Brevet FR2772045A1 — publié le 19990611

La présente invention concerne le rétroélément Z4M ainsi que son intégrase rétrovirale capable de diriger l'intégration d'une séquence d'acide nucléique dans une région spécifique d'un génome ainsi que les vecteurs comprenant, outre ladite séquence nucléique à intégrer, la séquence comprenant tout ou partie du susdit rétroélément ou de son intégrase ; I'invention concerne également l'utilisation de ces vecteurs. L'invention s 'inscrit plus particulièrement dans les domaines de la transgénêse et de la thérapie génique. Les techniques de génie génétique mettant en oeuvre des vecteurs viraux ont largement été développées ces dernières années, les vecteurs en question dérivant des rétrovirus, des adénovirus, des virus associés aux adénovirus, des virus herpétiques... La thérapie génique résulte de la mise en oeuvre de ces techniques réalisant la pénétration de l'ADN au sein d'une cellule hôte dans le but d'apporter un nouveau gène pour pallier l'insuffisance qualitative ou quantitative du gène d'origine, de moduler une expression génétique endogène ou de corriger précisément une anomalie d'un gène résultant d'une mutation. L'une des techniques les plus utilisées à l'heure actuelle est celle faisant intervenir l'utilisation des vecteurs dérivés des rétrovirus. Les avantages apportés par ce type de vecteur sont en effet nombreux efficacité de pénétration du matériel génétique dans la cellule hote, système actif et efficace d'entrée dans le noyau de la cellule cible, expression génique relativement importante, potentialité à pouvoir cibler un type de cellules particulières grâce au contrôle de la liaison du vecteur à la cellule cible et ainsi permettre l'expression génique sous contrôle d'une spécificité tissulaire, et enfin ces vecteurs sont si largement mis en oeuvre qu'ils donnent lieu à une quantité importante de données disponibles tant expérimentales que cliniques. Par ailleurs, les vecteurs dérivés des rétrovirus sont les plus utilisés pour le transfert de gène dans le cadre d'une thérapie génique car ils permettent d'intégrer au chromosome hôte des séquences thérapeutiques par des liaisons covalentes précises. Cependant, l'intégration de séquences dans un génome présente de nombreux risques pour l'hôte. Le système d'intégration rétroviral montre effectivement une très faible spécificité de site cible et les intégrations se font au hasard sur les chromosomes entraînant des mutations variées. L'intégration à proximité d'un proto-oncogène, par exemple, peut entraîner l'activation ectopique de gène à l'origine de cancers. A l'inverse, l'intégration rétrovirale peut aussi conduire à une inactivation du gène touché par l'insertion. De récentes études concernant les sites d'intégration spécifique de séquences d'ADN par des éléments de type rétrovirus (rétrotransposons) suggèrent que cette nouvelle stratégie de thérapie génique empêcherait tout problème d'insertion mutagène par le ciblage de la séquence d'ADN du chromosome hôte où se produit l'insertion et le contrôle de l'intégration de la séquence. Les rétrovirus sont des virus dont l'information génétique est portée par deux ARN à brins positifs. Le génome viral comporte les trois gènes gag, pol et env qui codent respectivement pour les protéines de la capside, pour des protéines enzymatiques indispensables à son cycle de vie (protéase (PR), réverse transcriptase (RT), Rnase H (RN) et intégrase (IN)) et pour la protéine d'enveloppe. Le cycle de vie du rétrovirus se compose d'une étape extracellulaire (infection de la cellule cible) et d'une étape intracellulaire (réplication de son matériel génétique). La première phase consiste en l'attachement du virus, via sa protéine d'enveloppe, à un récepteur spécifique présent à la surface de la cellule cible. La seconde se déroule en plusieurs étapes. Elle débute dans la capside par transcription réverse des deux ARN en ADN doubles brins linéaires grâce à une protéine codée par le virus lui-même: la réverse transcriptase. Cet intermédiaire ADN pénètre dans le noyau grâce à un complexe nucléoprotéique et s'intègre dans le génome de la cellule hôte grâce à une protéine du virus appelée intégrase. L'ADN du virus intégré dans le génome de l'hôte est alors nommé provirus. Cette forme provirale est ensuite retrouvée dans toutes les cellules filles somatiques résultant des divisions cellulaires successives de la cellule mère infectée. Après l'entrée de la particule virale dans la cellule infectée, la polyprotéine GAG-POL est clivée par la protéase virale (PR) en composants individuels. Ce processus est essentiel à la réplication du rétrovirus. Dès l'infection d'une nouvelle cellule cible, I'intégrase reste associée à un complexe nucléoprotéique (complexe de préintégration) qui contient le nouvel ADN proviral synthétisé mais aussi les protéines GAG et POL (Bowerman et al., 1989). Ce complexe de préintégration migre vers le noyau où l'intégration de la forme provirale s'effectue. Le processus d'intégration s'effectue en deux étapes. La première est localisée dans le cytoplasme à l'intérieur de la capside, où l'intégrase permet une réaction endonucléolytique qui généralement enlève deux nucléotides à l'extrémité 3' de l'ADN linéaire viral nouvellement synthétisé. La seconde consiste après transport dans le noyau en la jonction de l'ADN viral clivé en 3' et de l'ADN du chromosome hôte grâce à une réaction concertée de transfert de brins. Les deux extrémités de l'ADN viral vont se joindre à l'ADN cible entraînant une duplication de la séquence cible aux bornes de l'ADN proviral intégré. La nature et la taille de cette région dupliquée est spécifique du virus. Une protéine intégrase purifiée est capable d'effectuer cette réaction de transfert de brins, quand elle est couplée à un substrat ADN (Chow et al., 1992). Concernant leur structure, les intégrases rétrovirales présentent des domaines très conservés indispensables à leur bon fonctionnement. La région Nterminale (localisée entre les résidus 1 et 50 dans le cas du HIV-1) contient un motif de type "HHCC" (H pour Histidine et C pour Cystéine) très conservé, qui ressemble à un domaine en doigt de zinc trouvé chez les facteurs de transcription (Burke et al., 1992 ; McEuen et al., 1992 ; Bushman et al., 1993); La contribution exacte de ce domaine en doigt de zinc dans l'activité catalytique de l'intégrase est encore non élucidée. Néanmoins, le motif "HHCC" jouerait un rôle dans la formation stable des complexes entre l'intégrase et l'ADN viral (Hazuda et al., 1994, Ellison et Brown, 1994 , Ellison et al., 1995). La région centrale (localisée entre les résidus 50 et 212) contient trois résidus acides invariants appelés communément le domaine "D, D-35-E" (D pour pour acide aspartique et E pour acide glutamique). Ce domaine est très conservé des intégrases rétrovirales aux transposases eucaryotes et procaryotes (Kulkosky et al., 1992 ; Doak et al., 1994 Rice et Mizuuchi, 1995). Le remplacement de l'un quelconque des résidus acides de ce domaine entraîne la perte complète de l'activité enzymatique de l'intégrase, indiquant que ce domaine constitue le centre catalytique de cette enzyme (Engelman et Craigie, 1992 ; Van Gent et al., 1992 ; Leavitt et al., 1993). Enfin, le domaine C-terminal (moins conservé) est aussi nécessaire pour toutes les étapes d'intégration décrites précédemment. Ce domaine est chargé positivement et semble être impliqué dans des liaisons non spécifiques à l'ADN (Vink et al., 1993 Woerner et Marcus-sekura, 1993 ; Engelman et al., 1994). La fonction précise de ce domaine C-terminal n'est cependant pas encore élucidée. La présente invention concerne l'identification et le séquençage complet d'un nouveau rétroélément appelé ZAM et identifié chez Drosophila melanogaster. 