Brevet FR2762783A1 — publié le 19981106

La présente invention se rapporte à de nouvelles utilisations d'une classe d'oligosaccharides et de leurs dérivés. Elle concerne également une méthode cosmétique permettant d'augmenter la teneur en glycosaminoglycannes (GAG) des tissus conjonctifs et de lutter contre les radicaux libres. La cohésion de la trame fibreuse des tissus conjonctifs est assuréc par des protéoglycannes tels que la decorine et le biglicane. L'hydratation et la viscoélasticité des tissus est surtout attribuable à l'hyaluronane, glycosaminoglycanne de haut poids moléculaire (de l'ordre du million). Dans certains tissus comme le cartilage, ce glycosaminoglycanne (GAG) attache par des interactions spécifiques (protéine à GAG) de nombreuses molécules d'agrécanes qui forment ainsi des agrégats de très haut poids moléculaire conférant à la fois hydratation, résistance et élasticité à ces tissus. Or il a été montré que la biosynthèse des glycosaminoglycannes baisse avec l'âge. Dans le cartilage c'est une des causes majeures de l'arthrose qui s'installe à des âges différents selon les articulations et progresse rapidement avec l'âge. L'amincissement de la peau et sa déshydratation progressive est attribuée aussi à la perte progressive d'hyaluronane. L'hyaluronane est synthétisé grâce à l'hyaluronane synthétase, enzyme si tuée dans la membrane cellulaire. L'hyaluronane synthétisé entoure la cellule et régule ainsi le passage de molécules dans sa proximité, sa migration, son association avec d'autres cellules et macromolécules. Sa dégradation est assurée par l'hyaluronidase, présente dans les testicules des enzymes similaires (endoglycosaminidases et endo-glycuronidases) se trouvent dans les lysosomes, où la dégradation intracellulaire de l'hyaluronane s'accomplit après son endocytose médiée par des récepteurs spécifiques. En outre l'hyaluronane est très sensible à l'attaque de radicaux libres qui la dégradent rapidement. C'est ce mécanisme, couplé à la baisse de la synthèse, qui explique sa perte progressive avec l'âge. Pour toutes ces raisons la stimulation de sa biosynthèse, ainsi que sa protection contre la dégradation radicalaire, présentent un grand intérêt. De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé que des oligosaccharides présentant un galactose en position terminale non réductrice peuvent intervenir dans ces phénomènes. C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'un oligosaccharide possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou d'un dérivé d'un tel oligosaccharide susceptible d'être obtenu par fixation d'un radical hydrophobe, pour la préparation d'une composition destinée à augmenter la synthèse et/ou à diminuer la dégradation des protéoglycannes du tissu conjonctif. De tels oligosaccharides ont été décrits dans la demande WO 95/05 155. I1 avait alors été montré que des composés sont capables d'inhiber la dégradation de l'élastine du tissu conjonctif par des enzymes de type élastase, produits par les fibroblastes. Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant été montré que ces oligosaccharides agissent sur d'autres constituants de la matrice extracellulaire, et sur d'autres mécanismes de dégradation de cette matrice. En effet, ces oligosacharides, en particulier le lactose, le mélibiose ou leurs dérivés hydrophobes, sont utiles pour augmenter la synthèse et/ou diminuer la dégradation des glycosaminoglycannes (GAG), en particulier de l'hyaluronane, ou acide hyaluronique. Les protéoglycannes sont constitués d'une copule protéique associée par liaison covalente à une structure polyosidique spécifique : les glycosaminoglycannes (GAG) ; cette fraction polysaccharidique représente plus de 95% de la masse totale du protéoglycanne. Bien qu'il existe toujours un motif disaccharidique de base, la longueur et la composition des chaînes de GAG est extrêmement variable. La polymérisation de l'unité disaccharidique de base est réalisée par une liaison en 8 1-4. La classification des GAG repose sur la nature des sucres du monomère disaccharidique, ainsi que sur le nombre et la position dc groupements sulfates fixés sur la molécule. Les GAG comprennent notamment l'acide hyaluronique, les chondroïtines sulfates, le dermatane sulfate, le kératane sulfate et les héparanesulfate protéoglycannes ainsi que l'héparine. Des oligosaccharides particulièrement adaptés à la préparation de composition selon l'invention, sont choisis dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés pouvant être obtenus par fixation d'un résidu hydrophobe. Lorsque l'on utilise un dérivé d'oligosaccharides, de préférence, le résidu hydrophobe est choisi parmi les alkyles en C1-C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en Cl-Cl8, les acides carboxyliques en C1-C18 linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en Cl-Cl8, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en C1-C18. Les dérivés d'oligosaccharides adaptés à la mise en oeuvre de l'invention peuvent notamment appartenir à l'une des catégories citées ci-après, dans lesquelles l'oligosaccharide répond à la formule générale suivante galactose-n (a ou ss) - (Hex)p dans laquelle n représente la position 1, 2, 3, 4 ou 6, Hex représente un pentose ou un hexose en liaison a ou ss p est un nombre compris entre 1 et 5 a) - des glycosides répondant aux formules (I) oligosaccharidc 1-OR, dans lequel R est un résidu alkyle de 1 à 18 atomes de carbone, linéaire ou branché, (II) oligosaccharide 1-O-R-O-i -oligosaccharide dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 10, b) - une osylamine acylée selon l'une des formules suivantes, dans lesquelles l'oligosaccharide est de préférence le lactose, le mélibiose ou le stachiose - des osylamines acylées répondant à l'une des formules suivantes . (III) oligosaccharide 1-NH-CO-R, dans laquelle R est un résidu alkyle de 2 à 18 atomes de carbone, contenant 0, 1 ou 2 double liaisons, . (il) oligosaccharide i -NH-CO-R-CO-NH- 1-oligosaccharide, dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 8, c) - une alkylamine acylée par un acide aldonique obtenu par oxydation d'un oligosaccharide . (V) oligosaccharide -CO-NH-R, dans laquelle R a la même signification que dans la formule (III), . (VI) oligosaccharide CO-NH-R-NH-CO- oligosaccharide, où R a la même signification que dans la formule (III), d) - soit un produit de réduction des bases de Schiff formé par des oligosaccharides avec des mono- ou diamines aliphatiques, et répondant à l'une des formules suivantes . (VII) Gal- (Hex)n -X-HN-R, . (VIII) Gal - (Hex)n - X-HN-R-NH-X- (Hex)n - Gal, dans lesquelles Hex est un hexose ou un pentose, n =0,1 ou 2, x = 1-NH2-hexitol, et R a la même signification que dans (III). Selon un mode particulièrement avantageux, l'oligosaccharide ou son dérivé tel que défini ci-dessus sera utilisé pour la préparation d'une composition contenant en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie topique externe. En effet, de tels oligosaccharides, et plus particulièrement le mélibiose et ses dérivés stimulent la biosynthèse des glycoconjugués en général et plus spécifiquement de l'hyaluronane, par les fibroblastes, et notamment les fibroblastes âgés, à partir de doses très faibles. Il sont donc susceptibles d'améliorer la turgescence, l'hydratation et la cohésion des tissus conjonctifs en général et de la peau en particulier. Selon un des aspects de l'invention, des oligosaccharides possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale, non réductrice, ou des dérivés hydrophobes tels que définis précédemment, seront utilisés pour la préparation d'une composition destinée à lutter contre les effets des radiations U.V. et notamment contre les effets des radicaux libres. Les radicaux libres, par définition, sont des espèces chimiques, neutres ou chargées, qui possèdent un électron non apparié. Cet "électron célibataire" leur confère des propriétés chimiques particulières et une courte durée de vie. Ce sont des intermédiaires réactionnels qui vont se stabiliser par fusion ou transfert, et peuvent être à l'origine d'une réaction en chaîne. Parmi les radicaux libres on peut citer l'anion superoxyde O , le radical hydroxyl OH-, NO- . Les péroxydes générés au 2 cours de réactions métaboliques ainsi qu'au cours de la neutralisation de l'anion superoxyde par la SOD (superoxyde dismutase) provoquent les mêmes dégâts. Ils sont impliqués dans la dégradation de nombreux composants physiologiques et notamment des GAG. L'activité des oligosaccharides selon l'invention et plus particulièrement du mélibiose à ce niveau peut notamment s'expliquer par deux mécanismes, par lesquels l'invention n'est nullement limitée. D'une part ils bloquent la libération de radicaux libres médiée par le récepteur de l'élastine. Il s'agit de la libération de superoxyde et de l'oxyde nitrique, pouvant se combiner pour former l'anion peroxynitrite, toxique. D'autre part, ils inhibent la dégradation de l'hyaluronane par les radicaux libres, probablement par un effet suicide" et captage préférentiel des radicaux libres. L'invention concerne donc également l'utlisation d'oligosaccharides tels que définis ci-dessus, et notamment de mélibiose, comme capteurs de radicaux libres. En effet, ces oligosaccharides, en particulier le lactose et le mélibiose sont capables d'exercer un effet favorable contre les attaques radicalaires impliquées dans la dégradation des cellules et macromolécules du derme. La confirmation de ces résultats a été obtenue en utilisant l'effet des U.V. sur la peau. La présence de radicaux