Brevet FR2764303A1 — publié le 19981211

La présente invention concerne une protéine ayant une activité d'aspartase, un ADN codant cette protéine, un plasmide recombiné comprenant cet ADN, un transformant dans lequel ce plasmide recombiné est introduit, un procédé pour produire la protéine et un procédé pour produire de l'acide L- aspartique au moyen de ce transformant. L'acide L-aspartique est utilisé notamment dans des produits pharmaceutiques et des additifs pour aliments. Récemment, l'acide L-aspartique a également attiré l'attention comme matière première pour tensioactifs et agents chélatants biodégradables. L'acide L-aspartique est produit principalement par des procédés enzymatiques à partir d'acide furmarique et d'ammoniac au moyen d'une aspartase. Comme gène codant une aspartase on connaît un gène issu de Escherichia coli [(Journal of General Microbiology, 130, 1271-1278 (1984)] et un gène issu de Brevibacterium flavum MJ-233 (demande de brevet japonais publiée avant examen n 5-30 977). La présente invention a pour but de proposer un gène codant une aspartase qui soit différent des gènes cités ci-dessus et qui permette de produire de l'acide L-aspartique de manière plus efficace. A la suite de recherches approfondies pour atteindre ce but, on a isolé une protéine à activité d'aspartase et un gène codant cette protéine à partir de bactéries du genre Rhodococcus, ce qui a conduit à la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne: (1) une protéine à activité d'aspartase qui comporte la séquence d'acides aminés représentée dans SEQ ID NO: 1 ou la séquence d'acides aminés représentée dans SEQ ID NO: 1 comportant une déletion, une substitution ou une addition d'un ou plusieurs acides aminés; (2) un ADN codant la protéine; (3) un plasmide recombiné obtenu par ligature de l'ADN avec un vecteur plasmidique; (4) un transformant obtenu par introduction du plasmide recombiné dans un micro-organisme hôte; (5) un procédé de production de la protéine ci-dessus par culture du transformant; et (6) un procédé de production d'acide L-aspartique par réaction d'acide fumarique ou l'un de ses sels avec l'ammoniac ou l'un de ses sels en présence du transformant ci-dessus ou de la protéine ci-dessus. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux dans la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels: la figure 1 est une carte de restriction du plasmide recombiné pAR 002. Le double trait représente le vecteur pUC 118 et le simple trait représente la région d'ADN de la souche EA4 de Rhodococcus. La flèche épaisse dans la région d'ADN de la souche EA4 indique la position et l'orientation du gène d'aspartase selon la présente invention; la figure 2 est une carte de restriction du plasmide recombiné pAR016. Le double trait représente la région issue du plasmide pSJ034 et le simple trait représente la région d'ADN de la souche EA4. La flèche épaisse dans la région d'ADN de la souche EA4 indique la position et l'orientation du gène d'aspartase selon la présente invention; la figure 3 est un schéma représentant le plasmide pSJ034; et la figure 4 montre les étapes de construction du plasmide pSJ034. La souche Rhodococcus sp. EA4 (FERM BP-6231) constitue un exemple spécifique de micro-organismes capables de produire la protéine à activité d'aspartase selon la présente invention et un ADN codant cette protéine. Le micro-organisme hôte destiné à être utilisé dans le cadre de l'invention n'est pas limité d'une manière particulière et on peut citer spécifiquement la souche EA4 mentionnée ci-dessus ainsi que Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674, ATCC 17041, ATCC 17895, ATCC 19140 et ATCC 33258. La souche EA4 est déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, sous le numéro d'accès indiqué ci-dessus et ses propriétés bactériologiques sont décrites dans la demande de brevet japonais publiée avant examen n 4- 304 892. Les souches ATCC 12674, ATCC 17041, ATCC 17895, ATCC 19140 et ATCC 33258 sont disponibles auprès de la American Type Culture Collection (ATCC). La présente invention va maintenant être décrite de manière plus détaillée au moyen des exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 (1) Préparation d'ADN