Brevet FR2768748A1 — publié le 19990326

Recodage de séquences d'ADN permettant leur expression dans les levures et levures transformées obtenues La présente invention concerne le recodage des séquences d'ADN codant pour des protéines contenant des régions à forte teneur en codons mal traduits par les levures, en particulier codant pour des protéines d'origine végétale, comme les cytochromes P450 d'origine végétale, et leur expression dans les levures. Il est connu que certaines séquences, codant pour des protéines d'intérêt, notamment d'origine végétale, sont difficilement traduites dans les levures. C'est le cas en particulier pour les protéines ayant des régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures, en particulier des codons leucine, comme certains cytochromes P450 d'origine végétale. Certains systèmes développés pour améliorer l'expression de cytochromes P450 d'origine animale ou végétale dans les levures, comme ceux décrits par Pompon & coll.(Methods Enzymol, 272, 1996, 51-64; WO 97/10344), se sont révélés inadaptés pour de nombreux cytochromes P450 comprenant des régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures. Les cytochromes P450 constituent une super famille d'enzymes membranaires, de type monooxygénase capables d'oxyder une grande famille de substrats généralement hydrophobes. Les réactions se caractérisent le plus souvent par l'oxydation des liaisons C H ou C=C, des hétéroatomes, plus rarement par réduction des groupes nitro ou par déshalogénation. Ces enzymes interviennent plus particulièrement dans le métabolisme des xénobiotiques et des médicaments, et dans la biosynthèse de métabolites secondaires chez les plantes, dont certains à propriétés organoleptiques ou pharmacodynamiques. Les cytochromes P450 sont en conséquence utilisés notamment dans: - le diagnostic in vitro de la formation de métabolites toxiques ou mutagènes (molécules d'origine naturelle, polluants, médicaments, pesticides, etc.) permettant en particulier le développement de nouvelle molécules actives (pharmacie, agrochimie), - l'identification et la destruction de molécules toxiques ou polluantes pour 'environnement, - la synthèse enzymatique de nouvelles molécules. La recherche d'une expression hétérologue des cytochromes P450 par des cellules hôtes, et plus particulièrement des levures est donc importante pour obtenir une production contrôlée de cette enzyme en grande quantité, soit pour l'isoler et l'utiliser dans les opérations énoncées ci-dessus, soit pour employer directement les cellules transformées pour lesdites opérations sans préalablement isoler l'enzyme. La présente invention apporte une solution au problème énoncé ci-dessus, permettant l'expression dans des levures de protéines contenant des régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures et en particulier des cytochromes P450 d'origine végétale. La présente invention concerne donc une séquence d'ADN, en particulier d'ADNc, codant pour une protéine d'intérêt contenant des régions à forte teneur en en codons mal adaptés aux levures, caractérisée en ce qu'un nombre suffisant de codons mal adaptés aux levures est remplacé par des codons correspondants adaptés aux levures dans lesdites régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures. Au sens de la présente invention, on entend par " codons mal adaptés aux levures " les codons dont la féquence d'utilisation par les levures est inférieure ou égale à environ 13 pour 1000, de préférence inférieure ou égale à environ 12 pour 1000, plus préférentiellement inférieure ou égale à environ 10 pour 1000. La fréquence d'utilisation des codons par les levures, et plus particulièrement par S. cerevisiae est notamment décrite dans "Codon usage data base from Yasukazu Nakamura" (http:/lwww.dna.affrc.goJp/~nakamura/codon.html). C'est le cas en particulier des codons CTC, CTG et CTT codant pour la leucine, des codons CGG, CGC, CGA, CGT et AGG codant pour l'arginine, des codons GCG et GCC codant pour l'alanine, des codons GGG, GGC et GGA codant pour la glycine et des codons CCG et CCC codant pour la proline. Les codons mal adaptés aux levures selon l'invention sont plus particulièrement les codons CTC et CTG codant pour la leucine, CGG, CGC, CGA, CGT et AGG codant pour l'arginine, les codon GCG et GCC pour l'alanine, GGG et GGC codant pour la glycine et les codons CCG et CCC codant pour la proline. Au sens de la présente invention, on entend par " codons correspondants adaptés aux levures" les codons correspondants aux codons mal adaptés aux levures, codant pour les même acides aminés et dont la féquence d'utilisation par les levures est supérieure à 15 pour 1000, de préférence supérieure ou égale à 18 pour 1000, plus préférentiellement supérieure ou égale à 20 pour 1000. C'est le cas en particulier des codons TTG et TTA, préférentiellement TTG, codant pour la leucine, du codon AGA codant pour l'arginine, des codons GCT et GCA, préférentiellement GCT, codant pour l'alanine, du codon GGT codant pour la glycine et du codon CCA codant pour la proline. Au sens de la présente invention, on entend par " région à forte teneur en en codons mal adaptés aux levures" toute région de la séquence d'ADN comprenant au moins 2 codons mal adaptés parmi 10 codons consécutifs, les deux codons pouvant être adjacents ou séparées par jusqu'à 8 autres codons. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, les régions à forte teneur en codons mal adaptés comprennent 2, 3, 4, 5 ou 6 codons mal adaptés pour 10 codons consécutifs, ou comprennent au moins 2 ou 3 codons mal adaptés adjacents. Au sens de la présente invention, on entend par " nombre suffisant de codons ", le nombre de codons à remplacer nécessaires et suffisants pour observer une amélioration substantielle de leur expression dans les levures. De manière avantageuse, au moins 50 % des codons mal adaptés aux levures de la région à forte teneur considérée sont remplacés par des codons adaptés. De manière préférentielle, au moins 75 % des codons mal adaptés de la dite région sont remplacés, plus préférentiellement 100 % des codons mal adaptés sont remplacés. Au sens de la présente invention, on entend par " amélioration substantielle 11 soit une expression détectable lorsque aucune expression de la séquence de référence n'est observée, soit une augmentation de l'expression par rapport au niveau d'expression de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, on désigne par " séquence de référence " toute séquence codant pour une protéine d'intérêt, qui est modifiée selon l'invention pour favoriser son expression dans les levures. La présente invention est particulièrement adaptée aux séquences d'ADN, en particuler d'ADNc, codant pour des protéines d'intérêt comprenant des régions à forte teneur en leucine pour lesquelles un nombre suffisant de codons CTC codant pour la leucine dans ladite région à forte teneur en leucine, est remplacé par des codons TTG et/ou TTA, ou pour lequelles un nombre suffisant de codons CTC et CTG codant pour la leucine dans ladite région à forte teneur en leucine, sont remplacés par des codons TTG et/ou TTA, de préférence par un codon TTG. Au sens de la présente invention, on entend par " région à forte teneur en leucine " une région comprenant au moins 2 leucines parmi 10 acides aminés consécutifs dans la protéine d'intérêt, les deux leucines pouvant être adjacentes ou séparées par jusqu'à 8 autres acides aminés. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, les régions à forte teneur en leucine comprennent 2, 3, 4, 5 ou 6 leucines pour 10 acides aminés consécutifs, ou comprennent au moins 2 ou 3 leucines adjacentes. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, au moins 50 % des codons CTC ou CTC et CTG de la région à forte teneur en leucine sont remplacés par des codons TTG ou TTA, de préférence au moins 75 % des codons CTC ou CTC et CTG de ladite région sont remplacés, plus préférentiellement 100 % des codons CTC ou CTC et CTG sont remplacés. De manière avantageuse, la présente invention est particulièrement appropriée pour les séquences d'ADN dont la teneur générale en codons mal adaptés est d'au moins 20%, plus préférentiellement d'au moins 30%, par rapport au nombre total de codons dans la séquence de référence. De manière avantageuse, lorsque la séquence de référence comprend au moins une région en 5' à forte teneur en codons mal adaptés, le recodage de cette seule région en 5' permet d'obtenir une amélioration substantielle de l'expression de la protéine d'intérêt dans les levures. La longueur de la région en 5' à recoder selon l'invention sera variable fonction de la longueur de la région à forte teneur en codons mal adaptés. Cette longueur sera avantageusement d'au moins quatre codons, en particulier lorsque cette région comprend au moins deux mauvais codons adjacents, jusqu'à environ 40 codons, ou plus. Il n'est cependant pas nécessaire selon l'invention de recoder toute la séquence de référence, mais uniquement les régions à forte teneur en mauvais codons, en particulier la région en 5' seule, pour obtenir une amélioration substantielle de l'expression de la protéine d'intérêt dans les levures. De manière avantageuse, la séquence d'ADN codant pour une protéine d'intérêt est une séquence d'ADN isolée d'origine naturelle, en particulier d'origine végétale. L'invention est particulièrement avantageuse pour les séquences d'origine de plantes mono ou dicotylédones, de préférence monocotylédones, en particulier de la famille des graminées comme par exemple le blé, l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, le sorgho, la canne à sucre, etc. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN code pour une enzyme, en particulier un cytochrome P450, de préférence d'origine végétale. Ces cytochromes P450 présentant une forte teneur en codons mal adaptés, en particulier codant pour la leucine dans leur région N terminale, c'est dans la région codante de l'extrémité 5' que les codons mal adaptés sont remplacés. La présente invention concerne également un gène chimère comprenant une séquence d'ADN modifiée ci-dessus et des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une levure, c'est à dire capables de commander l'expression de la protéine d'intérêt dans la levure. De tels éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, décrits notamment par Rozman & coll. (Genomics, 38, 1996, 371-381) et par Nacken & coll. (Gene, 175, 1996, 253-260, Probing the limits of expression levels by varvîng promoters strength and plasmid copy number in Saccharomyces cerevisiae). La présente invention concerne également un vecteur pour la transformation des levures comprenant au moins un gène chimère ci-dessus. Elle concerne aussi un procédé de transformation des levures avec ledit vecteur, et les levures transformées obtenues. Elle concerne enfin un procédé de production d'une protéine d'intérêt hétérologue dans une levure transformée, la séquence codant pour ladite protéine d'intérêt étant telle que définie ci-dessus. Le procédé de production d'une protéine d'intérêt hétérologue dans une levure transformée, comprenant les étapes de: a) transformation d'une levure avec un vecteur capable de se repliquer dans les levures, comprenant une