Brevet FR2771741A1 — publié le 19990604

La présente invention a trait à des nouveaux variants d'épissage du récepteur sérotoninergique 5-HT4 chez l'homme. La sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) est un neurotransmetteur localisé dans le système nerveux central et périphérique des vertébrés où il exerce différents rôles physiologiques médiés par des sous-types distincts de récepteur (Saxena, 1995). Les récepteurs 5-HT4 représentent un membre de la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires (7TM) couplés à une protéine G qui est positivement couplée à ladénylate cyclase (Hedge et Eglen, 1996). Les récepteurs 5-HT4 sont exprimés dans une large variété de tissus incluant le cerveau humain et le cerveau des rongeurs (Eglen et al., 1995), le tractus gastro-intestinal d'humain, de chien, de porc et de rongeur, le coeur de porc et d'humain (Hedge et Eglen, 1996). Dans le cerveau de mammifère, les récepteurs 5-HT4 contribuent à la sécrétion de dopamine (Bonhomme et al., 1995) et régulent l'apprentissage et la mémoire à long terme par le biais de la modulation de a libération d'acétylcholine (Marchetti-Gauthier et al., 1997). Dans les tissus périphériques, les récepteurs 5-HT4 se sont avérés réguler la motilité du tractus gastro-intestinal, la sécrétion électrolytique intestinale, la sécrétion surrénale de corticostéroïdes, la contraction de la vessie et la contractilité de l'oreillette (Edge et Eglen, 1996). Les récepteurs 5-HT4 sont impliqués dans une large variété de désordres centraux et périphériques incluant les arythmies cardiaques (Kaumann, 1994) et les désordres neuro-dégénératifs (Reynolds et al., 1996; Wong et al., 1996). De plus, le développement d'agonistes et d'antagonistes des récepteurs 5-HT4 peut avoir des applications thérapeutiques dans le système nerveux central pour le traitement de désordres neuro-psychiatriques associés à un dysfonctionnement du système dopaminergique central tel que la maladie de Parkinson (Bonhomme et al., 1995) ou le traitement de déficiences mnésiques tels que présentées chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Marchetti-Gauthier et al., 1997). De tels médicaments pourraient aussi être utiles dans le traitement de désordres périphériques tels que le syndrome du colon irritable, la gastroparésie, l'incontinence urinaire et les arythmies cardiaques (Hedge et Eglen, 1996). Les récepteurs 5-HT4 présentent une pharmacologie unique qui est clairement différente de celle des autres membres de la famille des récepteurs 5-HT (Ford et Clarke, 1993). La plupart des études pharmacologiques et transductionnelles sur les récepteurs 5-HT4 ont été réalisées sur le système nerveux central et le tractus gastro-intestinal de rongeurs et chez les coeurs porcin et humain (Eglen et al., 1995 ; Hedge et Eglen, 1996). Bien que la pharmacologie des récepteurs 5-HT4 présents dans ces préparations soit très similaire, des différences inexpliquées existent. Ainsi, les benzamides, tels le renzapride et le cisapride, se comportent comme des agonistes puissants et entiers des récepteurs 5-HT4 dans les neurones des colliculi de la souris mais sont des agonistes moins puissants et seulement partiels dans le coeur humain (Ford et Clarke, 1993 ; Hoyer et al., 1994) et le muscle détruseur isolé à partir de la vessie humaine (Ford et Clarke, 1993 Hoyer et al., 1994 ; Candura et al., 1996). La 5méthoxytryptamine (5-MeOT), agoniste 5-HT4, présente une action agoniste inhabituellement faible pour les récepteurs 5-HT4 du muscle détruseur humain (Candura et al., 1996). Le ML10302, agoniste du récepteur 5-HT4 qui imite l'effet de la 5-HT sur la relaxation de l'oesophage du rat ainsi que sur la contraction provoquée électriquement chez l'iléon du cobaye (Langlois et al., 1994), présente un effet agoniste faible combiné avec un net antagonisme de la 5-HT sur la réponse AMPc générée par le récepteur 5-HT4(,, humain cloné à partir de l'oreillette humaine (Blondel et al., 1997) et un effet antagoniste dans les neurones du colliculus (Ansanay et al., 1996). De plus, les mécanismes de désensibilisation pour les récepteurs 5-HT4 sont aussi tissu-dépendants. En effet, une désensibilisation homologue rapide et entière (AMPc indépendante) des récepteurs 5-HT4 est observée dans les neurones des colliculi de la souris (Ansanay et al, 1996) et l'oesophage de rat (Rondé et al., 1996) tandis que ce type de récepteur est désensibilisé dans une moindre mesure dans l'oreillette humaine (Kaumann et al., 1991). Le premier récepteur 5-HT4 a été cloné à partir du cerveau de rat (Gerald et al, 1995) et deux variants d'épissage (r5-HT4g et r5-HT4L) ont été identifiés. Ces variants différent dans la longueur et la séquence de l'extrémité carboxy-terminale. La forme longue (r5-HT4L) qui a aussi été clonée dans les neurones de colliculi de souris (m5-HT4L), a des transcrits dans approximativement chaque partie du cerveau (Claeysen et al., 1996). Une observation intéressante vient de la distribution périphérique des transcrits de r5-HT4L et r5-HT4, chez le rat. Alors que les deux formes sont exprimées dans le tractus gastro-intestinal (iléon et colon), seul le transcrit rS-HT49 est trouvé dans le cour (Gerald et al., 1995). De plus, r5-HT4g a été trouvé exclusivement dans l'oreillette (Gerald et al., 1995). Les homologues humains des récepteurs rS-HT, et r5-HT4, appelés ici h5-HT4 (a) et h5-HT4 (b), ont été clonés récemment. Le récepteur h5-HT4(a) a été cloné à partir de coeur humain (Blondel et al., 1997; Claeysen et al., 1997); le récepteur h5-HT4b) a été cloné à partir d'une bibliothèque (Van de Wyngaert et al., 1997). Ces deux récepteurs h5-HT4(a) et h5-HT4 (b) transitoirement exprimés dans les cellules COS-7 présentent un profil pharmacologique 5-HT4 classique. Cependant, les affinités du récepteur cloné h5-HT4 BIMU1, renzapride et zacopride sont inférieures à celles trouvées dans le cerveau. Les inventeurs ont à présent montré l'existence de deux nouveaux sous-types de récepteur à la sérotonine chez l'homme, appelés récepteurs h5-HT4(c) et h5-HT4(d). L'analyse des homologies de séquences suggère que les formes h5-HT4a) et h5-HT4 La phosphorylation de l'extrémité carboxy-terminale des récepteurs à sept domaines transmembranaires par la protéine kinase A régule la désensibilisation du récepteur et l'association du récepteur avec la protéine G en réponse à des concentrations croissantes d'AMPc (Dohlman et al., 1991). De plus, la phosphorylation du récepteur par des protéines kinases non-AMPc dépendantes telles que les kinases du récepteur ss- adrénergique (ssARK1 et ssARK2) ou la rhodopsine kinase permet la désensibilisation homologue activée par un substrat dans les récepteurs à sept domaines transmembranaires tels que les récepteurs ss1- et P2- adrénergiques (Pei et al., 1994; Freedman et al., 1995) et le récepteur 5-HT20 (Westphal et al., 1995). Le nombre et la nature des sites de phosphorylation présents à l'extrémité C-terminale des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 sont donc susceptibles d'influencer la régulation négative de la fonction récepteur. Des différences de mécanismes de désensibilisation des récepteurs 5-HT4 tissu La forme 5-HT4d) est caractérisée par une extrémité C-terminale très courte, avec une séquence codant finissant deux acides aminés après Leu358. Des similarités de structure entre les extrémités C-terminales 5-HT4 et l'extrémité C-terminale 5-HT7 (même nombre de variants, incluant une isoforme riche en sites de phosphorylation et une isoforme tronquée près du site d'épissage), malgré l'absence d'une homologie de séquence claire, suggèrent des similarités dans la régulation de l'activité fonctionnelle parmi les récepteurs 5-HT couplés positivement à l'adénylate cyclase. La présente invention a pour objet un polypeptide isolé constitutif de variants d'épissage du récepteur humain sérotoninergique dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi la séquence SEQ ID N 2 du polypeptide variant 5-HT4 (C), OU la séquence SEQ ID n 4 du polypeptide variant 5-HT4(d), ou tout fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celui-ci. La présente invention concerne donc plus particulièrement un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5HT). Plus particulièrement, l'invention a pour objet un polypeptide h5-HT4(c) ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé de celuici biologiquement actif. La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5-HT4 (d). Plus particulièrement, I'invention a pour objet un polypeptide h5-HT4(d) ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 4, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé de celuici biologiquement actif. La séquence SEQ ID n 2 représente la séquence d'acides aminés du polypeptide h5-HT4(c) et la séquence SEQ ID n 4 représente la séquence d'acides aminés du polypeptide h5-HT4 (d). Les sept domaines transmembranaires potentiels (TM1 à TM7) des protéines sont soulignés, et les sites de phosphorylation putatifs sont indiqués par des symboles appropriés. Par "dérivé", on entend tout polypeptide variant du polypeptide de séquence SEQ ID n 2 ou n 4 ou toute molécule résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID n 2 ou n 4, c'est-à L'expression "biologiquement actif" signifie que le composé auquel elle se rapporte est capable de se lier à la sérotonine ou à des ligands apparentés à la sérotonine et/ou de participer à la transduction du signal induit par la sérotonine au niveau de la membrane cellulaire, en particulier à l'activation de l'adénylate cyclase, et/ou capable d'induire des anticorps qui reconnaissent le polypeptide h5-HT4 L'invention comprend donc également tout polypeptide ayant une séquence d'acides aminés essentiellement identique à la séquence ID n 2 ou n 4 dans laquelle un ou plusieurs résidus ont été substitués de manière constitutive par un résidu fonctionnellement similaire et qui démontre son habilité à mimer le récepteur h5-HT4C) ou h5HT4 I'arginine ou I'histidine par un autre résidu basique ou la substitution d'un résidu acide tel que l'acide aspartique et l'acide glutamique par un autre résidu acide. De même, I'invention comprend tout polypeptide ayant un ou plusieurs résidus chimiquement dérivés par réaction d'un groupe fonctionnel. Les polypeptides de la présente invention incluent aussi tout polypeptide ayant une ou plusieurs additions et/ou suppressions de résidus par rapport à la séquence ID n 2 ou n 4 dans la mesure où l'activité biologique est maintenue. Les polypeptides h5-HT4(c) et h5-HT4d de la présente invention peuvent être synthétisés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides h5HT4fC) ou h5-HT) peuvent être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n 1, la séquence SEQ ID n 3, les séquences nucléotidiques dérivées de la séquence SEQ ID n01 ou de la séquence SEQ ID n 3 du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, ou d'insertion, et les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3. La séquence SEQ ID n01 représente la séquence nucléotidique du polypeptide h5-HT4(c) et la séquence SEQ ID n 3 représente la séquence nucléotidique du polypeptide h5-HT4 Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1 ou n 3. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques. Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID n01 ou n 3 selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 30 C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 10 C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation "in situ", de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage. Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 3 ou de leur brins complémentaires. Afin de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 3 codant pour les récepteurs h5-HT4C, ou h5-HT4d, respectivement, et non avec les séquences nucléotidiques codant pour les récepteurs h5-HT4(a) ou h5-HT b, les sondes selon l'invention doivent contenir une séquence spécifique de l'extrémité 3' des séquences SEQ ID n01 ou n 3 codant pour les extrémités Cterminales des récepteurs h5-HT4(c) ou h5-HT4(d). Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un polypeptide h5-HT4 L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à : - préparer l'ARN dudit échantillon; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3, telle que définie précédemment; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur h5-HT4(c) ou h5-HT). L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3, telle que définie précédemment; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur 5-HT) ou 5-HT4(d). Les sondes d'ADNc de l'invention sont en outre avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques. Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci. Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique. L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de polypeptides 5HT) ou 5-HT), tels que définis précédemment. De telles séquences sont avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture codant pour 5-HT4(c) ou 5-HT4d) au niveau du transcrit. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants ayant une activité de récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) tels que précédemment définis. Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier. Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention. Un tel vecteur d'expression peut être notamment un plasmide (tel que pRc/CMV, disponible chez Invitrogen, Carlsbad, CA, ou pUC18, disponible chez Pharmacia, Piscataway, NJ), un cosmide, un phage (tel que le phage Lambda), ou tout type de virus recombinant. L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment les cellules de mammifères telles que les cellules COS-7, CHO, NIH3T3, HeLa, LM(tk-), HEK293, etc. Les cellules hôtes peuvent être en particulier des lignées cellulaires telles que les cellules C6 de gliome. L'invention a donc plus particulièrement pour objet les lignées cellulaires exprimant le polypeptide 5-HT4 (c) ou 5-HT4 (d) selon l'invention de manière stable. De manière préférentielle, mais non exclusive, les cellules hôtes pour l'expression du récepteur 5-HT4C, ou 5-HT4(d) recombinant fonctionnel expriment des protéines G et des adénylate cyclases, endogènes ou recombinantes. Les cellules hôtes selon l'invention sont utilisables dans un procédé de production d'un polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT), procédé dans lequel on cultive des cellules transfectées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID n 2 ou n 4 ou tout fragment, ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on récupère ledit polypeptide, fragment ou dérivé de celui-ci biologiquement actif, que l'on purifie. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. L'invention a également pour objet des anticorps poly- ou monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués. Ces anticorps ou fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide récepteur tel que défini précédemment, dérivé, ou fragment polypeptidique de celui-ci, administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d). Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre le récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide, portant un épitope T dépendant. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et ai (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, I'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG. Afin d'augmenter la spécificité du sérum polycional, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (1975). Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif. Ces immunotoxines peuvent dans ce cas constituer des agents thérapeutiques utilisables pour le traitement de certaines pathologies impliquant une surexpression du récepteur 5-HT4C) ou 5-HT). Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie des récepteurs 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase... Les anticorps anti-5-HT4fc) ou 5-HT4d, peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4d) doit être observée (surexpression anormale, suivie de la régulation de l'expression membranaire, etc.). L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4d, dans un prélèvement biologique eVou pour la mesure du taux d'expression de celui-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro d'une expression anormale du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression du récepteur 5-HT > ou 5-HT4(d) dans ledit prél Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être notamment administrée par voie orale, parentérale, intraveineuse, intramusculaire sous-cutanée, percutanée ou par administration intra-nasale. La préparation de compositions pharmaceutiques qui contiennent des principes actifs dissous ou dispersés dans ces dernières, est bien connue de l'homme du métier. Généralement, ces compositions sont préparées sous la forme de solutions ou de suspensions injectables. Cependant, elles peuvent aussi être sous des formes solides appropriées pour préparer des solutions, ou des suspensions extemporanément. Les préparations peuvent aussi être émulsifiées. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'sage ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc. L'invention a égaiement pour objet une méthode de traitement thérapeutique chez un sujet atteint de troubles ou désordres qui sont attenués, voire éliminés, par la réduction de l'expression des récepteurs 5-HT4 L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se lier au polypeptide 5-HT4C, ou 5-HT4(d) selon l'invention dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ledit polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d). Un grand nombre de composés peut ainsi être criblé rapidement pour tester la capacité de ces composés à se lier au récepteur 5-HT4(c) ou 5 HT4(d) selon l'invention. Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la détermination de la présence ou de l'absence de sérotonine dans un échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes. L'invention a donc également pour objet un procédé d'identification de ligands du récepteur 5HT4 a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des ligands du récepteur avec un polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4d ou une cellule hôte exprimant ledit polypeptide, b) isoler les complexes ligand-récepteur formés, c) identifier les ligands du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 (d) L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la sérotonine ou de ses analogues dans un prélèvement biologique et/ou de mesure du taux d'expression de celle-ci/ceux-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre un ledit polypeptide et la sérotonine ou ses analogues et la détection des complexes immunologiques spécifiques formés. Les tests de liaison utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier au polypeptide récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition avec d'autres composés non marqués. Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA. Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des moyens de marquage pour détecter le polypeptide récepteur 5-HT4, ou 5-HT4(d) selon l'invention, les anticorps anti-5-HT > ou 5-HT4(d) et/ou les ligands du récepteur 5-HT4c) ou 5-HTd,. Les moyens de marquage utilisés peuvent être notamment un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement à des anticorps ou à des antigènes sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de marquage. Les inventeurs ont par ailleurs étudié la répartition tissulaire des quatre différents variants d'épissage du récepteur 5-HT4, à savoir 5-HT4(a), 5HT4(b), 5-HT4) et 5-HT4 (d. Le profil d'expression de chaque variant d'épissage de 5-HT4 n'est pas restreint à un tissu donné à l'exception de 5-HT4(d) qui se trouve uniquement dans les intestins. Certains tissus (oreillette humaine, cerveau, intestin) expriment trois ou quatre isoformes 5-HT4, tandis que d'autres (vessie, rein) expriment seulement une isoforme. Ainsi, la vessie n'exprime spécifiquement que la forme 5-HT4(a). Dans deux tissus (les ventricules du coeur et le foie) aucun transcrit codant pour un quelconque variant d'épissage 5-HT4 n'a pu être amplifié. La présence du récepteur h5-HT4 Or, I'isoforme h5-HT4(c) est seule à posséder des sites de phosphorylation sur son extrémité C-terminale, la rendant plus sensible à la désensibilisation homologue. L'invention a ainsi plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4(c) selon l'invention pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du système nerveux central associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT4(c). L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4(d) selon l'invention pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du tractus gastrointestinal associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT). Les inventeurs ont en outre étudié le profil pharmacologique des récepteurs 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) selon l'invention. Tandis que les sous-types 5HT4(a), 5-HT b) et 5-HT4 (d exprimés dans les cellules COS-7 présentent une capacité similaire au couplage avec l'adénylate cyclase quant elles sont exposées à 5-HT, I'expression de l'isoforme 5-HT) donne une activation constitutive de I'adénylate cyclase qui résulte dans l'augmentation du niveau basal d'AMPc. Le degré de couplage constitutif est en outre augmenté par la surexpression de l'isoforme 5-HT4ç en utilisant plus d'ADN plasmidique pour la transcription. Un tel couplage constitutif a été décrit dans plusieurs autres situations, par exemple 1) dans la famille du récepteur métabotropique au glutamate, certains variants d'épissage étant couplés spontanément aux protéines G (Prezeau et al., 1996) ; 2) dans des mutations pathologiques ou expérimentales spécifiques conduisant à une activité constitutive dans certains récepteurs (Coughlin, 1994) ; 3) dans la surexpression des récepteurs à 7 domaines transmembranaires (Kenakin, 1996) tel que le récepteur m5-HT (Claeysen et al., 1996) conduisant à une activation constitutive de Gs. Tous les sous-types des récepteurs h5-HT4 exprimés dans les cellules COS-7 présentent un profil de récepteur 5-HT4 classique en termes d'ordre de puissance de divers ligands sérotoninergiques testés (Hoyer et al., 1994). Aucune différence majeure n'a pu être trouvée entre les isoformes (a), (b) et (c) en ce qui concerne les constantes d'affinité des agonistes et antagonistes 5-HT4. Cependant, I'isoforme (d) présente toujours une affinité supérieure pour n'importe quel ligand 5-HT4 testé en comparaison avec les autres isoformes (tableau 1). Puisque le récepteur 5-HT4(d) est le plus court des quatre isoformes du récepteur, ce résultat suggère que les modifications de la séquence protéique C-terminale des récepteurs 5-HT4 peuvent induire des changements dans les propriétés de liaison. La question se pose de savoir si ces modifications participent à la variabilité des constantes d'affinité pour les différents ligands 5-HT4 observés dans les différents tissus des espèces animales (Blondel et al., 1997). Des mécanismes alternatifs pour ces variabilités peuvent inclure des différences d'espèces pour les isoformes du récepteur 5-HT4 ou l'existence de variants d'épissage internes (Ullmer et al., 1995) qui pourraient affecter plus directement le site de liaison au ligand. L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier au polypeptide récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d), appelés ligands du récepteur 5HTS ou 5-HT4 (d,, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide 5-HT4(c) et/ou 5-HT4(d), en présence d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4(c) et/ou 5 HT4(d); et b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du signal. Plus particulièrement, on peut évaluer la capacité d'un ligand à moduler la transduction du signal en déterminant la concentration en AMPcyclique (AMPc) intracellulaire formé par l'activation de l'adénylate cyclase, ou l'activité de l'adénylate cyclase. Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence: - soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 (d) dont la capacité à moduler la transduction du signal est recherchée et d'une concentration déterminée d'au moins un agoniste connu de 5-HT4(c) ou 5-HT4(d); - soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu de 5-HT4(c) ou 5-HT4d) et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4fC ou 5-HT4 La capacité dudit ligand à moduler la transduction du signal est alors évaluée en déterminant de manière quantitative l'expression dudit gène rapporteur, en fonction de la concentration dudit ligand. Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits cidessus permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés, notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme agonistes ou antagonistes du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) selon l'invention. Les présents inventeurs ont ainsi montré que, de manière surprenante, ML10375, tout en antagonisant la réponse AMPc induite par la 5 HT médiée par toutes les isoformes 5-HT4, , réduit l'activité adénylate cyclase basale seulement dans les cellules transfectées par le récepteur 5-HT4(c) et HT4(d). Ce phénomène est médié par un effet agoniste inverse de ML10375. Ce phénomène représente le premier de ce genre dans la famille des récepteurs 5-HT4, et il suggère que la structure de l'extrémité C-terminale du récepteur à 7TM peut participer au développement d'un effet agoniste inverse d'un antagoniste donné. Le composé ML10375 de formule 4-amino-5-chloro-2méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthylpipéridino)éthyl est particulièrement utile pour la préparation de médicaments à action agoniste inverse envers le récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d). Les exemples et les figures dont les légendes suivent illustrent l'invention sans la limiter: LEGENDE DES FIGURES - La figure 1A représente les séquences d'acides aminés de l'extrémité C-terminale déduites des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 chez le rat et l'homme. Dans les deux espèces, la séquence diverge après Leu3s8. Les différences d'acides aminés entre le rat et l'homme sont encadrés. Les cercles blancs correspondent au site consensus protéine kinase, les cercles noirs au site consensus caséine kinase Il et le triangle noir à un site consensus protéine kinase A/protéine kinase G. L'astérisque correspond au codon stop terminal. - La figure 1 B représente les séquences comparées d'acides aminés des variants 5-HT4(c) et 5-HT4(d). - La figure 2 représente l'analyse par RT-PCR réalisée avec 50 ng d'ARNm à partir de divers tissus humains. Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 % et analysés par Southern Blot en utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique marquée au 32P, amorce commune à 5-HT), 5-HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4 (d. Une exposition de 8 heures de l'autoradiogramme est présentée. Un contrôle positif a été réalisé en utilisant des amorces d'actine de rat sur des échantillons d'ARNm traités avec (+ RT) ou sans (-RT) transcriptase inverse. Les produits de PCR de l'expérience de contrôle ont été analysés sur un gel d'agarose à 1,5 % et une photographie du gel coloré au bromure d'éthidium est présentée. Les amorces de PCR utilisées pour cette analyse sont décrites dans les exemples 1 et 2. (O: oreillette, V : ventricule, C : cerveau, G : tractus gastro-intestinal, P poumon, R: rein, v : vessie). - La figure 3 représente l'analyse par saturation de la liaison de [3H]GR113808 sur des préparations membranaires de cellules COS-7 exprimant des isoformes 5-HT4a) (A), 5-HT4(b) (B), 5-HT4(c) (C) et 5-HT4(d) (D). Les membranes recueillies à partir des cellules COS-7 transfectées de manière transitoire ont été incubées avec 8 concentrations de [3H] GR113808 (0,02-3,5 nM) pendant 30 minutes à 25 C. La liaison non spécifique a été définie par 10 pM de ML10375. Les résultats sont issus d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences identiques. Les valeurs de Kd et Bmax sont déterminées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software). - La figure 4 représente l'inhibition de la liaison spécifique de [3H]GR113808 aux récepteurs 5-HT4(a) (figure 4A), 5-HT4(b) (figure 4B), 5HT4 (C) (figure 4C) et 5-HT4(d) (figure 4D) clonés par 5-HT. Les membranes des cellules COS-7 transfectées de manière transitoire ont été incubées avec une concentration de [3H] GR113808 égale à 50 % de la valeur de Kd de chaque isoforme du récepteur. La liaison non spécifique a été définie par 10 pM de ML10375. Les résultats sont présentés comme un pourcentage de liaison spécifique en l'absence de 5-HT: les données ont été analysées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software). - La figure 5 représente les réponses d'AMPc à divers agonistes et antagonistes du récepteur 5-HT4 en utilisant les récepteurs 5-HT4(a), 5 HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4(d) exprimés transitoirement dans les cellules COS-7 ou dans les cellules transfectées à blanc". Les cellules ont été préincubées avec 5 mM de théophylline et 10 pM de pargyline pendant 15 minutes, puis incubées avec 1 pM d'agonistes (5-HT : A, C, D et E ; ML10302 : B et C renzapride : B et D) et/ou antagonistes (ML10375 : B et E), ou 10 uM de forskoline (A) pendant 15 minutes. L'effet de l'agoniste ou de l'antagoniste sur l'accumulation d'AMPc induite par 5-HT a été testé par addition de l'agoniste ou de l'antagoniste pendant la période de 15 minutes de préincubation, suivi par l'addition de 5-HT pendant 15 minutes. Les valeurs sont des valeurs moyennes i SEM de 7 à 12 expériences. NS: non significatif : *, p - La figure 6 représente les réponses d'AMPc de 5-HT (1 pM), de forskoline (10 pM) et d'antagoniste 5-HT4 ML10375 (1 pM) en utilisant le récepteur 5-HT4(c) exprimé transitoirement dans les cellules COS-7 ou dans les cellules transfectées L' à blanc " comme contrôle. Les cellules sont transfectées en utilisant 4 à 8 pg par puits (A et B), ou 6 pg par puits (C et D) d'ADN plasmidique. Les conditions d'incubation sont identiques à celle décrite aux figures 5C et D : les réponses sont étudiées en présence ou en l'absence d'une préincubation de 16 heures avec PTX (100 ng/ml). Les valeurs sont des valeurs moyennes + SEM de 6 à 11 expériences. NS : non significatif: *, p EXEMPLE 1 Structure primaire des variants d'épissage du récepteur 5 HT4 humain. Matériels: Les PCR ont été réalisées sur un appareil GeneAmp 2400 (Perkin Elmer). L'ADN polymérase HiTaq et le tampon associé ont été obtenus chez Bioprobe Systems. Dans toutes les réactions de PCR, les dNTps et les amorces spécifiques étaient à une concentration finale de 200 pM et 1 pM, respectivement.. L'ADN double brin a été séquencé avec un kit de séquençage d'ADN polymérase T7 (Pharmacia) selon les instructions du fabricant. 