Brevet FR2763943A1 — publié le 19981204

COMPOSES. LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION POUR LE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES DANS LES CELLULES La présente invention concerne de nouveaux composés pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Ces nouveaux composés sont plus particulièrement apparentés à la famille des lipopolyamines, et comportent des fonctions amidines. Ces composés sont utilisables pour transférer des acides nucléiques d'intérêt dans différents types cellulaires, aussi bien in vitro que in vivo. Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une nécessité. II peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation impliquant l'ADN. II peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. II peut encore s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des approches de greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure. Différents types de vecteurs synthétiques ont été développés pour améliorer le transfert des acides nucléiques dans les cellules. Parmi ces vecteurs, les lipides cationiques possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont constitués d'une partie polaire, cationique, interagissant avec les acides nucléiques, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire. Des exemples particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques (DOTMA: LipofectinR); certains détergents cationiques (DDAB); les lipopolyamines, en particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), dont la préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 111. Une autre famille de lipopolyamines est représentée par les composés RPR120531 et RPR 120535 décrits dans la demande de brevet n" PCTIFR96101774, incorporée à la présente par référence. La présente invention concerne un nouveau type d'agents de transfert d'acides nucléiques, possédant des propriétés particulièrement intéressantes. Plus précisément, les composés selon la présente invention sont des lipides cationiques portant une région cationique originale, conférant aux molécules des propriétés améliorées. Cette partie cationique est réprésentée plus précisément par une polyamine particulière, portant une ou plusiers fonctions amidine. Un premier objet de l'invention réside plus précisément dans un composé sous forme D, L ou DL, ainsi que ses sels, de formule générale (I) dans laquelle: - R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q q pouvant varier entre l, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R1, R2 et R3, R R et R' représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule (II) dans laquelle q' peut varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6, ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', r est un nombre entier compris entre 0 et 6 inclus, et les groupements R5 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste hydrocarboné, étant entendu que l'un au moins des groupes R1, R2 et R3 comporte au moins un groupement de formule (Il); - m et n représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 1 et 6 inclus avec lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale (I), - p représente un nombre entier pouvant varier entre 1 et 6 inclus; et, - R4 représente un groupement de formule générale (III) dans laquelle: R7 et R8 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement lipophile, I'un au moins des groupes R7 et R8 étant différent de l'hydrogène, t t est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque t est un entier supérieur à 1 R6, X, Y et s pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [X-(CHR6)s-Y] X X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement amine monoalkylé ou non, Y Y représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène R6 représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel, le cas échéant substituée et s s représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque s est égal à 1, R6 représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel, le cas échéant substituée, et lorsque s est supérieur à 1, R6 représentant un atome d'hydrogène. Plus préférentiellement, dans le groupement de formule (II), R5 peut être un reste hydrocarboné aliphatique ou aromatique, éventuellement halogéné. Parmi les restes aliphatiques on peut mentionner plus particulièrement un reste aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, cyclique ou non, éventuellement halogéné. Plus