Brevet FR2766573A1 — publié le 19990129

La présente invention est relative à un procédé de dépistage et/ou de pronostic d'un cancer par détection d'une protéine du cycle de tyrosinationdétyrosination de la tubuline (absence de tubuline-tyrosine-ligase (TTL) et/ou présence de tubuline A2) ainsi qu'à un kit de dépistage et/ou de pronostic (potentialité métastatique, caractère invasif, vitesse de développement de la tumeur) d'un cancer. Les microtubules forment, avec les filaments d'actine et les filaments intermédiaires, le cytosquelette des cellules eucaryotes. Les microtubules sont des organelles protéiques composées de molécules de tubuline, assemblées en structures tubulaires d'environ 25 nm de diamètre, d'une longueur pouvant atteindre plusieurs dizaines de micrométres. Les microtubules jouent de multiples rôles dans la cellule. Ils ont un rôle central dans la genèse et le maintien de la forme des cellules. Lors de l'interphase, ils organisent l'espace intracellulaire et sont responsables du transport intracellulaire d'organelles. Ils sont essentiels à la division cellulaire, en effet, lors de la mitose, ils se réorganisent pour former le fuseau mitotique, responsable de la répartition des chromosomes entre les deux cellules filles. Dans le système nerveux, les microtubules sont aussi directement impliqués dans la pousse des neurites et le transport axonal. Enfin, ils jouent un rôle central dans la motilité de cellules différenciées, comme par exemple les spermatozoïdes. Dans les cellules, la tubuline formée de deux sous-unités (a et ss), existe sous plusieurs isoformes. Cette diversité est générée à deux niveaux - la transcription sélective d'un ou plusieurs gènes codant pour chaque sous-unité, - une variété de modifications post-traductionnelles de la tubuline, comme son acétylation (Pipemo G. et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 2085-2094), sa phosphorylation (Gard D. et al., 1985, J. Cell Biol., 1985, 100, 764-774), sa glutamylation (Eddé B. et al., Science, 1990, 247, 83-85), sa polyglycylation (Redeker V. et al., Science, 1994, 266, 1688-1691) ou sa tyrosination (Barra HS. et al., 1988, 2, 133143). Cette dernière modification est connue sous le nom de cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline et est illustré à la figure 1. Conformément à ce cycle, la tubuline existe sous une forme tyrosinée (tubuline tyrosinée ou tubuline-tyr) et sous une forme détyrosinée (tubuline détyrosinée ou tubuline-glu) , le passage de l'une à l'autre de ces formes met en jeu deux enzymes spécifiques qui agissent au niveau de l'extrémité carboxy-terminale de la sous-unité a de la tubuline : le résidu tyrosine est clivé de la chaîne polypeptidique principale par une tubuline-carboxypeptidase (TCP) ou rajouté par une enzyme spécialisée, la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) (voir figure 1). Ce cycle, qui est absolument spécifique de la tubuline, inclut la synthèse d'une liaison peptidique sans participation des ribosomes. Une autre isoforme de la tubuline, résistante à la tyrosination, a également été mise en évidence (Paturle-Lafanechére L. et al., J. Cell. Science, 1994, 107, 1529-1543 et Biochemistry, 1991, 30, 10523-10528). Il s'agit d'une forme particulière de tubuline, représentant environ 35 % de la tubuline cérébrale, qui a été dénommée tubuline A2. Elle comprend deux aminoacides en moins (G1u450-Tyr451), par rapport à la tubuline-tyr (voir figure 2). Cette modification de la tubuline porte sur le site d'action de la TTL, ce qui explique pourquoi cette forme de tubuline ne peut pas être tyrosinée (Rùdiger M. et al., Eur. J. Biochem., 1994, 220, 309-320). Une étude de la localisation de la tubuline A2 a été réalisée (Paturle-Lafanechère et al., 1994, précité), elle a montré que la tubuline A2 est présente dans les neurones (cellules de Purkinje, neurones granulaires) mais n'est pas détectable dans les cellules gliales. Dans les cellules non-neuronales, la tubuline A2 est normalement absente, à l'exception des spermatozoïdes et des cellules ciliées, où les structures microtubulaires sont stabilisées. La Demanderesse a trouvé, de manière surprenante qu'il existe une suppression sélective de la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) dans les tumeurs, qui est directement corrélée à l'apparition de tubuline A2. La génération de tubuline A2, lors de la croissance tumorale, associée à la suppression d'activité de la TTL est pathologique, la tubuline A2 constitue donc un marqueur tumoral, particulièrement intéressant. En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de développer un test de dépistage et/ou de pronostic des tumeurs sur la base de ces propriétés (fonction de suppresseur de tumeur de la TTL et apparition de tubuline A2 dans les cellules cancéreuses). La présente invention a pour objet un procédé de dépistage et/ou de pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosinationdétyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubulinetyrosine-ligase, la tubuline A2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite détection comprend: - le traitement de l'échantillon tissulaire pour concentrer et/ou purifier et/ou solubiliser la tubuline A2 ou la TTL cytoplasmiques. - la mise en contact dudit échantillon tissulaire ou dudit fluide, avec