Brevet FR2763692A1 — publié le 19981127

DIAGNOSTIC IN VITRO DES ENCEPHALOPATHIES SUBAIGUES SPONGIFORMES TRANSMISSIBLES, PAR DOSAGE DE METABOLITES DU CORTI SOL. L'invention est relative à une méthode de diagnostic non-invasive des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST). Les ESST constituent à l'heure actuelle un problème majeur de santé publique. Afin de prévenir leur développement il est en particulier nécessaire de disposer d'outils permettant un diagnostic fiable, et le plus précoce possible. La tremblante du mouton est une ESST dont les symptômes cliniques sont connus de longue date, et qui a fait l'objet de nombreux travaux ; à ce titre, elle peut être considérée comme un modèle pour l'étude des ESST. La tremblante se manifeste par une longue période d'incubation asymptomatique, suivie d'une phase clinique de courte durée, où se manifestent les symptômes d'une atteinte neurologique (altérations comportementales, prurit, atteinte de la coordination motrice). Le diagnostic précoce est extrêmement difficile à établir, car il n'est pas possible de mettre en oeuvre les méthodes immunologiques classiquement utilisées pour d'autres maladies infectieuses, du fait qu'aucune réponse immunitaire spécifique de l'agent infectieux n'a pu être mise en évidence [SCHREUDER,. Vet. Quart., 16, 174-192, (1994)]. I1 a été proposé de diagnostiquer les ESST par la détection électrophysiologique des modifications fonctionnelles qu'elles induisent dans le système nerveux central [COURT and BERT, Pathol. Biol. 43, 25-42, (1995)] ; cependant cette approche n'est pas applicable pour un diagnostic de routine. Les Inventeurs ont recherché une approche différente du diagnostic des ESST, et ont choisi d'étudier la possibilité de détecter des altérations éventuelles des fonctions neuroendocrines. Quelques observations faites antérieurement permettent en effet de supposer l'existence de telles altérations ; KIM et al. [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 189, 21-27, (1988)] ont observé une prise de poids chez la souris en phase préclinique de tremblante, et ont émis l'hypothèse qu'elle pourrait être due à l'effet de la maladie sur les surrénales, par l'intermédiaire de 1'ACTH dont la sécrétion par l'hypophyse est influencée par l'hypothalamus. Chez des hamsters infectés par la tremblante, CARP et al. [J Infect. Dis. 161, 462-466 (1990)], ont également observé une augmentation de la taille des surrénales, et YE et al. [Acta Neuropathol. 88, 44-54 (1994)] ont constaté une augmentation significative des neurones marqués par un anticorps anti CRF dans le noyau préoptique de l'hypothalamus. Chez l'homme, PORTALUPPI et al. [Hypertension, 23, 569-576, (1994)] ont observé une augmentation des concentrations de cortisol chez un patient atteint d'un autre type d'ESST, l'insomnie familiale fatale. Les Inventeurs ont dans un premier temps vérifié si des altérations du fonctionnement de l'axe hypothalamo-hypophysaire pouvaient être observées de manière reproductible dans les cas d'ESST, et ont plus particulièrement recherché dans ce but d'éventuelles modifications de la fonction corticosurrénalienne chez des moutons atteints de tremblante par rapport aux moutons sains. Une première étude préliminaire leur a permis de constater un niveau moyen de cortisolémie en moyenne 4 fois plus élevé dans une population de moutons atteints de tremblante, par rapport à une population témoin de moutons sains. Cependant, ils ont également constaté que cette augmentation de la cortisolémie ne se reflétait pas systématiquement au niveau individuel, le taux de cortisol pouvant varier de manière importante chez un même individu, selon les conditions de prélèvement. En effet, la sécrétion du cortisol est soumise à des fluctuations d'origine endogène (pulsatilité et rythme circadien des sécrétions) ou exogène (en particulier réponse au stress des manipulations). De ce fait, le cortisol ne répond pas aux critères de spécificité et sensibilité exigés d'un marqueur diagnostique. Les Inventeurs ont également observé une augmentation des concentrations plasmatiques de certains métabolites du cortisol, à savoir le 20ss-dihydrocortisol et la cortisone chez les moutons atteints de tremblante, et