préférentiellement, il s'agit d'un reste aliphatique en C1 à C10 tel que par exemple un reste alkyl, notamment formyl, butyl, ter-butyl ou tert-butylcarbamate. Le ter-butyl-carbamate est un exemple particulièrement intéressant. Parmi les restes aromatiques, on peut citer plus particulièrement le benzyl et ses dérivés substitués tels que le chlorobenzyl, benzylcarbamate ou le chlorobenzylcarbamate. Le benzylcarbamate et le chlorobenzylcarbamate sont tout particulièrement intéressants. Dans une première variante de l'invention, I'un des groupes R5 représente un atome d'hydrogène et l'autre un reste aliphatique en C1 à C10. Dans une autre variante de l'invention, I'un des groupes R5 représente un atome d'hydrogène et l'autre un reste aromatique choisi de préférence parmi le benzyl et ses dérivés. Dans une autre variante de l'invention, les deux groupes R5 représentent des atomes d'hydrogène. Avantageusement, dans la formule (II), q' prend la valeur 2 ou 3 et r vaut 0. Préférentiellement, dans la formule générale (I), m est choisi parmi 2, 3 et 4. Comme indiqué ci-avant, dans la formule (III), I'un au mois des groupes R7 et R8 représente un groupement lipophile. On entend au sens de l'invention par groupement lipophile tout groupement de type lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire. II peut s'agir en particulier d'une ou plusieurs chaines aliphatiques grasses, d'un dérivé de stéroïde, d'un lipide naturel ou synthétique, de préférence capable de former des phases lamellaires ou héxagonales, ou éventuellement d'une combinaison de ceux-ci. II peut s'agir en particulier d'un radical aliphatique en C5 à C22, saturé ou non, linéaire ou ramifié, éventuellement fluoré ou halogéné, d'un stéroide de type cholestérol, cholestanol ou acide cholique, ou d'un groupement (CH2)u-NH-R9 dans lequel u est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclus et R9 est un radical acyl tel que par exemple un cholestéryl-formiate, arachidonyl ou acide cholique. De manière préférentielle, le groupement lipophile est un radical aliphatique en C10 à C22, de préférence en C17, C18 ou C19, et notamment les groupements (CH2)17CH3; (CH2)18CH3, et oleyl (chaine C18 insaturée). Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les deux groupes R7 et R8 représentent des groupement lipophiles tels que définis ci-dessus. En particulier, dans un mode de réalisation préféré, chacun des groupes R7 et R8 représente une chaine aliphatique grasse en C5 à C22. A titre de chaine latérale d'acide aminé naturel (voir R6) on entend notamment désigner au sens de l'invention des chaines contenant des motifs amidinium comme par exemple la chaine latérale de l'arginine. Comme il I'est énoncé précédemment cette chaine latérale peut être substituée par des groupements aliphatiques saturés ou insaturés, linéaires, ramifiés ou cycliques en C1 à C24 tels par exemple des radicaux cholestéryle, arachidonyle ou rétinoyle, des groupements mono- ou poly-aromatiques tels par exemple des dérivés benzyloxycarbonyles, benzyle esters, rhodaminyle, biotinyl substitués ou non. Une famille particulière de composés selon l'invention est celle dans laquelle R1 comporte un groupement de formule (II) et R2 et R3 sont des atomes d'hydrogène. Une autre famille particulière de composés selon l'invention est celle dans laquelle R1 et R2 comportent un groupement de formule (II) et R3 est un atome d'hydrogène. Une autre famille particulière de composés selon l'invention est celle dans laquelle R1 et R3 comportent un groupement de formule (II) et R2 est un atome d'hydrogène. Une autre famille particulière de composés selon l'invention est celle dans laquelle R1, R2 et R3 comportent un groupement de formule (II). Ces nouveaux composés de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine). A titre représentatif des composés selon l'invention on peut plus particulièrement citer les composés de sous-formules générales suivantes dans lesquelles R4 et R5 ont les significations données ci-dessus: A titre d'exemple illustratif préféré de composé selon l'invention on peut citer le composé RPR132335 de formule suivante Les composés de l'invention peuvent être préparés de différentes façons en synthèse en solution et/ou en synthèse en phase solide sur un support polymérique. Une méthode de synthèse consiste à préparer le lipide cationique polyaminé sur lequel sont ensuite greffée(s) la ou les fonction guanidines. Une deuxieme methode consiste à preparer les