au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline A2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines et - la révélation du complexe, éventuellement formé, par tout moyen approprié, tel que EIA, RIA, immunofluorescence. On entend par échantillon tissulaire, au sens de la présente invention, aussi bien un homogénat de tissu qu'une coupe de tissu , ce terme inclut également les tissus dissociés, traités de manière à remettre les cellules en culture. De manière avantageuse, pour détecter la tubuline A2 éventuellement présente dans une biopsie de tissu, il est possible et ce, de manière non limitative, de traiter l'échantillon tissulaire, selon l'un des protocoles suivants - effectuer des coupes du tissu, fixé de manière adéquate, et immunodétecter la protéine d'intérêt, - soumettre, après congélation et broyage dudit tissu, la poudre obtenue à un tampon d'extraction convenable; - purifier éventuellement et transférer la protéine d'intérêt, - dissocier les cellules et les remettre en culture, immunodétecter la protéine d'intérêt dans ces cellules, remises en culture. Toutes les méthodes d'immunodétection et de mesure des interactions entre les anticorps et les antigènes peuvent être utilisées Application à la détection de la tubuline A2: * Méthodes fluorimétriques: méthode directe: un anticorps spécifique anti-tubuline A2 est marqué par un composé fluorescent et mis en contact avec l'échantillon tissulaire, méthode indirecte : I'anticorps anti-tubuline A2, non marqué est appliqué sur l'échantillon tissulaire, un anticorps marqué dirigé contre les -Ig de l'espèce d'où provient l'anticorps spécifique, révèle sa fixation; * Dosages radio-irnrnunoloques La technique est fondée sur la liaison entre la tubuline M marquée ou un peptide spécifique (reproduisant la séquence spécifique de la tubuline A2) marqué, et un anticorps standard spécifique de cette tubuline. Le mélange de ces deux réactifs entraîne la formation de complexes immuns solubles, dissociables par la tubuline M froide (ou un peptide spécifique froid), éventuellement présente dans l'échantillon à analyser. Cette technique nécessite une séparation physique de la tubuline A2 ou du peptide radioactif libre et lié. * Dosages îmmuno-enzymatiques Le principe est le même que celui des dosages radio-immunologiques, à la réserve près que l'antigène ou l'anticorps est lié de façon covalente à une enzyme au lieu d'etre marqué paru un radio-isotope. L'enzyme, habituellement la peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline ou la ss-galactosidase, est visualisée par réaction colorée avec le substrat. Plusieurs modalités techniques peuvent être utilisées une technique de compétition peut être utilisée pour doser la tubuline A2. C'est la tubuline A2 ou un peptide spécifique qui est toujours fixé sur les microplaques. Un mélange d'échantillon tissulaire, éventuellement traité comme précisé ci-dessus, et de faibles quantités d'anticorps anti-tubuline M est ajouté. La quantité d'anticorps fixée sur la microplaque est d'autant plus faible que les molécules de tubuline M présentes dans l'échantillon à analyser ont neutralisé plus de molécules d'anticorps; des méthodes sandwich peuvent aussi être utilisées pour doser la tubuline A2 dans les échantillons tissulaires éventuellement traités : des microplaques sont recouvertes d'anticorps anti-tubuline I'échantillon à analyser est ajouté puis un anticorps anti-tubuline, différent de l'anticorps fixé sur le microplaques, couplé à une enzyme est appliqué et révélé par l'addition du substrat. * Immunotransfert ou western blot Cet essai est plus spécifiquement réalisé à partir d'échantillons dans lesquels la protéine à détecter est solubilisée, il comprend une séparation et un transfert des protéines avant la mise en contact avec le réactif; par exemple, I'échantillon cellulaire ou tissulaire est préparé en lysant les cellules ou l'homogénat tissulaire avec un tampon adéquat, en présence d'inhibiteurs de protéases pour éviter toute dégradation enzymatique. L'électrophorèse est effectuée dans un gel de polyacrylamide selon la technique de Laemmli, puis les protéines, dont éventuellement la tubuline A2, du gel sont transférées sur un filtre de nitrocellulose (ou tout autre filtre adéquat) , le filtre de nitrocellulose est récupéré et incubé avec l'anticorps anti-tubuline A2, puis le complexe tubuline A2-anticorps anti-tubuline z!2 est révélé par un anticorps anti-immunoglobuline (anticorps secondaire) marqué à la peroxydase (ou avec toute autre enzyme convenable) ou par un radio-isotope. Application à la détection des anticorps anti-tubuline A2 circulants * Méthode immuno-enzyrnatique la méthode indirecte est adaptée au dosage des anticorps antitubuline A2. Un peptide spécifique de la tubuline A2 ou la tubuline A2 elle-même, est fixé sur une microplaque. Le sérum à doser est d'abord pré-incubé avec un peptide spécifique de la tubuline-tyr en excès, de façon à éliminer les anticorps anti-tubuline non spécifiques de la tubuline A2. Ensuite, le sérum à doser est ajouté sur la microplaque et la fixation des anticorps anti-tubuline A2 est détectée par l'addition d'anticorps anti-IgG, couplés à une enzyme appropriée et révélée quantitativement au spectrophotomètre après addition du substrat de l'enzyme Application à la détection de la tubuline-tyrosine-ligase L'ensemble des méthodes exposées ci-dessus peuvent être mises en oeuvre pour doser la TTL. Dans les cellules tumorales, la TTL (suppresseur de tumeur) disparaît (signal négatif) alors que la tubuline A2 peut être simultanément détectée (o apparition d'un signal positif). Bien que le procédé puisse ne comprendre que la détection de la TTL, il est plus avantageux de détecter la tubuline A2 , en effet, un signal positif est d'interprétation plus aisée qu'un signal négatif (disparition de TTL) et présente un phénomène d'amplification. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, il comprend: - le traitement de l'échantillon tissulaire pour obtenir la phase soluble contenant éventuellement la TTL (en présence d'un tampon non dénaturant), - la mise en contact dudit échantillon tissulaire, avec le substrat de la tubuline-tyrosine-ligase, à savoir la tubuline-glu, en présence de tyrosine, éventuellement radiomarquée et - la détection de la tubuline-tyr produite, par tout moyen approprié. Cette détection peut être effectuée, soit par mesure de l'incorporation de la tyrosine radiomarquée, soit par un immunodosage, du type de celui décrit ci-dessus pour la tubuline A2, en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-tyr. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline A2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit dépistage: - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline A2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines, et - des doses appropriées d'un réactif de révélation. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection de tubuline-tyrosine-ligase dans un échantillon tissulaire, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit dépistage: - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-glu, la tubuline-tyr, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines, les anticorps dirigés contre ces protéines et les réactifs de dosage de la tyrosine; et, si nécessaire, - des doses appropriées d'un réactif de révélation. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la tubuline A2 comme marqueur tumoral. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre le cycle tyrosination-détyrosination de la tubuline, - la figure 2 illustre les différences de séquences en C-terminal des différentes isoformes de tubuline; - la figure 3 illustre le marquage immunofluorescent de cellules NfH/3T3, avant le sous-clonage des cellules TTL (sans activité tubuline-tyrosineligase) : la figure 3A illustre le double-marquage des microtubules Tyr et Glu, en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre la tubuline-tyr (TYR) ou d'anticorps polyclonaux dirigés contre la tubuline-glu (GLU), la figure 3B illustre le doublemarquage des microtubules Tyr et A2, en présence d'anticorps dirigés contre la tubuline-tyr (TYR) ou d'anticorps dirigés contre la tubuline A2 (A2). Certaines des cellules se colorent faiblement avec les anticorps anti-tubuline-tyr et fortement avec soit les anticorps anti-tubuline-glu ou les anticorps anti-tubuline A2 comme indiqué par les flèches (échelle 20 clam), - les figures 4 et 5 illustrent l'analyse comparative en immunofluorescence des sous-clones de cellules TTL et des cellules NIH/3T3 TTL, transfectées de manière stable avec l'ADNc de la TTL, pour leur contenu en tubuline A2, tubuline-glu et tubuline-tyr. La figure 4 illustre les résultats obtenus avec le sous-clone TTL et la figure 5 illustre les résultats obtenus avec les lignées cellulaires TTL transfectées et exprimant la TTL, de manière stable. Ces différentes cellules sont soumises à un double-marquage, soit avec un anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr (TYR) et un anticorps polyclonal anti-tubuline-glu (GLU), soit avec un anticorps monoclonal antitubuline-tyr (TYR) et un anticorps polyclonal anti-tubuline A2 (A2) (échelle 20 > lm); - la figure 6 illustre l'analyse en immunoblot du contenu en tubulinetyr, tubuline-glu, tubuline-52 (figure 6A) et TTL (figure 6B) de cellules NIH/3T3 (3T3), de cellules TTL (TTL) et de cellules TTL- transfectées avec l'ADNc de la TTL (TTL+). Les extraits cellulaires des différentes lignées cellulaires sont préparés comme décrit ci-après à l'exemple 1. Des échantillons (5 ,ul) sont analysés par procédure immunoblot pour détecter la tubuline-a, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-tubuline-a (DM1 A: a Tub) (Amersham), la tubuline-tyr, à l'aide d'un anticorps monoclonal primaire anti-tubuline-tyr (YL1/2: TYR), la tubuline-glu, à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline-glu (L3 : GLU) et la tubuline A2, à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline A2 (L7: A2). La bande de 50 kDa majeure observée correspond à la tubuline. A la figure 6B, des échantillons (5 vul) d'extraits cellulaires sont analysés en utilisant un anticorps monoclonal anti-TTL (ID3 : TTL). La bande majeure obtenue de 43 kDa est la TTL; - la figure 7 illustre une analyse en immunoblot du contenu en tubuline-a totale et en tubuline-tyr, tubuline-glu et tubuline A2, de tumeurs de souris nude et de différents tissus de souris normaux. La figure 7A correspond à des extraits cellulaires contrôles et à des extraits cellulaires tumoraux. Des échantillons (5 ,ul) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-a, la tubuline-tyr, la tubuline-glu et la tubuline A2, dans les conditions précisées ci-dessus pour la figure 6. 