Brevet FR2768743A1 — publié le 19990326

La présente invention concerne un procédé de lyse de micro-organisme, permettant de manière générale de rompre un micro-organisme, notamment la membrane d'une ou plusieurs cellules, pour libérer au moins un composé biologique, par exemple un matériel nucléique à traiter ou analyser. On connait le procédé généralement utilisé pour lyser les cellules qui consiste essentiellement en ce que: - on dispose dans un contenant un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant le microorganisme à lyser, - on dispose dans ledit contenant au moins un matériau particulaire, relativement dur, et substantiellement inerte par rapport aux composés biologiques, - on soumet le mélange de l'échantillon biologique et du matériau particulaire à un mouvement de type vortex. Ce procédé utilisé présente certains inconvénients. On a remarqué que le procédé de lyse utilisé couramment n'est pas suffisamment efficace, notamment la lyse cellulaire s'avère insuffisante en quantité et qualité. De plus, le procédé employé ne permet pas toujours de lyser des cellules réputées résistantes à la lyse, notamment les cellules des bactéries à Gram+, par exemple celles de Mycobactéries. De même, la mise en oeuvre du procédé nécessite souvent l'ajout de réactifs supplémentaires tels que par exemple des enzymes et/ou des détergents. La présente invention a pour objet de remédier aux inconvénients cités ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de lyse complète, efficace et simple d'un échantillon biologique comprenant même très peu de micro-organismes, sans réactifs supplémentaires au cours de la mise en oeuvre du procédé. Par exemple, la présente invention a pour objet un procédé simplifié de lyse cellulaire pour libérer directement au moins un composé biologique, notamment les acides nucléiques. Les avantages du procédé de lyse de la présente invention sont en effet une efficacité quantitative et qualitative. La premier objet de la présente invention est donc un procédé de lyse de micro-organisme, pour libérer au moins un composé biologique comprenant une étape de lyse, selon laquelle: - on dispose dans un contenant un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant le microorganisme à lyser, - on dispose dans ledit contenant au moins un matériau particulaire, relativement dur, et substantiellement inerte par rapport aux composés biologiques, - on soumet le mélange de l'échantillon biologique et du matériau particulaire à un mouvement de type vortex, caractérisé en ce que: - le matériau particulaire a un diamètre compris entre 90 et 150 Hm, et - Ve = a.Vb, avec Vb = le volume apparent des billes Ve = le volume de l'échantillon liquide, et a est un nombre compris entre 1,4 et 10 lorsque le contenant est de forme tubulaire, et a est un nombre inférieur ou égal à 2,1 lorsque le contenant est de forme disque. Par le procédé selon l'invention, on obtient le composé biologique non détérioré. Par ailleurs, le procédé selon l'invention est suffisamment efficace pour permettre la lyse d'un seul micro-organisme, ce qui pour beaucoup de procédés d'analyse biologique, notamment pour les techniques d'amplification ou d'analyse par hybridation de sonde(s), revêt un intérêt particulier. S'agissant d'un composé biologique de type nucléique, la présente invention apporte l'avantage déterminant de libérer ledit composé de manière accessible à tout réactif le concernant, par exemple une ou des amorces d'amplification, une ou des sondes d'hybridation... Dans un premier mode de réalisation selon l'invention, le matériau particulaire est constitué de billes de diamètre environ 100 pm. Dans un second mode de réalisation selon l'invention, on a: Vb Vc = .Ve, avec Vb = le volume apparent des billes Ve = le volume de l'échantillon liquide, Vc = le volume utile du contenant, et Q est un nombre supérieur ou égal à 2,5. Les contenants que l'on peut utiliser selon l'invention peuvent être de formats différents, par exemple de forme tubulaire ou de forme disque. On préfère que le contenant soit de forme tubulaire, de préférence à fond en forme de U. Dans ce mode de réalisation préféré, Q est un nombre compris entre 2,5 et 30. Dans un troisième mode de réalisation selon l'invention, les contenants sont de forme disque et de forme tubulaire à fond en forme de U (comme par exemple de type Falcon) ou à fond tronconique (comme par exemple de type Eppendorf&commat;). Lorsque le contenant est sous forme disque, a est un nombre inférieur ou égal à 2,1, de préférence inférieur ou égal à 1,4 et Q est un nombre supérieur ou égal à 9,3. On préfère