Brevet FR2771753A1 — publié le 19990604

La présente invention concerne un gène de chitine- désacétylase, un vecteur plasmidique contenant ledit gène et un organisme transformé. La chitine-désacétylase (EC 3.5.1.41) est une enzyme hydrolysant le groupe N-acétyle du résidu de N-acétyl- glucosamine de la chitine, et possédant la faculté de décomposer le résidu de N-acétylglucosamine en résidu de glucosamine et acide acétique. La désacétylation de la chitine donne le chitosane qui est une substance utile dans les domaines de l'industrie alimentaire, l'industrie pharmaceutique, etc. Par conséquent, ladite enzyme est utile pour envisager une exploitation efficace de la chitine qui est une ressource inutilisée. De plus, cette enzyme peut être utilisée pour préparer un oligosaccharide de chitosane à partir d'oligo- saccharide de chitine, et pour désacétyler par voie enzyma- tique les groupes N-acétyle présents dans d'autres résidus de sucres aminés. Comme décrit ci-dessus, la chitine-désacétylase est une enzyme hydrolysant les groupes N-acétyle de la chitine, d'un oligosaccharide de chitine et d'autres composés contenant des résidus de sucres aminés N- acétylés. Comme indiqué ci-dessus, l'utilité du chitosane, qui est un produit de désacétylation de la chitine, est reconnue dans des domaines très divers. Dans le seul domaine alimentaire, son utilité ressort, par exemple, de l'action épaississante, l'action d'abaissement du cholestérol, l'action hypotensive, l'effet prophylactique contre la goutte et l'hyperuricémie, l'effet30 prophylactique contre l'ostéoporose, la stimulation de la croissance des bactéries du genre Bifidus, l'inhibition de la croissance de E. coli et Clostridium perfringens, l'activité antitumorale, etc. Le groupe N-acétyle des résidus de sucres a classiquement été hydrolysé, principalement par hydrolyse chimique avec des alcalis. Il a été remarqué que le procédé est désavantageux en raison de l'apparition de réactions secondaires, de la difficulté rencontrée pour maîtriser la réaction et de la production d'un liquide alcalin résiduaire. En vue de surmonter ces inconvénients, un énergique travail de recherche a été entrepris sur une technique de désacétylation enzymatique dans des conditions douces, par l'utilisation de chitine-désacétylase. En particulier, l'attention s'est portée sur une chitine-désacétylase dérivée de Deuteromycotina (champignons imparfaits) (demande de brevet japonais Kokai Hei 8-289785). La chitine-désacétylase dérivée d'un champignon imparfait est avantageuse du fait que la réaction enzyma- tique n'est guère inhibée par un produit réactionnel, l'acide acétique, et du fait que des oligosaccharides de chitine ayant un bas poids moléculaire, etc., peuvent également être désacétylés. Par conséquent, la désacétylase convient très bien à l'usage industriel. En outre, l'enzyme offre un large éventail d'activités, par exemple une activité pour éliminer le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N- acétylés autres que ceux de la chitine, de sorte que l'enzyme peut être appliquée à la synthèse de nouvelles chaînes de sucres. Le champignon imparfait qui a fait l'objet de la recherche la plus énergique en tant que bactérie pour l'obtention de chitine-désacétylase est Colletotrichum lindemuthianum. Cependant, étant donne que Colletotrichum lindemuthianum est un champignon phytopathogène, sa manipu- lation présente des difficultés très défavorables pour des raisons de sécurité. De plus, en ce qui concerne la produc- tion de l'enzyme, ce microorganisme est désavantageux du fait qu'un temlpsplus long est necessaire pour que l'enzyme soit sécrétée dans un bouillon de culture, et35 l'enzyme à recueillir est peu abondante. Un but de la présente invention est de surmonter les problèmes décrits ci-dessus et d'apporter une contribution à la production industrielle d'une chitine-désacétylase dérivée de champignon imparfait, en clonant un gène de ladite enzyme pour déterminer la structure du gène et exprimer le gène afin d'utiliser l'enzyme plus efficacement. Les présents inventeurs ont conduit des recherches pour mettre en évidence le gène de structure de la chitine- désacétylase. Les inventeurs ont réussi