chromosomique à partir de la souche EA4. On a cultivé la souche EA4 dans 100 ml de milieu MY (0,5 % de polypeptone, 0,3 % d'extrait de bacto-levure, 0,3 % d'extrait de bacto- malt, I % de glucose) à 30 C pendant 72 h en secouant. Puis, on a récolté les cellules et on les a mises en suspension dans 4 ml de solution salée-EDTA (EDTA 0,1 M, NaCI 0,15 M (pH 8,0)). On a ajouté à la suspension 8 mg de lysozyme et on a secoué à 37 C pendant 1 à 2 h. Puis, on a congelé la suspension résultante et ensuite on lui a ajouté 10 ml de solution de Tris-SDS (I % de SDS, NaCI 0,1 M, Tris-HCl 0,1 M (pH 9, 0)) tout en secouant doucement. En outre, on a ajouté de la protéinase K (Merck) (concentration finale: 0,1 mg/ml) et on a secoué à 37 C pendant 1 h. On a ajouté à la suspension résultante un volume égal de phénol saturé de TE (TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0)), on a agité et on a centrifugé. On a recueilli la couche supérieure et on lui a ajouté 2 volumes d'éthanol. Puis, on a enroulé l'ADN autour d'une baguette de verre. On a retiré le phénol en utilisant de l'éthanol à 90 %, à 80 % et à 70 % dans cet ordre. Ensuite, on a dissous l'ADN dans 3 ml de tampon TE. On a ajouté à cette solution une solution de ribonucléase A (prétraitée à 100 C pendant 15 min) pour obtenir une concentration de 10, ug/ml et on a secoué à 37 C pendant 30 min. En outre, on a ajouté de la protéinase K et on a secoué à 37 C pendant 30 min, puis on a ajouté du phénol saturé de TE. On a centrifugé la solution résultante pour la séparer en une couche supérieure et en une couche inférieure. On a répété deux fois la même opération pour la couche supérieure puis on lui a ajouté un volume égal d'une solution mixte de chloroforme et d'alcool isoamylique (24:1) et on a répété la même opération d'extraction (dans la suite cette opération est appelée "traitement au phénol"). Ensuite on a ajouté deux volumes d'éthanol à la couche supérieure résultante puis on a enroulé l'ADN autour d'une baguette de verre pour obtenir un échantillon d'ADN chromosomique. (2) Préparation d'une sonde On a mélangé 10 jtl d'ADN chromosomique obtenu dans l'étape (1) (dilution 1/20), 10 g1 de tampon de réaction 10x, 3 g1 de MgCI2 50 mM, 2 pi de dNTP 10 mM, 1 p1 (équivalant à 100 pmol) de l'oligonucléotide représenté dans SEQ ID NO:4 comme amorce n I et 1 pi de l'oligonucléotide représenté dans SEQ ID NO:5 comme amorce n 2 et 1 pi de Taq polymérase (GIBCO BRL) pour préparer 100 1l de solution. On a conçu chacune des amorces ci-dessus sur la base de régions hautement conservées parmi différentes aspartases connues. On a soumis la solution résultante à une réaction de PCR ou ACP (amplification en chaîne par polymérase) consistant en 30cycles comprenant chacun une dénaturation à 93 C pendant 30 s pour séparer les deux brins d'ADN, une hybridation avec les deux amorces à 55 C pendant 30 s et une extension des amorces à 72 C pendant 2 min. Après la fin de la réaction, on a réalisé 3 extractions au chloroforme puis on a précipité à l'éthanol pour récupérer l'ADN amplifié. On a séparé l'ADN par électrophorèse en gel d'agarose à 0,7 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 600 pb qui est supposé coder une partie du gène d'aspartase de la souche EA4. On a marqué ce fragment d'ADN avec le kit de marquage d'ADN DIG (Boehringer Mannheim) pour préparer une sonde. (3) Préparation d'une banque d'ADN A 200 jll d'ADN chromosomique de la souche EA4 on a ajouté 40 ptl de tampon d'enzyme de restriction 10x, 145 g.l d'eau stérilisée et 15 il d'enzyme de restriction BamHI et on a fait réagir à 37 C pendant 6 h. Puis, on a réalisé une précipitation à l'éthanol pour récupérer l'ADN que l'on a soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. On a prélevé sur le gel un fragment d'ADN d'environ 8 kb que l'on a récupéré avec DNA PREP (DIA IATRON). On a inséré ce fragment d'ADN dans le site BamHI du vecteur de E. coli pUC 118 à l'aide d'un kit de ligature (Takara Shuzo) pour préparer une banque d'ADN recombiné. On a préparé le fragment de pUC118 utilisé dans la ligature de la manière suivante. A 10 ll de pUC118 on a ajouté 10 pl de tampon d'enzyme de restriction 10x, 77 {l d'eau stérilisée et 2}ll d'enzyme de restriction