Brevet FR2765241A1 — publié le 19981231

La présente invention se rapporte à une amélioration très remarquable du transfert in vivo d'acides nucléiques dans les cellules d'organismes eucaryotes pluricellulaires ou d'acides nucléiques associés à des produits permettant d'augmenter le rendement de tels transferts en utilisant des champs éléctriques faibles compris entre I et 600 V/cm, et à la combinaison d'un acide nucléique et du procédé de transfert selon l'invention pour leur utilisation en thérapie génique. Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base de la thérapie génique. Cependant, I'un des problèmes est de parvenir à faire pénétrer une quantité d'acide nucléique suffisante dans des cellules de l'hôte à traiter, en effet, cet acide nucléique, en général un gène d'intérêt, doit être exprimé dans des cellules transfectées. L'une des approches retenue à cet égard a été l'intégration de l'acide nucléique dans des vecteurs viraux, en particulier dans des rétrovirus, des adénovirus ou des virus associés aux adénovirus. Ces systèmes mettent à profit les mécanismes de pénétration cellulaire développés par les virus, ainsi que leur protection contre la dégradation. Cependant, cette approche présente des inconvénients, et en particulier un risque de production de particules virales infectieuses susceptibles de dissémination dans l'organisme hôte, et, dans le cas des vecteurs rétroviraux, un risque de mutagénèse insertionnelle. De plus, la capacité d'insertion d'un gène thérapeutique ou vaccinal dans un génome viral demeure restreinte. En tout état de cause, le développement de vecteurs viraux utilisables en thérapie génique impose d'avoir recours à des techniques complexes de virus défectifs et de lignées cellulaires de complémentation. Une autre approche (Wolf et al. Science 247, 1465-68, 1990 , Davis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) a donc consisté à administrer dans le muscle ou dans la circulation un acide nucléique de nature plasmidique, associé ou non à des composés destinés à favonser sa transfection, comme des protéines, des liposomes, des lipides chargés ou des polymères cationiques tels que le polyéthylènimine, qui sont de bons agents de transfection in vitro (Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989, Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987 , Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995). En ce qui concerne le muscle, depuis la publication initale de J.A. Wolff et al. montrant la capacité du tissu musculaire à incorporer de I'ADN injecté sous forme de plasmide libre (Wolff et al. Science 247, 1465-1468, 1990) de nombreux auteurs ont tenté d'améliorer ce processus (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431 , Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Quelques tendances se dégagent de ces essais, comme notamment I'utilisation de solutions mécaniques pour forcer l'entrée de l'ADN dans les cellules, en adsorbant l'ADN sur des billes propulsées ensuite sur les tissus ( gene gun ) (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474485). Ces procédés se sont avérés efficaces dans des stratégies de vaccination, mais ne touchent que les couches superficielles des tissus. Dans le cas du muscle, leur utilisation nécessiterait un abord chirurgical pour permettre d'accéder au muscle, car les particules ne traversent pas les tissus cutanés, I'injection d'ADN, non plus sous forme de plasmide libre, mais associé à des molécules susceptibles de servir de véhicule facilitant l'entrée des complexes dans les cellules. Les lipides cationiques, utilisés dans de nombreux autres procédés de transfection, se sont avérés jusqu'à l'heure actuelle décevants, car ceux qui ont été testés se sont montrés inhibiteurs de la transfection (Schwartz et al., 1996, Gene Ther. 3, 405-411). Il en est de même pour les peptides et polymères cationiques (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431). Le seul cas d'association favorable semble être le mélange polyvinylalcool ou polyvinylpyrrolidone avec l'ADN. L'augmentation résultant de ces associations ne représente qu'un facteur inférieur à 10 par rapport à l'ADS injecté nu (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709), le prétraitement du tissu à injecter avec des solutions destinées à améliorer la diffusion et/ou la stabilité de l'ADN (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151 159), ou à favoriser l'entrée des acides nucléiques, par exemple l'induction de phénomènes de multiplication ou de régénération de cellules. Les traitements ont concerné en particulier l'utilisation d'anesthésiques locaux ou de cardiotoxine, de vasoconstricteurs, d'endotoxine ou d'autres molécules (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431, Danko et al., 1994, Gene Ther. 1, 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Ces protocoles de prétraitement sont difficiles à gérer, la bupivacaine en particulier nécessitant pour être efficace d'être injectée à des doses très proches des doses létales. La préinjection de sucrose hyperosmotique, destinée à améliorer la diffusion, n'augrnente pas le niveau de la transfection dans le muscle (Davis et al., 1993). D'autres tissus ont été transfectés in vivo soit en utilisant l'ADN plasmidique seul, soit en association avec des vecteurs synthétiques (revues de Cotten et Wagner (1994), Current Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao et Huang (1995), Gene Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). Les principaux tissus étudiés ont été le foie, l'épithélium respiratoire, la paroi