Brevet FR2771101A1 — publié le 19990521

1. Introduction: Neospora caninum est un protozoaire qui a été isolé et identifié formellement par Dubey et coll. en 1988 (4) à partir de chiens infectés. Ce parasite est morphologiquement proche de Toxoplasma gondii (agent de la toxoplasmose), aussi bien dans sa forme invasive (forme tachyzoïte) que dans sa forme chronique (kystes). Cependant la distinction génétique entre N. caninum et T. gondii, a été formellement démontrée par la biologie moléculaire (2). N. caninum constitue donc un nouveau genre et une nouvelle espèce parasitaire internationalement reconnue. Bien que son cycle parasitaire demeure largement inconnu, des infections à N. caninum ont été mises en évidence chez de nombreuse espèces animales. Le seul mode d'infestation connu est la voie transplacentaire, à l'origine d'infections congénitales (6). Chez les jeunes animaux infectés, I'infection peut être asymptomatique ou se traduire par des troubles neurologiques sévères (paralysie des membres inférieurs rapidement progressive) (6). L'infection peut être également à l'origine d'avortements répétés ou d'animaux mort-nés à la naissance. L'infection à N. caninum (néosporose) est actuellement reconnue comme étant une cause importante (environ 30% des cas) d'avortements chez les bovins. Ces avortements surviennent généralement sur un mode épidémique au sein de certains troupeaux (6). Le diagnostic de certitude de l'infection repose sur l'examen histologique des tissus avec mise en évidence des parasites par immunomarquage (8). Le diagnostic sérologique (sérodiagnostic) mettant en évidence les anticorps spécifiques dirigés contre N. caninum est actuellement effectué, soit par immunofluorescence indirecte (I.F.I.), soit par E.L.l.S.A. (enzyme linked immuno-sorbent assay). Le sérodiagnostic par l.F.I. a été mis au point par Dubey et coll. en 1988 (5). Ce test est commercialisé (V.M.R.D., Pullman, WA, U.S.A.) et constitue la technique la plus utilisée actuellement. Les antigènes utilisés en l.F.I. sont des tachyzoïtes entiers de N. caninum fixés sur lame. Le sérodiagnostic par ELISA a été développé plus récemment. Les antigènes utilisés sont soit des extraits solubles ou des fractions membranaires d'antigènes, soit des antigènes recombinants (6). Les performances de ces differentes techniques sont comparables en termes de sensibilité et de spécificité. Cependant, L'absence de standardisation des antigènes utilisés dans les techniques ELISA entraîne une grande variabilité et un manque de corrélation des résultats entre les techniques (7). De plus un manque de reproductibilité inter-laboratoires a été mis en évidence pour la technique d'l.F.I. (7). Ces deux dernières techniques nécessitent en outre l'adjonction de "conjugués" (anti-anticorps) marqués destinés à mettre en évidence la présence d'anticorps spécifiques éventuellement présents dans le sérum analysé. Ces conjugués doivent faire l'objet d'une synthèse et d'une standardisation propre à chaque espèce animale étudiée en sérologie. Cette élaboration peut s'avérer fastidieuse, longue et coûteuse. Une difficulté supplémentaire tient aussi aux conditions de production disponibles à ce jour, pour obtenir des parasites en grand nombre et susceptibles d'être mis en oeuvre dans les procédés connus de sérodiagnostic. Jusqu'à présent, la production des tachyzoïtes de N. caninum est effectuée en cultures cellulaires mais le rendement quantitatif de cette technique est extrêmement faible. La production des tachyzoltes in vivo, notamment chez la souris est par ailleurs très difficile. II est en effet impossible d'obtenir une infection aigüe avec production de tachyzoïtes chez la souris Swiss-Webster sans immunodépression chimique préalable, permettant de rendre l'animal "sensible" Cette résistance naturelle à l'infection aigüe après inoculation de N. caninum de la souris Swiss-Webster a été démontrée par Lindsay et Dubey (9). Ces auteurs ont obtenu une infection aigüe avec production disséminée de tachyzoïtes après inoculation sous-cutanée de la souche NC-1, chez des souris Swiss-Webster traitées conjointement par acétate de méthyl-prednisolone administrée par voie sous-cutanée. De telles techniques impliquent cependant la mise en oeuvre de procédures d'inoculations fastidieuses, invasives et