BamHI et on a fait réagir à 37 C pendant 2 h. Puis on a réalisé un traitement au phénol et une précipitation à l'éthanol. On a séché l'ADN résultant puis on l'a dissous dans 50 gl d'eau stérilisée. A cette solution, on a ajouté 1 ll de phosphatase alcaline, 10 il de tampon 10x et 39.l d'eau stérilisée et on a fait réagir à 65 C. Puis on a réalisé un traitement au phénol et une précipitation à l'éthanol. On a séché l'ADN résultant et on l'a dissous dans de l'eau stérilisée. (4) Préparation de transformants et sélection de l'ADN recombiné On a inoculé la souche de E. coli JMI09 à 1 ml de milieu LB (1 % de bactotryptone, 0,5 % d'extrait de bacto-levure, 0,5 % de NaCI) et on a cultivé à 37 C pendant 5 h. On a ajouté 100 jil de la culture résultante à 50 ml de milieu SOB (2 % de bacto-tryptone, 0,5 % d'extrait de bacto-levure, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgSO4 1 mM, MgCI2 1 mM) et on a cultivé à 18 C pendant 20 h. Puis on a récolté les cellules par centrifugation, on a ajouté aux cellules 13 ml de solution de TF froide (PIPES-KOH 20 mM (pH 6,0), KCI 200 mM, CaCI, 10 mM, MnCI2 40 mM), on a laissé au repos à 0 C pendant 10 min et on a centrifugé de nouveau. Après avoir retiré le surnageant on a mis en suspension E. coli précipité dans 3,2 ml de solution de TF froide. On a ajouté 0,22 ml de diméthylsulfoxyde à la suspension résultante et on a laissé au repos à 0 C pendant min. A 200 gl des cellules compétentes ainsi préparées on a ajouté 10 1il de la solution contenant le plasmide recombiné préparée dans l'étape (3) ci-dessus (c'est-à-dire banque d'ADN) et on a laissé au repos à 0 C pendant 30 min. Puis on a appliqué un choc thermique au mélange à 42 C pendant 30 s et on a refroidi le mélange à 0 C pendant 2 min. Ensuite, on a ajouté 0,8 ml de milieu SOC (2 % de bacto-tryptone, 0, 5 % d'extrait de bacto-levure, glucose 20 mM, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgSO4 1 mM), MgC12 1 mM. On a cultivé les cellules à 37 C pendant 60 min en secouant. On a étalé en boîtes la culture résultante en portions aliquotes de 200 il sur du milieu LB gélosé contenant 100 gg/ml d'ampicilline et on a cultivé à 37 C. On a sélectionné par hybridation in situ un transformant ayant le gène d'aspartase parmi les colonies transformantes cultivées sur le milieu gélosé. Brièvement, on a transféré sur une membrane de Nylon (BIODYNE A; Nihon Pall Limited) les colonies transformantes cultivées sur le milieu gélosé, puis on a lysé les cellules et on a fixé l'ADN. Ensuite, on a traité la membrane avec la sonde (fragment d'environ 600 kb) préparée dans l'étape (2) ci- dessus. On a sélectionné les colonies contenant l'ADN recombiné d'intérêt en utilisant le kit de détection luminescent DIG (Boehringer Mannheim). (5) Préparation d'un plasmide recombiné On a cultivé le transformant sélectionné dans l'étape (4) ci-dessus dans ml de milieu LB à 37 C pendant une nuit. On a récolté les cellules on les a lavés à l'eau stérilisée. On a ajouté aux cellules 5 ml de solution I (glucose 2 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCI 25 mM (pH 8,0)) et 25 mg de lysozyme et on a laissé au repos à 0 C pendant 30 min. En outre, on a ajouté 10 ml de solution II (NaOH 1 N, 5 % de SDS) et on a laissé au repos à 0 C pendant 5 min. Puis, on a ajouté 7,5 ml de solution III (acétate de sodium 3 M (pH 4,8)) et on a laissé au repos à 0 C pendant 30 min. On a centrifugé le mélange résultant, on a ajouté 50 ml d'éthanol au surnageant et on a centrifugé de nouveau. Puis on a retiré le surnageant et on a ajouté au précipité 5 ml de solution IV (acétate de sodium mM, Tris-HCI 50mM (pH 8,0)) et 2,5 1l de solution de ribonucléase A (10 mg/ml) et on a laissé au repos à la température ambiante pendant 20 min. On a ajouté 12 ml d'éthanol au mélange résultant puis on a récupéré le plasmide par centrifugation, on l'a rincé avec de l'éthanol à 70 %, séché et dissous dans 0,4 ml d'eau stérilisée. Après avoir traité au phénol, on a récupéré le plasmide par précipitation à l'éthanol, on l'a séché et dissous dans 0,4 ml d'eau stérilisée. On a appelé pAR002 le plasmide recombiné ainsi obtenu. Ce plasmide a été déposé auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon comme