1. Amplification rapide et clonage des extrémités de l'ADNc La séquence du récepteur humain 5-HT4 Blondel et al. 1997 a été utilisée pour synthétiser les deux amorces HHT45 [5'C GGTG CTTATTTCCTGTAATG-3'] et HTS3 [5'-ATGGTCAACAAGC C CTAC -3'] correspondant au début de la séquence du récepteur et au cinquième domaine transmembranaire respectivement. Pour obtenir les ADNc à partir des extrémités 5' générées par le gène 5-HT4, la technique d'extension par RACE "amarrée" (anchored-RACE) a été appliquée comme décrit dans Newton et Graham, 1994. 50 ng d'ARN total de cerveau humain et d'ileon ont subi une transcription inverse en utilisant une amorce oligo (dt) contenant deux séquences d'ancrage et la transcriptase inverse Superscript (GIBCO/BRL). Les produits de réaction de ces deux tissus ont été ensuite recueillis et utilisés comme matrice pour une réaction RACE utilisant l'amorce HHT45 avec la première ancre. Le produit de la première réaction PCR a été utilisé comme matrice pour la réaction de RACE "nichée" (nested-RACE) utilisant l'amorce HTS3 (modifiée pour inclure une séquence de restriction Hindlil) avec la seconde "ancre" (contenant une séquence de restriction EcoRI). Ces deux réactions PCR ont été réalisées au moyen de 25 cycles d'amplification dans les conditions suivantes : dénaturation pendant 1 minute à 94 C, hybridation pendant 1 minute à 54 C et extension pendant 2 minutes à 72 C avec une extension finale pendant 8 minutes. Les températures d'hybridation étaient de 52 C pour la réaction RACE et de 54 C pour la réaction nested-RACE. Les fragments d'ADN ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 %, clonés dans pGEM-7Z (coupé par Hindlll/EcoRI) et séquencés. 2. Clonage des ADNc de pleine longueur L'ADNc total correspondant aux variants d'épissage 5-HT4(b > , 5HT4C et 5-HT4(d) a été amplifié en utilisant le pool original de transcription inverse de cerveau humain et d'ileon, et une stratégie de nested-PCR. L'amorce HHT45 (modifiée pour inclure un site de restriction Hindlil) a été utilisée comme amorce sens dans toutes les réactions PCR. Les amorces inverses pour le premier cycle d'amplification était F81 [5'GC CTCAGGTGAAGAGAAT-3'], F61 [5'-TGGCATTAGGATGGTTTGGTCA-3'] et F71 [5'-GCAATAAGAATTGGCCAC-3'] pour 5-HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4(d) respectivement. Les amorces inverses pour le second cycle d'amplification, qui contiennent toutes un site de restriction EcoRI à leur extrémité 5' étaient F82 [5'-GTCTTCTGGGTCATTGTC-3'], F62 [5'-TTAGGATGGTTTGGTCA-3'] et F72 [5'-CTCAAGGAGCTCAAAATC-3'] pour 5-HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4(d) respectivement. Les conditions de PCR étaient les mêmes que celles utilisées pour les deux cycles d'amplification de RACE-PCR. Les fragments correspondants aux ADNc de pleine longueur ont été purifiés sur un gel d'agarose à 1,5 %, souscloné dans pGEM-7Z (coupé par Hindlil/EcoRI) et séquencés pour confirmer l'intégrité de la séquence codante. 3. Structure primaire des variants d'épissaae du récepteur 5~ humain. La séquence d'acides aminés déduite des différents variants d'épissage est illustrée figure 1 à partir du site d'épissage Leu3. A l'intérieur de cette région du récepteur, 5-HT4(a) partage 93 % d'identité protéique avec la forme courte du récepteur du rat 5-HT4s (Blondel et al., 1997). La région comprise entre Leu358 et le dernier acide aminé de 5-HT4 (b) présente 74 % d'identité protéique avec la région correspondante de la forme longue du récepteur du rat 5-HT4L. Cependant, I'extrémité carboxy de 5-HT4(b) s'est avérée présenter 18 acides aminés de moins que son correspondant chez le rat, et le site consensus de phosphorylation par la PKC décrit du côté Cterminal chez le récepteur 5-HT4L du rat manque (Gérald et al., 1995). Les variants d'épissage 5-HT4(c) et 5-HT4(d) n'ont jamais été décrits chez aucune espèce. Il est intéressant de noter que l'extrémité carboxy du récepteur 5-HT4(c) présente un nombre inhabituellement élevé de sites de phosphorylation putatifs : deux sites caséine kinase Il et un site protéique kinase C et une séquence consensus pour la phosphorylation par la protéine kinase A/protéine kinase G. L'isoforme 5-HT4(d) correspond à une forme ultracourte du récepteur, avec une troncature d'extrémité carboxy seulement deux acides aminés après le site d'épissage sur la Leu3. EXEMPLE 2 : Expression tissulaire spécifique des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 Les expressions des différents transcrits 5-HT4 ont été analysées par amplification d'ADNc dérivé d'ARN isolé à partir de divers tissus humains en utilisant une technique de nested RT-PC R. La distribution tissulaire a été examinée en utilisant deux paires d'amorces spécifiques de chaque type de variants et deux cycles successifs d'amplification de PCR, conformément aux conditions décrites dans l'exemple 1. Les produits amplifiés ont été identifiés en utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique (figure 2). Les isoformes 5-HT4(a), 5-HT4(b), et 5-HT4(c) sont tous exprimés dans l'oreillette, le cerveau et les intestins. La vessie et le foie expriment chacun des niveaux détectables de seulement un sous-type de récepteur (5-HT4 (a) et 5-HT b respectivement). L'expression de 5-HT4(d) a été détectée uniquement dans les intestins. Enfin, les ventricules et les poumons n'expriment pas de quantités détectables d'un quelconque isoforme 5-HT4. II a été également démontré la présence dans tous les tissus d'ADNc correspondant au gène de ss-actine exprimé de manière constitutive, ainsi que l'absence de produits de PCR de ss- actine dans des expériences de contrôle sans transcriptase inverse (figure 2). EXEMPLE 3: Caractérisation pharmacologique des variants d'épissage des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules COS-7 Matériels: Le PEI (polyéthylèneimine MW 800 KD) a été obtenu chez Fluka (LIse d'Abeau Chesnes, France). ML 10302 (4-amino-5-chloro-2méthoxybenzoate de 2-(1-pipéridinyl)éthyl) et ML 10375 (4-amino-5-chloro-2- méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthylpipéridino)éthyl) ont été synthétisés selon Langlois et al., 1994; Yang et al., 1997. GR113808 (1-méthyl-1H-indole- 3- carboxylate de ([1 -[2-(méthylsulfonyl)amino]éthyl]-4-pipéridinyl]méthyl a été obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware, Hertfordshire, U.K.) et [3H]GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham (Arlington, Heights,IL). 1. Transfection de 'ADN La région codante entière des ADNc de 5-HT4(a), 5-HT b), 5-HT4(c) et 5-HT d) a été sous-clonée dans un vecteur d'expression de mammifère pRC/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les transfections ont été réalisées en utilisant le polyéthylènimine (PEI) tel que décrit dans Boussif et al. (1995). Les cellules ont été transfectées en utilisant un mélange d'ADN et de PEI dans un rapport de 20 pmol de PEI/mg d'ADN dans 0,9 % de NaCI. Pour les tests de liaison aux radioligands, les cellules COS-7 ont été ensemencées un jour avant la transfection dans des flacons de culture de 1,5 x 104 mm2 à une densité de 1 x 107 cellules/flacon, incubées pendant six heures avec de I'ADN plasmidique (150 ug/flacon) et recueillies 48 heures après transfection. Pour ia mesure de la formation d'AMPc, les cellules COS-7 ont été ensemencées un jour avant la transfection sur des plaques à douze puits à une densité de 5 x 105 cellules/puits, incubées pendant six heures avec de 'ADN plasmidique (4 à 8 pg/puits selon les expériences), et testées 24 heures après la transfection. Les cellules transfectées avec les constructions d'ADNc du récepteur 5-HT4 ont été comparées avec les cellules transfectées " à blanc" qui ont été exposées au plasmide pRC/CMV non modifié. 2. PréDaration membranaire Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le culot a été resuspendu dans 2,5 ml de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4) et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes à 4 C. Le culot résultant a été resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4). Les préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al., 1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard. 3. Tests de liaison du radioiiqand. Les études de liaison du radioligand ont été réalisées dans 500 ul de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) contenant 20 ul d'un agent compétiteur (pour les études de compétition de drogues), ou de ML 10375, pour donner une concentration finale de 10 pM (pour la détermination de la liaison non spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et 20 p de [3H]GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de Kd et 50 pl (100-200 pg) de préparation membranaire. Les études de saturation ont été conduites en utilisant [3H]GR113808 à 9 concentrations différentes allant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25 C pendant 30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à travers un papier filtre Whatman GF/B en utilisant le récolteur de cellules 48R Brandel. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour réduire la liaison aux filtres. Les filtres ont été ensuite lavés avec un tampon glacé (50 mM Tris-H HT4 étudiés in situ dans l'oreillette de l'homme (Kaumann et al., 1996) et l'oreillette du porcelet (Kaumann et ai., 1995) ; le striatum humain (Reynolds et al., 1995) et le noyau caudé humain (Waeber et aI., 1993), le striatum de rat (Langlois et ai., 1994 ; Yang et ai., 1997) et le striatum de cochon d'Inde (Ansanay et ai., 1996) ; les colliculi de souris (Ansanay et ai., 1996) ou après expression des isoformes clonées dans des fibroblastes cultivés (r5-HT4L (Gérald et al., 1995 ; Adham et al., 1996); m5-HT4L (Claeysen et al., 1996). On peut par ailleurs noter que, alors que chacun des composés testés se liait aux isoformes a, b et c du récepteur 5-HT4 avec une affinité similaire, l'affinité pour l'isoforme 5-HT4(d) était le plus souvent supérieure d'un facteur de 2 à 4 (tableau 1). EXEMPLE 4 : Stimulation de la production d'AMPc par les. variants d'épissage 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules COS-7 Matériels: DMEM a été obtenu chez GIBCO-BRL. La toxine pertussique (PTX) a été obtenue chez Calbiochem. BIMUl (endo-N-8-méthyl-8azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)-2,3-dihydro-3-éthyl-2-oxo-1H-benzimidazole-1carboxamide) et le zacopride (4-amino-5-chloro-2-méthoxy-N-(1- azabicyclo[2,2,2]octo-3-yl)benzamide, HCI), ont été synthétisés en laboratoire par les auteurs de la présente invention. Le renzapride (BRL 24924) (+) endo4-amino-5-chloro-2-méthoxy-N-(1-azabicyclo[3.3.1]non-4-yl)benzamide, HCl) a été obtenu chez SmithKline Beecham. La 5-hydroxytryptamine (5-HT), la 5méthoxytryptamine (5-MeOT) ont été obtenus chez Aldrich (L'lsle d'Abeau Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez Sigma (L'lsle d'Abeau Chesnest France). 1. Mesure de la formation d'AMPc Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les cellules COS-7 transfectées de manière transitoire sont incubées 24 heures après transfection dans du milieu de Eagle modifié par Dulbelcco (DMEM) contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 pM de pargyline pendant 15 minutes à 37 C en présence de 5 % de CO2. La 5-HT (1 pM), ou d'autres agents sérotoninergiques (1 pM) ou la forskoline (10 pM) ont été ajoutés et incubés pendant 15 minutes supplémentaires à 37 C en présence de 5 % de CO2. La réaction a été stoppée par aspiration du milieu et addition de 500 ul d'éthanol refroidi dans de la glace. Après une heure à température ambiante, les cellules ont été grattées et l'ensemble a été recueilli et lyophilisé. Le culot a été resuspendu dans 350 l de PBS et centrifugé pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été quantifié dans le surnageant en utilisant un test radioimmunologique (E.R.I.A. kit de dosage de Pasteur Diagnostics 79830). Les tests t de Student ont été réalisés en utilisant le logiciel Quick TTEst. 2. Stimulation de la production d'AMPc. Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à être couplés à l'adénylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des cellules COS-7 transfectées transitoirement avec les ADNc de 5-HT4(a), 5 HT4(b), 5-ht4(c), et 5-HT4(d). Les valeurs d'AMPc basales n'étaient pas significativement différentes dans les cellules transfectées " à blanc" et les cellules exprimant les récepteurs 5-HT4(a), 5-HT4fb) et 5-HT4d), indiquant que ces isoformes exprimées du récepteur n'avaient pas d'activité intrinsèque quant à la formation d'AMPc dans des cellules transfectées transitoirement en l'absence d'agonistes (figure 5a). Cependant, I'expression transitoire de l'isoforme 5-HT4(c) a conduit à une augmentation significative du niveau d'activité basal de I'adénylate cyclase en l'absence d'agonistes 5-HT4 (figure 5a). Le dernier résultat indique que l'expression de 5-HT4(c) dans le système décrit génère un état de récepteur spontanément actif. La 5-HT (1 pM) n'a pas d'effet sur l'activité basale d'adénylate cyclase dans les cellules COS-7 transfectées "à blanc" (figure 5a), indiquant que les récepteurs sérotoninergiques couplés à l'adényinate cyclase endogènes ne sont pas présents dans ces cellules. Dans les cellules exprimant 5-HT4(a), S-HTb), 5 HT4(c), et 5-HT4d), I'addition de 5-HT (1 pM) augmente significativement la concentration d'AMPc de 82 %, 85 %, 64 % et 77 % respectivement (figure 5a). La forskoline (10 pM), un activateur direct de ladénylate cyclase, induit des augmentations similaires des concentrations d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes du récepteur 5-HT4 et dans les cellules COS-7 transfectées "à blanc" (figure 5A) indiquant que le potentiel d'activation maximale de l'adénylate cyclase n'a pas été affecté dans les cellules exprimant les récepteurs 5-HT4. Les agonistes des récepteurs 5-HT4 ML10302 et renzapride, et l'antagoniste des récepteurs 5-HT4, ML10375 n'a pas d'effet significatif sur les niveaux d'AMPc basals dans les cellules COS-7 transfectées "à blanc" (figure 5B). Dans les cellules exprimant les isoformes du récepteur 5-HT4, ML10302 se conduit comme un agoniste 5-HT4 faible, et présente seulement 28 à 34 % de l'effet stimulateur de 5-HT (figure 5C), en dépit d'une haute affinité pour le récepteur (tableau 1). En outre, la préincubation des cellules avec 1, pM de ML10302 préalablement à l'addition de 5-HT (1 pM) antagonise significativement la capacité de 5-HT à augmenter les niveaux d'AMPc basals (figure 5C). Comme décrit par Blondel et al. (1997), le renzapride se conduit aussi comme un agoniste 5-HT4 faible dans les cellules exprimant I'isoforme du récepteur 5-HT4(a) et augmente la formation d'AMPc par seulement 56 % dans ces cellules (figure 5D), en dépit d'une affinité pour le récepteur 5-HT4(a) similaire à celle de 5-HT (tableau 1). Cependant, le renzapride se comporte comme un agoniste total dans les cellules exprimant les isoformes 5-HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4(d), dans la mesure où la formation d'AMPc induite par le renzapride médiée par ces variants d'épissage du récepteur, n'était pas significativement différente de la formation d'AMPc induite par la 5-HT (figure 5D). L'antagoniste 5-HT4, ML10375, (Yang et al., 1997) à une concentration de 1 pM n'avait pas d'effet significatif sur les niveaux basals d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes de récepteurs 5-HT4(a) et 5-HT4(b) mais a réduit significativement les niveaux basals d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes des récepteurs 5 HT4(c) et 5-HT4(d) (par respectivement 21 % et 24 %, figure 5E). De plus, la préincubation des cellules exprimant les isoformes de récepteur 5-HT4 avec 1 pM de ML10375 préalablement à l'addition de 5-HT (1 pM) antagonise la capacité de 5-HT d'augmenter significativement les niveaux d'AMPc basals (figure 5E). TABLEAU 1: Comparaison des affinités de liaisons de divers agonistes et antagonistes des récepteurs 5-HT4 sur les récepteurs 5-HT4(a), 5-HT4 Ki (nM) 5-HT4(a) 5-HT4(b) 5-HT4(c) 5-HT4(d) 5-HT 772 ~ 278 1151 ~ 170 481,9 ~ 112 330 ~ 113 5-MeOT 2080 ~ 508 2443 ~ 510 1020 ~ 236 553 ~ 149 ML10302 8,4 ~ 1,5 10,72 ~ 2,9 7,98 ~ 2,77 3,69 ~ 1,25 BIMU1 373 ~ 119 123,4 ~ 9,0 66 ~ 8,37 38,85 ~ 12 Renzapride 635 ~ 148 1179 ~ 142 636 ~ 91 173 ~ 40 Zacopride 7750 ~ 1615 11490 ~ 950 10630 ~ 2160 3599 ~ 1835 GR113808 0,33 ~ 0,033 0,53 ~ 0,10 0,41 ~ 0,13 0,078 ~ 0,24 ML10375 0,56 ~ 0,11 1,62 ~ 0,82 0,61 ~ 0,08 0,41 ~ 0,10 Les expériences correspondent à la compétition de divers composés pour la liaison de [3H]GR113808 à des membranes de cellules COS-7 transfectées de manière transitoire. Pour chaque isoforme du récepteur 5-HT4 humain, la concentration de [3H]GR113808 a été ajustée à 50 % de la valeur du Kd. Les estimations d'affinité sont données comme des valeur de Ki en nM et sont déterminées à partir de valeur IC50 obtenues par analyse de courbe non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism Software). Les valeurs de Ki sont représentatives d'au moins deux déterminations. L'ordre des puissances des drogues testées est identique pour les quatre isoformes 5-HT4 et sont : GR113808 > ML10375 > ML10302 > BIMU1 > Renzapride = 5-HT > 5 MeOT > Zacopride. EXEMPLE 5 : ML10375 : Agoniste inverse du récepteur 5-HT4 ML10375 est capable de réduire les niveaux d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes 5-HT4(c) et 5-HT4(d) en l'absence d'une quelconque simulation du récepteur par des agonistes 5-HT4. Pour tester l'hypothèse que ML10375 puisse constituer un agoniste inverse pour le récepteur 5-HT4 humain, l'isoforme 5-HT4(c) a été surexprimée dans des cellules COS-7 afin d'augmenter la fréquence de l'état du récepteur spontanément actif. Les cellules COS-7 ont été transfectées avec 4 à 8 pg d'ADN plasmidique par puits afin d'obtenir une augmentation des niveaux d'expression du récepteur 5-HT4(c). La transfection des cellules COS-7 en utilisant 4 pg et 8 pg d'ADN plasmidique a augmenté le niveau basal d'AMPc de 59 % et de 235 % respectivement (figure 6A). La 5-HT (1 pM) a induit une augmentation de 64 % du niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées avec 4 pg d'ADN plasmidique mais n'a pas augmenté significativement le niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées avec 8 ug d'ADN plasmidique (figure 6A). Ce dernier résultat indique que dans les cellules surexprimant l'isoforme du récepteur 5-HT0), la fréquence du récepteur spontanément actif empêche l'effet stimulateur de la 5-HT sur l'activité adénylate cyclase. La forskoline (10 pM) a induit des augmentations similaires des concentrations en AMPc dans les cellules transfectées par soit 4 pg soit 8 pg d'ADN plasmidique et dans les cellules transfectées "à blanc" (figure 6A), indiquant que le potentiel d'activation maximal de l'adénylate cyclase n'a pas été affecté dans les cellules surexprimant l'isoforme 5-HT4(c). Dans les cellules COS-7 transfectées avec 4 pg et 8 pg d'ADN plasmidique, ML10375 (1 pM) a diminué les valeurs basales d'AMPc de 24 % et 62 %, respectivement (figure 6B). Dans les cellules transfectées avec 4 pg d'ADN plasmidique, la préincubation avec ML10375 (1 pM) a antagonisé l'effet stimulateur de 5-HT (1 pM) sur l'AMPc basal (figure 6B). Dans les cellules transfectées avec 8 pg d'ADN plasmidique, la préincubation avec ML10375 (1 pM) a induit une diminution de 47 % du niveau d'AMPc basal même en présence de 1 pM de 5 HT (figure 6B). Pour tester si l'effet de ML10375 sur le niveau d'AMPc correspond à une activation des récepteurs 5-HT4(c) spontanément actifs ou à une inhibition de l'activité adénylate cyclase par la voie régulatrice médiée par la protéine Gi, I'effet de ML10375 a été examiné dans les cellules COS-7 transfectées avec 6 pg d'ADN plasmidique 5-HT4C) en présence ou en l'absence de PTX (100 ng/ml). Le traitement par PTX n'a modifié ni le niveau basal d'AMPc ni la stimulation d'AMPc induite par la 5-HT et la forskoline dans les cellules transfectées (figure 6C). De plus, le traitement par PTX n'a pas modifié significativement la réduction d'AMPc basal induite par ML 10375 dans les cellules transfectées (figure 6D). EXEMPLE 6: Caractérisation pharmacologique des variants d'épissage des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière stable dans les cellules CHO Matériels: Le milieu HAM-F12 a été obtenu chez Gibco-BRL. ML 10375 (4amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthylpipéridino)éthyl) a été synthétisé selon Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997. GR113808 (1méthyl-1 H-indole-3-carboxylate de ([1-[2-(méthylsulfonyl)amino]éthyl]4- pipéridinyl] méthyl) a été obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware, Hertfordshire, U.K.) et [3H]GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham (Arlington, Heights,IL). L'électroporateur utilisé était un Gene Pusler obtenu auprès de Biorad. 