Brevet FR2762785A1 — publié le 19981106

Les Corynébactéries sont des micro-organismes Gram positifs, généralement en forme de bacille bien qu'il y ait des exceptions importantes, sans mouvement propre, non acido-résistants, qui se multiplient de telle sorte que les cellules filles restent unies par la couche externe de la paroi cellulaire, formant des masses de cellules de forme irrégulière, quelquefois en forme de V. Ce groupe comprend plusieurs genres; notamment les genres appelés Corinebacterium, Arthrobacter, Cellu lomona, Kurthia et Brevibacterium. Les micro-organismes du genre Arthrobacter constituent la partie la plus abondante de la population bactérienne dans les courants et dépôts naturels dans les eaux ainsi que dans les sols. Ce sont des microorganismes résistants à la dessication et non pathogènes pour l'homme et les animaux. Ils ont une forme cylindrique (0,5 à 0,8 mm x 1,2 à 1,5 mm) ou sphérique (0,6 à 0,8 mm). Par exemple, en phase de croissance exponentielle des cultures, c'est la forme cylindrique qui domine largement, suivie d'une évolution vers la forme sphérique dans les cultures plus vieilles ; ils se caractérisent par une grande diversité nutritionnelle et métabolique; il y a même des espèces appartenant à ce genre capables de métaboliser des herbicides, la caféine, la nicotine et d'autres composés organiques normalement absents des sols. Généralement, leurs exigences nutritionnelles ne sont pas strictes, en raison de leur capacité à utiliser des substances organiques diverses en tant que source de carbone (et d'azote), telles que l'acide urique, la glycine, la L-lysine, la L-tirosine, divers glucides, comme cela est détaillé ci-après, les lactates ou malates, les sels d'ammoniac ou nitrate en tant que source d'azote et des facteurs de croissance comme la biotine, la thymine, la vitamine B12, I'acide panthothénique, (vitamine B5f) etc., selon les espèces. Les espèces du genre Arthrobacter se caractérisent par la croissance cyclique des cellules et la composition de la paroi cellulaire (Tableau 17.6, page 620, Bergey, Manual of Systematic Bacteriology 1989 (1), incorporé aux présentes à titre de référence), dont l'alanine et l'acide glutamique sont les principaux composants, la fraction restante comprenant comme composant principal: I'acide diaminopimélique, la lysine, I'acide aspartique, etc., selon les espèces, associés à des glycoprotéines (peptidoglucanes). Caractéristiques biochimiques générales du genre Arthrobacter Catalase (+) N'hydrolysent pas la gélatine et l'amidon, ne produisent pas d'indol ni d'uréases. Teneur en cytosine et guanine (CG) (% en moles dans l'ADN): 59 à 70. Sur agar de levure et peptone, les colonies sont de couleur jaune ou crème de 1,5 à 3,0 mm, et sur gélose salée, elles sont planes, lisses, mucilagineuses et brillantes. Température optimale de culture: 25 à 30"C. II s'agit d'un genre dont on connaît de nombreuses espèces, telles que A. globiformis, A. simplex, A. tumiscens, A. duodecadis, etc., ayant fait l'objet d'études et de recherches à des fins purement scientifiques ainsi qu'à des fins utilitaires. Sous ce deuxième aspect, il convient de mentionner les travaux liés à la production d'acide citrique, par culture de Arthrobacter paraffinens (1) et l'obtention de glutamate de sodium (2). Aux Pays-Bas, on a développé et mis en oeuvre l'utilisation de A. spinosa pour l'hydrolyse de galactobenzoates (4). En outre, dans une demande de brevet français déposée le même jour que la présente par le Déposant, on décrit des produits et compositions utiles pour réguler la glycémie chez les personnes souffrant de diabète non insulinodépendant obtenus à partir de la culture d'espèces sélectives du genre Arthrobacter. On a également découvert qu'il est possible de réguler la cholestérolémie et la lipémie (teneur en lipides dans le sang), en maintenant ces taux à des valeurs physiologiquement acceptables, par l'ingestion ou l'administration dosée de lysats de culture d'espèces sélectives d'Arthrobacter. La présente invention a pour objet un produit utile pour rétablir et maintenir des taux de cholestérol dans