séquence d'ADN modifiée définie ci-dessus et des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une levure, b) culture de la levure transformée, et c) extraction de la protéine d'intérêt de la culture de levure. Dans le cas où la protéine d'intérêt est une enzyme appropriée pour la transformation d'un substrat, comme un cytochrome P450, l'enzyme extraite de la culture de levure est ensuite utilisée comme catalyseur de la transformation dudit substrat. La catalyse peut toutefois être réalisée sans nécessiter l'extraction de la levure en cultivant la levure transformée en présence du dit substrat. La présente invention concerne donc également un procédé de transformation d'un substrat par catalyse enzymatique au moyen d'une enzyme exprimée dans une levure, comprenant les étapes de a) culture de la levure transformée selon l'invention en présence du substrat à transformer, puis b) récupération du substrat transformé de la culture de levure. Dans le cas de la levure transformée pour l'expression d'un cytochrome P450, la réaction catalysée par l'enzyme est une réaction d'oxydation, plus particulièrement des liaisons C-H ou C=C. Les techniques de transformation et de culture des levures sont connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Methods in Eniymology (vol. 194, 1991). Les levures utiles selon l'invention sont notamment choisies parmi les genres Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia et Yarrowia. De manière avantageuse, la levure est du genre Saccaromyces, en particulier S. cerevisiae. D'autres caractéristiques de l'invention apparaitront à la lumière des exemples ciaprès. Exemple 1: Création d'une banque de gêne d'ADNc de blé et identification de la séquence CYP73A17 La séquence de cytochrome P450 de blé CYP73A17 a été obtenue par criblage d'une banque d'ADNc de jeunes plantules de blé (pousses et racines sans les caryopses) construite dans le vecteur B-ZapII (Stratagène) selon les instructions du fournisseur. 1. Création de la banque d'ADNc Des graines de Triticum aestivum (L. cv. Darius) enrobées de cloquintacet-mexyl (0,1 % par poids sec de graines) sont cultivées dans des boites de plastique sur deux couches de gaze humide jusqu'à l'obtention de pousses d'une taille de 3 à 5 mm. L'eau dans les boites est ensuite remplacée par une solution de phénobarbital de sodium 4 mM et le blé est cultivé jusqu'à une taille des pousses d'environ 1 cm. La banque d'ADNc est construite à partir de 5 llg d'ARN poly(A)+ (Lesot, A., Benveniste, I., Hasenfratz, M.P., Durst, F. (1990) Induction of NADPH cytochrome P450(c) reductase in wounded tissues from Helianthus tuberosus tubers. Plant Cell Physiol., 31, 1177-1182) isolés à partir des pousses et des racines traitées, dans le vecteur B-ZapII (Stratagène) selon le protocole et les instructions du fournisseur. 2. Criblage de la banque d'ADNc 5x105 plages de lyse de la banque B-ZapII obtenue précédemment sont criblées avec une sonde correspondant à la séquence codante complète de CYP73Al d'Helianthus tuberas us marquée par amorçage au hasard au [&alpha;- P]dCTP. La préhybridation et l'hybridation des filtres est effectuée à faible stringence à 55 OC selon les protocoles standards. Les membranes sont lavées deux fois pendant 10 minutes avec 2 x SSC, 0,1 % SDS, et une fois pendant 10 minutes avec 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à température ambiante, puis deux fois pendant 30 minutes avec 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 45 "C. Les inserts des plages de lyse positives sont analysés par RPC (réaction de polymérisation en chaine) et hybridation afin de déterminer leur taille. Les clones avec des inserts s'hybridant à CYP73Al dans les conditions décrites ci-dessus et d'une taille supérieure à 1,5 kbp sont recriblés, avant l'excision du plasmide pBluescript selon le protocole du fournisseur (Stratagène) et séquençage par la technique prism Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle développée par Applied Biosystems Inc. Un clone de longueur totale est alors identifié par alignement avec CYP73A1. Le cytochrome P450 de blé CYP73A17 codé par la séquence isolée (identificateur de séquence N" 1) présente 76,2 % d'identité avec le CYP73A1 d'Helianthus tuberosus. Exemple 2: Modifications de la séquence codant pour le cytochrome P450 de blé CYP73A17 Contrairement au CYP73A1 d'Helianthus tuberosus, lequel peut être exprimé dans les levures (Urban & coll., 1994), des tentatives répétées d'expression de CYP73A17 de blé dans les levures par les même techniques usuelles se sont révélées infructueuses, alors que la séquence nucléotidique n'a pas été modifiée lors de son insertion dans le vecteur d'expression (vérification par séquençage). Aucune protéine n'est détectée par spectrophotométrie ou par immunoblot, de même qu'aucune activité enzymatique n'est détectable dans les microsomes de levure transformée et induite. 