Brevet FR2760023A1 — publié le 19980828

La présente invention est relative à des cellules eucaryotes exprimant à leur surface au moins une isoforme d'HLA-G et à leurs applications, notamment pour l'obtention d'un médicament, destiné à moduler l'activité cytolytique des cellules NK dans les pathologies où ces cellules NK sont activées ou inhibées et comme modèle d'étude, notamment dans une méthode de criblage de substances antitumorales. La présente invention est également relative à des animaux transgé- niques exprimant de maniére spécifique au moins une isoforme d'HLA-G. Les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), se divisent en plusieurs classes, les antigènes de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) qui présentent 3 domaines globulaires (al a2 et a3), et dont le domaine a3 est associé à la 2 microglobuline, les antigènes de classe II (HLA-DP, HLA-DQ et HLA-DR) et les antigènes de classe III (complément). Les antigènes de classe I comprennent, outre les antigènes précités, d'autres antigènes, dits antigènes de classe I non classiques, et notamment les antigènes HLA-E, HLA-F et HLA-G; ce dernier, en particulier, est exprimé par les trophoblastes extravilleux du placenta humain normal. La séquence du gène HLA-G (gène HLA-o.O) a été décrite par GERAGHTY et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987 84, 9145-9149): il comprend 4396 paires de bases et présente une organisation intron/exon homologue à celle des gênes HLA-A, -B et -C. De manière plus précise, ce gène comprend 8 exons, 7 introns et une extrémité non traduite 3', les 8 exons correspondent respectivement à: exon 1 séquence signal, exon 2 : domaine extracellulaire &alpha;l, exon 3 domaine extracellulaire a2 exon 4: domaine extracellulaire a3, exon 5 région transmembranaire, exon 6. domaine cytoplasmique I, exon 7 domaine cytoplasmique Il (non traduit), exon 8 domaine cytoplasmique III (non traduit) et région 3' non traduite (GERAGHTY et al., précité; ELLIS et al., J. Immunol., 1990 144, 731-735, KIRSZENBAUM M. et al., Otzcogesly Ces antigènes HLA-G sont essentiellement exprimés par les cellules cytotrophoblastiques du placenta et sont considérés comme jouant un rôle dans la protection du foetus (absence de rejet par la mère). En outre, dans la mesure ou l'antigène HLA-G est monomorphique, il peut également être impliqué dans la croissance ou la fonction des cellules placentaires (KOVATS et al., Science 1990, 248, 220-223). D'autres recherches concernant cet antigène non classique de classe I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951) ont montré que le transcrit primaire du gène HLA-G peut être épissé de plusieurs manières et produit au moins 3 ARNm matures distincts : le transcrit primaire d'HLA-G fournit une copie complète (Gl) de 1 200 bp, un fragment de 900 bp (G2) et un fragment de 600 bp (G3). Le transcrit G1 ne comprend pas l'exon 7 et correspond à la séquence décrite par ELLIS et al. (précité), c'est-à-dire qu'il code une protéine qui comprend une séquence leader, trois domaines externes, une région transmembranaire et une séquence cytoplasmique. L'ARNm G2 ne comprend pas lexon 3, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle les domaines al et a3 sont directement joints , ltARNm G3 ne contient ni l'exon 3, ni l'exon 4, c'est-à-dire qu'il code une protéine dans laquelle le domaine al et la séquence transmembranaire sont directement joints. L'épissage qui prévaut pour l'obtention de l'antigène HLA-G2 entraîne la jonction d'une adénine (A) (provenant du domaine codant al) avec une séquence AC (issue du domaine codant a3), ce qui entraîne la création d'un codon AAC (asparagine) à la place du codon GAC (acide aspartique), rencontré au début de la séquence codant le domaine a3 dans HLA-GI. L'épissage généré pour l'obtention de HLA-G3 n'entraîne pas la formation d'un nouveau codon dans la zone d'épissage. Les Auteurs de cet article ont également analysés les différentes protéines exprimées . les 3 ARNm sont traduits en protéine dans la lignée cellulaire .221-G. Les Auteurs de cet article concluent à un rôle fondamental de l'FILA-G dans la protection du foetus vis-à-vis d'une réponse immune maternelle (induction d'une tolérance immune). Toutefois, il est précisé que le rôle de la protéine G3, qui ne contient pas le domaine a3 n'est pas établi. Certains des Inventeurs ont récemment montré l'existence d'autres formes épissées d'ARNm d'HLA-G le transcrit HLA-G4, qui n'inclut pas l'exon 4 , le transcrit HLA-GS, qui inclut l'intron 4, entre les exons 4 et 5, provoquant ainsi une modification du cadre de lecture, lors de la traduction de ce transcrit et en particulier l'apparition d'un codon stop, après l'acide aminé 21 de l'intron 4 , et le transcrit HLA G6, possédant l'intron 4, mais ayant perdu l'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213, Demande Européenne EP 0 677 582 KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241, MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, 43, 231-236), ils ont également montré que ces différents transcrits sont exprimés dans plusieurs types de cellules humaines foetales et adultes, notamment dans les lymphocytes (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol., 1995, précité , MOREAU P. et al., Human Immunol. 