Brevet FR2766204A1 — publié le 19990122

La présente invention concerne un milieu de culture permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe des bactéries pathogènes du genre Listeria ainsi qu'un procédé mettant en oeuvre ce milieu. L'isolement et l'identification de la bactérie Listeria monocytogenes est un problème majeur de la surveillance de l'hygiène agro-alimentaire et de la bactériologie médicale. Parmi les bactéries du genre Listera spp. seule l'espèce monocytogenes est connue pour être pathogène pour l'homme. Les autres espèces de Listeria ne sont pas pathogènes ou sont pathogènes seulement pour les animaux. C'est le cas notamment de Listeria ivanovii. La voie de contamination par Listeria monocytogenes est le plus souvent d'origine alimentaire. Ainsi, il est nécessaire de prévoir la détection de Listeria monocytogenes tout au long de la filière agro-alimentaire, des matières premières en passant par l'environnement des ateliers de fabrication jusqu'au produit fini destiné à la consommation. Dans le cadre de diagnostic d'affections bactériennes chez l'humain, il est également important de distinguer la Listeria monocytogenes parmi les autres bactéries du genre Listeria spp. qui ne sont pas pathogènes. La détection et l'isolement de Listeria spp. sont classiquement réalisés avec des milieux de culture sélectifs. Les milieux sélectifs Oxford (Curtis et al., Left. Appl. Microbiol. (1989), 8, pp. 85-98) et Palcam (Van Netten et al., J. Food Microbiol. (1988), 6, pp. 187-188) sont les plus couramment utilisés. Ces milieux permettent la détection de toutes les espèces du genre Listeria spp.. Ainsi, les colonies typiques observées doivent être soumises à des tests d'identification supplémentaires, tels que des tests microscopiques, et/ou biochimiques, et/ou immunologiques, et/ou génétiques, de manière à vérifier l'appartenance à l'espèce monocytogenes. Or, les manipulations supplémentaires, nécessaires à l'identification de Listeria monocytogenes, augmentent la durée et le coût des analyses. Elles nécessitent une multitude de réactifs et l'intervention de personnel qualifié. De plus, le prélèvement des colonies soumises à l'identification étant aléatoire, les manipulations supplémentaires sont souvent source d'erreur ou au moins, la cause d'une moindre précision et fiabilité. C'est le cas notamment, lorsque sur le milieu d'isolement, les colonies de Listeria monocytogenes sont très minoritaires par rapport aux colonies formées par les autres espèces de Lister/a. On sait par ailleurs qu'il est possible de discriminer les espèces pathogènes de Listeria, Listeria monocytogenes et Listeria /vanovii, des autres Listeria par la mise en évidence de l'activité phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PIPLC). En effet, il a été démontré que la PIPLC est sécrétée dans le milieu de culture des espèces pathogènes du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii (Leimeister-Wachter et al, Mol. Microbiol. (1991) 5, pp. 361-366). On sait également qu'il est possible d'identifier ces deux espèces pathogènes grâce à des procédés indirects (Notermans et al, App. and Env. Microbiology (1991), vol 57 ne 9, pp. 2666-2670). Selon le procédé proposé par Notermans et al, la souche de Listeria à tester, préalablement isolée, est ensemencée sous forme de tache à la surface d'une gélose TY (Tryptone Yeast Extract). Après 24 à 48 heures d'incubation à 37"C, une deuxième couche de gélose est coulée dans les boîtes de Pétri. Cette deuxième couche contient de l'agarose, du chloramphénicol et du L-aphosphatidyl-inositol, substrat naturel de la PIPLC. Les boîtes sont ensuite de nouveau incubées à 37"C et observées pendant 5 jours. Ce procédé nécessite donc plusieurs étapes, telles que l'isolement de la souche, I'ensemencement en tache sur gélose et la répartition d'une seconde couche de gélose contenant le substrat de la PIPLC. En outre, ce procédé ne permet pas de distinguer les bactéries Listeria monocytogenes, pathogènes pour l'homme, des bactéries Listeria ivanovii qui, comme indiqué précédemment, ne sont pas pathogènes pour l'homme. L'objet de l'invention est un milieu permettant l'identification des bactéries pathogènes du genre Listeria en une seule étape. La présente invention concerne plus spécialement un milieu de culture spécifique, permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe des espèces pathogènes du genre Listeria, ledit milieu contenant un substrat chromogène de synthèse spécifiquement clivé par la PIPLC, notamment le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol. Le milieu, selon l'invention, permet la distinction directe entre, d'une part, Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii qui forment des colonies colorées et d'autre part, les autres espèces de Listeria dont les colonies sont non colorées. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, I'utilisation du 5bromo-4-ch loro3-i ndolyl-phosphatidyl-myoinositol permet la détection des espèces Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii qui forment des colonies bleues. De manière préférentielle, le milieu de culture nutritif gélosé selon l'invention contient le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol à une concentration de 100 à 500 mg/l, de préférence à une concentration de 150 à 300 mg/l. Le milieu de culture nutritif gélosé utilisé dans l'invention doit permettre la croissance des Listeria spp.. II est par exemple possible d'utiliser la gélose Columbia, constituée de peptones, d'amidon, de chlorure de sodium et d'agar et bien connue de l'homme du métier. La présente invention concerne aussi l'utilisation du 5-bromo4-chloro-3indolyl-phosphatidyl-myoinositol pour la préparation d'un milieu de culture spécifique, permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe des espèces pathogènes du genre Listeria et notamment de la bactérie Listeria monocytogenes. De manière étonnante il a été aussi trouvé, que l'addition du sang ou des ses dérivés, - tels que par exemple plasma ou sérum -, dans le milieu de culture permet d'obtenir des colonies PIPLC positives ayant une coloration très nette. La présente invention concerne également un milieu de culture nutritif gélosé spécifique, permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe des espèces pathogènes du genre Listeria et notamment de la bactérie Listeria monocytogenes, ledit milieu contenant le 5-bromo-4chioro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol et du sang ou un de ses dérivés, de préférence du sérum. La proportion du sang ou de ses constituants dans le milieu selon l'invention peut être comprise entre 20 et 80 ml, plus spécialement entre 40 et 60 ml, de préférence 50 ml pour un litre de milieu de culture. On préfère des milieux de culture contenant du 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl- myoinositol à une concentration de 100 à 200 mg/ml et du sérum à une proportion de 40 à 60 ml pour 1 litre de milieu. L'addition dans le milieu de culture d'un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice contribue à intensifier ia coloration de culture de colonies de PlPLC positives, en rendant ainsi le test plus facile à interpréter. De préférence, L'agent pulvérulent est ajouté au milieu de culture complété avec du sérum. Des milieux de culture nutritifs gélosés selon l'invention, contenant le 5bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol en tant que substrat chromogène de synthèse spécifiquement clivé par la PIPLC, du sérum et un agent pulvérulent, tel que le kaolin ou la silice, font aussi partie de l'invention. La concentration de l'agent pulvérulent dans le milieu de culture nutritif gélosé dépend de la nature de l'agent utilisé et peut varier notamment entre 5 et 30 g/l, de préférence entre 15 et 25 g/l. Selon l'invention, le milieu de culture peut également contenir un glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes, tel que le xylose par exemple. L'addition d'un tel glucide dans un milieu de culture contenant le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol permet alors la distinction entre d'une part, Listeria monocytogenes qui forme des colonies bleu franc, d'autre part Listeria ivanovii qui forme des colonies bleu pâle à vertes et enfin les autres espèces de Listeria dont les colonies sont incolores. La présente invention concerne également un milieu de culture nutritif gélosé spécifique permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe de Listeria monocytogenes, ledit milieu contenant le 5bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol en tant que substrat chromogène de synthèse spécifiquement clivé par la PIPLC, des dérivés du sang, de préférence le sérum, un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice et un glucide métabolisable ou fermentescible par Listeria ivanovii, mais pas par Listeria monocytogenes, de préférence le xylose. La concentration du glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes, dans le milieu de culture, peut varier entre 5 et 15 g/l et dépend bien entendu du glucide utilisé. Le milieu de culture, selon l'invention, peut également contenir un indicateur de pH. Comme indicateurs du pH, on peut citer ceux qui sont couramment utilisés en microbiologie par exemple l'acide alizarinesulfonique, le rouge de méthyle, le rouge de chlorophénol, le tournesol, le pourpre de bromocrésol, le rouge de bromophénol, le bleu de bromoxylénol, I'alizarine, le bleu de bromothymol, le rouge de phénol, etc. Bien entendu, I'indicateur du pH doit être utilisé dans le milieu de culture en concentration adaptée. Cette dernière dépend de la nature de l'indicateur et peut varier notamment entre 50 et 300 mg/l. Parmi les différents indicateurs de pH, on préfère utiliser le rouge de phénol. Cet indicateur améliore encore la distinction entre Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii, les colonies étant, lorsque le milieu contient le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol, respectivement de couleur bleu franc sans virage de l'indicateur pour Listeria monocytogenes et de couleur bleu pâle et entourées d'un cercle jaune pour Listeria ivanovii, ce phénomène étant lié au virage de l'indicateur. Selon l'invention, un milieu de culture préféré est un milieu de culture nutritif gélosé, contenant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phcsphatidyl- myoinositol, des dérivés du sang de préférence le sérum, un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice, un glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes, de préférence le xylose, et un indicateur de pH tel que notamment le rouge de phénol. D'autre part, I'activité PIPLC n'est pas présente exclusivement chez Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii. Cette activité enzymatique est notamment rencontrée chez certaines espèces de Bacillus (Griffith et al., Methods Enzymol. (1991), 197, pp. 493-502) et de Clostridium (Taguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. (1978), 186, pp 196-201). De plus, le développement d'une flore saprophyte importante (bactéries ou levures) sur le milieu de culture peut nuire à la détection des Listeria monocytogenes par un phénomène de compétition. Ainsi, il est souhaitable d'inhiber la croissance de germes interférents afin d'éliminer les risques de faux positifs (colonies bleues formées par des bactéries autres que Listeria monocytogenes) ou de faux négatifs (masquage de la coloration bleue des colonies de Listeria monocytogenes par un développement important d'autres contaminants). Pour éviter ces phénomènes, il est recommandé de compléter le milieu de culture avec des agents anti bactériens et/ ou antifongiques vis à vis desquels les Listeria spp. sont peu ou non sensibles. Ces agents peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. Parmi ces agents, on peut citer par exemple le chlorure de lithium, le chlorhydrate d'acriflavine, I'acide nalidixique, la polymixine B, le cefotan, le sulfate de colistine, la fosfomycine, la ceftazimidine, le moxalactam, la cycloheximide et l'amphotéricine B. Les milieux de culture nutritifs gélosés contenant du 5-bromo-4-chloro-3indolyl-phosphatidyl-myoinositol, des dérivés du sang, de préférence le sérum un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice, un glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes, de préférence du xylose un indicateur de pH, tel que notamment le rouge de phénol et des agents anti bactériens ou antifongiques font également partie de la présente invention. La présente invention concerne aussi un procédé d'identification des bactéries pathogènes du genre Listeria comprenant: - I'ensemencement d'un