Brevet FR2763957A1 — publié le 19981204

La présente invention concerne un procédé pour isoler un matériel intracellulaire, nucléique et/ou protéique, à partir d'un échantillon cellulaire en suspension dans un liquide, comprenant une étape de lyse cellulaire et une étape de séparation. Le procédé de l'invention est simple à mettre en oeuvre, est adapté à toute cellule, cellule eucaryote, cellule procaryote, notamment bactérie Gram + ou Gram -, quelle que soit la nature et la résistance de l'enveloppe cellulaire, et permet d'accéder directement au matériel intracellulaire sans qu'une étape supplémentaire de purification ne soit nécessaire. La Demanderesse a découvert, de manière complètement inattendue, que l'exposition d'un échantillon cellulaire & une impulsion électrique, dans des conditions réactionnelles déterminées, conduit & une lyse cellulaire avec un rendement maximal, tout en libérant des constituants intracellulaires sous une forme directement exploitable dans une étape ultérieure de traitement, notamment séparation. Comme le résume l'article de T.Y. TSONG (dans Biophysical Journal of Biochemical Society (1991) 60, 297308), on connais un procédé de traitement électrique d'une suspension de cellules, utilisé dans la technique dite d'électroporation, et caractérisé par l'exposition de la suspension & un champ électrique. Selon cette technique, on provoque la perforation de la membrane cellulaire pour obtenir des pores, au travers desquels les constituants intracellulaires vont sortir, mais par lesquels il est ainsi possible d'introduire diverses substances exogènes. La grande variété des substances que l'on peut incorporer comme par exemple des molécules å activité biologique, pharmaceutique, des acides ou fragments d'acides nucléiques, et notamment plasmides, confère & cette technique un large spectre d'utilisations. Plus précisément cette technique consiste & appliquer un champ électrique d'une intensité supérieure & la force diélectrique de la membrane cellulaire, entraînant une modification de sa conductivité et donc de sa perméabilité. A condition d'opérer dans des conditions sensiblement isotoniques pour qu'une pression osmotique du même ordre existe entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule, cette transformation structurale de la membrane est réversible, et lorsque la suspension n'est plus soumise à l'effet du champ électrique, les pores se referment, emprisonnant les substances exogènes qui se sont introduites. A chaque espèce de cellules correspond une valeur optimale du champ électrique. Cette dernière dépend directement de la résistance et de la constitution de la paroi cellulaire. I1 faut noter qu'un champ d'intensité trop élevée provoque la formation de pores d'une taille telle qu'ils ne peuvent plus se refermer, et entraîne ainsi la mort de la cellule. K. KINOSITA et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1979 > 554, 479-497) ont observé que l'exposition d'une suspension isotonique d'érythrocytes à un champ électrique entraîne l'accroissement de la perméabilité membranaire, mais que le flux de soluté entrant à l'intérieur de la cellule par les pores formés dans la membrane, engendre un gonflement de la cellule qui provoque sa lyse. Cependant ce phénomène de lyse après électroporation, résultant d'une surpression å l'intérieur de la cellule a été observé pour les érythrocytes qui possèdent une membrane plasmique assez peu résistante, et ne peut pas être généralise & tout type de cellules, notamment bactéries. Selon l'invention, on apporte un procédé permettant en un temps très court de lyser toutes les cellules d'une suspension, quelle que soit la concentration en cellules, c'est- & -dire même pour des fortes concentrations. Ce procédé comprend les étapes suivantes (a) on expose l'échantillon cellulaire en suspension dans un liquide, à au moins une impulsion électrique, dont au moins une caractéristique est déterminée pour permettre une lyse pratiquement complète du matériel intracellulaire; (b) on sépare du matériel cellulaire lysé, une fraction nucléique et/ou une fraction protéique. Pour l'étape (a), on définit avantageusement la durée de