libres dans la peau humaine après irradiation U.V. a été mise en évidence par la technique d'électrorésonance de spin. L'irradiation subie provoque un stress oxydatif, et dans des conditions physiologiques normales les radicaux libres produits sont pris en charge par les différents systèmes naturels de défense, à savoir - Le glutathion réduit, capteur efficace de radicaux libres - La glutathion-peroxydase (GPX), chargée de la protection contre les peroxydes - Les élastases provenant des tissus et des cellules mononuclées infiltrants (PMN, monocytes, lymphocytes). L'activité élastasique extractible de la peau augmente sous l'effet des U.V. On trouve dans le derme deux types d'activités : une de type métallo-endopeptidase provenant des fibroblastes et sensible à l'EDTA, et l'autre, d'origine leucocytaire, une sérine-protéase des PMN, qui n'est pas inhibée par l'EDTA. Les monocytes-macrophages produisent aussi une métallo-élastase. Le traitement par ces principes actifs, tels le lactose et/ou le mélibiose augmente les défenses anti-radicalaires de l'organisme et plus particulièrement de la peau et diminue le stress oxydatif, comme cela est objectivé par la mesure des marqueurs correspondants. Le mélibiose et ses dérivés sont particulièrement efficaces car ils sont faiblement dégradés dans l'organisme. L'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique pour lutter contre les effets des radicaux libres et/ou pour augmenter la synthèse ou diminuer la dégradation des glycosaminoglycannes chez un mammifère en bonne santé, comprenant l'administration d'au moins un oligosaccharide possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice, ou d'au moins un dérivé de celui-ci susceptible d'être obtenu par fixation d'un radical hydrophobe. Avantageusement, cette administration sera faite sur la peau, les muqueuses ou les phanères. Les oligosaccharides selon l'invention sont également utiles dans des compositions destinées à lutter contre l'alopécie, à améliorer l'hydratation de la peau et à améliorer la microcirculation cutanée. Les compositions selon l'invention peuvent notamment se présenter sous forme de solutions, gels, lotions, crèmes émulsions E/H, H/E, ou d'émulsions multiples ou sous forme liposomée. Elles seront formulées de manière connue de l'homme du métier avec des agents de texture, émulsionnants, épaississants, conservateurs, etc. La concentration en oligosaccharides, notamment en mélibiose dans les compositions selon l'invention sera avantageusement comprise entre 0,01 et 10 % p/p et de prérférence entre 1 et 4% p/p. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans en limiter la portée. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes Figure 1 Figure 1.A. : Variation de la quantitié d'acide hyaluronique en fonction de la concentration en mélibiose dans le milieu extracellulaire au 5ème passage. Figure 1.B.: Variation des quantités d'acide hyaluronique en fonction de la concentration en mélibiose dans le milieu extracellulaire au 10ème passage. Figure 1.C.: Variation des quantités d'acide hyaluronique présentes dans le milieu extracellulaire au 15ème passage. Figure 2 Figure 2.A.: Variation de la quantité d'acide hyaluronique dans le milieu intracellulaire en fonction de la concentration en mélibiose au Sème passage. Figure 2.B.: Variation de la quantité d'acide hyaluronique dans le milieu intracellulaire en fonction de la concentration en mélibiose au 10ème passage. Figure 2.C.: Variation des quantités d'acide hyaluronique dans le milieu intracellulaire en fonction de la concentration en mélibiose au 15ème passage. Figure 3 : Incorporation de la 3H-glucosamine dans les glycoconjugués totaux dans le compartiment intra et péricellulaire. Effet de doses croissantes de mélibiose. Abscisse : Concentration en mélibiose (g/ml). Ordonnée: 3H Glucosamine incorporée dans les glycoconjugués exprimée en cpm / million de cellules. Les résultats sont exprimés en Moyenne + Déviation standard. Analvse statistique: Student't test, * p Figure 4 : Incorporation de la 3H-glucosamine dans les glycoconjugués totaux dans le compartiment extracellulaire. Effet de doses croissantes de mélibiose. Abscisse : Concentration en mélibiose (g/ml). Ordonnée: 3H-glucosamine incorporée dans les glycoconjugués exprimée en cpm/million de cellules. Les résultats sont exprimés en Moyenne + Déviation standard. Analvse statistique: Student't test,* p Figure 5 : Incorporation de la 3H-glucosamine dans l'hyaluronane dans le compartiment intra et péricellulaire. Effet du mélibiose à 1 Fg/ml Abscisse : Concentration en mélibiose T: O Mi:1 (yg/ml). Ordonnée: 3H-glucosamine incorporée dans l'hyaluronane exprimée en cpm / million de cellules. Figure 6 : Incorporation de la 3H-glucosamine dans l'hyaluronane dans le compartiment extracellulaire. Effet du mélibiose à 1 Clg/ml. Abscisse : Concentration en mélibiose T: O M1: 1 ( > g/ml). Ordonnée: 3H-glucosamine incorporée dans l'hyaluronane exprimée en cpm / million de cellules. Figure 7 : Viscosité de l'hyaluronane seul ou mélangé avec le réactif d'Udenfriend (acide ascorbique - fer - EDTA ; génère des radicaux 011.) 