14Ma une taille de 8,4 kilobases et sa séquence est reportée dans SEQ ID N" 1. Comme les rétrovirus, ZAM est constitué de trois gènes gag, pol et env codant pour des protéines analogues à celles retrouvées chez les rétrovirus, à savoir respectivement la protéine de capside, les protéines à activité enzymatique (protéase, réverse transcriptase, Rnase H et intégrase) et la protéine d'enveloppe. Les trois cadres de lecture (ORFs) sont encadrés par des régions répétées longues (LTRs). ZAM possède le site de liaison à l'ARN de transfert spécifique de la sérine (site PBS) dans sa région 5' et une région riche en polypurines à l'extrémité 3'. Ces deux régions sont utilisées pour le processus de transcription reverse. La présente invention a donc notamment pour objet une séquence nucléotidique correspondant à : a) la séquence selon SEQ ID N" 1 en tout ou partie, ou b) une séquence s'hybridant avec la séquence selon a), ou c) une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 90 % d'homologie avec une séquence selon a) ou b). Plus particulièrement, cette séquence correspond à tout ou partie du rétroélément Z4M de Drosophila melanogaster. Comme indiqué précédemment, le rétroélément ZAM comprend le gène d'une intégrase. Cette intégrase rétrovirale est capable de diriger l'intégration d'une séquence d'acide nucléique dans une région spécifique d'un génome. Cette région spécifique est la séquence GCGC au niveau de laquelle, comme mentionné cidessus, I'intégrase conforme à la présente invention procède à l'intégration d'une séquence d'acide nucléique. Comme également précédemment indiqué, I'intégration d'une séquence d'acide nucléique peut être réalisée dans le but d'inactiver ou d'inhiber tout ou partie de l'expression d'un gène dans une cellule cible ; elle peut également comprendre un gène d'intérêt destiné à pallier une déficience totale ou partielle du gène correspondant natif. La séquence de l'intégrase du rétroélément Z4M est reportée dans SEQ IDN02. La présente invention a donc également pour objet une séquence nucléotidique correspondant à un gène comprenant a) la séquence selon SEQ ID N" 2 en tout ou partie, ou b) une séquence s'hybridant avec la séquence selon a), ou c) une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 90 % d'homologie avec une séquence selon a) ou b), ou d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon a), b) ou c) ou une protéine équivalente. L'invention concerne donc également des séquences codant pour l'intégrase de Z1M compte tenu de la dégénérescence du code génétique et pour toute protéine équivalente. Par "protéine équivalente" à l'intégrase de Z4M, on entend une protéine qui, sans avoir une séquence et/ou une structure rigoureusement identique à l'intégrase de ZAM, présente une activité identique ou similaire à cette dernière ou produit les mêmes effets ; c'est notamment le cas de protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles. De plus, l'étude de l'intégrase conforme à l'invention a montré qu'elle présentait toutes les caractéristiques des intégrases rétrovirales citées précédemment, à savoir un domaine HHCC du côté N-terminale, un domaine D, D-35-E dans sa partie médiane et une région riche en acides aminés basiques du côté C-terminal. Comme indiqué précédemment, la séquence spécifique au niveau de laquelle intervient l'intégrase rétrovirale conforme à l'invention contient le tétranucléotide GCGC. Le système de fonctionnement de l'intégrase occasionne une duplication de cette séquence qui se retrouve donc de part et d'autre de la séquence intégrée dans le génome de la cellule hôte. A ce propos, il est a souligner que cette séquence contient le site de restriction Hha I (GCGC). La présente invention a également pour objet un vecteur d'intégration d'une séquence d'acide nucléique, voire d'un gène d'intérêt, qui comprend outre la séquence d'acide nucléique à intégrer, une séquence d'acide nucléique nécessaire pour procéder à ladite intégration. Cette séquence est l'une des séquences nucléotidiques conforme à l'invention et de préférence une séquence correspondant à tout ou partie de ou présentant une forte homologie avec l'intégrase conforme à l'invention. En effet, la séquence d'acide nucléotidique correspondant à l'intégrase peut ne coder que pour une partie de celle-ci ou une forme mutée de celle-ci si le polypeptide résultant présente une activité identique ou similaire à celle de l'intégrase sauvage. Les vecteurs susceptibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention sont des vecteurs de type adénoviral, rétroviral, plasmidique ou tout transposon ou rétrotransposon susceptible de remplir la même fonction. Dans ce cas, il est clair que le vecteur conforme à l'invention, en plus, par exemple, de l'intégrase et de la séquence d'acide nucléique à intégrer, doit comprendre tous les éléments nécessaires à l'expression de l'intégrase dans la cellule hôte, que celle-ci soit eucaryote ou procaryote. Dans le cadre de la présente invention, le vecteur peut également comprendre tout ou partie du rétroélément ZAM qui comprend déjà les éléments en question. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un vecteur conforme à l'invention ainsi qu'un support pharmaceutiquement acceptable. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur conforme à l'invention pour réaliser une transgénèse ou pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique. Figure 1 : Séquence complète du rétroélément ZAM de Drosophila melanogaster Sur cette séquence (correspondant à SEQ ID N" 1) sont notamment indiqués les sites de restriction, les trois cadres de lectures ORFI, ORF2 et ORF3 correspondant aux gènes gag, pol et env respectivement, ainsi que les séquences répétées (LTR et IR) Figure 2 : Structure de l'allèle W'R6Re' La structure de l'allèle WlR6Rev est présentée comme suit : les régions carrées noires indiquent les exons alors que les lignes fines les joignant indiquent les introns. Les exons 1 et 2 du gène white sont les seuls exons de white représentés. L'ADN en amont du gène est représenté par des tirets. Les sites d'insertion du facteur I et de la séquence 9kb sont indiqués par des triangles. L'orientation du facteur I est indiquée par une flèche. Figure 3 : Structure moléculaire et organisation de ZAM (A) Carte de restriction de l'insert 9kb. Les rectangles représentent les séquences répétées longues (Long Terminal Repeats LTRs), les lignes en pointillés représentent les régions non transcrites en amont de white. Organisation des gènes : les phases ouvertes de lecture de gag, pol et env sont symbolisées par des rectangles. (B) Stratégie du sous-clonage de l'insertion. Les lignes noires représentent des fragments de l'insertion clonée dans le vecteur pBluescript ou amplifiée par PCR à longue matrice (Long Template PCR) P3. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification PCR de l'insertion complète (o1 et 02) ou du fragment P3 (5U et p2) sont symbolisés par des flèches. Figure 4 : Alignement multiple de la séquence d'acides aminés déduite des régionspol Comparaison de la séquence partielle d'acides aminés des régions conservées de la protéase (A), de la réverse transcriptase (B), de la RNase H (C), de l'intégrase (D) de l'ORF de pol et d'une région conservée (E) de l'ORF de env. Les acides aminés qui sont strictement conservés entre ZAM et les autres membres analysés sont indiqués par un signe +, alors que les acides aminés conservés dans certains éléments et similaires dans d'autres sont indiqués par une étoile. Les tirets indiquent des trous qui sont introduits pour préserver l'alignement. Abréviations MoMuLV pour Moloney Murine Leukemia Virus ; HIV2 pour Human Immunodeficiency Virus type 2. Les numéros d'accession (pour pol et env respectivement) sont les suivants : TED, B36329 et C36329 , gvpsv, GNFFG1 et ENVI-DROME ; 297, B24872 et ENV2-DROME ; 17,6, GNFF17 et Y172-DROME ; tom, S34639 et S34640 ; MoMuLV, POL-MLVMO et HIV2 1072794. Figure 5 : Expression et structure des transcrits de ZAM (A) Organisation de l'élément ZAM avec les localisations des différents ORFs. (B) Structure des transcrits génomiques et sous-génomiques de l'élément ZAM. Les dessins schématiques montrent l'ARN génomique non-épissé et le transcrit ORF3 épissé. Les numéros correspondent aux nucléotides du site donneur de lépissage (531) et du site accepteur (6387), la position où la polyadénylation a eu lieu (8306) et le site où l'initiation de transcription a commencé (329). SU, El, E2, E3, E4 et ES sont les nucléotides utilisés pour les amplifications PCR et pour l'analyse de la séquence. (C) Séquence nucléotidique des sites d'épissage de Z4M. Les deux séquences génomiques sont celles de la région leader et du début de ORF3. La séquence de l'ARN sous-génomique est celle provenant de l'amplification PCR de l'ADNc. Figure 6 : Séquence d'acides aminés prédite du produit de l'épissage de ORF3 Le soulignement épais indique la localisation du peptide signal (SP) de la protéine précurseur et du domaine transmembranaire (TM). Les résidus asparagine (N) dans les sites de N-glycosylation conformément à la séquence consensus N-X-S/T sont dans des carrés. Un site putatif de clivage protéolytique et des résidus cystéine sont soulignés d'un trait épais. La flèche noire indique le site possible de clivage qui élimine le peptide signal. Figure 7 : Formation du rétrogène Enveloppe (A) représente une structure simplifiée de ZAM ainsi que son ARNmenv. La PCR à longue matrice a été réalisée sur l'ADN génomique des souches à basse copie (Canton S et wxR6) et haute copie de ZAM (wlR6ReV et Charolles) en utilisant les oligonucléotides SU et El. Les deux cascades de formation de l'ADN enveloppe génomique qui est épissé et délété (Charolles) sont présentées dans (B) (formation du rétrogène) et dans (C) (formation du pseudogène). (B1) présente la structure du rétrogène ZAM identifié dans des souches Charolles. Les carrés vides et rayés représentent les LTRs complets et incomplets respectivement. ASO (Antisense Splice Oligonucleotide) et SDO (Sense Deletion Oligonucleotide) sont les amorces spécifiques utilisées pour les expériences de PCR inverse. ASO et SDO sont localisés respectivement à la jonction d'épissage (SJ) et au site de délétion (triangle). SD et SA sont respectivement les sites donneur et accepteur d'épissage. H symbolises le site d'action de l'endonucléase de restriction Hhal utilisée pour la PCR inverse. L'invention ne se limite pas à la description ci-dessus. Les exemples ci-après permettrons de mieux la comprendre mais ils ne sont donnés qu'à titre illustratif. EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION ET ANALYSE DE L'ELEMENT ZAM I- Matériels et méthodes 1) Les stocks de mouches Les stocks de mouches sont maintenus sur un milieu nutritif maïsglucose-levure.à 20 C. Les souches des Charolles, SV-XX (WVl44, C(l)DX, yf), WIR6 et Canton S proviennent de la collection de l'lNSERM U384. 2) La DréDaration de l1ADN de Drosophile et le southern blottir L'extraction de l'ADN génomique a été réalisée à partir des souches de Drosophile selon le protocole de Udomkit et al., 1995. L'ADN a ensuite été transféré sur membrane Hybond N+ par capillarité dans une solution contenant 3,6 M NaCI, 0,2 M Na phosphate, 0,02 M EDTA pH 7,7. Après hybridation à 420C, les filtres ont été lavés dans 2X SSC, 0,1% SDS à 420C et dans 0,1X SSC, 0,1% SDS à 42 C. Les fragments utilisés comme sonde ont été purifiés par gel et marqués avec cL[32P]-dCTP par "random priming" (Stratagène). 3) Les amplifications PCR L'amplification PCR a été effectuée avec le système de Boehringer (ExpandTM Long Template PCR System). Les conditions et les procédures sont décrites dans le protocole du fabricant. Les amorces ol et o2 (SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 respectivement) ont été utilisées pour amplifier Itélément complet ZAM présent au locus W'R6ReV; 5U et p2 (SEQ ID N 5 et SEQ ID N 6 respectivement) pour amplifier le fragment P3 correspondant à la région 5' de ZAM (figure 3). Amorce ol (site PstI) : 5' GTT GTC CCC TGC AGT AAA TGC 3' (6510 ; 6530) Ammorce o2 (site HpaI) 5' GAGCCAGTT AAC TGGCAT TCC 3' (7311 ; 7291) Amorce SU: 5' CAG CCG GAA AAC TGG AAT GGA 3' (478 ; 498) Amorce p2 : 5' GGG TTG TAG AAT ATG TCG CGA 3' (3658 ; 3678) 4) Sénuencaze de l'ADN La séquence de l'élément ZAM a été déterminée en sous-clonant le produit obtenu par PCR de PstI-HpaI dans le vecteur SK pBluescript (Stratagène). Les matrices double brin ont été préparées en utilisant des colonnes QUIAGENTM et ont été séquencées sur leurs deux brins par terminaison de chaîne par didésoxynucléotide en utilisant le DNA Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer), et les échantillons ont été chargés sur un analyseur de séquence ABI377. Deux séquences ou plus d'un même fragment cloné provenant d'amplifications indépendantes ont été déterminées pour éliminer les erreurs potentielles provenant de l'amplification par PCR. 5) Extraction et isolation de l'ARN Par DOIs (A)+ Les ARN provenant de mouches âgées de O à 24 heures ont été extraits en utilisant la méthode de la guanidine-HCl (Cox, 1968). Après traitement pendant 10 minutes à 650C, l'ARN total a été chargé sur une colonne de celluloseoligo(dT) et les ARN poly(A)+ furent isolés (Aviv et Leder, 1972). 6) Northern blot La sonde ARN antisens BH fut synthétisée à partir du fragment HindIII-BglII de l'0RE3 de ZAM (figure 3) cloné dans le vecteur pBluescriptlI en utilisant les procédures établies par Maniatis et al., 1989. Une sonde d'ADN provenant du gène de l'Actin-5C fut utilisée comme contrôle du chargement de l'ARN. Les Northern blots furent réalisés selon le protocole décrit par Lajoinie et al., (1995). 