ont ainsi pu établir que ces métabolites, comme le cortisol, reflètent le niveau de l'activité corticotrope des brebis. Ils ont également constaté que la concentration de ces métabolites n'est pas soumise aux mêmes fluctuations brusques que celle du cortisol. Ces métabolites constituent donc, contrairement au cortisol, un marqueur diagnostique fiable des altérations de la fonction corticosurrénalienne, et en particulier des dysfonctionnements liés aux ESST. Les Inventeurs ont en outre constaté chez les moutons atteints de tremblante, une augmentation significative des concentrations urinaires de certains métabolites du cortisol, à savoir le 20ss-dihydrocortisol, la 20ss-dihydrocortisone et la cortisone. Le dosage de ces composés dans les urines peut donc également permettre le diagnostic de dysfonctionnements de la fonction corticosurrénalienne, en particulier de ceux liés aux ESST. La présente invention concerne donc l'utilisation d'au moins un métabolite du cortisol, choisi dans le groupe constitué par le 20ss- dihydrocortisol, la 20ss-dihydrocortisone, et la cortisone comme marqueur spécifique pour le diagnostic in vitro d'un dysfonctionnement de la fonction surrénalienne induit par une ESST. La présente invention a plus particulièrement pour objet - une méthode de diagnostic d'une ESST chez un mammifère, par la détection d'un dysfonctionnement de la fonction corticosurrénalienne induit par ladite ESST, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend la détection et/ou le dosage, dans un échantillon du sang dudit mammifère, d'au moins un métabolite du cortisol choisi dans le groupe constitué par le 20P- dihydrocortisol et la cortisone. - une méthode de diagnostic d'une ESST chez un mammifère, par la détection d'un dysfonctionnement de la fonction corticosurrénalienne induit par ladite ESST, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend la détection et/ou le dosage, dans un échantillon de l'urine dudit mammifère, d'au moins un métabolite du cortisol choisi dans le groupe constitué par le 20ss- dihydrocortisol, la 20Q-dihydrocortisone, et la cortisone. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention ledit mammifère appartient à l'espèce ovine. Dans le cadre de la mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser, pour détecter et/ou doser le 20P-dihydrocortisol, la 20ss-dihydrocortisone ou la cortisone, dans le sang ou dans l'urine, n' importe quelle technique, connue en elle-même, de détection ou de dosage des corticoïdes ; il peut s'agir en particulier de techniques chromatographiques telles que celles décrites par exemple par DODDS et al. [J. Liqu. Chromatogr.,18(9),1809-1820 (1995)], SCHONESCHOFER et al. [J. Chromatogr., 380, 267-274, (1986)], ou bien de techniques de dosage immunologique, par exemple de type ELISA ou RIA [pour revue, cf. par exemple BURTIS et ASHWOOD, TIETZ TEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTRY, édité par W.B. SAUNDERS COMPANY, 7 Edition, pp 1822-1825]. La méthode conforme à la présente invention est simple et rapide à mettre en oeuvre, peut être aisément automatisée, et est donc particulièrement bien adaptée pour un diagnostic de masse. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la mise en oeuvre de dosages plasmatiques ou urinaires du 20ss- dihydrocortisol, de la 20ss-dihydrocortisone, et de la cortisone, dans le cadre de la détection de la tremblante du mouton. EXEMPLE 1 : COMPARAISON DES SECRETIONS DE CORTICOIDES DES BREBIS SAINES ET DES BREBIS EN PHASE TERMINALE DE TREMBLANTE. Materiels et méthode Caractéristiques des animaux et critères d'inclusion L'expérimentation a été effectuée sur 5 brebis saines (groupe témoin), et 6 brebis en phase terminale de tremblante. Les caractéristiques des animaux sont indiquées dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Statut pathologique Age (ans) Nombre Poids (kg) Saines Romanov 1-5 5 50-64 Romanov Tremblante x 2-3 2 41-48 Charollaise Tremblante Romanov 2-3 4 35-48 Les brebis saines ont été incluses sur la base d'une absence de signes cliniques évocateurs de tremblante. 