à cloner le gène de chitine-désacétylase à partir d'un micro-organisme apparte- nant au genre Colletotrichum ayant la faculté de produire cette enzyme. La présente invention a ainsi été réalisée. Le premier aspect de l'invention est le gène de chitine-désacétylase codant pour la protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences. Le deuxième aspect de l'invention est une séquence nucléotidique d'ADN hybridable à la séquence nucléotidique du gène selon le premier aspect de l'invention et codant pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N- acétylés. Le troisième aspect de l'invention est un vecteur plasmidique contenant le gène de chitine-désacétylase selon le premier aspect de l'invention. Le quatrième aspect de l'invention est un organisme transformé produit par transformation au moyen du vecteur plasmidique selon le troisième aspect de l'invention. Les inventeurs ont purifié à un haut degré la chitine-désacétylase retirée d'un bouillon de culture d'un champignon imparfait appartenant au genre Colletotrichum ayant la faculté de produire de la chitine- désacétylase, et ils ont déterminé sa séquence d'acides aminés N-terminale. De plus, en décomposant la chitine-désacétylase avec une protéase, des fragments peptidiques ont été préparés pour déterminer leurs séquencesd'acides aminés. Ensuite, les inventeurs ont prépare une amorce d'après la séquence nucléotidique déduite de ces séquences d'acides aminés. Des produits amplifiés ont été recueillis par la réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant l'amorce et de l'ADN génomique extrait du microorganisme appartenant au genre Colletotrichum. Les produits de-FR recueillis ont été clones pour leur analyse avec un séquenceur d'ADN, afin de déterminer la séquence d'ADN. La séquence d'ADN a été traduite en acides aminés, qui correspondaient aux séquences d'acides aminés des fragments peptidiques initialement préparés, ce qui a incité à penser que ces fragments peptidiques correspondaient à des parties du gène de chitine-désacétylase. Surlbase de la séquence d'ADN déterminée, une amorce à ensuite été construite de nouveau, avec une prise en compte suffisante de la stringence des codons, pour cloner le gène de chitine-désacétylase, en utilisant comme matrice un ADNc préparé à partir d'ARN par utilisation de transcriptase inverse. Premièrement, une PCR a été effectuée sur la base de l'ADNc en utilisant une amorce contenant une séquence oligo-dT et l'amorce mentionnée ci-dessus pour analyser la séquence 3' en aval de la séquence connue du gène et déterminer la séquence nucléotidique de l'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que la séquence d'acides aminés de la région C-terminale a été déterminée. Ensuite, une séquence d'adaptateur a été adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un kit d'amplification rapide d'extrémités d'ADNc (5'- RACE) disponible dans le commerce, pour effectuer une PCR en utilisant une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, afin de déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation. En ce qui concerne la région du gène de structure, la séquence d'acides aminés correspondante a été déterminée. De plus, on a préparé une amorce comprenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une région déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce incluant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en effectuant unePCR en utilisant ces amorces, on a recueilli un fragment amplifié contenant le gène de structure de chitine-désacéty- lase complet. Le fragment a été ligaturé à un vecteur plasmidique qui a ensuite été utilisé pour transformer E. coli par une technique usuelle afin de récupérer la bactérie transformée. L'invention sera décrite en détail ci-dessous. Comme décrit ci-dessus, la chitine-désacétylase de la présente invention provient d'un microorganisme apparte- nant au genre Colletotrichum, ayant la faculté de produire la chitine-désacétylase. Les champignons imparfaits appartenant au genre Colletotrichum, ayant la faculté de produire la chitine- désacétylase, comprennent par exemple Colletotrichum lindemuthianum ATCC 56676, etc. La chitine-désacétylase peut être