4 séries d'expériences sont réalisées , les résultats obtenus pour chaque série, comprennent une piste contrôle représentant les extraits cellulaires utilisés pour l'injection et deux autres pistes qui correspondent aux échantillons de tumeurs obtenus à partir de deux souris différentes (souris 1 et souris 2). Dans la première série d'expériences, qui utilise des cellules TTL pour induire des tumeurs, la première piste (contrôle 17B12) correspond à un extrait de cellules TTL-, obtenu avant l'injection dans deux souris différentes. La deuxième piste (souris 1 (17B12)) et la troisième piste (souris 2 (17B12)) de cette série d'expériences correspond à des échantillons de tumeurs, induites chez ces deux souris après injection des cellules. Les autres séries d'expériences utilisent des cellules TTL transfectées par un plasmide exprimant la TTL. Dans chacune de ces trois autres séries d'expériences, chacune des deux souris (souris 3 et 4 , souris 5 et 6 , souris 7 et 8) a été injectée avec des cellules TTL transfectées par de l'ADNc de TTL. 3 sous-clones différents de lignées cellulaires transfectées ont été plus particulièrement testés (GT4 (souris 3 et 4), 22C5 (souris 5 et 6) et 17F12 (souris 7 et 8)). Figure 7B : plusieurs échantillons tissulaires de souris (coeur, cerveau, muscle, foie, rein et rate) sont chargés sur un gel SDS à 8 % à des taux équivalents à ceux de la tubuline-a totale. Les protéines séparées sont soumises à une analyse en western blot, à l'aide soit d'un anticorps anti-tubuline-a (DM1 A: a Tub), soit à l'aide d'un anticorps anti-tubuline A2 (L7 : A2); - la figure 8 montre les différentes isoformes de tubuline et les taux de TTL dans des cellules TTL transfectées par un ADNc de TTL, mises en croissance in vitro ou in situ (émergence de sarcomes). La figure 8A illustre les résultats obtenus avec des cellules transfectées par de l'ADNc de TTL (clone 17F12, souris 7 et 8), mises en culture soit en présence (contrôle), soit en l'absence ((-)G418) de généticine pendant 6 semaines, les tumeurs sont générées par injection des cellules à partir du meme clone dans deux souris (souris 7 et souris 8). Les échantillons (5 ul) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-a, la tubuline-tyr, la tubuline-glu la tubuline A2, dans les conditions précisées ci-dessus pour la figure 6. Figure 8B : les mêmes échantillons sont analysés en western blot pour détecter la TTL, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-TTL (ID3); - la figure 9 illustre l'analyse en immunoblot de la tubuline A2 de différentes tumeurs humaines. Figure 9A: les cellules d'une lignée cellulaire humaine cancéreuse du sein (Cal 51) sont, soit mises en croissance in vifro (culture), soit injectées à des souris nude pour induire une tumeur (tumeur), les cellules sont extraites et 5 ul d'échantillons sont analysés en western blot, pour détecter la tubuline-a totale, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-tubuline-a (DM1 A: a Tub) et la tubuline A2) à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline A2 (L7: A2). Figure 9B : petites biopsies de différentes tumeurs humaines placées dans des souris nude pour induire une croissance tumorale. Des échantillons tumoraux sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-a totale et la tubuline A2, dans les conditions précisées ci-dessus. Figure 9C : des échantillons (15 ,ul chacun), constitués soit par un pool d'une centaine de cytosols (piste de gauche), soit par des cytosols de différentes tumeurs de sein humaines (un échantillon par piste) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline A2 dans les conditions précisées ci-dessus. Il doit etre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation des échantillons et des réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention Préparation des anticorps anti-tubuline A2. Les anticorps sont obtenus selon la procédure décrite par Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789). La séquence du peptide utilisé comme immunogéne est EGEEEGE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C-terminale de la tubuline A2). Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins. Les IgG obtenus sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) et leur spécificité vis-å-vis de la tubuline A2 est vérifiée par analyse en western blot. Les anticorps anti-tubuline produits sont détectés par un ELISA (Gundersen et al., 1984, précité), dans lequel les microplaques de titration sont recouvertes de tubuline-. * Préparation des anticorps anti-tubuline tvr L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr YL1/2 reconnaît spécifiquement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité a de la tubuline tyrosinée (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475); il est obtenu selon la procédure décrite par Kilmartin J.V. et al., J. Ceil Biol., 1982, 93, 576-582). X PréDaration des anticorps anti-tubuline-glu Les anticorps sont obtenus selon la procédure décrite par Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789). La séquence du peptide utilisé comme immunogène est GEEEGEE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C-terminale de la tubuline-glu). Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins. La spécificité des anticorps obtenus est vérifiée par ELISA conformément à la méthode décrite par Gundersen et al. précité. Les IgG obtenues sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) et leur spécificité vis-à-vis de la tubuline-glu est vérifiée par analyse en western blot. * Préparation d'anticorns anti-TTL Les anticorps anti-TTL sont obtenus selon la procédure décrite dans Wehland et al., J. Cell Biol., 1987, 104, 1059-1067). * Prénaration de tubuline A2, de tubuline-glu et de tubuline-tyr purifiées Les différentes tubulines sont isolées et purifiées à partir de cerveaux de boeuf, comme décrit dans Paturle et al., 1989, précité et Paturle-Lafanechère et al., 1991, précité. * Préparation des échantillons bioloziques. D'une manière générale, les échantillons tissulaires peuvent être préparés, soit dans un tampon dénaturant (contenant du SDS, par exemple), soit dans n'importe quel autre tampon, éventuellement décrit dans l'art antérieur, qui permette d'isoler la phase soluble des homogénats cellulaires ou tissulaires. Le choix du tampon dépend de l'usage ultérieur qui sera fait de l'échantillon tissulaire. - Echantillons tissulaires: échantillons tissulaires de souris normales. Ils sont disséqués et conservés dans l'azote liquide jusqu'à utilisation. Les échantillons (coeur, cerveau, muscle, foie, rein et rate) sont pesés et homogénéisés dans du SDS 1 % (1 ml/g de tissu), portés à ébullition pendant 5 minutes, puis centrifugés (200 000 g, 15 minutes à 20"C). Après addition d'un tampon dit tampon de dépôt (constitué de Tris-HCl 125 mM, SDS 2 %, glycérol 10 %, 2-mercaptoéthanol 10 %, bleu de bromophénol 10 %, pH 6,8),1'échantillon est à nouveau porté à ébullition pendant 3 minutes, puis stocké à -80 C jusqu'à son utilisation. échantillons tumoraux. Ils sont obtenus par injection de cellules tumorales humaines à des souris nude, la tumeur induite est récupérée à différentes phases de son évolution. De manière plus précise, une lignée cellulaire tumorale humaine, dénommée Cal 51 et décrite dans J. Gioanni et al., Brit. J. Cancer, 1990, 62, 8-13) est cultivée sur un milieu DMEM complémenté en sérum de veau 10 % ; les cellules sont ensuite injectées à des souris nude comme suit les cellules sont mises en suspension dans un milieu de croissance et 6 400 u1 de chaque suspension cellulaire (de 1 à 2,5.106 cellules) est injectée en sous- cutané dans la zone scapulaire de la souris nude, sous anesthésie légère à l'éther, les tissus sont congelés dans de l'azote liquide, puis réduits en poudre (moulin Freezer, Spex, Bioblock). On ajoute 1 ml de tampon de lyse/g d'homogénat cellulaire (tampon de lyse : Pipes-KOH 80 mM, pH 6,8, MgC12 1 mM, Triton-X-100 0,5 % (voUvol), glycérol 10 % (vol/vol), CaC12 5 mM + cocktail d'inhibiteurs de protéases). La lyse s'effectue pendant 10 min à 4"C. Ensuite, on rajoute 1/20 du même tampon sans Cal2, mais contenant de l'EGTA 200 mM (EGTA 10 mM final), de façon à chélater le CaCl2. L'échantillon est ensuite centrifugé (200 000 g, 15 min, 40C). Le surnageant est additionné d'un tampon de dépôt (comme ci-dessus), porté à ébullition pendant 3 min et stocké à -80 C jusqu'à utilisation. Une autre lignée cellulaire, à savoir des cellules dérivées des cellules NIH/3T3 (ATCC CRL 1658, fibroblastes embryonnaires de souris), obtenues après de multiples passages en culture, peuvent être utilisées pour préparer des échantillons tumoraux, dans les conditions exposées ci-après à l'exemple 2. échantillons de cancer du sein humain. Les échantillons, récoltés aux services de chirurgie des hôpitaux, sont immédiatement congelés dans de l'azote liquide, puis réduits en poudre comme précisé ci-dessus. Le tampon d'extraction est, dans ce cas, constitué de Tris 100 mM, EDTA 1 mM, MgC12 2,5 mM, glycérol 10 %, leupeptine 25 ug/ml, PMSF 0,5 mM, vanadate 1 mM et DTT 0,5 mMàpH7,4. Extraits Ces échantillons sont conservés à -80 C . De tels échantillons sont de préférence utilisés pour effèctuer les western blots (protéine soluble). Le contenu protéique des différents échantillons varie de 1 à 3 mg/ml. * Transfection cellulaire L'ADNc de TTL de porc est inséré dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (Invitrogen), qui contient un gène de résistance à la néomycine. Les plasmides contenant l'insert sont transfectés dans des cellules TTL, conformément à la procédure décrite dans Chen et al. (Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745-2752). Brièvement, des cellules en croissance exponentielle sont trypsinisées, ensemencées dans des boîtes de Pétri à raison de 5.105 105 cellules/10 cm et incubées une nuit dans 10 ml de milieu de croissance. Pour la transfection, 25 g d'ADN plasmidique est mélangé avec 0,5 ml de CaC12 0,25 M, 0,5 ml de 2 x BBS (BES 50 mM, NaCI 280 mM, Na2HP04 1,5 mM, pH 6,9) et le mélange est incubé 15 min à température ambiante. Une solution calcium-phosphate-ADN est ajoutée goutte-à-goutte aux cellules en culture qui sont maintenues pendant 20 heures à 35"C, sous atmosphère enrichie en C02 (3 %). Le milieu est ensuite retiré, les cellules rincées deux fois avec le milieu de croissance, réensemencées et incubées 24 heures à 370C, sous atmosphère enrichie en Co2 (6 %). Les cellules sont ensuite diluées selon un rapport 1/10 et incubées pendant 