briques polyaminoamidines fonctionalisées qui sont ensuite introduites dans les lipopolyamines. Les groupements amidines du type guanidine obtenus par les différentes méthodes peuvent etre synthetisés par exemple par réaction entre une et/ou plusieurs amines primaires situées dans une molecule d'intérêt et des réactifs tels que le O Methylisourea Hydrogen sulfate (Ref: J. Med Chem. 38(1995) 16, 3053-3061), le S Methylisothiourea semisulfate (ref: Int. J. Pept. Prot. Res.40 (1992), 119-126), la Bis-Boc-Thiourea (ref: Tet. Lett. 48 (1993), 7677-7680), la N,N'di (benzyloxycarbonyl)S-Methylisothiourea ou la N, N'-di(t-buthoxycarbonyl)S- Methylisothiourea (ref: Synth Commun. 26(1996), 2, 407-413). D'autres méthodes connues de l'homme du métier peuvent bien entendu être utilisées. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un composé tel que défini ci-avant, et un acide nucléique. Préférentiellement, le composé et l'acide nucléique sont présents en quantités telles que le rapport R des charges positives du composé sur les charges négatives de l'acide nucléique soit compris entre 0,1 et 50, de préférence entre 0,1 et 20. Ce rapport peut être ajusté aisément par l'homme du métier en fonction du composé utilisé, de l'acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type de cellules à transfecter). On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. II peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement. Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par des plasmides, vecteurs, épisomes, cassettes d'expression, etc. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter des régions codantes, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de s'associer au complexe composé/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un acide nucléique, un composé tel que défini ci-avant et un adjuvant capable de s'associer au complexe composé/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés. Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport R est faible. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et, de manière surprenante, de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane. Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. II peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), I' oléoyl-palmitoylphos- phatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois; les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2). Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple: le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, I'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry). Récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non directement au niveau de la condensation dudit acide nucléique (W096/25508). La présence d'un tel composé, au sein d'une composition selon l'invention permet de diminuer la quantité de composé transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante. Par composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un composé compactant, directement ou non, I'acide nucléique. Plus précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'acide nucléique à transfecter soit intervenir au niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au niveau de l'acide nucléique. Selon un mode de réalisation préféré, cet agent intervenant au niveau de la condensation de l'acides nucléique est constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature biochimique, par exemple un ou plusieurs acides aminés ou de nature chimique. Un tel agent peut également dériver en tout ou partie d'une histone, d'une nucléoline, d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20 équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acides nucléiques en mol/mol et, plus préférentiellement, de 0,5 à 5. Par ailleurs, les compositions de l'invention peuvent également comporter un ou plusieurs éléments de ciblage permettant de diriger le complexe préférentiellement vers des types préférés de cellules ou vers des compartiemnts intracellulaires particuliers. Ce type d'élément a été décrit par exemple dans la demande W096/02655. L'invention a également pour objet l'utilisation des composés tels que définis ci-avant pour le transfert d'acides nucléiques (et plus généralement de polyanions) dans les cellules, in vitro, ex vivo ou in vivo. L'invention concerne en outre une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes: (1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé tel que défini