Brevet FR2764389A1 — publié le 19981211

Utilisation de venin de Crotalus viridis helleri, procédé et nécessaire pour la détermination de la réactivité de la protéine C activée Domaine de l'invention La présente invention a trait à une nouvelle utilisation d'un venin de serpent particulier, le venin de Crotalus viridis helleri (ce venin est désigné ci-après CVH), dans le domaine de la détermination de la réactivité de la protéine C activée, cette détermination englobant celle de l'activité de la protéine C fonctionnelle et celle de la résistance à la protéine C activée (la protéine C activée est notée ici APC et la résistance à APC est notée APC-R ; les autres abréviations utilisées sont définies plus loin). L'invention concerne également un procédé de détermination de APC-R utilisant CVH et un nécessaire de dosage permettant de mettre en oeuvre ce procédé. Art antérieur L'étude des thrombophilies héréditaires a permis de démontrer que APC-R est principalement associée à une mutation sur le gène codant pour le facteur V. Cette mutation, dénommée "mutation de Leiden", "mutation R506Q", ou "mutation 506R506Q", se traduit au niveau de la séquence des aminoacides du facteur V humain par le remplacement en position 506 de Arg en Gln, et favorise l'apparition de thromboses le plus souvent veineuses (au niveau des membres inférieurs avec, le cas échéant, embolie pulmonaire). Voir notamment à cet effet les publications de R.M. BERTINA et al., Nature, 1994, 36Q pages 64-68, de M. KALAFATIS et al., J. Biol. Chem., 1994, 269. pages 31869-31880, de H. DE RONDE et al., Thromb. Haemost., 1994, X, pages 880-886, de P.J. SVENSSON et al., N. Engl. J. Med., 1994, 330. pages 517-522, de B. DAHLBÀCK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, M, pages 1004-1008 et de DAHLBÀCK et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 1994, 2L pages 1396-1400. D'autres anomalies du facteur V peuvent être à l'origine de APC-R. Il se pourrait en particulier qu'un clivage à un moment inopportun en position 306 (i.e. 306Arg) de la séquence des aminoacides du facteur V et/ou Va soit l'une des autres causes possibles de APC-R. La détermination de APC-R a été mise en oeuvre initialement (notamment selon un test APTT, KCCT ou analogue) pour apprécier l'existence d'un désordre thrombotique en comparant le temps de coagulation, qui est prolongé par addition de APC, d'un plasma témoin avec celui, qui est réduit en cas d'anomalie par rapport au précédent, d'un échantillon de plasma humain à tester additionné de APC. Voir à cet effet : C.A. MITCHELL et al., N. Engi. J. Med., 1987, Ml, pages 1638-1642, L. AMER et al., Thromb. Res., 1990, SZ, pages 247-258 et B. DAHLBÀCK et al., Thromb. Haemost., 1991, , abstract 39, page 658. Le seul nécessaire actuellement disponible sur le marché (il est commercialisé sous la dénomination de "COATEST APC-RESISTANCE" par la société dite CHROMOGENIX) met en oeuvre le procédé décrit dans la divulgation de B. DAHLBÀCK et al., Thromb. Haemost., 1991, 65, abstract 39, page 658, précitée et illustré dans WO-A-9310261 et l'article de B. DAHLBÀCK et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90. pages 10041008 précité. Ce procédé comprend le mélange d'un volume de plasma à tester ou de plasma témoin avec un volume de réactif APTT [PL + activateur de surface (silice, kaolin ou verre)], l'incubation pendant 4 minutes à 37"C, puis l'initiation de la coagulation au moyen d'un volume d'une solution de Cal2, d'une part, ou d'un volume d'une solution de CaCl2 et APC, d'autre part. Ce procédé est insatisfaisant en ce sens que, sensible notamment à la présence du facteur VIII, d'héparine, de PS, des CAC et des VKA, il fournit trop de résultats faux négatifs et faux positifs. Des perfectionnements ont donc été proposés dans WO-A-9615457, WO-A-9604560 et EP-A-0711838. WO-A-9615457 propose un procédé de détermination de APC-R dans lequel on met en contact le plasma à tester, un réactif procoagulant (ici le facteur tissulaire) et un PdfV, puis après incubation on initie la coagulation au moyen de Cas12 ou CaC12 + APC, la variation du temps de coagulation étant ensuite appréciée par rapport à un plasma témoin. WO-A-9604560 vise une technique améliorée pour détecter APC R. Cette technique est fondée sur l'utilisation d'un réactif exogène activant spécifiquement le facteur V en Va, en complément d'une activation de