7) Détermination des terminaisons 5' et 3' du transcript ZAM Extension de l'amorce Pour l'obtention de la carte de l'extrémité 5' des ARN initiés à partir du LTR 5' de ZX4M, I'amorce réverse et complémentaire 5Ure a été marquée radioactivement à son extrémité 5' par la polynucléotide-kinase T4 et par [Y2P]ATP L'amorce à extrémité radioactivement marquée a été hybridée aux ARN totaux de wlR6Rdv et étendue en utilisant la réverse transcriptase du virus de Avian Myeloblastosis (VAM). L'analyse des produits a été réalisée selon Triezenberg, 1992. Seulement une bande correspondant au produit d'extension a été observée après autoradiographie, ce qui indique que la transcription commence à la même position pour les deux unités de transcription. Amorce 5Ure (SEQ ID N 7) : 5' TCC ATT CCA GTT TTC CGG CTG 3' (478 ; 198) RT-PCR Le premier brin de l'ADNc a été réalisé en utilisant le kit BRL de synthèse de premier brin d'ADNc sur l'ARN total wlR6ReV. Une amorce oligo dT modifiée qui contient un adaptateur d'amorce 5' a été utilisée pour l'étape de la réverse transcription. L'amplification PCR fut conduite en utilisant l'adaptateur d'amorce et l'oligonucléotide spécifique à l'enveloppe de ZAM. Amorce oligo dT modifiée (SEQ ID N 8) : S' GAC TCG AGT CGA CAT CGA (dT)17 3' Adaptateur d'amorce (SEQ ID N 9) : 5'GAC TCG AGT CGA CAT CG 3' Amorce spécifique de ZAMenv (SEQ ID N 10) : 5' TCA ACA GAA GAG CAC CC 3' (7642 ; 7658) 8) Analyse Dar RT- PCR 500 ng d'ARN poly(A)+ provenant de mouches adultes ont été transcrits en sens inverse pour donner les ADNc simple brin en utilisant le kit de synthèse d'ADNc simple brin provenant de BRL en suivant le protocole fourni par le fabricant. 2 l du réservoir d'ADNc ont été utilisés pour l'amplification PCR avec les oligonucléotides spécifiques 5U et ceux décrits ci-dessous. Amorce El (SEQ ID N 11) : 5' TGG TGT ATG GTA CCG ATG GGT 3' (7971, 7991) Amorce E2 (SEQ ID N 12) : 5' TGT GAG TGT ATC CAG GTG 3' (7732 ; 7749) Amorce E3 (SEQ ID N 13) : 5' ATG TCG CAG TAG CTG GTC 3' (7437,7454) Amorce E4 (SEQ ID N 14) : 5' TGT CTT GTC TAA GAT GAG 3' (6706 ; 6723) Amorce E5 (SEQ ID N 15) : 5' CAT GTT GCC GGT GAC GAC 3' (6706 ; 6723) 9) Expérience de PCR inversée (inverse PCR) L'extraction de l'ADN des Charolles a été réalisée en utilisant une mouche selon la méthode de Gloor et Engels (1991). L'ADN a été traité par l'endonucléase de restriction HhaI. L'extrémité 3' du rétrogène Z4M a été identifiée par la méthode de PCR inversée (Gloor et al., 1983). ASO et SDO (Antisense Splice Oligonucleotide et Sense Deletion Oligonucleotide) a été utilisés comme amorce dans l'expérience de PCR. Amorce ASO (SEQ ID N 16) : 5' CCC CAT GGC AAG ATA ATA GAA C 3' Amorce SDO (SEQ ID N 17) : 5' GTA CTT AAT ATA TAA AGG AAA CGG G 3' 10) Hvbridation in situ sur les chromosomes Dolytènes L'hybridation in situ sur les chromosomes polyténes des souches de D. melanogaster a été réalisée d'après la méthode décrite par Biémont (1994). II- Résultats et discussion 1) Mise en évidence nar réversion phénotypique de l'existence de l'élément ZAM On a recherché un gène modifiant en trans l'expression de l'allèle wxR6 en réalisant une mutagenèse PM (Robertson et al., 1988) sur une lignée portant l'allèle wJR6 . Cet alléle est dû à l'insertion du facteur I (rétrotransposon de type LINE) dans le premier intron du gène white et donne un phénotype d'oeil marron orangé aux mouches (Lajoinie et al., 1995). Des lignées homozygotes ont été établies à partir de mouches issues de la mutagenèse et exhibant un changement de couleurs des yeux. Une de ces lignées portait une mutation sur le troisième chromosome qui supprimait partiellement le phénotype d'oeil marron-orangé wlR6 en brun foncé (Su78). Après plus de vingt générations, un mâle présentant un phénotype sauvage pour la couleur de l'oeil a été isolé. La cause de cette réversion a été génétiquement localisée sur le chromosome X à proximité du gène white. Par la technique de Southern blot, en utilisant de nombreux enzymes de restriction, on a trouvé que l'unité de transcription de l'allèle W'R6 était inchangée: chaque exon et intron était toujours présent. Il en était de même pour la carte de restriction du facteur I. Cependant, le locus white fut l'objet d'une insertion de 9 kb à environ 3 kb en amont du site d'initiation de la transcription du gène white entre les sites de restriction PstI et HpaI aux positions 6523 et 7305 respectivement selon O'Hare et al., 1984 (figure 2). Cette insertion de 9 kb est absente de ce site dans la souche wlR6 et dans les lignées utilisées pour la mutagenèse PM ou issues de la mutagenèse PM. Ce nouvel allèle de white fut nommé WlR6Rev, 2) L'insert de 9 kb est semblable à un élément rétroviral Dans le but d'isoler et de cloner l'élément inséré, des expériences de PCR ont été entreprises (V. supra, matériels et méthodes). Les oligonucléotides ol et o2, compris entre les sites de restriction PstI et HpaI, ont été utilisés comme amorce pour l'amplification (figure 3). La carte de restriction a été établie et vérifiée par southern blotting d'ADN génomique (figure 3A). Les produits obtenus par PCR ont été clonés en sous-fragments comprenant l'insertion complète (figure 3B). L'insertion présente la structure typique du rétrovirus gypsy (figure 3A), mais elle fait partie d'une famille clairement distincte des éléments transposables décrits jusqu'à ce jour chez D. melanogaster. On a appelé ce nouvel élément rétroviral ZAM. ZAM possède à ces deux extrémités des longues répétitions terminales ( long terminal repeats, LTR) de 473 pb. Les deux LTR ont des répétitions inversées longues de 7 pb à leurs extrémités 5' et 3'. Les LTR 5' et 3' de Z4M, comme tout LTR de rétrovirus, sont bordés effectivement par un site de liaison d'amorce (primer binding site PBS) complémentaire d'un ARNt cellulaire et par une séquence poly-purine (polypurine tract PPT). Le PBS de ZAM a 12 pb complémentaires à l'extrémité 3' de l'ARNtser de D. melanogaster. L'analyse par ordinateur des LTR de ZAMen utilisant le logiciel BISANCE (Dessen et al., 1990) a montré deux motifs consensus forts du type TATA-box. Le premier motif se situe à la position 208 (TATAAA) et le second, qui correspond à une bolte TATA rétrovirale est localisé à la positon 312. Ce dernier possède une séquence signal qui correspond à un signal de polyadénylation potentiel. Le site d'insertion de 141V dans l'allèle wlR6Rcv montre une duplication cible de CGCGCG aux bornes de l'élément. 