le sang, c'est-à-dire de cholestérolémie, physiologiquement acceptables, qui comprend la biomasse formée par des bactéries du genre Arthrobacter cultivées dans un milieu et des conditions favorables à la prolifération des cellules inoculées dans ledit milieu, ledit milieu comprenant du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone, la biomasse étant séparée et recueillie pendant la phase stationnaire de la culture en rejetant le surnageant, la biomasse formée étant ensuite lysée en retenant dans le lysat les composants intracellulaires et les fragments provenant de la désintégration de la membrane et des organules cellulaires des cellules cultivées. La présente invention a également pour objet un produit utile pour rétablir et maintenir des niveaux de cholestérolémie physiologiquement acceptables qui comprend la biomasse formée dans la culture de bactéries du genre Arthrobacter, dans un milieu et des conditions favorables à leur croissance, ledit milieu comprenant du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone assimilable, ladite biomasse étant ensuite séparée et recueillie pendant la phase stationnaire de la culture par filtrage à l'aide de membranes dont les pores ont un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètres en rejetant le surnageant, et en retenant dans le lysat les composants intracellulaires et les organules des cellules cultivées. De préférence, les cellules cultivées du genre Arthrobacter sont celles de l'Arthrobacter pascens, et/ou leurs mutants, variantes ou recombinants. Le milieu comprend de préférence de 0,5 à 5 % en poids de cholestérol ou d'esters de cholestérol en tant que source de carbone assimilable. La biomasse est avantageusement séparée et recueillie pendant la phase stationnaire de la culture par filtrage sur des membranes filtrantes dont les pores ont un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètre. Un autre objet de l'invention est un procédé pour obtenir un produit utile pour rétablir et maintenir des taux de cholestérolémie physiologiquement acceptables, qui comprend les étapes consistant à: a) cultiver dans un milieu et des conditions favorables à leur prolifération des bactéries du genre Arthrobacter inoculées dans ledit milieu, ledit milieu comprenant du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone assimilable; b) séparer et recueillir, pendant la phase stationnaire de la culture, la biomasse formée, en rejetant le surnageant, et c) lyser ladite biomasse et récupérer le produit lysé, en retenant les composants intracellulaires et les fragments structurels des cellules lysées. Un autre objet de l'invention est un procédé pour préparer un produit utile pour rétablir et maintenir des niveaux acceptables de cholestérolémie, qui comprend les étapes consistant à: a) cultiver dans un milieu et des conditions favorables à leur prolifération des bactéries Arthrobacter pascens inoculées dans ledit milieu qui comprend du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone assimilable; b) séparer par filtrage à l'aide de membranes filtrantes dont les pores ont un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètre et recueillir les cellules pendant la phase stationnaire de la culture, en rejetant le surnageant; c) lyser les cellules recueillies par thermolyse, par cycles de chauffage alternés, pendant une durée suffisante pour obtenir un lysat stérile de cellules recueillies, ledit lysat comprenant les composants intracellulaires et fragments structurels des cellules lysées. De préférence, la biomasse lysée est une biomasse thermolysée selon une séquence alternée de chocs thermiques, par exemple de -4 C et 25"C. La présente invention a également pour objet les produits alimentaires et formulations thérapeutiques qui comprennent ledit lysat stérile des cellules recueillies. Un autre objet de l'invention porte sur une composition alimentaire qui comprend, dans un support acceptable en diététique, la biomasse obtenue selon l'invention par culture des bactéries du genre Arthrobacter, telles que A. pascens, et lysées, en tant qu'agent capable de réduire et de maintenir la cholestérolémie à des taux physiologiquement acceptables. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique qui comprend la biomasse stérile obtenue selon l'invention par culture d'A. pascens et lysée en tant qu'agent capable de réduire et de maintenir la cholestérolémie à des taux physiologiquement acceptables, dans un support pharmaceutiquement acceptable. De manière préférentielle, la composition pharmaceutique se présente sous forme de gélules, de poudres à diluer, de comprimés ou de sirops. Aux fins de la présente invention, I'expression culture dans un milieu et des conditions permettant la croissance (ou la prolifération) des cellules inoculées est utilisée pour indiquer que le milieu de culture contient les sources d'azote, les minéraux, les oligo-éléments et les additifs suffisants pour nourrir la culture de l'espèce d'Arthrobacter inoculée jusqu'à la phase stationnaire - cholestérolémie est le terme usuel dans le vocabulaire clinique pour désigner le taux de cholestérol dans le sang, habituellement en mg/litre et aussi en mg/100 ml de sang. De son côté, le terme lipémie désigne la teneur totale en lipides dans le sang, et comprend le cholestérol et ses esters, les triglycérides, les acides gras et les autres lipides présents dans le sang - cellules lysées (ou lysat de cellules) définit le produit stérile provenant de la biomasse provenant des cellules cultivées et séparées du milieu de culture par application de la chaleur (thermolyse) et/ou à l'aide de moyens mécaniques (moulins colloïdaux) ou d'ultrasons; ou bien par traitement avec des agents chimiques, tels que des solutions acides tamponnées, par choc osmotique, etc; de ce point de vue, il faut comprendre que le lysat est recueilli en retenant tous les composants du milieu interne et les fragments et parties structurelles des cellules lysées, par exemple la membrane, les organules, etc; - recueillir les cellules cultivées signifie, aux fins de la présente invention, séparer la masse de cellules formées dans le milieu de culture, pendant la phase stationnaire (quand la population bactérienne est de l'ordre de 7,5x108 CFU/ml par exemple), principalement par filtrage à l'aide de membranes ou de cartouches filtrantes avec des pores d'un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètre, ou par centrifugation à 4000 à 6500 tours par minute, le cas échéant en lavant la biomasse recueillie avec des solutions diluées de chlorure de sodium (sérum physiologique) et enfin avec de l'eau. II faut bien entendu s'assurer de la stérilité du lysat, par exemple en incubant les cultures Endo ou MPA inoculées avec des échantillons de lysat. La figure 1 illustre l'évolution de la cholestérolémie à partir du début du traitement de trois groupes de patients, soumis à des régimes alimentaires communs, c'est-à-dire non spécifiques. La ligne (1) correspond à des patients âgés de 24 à 62 ans; la ligne 2 illustre l'évolution de la cholestérolémie chez le groupe (2) - patients âgés de 62 à 78 ans; et la ligne (3) correspond à un groupe témoin soumis aux mêmes conditions. Caractéristiques biochimiques de l'espèce Arthrobacter pascens Ces bactéries utilisent le saccharose, le maltose, le galactose, le glucose, la glycérine en tant que source de carbone assimilable; elles n'hydrolysent pas l'amidon, ne produisent pas de SH2, ni d'indol et d'ammoniac. Ce sont des bactéries catalase positives et lécitinase négatives, argininedéhydrase négatives, uréase négatives. Dans de l'agar peptone de viande (MPA), elles forment des colonies de couleur blanc crème, lisses et brillantes. Les bactéries de A. pascens liquéfient la gélatine. Caractéristiaue du Ivsat Le lysat de la présente invention est obtenu en général sous forme d'une masse poreuse de couleur blanche ou blanche tirant sur le jaune, légèrement acide, inodore et soluble dans l'eau et dans des solutions isotoniques de chlorure de sodium. Les solutions aqueuses à 1% ont un pH de 4,0 à 6,0 et le lysat est stable en milieu légèrement acide ou alcalin, mais est inactivé par chauffage à une température supérieure à 70"C. Son activité biologique est