6 mois après l'essai, aucune des brebis considérées comme saines au moment de l'inclusion n'était atteinte de signes évocateurs de la tremblante. Le diagnostic de tremblante pour l'inclusion est fondé sur des critères cliniques (comportement anormal, ataxie, tremblements, prurit). Le diagnostic avait été établi chez ces brebis au moins 21 jours avant le début de l'expérience. La longévité des brebis cliniquement atteintes de tremblante est en moyenne de 2 à 6 mois. Les brebis qui ont participé à cet essai ont été considérées comme étant en phase terminale de tremblante. Le diagnostic clinique a été confirmé en fin d'essai après euthanasie des brebis atteintes de tremblante et examen histopathologique. Conditions d'hébergement et de nourriture Les brebis ont été habituées aux conditions expérimentales pendant 4 jours avant le début de l'expérience. Les brebis, placées dans des cages à métabolisme dans un bâtiment ouvert, ont été soumises aux variations naturelles de la durée du jour. Elles ont été nourries avec du foin à volonté et des granulés et ont eu accès libre à l'eau. A la fin de l'expérimentation les brebis du groupe tremblante ont été sacrifiées in extremis et ont subi un examen histopathologique conventionnel pour confirmer le diagnostic de tremblante. Les brebis du groupe témoin n'ont pas été euthanasiées et ont été placées en observation clinique. Prélèvements de sang Des prélèvements sanguins ont été réalisés simultanément sur l'ensemble des animaux expérimentaux au cours d'un nycthémère. Les prélèvements de sang (5 ml) ont été obtenus toutes les 30 minutes de 21 h00 à 07 h00 et toutes les heures pendant la période restante. Les prélèvements ont été effectués à l'aide d'un cathéter HEMOCATH 30, (VYGON, Paris) placé dans la veine jugulaire gauche au moins 1 heure avant le début des prélèvements sanguins. Le cathéter a été rincé avec 2 ml de sérum physiologique hépariné (10 U héparine ROCHE par ml) après chaque prélèvement. Avant chacun des prélèvements, 1 ml du contenu du cathéter a été prélevé et éliminé. Le sang a été recueilli sur héparinate de sodium (soit 250 U/5 ml) et rapidement centrifugé à 1500 g pendant 15 minutes. Le plasma a été réparti en 2 fractions aliquotes dans des tubes EPPENDORF de 1,5 ml. Dosage des corticoïdes plasma tiques Le dosage des corticoïdes plasmatiques (14 échantillons par brebis) a été réalisé par HPLC conformément à la méthode précédemment décrite par ALVINERIE et TOUTAIN [J. Pharm. Sci. 71, 816-818 (1982)] Analyse statistique Les moyennes et les écart-types ont été calculés à l'aide du logiciel EXCEL (Microsoft corporation, Richmond). Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel STATGRAPHICS (version 5, STSC lnc.,1991). Les concentrations des corticoïdes inférieures à la limite de quantification sont arbitrairement fixées à 2,5 ng/ml pour l'analyse statistique. Les résultats ont été analysés à l'aide d'une analyse de variance avec 2 facteurs fixes : l'état pathologique (témoin vs tremblante) et le temps. Le test est significatif pour un niveau de p inférieur à 0,05. Résultats Cortisol La concentration plasmatique moyenne générale pendant 24 h) de cortisol des brebis témoins est faible (8,2 + 3,4 ng/ml). L'interaction entre les facteurs fixes état pathologique et temps est significative (p Chez les brebis témoins, les concentrations les plus élevées c'est-à-dire 18,5 + 13,5 ng/ml et 35,4 + 23,4 ng/ml sont observées respectivement aux temps 08h00 et llh00 alors que les concentrations en cortisol des brebis atteintes de tremblante sont systématiquement élevées tout au long du nycthémère sans rythme circadien apparent. La concentration plasmatique moyenne générale pendant 24 h de cortisol des brebis atteintes de tremblante est 4 fois plus élevée que celle des brebis témoins (32,3 + 19,9 ng/ml vs 8,2 + 3,4 ng/ml, p Toutes les concentrations plasmatiques des brebis atteintes de tremblante sont supérieures à celles des brebis témoins, excepté au temps llh00 où les concentrations plasmatiques des brebis témoins ont présenté leurs valeurs les plus élevées. Les coefficients de variation individuels des concentrations plasmatiques en cortisol obtenues au cours d'un nycthémère varient de 72,0 à 147,5% chez les brebis témoins et de 47,7 à 73,9% chez les brebis atteintes de tremblante. 