Brevet FR2771422A1 — publié le 19990528

REACTIFS ET METHODES POUR LA DETECTION DE GENES LIES AU COMPLEXE MAJEUR D'HISTOCOMPATIBILITE D'OISEAUX D'ELEVAGE, TELS QUE LE POULET L'invention a pour objet la détection de gènes liés au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) d'oiseaux d'élevage, tels que le poulet. A ce titre, elle concerne des molécules d'acides nucléiques permettant de détecter ceux des gènes du CMH impliqués dans les phénomènes de résistance ou de susceptibilité au développement de tumeurs viro-induites. L'invention concerne également les applications de ces molécules d'acides nucléiques, notamment pour le développement de tests de génotypage chez les oiseaux d'élevage, en particulier le poulet, et pour la sélection d'animaux d'intérêt. Les maladies virales infectieuses sont redoutées des éleveurs en raison de leur caractère contagieux qui conduit à des pertes importantes d'animaux. La vaccination a constitué une prophylaxie efficace jusqu'à l'émergence de souches hypervirulentes, rendant nécessaire l'identification des haplotypes résistants. Diverses méthodes ont ainsi été proposées pour tenter de sélectionner ceux des animaux qui sont capables de résister à de telles pathologies et ceux qui sont au contraire susceptibles d'être affectés. Les techniques les plus utilisées en routine sont basées sur des polymorphismes sérologiques ou de type RFLP. Toutefois, ces méthodes ne fournissent pas de connaissances précises sur le phénomène de résistance ou de susceptibilité à la maladie, en particulier par manque de caractère discriminant vis-à-vis des gènes des systèmes B ou Rfp-Y du CMH. Les travaux des inventeurs sur le séquençage de gènes du CMH a montré la complexité génétique de cette région, ce qui les a conduits à prendre en compte un autre type de polymorphisme, à savoir basé sur la séquence de ces gènes et des régions apparentées, telles que celles de leurs promoteurs et des régions microsatellitaires. Les inventeurs ont ainsi mis au point des moyens pour disposer de molécules oligonucléotidiques hautement spécifiques des polymorphismes observés, permettant d'identifier les parties de gènes, et même les sites impliqués dans le contrôle de la résistance ou de la susceptibilité au développement de tumeurs. Le caractère spécifique de ces molécules, visà-vis d'un gène donné de l'un des systèmes du CMH, en fait des outils discriminants particulièrement fiables pour identifier avec précision la capacité de résistance ou de susceptibilité du poulet étudié, ou d'autres oiseaux, à une infection virale, et pour étudier au niveau moléculaire les séquences du CMH impliquées. L'invention a donc pour but de fournir des molécules d'acides nucléiques permettant de détecter spécifiquement, chez les oiseaux d'élevage et en particulier chez le poulet, les gènes liés au CMH impliqués dans les phénomènes de résistance ou de susceptibilité au développement de tumeurs viro-induites. Elle vise également à fournir une méthode et un kit de détection de génotypes de mise en oeuvre aisée en routine. Les molécules d'acides nucléiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'il s'agit de molécules, isolées de leur environnement naturel, d'acides nucléiques de gènes codant pour des protéines impliquées dans le contrôle de la résistance ou de la susceptibilité au développement de tumeurs viro-induites chez les oiseaux d'élevage, telles que celles de la maladie de Marek chez le poulet, avec le cas échéant, les régions qui leur sont attachées, telles que celles du promoteur ou microsatellitaires. Le terme gène tel qu'utilisé dans la description et les revendications englobe ces régions. Ces molécules d'acides nucléiques sont plus spécialement caractérisées en ce qu'elles présentent les séquences d'acides nucléiques de gènes du système B ou du système Rfp-Y du CMH des oiseaux d'élevage, à l'exception des séquences des gènes de classe II B-L, du gène 17.5, du gène 12.3 et du gène B-FIV de classe I, ou sont capables de s'apparier avec l'un des brins d'un gène capable de coder pour une protéine telle que définie cidessus dans des conditions faiblement stringentes. L'appariement dans des conditions de faible stringence auquel il est fait référence ci-dessus est réalisé à température ambiante, dans un milieu 0,1 SSC, avec lavage à température ambiante. Les gènes de classe II B-L sont décrits dans Immunogenetics 31:179-187, 1990 et