répétées, potentiellement sources de surinfections létales chez les animaux fragilisés par l'immunodépression. Ces techniques sont donc difficilement compatibles avec les nécessités de production standardisée de quantités importantes de tachyzoïtes chez un grand nombre de souris. L'invention a pour but de remédier à ces difficultés, en particulier de fournir un procédé de diagnostic d'une infection à N. canim um, applicable sans modifications de certaines de ses étapes caractéristiques, quelle que soit l'espèce animale chez laquelle l'infection est à rechercher. Par ailleurs, I'invention vise à fournir un procédé permettant la production de quantités suffisantes de parasites, pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic conforme à l'invention. Le procédé selon l'invention, qui met en oeuvre une infection de mammifères d'épreuve immunodéprimés infectables par N. caninum, notamment de souris, est caractérisé en ce que les agents d'immunodépression, notamment des corticoldes, sont des agents absorbables par voie orale et administrés quotidiennement ad libitum aux animaux par voie orale, notamment avec leurs aliments ou, et de préférence, leur eau de boisson sur une durée de plusieurs jours, notamment de 5 à 15 jours, par exemple 10 jours, préalablement à leur infection avec des tachyzoïtes de N. caninum, I'administration étant ensuite de préférence poursuivie dans les mêmes conditions jusqu'au sacrifice des animaux. L'invention découle de la découverte qu'il était possible, en procédant différemment à l'infection des animaux immunodéprimés, de contrôler cette immunodépression afin qu'elle soit progressive, constante et non létale. II a par ailleurs été constaté qu'il était possible, de par ce mode d'administration des corticoïdes, de maintenir sous contrôle l'infection ultérieure à un niveau sub-létal, jusqu'au delà de l'obtention d'une production de quantités importantes de parasites au stade tachyzoïtes, même lorsque celle-ci est fortement stimulée. L'infection des souris ainsi immunodéprimées peut être réalisée de toutes façons appropriées, notamment par voie intrapéritonéale. II est avantageux de la stimuler. On obtient des suspensions considérablement enrichie en tachyzoïtes de N. caninum, par inoculation concomitante de cellules sarcomateuses murines (cellules TG 180), qui permettent une réplication intra-cellulaire accélérée des parasites, en particulier selon la méthode décrite par Ardouin et al. (1) appliquée à la production de suspensions enrichies en toxoplasmes chez des souris préalablement infectées par voie intrapéritonéale avec de tels toxoplasmes. Les cellules TG180 peuvent être remplacées par tous organismes analogues aptes à favoriser la formation d'ascites péritonéales dans lesquelles prolifèrent alors des tachyzoïtes. La préparation obtenue à partir des ascites produites est ensuite débarrassée des cellules péritonéales par une digestion par la trypsine. Les tachyzoïtes alors obtenus peuvent être utilisés comme antigènes figurés (entiers) pour la mise en évidence des anticorps circulants spécifiques du sérum (diagnostic immunologique ou sérodiagnostic) par agglutination directe des parasites, sans recours à des conjugués, de sorte que le test est alors applicable, sans adaptations préalables particulières, à des espèces animales différentes. L'immunodépression progressive, constante et non-létale des souris, en particulier de souris Swis-Webster, est par exemple obtenue avec un corticoide utilisé consistant en du phosphate de dexaméthasone administré ad libitum dans l'eau de boisson des souris, à la concentration de 5 à 15 uglml, notamment de 10 Cig/mi, pendant une durée précédant le jour de l'infection, de 5 à 15 jours, avantageusement dans les 10 jours précédant l'inoculation parasitaire. Ce protocole d'immunodépression murine par le phosphate de dexaméthasone par voie orale s'inspire de celui décrit par Yang & Healey (11), appliqué par ces auteurs aux souris de type C57BL/6N pour la mise au point d'un modèle murin d'infection parasitaire intestinale dû à un parasite sans rapport aucun avec Neospora caninum Cryptosporidium parvum. Ce modèle murin d'immunosuppression n'avait jamais été appliqué précédemment dans les infections expérimentales à Neospora caninum. Au contraire de l'immunodépression par