Brevet FR2765496A1 — publié le 19990108

L'utilisation de cellules, d'organites cellulaires ou meme de nombreux composés fragiles comme les huiles essentielles, les arômes, les vitamines, ne peut être envisagée que par l'utilisation de techniques dites de Bioencapsulation. On peut ainsi protéger, isoler ou modifier le comportement des éléments encapsulés vis à vis du milieu dans lequel ils sont utilisés ou formules. La Bioencapsulation permet: - de protéger les cellules, organites ou molécules contre des stress thermiques ou mecaniques, contre le cisaillement et les variations de pression. - de protéger contre les stress chimiques comme l'oxydation ou l'action des acides et des bases. - de protéger contre l'action du système immunitaire dans le cas de microcapsules implantées. - de moduler les paramètres de libration des composés encapsulés. - de moduler les stress hydriques. - d'améliorer la conservation et le stockage. Strategies d'encapsulation Les différentes technologies utilisées, suivent toutes le même schéma comprenant deux étapes. La première consiste à disperser le produit ou la préparation à encapsuler en fines gouttelettes. La seconde voit la réalisation de l'encapsulation proprement dite par la solidification de gouttelettes soit en surface, soit dans la masse. La dispersion est une étape clé de la réussite d'une bonne encapsulation car elle conditionne à la fois l'efficacité de l'encapsulation, la taille des billes, l'homogénéité de taille et la forme. Les deux voies bien connues de l'homme de l'art restent l'extrusion et l'émulsification comme décrit par Levy et Poncelet, 1994, Biofunu, Mars 16-21. e L'extrusion: L'extrusion consiste à disperser la solution à encapsuler en la laissant tomber goutte à goutte dans un milieu où est réalisée la gélificaation des goutte ou la formation d'une membrane superficielle (Levy et Poncelet, 1994, Biofutur, Mars, 16-21). Le goutte à goutte est obtenu à l'aide d'une aiguille. Cependant, en fonction de la taille des capsules souhaitée, cette technique peut être modulée par l'application d'un courant d'air coaxial, d'une différence de potentiel ou d'une vibration. S'il est ainsi possible de mieux contrôler le domaine de taille, il apparaît impossible d'envisager une production industrielle pour des capsules infërieures à 500 microns à la fois pour des raisons de rendements et de dispersion de taille. Une évolution intéressante est la technique de coextrusion de la solution à encapsuler et de la solution de polymères formant la membrane de la microcapsule. Cette technique permet d'obtenir des taux d'encapsulation intéressants mais elle est difficile à maîtriser et nécessite un matériel spécifique. La dispersion par émulsification C'est la technique la plus simple de dispersion de la solution à encapsuler. Elle consiste à disperser cette solution aqueuse dans une phase hydrophobe par agitation, généralement en présence de tensioactif. Cette technique simple est industrialisable à très grande échelle. Elle est surtout retenue pour la production de capsules de tailles comprises entre 10 et 500 microns. En dehors de ce domaine, les distributions de tailles ne sont plus homogènes. Quel que soit le mode de dispersion employé, il est suivi de l'étape de solidification. Cette étape conduit à la synthese de la microcapsule contenant la structure à encapsuler, par la mise en place d'une membrane de nature variée plus ou moins résistante ou par la solidification complète formant une bille pleine par polymérisation ou gélification. La notion d'encapsulation doit être ici comprise au sens large c'est à dire qu'elle correspond à l'inclusion dans une structure généralement polymérique permettant - la protection - la facilité de séparation - le conditionnement comme microréacteur - la modulation du mode de libération de molécules Les différentes techniques de Bioencapsulation ont permis d'obtenir des résultats intéressants dans des domaines très variés. On peut distinguer les premières applications dans le domaine du papier sans carbone mais aussi la stabilisation de mycorhizes et de fragment racinaire encapsulés en billes d'alginate (Strullu et al, 1991, World J. Microbiol. Biotechnol. 