la coagulation soit par la transformation XoXa, soit par la transformation prothrombineothrombine selon un mécanisme dépendant du facteur V. WO-A-9604560 préconise notamment - en tant que réactif exogène, un venin de serpent tel que le venin de Naja nivea pour activer V en Va, et - pour l'activation complémentaire: soit RVV-X pour activer X en Xa, soit un venin (ou extrait de venin) de serpent, tel que les venins de Pseudonaja textilis, No te ch is scutatus ou Oxyuranus scutellatus, pour l'activation de la prothrombine en thrombine selon un mécanisme dépendant du facteur V. EP-A-0711838 recommande pour la détermination de APC-R un procédé comprenant (a) le mélange d'un plasma à tester avec un réactif A à teneur réduite en facteur V, notamment PdfV, (b) I'addition d'un réactif B activant directement ou indirectement le facteur V en Va, notamment un venin de serpent tel que RVV (qui par sa fraction RVV-V induit l'activation de V en Va et qui par sa fraction RVV-X induit l'activation de X en Xa) ou le venin de Echis carinatus (qui induit l'activation de la prothrombine en thrombine et par suite active de façon indirecte V en Va), (c) I'addition d'un réactif C permettant la dégradation du facteur Va, à savoir APC [ou le mélange PC + activateur (notamment ACC)], et (d) l'addition de réactifs permettant la détermination de l'activité résiduelle du facteur Va, avec la condition que la proportion du volume de l'échantillon de plasma à tester par rapport au volume total soit au plus de 20 %, avantageusement inférieure ou égale à 10 % ("wobei der Anteil des Probenvolumens am gesamten Testvoltimen maximal 20 %, vorzugsweise jedoch weniger oder gleich 10 % beträgt", selon la revendication 1. page 13 lignes 39-40 de EP-A-071 1838). Ce procédé présente l'inconvénient de faire appel à des volumes de plasma (à tester ou témoin), de réactif A et de réactif B qui sont tous les trois différents. Cette circonstance ne facilite pas les mesures des temps de coagulation au moyen de dispositifs totalement autornatiques. Les procédés précités de WO-A-9604560 et EP-A-0711838 permettent de pallier à la majorité des inconvénients du test "COATEST APC-RESISTANCE". Cependant, ces deux documents ne décrivent ni ne suggèrent l'utilisation du venin de serpent particulier de l'invention, à savoir CVH, pour initier la coagulation au niveau du facteur X par la transformation XoXa. La seule technique efficace à ce jour pour déterminer APC-R est fondée sur la biologie moléculaire (BM). Elle est longue, fastidieuse, onéreuse et exige un matériel élaboré et un personnel hautement qualifié. En outre, sa mise en oeuvre doit satisfaire à l'article L. 145-15 de la loi française No. 94-653 du 29 juillet 1994 qui fait obligation d'obtenir le consentement écrit des personnes pour lesquelles une étude génétique est entreprise. But de l'invention On se propose de fournir une nouvelle solution technique pour la détermination de APC-R, qui (i) soit simple sur le plan de la mise en oeuvre, (ii) soit au moins aussi efficace que celles envisagées dans les documents WO-A-9604560 et EP-A-0711838 précités, et (iii) s'appuie sur l'initiation de la coagulation au niveau du facteur X (i.e. transformation XoXa) dont l'intérêt a été reconnu dans WO-A-9604560 (voir page 5 lignes 1-12). Le but recherché est d'améliorer la sensibilité en réduisant le nombre de résultats faux positifs et faux négatifs. Objet de l'invention La nouvelle solution technique selon l'invention repose sur le choix d'un activateur particulier pour initier la coagulation au niveau du facteur X (i.e. XoXa). Cet activateur particulier est un venin de serpent, à savoir CVH. Selon un premier aspect de l'invention, I'on préconise une nouvelle utilisation d'un venin de serpent pour déclencher la coagulation par activation du facteur X en Xa en vue de déterminer la réactivité de la protéine C activée, notamment l'activité fonctionnelle de la protéine C (PC), d'un plasma humain à tester, ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à du venin de Crotalus viridis helleri en tant que substance initiant la coagulation, en présence de Ca2 +, au niveau du facteur X, ledit venin activant sélectivement X en Xa sans être influencé par la présence ou l'absence des autres facteurs de la coagulation. Selon un second aspect de l'invention, l'on préconise un nouveau procédé de détermination de APC-R d'un échantillon