encore plus que le contenant soit un tube à fond tronconique tel qu'un tube Eppendorf, a étant compris entre 1,4 et 10, de préférence entre 1,4 et 3,3, et Q étant compris entre 2,5 et 30, de préférence entre 2,5 et 15, de préférence encore entre 3,75 et 15. On préfère encore plus que le contenant soit un tube à fond en U, tel qu'un tube Falcon, a étant compris entre 1,4 et 10, de préférence entre 1,4 et 3,3, de préférence encore est à 3,3, et Q étant compris entre 3 et 30, de préférence entre 12 et 30, de préférence encore égal à 20. Dans un quatrième mode de réalisation selon l'invention, le matériau particulaire comprend d'autres billes ayant un diamètre supérieur à celui desdites billes du contenant. On préfère que le contenant comprenne jusqu'à 10 autres billes. On préfère encore plus que ces autres billes aient un diamètre environ de 2 à 3 mm. Cette caractéristique complémentaire du procédé selon l'invention permet, pour une efficacité équivalente, en particulier de diminuer ou limiter le temps requis pour l'étape de lyse cellulaire. Cette caractéristique complémentaire permet aussi de rompre des échantillons biologiques complexes, tels que tissus vivants, avant de lyser proprement dit le matériau cellulaire. Dans un cinquième mode de réalisation selon l'invention, le temps de mise en mouvement de type vortex est au moins égal à 10 secondes, de préférence auau moins 20 secondes, avantageusement entre 1 et 5 minutes. Dans un mode de réalisation préférentiel, le temps de mise en mouvement de type vortex est environ de 2 minutes. Le temps de vortex est adapté de manière à obtenir un pourcentage de lyse au moins supérieur ou égale à 20%. On préfère encore, selon les spécificités du protocole de lyse utilisé, notamment lorsqu'on ajoute des billes de plus gros diamètre, que le temps de mise en mouvement de type vortex soit d'environ 2 minutes. Dans un sixième mode de réalisation selon l'invention, les cellules sont des bactéries. Un second objet de l'invention est l'utilisation du lysat obtenu par le procédé décrit ci-dessus, notamment pour une détection et/ou une quantification de molécules d'acides nucléiques ou une amplification, directe ou après purification des molécules d'ADN et/ou d'ARN. Ainsi, après amplification, on peut détecter au moins 1.102 cellules/ml. Toutefois, l'utilisation du procédé de l'invention n'est pas limité aux techniques précitées. Un troisième objet de l'invention est un contenant à usage unique, pour la mise en oeuvre d'un procédé décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend une charge d'un matériau particulaire adaptée, en fonction d'une quantité prédéterminée de l'échantillon biologique, à la mise en oeuvre directe du procédé décrit précédemment. Par "échantillon biologique", on entend tout échantillon, prélèvement ou fraction d'un matériel biologique, simple ou complexe, par exemple un tissu vivant ou un liquide ou fluide corporel. Cet échantilon biologique contient au moins un micro-organisme à lyser, avec ou sans traitement préalable de la structure comprenant ledit micro-organisme, par exemple destruction de l'organisation du tissu. Par "micro-organisme", on entend tout matériau biologique, comprenant naturellement une membrane ou enveloppe fermée, un ou plusieurs composés biologiques d'intérêt renfermé à l'intérieur de ladite membrane ou enveloppe, par exemple protéiques et/ou nucléiques. A titre d'exemple, on peut citer bien entendu les microorganismes procaryotes, tels que les bactéries et archaebactéries, les micro-organismes eucaryotes tels que les cellules végétales ou animales et les champignons, également différents tissus vivants, et par extension des particules virales. Par le terme " lyse ", on entend tout processus permettant de rompre la membrane ou l'enveloppe précitée pour libérer le ou les composés biologiques d'intérêt sous forme totale ou partielle. Par " composé biologique ", on entend tout constituant du micro-organisme, libéré de manière partielle ou totale par l'étape de lyse, comprenant un matériel biologique, notamment nucléique ou peptidique, d'intérêt, au sens où ce dernier est ensuite traité, notamment analysé ou détecté. Les figures et les exemples qui suivent permettent d'illuster l'objet de l'invention, mais ne limitent en rien la portée de celle-ci. La figure 1 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction du diamètre des billes (en abscisse) et de la composition du mélange (nature et proportion des billes). " SI " signifie " solution initiale " et représente le témoin qui n'a pas été lysé. A : Billes de verre de 1 à 50 pm B : Billes de