1. Modification de séquence codante La séquence codante pour le CYP73A17 de blé (SEQ. ID No 1) a donc été modifiée de trois manières différentes par mutagénèse induite par RPC comme suit: Les sites de restriction BamHI et EcoRI ont été respectivement introduits par RPC juste en amont du codon ATG et juste en aval du codon stop de la séquence codante de CYP73A17 (source, origine) en employant les amorces sens et réverse ci-dessous les sites de restrictions étant BamHlpour les amorces sens Recl (SEQ ID No 3), Rec2 (SEQ ID No 4) et Rec3 (SEQ ID No 5), et EcoRI pour l'amorce réverse(SEQ ID No 6). Une amorce représentée par la SEQ ID No2 a également employée pour permettre la transformation des levures avec la séquence codante pour le CYP73A17 de blé non modifiée (natif). Les cinq amorces ci-dessus ont été obtenues auprès de la société Eurogentech, synthètisées et purifiées selon les méthodes usuelles. Pour chaque modification, avec les quatre différentes amorces sens, le mode opératoire est le suivant: Le mélange réactionnel (20 mM Tris-HCl pH 8,75, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 5 % (v/v) DMSO, 300 pLM dNTP, 20 pmoles de chaque amorce, 150 ng template, volume total 50 ,ul) est préchauffé pendant 2 minutes à 94 "C, avant l'addition de 5 unités d'ADN polymérase Pfu (Stratagène). Après 2 minutes à 94 OC, on procède à 30 cycles d'amplification comme suit: 1 minute de dénaturation à 94 "C, 2 minutes d'hybridation à 55 "C, 2 minutes d'extention à 72 "C. La réaction est complétée par 10 minutes d'extension à 72 "C. On obtient pour chaque amorce une séquence dérivée de la séquence ID n0 1, représentées pour les séquences codantes modifiées par les séquences ID No 7, No 8 et No 9. Les extrémités 5' des séquences obtenues avec les quatre amorces sens ci-dessus sont représentées ci-dessous, le site de restriction BamHI étant marqué en italliques: natif: ATATATGGATCC ATG GAC GTC CTC CTC CTG GAG AAG GCC Rec 1 ATATATGGATCC ATG GAT GTT TTG TTG TTG GAG AAG GCC Rec 2 ATATATGGATCC ATG GAT GTT TTG TTG TTG GAA AAA GCT Rec 3 ATATATGGATCC ATG GAT GTT TTG TTG TTG GAA AAA GCT Protéine: met asp val leu leu leu glu lys ala CTC CTG GGC CTC TTC GCC GCG CCC GTG CTC GCC ATC GCC GTC GCC CTC CTC CCC CTC TTC GCC CCC CCC CTC CTC GCC ATC GCC GTC GCC TTC TTC CGT TTC TTC GCC CCC CCC GTG CTC GCC ATC GCC GTC GCC TTC TTC GGT TTC TTT GCT GCT GCT GTT TTC GCT ATT GCT GTT GCT leu leu gly leu phe ala ala ala val leu ala ile ala val ala AAC CTC ACC GGC AAC CGC TTC CGC CTC CCC CCT GGC CCC TCC GGC AAG CTC ACC GGC AAG CGC TTC CGC CTC CCC CCT GGC CCC TCC GGC AAG CTC ACC GGC AAG CGC TTC CGC CTC CCC CCT GGC CCC TCC GGC AAA TTC ACT GGT AAA AGA TTT AGA TTC CCA CCA GGT CCA TCC CCC lys leu thr gly lys arg phe arg leu pro pro gly pro ser gly GCC CCC ATC GTC ..... GCC CCC ATC GTC ..... GCC CCC ATC GTC ..... GCC CCC ATC GTC ..... ala pro ile val 2. Transformation des levures Après digestion par les enzymes de restriction BamHI et EcoRI, les quatre séquences codantes modifiées ci-dessus, sont intégrées dans le vecteur pYeDP60 décrit par Pompon & coll. (Methods Enzymol, 272, 1996, 51-64; WO 97/10344), dont le contenu est intégré ici par référence pour ce qui concerne le plasmide, la méthode d'insertion dans le plasmide et la méthode de transformation et de croissance des levures, en particulier à partir des levures Saccharomyces cerevisiae souches W(R), WAT21 et WAT 11. La méthode de transformation et de croissance des levures est également décrite par Pompon & coll. et par Urban & coll. (Eur. J. Biochem., 222, 1994, page 844, 2ème colonne, "Yeast transformation and cell culture "). On obtient 4 souches de levures transformées dénommées: W73A17(natif), W73A 1 7(Rec i), W73Al7(Rec2) et W73A 1 7(Rec3). Exemple 3: Expression de CYP73A17 dans les levures modifiées Les levures transformées obtenues précédemment sont cultivées selon la méthode décrite par Urban & coll. (Eur. J. Biochem, 222, 1994, page 844, 2ème colonne, "Yeast transformation and cell culture") dans 50 ml de milieu SGI pendant 72 h à 30 OC. Les cellules sont récupérées par 10 minutes de centrifugation à 8000 g lavées avec 25 ml de milieu YPI, recentrifugées, puis remises en suspension dans 250 mi de milieu YPI. L'induction par le galactose est mise en oeuvre pendant 14-16 h sous agitation à 160 rpm, jusqu'à ce que la densité cellulaire atteigne 108 cellules par ml. Les microsomes sont ensuites préparés selon la méthode décrite par Pierrel & coll. (Eur. J Biochem., 224, 1994, 835-844). L'expression de CYP73A17 pour les quatre souches est quantifiée par spectrophotométrie différentielle selon la méthode décrite par Omura et Sato (J. Biol. Chem., 177, 678-693). Elle est proportionnelle au nombre de codons mal adaptés modifiés. L'activité enzymatique microsomale est mesurée selon la méthode décrite par Durst F., Benveniste I., Schalk M. and Werck-Reichhart D. (1996) Cinnamic acid hydroxylase activity in plant microsomes. Methods Enzymol. 272, 259-268. Les résultats obtenus après transformation de WAT21 sont reportés sur le Tableau ci-dessous. L'activité est exprimée en activité cinnamate 4-hydroxylase. Le pourcentage additionnel d'activité (valeurs arrondies), permet d'illustrer l'importance du saut d'activité observé après modification des codons mal adaptés. Souche i Activité mol/min/ protéine % activité additionnelle W73Al7 natif 1 0,64 W73Al7Recl 2,84 + 340 W73A17 Rec2 1 4,92 + 670 W73A17 Rec3 , 8,90 +1300 Ces résultats relatifs à l'augmentation de l'activité enzymatique viennent confirmer ceux relatifs à l'augmentation de l'expression de la protéine dans les levures. Ils montrent qu'une transformation de la seule extrémité en 5', même limitée (Recl), est suffisante pour obtenir une amélioration très importante de la production d'enzyme par la levure, et de son activité enzymatique. Exemple 4: Expression de CYP86A5 de blé dans les levures modifiées La séquence codant pour le cytochrome P450 de blé CYP86A5 de blé, représentée par l'identificateur de séquence No 10 (SEQ ID No 10) a été isolée de la banque d'ADNc de blé décrite à l'exemple 1 selon le même mode opératoire décrit pour la séquence de CYP73A17, en employant comme sonde la séquence codante complète de CYP86Al d'Arabidopsis thaliana. Cette séquence de CYP86A5 de blé a été modifiée selon le mode opératoire de l'exemple 2 en employant comme amorces sens et réverse