de plasma humain à tester, ledit procédé, qui met en oeuvre l'initiation de la coagulation au niveau du facteur X au moyen d'un venin de serpent en présence (i) de Ca2+ ou (ii) d'un mélange de Ca2+ et APC exogène, puis l'évaluation du temps de coagulation, (i) en l'absence de APC et, respectivement, (ii) en présence de APC, par rapport à un plasma normal, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1 ) mettre en contact (a) un échantillon de plasma humain à tester, (b) un réactif déficient en facteur V (RdfV) en tant que produit fournissant la majorité des (de préférence tous les) facteurs de la coagulation autres que le facteur V, et (c) CVH en tant que produit activant spécifiquement X en Xa, et incuber le mélange ainsi obtenu pendant au moins 1 minute à une température comprise entre 10 et 45"C, de préférence pendant 3 à 5 minutes à une température de 35 à 40"C, et mieux pendant 4 minutes à 37 C; (2 ) introduire dans ledit mélange ainsi incubé (i) Ca2 + ou, respectivement, (ii) Ca2 + + APC exogène (3 ) évaluer le temps de coagulation (i) en l'absence de APC et, respectivement, (ii) en présence de APC (4 ) reproduire les étapes (1 ) à (3 ) en remplaçant à l'étape (1 ) ledit échantillon de plasma humain à tester par un plasma normal en tant que témoin ; et, (5 ) apprécier APC-R par la comparaison des évaluations obtenues aux étapes (3 ) et (4"). Selon un troisième aspect de l'invention, l'on préconise un nécessaire, trousse ou kit de dosage caractérisé en ce qu'il comprend - un premier réactif qui est un plasma déficient en facteur V, - un second réactif constitué par le CVH, et - un troisième réactif constitué par APC en milieu calcique. Abréviations Par commodité on a utilisé dans la présente description les abréviations et acronymes suivants. ACC venin d'Agkistrodon contortrix, ce venin est un produit qui active sélectivement PC en APC APC protéine C activée APC-R résistance à la protéine C activée (quand il est question de "plasma APC-R" on entend que ledit plasma est résistant à APC) APTT temps de thromboplastine partielle activée (de l'anglais "activated partial thromboplastin time") AT III antithrombine III BM test par biologie moléculaire mettant en oeuvre ici une sonde ("probe") nucléique codant pour un fragment peptidique d'une dizaine d'aminoacides englobant 506Q, et la détection de la mutation par hybridation de la sonde après amplification (par PCR) de la région du DNA correspondant BM + désigne un plasma dans lequel le facteur V comprend la mutation R506Q (i.e. plasma "positif" selon le test BM) BM- désigne un plasma dans lequel le facteur V ne comprend pas la mutation R506Q (i.e. plasma "négatif" selon le test BM) CAC anticoagulant circulant CVH venin de Crotalus viridis helleri KCCT temps de céphaline-kaolin (de l'anglais "kaolin-cephalin clotting time") PB tampon Prionex (tampon contenant la fraction polypeptidique purifiée de collagène de porc) PC protéine C PCR amplification en chaîne par polymérase (de l'anglais "polymerase chain reaction") PdfV plasma déficient en facteur V PS protéine S PL phospholipides RdfV réactif déficient en facteur V RVV venin de la vipère de Russel (Vipera russeli), ce venin active le facteur V en Va et le facteur X en Xa RVV-V fraction purifiée de RVV activant le facteur V en Va RVV-X fraction purifiée de RVV activant le facteur X en Xa TOK tampon d'Owren-Koller, il s'agit d'un tampon véronal VKA antagoniste de la vitamine K Brève description du dessin Dans le dessin annexé - la figure 1 montre la variation du rapport normalisé n-APC-R-RS, qui est défini plus loin et représenté en ordonnée, en fonction de la concentration (% v/v) du plasma (pool témoin ou plasma APC-R) dans un mélange plasma + PdfV, cette concentration étant représentée en abscisse ; et, - la figure 2 représente la variation dudit rapport normalisé n-APC-R-RS (en ordonnée) en fonction de la concentration (% v/v) d'un plasma APC-R dans un mélange plasma APC-R + pool témoin de plasmas (en abscisse). Description détaillée de l'invention L'utilisation du venin particulier, CVH, selon l'invention permet d'apprécier la réactivité de APC, et en particulier l'activité fonctionnelle de PC, d'une part, et APC-R, d'autre part. Bien entendu, la détermination de APC-R est plus importante sur le plan du diagnostic que celle de l'activité fonctionnelle de PC. Par suite, la détermination de l'activité