verre de 50 à 100 pm C : Billes de verre de 90 à 150 pm D : Billes de verre 100 pm E : Billes de zirconium 100 pm F : Billes de zirconium 500 pm G : Mélange 50/50 de billes de zirconium de 100 et 500 Hm. La figure 2 illustre la quantité d'acides nucléiques de S.epidermidis détectée (en ordonnées) en fonction du diamètre des billes (en abscisse). " SI " signifie " solution initiale " et représente le témoin qui n'a pas été lysé. A : Billes de verre de 1 à 50 pm B : Billes de verre de 50 à 100 pm C : Billes de verre de 90 à 150 pm D : Billes de verre 100 pm E : Billes de zirconium 100 pm F : Billes de zirconium 500 pm G : Mélange 50/50 de billes de zirconium de 100 et 500 pm. La figure 3 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en tube Eppendorf en fonction du coefficient a (en abscisse). La figure 4 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en tube Falcon en fonction du coefficient a (en abscisse). La figure 5 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) dans un contenant en forme de disque en fonction du coefficient a (en abscisse). La figure 6 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en tube Eppendorf en fonction du coefficient Q (en abscisse). La figure 7 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en tube Falcon en fonction du coefficient Q (en abscisse). La figure 8 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) dans un contenant en forme de disque en fonction du coefficient Q (en abscisse). La figure 9 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction de la géométrie du contenant (en abscisse). A : tube Eppendorf à fond en forme de V, Vc = 1,5 ml B : cuvette de spectrophotométrie à fond plat, Vc = 5 ml C : tube à fond plat, Vc = 30 ml D : tube à fond plat, Vc = 60 ml E : bouteille de verre à fond plat, Vc = 8 ml F : bouteille de verre à fond plat, Vc = 25 ml G : tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 6 ml H: tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 14 ml I : tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 22 ml J : tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 6 ml K : tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 14 ml L : tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 22 ml M : tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 4 ml La figure 10 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction de différentes billes ajoutées (en abscisse). La figure 11 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction de combinaisons de différentes billes ajoutées (en abscisse). A : 10 billes inox de diamètre 2 mm B : 10 billes de verre de diamètre 3 mm C : 5 billes inox et 5 billes de verre de diamètres respectifs 2 et 3 mm D : 4 billes inox et 4 billes de verre de diamètres respectifs 2 et 3 mm E : 5 billes inox et 3 billes de verre de diamètres respectifs 2 et 3 mm F : 3 billes inox et 5 billes de verre de diamètres respectifs 2 et 3 mm La figure 12 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction du temps de mise en mouvement de type vortex (en abscisse) pour les protocoles I et II de l'exemple 5. La figure 13 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction du temps de mise en mouvement de type vortex (en abscisse) pour les protocoles II et III de l'exemple 5. Afin de déterminer l'efficacité du procédé de lyse selon l'invention, on a mis au point un protocole test général d'analyse du lysat obtenu en mesurant le pourcentage de lyse. Ce protocole général est décrit ci-après. Des bactéries à paroi Gram+ Staphylococcus epidermidis (bioMérieux référence API NO 8149310) cultivées en milieu liquide BCC (Bouillon Coeur Cervelle) sont centrifugées à 2500 tours/minute pendant 10 minutes à 25"C, avant d'être resuspendues indifféremment en milieu 9 BCC ou en tampon de lyse à la concentration 5.109 cellules /300 pl. La composition du tampon de lyse est la suivante: 30mM Tris-Hcl, 5mM EDTA, 100 mM NaCL, pH 7.2. 300 p1 de la suspens ion sont ajoutés dans un tube contenant préalablement un volume défini de billes de verre. Le tube fermé est vortexé pendant 2 minutes, à puissance maximale de l'appareil (Reax 2000, Heidolph). La suspension bactérienne ainsi traitée est conservée dans la glace avant analyse. Le pourcentage de lyse est déterminé immédiatement après recueil de l'échantillon, par mesure de la densité optique à 550 nm. Le pourcentage de lyse est égal au rapport de la valeur de DO à 550 nm de la solution bactérienne après vortex sur la valeur de DO à 550 nm avant vortex. La qualité des acides nucléiques libérés par l'étape de vortex est vérifiée sur gel d'agarose 0,8%. 