des vaisseaux, le système nerveux central et les tumeurs. Dans tous ces tissus, les niveaux d'expression des transgènes se sont révélés trop faibles pour entrevoir une application thérapeutique (par exemple au niveau du foie, Chao et al. (1996) Human Gene Thérapy 7, 901), bien que certains resultats encourageants aient été récemment présentés pour le tranfert d'ADN plasmidique dans la paroi vasculaire (Iires et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 959 et 989). Dans le cerveau, I'efficacité de transfert est très faible, de même que dans les tumeurs (Schwartz et al. 1996, Gene Therapy 3,405; Lu et al. 1994,Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91,12669) L'électroporation, ou utilisation de champs électriques pour perméabiliser des cellules, est également utilisée in vitro pour favoriser la transfection d'ADN dans des cellules en culture. Toutefois, il était jusqu'à présent admis que ce phénomène répondait à un effet dépendant d'un seuil et que cette électroperméabilisation ne pouvait être observée que pour des champs électriques d'intensité relativement élevée, de l'ordre de 800 à 1 200 Volts/cm pour les cellules animales. Cette technique a également été proposée in vivo pour améliorer l'efficacité d'agents antitumoraux, comme la bléomycine, dans des tumeurs solides chez l'homme (brevet américain n" 5 468 228, L.M. Mir). Avec des impulsions de très courte durée (100 microsecondes), ces conditions électriques (800 à 1 200 Volts/cm) sont très bien adaptées au transfert intracellulaire de petites molécules. Ces conditions (impulsions de 100 microsecondes) ont été appliquées sans amélioration pour le transfert d'acides nucléiques in vivo dans le foie, ou des champs inférieurs à 1 000 Volts/cm se sont révélés totalement inefficaces, et même inhibiteurs par rapport à l'injection d'ADN en l'absence d'impulsions électriques (brevet WO 97/07826 et Heller et al. FEBS Letters, 389, 225-8, 1996). Cette technique présente d'ailleurs des difficultés d'application in vivo, car l'administration de champs d'une telle intensité peut provoquer des lésions tissulaires plus ou moins étendues, qui ne représentent pas un problème pour le traitement de patients cancéreux mais qui peuvent représenter un inconvénient majeur pour le sujet sain ou pour le sujet malade lorsque l'acide nucléique est administré dans des tissus autres que les tissus tumoraux. Alors que toutes les études citées mentionnent la nécessité de champs électriques élevés, de l'ordre de 1 000 Voltslcm, pour être efficace in vivo, de manière vraiment inattendue et remarquable, les demandeurs ont à présent montré que le transfert d'acides nucléiques dans des tissus in vivo pouvait être augmenté de façon très importante, sans effets indésirables, en soumettant le tissu à des impulsions électriques d'intensité faible, par exemple de 100 ou de 200 Volts/cm, et d'une durée relativement longue. De plus, les demandeurs ont constaté que la grande variabilité d'expression du transgène observée dans l'art antérieur de transfert d'ADN était notablement réduite par le procédé selon l'invention. C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de transfert d'acides nucléiques in vivo, dans lequel les cellules des tissus sont mises en contact avec l'acide nucléique à transférer, par administration directe dans le tissu ou par administration topique ou systémique, et dans lequel le transfert est assuré par application auxdits tissus d'une ou de plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre I et 600 Volts/cm. Selon un mode préféré le procédé selon l'invention s'applique à des tissus dont les cellules ont des géométries particulières comme par exemple des cellules de grande taille et/ ou de forme allongée et/ou répondant naturellement à des potentiels d'action éléctriques et/ ou ayant une morphologie spécifique. De préférence, l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 Volts/cm et la durée totale d'application est supérieure à 10 millisecondes. Le nombre d'impulsions utilisées est par exemple de 1 à 100 000 impulsions et la fréquence des impulsions est comprise entre 0,1 et 10 000 Hertz. Les impulsions peuvent être aussi délivrées de manière irrégulière et la fonction qui décrit l'intensité du champ en fonction du temps peut être variable. L'intégrale de la fonction décrivant la variation du champ électrique avec le temps est supérieure à 1 kVxmsec/cm. Selon un mode préféré de l'invention, cette intégrale est supérieure ou égale à 5 kVdnsec/cm. Selon un mode préféré de l'invention, I'intensité de champ des impulsions est comprise entre 30 et 300 Volts/cm. Les impulsions électriques sont choisies parmis les impulsions à ondes carrées, les champs électriques générant des ondes à décroissance exponentielle, des ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes. Selon un mode préféré de l'invention, les impulsions électriques sont des impulsions à ondes carrées. L'administration d'impulsions électriques peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple: . système d'électrodes externes placées de part et d'autre du tissu à traiter, notamment électrodes non invasives placées au contact de la peau, système d'électrodes implantées dans les tissus, système d'électrodes/injecteur permettant l'administration simultanée des acides nucléiques et du champ électrique. L'administration étant réalisée in vivo, il est parfois nécessaire d'avoir recours à des produits intermédiaires assurant la continuité électrique avec des électrodes externes non invasives. Il s'agira par exemple d'électrolyte sous forme de gel. Les