20ss-dihydrocortisol Chez les brebis témoins, exceptée une seule, les concentrations plasmatiques en 20ss-dihydrocortisol sont inférieures à la limite de quantification de la méthode analytique (5 ng/ml). A l'opposé, la plupart des concentrations plasmatiques en 20ss-dihydrocortisol des brebis atteintes de tremblante sont supérieures à 5 ng/ml, la moyenne de ces concentrations observées pour chaque brebis au cours d'un nycthémère variant de 3,6 à 27,5 ng/ml, Chez toutes les brebis atteintes de tremblante, les concentrations en 20ss-dihydrocortisol sont élevées pendant les premières heures de la matinée (5h30-6h00), la concentration générale moyenne étant de 11,7 + 10,5 ng/ml. La concentration plasmatique moyenne générale pendant 24 h) de 2Oss-dihydrocortisol des brebis atteintes de tremblante est supérieure à celle des brebis témoins (10,4 + 8,9 ng/ml vs 2,6 + 0,2 ng/ml, p Les coefficients de variation individuels des concentrations plasmatiques en 20ss-dihydrocortisol obtenues au cours d'un nycthémère ont varié de 0 à 46,8% chez les brebis témoins et de 31,1 à 63,1% chez les brebis atteintes de tremblante. D'autre part, il apparaît que les concentrations en 20ss-dihydrocortisol et en cortisone ne pas soumises aux mêmes variations que les concentrations en cortisol, et sont, globalement et au niveau individuel, systématiquement plus élevés chez les animaux atteints de tremblante. Cortisone La cortisone n'est jamais quantifiable chez les brebis témoins (limite de quantification de 5 ng/ml). A l'opposé, la cortisone est quantifiée chez l'ensemble des brebis atteintes de tremblante dans au moins 3 échantillons collectés au cours du nycthémère. La concentration moyenne globale (24 heures) en cortisone des brebis atteintes de tremblante est de 5,0 + 1,6 ng/ml. 2013- dihydrocorti sone Ce métabolite du cortisol n'a été détecté, ni chez les brebis témoins, ni chez les brebis atteintes de tremblante. Discussion Les résultats ci-dessus montrent que les concentrations plasmatiques en cortisol, 20P- dihydrocortisol, ou cortisone des brebis atteintes de tremblante sont en moyenne 4 fois supérieure à celles des brebis témoins. Les concentrations plasmatiques en cortisol des brebis témoins correspondent aux valeurs physiologiques classiquement observées chez cette espèce. Chez les brebis témoins, l'augmentation des cortisolémies aux temps 08h00 et llh00 s'explique par l'effet conjugué de la prise de nourriture et du rythme nycthéméral de sécrétion de cortisol. A l'opposé, chez les brebis atteintes de tremblante, les concentrations en cortisol sont systématiquement élevées tout au long du nycthémère sans rythme circadien apparent. L'augmentation des cortisolémies chez ces brebis traduit un hypercorticisme confirmé par l'examen anatomo-pathologique qui fait apparaître une hypertrophie de la zone fasciculée des glandes surrénaliennes des brebis atteintes de tremblante. EXEMPLE 2 : COMPARAISON DES SECRETIONS DE CORTICOIDES DES BREBIS SAINES ET DES BREBIS ATTEINTES DE TREMBLANTE A DIFFERENTS STADES DE LA MALADIE. Materiels et methodes Animaux Caractéristiques: L'expérimentation a été effectuée avec un effectif initial de 7 brebis saines (groupe témoin), et 7 brebis atteintes de tremblante. L'effectif du groupe témoin est resté constant tout au long de l'essai alors que l'effectif du groupe tremblante a diminué au fur et à mesure des euthanasies. Les caractéristiques des animaux sont indiquées dans le tableau II ci-dessous. TABLEAU II Statut Race Age (ans) Nombre Poids (kg) pathologique Saines Romanov 1-5 5 50-64 Saines Lacaune 2 2 64-65 Tremblante Manech 1-5 4 35-55 Tremblante ~ Romanov 14 1-4 3 32-37 Critères d'inclusion Les brebis saines ont été incluses selon les critères indiqués à l'exemple 1 ci-dessus. Les brebis atteintes de tremblante ont été incluses sur la base de l'apparition des symptômes décrits à l'exemple 1 cidessus, au moins 10 jours avant le début de l'expérience. Conditions expérimentales: Les conditions d'hébergement et de nourriture des brebis sont identiques à celles indiquées à l'exemple 1 ci-dessus ; les brebis atteintes de tremblante ont été euthanasiées in extremis ou bien à la fin de l'expérience, i.e. après 5 périodes de prélèvement. Prélèvements de sang Des prélèvements sanguins, effectués comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus, ont