retirée du bouillon de culture du microorganisme ci-dessus. Plus particulièrement, le microorganisme peut être cultivé dans un milieu nutritif par une méthode de routine afin de recueillir le bouillon de culture microbienne qui est ensuite purifié par des techniques de purification telles30 que la chromatographie sur colonne, la chromatographie rapide de protéines en phase liquide (FPLC) et la chrmtographie en phase liquide à haute performance (HPC), po=urerailir la chitine-désacétylase hautement purifiée. Ensuite, il faut déterminer la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale de la chitine-désacétylase purifiée. Pour le séquençage, on peut faire usage d'un séquenceur de protéines du type HPG 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.). La séquence de la partie N-terminale a été déterminée et elle est présentée en tant que Séquence N 2 dans la Liste des Séquences. En effectuant ensuite une dégradation enzymatique de la chitinedésacétylase, on prépare des fragments peptidiques pour déterminer leur séquences d'acides aminés (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). En terminant les séquences nucléotidiques des séquences d'acides aminés analysées et en utilisant une amorce préparée d'après les séquences déduites, on effectue une PCR avec une matrice d'ADN extraite du champignon imparfait appartenant au qenre Colletotrichum. Les bandes resultantes (produits de PCR sont clonées pour effectuer leur analyse par un séquenceur d'ADN du type ABI PRISM 371 ou 310 (fabriqué par Perkin Elmer Applied Biosystems Co.) afin de déterminer la séquence nucléotidique d'ADN. La séquence nucléotidique d'ADN résultante est représentée en tant que Séquence N 6 dans la Liste des Séquences. La traduction de la séquence nucléotidique d'ADN en acides aminés révèle la présence d'une séquence d'acides aminés correspondant à une partie des fragments peptidiques initialement recueillis (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). Il est alors confirmé que ces fragments peptidiques correspondent à des parties du gène de chitine-désacétylase. Une amorce est ensuite reconstruite d'après la séquence d'ADN résultante, avec une prise en compte suffi- sante de la stringence des codons, pour le clonage de la chitinedésacétylase en utilisant comme matrice un ADNc préparé à partir d'ARN en utilisant une transcriptase inverse. Premièrement, on effectue unePCR basée sur l'ADNc ayant été préparé à partir d'ARN en utilisant une trans- criptase inverse, en utilisant une autre amorce incluant une séquence oligo-dT et l'amorce susmentionnée, pour analyser la séquence 3' en aval de la séquence connue du gène, puis déterminer la séquence nucléotidique d'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que la séquence d'acides aminés est déterminée. Ensuite, une séquence d'adaptateur est adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un nécessaire de 5'-RACE disponible dans le commerce (Marathon cDNA Amplification Kit, fabriqué par Clone Tech Co.), et une PCR est effectuée en utilisant une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation. Les séquences d'acides aminés correspondantes ont été déterminées pour la région déduite comme étant une séquence signal partant du codon d'initiation et la région du gène de structure de la protéine mature. De plus, on prepare une amorce comprenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une partie déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce comprenant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en utilisant ces amorces pour une PCR, on a recueilli un fragment amplifié contenant le gène de structure complet de la chitine-désacétylase. Le fragment contient la séquence d'ADN correspondant à la séquence d'acides aminés repré- sentée dans la Séquence N 1 de la Liste des Séquences, après la région déduite comme étant une séquence signal en partant du codon d'initiation et, ainsi, le fragment contient le gène d'enzyme complet de la chitine-désacétylase selon le premier aspect de l'invention. Le gène de chitine-désacétylase selon le premier aspect l'invention contient la séquence nucléotidique décrite en tant que Séquence N 1 dans la Liste des