acides nucléiques peuvent être administrés par tout moyen approprie, mais sont de préférence injectés in vivo directement dans les tissus ou administrés par une autre voie, locale ou systémique et notamment au moyen d'un cathéter, qui les rend disponibles à l'endroit d'application du champ électrique. Les acides nucléiques peuvent être administrés avec des agents permettant ou facilitant le transfert, comme cela a été mentionné précédemment. Notamment, ces acides nucléiques peuvent être libres en solution ou associés à des agents synthétiques, ou portés par des vecteurs viraux. Les agents synthétiques peuvent être des lipides ou des polymères connus de l'homme du métier, ou bien encore des éléments de ciblage permettant la fixation sur la membrane des tissus cibles. Parmi ces éléments, on peut citer des vecteurs portant des sucres, des peptides, des anticorps ou des récepteurs hormonaux. On conçoit, dans ces conditions de l'invention, que l'administration des acides nucléiques puisse précéder, être simultanée ou même suivre l'application des champs électriques. C'est pourquoi, la présente invention a également pour objet un acide nucléique et un champ électrique d'une intensité comprise entre I et 600 Volts/cm, comme produit de combinaison pour leur administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, aux cellules de mammifères et en particulier aux cellules humaines, in vivo. De préférence, l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 Volts/cm et, de manière encore plus préférée, I'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 Volts/cm. Le procédé selon la présente invention est utilisable dans la thérapie génique, c'est-à-dire la thérapie dans laquelle l'expression d'un gène transféré, mais également la modulation ou le blocage d'un gène, permet d'assurer le traitement d'une pathologie particulière. De préférence, les cellules des tissus sont traitées dans le but d'une thérapie génique permettant: soit la correction des dysfonctionnements des cellules elles-mêmes (par exemple pour le traitement des maladies liées à des déficiences génétiques comme par exemple la mucoviscidose), soit la sauvegarde et/ou la régénération de la vascularisation ou de l'innervation des tissus ou organes par des facteurs trophiques, neurotrophiques et angiogéniques produits par le transgène, soit la transformation du tissu en organe sécréteur de produits conduisant à un effet thérapeutique tels que le produit du gène lui-même (par exemple facteurs de régulation de thrombose et d'hémostase, facteurs trophiques, hormones) ou tels qu'un métabolite actif synthétisé dans le tissu grâce à l'adjonction du gène thérapeutique, soit une application vaccinale ou immunostimulante. Un autre objet de l'invention est l'association des impulsions électriques d'un champ à des compositions contenant les acides nucléiques formulées en vue de toute administration permettant d'accéder au tissu par voie topique, cutanée, orale, vaginale, parentérale, intranasale, intra-artérielle, intraveineuse, intramusculaire, souscutanée, intra-oculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour toute autre administration. Il peut s'agir en stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations et le volume des injections peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. Les acides nucléiques peuvent être d'origine synthétique ou biosynthétique, ou extraits de virus ou de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes provenant d'organismes unicellulaires (par exemple, levures) ou pluricellulaires. Ils peuvent être administrés en association de tout ou partie des composants de l'organisme d'origine et/ou du système de synthèse. L'acide nucléique peut être un acide désoxyribonucléique ou un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt et d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semisynthétiques d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par ciblage de banques, par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par ciblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement. En particulier, L'acide nucléique peut être un ADN ou un ARN sens ou antisens ou à propriété catalytique comme un ribozyme. Par antisens , on entend un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible. Par sens , on entend un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéique et impliqué dans l'expression d'un gène donné. Selon un mode de réalisation préféré, L'acide nucléique comporte un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Avantageusement, le fragment d'acide nucléique est sous forme d'un plasmide. Les acides désoxyribonucléiques peuvent être simple ou double brin, de même que des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. Ils peuvent porter des gènes thérapeutiques, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, ou des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique )) notamment tout gène codant pour un ARN ou pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, I'expression du transgène permet par exemple de pallier à une expression insuffisante dans la cellule ou à l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou permet encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi.coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule (traitement des déficits enzymatiques), ou permettre de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire par exemple pour le traitement des tumeurs. Il peut s'agir d'un gène suicide (Thymidine Kinase de l'Herpès) pour le traitement des cancers ou de la resténose. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes dont les enzymes de biosynthèse des vitamines, les dérivés sanguins, les hormones telles que l'hormone de croissance, les lymphokines : interleukines, interférons, TNFa, etc. (brevet français n" 92 03120), les facteurs de croissance, par exemple les facteurs angiogéniques tels que les VEGF ou FGF, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques, en particulier neurotrophiques pour le traitement des maladies neurodégénératives, des traumatismes ayant endommagé le système nerveux, ou des dégénerescences rétiniennes : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, ou les facteurs de croissance osseuse, les facteurs hématopoïétiques, etc., la dystrophine ou une minidystrophine (brevet français nO 9111947), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: facteurs VII, VIII, M, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les. gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidyl acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaison des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs aux LDL, les récepteurs des chylomicronsremnants et les récepteurs scavenger, etc. On peut, de plus, ajouter la leptine pour le traitement de l'obésité. On peut également ajouter les antioncogènescomme p53 ou d'autres supresseurs de tumeurs ou encore la protéine GAX limitant la prolifération des cellules dans le muscles lisses (traitement de la resténose). Parmi les autres protéines ou peptides pouvant être sécrétés par un tissu ou produit par ce tissu, il est important de souligner les anticorps, les fragments variables d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance pour son utilisation en immunothérapie, par exemple pour le traitement des maladies infectieuses, des tumeurs, des maladies autoimmunes telles que la sclérose en plaques (anticorps antiidiotype). D'autres protéines d'intérêt sont, de façon non limitative, des récepteurs solubles, comme par exemple le récepteur CD4 soluble ou le récepteur soluble du TU'FI pour la thérapie anti-HIV, le récepteur soluble de l'acétylcholine pour le traitement de la myasthénie; des peptides substrats ou inhibiteurs d'enzymes, ou bien des peptides agonistes ou antagonistes de récepteurs ou de protéines d'adhésion comme par exemple pour le traitement de l'asthme, de la thrombose et de la resténose; des protéines artificielles, chimériques ou tronquées. Parmi les hormones d'intérêt essentiel, on peut citer l'insuline dans le cas du diabète, l'hormone de croissance et la calcitonine. Les nombreux exemples qui précèdent et ceux qui suivent illustrent l'étendue potentielle du champ d'application de la présente invention. L'acide nucléique thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaire d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet européen n" 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (brevet européen n" 321 201). Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, I'invention permet donc la réalisation soit de vaccins, soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (brevet européen n" 185 573), du virus de la pseudo-rage, du syncitia forming virus , d'autres virus ou encore d'antigènes spécifiques de tumeurs comme les protéines MAGE (brevet européen nO 259 212). Préférentiellement, L'acide nucléique comprend également des séquences permettant et/ou favorisant l'expression dans le tissu du gène thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule transfectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire transfecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc. Il peut aussi s'agir d'un promoteur, inductible ou répressible. Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule. D'autres gènes présentant un intérêt ont été notamment décrits par McKusick, V.A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Eighth edition. John Hopkins University Press (1988)), et dans Stanbury, J.B. et al. (The metabolic basis ofinberited disease, Fith edition. McGraw-Hill (1983)). Les gènes d'intérêt recouvrent les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants de la cellule. On peut ainsi citer de manière non limitative les gènes associés aux maladies du métabolisme des carbohydrates comme par exemple fructose-l-phosphate aldolase, fructose- 1, 6-diphosphatase, glucose-6-phosphatase, a-1,4-glucosidase lysosomale, amylo-1 , 6-glucosidase, amylo-(1,4 :1,6)-transglucosidase, phosphorylase musculaire, phosphofructokinase musculaire, phosphorylase-b-kinase, galactose-lphosphate uridyl transférase, toutes les enzymes du complexe pyruvate déshydrogénase, pyruvate carboxylase, 2-oxoglutarate glyoxylase carboxylase, Dglycérate déhydrogénase. On peut également citer: - les gènes associés avec des maladies du métabolisme des amino-acides comme par exemple phénylalanine hydroxylase, dihydrobioptérine synthétase, tyrosine aminotransférase, tyrosinase, histidinase, fumarylacéto-acétase, glutathion synthétase, y-glutamylcystéine synthétase, ornithine4-aminotransférase, carbamoylphosphate synthétase, ornithine carbamoyltransférase, argininosuccinate synthétase, argininosuccinate Iyase, arginase, L-lysine déhydrogénase, L-lysine kétoglutarate réductase, valine transaminase, leucine isoleucine transaminase, décarboxylase des 2céto-acides à chaîne ramifiée, isovaléryl-CoA déhydrogénase, acyl-CoA déhydrogénase, 3 -hydroxy-3 -méthylglutaryl-C oA lyase, acétoacétyl-CoA 3kétothiolase, propionyl-CoA carboxylase, méthylmalonyl-CoA mutase, ATP :cobalamine adénosyltransférase, dihydrofolate réductase, méthylène tétrahydrofolate réductase, cystathionine