l'impulsion électrique de manière telle qu'on obtient une lyse complète du matériel intracellulaire. La durée de l'impulsion peut notamment être déterminée par la capacité et/ou la résistance électrique d'un circuit électrique de charge. A titre d'exemple, la capacité a une valeur au moins égale & 500 ZFD, de préférence au moins égale & 950 îFD, et/ou la résistance a une valeur au moins égale & 50 Ohms. Ainsi, la durée de l'impulsion électrique, définie par l'intervalle de temps pendant lequel la tension électrique est au moins égale à 50 % de la tension maximale, est de préférence au moins égale & 200 ms. Une caractéristique de l'impulsion électrique est avantageusement déterminée pour établir dans l'échantillon un champ électrique au moins égal à 2500 V/cm. Les caractéristiques de l'impulsion électrique & appliquer & l'échantillon cellulaire pour provoquer la lyse selon l'invention, peuvent être atteintes au moyen d'un générateur électrique préconisé pour la technique d'électroporation, bien que la gamme des valeurs des caractéristiques selon l'invention se situe en dehors du domaine de celles utilisées dans l'électroporation. Pour un meilleur rendement de la lyse cellulaire, le liquide dans lequel l'échantillon cellulaire est en suspension est de préférence l'eau. Avant d'exposer des variantes du procédé de l'invention, et d'en détailler les caractéristiques et avantages, on définit ci-après certains termes employés dans la présente description et les revendications. Par isolement d'un matériel intracellulaire selon l'invention, on comprend la séparation, la détection de ce matériel, l'enrichissement d'une fraction en ledit matériel, selon une méthode d'isolement spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative. Selon une variante du procédé de l'invention, ainsi que l'illustration qui en est faite dans l'exemple 2 et 3 qui suivent, le procédé est appliqué a l'isolement de matériel nucléique, mais bien entendu, cette mise en oeuvre particulière n'introduit aucune limitation & ce matériel. Ainsi, le matériel intracellulaire à isoler peut consister en une fraction protéique. Un échantillon cellulaire tel qu'on l'entend selon l'invention, comprend tout échantillon susceptible de contenir des cellules, notamment un échantillon biologique tel que celui obtenu à partir d'un fluide biologique, un échantillon d'origine alimentaire. L'échantillon consiste en tout ou partie d'un échantillon, en particulier il peut consister en un aliquote, une dilution. Selon l'invention, une impulsion électrique se définit comme un apport important d'énergie électrique sur une courte période. Dans une mise en oeuvre particulière du procédé de l'invention, le matériel intracellulaire & isoler est un matériel nucléique, et on sépare le matériel nucléique par mise en contact de l'échantillon cellulaire lysé avec une protéase ou un composé libérant des radicaux organiques. La protéase ou ledit réactif peut être introduit au départ dans l'échantillon cellulaire, pendant ou après l'étape (a) de lyse. La protéase est notamment choisie parmi la pronase, les subtilysines, la pepsine, la trypsine, le lysozyme, la chymotrypsine, l' La concentration de la protéinase K dans l'échantillon est comprise entre 0,5 et 9 mg/ml, de préférence entre 3 à 6 mg/ml, et de préférence encore, la concentration est égale & 6 mg/ml. Un composé libérant des radicaux utile pour séparer le matériel nucléique est un composé qui peut produire sous certaines conditions telles qu'exposition & une source d'énergie lumineuse, thermique, ou sous certaines conditions chimiques, un radical porteur d'au moins un électron libre, très instable et très réactif. Un composé préférentiel est un percomposé, notamment choisi parmi le périodate, le parapériodate, le peroxyde de sodium, le perborate et par exemple le tétrahydrate de perborate de sodium. Un dernier objet de l'invention est un procédé de traitement d'un matériel nucléique, mettant en oeuvre une étape d'isolement du procédé de l'invention, selon lequel, après séparation de la fraction protéique du matériel cellulaire lysé, la fraction nucléique est soumise directement & au moins une étape de traitement. Cette dernière peut consister en une étape de détection d'au moins un composant de la fraction nucléique ou une étape d'amplification d'au moins un composant de la fraction nucléique. Dans ce procédé particulier de traitement d'un matériel nucléique, il est souhaitable que l'étape de lyse (a) entraîne au moins une dénaturation partielle, voire une fragmentation, du matériel nucléique à traiter. Mais le procédé de l'invention peut aussi permettre de récupérer un matériel intracellulaire intact. Par intact, on comprend un matériel substantiellement non dénaturé et non fragmenté. A cet effet, on choisira de préférence une impulsion électrique déterminée par une capacité de 500 ?FD, une résistance de 186 Ohms et une tension électrique de 500 V. La présente invention est ci-après illustrée dans les exemples 1 & 3 suivants, en référence aux figures 1 & 6. La Figure 1 représente le pourcentage de lyse cellulaire en fonction de la capacité du condensateur, pour deux valeurs de la tension de 2,5 kV et de 0,45 kV respectivement, et une résistance de 186 Ohms. La Figure 2 représente le pourcentage de lyse cellulaire en fonction de la capacité du condensateur, pour une tension de 500 V et une résistance de 186 Ohms. La Figure 3 représente le pourcentage de lyse cellulaire en fonction de la capacité du condensateur, pour deux valeurs de la distance entre les électrodes respectivement, pour une tension de 500 V et une résistance de 186 Ohms. La Figure 4 représente le pourcentage de lyse cellulaire en fonction de la résistance du condensateur, pour trois valeurs de la capacité respectivement, et pour une tension de 500 V. La Figure 5 représente le pourcentage de lyse cellulaire en fonction de la capacité du condensateur, pour deux valeurs du volume de la suspension cellulaire respectivement, pour une tension de 500 V et une résistance de 186 Ohms. La Figure 6 représente le pourcentage de détection des acides nucléiques en fonction de l'impulsion électrique, et plus particulièrement de la capacité du condensateur produisant l'impulsion, pour une tension de 500 V et une résistance de 186 Ohms. Exemple 1 s Efficacité du procédé de l'invention sur la lyse de bactéries 1) Protocole aénéral Le protocole suivant constitue le mode opératoire général pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention. Des bactéries & paroi Gram + Staphylococcus epidermidis (souche A054) cultivées en milieu liquide BBC (Bouillon Coeur Cervelle) sont centrifugées & 2500 tours/min pendant 10 minutes1 avant d'être resuspendues dans de l'eau & la concentration 3,3.109 cellules/ml. 300 pl de la suspension sont déposés dans une cuve d'électroporation caractérisée par une distance entre les deux électrodes de 2 mm ou 4 mm. La cuve est placée sur un circuit électrique dont les paramètres électriques sont choisis comme suit - tension variable de O à 2,5 kV, - résistance variable de O à 780 Ohms, - capacité variable de 25 à 3190 pFD. Après lancement de l'impulsion électrique, la décharge électrique se réalise en quelques millisecondes entre les deux électrodes. La suspension bactérienne ainsi traitée est conservée dans la glace. Le pourcentage de lyse après l'impulsion est déterminé immédiatement après recueil de l'échantillon, par mesure de la densité optique à 550 nm. Le pourcentage de lyse est égal au rapport de la valeur de DO à 550 nm de la solution bactérienne après impulsion, à la valeur de DO à 550 nm avant impulsion. 2) Influence de différents paramètres. notamment électriques sur l'efficacité de la lyse L'influence de la capacité, de la résistance du condensateur, du champ électrique et du volume de la suspension a été étudiée. a) Capacité Dans un premier temps, on a utilisé l'appareil Gen Pulser I de bioRad (nO 165-2098 version 8-90). Selon les consignes d'utilisation de l'appareil, deux valeurs de tension ont été choisies, soit 450 V et 2,5 kV. On a fait varier les valeurs de capacité de O & 25 ?FD sous 2,5 kV, et de O & 960 MFD sous 450 V. La valeur de la résistance est fixée à 186 Ohms. La distance entre les deux électrodes est de 2 mm. Comme l'indiquent les résultats apparaissant & la Figure 1, on constate que pour une tension déterminée, le pourcentage de lyse cellulaire augmente avec l'élévation de la capacité appliquée. Par exemple, on peut noter que 50 % de lyse sont obtenus avec une capacité de 960 FD et une tension de 450 V. Dans un second temps, l'efficacité de lyse a pu être améliore par l'utilisation d'un second appareil (BTX de Gentronics, MedGene Science) permettant de tester des valeurs de capacité supérieures, pouvant atteindre 3190 ZFD avec une tension égale à 500 V. Les tests réalisés sur cet appareil dont les résultats apparaissent & la Figure 2, confirment que la lyse cellulaire est d'autant plus efficace que la capacité est élevée, & résistance et tension constantes. Ainsi, pour des valeurs de capacité supérieures à 950 AFD, et des valeurs de tension et de résistance égales à 500 V et 186 Ohms, respectivement, 100 % des bactéries S. epidermidis traitées sont lysées. b) Champ électrique L'influence de la valeur du champ électrique (E = V/d) a ensuite été analysée pour des valeurs de tension (V), de capacité et de résistance constantes et en faisant varier la distance (d) entre les électrodes de la cuve d'électroporation, L'appareil utilisé est le BTX de Gentronics. A 500 V, lorsque la distance est multipliée par deux, le champ électrique appliqué en tout point de la solution est divisé par un facteur deux. On constate dans ces conditions que l'efficacité de la lyse est diminuée, comme montré sur la Figure 3. On constate par ailleurs dans ce cas, qu'il est nécessaire d'appliquer une capacité de 500 ZFD pour obtenir au moins 90 % de lyse cellulaire. c) Résistance L'efficacité de la lyse cellulaire a été analysée dans des conditions de tension constante de 500 V, et pour des valeurs variables de capacité (de 500 pFD à 3190 FD) et de résistance (de O à 780 Ohms). Comme l'indiquent les résultats représentés sur la Figure 4, l'efficacité de la lyse cellulaire augmente avec la valeur de la résistance pour des valeurs constantes de tension et de capacité. d) Volume de la suspension cellulaire Le protocole de lyse cellulaire tel que décrit précédemment a ensuite été conduit à tension constante (500 V), résistance constante (186 Ohms) et capacité variable (de O & 3190 pFD) sur un échantillon de suspension de 300 1 ou 800 l, afin d'étudier l'influence du volume de l'échantillon à traiter sur l'efficacité de la lyse cellulaire. Comme l'indique la figure 5, la lyse cellulaire obtenue dans les conditions électriques décrites est indépendante du volume de suspension cellulaire placé entre les deux électrodes. 3) Efficacité de la lyse selon le procédé de l'invention sur d'autres espèces cellulaires Le procédé de lyse selon l'invention peut être appliqué & d'autres espèces cellulaires. Pour cela, le second protocole décrit en a) (BTX, MedGene Science) a été testé sur d'autres cellules (Mycobacterium gordonae, Escherichia colt, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus stearothermophilus, Micrococcus sp., Actinomyces viscoses, Actinomyces naeslundii, Stomatococcus mucilaginosus, Nocardia asteroides, Rhodococcus sp.) en fixant les paramètres électriques suivants comme suit Tension 500V, Capacité 1500 AFD et Résistance 186 Ohms. Les résultats obtenus indiquent que le pourcentage de lyse cellulaire pour chacun des cas analysés est compris entre 80 et 100 %. Exemple 2 : Analyses des acides nucléiques (ADN/ARN) 168 obtenus après lyse selon le procEd8 de l'invention. Après l'étape de centrifugation (voir exemple 1), le culot bactérien (S. epidermidis - souche A054) est mis en suspension dans de l'eau à la concentration de 3,3.109 cellules/ml en présence ou en absence de protéinase K å la concentration finale de 6 mg/ml (E.C. 3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 1092766). Le protocole est conduit dans les conditions déterminées à l'exemple 1 (tension : 500 V, résistance : 186 Ohms et capacité : 1500 ZFD). Lorsque la suspension bactérienne renferme en outre de la protéinase K, après lyse cellulaire l'échantillon est incubé 15 minutes å 370C. Après traitement, les échantillons sont conservés dans la glace. L'efficacité de la lyse cellulaire est déterminée comme décrit & l'exemple 1 par mesure de la DO à 550 nin. On constate que cette efficacité (100 %) n'est pas influencée par la présence de la protéinase K dans le milieu de lyse. Par ailleurs, l'analyse sur gel d'agarose 0,8 % d'un aliquote de l'échantillon lysé montre qu'en absence de traitement & la protéinase K, le matériel nucléique ne pénètre pas dans le gel et demeure dans les puits du gel avec les débris cellulaires. Par contre, les acides nucléiques libérés dans les échantillons soumis & la digestion par la protéinase K migrent dans le gel en fonction de leur taille. Dans une seconde série d'expérience, les acides nucléiques obtenus après lyse, avec/sans traitement & la protéinase K, ont été analysés avec l'appareil Vidas (bioMérieux France) qui permet de détecter spécifiquement des acides nucléiques selon la technique d'hybridation dite sandwich, en utilisant des sondes oligonucléiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques 16S de S. epidermidis (EP 0632269). Les oligonucléotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID NO: 1) et 5' GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID NO: 2). La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatase alcaline (AKP). Cette analyse montre qu'en l'absence de traitement par la protéinase K, les acides nucléiques ADN/ARN libérés après électroporation ne sont pas détectables par la technique mise oeuvre. Au contraire, le traitement par la protéinase K permet la détection spécifique desdits acides nucléiques, libérés lors de la lyse cellulaire. L'influence du paramètre électrique relatif & la capacité sur la détection spécifique des acides nucléiques 16S de S. epidermidis a été analysée. Les résultats apparaissent sur la figure 6. La détection des acides nucléiques est exprimée en RFU, c'est-à-dire en unité de fluorescence relative. Ces résultats confirment l'influence de la capacité dans la libération des acides nucléiques contenus dans les cellules lors de la lyse réalisée conformément & l'invention. Exemple 3 t Amplification des acides nucléiques ADN et ARN 169 libérés par lyse selon le procédé de l'invention. Les acides nucléiques recueillis selon l'exemple 2 sont soumis & une amplification. Les conditions de lyse sont les suivantes Appareil BTX Gentronics, Tension 500 V, Résistance 186 Ohms, Capacité 1500 HFD, une impulsion électrique. Deux protocoles d'amplification spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis ont été réalisés & partir des lysats recueillis, soit un protocole PCR pour l'amplification de l'ADN, soit un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr 16S. Protocole PCR : la technique de PCR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR strategies, Ed: Innis, Gelford et Sninsky Academic press 1995, pp 17-31. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1 5' ATCTTGACATCCTCTGACC 3'SEQ ID NO: 3 Amorce 2 5' TCGACGGCTAGCTCCAAAT 3' SEQ ID NO: 4 Les cycles de température suivants ont été utilisés 1 fois 3 minutes 940C 2 minutes 650C 35 fois 1 minutes 720C 1 minutes 940C 2 minutes 650C 1 fois 5 minutes 720C Protocole NASBA : la technique de NASBA suivie est celle décrite par Van Der Vliet et al., J. Gen. Microbiol. 1993, 139 : 2423. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1 5' GGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGA 3' SEQ ID NO: 5 Amorce 2 5' TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA 3' SEQ ID NO: 6 1) Amplification PCR de l'ADN libéré 10 Zl de lysat sont utilisés pour chaque essai PCR. Les amplicons produits sont analysés sur gel d'agarose 0,8 % et sur Vidas selon le protocole décrit & l'exemple 2. En l'absence de protéinase K, on constate que l'ADN libéré après lyse n'est pas amplifié. Par contre, on constate que l'ADN libéré après lyse en présence de 0,3 Zg/ml final de protéinase K et incubation 15 minutes & 370C est amplifié. Un signal d'amplification est détecté après hybridation sandwich spécifique des amplicons produits sur Vidas comme décrit dans l'exemple 2, pour une concentration bactérienne initiale égale ou supérieure & 300 bactéries/300 Zl. 2) Amplification NASBA de l'ARN 16S libéré 5 Zl de lysat sont utilisés pour chaque essai