24 heures, avant la sélection des transformants stables à l'aide de généticine (750 pLg/ml). Après deux semaines de sélection, les clones isolés sont sélectionnés à l'aide d'anneaux de clonage et incubés séparément dans un milieu de croissance comprenant 750 Ag/ml de généticine pour l'amplification et le criblage par immunofluorescence. * Dilutions des anticorps L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr (YL1/2) est utilisé à une dilution de 1/1 000 pour l'immunofiuorescence et les western blots. Les anticorps secondaires utilisés avec cet anticorps sont les anticorps de chèvre anti-rat conjugués à la rhodamine (1/250) pour l'immunofluorescence ou les anticorps anti-souris conjugués à la peroxydase (1/5 000) pour les western blots. Les anticorps polyclonaux purifiés anti-tubuline-glu et anti-tubuline A2 sont dilués respectivement au 1/500 et au 1/1 000 pour l'immunofluorescence et au 1/100 000 et au 1/200 000 pour les western blots. Les anticorps secondaires utilisés avec ces anticorps sont les anticorps anti-lapin conjugués à la fluorescéine (1/250) pour l'immunofluorescence et les anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase (1/5 000) pour les western blots. Pour les western blots, la tubuline-a totale est détectée à l'aide d'un anticorps anti-tubuline-a monoclonal DM1A (Amersham) dilué au 1/1 000, qui est détecté à l'aide d'un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase (1/5 000). L'anticorps monoclonal anti-TTL (ID3) est dilué au 1/1 000 pour son utilisation dans les western blots. * Expériences in vivo Les cellules transfectées avec l'ADNc de TTL (ou avec le plasmide seul) sont sous-clonées dans un milieu de croissance contenant 750 ,ug/ml de généticine, puis les différentes tubulines (tyr, glu et A2) sont détectées par immunofluorescence. Les clones purs (contenant 100 % de cellules tyr ou 100 % de cellules glu) sont sélectionnés et amplifiés. Les cellules en croissance exponentielle sont trypsinisées et centrilu- gées (1 250 rpm, 5 min, température ambiante), les cellules sont remises en suspension dans un milieu de croissance et 400 FI de chaque suspension cellulaire (de 1 à 2,5.106 cellules) sont injectés en sous-cutané dans la région scapulaire de souris nude sous anesthésie légère à l'éther. Pour chaque clone différent, deux souris sont simultanément injectées. Les animaux sont observés chaque jour et le jour de l'apparition de la tumeur est noté. Les animaux sont tués par dislocation cervicale après une période de croissance tumorale, puis les tumeurs sont extraites, pesées et découpées et traitées comme précisé ci-dessus. ExemPle 2 : Étude de cellules TTL : mise en évidence d'une corrélation avec la présence de tubuline A2 et un état tumorigène. - Sélection de cellules TTL Les cellules NIH/3T3 précitées, dérivées de la lignée ATCC CRL 1658, sont cultivées sur milieu DME supplémenté avec du sérum de veau à 10 % et du sérum de veau foetal à 1 %. Les sous-clones TTL sont obtenus par dilution limite, après 3 cycles de croissance. Ils sont sélectionnés en fonction de l'uniformité de leur phénotype, par double coloration en immunofluorescence, en utilisant soit des anticorps antitubuline-glu, soit des anticorps anti-tubuline A2, en combinaison avec un anticorps anti-tubuline-tyr. Les sous-clones TTL sont ceux qui ne produisent pas de tubulinetyr. Dans ces cellules, les microtubules Glu représentent la quasi-totalité des microtubules cytoplasmiques, au lieu de la petite sous-population habituellement observée dans les différents types cellulaires. La tubuline-tyr est peu abondante et est présente de manière diffuse dans les microtubules cytoplasmiques. De plus, ces cellules possèdent spontanément, en quantité importante, des microtubules formés de tubuline A2. - Mise en évidence de la présence de tubuline-glu et de tubuline A2 Les réseaux microtubulaires de ces cellules en interphase réagissent de manière substantielle, avec des anticorps anti-tubuline-glu (figure 3A). Des expériences de double-marquage, comparant la distribution des microtubules contenant de la tubuline-glu et des microtubules contenant de la tubulinetyr montrent que les cellules qui réagissent avec les anticorps anti-tubuline-glu ne réagissent pas avec les anticorps anti-tubuline-tyr (figure 3A, flèche). La figure 3B illustre les cellules NIH/3T3 dont les microtubules contiennent de la tubuline A2 , cette population cellulaire est distincte de celle contenant de la tubuline-tyr (figure 3B, flèche). Parmi les cellules qui présentent un signal tubuline-glu fort, on observe une présence abondante de tubuline A2 dans les microtubules (figure 4). Les résultats obtenus en immunochimie sont en corrélation avec l'analyse en western blot Lorsque les gels sont chargés sur une même base en protéine, la tubuline a est approximativement équivalente dans les cellules NM/3T3 et dans le sous-clone tubuline-glu (figure 6A). Cependant ces lignées diffèrent par la séquence C-terminale. de la tubuline a. Le sous-clone tubuline-glu ne contient pratiquement pas de tubuline-tyr, alors qu'il contient en abondance de la tubuline-glu et de la tubuline A2 (figure 6A). - Mise en évidence de l'absence de TTL Les extraits cellulaires obtenus, comme précisé ci-dessus, sont mis en contact avec des anticorps anti-TTL, pour déterminer si