B-synthétase, le complexe sarcosine déshydrogénase, les protéines appartenant au système de clivage de la glycine, ss- alanine transaminase, carnosinase sérique, homocarnosinase cérébrale. - Les gènes associés avec des maladies du métabolisme des graisses et des acides gras, comme par exemple lipoprotéine lipase, apolipoprotéine C-II, apolipoprotéine E, d'autres apolipoprotéines, lécithine cholestérolacyltransférase, récepteur des LDL, stérol hydroxylase du foie, acide phytanique a-hydroxylase. - Les gènes associés avec des déficiences lysosomales, comme par exemple a-Liduronidase lysosomale, iduronate sulfatase lysosomale, héparan N-sulfatase lysosomale, N-acétayl-a-D-glucosaminidase lysosomale, acétyl-CoA: a-glucosamine N-acétyltransférase lysosomale, N-acétyle-D-glucosamine 6-sulfatase lysosomale, galactosamine 6-sulfate sulfatase lysosomale, ss-galactosidase lysosomale, arylsulfatase B lysosomale, ss-glucuronidase lysosomale, N-acétylglucosaminyl-phosphotransférase, a-D-mannosidase lysosomale, a-neuraminidase lysosomale, asparrylglycosaminidase lysosomale, a-L-fùcosidase lysosomale, lipase acide L'avantage de l'utilisation de l'éléctrotransfert en thérapie génique réside dans la sécurité apportée par le traitement local lié à l'utilisation de champs électriques locaux et ciblés. De par la sécurité liée à l'utilisation de champs faibles, la présente invention pourrait s'appliquer au niveau du muscle cardiaque pour le traitement de cardiopathies, par exemple en utilisant un défibrilateur adapté. Elle pourrait s'appliquée aussi au traitement de la resténose par ltexpression de gènes inhibiteurs de la prolifération des cellules musculaires lisses comme la protéine GAX. La combinaison de champs peu intenses et de durées d'administration longues appliquée aux tissus in vivo améliore la transfection des acides nucléiques sans amener de détériorations notables des tissus. Ces résultats améliorent le rendement des transferts d'ADN dans le cadre de la thérapie génique mettant en oeuvre les acides nucléiques. En conséquence, le procédé selon l'invention permet, pour la première fois, d'envisager de produire par thérapie génique un agent à des doses physiologiques et/ou thérapeutiques, soit dans les tissus, soit sécrété dans leur voisinage ou dans la circulation sanguine ou lymphatique. De plus, le procédé selon l'invention permet, pour la première fois, la modulation fine et le contrôle de la quantité efficace de transgène exprimé par la possibilité de moduler le volume du tissu à transfecter, par exemple avec des sites multiples d'administration, ou encore la possibilité de moduler le nombre, la forme, la surface et la disposition des électrodes. Un élément de contrôle supplémentaire provient de la possibilité de moduler l'efficacité de la transfection par la variation de l'intensité de champ, du nombre de la durée et de la fréquence des impulsions, et évidemment suivant l'état de l'art, la quantité et le volume d'administration des acides nucléiques. On peut ainsi obtenir un niveau de transfection approprié au niveau de production ou de sécrétion désiré. Le procédé permet enfin un surcroît de sécurité par rapport aux méthodes chimiques ou virales de transfert de gènes in vivo, pour lesquelles l'atteinte d'organes autres que l'organe cible ne peut pas être totalement exclue et maîtrisée. En effet, le procédé selon l'invention permet le contrôle de la localisation des tissus transfectés (strictement liée au volume de tissu soumis aux impulsions électriques locales) et apporte donc la possibilité d'un retour à la situation initale par l'ablation totale ou partielle du tissu lorsque cela est rendu possible par le caractère non vital de ce tissu et par ses capacités de régénération comme dans le cas du foie ou du muscle. Cette grande souplesse d'utilisation permet d'optimiser le procédé suivant l'espèce animale (applications humaines et vétérinaires), I'âge du sujet, son état physiologique et/ou pathologique. Le procédé selon l'invention permet, en outre, pour la première fois, de transfecter des gènes de grande taille et/ou des introns et/ou des éléments régulateurs de petite ou de grande taille, contrairement aux méthodes virales qui sont limitées par la taille de la capside. Cette possibilité est essentielle pour le transfert de gènes de très grande taille comme celui de la dystrophine ou de gènes avec des introns et/ou des éléments régulateurs de grande taille, ce qui est nécessaire par exemple pour une production physiologiquement régulée d'hormones. Cette possibilité est essentielle pour le transfert d'épisomes ou de chromosomes artificiels de levure ou de minichromosomes. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer de manière non limitative l'invention. Dans ces exemples, on se réferera aux figures suivantes: . Figure 1: Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ élevé sur la transfection d'ADN plasmidique pxl 2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, . Figure 2 : Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ intermédiaire sur la transfection d'ADN plasmidique pxl 2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, Figure 3 : Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ faible et de différentes durées sur la transfection d'ADN plasmidique pxl 2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, Figure 4: Effets d'impulsions électriques d'intensité de champ faible et de différentes durées sur la transfection d'ADN plasmidique pxl 2774 dans le muscle tibial cranial chez la souris; valeurs moyennes + SEM, Figure 5 : Efficacité de l'électrotransfection