les deux oligonucléotides représentés par les séquences ID No 12 et 13 (SEQ ID No 12 et SEQ ID No 13), respectivement, pour obtenir la séquence codante modifiée selon l'invention représentée par l'identificateur de séquence No. 14 (SEQ ID No 14). Une amorce représentée par la SEQ ID No 11 a également employée pour permettre la transformation des levures avec la séquence codante pour le CYP86A5 de blé non modifiée (natif). Les levures sont transformées avec cette nouvelle séquence codante et ltexpression quantifiée par spectrophotométrie différentielle selon le mode opératoire de l'exemple 2. Alors que la séquence de CYP86A5 de blé naturelle n'est pas exprimée de façon détectable, la séquence modifiée selon l'invention est exprimée de manière substantielle dans les levures transformées. Les exemples ci-dessus démontrant sans ambiguïté que pour des séquences d'ADN comprenant en 5' une région à forte teneur en codons mal adaptés aux levures, le simple recodage selon l'invention, même partiel, de cette seule région avec des codons correspondants adaptés aux levures permet une amélioration substantielle de leur expression dans les levures. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2261 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:49..1551 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: CGCAGCACGG CAACACATAC ACAGGAGCCA CACACCGCAC CTACCCCG ATG GAC GTC 57 Met Asp Val 1 CTC CTC CTG GAG AAG GCC CTC CTG GGC CTC TTC GCC GCG GCG GTG CTG 105 Leu Leu Leu Glu Lys Ala Leu Leu Gly Leu Phe Ala Ala Ala Val Leu 5 10 15 GCC ATC GCC GTC GCC AAG CTC ACC GGC AAG CGC TTC CGC CTC CCC CCT 153 Ala Ile Ala Val Ala Lys Leu Thr Gly Lys Arg Phe Arg Leu Pro Pro 20 25 30 35 GGC CCC TCC GGC GCC CCC ATC GTC GGC AAC TGG CTG CAG GTC GGC GAC 201 Gly Pro Ser Gly Ala Pro Ile Val Gly Asn Trp Leu Gln Val Gly Asp 40 45 50 GAC CTC AAC CAC CGC AAC CTG ATG GGC CTG GCC AAG CGG TTC GGC GAG 249 Asp Leu Asn His Arg Asn Leu Met Gly Leu Ala Lys Arg Phe Gly Glu 55 60 65 GTG TTC CTC CTC CGC ATG GGC GTC CGC AAC CTG GTG GTC GTC TCC AGC 297 Val Phe Leu Leu Arg Met Gly Val Arg Asn Leu Val Val Val Ser Ser 70 75 80 CCC GAG CTC GCC AAG GAG GTC CTC CAC ACC CAG GGC GTC GAG TTC GGC 345 Pro Glu Leu Ala Lys Glu Val Leu His Thr Gln Gly Val Glu Phe Gly 85 90 95 TCC CGC ACC CGC AAC GTC GTC TTC GAC ATC TTC ACC GGC AAG GGA CAG 393 Ser Arg Thr Arg Asn Val Val Phe Asp Ile Phe Thr Gly Lys Gly Gln 100 105 110 115 GAC ATG GTG TTC ACG GTG TAC GGC GAC CAC TGG CGC AAG ATG CGG CGG 441 Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Asp His Trp Arg Lys Met Arg Arg 120 125 130 ATC ATG ACG GTG CCC TTC TTC ACC AAC AAG GTG GTG GCG CAG AAC CGC 489 Ile Met Thr Val Pro Phe Phe Thr Asn Lys Val Val Ala Gln Asn Arg 135 140 145 GTG GGG TGG GAG GAG GAG GCC CGG CTG GTG GTG GAG GAC CTC AAG GCC 537 Val Gly Trp Glu Glu Glu Ala Arg Leu Val Val Glu Asp Leu Lys Ala 150 155 160 GAC CCG GCG GCG GCG ACG GCG GGC GTG GTG GTC CGC CGC AGG CTG CAG 585 Asp Pro Ala Ala Ala Thr Ala Gly Val Val Val Arg Arg Arg Leu Gln 165 170 175 CTC ATG ATG TAC AAC GAC ATG TTC CGC ATC ATG TTC GAC CGC CGG TTC 633 Leu Met Met Tyr Asn Asp Met Phe Arg Ile Met Phe Asp Arg Arg Phe 180 185 190 195 GAG AGC GTG GCC GAC CCG CTC TTC AAC CAG CTC AAG GCG CTC AAC GCC 681 Glu Ser Val Ala Asp Pro Leu Phe Asn Gln Leu Lys Ala Leu Asn Ala 200 205 210 GAG CGC AGC ATC CTC TCC CAG AGC TTC GAC TAC AAC TAC GGC GAC TTC 729 Glu Arg Ser Ile Leu Ser Gln Ser Phe Asp Tyr Asn Tyr Gly Asp Phe 215 220 225 ATC CCC GTC CTC CGC CCC TTC CTC CGC CGC TAC CTC AAC CGC TGC ACC 777 Ile Pro Val Leu Arg Pro Phe Leu Arg Arg Tyr Leu Asn Arg Cys Thr 230 235 240 AAC CTC AAG ACC AAG CGG ATG AAG GTG TTC GAG GAC CAC TTC GTC CAG 825 Asn Leu Lys Thr Lys Arg Met Lys Val Phe Glu Asp His Phe Val Gln 245 250 255 CAG CGC AAG GAG GCG TTG GAG AAG ACG GGT GAG ATC AGG TGC GCC ATG 873 Gln Arg Lys Glu Ala Leu Glu Lys Thr Gly Glu Ile Arg Cys Ala Met 260 265 270 275 GAC CAC ATC CTG GAA GCC GAA AGG AAG GGC GAG ATC AAC CAC GAC AAC 921 Asp His Ile Leu Glu Ala Glu Arg Lys Gly Glu Ile Asn His Asp Asn 280 285 290 GTC CTC TAC ATC GTC GAG AAC ATC AAC GTC GCA GCC ATC GAG ACG ACG 969 Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr 295 300 305 CTG TGG TCG ATC GAG TGG GGC CTC GCG GAG CTG GTG AAC CAC CCG GAG 1017 Leu Trp Ser Ile Glu Trp Gly Leu Ala Glu Leu Val Asn His Pro Glu 310 315 320 ATC CAG CAG AAG CTG CGC GAG GAG ATC GTC GCC GTT CTG GGC GCC GGC 1065 île Gln Gln Lys Leu Arg Glu Glu Ile Val Ala Val Leu Gly Ala Gly 325 330 335 GTG GCG GTG ACG GAG CCG GAC CTG GAG CGC CTC CCC TAC CTG CAG TCC 1113 Val Ala Val Thr Glu Pro Asp Leu Glu Arg Leu Pro Tyr Leu Gln Ser 340 345 350 355 GTG GTG AAG GAG ACG CTC CGC CTC CGC ATG GCA ATC CCG CTC CTG GTG 1161 Val Val TTC GGC GTC GGC CGC CGG AGC TGC CCC GGG ATC ATC CTC GCG CTG CCC 1401 Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro 440 445 450 ATC ATC GGC ATC ACG CTC GGA CGC CTG GTG CAG AAC TTC CAG CTG CTG 1449 Ile Ile Gly Ile Thr Leu Gly Arg Leu Val Gln Asn 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CAC GGC AAC GAT TTC CGG 1296 Phe Leu Glu Glu Glu Lys Ala Val Glu Ala His Gly Asn Asp Phe Arg 420 425 430 TTC GTG CCC TTC GGC GTC GGC CGC CGG AGC TGC CCC GGG ATC ATC CTC 1344 Phe Val Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Ile Ile Leu 435 440 445 GCG CTG CCC ATC ATC GGC ATC ACG CTC GGA CGC CTG GTG CAG AAC TTC 1392 Ala Leu Pro Ile Ile Gly Ile Thr Leu Gly Arg Leu Val Gln Asn Phe 450 455 460 CAG CTG CTG CCG CCG CCG GGG CAG GAC AAG ATC GAC ACC ACC GAG AAG 1440 Gln Leu Leu Pro Pro Pro Gly Gln Asp Lys Ile Asp Thr Thr Glu Lys 465 470 475 480 CCC GGG CAG TTT ACC AAC CAG ATC CTC AAG CAC GCC ACC ATT GTC TGC 1488 Pro Gly Gln Phe Thr Asn Gln Ile Leu Lys