été simultanément réalisés sur l'ensemble des animaux pendant 5 périodes séparées d'au moins une semaine. Au cours de chacune des périodes, des prélèvements sanguins ont été obtenus à 10h00, 13h00 et 17h00, puis toutes les 2 heures de 20h00 à 08h00. Prélèvements d'urines Des prélèvements ponctuels d'urines ont été réalisés environ tous les 10-12 jours. Les brebis ont été sondées avec une sonde de Foley charrière 12 siliconée et stérile (RÜSCH, 23 Av. des Prés, BP68, 94268 Fresnes cedex, France). L'heure du prélèvement d'urines ainsi que des observations sur les conditions de réalisation du prélèvement ont été notés. L'urine collectée a été divisée en fractions aliquotes de 30 ml conservées à -200C jusqu'au moment de la réalisation des dosages. Le calendrier de ces prélèvements, et le nombre de brebis témoins et atteintes de tremblante concernées par chacune de ces interventions est indiqué dans les tableaux III et IV ci-dessous. TABLEAU III : Prélèvements sanguins NO période 1 2 3 4 5 Témoins 7 7 7 7 7 Tremblante 7 6 4 3 2 TABLEAU VI :Prélèvements urinaires N prélèvement i 2 | 3 | 4 5 6 Témoins 2 3 4 6 5 2 Tremblante 7 6 5 6 3 2 Dosage des corticoïdes plasma tiques et urinaires et analyse des résultats Le dosage des corticoïdes a été effectué par HPLC, et les résultats analysés comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Résultats Corticoides plasmatiques Les concentrations en corticoïdes des périodes 1 et 4 ont été analysées. Coati sol Le tableau V ci-dessous donne les concentrations plasmatiques moyennes générales pendant 24 h en cortisol (ng/ml) observées au cours des périodes 1 et 4, pour les brebis témoins et les brebis atteintes de tremblante. TABLEAU V Période I 4 Cortisol Témoins Tremblante Témoins Tremblante n 7 7 7 3 Moyenne+SD 13,2+6,5 21,7+14,4 3,7+1,1 21,37,3 n représente le nombre de brebis pour chacune des catégories. Les concentrations plasmatiques en cortisol des brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (p L'interaction entre les facteurs état pathologique (saine vs tremblante) et période est significative (p 2013- dihydrocorti sol Le tableau VI ci-dessous donne les concentrations plasmatiques moyennes générales pendant 24 h en 20ss-dihydrocortisol (ng/ml) observées au cours des périodes 1 et 4, pour les brebis témoins et les brebis atteintes de tremblante. TABLEAU VI Période I 4 20ss-dihydrocortisol Témoins Ternblle Témoins Tremblante n 7 7 7 3 Moyenne+SD 3,2+1 ,3 8,3t6,9 1 ,3+0,4 7,7+2,2 n représente le nombre de brebis pour chacune des catégories Les concentrations plasmatiques en 20ss- dihydrocortisol des brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (p Cortisone Le tableau VII ci-dessous donne les concentrations plasmatiques moyennes générales (pendant 24 h) en cortisone (ng/ml) observées au cours des périodes 1 et 4, pour les brebis témoins et les brebis atteintes de tremblante. TABLEAU VII Période I 4 Cortisone Témoins Tremblante Témoins Tremblante n 7 7 7 3 Moyenne+SD 3,2+6,5 10,5+7,1 1 ,2+0,2 5,1+1 n represente le nombre de brebis pour chacune des categories Les concentrations plasmatiques en cortisone des brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (p L'interaction entre les facteurs état pathologique (saine vs tremblante) et période est significative (p Ce métabolite n'est détecté ni dans le plasma des brebis témoins, ni dans celui des brebis atteintes de tremblante. Corticoîdes urinaires Les prélèvements urinaires obtenus 3 jours avant la période 1, ou 2 et 6 jours après la période 1 ont été analysés. Le tableau VIII ci-dessous donne les concentrations urinaires en corticoïdes (cortisol, 20ss- dihydrocortisol, 20ss-dihydrocortisone et cortisone) obtenues au cours de ces périodes. TABLEAU VIII Brebis Etat physio- Cortisol 20ss-dihydro- 20p-dihydro- Cortisone pathologiqu cortisol cortisone e 1 témoin 2 témoin 3 témoin 23 70 26 4 témoin 35 20 5 témoin Moyenne* 33,0 21,2 Ecart-type 21,7 2,7 1 Tremblante 62 166 70 51 2 Tremblante 50 168 59 10 3 Tremblante 47 160 48 22 4 Tremblante 57 83 33 LOQ 5 Tremblante 56 34 24 57 6 Tremblante 61 120 38 53 Moyenne * 55,5 121,8 45,3 37,2 Ecart-type 6,0 54,3 17,1 18,2 *Les moyennes ont été calculées lorsque deux brebis au moins