1/1000, en présence ou non de mélibiose à différentes concentrations. Figure 8 : La figure montre l'effet du traitement par les principes actifs sur la teneur des peaux des rats en glutathion peroxydase à sélénium. Sur le graphique inférieur les valeurs sont données en mol d'enzyme par mg de poids frais de peau, sur le supérieur les résultats sont indiqués en pourcentages, les valeurs des peaux témoins ayant été prises pour 100 %. Figure 9 : L'histogramme de la figure montre en ordonnées l'activité élastasique des peaux des deux côtés, témoins et traitées des 3 lots de rats. On voit qu'à l'exception du lot traité avec l'excipient seul (n" 3), les côtés traités (n" 1 : prep. RoC ; n" 2 : L + M) contiennent moins d'activité élastasique que les côtés témoins. Exemple 1: Effet du mélibiose sur la quantité d'hyaluronane dans des cultures de fibroblastes On dose l'acide hyaluronique ou hyaluronane (HA) par une technique d'EISA dérivée de celle mise au point par Delpech et al (Anal. Biochem., 1985, 149: 555-565). Cette technique est basée sur l'affinité de la hyaluronectine (HN) pour l'hyaluronane (HA). L'HN couplée à la phosphatase alcaline se lie à l'HA adsorbé sur la plaque de titrage. Le taux d'HN fixé est mesuré par l'activité phosphatasique. Lorsque HN est préincubée en présence de HA, la fixation de HN sur la plaque est inhibée. La variation de l'absorbance à 405 nm est proportionnelle à l'inhibition par 1'HA contenu dans les échantillons. Cette technique possède plusieurs avantages : elle est spécifique, à haute affinité (seuil de détection 1 jig/l et rapide (dosage dans la journée). 1- Matériel et Méthode a) Préparation de l'hyaluronectine Elle comprend trois grandes étapes - extraction de l'hyaluronectine à partir de cerveau d'agneau, par broyage et centrifugation; - préparation d'une colonne d'HA-Sépharose 4 B, par fixation d'AH (100 mg) sur du Sépharose (4 g) en présence de carbodiimide (125 mg). Le pH est ajusté entre 4,5 et 5 avec Cl 0,1 N toutes les 15 minutes pendant 4 heures. Après incubation à température ambiante, le gel d'AH Sépharose est lavé par NaCl 1M puis avec de l'acide acétique 1M à 4" C ; le gel est ensuite lavé avec 200 ml de tampon glycine 0,2 M/HC1 pH 2 puis 100 ml de guanidine 4M et de l'eau physiologique; - purification de HN par affinité sur la colonne d'HA-Sépharose 4B et couplage avec la phosphatase alcaline : elle est effectuée à partir de l'extrait obtenu à l'issue de la première étape, en éliminant le complexe HA-HN contaminant ; après couplage à la phosphatase alcaline (PA) en présence de glutaraldéhyde, la PA non couplée est éliminée par gel filtration. La dilution d'HN-PA à utiliser pour le dosage d'HA est déterminée sur plaque ELISA, de façon à obtenir une DO = 1,5 à 405 nm en absence d'HA. b) dosage de 1'hyaluronane Le dosage de HA par la technique d'ELSA comprend 5 étapes principales. 1. Prénaration de l'HA étalon L'HA du commerce (Sigma) isolé de la crète de coq doit être purifié préalablement à son utilisation. En effet cet HA est contaminé par des protéines et des protéoglycannes. L'HA est dissout dans du PBS (1 mg/ml). Les protéoglycannes contaminants sont éliminés par un traitement à la Chondroitinase ABC (0, 5 U/10 mg HA) pendant 1 heure à 37 C. La chondroitinase et les protéines contaminantes sont détruites par un traitement protéasique (Streptomyces Vulgaris Protease Type XIV, 1 U/mg HA) pendant 18 heures à 37 C. La protéase est dénaturée à la chaleur (20 minutes à 100" C). L'HA est alors dialysé contre un tampon Glycine 0,2 M/HC1 pH 2,2 puis contre du PBS. L'HA est quantifié par le dosage des acides hexuroniques selon la technique de Bitter et Muir (1 Fg d'acide héxuronique = 1, 776 sg HA) puis la concentration en HA est ramenée à 500 g/ml, en TBS/Az 0,2%. 2. Sensibilisation des plaques L'étape de sensibilisation consiste en l'adsorption d'HA dans les plaques. L'HA du commerce (1 mg/ml) est dissout dans du tampon bicarbonate 0,1 M, Azide 0,2 g/l puis 250 ,u1 sont répartis dans chaque godet de la plaque ELISA. Les plaques sont sensibilisées au minimum une nuit à 4" C et se conservent pendant 1 mois à + 4" C. 3. PréDaration de l'échantillon L'hyaluronectine pouvant contaminer l'échantillon est éliminée par un traitement protéasique (Proteus Vulgaris Type XIV). L'échantillon est dilué au 1/10 dans une solution protéase (1 mg/ml) en TBS/Azide 0,2 g/l pendant 18 heures à 37 C. L'activité protéasique est dénaturée à la chaleur (20 minutes à 100 C). 