les ADNc de ladite banque d'ADN, tels que les primers T3, 1T7, KS, SK, M13, Reverse; identification de la séquence d'ADNc de ladite banque qui s'hybride avec un oligonucléotide selon l'une quelconque des revendication 1 à 7; identification dans cette séquence d'un ou plusieurs peptides avec une possible extrémité C-terminale amnidée. 22. Méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce que l'étape d'amplification utilise une librairie combinatoire selon la revendication 14. 23. Méthode selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, caractérisée en ce que la banque d'ADN est une banque d'ADNc. 24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisée en ce que l'oligonucléotide simple brin est détectable à l'aide d'un agent de marquage, tel que le 32p ou la digoxygénine.