transformant E. coli JMI09/pAR002 sous le numéro d'accès FERM BP-6233. (6) Préparation d'une carte de restriction et détermination de la région avec laquelle la sonde s'hybride. On a préparé une carte de restriction par digestion du plasmide pAR002 obtenu dans l'étape (5) ci-dessus avec plusieurs enzymes de restriction (figure 1). De plus, on a soumis pAR002 à une digestion avec les enzymes de restriction KpnI, BglIl, PstI, SalI, etc., et on l'a soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Puis on a réalisé une hybridation de Southern pour déterminer un fragment auquel la sonde s'hybride. (7) Détermination de la séquence nucléotidique On a déterminé les séquences nucléotidiques pour les régions flanquant la région spécifiée dans l'étape (6) ci-dessus et pour cette région elle même avec un séquenceur à fluorescence Pharmacia ALF II. On a ainsi obtenu la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NO:3. Dans cette séquence, on a trouvé un cadre de lecture ouvert qui a la séquence d'acides aminés indiquée dans SEQ ID NO: 1. En faisant une comparaison au moyen de la banque de données de séquences d'acides aminés NBRF (National Biomedical Research Foundation), on a constaté que le gène présente 50 à 60 % d'homologie avec les aspartases connues au niveau de la séquence d'acides aminés et que le polypeptide présente aussi une homologie importante dans les régions de grande homologie parmi les aspartases connues. On considère donc que ce polypeptide constitue une aspartase. La séquence nucléotidique de ce cadre de lecture ouvert est représentée dans SEQ ID NO:2. Exemple 2 (1) Préparation du plasmide pAR0 16 On a mélangé 10 pil de pAR002 (dilution 1/20), 10 tl de tampon de réaction 10x, 3 pl de MgCI2 50 mM, 2 ll de dNTP 10 mM, 1 pl (équivalant à 100 pmol) de l'oligonucléotide représenté dans SEQ ID NO:6 comme amorce n 3 et 1 il de l'oligonucléotide représenté dans SEQ ID NO:7 comme amorce n 4, et 1 gl de Taq polymérase (GIBCO BRL) pour préparer 100 pl de solution. On a conçu les amorces de manière qu'un fragment contenant le cadre de lecture ouvert de l'aspartase de EA4 soit amplifié. On a soumis la solution ainsi préparée à une PCR ou ACP de 30 cycles, chaque cycle consistant en une dénaturation à 93 C pendant 30 s, une hybridation à 55 C pendant 30 s et une extension à 72 C pendant 2 min. Après la fin de la réaction, on a réalisé 3 extractions au chloroforme puis une précipitation à l'éthanol pour récupérer l'ADN amplifié. Ensuite, on a soumis l'ADN récupéré à une digestion avec les enzymes de restriction XbaI et Sse8387I, puis on l'a séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 0,7 %. On a récupéré sur le gel une bande de 1,2 kb que l'on a insérée dans le site XbaI-Sse8387I du plasmide pSJ034 (figure 3) ayant une forte activité de promoteur pour les bactéries Rhodococcus, pour préparer ainsi le plasmide recombiné pAR016 (figure 2). On a préparé le plasmide pSJ034 à partir du plasmide pSJ023 (décrit dans la demande de brevet japonais n 9-65616) selon les étapes indiquées sur la figure 4. Le plasmide pSJ023 a été déposé auprès du National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, japon comme transformant R. rhodochrous ATCC 12674/pSJ023 sous le numéro d'accès FERM BP-6232. (2) Transformation de bactéries Rhodococcus et activité d'aspartase du transformant résultant On a récolté par centrifugation des cellules de la souche de Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674 dans la phase de croissance logarithmique, on les a lavées 3 fois avec de l'eau stérilisée et glacée et on les a mises en suspension dans de l'eau stérilisée. On a mélangé 10 ul de cette suspension de cellules avec 1,1 de plasmide pAR016 et on a refroidi dans la glace. On a placé ce mélange d'ADN et de cellules dans une cuvette. Puis on lui a appliqué des impulsions électriques à 2,0 kV et 200 n avec un appareil Gene Pulser (Bio Rad). On a laissé au repos pendant 10 min le liquide ainsi traité en le refroidissant dans la glace puis on lui a appliqué un choc thermique à 37 C pendant 10 min. Ensuite, on a ajouté 500 gl de milieu MYK (0,5 % de polypeptone, 0,3 % d'extrait de bacto-levure, 0,3 % d'extrait de bacto-malt, 0,2 % de K2HPO4, 0,2 % de KH, P04) et