3) Analvse de la séquence de ZAM L'analyse de la séquence de ZAM, en utilisant le logiciel DNA strider (Marck, 1988), a démontré l'existence de trois phases ouvertes de lecture (open reading frame, ORF) qui codent pour des polypeptides similaires aux protéines GAG, POL, et ENV trouvées chez les rétrovirus de vertébrés tels que HIV1 ou MoMuLV (Morrow et al., 1994, Shinnick et al., 1981) ou chez les éléments rétroviraux tels que 297, 17.6, gpay, tom et TED. Dans tous les cas, les similarités s'étendent aux domaines d'acides aminés très conservés décrits chez les rétrovirus. L'ORF1 de ZAM (figure 1) a une longueur de 343 acides aminés. Elle contient un domaine riche en Asparagine localisé dans la partie N-terminale et une région acide dans la partie C-terminale de la protéine comme décrit précédemment pour la plupart des éléments rétroviraux. L'0RE2 de ZAM (figure 1) code pour une protéine de 1217 acides aminés qui comprend des séquences similaires à d'autres poly-protéines Pol (Xiong et Eickbush, 1990). L'analyse par le logiciel BLAST-X (Altschul et al., 1990) a révélé quatre domaines - Le domaine protéase (prt) comporte la courte séquence acide Aspartique Thréonine-Glycine (DTG), décrite comme le site actif des Aspartyl (acide) protéases par Rawlings et Barret, 1995. - La réverse transcriptase (rt) caractérisée par le motif conservé, appelé YxDD box, qui correspond à son centre catalytique (Yuki et al., 1986). - La RNAse H (rnh). - Le domaine intégrase (int), qui comporte un domaine potentiel de site de liaison aux ions Zinc (appelé "Zinc finger") et un motif DD35E caractéristique des sites actifs des Intégrases (Polard et Chandler, 1995). Les figures 4A, B, C, D, présente les alignements partiels de ces domaines avec ceux des rétrovirus de vertébrés et éléments similaires. L'ORF3 (546 aa) (figure 1) a révélé des similitudes avec les protéines ENV de 297, 17.6, gypsy, tom et TED. Un domaine conservé parmi ces rétrovirus et éléments similaires est présenté dans la figure 4E. II montre un domaine Arginine-x-Lysine-Arginine (RxKR) considéré comme site consensus de clivage protéolytique (Klenk et Garten, 1994). 4) Les ARN de ZAM varient de manière quantitative et qualitative selon les souches Dans le but de déterminer les caractéristiques de la transcription de Z4M, les ARN totaux ont été extraits de mouches adultes WlR6 et WIR6Rv, des souches LCN et HCN respectivement. Le filtre de nylon a d'abord été sondé avec la ribosonde BH (figure 5B) correspondant au gène env de ZAM et a ensuite été sondé avec un clone du gène actine afin de contrôler la charge des échantillons déposés sur le gel. Les résultats sont compilés à la figure 5. Deux principaux transcripts ont été identifiés dans la souche WIR6Rev. un transcript de 8,6 kb et un de 1,7 kb. L'ARN de 8,6 kb n'est pas détecté dans la souche WIR6. Bien qu'une plus grande quantité d'ARN ait été chargée dans le cas de WIR6, seul l'ARN de 1,7 kb a été observé dans cette souche. Les extrémités 5' des ARN de la souche WIRRev ont été déterminées par la méthode d'extension d'armorce (V. supra, matériels et méthodes). La transcription commence à la position 329 du 5'LTR. Cela suggère que la boîte TATA à la position 312, telle que prédite par analyse informatique, est utilisée comme site d'initiation de la transcription (figure SB). Les extrémités 3' des ARN ont été déterminées par RT-PCR. La polyadénylation des ARN de ZAM. se passe à 26 pb en aval du site AATAAA du 3' LTR, à la séquence CAAGCAGC-(A)n (position 8306, figure 5B). Seul un site correspondant au site d'initiation de la transcription et un site de polyadénylation ont été identifiés lors de notre préparation d'ARN, ce qui suggère que les transcripts 8,6 kb et 1,7 kb possèdent les mêmes extrémités 5' et 3' De plus, puisque l'ARN 8,6 kb correspond à la longueur totale de 141V commençant dans la région 5'LTR et finissant dans la région 3' LTR, il pourrait être un intermédiaire de la transposition. L'ARN 1,7 kb est présent dans toutes les souches testées. Puisque les ARNm de l'enveloppe de rétrovirus tels que HIV1 ou gypsy sont produits par épissage du trancripts complet qui élimine les phases ouvertes de lecture gag et pol, on a analysé la structure du transcript 1,7 kb de ZAM. 5) L'élément ZAM code un transcriDt sous génomique épissé de ORF3 présentant les caractéristiques d'un ARNm fonctionnel rétroviral Les Northern blots ont montré que l'ARN 1,7 kb ne s'hybride pas avec la ribosonde BB spécifique de pol. Cela suggère que cette bande de 1,7 kb pourrait correspondre au transcript spécifique de l'enveloppe. En utilisant la méthode RT PCR, on a isolé les fragments d'ADNc, amplifiés à partir d'amorces cibles de la région 5' non-traduite de Z4M (5U) en combinaison avec les amorces correspondantes aux divers sites du gène env (El, E2, E3, E4 et E5) (figure 5B). Des fragments de taille attendue pour une amplification d'un ARN épissé pour les gènes gag et pol, ont été observés après électrophorèse des produits PCR. Un des fragments générés à partir des amorces 5U et E5 a été séquencé. Il correspond au produit de fusion entre la région leader prédite et ORF3 (figure 5C). Les jonctions identifiées de l'épissage présentent les sites consensus d'épissage 5' et 3' caractérisés par la présence de dinucléotides GT au site donneur et AG au site accepteur. Le site donneur d'épissage est localisé à la position 531, 59 bp en aval du début du PBS de l'ARNt; le site accepteur est localisé à la position 6387 (figure 5C). La région leader et l'0RE3 sont en phase dans l'ARN messager épissé, ce qui suggère que le premier codon méthionine dans la région leader (position 494) est utilisé comme site d'initiation de la traduction (figure 5C). La traduction de cet ADNc correspond à un polypeptide potentiel de 551 acides aminés. Le figure 6 présente la séquence d'acides aminés prédite par la traduction de l'ARN sous-génomique et souligne les motifs structurels typiques de polypeptide codé par l'enveloppe de ZAM. La séquence N-terminale de 22 acides aminés (position 3-24) présente les caractéristiques d'un peptide signal (Hunter et Swanstrom, 1990). Un site potentiel de clivage de ce peptide a été identifié grâce au logiciel signalp (Von Heijne, 1983). Une deuxième région hydrophobe de 19 acides aminés comprenant les résidus 485 à 503 est localisée au site attendu pour un domaine transmembranaire TM (Coffin et al., 1990). La partie cytoplasmique correspondrait aux résidus 506-551. il sites putatifs de N-glycosylation conformes aux séquences consensus Asparagine-x-Sérine ou Thréonine (N-x-S/T), et 6 résidus Cystéine sont similaires à des structures trouvées dans les protéines d'enveloppe des rétrovirus. 6) Existence d'un rétrozène épissé env de ZAM Afin de caractériser l'ARNm-env épissé, une analyse des ARN présents dans la souche Charolles a été entreprise. Les transcripts observés par Northern blot sont identiques à ceux observés pour la souche WIR6Rev Cependant, dans les expériences RT-PCR en utilisant les oligonuléotides 5U et El, un fragment de 1,5 kb, qui s'hybride avec le fragment BH, a été amplifié. Sa séquence révèle que ce fragment fut amplifié à partir d'un ARN identique à l'ARNm de la souche WIR6Rev dans sa conformation épissée. Une différence notable a été découverte : une délétion de 148 pb est localisée entre les positions 7308 et 7456 de la séquence de l'enveloppe de ZAM. Dans le but de tester si le fragment ORF3délété aurait pu provenir de l'amplification d'un élément 141V délété et endogène du génome de Charolles, une expérience de PCR utilisant les oligonucléotides 5U et El a été réalisée sur l'ADN génomique de Charolles. Ces mêmes expériences ont été réalisées en utilisant l'ADN génomique de WlR6ReV et de deux autres souches indépendantes (figure 7A). Le blot a été hybridé avec une sonde ZAM total. Dans toutes les souches, la PCR a amplifié un fragment de 7,5 kb qui correspond à la taille complète de ZAM. Quelques autres bandes ont été observées dont un fragment de 1,5 kb présent uniquement chez Charolles. Le séquençage de ce fragment de 1,5 kb montre qu'il possède les mêmes caractéristiques structurelles que le fragment 1,5 kb produit lors du RT-PCR (V. supra, la structure sous-génomique de env plus la délétion de 148 pb). Cette séquence génomique de l'enveloppe de ZAM proviendrait très probablement de la réverse transcription d'un ARN ORF3 de ZAM et de la subséquente intégration dans le génome hôte. La délétion interne est présumée représenter une mutation secondaire indépendante. Deux possibilités sont à considérer 1 - Elle pourrait être formée par un processus rétroviral d'intégration (processus rétrogéne) ayant eu lieu lors de la mobilisation de ZAM (figure 7B et 7B1, Goodchild et al., 1995 ; Yoshioka et al., 1991). 