10 pl du lysat sont déposés par puits, la migration est réalisée sous voltage constant (150V) et le gel est coloré au bromure d'éthidium (BET) avant observation sous rayonnement ultra-violet. La quantité d'acides nucléiques libérés par l'étape de vortex est déterminée par détection spécifique selon la technique d'hybridation dite sandwich en utilisant l'appareil Vidas commercialisé par bioMérieux (France). Des sondes oligonucleotidiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis (voir le brevet EP 0632269) ont été choisies. Les oligonucleotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence : 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ ID Nô:1) et 5'GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID Nô:2). La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatage alcaline (PA). L'hybridation spécifique de ces sondes avec les acides nucléiques libérés dans le lysat est fonction de la quantité d'acides nucléiques présents, mais aussi de leur accessibilité pour les sondes utilisées. Deux protocoles d'amplification spécifiques des molécules d'ADN et d'ARN de S. epidermidis ont été réalisés à partir des lysats recueillis pour vérifier si les acides nucléiques libérés par vortex peuvent être amplifiés : un protocole PCR pour l'amplification de 1'ADN et un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNrl6S. Protocole PCR : la technique de PCR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR stratégies, Ed : Innis, Gelford et Sninsky Académie press 1995, pp 17-31. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1: 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' SEQ ID NO:3 Amorce 2: 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' SEQ ID NO:4 Les cycles de température suivants ont été utilisés 1 fois 3 minutes 940C 2 minutes 65"C 35 fois 1 minute 720C 1 minute 94"C 2 minutes 65"C 1 fois 5 minutes 720C Protocole NASBA : la technique de NASBA suivie est celle décrite par Van der Vliet et al., J. Gen. Microbiol. 1993, 139 : 2423. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1: 5' -GGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGA-3' Amorce 2: 5' -TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA-3' 10 pl de lysat ou 5 pl de lysat sont utilisés pour chaque essai PCR et NASBA, respectivement. Les amplicons produits par PCR sont observés sur gel d'agarose 0.8% et quantifiés sur Vidas selon le protocole décrit ci-dessus. Les amplicons produits après NASBA sont détectés et quantifiés sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection spécifique de S. epidermidis, selon la méthode décrite par P. Cros et al., Lancet 1992, 240 : 870. La sonde de détection est couplée à la peroxidase de Raifort (HRP). Les deux sondes présentent les séquences suivantes Sonde de capture: 5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 7) Sonde de détection: 5'-GACATCCTCTGACCCCTC-3' (SEQ ID NO: 8) Exemple 1 : Influence du diamètre des billes et du coefficient a sur l'efficacité de la lyse par vortex a- Influence du diamètre des billes. Le protocole de lyse a été réalisé comme décrit ci-dessus à partir d'une suspension initiale de Staphylococcus epidennidis (5.1ou cellules/300 pl) en présence de 90 pl de différents mélanges de billes caractérisées par des diamètres différents, pendant 2 minutes par essai. Les diamètres testés sont compris entre 1 et 500 pm; les mélanges testés sont les suivants A : microbilles de verre de diamètre compris entre 1 et 500 pm, B : microbilles de verre de diamètre compris entre 50 et 100 pm, C : microbilles de verre de diamètre compris entre 90 et 150 pm, D : mélange homogène de billes de diamètre 100 pm, E : mélange homogène de billes de zirconium de diamètre 100 pm F : mélange homogène de billes de zirconium de diamètre 500 pm G : mélange (50/50 v/v) de billes de zirconium de diamètre 100 et 500 pm, Comme l'indique la figure 1, la lyse cellulaire obtenue est la plus efficace en présence de billes de diamètre compris entre 90 et 150 pm, et de préférence égal à 100 pm. Les mesures de densité optique à 550nm des échantillons recueillis après 2 minutes de vortex dans ces conditions indiquent que le pourcentage de lyse de S. epidermidis est compris entre 60 et 70% avec ce diamètre de billes. Seule des différences négligeables de pourcentage de lyse sont observées en fonction de la nature des billes (verre ou zirconium) de même diamètre. Par contre l'utilisation de billes de diamètre inférieur ou supérieur à 90 jusqu'à 150 pm, telles les mélanges de billes de diamètre 1 à 50 pm, 50 à 100 pm, 100 à 500 pm, ou le mélange homogène de billes de diamètre 