His Ala Thr Ile Val Cys 485 490 495 AAG CCA CTC GAG GCT TAA 1506 Lys Pro Leu Glu Ala 500 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2181 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:112..1734 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: CGATCCACCC CTTGGATCCA CTCTACCCAG CTCGCTAGCC AGCGGGGTAC ATACACGCAC 60 GCACGTACGC GCGTACGTAC ACTCGCAGAG CTTGCTTCAG GGAGGCCGGC A ATG GAG 117 Met Glu 1 GTG GGG ACG TGG GCG GTG GTG GTG TCG GCG GTG GCC GCG TAC ATG GCG 165 Val Gly Thr Trp Ala Val Val Val Ser Ala Val Ala Ala Tyr Met Ala 5 10 15 TGG TTC TGG CGG ATG TCC CGC GGG CTG CGC GGG CCG CGG GTT TGG CCC 213 Trp Phe Trp Arg Met Ser Arg Gly Leu Arg Gly Pro Arg Val Trp Pro 20 25 30 GTG CTC GGC AGC CTG CCG GGC CTG GTG CAG CAC GCC GAG GAC ATG CAC 261 Val Leu Gly Ser Leu Pro Gly Leu Val Gln His Ala Glu Asp Met His 35 40 45 50 GAG TGG ATC GCC GGC AAC CTG CGC CGC GCG GGC GGC ACG TAC CAG ACC 309 Glu Trp Ile Ala Gly Asn Leu Arg Arg Ala Gly Gly Thr Tyr Gln Thr 55 60 65 TGC ATC TTC GCC GTG CCC GGG GTG GCG CGC CGC GGC GGC CTG GTC ACC 357 Cys Ile Phe Ala Val Pro Gly Val Ala Arg Arg Gly Gly Leu Val Thr 70 75 80 GTC ACC TGC GAC CCG CGC AAC CTG GAG CAC GTC CTG AAG GCG CGC TTC 405 Val Thr Cys Asp Pro Arg Asn Leu Glu His Val Leu Lys Ala Arg Phe 85 90 95 GAC AAC TAC CCC AAG GGC CCC TTC TGG CAC GGC GTC TTC CGG GAC CTG 453 Asp Asn Tyr Pro Lys Gly Pro Phe Trp His Gly Val Phe Arg Asp Leu 100 105 110 CTC GGC GAC GGC ATC TTC AAT TCC GAC GGC GAC ACC TGG CTC GCG CAG 501 Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Asp Thr Trp Leu Ala Gln 115 120 125 130 CGC AAG ACG GCC GCG CTC GAG TTC ACC ACC CGC ACG CTC CGG ACG GCC 549 Arg Lys Thr Ala Ala Leu Glu Phe Thr Thr Arg Thr Leu Arg Thr Ala 135 140 145 ATG TCC CGC TGG GTC TCG CGC TCC ATC CAC GGC CGC CTC CTG CCC ATC 597 Met Ser Arg Trp Val Ser Arg Ser Ile His Gly Arg Leu Leu Pro Ile 150 155 160 CTG GCC GAC GCG GCC AAG GGC AAG GCG CAG GTG GAT CTC CAGXGAC CTC 645 Leu Ala Asp Ala Ala Lys Gly Lys Ala Gln Val Asp Leu Gîn Asp Leu 165 170 175 CTC CTC CGC CTC ACC TTC GAC AAC ATC TGC GGC CTG GCC TTC GGC AAG 693 Leu Leu Arg Leu Thr Phe Asp Asn Ile Cys Gly Leu Ala Phe Gly Lys 180 185 190 GAC CCG GAG ACG CTC GCC CAG GGC CTG CCG GAG AAC GAG TTC GCC TCC 741 Asp Pro Glu Thr Leu Ala Gln Gly Leu Pro Glu Asn Glu Phe Ala Ser 195 200 205 210 GCG TTC GAC CGC GCC ACC GAG GCC ACG CTC AAC CGC TTC ATC TTC CCG 789 Ala Phe Asp Arg Ala Thr Glu Ala Thr Leu Asn Arg Phe Ile Phe Pro 215 220 225 GAG TTC CTG TGG CGC TGC AAA AAG TGG CTG GGC CTC GGC ATG GAG ACC 837 Glu Phe Leu Trp Arg Cys Lys Lys Trp Leu Gly Leu Gly Met Glu Thr 230 235 240 ACG CTG ACC AGC AGC ATG GCC CAC GTC GAC CAG TAC CTC GCC GCC GTC 885 Thr Leu Thr Ser Ser Met Ala His Val Asp Gln Tyr Leu Ala Ala Val 245 250 255 ATC AAG AAG CGC AAG CTC GAG CTC GCC GCC GGC AAC GGC AAA TGC GAC 933 Ile Lys Lys Arg Lys Leu Glu Leu Ala Ala Gly Asn Gly Lys Cys Asp 260 265 270 ACG GCG GCG ACG CAC GAC GAC CTG CTC TCC CGG TTC ATG CGG AAG GGT 981 Thr Ala Ala Thr His Asp Asp Leu Leu Ser Arg Phe Met Arg Lys Gly 275 280 285 290 TCC TAC TCG GAC GAG TCG CTC CAG CAC GTG GCG CTC AAC TTC ATC CTC 1029 Ser Tyr Ser Asp Glu Ser Leu Gln His Val Ala Leu Asn Phe Ile Leu 295 300 305 GCC GGC CGC GAC ACC TCC TCC GTG GCG CTC TCC TGG TTC TTC TGG CTC 1077 Ala Gly Arg Asp Thr Ser Ser Val Ala Leu Ser Trp Phe Phe Trp Leu 310 315 320 GTG TCC ACC CAC CCT GCG GTG GAG CGC AAG ATC GTG CGC GAG CTC TGC 1125 Val Ser Thr His Pro Ala Val Glu Arg Lys Ile Val Arg Glu Leu Cys 325 330 335 TCC GTT CTC GCC GCG TCA CGG GGC GCC CAT GAC CCG GCA TTG TGG CTG 1173 Ser Val Leu Ala Ala Ser Arg Gly Ala His Asp Pro Ala Leu Trp Leu 340 345 350 GCG GAG CCC TTC ACC TTC GAG GAG CTC GAC CGC CTG GTC TAC CTC AAG 1221 Ala Glu Pro Phe Thr Phe Glu Glu Leu Asp Arg Leu Val Tyr Leu Lys 355 360 365 370 GCG GCG CTG TCG GAG ACC CTC CGC CTC TAC CCC TCC GTC CCC GAG GAC 1269 Ala Ala Leu Ser Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ser Val Pro Glu Asp 375 380 385 TCC AAG CAC GTC GTC GCG GAC GAC TAC CTC CCC GAC GGC ACC TTC GTG 1317 Ser Lys His Val Val Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Phe Val 390 395 400 CCG GCC GGG TCG TCG GTC ACC TAC TCC ATA TAC TCG GCG GGG CGC ATG 1365 Pro Ala Gly Ser Ser Val Thr Tyr Ser Ile Tyr Ser Ala Gly Arg Met 405 410 415 AAG GGG GTG TGG GGG GAG GAC TGC CTC GAG TTC CGG CCG GAG CGA TGG 1413 Lys Gly Val Trp Gly Glu Asp Cys Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Trp 420 425 430 CTG TCG GCC GAC GGC ACC AAG TTC GAG CAG CAC GAC TCG TAC AAG TTC 1461 Leu Ser Ala Asp Gly Thr Lys Phe Glu Gln His Asp Ser Tyr Lys Phe 435 440 445 450 GTG GCG TTC AAC GCC GGG CCG AGG GTG TGC CTG GGC AAG GAC CTA GCC 1509 Val Ala Phe Asn Ala Gly Pro Arg Val Cys Leu Gly Lys Asp Leu Ala 455 460 465 TAC CTG CAG ATG AAG AAC ATC GCC GGG AGC GTG CTG CTC CGG CAC CGC 1557 Tyr Leu Gln Met Lys Asn Ile Ala Gly Ser Val Leu Leu Arg His Arg 470 475 480 CTG ACC GTG GCG CCG GGC CAC CGC GTG GAG CAG AAG ATG TCG CTC ACG 1605 Leu Thr Val Ala Pro Gly His Arg Val Glu Gln Lys Met Ser Leu Thr 485 490 495 CTC TTC ATG AAG GGC GGG CTA CGG ATG GAG GTA CGT CCG CGC GAC CTC 1653 Leu Phe Met Lys Gly Gly Leu Arg Met Glu Val Arg Pro Arg Asp Leu 500 505 510 GCC CCC GTC CTC GAC GAG CCC TGC GGC CTG GAC GCC GGC GCC GCC ACC 1701 Ala Pro Val Leu Asp Glu Pro Cys Gly Leu Asp Ala Gly Ala Ala Thr 515 520 525 530 GCC GCC GCA GCA AGT GCC ACA GCG CCG TGC GCG TAGAAGACCT GGCACCGGCA 1754 Ala Ala Ala Ala Ser Ala Thr Ala Pro Cys Ala 535 540 CGCGCCATGC ATGATTCGTG CGTGCTAGCT GTTGAAGGGA CGCCGGACAT TGAATGTGTA 1814 GATAGGGCAG CAGTGCAAGA CCGTAAGTAA AATTGATGAT GGGTTTGGTG ACAACATTGA 1874 AGCCACTCCT TTCCAGAATT TACGACCCGG ATAGGAGAAA CAGGGAAACT TTGCAGATCA 1934 CAACACAAGA TCTAGCCAGC CGGGGATCTG