stable entre pH 5,0 et 8,0 avec un maximum à pH 7,0. Les expériences réalisées chez les personnes traitées avec le lysat de la présente invention n'ont pas révélé de lésions ou d'altérations des muqueuses de l'appareil digestif (muqueuse stomacale et intestinale). Les exemples suivants sont donnés à titre d'illustration de la meilleure mise en oeuvre de la présente invention, à partir de la culture de A. pascens. ExemDle 1 Préparation d'un Ivsat avec activité de réduction du cholestérol a) Culture Dans un flacon Erlenmeyer d'une contenance de 2 litres, on introduit 750 ml d'un milieu de culture ayant la composition suivante: Monohydrogéno-phosphate de potassium K2H (P04) 2,8 g/I Phosphate de triammonium (NH4)3 PO4 3,0 Chlorure de sodium NaCI 2,0 Chlorure de calcium dihydraté CaCI2-2H20 3,0 Extrait de levure 2,0 Sulfate de magnésium MgSO4 0,25 Cholestérol 2,0 pH = 7,2 On inocule dans ledit milieu des cellules d'Arthrobacter pascens et on cultive les cellules inoculées en aérobiose, en injectant de l'oxygène à raison de 12 litres/minute, en maintenant la température à 32"C (+ 0,5"C) et le pH à 7,2 +0,2 par addition contrôlée de solution à 0,1 N d'hydroxyde de potassium. On interrompt l'incubation 14 heures après le début de l'incubation (début de la phase stationnaire), quand la population de cellules viables est de 7,5x108 CFU (vérifié au moyen d'échantillons prélevés sur la culture, cultivés sur milieu solide de MPA). A ce moment-là, la concentration en cholestérol dans le milieu de culture s'est réduite à 0,060 g/litre, ce qui correspond à une réduction de la concentration en cholestérol dans le milieu de culture de 2,6 g/litre (concentration initiale) à 0,06 g/l (concentration finale), à raison de 180 mg/heure. On récupère les cellules cultivées par filtrage sur des membranes poreuses (pores de 0,5 micromètre de diamètre) et la masse des cellules récupérées est désintégrée par application de chaleur, en un cycle de trois opérations alternées de refroidissement et de chauffage entre -4,00C et +250C. Une fois vérifiée la stérilité de la biomasse lysée en cultures sur MPA et Endo, on évalue in vivo l'activité sur la cholestérolémie du matériau lysé, conformément à la description de l'Exemple suivant. ExemDle 2 Vérification des oroDriétés de réaulation de la cholestérolémie du Ivsat de la présente invention Les études sont menées sur 18 personnes divisées en deux groupes de 9 individus. Le premier groupe est formé de 9 patients d'âge variable (entre 24 et 62 ans) avec des taux de cholestérol dans le sang allant de 220 à 280mg/litre (moyenne 242,3 + 9,15 mg/litre; P: inférieur à 0,85). Le second groupe est formé de personnes âgées de 62 à 78 ans avec des taux de cholestérol dans le sang compris entre 270 et 370 mg/litre (moyenne 302,6 + 16,3 mg/litre ; P: inférieur à 0,05). Les personnes des deux groupes sont soumises à des examens cliniques périodiques trois mois avant le début de l'étude, et le traitement d'administration quotidienne de doses de Sinvastine en dragées de 5 mg (1 par jour) est poursuivi jusqu'à la veille du début de l'étude. Le traitement est appliqué à un groupe témoin formé de 6 patients de cholestérolémie normale. (162 + 6,2 mg/litre de cholestérol dans le sang ; P: inférieur à 0,05.) Les trois groupes sont alimentés avec un même régime alimentaire courant pendant trois mois, chaque individu de chaque groupe absorbant 1 g/jour du lysat de la présente invention. On effectue des prélèvements sanguins sur chaque personne aux jours 2, 4, 14, 30 et 90 suivant le début du traitement, ainsi que 30 jours après l'arrêt du traitement. Les données enregistrées révèlent que chez les patients du premier groupe (24 à 62 ans) la cholestérolémie s'est sensiblement réduite à une valeur moyenne de 176,2 + 4,3 mg/litre (P: inférieur à 0,05), à partir du quatrième jour après le début du traitement (ligne 1 sur la figure 1). Chez les personnes du groupe 2 (ligne 2 du graphique), la cholestérolémie atteint des niveaux normaux entre le jour 7 et 14 après le début du traitement (cholestérolémie moyenne 182,3 + 3,6 mg/litre, P: inférieur à 0,05). Par