1995, précité). Il existe donc au moins 5 ARNm HLA-G différents qui codent potentiellement 5 isoformes d'HLA-G. Bien que le foetus puisse être considéré comme une semiallogreffe, les cellules foetales survivent et ne sont pas rejetées, par la mère, il est apparu que les molécules FILA-G, exprimées à la surface des trophoblastes protègent les cellules foetal les de la lyse par les cellules natiiral killer (NK) maternelles (CAROSELLA E.D. et al., C.R. Acad. Sci., 318, 827-830, CAROSELLA E.D. et al, Immunol. Today, 1996, 407-409). Des études antérieures ont montré que l'expression des molécules HLA-G à la surface de cellules cibles permet de protéger lesdites cellules cibles de l'activité lytique des cellules NK de la couche déciduale de l'endomètre maternel (CHUMBLEY G. et al., Cell Immunol., 1994, 155, 312-322, DENIZ G. et al., J. Immunol., 1994 ,, 152, 4255-4261). Il est à noter que ces cellules cibles Sont, obtenues par transfection avec des vecteurs comprenant l'ADN génomique de HLA-G, génèrant potentiellement tous les transcrits alternatifs. Les cellules NK expriment des récepteurs des molécules du CMH de classe I (kill'r inhihitory receplors ou KIR ou NKIR pour récepteurs inhibiteurs NK), qui sont responsables de l'inhibition de la cytotoxicité, lorsque ces molécules HLA, agissant comme ligands, sont reconnues par ces récepteurs , par exemple, PAZMANY L. et al. (Science, 1996, 274, 792-795) ont montré que l'expression de HLA-G protégeait de la lyse les cellules cibles LCL 721.221 (lignée cellulaire de lymphome B), transfectées par le gène FILA-G. Ces cellules sont habituellement sensibles aux cellules NK , ils ont en outre identifié les récepteurs sur les cellules NK qui reconnaissent HLA G, à savoir les récepteurs NKIR I et NKIR2, appartenant à la superfamille des immunoglobulines (p58) capables de distinguer entre deux groupes dimorphiques de molécules HLA-C, HLA-G pourrait être le ligand naturel des récepteurs des cellules NK, certains des Inventeurs ont, en effet, montré que les cellules NK n'expriment aucun transcrit FILA-G, ce résultat confirmant que les produits d'expression du gène HLA-G jouent vraisemblablement un rôle dans l'immuno-tolérance (TEYSSIER M. et al., Nat. Immunol., 1995, 14, 262-270). Compte tenu du rôle important que peut jouer la molécule HLA-G aussi bien dans les pathologies où les cellules NK sont particulièrement actives (maladies autoimmunes, transplantations) ou sont au contraire inhibées (présence anormale de molécules FILA-G, notamment sur certaines tumeurs ou dans les infections virales), les Inventeurs, poursuivant leurs travaux ont trouvé, de manière surprenante, qu'il était possible d'exprimer à la surface cellulaire, une seule isoforme et de contrôler son expression quantitative et qualitative et donc d'en maîtriser son utilisation. La présente invention a pour objet des cellules eucaryotes obtenues par modification génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transfectées par un vecteur qui comprend un ADNc codant une isoforme d'HLA-G. Selon un mode de réalisation avantageux desdites cellules eucaryotes transfectées, ledit ADNc code une isoforme comportant au moins un domaine extracellulaire, notamment le domaine al. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites cellules, ledit vecteur d'expression est constitué successivement d'une origine de réplication, appropriée, d'un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, du promoteur viral RSV et d'un ADNc codant une isoforme d'HLA-G. De manière surprenante, les cellules NK voient leur activité cytolytique inhibée, en présence desdites cellules eucaryotes ainsi transfectées, et ce quelle que soit l'isofbrme membranaire exprimée à leur surface. En particulier, les isoformes membranaires HLA-G1 et llLA-G2 inhibent l'activité NK, jouant ainsi un rôle immunomodulateur. Lesdites cellules eucaryotes peuvent être issues de n'importe quel animal et notamment être des cellules de mammifères, plus particulièrement des cellules humaines. De telles cellules transfectées selon l'invention trouvent application - pour l'obtention d'un médicament destiné à inhiber l'activité des cellules tueuses, notamment des cellules NK, selon le type de cellules eucaryotes transfectées, on obtient un produit immunomodulant à action générale ou un produit immunomodulant à action spécifique, notamment adapté à la protection d'un organe greffé , on peut citer à titre d'exemples non limitatifs les cellules hépatiques, les cellules rénales ou les cellules souches hématopoiétiques transfectées - pour la production de cellules humaines aptes à être transplantées dans un organe spécifique et à protéger ce dernier de la lyse, induite par les cellules tueuses, notamment les cellules NK - comme modèle d'étude de l'interaction HLA-G/cellules immunocompétentes, notamment cellules tueuses, et plus particulièrement les cellules NK, pour trouver des effecteurs susceptibles de moduler la réponse antitumorale et d'inhiber l'expression HLA-G induite dans certains cancers, tout en conservant une expression des antigènes HLA classiques , ceci permet leur utilisation, pour l'obtention d'un médicament destiné à lever la fonction inhibitrice de la ou des isoforme(s) exprimée(s) par lesdites cellules vis-à-vis des cellules tueuses, notamment les cellules NK, dans les pathologies, telles que les cancers, où ces cellules NK sont inhibées par la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classes I EtA-G, - pour la production de mammifères non humains transgéniques exprimant une isoforme spécifique FILA-G, aptes à produire des tissus exprimant ladite isoforme (donneurs de xénogreffe) et/ou aptes à créer des modèles d'étude de la régulation et de la fonction des différentes isoformes HLA-G, liés à la tolérance, dans les maladies autoimmunes et au cours des greffes. Pour produire lesdits animaux transgéniques, notamment des souris transgéniques, on introduit au moins une copie d'un segment comprenant un ADNc codant une isoforme d'HLA-G, associée à un promoteur convenable, dans les cellules d'un embryon de souris à un stade précoce. La présente invention a également pour objet un récepteur purifié et isolé, caractérisé en ce qu'il est apte à lier au moins une isoforme d'HLA-G exprimée à la surface d'une cellule cible eucaryote telle que définie ci-dessus, en ce que ledit récepteur est exprimé à la surface de lignées cellulaires T qui n'expriment aucun récepteur inhibiteur