de l'ADN plasmidique pxl 2774 dans le muscle tibial cranial de la souris aux intensités de champs électriques faibles: valeurs moyennes + SEM. EXEMPLE 1 Expérience effectuée dans les conditions de l'état de la technique antérieure dans laquelle les champs électriques se montrent inhibiteurs de la transfection Dans cet exemple, les produits suivants ont été utilisés: ADN pxl 2774 (brevet PCT/FR 96/01414) est un ADN plasmidique comportant le gène rapporteur de la luciférase. Les autres produits sont disponibles auprès de fournisseurs du commerce . Kétamine, Xylazine, Sérum physiologique (NaCl 0,9 %). Un oscilloscope et un générateur d'impulsions électriques (rectangulaires ou carrées) du commerce (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, France) ont été utilisés. Les électrodes utilisées sont des électrodes plates en acier inoxydable distantes de 5,3 mm. L'expérience est réalisée chez la souris C57 BV6. Les souris provenant de différentes cages sont réparties au hasard avant l'expérience ("randomisation"). Les souris sont anesthésiées par un mélange kétamine, xylazine. La solution de plasmide (30 ,ul d'une solution à 500 tg/ml de NaCI 0,9%) est injectée longitudinalement à travers la peau dans le muscle tibial cranial des pattes gauche et droite à l'aide d'une seringue hamilton. Les deux électrodes sont enduites d'un gel conducteur et la patte injectée est placée entre les électrodes au contact de celles-ci. Les impulsions électriques sont appliquées perpendiculairement à l'axe du muscle à l'aide d'un générateur d'impulsions carrées, une minute après l'injection. Un oscilloscope permet de contrôler l'intensité en Volts (les valeurs indiquées dans les exemples représentent les valeurs maximales), la durée en millisecondes et la fréquence en hertz des impulsions délivrées, qui est de 1 Hz. 8 impulsions consécutives sont délivrées. Pour l'évaluation de la transfection du muscle, les souris sont euthanasiées 7 jours après l'administration du plasmide. Les muscles tibial cranial des pattes gauche et droite sont alors prélevés, pesés, mis dans du tampon de lyse et broyés. La suspension obtenue est centrifugée afin d'obtenir un surnageant clair. La mesure de l'activité luciférase est réalisée sur 10 ul de surnageant à l'aide d'un luminométre du commerce dans lequel le substrat est ajouté automatiquement à la solution. L'intensité de la réaction lumineuse est donnée en RLU (Relative Luminescence Unit) pour un muscle connaissant le volume total de suspension. Chaque condition expérimentale est testée sur 10 points : 5 animaux injectés en bilatéral. Les comparaisons statistiques sont réalisées à l'aide de tests non paramétriques. Deux figures, dont l'échelle est linéaire ou logarithmique, illustrent les résultats. Dans cette première expérience on a testé les effets d'un champ électrique de 800 à 1200 Volts/cm qui permet l'électroporation de tumeurs (Mir et al. Eur. J. Cancer 27, 68, 1991). On constate, d'après la figure 1, que, relativement au groupe contrôle, ou l'ADN est injecté sans impulsion électrique: avec 8 impulsions de 1200 Volts/cm et d'une durée de 0,1 msec, la valeur moyenne de l'activité luciférase est beaucoup plus faible, avec des impulsions de 1200 Volts/cm et de 1 msec, 3 animaux sont morts, la valeur moyenne de l'activité luciférase est beaucoup plus faible, avec des impulsions de 800 Volts/cm et de 1 msec la valeur moyenne de l'activité luciférase est aussi significativement réduite. La plupart des muscles ayant subi l'action du champ électrique sont visiblement altérés (friables et d'aspect blanchâtre). EXEMPLE 2 Expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques à des champs électriques modérés Cette expérience est réalisée avec des souris C57 BV6. Mis à part l'intensité de champ électrique des impulsions et leur durée, les conditions de réalisation sont celles de l'exemple I. Les résultats sont montrés à la figure 2. On reproduit le résultat de l'exemple 1, c'est-à-dire l'effet inhibiteur d'une série de 8 impulsions à 800 Volts/cm d'une durée de 1 msec sur l'activité luciférase détectée dans le muscle. Avec un champ de 600 Volts/cm, on observe la même inhibition et la même altération du tissu musculaire. Par contre, de façon remarquable et surprenante, la diminution du voltage permet de ne plus altérer visiblement les muscles, et, de plus, à 400 et 200 Volts/cm le niveau de transfection des muscles est en moyenne supérieur à celui obtenu sur les muscles non soumis à un champ. II est à noter que, relativement au groupe témoin (non soumis à un champ électrique), la dispersion des valeurs de l'activité luciférase est diminuée à 200 Volts/cm (SEM = 20,59% de la valeur moyenne contre 43,32% en l'absence de champ électrique (figure 2A)). EXEMPLE 3 Expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques avec des impulsions de faible intensité de champ montrant une très forte stimulation de l'expression du transgène Cette expérience est réalisée avec des souris C57 BV6. Mis à part l'intensité de champ électrique des impulsions et leur durée, et le fait que les impulsions sont délivrées 25 secondes après l'injection de l'ADN, les conditions de réalisation sont celles des exemples précédents. Les résultats sont montrés à la figure 3. La valeur moyenne de l'expression du transgène luciférase est nettement augmentée avec une durée d'impulsion de 20 msec à 100 Volts/cm, et à partir d'une durée d'impulsion de 5 msec à 200 Volts/cm. Cette expérience montre aussi clairement que la valeur moyenne de l'activité luciférase obtenue par électrotransfection de l'ADN