fonctionnelle de PC n'est que subsidiaire par rapport à celle de APC-R qui permet d'apprécier le risque de thrombose chez le patient testé. CVH est un produit commercial disponible sur le marché. On peut l'obtenir sous forme purifiée et lyophilisée au près de la société dite SIGMA. Avant l'invention, ce venin était utilisé principalement pour la production d'anti-sérum vis-à-vis des morsures de Crotalus viridis helleri. En pratique, CVH lyophilisé sera avant emploi dilué avec PB jusqu'à une concentration de 0,10 à 0,15 ,ug/ml (de préférence à une concentration de 0,12 ,ug/ml, ce qui correspond lors de la mise en oeuvre du procédé à une concentration finale de 0,03 yg/ml). Le réactif RdfV est principalement un plasma PdfV. Par l'expression "déficient en facteur V" on entend ici un réactif (RdfV) ou un plasma (PdfV) qui est soit essentiellement appauvri en facteur V soit dépourvu de facteur V. RdfV ou PdfV intervient selon l'invention en tant que plasma substrat, qui peut être d'origine synthétique, animale ou humaine. De façon avantageuse, on fera appel à un PdfV dépourvu de facteur V et obtenu par immunodéplétion. Pour éviter toute interférence avec les anti-phospholipides, notamment ceux du lupus, on recommande d'enrichir RdfV ou PdfV en PL. Selon un mode particulier de réalisation, à l'étape (1 ) on fait appel à un échantillon de plasma humain à tester obtenu par traitement avec du citrate trisodique (lors du prélèvement), centrifugation à 3500 g pendant 15 minutes environ et dilution au moyen de TOK. Le plasma normal utilisé comme témoin à l'étape (4 ) est obtenu dans les mêmes conditions. De façon pratique, en tenant compte des notations APC-R-RS et n-APC-R-RS proposées dans l'article précité de H. DE RONDE et al., à l'étape (3 ) et à l'étape (4 ) on évalue pour ledit échantillon de plasma humain à tester, d'une part, et pour ledit plasma témoin, d'autre part, la sensibilité à APC, ladite sensibilité étant le rapport (dénommé APC-R-SR) du temps de coagulation en présence de APC au temps de coagulation en l'absence de APC temps de coagulation en présence de APC APC - R - SR = temps de coagulation en l'absence de APC et en ce que à l'étape (5 ) on apprécie APC-R par le rapport normalisé (dénommé n-APC-R-SR) de la sensibilité à APC de l'échantillon de plasma humain à tester à la sensibilité à APC du plasma normal témoin n- APC - R-.SR = (APC - R - SR )échantillon (APC - R - SR )plasma témoin Selon le procédé de l'invention, une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR > 2 0,80 indique que l'échantillon de plasma humain à tester ne présente aucune résistance à la protéine C activée, et une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR Quand on a une valeur du rapport normalisé comprise dans l'intervalle douteux (0,72 Avantageusement, on utilisera selon l'invention des volumes identiques pour chacun des réactifs utilisés, à savoir : le plasma humain à tester (de préférence à une dilution de 1/10 dans TOK), RdfV (ou PdfV), solution de CaCl2, solution de CaCl2 + APC, plasma témoin (ou pool de plasmas témoins), et solution (ou dilution) de CVH (de préférence CVH dans de l'eau contenant 1 % v/v de PB). L'évaluation de APC-R aux étapes (3 ), (4 ) et (5 ) est d'un type connu de l'art antérieur, qui correspond à un taux de conversion d'un "substrat". Le temps de coagulation est mesuré soit directement (notamment au moyen d'un coagulomètre) en repérant l'instant du début de la coagulation, le substrat étant alors PdfV, soit indirectement (notamment au moyen d'un spectromètre) en repérant l'instant correspondant à la formation de thrombine générée dans le système réactionnel, le substrat étant alors la prothrombine. Le substrat préféré selon l'invention est PdfV. Le nécessaire, kit ou trousse de dosage selon l'invention, comportera de façon avantageuse un PdfV enrichi en PL. Ledit nécessaire peut encore contenir CaC12 pour préparer la solution aqueuse de CaCl2 à la concentration requise pour fournir les ions Ca2+ requis pour initier la coagulation. Selon le mode préféré de mise en oeuvre du procédé de l'invention - à l'étape (1 O), on met en contact (A) ledit échantillon de plasma humain à tester dilué, notamment au moyen de TOK, à une concentration supérieure ou égale à 1/20 v/v, en particulier à une concentration supérieure ou égale à 1/10 v/v, (B) un plasma humain déficient en facteur V et