7, 292-297). Des résultats excellents ont été obtenus dans les protocoles de cryoconservation d'apex végétaux par enrobage toujours avec des billes d'alginates (Scottez C. et al 1993, Cryobiology, 29, 691). Enfin la production d'éthanol et la maturation de la bière ou du vin (FR 2736924AI) ont bénéficié de ces techniques d'immobilisation de micro-organismes dans des capsules thermoplastiques des billes d'alginates ou en dérivé granulaire de la cellulose (DEAE-cellulose) utilisé par les brasseries finlandaises KERAVA. On obtient dans ces derniers cas une récupération par décantation sans les techniques lourdes d'ultrafiltration et on prévient le problème de la floculation. Parallèlement des sociétés utilisent ces technologies pour la production d'anticorps monoclonaux a partir de billes d'alginates (Damon biotech) et pour l'immunoprotection de xenogreffes par encapsulation en fibres creuses par Cytotherapeutics (Emerich et al, 1996, Cell Transplantation, 5, 589-596). Nous pouvons donc définir les principaux critères de l'encapsulation idéale. La capsule doit être biocompatible, ne doit pas modifier les équilibres physiologiques, ne doit pas induire d'effets secondaires, doit être biodégradable après avoir rempli son rôle et surtout être stable dans ses conditions d'utilisation. De plus, elle doit présenter une capacité d'encapsulation élevée et permettre une modulation efficace des propriétés de perméabilité aux nutriments, aux composés produits ou encapsulés, ainsi qu'aux différents composés ou éléments du milieu d'utilisation ou d'implantation des capsules. Enfin la technique d'encapsulation doit être facilement industrialisable. La capsule peut donc présenter les critères suivants: - une structure particulière obtenue par établissement de liaisons covalentes, amène une bonne stabilité chimique, thermique et mécanique. Elle doit etre obtenue sans faire appel aux techniques classiques difficiles de polymérisation interfaciale (Levy et al, 1982, J.Pharm.Sci., 71,759-762), de gélification thermique (Poncelet et al, 1993, Fundamentals of animal cell encapsulation and immobilisation, CRC Press Boca Raton,297-314) ou ionique (Kierstan et al, 1977, Biotechnol. Bioeng., 19,387), de pelliculage covalent (Dupuy et al, 1988, J. Biomed. Mater. Res., 22, 1061-1070) ou ionique (Lim et al., 1980, Science, 210, 908), de précipitation interfaciale (Stevenson et al., 1988, Biomater Artif. Cells Artif. Organs, 16(4),747-769), de coacervation ou de gélification superficielle par changement de solvant (Balladur et al, Ann. de Gastro-entérologie et d'Hépatologie, 30 (6), 265-269). - le composé doit être compatible avec la stabilité des composés à encapsuler - une capacité de changement importante aussi bien pour des composés biologiques, cellules ou organites, que pour des molécules hydrophobes - une stabilité d'incorporation importante et modulable - une bonne dispersabilité dans les milieux aqueux - un contrôle aisé de la taille Ce cahier des charges n'est approché que par quelques techniques d'encapsulation. Parmi ces techniques, la plus utilisée reste la gélification de l'alginate. Elle a permis d'apporter des réponses à certains problèmes comme la conservation des complexes semences/micro-organismes (Strullu et al, 1994, Biofutur, Mars, 35-36), la conservation d'activité plurimensuelle lors de la fermentation, la production d'éthanol et la vinification. De plus, la taille des pores n'est pas stable et on ne contrôle pas les échanges. L'homme de l'art sait que des capsules gélifiées en masse, obtenues par extrusion de l'alginate puis précipitation en bain de CaCI2, tel que décrit par Kierstan et Bucke, 1977, Biotechnol. Bioeng., 19, 387, sont extrêmement fragiles et sensibles å la présence d'agent complexant le cation Ca++, comme le phosphate, le citrate ou les tartrates présents dans les vins. Elles libèrent alors leur contenu. Une altemative à la gélification alginate/Ca++ est apportée avec les gels thermosensibles comme les carraghénanes ou l'agarose. Ainsi le -carraghénane gélifie lorsque la température est ramenée sous 450C et reste stable quelles que soient les espèces ioniques présentes. Cependant il ne permet l'encapsulation que de composés supportant des temperatures supérieures à 450C, ce qui exclut les cellules et molécules thermosensibles. Une des évolutions de la gélification de l'alginate est la technique de pelliculage par liaisons ioniques (Lim F. et Sun A.M., 1980, Sciences, 210, 908). Elle consiste à déposer un polymère de charge opposée à l'alginate à la surface de la bille d'alginate préformee, par simple dispersion dans un bain. Le polymère le plus utilisé est la polylysine. On obtient ainsi une membrane de perméabilité définie par les conditions opératoires. Par cette nouvelle technique, il a été possible de préparer des capsules contenant des cellules tout en contrôlant la perméabilité de la membrane. Il devient alors possible de confiner des métabolites produits par les cellules dans la capsule réalisée, afin de faciliter leur manipulation, leur récupération. C'est la technologie retenue par Damon Biotech (GB A2094750, WO A8904637) comme décrit par Posillico, 1984, Biotechnology, 4, 114-117. D'autres équipes ont réalisé en suivant la technique de pelliculage ionique, l'encapsulation de cellules afin d'obtenir une immunoisolation par la membrane et ainsi permettre la transplantation de xenogreffes, entre autres, d'isolats de Langerhans (Zekorm et al, 1992, Acta Diabetol., 29, 41-45) et d'hépatocytes. Ces travaux ont montré