500 pm entraine une diminution du pourcentage de lyse. L'analyse sur gel d'agarose 0,88 des acides nucléiques libérés dans les lysats, présentée dans la figure 2, montre que les molécules d'ADN et d'ARNr sont bien conservées puisque leur profil de migration sur gel d'agarose 0,8% est le même que celui des molécules d'ADN et ARNr bactériens purifiés et commercialisés. Les acides nucléiques relargués ont également le même profil de migration quel que soit le diamètre des billes utilisées pour la lyse cellulaire. Les acides nucléiques libérés sont également détectables par analyse Vidas dont le protocole est décrit ci-dessus. Toujours d'après la figure 2, la quantité d'acides nucléiques libérés dans les lysats mesurée par analyse Vidas reflète le pourcentage de lyse obtenu. En parallèle, il a été démontré que 1'ADN ou lARNr 16S de chaque lysat peut être amplifié par protocole PCR ou NASBA spécifiques de S. epidermidis, qui sont décrits dans la partie protocole test general ci-dessus. b- Influence du coefficient a - tube Eppendorf Le protocole de lyse a été réalisé en présence de billes de diamètre 100 pm, pendant 2 minutes. Des tubes Eppendorfs identiques ont été utilisés pour tous les essais. Le volume de la suspension bactérienne a été fixé à 300 pl /tube pour chaque essai, et le volume de billes a varié entre 1 et 300 pl/tube. Soit Vb, le volume apparent des billes et Ve, le volume de l'échantillon liquide tel que Vb La figure 3 indique que la lyse de S. epidermidis est efficace pour des valeurs du coefficient a comprises entre 1,4 et 10 : le pourcentage de lyse est compris entre 30 et 70%. Pour des valeurs de a 10, le volume de billes est faible et la probabilité de rencontre et de choc mécanique entre billes et cellules est réduite. De préférence la lyse cellulaire est plus efficace pour des valeurs de a comprises entre 1,4 et 3,3 : le pourcentage de lyse étant compris entre 40 et 70%. L'analyse sur gel d'agarose 0,8% du lysat montre que les profils de migration des acides nucléiques libérés ne sont pas modifiés, quelles que soient les valeurs de a. La quantité d'acides nucléiques mesurée par analyse Vidas est directement corrélée au pourcentage de lyse. - tube Falcon Une même étude a été réalisée en remplaçant les tubes Eppendorf par des tubes Falcon en polypropylène (Vc = 6ml). La figure 4 indique que la lyse de S. epidermidis est efficace pour des valeurs du coefficient a comprises entre 1,4 et 10 : le pourcentage de lyse est supérieur à 20%. De préférence, la lyse cellulaire est plus efficace pour des valeurs de a comprises entre 1,4 et 3,3 : le pourcentage de lyse est compris entre 65 et 85%. -forme disque On a utilisé une carte de dimensions 1 = L = 8,5cm et h = 0.4 cm. Un ou plusieurs trous, définis comme des puits, sont réalisés de hauteur constante et égale à la hauteur de la carte (soit 0.4 cm) et de diamètre constant. Ces puits sont recouverts d'un film de chaque côté, et chaque puits est rempli d'un mélange de billes de diàmètre 100 pm de volume apparent Vb, de 10 billes de fer de diamètre 2 mm et d'une suspension cellulaire de volume Ve. La carte ainsi définie est maintenue sur le vortex. Le protocole de lyse a été réalisé pendant deux minutes. Des cartes telles que décrites ci-dessus avec un diamètre de 30 cm (Vc = 2,8 ml/puits) ont été utilisées pour chaque essai. Le volume de la suspension bactérienne a été fixée à 700 p1 /puits et le volume de billes a varié de 90 à 510 pl/puits. Le coefficient a a varié de 1,4 à 7,8. Après l'étape de vortex, le pourcentage de lyse des échantillons recueillis a été analysé par mesure de densité optique à 550 nm, les acides nucléiques libérés ont été observés sur gel d'agarose et quantifiés par analyse Vidas. La figure 5 indique le pourcentage de lyse obtenu en fonction du coefficient a. La lyse de S.epidermidis est efficace avec un contenant format "carte" pour des valeurs du coefficient inférieures ou égales à 2,1 : lorsque a est compris entre 1,4 et 2,1, le pourcentage de lyse est compris entre 45% et 75%. De préférence, la valeur optimale du coefficient devrait être inférieure à 1,4 car même pour des valeurs de a s'approchant de 1,4, les valeurs de pourcentage de lyse n'arrivent pas à un plateau. L'analyse sur gel d'agarose 0,88 du lysat montre que les profils de migration nucléiques libérés ne sont pas modifiés quelles que soient les valeurs de a. La quantité d'acide nucléique mesurée par analyse Vidas est directement corrélée au pourcentage de lyse. Exemple 2 : influence du coefficient ss sur l'efficacité de la lyse par vortex - Tube Eppendorf Le protocole de lyse a été réalisé