enrichi en PL, en tant que réactif RdfV, et (C) ledit venin de Crotalus viridis helleri, et incube pendant 4 minutes à 37 C; - à l'étape (2 ) on introduit dans le mélange ainsi incubé (i) Ca2+ ou, respectivement, (ii) le mélange Ca2+ + APC exogène à l'étape (3 ) on évalue la sensibilité à APC dudit échantillon de plasma humain à tester - à l'étape (4"), on reproduit l'ensemble des étapes (1 ) à (3 ) où à l'étape (1 ) ledit échantillon de plasma humain à tester est remplacé par un plasma hurnain normal, de façon à évaluer la sensibilité à APC dudit plasma humain normal ; et, - à l'étape (5 ), on apprécie APC-R par le rapport normalisé n-APC-R-SR, une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR > 2 0,80 indiquant générale- ment que l'échantillon de plasma humain à tester ne présente aucune résistance à la protéine C activée, et une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR Comme démontré ci-après, le procédé selon l'invention est spécifique et efficace. Il fournit des coefficients de variation "intra-essais" inférieurs à 3 % et des coefficients de variation "inter-essais" inférieurs à 5 %. De plus, il est insensible aux taux de facteurs de la voie intrinsèque, à l'héparine normale (poids moléculaire moyen : 12000 daltons), aux héparines fractionnées de faible poids moléculaire, aux taux de PS, aux taux de facteur VIII, aux CAC, aux VKA et à la mutation 20210A de la prothrombine. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation et d'essais. L'ensemble de ces éléments n'est pas limitatif mais est fourni à titre d'illustration. Exemple I Obtention du plasma humain à tester Le prélèvement est effectué sur une solution de citrate trisodique 0,109 M, à raison de 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang. L'échantillon est ensuite centrifugé à 3500 g pendant 15 minutes à 4"C. il est recommandé de faire une double centrifugation à 4"C afin d'éliminer la présence éventuelle de plaquettes dans l'échantillon. La séparation et le recueil du plasma doivent être réalisés le plus rapidement possible après le prélèvement. Après décantation, le plasma peut être conservé à 2-8"C pendant 8 h, 15-19"C pendant 8 h, et -20 C pendant 1 mois. En cas de décongélation. le plasma doit être décongelé à 37"C au bain-marie thermostaté pendant au moins 10 minutes puis homogénéisé avant utilisation. La recongélation d'un plasma est proscrite. Exemple 2 Obtention du plasma témoin On procède comme indiqué à l'exemple 1. Exemple 3 Préparation et conservation des réactifs - premier réactif (Rl) Ri est un plasma humain lyophilisé immunodéplété en facteur V et enrichi en PL. Le produit lyophilisé est transformé en composition aqueuse au moyen de 2 ml d'eau distillée. On homogénéise la solution résultante à la température ambiante (18-25"C) avant utilisation. Cette solution est stable à 18-25"C pendant 6 h, 15-19"C dans l'automate vendu sous la nomenclature commerciale de "STA" par la société DIAGNOSTICA STAGO pendant 38 h, 2-8"C pendant 26 h, et -20 C pendant I mois. - deuxième réactif (R2) R2 est le lyophilisat de CVH. Ce produit lyophilisé est transformé en composition aqueuse au moyen de 2 Inl d'eau distillée (pouvant contenir avantageusement 1 % v/v de PB). On homogénéise la composition résultante à la température ambiante (18-25"C) avant utilisation. Cette composition est stable à 18-25"C pendant 6 h, 15-19"C dans l'automate "STA" pendant 38 h, 2-8"C pendant 26 h, et -20 C pendant I mois. - troisième réactif (R3) R3 est la protéine C activée humaine en milieu calcique lyophilisée. Le lyophilisat est versé dans I mi d'eau distillée. On homogénéise la solution résultante à la température ambiante (18-25"C) avant utilisation. Cette solution est stable à 18-25"C pendant 6 h, 15-19"C dans l'automate "STA" pendant 38 h, 2-8"C pendant 26 h, et -20 C pendant 1 mois. Exemple 4 Mode opératoire On utilise (sauf indication contraire) des volumes identiques des divers réactifs intervenant dans le procédé de détermination selon l'invention. Ces volumes sont compris entre 5 y1 et 50 ,ul. Les modalités opératoires qui suivent sont celles qui concernent les mesures effectuées au moyen de l'automate "STA" précité ; on a ainsi utilisé 50 ,ul d'échantillon de plasma humain à tester dilué au 1/10 en TOK, 50 y1 de R1 (i.e. PdfV enrichi en PL), 50 s41 de R2 (i.e. CHV), et 50 y1 de CaC12 en solution aqueuse ou de R3 (i.e. APC + Ca2+). On met en contact au moyen de l'automate "STA" le plasma humain à tester ou le pool de plasmas normaux, PdtV enrichi en PL, et CVH. On incube le mélange résultant pendant 4 minutes à 37"C. On introduit dans ledit mélange la solution de CaCl2 ou le mélange CaCl2 + APC (i.e. R3) après avoir été chacun préchauffé à 37"C. Le "STA" détermine le temps de coagulation pour l'échantillon à tester et le pool témoin en présence et en l'absence de APC. Les résultats obtenus sont directement exprimés sous la forme du rapport normalisé précité : n-APC-R-RS. Exemple 5 Détermination de la zone normale A partir de 30 poches de plasmas fournies par le Centre de Transfusion Sanguine, on a déterminé (trois déterminations par essais) la valeur normale du rapport normalisé en fonction d'un pool normal de 25 hommes et de 25 femmes, ainsi que la zone pathologique sur un lot de 15 plasmas BM+ (plasmas APC-R homozygotes et hétérozygotes). On a pu constater que la valeur normale pour les plasmas BM- est telle que n-APC R-RS > 0,80 avec l'automate "STA". Exemple 6 Reproductibilité intra-essals A partir de 2 plasmas APC-R homozygotes (BM+) et d'un pool normal intervenant comme témoin (BM-), 21 déterminations ont été effectuées en triplicata. Les résultats concernant le coefficient de variation sont donnés dans le tableau I qui suit. Ils montrent que le coefficient de variation du rapport normalisé n-APC-R-RS est inférieur à 3 %. TABLEAU I Coefficient de variation de n-APC-R-RS Lot Lot 005 Lot 006 Lot 007 Pool BM- 2,08 1,94 2,25 APC-R 1 (BM+) 1,64 0,96 1,32 APC-R 2 (BM +) 1,60 1,82 1,57 Exemple 7 Reproductibilite Jour-par-jour Afin d'apprécier la reproduction jour-par-jour, un plasma normal congelé (BM-) et 2 plasmas pathologiques (BM+) l'un congelé et l'autre lyophilisé ont été aliquotés puis testés pendant 10 jours avec le même lot de réactifs sur le même automate "STA". Les résultats consignés dans le tableau II montrent que le coefficient de variation de n-APC-R-RS jour-par-jour est inférieur à 5 %. TABLEAU Il BM- BM+ congelé BM+ lyophilisé n-APC-R-RS n-APC-R-RS n-APC-R-RS Moyenne 0,93 0,51 0,56 SD 0,03 0,02 0,02 CV % 3,66 3,99 4,08 Notes : SD : écart standard par rapport à la moyenne CV % : coefficient de variation Exemple 8 Reproductibilité par lot On a testé avec l'automate "STA" un plasma normal BM- et un plasma pathologique BM + (plasma APC-R hétérozygote) aliquotés et congelés. Aussitôt après la décongélation, chaque plasma a été testé cinq fois dans une même série (un flacon), 15 séries indépendantes (15 flacons du même lot) ont été réalisées. Les résultats consignés dans le tableau III montrent que le coefficient de variation est inférieur à 5 %. TABLEAU III Plasma normal (BM-) | Plasma pathologique (BM+) M SD CV % M | SD CV % sans APC 41,93 0,757 1,804 38,46 0,602 1,564 avec APC 138,86 5,898 4,247 59,42 | 1,568 | 2,639 APC-R-RS 3,31 0,157 4,738 1,54 0,035 2,236 n-APC-R- 1,230 0,052 4,242 0,575 0,010 1,807 RS (médiane) Notes : M : moyenne du temps de coagulation (en secondes) SD : écart standard par rapport à la moyenne (en secondes) CV : coefficient de variation (exprimé en Exemple 9 Reoroductlblllte lot par lot 2 plasmas pathologiques notés BM+ 1 et BM + 2 (plasmas homozygotes) et un plasma normal BM- ont été décongelés et étudiés avec 3 lots différents des mêmes réactifs (moyenne de 5 mesures par essai). Un second plasma normal identique au précédent a été également testé en parallèle afin de déterminer le rapport n-APC-R-RS. Les résultats consignés dans le tableau IV montrent que le procédé selon l'invention est reproductible lot par lot. TABLEAU IV Plasmas n-APC-R-RS testés Lot 005 Lot 006 Lot 007 A max. BM- 1,17 1,10 1,07 0,10 BM+ 1 0,54 0,52 0,55 0,03 BM+ 2 0,55 | 0,52 | 0,54 0,03 Note : A max. : variation maximale Selon le tableau IV, A max. (en valeur absolue) est inférieur ou égal à 0,05 pour les plasmas BM+ et inférieur ou égal à 0,10 pour le plasma BM-. Exemple 10 Influence du taux de facteur V Pour mettre en évidence la spécificité du procédé selon l'invention en ce qui concerne le facteur V, on a réalisé une série de dilutions d'un pool normal ou d'un plasma APC-R dans un PdfV, d'une part, et une série de dilutions du même plasma APC-R dans ledit pool normal, d'autre part. Les résultats obtenus ont été consignés dans les figures 1 et 2. La courbe A de la figure 1 donne la variation du rapport normalisé