ci-avant, pour former un complexe acide nucléique /composé, et, (2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1). La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 ijg d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique comprises entre 0,01 et 10 mg peuvent par exemple être utilisées. Pour des utilisations in vivo, soit en thérapie soit pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). II peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques in vivo, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un acide nucléique apte à corriger ladite maladie associé à un composé de formule générale I dans les conditions définies ci-avant. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou nucléique et l'acide nucléique administré code pour ledit produit protéique ou contient ledit produit nucléique. Elle s'étend à toute utilisation d'un composé selon l'invention pour la transfection in vivo ou in vitro de cellules. Les composés de l'invention sont particulièrement utilisables pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. II peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc), épitheliales, etc, sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs). Les composés de l'invention peuvent à titre illustratif être utilisé pour le transfert in vitro ou in vivo d'acides nucléiques codant pour des protéines ou polypeptides choisis par exemple parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VI Il, IX, les gènes intervenant dans la réparation de I'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-l, A-ll, A IV, B, C-l, C-ll, C-lil, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholesterol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger.etc. Les composés de l'invention peuvent également être utilisés pour transférer dans les cellules des gènes ou séquences antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201). L'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, I'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. II peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus, d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. FIGURES Fiaure 1: Schéma de synthèse du RPR132335 Figure 2 : Mesure de l'efficacité de transfection des composés de l'invention dans les cellules NIH3T3, HepG2 et HeLa, en absence de protéines sériques. Figure 3 : Comparaison de l'efficacité de transfection des composés de l'invention dans les cellules NIH3T3, HepG2 et HeLa, en absence et en présence de protéines sériques ExemDles ABREVIATIONS ET SYMBOLES AcOEt: Acétate d' éthyle BOC t-Butoxycarbonyl BOP: Benzotriazol- 1 -yloxytris (diméthylamino) phosphonium hexafluorophosphate DCC: Dicyclohexylcarbodiimide DCU: Dicyclohexylurée DMAP: 4-Diméthylaminopyridine DMF: Diméthylformamide DMSO: Diméthyle sulfoxide DODA: Dioctadécylamine EP: Ether de pétrole EtOH: Ethanol NEt3: Triéthylamine Rf: Coefficient de rétention frontal TFA: Acide trifluoroacétique THF: Tétrahydrofurane TMS: Tétraméthylsilane UV: Ultra-Violets SPPS: Solid Phase Peptide Synthesis CLHP: Chromatographie Liquide à Haute Pression Z: Benzyloxycarbonyl CIZ: p-Ch Iorobenzyloxycarbonyl A- MATERIELS ET METHODES POUR LES SYNTHESES CHIMIQUES 1- MATERIEL a) Composés - Les polyamines de départ sont disponibles commercialement, par exemple: spermidine, spermine, tris (2-aminoéthyle) amine, phénylène-diamine, diaminoéthane (propane, butane, pentane, hexane, etc.), ou peuvent être synthétisées par des méthodes classiques, par exemple par cyanoéthylation exhaustive d'amines disponibles dans le commerce telles que les diamino-éthane (propane, butane, pentane, hexane, etc.) amine, spermidine, spermine pour donner des polyamines branchées. - Les agents alkylants sont choisis en fonction de la méthode d'alkylation comme suit: Pour une alkylation classique: I'acide bromoacétique, les acides w-halogéno carboxyliques. Pour une alkylation réductive: un acide w-aldéhyde-carboxylique, tel que l'acide glyoxalique, le semi-aldéhyde succinique,etc., ou un céto-acide tel que l'acide acéto-acétique ou l'acide pyruvique, etc. - Les polymères utilisés sont des résines disponibles dans le commerce pour la synthèse peptidique en phase solide (synthèse de Merrifield), par exemple la résine d'O-Chlorotrityl chlorure, la résine HMP, qui fournissent des produits portant des fonctions acides libres ou une résine de type Rink. Les acides polyaminés peuvent être synthétisés directement sur un peptide présynthétisé