Brevet FR2771105A1 — publié le 19990521

UTILISATION DU FUSARIUM MONILIFORME POUR LA PRÉPARATION DES DÉRIVÉS 7ALPHA-HYDROXYLÉS DE LA DÉHYDROÉPIANDROSTÉRONE ET DE LA PREGNENOLONE La présente invention est relative à la préparation de dérivés 7a-hydroxylés de la déhydroépiandrostérone (DHEA) et de la pregnènolone (PREG), en utilisant, à la place des réactions chimiques classiques, un processus de bioconversion mettant en oeuvre le Fusarium moniliforme comme agent clé catalysant l'hydroxylation en position 7a des stéroïdes DHEA ou PREG donnés comme substrats. La nécessité de production de stéroïdes 7ahydroxylés est soulignée dans certains brevets d'application où la 7a-hydroxy-DHEA est produite par voie chimique et est revendiquée pour le traitement de la maladie d'Alzheimer (WO 94/03176), l'augmentation de la réponse immunitaire (WO 93/20696; WO 94/03176; WO 94/08588; WO 96/35428), des effets antiglucocorticoïdes (WO 94/08588), le traitement de l'obésité (WO 92/03925), du diabète et de certains cancers (US 4,898,694). Dans ces brevets, la plupart des revendications s'étendent à d'autres stéroïdes 7a-hydroxylés, dont la 7ahydroxy-PREG (US 5,175,154; WO 94/08588; WO 96/35428). Dans tous les cas, l'obtention des stéroïdes 7a-hydroxylés procède de processus chimiques au cours desquels plusieurs étapes permettent d'hydroxyler en positions 7a et 7ss la DHEA ou la PREG. Les stéroïdes 7a-hydroxylés sont ainsi produits avec des rendements qui n'excèdent pas 40% après des étapes de purifications nécessaires et coûteuses. Il est donc apparu souhaitable d'utiliser un processus de bioconversion permettant de faire réaliser par un microorganisme la transformation directe d'un stéroïde comme la DHEA exclusivement en son dérivé 7a-hydroxylé. L'hydroxylation de stéroïdes en diverses positions est décrite depuis longtemps dans "Microbial transformations of steroids" (A. CAPEK et coll., Biologia et Industria, Ed. W. Roman & L. Genevois, 1966 Praha, Publ. Dr. W. Junk, La Hague, Pays-Bas) . Depuis, quelques travaux ont mentionné l'obtention de dérivés 7a-hydroxylés de la DHEA avec des rendements de 21,5% pour Gibberella saubinetti (Okada et coll., Yakugaku Zasshi, 1965, 85:816-822), de 308 pour Diaporthe celastrina (Bell et coll., J.C.S. Perkin I, 1975, 1364-1366), de 35% avec Fusarium graminearum (Defaye et coll., J. Steroid Biochem., 1978, 9:331-336) et de 22,5% avec Mucor pyriformis (Madyastha & Joseph, iAppl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 44:339-343). Ces derniers obtenaient avec Mucor pyriformis 25% de rendement pour la transformation de la PREG en 7a-hydroxy-PREG. Dans l'ensemble de ces travaux, les objectifs poursuivis ne concernaient pas une production exclusive de dérivés 7a-hydroxylés, et dans d'autres publications, les souches utilisées pour la 7a-hydroxylation s'appliquaient à des stéroïdes différents, comme la progestérone, la testostérone ou leurs dérivés saturés. La Demanderesse a maintenant trouvé que, de façon surprenante, la DHEA et la PREG pouvaient être hydroxylées en position 7a avec des rendements nettement supérieurs en utilisant Fusarium moniliforme. En particulier, l'activité 7a-hydroxylante de cette souche s'est révélée hautement inductible par la DHEA, et la souche induite transforme plus de 90% de la DHEA en son dérivé 7a-hydroxylé. Les stéroïdes produits selon l'invention, à savoir la 7a-hydroxy-DHEA et la 7a-hydroxy-PREG sont caractérisés respectivement par les formules suivantes: Le Fusarium moniliforme utilisé pour la production de ces stéroïdes fait partie des ascomycètes et possède donc, à l'état parfait, des asques triseptiques qui le désignent dans le genre Gibberella. L'identification spécifique du Fusarium moniliforme pourrait s'avérer difficile car plusieurs nomenclatures sont utilisées fréquemment. D'une part, Wollenweber et Reinking (Die Fusarium, 1935, Paul Parey, Berlin), le désignent dans le groupe Liseola (3e groupe du genre Gibberella), et d'autre part, Snyder et Haussen (Amer. J. Bot., 1940, 27:64-67) identifient l'espèce en tant que Fusarium moniliforme. Enfin, le Fusarium moniliforme amorphe est quelquefois désigné d'après son genre sous le nom de Gibberella fujikuroi. La souche de Fusarium moniliforme décrite et utilisée dans les essais présentés plus loin a été isolée