voie sous-cutanée, ce protocole simple d'immunodépression par voie orale permet le traitement simultané d'un grand nombre de souris, sans aucune manipulation des animaux. Mais il va de soi que d'autres corticoïdes peuvent être substitués aux phosphates de déxaméthasone, étant entendu que dans chaque cas, I'on déterminera expérimentalement, au préalable l'intervalle de doses et la durée du traitement d'immunodépression préalable à l'infection parasitaire, aux fins de produire effectivement cette dernière, notamment par infection conjointe des animaux avec des tachyzoïtes et des cellules sarcomateuses murines, par exemple du type cellules TG180. Le procédé de diagnostic selon l'invention est alors caractérisé par une mise en contact d'une suspension de tachyzoïtes entiers, avec le fluide biologique, par exemple un sérum animal, voire même humain, soupçonné contenir des anticorps anti-Neospora caninum, et la détection de l'agglutination éventuellement observée. Tout mode d'observation approprié à la détection de l'agglutination peut alors être mis en oeuvre, par exemple comme indiqué plus loin sous la rubrique 3.3 Lecture et Interprétation . En particulier, la présence d'un voile d'agglutination indiquera une réaction positive au plan qualitatif. La détermination quantitative pourra être appréciée par une titration des anticorps par dilutions séquentielles, le titre résultant alors de la dernière dilution du fluide biologique testé, notamment du sérum, qui donne encore lieu à une agglutination des parasites. II est avantageux, préalablement à la susdite mise en contact, d'inhiber les anticorps de classe IgM éventuellement présents dans le fluide biologique à tester, par exemple par adjonction à celui-ci de 2mercapto-éthanol . Comme il sera montré ci-après les résultats que l'invention autorise, attestent à la fois: . des hautes sensibilités et reproductibilités des tests, permettant l'obtention de résultats généralement supérieurs à ceux obtenus par les méthodes classiques, . de l'aptitude du test selon l'invention à être appliqué avec des efficacités comparables à la détection d'une infection à N. caninum dans des sérums issus d'animaux appartenant à des espèces différentes, en l'absence de toute obligation d'adaptation du test à chacune de ces espèces. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention découlent encore de la description qui suit des essais expérimentaux qui en démontrent l'efficacité, étant évidemment entendu qu'ils ne sauraient être interprétés comme tendant à limiter la portée de l'invention. DESCRIPTION DES TESTS 1. Souche parasitaire utilisée: La souche NC1 de Neospora caninum a été fournie au stade tachyzoïtes (forme invasive de réplication active) par J.P. Dubey (U.S. Dept. of Agriculture, Beltsville, Maryland, USA). Cette souche est la souche d'origine isolée en 1988 (Dubey et coll., 1988) et entretenue par passages successifs en culture cellulaire. La souche parasitaire est conservée vivante au laboratoire en culture cellulaire par passages réguliers sur cellules fibroblastiques humaines (MRC5, bioMérieux, France), selon la procédure habituellement appliquée (5). II va de soi que toute autre souche de N.caninum pourrait être utilisée de manière semblable. II est à cet égard fait référence aux diverses souches identifiées dans l'article de J.P. Dubey, D.S. Lindsay, dans Veterinary Parasitology 67 (1996): 1-59. 2. Production d'antigène de N.caninum 2. 1 Immunodépression des souris Du phosphate de dexaméthasone est administré ad libitum dans l'eau de boisson de souris Swis Webster à la concentration de 10 pig/ml dans les 10 jours précédant l'inoculation parasitaire. En d'autres termes, la sensibilité des souris Swiss-Webster à l'infection aigue a pu être obtenue par l'administration per os de dexamethasone d'après la méthode décrite par Yang et Healey (1993) chez des souris C57BL/6N (génétiquement modifiées). Cette méthode facile à mettre en oeuvre entraîne une immunodépression des souris, progressive, constante et non létale. Elle permet une stimulation de la réplication des parasites sous forme de tachyzoltes après une inoculation intra-péritonéale. 