Eur. J. Immunol, 1993, 23:1139-1145. Le gène 17.5 appartient à la superfamille des gènes codant pour les lectines et le gène 12.3 à la famille des gènes codant pour des protéines liant la guanine (guanine nucleotide-binding protein). Ce gène est décrit dans Immunogenetics 39:221-229, 1994. Le gène 12.3 est décrit dans P.N.A.S. USA, vol. 86, 4594-4598, juin 1989, Genetics. Le gène B-FIV de classe I est décrit dans Immunogenetics 31:405-409, 1990. L'invention vise notamment les molécules d'acides nucléiques répondant à ceux des enchaînements de l'un des gènes suivants enchaînement du système Rfp-Y B-FV (figure 1), B-F VI (figure 2) enchaînement du système B, 8.4 génomique (figure 3) ; B-F I (figure 4) C121 (figure 5) ; DM (figure 6) ; TAP1 (du début de l'exon 2 à l'extrémité 3') (figure 7) ; et TAP2G (figure 8) L'étude des séquences d'acides nucléiques des molécules définies plus haut a permis de repérer avec précision les blocs de polymorphismes qui doivent être détectés pour établir un génotypage fiable et précis. En comparant les séquences de ces blocs, provenant de différents gènes d'un même haplotype ou d'un même gène de différents haplotypes, les inventeurs ont pris en considération les enchaînements divergents et élaboré, pour chaque gène, des oligonucléotides complémentaires de ces enchaînements divergents. On dispose ainsi d'amorces spécifiques et discriminantes vis-à-vis d'un gène donné du système B ou du système Rfp-Y. L'invention vise tout spécialement les molécules d'oligonucléotides correspondant à ces enchaînements et comprenant une partie de la région polymorphe des système s du CMH du poulet ou autres oiseaux d'élevage. On rappelle que la région polymorphe peut être dans le gène ou dans une région apparentée telle que les régions microsatellitaires ou celle du promoteur. Selon un mode de réalisation de l'invention, les polymorphismes sont liés à la fonction des systèmes du CMH. I1 s'agit ainsi avantageusement de molécules correspondant à une partie d'un exon. On citera à titre d'exemple des molécules correspondant à l'exon 2 (domaine a 1) des gènes YF du poulet. Un couple d'amorces approprié est constitué par Y-F VI a 1 : GGCCCCGGGATGCCGCGGTTC Y-F VI a 1, R : ATCCGCTCACCGCCCTGG Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les molécules oligonucléotidiques correspondent à une partie d'une région polymorphe qui n'est pas liée à la fonction des systèmes du CMH. Des régions préférées de ce type sont des microsatellites. En considérant par exemple, le gène B-FI, des molécules d'oligonucléotides utilisables pour constituer des couples d'amorces correspondent aux enchaînements suivants B-FI : 5' CCA GCA GTC ACT GCA CAT AT 3' B-FI, R : 5' AGG TGG AGT GCG CAA AGT T 3' Avec les molécules oligonucléotidiques définies ci-dessus et celles élaborées à partir de gènes connus, mais selon la démarche de l'invention, on dispose de jeux d'amorces hautement spécifiques, permettant de déterminer avec précision l'haplotype de l'animal à étudier et de détecter s'il est résistant au développement de tumeurs viro-induites, ou au contraire susceptible d'être affecté. L'invention vise donc également une méthode de génotypage d'oiseaux d'élevage et notamment du poulet. Cette méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend - l'amplification d'un échantillon d'acide nucléique provenant de l'animal à étudier à l'aide d'un ou de plusieurs couples d'amorces capables de s'hybrider spécifiquement avec l'acide nucléique d'une région polymorphe des système s Rfp-Y ou B du CMH desdits oiseaux, - la détection des produits de PCR obtenus. Une simple comparaison des résultats obtenus avec un référentiel établi au préalable permet de déterminer rapidement l'haplotype de l'animal. L'échantillon d'acide nucléique est constitué en particulier par de l'ADN génomique extrait de matériel biologique de l'animal à étudier ou par ce matériel même, en particulier par du sang de l'animal. Il peut s'agir en variante d'ADNc, d'ARN ou encore de PNA (polypeptides nucleic acids). Les amorces sont élaborées à partir des molécules oligonucléotidiques définies ci-dessus et, d'une manière générale, de tout gène (et région apparentée) codant pour une protéine impliquée dans le contrôle de la résistance ou de la susceptibilité aux tumeurs viro-induites chez les oiseaux d'élevage et notamment de poulet, en particulier les gènes B-L de classe II, 17.5, 12.3 et B-FIV de