Séquences ou possède une fonction sensiblement identique à celle de cette séquence. L'expression "fonction sensiblement identique" signifie ici qu'un gène codant pour les mêmes résidus d'acides aminés est considéré comme sensiblement identique, compte tenu de la stringence des codons, même si sa séquence est tout à fait différente de celle du gène décrit en tant que Séquence N 1. Sous son deuxième aspect, la présente invention concerne une séquence nucléotidique hybridable à la séquence nucléotidique du gène selon le pruer objetdel'invtionetqui code pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N-acétylés. Lorsque l'homologie globale est d'environ 85 % ou plus, un gène presque homologue à celui du premier aspect de l'invention peut être facilement clone, en référence à la séquence de ladite Séquence N 1, en utilisant des techniques connues du génie génétique telles que l'hybri- dation d'ADN et l'amplification de gènes. Sous son troisième aspect, la présente invention conoerte un vecteur plasmidique contenant ledit gène; et sous son quatrième aspect, la présente inventionpropose un organisme transformé produit par transformation avec ledit vecteur plasmidique. Plus particulièrement, un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique du gène selon le premier aspect peut être inséré par ligature dans un vecteur plasmidique tel qu'un vecteur plasmidique pCR2.1 (fabriqué par In Vitro Gen Co.), pour transformer E. coli en y introduisant le vecteur selon une méthode de routine. La souche E. col! transformée en utilisant le vecteur plasmidique pCR2.1 (fabriqué par In Vitro Gen Co.) a été déposée sous le numéro de référence FERM BP-6191 à l'Institut National de Science Biologique et de Technologie Humaine, Agence de la Science et de la Technologie Industrielles (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon). En outre, comme cela doit être évident pour une personne normalement avisée en ce domaine, la chitine- désacétylase peut être exprimée en grande quantité dans des cellules hâtes d'organismes procaryotes ou eucaryotes, en utilisant la séquence d'ADN selon la présente invention. En d'autres termes, l'enzyme peut être exprimee par la méthode de routine suivante. Par exemple, le gène de la présente invention est inséré dans un vecteur d'expression pour un organisme procaryote ou eucaryote, avec un signal de modification approprié, et le vecteur est ensuite utilisé pour trans- former une cellule. Il a été développé une grande diversité de tels signaux de modification et vecteurs d'expression qui sont disponibles dans le commerce, et l'on fait donc usage de ceux qui sont bien connus de l'homme de l'art. Une série de manipulations pour l'utilisation des vecteurs et la méthode de transformation sont déjà bien connues et peuvent être exécutées par l'homme de l'art. Par exemple, on peut employer la méthode décrite par J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (éd.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) pour exécuter les opérations décrites ci-dessus. Selon la présente invention, l'enzyme recueillie par l'expression du gène de chitine-désacétylase selon le premier aspect de l'invention active la désacétylation de la chitine, d'un oligosaccharide de chitine et des groupes N-acétyle d'autres résidus de sucres aminés N-acétylés, en permettant de préparer efficacement le chitosane, un oligosaccharide de chitosane ou d'autres sucres N-désacétylés qui sont utiles comme matières premières dans l'industrie de transformation alimentaire et l'industrie pharmaceutique. L'extraction de chitine-désacétylase à partir de bactéries phytopathogènes telles que des microorganismes appartenant au genre Colletotrichum a classiquement impliqué des problèmes de sécurité et d'organisation occasionnés par la manipulation de ces bactéries pathogènes, et la culture du microorganisme nécessite une longue période de temps. De plus, le rendement en enzyme n'était pas satisfaisant. En faisant s'exprimer le gène de chitine-désacéty- lase dans un organisme procaryote ou eucaryote par utilisa- tion du plasmide contenant le gène de chitine-désacétylase selon le troisième aspect de la présente invention, on peut obtenir cette