2.2 Inoculation des souris: Après 10 jours d'immunodépression par le phosphate de dexamethasone par voie orale (cf. supra), I'inoculation des tachyzoïtes de N. caninum (souche NC1) est réalisée par voie intra-péritonéale, à raison de 5.104 tachyzoïtes/souris, afin d'obtenir des tachyzoites libres, intrapéritonéaux pouvant être facilement recueillis, comme précédemment décrit pour le sérodiagnostic de la toxoplasmose (cf. supra). Le recueil des tachyzoïtes intra-péritonéaux s'effectue 4 jours après l'inoculation. Le lavage péritonéal obtenu est centrifugé avec des cellules sarcomateuses murines (cellules TG 180) selon la méthode préconisée par Adouin et coll. pour le sérodiagnostic de la toxoplamose (1). Le ratio optimal de concentration tachyzoïtes/cellules TG 180 est de 2/1. Une partie du culot de centrifugation est inoculé à des souris immunodéprimées selon le protocole précédemment décrit. 2.3 Recueil de l'ascite: Quatre jours après l'inoculation, les souris infectées sont sacrifiées et le liquide péritonéal contenant un grand nombre de tachyzoïtes libres et intra-cellulaires est lavé en tampon PBS comme précédemment décrit pour le sérodiagnostic de la toxoplasmose (1,3). 2.4 Préparation antiqénique Cette préparation s'effectue d'après la méthode utilisée pour le sérodiagnostic de la toxoplasmose (1,3). En bref, le lavage péritonéal dilué dans du PBS est incubé à 37"C sous agitation constante pendant 30 minutes en présence de trypsine à 1%o. La digestion des cellules TG 180 par la trypsine enrichit considérablement la solution en antigènes parasitaire en libérant les nombreux tachyzoltes intra-celluaires. Après la digestion cellulaire, la solution est lavée 3 fois en PBS (pH=7,2) et le culot est remis en suspension dans une solution de formaldéhyde à 6% pour fixation des parasites. Après 12 heures de fixation, la solution est lavée 3 fois en PBS. Les tachyzoïtes sont ensuite conservés dans une solution additionnée d'azide de sodium à 1%, jusqu'à utilisation pour la réaction d'agglutination. 3. Réaction d'agglutination directe de N. caninum pour le diagnostic sérologique: 3.1 Historique: La réaction d'agglutination directe des parasites visant à mettre en évidence la présence d'anticorps anti-Neospora dans un sérum humain ou animal est directement inspirée de la méthode utilisée pour le sérodiagnostic de la toxoplasmose, initiée par Fulton & Turk (1959) et Ardoin et coll. (1966), et définitivement mise au point par Desmonts & Remington (3). Ces deux derniers auteurs ont notamment sensibilisé la réaction par l'adjonction de 2-mercapto-éthanol (2-ME), permettant d'éliminer les IgM (naturelles ou spécifiques) éventuellement contenues dans le sérum et qui peuvent fausser les réactions d'agglutination. Les anticorps spécifiques mis en évidence par une telle réaction d'agglutination sont donc des anticorps de classe IgG. 3.2 Méthode: Les réactions d'agglutinations sont effectuées dans des microplaques 96 puits à fond rond (NuncB, Danemark). En bref, 50,ul de tampon PBS additionné de 2-ME 0,2M est distribué dans chaque microcupule. Des dilutions séquentielles de raison 2 sont ensuite réalisées dasn le tampon PBS/2-ME pour chaque sérum analysé. Les parasites stockés en PBS-Azide sont mis suspension en tampon alcalin BABS (pH 8,7) pour une concentration finale de 2.104 tachyzoïtes/ul. 50 PI de cette solution antigénique sont ensuite distribués dans chaque microcupule. Les microplaques sont agitées brièvement et mises à incuber à 30"C pendant 12 heures. 3.3 Lecture et interprétation. Après 12 heures d'incubation à 30"C, les réactions d'agglutination parasitaires peuvent être interprétées. La présence d'anticorps sériques entraîne la formation d'une agglutination parasitaire en voile, macroscopiquement visible dans une microcupule. L'absence d'anticorps se traduit par une sédimentation en bouton des parasites au fond des microcupules L'interprétation de la réaction est - qualitative : présence ou absence de voile d'agglutination. - quantitative ' titration possible des anticorps par dilutions séquentielles: le titre est donné par la dernière dilution du sérum donnant une agglutination des parasites. 4. Application au diagnostic d'infections naturelles et expérimentales: Le test d'agglutination directe de N. caninum a été évalué comparativement à l'immunofluorescence indirecte sur des sérums d'animaux de différentes espèces, infectés naturellement ou expérimentalement, par N. caninum ou par d'autres protozoaires de la même famille. 