échantillon susceptible de contenir lesdites bactéries pathogènes du genre Listeria sur un milieu de culture gélosé contenant un substrat chromogène spécifique de la PIPLC, - I'incubation dudit milieu de culture ensemencé avec ledit échantillon, - et la détermination de la présence desdites bactéries pathogènes du genre Listeria par la couleur caractéristique du substrat. Ledit échantillon susceptible de contenir des bactéries pathogènes du genre Listeria est ensemencé sous une forme brute ou est préalablement dilué ou est préalablement enrichi avant d'être ensemencé sur un milieu de culture, tel que défini précédemment. Selon un mode préféré de réalisation du procédé selon l'invention, on cultive un échantillon brut à tester, dilué ou ayant subi une ou plusieurs phases d'enrichissement sur un milieu de culture nutritif gélosé qui contient un substrat chromogène de synthèse spécifiquement clivé par la PIPLC, qui est le 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol, des dérivés du sang tels que le sérum, un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice, un glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes, de préférence le xylose et éventuellement un indicateur de pH, tel que notamment le rouge de phénol et des agents antibactériens ou antifongiques. On détermine la présence de Listeria monocytogenes par la couleur caractéristique de ses colonies. Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer l'invention. EXEMPLE 1: Différenciation entre Listeria pathogènes, autres Listeria spp. et interférents. PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE Milieu 1: milieu de base Gélose Columbia 39 g/l Chlorure de lithium 10 g/l . Ceftazidime* 20 mg/l Moxalactam* 20 mg/l . Polymixine B* 20 mg/l . Amphotéricine B* 3 mg/l *: composants thermolabiles Milieu 2: milieu de base + 5-bromo4-chioro-3-indolvi-phosphatidv!-myoinositol La composition en gramme par litre de ce milieu est identique à celle du milieu 1, mais le milieu 2 contient en plus 300 mg/l de 5-bromo4chloro-3-indolyl- phosphatidyl-myoinositol. La préparation de chaque milieu s'effectue comme suit: - Dissolution des composants non thermolabiles dans de l'eau osmosée. - Chauffage des mélanges jusqu'à ébullition. - Ajustement, si nécessaire, du pH à 7,3 +/- 0,2. - Répartition dans des flacons à raison de 95 ml/flacon. - Autoclavage des fiacons à 120 C pendant 15 minutes. - Addition des composants thermolabiles, en solution stérile après refroidissement de la gelose à 47 C environ - Répartition des milieux autoclavés dans des boîtes de Pétri stériles (diamètre 90 mm) à raison de 15 à 20 ml/boîte. SOUCHES TESTEES Les souches testées sont les suivantes: Listeria spp Listeria monocytogenes Lisferia ivanovii Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria welshimeri Interférents: Bacillus cereus Staphylococcus a ures Candida tropicales MISE EN CULTURE - INCUBATION - LECTURE Les souches sont repiquées dans des bouillons Tryptone-Caséine-Soja puis incubées à 37"C. Après 18 heures d'incubation, les bouillons sont dilués dans du diluant "Tryptone Sel", constitué de la peptone Tryptone à 1/1000 et de chlorure de sodium à 8,5/1000; de manière à obtenir des suspensions comprises entre 106 et 107 cellules/ml. Pour chaque suspension, on ensemence par isolement avec une ose stérile de 1 ,ul, une boîte de milieu 1 et une boîte de milieu 2. Les boîtes sont incubées à 37"C. Après 24 heures et 48 heures d'incubation, les boîtes sont lues. La lecture consiste en une observation de la couleur des colonies formées par chacune des souches sur chacun des milieux. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau TABLEAU I COULEUR DES COLONIES Distinction MILIEUX Listeria pathogènes Listeria non pathogènes Interférents Listeria path. L, mono. L. ivan. L. finn. | L. seel. L. welsh. et non path. I blanche blanche blanche blanche blanche inhibition impossible 2 bleue bleue blanche blanche blanche inhibition ossible Le milieu 2 permet de différencier les espèces Listeria, pathogènes et non pathogènes. Par ailleurs, le supplément sélectif permet d'inhiber les bactéries Bacillus cereus et Staphylococcus aureus, potentiellement faux positifs sur le milieu de culture. EXEMPLE 2: Différenciation entre Listeria espèces pathogènes et autres espèces Listeria PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE Milieu 2; milieu de base + 5-bromo4-chloro-3-indolvl-ohosPhatidYi-maoinositol Le milieu 2 est tel que décrit dans l'exemple 1. Milieu 3: milieu de base + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol La composition du milieu 3 est identique à celle du milieu 2 indiqué ci-dessus, mais ce milieu contient 150 mg/l de 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidylmyoinositol au lieu de 300 mg/l (milieu 2). Milieu 4: milieu de base + 5-bromo4-chloro-3-indolyl-Phosphatidyl-myoinositol + sanq La composition du milieu 4 est identique à celle du milieu 3, mais ce milieu contient en plus 50 ml/l de sang de cheval. Pour la préparation du milieu, le sang est traité comme un composant thermolabile. Milieu 5 : milieu de base + 5-bromo4-chloro-3-indolvl-hosphatidvl-mvoinositol + sérum La composition du milieu 5 est identique à celle du milieu 4, mais ce milieu contient 50 ml/l de sérum de cheval au lieu de sang. Milieu 6 : milieu de base + 5-brnmo4-chloro-3-indolvl-phosphatidvl-myoinositol + sérum + silice La composition du milieu 6 est identique à celle du milieu 5, mais ce milieu contient en plus 20gel de silice, composant non thermolabile. La préparation de chaque milieu est effectuée comme décrit dans l'exemple 1. SOUCHES TESTEES Les souches testées sont les suivantes: Listeria son Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria welshimeri MISE EN CULTURE - INCUBATION - LECTURE Pour la mise en culture, I'incubation et la lecture, il a été procédé comme décrit dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau Il. TABLEAU Il COULEUR DES COLONIES Distinction MILIEUX Listeria pathogènes Listeria non pathogènes Listeria path. L.monoc. L. ivan. L. inn. L. seeL L. welsh. et non path. 2 bleue bleue blanche blanche blanche bonne 3 bleutée bleutée blanche blanche j blanche moyenne 4 bleu franc bleu franc blanche blanche blanche excellente 5 bleue bleue blanche blanche blanche bonne 6 bleu franc bleu franc blanche ~ blanche ~ blanche ~ excellente Les résultats du tableau Il démontrent que pour effectuer une lecture sûre et précise du test, c'est-àdire obtenir une bonne distinction entre les espèces Listeria pathogènes et les Listeria non pathogènes, il est souhaitable de compléter le milieu de culture par du sang, du sérum ou un mélange de sérum et de silice. L'addition au milieu du sang, du sérum ou d'un mélange de sérum et de silice contribue à intensifier fortement la coloration bleue des colonies PIPLC positives et permet ainsi de réduire de manière très significative la concentration en 5-bromo4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol dans le milieu de culture. EXEMPLE 3: Différenciation entre Listeria monocytogenes et autres espèces Listeria y compris Listeria ivanovii. PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE Milieu 6: milieu de base + 5-bromo4-chloro-3-indolvl-PhosPhatidvl-mYoinositoi + sérum + silice Le milieu 6 est tel que décrit dans l'exemple 2. Milieu 7 : milieu de base + 5-bromo-4-chloro-3-indolvl-phosphatidyl-mvoinositol + sérum + silice + xylose La composition du milieu 7 est identique à celle du milieu 6, décrit dans cet exemple, mais ce milieu contient en plus 10gel de xylose, composant qui pour la préparation du milieu est considéré comme composant thermolabile. Milieu 9 : milieu de base + 5-bromo4-chloro-3-indolvI-phosPhatidvl-myoinositol + sérum + silice + xylose + rouae de phénol La composition du milieu 8 est identique à celle du milieu 7 indiqué ci-dessus, mais ce milieu contient en plus 80 mg/l de rouge de phénol (composant non thermolabile). La préparation de chaque milieu est effectuée comme décrit dans l'exemple 1. SOUCHES TESTEES Les souches testées sont les suivantes: Listeria 500.; Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria seeligeri MISE EN CULTURE - INCUBATION - LECTURE Pour la mise en culture, I'incubation et la lecture, il a été procédé comme décrit dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau III. TABLEAU III COULEUR DES COLONIES Distinction Distinction MILIEUX Listeria pathogènes Listeria non path. Listeria path. Listeria