1. Transfection de l'ADN La région codante entière des ADNc de 5-HT4(c) et 5-HT4(d) a été sous-clonée dans un vecteur d'expression de mammifère pRC/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les cellules CHO sont transfectées de façon stables par électroporation (250 V, 960 pF) avec le plasmide PRclCMV contenant le clone h5-HT4) ou hS-HT d) coupé par l'enzyme de restriction Kpnî (îOpg de plasmide pour 107 cellules). Les cellules sont cultivées dans du milieu HAM-F12 complémenté avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur. Après 48 heures, la généticine (1.25 mg/ml) est ajoutée dans le milieu. Douze jours plus tard, les clones sont individualisés et cultivés dans des plaques 12 puits. La sélection des clones s'effectue en étudiant la stimulation de l'AMPc formé en présence de 1 pM de sérotonine. Pour les tests de liaison aux radioligands ou pour la mesure de la formation d'AMPc, les cellules transfectées avec les constructions d'ADNc des récepteur 5-HT4 ont été comparées avec les cellules transfectées "à blanc" qui ont été exposées au plasmide pRC/CMV non modifié. 2. Préparation membranaire Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le culot a été resuspendu dans 2,5 ml de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4) et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes à 4 C. Le culot résultant a été resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4) Les préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al., 1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard. 3. Tests de liaison du radioliaand. Les études de liaison du radioligand ont été réalisées dans 500 pI de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) 20 ul de ML 10375, pour donner une concentration finale de 10 pM (pour la détermination de la liaison non spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et 20 ul de [3H]GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de Kd et 50 ul (100-200 pg) de préparation membranaire. Les études de saturation ont été conduites en utilisant [3H]GR113808 à 9 concentrations différentes allant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25 C pendant 30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à travers un papier filtre Whatman GF/B en utilisant le récolteur de cellules 48R Brandel. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour réduire la liaison aux filtres. Les filtres ont été ensuite lavés avec un tampon glacé (50 mM Tris-HCI, pH 7,4) et placés une nuit dans 4 ml de cocktail de scintillation "ready safe" (Beckman, Fullerton, CA). La radioactivité a été mesurée en utilisant un compteur de scintillation liquide Beckman LS 6500 C. Les données de liaison ont été analysées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (Graph Pad Prism Program, Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA). 4. Résultats des tests de liaison L'analyse de saturation utilisant [3H]GR113808 a révélé des sites de haute affinité saturables, uniques pour les deux variants d'épissage du récepteur. Les valeurs similaires de Kd pour [3H]GR113808 ont été trouvées entre les deux isoformes 5-HT4 EXEMPLE 7 : Stimulation de la production d'AMPc par les variants d'épissage 5-HT4 exprimés de manière stable dans les cellules CHO Matériels: Les milieux DMEM et HAM-F12 ont été obtenus chez GIBCO BRL. La 5-hydroxytryptamine (5-HT) a été obtenue chez Aldrich (L'lsle d'Abeau Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez Sigma (L'lsle d'Abeau Chesnes, France). 1. Mesure de la formation d'AMPc Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les cellules CHO transfectées de manière stable sont incubées dans le milieu HAM-F12 contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 pM de pargyline pendant 15 minutes à 37 C en présence de 5 % de CO2. La 5-HT (1 pM) a été ajoutée et les cellules incubées pendant 15 minutes supplémentaires à 37 C en présence de 5 % de CO2. La réaction a été stoppée par aspiration du milieu et addition de 500 ul d'éthanol refroidi dans de la glace. Après une heure à température ambiante, les cellules ont été grattées et l'ensemble a été recueilli et lyophilisé. Le culot a été resuspendu dans 350 l de PBS et centrifugé pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été quantifié dans le surnageant en utilisant un test radioimmunologique (E.R.I.A. kit de dosage de Pasteur Diagnostics 79830). Les tests t de Student ont été réalisés en utilisant le logiciel Quick TEst. 2. Stimulation de la Production d'AMPc. Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à être couplés à l'adénylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des cellules CHO transfectées de manière stable avec les ADNc de h5-HT4(c) et h5-HT4(d). Les valeurs d'AMPc basales n'étaient pas significativement différentes dans les cellules transfectées "à blanc" et les cellules exprimant les récepteurs h5-HT4(c) et h5-HT4 REFERENCES Adham N., Gerald C., Schechter L., Vaysse P., Weinshank R., and Branchek T. (1996) [3H]S-hydroxytryptamine labels the agonist high affinity state of the cloned rat 5-HT4 receptor. Eur. J. Pharmacol. 304, 231235. Ansanay H., Sebben M., Bockaert J., and Dumuis A. (1996) Pharmacological comparison between [3H]GR113808 binding sites and functional 5-HT4 receptors in neurons. Eur. J. Pharmacol. 298, 165-174. Benoit et al., PNAS USA, 1982, 79, 917-921 Blondel O., Vandecasteele G., Gastineau M., Leclerc S., Dahmoune Y., Langlois M., and Fischmeister R. (1997) Molecular and functional characterization of a 5-HT4 receptor cloned from human atrium. FEBS Lett. (in press). Bonhomme N., De Deurwaèrdere P., Le Moal M., and Spampinato U. (1995) Evidence for 5-HT4 receptor subtype involvement in the enhancement of striatal dopamine release induced by serotonin: a microdialysis study in the halotane-anesthetized rat. Neuropharmacology 34, 269-279. Boussif O., Lezoualch F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B., and Behr J. P. (1995) A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natal. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301. Candura S. M., Messori E., Franceschetti G. P., D'Agostino G., Vicini D., Tagliani M., and Tonini M. (1996) Neural 5-HT4 receptors in the human isolated detrusor muscle: effects of indole, benzimidazolone and substituted benzamide agonists and antagonists. Br. J. Pharmacol. 118,1965- 1970. Claeysen S., Faye P., Sebben M., Lemaire S., Bockaert J., and Dumuis A. (1997) Cloning and expression of human 5-HT4S receptors. Effect of receptor density on their coupling to adenylyl cyclase. FEBS Letters 398, 1925. Claeysen S., Sebben M., Journot L., Bockaert J., and Dumuis A. (1996) Cloning, expression and pharmacology of the mouse 5-HT4L receptor. FEBS Letters 398,19-25. Coughlin S. R. (1994) Expanding horizons for receptors coupled to G proteins: diversity and disease. Curr. Opin. Biol. 6, 191-197. Dolman H. G., Thorner J., Caron M. G., and Lefkowitz R. J. (1991) Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Annu. Rev. Biochem. 60, 653-88. Eglen R. M., Wong E. H. F., Dumuis A., and Bockaert J. (1995) Central 5-HT4 receptors. Trends Pharmacol. Sci. 16, 391-397. Ford A. P. and Clarke D. E. (1993) The 5-HT4 receptor. Med. Res. Rev. 13, 633662. Freedman N. J., Liggett S. B., Drachman D. E., Pei G., Caron M. G., and Lefkowitz R. J. (1995) Phosphorylation and desensitization of the human ss1-adrenergic receptor. J. Biol. Chem. 270, 17953-17961. Gerald C., Adham N., Kao H. T., Olsen M. A., Laz T. M., Schechter L. E, Bard J. E., Vaysse P. J. J., Hartig P. R., Branchek T. A., and Weinshank R. L. (1995). The 5-HT4 receptor: molecular cloning and pharmacological characterization of two splice variants. EMBO J. 14,28062815. Hegde S. and Eglen R. (1996) Peripheral 5-HT4 receptors FASEB J. 10, 1398-1407. Heidmann D. E. A., Metcalf M. A., Kohen R., and Hamblin M. W. (1997) Four 5-hydroxytryptamine7 (5-HT7) receptor isoforms in human and rat produced by alternative splicing: species differences due to altered intron-exon organization. J. Neurochem. 68, 1372-1381. Hoyer D., Clarke D. E., Fozard J. R., Hartig P. R., Martin G. R., Mylecharane E. J., Saxena P. R. and Humphrey P. P. A. (1994) International Union of Pharmacology classification of receptors for 5-hydroxytryptamine (Serotonin). Pharmacol. Rev. 46, 157-204. Hoyer D. and Martin G. (1997) 5-HT receptor classification and nomenclature: towards a harmonization with the human genome. Neuropharmacology 36, 419-428. Kaumann A. J. (1994) Do human atrial 5-HT4 receptors mediate arrhythmias? Trends Pharmacol. Sci. 15,451-455. Kaumann A. J., Lynham J. A., and Brown A. M. (1996) Comparison of the densities of 5-HT4 receptors, ss1- and Q2-adrenoceptors in human atrium: functional implications. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 353, 592-595. Kaumann A. J., Lynham J. A., and Brown A. M. (1995) Labelling with [1251]-SB 207710 of a smalt 5-HT4 receptor population in piglet right atrium: functional relevance. Br. J. Pharmacol. 115, 933-936. Kaumann A. J., Sanders L., Brown A. M., Murray K. J., and Brown M. J. (1991) A 5-HT4-like receptor in human right atrium. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 344, 150-157. Kenakin T. (1996) The classification of seven transmembrane receptors in recombinant expression systems. Pharmacol. Rev. 48, 413-463. Kôhler et Milstein (Nature (1975) vol. 256, pp 495-497. Langlois M., Zhang L., Yang D., Brémont B., Shen S., Manara L., and Croci T. (1994). Design of a potent 5-HT4 receptor agonist with nanomolar affinity. Biomed. Chem. Lett. 4,1433-1436. Lowry, O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randall R. J. (1951) Protein measurements with the folin reagent. J. Biol. Chem. 193, 265275. Marchetti-Gauthier E., Roman F. S., Dumuis A., Bockaert J., and Soumireu-Mourat B. (1997) BIMU1 increases associative memory in rats by activating 5-HT4 receptors. Neuropharmacology 36, 697-706. Namba T., Sugimoto Y., Negishi M., Irie A., Ushikubi F., Kakizuka A., Ito S., Ichikawa A., and Narumiya S. (1993) Alternative splicing of Cterminal tail of prostaglandin E receptor subtype EP3 determines G-protein specificity. Nature 365, 166-170. Newton C. R. and Graham A. (1994) Isolation and construction of DNA clones, in PCR (Graham, J. M. and Billington, D., eds.), pp. 47-57, Bios Scientific Publishers, Oxford, UK Pei G., Samama P., Lohse M., Wang M., Codina J., and Lefkowitz R. J. (1994) A constitutively active mutant ss2-adrenergic receptor is constitutively desensitized and phosphorylated. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2699-2702. Prezeau L., Gomeza J., Ahern S., Mary S., Galvez T., Bockaert J., and Pin J. P. (1996) Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with different agonist-independent activity. Mol. Pharmacol. 49, 422-429. Reynolds G.. P., Mason L., Meldrum A., De Keczer S., Parnes H., and Wong E. H. F. (1995) 5- hydroxytryptamine (5-HT)4 receptors in post mortem human brain tissue: distribution, pharmacology and effects of neurodegenerative diseases. Br. J. Pharmacol. 114, 993-998. Rondé P., Ansanay H., Dumuis A., Miller R., and Bockaert J. (1995) Homologous desensitization of 5-hydroxytryptamine4 receptors in rat oesophagus: functional and second messenger studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 272, 977-983. Saxena P. R. (1995) Serotonin receptors: subtypes, functional responses and therapeutic relevance. Pharmacol. Ther. 66, 339-368. Spengler D., Waeber C., Pantaloni C., Holsboer F., Bockaert J., Seeburg P. H., and Journot L. (1993) Differential signal transduction by five splice variants of the PACAP receptor. Nature 365,170-175. Ullmer C., Schmuck K., Kalkman H. O., and Lübbert H. (1995) Expression of serotonin receptor mRNAs in blood vessels. FEBS Lett. 370, 215-221. Van den Wyngaert I., Gommeren W., Verhasselt P., Jurzak M., Leysen J., Luyten W., Bender E. (1997) Cloning and expression of a human serotonin 5-HT4 receptor cDNA. J. Neurochem. 69,1810-1819. Waeber C., Sebben M., Grossman C., Javoy-Agid F., Bockaert J., and Dumuis A. (1993) [3H]-GR113808 labels 5-HT4 receptors in the human and guinea-pig brain. Neuroreport 4, 1239-1242. Westphal R. S., Backstrom J. R., and Sander-Bush E. (1995) Increased basal phosphorylation of the constitutively active serotonin 2C receptor accompanies agonist-mediated desensitization. Mol. Pharmacol. 48, 200-205. * Wong E. H., Reynolds G. P., Bonhaus D. W., Hsu S., and Eglen R. M. (1996) Characterization of [3H]GR113808 binding to 5-HT4 receptors in brain tissues from patients with neurodegenerative disorders. Behav. Brain Res. 73, 249-252. Yang D., Soulier J. L., Sicsic S., Mathé- Allainmat M., Brémont B., Croci T., Cardamone R., Aureggi G., and Langlois M. (1997) New esters of 4amino-5-chloro-2-methoxybenzoic acid as potent agonists and antagonists for 5-HT4 receptors. J. Med. Chem. 40, 608-621. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSERM (B) RUE: 101, rue de Tolbiac (C) VILLE: Paris (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75013 (ii) TITRE DE L' INVENTION: variants d'épissage du récepteur 5-HT4 (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 41.0, Version 41.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SéQUENCE: (A) LONGUEUR: 1170 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin, aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 19..1158 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: CGGTGCTTAT TTCCTGTA ATG GAC AAA CTT GAT GCT AAT GTG AGT TCT GAG 51 Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu 1 5 10 GAG GGT TTC GGG TCA GTG GAG AAG GTG GTG CTG CTC ACG TTT CTC TCG 99 Glu Gly Phe Gly Ser Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser 15 20 25 ACG GTT ATC CTG ATG GCC ATC TTG GGG AAC CTG CTG GTG ATG GTG GCT 147 Thr Val Ile Leu Met Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala 30 35 40 GTG TGC TGG GAC AGG CAG CTC AGG AAA ATA AAA ACA AAT TAT TTC ATT 195 Val Cys Trp Asp Arg Gln Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Phe Ile 45 50 55 GTA TCT CTT GCT TTT GCG GAT CTG CTG GTT TCG GTG CTG GTG ATG CCC 243 Val Ser Leu Ala Phe Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro 60 65 70 75 TTT GGT GCC ATT GAG CTG GTT CAA GAC ATC TGG ATT TAT GGG GAG GTG 291 Phe Gly Ala Ile Glu Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val 80 85 90 TTT TGT CTT GTT CGG ACA TCT CTG GAC GTC CTG CTC ACA ACG GCA TCG 339 Phe Cys Leu Val Arg Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser 95 100 105 ATT TTT CAC CTG TGC TGC ATT TCT CTG GAT AGG TAT TAC GCC ATC TGC 387 Ile Phe His Leu Cys Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys 110 115 120 TGC CAG CCT TTG GTC TAT AGG AAC AAG ATG ACC CCT CTG CGC ATC GCA 435 Cys Gln Pro Leu Val Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala 125 130 135 TTA ATG CTG GGA GGC TGC TGG GTC ATC CCC ACG TTT ATT TCT TTT CTC 483 Leu Met Leu Gly Gly Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe Ile Ser Phe Leu 140 145 150 155 CCT ATA ATO CAA GGC TGG AAT AAC ATT GGC ATA ATT GAT TTG ATA GAA 531 Pro Ile Met Gln Gly Trp Asn Asn Ile Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu 160 165 170 AAG AGG AAG TTC AAC CAG AAC TCT AAC TCT ACG TAC TGT GTC TTC ATG 579 Lys Arg Lys Phe Asn Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met 175 180 185 GTC AAC AAG CCC TAC GCC ATC ACC TGC TCT GTG GTG GCC TTC TAC ATC 627 Val Asn Lys Pro Tyr Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile 190 195 200 CCA TTT CTC CTC ATG GTG CTG GCC TAT TAC CGC ATC TAT GTC ACA GCT 675 Pro Phe Leu Leu Met Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala 205 210 215 AAG GAG CAT GCC CAT CAG ATC CAG ATG TTA CAA CGG GCA GGA GCC TCC 723 Lys Glu His Ala His Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser 220 225 230 235 TCC GAG AGC AGG CCT CAG TCG GCA GAC CAG CAT AGC ACT CAT CGC ATG 771 Ser Glu Ser Arg Pro Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met 240 245 250 AGG ACA GAG ACC AAA GCA GCC AAG ACC CTG TGC ATC ATC ATG GGT TGC 819 Arg Thr Glu Thr Lys Ala Ala Lys Thr Leu Cys Ile Ile Met Gly Cys 255 260 265 TTC TGC CTC TGC TGG GCA CCA TTC TTT GTC ACC AAT ATT GTG GAT CCT 867 Phe Cys Leu Cys Trp Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro 270 275 280 TTC ATA GAC TAC ACT GTC CCT GGG CAG GTG TGG ACT GCT TTC CTC TGG 915 Phe Ile Asp Tyr Thr Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp 285 290 295 CTC GGC TAT ATC AAT TCC GGG TTO AAC CCT TTT CTC TAC GCC TTC TTG 963 Leu Gly Tyr Ile Asn Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu 300 305 310 315 AAT AAG TCT TTT AGA CGT GCC TTC CTC ATC ATC CTC TGC TGT GAT GAT 1011 Asn Lys Ser Phe Arg Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp 320 325 330 GAG CGC TAC CGA AGA CCT TCC ATT CTG GGC CAG ACT GTC CCT TGT TCA 1059 Glu Arg Tyr Arg Arg Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser 335 340 345 ACC ACA ACC ATT AAT GGA TCC ACA CAT GTA CTA AGT TCT GGA ACT GAA 1107 Thr Thr Thr Ile Asn Gly Ser Thr His Val Leu Ser Ser Gly Thr Glu 350 355 360 ACC GAC AGA AGA AAC TTT GGA ATA AGG AAG AGA AGA TTG ACC AAA CCA 1155 Thr Asp Arg Arg Asn Phe Gly Ile Arg Lys Arg Arg Leu Thr Lys Pro 365 370 375 TCC TAATGCCAAA AA 1170 Ser 380 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 380 acides aminés (B) TYPE: acide aminé, (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu Glu Gly Phe Gly Ser 1 5 10 15 Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser Thr Val Ile Leu Met 20 25 30 Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala Val Cys Trp Asp Arg 35 40 45 Gln Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Phe Ile Val Ser Leu Ala Phe 50 55 60 Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro Phe Gly Ala Ile Glu 65 70 75 80 Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Cys Leu Val Arg 85 90 95 Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser Ile Phe His Leu Cys 100 105 110 Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys Cys Gln Pro Leu Val 115 120 125 Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala Leu Met Leu Gly Gly 130 135 140 Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe Ile Ser Phe Leu Pro Ile Met Gln Gly 145 150 155 160 Trp Asn Asn Ile Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu Lys Arg Lys Phe Asn 165 170 175 Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met Val Asn Lys Pro Tyr 180 185 190 Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile Pro Phe Leu Leu Met 195 200 205 Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala Lys Glu His Ala His 210 215 220 Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Arg Pro 225 230 235 240 Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met Arg Thr Glu Thr Lys 245 250 255 Ala Ala Lys Thr Leu Cys île Ile Met Gly Cys Phe Cys Leu Cys Trp 260 265 270 Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro Phe Ile Asp Tyr Thr 275 280 285 Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ile Asn 290 295 300 Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asn Lys Ser Phe Arg 305 310 315 320 Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp Glu Arg Tyr Arg Arg 325 330 335 Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser Thr Thr Thr Ile Asn 340 345 350 Gly Ser Thr His Val Leu Ser Ser Gly Thr Glu Thr Asp Arg Arg Asn 355 360 365 Phe Gly Ile Arg Lys Arg Arg Leu Thr Lys Pro Ser 370 375 380 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1208 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 19..1098 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CGGTGCTTAT TTCCTGTA ATG GAC AAA CTT GAT GCT AAT GTG AGT TCT GAG 51 Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu 1 5 10 GAG GGT TTC GGG TCA GTG GAG AAG GTG GTG CTG CTC ACG TTT CTC