la validité du concept d'immunoprotection par Bioencapsulation. Cependant la stabilité de ces capsules est encore trop faible. In vivo, on assiste rapidement à l'infiltration de monocytes, de macrophages puis à la dégradation de la capsule, entraînant la perte de l'irnplant en quelques semaines (Clayton et al, Diabetes Research, 1990, 14, 127132). De plus, même dans les sites a faible réaction comme le système nerveux central ou le péritoine, on observe rapidement une fibrose péricapsulaire. Pour pallier à la faible stabilité chimique des capsules obtenues par pelliculage ionique, d'autres techniques ont été développées dites de polymérisation interfaciale. Toutes ces techniques reposent sur le même principe. Une suspension aqueuse de protéines ou de polymères contenant le produit à encapsuler, est dispersée dans une phase organique à laquelle est ajouté l'agent réticulant, généralement un polychlorure d'acide qui réagit avec les groupements amines à l'interface, pour donner une membrane de type nylon (FR 2 642329A 1). Ces techniques basées sur l'emploi de collagène, ont permis l'encapsulation de complexes enzymatiques ainsi que de composés hydrophobes. Cependant l'homme de l'art sait qu'elle reste trop agressive pour l'encapsulation de cellules. D'autre part, la nature protéique de la membrane limite considérablement les possibilités d'application thérapeutique ou d'administration, en raison des risques de réponse immunitaire. La macroencapsulation sur fibre creuse apporte de très bons résultats en terme de survie cellulaire et de stabilité in vivo (Aebischer et al, 1991, Exp. Neurol., 111, 269). Néanmoins ces techniques présentent certains inconvénients comme - une taille importante nécessitant un acte chirurgical dans le cas d'implants d'allogreffes et de xénogreffes. - une épaisseur de membrane importante qui entraîne des problèmes de diffusion et ne permet pas une réponse rapide à un stimuli physiologique. La sécrétion d'insuline par des îlots de Langerhans encapsulés est ainsi décalée. - une faible densité de cellules encapsulées impliquant une longueur de fibre élevée. Pour pallier à ces difficultés, certaines équipes proposent des techniques de microencapsulation utilisant des hydrogels à partir de polymères utilisés dans les fibres creuses comme l'acrylonitrile et le méthallysulfonate de sodium (FR 2696755AI), ou les photopolymères éthylène glycol multiacrylate (WO 9631199), ou des polyacrylamides. Ces dernières techniques sont encore délicates à maîtriser. De plus, elles font appel à des solvants ou à des photoinitiateurs producteurs de radicaux libres, qui entraînent tous des problèmes de toxicité. La présente invention concerne un nouveau type de microcapsule destinée à l'incorporation interne de composés fragiles et caractérisée en ce que: - la stabilité physico-chimique peut être modulée - la capsule est biocompatible et n'entraîne pas de réponse de l'organisme dans le cas où elle est implantée - la taille est contrôlable - la porosité peut être modulée Les microcapsules selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un hydrogel préparé par réticulation covalente de polymères biocompatibles choisis de préférence parmi les polysaccharides. Plus particulièrement la présente invention concerne un nouveau type de microcapsule utile notamment pour le transport de composés à usage biologique. Ces microcapsules présentent une stabilité très importante, une taille définie qui peut être modulée en fonction des applications. Elles sont aptes à l'encapsulation de molécules diverses synthétiques, hémisynthétiques, recombinantes ou naturelles, de cellules bactériennes, de levures, de cellules de mammiferes, de composés huileux, d'arômes et de poudres. Ces microcapsules peuvent être utilisées pour permettre ou accroître la solubilité et la dispersabilité aqueuse, pour assurer la protection contre les réponses du système immunitaire lors d'implants, pour faciliter la manipulation et la récupération de ferments lors de la vinification et des procédés de fermentation en général. Ces microcapsules peuvent être aussi utilisées pour obtenir une modulation des modes de libération des molécules dans le temps, pour améliorer la stabilité physico-chimique dans le temps de molécules sensibles, pour protéger les composés encapsulés contre les agressions mécaniques et thermiques, pour assurer le transport des molécules au sein de systèmes biologiques complexes eucaryotes ou procaryotes destinés à assurer des réactions chimiques, photochimiques, enzymatiques immunologiques pour des applications pharmaceutiques, cosmétologiques, de diagnostic, d'études et de recherche, de fermentation. La présente invention concerne un nouveau type de matrice polymérique biocompatible destinée à l'encapsulation de composés variés et caractérisée en ce que la phase de réticulation du polymère