en présence d'un rapport constant entre le volume apparent de billes et le volume de l'échantillon liquide Sur la figure 6 est indiqué le pourcentage de lyse obtenu en fonction du coefficient ss. La lyse de S. epidermidis est plus efficace pour des valeurs du coefficient Q compris entre 2,5 et 15 : le pourcentage de lyse est supérieur à 30%. Pour des valeurs de ss inférieures à 2,5, les volumes de billes et d'échantillon liquide sont trop importants; ils limitent le mouvement des billes dans l'échantillon et le volume mort de l'échantillon augmente. Pour des valeurs de Q supérieures à 15, le volume de l'échantillon est trop faible pour permettre une récupération complète du volume initial de la suspension cellulaire pour a = 3,3. De préférence, l'efficacité de lyse cellulaire est meilleure pour des valeurs de Q comprises entre 3,75 et 15 : le pourcentage de lyse est compris entre 35 et 60%; de préférence pour des valeurs comprises entre 7,5 et 15 (40 à 60% de lyse). L'analyse sur gel d'agarose 0,8% des lysats montre que les profils de migration des acides nucléiques libérés sont les mêmes quelles que soient les valeurs de ss. Les quantités d'acides nucléiques mesurées par analyse Vidas sont directement corrélées aux pourcentages de lyse obtenus. - tube Falcon Une étude similaire a été réalisée en utilisant des tubes Falcon de polypropylène (Vc = 6ml) à la place des tubes Eppendorf. Une même valeur du coefficient a a été fixée 30, le volume de l'échantillon est trop faible pour permettre une récupération complète du volume initial de la suspension cellulaire, pour a = 3,3. De préférence, l'efficacité de la lyse cellulaire est meilleure pour des valeurs de Q comprises entre 12 et 30 le pourcentage de lyse est supérieur à 60%. -forme disque Le protocole de lyse a été réalisé avec le même contenant utilisé dans l'exemple 1 (diamètre des puits 30 mm, vc = 2,8 ml), avec une valeur de coefficient a Sur la figure 8 est indiqué le pourcentage de lyse obtenu en fonction du coefficient ss. La lyse de S.epidermidis est efficace en contenant " format carte pour des valeurs de Q A : tube Eppendorf en polypropylène à fond en forme de V, Vc = 1,5 ml B : cuvette de spectrométrie en polypropylène à fond plat, Vc = 5 ml C : tube à fond plat, Vc = 30 ml D : tube à fond plat, Vt = 60 ml E = bouteille de verre à fond plat, Vc = 8 ml F = bouteille de verre à fond plat, Vc = 25 ml G = tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 6 ml H = tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 14 ml I = tube en polystyrène à fond en forme de U, Vc = 22 ml J = tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 6 ml K = tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 14 ml L = tube en polypropylène à fond en forme de U, Vc = 22 ml M = tube en polypropylène à fond en forme de U, Vt = 4 ml La figure 9 indique le pourcentage de lyse obtenu en fonction de la géométrie du contenant utilisé. Le pourcentage de lyse est compris en moyenne entre 60 et 75% avec les tubes à fond plat ou à fond en forme de V, par contre il est compris en moyenne entre 70 et 80% avec les tubes à fond en forme de U pour un même temps de vortex et une même valeur de a. La mesure par analyse Vidas de la quantité d'acides nucléiques libérés confirme cette influence. Exemple 4 : influence de l'aiout de billes de plus aros diamètre sur l'efficacité de la lyse par vortex Le protocole de lyse a été réalisé en tube Eppendorf, en présence de 300 pl de suspension cellulaire et 90 pl de billes de diamètre 100 pm (soit a = 3,3 et Q = 5) pendant deux minutes. Différentes billes on été ajoutées au milieu en combinaison : billes de fer de diamètre 2 mm, billes de verre de diamètre 3 mm. La figure 10 présente le pourcentage de lyse de S.epidermidis en fonction des différentes combinaisons de billes ajoutées. L'addition de bille de fer ou de billes de verre entraine une augmentation du pourcentage de lyse. Ce pourcentage est sensiblement meilleur en présence de jusqu'à 10 billes/tube. la présence de ces 10 billes ne gêne pas le mouvement des billes de diamètre 100 pm; par contre au delà de cette valeur, le mouvement est gêné. Le pourcentage de lyse obtenu est plus élevé en présence d'un même nombre de billes de verre par essai que de billes de fer. D'après la figure 11, l'addition de combinaison de billes de fer et de verre permet d'obtenir un pourcentage de lyse aussi élevés qu'en présence de l'addition d'un mélange homogène de billes pour chaque combinaison testée; le pourcentage de lyse est supérieur à 80%. L'analyse sur gel d'agarose 0,8% des acides nucléiques libérés montre que