4.1 Sérums: Tous les sérums ont été préalablement testés en immunofluorescence indirecte (IFI) et conservés congelés à -20 C avant d'être analysés en aveugle par le test d'agglutination directe (NAT). Les sérums d'infection expérimentale ont été obtenus à partir de lapins, de rats et de moutons infectés par voie parentérale avec des tachyzoïtes de Neospora caninum, ainsi que de lapins infectés per os avec des oocystes ou des sporocystes d'Apicomplexa voisins du Neospora Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., et Hammondia hammondi. Les prélèvements sanguins ont été réalisés le jour même de l'inoculation puis à différents moments après l'infection (cf. tableaux 1 & 2). Les résultats obtenus en IFI ont fait l'objet d'une publication antérieure (12). Les sérums d'infection naturelle proviennent de 70 vaches laitières d'un troupeau ayant subi une épidèmie d'avortements liés à Neospora caninum. Les sérums ont été prélevés au 18ème jour de l'épidémie. Celleci a été décrite par McAllister et coll. (1996) et par Dubey et coll. (1997). Ont été également étudiés des sérums d'une chienne et de son chiot présentant des signes d'infection congénitale et chez lequel le diagnostic de néosporose a été prouvé par l'immunohistochimie. Un chiot d'une autre portée a aussi été étudié. 4.2 Analvse statistique: Le XL a été utilisé pour la comparaison des titres d'anticorps des vaches infectées. Un coefficient de corrélation entre l'IFI et le NAT a été calculé par analyse de variance. 4.3 Résultats: 4.3.1 Infections expérimentales Les titres d'anticorps spécifiques obtenus avec l'IFI et le NAT sont résumés dans les tableaux 1 et 2. Les sérums de lapins inoculés avec Sarcocystis muris, S. neurona, Hammondia hammondi et Toxoplasma gondii sont négatifs en IF1 au 1/50e et au 1/20e avec le NAT (tableau 1). Des anticorps sont détectés au 1/40e avec le NAT dans le sérum du lapin inoculé avec S. cruzi, alors qu'il est négatif au 1/50e en IFI. Un lapin, un mouton et neuf rats inoculés avec N. caninum montrent des titres élevés d'lgG en agglutination , ces résultats sont bien corrélés avec ceux de l'immunofluorescence (tableau 2). 4.3.2 Infections naturelles La répartition des titres d'lgG spécifiques selon la survenue ou non d'un avortement chez les 70 vaches est résumée dans le tableau 3. Une corrélation significative a été trouvée entre les titres d'anticorps anti-N. caninum mesurés par le NAT et l'IFI, le coefficient de corrélation étant (r) = 0.469 [F(1,76) = 21.18; p 4.4 Discussion Les résultats indiquent que comparativement à l'IFI, le NAT est fiable pour le sérodiagnostic des infections naturelle et expérimentale à Neospora caninum chez différentes espèces animales. La valeur diagnostique des titres faibles d'anticorps ne peut pas être évaluée chez les animaux infectés naturellement. Par conséquent, la spécificité du test ne peut être déterminée que chez des animaux expérimentalement infectés par des protozoaires différents mais phylogénètiquement proches du Neospora. Dans ces conditions il n'a pas été observé de réactions croisées avec le NAT, à l'exception d'une réaction légèrement positive chez un lapin infecté par des sporocystes de Sarcocystis cruzi. De faibles réactions non spécifiques ont également été rapportées avec l'IFI et l'ELISA après infection par S. cruzi (Dubey et coîl. 1996). Le NAT montre une haute sensibilité puisque tous les animaux infectés expérimentalement ont développé des titres élevés d'lgG spécifiques après inoculation par N. caninum ; ceci est en accord avec les résultats rapportés antérieurement avec l'IFI. Un large éventail de titres d'anticorps, significativement corrélés avec ceux de l'IFI, a été observé chez des vaches provenant d'un troupeau atteint d'une épidémie d'avortements liés à N. caninum. Quel que soit le test sérologique utilisé, y compris le NAT, un titrage isolé d'anticorps chez un animal donné ne permet pas de retenir l'infection à N. caninum comme étant à l'origine de l'avortement. Cependant, si l'on considère l'ensemble du troupeau, les titres élevés d'anticorps anti-N. caninum obtenus avec le NAT sont significativement associés avec la survenue d'un avortement. Cette association a été précédemment démontrée avec l'IFI par McAllister et coll (1996). Chez