l'abondance de microtubules contenant de la tubuline-glu est corrélée avec l'absence d'une activité TTL. Après incubation des anticorps, on ne détecte aucune TTL dans les sous-clones contenant de la tubuline-glu (figure 6B). Des essais de transfection de ces cellules TTL avec un plasmide comprenant l'ADNc de la TTL restaure une expression et une activité TTL (figure 6B) à des taux apparemment normaux, ce qui a pour conséquence la disparition de tubuline-glu et de tubuline A2 (figure 6A). Ceci illustre la corrélation qui existe entre l'absence de TTL et la présence de tubuline-glu et de tubuline A2 Cet effet de la transfection avec un plasmide contenant l'ADNc de la TTL est également illustré par immunofluorescence: un sous-clone TTL contient de la tubuline-tyr en abondance, des taux très faibles de tubuline-glu (figure 5) et pas de tubuline A2 (pas de réaction avec les anticorps anti-tubuline A2, figure 5). - Relation entre l'absence d'expression de TTL. la présence de tubuline A2 et l'émergence d'une tumeur. Aussi bien les cellules TTL que les cellules TTL contenant le plasmide exprimant l'ADNc de TTL, lorsqu'elles sont injectées dans des souris nude produisent des tumeurs. Dans le cas des tumeurs dérivées des cellules TTL contenant le plasmide exprimant la TTL, on observe, en western blot, que les cellules contiennent de la tubuline-glu et de la tubuline A2 en abondance (figure 7A). Le résultat est tout à fait reproductible 2 souris injectées avec la même lignée cellulaire donnent les mêmes résultats. Ceci démontre l'intérêt et la spécificité de la détection de la tubuline A2, comme marqueur de la perte d'une activité TTL, liée à l'émergence de cellules tumorales. En effet, les résultats en western blot de biopsies de tissus normaux montrent qu'ils contiennent de la tubuline-tyr et de la tubuline-glu, mais jamais de tubuline A2 sauf dans le cerveau (figure 7B). La présence accrue de tubuline-glu et de tubuline A2 est due à la perte de l'activité TTL, pendant la croissance de la tumeur (western blot en présence d'anticorps anti-TTL, figure 8B). Il en résulte que la présence de tubuline A2 dans un tissu est le résultat direct de la suppression de l'activité TTL ; la TTL peut donc être considérée comme un suppresseur de tumeur. Exemple 3: détection de la tubuline A2 dans des cellules cancéreuses Test ELISA Effectué sur des microplaques de titration comprenant 96 puits. Toutes les incubations sont réalisées à 37"C. Chaque puits comprend 0,5 Flg de tubuline A2 dans un tampon carbonate/bicarbonate (100 mM, pH 9,5). Les microplaques sont incubées pendant 2 heures puis lavées 3 fois avec un tampon PBS/Tween 0,1 % (PST), les anticorps anti-tubuline A2 et des fractions d'échantillons tissulaires obtenus à partir de biopsies sont mélangés et préincubés pendant 45 min avant que 50 ul du mélange soit ajouté/puits. La concentration en anticorps anti-tubuline A2 est maintenue constante à 2,5 llg/puits. Ces microplaques sont incubées pendant 1 h et lavées 3 fois avec du PBST, avant d'introduire 50 ul d'IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à de la ss- galactosidase (dilution 1:2 000 dans du PBST/BSA 1 %) dans chaque puits. Après 1 h d'incubation, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBST et 50 u1 de substrat (O-nitrophényl-ss-D-galactopyranoside ou ONPG 0,8 mg/ml, 2mercaptoéthanol 7 ul/mi, dans du PBS) sont ajoutés par puits. Après 30 min d'incubation, la réaction est arrêtée par addition de 50 ul de Na2CO3 0,5 M, pH 9,5. L'absorbance est mesur.ée à 405 nm. Western blot On peut, soit extraire la fraction soluble des cellules par n'importe quelle procédure de l'art antérieur, soit lyser les cellules dans un tampon dénaturant comme précisé ci-dessus. L'électrophorèse des protéines obtenues est réalisée selon la méthode de Laemmli (Nature, 1970, 227, 680-685). Les protéines séparées sont transférées sur des membranes de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, CeraLabo), conformément à la méthode de Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350-4354). Les IgG anti-tubuline A2 sont diluées au 1/200 000. La révélation est effectuée par incubation des membranes, pendant 30 min avec des anticorps secondaires conjugués à de la peroxydase, suivie de 3 lavages (Kit ECC Amersham). Immunofluorescence (W) - Sections: Des morceaux de tumeurs sont transférés dans du PBS contenant du paraformaldéhyde 4 % (pH 7,4), pendant 12 heures à 4"C. Le tissu fixé est alors incubé 12 h dans un tampon de saccharose à 20 % et congelé dans de l'isopentane. Des sections (épaisseur 10 clam) sont préparées à l'aide d'un cryotome à - 18 C. On procède ensuite comme décrit dans Paturle-Lafanechére et al. (J. Cell. Science, 1994, précité). - Cellules: Pour l'analyse en IF des cellules, on procède comme suit les cellules sont mises en culture 1-4 jours sur des lamelles en verre, rincées dans du PBS à 37"C, fixées pendant 6 min dans du méthanol anhydre à -200C, puis lavées dans du PBS/Tween 20 à 0,1 % (v/v). Les cellules sont ensuite incubées avec les anticorps primaires et secondaires convenables, dilués dans du PBS contenant de la SAB à 0,1 %. Les noyaux sont colorés avec de l'Hoechst 33258 à 1 )lg/ml dans du PBS contenant de la SAB à 0,1 %. Les lamelles sont montées et observées au microscope. Résultats Les résultats illustrés