les molécules d'ADN et d'ARNr ont le même profil de migration après lyse quelles que soient les combinaisons des billes utilisées. L'addition des billes de fer et de verre n'altère pas la structure du matériel nucléique libéré. De plus il a été vérifié que leur présence dans le lysat ne perturbe pas les réactions d'amplification PCR et NASBA. Exemple 5 : Influence du temps de vortex sur l'efficacité de la lyse par vortex Trois protocoles de lyse ont été réalisés en parallèle - Protocole I : tube Eppendorf Vc = 1,5 ml, 90 pl de bille de diamètre 100 pm et 300 pl de suspension cellulaire a = 3,3 et Q = 5) - Protocole II : protocole I avec addition de 3 billes de verre de diamètre 3 mm et 5 billes de fer de diamètre 2 mm - Protocole III : protocole II en tube Falcon (Vc = 6ml) à la place des Eppendorfs. Pour chaque protocole, différents temps de vortex ont été réalisés. La figure 12 présente le pourcentage de lyse obtenu en fonction du temps de vortex, pour les protocoles I et II. Les conditions expérimentales du protocole I ne sont pas optimales. On confirme qu'après 2 minutes de vortex, seulement 60% des bactéries S. epidermidis sont lysées. Par contre il est possible d'améliorer l'efficacité du protocole malgré ces conditions non optimales en augmentant le temps de vortex : dès 8 minutes de vortex, 85% des bactéries sont lysées. Les conditions expérimentales du protocole II sont plus optimales que celles du protocole I, dû à l'addition de billes de diamètre 3 mm : dans ces conditions, 85% des bactéries S. epidermidis sont lysées dès 4 minutes de vortex. La figure 13 présente le pourcentage de lyse obtenu en fonction du temps de vortex pour les protocoles II et III. Les conditions expérimentales du protocole III sont plus optimales que celles du protocole II : 88% des bactéries S. epidermidis sont lysées après seulement 2 minutes de vortex alors que seulement 80% ou 60% des bactéries après 2 minutes avec le protocole II ou I, respectivement. La mesure par analyse Vidas des acides nucléiques libérés confirme ces principales observations. Ainsi, augmenter le temps de vortex permet d'obtenir un pourcentage de lyse élevé lorsque les conditions expérimentales initiales ne sont pas optimales .Parallèlement, lorsque ces conditions sont optimales, le temps de vortex peut être court (2 minutes). Exemple 6 : Universalité du protocole de lvse selon l'invention Le procédé de lyse selon l'invention peut être appliqué à d'autres espèces cellulaires. Pour cela, le protocole a été réalisé en tube Eppendorf en présence de 300 pl de suspension cellulaire de concentration 1.109 cellules /ml, de 90 pl de billes de diamètre 100 pm avec un temps de vortex égal à 8 minutes. Différentes cellules ont été respectivement utilisées (Mycobacterium gordonae, Escherichia col i, Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus stearothennophilus, Micrococcus sp., Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Stomatococcus mucilaginosus, Nocardia asteroides, Rhodococcus sp.). Les résultats obtenus indiquent que le pourcentage de lyse pour chacun des cas analysés est compris entre 80 et 90%. Les profils de migration sur gel d'agarose 0,8% des acides nucléiques libérés dans chaque lysat sont similaires pour chaque souche bactérienne testée, et sont similaires à celui d'ADN et ARNR 16S d'E. coli purifiés et commercialisés. Exemple 7 : Sensibilité du protocole de lyse selon 1 'invention Les acides nucléiques ADN et ARNr 16S libérés par lyse selon le procédé de l'invention ont été soumis à une amplification. Les conditions de lyse sont les mêmes que celles indiquées dans l'exemple 6. La souche bactérienne utilisée est S. epidermidis. Deux protocoles d'amplification spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis ont été réalisés à partir des lysats recueillis, soit un protocole PCR pour l'amplification de 1'ADN, soit une protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr 16S, comme décrits ci-dessus dans le protocole test général. Amplification PCR de 1'ADN libéré Des concentrations initiales de 1. 109 à 1. 102 cellules /ml ont été utilisées. 10 pl de lysat ont été utilisés pour chaque essai PCR. Les amplicons produits ont été détectés et quantifiés après hybridation sandwich spécifique sur Vidas, comme décrit dans le protocole test général. Les amplicons produits sont mesurables pour des concentrations bactériennes initiales au moins supérieures ou égales à 1.102 cellules /ml, soit 30 cellules /300 ul. Ainsi le protocole de lyse optimisé par vortex est efficace pour lyser au moins 30 cellules /300 pl et pour libérer des molécules d'ADN amplifiables par PCR de sorte que la quantité d'amplicons produits soit détectables. 