n-APC-R-SR en fonction de la concentration (en % v/v) du pool de plasmas normaux dans le mélange (pool de plasmas normaux) + (PdfV). La courbe B de ladite figure 1 donne la variation du rapport normalisé n-APC-R-SR en fonction de la concentration (en % v/v) du plasma APC-R dans le mélange (plasma APC-R) + (PdrV). La courbe C de la figure 2 donne la variation du rapport normalisé n-APC-R-SR en fonction de la concentration (en % v/v) du même plasma APC-R dans le mélange (plasma APC-R) + (pool de plasmas normaux). Les courbes A et B mettent en évidence que - en ce qui concerne la dilution du plasma APC-R dans un PdfV, on obtient un résultat "positif" (n-APC-R-SR R est à une concentration de 10 à 100 % v/v ; et, - en ce qui concerne la dilution du pool de plasmas normaux dans un PdfV, on obtient un résultat "négatif" (n-APC-R-SR 2 0,98) quand ledit pool de plasmas normaux est à une concentration de 10 à 100 % v/v. En conséquence, les courbes A et B de la figure 1 démontrent clairement la spécificité du procédé selon l'invention en ce qui concerne la mutation de Leiden du facteur V. Cette spécificité est confirmée par la courbe C de la figure 2 qui montre que la dilution du plasma APC-R dans le pool de plasmas normaux conduit à un résultat "positif" (n-APC-R-SR Exemple il Essai comparatif 1 Pour comparaison on a testé sur automate "STA" 180 plasmas, à savoir 60 BM- et 120 BM+ (60 homozygotes et 60 hétérozygotes, notés respectivement BM+ A et BM+ B) en utilisant comme initiateur de la coagulation soit RVV-X selon l'enseignement de EP-A-0711838 [avec un rapport volumique PdfV/PdfV + plasma à tester = 75 %] soit CVH selon l'invention [avec un rapport volumique PdfV/PdfV + plasma à tester = 50 %]. Les résultats consignés dans le tableau V montrent que le procédé selon l'invention fournit une meilleure sensibilité. Dans cet essai comparatif, un second pool de 50 plasmas normaux BM- a été utilisé comme témoin. TABLEAU V Nombre de plasmas testés Plasmas contrôle par BM selon l'art antérieur selon l'invention utilisés + -1+ BM- 0 60 0 $ 60 0 60 BM+ A , 60 0 ~ 59 1 I 60 0 BM+ B 60 0 57 3 60 0 Exemple 12 Essai comparatif 2 En s'inspirant de l'enseignement de WO-A-9604560 [à savoir ici un seul venin (RVV-X) pour l'activation XoXa], on a comparé RVV-X avec CVII dans la détermination de APC-R. A cet effet, on a testé sur l'automate "STA" précité deux plasmas pathologiques (notés APC-R 1 et respectivement APC-R 2) dilués à 1/10 dans TOK vis-à-vis d'un pool de plasmas normaux, en utilisant en outre deux contrôles : un plasma BM- et un plasma BM+.Les résultats obtenus consignés dans le tableau VI ci-après, mettent en évidence que CVII présente un pouvoir discriminant supérieur à celui de RVV-X. En effet, pour les plasmas APC-R 1 et APC-R 2, RVV-X donne un rapport normalisé n-APC-R-SR se situant dans l'intervalle douteux 0,72 R 2) nettement inférieur au seuil minimal (0,72) dudit intervalle douteux. TABLEAU VI Plasmas Pool BM- BM+ APC-R 1 APC-R 2 normal contrôle contrôle RVV-X CT (s) 36,6/79,9 42,3/86,8 40,2/52,4 43,4/63,2 45,0/70,6 ACT (s) 40,3 44,5 12,2 19,8 25,6 rs 2,01 2,05 1,30 1,45 1,56 rn - 1,02 0,64 0,72 0,77 CVH CT (s) 39,3/114,4 43,8/118,0 42,1/71,1 43,0/71,9 46,0/78,0 ACT (s) 75,1 74,2 29,0 28,9 32,0 rs 2,91 2,69 1,68 1,67 1,69 rn - 0,92 0,57 0,57 0,58 Notes : CT : temps de coagulation (en secondes) sans APC/avec APC ACT : variation du temps de coagulation CT (avec APC) - CT (sans APC) rs : APC-R-SR rn: n-APC-R-SR REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un venin de serpent pour déclencher la coagulation par activation du facteur X en Xa en vue de déterminer la réactivité de la protéine C activée, notamment l'activité fonctionnelle de la protéine C, d'un plasma humain à tester, ladite utilisation étant caractérisée en ce que l'on fait appel à du venin de Crotalus viridis helleri en tant que substance initiant la coagulation, en présence de Cl2+, au niveau du facteur X, ledit venin activant sélectivement X en Xa sans être influencé par la présence ou l'absence des autres facteurs de la coagulation. 2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'on fait appel à du venin de Crotalus viridis helleri pour déterminer la résistance (APC-R) à la protéine C activée (APC) d'un plasma humain à tester. 