on a laissé au repos à 30 C pendant 5 h. Puis on a appliqué le mélange résultant sur du milieu MYK gélosé contenant 50 kig/ml de kanamycine et on a cultivé à 30 C pendant 3 j. On a inoculé le transformant ainsi préparé de bactéries Rhodococcus à ml de milieu MYK (contenant 50 gg/ml de kanamycine) et on a cultivé à 30 C pendant 72 h sous forme de préculture. On a inoculé 1 % de la préculture à 10 ml de milieu MYK (contenant 50 pg/ml de kanamycine) et on a cultivé à 30 C pendant 96 h. Puis, on a récolté les cellules par centrifugation, on les a lavées avec du tampon phosphate 100 mM (pH 8,0) et on les a mises en suspension dans une petite quantité de tampon. On a soumis cette suspension de cellules à une sonication en refroidissant dans la glace et on a centrifugé pour obtenir une solution d'enzyme brute sur laquelle on a déterminé l'activité d'aspartase. Comme témoin, on a utilisé la souche ATCC 12674 cultivée sans addition de kanamycine. On a déterminé l'activité d'aspartase de la manière décrite ci-dessous. Brièvement, on a mis en contact du fumarate d'ammonium 1,0 M/chlorure de magnésium 1 mM (pH 8,8) avec la solution d'enzyme brute. Puis on a déterminé quantitativement l'acide aspartique produit à 30 C pendant 60 min par CLHP au moyen d'une colonne ODS (colonne d'adsorbant hydrophile à groupes octadécylsilyle (ODS). On a constaté que l'activité d'aspartase était augmentée dans le transformant contenant le plasmide. Acide L-aspartique produit (mM) ATCC 12674/pAR016 322 ATCC 12674 0,1 Exemple 3 (1) On a introduit le plasmide pAR016 dans les souches ATCC 17895 et ATCC 19140 de la même manière que dans l'exemple 2 pour préparer des transformants de bactéries Rhodococcus. On a inoculé chacun de ces transformants à 10 ml de milieu MYK (contenant 50,tg/ml de kanamycine) et on a cultivé à 30 C pendant 72 h sous forme de préculture. On a inoculé 1 % de la préculture à 100 ml de milieu GGPK (1,5 % de glucose, I % de glutamate de sodium, 0,1 % d'extrait de bacto-levure, 0, 5 % de K2HPO4, 0,5 % de KH2PO4, 0,5 % de MgSO4, 7H20, pH 7,2 (contenant 50 gg/ml de kanamycine) et on a cultivé à C pendant 96 h. On a récolté les cellules par centrifugation, on les a lavées avec du tampon phosphate 100 mM (pH 8,0) et on les a mises en suspension dans une petite quantité de ce tampon. On a conduit une réaction de production d'acide aspartique en utilisant la suspension de cellules résultante. Brièvement, on a ajouté la suspension de cellules à 100 ml de fumarate d'ammonium 1,0 M/chlorure de magnésium 1 mM, (pH 8,8) et on a agité à 30 C pendant 20 h. Comme témoin, on a utilisé la souche ATCC 12674 cultivée sans addition de kanamycine. On a déterminé l'activité d'aspartase en déterminant quantitativement l'acide aspartique produit par la réaction ci-dessus (à 30 C pendant 20 h) par CLHP en utilisant une colonne ODS. On a ainsi trouvé que l'activité d'aspartase était augmentée dans les transformants contenant le plasmide. Acide L-aspartique produit (mM) ATCC 17895/pAR016 990 ATCC 17895 5 ATCC 19140/pAR016 985 ATCC 19140 8 Ainsi, la présente invention fournit un gène codant une protéine à activité d'aspartase. En utilisant un micro-organisme transformant comportant de multiples copies de ce gène il est possible de préparer l'acide L-aspartique efficacement à partir d'acide fumarique et d'ammoniac. Liste de séquences (2) Informations pour SEQ ID NO:1: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 477 acides aminés (B) Type: acide aminé (C) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: protéine (vi) Source initiale: (A) Organisme: Rhodococcus (B) Souche: EA4 (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO: 1: Phr Met Arg lie Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro 3s 10 15 lu Ala Tyr Tyr Gly lie His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe 25 30 !le Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala 40 45 Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly 55 60 eu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala lie Glu Gln Ala Cys Lys Glu 75 80 rg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val lIe Gin 90 95 Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala 105 110 Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gin Tyr Gln Phe 120 125 Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val 135 140 Tyr Pro Thr Ala lie Lys lie Gly Leu Gln GIY Ala Val Thr Arg Leu 150 155 160 Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala GIY Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala 170 175 Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala 185 190 Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile 200 205 Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu 210 215 220 le Asn Leu Gly Gly Thr Ala lie Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro 225 230 235 240 Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu 245 250 255 Asp le Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val GIY 260 265 270 Ala Phe Val Gin Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu 275 280 285 Ser Lys lie Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala 290 295 300 Gly Leu Gly Glu [le Asn Leu Pro Ala Val Gain Ala Gly Ser Ser Ile 305 310 315 320 Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gin Ile 325 330 335 Ala Tyr Arg Val Val GlY Asn AsP Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu 340 345 350 Ala Gly Gln Leu Gin Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val lie Ala His Ser 355 360 365 Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg 370 375 380 Glu Arg Cys Val lie Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg 385 390 395 400 Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr lie 405 410 415 Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly 420 425 430 Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu 435 440 445 AsP Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile 450 455 460 Val Ser A;a Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr 465 470 475 (2) Informations pour SEQ ID NO:2: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 1434 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: double (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADN (génomique) (vi) Source initiale: (A) Organisme: Rhodococcus (B) Souche: EA4 (ix) Caractéristiques (A) Nom/clé: CDS (B) Position: 1..1431 (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO:2: ATG ACG ATG CGC ATC GAG CAC GAC CTG CTC GGT GAT CGC GAA GTG CCT 48 Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro 1 5 10 15 GCG GAG GCC TAC TAC GGC ATC CAC ACG CTG AGA GCA CTG GAG AAC TTC 96 Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe 25 30 CCG ATC ACC GGT ATT CCT CTC TCG GTC CAC CCCG GAC ATG GTA TCG GCG 144 Pro Ile Thr GIy le Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala 35 40 45 TTG GCT GCG GTC AAG CAG GCC GCT GCT CGG GCG AAC GCC GAC CTC GGA 192 Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly 55 60 ATC CTC TCG CCC GAG CAT GCA GCG GCG ATC GAG CAA GCT TGC AAG GAG 240 lie Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu 70 75 80 ATT CGT GCG GGC AGG TTC ACC GAC CAG TTC GTC GTC GAC GTC ATT CAG 288 lie Arg Ala GIY Arg Phc Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val le Gin 90 95 GGT GGT GCC GGC ACG TCA TCG AAC ATG AAC GCC AAC GAA GTG GTC GCG 336 Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala 105 110 AAC CGC GCG CTC GAA ATT CTC GGC GGC GCAA CGG GGG CAG TAC CAA TTC 384 Asn Arg Ala Leu Glu le Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe 120 125 CTC CAT CCG CTC GAA CAC GTC AAC ATG AGT CAG AGC ACC AAC GAC GTC 432 Leu His Pro Leu Glu His Val Asa Met Ser Gin Ser Thr Asn Asp Val 135 140 TAC CCC ACC GCG ATC AAA ATC GGC TTG CAA GGT GCC GTC ACC AGG CTT 480 Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Tle Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu i50 155 160 CGA GGT GCCG ATG GAC GAA CTT GCA GGC GCA TTC GCG GAG AAA GCA GCC 528 Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala 170 175 GAG TTC TCC CAC GTG CTC AAG GTC GGG CGG ACT CAG TTG CAA GAC GCG 576 Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala i8C 185 190 GTC CCG ATG ACT CTC GGT CAA GAG ATT GTC ACG TTC GCC GTG ATG ATC 624 Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu lie Val Thr Phe Ala Val Met Ile 200 205 AAG GAG GAC TCT CAG AGA CTr GAA GAG GCC GCT CGG TTG ATC TCG GAG 672 Lys Glu Asp Ser Gin Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu lie Ser Glu 210 215 220 ATC MJC CTG GGA GGG ACG GCG ATA GGT ACC GGT CTC AAT GCG CAC CCG 720 Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala lie Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro 225 230 235 240 GAG TAC GCC AGA CGT GTG CGT GAG CAT CTG GTG TCG ATC ACC GGT CTC 768 Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser lie Thr Gly Leu 245 250 255 GAC ATC TCG ACG GCA TCG GAT CTC ATC GAA GCA ACC CAG GAC GTC GGG 816 Asp lie Ser Thr Ala Ser Asp Leu le Glu Ala Thr Gin Asp Val Gly 260 265 270 GCC TTC GTT CAG CTG TCG GGA GTG CTC AAG CGT ACC GCG GTC AAA CTG 864 Ala Phe Val Gin Leu Ser GIy Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu 275 280 285 TCC AAG ATC TGC AAC GAT CTG AGA TTG CTG TCC TCA GGC CCA CGA GCA 912 Ser Lys lie Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala 290 295 300 GGT CTG GGT GAG ATC AAT TTA CCT GCG GTG CAG GCA GGT TCG TCG ATC 960 Gly Leu Gly Glu lie Asa Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile 305 310 315 320 ATG CCC GGA AAG GTC AAT CCG GTC ATT CCG GAA GTG GTC AAT CAG ATT 1008 Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val lie Pro Glu Val Val Asn Gin Ile 325 330 335 GCC TAC CGG GTG GTG GGA AAC GAT CTG ACC ATC ACC ATG GCT GCC GAG 1056 Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr lie Thr Met Ala Ala Glu 340 345 350 GCG GGT CAA CTG CAG CTC.AAC GCA TTC GAA CCG GTC ATT GCA CAC AGC 1104 Ala Gly Gln Leu Gin Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser 355 360 365 TTG TTC GAG ACT GCA GAA CTC CTC ACG CGG GGC TGC ACT GTG TTG CGC 1152 Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg 370 375 380 GAG CGA TGC GTG ATC GGC ATT ACC GCC AAC GTC GAG CAT CTC GAA CGA 1200 Glu Arg Cys Val lle Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg 385 390 395 400 ACG GTC GCG GCT TCG ATC GGT GTC GTG ACC GCCG CTC AAT CCC TAC ATC 1248 Thr Val Ala Ala Ser lie Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr ile 405 410 415 GGC TAC ACA GCC GCG ACG GAA TTG GCG GCG GAC GCG CTT GCT TCC GGT 1296 Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly 4120 425 430 CGT ACC GTC GTG GAG TTG GTG CTC GAA CGC GGG TTG TTC GC AAG GAG 1344 Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu 435 440 445 GAT TTG GAC GCG ATC ATG GAG CCT GCG AAT TTG GCA CGA ACT GCG ATC 1392 Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala lIe 450 455 460 GTG TCG GCT CCC GAT:TC GAT CCA CTC GTC CCG TCG ACC TGA 1434 Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr 465 470 475 (2) Informations pour SEQ ID NO:3: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 1912 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: double (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: ADN (génomique) (vi) Source initiale: (A) Organisme: Rhodococcus (B) Souche: EA4 (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO: 3: TTCGAjAGCCA CGCCCGTTCA GGTGACCTGC GTGCGGCGAA GTTCGGTGGA GCCGAACTAC 60 CGTGGGGCGA GATCCCGGTG GCGGCAAACC TCAAATGACG ATGCGCATCG AGCACGACCT 120 GCTCGGTGAT CGCGAAGTGC CTGCGGAGGC CTACTACGGC ATCCACACGC TGAGAGCACT 180 GGAGAACTTC CCGATCACCG GTATTCCTCT CTCGGTCCAC CCCGACATGG TATCGGCGTT 240 GGCTGCGGTC AAGCAGGCCG CTGCTCGGGC GAACGCCGAC CTCGGAATCC TCTCGCCCGA 300 GCATGCAGCG GCGATCGAGC AAGCTTGCAA GGAGATTCGT GCGGGCAGGT TCACCGACCA 360 GTTCGTCGTC GACGTCATTC AGGGTGGTGC CGGCACGTCA TCGAACATGA ACGCCAACGA 420 AGTGGTCGCG AACCGCGCGC TCGAAATTCT CGGCGGCGAA CGGGGGCAGT ACCAATTCCT 480 * CCATCCGCTC GAACACGTCA ACATGAGTCA GAGCACCAAC GACGTCTACC CCACCGCGAT 540 CAAAATCGGC TTGCAAGGTG CCGTCACCAG GCTTCGAGGT GCGATGGACG AACTTGCAGG 600 CGCATTCGCG GAGAAAGCAG CCGAGTTCTC CCACGTGCTC AAGGTCGGGC GGACTCAGTT 660 GCAAGACGCG GTCCCGATGA CTCTCGGTCA AGAGATTGTC ACGTTCGCCG TGATGATCAA 720 GGAGGACTCT CAGAGACTGG AAGAGGCCGC TCGGTTGATC TCGGAGATCA ACCTGGGAGG 780 GACGGCGATA GGTACCGGTC TCAATGCGCA CCCGGAGTAC GCCAGACGTG TGCGTGAGCA 840 TCTGGTGTCG ATCACCGGTC TCGACATCTC GACGGCATCG GATCTCATCG AAGCAACCCA 900 GGACGTCGGG GCCTTCGTTC AGCTGTCGGG AGTGCTCAAG CGTACCGCGG TCAAACTGTC 960 CAAGATCTGC AACCATCTGA GATTGCTGTC CTCAGGCCCA CGAGCAGGTC TGGGTGAGAT 1020 CAATTTACCT GCGGTGCAGG CAGGTTCGTC GATCATGCCC GGAAAGGTCA ATCCGGTCAT 1080 TCCGGAAGTG GTCAATCAGA TTGCCTACCG GGTGGTGGGA AACGATCTGA CCATCACCAT 1140 GGCTGCCGAG GCGGGTCAAC TGCAGCTCAA CGCATTCGAA CCGGTCATTG