et identifiée par le groupe de microbiologie de l'Ecole Supérieure de Microbiologie et de Sécurité Alimentaire de Brest (Technopole Brest-Iroise, 29280 Plouzané) où elle est conservée en mycothèque. Pour une croissance optimale, les cultures de Fusarium moniliforme sont réalisées en mode aérobie sur milieu stérile composé de glucose (lOg/litre), poudre d'extrait de boeuf (lOg/litre) et extrait de levure (5g/litre). Le pH du milieu est ajusté à 5,5 et la température est maintenue à 270C. Dans ces conditions, et 48 heures après l'insémination, la masse de mycélium de Fusarium moniliforme obtenue est de 4 grammes/litre environ. Toutefois, toute modification de la composition du milieu ou des conditions d'incubation ou du rendement en poids de mycélium obtenu font partie de la présente invention. Les conditions nécessaires pour que le mycélium de Fusarium moniliforme obtenu puisse assurer la bioconversion de la DHEA ou de la PREG en leurs dérivés 7ahydroxylés décrits ci-dessus sont exposées ci-après. Le mycélium de Fusarium moniliforme produit est récupéré par filtration ou tout autre mode permettant de le séparer de son milieu de culture. Il est ensuite introduit dans un milieu neuf et identique en composition à celui mentionné plus haut, mais contenant de la DHEA 0,3 mM, cette DHEA étant ajoutée au milieu sous forme de solution dans un solvant organique hydrosoluble, de préférence l'éthanol, en quantité n'excédant pas 0,5 pour cent du volume du milieu. La phase d'induction de l'activité 7a-hydroxylante du mycélium débute alors avec l'incubation à 270C en phase aérobie (de 30 à 90 ml d'air par minute et par litre de milieu). L'étude de l'induction du mycélium de Fusarium moniliforme par la DHEA démontre que ce stéroïde est rapidement absorbé du milieu vers le mycélium d'où il est excrété ensuite principalement sous la forme de Va-hydroxy- DHEA (I). Ainsi, au bout de 18 heures d'incubation, 80 pour cent des stéroïdes extraits du milieu sont de la 7a-hydroxy DHEA (Figure 1). Par ailleurs, la recherche de l'activité 7a-hydroxylante induite par la DHEA est localisée principalement dans la fraction microsomale (Figure 2). Dans les microsomes de Fusarium moniliforme induit par la DHEA, cette activité enzymatique est dûe à un cytochrome P450 particulier, comme l'ont démontré l'inhibition de l'activité 7a-hydroxylante par le monoxyde de carbone, les spectres de différence à 450 nm et l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes où une protéine microsomale de 56 kDaltons appara"t au cours du processus d'induction. Dans les microsomes de Fusarium moniliforme induit, la 7a hydroxylation de la DHEA s'effectue avec un h de 1,2 10-6 M et une vitesse maximale de 0,9 nmoles par minute et par mg de protéines microsomales. Le mycelium induit est à nouveau récupéré comme ci-dessus, et introduit dans un nouveau milieu minimal stérile (10 g de mycélium induit par litre), dont la composition peut varier sans affecter la présente invention, mais contenant, de préférence, 1 g par litre de glucose et 9 g par litre de chlorure de sodium à pH 5,5. Ce milieu contient aussi 400 mg par litre de DHEA ou de PREG, ajoutés sous forme de solution dans un solvant organique miscible à l'eau, de préférence l'éthanol, en quantité n'excédant pas 3 pour cent du volume du milieu. Au bout de 24 heures d'incubation aérobie (30 à 90 ml d'air par minute et par litre de milieu), et afin de récupérer les stéroïdes produits de la bioconversion, le milieu d'incubation est soumis à tout procédé d'extraction applicable dans le cadre de la présente invention. L'extraction peut être effectuée avec un solvant organique non miscible à l'eau, de préférence l'acétate d'éthyle. Ainsi, l'application de cette méthode permet, en une seule étape, et grâce au Fusarium moniliforme induit par la DHEA, de transformer plus de 80 pour cent de la DHEA ou de la PREG en leurs dérivés 7a-hydroxylés I ou II, respectivement. Cette transformation est dûe à un cytochrome P450 microsomal spécifiquement induit par la DHEA, et dont l'isolement, la reconstitution, l'immobilisation sur supports artificiels ou l'utilisation par quelque technique que ce soit, font partie de la présente invention. L'invention concerne notamment la production des stéroïdes I et II par bioconversion en une