peut être modulée pour permettre l'incorporation interne de molécules hydrosolubles ou hydrophobes. Cette encapsulation qui a lieu de manière homogène est introduite après la première étape de réticulation du polymère et avant la gélification complète. Si ces réactions de réticulation, par exemple par l'épichlorhydrine, sont biens connues de lthomme de l'art, le procédé selon l'invention apporte une modification intéressante dans un mode de mise en oeuvre préféré en effectuant: - la dispersion du polymère dans une phase aqueuse alcaline -I'addition de l'agent réticulant, par exemple l'épicblorhydriae à la dispersion alcaline de polymeres sous agitation - après un temps de réaction autorisant la dispersion complète de l'agent réticulant et avant le début de gélification, on ajoute le composé à encapsuler en maintenant l'agitation - le milieu de réaction est alors dispersé dans une phase organique hydrophobe jusqu'a polymérisation complète des capsules On obtient ainsi après lavage, des microcapsules permettant l'encapsulation de nombreux composés. Dans un autre mode de mise en oeuvre, le milieu réactionnel contenant le produit d'encapsulation n'est pas dispersé en phase organique hydrophobe. Il est laissé au repos jusqu'à prise en masse sous forme de gel. Les microcapsules contenant le produit à encapsuler sont alors obtenues par broyage mécanique. Les microcapsules obtenues ne sont pas sphériques mais cette technique permet d'obtenir de tres petites tailles de microcapsules sans emploi de tensioactifs. Selon la présente invention, on a découvert de manière totalement inattendue que cette technique permet l'incorporation de cellules en maintenant une excellente viabilité et une fonctionnalité, à la fois pour des cellules bactériennes, des levures et des cellules de mammiferes, par exemple de glandes surrénales ou de lignées dopaminergiques Pu 12. Plus particulierement, la présente invention concerne une microcapsule caractérisée en ce qu'elle comporte dans l'ordre: - une matrice d'hydrogel à base de carbohydrates ou de polyols réticulés, hydrophile, non liquide et biocompatible - des inclusions des composés à encapsuler qui sont dispersés dans la totalité de la matrice La matrice peut être préparée par différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art. En particulier lorsqu'il s'agit d'un polysaccharide, de préférence biodégradable, linéaire ou ramifié, par exemple d'amidon et dérivés, de cellulose, de dextrane, de polysaccharides dérivés naturellement par des fonctions ioniques, par exemple le chitosan, les acides hyaluroniques, les alginates, les carraghénanes, I'hydrogel ou matrice polysaccharidique, est obtenu par réticulation, par des procédés bien connus de l'homme de l'art. Les procédés de réticulation peuvent etre effectués par l'utilisation d'agents bifonctionnels capables de réagir avec les groupements hydroxyles des polysaccharides comme l'épichlorhydrine, I'épibromohydrine ou difonctionnels comme les bis-époxydes, les dialdéhydes, les dichlorures d'acides dicarboxyliques, les diisothiocyanates, les anhydrides mixtes d'acides dicarboxyliques. La formation des microcapsules est réalisé au cours de la dernière étape du procédé. Une première variante de cette étape consiste à broyer mécaniquement de gros blocs de matrices obtenus par polymérisation en masse. La seconde consiste à réaliser la matrice sous forme de capsules par la technique de polymérisation en dispersion dans un liquide non miscible avec la phase réactionnelle. Dans la technique de dispersion, I'utilisation de tensioactifs comme le Tween ou le Span est conditionnée par la taille recherchée. La dispersion dans la phase hydrophobe est realisée par agitation en réacteur à l'aide d'une pale ou par agitation sur table d'agitation à mouvement circulaire. La stabilité physico-chimique et mécanique ainsi que la porosité de la microcapsule ainsi préparée sont fonction des conditions operatoires de réticulation comme la dilution initiale du polymère et/ou la quantité d'agent réticulant. Ces microcapsules peuvent être utilisées pour l'administration de molécules par les voies orale, per linguale, nasale, vaginale, rectale, cutanée, oculaire mais aussi pulmonaire et parentérale. Elles peuvent être aussi utilisées pour les applications topiques des tissus kératineux comme les phanères. Elles peuvent être utilisées comme agent de protection lors du stockage à long terme, sous forme seche ou humide, de molécules d'organites de cellules ou d'amas de cellules ou de fragments de tissus ou de semences ou d'embryons d'apex. Ces nouveaux véhicules de principes actifs sont capables d'encapsuler un grand nombre de composés. Des composés hydrophobes comme les huiles minérales par exemple de paraffine ou de silicone, des huiles organiques par exemple d'olive, de calendula, d'amande douce, de saumon, de foie de