ailleurs des échantillons de sang prélevés 30 et 90 jours après l'arrêt du traitement, chez les personnes des groupes 1 et 2, ne révèlent pas d'augmentation quelconque de la cholestérolémie, bien que les deux groupes n'aient pas été soumis à un régime spécial, le taux de cholestérol se maintenant dans des limites considérées comme normales. II n'a été observé aucun effet secondaire gênant chez aucune des personnes ayant absorbé le lysat de la présente invention, bien que certains effets secondaires considérés comme favorables aient été observés: - perte de poids de l'ordre de 2 à 6 kg; - amélioration notable de la mémoire chez les patients du groupe 2 et amélioration générale de l'état psychique - disparition de la sensation de trop-plein ou de lourdeur qui suit l'ingestion d'aliments gras - pas d'enregistrement de variations des niveaux des composants dans l'urine, ni modification des paramètres sériques. Ces données démontrent qu'un traitement continu de 4 jours s'est avéré suffisant chez un groupe de personnes relativement jeunes (groupe 1) qui ont atteint des taux de cholestérol physiologiquement acceptables (176 mg/litre en moyenne), par l'incorporation de 1 gramme du lysat de la présente invention dans l'alimentation quotidienne, équivalent à une réduction de la cholestérolémie de 66 unités dans le groupe 1 et de 120 unités dans le groupe 2 (sur une durée plus longue (au moins 7 jours)). (lignes 1 et 2, respectivement sur la figure 1). II se détache de l'analyse de ces graphiques et d'autres similaires une amélioration notable des taux de cholestérol chez les deux groupes de personnes souffrant d'hypercholestérolémie lorsqu'elles sont traitées avec la biomasse lysée de la présente invention, ainsi que la diminution des risques pathologiques associés à des taux élevés de concentration de cholestérol dans le sang qui débouchent souvent sur la formation d'athéromes et des désordres neurologiques. Se détachent également la perte de poids corporel et l'évolution favorable de l'état général chez les personnes traitées. Le lysat de la présente invention peut être administré en combinaison à certains des composants de l'alimentation quotidienne, en tant qu'additif dans la formulation de divers produits laitiers: lait, yaourt, desserts tels que les flans, les mousses, les glaces, etc. En général, on sait que des quantités de l'ordre de 1 g/jour sont suffisantes pour rétablir et maintenir le taux de cholestérolémie dans des limites physiologiquement acceptables. Les effets se manifestent de 4 à 15 jours après le début du traitement en fonction de l'âge et de l'état de santé du patient, et sont maintenus en régulant les doses et leur rythme d'administration. De ce point de vue, il convient de souligner que le lysat de la présente invention inclut les composants du milieu interne et les fragments provenant de la désintégration de la membrane des organules cellulaires des cellules cultivées à l'état brut (c'est-à-dire non dénaturés): vitamines, acides aminés, enzymes, etc., ce qui permet de comprendre la multiplicité des effets biologiques observés. Le produit de la présente invention peut être utilisé aux fins mentionnées principalement pour réguler la cholestérolémie, seul ou en combinaison avec les moyens, par exemple régime spécial, et/ou médicaments classiques. Bien que tous les aspects biologiques liés à la régulation de la cholestérolémie du lysat de la présente invention permettant la régulation du métabolisme des lipides n'aient pas encore été élucidés, on considère, sans que cela constitue une quelconque limitation du sens et de la portée de la présente invention, que la régulation de la cholestérolémie correspond à la présence dans le lysat de la présente invention d'un facteur inhibant la biosynthèse de la bêta-hydroxy-bêtaméthylglutamyl- CoA-réductase et/ou des lipoprotéines qui interviennent dans le processus de conversion du lanostérol en cholestérol par l'intermédiaire du desmotérol ou du 7-déhydrocholestérol. Le lysat de la présente invention peut en outre être administré sous forme de sirops, pilules, comprimés, poudres à diluer et gélules. BIBLIOGRAPHIE 1. Bergey - Manual of Systematic Bacteriology (1969), pages 622 à 625. 