KIR I, KIR2 ou CD94, ni au moins certains récepteurs membranaires spécifiques des cellules T, et en ce que la formation du complexe isoforme d'HLA-G/récepteur inhibe la lyse des cellules cibles, par lesdites lignées T. De manière avantageuse, lesdites lignées T n'expriment pas au moins les récepteurs CD3 et ass ou n'expriment aucun récepteur membranaire spécifique des cellules T. La lignée cellulaire leucémique T immature dénommée YT2C2 est une lignée de ce type car elle n'exprime aucun récepteur inhibiteur KIR1, KIR2 et CD94, ni les récepteurs spécifiques des cellules T, tels que les récepteurs CD3 et ot. Pour isoler ledit récepteur, il est possible a) soit d'incuber lesdites lignées T avec une isoforme d'HLA-G, notamment avec l'isoforme soluble HLA-GS, isoler le complexe HLA-G/récepteur formé par un traitement des lignées à la trypsine, dissocier le récepteur de la molécule FILA-G, par traitement par un agent dénaturant tel qu'un détergent, séparer le récepteur, soit en passant le mélange ainsi obtenu sur une colonne d'immunoaffinité couplée à un anticorps anti-HLA-G, et en récupérant le récepteur libre dans l'éluat, soit en soumettant ledit mélange à une électrophorèse convenable. b) soit de cloner ledit récepteur, conformément à la méthode décrite dans Colonna M. et al., Science, 1995, 268, 405-408. La présente invention a également pour objet un procédé d'étude de l'affinité de liaison d'une isoforme d'HLA-G pour un récepteur KIR ou un récepteur tel que défini ci-dessus (récepteur à activité NK), caractérisé en ce qu'il comprend - la transfection d'une cellule hôte eucaryote par un vecteur d'expression comprenant un ADNc codant une isoforme d'HLA-G, - la culture desdites cellules hôtes, de manière à ce qu'elles expriment à leur surface ladite isoforme d'HLA-G, - la mise en contact desdites cellules eucaryotes transfectées avec des cellules tueuses, telles que les cellules NK ou des lignées T telles que définies ci-dessus, en présence de substances activant ou inhibant l'HLA-G et/ou de substances activant ou inhibant le récepteur KIR ou le récepteur à activité NK selon l'invention et - la mesure de la quantité de complexe isoforme HLA-G/récepteur. Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 illustre la construction du fragment d'ADNc HLA-G2. Les flèches verticales indiquent les sites des enzymes de restriction spécifiques pour la génération de l'ADNc 1tA-G2, à partir de l'ADNc d'HLA-GI. Les flèches horizontales indiquent les amorces PCR (G.53, G.257, G.1225) et les lignes horizontales sans flèche indiquent les sondes spécifiques HLA-G utilisées pour l'hybridation (G.526 et G. 1200). - la figure 2 illustre la détection des transcrits HLA-G dans la lignée cellulaire parentale K562, les transfectants selon l'invention et la lignée cellulaire JEG3. Les ARN sont amplifiés en utilisant les amorces spécifiques HLA-G G.257 et G. 1225 , le Southern blot est obtenu par hybridation avec des sondes marquées au phosphore32 G.1200 ou G.526. Les pistes positives (+) et négatives (-) correspondent aux matrices RT et RT et le blanc est un contrôle réalisé en utilisant un mélange PCR sans matrice ADNc. Pour contrôler la quantité d' ARN dans chaque échantillon, les résultats de l'amplification PCR obtenus avec des amorces spécifiques de la p-actine et un Southern blot sont hybridés avec une sonde marquée au phosphore pi2 -actine. - la figure 3 illustre l'immunoprécipitation, le SDS-PAGE et l'analyse en Western blot des protéines de surface cellulaire marquées à la biotine. Des lysats membranaires biotinylés de cellules K562 (pistes I et 2), K562-pRc/RSV (pistes 3 et 4), K562-HLA-G1 (pistes 5 et 6), K562-HLA-G2 (pistes 7 et 8) et JEG-3 (pistes 9 et 10) sont immunoprécipités avec un anticorps monoclonal contrôle UPC- 10 (pistes 1, 3, 5, 7 et 9) ou un anticorps monoclonal W6/32 (pistes 2, 4, 6, 8 et 10) et analysés par SDS-PAGE à 10% dans des conditions de réduction. Les marqueurs de poids moléculaire sont indiqués sur la droite. - la figure 4 illustre l'expression des molécules HLA sur les transfectants de lignée cellulaire K562 détectées par cytofluorométrie. Les cellules sauvages K562, les cellules K562 transfectées soit avec le vecteur seul (K562 pRc/RSV), soit avec les vecteurs contenant l'ADNc codant HLA-G1 (K562-FILA-Gl) ou l'ADNc codant HLA-G2 (K562-HLA-G2) et les cellules JEG-3 sont marquées par immunofluorescence indirecte avec les anticorps monoclonaux primaires suivants (profils en gras) W6/32 anticorps monomorphique anti classe I (partie gauche de la Figure) et B1.G6 anticorps anti-ss2m humaine (partie droite de la Figure). Des contrôles sont réalisés sur les mêmes cellules marquées avec un anticorps contrôle (profils en blanc). Après lavage, les cellules sont marquées avec un anticorps F(ab)'2 d'immunoglobuline de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la phycoérythrine. Les résultats ont été répétés au moins cinq fois. - la figure 5 illustre l'effet de l'expression de molécules HLA-G1 et HLA-G2 sur l'activité lytique des cellules NK. Des cellules K562 transfectées soit avec le vecteur seul, soit avec le vecteur HLA-G1 ou le vecteur HLA-G2 sont utilisées comme cibles (T). Des cellules mononucléées de sang périphérique, fraîchement isolées des différents donneurs suivants: (A) donneur 4010 (HLA-A3, -B44, -B56 et -Cwl), (B) donneur 845 (HLA-A1, -A28, -B8, -BS 1, et -Cw7) et (C) donneur 813 (HLA-A2, -B27, -B51, et -Cwl) sont utilisées comme cellules effectrices (E). Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse, enregistré en 4 heures dans un test de libération du chrome 51 (5'Cr). La déviation standard de la moyenne de triplicats est en dessous de 5% et la libération spontanée n'excède jamais 10% de la libération maximale. - la figure 6 illustre l'effet de l'expression des molécules HLA-G1 et HLA-G2 sur la lyse induite par des cellules polyclonales NK. Les cellules K562 transfectées soit avec le vecteur seul, soit avec le vecteur HLA-G1, soit avec le vecteur HLA-G2 sont utilisées comme cibles (T) pour les cellules NK (dont plus de 95% ont le phénotype suivant CD3-, CD16+ et CD56+), isolées à partir du donneur dénommé 303 (HLA-A29, -B44, -B62 et -Cw3, -Cw5) dans un rapport E:T de 1:1, du donneur dénommé 395 (HLA-A2, -B13, -B44 et -Cw1) dans un rapport E:T de 1:1 et du donneur 481 (ILA-A3, -A26, -B27, -B35, et -Cw4, -Cw2) dans un rapport E:T de 5:1. Ces résultats sont exprimés comme pourcentage de lyse, enregistré pendant 4 heures dans un test de libération de 51Cr. La déviation standard de la moyenne de triplicats est en dessous de 5% et la libération spontanée n'excède jamais 10 /o de la libération maximale. - la figure 7 illustre l'effet d'un traitement à l'aide d'un anticorps monoclonal sur la résistance des cellules cibles transfectées par un vecteur HLA-GI ou HLA-G2 à la lyse induite par les cellules NK. La cytotoxicité est établie avec les cibles indiquées et (A) les cellules mononucléées du sang périphérique du donneur 382 (HLA-A11,-A29, -B44 et -Cw5), (B) les cellules mononucléées du sang périphérique du donneur 845 (HLA-A1, -A28, -B8, -B51, et -Cw7) et (C) le clone YT2C2, comme cellules effectrices (E). Les anticorps W6/32 ou contrôle de type IgG2a sont ajoutés à l'essai à une concentration de 10 pLg/ml. Les toxicités des anticorps monoclonaux sont vérifiées pour chaque test et sont toujours inférieures à 3% et - la figure 8 illustre l'effet de l'expression HLA-G1 et HLA-G2 sur la sensibilité de la cytotoxicité du clone YT2C2. Les cellules K562 transfectées soit avec le vecteur seul, soit avec le vecteur HLA-GI ou le vecteur HLA-G2 sont utilisées comme cellules cibles (T). Les résultats sont exprimés comme pour le pourcentage de lyse enregistré en 4 heures dans un test de libération du chrome 51. La déviation standard de la moyenne de triplicats est inférieure à 5% et la libération spontanée n'excède jamais 10% de la libération maximale. Cette expérience a été répétée au moins 5 fois et produit à chaque fois les mêmes résultats. L'expression des récepteurs NKIR sur le clone YT2C2 a été établie par cytofluorométrie. Les cellules YT2C2 sont marquées par immunofluorescence indirecte avec les anticorps monoclonaux primaires suivants EB6 (IgG1, anti-p58.1 ou NKIRI), GL183 (IgGi, anti-p58.2 ou NKIR2) et HP-3B I (IgG2a, anti-CD94). Les controles sont les mêmes cellules marquées avec un anticorps non pertinent. Après lavage, les cellules sont marquées à l'aide d'un conjugué F(ab)'2 d'anticorps de chèvre anti-lgG de souris/phycoérythrine. Seulement un des quatre essais est illustré sur cette Figure. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple: Production des lignées cellulaires contenant les transfectants HLA-G leur rôle dans la protection des cellules qui expriment ces molécules à leur surface contre la cytotoxicité des cellules NK. A/ MATÉRIELS ET MÉTHODES 1/ Lignées cellulaires La lignée cellulaire érythroleucémique humaine K562 (ATCC) et la lignée cellulaire leucémique T immature (clone YT2C2 à activité NK) sont maintenues dans un milieu RPMI 1640 complémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, inactivé par la chaleur, de la L-glutamine 2mM, de la gentamicine à I pg/ml et de la fungizone (Sigma, Saint-Quentin, France) et cultivées à 370C dans un incubateur, humidifié à atmosphère enrichie à 5% en CO2. Les transfectants K562 sont sélectionnés dans un milieu contenant de la généticine à 1 mg/ml (G4 18 sulfate, Sigma). La lignée cellulaire choriocarcinomateuse humaine HLA-G-positive dénommée JEG-3 (ATCC) est cultivée dans un milieu DMEM (Sigma) supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10%, inactivé à la chaleur, des antibiotiques et de la Lglutamine 2mM. Les lignées cellulaires ne contiennent pas de mycoplasmes. 2/ Les vecteurs HLA-G: Pour obtenir les transfectants HLA-GI et HLA-G2, les ADNc correspondant sont insérés dans un vecteur d'expression eucaryote dénommé pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA), contenant le virus du sarcome de Rous (RSV) comme promoteur et le gène de la néomycine comme marqueur de sélection. La stratégie générale pour la construction du vecteur est illustrée à la Figure 1. Brièvement, le fragment EcoRI de l'ADNc codant l'HLA-GI d'une longueur de 1,5-kb est coupé de manière franche en utilisant un fragment Klenow de l'ADN polymérase I et soudé avec le vecteur pRc/RSV digéré par l'enzyme Hind III et déphosphorylé par la phosphatase intestinale de veau (GIBCO-BRL, Life Technologies, Eragny, France). L'orientation correcte de cette construction, dénommée pRc/RSV-GI, est confirmée par digestion enzymatique et séquençage. Pour obtenir les plasmides recombinants contenant la séquence codant l'FILA-G2, le fragment EcoRI d'ADNc codant la molécule HLA-GI est inséré dans le site EcoRt du vecteur pGEX-4T-3 (Pharmacia Biotech., Orsay, France) Le fragment d'ADNc codant la molécule HLA-G2 est obtenu par amplification PCR, comme décrit dans KIRSZENBAUM M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213, en utilisant les amorces spécifiques des HLA-G G.53 et G.1225. Le fragment obtenu est ensuite digéré par les enzymes de restriction Ncoi/Bsmî et inséré dans le vecteur pGEX-HLA-GI, à partir duquel le fragment Ncol/BsmI contenant la région codant le domaine a2, a été préalablement retiré (pGEX-HLA-G2). Le plasmide d'expression du HLA-G2 dénommé pRc/RSV-G2 est obtenu après digestion EcoRI du vecteur pGEX-HLA-G2 , le fragment d'ADNc est coupé de manière franche et inséré dans le vecteur pRc/RSV digéré par l'enzyme de restriction HindIII et qui a été préalablement coupé de manière franche et déphosphorylé. 