ont des concentrations urinaires en corticoides supérieures à la limite de quantification (LOQ = 20 ng/ml). Pour ce calcul, les concentrations inférieures au LOQ sont fixées à 20 ng/ml. Corti sol Les concentrations urinaires en cortisol de 4 brebis témoins sont inférieures à 20 ng/ml, la concentration urinaire de la 5ème brebis témoin étant de 23 ng/ml. Les concentrations urinaires moyennes en cortisol des brebis atteintes de tremblante sont de 55,5 + 6,0 ng/ml. Ces concentrations sont supérieures à celles des brebis témoins (p 2013- dihydrocorti sol Les concentrations urinaires moyennes en 20ss- dihydrocortisol des brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (121,8 + 54,3 ng/ml vs 33,0 + 21,7 ng/ml, p Cortisone La cortisone n'a pas pu être quantifiée chez les brebis témoins, la concentration étant inférieure à la limite de quantification (5 ng/ml). A l'opposé, la cortisone est quantifiée chez 5/6 brebis atteintes de tremblante, la concentration moyenne en cortisone des brebis atteintes de tremblante étant de 38,6 + 21,2 ng/ml. 20ss-dihydrocortisone Les concentrations urinaires moyennes en 20ss- dihydrocortisone des brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (45,3 i 17,1 ng/ml vs 21,2 + 2,7 ng/ml, p Discussion Les résultats ci-dessus montrent que les concentrations plasmatiques en cortisol, 20ss- dihydrocortisol, et cortisone des brebis atteintes de tremblante sont en moyenne 2 à 6 fois supérieures à celles des brebis témoins, et que les concentrations urinaires en cortisol, 20ss-dihydrocortisol, 20ss- dihydrocortisone et cortisone des brebis atteintes de tremblante sont également supérieures à celles des brebis témoins. Cette différence est observée dès les premières séances de prélèvement sanguin et urinaire, i.e. dès le début de la phase clinique, il apparaît donc que la réponse surrénalienne n'est pas liée à une simple déchéance premortem, c'est-à-dire une situation non spécifique, mais à la pathogénie même de la tremblante. L'amplitude des variations des concentrations en corticoïdes plasmatiques observées entre les brebis témoins et les brebis atteintes de tremblante au cours de la première période est faible comparée à celle observée au cours de la période 4. Cette faible amplitude des différences de concentrations résulte du niveau anormalement élevé des concentrations en corticoïdes chez les brebis témoins au cours de la première période. Ces concentrations obtenues chez les brebis témoins retournent à des valeurs physiologiques (i.e. inférieures à 15 ng/ml) au cours de la quatrième période. Ceci pourrait traduire un effet de stress lié aux procédures expérimentales (mise en cage, prélèvements). Cet effet serait aboli au cours de la quatrième période en raison de l'habituation des animaux aux conditions expérimentales. En revanche, chez les brebis atteintes de tremblante, les concentrations plasmatiques moyennes en corticoïdes observées au cours de la première période sont du même ordre de grandeur que celles observées au cours de la quatrième période. En revanche, les concentrations urinaires en corticoïdes, déterminées dans un intervalle de temps qui inclut la première période, sont faibles (inférieures ou de même ordre de grandeur que la limite de quantification) dans le cas des brebis témoins, alors que ces corticoides sont nettement au dessus de la limite de quantification quantifiés dans tous les échantillons d'urine des brebis atteintes de tremblante. Cela signifie que les concentrations urinaires en corticoïdes représentent une meilleure robustesse (c'est-à-dire sont moins influençables) que les concentrations plasmatiques vis-à-vis d'un stress ponctuel. EXEMPLE 3 : CONFIRMATION DE L'ORIGINE HYPOTHALAMO HYPOPHYSAIRE DE L'HYPERCORTICISME ASSOCIE A LA TREMBLANTE Afin de déterminer si le syndrome d'hypercorticisme associé à la tremblante résultait d'une atteinte des systèmes neuronaux hypothalamiques contrôlant les sécrétions d'ACTH, ou bien d'une hyperactivité sécrétoire autonome des corticosurrénales, une exploration fonctionnelle dynamique de la glande surrénale a été effectuée. Cette étude a été réalisée sur les mêmes brebis (saines ou atteintes de tremblante) que celles utilisées à l'exemple 2 ci-dessus. Les conditions