les chiens suspects de neosporose, les titres élevés d'anticorps observés avec le NAT et l'IFI sur des sérums appariés d'une chienne et de son chiot apparaissent hautement prédictifs d'une infection congénitale comme celà a été rapporté anterieurement (Dubey et Lindsay 1996). Le NAT détecte seulement des anticorps IgG puisque l'emploi du 2mercaptoéthanol supprime les IgM spécifiques et non spécifiques (Desmonts et Remington 1980). Cependant, les IgG apparaissant dans les deux semaines suivant l'infection à N. caninum ou à T. gondii (Dubey et coll 1996), la fiabilité du NAT dans le diagnostic de la néosporose n'est probablement pas diminuée. II important de souligner que le NAT peut être utilisé tel quel pour toutes les espèces animales. Les sérums de différentes espèces peuvent même être étudiés dans une même série d'analyse avec des aspects comparables d'agglutination. Au contraire, I'IFI et l'ELISA requièrent l'emploi de conjugués (ou 'deuxièmes anticorps') préparés à partir d'espèces animales nécessairement différentes de celles de l'hôte infecté. De plus, ces dernières méthodes demandent une longue standardisation de la technique en fonction de l'espèce animale étudiée. Un autre inconvénient de L'IFS peut être la sujectivité de la lecture des réactions conduisant à un manque de reproductibilité entre laboratoires (Dubey et coll 1997). Enfin la grande diversité des antigènes de Neospora utilisés dans les différentes techniques ELISA actuellement disponibles rend compte des importantes variations des résultats, en particulier pour les taux faibles d'anticorps (Dubey et coll 1997). Au total, par comparaison avec l'IFI pris comme référence, le NAT est un test fiable pour la détection et le titrage des IgG anti-N. caninum d'espèces variées. A la différence des autres test disponibles, le NAT est moins coûteux, facile à réaliser et à lire, et ne nécessite qu'un minimum d'équipement et de matériels de laboratoire. II est ainsi approprié aux larges dépistages d'animaux sur le terrain tout aussi bien qu'à l'étude des réponses humorales spécifiques de N. caninum. 5. Tableaux: TABLEAU 1. Comparaison des titres d'anticorps IgG anti-Neospora caninum obtenus en agglutination directe (NAT) et en immunofluorescence indirecte (IFI) chez des lapins infectés expérimentalement par des protozoaires apparentés Lapin N Protozoaire Jpl(a) NAT(b) IFI(c) inoculé S. muris 0 184 2 H. hammondi 0 32 167 3 H. hammondi 0 '20 84 4 T. gondii 0 ND 42 5 T. gondii 0 17 6 S. neurona 0 81 7 S. neurona 0 81 8 S. cruzi 0 '20 92 40 Les titres sont exprimés en inverse de la dernière dilution positive. TABLEAU 2. Comparaison des titres d'anticorps IgG anti-Neospora caninum obtenus en agglutination directe et en immunofluorescence indirecte chez des animaux infectés expérimentalement par Neospora caninum Animal No Jpl(a) NAT(b) -(c) lapin 0 31 32000 6400 rat 1 57 8000 6400 2 57 8000 1600 3 57 16000 3200 4 57 8000 1600 5 57 8000 6400 6 136 1000 800 7 136 8000 3200 8 136 4000 1600 9 136 8000 3200 mouton 0 20 15 > 2560 1600 36 > 2560 25600 49 > 2560 25600 cf. tableau 1 pour la légende TABLEAU 3. Répartition des titres d'anticorps IgG anti-Neospora caninum obtenus en agglutination directe et en immunofluorescence indirecte chez des vaches ayant ou non avorté au cours d'une épidémie de néosporose vaches avec vaches sans Titres avortement avortement NAT IFI NAT IFI 200 29 31 22 22 Total 33 37 cf. tableau 1 pour la légende TABLEAU 4. Comparaison des titres d'anticorps IgG anti-Neospora caninum obtenus en agglutination directe et en immunofluorescence indirecte chez des chiens suspects d'infection à N. caninum. NAT IFI Chienne 25600 800 Chiot 1(a) 51200 > 3200 Chiot 2(b) 320 100 cf. tableau 1 pour la légende (a) chiot présentant des signes cliniques d'infection congénitale (b) chiot asymptomatique 6. Références bibliographiques: 1. Ardoin P., H. Baufine-Ducrocq, and P. Couzineau. 1966. Multiplication de Toxoplasma gondii en sarcome TG180 de la souris, in vivo. C. R. Soc. Bol. 160:1821 - 1823. 2. Brindley P.J, R.T. Gazzinelli, E.Y. Denkers, S.W. Davis, J.P. Dubey, R. Belfort, M.C. Martins, C. Silveira, L. Jamra, A.P. Waters and A. Sher. 1993. Differentiation of Toxoplasma gondii from closely related coccidia by riboprint analysis and a surface antigen gene polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg 48: 447-456. 