4. Préincubation des échantillons La préincubation de HA avec HN permet d'augmenter la sensibilité du dosage. 300 crl de chaque point (échantillon et gamme étalon HA) est additionné de 300 il HN-PA (diluée au 1/50 dans du TBS/AZ/BSA) pendant 1 heure à 4" C. L'AH étalon est dilué dans du TBS/Az, (160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 Fl final). La gamme est réalisée en double et les échantillons sont dosés en double à 3 dilutions différentes. Le dosage des échantillons a été réalisé sur un minimum de 2 plaques. La variation intra-essai est inférieure à 5% et la variation inter-essai varie de 10 à 15%. 5. Incubation et révélation de la Dlaaue La plaque sensibilisée est lavée avec de l'eau du robinet, de l'acide acétique 0,1 M, puis 2 fois en eau déminéralisée et enfin 1 fois en PBS. 250 zl d'échantillon sont déposés par puits. La plaque est incubée pendant 4 heures à 4" C, puis vidée et lavée 3 fois en PBS. 250 cil de Tampon révélateur (para-NitroPhénylPhosphate 1 g/l, Diéthanolamine 1 M pH 9,8 + MgCl2 1 mM) est ajouté dans chaque puits. La plaque est incubée 1 heure à 37 C puis la densité optique est déterminée à 405 nm dans un lecteur de plaques automatique (Dynatech). L'inhibition de la fixation de HN sur 1'HA adsorbé sur la plaque est proportionnelle à l'HA ajouté pendant la préincubation. Pour faciliter les calculs, la relation HA/D.O. 405 nm est linéarisée en exprimant la concentration en HA en échelle logarithmique. La densité optique, proportionnelle à la quantité d'HA à doser varie relativement peu pour de grande variation en HA. Afin d'augmenter la fiabilité, le dosage est toujours réalisé en double à 3 concentrations différentes de l'échantillon. La variation intra-essai est inférieure à 5% et l'écart inter-essai varie de 10 à 15% c) culture de fibroblastes Le matériel est une culture de fibroblastes de peau humaine. Il s'agit d'une peau d'une enfant de 13 ans prélevée au cours d'une intervention de chirurgie plastique de recollement d'oreilles. Ces cellules sont mises en culture à raison de 3 105 cellules par boite (Nunc de 6 cm de diamètre) dans 5 ml de milieu DMEM avec 10% de sérum de veau foetal 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de fungizone, en atmosphère humide à 5% de CO2 et à 37 C. Le mélibiose est ajouté dans le milieu à différentes concentrations 0,1 zg/ml, 1 pg/ml et 5 yg/ml final (1 zg/ml 3 sM). Effet du nombre de passages Afin de rechercher une éventuelle modulation de l'effet de l'âge sur la biosynthèse de l'hyaluronane, les essais sont réalisés avec des cellules de passage différents, le rapport de dilution (split ratio) étant de 1/2 : - un passage jeune ou précoce : Sème passage ou doublement de population cellulaire (DPC) - un passage moyen: 10ème passage; - un passage plus avancé: 15ème passage. 2- Résultats Les figures 1 et 2 montrent l'effet de concentrations croissantes de mélibiose sur la quantité d'hyaluronane dosée dans le milieu de culture et dans la couche péricellulaire des fibroblastes. Au 5ème passage avec 1 crg/ml une augmentation modeste mais significative est constatée dans le milieu extracellulaire. 5 crg/ml double la quantité d'hyaluronane excrétée dans le milieu de culture. Au 1 poème passage déjà 0,1 crg/ml mélibiose produit une forte augmentation de l'hyaluronane dans le milieu de culture avec un effet maximal à 1 llg/ml. Au 15ème passage, on note une forte baisse de la synthèse d'hyaluronane excrété par les fibroblastes non sitmulés. Le mélibiose à 1 Fg/ml et 5 sg/ml stimule fortement ces biosynthèses. Des stimulations similaires sont constatées dans le milieu péri- et intracellulaire, la concentration optimale varie selon les passages, de 1,0 Fg/ml au 5ème passage à 0,1 Fg/ml au 10ème passage et 15ème passages. L'ensemble de ces résultats montre que le mélibiose stimule fortement la biosynthèse de l'hyaluronane dans le milieu de culture et dans les fibroblastes et en augmente la teneur. Exemple 2: Effet du mélibiose sur la biosynthèse des glycoconjugués - glycoprotéines et glycosaminoglycannes, dans des cultures dc fibroblastes 1- Matériel ct Méthodes Culture des fibroblastes de peau humaine Le matériel utilisé est une culture de fibroblastes de peau humaine. Les effets de doses croissantes de mélibiose sur la biosynthèse des glycoconjugués et plus particulièrement celle de l'hyaluronane sont évalués. Le mélibiose est ajouté dans le milieu de culture à différentes concentrations : 0,1 crg/ml, 1 crg/ml et 5 g/ml final. Afin de rechercher une éventuelle modulation de la biosynthèse des glycoconjugués liée à l'âge, les essais sont réalisés avec des cellules de deux passages différents, le rapport de dilution (split ratio) étant de 1/2 - un passage précoce : 5ème passage ou doublement de population cellulaire (DPC) - un passage plus tardif: 15ème passage. Biosynthèse des glycoconjugués La glucosamine est un sucre aminé entrant dans la composition de tous les trois des 4 grandes familles de macromolécules de la matrice extracellulaire les glycoprotéines, les protéoglycannes, les glycosaminoglycannes (les chaînes GAG) et enfin dans l'hyaluronane. La 3H-Glucosamine ajoutée dans le milieu de culture des fibroblastes (1 zCi/ml) permet donc le marquage radioactif de tous les glycoconjugués néosynthétisés. Les fibroblastes de peau sont mis en culture à raison de 1,5 - 3. 