d'hébergement et de nourriture ainsi que les conditions de prélèvement de sang et de dosage des corticoïdes sont identiques à celles décrites dans l'exemple 2. Administration de dexaméthasone et de tétracosactide Après un prélèvement sanguin contrôle, les brebis ont reçu une injection intraveineuse de dexaméthasone (CORTHAMETHASONE&commat;, VETOQUINOL, Lure, France). Des prélèvements sanguins ont été effectués 3, 4 et 6 heures après cette première administration. Immédiatement après le dernier prélèvement (+6 h), les brebis ont reçu une injection intraveineuse de tétracosactide (ACTH) (SYNACTHENEs immédiat, CIBA GEIGY). Des prélèvements sanguins ont ensuite été réalisés toutes les 30 minutes pendant les 90 minutes qui ont suivi cette deuxième administration. Les administrations intraveineuses de dexaméthasone et de tétracosactide ont été réalisées à l'aide d'un cathéter (HEMOCATH 30, VYGON, Paris) placé dans la veine jugulaire gauche au moins une heure avant le début des prélèvements sanguins. Un volume de 0,4 ml (0,4 mg) de dexaméthasone, correspondant à une dose de l'ordre de 0,01 mg/kg, a été administré à l'aide d'une seringue de 1 ml. Un volume de 1 ml d'ACTH (0,25 mg) correspondant à une dose de l'ordre de 0,005 mg/kg, a été administré à l'aide d'une seringue de 1 ml. Le cathéter a été rincé 3 fois avec 5 ml du sang prélevé puis avec 5 ml de sérum physiologique après chacune des administrations. Analyse statistique Les moyennes et les écart-types ont été calculés et les analyses statistiques réalisées à l'aide du logiciel EXCEL (Microsoft corporation, Richmond). Les concentrations des corticoïdes inférieures à la limite de quantification sont arbitrairement fixées à 0,5 ng/ml pour l'analyse statistique. Les concentrations plasmatiques moyennes en corticoïdes des brebis témoins et des brebis atteintes de tremblante ont été comparées à l'aide d'un test de Aspin-Welch. Un niveau de p inférieur à 0,05 atteste la signification du test. Résultats Le tableau IX ci-dessous donne les concentrations plasmatiques (ng/ml) moyennes (+SD) en cortisol, 20ss-dihydrocortisol, et cortisone, observées avant l'administration de dexaméthasone (DEX), pendant les 6 heures qui suivent cette administration, et au cours des 90 minutes suivant l'administration consécutive de tétracosactide (ACTH). TABLEAU IX Témoins Tremblante Contrôle DEX ACTH Contrôle DEX ACTH Cortisol 3,7+2,4 0,5+0,0 69,2+7,9 11,6+8,5 4,5+2,2 1 26,9t1 8,9 20ss- dihydro- 1,8+1,7 0,5+0,0 13,4+7,4 5,2+6,0 1,5+0,9 43,6+17,2 cortisol Cortisone 1,1#0,7 0,5+0,0 5,7s0,9 4,7+2,6 1,6+0,4 13,0+2,7 Cortisol Les concentrations plasmatiques moyennes en cortisol observées avant l'administration de dexaméthasone (prélèvement contrôle) chez les brebis atteintes de tremblante ne sont significativement supérieures à celles des brebis témoins p L'administration de dexaméthasone a abaissé les concentrations plasmatiques en cortisol au-dessous de la limite de quantification, 4 heures après l'administration; cela a été observé chez toutes les brebis, à l'exception d'une brebis atteinte de tremblante, dont les taux plasmatiques moyens observés après l'administration ont représenté 76% de la concentration plasmatique basale. L'administration de tétracosactide a augmenté les concentrations plasmatiques de cortisol. Les concentrations plasmatiques moyennes en cortisol des brebis atteintes de tremblante, obtenues après l'administration de tétracosactide, n'ont pas été significativement différentes de celles des brebis témoins. 20/3-dihydrocortisol Les concentrations plasmatiques moyennes en 20ss-dihydrocortisol observées avant l'administration de dexaméthasone (prélèvement contrôle) chez les brebis atteintes de tremblante ne sont pas significativement différentes de celles des brebis témoins. L'administration de dexaméthasone a abaissé les concentrations plasmatiques en 20ss-dihydrocortisol audessous de la limite de quantification, 4 heures après l'administration, chez toutes les brebis. L'administration de tétracosactide a augmenté les concentrations plasmatiques de 20B-dihydrocortisol. Les concentrations plasmatiques moyennes en 20ss- dihydrocortisol des brebis atteintes de tremblante, obtenues après l'administration de tétracosactide, ne