3/ Lignées cellulaires contenant les transfectants HLA-G Les vecteurs contenant la séquence pRc/RSV-G1 ou la séquence pRc/RSV-G2 ainsi que le vecteur pRc/RSV qui sert de contrôle sont transfectés dans les cellules K562 par électroporation (Bio-Rad Gene Pulsar à 250V, 960 pF). Après deux jours de culture, les cellules sont sélectionnées avec de la généticine à 1 mg/ml dans un milieu RPMI, contenant 10% de sérum de veau foetal. Les cellules contenant les transfectants sont contrôlées par analyse par cytométrie de flux, de manière à confirmer l'expression des molécules HLA de classe I. Pour obtenir un taux d'expression élevé de HLA-G dans les transfectants K562, les cellules sont isolées par tri cellulaire après immunomarquage (fluorescence-actived cell sor1iig ol, FACS, Vantage-Becton Dickinson, Pont de Claix, France), à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique des HLA de classe I. 4/ Analyses RT-PCR: L'ARNm total est extrait à partir de 107 cellules à l'aide du réactif RNA NOW (Biogentex, Inc.) conformément aux recommandations du fabricant. La qualité de l'ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% dénaturant. Les ADNc sont préparés à partir de 10 g d'ARN total traités avec de la DNAse I (Boerhinger Mannheim) en utilisant une amorce oligo-(dT)l2zg et la transcriptase inverse M-MLV (GIBCO-BRL). Les amplifications RT-PCR sont réalisées en utilisant deux amorces spécifiques des FILA-G, la G.257 (exon 2) et la G. 1225 (3'-UT), comme décrit dans KIRSZENBAUM M. et al. (1994) précité. Dans toutes les amplifications PCR, un mélange de réaction RT sans transcriptase inverse M-MLV (RT-) et un mélange PCR sans matrice d'ADNc (blanc), sont utilisés comme contrôles. Une amplification RT-PCR additionnelle de p-actine est réalisée pour pouvoir évaluer la quantité d'ARN dans tous les échantillons. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et colorés à l'aide de bromure d'éthidium. La spécificité des produits PCR est confirmée par blotting alcalin des fragments dans du NaOH 0,4 N sur des membranes de Nylon (Hybond N+, Amersham, France). L'hybridation est réalisée à l'aide des sondes G. 1200 et G.526 (spécifique de l'exon 3) comme décrit dans KIRSZENBAUM M. et al, 1994 précité. Les filtres sont exposés sur des films Kodak (Biomax) avec des écrans amplificateurs pendant 4 à extensif de la membrane, la réaction colorée est réalisée en utilisant le réactif de détection de Western blotting ECL (Amersham, France), après quoi la membrane est exposée à un film Kodak à température ambiante. 6/ Anticorps monoclonaux et analyses par cytométrie de flux Les anticorps suivants sont utilisés W6/39 IgG2a, anti-chaines a de HLA de classe I associées à la P3-m (Sigma) lBlG6 IgG2a, anti-ss2-m (Sigma) , Glu83 TgGI, anti-p58 (Immunotech, Marseille, France) , EB6 IgGI, anti-p58 (Immunotech) , HP-3B I IgG2a, anti-CD94 (Immunotech) ,UCHT-1 IgGl, anti-CD3 conjugué à du rouge quantum (Sigma) 3G8 IgGI, anti-CD16 conjuguée à de la fluorescéine (Immunotech) , et B 159 IgGl anti-CD56 conjuguée à de la phycoérythrine (Immunotech). Pour les essais de cytométrie de flux, les cellules sont lavées dans un tampon PBS et marquées avec l'anticorps monoclonal correspondant dans du PBS/Sérum Albumine Bovine 1% pendant 30 minutes à 4"C. Après deux lavages successifs dans un tampon PBS/Sérum Albumine Bovine 1%, les cellules sont soit directement analysées dans un cytomètre de flux (FACS Vantage, Becton Dickinson), si l'anticorps utilisé est conjugué à un fluorochrome, soit marquées avec un fragment F(ab')2 d'immunoglobuline de chèvre anti- IgG de souris conjugué avec de la phycoérythrine (Immunotech) avant l'analyse FACS. Des aliquots contrôles sont marqués avec un anticorps contrôle, pour pouvoir évaluer la liaison non spécifique aux cellules cibles. 7/ Cellules effectrices NK Les cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC) d'adultes sains volontaires (mâles et femelles âgés de 30 à 60 ans) sont obtenues par un gradient de densité Ficoll/histopaque. Les cellules NK sont isolées à partir des PBMC comme suit - Les cellules CD3 sont éliminées en utilisant des billes revêtues d'anticorps anti CD3 (Dynabeads Dynal, Norvège). Les billes ainsi revêtues sont mélangées avec les cellules mononucléées du sang périphérique dans un rapport 4:1 billes:cellules CD3 cibles. Après incubation à 4 C pendant 30 minutes, les cellules cibles ayant formé des complexes avec les billes sont éliminées par passage dans un champ magnétique approprié. - La fraction dépourvue de cellules CD3 est alors marquée avec un anticorps mono clonal anti-CD56 conjugué à de la phycoérhythrine, pour sélectionner les cellules CD56 par tri cellulaire à l'aide d'un cytomètre de flux (FACS). - Pour controler le phénotype des cellules triées (CD56-), un échantillon de cellules est immédiatement marqué avec soit des anticorps monoclonaux anti-CD 16 conjugués avec de l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC), soit avec un anticorps monoclonal anti-CD3 conjugué avec du rouge quantum, suivi par une analyse fluorescente. La population CD56 obtenue est viable ( > 95%) et présente un phénotype qui correspond aux cellules NK (plus de 90% des cellules NK sont CD3-, CD 16 CD56 ). 9/ Essais de cytotoxicité L'activité cytolytique des cellules mononucléées du sang périphérique, des cellules NK et des cellules YT2C2 (cellules effectrices ou E) à l'encontre des transfectants HLA-G (cellules cibles ou T) est estimée à l'aide de tests de libération pendant 4 heures du chrome 51, dans lesquels les cellules effectrices sont mélangées avec 5. 5.103 de cellules cibles marquées au chrome 51 (100 ptCi de 5'Cr-chromate de sodium, Amersham, UK), dans différents rapports E/T, dans des plaques de microtitration dont le fond est en forme de U. Après 4 heures à 37"C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2, 100 RI de surnageant sont prélevés pour un comptage par scintillation en phase liquide (Wallac 1450 Microbeta, Pharmacia, France). Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme suit pourcentage de lyse spécifique = [cpm dans le puits expérimental - cpm de libération spontanée)/(cpm de libération maximale - cpm de libération spontanée)j x 100. La libération spontanée est déterminée par incubation des cellules cibles (T) marquées avec le milieu. La libération maximale est déterminée par solubilisation des cellules cibles dans de l'HCl 0, I M. Dans toutes les expériences, la libération spontanée est inférieure à 10% par rapport à la libération maximale. Les résultats sont présentés comme des moyennes de trois échantillons. Dans les expériences dans lesquelles les anticorps monoclonaux sont utilisés pour bloquer l'interaction HLA-G NK, les cellules cibles sont incubées avec l'anticorps monoclonal correspondant, puis lavées et incubées avec un anticorps F(ab')2 de chèvre anti-souris (Jackson Immunoresearch, USA) pour éviter la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par interaction des récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines, exprimés sur les cellules NK avec le premier anticorps utilisé. Les toxicités des anticorps monoclonaux sont également vérifiées dans chaque essai et sont toujours infé- rieures à 3%. B/ RESULTATS: 1/ Production de transfectants stables exprimant la molécule HLA-G1 ou la molécule HLA-G2 L'analyse des séquences d'ADNc d'HLA-Gl et d'HLA-G2 transfectées démontre que l'ADNc d'HLA-G1 ne contient pas les deux codons GAC correspondant aux positions en acides aminés 247 et 248 (ELLIS et al., J. Immunol, 1990, 144, 731-735), mais seulement un seul codon GAC, correspondant à la position en acides aminés 247 (PAZMANY L. et al., Science, 1996, 274, 792-795). La séquence d'ADNc codant l'HLA-G2, obtenue par amplification RT-PCR à l'aide des sondes G.53 et G.1225, présente une jonction entre les exons 2 et 4, en raison de l'absence de l'exon 3 dans cette forme d'ARNm épissée. La caractérisation des transfectants est réalisée par une analyse en Southern blot des produits de la RT-PCR obtenus en utilisant les amorces G.257 et G. 1225 avec la lignée cellulaire parentale K562, les transfectants et les cellules JEG-3. Les résultats sont illustrés à la Figure 2. L'hybridation des produits de la RT-PCR obtenus, avec la sonde G. 1200, révèle une bande de 0,98 kb pour le transfectant K562 HLA-GI correspondant à l'ARNm d'HLA-GI et une bande de 0,71 kb correspondant à la forme épissée alternative, qui ne comprend pas I'exon 3 (KIRSZENBAUM M. et al., Hum. Immunol., 1995, 43, 237-241). Avec les cellules JEG-3, trois bandes sont observées à 0,98 kb (HLA-G1), 0,7 kb (HLA-G2 et HLA-G4) et 0,43 kb (HLA-G3) (MOREAU P. et al., Hum. Immunol., 1997, 52, 41-46). Par contraste, aucune bande HLA-G n'est détectée dans la lignée cellulaire parentale K562 ou dans la lignée transfectante contrôle K562-pRc/RSV. L'hybridation des memes produits de la RT-PCR avec la sonde spécifique de l'exon 3 G.526 révèle une seule bande dans les cellules transfectées HLA-GI tandis qu'aucune hybridation n'est observée dans les transfectants HLA-G2, en raison de l'absence de l'exon 3 dans la forme HLA-G2 (Figure 2). L'amplification RT-PCR du gène de la P-actine, constitutivement exprimée, démontre que l'absence de bandes HLA-G dans les contrôles K562 n'est pas due à l'absence d'ARN (Figure 2). 2/ Immunoprécipitation and analyse SDS-PAGE des protéines de surface marquées L'immunoprécipitation des protéines FILA avec l'anticorps monoclonal W6/32 est réalisée, afin d'établir si les transfections permettent d'obtenir une expression spécifique des protéines HLA-G à la surface. Comme illustré à la Figure 3, le Western blot correspondant révèle que l'anticorps monoclonal W6/32 immunoprécipite une molécule de 39-kDa dans les cellules K562 qui expriment la protéine HLA-G1 (piste 6) et dans les cellules JEG-3 (piste 10). Pour les transfectants HLA-G2, I'immunoprécipitation à l'aide de l'anticorps W6/32 montre une bande correspondant à la taille de la protéine G2. Aucune molécule du système HLA (molécule HLA classique de classe I, HLA-G1 ou HLA-G2) n'est trouvée ni dans les cellules parentales K562, ni dans les cellules contrôles K562 pRc-RSV. 3/ Analyse par cytométrie de flux des transfectants HLA-G: Pour déterminer le taux d'expression d'HLA-G à la surface des cellules, I'analyse des profils en cytométrie de flux des différentes cellules est réalisée les résultats sont illustrés à la Figure 4 et concernent les différents lignées étudiées : la lignée cellulaire parentale K562, la lignée contrôle comprenant le plasmide pRc/RSV, les transfectants HLA-GI et HLA-G2 ainsi que la lignée cellulaire JEG-3 choriocarcinomateuse positive pour l'expression du FILA-G. Les résultats observés montrent que la lignée cellulaire parentale K562 n'exprime aucun taux détectable de molécule de surface HLA de classe I (estimation à l'aide de l'anticorps pan FILA de classe I W6/32 et à l'aide de l'anticorps anti-ss2m Bit6) Aucune molécule HLA de classe I n'est détectée dans la lignée cellulaire K562 transfectée avec le vecteur vide pRc/RSV. Le transfectant HLA-GI est marqué par les anticorps W6/32 et B1G6 à peu près de la même manière que ce qui est obtenu avec les cellules JEG-3. Le transfectant HLA-G2 est également marqué par l'anticorps W6/32 ainsi que l'anticorps B1G6. Ce résultat montre que l'isoforme HLA-G2 liée à la membrane est bien présente à la surface des cellules, associée avec la ss2-microglobuline, de la même manière que les molécules HLA de classe I classiques. 