enzyme en grande quantité d'une manière sûre et rapide, sans avoir à s'inquiéter des problèmes susmentionnés. Par conséquent, selon la présente invention, l'utilisation de la chitine-désacétylase sera encore plus profitable et utile aux industries de production de matières premières. La présente invention va maintenant être décrite par un exemple qui n'est cependant pas destiné à la limiter. Exemple Un champignon imparfait, Colletotrichum linde- muthianum ATCC 56676, sous-cultivé dans un milieu incliné, est inoculé dans un milieu de culture liquide pour effectuer une culture pendant 18 jours dans l'obscurité à 22 C. Le bouillon de culture microbienne est recueilli en séparant20 le microorganisme par filtration, et il est ensuite purifié en utilisant la précipitation par le sulfate d'ammonium, la chromatographie hydrophobe, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie par filtration sur gel, etc., pour recueillir une chitine-désacétylase hautement purifiée. On détermine ensuite la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale de la chitine-désacétylase purifiée. Pour ce séquençage, on utilise un séquenceur de protéines du type HPG 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.). La séquence d'acides aminés déterminée de la partie N-terminale est représentée en tant que Séquence N 2 dans la Liste des Séquences. Lorsqu'une protéine enzymatique est purifiée par chromatographie en phase inversée en utilisant un solvant contenant de l'acide trifluoracétique, la partie N-terminale35 est pyroglutaminée. Par conséquent, la séquence ne peut jamais être lue. Cependant, par séquençage après traitement par la pyroglutamate-aminopeptidase (fabriquée par Boehringer Mannheim Co.), la séquence peptidique commençant au second résidu à partir de l'extrémité N-terminale peut être analysée et déterminée séquentiellement. Des fragments peptidiques sont préparés par dégra- dation ménagée de la chitine-désacétylase avec l'endoprotéi- nase Lys-C (Boehringer Mannheim Co.) et l'endoprotéinase Arg-C (Boehringer Mannheim Co.), puis leuxséquenced'acides aminés sont déterminéeS (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). A partir des séquences d'acides aminés déterminées on choisit des régions ayant une moindre stringence des codons et, en utilisant une amorce produite d'après ces régions, on effectue une PCR en utilisant comme matrice de l'ADN extrait i15 du champignon imparfait appartenant au genre Colletotrichum: Les bandes résultantes (produits de PCR) sont clonées pour leur analyse par un séquenceur d'ADN du type ABI PRISM 377 (fabriqué par Perkin Elmer Applied Biosystems Co.) pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN. La séquence nucléotidique de 444 pb résultante, telle que déterminée par séquençage, est représentée en tant que Séquence N 6 dans la Liste des Séquences. La séquence nucléotidique d'ADN est traduite en acides aminés et l'on observe une séquence d'acides aminés correspondant à une partie des fragments peptidiques recueillis initialement (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). Il est alors confirmé que ces fragments peptidiques correspondent à des parties du gène de chitine-désacétylase. Ensuite, sur la base de la séquence d'ADN résul- tante, on reconstruit une amorce, avec une prise en compte suffisante de la stringence des codons, et le clonage de la chitine-désacétylase est effectué en utilisant comme matrice un ADNc ayant été préparé à partir d'ARN en utilisant une transcriptase inverse (RNA PCR kit (AMV) Ver. 2. 1, fabriqué par Takara Brewery Co.). Premièrement, sur la base de l'ADNc préparé par la réaction d'une amorce contenant une séquence oligo-dT avec de l'ARN comme matrice en utilisant une transcriptase inverse, on effectue une PCR en utilisant à la fois une amorce contenant une séquence oligo-dT et l'amorce sus- mentionnée, pour analyser la séquence 3' en aval de la sequence connue du gène et déterminer la séquence nucléoti- dique d'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que la séquence d'acides aminés est déterminée. Ensuite, une séquence d'adaptateur est adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un nécessaire de 5'-RACE (Marathon