2. Microbiologia Industrial, L. I. Vorobiosa, Université de Moscou (1989), page 198. 3. Ibidem page 256 4. Biosynthesis of hydroxylated aromatic compounds - Van der Twell et al., Eur. Congress (on boolth) (1987) volume 2, page 172. 5. T. A. Freiar et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1994). 6. T. D. Brook, M. T. Madigan, Microbiologia Prentice Hall Hispano-Americana, pages 847 à 849, 6ème Ed. REVENDICATIONS 1. Produit utile pour rétablir et maintenir des taux de cholestérolémie physiologiquement acceptables, caractérisé en ce qu'il comprend la biomasse formée par des bactéries du genre Arthrobacter cultivées dans un milieu et des conditions favorables à la prolifération des cellules inoculées dans ledit milieu, ledit milieu comprenant du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone, la biomasse étant séparée et recueillie pendant la phase stationnaire de la culture, en rejetant le surnageant, et en lysant la biomasse formée, en retenant dans le lysat les composants intracellulaires et les fragments provenant de la désintégration de la membrane et des organules cellulaires des cellules cultivées. 2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules cultivées du genre Arthrobacter sont celles de l'Arthrobacter pascens, et/ou des mutants, variantes, ou recombinants de celui-ci. 3. Produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la concentration en cholestérol ou esters de cholestérol dans le milieu de culture est de 0,5 à 5% en poids. 4. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la biomasse est recueillie par filtrage sur des membranes filtrantes dont les pores ont un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètre. 5. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la biomasse lysée est une biomasse thermolysée selon une séquence alternée de chocs thermiques, par exemple de -4 C et 25"C. 6. Procédé pour obtenir un produit selon la revendication 1 utile pour rétablir et maintenir des taux de cholestérolémie physiologiquement acceptables, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) cultiver dans un milieu et des conditions favorables à leur prolifération des bactéries du genre Arthrobacter inoculées dans ledit milieu, ledit milieu comprenant du cholestérol ou des esters de cholestérol en tant que source de carbone assimilable b) séparer et recueillir pendant la phase stationnaire de la culture la biomasse formée, en rejetant le surnageant, et c) lyser ladite biomasse et récupérer le lysat, en retenant les composants intracellulaires et les fragments structurels des cellules lysées. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les bactéries du genre Arthrobacter sont choisies parmi Arthrobacter pascens, ses mutants, variantes et recombinants. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que la séparation et la collecte de la biomasse se fait par filtrage avec des membranes filtrantes dont les pores ont un diamètre de l'ordre de 0,5 micromètre. 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la biomasse recueillie est lysée par thermolyse, qui comprend une séquence alternée de chocs thermiques entre -4 C et 25"C. 10. Composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un support acceptable en diététique, la biomasse obtenue par culture des bactéries du genre Arthrobacter, telles que A. pascens, et lysée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en tant qu'agent capable de réduire et de maintenir la cholestérolémie dans des limites physiologiquement acceptables, selon la revendication 1. 11. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend la biomasse stérile obtenue par culture de A. pascens et lysée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en tant qu'agent capable de réduire et de maintenir la cholestérolémie dans des limites physiologiquement acceptables, selon la revendication 1, dans un vecteur pharmaceutiquement acceptable. 12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de gélules, de poudres à diluer, de comprimés ou de sirops.