sur la phase solide et portant une fonction bromo-alkyl ou un acide w-aldéhyde. - Les dioctadecylamine, triethylamine, trifluoroacetique, BOP, DMAP, chloroformate de benzyle de chez Aldrich.sont des produits commerciaux. Les solutions de NaCI et NaHC03 sont saturées; la solution de KHS04 est de 0.5 M b) Mesures Physiques. Les spectres de RMN Proton ont été enregistrés sur des spectrométres Bruker 400 et 600 MHZ. Les spectres de masse ont été réalisés sur un API MS/III. c) Techniques de chromatographie Analytique Les analvses CLHP sont réalisées sur un appareil Merck-Hitachi équipé d'un autosampler AS-2000A, de une pompe inteligent L-6200A et de un détecteur UVvis L-4000 avec longueur d'onde réglable mise à 220 nm pour séparations analitiques et à 235nm pour séparations préparatives. Les colonnes pour les séparations analytiques sont des colonnes BU-300 aquapore Butyl 7m, 300 A 300x4.6 mm. de chez Perkin-Elmer. Les phases mobiles sont H20 (0.1 % TFA) et Acétonitrile (0.1% TFA). Injection de 20 pL d'une solution d'environ 1 mg/mL dans une vanne à boucle de 100 CIL. Le débit pour les analyses analytiques est réglé à 1 ml/min. Conditions de seoaration: Solvant A Solvant B Eau déminéralisée 2500 mL Acétonitrile pour HPLC 2500 mL Acide trifluoroacétique 2 mL Acide trifluoroacétique 2.5 mL Gradient: Temps en m Ensemble pour la chromatographie en phase liquide en mode gradient, permettant une détection UV. Cette chaîne préparative est composée de: Pompe A: GILSON modèle 305 équipée d'une tête 50 SC. Pompe : GILSON modèle 303 équipée d'une tête 50 SC. PomDe ini.: GILSON modèle 303 équipée d'une tête 25 SC. Module de Dression : GILSON modèle 806. Mélangeur: GILSON modèle 811 C équipé d'une tête de 23 ml. Détecteur UV : GILSON modèle 119 équipé d'une cellule préparative. Collecteur de fraction : GILSON modèle 202 équipé de portoirs n" 21. Intégrateur: SHIMADZU modèle C-R6A. Colonne : Colonne C4 (i Omm) en acier inoxydable de 25 cm de longueur et de 2.2 cm de diamètre commercialisée par VYDAC modèle 214 TP 1022. INJECTION : La solution de produit a purifier est chargée sur la colonne par la pompe d'injection au débit de 15 cumin. Collecteur de fractions: Un tube en 30 secondes. DETECTION I = 220 nm, 2= 235 nm PHASE MOBILE: Solvant A Solvant B Eau déminéralisée 2500 mL Acétonitrile pour HPLC 2500 mL Acide trifluoroacétique 2 mL Acide trifluoroacétique 2.5 mL Gradient: Temps en min % solvant A % solvant B Débit en mUmin 0 70 30 18 10 70 30 18 80 0 100 18 120 0 100 18 Les chromatoçïraohies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d' épaisseur. Elles sont révélées soit aux UV ( 254nm ), à la ninhydrine, en vaporisant (spray léger) une solution éthanolique de ninhydrine (40 mg /100 ml EtOH) pour révéler les amines ou les amides en chauffant à 1509C, à la fluorescamine, en vaporisant une solution (40 mg / 100 ml Acétone) pour révéler les amines primaires ou à I' iode, en recouvrant la plaque de poudre d'iode. .Les chromatograshies sur colonne en phase directe ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,063-0,200 mm. d) Technique de synthèse en phase solide SPPS La synthèse en phase solide est réalisée dans un réacteur manuel de synthèse de peptides SPPS de fabrication artisanal et l'agitateur est un Flask Shaker modele A5-6021. L'evolution de couplage des polyamines à la phase solide ainsi que l'evolution de la protection des polyamines dans la SPPS est suivie par le test de Kaiser [Kaiser, E., Colescolt, D.L., Bossinger, C.D. and Cook, P.I. Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)]. La resine utilisee dans les exemples pour la SPPS est la Chlorotrityl chloride Resin de chez NOVABIOCHEM-Suisse. 2- MODE OPERATOIRE GENERAL 2.1- Synthese de RPR132335 Le RPR 120535 A (0.784 mmol) est dissout dans du Méthanol (25 ml) dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. A cette solution est ajoutée de la TEA (10.21 mmol). On coule lentement (5 min) sur le milieu une solution de O Methylisourea .H2S04 (1.173 mmol) dans de l'eau (9 mL). En fin de coulée un trouble apparaît. Le milieu est maintenu à 40"C durant 16 h puis on concentre à sec. Le produit est ensuite purifié par HPLC préparative. Les fractions intéressantes sont regroupées et lyophilisées. On obtient 0.157 mmol de produit salifié (R = 20.1%), HPLCanatyuê Rt = 14.94 min. Spectre de RMN 1H(400 MHz, (CD3)2SO d6, 6 en ppm) : 0,86 (t, J= 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; 1,24 (mt, 60H : (CH2)15 centraux des chaînes grasses) ; 1,43 et 1,53 (2 mts, 2H chacun 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; 1,63 (mt, 4H : (CH2)2 centraux du butyle) ; 1,81 et 1,96 (2 mts, 2H chacun : CH2 central des propyles) ; de 2,85 à 3,10 et 3,22 (2 mts, 16H en totalité: NCH2 du butyle - NCH2 des propyles et NCH2 des chaînes grasses) ; 3,81 (s large, 2H : NCH2CON) ; 4,03 (d, J = 4,5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,32 - 7,97 - 8,62 - 8,75 et 9,02 (respectivement mf - t - t - mf et mf: H correspondant aux protons échangeables). MH+= 863 2.2- Utilisation des composés de l'invention pour la transfection in vitro de matériel génétique Matériel génétique utilisé L'acide nucléique utilisé est le plasmide pXL2774 (WO97/1 0343) comportant le gène codant pour la luciférase sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain (CMV). Les solutions d'acide nucléique sont diluées à 20 Wug/ml dans du sérum physiologique (NaCI 0,15M). Solutions de transfection (préparation extemporanée) Les produits décrits dans l'invention sont mis en solution dans l'eau à concentration variant de 60 à 240M et mélangés volume à volume avec la solution d'ADN ; la concentration saline finale est de 75 mM. Transfection Les cellules sont cultivées dans les conditions appropriées en microplaques de 24 puits (2 cm2/puits) et sont transfectées alors qu'elles sont en phase exponentielle de croissance et à 50-70 % de la confluence. Les cellules sont lavées par 2 fois 500 lli de milieu dépourvu de protéines sériques et remises en croissance soit en milieu sans sérum [transfection en absence de sérum], soit en milieu complet [transfection en présence de sérum]. 50 p1 de mélange cytofectant [0,Sug ADN/puits] sont ajoutés aux cellules [3 puits/condition vecteur-DNA]. Quand les cellules sont transfectées en absence de sérum le milieu de croissance est supplémenté par la quantité appropriée de sérum 2 heures après la transfection. L'efficacité de transfection est évaluée à 48 heures post-transfection par une mesure de l'expression de la luciférase selon les recommandations données pour l'utilisation du kit Promega [Luciferase Assay System]. La toxicité des mélanges cytofectants est estimée par une mesure des concentrations protéiques dans les lysats cellulaires. Résultats Le produit RPR132335 a été utilisé comparativement au lipide cationique RPR120535 (sel de TFA) [demande PCT/FR96/01774] comme vecteur d'ADN pour transfecter trois lignées cellulaires différentes: cellules NIH3T3, cellules HepG2 et cellules HeLa. Pour ces trois types cellulaires nous n'avons pas mis en évidence une toxicité significative du produit RPR132335 décrit dans l'exemple 2.1. L'efficacité maximum de transfection (figure 2) est obtenue pour un ratio de 6 nanomoles lipide cationique /pg d'ADN pour les cellules NIH3T3 et pour un ratio de 9 nanomoles lipide cationique /pg d'ADN pour les cellules HeLa ou HepG2. Pour une transfection en absence de sérum, les niveaux d'expression obtenus dans les cellules HeLa ou HepG2 sont de 2 à 4 fois plus élevés pour le produit RPR132335 que pour le produit pris en référence. Un des avantages particuliers des produits de l'invention est mis en évidence dans des expériences de transfection en présence de protéines sériques (figure 3). En effet dans ce cas il n'y a aucune inhibition due à la présence des protéines sériques ce qui constitue une propriété particulièrement intéressante pour des transfections in-vivo. REVENDICATIONS 1. Composé, sous forme D, L ou DL, ainsi que ses sels, de formule générale (1): dans laquelle: - R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement -(CH2)q-NRR' avec q q pouvant varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6 ceci de manière indépendante entre les différents groupements R1, R2 et R3, R et R' représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule (II) dans laquelle q' peut varier entre 1, 2, 3, 4, 5 et 6, ceci de manière indépendante entre les différents groupements R et R', r est un nombre entier compris entre 0 et 6 inclus, et les groupements R5 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste hydrocarboné, étant entendu que l'un au moins des groupes R1, R2 et R3 comporte au moins un groupement de formule (Il); - m et n représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier pouvant varier entre 1 et 6 inclus avec lorsque n est supérieur à 1, m pouvant prendre des valeurs différentes et R3 des significations différentes