ATCTGATTTG CGTCTGCTCG GAGCACGGGT 1994 GCATGGGAGA CCAAGGAGGA AAACAAAAAA TAACAGAAAC AGAGTGAGCA ATATTTGTGA 2054 TTGTAGCCAC GGGAAAGAGA GAGGAGTAAT TAGTAATTCA GATTTGTTTG CAGTAGCTCG 2114 GTGTTGGTGA CCAGATCATA GCCAACTAGG CTATTCTATT CTATTCTATT TTTGAAGATG 2174 ATTTTTC 2181 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 150 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "Amorce" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ATATATGGAT CCATGGAGGT GGGGACGTGG GCGGTGGTG 39 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 150 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "Amorce" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: ATATATGGAT CCATGGAAGT TGGTACTTGG GCTGTTGTTG TTTCTGCTGT TGCTGCTTAT 60 ATGGCTTGGT TTTGGAGAAT GTCTAGAGGT TTGAGAGGTC CAAGAGTTTG GCCAGTTTTG 120 GGTTCTTTGC CAGGCCTGGT GCAGCACGCC 150 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "Reverse" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: TATATAGAAT TCCTTCTACG CGCACGGCGC TGTGGCACTT GC 42 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1626 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1..1623 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: ATG GAA GTT GGT ACT TGG GCT GTT GTT GTT TCT GCT GTT GCT GCT TAT 48 Met Glu Val Gly Thr Trp Ala Val Val Val Ser Ala Val Ala Ala Tyr 1 5 10 15 ATG GCT TGG TTT TGG AGA ATG TCT AGA GGT TTG AGA GGT CCA AGA GTT 96 Met Ala Trp Phe Trp Arg Met Ser Arg Gly Leu Arg Gly Pro Arg Val 20 25 30 TGG CCA GTT TTG GGT TCT TTG CCA GGC CTG GTG CAG CAC GCC GAG GAC 144 Trp Pro Val Leu Gly Ser Leu Pro Gly Leu Val Gln His Ala Glu Asp 35 40 45 ATG CAC GAG TGG ATC GCC GGC AAC CTG CGC CGC GCG GGC GGC ACG TAC 192 Met His Glu Trp Ile Ala Gly Asn Leu Arg Arg Ala Gly Gly Thr Tyr 50 55 60 CAG ACC TGC ATC TTC GCC GTG CCC GGG GTG GCG CGC CGC GGC GGC CTG 240 Gln Thr Cys Ile Phe Ala Val Pro Gly Val Ala Arg Arg Gly Gly Leu 65 70 75 80 GTC ACC GTC ACC TGC GAC CCG CGC AAC CTG GAG CAC GTC CTG AAG GCG 288 Val Thr Val Thr Cys Asp Pro Arg Asn Leu Glu His Val Leu Lys Ala 85 90 95 CGC TTC GAC AAC TAC CCC AAG GGC CCC TTC TGG CAC GGC GTC TTC CGG 336 Arg Phe Asp Asn Tyr Pro Lys Gly Pro Phe Trp His Gly Val Phe Arg 100 105 110 GAC CTG CTC GGC GAC GGC ATC TTC AAT TCC GAC GGC GAC ACC TGG CTC 384 Asp Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Asp Thr Trp Leu 115 120 125 GCG CAG CGC AAG ACG GCC GCG CTC GAG TTC ACC ACC CGC ACG CTC CGG 432 Ala Gln Arg TGG CTC GTC TCC ACC CAC CCT GCG GTC GAG CGC AAG ATC GTG CGC GAG 1008 Trp Leu Val Ser Thr His Pro Ala Val Glu Arg Lys Ile Val Arg Glu 325 330 335 CTC TGC TCC GTT CTC GCC GCG TCA CGC GGC GCC CAT GAC CCG GCA TTG 1056 Leu Cys Ser Val Leu Ala Ala Ser Arg Gly Ala His Asp Pro Ala Leu 340 345 350 TGG CTG GCG GAG CCC TTC ACC TTC GAG GAG CTC GAC CGC CTG GTC TAC 1104 Trp Leu Ala Glu Pro Phe Thr Phe Glu Glu Leu Asp Arg Leu Val Tyr 355 360 365 CTC AAG GCG GCG CTG TCG GAG ACC CTC CGC CTC TAC CCC TCC GTC CCC 1152 Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ser Val Pro 370 375 380 GAG GAC TCC AAG CAC GTC GTC GCG GAC GAC TAC CTC CCC GAC GGC ACC 1200 Glu Asp Ser Lys His Val Val Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Asp Gly Thr 385 390 395 400 TTC GTG CCG GCC GGC TCC TCG GTC ACC TAC TCC ATA TAC TCG GCG GGG 1248 Phe Val Pro Ala Gly Ser Ser Val Thr Tyr Ser Ile Tyr Ser Ala Gly 405 410 415 CGC ATG AAG GGG GTG TGC GGC GAG GAC TGC CTC GAG TTC CGG CCG GAG 1296 Arg Met Lys Gly Val Trp Gly Glu Asp Cys Leu Glu Phe Arg Pro Glu 420 425 430 CGA TGG CTG TCG GCC GAC GGC ACC AAG TTC GAG CAG CAC GAC TCG TAC 1344 Arg Trp Leu Ser Ala Asp Gly Thr Lys Phe Glu Gln His Asp Ser Tyr 435 440 445 AAG TTC GTG GCG TTC AAC GCC GCG CCG AGG GTG TGC CTG GGC AAG GAC 1392 Lys Phe Val Ala Phe Asn Ala Gly Pro Arg Val Cys Leu Gly Lys Asp 450 455 460 CTA GCC TAC CTG CAG ATG AAG AAC ATC GCC CGC AGC GTG CTG CTC CGG 1440 Leu Ala Tyr Leu Gln Met Lys Asn Ile Ala Gly Ser Val Leu Leu Arg 465 470 475 480 CAC CGC CTG ACC GTG GCG CCG GGC CAC CGC GTG GAG CAG AAG ATG TCC 1488 His Arg Leu Thr Val Ala Pro Gly His Arg Val Glu Gln Lys Met Ser 485 490 495 CTC ACG CTC TTC ATG AAG GGC GGG CTA CGC ATG GAG GTA CGT CCG CGC 1536 Leu Thr Leu Phe Met Lys Gly Gly Leu Arg Met Glu Val Arg Pro Arg 500 505 510 GAC CTC GCC CCC GTC CTC GAC GAG CCC TGC GGC CTG GAC GCC GGC GCC 1584 Asp Leu Ala Pro Val Leu Asp Glu Pro Cys Gly Leu Asp Ala Gly Ala 515 520 525 GCC ACC GCC GCC GCA GCA AGT GCC ACA CCC CCC TGC CCG TAG 1626 Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Ala Thr Ala Pro Cys Ala 530 535 540 REVENDICATIONS 1. Séquence dADN codant pour une protéine d'intérêt contenant des régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures, caractérisée en ce qu'un nombre suffisant de codons mal adaptés aux levures est remplacé par des codons correspondants adaptés aux levures dans lesdites régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures. 2. Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que les codons mal adaptés aux levures sont choisis parmi les codons dont la fréquence d'utilisation par les levures est inférieure ou égale à environ 13 pour 1000, de préférence inférieure ou égale à environ 12 pour 1000, plus préférentiellement inférieure ou égale à environ 10 pour 1000. 3. Séquence selon la revendication 2, caractérisée en ce que les codons mal adaptés aux levures sont choisis parmi les codons CTC, CTG et CTT codant pour la leucine, les codons CGC, CGC, CGA, CGT et AGG codant pour l'arginine, les codons GCG et GCC codant pour l'alanine, les codons GGG, GGC et GGA codant pour la glycine et les codons CCC et CCC codant pour la proline. 4. Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que les codons mal adaptés aux levures sont choisis parmi les codons CTC et CTG codant pour la leucine, les codons CGG, CGC, CGA, CGT et AGG codant pour l'arginine, les codon GCG et GCC pour l'alanine, les codons GGG et GGC codant pour la glycine et les codons CCC et CCC codant pour la proline. 5. Séquence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les codons correspondants adaptés aux levures sont choisis parmi les codons correspondants aux codons mal adaptés aux levures, codant pour les même acides aminés et dont la féquence d'utilisation par les levures est supérieure à 15 pour 1000, de préférence supérieure ou égale à 18 pour 1000, plus préférentiellement supérieure ou égale à 20 pour 1000. 6. Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce que les codons correspondants adaptes aux levures sont choisis parmi les codons TTC et TTA, préférentiellement TTC, codant pour la leucine, le codon AGA codant pour l'argînine, les codons GCT et GCA, préférentiellement CCT, codant pour l'alanine, le codon GGT codant pour la glycine et le codon CCA codant pour la proline. 7. Séquence selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures comprennent au moins 2 codons mal adaptés parmi 10 codons consécutifs, les deux codons pouvant être adjacents ou séparées par jusqu'à 8 autres codons. 8. Séquence selon la revendication 7, caractérisée en ce que les régions à forte teneur en codons mal adaptés comprennent 2, 3, 4, 5 ou 6 codons mal adaptés pour 10 codons consécutifs, ou comprennent au moins 2 ou 3 codons mal adaptés adjacents. 9. Séquence d'ADN, en particuler d'ADNc, codant pour une protéine d'intérêt comprenant des régions à forte teneur en leucine, caractérisée en ce qu'un nombre suffisant de codons CTC codant pour la leucine dans ladite région à forte teneur en leucine, est remplacé par des codons TTG et/ou TTA, ou en ce qu'un nombre suffisant de codons CTC et CTG codant pour la leucine dans ladite région à forte teneur en leucine, sont remplacés par des codons TTG et/ou TTA. 10. Séquence selon la revendication 9, caractérisée en ce que les codons CTC ou CTC et CTG sont remplacés par un codon TTG. 11. Séquence selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que les régions à forte teneur en leucine comprennent 2, 3, 4, 5 ou 6 leucines pour 10 acides aminés consécutifs, ou comprennent au moins 2 ou 3 leucines adjacentes. 12. Séquence selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce la teneur générale en codons mal adaptés est d'au moins 20 %, plus préférentiellement d'au moins 30 %, par rapport au nombre total de codons. 13. Séquence selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une région en 5' à forte teneur en codons mal adaptés aux levures. 14. Séquence selon la revendicationl3, caractérisée en ce que les codons mal adaptés aux levures sont remplacés dans cette seule région en 5'. 15. Séquence selon l'une des revendications l à 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN isolée d'origine naturelle, en particulier d'origine végétale. 16. Séquence selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est d'origine de plantes dicotylédones ou monocotyledones, en particulier de plantes monocotyledones. 17. Séquence selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est d'origine de plantes de la famille des graminées, en particulier choisies parmi le blé, l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, le sorgho ou la canne à sucre. 18. Séquence selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle code pour une enzyme. 19. Séquence selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle code pour un cytochrome P450. 20. Séquence selon la revendication 19, caractérisée en ce que la séquence contenant des régions à forte teneur en codons mal adaptés aux levures comprend la région codante des séquences ID No 1 ou ID No 10. 21. Séquence selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'il s'agit des séquences ID No 7, ID No 8, ID No 9 ou ID No 13. 22. Gène chimère comprenant une séquence d'ADN modifiée selon l'une des revendications l à 21 et des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une levure. 23. Vecteur pour la transformation des levures comprenant au moins un gène chimère selon la revendication 22. 24. Procédé de transformation des levures au moyen d'un vecteur selon la revendication 23. 25. Levure transformée pour l'expression d'une protéine d'intérrêt caractérisée en ce qu'elle comprend un gène chimère selon la revendication 22. 26. Levure selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les genres Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia et Yarrowia, avantageusement du genre Saccharomyces, en particulier S. cerevisiae. 27. Procédé de production d'une protéine d'intérêt hétérologue dans une levure transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de: a) transformation d'une levure avec un vecteur selon la revendication 23, comprenant une séquence d'ADN modifiée selon l'une des revendications 1 à 21 et des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une levure, b) culture de la levure transformée, et c) extraction de la protéine d'intérêt de la culture de levure. 28. Procédé de transformation d'un substrat par catalyse enzymatique au moyen d'une enzyme exprimée dans une levure, comprenant les étapes de a) culture en présence du substrat à transformer, de la levure transformée avec un vecteur selon la revendication 23, comprenant une séquence d'ADN modifiée selon l'une des revendications 1 à 21 et des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une levure, puis b) récupération du substrat transformé de la culture de levure.