2)- Amplification NASBA de l'ARNr 16S Des concentrations initiales de 2.109 à 2.102 cellules /ml ont été utilisées. 5 pl de lysat ont été utilisés pour chaque essai NASBA. Les amplicons produits ont été détectés et quantifiés sur microplaque par hybridation sandwich avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques de S. epidermidis, comme décrit dans le protocole test général. Les amplicons produits ont pû être détectés et mesurés pour des concentrations bactériennes 2 initiales au moins supérieures ou égales à 2.102 cellules /ml, soit 60 cellules /300 ul. La quantité d'amplicons mesurée est importante pour cette concentration initiale, ce qui indique que probablement des amplicons produits après lyse de bactéries de concentration initiale inférieure à 60 cellules /300 pl seraient détectables et mesurables. REVENDICATIONS 1. Procédé de lyse de micro-organisme, pour libérer au moins un composé biologique comprenant une étape de lyse, selon laquelle: - on dispose dans un contenant un échantillon biologique en milieu liquide, comprenant le microorganisme à lyser, - on dispose dans ledit contenant au moins un matériau particulaire, relativement dur, et substantiellement inerte par rapport aux composés biologiques, - on soumet le mélange de l'échantillon biologique et du matériau particulaire à un mouvement de type vortex, caractérisé en ce que: - le matériau particulaire comprend des billes ayant un diamètre compris entre 90 et 150 pm, et - Ve = a.Vb, avec Vb = le volume apparent des billes, Ve = le volume de l'échantillon liquide, et a est un nombre compris entre 1,4 et 10 lorsque le contenant est de forme tubulaire, et a est un nombre inférieur ou égal à 2,1 lorsque le contenant est de forme disque. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau particulaire est constitué de billes de diamètre environ 100 pm. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que Vb Vc = Q.Ve, et Q est un nombre supérieur ou égal à 2,5, avec Vb = le volume apparent des billes, Ve = le volume de l'échantillon liquide, Vc = le volume utile du contenant. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le contenant est de forme tubulaire, de préférence à fond en forme de U. 5. Procédé selon les revendications 1 et 4, caractérisé en ce que ss est un nombre compris entre 2,5 et 30. 6. Procédé selon les revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le contenant est un tube à fond tronconique, et a est un nombre compris entre 1,4 et 3,3, et Q est un nombre compris entre 2,5 et 15, de préférence entre 3,75 et 15. 7. Procédé selon les revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le contenant est un tube à fond en forme de U, et a est un nombre compris entre 1,4 et 3,3, de préférence est égal à 3,3, et ss est un nombre compris entre 3 et 30, de préférence entre 12 et 30, de préférence encore égal à 20. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le contenant est sous forme disque. 9. Procédé selon les revendications 1 et 8, caractérisé en ce que a est un nombre inférieur ou égal à 1,4 et Q est un nombre supérieur ou égal à 9,3. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau particulaire comprend d'autres billes ayant un diamètre supérieur à celui desdites billes du contenant. 11. Procédé selon les revendications 1 et 10, caractérisé en ce que le contenant comprend jusqu'à 10 autres billes. 12. Procédé selon les revendications 1 et 10, caractérisé en ce que les autres billes ont un diamètre environ de 2 à 3 mm. 13. Procédé selon le revendication 1 caractérisé en ce que le temps de mise en mouvement de type vortex est au moins égal à 10 secondes, de préférence au moins égal à 20 secondes, avantageusement entre 1 et 5 minutes. 14. Procédé selon les revendications 1 et 13 caractérisé en ce que le temps de mise en mouvement de type vortex est d'environ 2 minutes. 15. Procédé selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que les micro-organismes sont des bactéries. 16. Utilisation du lysat obtenu par le procédé selon les revendication 1 à 15 pour l'amplification de molécules d'ADN et/ou d'ARN. 17. Utilisation du lysat obtenu par le procédé selon la revendications 16 pour la détection et/ou la quantification de molécule d'ADN et/ou d'ARN. 18. Contenant à usage unique, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend une charge d'un matériau particulaire adaptée, en fonction d'une quantité prédéterminée de l'échantillon biologique, à la mise en oeuvre directe du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.