105 cellules par boite (Nunc de 6 cm de diamètre) dans 5 ml de milieu DMEM avec 10% de sérum de veau foetal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de fungizone, en atmosphère humide à 5% de CO2 et à 37 C. 24 heures après le milieu est remplacé par un milieu contenant des doses croissantes de mélibiose (0,1, 1 ou 5 crg/ml). Les cellules sont cultivées pendant 48 heures à 37 C, sous agitation. La 3H-Glucosamine (1 FCi/ml) permettant le marquage radioactif de tous les glycoconjugués néosynthétisés est ajoutée. 24 heures après, les milieux de culture sont recueillis après deux lavages avec 1 ml de PBS, 2 mM EDTA - PMSF et les cellules sont détachées en présence d'urée 1 M. Les compartiments intra et extracellulaires sont dialysés de façon à éliminer la radioactivité non incorporée. La radioactivité liée à la 3H-Glucosamine est comptée en scintillation liquide. Biosynthèse de l'hyaluronane La mesure de la radioactivité liée à la 3H-Glucosamine incorporée dans l'hyaluronane est réalisée après dégradation sélective par la hyaluronidase (Hyaluronidase Streptomyces 0,1 TRU/ml) à 60 C pendant une nuit. Les extraits sont alors ultrafiltrés (seuil de coupure 10 kDa). La radioactivité est mesurée dans le filtrat contenant les fragments dégradés de l'hyaluronane. 2- Résultats a) biosynthèse des glycoconjugués totaux Groupe témoin: La quasi-totalité de la glucosamine incorporée est retrouvée dans le compartiment extracellulaire (90-95%). Seule une petite fraction est présente dans le compartiment intra/péri cellulaire. ComDartiment intra/néri cellulaire : (Figure 3). Aucune modification observée avec le nombre de passages. Compartiment extracellulaire : (Figure 4). La 3H-Glucosamine incorporée est multipliée par un facteur 2,5 entre les passages 5 et 15. On observe donc au cours de passages successifs une stimulation de la biosynthèse des glycoconjugués totaux. Effet de doses croissantes du mélibiosc Comoartiment intra/néri cellulaire : (Figure 3). Pour le passage tardif (P15) on observe une stimulation statistiquement significative de 14% à la dose de 0,1 zg/ml, de 50% à la dose de 1 zg/ml et de 35% à la dose de 5 crg/ml. Compartiment extracellulaire: (Figure 4). Une légère diminution est observée pour l'incorporation de la 3H-Glucosamine au passage précoce P5, aux doses de 0,1 et 1 cig/ml (14% et 10%) et une légère augmentation (12 %) à la dose de 5 ,ug/ml. Par contre une augmentation significative est observée au passage tardif plS (14% à 0,1 sg/ml, 35% à 1 ccg/ml et 15% à 5 CLg/ml). b) biosynthèse de l'hyaluronane Groupe témoin Comvartiment intra/néri cellulaire: (Figure 5). La 3H-Glucosamine incorporée est multipliée par un facteur 4,2 entre les passages 5 et 15. Compartiment extracellulaire : (Figure 6). La 3H-Glucosamine incorporée est multipliée par un facteur 3,5 entre les passages 5 et 15. On observe donc au cours de passages successifs une stimulation de la biosynthèse de l'hyaiuronane ainsi que de sa rétention dans les espaces intra et péricellulaires. Effet du mélibiose Comnartiment intra/Déri cellulaire: (Figure 5). La 3H-Glucosamine incorporée est multipliée par un facteur 1,3 au passage précoce P5 et par un facteur 7,6 au passage tardif P15 en présence de mélibiose à la dose de 1 g/ml. Comnartiment extracellulaire: (Figure 6). Une augmentation de 15% au passage précoce P5 et de 75% au passage plus tardif P15 est observée pour l'incorporation de la 3H-Glucosamine P15 en présence de mélibiose à la dose de 1 llg/ml. I1 apparaît donc que le mélibiose stimule la biosynthèse des glycoconjugués, et de l'hyaluronane en particulier, par les fibroblastes cutanés. Cette stimulation est plus marquée avec des fibroblastes "âgés" (passages tardifs) ; des stimulations très fortes sont obtenues avec des concentrations de mélibiose très faibles, de l'ordre de 0,1 à 1 ,ag/ml. Exemple 3: Effet anti-radicalaire du mélibiose La dégradation de l'hyaluronane par des radicaux libres est déterminée par la baisse de la viscosité d'une solution d'hyaluronate de Na à 37"C. En présence de réactif d'Udenfriend (acide ascorbique, EDTA, Fer), dégageant des radicaux OH., il y a dégradation rapide de l'hyaluronane. En présence de