3. Procédé de détermination de APC-R d'un échantillon de plasma humain à tester, ledit procédé, qui met en oeuvre l'initiation de la coagulation au niveau du facteur X au moyen d'un venin de serpent en présence (i) de Cl2 + ou (ii) d'un mélange de Ca2 + et APC exogène, puis l'évaluation du temps de coagulation, (i) en l'absence de APC et, respectivement, (ii) en présence de APC, par rapport à un plasma normal, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à (1 ) mettre en contact (a) un échantillon de plasma humain à tester, (b) un réactif déficient en facteur V (RdfV) en tant que produit fournissant la majorité des facteurs de la coagulation autres que le facteur V, et (c) le venin de Crotalus viridis helleri en tant que produit activant spécifiquement X en Xa, et incuber le mélange ainsi obtenu pendant au moins 1 minute à une température comprise entre 10 et 45 C; (2 ) introduire dans ledit mélange ainsi incubé (i) Ca2 + ou, respectivement, (ii) Ca2 + + APC exogène (3 ) évaluer le temps de coagulation (i) en l'absence de APC et, respectivement, (ii) en présence de APC (4 ) reproduire les étapes (1 ) à (3 ) en remplaçant à l'étape (1 ) ledit échantillon de plasma humain à tester par un plasma normal en tant que témoin ; et, (5 ) apprécier APC-R par la comparaison des évaluations obtenues aux étapes (3 ) et (4"). 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que ledit réactif RdfV est un plasma humain ou animal déficient en facteur V (PdfV). 5. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'on introduit à l'étape (1 ) des phospholipides (PL). 6. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que, à l'étape (1 ) et à l'étape (4 ) on fait appel à un échantillon de plasma humain à tester obtenu par traitement avec du citrate trisodique, centrifugation à 3500 g pendant 15 minutes et dilution au moyen du tampon d'Owren-Koller (TOK), d'une part, et à un plasma témoin obtenu à partir de sang humain normal et dilué dans des conditions identiques à celle dudit échantillon de plasma humain à tester, d'autre part. 7. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que, à l'étape (3 ) et à l'étape (4 ) on évalue pour ledit échantillon de plasma humain à tester, d'une part, et pour ledit plasma témoin, d'autre part, la sensibilité à APC, ladite sensibilité étant le rapport (dénommé APC-R-SR) du temps de coagulation en présence de APC au temps de coagulation en l'absence de APC: temps de coagulation en présence de APC APC - R - SR = temps de coagulation en 1' absence de APC et en ce que à l'étape (5 ) on apprécie APC-R par le rapport normalisé (dénommé n-APC-R-SR) de la sensibilité à APC de l'échantillon de plasma humain à tester à la sensibilité à APC du plasma normal témoin n - APC - R - SR = (APC - R - SR)échantillon (APC - R - SR )plasma témoin le plasma normal utilisé comme témoin étant avantageusement un pool de plasmas normaux humains. 8. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que - à l'étape (1"), on met en contact (A) ledit échantillon de plasma humain à tester dilué, notamment au moyen de TOK, à une concentration supérieure ou égale à 1/20 v/v, (B) un plasma humain déficient en facteur V et enrichi en PL, en tant que réactif RdfV, et (C) ledit venin de Crotalus viridis hellen, et incube pendant 4 minutes à 37 C; - à l'étape (2 ) on introduit dans le mélange ainsi incubé (i) Ca2+ ou, respectivement, (ii) le mélange Ca2+ + APC exogène à l'étape (3 ) on évalue la sensibilité à APC dudit échantillon de plasma humain à tester - à l'étape (4"), on reproduit l'ensemble des étapes (1 ) à (3 ) où à l'étape (1 ) ledit échantillon de plasma humain à tester est remplacé par un plasma humain normal, de façon à évaluer la sensibilité à APC dudit plasma humain normal ; et, - à l'étape (5 ), on apprécie APC-R par le rapport normalisé n-APC-R-SR, une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR > 0,80 indiquant généralement que l'échantillon de plasma humain à tester ne présente aucune résistance à la protéine C activée, et une valeur dudit rapport normalisé n-APC-R-SR 9. Nécessaire de dosage utile pour mettre en oeuvre le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend - un premier réactif qui est un plasma déficient en facteur V, - un second réactif constitué par le venin de Crotalus vinais helleri, et - un troisième réactif constitué par APC en milieu calcique. 10. Nécessaire de dosage selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit premier réactif est enrichi en PL.