classe I. I1 s'agit par exemple d'amorces de régions microsatellitaires permettant de détecter des haplotypes du complexe B, telles que celles élaborées à partir du gène B-FI, et évoquées ci-dessus, ou d'amorces permettant de détecter des haplotypes du système RFp-Y, et élaborées à partir du gène 17.5, comme le couple 17.52 : CAG GAT CTG CAC TGG CCA ATA 17.5, R1 : GAA TGG CGG TGC TTC CGT GCC TGG La détection des produits de PCR est effectuée selon les techniques classiques. Ces techniques comprennent le séquençage, l'électrophorèse, les hybridations avec analyse SSOP ou SSCP. Cette technique sera avantageusement choisie selon la nature du polymorphisme impliqué. Ainsi, dans le cas de polymorphisme de type microsatellite, on détectera avec avantage les produits de PCR selon leur taille en ayant recours aux techniques d'électrophorèse. Lorsque le polymorphisme ne concerne que quelques nucléotides, voire un seul nucléotide, on aura plus spécialement recours, aux fins de différenciation des haplotypes de produits de PCR, aux techniques d'hybridation (analyse sur membrane à l'aide de sondes spécifiques des séquences d'haplotypes, SSOP ou Sequence Specific Oligonucleotide Probe), de migration différentielle des échantillons dénaturés (SSCP ou Single Strand Conformational Polymorphism), ou de séquençage. De manière générale, cette dernière technique est préférée compte tenu de la simplicité de sa réalisation. L'invention fournit ainsi une technique simple et rapide d'établissement du profil génétique d'un grand nombre d'animaux à étudier, ce qui permet de déterminer les haplotypes et de sélectionner ceux d'intérêt en vue d'un élevage. De plus, chaque type de gène pouvant être discriminé en utilisant des amorces présentant la spécificité requise et son appartenance au système B ou Rfp-Y pouvant être établie, il est possible d'effectuer des études fondamentales plus complètes. L'invention vise également un coffret ou trousse pour détecter le génotype du poulet ou autre oiseau d'élevage selon la méthode définie ci-dessus. Ces coffrets ou trousses sont caractérisés en ce qu'ils comportent les réactifs nécessaires pour la réalisation d'au moins une PCR et du test de révélation. En particulier, ils comportent les amorces pour la PCR, un témoin positif de la réaction, ainsi qu'une notice d'utilisation. Les amorces se présentent sous forme lyophilisée ou en solution ou, selon le mode de détection, sur un support. Le support peut être, de manière classique, une plaque multipuits ou se présenter sous forme de puces à ADN. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont exposés dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence à la figure 9 représentant une photo d'électrophorèse de produits de PCR illustrant le test de génotypage de l'invention. On rappelle que les figures 1 à 8, déjà évoquées ci-dessus, illustrent les séquences de gènes selon l'invention. Exemple Etude d'haplotypes Rfp-Y du poulet à l'aide d'amorces microsatellitaires. - amplification avec le Kit Expand High Fidelity PCR System Avec les amorces 17.5 R1/17.52 ADN génomique : 1 g Oligos prendre : 0,3 M dNTP : 8 l qsp H2O 50 l On ajoute 50 l de Mix 2 en mélangeant. Mix 2 : 0,75 l d'enzyme 10 l TP10X avec MgCl2 qsp H2O 50 y1 Programme d'amplification 30 Cycles 940C 940C 650C 720C 40C 2' 30" 1' 1' Avec B-FI/B-FI, R ADN génomique : 1 g Oligos prendre : 0,3 M dNTP : 8 l qsq H2O 50 l et ajouter 50 /l de Mix 2 en mélangeant. Programme d'amplification 30 Cycles 940C 940C 600C 720C 40C 2' 30" 1' 1' - révélation par électrophorèse sur gel d'agarose ou par séquençage. Le test a été appliqué à 9 haplotypes de poulet, sélectionnés sérologiquement pour le complexe B. Il s'agit des haplotypes B4, B5, B7, B12, B13, B14, B15, B21 et d'un haplotype inconnu BX. Plusieurs individus d'un même type ont été étudiés pour B12 (6 individus), B13 (3 individus), B14 (4 individus), B21 (4 individus) et un seul individu pour les autres haplotypes. La figure 9 donne une photo d'électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % des produits de PCR obtenus à l'issue de l'étape d'amplification. Les pistes 1 et 27 correspondent aux marqueurs de taille et les pistes (2 à 25) aux produits de PCR des haplotypes suivants : piste 2 : B4 ; piste 4 : B5 ; piste 5 : B7 ; pistes 6 à 11 : B12 ; pistes 12, 13, 14 : B13 pistes 15, 16, 17, 18 : B14 ; piste 19 : B15 ; pistes 20, 21, 23, 24 ; B21 ; piste 25 : BX (absence de détection pour les pistes 3 et 22). L'examen de cette figure montre que les individus qui ont l'haplotype B12 donnent une même bande et sont donc bien homogènes. La même observation s'applique aux individus B14. En revanche, avec B21, on constate que les profils sont différents, ce qui démontre l'inefficacité de l'approche sérologique. Compte-tenu de la position de la bande de BX, on détermine qu'il s'agit d'un haplotype B4. L'application pratique de cette méthode revient à soumettre les individus naturellement résistants au protocole décrit ci-dessus en prenant en compte les deux systèmes Rfp-Y et B du CMH et à ne sélectionner parmi des animaux à tester que ceux dont le profil correspond à celui des animaux résistants. L'invention fournit ainsi les moyens de vérifier l'homogénéité des animaux et d'effectuer des sélections rigoureuses en prenant en compte chaque système du CMH, et dans ces systèmes les gènes recherchés. REVENDICATIONS 1/ Molécules d'acides nucléiques isolées de leur environnement naturel, de gènes codant pour des protéines impliquées dans le contrôle de la résistance ou de la susceptibilité au développement de tumeurs chez le poulet, telles que celles de la maladie de Marek, et de régions apparentées auxdits gènes caractérisées en ce qu'elles présentent les séquences d'acides nucléiques de gènes du système B ou du système Rfp-Y, correspondant au complexe majeur d'histocompatibilité des oiseaux d'élevage à l'exception des séquences des gènes de classe II B-L, du gène 17.5, du gène 12.3 et du gène B-FIV de classe I, ou sont capables de s'apparier avec l'un des brins d'un gène capable de coder pour une protéine telle que définie ci-dessus dans des conditions faiblement stringentes. 2/Molécules d'acides nucléiques selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles répondent à l'un des enchaînements suivants enchaînement du système Rfp-Y B-FV (figure 1), B-FVI (figure 2) enchaînement du système B, 8.4 génomique (figure 3) ; B-FI (figure 4) C121 (figure 5), DM (figure 6), TAP1 (du début de l'exon 2 à l'extrémité 3') (figure 7), et TAP2G (figure 8). 3/ Molécules d'acides nucléiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles correspondent à une partie des séquences définies dans les revendications 1 ou 2, cette partie étant spécifique et discriminante pour un gène donné des systèmes B et Rfp-Y. 4/ Molécules d'acides nucléiques selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'il s'agit de molécules d'oligonucléotides correspondant à une partie de région polymorphe des systèmes du complexe majeur d'histocompatibilité du poulet. 5/ Molécules d'acides nucléiques selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de molécules d'oligonucléotides correspondant à une partie d'exon. 6/ Molécules d'acides nucléiques selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'il s'agit de molécules d'oligonucléotides correspondant à une partie de région polymorphe qui n'est pas liée à la fonction des systèmes du CMH, telle que les régions microsatellitaires. 7/ Méthode de génotypage d'oiseaux d'élevage et notamment du poulet, caractérisée en ce qu'elle comprend - l'amplification d'un échantillon d'acide nucléique provenant de l'animal à étudier à l'aide d'un ou de plusieurs couples d'amorces capables de s'hybrider spécifiquement avec l'acide nucléique d'une région polymorphe des systèmes Rfp-Y ou B du CMH desdits oiseaux, et - la détection des produits de PCR obtenus. 8/ Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que les amorces sont élaborées à partir des molécules selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, et de tout gène (et région apparentée) codant pour une protéine impliquée dans le contrôle de la résistance ou de la susceptibilité aux tumeurs viro-induites chez les oiseaux d'élevage et notamment de poulet, particulièrement les gènes de classe II B-L, 17.5, 12.3 et B-FIV. 9/ Méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la détection des produits de PCR est effectuée par séquençage. 10/ Coffret ou trousse pour le génotypage d'oiseaux d'élevages et notamment du poulet, caractérisé en ce qu'ils comportent les réactifs nécessaires pour la réalisation d'au moins une PCR et du test de révélation, selon la méthode de la revendication 8 ou 9, en particulier les amorces élaborées à partir des molécules d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 3 à 6.