monoc. L..monoc. L. ivan. L. inn. L. seel. et non spath. et autres Listeria 6 ~ bleu franc bleu franc blanche blanche possible impossible 7 bleu franc bleu pâle blanche blanche possible possible â vertes 8 bleu franc bleu pâle blanche blanche possible possible (-) à vertes (-) (+) (-) : pas de virage de l'indicateur coloré, la gélose reste rouge autour des colonies (souche xylose -) (+) : virage de l'indicateur coloré, on observe un cercle jaune autour des colonies (souche xylose +) Les résultats du tableau Il démontrent que l'addition dans le milieu de culture du xylose, de préférence en combinaison avec le rouge de phénol permet la distinction entre Listera monocytogenes et toutes les autres espèces de Listeria en particulier Listeria ivanovii. REVENDICATIONS 1. Milieu de culture nutritif gélosé permettant l'identification directe des bactéries pathogènes du genre Listeria, ledit milieu contenant un substrat chromogène de synthèse spécifiquement clivé par la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PIPLC). 2. Milieu de culture selon la revendication 1, dans lequel ledit substrat chromogène est le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol. 3. Milieu de culture selon la revendication 2 dans lequel le 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-phosphatidyl-myoinositol est à une concentration de 100 à 500 mg/l, de préférence à une concentration de 150 à 300 mg/l. 4. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, contenant en outre du sang ou un de ses dérivés, de préférence du sérum. 5. Milieu de culture, selon la revendication 4, dans lequel la proportion du sang ou de ses dérivés est comprise entre 20 et 80 ml pour 1 litre de milieu de culture, plus spécialement entre 40 et 60 ml, de préférence 50 ml pour 1 litre de milieu de culture. 6. Milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, contenant en outre un agent pulvérulent tel que le kaolin ou la silice. 7. Milieu de culture, selon la revendication 6, dans lequel la concentration de l'agent pulvérulent est comprise entre 5 et 30 g/l, de préférence entre 15 et 25 g/l. 8. Milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, contenant en outre un glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes. 9. Milieu de culture, selon la revendication 8, dans lequel ledit glucide métabolisable par Listeria ivanovii mais pas par Listeria monocytogenes est le xylose. 10. Milieu de culture, selon l'une des revendications 8 et 9, dans lequel la concentration dudit glucide est comprise entre 5 et 15 g/l. 11. Milieu de culture, selon l'une l'une quelconque des revendications 1 à 10, contenant en outre un indicateur de pH, de préférence le rouge de phénol. 12. Milieu de culture, selon la revendication 11, dans lequel la concentration dudit indicateur de pH est comprise entre 50 et 300 mg/l. 13. Milieu de culture, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, contenant en outre un ou plusieurs agents antibactériens et/ou antifongiques, de préférence choisi parmi le chlorure de lithium, le chlorhydrate d'acriflavine, I'acide nalidixique, la polymixine B, le cefotan, le sulfate de colistine, la fosfomycine, la ceftazimidine, le moxalactam, la cycloheximide et l'amphotéricine B. 14. Procédé d'identification des bactéries pathogènes du genre Listeria comprenant: - I'ensemencement d'un échantillon susceptible de contenir lesdites bactéries pathogènes du genre Listeria sur un milieu de culture gélosé contenant un substrat chromogéne spécifique de la PIPLC, - I'incubation dudit milieu de culture ensemencé avec ledit échantillon, - et la détermination de la présence desdites bactéries pathogènes du genre Listeria par la couleur caractéristique du substrat 15. Procédé selon la revendication 14 dans lequel ledit échantillon susceptible de contenir des bactéries pathogènes est préalablement enrichi avant d'être ensemencé sur un milieu de culture selon lune des revendications 1 à 13. 16. Utilisation du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatidyl-myoinositol pour la préparation d'un milieu de culture nutritif gélosé, permettant la recherche, I'isolement, le dénombrement et l'identification directe des bactéries pathogènes du genre Lister/a.