cDNA Amplification Kit, fabriqué par Clone Tech Co.) et une PCR est effectuée en utilisant à la fois une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation, en utilisant un séquenceur d'ADN ABI PRISM 310 (fabriqué par Perkin Elmer Applied Biosystems Co.). La séquence d'acides aminés corres- pondante est déterminée pour la région du gène de structure. De plus, on prépare une amorce contenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une partie déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce incluant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en utilisant ces amorces dans une PCR, on recueille un fragment amplifie contenant le gène de structure complet de la chitine- désacétylase. Le fragment est inséré par ligature dans un vecteur plasmidique pCR2.1 (In Vitro Gen Co.), qui est ensuite utilisé pour transformer E. col! par une méthode de routine. Le produit résultant est inoculé sur un milieu de gélose LB contenant de l'ampicilline (50 kg/ml) et de la méticilline (80 ig/ml) et la culture est conduite pendant une nuit à 37 C afin de sélectionner la bactérie transformée (FERM BP-6191) et récupérer le plasmide introduit pour déterminer la séquence nucléotidique dudit gène d'enzyme (voir la Séquence N 7 de la Liste des Séquences). En conséquence, le fragment inséré contient la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences, suivie d'une séquence déduite comme étant un signal d'initiation partant du codon d'initiation, et il est clairement démontré que le fragment contient le gène d'enzyme complet de la désacétylase selon le premier aspect de l'invention. L'exposé de la demande de brevet japonais N 9-345737 déposée le 2 décembre 1997 est incorporé ici par référence dans son intégralité. LISTE DES SÉQUENCES Séquence N 1 Longueur de Séquence: 663 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: deux Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: ADNc, partie de gène de structure Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Caractéristiques de la Séquence: Symbole Représentant les Caractéristiques: CDA Situation: 1...663 Méthode de Détermination des Caractéristiques: E Séquence: CAG GTT CCC GTG GGC ACA CCC ATC CTC CAG TGC ACC CAG CCT GGT TTG 48 Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 GTT GCT CTG ACC TAC GAC GAC GGT CCT TTC ACC TTC ACC GCT CAG CTC 96 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gin Leu 25 30 CTC CAC ATC TTG AAG CAG AAC GAC GTC AAG GCG ACC TTC TTC GTC AAC 144 Leu Asp Ile Leu Lys Gin Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 40 45 GGC AAC AAC TGG GCC AAC ATC GAG GCC GGA TCC AAC CCC GAC ACG ATC 192 Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly Ser Asn Pro Asp Thr ile 55 60 CGC CGC ATG CGC GCC GAC GGC CAC CTC GTC GGC TCT CAC ACG TAC GCT 240 Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val Gly Ser His Thr Tyr Ala 70 75 80 CAC CCG GAC CTC AAC ACG CTC TCC TCC GCG GAC CGC ATC TCC CAG ATG 288 His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala Asp Arg Ile Ser Gin Met 90 95 CGG CAG CTC GAG GAG GCC ACC CGC CGC ATC GAC GGC TTC GCG CCC AAG 336 Arg Gin Leu Glu Glu Ala Thr Arg Arg Ile Asp Gly Phe Ala Pro Lys 105 110 TAC ATG CGC GCG CCG TAC CTG TCG TGC GAC GCG GGC TGC CAG GGC GAC 384 Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Cys Asp Ala Gly Cys Gin Gly Asp 120 125 CTC GGC GGC CTC GGA TAC CAC ATC ATC GAC ACC AAC CTC GAC ACC AAG 432 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile le Asp Thr Asn Leu Asp Thr Lys 135 140 GAC TAC GAG AAC AAC AAG CCC GAG ACC ACC CAC CTC TCG GCC GAG AAG 480 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 150 155 160 TTC GAC AAC GAG CTG AGC GGC GAC GTC GGC GCC AAC AGC TAC ATT GTC 528 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 170 175 CTC TCG CAC GAC GTC CAC GAG CAG ACG GTC GTC TCC CTC ACG CAG AGG 576 Leu Ser His Asp Val His Glu Gin Thr Val Val Ser Leu Thr Gin Arg 185 190 CTG ATT GAC ACG CTC AAG AGC AAG GGC TAC CGC GCC GTC ACC GTC GGC 624 Leu Ile Asp Thr Leu Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 200 205 GAG TGC CTC GGC GAC GCC CCG GAG AAC TGG TAC AAG GCG 663 Glu Cys Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr Lys Ala 210 215 220 Séquence