3. Desmonts, G. and J.S. Remington. 1980. Direct agglutination test for diagnosis of Toxoplasma infection: method for increasing sensitivity and specificity. J. Clin. Microbiol. Il 562 - 568. 4. Dubey, J.P., J.L. Carpenter, A. Speer, M.J. Topper, and A. Uggla. 1988a. Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 192:1269 - 1285. 9. Lindsay D.S. and J.P Dubey. 1989b. Neospora caninum (Protozoa: Apicomplexa) infections in mice. J. Parasitol. 75: 772 - 779. 10. Fulton J.D. and J.L. Turk. 1959. Direct agglutination test for Toxoplasma gondii. Lancet ii 1068 - 1069.0 11. Yang S. and M.C. Healey. 1993. The immunosuppressive effects of dexamethasone administered in drinking water to C57BL/6N mice infected with Cryptosporidium parvum. J. Parasitol. 79. 626 - 630. 12. Dubey J.P., Lindsay D.S., Adams D.S., Gay J.M., Baszler T.V., Blagburn B.L., Thulliez P. 1996. Serologic responses of cattle and other animals infected with Neospora caninum. Am. J. Vet. Res. 57: 329-336. 13. McAllister M.M., Huffman E.M., Hietala S.K., Conrad P.A., Anderson M.L., Salman M.O. 1996. Evidence suggesting a point source exposure in an outbreak of bovine abortion due to neosporosis. J. Vet. Diagn. Invest. 8: 355-357. REVENDICATIONS 1. Procédé de production de tachyzoites entiers de Neospora caninum in vivo chez un mammifère infectable par N. caninum, notamment de souris, dans lequel on produit une immunodépression par un agent immunodépresseur préalablement à une infection par N. caninum, caractérisé en ce que l'agent immunodépresseur, notamment un corticoïde, est absorbable par voie orale et qu'il est administré quotidiennement ad libitum à ce mammifère par voie orale, notamment avec ses aliments ou, et de préférence, son eau de boisson sur une durée de plusieurs jours, notamment de 5 à 15 jours, par exemple 10 jours, préalablement à son infection avec des tachyzoites de N. caninum, et par la récupération des tachyzoites entiers obtenus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les mammifères infectables sont des souris, en particulier de souris Swiss Webster, et que l'immunodépressîon est induite par du phosphate de dexaméthasone administré ad libitum dans l'eau de boisson des souris, à la concentration de 5 à 15 ug/ml, notamment de 10 pg/ml/jour, pendant une durée précédant le jour de l'infection, de 5 à 15 jours, avantageusement dans les 10 jours précédant l'inoculation parasitaire. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2 caractérisé par la stimulation de l'infection par l'administration concomitante à celle des tachyzoites, de micro-organismes aptes à favoriser la formation d'ascites péritonéales dans lesquelles prolifèrent alors des tachyzoïtes. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ces micro-organismes sont des cellules sarcomateuses murines (cellules TG 180). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'administration quotidienne ad libitum est poursuivie jusqu'au sacrifice des animaux pour récupérer les tachyzoïtes entiers produits. 6. Application des tachyzoîtes entiers produits par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à la détection d'anticorps anti-Neospora caninum dans un fluide biologique, tel qu'un sérum animal, voire même humain, soupçonné de les contenir, caractérisée par la mise en contact d'une suspension de ces tachyzoïtes avec le fluide biologique, tel qu'un sérum animal, voire même humain, soupçonné de contenir des anticorps anti-Neospora caninum, et par la détection de l'agglutination éventuellement observée. 7. Application selon la revendication 6, caractérisée en ce que le fluide biologique a fait l'objet d'une étape d'inhibition préalable des anticorps de classe IgM qui y étaient éventuellement présents, notamment par adjonction à celui-ci de 2-mercapto-éthanol, préalablement à la susdite mise en contact. 8. Application selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que l'agglutination est appréciée par la formation d'un voile d'agglutination. 9. Application selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que la détection comporte une titration des anticorps par dilutions séquentielles, le titre résultant de la dernière dilution du fluide biologique testé qui donne encore lieu à une agglutination des parasites.