2- Par un mécanisme moins spécifique impliquant sa réverse transcription aléatoire par une réverse transcription cellulaire ayant conduit à la formation d'un pseudogène (figure 7C, Tchénio et al., 1993). Les pseudogènes générés par ce dernier mécanisme sont caractérisés par trois éléments diagnostiques : Ils n'ont pas la séquence promoteur en amont, ils n'ont pas d'introns et comportent une queue poly-A à leur extrémité 3' Une séquence, appartenant à un rétro-transposon avec des LTRs, et intégrée par un processus de transposition, n'aurait également pas d'intron, mais serait en revanche encadrée par des LTRs complets et n'aurait pas de queue poly-A. Afin de distinguer entre ces deux modèles, l'expérience suivante a été réalisée: L'extrémité 3' de l'élément trouvé dans Charolles a été analysée par une approche d'inverse-PCR en utilisant des amorces spécifiques. L'amorce ASO a été choisie pour sa complémentarité avec la jonction de l'épissage et SDO pour la séquence de jonction créee par la délétion de 148 pb (figure 7B1). Un fragment de 1,2 kb a été amplifié, cloné et séquencé. On a démontré ainsi que l'élément ZAM identifié dans Charolles comporte un LTR 3' reconstitué mais pas de queue poly-A. Donc, cet élément fut crée par rétrotransposition. En outre, cet élément délété est encadré par une séquence CGCG qui est identique aux 4 pb de la duplication de la cible d'insertion de Z4Men aval de white. EXEMPLE 2 : ETUDE DE LA DISTRIBUTION GENOMIOUE DE ZAM 1) Nombre de coties de ZAM et variabilité selon les souches La distribution génomique de Z4M a été étudiée par des expériences de Southern blot sur diverses souches de D. melanogaster. Des résultats typiques sont obtenus en sondant d'égales quantités d'ADN traité par les enzymes PstI BglII avec la sonde BH (figure 3B). De nombreuses bandes hybridées ont été visualisées. Ce résultat démontre qu'il existe plusieurs copies de 141V dans le génome de Drosophila melanogaster. Cependant, le nombre de copies de 141V varie selon les souches. La majorité d'entre elles (on a testé plus de 15 souches indépendantes y compris toutes les souches utilisées pour ou isolées suite à la mutagenèse PM) comporte un faible nombre de copies (souches LCN, low copy number). Deux exceptions furent notées : la ligné portant l'allèle WlR6Rev et la lignée Charolles possédant de nombreuses copies de 141V dans leur génome (souches HCN, high copy number). La souche Su78, à partir de laquelle fut obtenu un mâle portant l'allèle WIR6ReV, a un nombre intermédiaire de copies de ZAM (inférieur à WlR6Rv mais supérieur à WiR6). Une faible empreinte de bandes communes est observée pour toutes les souches examinées, alors que des bandes additionnelles qui diffèrent d'une souche à l'autre sont présentes. L'empreinte des bandes, observées pour WIR6RV et son parent WiR6, indique clairement que ZAM a été mobilisé et que son nombre de copies a augmenté récemment. 2) Etude de la distribution génomique de ZAM nar hybridation in situ. La localisation génomique des copies de ZAM a été étudiée dans différentes souches par hybridation in situ sur les chromosomes polyténes des larves de troisième stade. Les images présentées (Figure 3) montrent des résultats typiques lorsque les chromosomes ont été hybridés avec la sonde HpaI-PstI contenant l'élément ZAM complet encadré par les séquences en amont de white. La souche Charolles à haut nombre de copies (A) comporte 15 signaux d'hybridation dispersés sur les bras des chromosomes et entourant les centres des chromosomes. Un faible signal d'hybridation peut être vu dans la région hétérochromatique du génome. Tout comme Charolles, la souche WlR6ReV (B) possède environ 15 signaux d'hybridation, mais ils sont localisés principalement sur le chromosome X. En revanche, la souche Canton S à faible nombre de copies (C) exhibe seulement quelques faibles signaux dans la région hétérochromatique et aucun signal sur les bras des chromosomes. La souche WiR6 (D) a la même empreinte de signal d'hybridation que Canton S sauf pour deux signaux localisés respectivement sur les chromosomes X et trois. EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE DE LA SPECTFICITE D'INSERTION Mise en évidence du site spécifique d'insertion de ZAM Le premier site d'insertion (séquence dupliquée) de ZAM a d'abord été mis en évidence lors du clonage de l'élément par la technique de PCR telle que décrite dans l'exemple I. Le clonage d'un élément 141V indépendant (souche différente) a montré que la même séquence est dupliquée aux bornes de l'élément. L'analyse de ces séquences dupliquées a montré l'existence d'un site de coupure par l'endonucléase de restriction HhaI. L'élément MM présente trois sites internes HhaI en plus des sites localisés dans ces séquences flanquantes. Ainsi, dans le but d'identifier s'il existe une spécificité d'insertion de l'élément ZAM, 1'ADN génomique de différentes souches a été traité par l'enzyme de restriction HhaI. Les fragments obtenus ont été séparés sur gel d'agarose, transférés sur membrane de nylon et hybridés avec une sonde de ZAM marquée au cx[P 32]dCTP. Quatre fragments marqués de taille (0,5 ; 3,4 ; 1,4 et 3,2 kilobases) ont été observés. Ces quatre éléments correspondent à des fragments internes de ZAM. Ces résultats démontrent qu'un site HhaI se trouve aux bornes de chaque élément ZAM, quel que soit le lieu d'insertion ou quelle que soit la souche testée. Une conclusion peut donc être tirée de cette expérience, à savoir : I'intégrase de ZAM génère des insertions préférentielles en des sites coupés par l'enzyme Hhal. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: UNIVERSITE D'AUVERGNE (B) RUE: 49 BOULEVARD FRANCOIS MITTERAND (C) VILLE: CLERMONT-FERRAND (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 63000 (il) TITRE DE L' INVENTION: RETROELEMENT ZAM ET SON INTEGRASE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 17 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release 41.0, Version 41.