sont pas significativement différentes de celles des brebis témoins. Cortisone Les concentrations plasmatiques moyennes en cortisone observées avant l'administration de dexaméthasone (prélèvement contrôle) chez les brebis atteintes de tremblante sont significativement supérieures à celles des brebis témoins (p L'administration de dexaméthasone a abaissé les concentrations plasmatiques en cortisone au dessous de la limite de quantification, 3 heures après l'administration; cela a été observé chez toutes les brebis, à l'exception de l'une des brebis atteintes de tremblante, dont les taux plasmatiques moyens observés après l'administration ont représenté 81% de la concentration plasmatique basale. L'administration de tétracosactide a augmenté les concentrations plasmatiques de cortisone. Les concentrations plasmatiques moyennes en cortisone des brebis atteintes de tremblante, obtenues après l'administration de tétracosactide, sont significativement supérieures à celles des brebis témoins p Discussion * Les résultats ci-dessus montrent que l'administration d'une faible dose de dexaméthasone (de l'ordre de 0,01 mg/kg) abaisse fortement les sécrétions de corticoides des brebis atteintes de tremblante comme celles des brebis témoins. Ceci permet de conclure que l'hypercorticisme n'a pas une origine surrénalienne mais centrale. D'autre part, la capacité à supprimer la sécrétion de cortisol avec une faible dose de dexaméthasone (0,01 mg/kg) suggère que les cellules qui sécrètent de façon excessive de l'ACTH sont normales en terme de sensibilité au rétrocontrôle par les corticoïdes. On peut donc supposer que l'hypercorticisme des brebis atteintes de tremblante est d'origine hypothalamique (ou suprahypothalamique). * L'administration de tétracosactide a induit une augmentation des concentrations plasmatiques en corticoïdes. Les concentrations plasmatiques moyennes en cortisone des brebis atteintes de tremblante, observées après l'administration de tétracosactide sont 2 fois plus élevées que celles des brebis témoins. Cela montre une hyperplasie de la glande surrénale (vérifiée d'autre part par les examens anatomopathologiques) qui serait la conséquence d'une hypersécrétion chronique de ACTH. En effet, l'ACTH a des effets trophiques sur la glande surrénale et elle augmente l'équipement enzymatique responsable de la biosynthèse de cortisol. * Le fait que la cortisone semble avoir davantage augmenté que le 20ss-dihydrocortisol pourrait en outre s'expliquer par une modification du schéma métabolique du cortisol. En conclusion, l'ensemble des expérimentations décrites dans les exemples ci-dessus confirme l'existence d'un syndrome d'hypercorticisme des brebis atteintes de tremblante, démontre que ce syndrome a une origine centrale (probablement hypothalamique), et qu'il peut être spécifiquement détecté par dosage sanguin et/ou urinaire de métabolites primaires du cortisol. REVENDICATIONS 1) Utilisation d'au moins un métabolite du cortisol, choisi dans le groupe constitué par le 20ss- dihydrocortisol, la 20ss-dihydrocortisone, et la cortisone comme marqueur spécifique pour le diagnostic in vitro d'un dysfonctionnement de la fonction corticosurrénalienne induit par une encéphalopathie subaiguë spongiforme transmissible (ESST). 2) Méthode de diagnostic d'une ESST chez un mammifère, par la détection d'un dysfonctionnement de la fonction corticosurrénalienne induit par ladite ESST, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend la détection et/ou le dosage, dans un échantillon du sang dudit mammifère, d'au moins un métabolite du cortisol choisi dans le groupe constitué par le 20ss- dihydrocortisol et la cortisone. 3) Méthode de diagnostic d'une ESST chez un mammifère, par la détection d'un dysfonctionnement de la fonction corticosurrénalienne induit par ladite ESST, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend la détection et/ou le dosage, dans un échantillon de l'urine dudit mammifère, d'au moins un métabolite du cortisol choisi dans le groupe constitué par le 20ss- dihydrocortisol, la 20ss-dihydrocortisone, et la cortisone. 4) Méthode de diagnostic selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que ledit mammifère appartient à l'espèce ovine.