morue, d'onagre, des huiles essentielles, des arômes, des colorants, des poudres minérales comme le talc, le dioxide de titane, L'oxyde de zinc, des silicates, des fonds de teint, des colorants et pigments insolubles, des dispersions huileuses d'extraits végétaux, des vitamines seules ou en dispersion huileuse, des cellules par exemples des hépatocytes, des ilots de Langerhans, des cellules de pancréas, des cellules de médullo-surrénales, des cellules de lignées dopaminergiques PC 12, des cellules génétiquement modifiées, des levures par exemple saccharomyces boulardi, saccharomyces cerevisiae, des bactéries par exemple leuconostoc oenos et des molécules à activité thérapeutique. Par exemple; - les peptides et leurs dérivés, le glucagon, la somatostatine, la calcitonine, I'interféron et les interleukines, la LHRH, I'erythropoietine, les antagonistes de la bradykinine, les polypeptides ainsi que les recombinants issus des biotechnologies - les anticorps - les protéoglycanes - Les anticancéreux - les antibiotiques - les antiviraux, en particulier les analogues d'oligonucléotides et les inhibiteurs de la transcriptase inverse - les antiprotéases - les insecticides et antifongiques - les oligonucléotides - les anesthésiques et anesthésiques locaux comme la benzocaine - les vasoconstricteurs - les cardiotoniques comme la digitoxine et la digitaline et ses dérivés - les vasodilatateurs - les diurétiques et antidiurétiques - les prostaglandines - les neuroleptiques - les antidépresseurs - les hormones et dérivés - les anti-inflammatoires stéroîdiens et non stérofdiens - les antihistaminiques - les agents anti-allergiques - les antiseptiques - les agents de diagnostic - les acides aminés et sels minéraux - les enzymes - les molécules à activité d'absorption des rayonnement U.V. La plupart des molécules à activité biologique peut être incorporée directement en mélange ou en dispersion huileuse. Les domaines d'utilisation de ces capsules innovantes sont très étendus aussi bien pour les applications pharmaceutiques, cosmétiques et d'hygiène, que biotechnologiques et agro-alimentaires. On comprendra mieux la présente invention et ses nombreux avantages en se référant aux exemples particuliers suivants, donnés à titre d'exemple et qui ne sauraient en aucune façon limiter la dite invention. Toutes les parties indiquées dans les exemples sont des parties en volume et tous les pourcentages sont des pourcentages en poids. Exemples Exernple I selon l'invention . Prparation de microcansules d'huile de Silicone de 400 microns Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grumes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute I ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 20 grammes d'huile de Silicone Hüls. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 8 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est disperse sous agitation à 100 tours/min dans 200 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCI 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules d'huile de silicone de 400 microns Exemple 2 selon l'invention. Préparation de microcapsules de propionate de vitamine A de 40 microns Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute I ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 20 grammes de propionate de vitamine A. Le mélange est dispersé a 100 tours/min pendant 8 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est mélangé à 200 mg de Tween 80 et dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 200 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCI 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules d'ester de vitamine A de 40 microns Exemple 3 selon l'invention . Preparation de microcapsutes de mélange vitamine E/vitamme Clhulle d'amande douce Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de vitamine C finement dispersée dans 18 ml de mélange huile d'amande douce contenant 10% de vitamine E en poids. Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 1,1 ml d'epichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute le mélange huileux de vitamines. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 8 minutes puis laissé au repos pendant 3 heures. Le gel obtenu contenant des inclusions du mélange de vitamines, est broyé grossièrement, repris dans 200 ml d'eau et neutralisé par HCI 2N. Le broyât est ensuite homogénéisé à l'aide d'une turbine à 1000 tours/min jusqu'à obtenir des microcapsules de 20 microns. Les microcapsules de vitamines sont ensuite lavées à l'eau par centrifugation. Exemple 4 selon l'inventlon . Préparation de microcapsules de mélange de poudres de dioxide de titane et de silicate de magnésium Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de dioxyde de titane et I gramme de silicate de magnésium finement dispersée dans 20 ml d'eau Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un systeme Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogène on ajoute 1,1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute le mélange de dioxyde de titane et de silicate de magnésium. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 8 minutes puis laissé au repos pendant 3 heures. Le gel obtenu contenant des inclusions du mélange d'oxyde de titane et de silicate de magnésium, est broyé grossièrement, repris dans 200 ml d'eau et neutralisé par HCI 2N. Le broyât est ensuite homogénéisé à l'aide d'une turbine à 1000 tours/min jusqu'à obtenir des microcapsules de 20 microns. Les microcapsules de sont ensuite lavées à l'eau par centrifugation. Exemple 5 selon I invention . Préparation de microcapsules de mélange de poudres de dioxyde de titane et d'oxyde de zinc Dans un bêcher de 150 ml, on disperse finement par extrusion à l'aide d'une seringue, 2 grammes de dioxyde de titane et I gramme d'oxyde de zinc finement dispersée dans 20 ml d'eau Dans un becher de 500 ml, on disperse 20 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 52 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une pale, on ajoute 8 ml de solution NaOH 8N. Lorsque la solution est homogene on ajoute 1,1 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute le mélange de dioxyde de titane et d'oxyde de zinc. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 8 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 200 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures. Les capsules sont réc d'une hélice tripale en inox de 200 mm de diametre dans 15 litres d'huile de paraffine épaisse Giffrer contenant 15 grammes de tween. L'émulsion est maintenue dispersée par agitation lente à l'aide d'une pale de type ancre à une vitesse comprise entre 30 et 50 tours/min. Après 3 heures d'agitation les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 16 litres d'eau et neutralisées par HCI 2N. Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 8 litres d'eau. On obtient des capsules d'huile essentielle de 40 microns. Exemple 8 selon l'invention . Préparation de cellules de medullo-surrénales de veau encapsulées Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 10 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un systeme Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 2,5 ml de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,980 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension de cellules de médullosurrénales en milieu de culture DMEM. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 "C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml de milieu de culture. Les microcapsules sont ensuite lavées par décantation avec 200 ml de milieu jusqu'à neutralisation. On obtient des capsules de 250 microns contenant les cellules. Exemple 9 selon l'invention. Preparation de levures saccharomyces Boulardn encapsulees Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 10 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 2,5 ml de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de levures. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 "C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCI 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 200 à 400 microns contenant les levures. Exemple 10 selon l'invention . Prenaration de bactenes Leuconostoc Oenos encapsulées Dans un bêcher de 500 mi, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 7,5 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation a 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 2,5 ml de solution NaOH 4N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,25 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 tours/min, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de bactéries. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfin il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine épaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 OC. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCI 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 200 9 400 microns contenant les bactéries. Exemple 11 selon l'invention . Preparation de capsules à laree Dores contenant leuconostoc oenos Dans un bêcher de 500 ml, on disperse 5 grammes d'amidon de poids moléculaire de 10 000 dans 15 ml d'eau. Après 3 heures d'agitation à 50 tours/min à l'aide d'un système Heidolph RZR muni d'une hélice bipale, on ajoute 3,5 ml de solution NaOH 6N. Lorsque la solution est homogène, on ajoute 0,75 ml d'épichlorhydrine puis après 15 minutes d'agitation à 65 toursimin, on ajoute 2 ml de suspension épaisse de bactéries. Le mélange est dispersé à 100 tours/min pendant 3 minutes puis laissé au repos 5 minutes. Enfm il est dispersé sous agitation à 100 tours/min dans 150 ml d'huile de paraffine epaisse Giffrer, puis placé sous agitation lente sur une table