CACACAGCTT 1200 GTTCGAGACT GCACAACTCC TCACGCGGGG CTGCACTGTG TTGCGCGAGC GATGCGTGAT 1260 CGGCATTACC GCCAACGTCG AGCATCTCGA ACGAACGGTC GCGGCTTCGA TCGGTGTCGT 1320 GACCGCGCTC AATCCCTACA TCGGCTACAC AGCCGCGACG GAATTGGCGG CGGACGCGCT 1380 TGCTTCCGGT CGTACCGTCG TGGAGTTGGT GCTCGAACGC GGGTTGTTGG GCAAGGAGGA 1440 TTTGGACGCG ATCATGGAGC CTGCGAATTT GGCACGAACT GCGATCGTGT CGGCTCCCGA 1500 TTTCGATCCA CTCGTCCCGT CGACCTGACC AGGTCTTCAG GGCGGTTGAC ACCGCACATG 1560 TGGGCGGTAT CGTTTAGTGA TACGTATAAC TACTTGCAGT CCTGTTGTGT CAGGATTGAC 1620 AGAAGCTGAG TCGGCACGGT TCAAGGACGT ACCGCGCCAA GCCAGCCAGG AGACGGAAAC 1680 CATGTTCGAA AAGACACGAA TGGACAGTCA TCCCCCCTGT AAGAGCAACT ACGACGTCAT 1740 CGTCGTGGGA AGCGGAATGG GGGGTGGAAC GATGGCATAC GCTCTCMAAGG ATTCCGGCCT 1800 CGATGTGCTC TTGATCGAGA GGGGAGACTT CCTTCCACAG GAACGTCAGA ATTGGGACCC 1860 CCGAGCGGTG TTCGAGAAAG ATCGGTACAA GAACGCCGA AAATGGGTCG AC 1912 (2) Informations pour SEQ ID NO:4: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 20 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: autre acide nucléique (A) Description: /desc = "ADN synthétique" (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO: 4: AACATGAACACTAACGAGGT 20 (2) Informations pour SEQ ID NO:5: (i) Caractéristiques de la séquence (A) Longueur: 20 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: simple (C) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: autre acide nucléique (A) Description: /desc = "ADN synthétique" (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO: 5: AGGTCGTTGC AGATCTTGGA 20 (2) Informations pour SEQ ID NO:6: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 33 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: autre acide nucléique (A) Description: /desc = "ADN synthétique" (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO:6: AATCTAGAAT GACGATGCGC ATCGAGCACG ACC 33 (2) Informations pour SEQ ID NO:7: (i) Caractéristiques de la séquence: (A) Longueur: 27 paires de bases (B) Type: acide nucléique (C) Configuration des brins: simple (D) Topologie: linéaire (ii) Type de molécule: autre acide nucléique (A) Description: /desc = "ADN synthétique" (xi) Description de la séquence: SEQ ID NO:7: CTCTAGACCT GCGTACGGCG AAGTTCG 27 REVENDICATIONS 1. Protéine caractérisée en ce qu'elle a une activité d'aspartase et présente la séquence d'acides aminés indiquée dans SEQ ID NO: 1 ou la séquence d'acides aminés indiquée dans SEQ ID NO: 1 ayant une délétion, une substitution ou une addition d'un ou plusieurs acides aminés. 2. ADN caractérisé en ce qu'il code la protéine selon la revendication 1. 3. ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il a la séquence nucléotidique indiquée dans SEQ ID NO:2. 4. ADN selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce qu'il est issu de bactéries Rhodococcus. 5. ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce que les bactéries Rhodococcus font partie de la souche Rhodococcus sp. EA4. 6. Fragment d'ADN d'environ 600 pb caractérisé en ce qu'il est amplifiable avec les ADN synthétiques représentés dans SEQ ID NO:4 et 5 respectivement. 7. Plasmide recombiné caractérisé en ce qu'il est obtenu par ligature de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 avec un vecteur plasmidique. 8. Plasmide recombiné caractérisé en ce qu'il est obtenu par ligature avec un vecteur plasmidique de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 et d'une région d'ADN susceptible de réplication et de prolifération dans des bactéries Rhodococcus. 9. Transformant caractérisé en ce qu'il est obtenu par introduction du plasmide recombiné selon l'une quelconque des revendications 7 et 8 dans un micro-organisme hôte. 10. Transformant selon la revendication 9 caractérisé en ce que le micro-organisme hôte est une bactérie Rhodococcus. 11. Procédé de production de la protéine selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend la culture du transformant selon l'une quelconque des revendications 9 et 10. 12. Procédé de production d'acide L-aspartique caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de l'acide fumarique ou de l'un de ses sels avec l'ammoniac ou l'un de ses sels en présence du transformant selon l'une quelconque des revendications 9 et 10 ou de la protéine selon la revendication 1.