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8435 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: rétroélément ZAM (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AGTTACCGAC CCATCGGTAC CATACACCAC CCCTCCCTCT AAGCCACCAC GCCTACACAA 60 GTAGAAGACA TCGAACCGGG AAGCTTTGCG ATACAAAGTT GCAGCATAAA CATCAACAAC 120 GGGTCAGACG CCGACATCCG CCCAAAATGC TGACACCACA TCCTTTTCGC TCAGACAGAA 180 CAACGCATAC AATTCCATAT ACATACGTAT AAACATACTC ATACTTTCTG CTGTGTCAGA 240 TACTTTATTT CTAAGAACTT TAACATTGTA ATACATACAC ACATATTCAC TGTTAGCCCA 300 TTTAAGACGA AGAATAAAGA CGACCACAGT CGAGTGCAAG CAGCAAACAC TTGTAGACGT 360 ACATAATCTC CGATCAAAAT TCTCCCAAGA CGACCGTGGC TACGTTCTGG ACCCGCATAA 420 CTCCTCTATC TTTCTGAGTG ATAATACCTC CGCAAGACTC CCCGGAGGTA ACTGGCGCAG 480 CCGGAAAACT GGAATGGAAA ATACTTTATT AAACCTTCTA TTAGTTCTAT TGTAAGTAGT 540 TGTGGAAAAA GAGTGAGAAT GAAGTGCAGA AATGTCTAAA AGTGATTACA ACAAAAATCC 600 TAATACAATA CATAAACCGC CTTAACAAAC ATACAAAACA CGCATATAAA AAAAAAAAAA 660 AA AAAAAAA GAAAAAAAAA AACCCAAAAC TTAAAAATGC CGTAACCGCG AAACATGATA 720 TGCGTTGTAC TTGTGTGAAA TCAATCGCTG ATAGTCACTG CCGAAGTTTA TTAAGGCCAA 780 GTACCATATC ATTACTTTCA TGTTTACATA CATATATATG CCCCACAATT AAAACAACAT 840 ACACACACAC AAATATTTCA AATGCAAAAA AAAAAAAAAG AATGTAGTGT ACCTGCGTGG 900 CATCAATCGC TGATAAACCA CTGCCGAAAT ATTAAAGGCC CGGTACTACA TCACAAAACA 960 CGTATATATG CAACAAAAAT ATACACAACA AAACCATATA TACAAACGTG TATGAGTGAC 1020 GTGTAATGTA CTTGTGTGAA ATCAATCGCT GATAATCACT GCCGAAGCTT AGTAAGGCCA 1080 AGTACCACAT CATTACTAAC ATGTGTACAT ATATATATAT GCAAAACAAT TAAAACAACA 1140 TACACACACA CAAATATTTC AAATGCAAAA AAAAAAAAAA AAGAGGAAAT GTTGTGTACC 1200 TGCGTGGCAT CAATCGCTGA TAAACCACTG CCGAAATATT AAAGGCCCGG TACTACATCA 1260 CAAAACACGT ATATATGCAA CAAAAATATA CACAACAAAA CCATATATAC AAACGTGTAT 1320 GAGTGACGTG TAATGTACTT GTGTGAAATC AATCGCTGAT AATCACTGCC GAAGCTTAGT 1380 AAGGCCAAGT ACCACATCAT TACTAACATG TGTACATATA TATATGCAAA CCACCAAAAC 1440 AAATACATAT ACACATACAA ACACTCCAAA AAAAAAAACA AATAATACTA TATGAACGGC 1500 GAAGCGTATG TTTTCTAAGG CTGGATACAA AACCACAAAA CCAAATATAA ATTGCACACC 1560 TTAATAAAGA AAAGAACAAA AATGATAATA AACAAAAGAA ATTTTTTTTG GAACATGCAC 1620 CCATACTCTC ACTCTTTCAA CACAAATAAA GTATTCAAAT TATACATACA TACAATAATA 1680 CCACTATATT ACAGAAATTA ACGCACAAGA AAACACACAC ACTATCCAAC AACAAACAAG 1740 TAATTAAGAG TTATTAAGTA CATTGTAAAC TACATATTTT TATCTTAAAT GTCAPAGAAA 1800 TTAACACAAA CTATTAAACA AACAACTCGC TCCGTGTTAG AATCACACAC ATTTCCCAAA 1860 AGAGTTACAC GATCAGTTTC GAAAACAAAC ACCCTCCCCG TAATAAGAGA AAGCACCCCC 1920 TTACCGCCCC TTCAACCTAT AAATATGGAT TCGGGCAACG CCTCCGTAGG TAATTCCGCC 1980 CCCGTAACAC CTACTGTCAG TGGCTTTAGC AGTATTGCTA CGGCACTTAG TGCCACCGAT 2040 ATTTTAGCCT TCGTTAAAGA ACTTCCGACC TTCGATGGTA CTCCAGGCCA ACTCGACAAA 2100 TATATAACTA GCGTTGAGGA AATAATCATG CTCATTAGGG GTACCGACCA AACTCCGTAC 2160 GGACTTCTGA CACTCAGGGC AATTAGGAAT AAAATAGTTG GAAGAGCAGA CGAAGCTCTA 2220 AACCTAGCCA ACACCAAACT TATATGGGAC GATATCAAAA GTAACCTACT ACGTTTATAC 2280 TCTAGCAAGA AAAGCGAAGC TACCCTCTTA GGCGAGCTCC AATCTCTCCC AGATAACCTA 2340 ACCCTAGGGC AATTGTTCTT CGGCTTATCG AGGATTAGGA GCCAACTTAT ATCCATTACT 2400 TCCAATAGTG GACAGTCGGC CACAATCATC GAAGCCAAGA AAACACTATA TGACGAAGTC 2460 TGTTTAAACG CCTTCATCTC AAGAATTAGA GAACCACTTA AAACAGTCAT CAGATTGAAA 2520 GACCCCAAGA CTATCGAAAC AGCTTACGAG CTATGTCAAG GAGAAAGGGC TCGTTACCAG 2580 AACAGAAACC CATATCCCCC AACACAAAAC AACACCGAAC GACGAACTAA CAACTACAAT 2640 AACAATAACA ACAACAATCA CAGAGACAAC AACAACCGCA ACAACGTAAC TCGTCTTACA 2700 CCCAAAACCA CTCAAACCAT TACTCAAACC CCAATTCCCA ATATCGTCAA TCAAACAACG 2760 GCAACAGAAC TAGTAACCCG TTTAAAGATA ATAAAACAAA TTATGGGCTA CACAACATAG 2820 AAGAAGAAAA ACTCACCCAA CACTGCCTTA CCAACTTAAA TTTTCAGGCA CCCGCCTCAG 2880 GAACCCAACA GGATACATAA ATCCTACCAC ACATGCAACA TCCCTTCCAT ACATAACTCT 2940 AAACCTCCAA CAAAAATTCC CTTTATCATT TCTTATCGAT ACAGGATCCA ATAACTCCTT 3000 CATTGACCCA GPATCTGCAA ACCAACTAGA GTGCACAATT CTACCAACAT CCACTTCAAT 3060 TACAACAGCA TTAAATAGTT TCAAAATTGA AGAAAAGGCA ATATTCCCAA TGCCACCCGA 3120 GTTCAAAACC GAAGGTCAAA TTACCCTACT TAAATTCAAA TTTCACTCTT ATTTCAATGG 3180 CCTCATAGGA ATGGACCTAT TATCACACCT AGAAGCAAAA GTAGACCTAG TAAACTTACA 3240 ACTAGTAACT TCAAAGTCTA CACTCCCAAT ATTCTTATAC ACTAACCAGG CTTCAAAAAT 3300 TTTTAACATC CCCGCCTACA GTAAAGTTAT CTTACCACTA CCAGTAAAGA CTAATCATGG 3360 GGAATTCTAT TGTTGTACTA CACAACTAAA TAATGAGTTA TCGTTGTCAG AAGGACTATA 3420 TAAATCAAAC AATAATATTG CCAATGTCGA AATCTCTAAC CAATCCGACT CAGATAAACT 3480 ATTATACCTA GAATACCCCC TAGAAACCAT TCCATACAAT AAAAACGACC ATATAGAGCT 3540 CTTTAATATA TCAGCTACAC CTCTTAATAA CGATACCCCT CAAGCCCCAT TACATATCCT 3600 CACAGAACAC CTCAATCCAG AGGAAAAAC AGCCTTAACA ACCCTATGTA AACAATTTCG 3660 CGACATATTC TACAACCCAG AAACACCATT AACTTTTACC AACAAAATCA CACACTCCAT 3720 CCCAACCATA GATAACACTC CTATCCACAC AAAATCCTAC AGATACCCTT TTGTCCATAA 3780 AACAGAAGTC AAAAAACAAA TCGAATCCAT GTTAGACCAA CAAATTATTA GATCTAGCCA 3840 CTCCCCTTGG AGCGCCCCGG TGTGGGTGGT CCCAAAAAAA CTAGACGGGA CAGGGAACAG 3900 GAAATGGCGA CTTGTAATAG ACTACCGGAA ACTCAACGAC AAAACCATTT CGGACAGATA 3960 CCCCATCCCA AACATAAATG ACATATTAGA TAGCATAGGC AAAGCAAAAT ATTTCTCAAC 4020 GCTCGACCTA ACTAGCGGTT TTCATCAAAT CGAGATGAAT CCAAAAGATA TCGCCAAAAC 4080 AGCCTTTACA GTCGAAGGGG GTCACTACGA ATTCACACGG ATGCCCTTCG GCTTAAAAAA 4140 CGCACCGGCT ACCTTTCAAC GGGTTATGGA CAGCGTTCTT GGCGATCTCA ACGGCACCAT 4200 TTGCCTATTC TATCTTGACG ATATTATAAT TTTCTCGCCT TCCCTACAAA AACACCTGTT 4260 GGACATAAAA ATGGTATTCG AAAAACTCAG AGCGGCAAAC TTTAAACTAC AACCTTCAAA 4320 ATCAGAATTC CTAAGGAAAG AGATAGAATT TCTAGGCCAC ATAGTCACAC AAGACGGAGT 4380 TAAACCAAAC CCGAACAAAA TAAGTGCGAT CAAAAAATTT CCTTGCCCCA CCAACAGAAG 4440 AGCTATCAAA TCTTTTCTCG GGTTACTGGG TTATTATAGG AAGTTTATAA GAGACTTTGC 4500 ACGAATAACG AAGCCCATGA CTAAACAATT GAAAGGGAAA AGACAAGTTA CTACAGACAA 4560 AGACTTTGTA GACGCATTCG AACAGTGCAA AACTCTTCTG TCCAATGACC CAATACTCAT 4620 ACACCCAGAC TTCGAAAAAC CATTCATTCT TACTACGGAT GCTAGTAACT TCGCGTTAGG 4680 AGCCGTACTA TCTCAAGGCT CCTTACAAAA CGATAGACCT GTATGTTTTG CCAGCAGGAC 4740 CCTCTCCGAC ACCGAAGTCA ACTATTCAAC CATAGAAAAA GAAATGTTGG CAATAATATG 4800 GGCAGTAAAA TACTTCAGAC CATATATTTA TGGCGTAAAA TTTACTATTG TTACAGATCA 4860 CAAGCCACTA ATATGGCTTA TGAATTTCAA AGAACCCAAC TCAAAAATAA TTCGTTGGAG 4920 ACTCCAACTC ATGGAATACA ATTTTGAAAT AATTCACAAG AAAGGTTCAC AAAATGTAAT 4980 TGCAGACGCC TTAAGTAGAG CGGACCCAAA TTTAAACTAC AACGAAACAC TGACTGTTAA 5040 GCCTTGCCCC ACATCCGAAA AACCTATTAA CGAATTTAAC ACGCAACTCA TACTAGAAAT 5100 AGATACAAAT ACGTCTTACC AAACTACAAC ACCATTTAAA CAAAAGATTA GGAAAAAATA 5160 TTCACAGCCT TGCTTCGATT TCGATAATAT TGTTAAAATC TTGAAAGGAA CCCTAAAACC 5220 TAACAGGATT TGCGCATTCT TGGCGGACGA TAATAATTCC GCATTAATCG AAAAAGCATT 5280 CTCAACGTAT TTTGCACATA AAAAACACTT TAAAATTATC AGATGCAAAT CACTTCTCCA 5340 CGAAATCGTA GGAAACCCCG AACAAAACAA ATTCATTCAG GAATATCACA CTAACAGCAA 5400 CCACAGAGGC ATAGACGAAA CATTCCTTCA CCTCAAACGA GAAACCTACT TCCCCAATAT 5460 GAAAAACAAA ATCTCTGAAT TAATTAGGAA TTGCGAAACC TGTCTAAAAC TCAAATACGA 5520 CAGGCAACCA CAAAATATAG TATTTGAAAC CCCAGAAACC CCATCGAAAC CCCTCGACAT 5580 AATACACATA GACATCTATA CTATTAACAA TAATTTTAAC CTGACAATCA TAGACAAATT 5640 CTCAAAATTC GCAGCTGTCT ACCCCATCCC AAATAGAAAC GGCATCAATT GCATCAAAGC 5700 AATCAAAAAT TTTTTCAGTC AATTCGGACT ACCCAAAAAA CTAATACACG ACCAAGGAGT 5760 AGAATTTTGC AACGACATAT TTCGAAAGTT TTGCTCTCAA TATAATATAC TTCTCCATGT 5820 CACATCCTTC CAGCAATCTT CAAGTAATTC TCCAGTAGAA CGTTTACACT CCTCTTTGAC 5880 AGAGATTTAC AGAATAATAC TAGACACACG GAAAAAACAC AAATTACCTA CAGACCACGA 5940 AGAAATAATG TCAGAAACTG TAATAACATA TAACAACGCA ATCCACTCCA CCACCAAACA 6000 CACCCCTTTT GAACTTTTTA ATGGTAGGAC CCATTTATTC GAGAAAACAA TAATACCCAA 6060 TAATGAGCAT GACTATTTAA ATAAACTAAA TACGTTCCAA GACAAACTAT ACTCCGAAAT 6120 AAAAGAAAAA TTGTCCACAA ACACCCAACA AAGGATAGAA AAGCTAAACA CAAGCAGAGT 6180 AGAACCAACA ACAGTACAAC CTAACAGCAC AATTTTCAGA AAAGAAAACA GGAGAAATAA 6240 ATTAACACCA CGGTTTTCCT TACACAGAAC AGCAAAAGAC AAAGGAAAAA CTCTAGTAAC 6300 CACAAGAAAT CAAAAAATCC ACAAATCAAA AATTAGGAAA ATATCCAAAC CTCCAAATGA 6360 CTTAAGCCTT TCCACCTGCA TTCCAGATCT TGCCATGGGG CATACCAATC TATCTTCATC 6420 CACAACTTCA ATAGCACCAA CCTCCTAGCA AAAGTGCCGG TAGGGAAAAC ACTCGTGATA 6480 GGAAACTATA AAAAAATTAG CCACATAATC GATCTGTCCG AATACACCAA CTGTATTGAA 6540 AAATTATACC ACACCATCGA TACCCTAAGA CAAGATGAAA CACTCACCGA TTCTATATCA 6600 ATACTAAATG CTAAACTGGC CCAAACTCAA AGTAAAATAG ACGCACTAAC ACCCTTTTCA 6660 CGCCACAAAA GAGGTCTTAT