TCG 99 Glu Gly Phe Gly Ser Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser 15 20 25 ACO GTT ATC CTG ATG GCC ATC TTG GGG AAC CTG CTG GTG ATG GTG GCT 147 Thr Val Ile Leu Met Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala 30 35 40 GTG TGC TGG GAC AGG CAG CTC AGG AAA ATA AAA ACA AAT TAT TTC ATT 195 Val Cys Trp Asp Arg Gln Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Phe Ile 45 50 55 GTA TCT CTT GCT TTT GCG GAT CTG CTG GTT TCG GTG CTG GTG ATG CCC 243 Val Ser Leu Ala Phe Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro 60 65 70 75 TTT GGT GCC ATT GAG CTG GTT CAA GAC ATC TGG ATT TAT GGG GAG GTG 291 Phe Gly Ala Ile Glu Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val 80 85 90 TTT TGT CTT GTT CGG ACA TCT CTG GAC GTC CTG CTC ACA ACG GCA TCG 339 Phe Cys Leu Val Arg Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser 95 100 105 ATT TTT CAC CTG TGC TGC ATT TCT CTG GAT AGG TAT TAC GCC ATC TGC 387 Ile Phe His Leu Cys Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys 110 115 120 TGC CAG CCT TTG GTC TAT AGG AAC AAG ATG ACC CCT CTG CGC ATC GCA 435 Cys Gln Pro Leu Val Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala 125 130 135 TTA ATG CTG GGA GGC TGC TGG GTC ATC CCC ACG TTT ATT TCT TTT CTC 483 Leu Met Leu Gly Gly Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe île Ser Phe Leu 140 145 150 155 CCT ATA ATG CAA GGC TGG AAT AAC ATT GGC ATA ATT GAT TTG ATA GAA 531 Pro Ile Met Gln Gly Trp Asn Asn Ile Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu 160 165 170 AAG AGG AAG TTC AAC CAG AAC TCT AAC TCT ACG TAC TGT GTC TTC ATG 579 Lys Arg Lys Phe Asn Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met 175 180 185 GTC AAC AAG CCC TAC GCC ATC ACC TGC TCT GTG GTG GCC TTC TAC ATC 627 Val Asn Lys Pro Tyr Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile 190 195 200 CCA TTT CTC CTC ATG GTG CTG GCC TAT TAC CGC ATC TAT GTC ACA GCT 675 Pro Phe Leu Leu Met Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala 205 210 215 AAG GAG CAT GCC CAT CAG ATC CAG ATG TTA CAA CGG GCA GGA GCC TCC 723 Lys Glu His Ala His Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser 220 225 230 235 TCC GAG AGC AGG CCT CAG TCG GCA GAC CAG CAT AGC ACT CAT CGC ATG 771 Ser Glu Ser Arg Pro Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met 240 245 250 AGG ACA GAG ACC AAA GCA GCC AAG ACC CTG TGC ATC ATC ATG GOT TGC 819 Arg Thr Glu Thr Lys Ala Ala Lys Thr Leu Cys Ile Ile Met Gly Cys 255 260 265 TTC TGC CTC TOC TGG GCA CCA TTC TTT GTC ACC AAT ATT GTG GAT CCT 867 Phe Cys Leu Cys Trp Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro 270 275 280 TTC ATA GAC TAC ACT GTC CCT GGG CAG GTG TGG ACT GCT TTC CTC TGG 915 Phe Ile Asp Tyr Thr Val Pro Oîy Gin Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp 285 290 295 CTC GGC TAT ATC AAT TCC GGG TTG AAC CCT TTT CTC TAC GCC TTC TTG 963 Leu Gly Tyr Ile Asn Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu 300 305 310 315 AAT AAG TCT TTT AGA CGT GCC TTC CTC ATC ATC CTC TGC TGT GAT GAT 1011 Asn Lys Ser Phe Arg Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp 320 325 330 GAG CGC TAC CGA AGA CCT TCC ATT CTG GGC CAG ACT GTC CCT TGT TCA 1059 Glu Arg Tyr Arg Arg Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser 335 340 345 ACC ACA ACC ATT AAT GGA TCC ACA CAT GTA CTA AGA TTT TGAGCTCCTT 1108 Thr Thr Thr Ile Asn Gly Ser Thr His Val Leu Arg Phe 350 355 360 GAGGACTGTG GCCAATTCTT ATTGCTCATT TTTTTTCTTA GTGCCCAACA CAGGTTTTTT 1168 TGCACTGAAG TTATCAAATA AATTCATTGG ATGTAAAAAA 1208 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 360 acides aminés (B) TYPE: acide aminé, (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu Glu Gly Phe Gly Ser 1 5 10 15 Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser Thr Val Ile Leu Met 20 25 30 Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala Val Cys Trp Asp Arg 35 40 45 Gln Leu Arg Lys île Lys Thr Asn Tyr Phe île Val Ser Leu Ala Phe 50 55 60 Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro Phe Gly Ala Ile Glu 65 70 75 80 Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Cys Leu Val Arg 85 90 95 Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser Ile Phe His Leu Cys 100 105 110 Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys Cys Gin Pro Leu Val 115 120 125 Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala Leu Met Leu Gly Gly 130 135 140 Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe Ile Ser Phe Leu Pro Ile Met Gln Gly 145 150 155 160 Trp Asn Asn île Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu Lys Arg Lys Phe Asn 165 170 175 Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met Val Asn Lys Pro Tyr 180 185 190 Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile Pro Phe Leu Leu Met 195 200 205 Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala Lys Glu His Ala His 210 215 220 Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Arg Pro 225 230 235 240 Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met Arg Thr Glu Thr Lys 245 250 255 Ala Ala Lys Thr Leu Cys Ile Ile Met Gly Cys Phe Cys Leu Cys Trp 260 265 270 Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro Phe Ile Asp Tyr Thr 275 280 285 Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ile Asn 290 295 300 Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asn Lys Ser Phe Arg 305 310 315 320 Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp Glu Arg Tyr Arg Arg 325 330 335 Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser Thr Thr Thr Ile Asn 340 345 350 Gly Ser Thr His Val Leu Arg Phe 355 360 REVENDICATIONS 1. Polypeptide isolé constitutif de variants d'épissage du récepteur humain sérotoninergique dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi la séquence SEQ ID N 2 du polypeptide variant 5-HT4(c)i OU la séquence SEQ ID n 4 du polypeptide variant 5-HT4 (d) ou tout fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celui-ci. 2. Séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n 1, la séquence SEQ ID n 3, les séquences nucléotidiques dérivées de la séquence SEQ ID n01 ou de la séquence SEQ ID n"3 du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, ou d'insertion, et les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3. 3. Vecteur de clonage etlou d'expression contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 2. 4. Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication 3. 5. Anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide récepteur selon la revendication 1, dérivé, ou fragment polypeptidique de celui-ci biologiquement actif, administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon la revendication 1. 6. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 7. Procédé de production d'un polypeptide recombinant 5 HT) ou 5-HT4 {d, fragment, ou dérivé de celui-ci biologiquement actif, dans lequel on cultive des cellules transformées selon la revendication 4 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID n 2 ou SEQ ID n 4 ou tout fragment, ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et on récupère ledit polypeptide, fragment, ou dérivé de celui-ci biologiquement actif. 8. Procédé de criblage de composés susceptibles de se lier au polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) selon la revendication 1, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ledit polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d). 9. Procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier au polypeptide 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) selon la revendication 1, appelés ligands du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 (d), comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide 5-HT4 (c) etlou 5-HT4(d), en présence d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4(c) etlou 5 HT ); et b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du signal 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel on évalue la capacité du ligand à moduler la transduction du signal en déterminant la concentration intracellulaire en AMPc ou l'activité de l'adénylate cyclase. 11. Méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4 (d) dans un prélèvement biologique etlou de mesure du taux d'expression de celui-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps selon la revendication 5 avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques formés. 12. Procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5 HT4(c) ou 5-HT4(d) dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à - préparer l'ARN dudit échantillon; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3, telle que définie dans la revendication 2 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur 5-HT ) ou 5-HT4(d). 13. Procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5 HT > ou 5-HT4(d) dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à: - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n01 ou la séquence SEQ ID n 3, telle que définie dans la revendication 2 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur 5-HT4tc) ou 5-HT4 (d. 14. Méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la sérotonine ou de ses analogues dans un prélèvement biologique etlou de mesure du taux d'expression de celle-ci/ceuxci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'un polypeptide selon la revendication 1 avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et la sérotonine ou ses analogues et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. 15. Utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4C, selon la revendication 1 pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du système nerveux central associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT4 16. Utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4(d) selon la revendication 1 pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicaments destinés à traiter les troubles du tractus gastro-intestinal associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT4(d). 17. Utilisation du 4-amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate de 2-(cis3, 5-diméthylpipéridino)éthyl pour la préparation de médicaments à action agoniste inverse envers le récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d).