4/ Résistance des transfectants HLA-G1 et HLA-G2 à la cytolyse par les cellules NK Les transfectants HLA-GI et HLA-G9 sont testés parallèlement à la lignée parentale correspondante pour leur sensibilité aux cellules NK. 20 expériences ont été effectuées, chacune enregistrée avec des cellules mononucléées de différents donneurs La Figure 5 montre que l'activité lytique des cellules NK, présentes dans les cellules mononucléées du sang péripherique isolé à partir de trois adultes donneurs sains, est inhibée aussi bien par les transfectants K562 HLA-GI que par les transfectants K562 HLA-G2, tandis que la lignée cellulaire contrôle K562 pRC/RSV reste sensible à l'activité lytique des cellules NK. Bien que le taux absolu de lyse varie d'un donneur à l'autre, comme illustré à la Figure 5 pour les donneurs désignés 4010, 845 et 813 qui présentent respectivement des taux de lyse élevés, moyens et bas, la sensibilité des cellules exprimant la molécule HLA-GI et la molécule HLA-G2 est réduite d'au moins 70%. Ces résultats sont confirmés lorsque l'on utilise des cellules polyclonales NK CD3-, CD16+, Cl56+, obtenues à partir de cellules mononucléées de sang périphérique de trois autres donneurs comme cellules effectrices (Figure 6). En outre, aucune différence n'est observée entre les donneurs mâles et femelles. Afin de montrer que l'inhibition de l'activité lytique des cellules NK est due effectivement à la présence des molécules HLA-GI et HLA-G2 à la surface des cellules cibles , des tests de cytotoxicité sont réalisés en présence de cellules cibles préincubées soit avec l'anticorps W6/32 qui reconnaît les molécules HLA-G1 et HLA G2, soit à l'aide d'un anticorps contrôle. L'addition d'anticorps monoclonal W6/32 lève l'inhibition de l'activité des cellules NK, due à la présence des molécules HLA-G1 et FILA-G2 et, par conséquent, restaure l'activité lytique des cellules NK sur les cellules cibles transfectées (Figures 7a et 7b). Dans la mesure où le mécanisme de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) pourrait être impliqué dans cette réaction par l'interaction avec les récepteurs au fragment Fc des cellules NK, le fragment Fc de l'anticorps W6/32 est bloqué par un fragment F(ab')2 d'anticorps de chèvre anti-IgG de souris. 5/ Tnhibition de la lyse induite par le clone YT2C2 à activité NK, par les transfectants HLA-G 1 et HLA-G2 Le clone N'T2C2 correspondant à des cellules T immatures leucémiques est utilisé comme efiecteur contre les transfectants FILA-G. La Figure 8 montre qu'aussi bien les transfectants FILA-GI que les transfectants HLA-G2 abolissent la lyse induite par le clone YT2C2, tandis que les lignées cellulaires contrôles ne le font pas. Cependant, contrairement à ce qui est observé avec les cellules mononucléées du sang périphérique, l'inhibition de la lyse induite par le clone N'T2C2 n'est pas levée par l'utilisation de cellules cibles transfectées traitées par l'anticorps monoclonal W6/32 (Figure 7c), suggérant que l'épitope reconnu par l'anticorps monoclonal sur la molécule HLA-G n'est pas impliqué dans la reconnaissance de la molécule HLA-G par le récepteur qui est présent sur les cellules YT2C2. Une analyse par immunofluorescence indirecte est réalisée, de manière à vérifier le phénotype des cellules YT2C2. Pour ce faire, les anticorps monoclonaux EB6 et GL183, qui reconnaissent respectivement les récepteurs NKIR1 et NKIR2, exprimés à la surface de sous-groupes de cellules NK, ainsi que l'anticorps HP-3B1, qui reconnaît le récepteur CD94 et qui est exprimé sur la plupart des cellules NK, ont été utilisés. Ces récepteurs sont impliqués dans la reconnaissance des molécules FILA-A, -B ou -C par les cellules NK (COLONNA et al., Science, 1995, 268; 405-408 et MORETTA et al., J. Exp. Med, 1994, 180, 545-555). La Figure 8 montre que les cellules YT2C2 présentent le phénotype négatif suivant EB6-, GL183- et HP3B1- Ces anticorps monoclonaux ont été préalablement testés par immunofluorescence indirecte et marquent positivement 3 à 10% des cellules mononucléées du sang périphérique des donneurs adultes sains. Ces différents résultats montrent que, en plus des récepteurs dénommés KIR 1 et NKIR2, qui ont été récemment décrits comme reconnaissant HLA-G (PAZMANY et al. (1996) précité), le clone YT2C2 exprime un nouveau récepteur capable de lier les molécules HLA-G et d'induirc une protection contre la lyse par les cellules YT2C2. L'ensemble des résultats montre que les antigène HLA-G jouent un rôle dans la protection des cellules qui expriment ces molécules à leur surface contre la cytotoxicité induite par les cellules NK. Contrairement aux travaux de l'art antérieur (CHUMBLEY et al., Cell Immunol., 1994, 155, 312-322 , DENIZ et al., J. Immunol., 1994, 152, 4255-4261 et PAZMANY L. et al. (1996) précité), dans lesquels il a été proposé de transfecter I'ADN génomique codant la molécule HLA-G dans une cellule cible, pour étudier ses effets sur l'activité lytique de clone NK, les Inventeurs ont trouvé qu'en évaluant séparément les isoformes IILA-G1 et HI,A-G2, dans des conditions physiologiques face à des cellules NK polyclonales obtenues à partir de donneurs sains adultes, il était possible de manière surprenante (i) d'exprimer les molécules HLA-G1 et Hl,A-G2, à la surface des cellules cibles ct (ii) de montrer que de telles cellules cibles ainsi modifiées étaient capables d'inhiber l'activité lytique desdites cellules NK. Le Tableau I ci-après démontre qu'aussi bien l'isoforme HLA-GI et que l'isoforme HLA-G2 liées à la membrane cellulaire inhibent fortement la lyse induite par les cellules NK. Tableau I transcrit mRNA expression membranaires d Résistance à la HLA de classe I lyse NK Lignée cellulaire HLA-G1 HLA-G2 W6/32 Non transfcctée K562 Iransfcctccs K562-pRc/RSV - - - KD62-HLA-G 1 t - + K562-HLA-G2 - + T + Cette inhibition est levée lorsque les cellules transfectées qui expriment la molécule HLA-G1 ou la molécule HLA-G2 sont incubées avec l'anticorps monoclonal pan-classe I, indiquant que l'inhibition de la lyse induite par les cellules NK est due à la présence des molécules HLA-G à la surface des cellules cibles transfectées K562 (Figure 7). Le fait que l'activité lytique NK soit inhibée chez tous les donneurs testés par les cellules cibles