TAACGGGTTA GGTAGTTTAG AACACTCAAA ATACAATTTA CACAAAAATA TACAACAACG AAGAAGAAAT AAAGAAACTA 6960 CAATATATAA ATAGGCTTAA CTACAATATA GATTTATTAG TTAGCCACCT AAGCGACATT 7020 ATAGAAAGTA CACTGCTTGC CAAAATTAAT GTTATCCCAA AACTCATCTT AGACAAGACA 7080 GAAATAACCA AAATCAAACA AATTTTTAAA ACACAAAACT ACACAATAAA ATCCGAGCAA 7140 CACATTTATA ACCTCTTAAA AATGAACGCA CTCAATTACC AAAACAAAAT AATTTTTAGT 7200 ATCAAAATTC CTATTTTTTT AAGTTGTAAC TACGAAATGG CAAGATTAAT TCCACTTCCA 7260 ATAAATTCCA CACAATTTGT AATAGCACCT AAGTACTTAA TATATAATAA CAAAAGTAAC 7320 AGCATGTTTT CAACTATGTA TAAATGTCCT GTAATAGAAG AACAATTCGT CTGCGAAATC 7380 GACTCCATCA ATAATCTTAA AAATAATACT TGCCTGGGAC ACCTTATCCA AAATAAGACC 7440 AGCTACTGCG ACATAAAGGA AACGGGACTC ACGACTGATG TGTTCGAACC GGAAAAAGGC 7500 TTCATACTTG TATTTAACGG GAACAACCTC CCAATCATCT CCTCCAACCA GACCATAACT 7560 AGTATCAATG GATCAGCTAT AATAAAGTAT AACAATTGCA CATTAAAAAT CAATGAAATA 7620 AACTACGACA ACAGGGCGGT ATCAACAGAA GAGCACCCCG ACTTCTTCCT ACCACCAATG 7680 CGGAAACTAA TAAAAAATGC CACTATCAAC ATACTCACCT TGGAPAGACT TCACCTGGAT 7740 ACACTCACAA CATCCAATAA GCTACTGGTC GTCGCCGCAG GAAACTCTCG ACACTCGACA 7800 ACCTTGTATA TCCTCTTCAC CGTATCCCTA GTCGCCGTAA TACTCACCTG GACACTTCGA 7860 AGGGACACCC ACATCTTCCA TACCGGGCCC GACCACATTC TTCCAATCGT CGCTCCACCA 7920 ATTCCTCCGT CTATGGCCTT CGCTCCAAAC TGGGGGGGGA GGAGTTACCG ACCCATCGGT 7980 ACCATACACC ACCCCTCCCT CTAAGCCACC ACGCCTACAC AAGTAGAAGA CATCGAACCG 8040 GGAAGCTTTG CGATACAAAG TTGCAGCATA AACATCAACA ACGGGTCAGA CGCCGACATC 8100 CGCCCAAAAT GCTGACACCA CATCCTTTTC GCTCAGACAG AACAACGCAT ACAATTCCAT 8160 ATACATACGT ATAAACATAC TCATACTTTC TGCTGTGTCA GATACTTTAT TTCTAAGAAC 8220 TTTAACATTG TAATACATAC ACACATATTC ACTGTTAGCC TATTTAAGAC GAAGAATAAA 8280 GACGACCACA GTCGAGTGCA AGCAGCAAAC ACTTGTAGAC GTACATAATC TCCGATCAAA 8340 ATTCTCCCAA GACGACCGTG GCTACGTTCT GGACCCGCAT AACTCCTCTA TCTTTCTGAG 8400 TGATAATACC TCCGCAAGAC TCCCCGGAGG TAACT 8435 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1260 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: INTEGRASE (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATTGTTAAAA TCTTGAAAGG AACCCTAAAA CCTAACAGGA TTTGCGCATT CTTGGCGGAC 60 GATAATAATT CCGCATTAAT CGAAAAAGCA TTCTCAACGT ATTTTGCACA TAAAAAACAC 120 TTTAAAATTA TCAGATGCAA ATCACTTCTC CACGAAATCG TAGGAAACCC CGAACAAAAC 180 AAATTCATTC AGGAATATCA CACTAACAGC AACCACAGAG GCATAGACGA AACATTCCTT 240 CACCTCAAAC GAGAAACCTA CTTCCCCAAT ATGAAAAACA AAATCTCTGA ATTAATTAGG 300 AATTGCGAAA CCTGTCTAAA ACTCAAATAC GACAGGCAAC CACAAAATAT AGTATTTGAA 360 ACCCCAGAAA CCCCATCGAA ACCCCTCGAC ATAATACACA TAGACATCTA TACTATTAAC 420 AATAATTTTA ACCTGACAAT CATAGACAAA TTCTCAAAAT TCGCAGCTGT CTACCCCATC 480 CCAAATAGAA ACGGCATCAA TTGCATCAAA GCAATCAAAA ATTTTTTCAG TCAATTCGGA 540 CTACCCAAAA AACTAATACA CGACCAAGGA GTAGAATTTT GCAACGACAT ATTTCGAAAG 600 TTTTGCTCTC AATATAATAT ACTTCTCCAT GTCACATCCT TCCAGCAATC TTCAAGTAAT 660 TCTCCAGTAG AACGTTTACA CTCCTCTTTG ACAGAGATTT ACAGAATAAT ACTAGACACA 720 CGGAAAAAAC ACAAATTACC TACAGACCAC GAAGAAATAA TGTCAGAAAC TGTAATAACA 780 TATAACAACG CAATCCACTC CACCACCAAA CACACCCCTT TTGAACTTTT TAATGGTAGG 840 ACCCATTTAT TCGAGAAAAC AATAATACCC AATAATGAGC ATGACTATTT AAATAAACTA 900 AATACGTTCC AAGACAAACT ATACTCCGAA ATAAAAGAAA AATTGTCCAC AAACACCCAA 960 CAAAGGATAG AAAAGCTAAA CACAAGCAGA GTAGAACCAA CAACAGTACA ACCTAACAGC 1020 ACAATTTTCA GAAAAGAAAA CAGGAGAAAT AAATTAACAC CACGGTTTTC CTTACACAGA 1080 ACAGCAAAAG ACAAAGGAAA AACTCTAGTA ACCACAAGAA ATCAAAAAAT CCACAAATCA 1140 AAAATTAGGA AAATATCCAA ACCTCCAAAT GACTTAAGCC TTTCCACCTG CATTCCAGAT 1200 CTTGCCATGG GGCATACCAA TCTATCTTCA TCCACAACTT CAATAGCACC AACCTCCTAG 1260 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce ol (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: GTTGTCCCCT GCAGTAAATG C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce o2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GAGCCAGTTA ACTGGCATTC C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce 5U (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CAGCCGGAAA ACTGGAATGG A 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce p2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GGGTTGTAGA ATATGTCGCG A 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce 5Urc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: TCCATTCCAG TTTTCCGGCT G 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce oligo dT modifiée (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: caractéristique particulière (B) EMPLACEMENT : 19 (D) AUTRES INFORMATIONS : N signifie dT (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GACTCGAGTC GACATCGANN NNNNNNNNNN NNNNN 35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: adaptateur d'amorce (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GACTCGAGTC GACATCG (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce spécifique de ZAM env (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: TCAACAGAAG AGCACCC 17 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce El (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: TGGTGTATGG TACCGATGGG T 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce E2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TGTGAGTGTA TCCAGGTG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce E3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: ATGTCGCAGT AGCTGGTC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce E4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: TGTCTTGTCT AAGATGAG 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce E5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CATGTTGCCG GTGACGAC 18 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce ASO (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CCCCATGGCA AGATAATAGA AC 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce SDO (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: GTACTTAATA TATAAAGGAA ACGGG 25 23 35 REFERENCES - Altschul, S. 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Séquence nucléotidique correspondant à un gène comprenant: a) la séquence selon SEQ ID N" 2 en tout ou partie, ou b) une séquence s'hybridant avec la séquence selon a), ou c) une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 90 % d'homologie avec une séquence selon a) ou b), ou d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon a), b) ou c) ou une protéine équivalente. 4. Séquence nucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'intégrase du rétroélément Z4M de Drosophila melanogaster ou d'une intégrase équivalente. 5. Vecteur d'intégration d'une séquence d'acide nucléique comprenant, outre ladite séquence nucléique à intégrer, une séquence d'acide nucléotidique selon la revendication 1 ou 2. 6. Vecteur d'intégration d'une séquence d'acide nucléique comprenant, outre ladite séquence nucléique à intégrer, une séquence nucléotidique selon la revendication 3 ou 4. 7. Vecteur selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur de type adénoviral, rétroviral, plasmidique ou d'un transposon ou rétrotransposon 8. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une des revendications 5 à 7 et un support pharmaceutiquement acceptable. 9. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 5 à 7 pour la préparation d'une composition destinée à la transgénèse. 10. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 5 à 7 pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique.