Brevet FR2761606A1 — publié le 19981009

UTILISATION DE DERIVES AMINOTHIOLESTERS DANS LE DOMAINE PHARMACEUTIQUE La présente invention concerne l'utilisation de dérivés aminothiolesters dans la préparation d'une composition pharmaceutique en vue de lever l'inhibition d'apoptose due å la présence du gène bcl2 dans des cellules transformées. II existe deux types de mécanisme impliqués dans la mort des cellules. Le premier de type classique est appelé la nécrose. Morphologiquement, la nécrose est caractérisée par un gonflement des mitochondries et du cytoplasme et par une altération nucléaire, suivi de la destruction de la cellule et son autolyse, ceci étant accompagné par un phénomène d'inflammation. La nécrose survient de manière passive et incidente. La nécrose tissulaire est généralement due à un trauma physique des cellules ou un poison chimique, par exemple. L'autre forme de mort cellulaire est appelée l'apoptose [Kerr, J.F.R. and Wyllie, A.H., Br. J. Cancer, 265 239 (1972)], mais contrairement à la nécrose l'apoptose n'entraîne pas un phénomène d'inflammation. II est décrit que l'apoptose peut se réaliser sous différentes conditions physiologiques. C'est une forme hautement sélective du suicide cellulaire qui se caractérise par des phénomènes morphologiques et biochimiques aisément observables. Ainsi, on observe notamment une condensation de la chromatine associée ou non à une activité endonucléasique, la formation de corps apoptiques et une fragmentation de l'acide désoxyribonucléique (A.D.N.) par l'activation d'endonucléases en des fragments d'ADN de 180-200 paires de bases (ces fragments peuvent être observés par électrophorèse sur gel d'agarose). L'apoptose peut être considérée comme une mort programmée des cellules impliquée dans le développement, la différenciation et le renouvellement tissulaire. II est également considéré que la différenciation, la croissance et la maturation des cellules sont étroitement liées à l'apoptose et que les substances capables de jouer un rôle sur la différenciation, la croissance et la maturation des cellules sont aussi liées au phénomène de l'apoptose. II a déjà été décrit dans la demande de brevet WO 96-20701 déposée par la Demanderesse un composé choisi parmi le méthional, le malondialdéhyde et tout facteur augmentant le taux intracellulaire du méthional ou du malondialdéhyde pour une utilisation comme médicament, ce médicament étant plus particulièrement destiné à augmenter le phénomène de la mort programmée des cellules (I'apoptose) et ainsi peut permettre de traiter de nombreuses maladies, plus particulièrement les maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, telles que dans le cas du cancer, des maladies autoimmunes ou des allergies. Toutefois, l'addition de méthional exogène à des cellules en culture inhibe autant la croissance des cellules transformées que celle des cellules normales. Pour essayer d'augmenter le taux de méthional endogène dans les cellules transformées, mais pas dans les cellules normales, son métabolisme a été étudié. Ainsi, dans le métabolisme du méthional, il est connu que l'acide 4-méthylthio-2oxobutanoïque peut être métabolisé in vivo par le complexe déshydrogénase oxo-acide à chaîne branchée présent dans les mitochondries des cellules du foie, du coeur, et du muscle squelettique via le méthional pour donner le méthylthiopropionylCoA [cf. Wu, G. & Yeaman, S.J. (1989) Biochem. J. 257, 281-284; Haussinger, D., Stehle, T. & Gerok, W. (1985) J. Biol. Chem. 366, 527-536; Jones, S.M.A. & Yeaman, S.J. (1986) Biochem. J. 237, 621-623]. Il est également décrit que l'acide 4-méthylthio-2-oxobutanoïque peut être métabolisé in vivo par transamination en méthionine [cf. Ogier, G., Chantepie, J., Deshayes, C., Chantegrel, B., Charlot, C., Doutheau, A & Quash, G. (1993) Biochem. Pharmacol. 45, 1631-1644]. Le méthional peut éventuellement aussi être réduit ou oxydé respectivement en méthionol par une aldéhyde réductase ou en acide méthylthiopropionique par une aldéhyde déshydrogénase. Le méthional en association avec le radical HO- peut enfin donner du malondialdéhyde et du méthane thiol par une réaction de Fhydroxylation [Quash, G., Roch, A.M., Chantepie, J., Michal, Y., Fournet, G., et Dumontet, C. (1995) Biochem. J. 305, 1017-1025]. Dans ce qui suit, les abréviations suivantes peuvent être utilisées - MTOB représente l'acide 4-méthylthio-2-oxobutanoïque; - MTPA représente l'acide méthylthiopropionique - El représente la décarboxylase du complexe déshydrogénase oxo-acide à chaîne branchée dont le co-facteur est la thiamine pyrophosphate (TPP) - E2 représente la transacylase du complexe déshydrogénase oxo-acide à chaîne branchée dont le co-facteur est l'acide thioctique (TA) - ALDR représente l'aldéhyde réductase; - ALDH représente l'aldéhyde déshydrogénase. II a également été décrit que des inhibiteurs de la transaminase impliquée dans la transformation du MTOB en méthionine, qui sont des composés d'esters de la Lméthionine et de pyridoxal, inhibent sélectivement la croissance de plusieurs types de cellules transformées mais pas celle de cellules normales MRC5 et induisent faiblement l'apoptose également dans les cellules lymphoïdes BAF3 mises en culture en présence d'interleukine 3. Dans le cas de pathologies qui sont caractérisées par une surexpression du gène bc12, tels que notamment les cancers du sein, les lymphomes des cellules B, les leucémies, les neuroblastomes, les adenocarcinomes de la prostate, les prolactinomas et autres adénomes pituitaires, cette surexpression du gène bc12 confère aux cellules une résistance à l'apoptose et donc à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes (Miyashita, T. and Reed, J.C. (1993) Blood 81, 151-157 ; Furuya,Y. et al. (1996) Clinical Cancer Research 2, 389-398). Par ailleurs, il a été décrit que l'addition d'un inhibiteur de l'enzyme ALDH, le disulfiram (à 50 ptM), à des cellules BAF3-bo induisait la fragmentation dans 30% de l'ADN cellulaire, typique de l'apoptose, tandis que dans les cellules BAF3-bc12, résistantes à l'apoptose, cette augmentation ne dépassait pas 5% (Roch, A.-M. et al., (1996) Biochem. J. 313, 973-981). L'augmentation de la concentration de disulfiram n'a pas permis d'obtenir un pourcentage de fragmentation plus élevé à cause de la toxicité intrinsèque de ce produit. Un des buts de la présente invention est donc d'inhiber partiellement, voire totalement, ce caractère résistant à l'induction d'apoptose dû au gène bc12 présent dans les cellules transformées. Ce but et d'autres sont atteints par la présente invention qui concerne l'utilisation d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition d'un caractère résistant à l'induction d'apoptose de cellules transformées, ce caractère étant dû au gène bc12 présent dans ces cellules. La présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition du caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées. Plus particulièrement, le caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées est dû au gène bc12 présent dans ces cellules. Les dérivés aminothiolesters présentent la formule (I) suivante dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, de C1-C6. Parmi les radicaux alkyle linéaire saturé ayant de 1 à 6 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle. Parmi les radicaux alkyle ramifiés saturés ayant de 1 à 6 atomes de carbone, on peut citer notamment les radicaux 2-méthylbutyle, 2-méthylpentyle, isopropyle et tertiobutyle. Parmi les radicaux alkyle insaturés ayant de 1 à 6 atomes de carbone, on peut citer notamment le radical allyle. De préférence, R1, R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle de C1 à C3. De préférence, R1 et R2 représentent un radical méthyle et R3 un radical choisi parmi le radical méthyle, éthyle et propyle. De manière avantageuse, R1, R2 et R3 représentent le radical méthyle. On utilise avantageusement un composé de formule (I) dans laquelle l'amine est sous forme d'ammonium, de préférence sous forme d'ammonium organique et avantageusement sous forme de formiate ou d'acétate d'ammonium. Sous forme d'ammonium, les composés de formule (I) présentent l'avantage d'être hydrosolubles, et donc facilement utilisables. Ces composés peuvent être obtenus par (1) réaction d'un dérivé dialkylpropargylamine, dans lesquels la fonction amine est protégée (ces composés sont décrits dans la demande de brevet EP 0 133 407), avec une base très forte pour donner le carbanion du radical propargyle, (2) on fait réagir ensuite ce carbanion avec un oxysulfure de carbone, puis (3) on réalise une réaction d'alkylation sur le soufre du produit obtenu en (2) et enfin (4) on déprotège l'amine. Pour obtenir le composé de formule (I) sous forme d'ammonium, on utilise tout moyen connu en soi. Ainsi, pour obtenir le composé de formule (I) sous forme de formiate ou d'acétate d'ammonium, on fait réagir le composé obtenu à l'étape (4) avec respectivement l'acide formique ou l'acide acétique. D'autres caractéristiques, aspects, objets et avantages de l'invention apparaîtront encore plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, ainsi que des divers exemples concrets, mais nullement limitatifs, destinés à l'illustrer. La figure 1 représente le pourcentage de fragments d'ADN obtenus dans des cellules BAF-bcl2 mises en culture pendant 6 heures avec différents composés en fonction des concentrations (exprimées en pM) de ces différents composés qui sont : I'amino4 méthyle pentyne-2 al-1 (représenté par D), le 4-amino9-méthylpent-2-yne thioate de Sméthyle (représenté par ) et le mélange du 4-amino-4-méthylpent-2-yne thioate de Sméthyle (à différentes concentrations) et de méthional à 200 M (représenté par ). La figure 2 représente le pourcentage de fragments d'ADN obtenus dans des cellules BAF-bO mises en culture pendant 6 heures avec différents composés en fonction des concentrations (exprimées en lM) de ces différents composés qui sont : I'amino4 méthyl4 pentyne-2 al-l (représenté par O), le 4-amino4-méthylpent-2-yne thioate de Sméthyle (représenté par ) et le mélange du 4-amino4-méthylpent-2-yne thioate de Sméthyle (à différentes concentrations) et de mêthional à 200 FM (représenté par ). Ces composés de formule (I) qui inhibent l'activité de l'enzyme ALDH présentent l'avantage d'être de type "suicide" (liaison covalente irréversible avec l'enzyme ALDH), de ne pas être toxique et d'inhiber la croissance des cellules transformées (cancéreuses) et non pas celle des cellules normales. Les pathologies qui sont caractérisées par une surexpression du gène bc12 sont notamment les cancers du sein, les lymphomes des cellules B, les leucémies, les neuroblastomes, les adenocarcinomes de la prostate, les prolactinomas et autres adénomes pituitaires. La composition pharmaceutique selon l'invention comprend un milieu physiologiquement acceptable. L'administration de la composition selon l'invention peut être effectuée par voie entérale, parentérale, topique ou oculaire. De préférence, la composition pharmaceutique est conditionnée sous une forme convenant à une application par voie systémique (pour injection ou perfusion). Par voie entérale, la composition, plus particulièrement la composition pharmaceutique, peut se présenter sous formes de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Les composés de formule (I) selon l'invention sont généralement administrés à une dose journalière d'environ 0,001 mg/kg à 100 mg/kg en poids corporel en 1 à 3 prises. Par voie topique, la composition pharmaceutique selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques ou de patches polymériques et d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition par voie topique peut se présenter soit sous forme anhydre, soit sous forme aqueuse. Par voie oculaire, ce sont principalement des collyres. Les composés de formule (I) sont utilisés par voie topique ou oculaire à une concentration généralement comprise entre 0,0001 % et 10 % en poids, de préférence entre 0,01 et 1 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Les compositions telles que décrites précédemment peuvent bien entendu en outre contenir des additifs inertes ou même pharmacodynamiquement actifs ou des combinaisons de ces additifs, et notamment le méthional, de nombreux agents antinéoplasiques, tels que par exemple la dexamethasone, la cyclophosphamide, le cisplatin, I'étoposide et le BCNU (N,N-Bis(2-chloroéthyl)-N-nitrosourea), qui sont également capables d'induire l'apoptose. Ainsi, la présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un support physiologiquement acceptable, au moins un composé de formule (I), tel que décrit ci-dessus, et au moins un composé choisi parmi le méthional et un agent antinéoplasique. Cette composition est donc plus particulièrement destinée à traiter, de manière préventive ou curative, des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, telle que les cancers, des maladies auto-immunes ou allergiques. La composition pharmaceutique comprend de préférence le méthional et au moins un composé de formule (I), tel que décrit ci-dessus. De préférence, l'agent antinéoplasique est capable d'induire l'apoptose et peut ainsi être choisi parmi ceux cités ci-dessus. La composition selon l'invention peut être sous forme d'un kit comprenant au moins un composé de formule (I), tel que décrit ci-dessus, et au moins un composé choisi parmi le méthional et un agent antinéoplasique, les composés de ce kit étant conditionnés de manière séparée. Bien entendu, I'homme du métier veillera à choisir le ou les éventuels composés à ajouter à ces compositions de telle manière que les propriétés avantageuses attachées intrinsèquement à la présente invention ne soient pas ou substantiellement pas altérées par l'addition envisagée. On va maintenant donner, à titre nullement limitatif, plusieurs exemples destinés à illustrer la présente invention. EXEMPLE 1 Procédé de préparation du 4-amino4-méthvlpent-2-yne thioate de S-méthvle A une solution de 4,519 (20 mM) de N,N-(1,2-bis(diméthylsilyl)éthane)-1,1diméthylpropargylamine (décrit dans la demande de brevet EP 0 133 407) dans 100ml de tétrahydrofuranne, on ajoute en 5 minutes à -70 C 16 ml d'une solution 1,5 M de nbutyllithium dans l'hexane. On laisse le milieu réactionnel revenir à température ambiante en 30 minutes puis on agite ancore 1 heure à cette température (18"C). Après retour à 70"C on cannule 9 ml d'oxysulfure de carbone préalablement condensé. Après une heure d'agitation à -70 C puis 30 minutes à +3"C on ajoute 1,31 ml (21mM) d'iodure de méthyle et on poursuit l'agitation pendant 2 heures à cette température. Après dilution dans 400 ml d'éther, on lave par une solution saturée de chlorure de sodium, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore sous vide, I'amine est débloqué sur gel de silice tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 133 407., on isole ainsi 29 (63%) de l'amine. EXEMPLE 2 Procédé de préparation du formiate de 4-amino-4-méthvlnent-2-gne thioate de S-méthvle A 418 mg (2,7 mM) de l'amine obtenu a l'exemple 1 dans l'éther anhydre, on ajoute 2,7 mM d'acide formique en solution dans 2 ml d'éther à 0 C. On agite 5 minutes, puis on porte à température ambiante et on évapore å sec. Après reprise dans l'éther anhydre, on disperse le solide et on élimine le surnageant, puis on sèche sous vide et on isole 415 mg (77%) du formiate d'amine désiré. EXEMPLE 3 Effet de différents composés sur l'induction d'apoptose dans les cellules BAF3-bO et BAF3bic12 Les cellules utilisées correspondent à une lignée cellulaire lymphocytaire de souris BAF3 qui requiert de l'interleukine 3 (IL3) pour croître et qui subit l'apoptose (plus de 80% des cellules) en l'absence d'lL3 en 16 heures [cf. Collins, M.K.L., Marvel, J., Malde, P. & Lopez-Rivas, A. (1992) J. Exp. Med. 176, 1043-1051]. Les cellules BAF3-bc12 correspondent à des cellules BAF3 transfectées par le gène bc12, les cellules BAF3-b0 correspondent à des cellules BAF3 non transfectées par le gène bc12. Comme précisé précédemment, les cellules BAF3-bO subissent l'apoptose (plus de 80% des cellules) en l'absence d'lL3 en 16 heures. Par contre, les cellules BAF3-bc12 qui sont donc transfectées par le gène bc12 ne présentent aucun signe d'apoptose en l'absence d'lL3. Les cellules BAF3-bO ou BAF3-bc12, mises en culture en présence d'lL3, sont marquées par une adaptation de la méthode décrite dans Wright, S. et al. (1992) J. of Cell. Biochem. 48, 344-355, en incubant 2,5.105 cellules /ml avec 0,5 pCi [3H]-thymidine pendant 40 heures à 37"C. Après deux lavages avec un milieu de culture, 2,5. 106 cellules sont mises en culture en présence de différents composés à tester. Après incubation pendant 6 heures, ces cellules sont récupérées par centrifugation à 4009 pendant 5 minutes et lavées 3 fois dans du tampon PBS. Les cellules récupérées dans le culot sont lysées dans 2ml de 0,1% de Triton X-100, 20mM EDTA, 5mM Tris pH8 et centrifugées à 300009 à 4"C pendant 30 minutes. Les surnageants sont récupérés et les culots dissous dans 0,3 ml de 0,5 N NaOH. Des aliquots du milieu de culture (1mol), du surnageant (0,3ml) et du culot solubilisé (0,1mol) sont mis à doser dans le compteur a scintillation. Le pourcentage de fragments d'ADN est calculé de la façon suivante: % de fragments = dpm du milieu de culture + dPm du surnageant d'ADN dpm du milieu de culture + dpm du surnageant + dpm du culot solubilisé Les résultats sont rassemblés dans les figures 1 et 2. Les résultats de l'amino4 méthyle pentyne-2 al-1 sont donnés à titre de comparaison. L'amino4 méthyle pentyne-2 al-1 (représenté par C) est également un inhibiteur d'ALDH mais ne correspond pas au composé de formule (I) utilisé dans la présente invention. Son procédé d'obtention est décrit dans la demande brevet EP O 133 407. Le 4-amino-4-méthylpent-2-yne thioate de S-méthyle est le composé obtenu selon le procédé décrit à l'exemple 1. Ces résultats montrent clairement que la présence du 4-amino4-méthylpent-2-yne thioate de S-méthyle, de préférence en association avec le méthional, permet de lever l'inhibition d'apoptose dûe au gène bc12 dans les cellules BAF3-bc12. L'association méthional4-amino- 4-méthylpent-2-yne thioate de S-méthyle est particulièrement intéressante, car elle présente une synergie de la levée de l'inhibition d'apoptose, en effet seul à 200,uM le méthional ne présente aucune activité (0% de fragments d'ADN). REVENDICATIONS 1- Utilisation, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition d'un caractère résistant à l'induction d'apoptose de cellules transformées, ce caractère étant dû au gène bc12 présent dans ces cellules, d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) suivante dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, de C1-C6. 2.- Utilisation, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à lever l'inhibition du caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées, d'au moins un dérivé aminothiolester de formule (I) suivante: dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, de C1-C6. 3.- Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le caractère résistant à la chimiothérapie ou aux antiandrogènes de cellules transformées est dû au gène bc12 présent dans ces cellules. 4- Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le dérivé aminothiolester présente une formule (I) dans laquelle R1, R2 et R3, indépendamment, représentent des radicaux choisis parmi les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, 2-méthylbutyle, 2-méthylpentyle, isopropyle, tertiobutyle et allyle. 5- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que R1, R2 et R3, indépendamment, représentent un radical alkyle de Cl à C3. 6- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que R1, R2 et R3 représentent le radical méthyle. 7- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé de formule (I) présente le radical amine sous forme d'ammonium, de préférence sous forme d'ammonium organique et avantageusement sous forme de formiate ou d'acétate. 8- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée à traiter les pathologies choisies parmi les cancers du sein, les lymphomes des cellules B, les leucémies, les neuroblastomes, les adenocarcinomes de la prostate, les prolactinomas et autres adénomes pituitaires. 9- Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I), défini selon l'une des revendications 1 à 7, et au moins un composé choisi parmi le méthional et un agent antinéoplasique. 10- Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend le méthional et au moins un composé de formule (I), défini selon l'une des revendications i à 6. 11- Composition selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est sous forme d'un kit, les composés de ce kit étant conditionnés de manière séparée. 12- Composition pharmaceutique telle que définie dans l'une des revendications 9 å 1 1 destinée à traiter, de manière préventive ou curative, des maladies liées à une hyperprolifération cellulaire, plus particulièrement les cancers, les maladies autoimmunes ou allergiques. 13- Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est destinée à traiter, de manière préventive ou curative, des maladies choisies parmi les cancers du sein, les lymphomes des cellules B, les leucémies, les neuroblastomes, les adenocarcinomes de la prostate, les prolactinomas et autres adénomes pituitaires.