seule étape au moyen de Fusarium moniliforme. Elle concerne également l'utilisation de la déhydroépiandrostérone (DHEA) comme inducteur de l'enzyme effectuant la Va-hydroxylation de la déhydroépiandrostérone et de la pregnènolone dans les microsomes de Fusarium moniliforme. Elle concerne en outre l'utilisation sous forme native dans le myc~lium ou sous forme différemment élaborée des microsomes du Fusarium moniliforme induits par la DHEA pour les productions des composés I et II. Elle concerne aussi l'induction des enzymes microsomales à l'aide de toute molécule organique apte à effectuer cette induction, de préférence la DHEA. Les stéroïdes I ou II élaborés sont avantageusement extraits directement du milieu de culture par tout solvant organique et tout processus se prêtant à cette extraction. Dans les conditions décrites, ces stéroïdes sont obtenus à partir de DHEA ou de pregnènolone (PREG), repectivement avec des taux supérieurs à 60 pour cent de bioconversion. L'isolement et la purification de I ou de II après extraction est effectuée par toute méthode adéquate pour la séparation et la purification de ces stéroïdes. La production des stéroïdes I et II utilise avantageusement la chromatographie séquentielle ou continue à l'échelle industrielle, ou la cristallisation différencielle dans des solvants miscibles de polarités opposées. L'invention concerne encore l'utilisation des stéroïdes I ou II produits selon l'invention pour l'application topique dans les domaines cosmétique et dermopharmaceutique. Elle concerne de plus l'utilisation des milieux de bioconversion contenant les stéroïdes I ou II obtenus selon l'invention dans les domaines cosmétique et dermatopharmaceutique pour les applications anti-âge, hydratante, séborégulatrice, amincissante, raffermissante, pour la protection contre les rayons W et pour le traitement des cheveux ou du cuir chevelu. Dans les dessins annexés : La Figure 1 montre les stéroïdes totaux et la 7ahydroxy-DHEA produite, mesurés dans le milieu et le mycélium de Fusarium moniliforme au cours de l'induction de l'activité 7a-hydroxylante par la DHEA 0,3 mM. La Figure 2 montre l'activité enzymatique mesurée dans les fractions subcellulaires isolées à partir du mycélium de Fusarium moni li forme au cours du processus d'induction de l'activité 7a-hydroxylante par la DHEA 0,3 mM . Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer et mieux expliquer l'invention. Exemple I: Production de 7a-hydroxy-DHEA (I) Un gramme de mycélium de Fusarium moniliforme induit pendant 18 heures par la DHEA est récupéré et introduit dans 100 ml de milieu à pH 5,5 contenant 1 g par litre de glucose, 9 g par litre de chlorure de sodium et 40 mg de DHEA ajoutés en solution dans 2 ml d'éthanol. Afin de quantifier la DHEA et ses produits de transformation, on introduit également 1 200 000 dpm de [4-14C]-DHEA (3 ug dans 10 ul d'éthanol). Après incubation aérobie (5 ml d'air par minute) pendant 24 heures, le milieu est récupéré par filtration, rincé par 100 ml d'eau distillée, puis le filtrat obtenu est extrait par 3 fois 50 ml d'acétate d'éthyle. Cet extrait contient 1 100 000 dpm de la radioactivité initiale, soit 91,6 pour cent (36,7 mg) de la DHEA introduite initialement. L'extrait concentré est soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice (30 g) montée dans l'acétate d'éthyle et éluée par l'acétate d'éthyle. Trois fractions principales sont successivement obtenues, la première correspondant à la DHEA (9,1 pour cent, 3,3 mg), la deuxième correspondant à la 7ss-hydroxy-DHEA (1,3 pour cent, 0,5 mg), et la troisième correspondant à la 7a-hydroxy-DHEA (86 pour cent, 31,6 mg). Dans ces conditions, le rendement de production de la 7a-hydroxy-DHEA récupérée à partir du milieu est donc de 79 pour cent. Un échantillon de 7a-hydroxy-DHEA (I) authentique, produit par synthèse chimique, et dont les caractéristiques physico-chimiques sont celles établies dans les travaux précédents (Dodson et coll., J. Am. Chem. Soc., 1959, 81:6295-6297; Defaye et coll., J. Steroid Biochem., 1978, 9:331-336) sert de référence pour l'identification de la 7a-hydroxy-DHEA produite par le Fusarium moniliforme dans les conditions décrites ci-dessus. Un échantillon de 7a-hydroxy-DHEA (I) authentique et une portion des 31,6 mg de la