d'agitation circulaire d'orbite 40 mm à 145 tours/min pendant 3 heures à 36 "C. Les capsules sont récupérées par décantation puis reprises par 200 ml d'eau et neutralisées par HCI 2N . Les microcapsules sont ensuite lavées 3 fois par décantation avec 200 ml d'eau. On obtient des capsules de 400 microns contenant les bactéries et caractérisées par une grande porosité proche de 500 000 daltons permettant le passage de nutriments et des produits de fermentation. Revendicatlons I Microcapsules caractérisées en ce qu'elles sont constituées par un hydrogel de polysaccharide réticulé par des liaisons covalentes et dans lequel sont dispersées des inclusions de produits encapsulés 2 - Procédé de fabrication des capsules selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes a) - la dispersion du polymère dans une phase aqueuse alcaline b) -I'addition de l'agent réticulant, par exemple l'épichlorhydrîne à la dispersion alcaline de polymères sous agitation c) - I'addition du composé à encapsuler sous agitation, après un temps de réaction autorisant la dispersion complète de l'agent réticulant et avant le début de gélification d) - la réticulation complète et dispersion du polymère conduisant å la formation des capsules e) - récupération des capsules par décantation ou filtration sont neutralisées et lavées par l'eau 3 - Procédé selon la revendications 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'étape d) en laissant au repos le milieu de réaction pendant 3 heures jusqu'à réticulation complète et prise en masse sous forme de gel qui est ensuite neutralisé et broyé mécaniquement pour former les microcapsules contenant le produit à encapsuler. 4 - Procéde selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on réalise l'étape d) en dispersant le milieu de réaction sous forme de gouttelettes dans une phase organique hydrophobe sous agitation jusqu'à réticulation complète des capsules. 5 Procédé selon la revendications 4, caractérise en ce que la phase hydrophobe est une huile de paraffine épaisse 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications de 2 à 5, caractérisé en ce que le polymère est un amidon de poids moléculaire de 10 000. 7 - Procéde selon l'une quelconque des revendications de 2 à 6, caractérisé en ce qu'on introduit à la solution de polymere un ou plusieurs composés à encapsuler, à l'état de poudre, de solution, de suspension, d'émulsion. 8 - Capsule selon la revendication I ou telle qu'obtenue par les procédés selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le ou les composés encapsulés sont des substances d'intérêt biologique, alimentaire, cosmétique, thérapeutique. 9 - Capsule selon les revendications 8, caractérisé en ce que le ou les composés encapsulés sont des substances choisies parmi: - les anticorps - les protéoglycanes - Les anticancéreux - les antibiotiques - les antiviraux, en particulier les analogues d'oiigonucléotides et les inhibiteurs de la transcriptase inverse - les antiprotéases - les insecticides et antifongiques - les oligonucléotides, ADN et éléments de génome - les anesthésiques et anesthésiques locaux comme la benzocaïne - les vasoconstricteurs - les cardiotoniques comme la digitoxine et la digitaline et ses dérivés - les vasodilatateurs - les diurétiques et antidiurétiques - les prostaglandines - les neuroleptiques - les antidépresseurs - les hormones et dérivés - anti-inflammatoire stéroîdiens et non stéroïdiens - les antihistaminiques - les agents anti-allergiques - les antiseptiques - les agents de diagnostic - les vitamines - les acides aminés et sels minéraux - les enzymes - les hydroxyacides et les Huiles essentielles - les molécules à activité d'absorption des rayonnement U.V. ou d'hydratation de l'épiderme 10- Capsule selon la revendication 8 caractérisée en ce que les composés encapsulés sont des levures, des bactéries, des cellules de mammifères, des apex végétaux. Il - Capsule selon la revendication 10, caractérisée en ce que les cellules sont choisies parmi des hépatocytes, des îlots de Langerhans, des cellules de pancréas, des cellules de médullo-surrénales, des cellules de lignées dopaminergiques PC12, des cellules génétiquement modifiées et caractérisée en ce que la capsule est implantable et l'hydrogel réticulé la formant est perméable à l'insuline, aux nutriments nécessaires aux cellules, à la dopamine, aux metenképhalines, aux produits du métabolisme des hépatocytes et imperméable aux éléments cellulaires et moléculaires du système immunitaire. 12 - Capsule selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou telle qu'obtenue par les procédés selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la substance encapsulée est une phase huileuse contenant une ou plusieurs substance d'intérêt biologique, alimentaire, cosmétique, thérapeutique, à l'état de solution, de dispersion ou d'émulsion.