ci-après sont ceux obtenus en immunofluorescence et en western blot ; des résultats similaires sont obtenus en ELISA, lorsque l'on suit la procédure décrite ci-dessus. - Lignée cellulaire transformée (tumeur humaine) Cal 51 en culture. En culture, la lignée cellulaire contient des taux normaux de tubulinetyr et de tubuline-glu , elle ne contient pas de tubuline A2, comme illustré en western blot (figure 9A), IF ou ELISA. - Souris nude présentant un cancer après injection de la lignée cellulaire Cal 51. On observe la production de tubuline A2 lorsqu'il y a effectivement développement d'une tumeur (figure 9A), ceci indiquant la perte de l'activité TTL. - Tumeurs humaines diverses : des biopsies humaines ont été analysées, à partir de tissus d'origines variées après passage par souris nude (figure 9B). Les différentes tumeurs testées sont les suivantes : sarcome synovial, liposarcome, ostéosarcome, hemangiopericytome ,toutes présentent de la tubuline A2, à l'exception de l'ostéosarcome. - Tumeurs humaines primaires de sein : un pool de 100 extraits de biopsies humaines et 7 extraits individuels ont été analysés , la tubuline A2 est clairement détectée (figure 9C, colonne de gauche), sauf dans un extrait individuel. Exemple 4: absence de TTL détectable dans les cellules cancéreuses La disparition de la TTL constitue un signal négatif de dépistage d'une tumeur. - Dosage par ELISA les extraits cellulaires sont réalisés comme précisé ci-dessus. La TTL est purifiée par chromatographie d'immunoaffinité en utilisant un anticorps monoclonal spécifique de la ligase (anticorps LA/C4) tel que décrit dans Schroeder et al. (J. Cell Biol., 1985, 100, 276-281). L'enzyme est ensuite éluée avec du MgCl2 3 M dans un tampon de stabilisation K±MES 25 mM, pH 6,8, KC1 100 mM, MEC12 2 mM, EGTA 1 mM, DTT 0,5 mM, glycérol à 20 % (v/v) et dialysée contre le tampon de stabilisation. On procède ensuite comme précisé ci-dessus. - Mesure de l'activité enzymatique Les mesures enzymatiques sont effectuées dans 50 RI d'un tampon de mesure de l'activité TTL contenant de l'acide morpholinoéthanesulfonique K+ 100 mM (MES-KOH) (pH 6,8), EGTA 1 mM, MgC12 25 mM, ATP 5 mM, KCI 100 mM, tyrosine 100 uM et de la tubuline-glu (4,5 mg/ml au maximum) , l'incorporation de tyrosine est mesurée en présence de 3H-tyrosine (2 RCi/50 pLI). En variante, on peut doser la tubuline tyrosinée formée par immunodétection (ELISA ou immunofluorescence), dans les conditions précisées ci-dessus. On utilise par exemple un anticorps qui reconnaît spécifiquement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité a de la tubuline tyrosinée (Wehland et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475) à une dilution au 1/1 000ème pour l'immunofluorescence ou les western blots. L'anticorps secondaire utilisé est une Ig de chèvre anti-rat conjuguée à la rhodamine (1/250) pour l'immunofluorescence ou une IgG de chèvre anti-souris (ou anti-rat) conjuguée à la peroxydase pour les western blots (1/5 000). Pour l'ELISA, I'anticorps secondaire utilisé est une IgG de chèvre anti-souris ou anti-rat conjuguée à de la ss-galactosidase (1/2 00 dans du PBST/SAB 1 o > Exemple S: détection des anticorps anti-tubuline A2 circulants Par ELISA ou par western blot, dans les conditions exposées cidessus. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDTCATIONS 1") Procédé de dépistage et/ou de pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase et la tubuline A2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines 2") Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite détection comprend: - le traitement de l'échantillon tissulaire pour concentrer et/ou purifier et/ou solubiliser la tubuline A2 ou la TTL cytoplasmiques; - la mise en contact dudit échantillon tissulaire ou dudit fluide biologique, avec au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubulinetyrosine-ligase, la tubuline A2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines, et - la révélation du complexe éventuellement formé par tout moyen approprié. 3 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: - le traitement de l'échantillon tissulaire pour obtenir la phase soluble contenant éventuellement la TTL, - la mise en contact dudit échantillon tissulaire, avec le substrat de la tubuline-tyrosine-ligase, à savoir la tubuline-glu, en présence de tyrosine, éventuellement radiomarquée et - la détection de la tubuline-tyr produite, par tout moyen approprié. 4 ) Kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase et la tubuline A2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit dépistage: - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline A2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines , et - des doses appropriées d'un réactif de révélation. 5 ) Kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection de tubuline-tyrosine-ligase dans un échantillon tissulaire, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre dudit dépistage: - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-glu, la tubuline-tyr, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines, les anticorps dirigés contre ces protéines et les réactifs de dosage de la tyrosine, et, si nécessaire, - des doses appropriées d'un réactif de révélation. 6 ) Utilisation de la tubuline A2 comme marqueur tumoral.