HLA-G positives, confirme que la molécule HLA-G pourrait être le ligand public du récepteur inhibiteur NK présent chez tous les individus (NKIR) et montre l'intérêt de l'obtention de cellules présentant un taux important et prédictible d'expression de molécules tfLA-G. De rnanière surprenante, il ressort de ces résultats que le domaine al commun à ces deux isoformes devrait être considéré comme jouant un role important dans la protection contre les cellules NK. Ceci peut être soutenu par le tuait que les séquences en amino acides des molécules HLA de classe i nécessaires pour l'interaction avec le récepteur KIR sont localisées dans le domaine al (COLONNA et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 7983-7985 et MANDELBOIM et al., J. Exp. Med., 1996, 184, 913-922). L'analyse séquentielle montre que le domaine al des molécules HLA-G présente des amino acides qui ont été antérieurement décrits comme induisant une résistance contre la cytolyse induite par les cellules NK dans les allèles protecteurs FILA-A, HLA-B et HLA-C (PAZMANY et al. précité). De manière surprenante, les Inventeurs ont trouvé maintenant que la molécule HLA-G partage des caractéristiques structurelles avec les allèles protecteurs HLA-A3, All, Aw68, Aw69, B7 et B27. En particulier, la position 74 dans le domaine al de l'HLA-G est occupé par un résidu Asp, associé avec l'induction d'une résistance aux cellules NK. En outre, les Inventeurs ont trouvé, également de manière surprenante, que les cellules T leucémiques YT2C2 n'induisaient plus de lyse en présence de transfectants exprimant la molécule HLA-GI ou la molécule HLA-G2, bien qu'aucun des récepteurs KIR capables de lier l'FILA-G (récepteur p58.1, récepteur p58.2 et CD94) ne soient présents sur les cellules YT2C2 (Figure 8). Ces résultats suggèrent qu'un nouveau récepteur distinct de ceux déjà décrits est impliqué dans la reconnaissance des molécules HLA-GI et HLA-G2. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite , elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. REVENDICATIONS 1") Cellules eucaryotes obtenues par modification génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transfectées par un vecteur qui comprend un ADNc codant une isoforme d'HLA-G. 2") Cellules eucaryotes selon la revendication 1, caractérisées en ce que ledit ADNc code une isoforme comportant au moins un domaine extracellulaire, notamment le domaine al. 3 ) Cellules eucaryotes selon la revendication I ou la revendication 2, caractérisées en ce que ledit vecteur d'expression est constitué successivement d'une origine de réplication, appropriée, d'un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, du promoteur viral RSV et d'un ADNc codant une isoforme d'HLA-G. 4 ) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'un médicament destiné à inhiber l'activité des cellules tueuses, notamment des cellules NK dans les pathologies ou les situations dans lesquelles lesdites cellules sont activées. 5 ) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'un médicament destiné à lever la fonction inhibitrice de la ou des isoforme(s) exprimée(s) par lesdites cellules vis-à-vis des cellules tueuses, notamment les cellules NK, dans les pathologies où ces cellules tueuses sont inhibées par la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classes I FILA-G. 6 ) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications i à 3 comme modèle d'étude de l'interaction HLA-G/cellules immunocompétentes, notamment les cellules tueuses. 7 ) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour l'obtention d'une composition destinée à la transplantation desdites cellules dans un organe cible. 8 ) Animaux transgéniques, notamment des souris transgéniques, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par l'insertion d'au moins une copie d'un segment comprenant un ADNc codant une isoforme d'HLA-G, associée à un promoteur convenable, dans les cellules d'un embryon de souris à un stade précoce. 9 ) Utilisation des animaux trangéniques exprimant la molécule HLA G à la surface de leurs cellules, pour la préparation d'organes aptes à être ,greffés. 10 ) Utilisation d'un vecteur qui comprend un ADNc codant une isoforme d'HLA-G tel que défini à la revendication 1, pour l'obtention d'animaux transgéniques. 11") Tissus ou organes de mammifères, caractérisés en ce qu'ils incluent des cellules eucaryotes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 120) Récepteur purifié et isolé, caractérisé en ce qu'il est apte à lier au moins une isoforme d'HLA-G exprimée à la surface d'une cellule cible eucaryote selon l'une quelconque des revendications I à 3, en ce que ledit récepteur est exprimé à la surface de lignées cellulaires T qui n'expriment aucun récepteur inhibiteur KIRI, KIR2 ou CD94, ni au moins certains récepteurs membranaires spécifiques des cellules T et en ce que la formation du complexe isoforme d'HLA-G/récepteur inhibe la lyse des cellules cibles par lesdites lignées. 13 ) Procédé d'étude de l'affinité de liaison d'une isoforme d'HLA-G pour un récepteur NK ou un récepteur à activité NK selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend - la transfection d'une cellule hôte eucaryote par un vecteur d'expression comprenant un ADNc codant une isoforme d'HLA-G, - la culture desdites cellules hôtes, de manière à ce qu'elles expriment à leur surface ladite isoforme d'HLA-G, - la mise en contact desdites cellules eucaryotes transfectées avec des cellules tueuses, telles que des cellules NK ou des lignées T qui n'expriment aucun récepteur inhibiteur KIR1, KLR2 ou CD94, ni au moins certains récepteurs membranaires spécifiques des cellules T, en présence de substances activant ou inhibant l'HLA-G et/ou de substances activant ou inhibant le récepteur NK ou le récepteur à activité NK et - la mesure de la quantité de complexe isoforme HLA-G/récepteur.