NASBA. Les amplicons produits sont détectés et quantifiés sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection spécifique de S. epidermidis, suivant la méthode décrite par P. Cros et al., Lancet 1992, 240: 870. La sonde de détection est couplée & la "Horse Radish Peroxidase" (HRP). Les deux sondes présentent les séquences suivantes Sonde de capture 5' GATAGAGTTTTCCCCTTC 3' SEQ ID NO: 7 Sonde de détection 5' GACATCCTCTGACCCCTC 3' SEQ ID NO: 8 En l'absence de protéinase K, on constate que 1'ARNr 16S libéré après lyse, suivie ou non d'une incubation de 15 minutes & 370, n'est pas amplifié. Par contre, on constate que l'ARNr 16S libéré après lyse en présence de 0,3 Ag/ml final de protéinase K et incubation de 15 minutes & 370C est amplifié. Un signal d'amplification est détecté après hybridation spécifique des amplicons produits sur microplaque, comme décrit cidessus, pour une concentration bactérienne initiale égale ou supérieure & 60 bactéries/ml. REVENDICATIONS 1. Procédé pour isoler un matériel intracellulaire nucléique et/ou protéique, à partir d'un échantillon cellulaire en suspension dans un liquide, caractérisé en ce que (a) on expose l'échantillon à au moins une impulsion électrique, dont au moins une caractéristique est déterminée pour permettre une lyse pratiquement complète du matériel intracellulaire; (b) on sépare du matériel cellulaire lysé une fraction nucléique, et/ou une fraction protéique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de l'impulsion électrique, déterminée par exemple par la capacité et/ou la résistance électrique d'un circuit électrique de charge, est adaptée & une lyse complète du matériel intracellulaire. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de l'impulsion électrique, définie par l'intervalle de temps pendant lequel la tension électrique est au moins égale & 50 % de la tension maximum, est au moins égale & 200 ms. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une caractéristique de l'impulsion électrique est déterminée pour établir dans l'échantillon un champ électrique au moins égal à 2500 V/cm. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce la durée de l'impulsion électrique est déterminée par une capacité de 500 yFD et une résistance électrique de 186 Ohms, pour une tension électrique de 500 V. o. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide dans lequel l'échantillon cellulaire est suspension est l'eau. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare le matériel nucléique par mise en contact de l'échantillon cellulaire lysé avec une protéase ou un composé libérant des radicaux organiques. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéase ou le composé est introduit au départ dans l'échantillon cellulaire. 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séparation du matériel nucléique est effectuée avec une protéase, choisie parmi la pronase, les subtilysines, la pepsine, la trypsine, le lysozyme, la chymotrypsine, l'a-chymotrypsine et la protéinase K. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéase est la protéinase K. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration de la protéinase K dans l'échantillon est comprise entre 0,5 et 9 mg/ml, de préférence entre 3 & 6 mg/ml, et de préférence encore la concentration est égale à 6 mg/ml. 12. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le composé est un percomposé, notamment choisi parmi le périodate, le parapériodate, le peroxyde de sodium, le perborate et par exemple le tétrahydrate de perborate de sodium. 13. Procédé de traitement d'un matériel nucléique, mettant en oeuvre une étape d'isolement selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 & 12, caractérisé en ce qu'après séparation de la fraction protéique du matériel cellulaire lysé, la fraction nucléique est soumise directement à au moins une étape de traitement. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de traitement est une étape de détection d'au moins un composant de la fraction nucléique. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de traitement est une étape d'amplification d'au moins un composant de la fraction nucléique.