mélibiose à 5, 10 ou 30 mg/ml, le même réactif dégrade de plus en plus lentement l'hyaluronane. A 3% (30 mg/ml) la protection est totale (Fig. 7). Exemple 4 : Etude sur rat hairless de l'effet anti-radicalaire du mélibiose ou du lactose Les défenses contre le stress oxydatif, glutathion réduit, glutathionperoxydase ainsi que l'élastase, ont été mesurées, après traitement par le lactose et le mélibiose. Une lampe Solar Light type 1148 a été utilisée comme source U.V. Les rats hairless étaient des mâles d'un poids initial compris entre 150 et 180 g. Trois lots de 5 rats ont reçu sur leur flanc droit 1 g d'un produit dont la pénétration a été favorisée par massage pendant environ une minute. Le premier lot a reçu le mélîbiose, sous forme d'une composition commercialisée par la société ROC (Mélibiose anti-âge), le deuxième un mélange de lactose (L) - mélibiose (M) à 3% de chaque, finalement le troisième lot n'a reçu que l'excipient. Le flanc gauche des rats n'a pas été traité. La surface traitée était de l'ordre de 15 cm2. Donc les rats reçoivent approximativement 2 mg/cm2 de chaque principe actif. Le traitement a duré deux semaines à raison de 5 applications par semaine. A la fin du traitement les rats ont été anesthésiés et irradiés sur les deux flancs avec la lampe U.V. à 6 spots à la dose de 3 M.E.D. Le lendemain de l'irradiation les rats sont de nouveau anesthésiés et les spots de peaux irradiées disséquées, groupées par trois et pesées. Le poids frais moyen des 3 spots était de 266 t 25 mg. Ensuite les peaux sont finement découpées, broyées dans un Potter avec une solution tampon appropriée à chaque dosage puis on recueille les extraits par centrifugation dans des tubes Eppendorf. Les dosages sont effectués sur les extraits ainsi obtenus et les résultats sont rapportés au poids frais cutané. 1- Dosage des glutathion-peroxydases (GPX) La GPX à sélénium assure la transformation - d'hydroperoxydes selon la réaction suivante - de peroxyde d'hydrogène: selon une cinétique non Michaelienne. La méthode utilisée pour les dosages est adaptée de la méthode de Paglia et Valentine (D.E. Paglia and W.N. Valentine, J. Lab. Clin. Med., 70: 158 (1967)). Elle est basée sur la mesure de la vitesse de formation du glutathion disulfure (GSSG) qui sera réduit par un excès de glutathion réductase. Le substrat choisi est le t-butylhydroxyperoxyde. Il réagit selon l'équation Le glutathion réduit (GSH) nécessaire à la réaction catalysée par la GPX est fourni en même temps que la NADPH et la glutathion réductase afin de permettre le recyclage du glutathion disulfure obtenu après consommation du GSH selon la réaction suivante L'oxydation du NADPH est suivie en spectrophotométric à 340 nm. Cette méthode permet le dosage des glutathion peroxydases totales. Le dosage de la glutathion-peroxydase est effectué dans les conditions suivantes Tampon: Tris 50 nM EDTA 0,1 mM, pH = 7,6 par HCI Acide mercaptosuccinique Glutathion réduit : Sigma C10H17N306S Glutathion réductase: Sigma NADPH : -nicotinamide adénine dinucléotide sous forme de sel tetrasodique, Sigma C2 1H26N7O17P3Na4 t-butylhydroperoxyde: Sigma C4H1002 Longueur d'onde: 340 nm Temps de lecture: 3 mn. Résultats La figure 8 montre l'effet du traitement sur la glutathion peroxydase, enzyme à sélénium, jouant un rôle important dans la protection antiradicalaire. I1 apparaît que le traitement avec les principes actifs a fortement augmenté l'activité glutathion peroxydasique de la peau, confirmant l'effet antiradicalaire du lactose et mélibiose. 2- Dosage du glutathion Le glutathion ou vglutamyl-cystéinyl-glycine tripeptide présente des propriétés nucléophiles réductrices qui lui permettent de jouer un rôle essentiel dans les systèmes de protection antioxydante. C'est un antioxydant important puisqu'il est nécessaire à l'activité des glutathion peroxydases. On a utilisé pour son dosage une méthode colorimétrique exploitée par le kit Bioxytech GSH-400 et mettant en présence de l'échantillon un réactif R1 réagissant avec tous les mercaptans. Cette étape est suivie d'une alcalinisation du milieu chromophorique spécifique du glutathion à absorbance bien caractéristique. Longueur d'onde: 400 nm. Résultats Le tableau 1 montre l'augmentation de la teneur en glutathion réduit (GSH) de la peau irradiée aux U.V. et traitée comme ci-dessus Tableau 1 Lot n n" 1 n 2 n 3 % augm. GSH 109 10 n 1: prep. RoC ; n0 2 : L + M ; n 3 : témoin I1 apparaît que le traitement avec les principes actifs a provoqué une forte augmentation de la teneur en glutathion réduit (qui a doublé). Or le GSH représente un des protecteurs des plus efficaces contre les radicaux libres. 