N 2 Longueur de Séquence: 51 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment N-terminal Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 OrigineDirecte: chitine-désacétylase Séquence: Gin Val Pro Val Gly Thr Pro lie Leu Gin Cys Thr Gin Pro Gly Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gin Leu 25 30 Leu Asp le Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 40 45 Gly Asn Asn Séquence N 3 Longueur de Séquence: 50 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de dégradation de chitine- désacétylase Séquence: Ala Thr Phe Phe Val Asn Gly Asn Asn Trp Ala Asn le Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ser Asn Pro Asp Thr le Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val 25 30 Gly Ser His Thr Tyr Ala His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala 40 45 Asp Arg Séquence N 4 Longueur de Séquence: 84 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de dégradation de chitine- désacétylase Séquence: Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Xaa Asp Ala Gly Xaa Gin Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His lie lie Asp Thr Asn Leu Asp Xaa Lys 25 30 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Xaa Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 40 45 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 55 60 Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gin Arg 70 75 80 Leu Ile Asp Thr Séquence N 5 Longueur de Séquence: 27 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de dégradation de chitine- désacétylase Séquence: Leu lie Asp Thr Xaa Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr 25 27 Séquence N 6 Longueur de Séquence: 444 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: autre acide nucléique Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de réaction d'ACP Séquence: AACATCGAGG CCGGGTCCAA CCCCGACACG ATCCGCCGCA TGCGCGCCGA CGGCCACCTC 60 GTCGGCTCTC ACACGTACGC TCACCCGGAC CTCAACACGC TCTCCTCCGC GGACCGCATC 120 TCCCAGATGC GGCAGCTCGA GGAGGCCACC CGCCGCATCG ACGGCTTCGC GCCCAAGTAC 180 ATGCGCGCGC CGTACCTGTC GTGCGACGCG GGCTGCCAGG GCGACCTCGG CGGCCTCGGA 240 TACCACATCA TCGACACCAA CCTCGACACC AAGGACTACG AGAACAACAA GCCCGAGACC 300 ACCCACCTCT CGGCCGAGAA GTTCGACAAC GAGCTGAGCG GCGACGTCGG CGCCAACAGC 360 TACATTGTCC TCTCGCACGA CGTCCACGAG CAGACGGTCG TCTCCCTCAC GCAGAGGCTG 420 ATTGACACGC TCAAGAGCAA GGGC 444 Séquence N 7 Longueur de Séquence: 756 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: lineaire Type Moléculaire de la Séquence: autre acide nucléique Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de réaction d'ACP Séquence: GTCGACATGC ACTTCTCGAC CCTTCTTGGC GCCGCGGCTA CTGCTGCTCT CGCTGGCAGC 60 * ACGAACGCAA GCCCTCTCGC CCGTCGCCAG GTTCCCGTGG GCACACCCAT CCTCCAGTGC 120 ACCCAGCCTG GTCTGGTTGC TCTGACCTAC GACGACGGTC CTTTCACCTT CACCGCTCAG 180 CTCCTCGACA TCTTGAAGCA GAACGACGTC AAGGCGACCT TCTTCGTCAA CGGCAACAAC 240 TGGGCCAACA TCGAGGCCGG ATCCAACCCC GACACGATCC GCCGCATGCG CGCCGACGGC 300 CACCTCGTCG GCTCTCACAC GTACGCTCAC CCGGACCTCA ACACGCTCTC CTCCGCGGAC 360 CGCATCTCCC AGATGCGGCA GCTCGAGGAG GCCACCCGCC GCATCGACGG CTTCGCGCCC 420 AAGTACATGC GCGCGCCGTA CCTGTCGTGC GACGCGGGCT GCCAGGGCGA CCTCGGCGGC 480 CTCGGATACC ACATCATCGA CACCAACCTC GACACCAAGG ACTACGAGAA CAACAAGCCC 540 GAGACCACCC ACCTCTCGGC CGAGAAGTTC GACAACGAGC TGAGCGGCGA CGTCGGCGCC 600 AACAGCTACA TTGTCCTCTC GCACGACGTC CACGAGCAGA CGGTCGTCTC CCTCACGCAG 660 AGGCTGATTG ACACGCTCAA GAGCAAGGGC TACCGCGCCG TCACCGTCGG CGAGTGCCTC 720 GGCGACGCCC CGGAGAACTG GTACAAGGCG AGATCT 756 REVENDICATIONS 1. Gène de chitine-désacétylase, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés telle que décrite en Séquence N 1. 2. Séquence nucléotidique d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique hybridable à la séquence nucléotidique telle que décrite en Squence N et codant pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N-acétylés. 3. Vecteur plasmidique, caractérisé en ce qu'il contient le gène de chitine-désacétylase selon la revendi- cation 1. 4. Organisme transformé, caractérisé en ce qu'il a été transformé par le vecteur plasmidique selon la revendi-. cation 3. 5. Organisme transformé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit organisme transformé est E. coli (FERM BP-6191).