fraction chromatographique correspondant à la 7a-hydroxy-DHEA, sont transformés en dérivés di-triméthylsilyl éthers (réaction avec le bissilyl-trifluoroacétamide à 600C pendant 40 minutes). Une fraction des des dérivés obtenus est ensuite soumise à la chromatographie en phase gazeuse (colonne capillaire avec phase stationnaire HP-1), couplée à la spectrométrie de masse utilisée en ionisation positive par bombardement d'électrons. Dans les conditions de l'expérience, le temps de rétention sur la colonne chromatographique du dérivé ditriméthylsilyl éther de la 7a-hydroxy-DHEA authentique est de 13,8 minutes, et le spectre de masse indique un fragment majoritaire à m/z 358 (M±90) et des fragments minoritaires à m/z 343, m/z 129 et m/z 73. Le même temps de rétention et un même spectre de masse sont obtenus avec le dérivé ditriméthylsilyl éther du produit récupéré après cette production. Cette identification permet de conclure que le Fusarium moniliforme induit par la DHEA transforme bien la DHEA en 7a-hydroxy-DHEA (I). Dans les conditions décrites, le taux de cette transformation est voisin de 80 pour cent. Exemple II: Production de 7a-hydroxy-PREG (II) Un gramme de mycélium de Fusarium moniliforme induit pendant 18 heures par la DHEA est récupéré et introduit dans 100 ml de milieu à pH 5,5 contenant lg par litre de glucose, 9 g par litre de chlorure de sodium et 40 mg de PREG ajoutés en solution dans 2 ml d'éthanol. Afin de quantifier la PREG et ses produits de transformation, on introduit également 1 200 000 dpm de [20-14C]-DHEA (3,1 pg dans 10 p1 d'éthanol). Après incubation aérobie (5 ml d'air par minute) pendant 24 heures, le milieu est récupéré par filtration, rincé par 100 ml d'eau distillée, puis le filtrat obtenu est extrait par 3 fois 50 ml d'acétate d'éthyle. Cet extrait contient 1 050 000 dpm de la radioactivité initiale, soit 87,5 pour cent (35 mg) de la PREG introduite initialement. L'extrait concentré est soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice (30 g) montée dans l'acétate d'éthyle et éluée par l'acétate d'éthyle. Deux fractions principales sont successivement obtenues, la première correspondant à la PREG (12 pour cent, 4,2 mg), la deuxième correspondant à la 7c(- hydroxy-PREG (74 pour cent, 25,9 mg). Les 14 pour cent restants (4,9 mg) sont constitués de plusieurs produits minoritaires non identifiés. Dans ces conditions, le rendement de production de la 7a-hydroxy-PREG récupérée à partir du milieu est donc de 65 pour cent. Un échantillon de 7a-hydroxy-PREG (II) authentique, produit par synthèse chimique, (Akwa et coll., Biochem. J., 1992, 288: 959-964) sert de référence pour l'identification de la 7a-hydroxy-PREG produite par le Fusarium moniliforme dans les conditions décrites ci-dessus. Un échantillon de 7a-hydroxy-PREG (II) authentique et une portion des 25,9 mg de la fraction chromatographique correspondant à la Va-hydroxy-PREG, sont transformés en dérivés di-triméthylsilyl éthers (réaction avec le bis-silyl-trifluoroacétamide à 600C pendant 40 minutes). Une fraction des dérivés obtenus est ensuite soumise à la chromatographie en phase gazeuse (colonne capillaire avec phase stationnaire HP-1), couplée à la spectrométrie de masse utilisée en ionisation positive par bombardement d'électrons. Dans les conditions de l'expérience, le temps de rétention sur la colonne chromatographique du dérivé di-triméthylsilyl éther de la 7a-hydroxy-PREG authentique est de 17,75 minutes, et le spectre de masse indique un fragment majoritaire à m/z 386 et des fragments minoritaires à m/z 296, m/z 207, m/z 143, m/z 129 et m/z 73. Le même temps de rétention et un même spectre de masse sont obtenus avec le dérivé ditriméthylsilyl éther du produit récupéré après cette production. Cette identification permet de conclure que le Fusarium moniliforme induit par la DHEA transforme bien la PREG en 7a-hydroxy-PREG (II). Dans les conditions décrites, le taux de cette transformation est voisin de 65 pour cent. REVENDICATION 1. Procédé pour la préparation de la 7a-hydroxydéhydroépiandrostérone et de la 7a-hydroxy-pregnènolone à partir de la déhydroépiandrostérone et de la pregnènolone, respectivement, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement une étape de bioconversion utilisant le Fusarium moniliforme.