3- Activité élastasique Une expérience préliminaire a été réalisée pour préciser les conditions optimales pour la conduite des études. Ce travail a consisté à doser les activités élastiques des peaux non irradiées et irradiées avec 3 M.E.D. Les peaux ont été prélevées 24 heures après irradiation et traitées pour l'extraction des activités élastasiques. Des échantillons parallèles ont été incubés avant la mesure de la densité optique à 37 C pendant des temps variables de 2,5 à 20 heures, avec et sans EDTA. L'EDTA est un inhibiteur sélectif des métallo-endopeptidases. Quand on considère son effet sur les résultats des dosages, on constate dans les peaux irradiées que dans les premiers temps (2,5 et 4,5 heures d'incubation) une faible partie seulement de l'activité élastasique est inhibée, ce qui indique que la quasi totalité de l'activité mesurée concerne l'élastase des PMN (leucocytes polynucléaires). Du côté non irradié on constate aussi une activité relativement élevée attribuable à l'effet de cytokines libérées au sites d'irradiation et agissant à distance. A ces endroits l'addition de l'EDTA augmente l'activité mesurée de 55%, ce qui peut être attribué à une activation par l'EDTA par complexation des traces métalliques, des sérine-protéases de PMN partiellement inhibées par ces métaux. Après des temps d'incubation prolongés, 6,5 et 20 heures, on constate dans la peau irradiée et non irradiée que la proportion de l'activité élastasique EDTA-inhibable augmente pour atteindre finalement 50% environ de l'activité totale. L'augmentation de la valeur relative de l'activité élastasique attribuable aux métallo-endopeptidases est probablement due à leur plus grande résistance à l'inactivation que celles des sérine-élastases. Un autre mécanisme envisagé est l'activation de la métallo-endopeptidase latente des fibroblastes par la PMN-élastase. A partir de ces résultats, le temps d'incubation de 6 heures a été retenu pour la suite des dosages de l'activation élastasique, car dans ces conditions on a une activité totale qui est inhibée par l'EDTA ajouté au mélange réactionnel et provient donc des fibroblastes. Résultats La figure 9 donne l'inhibition des activités élastasiques mesurées dans les extraits de peaux irradiées et traitées avec le mélibiose ("Mélibiose anti-âge" RoC) : lot n" 1 ; ou avec un mélange de lactose-mélibiose à 3% dans un excipient : lot n" 2 ; ou encore avec l'excipient seul: lot n" 3. Les préparations contenant lactose et/ou mélibiose ont produit une protection de l'ordre de 30% contre l'augmentation de l'activité élastasique induite dans la peau par l'irradiation aux U.V. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un oligosaccharide possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou d'un dérivé d'un tel oligosaccharide susceptible d'etre obtenu par fixation d'un radical hydrophobe, pour la préparation d'une composition destinée à augmenter la synthèse et/ou à diminuer la dégradation des protéoglycannes du tissu conjonctif. 2. Utilisation d'un oligosaccharide selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est destinée à augmenter la synthèse et/ou à diminuer la dégradation des glycosaminoglycannes (GAG). 3. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le glycosaminoglycanne est l'hyaluronane, ou acide hyaluronique. 4. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'oligosaccharide est choisi dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés pouvant être obtenus par fixation d'un résidu hydrophobe. 5. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le résidu hydrophobe est choisi parmi: les alkyles en C1-C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en Cl-Cl8, les acides carboxyliques en C1-C18 linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en C1-C18, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en C1-C18. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition contient en outre des excipients cosmétologiquement ou pharmaceutiquement acceptables adaptés à une administration topique externe. 7. Utilisation d'un oligosaccharide possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice, ou d'un dérivé d'un tel oligosaccharide tel que déhni dans l'une des revendications 1, 4 ou 5 pour la préparation d'une composition destinée à lutter contre les effets des radiations U.V. 8. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que la composition est destinée à lutter contre les effets des radicaux libres. 9. Méthode cosmétique pour lutter contre les effets des radicaux libres et/ou pour augmenter la synthèse ou diminuer la dégradation des glycosaminoglycannes chez un mammifère en bonne santé, comprenant l'administration d'un oligosaccharide possédant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un galactose en position terminale non réductrice, ou d'au moins un dérivé de celui-ci susceptible d'être obtenu par fixation d'un radical hydrophobe.