au sein de la formule générale (I), - p représente un nombre entier pouvant varier entre 1 et 6 inclus; et, - R4 représente un groupement de formule générale (III) dans laquelle: R7 et R8 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement lipophile, I'un au moins des groupes R7 et R8 étant différent de l'hydrogène, t t est un nombre entier choisi entre 0 et 10 avec lorsque t est un entier supérieur à 1 R6, X, Y et s pouvant avoir des significations différentes au sein des différents motifs [X-(CHR6)s-Y] X X représente un atome d'oxygène, de soufre ou un groupement amine monoalkylé ou non, Y Y représente un groupement carbonyle ou un groupement méthylène R6 représente un atome d'hydrogène ou une chaine latérale d'acide aminé naturel , le cas échéant substituée et s représente un entier variant entre 1 et 10 avec lorsque s est égal à 1, R6 représentant une chaine latérale d'acide aminé naturel, le cas échéant substituée, et lorsque s est supérieur à 1, R6 représentant un atome d'hydrogène. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que, dans le groupement de formule (II), R5 est un atome d'hydrogène ou un reste hydrocarboné aliphatique ou aromatique, éventuellement halogéné. 3. Composé selon la revendication 2 caractérisé en ce que, dans la formule (I I), I'un des groupes R5 représente un atome d'hydrogène et l'autre un reste aliphatique en C1 à C10 ou un reste aromatique choisi de préférence parmi le benzyl et ses dérivés. 4. Composé selon la revendication 2 caractérisé en ce que, dans la formule (II), les deux groupes R5 représentent des atomes d'hydrogène. 5. Composé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans la formule (II), q' prend la valeur 2 ou 3 et r vaut 0. 6. Composé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans la formule générale (I), m est choisi parmi 2, 3 et 4. 7. Composé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans la formule (III), I'un au mois des groupes R7 et R8 représente un groupement lipophile composé d'une ou plusieurs chaines aliphatiques grasses, d'un dérivé de stéroïde, d'un lipide naturel ou synthétique, ou éventuellement d'une combinaison de ceux-ci. 8. Composé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le groupement lipophile est représenté par un radical aliphatique en C5 à C22, saturé ou non, linéaire ou ramifié, éventuellement fluoré ou halogéné, 9. Composé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le groupement lipophile est représenté par un stéroïde de type cholestérol, cholestanol ou acide cholique. 10. Composé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le groupement lipophile est représenté par un groupement (CH2)u-NH-R9 dans lequel u est un nombre entier compris entre 2 et 6 inclus et R9 est un radical acyl tel que par exemple un cholestéryl-formiate, arachidonyl ou acide cholique. 11. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les deux groupes R7 et R8 représentent des groupements lipophiles. 12. Composé selon la revendication 11 caractérisé en ce que les deux groupes R7 et R8 représentent une chaine aliphatique grasse en C5 à C22. 13. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R1 comporte un groupement de formule (II) et R2 et R3 sont des atomes d'hydrogène. 14. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R1 et R2 comportent un groupement de formule (II) et R3 est un atome d'hydrogène. 15. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R1 et R3 comportent un groupement de formule (II) et R2 est un atome d'hydrogène. 16. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R1, R2 et R3 comportent un groupement de formule (II). 17. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les composés de formule suivantes dans lesquelles R4 et R5 ont les significations données dans la revendication 1: 18. Le composé RPR132335 de formule: 19. Composition comprenant un composé selon l'une des revendications précédentes et un acide nucléique. 20. Composition selon la revendication 19 comprenant en outre un adjuvant. 21. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1-18 pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro. 22. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro comprenant les étapes suivantes: (1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé tel que défini dans les revendications 1-18 pour former un complexe entre ledit composé et ledit acide nucléique, et, (2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).