dans le muscle est une fonction de la durée des impulsions électriques, lorsqu'on emploie des voltages de 200 et 100 Volts/cm. On note aussi que la dispersion des valeurs est notablement réduite pour les groupes de muscles électrotransfectés (figure 3A). En l'absence d'impulsions électriques (contrôle), la SEM représente 77,43% de la valeur moyenne alors que la SEM relative de la moyenne est réduite à 14% (200 Volts/cm, 5 msec), 41,27% (200 Volts/cm, 20 msec) et entre 30% et 48% pour l'électrotransfert à 100 Volts/cm de champ électrique. Dans la meilleure condition de cette expérience, on améliore par un facteur de 89,7 I'expression du transgène par rapport au contrôle injecté en l'absence d'impulsions électriques. EXEMPLE 4 Expérience d'électrotransfert d'acides nucléiques dans le muscle à 200 Volts/cm montrant une augmentation de l'expression du transgène d'un facteur supérieur à 200 Cette expérience est effectuée chez les souris DBA 2, avec des impulsions électriques d'une intensité de champ de 200 Volts/cm et de durée variable, les autres conditions de cette expérience étant celles de l'exemple 3. Cet exemple confirme qu'à 200 Volts/cm la transfection de l'activité luciférase est augmentée à partir d'une durée d'impulsion de 5 msec puis continue à croître pour des durées plus longues (figures 4 et 5). Là encore, on observe avec l'électrotransfection une réduction de la variabilité inter-individuelle indiquée par la SEM par rapport au contrôle non électrotransfecté (la valeur relative de la SEM est égale à 35% pour le contrôle et 25, 22, 16, 18, 16 et 26% pour des séries d'impulsions de 1, 5, 10, 15, 20 et 24 msec respectivement). Dans la meilleure condition de cette expérience, on améliore par un facteur de 205 I'expression du transgène par rapport au contrôle injecté en l'absence d'impulsions électriques. EXEMPLE 5 Efficacité de l'électrotransfert d'acides nucléiques en fonction du produit nombre des impulsions x intensité du champ x durée de chaque impulsion La figure 5 exemplifie l'importance du paramètre correspondant au produit nombre des impulsions x intensité du champ x durée de chaque impulsion . Ce paramètre correspond en fait à l'intégrale en fonction du temps de la fonction qui décrit la variation du champ électrique. La représentation en figure 5 des résultats obtenus au cours des expériences 2, 3 et 4 avec des intensités de champ électrique de 200 V/cm, 100 V/cm ou en absence des champs électriques montre que l'efficacité de transfection augmente en fonction du produit de la durée totale d'exposition au champ électrique par l'intensité de champ. Un effet de stimulation est obtenu pour une valeur supérieure à 1 kVxmsec/cm du produit champ électrique x durée totale des impulsions . Selon un mode préféré, une stimulation est obtenue pour une valeur supérieure ou égale à 5 kVxmsec/cm du produit champ électrique x durée totale des impulsions . Revendications 1) Produit de combinaison caractérisé en ce qu'un acide nucléique et un champ électrique d'une intensité comprise entre 1 et 600 Volts/cm sont combinés, pour leur administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps in vivo à un tissu et, pour la thérapie génique reposant sur l'électrotransfection in vivo dans les tissus. 2) Produit de combinaison selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 4 et 400 volts/cm. 3) Produit de combinaison selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'intensité du champ est comprise entre 30 et 300 volts/cm. 4) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que la durée totale d'application du champ électrique est supérieure à 10 millisecondes. 5) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'application au tissu du champ électrique comprend une ou plusieurs impulsions de fréquence régulière. 6) Produit de combinaison selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'application au tissu du champ électrique comprend entre 1 et 100 000 impulsions de fréquence comprise entre 0,1 et 10 000 hertz. 7) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 5, caractérisé en ce que les impulsions éléctriques sont délivrées de façon irrégulière les unes par rapport aux autres et en ce que la fonction décrivant l'intensité du champ électrique en fonction du temps d'une impulsion est variable. 8) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 7, caractérisé en ce que l'intégrale de la fonction décrivant la variation du champ électrique avec le temps est supérieure à 1 kVxmsec/cm. 9) Produit de combinaison selon la revendication 8, caractérisé en ce que cette intégrale est supérieure ou égale à 5 kVxmsec/cm. 10) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont choisies parmi les impulsions à ondes carrées, les champs électriques générant des ondes à décroissance exponentielle, des ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes. 11) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les impulsions électriques comprennent des impulsions à ondes carrées. 12) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont appliquées de façon externe. 13) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 11, caractérisé en ce que les impulsions électriques sont appliquées à l'intérieur du tissu. 14) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté dans le tissu. 15) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté par voie systémique. 16) Produit de combinaison selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'acide nucléique est injecté par voie intra-artérielle ou intra-veineuse. 17) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est administré par voie topique, cutanée, orale, vaginale, intranasale, intramusculaire, sous cutanée ou intra-oculaire. 18) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'acide nucléique est présent dans une composition contenant, en outre, des excipients pharmaceutiquement acceptables pour les différents modes d'administration. 19) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est présent dans une composition, adaptée à l'administration parentérale. 20) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique. 21) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 22) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique est d'origine synthétique ou biosynthétique, ou extrait d'un virus ou d'un organisme procaryote ou eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire. 23) Produit de combinaison selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'acide nucléique administré est associé à tout ou partie des composants de l'organisme d'origine et/ou du système de synthése. 24) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 23, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un ARN ou une proteine d'intérêt. 25) Produit de combinaison selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'ARN est un ARN catalytique ou anti sens. 26) Produit de combinaison selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour une protéine choisie parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines, les facteurs de croissance, les facteurs trophiques, les facteurs angiogéniques, les facteurs neurotrophiques, les facteurs de croissance osseuse, les facteurs hématopoiétiques, les facteurs de coagulation, les antigènes et les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, des lipides et des autres constituants essentiels de la cellule. 27) Produit de combinaison selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour les facteurs angiogéniques VEGF et FGF, les facteurs neurotrophiques BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, la protéine Gax, l'hormone de croissance, la calcitonine, la leptine et les apolipoprotéines, les enzymes de biosynthèse des vitamines, les hormones et les neuromédiateurs. 28) Produit de combinaison selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps, un fragment variable d'anticorps simple chaîne (ScFv) ou tout autre fragment d'anticorps possédant des capacités de reconnaissance dans un but d'immunothérapie, ou code pour un récepteur soluble, pour un peptide agoniste ou antagoniste d'un récepteur ou d'une protéine d'adhésion, pour une protéine artificielle, chimérique ou tronquée. 29) Produit de combinaison selon la revendications 28, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un anticorps antiidiotype, un fragment soluble du récepteur CD4 ou du récepteur du TNFa ou du récepteur de l'acétylcholine. 30) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'acide nucléique code pour un précurseur d'une protéine thérapeutique. 31) Produit de combinaison selon l'une des revendications 20 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique est sous forme d'un plasmide. 32) Produit de combinaison selon l'une des revendications 20 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique contient un gène de grande taille et/ou des introns et/ou des éléments régulateurs de petite ou de grande taille. 33) Produit de combinaison selon l'une des revendications 20 à 30, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un ADN épisomal ou un chromosome artificiel de levure ou un minichromosome. 34) Produit de combinaison selon l'une des revendications 20 à 33, caractérisé en ce que l'acide nucléique contient des séquences permettant et/ou favorisant l'expression du transgène dans le tissu. 35) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce que l'acide est associé à tout type de vecteurs ou à toute combinaison de vecteurs permettant d'améliorer le transfert d'acide nucléique tels que des virus, des agents synthétiques ou biosynthétiques, ou encore des billes propulsées ou non. 36) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisé en ce que le tissu est soumis à un traitement visant à améliorer le transfert de gêne, un traitement de nature pharmacologique en application locale ou systémique, ou un traitement enzymatique, perméabilisant, chirurgical, mécanique, thermique ou physique. 37) Produit de combinaison selon l'une des revendications I à 14, caractérisé en ce qu'il permet de faire produire par le tissu un agent à des doses physiologiques et/ou thérapeutiques, soit dans les cellules du tissu, soit secrété. 38) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le volume de tissu transfecté. 39) Produit de combinaison selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il permet de moduler le volume de tissu transfecté par l'utilisation de sites multiples d'administration. 40) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il permet de moduler la quantité de transgène exprimé en modulant le nombre, la forme, la surface et la disposition des électrodes, et en variant l'intensité de champ, le nombre, la durée, la fréquence et la forme des impulsions, ainsi que la quantité et le volume d'administration de l'acide nucléique. 41) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il permet de contrôler la localisation des tissus transfectés par le volume de tissu soumis aux impulsions électriques locales. 42) Produit de combinaison selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il permet un retour à la situation initiale par l'ablation de la zone de tissu transfectée.