Brevet FR2765590A1 — publié le 19990108

La présente invention a pour objet une méthode de semiquantification d'allèles. Plusieurs méthodes de quantification d'ARNm existent. L'hybridation par Northern Blot, par hybridation "dot et slot", ou l'essai de protection par la S1 sont des techniques qui permettent d'estimer la quantité totale d'une espèce particulière d'ARNm dans une préparation. Cependant, des techniques nécessitent de grandes quantités d'ARNm, pour être valables, ce qui représente un inconvénient majeur. En particulier, cet inconvénient devient critique lorsque la préparation d'ARNm provient d'un tissu prélevé par autopsie, I'intégrité de l'échantillon étant compromise. De plus, ces méthodes ne fournissent aucune information quant au niveau d'expression des différents allèles d'un locus. D'autres méthodes tirent profit de la sensibilité de la RT-PCR pour augmenter la concentration en ARNm spécifique et sont largement utilisées pour mesurer la quantité d'ARNm dans une préparation. Ainsi, des techniques ont été élaborées à partir de la RT-PCR pour étudier la différence de niveau d'expression des allèles d'un gène spécifique, en utilisant la combinaison de l'amplification par PCR spécifique de l'allèle et la quantification par PCR (Horiskoshi et al, 1994, Leuk. Res., 18, 693-702) ou encore en utilisant l'électrophorèse sur un séquenceur automatique d'ADN avec des amorces marquées fluorescentes (Jensen et al., 1996, Hum. Mut., 8, 126-133). Cependant, ces méthodes peuvent être difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent des équipements importants. Les auteurs de la présente invention ont mis au point une méthode de quantification relative d'un premier alléle, appelé allèle 1, par rapport à un second allèle, appelé allèle 2, comprenant les étapes consistant à: a) soumettre 'ADN à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles b) soumettre 'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles; c) séparer les fragments d'ADN; d) évaluer la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable; e) déterminer le pourcentage initial en les différents allèles, par la formule suivante: No allèle 1 A&alpha;'allele 1 No allèle 1 + No allèle 2 A&alpha;'allèle 1 + &alpha;'allèle 2 dans laquelle No est le nombre initial de molécules d'ADN, A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de chaque allèle, et a' est déterminé soit par la formule suivante: 5rnax K' dans laquelle Smax est le signal maximum qui peut être mesuré, et K' est une constante, Smax et K' étant déterminés par la fonction f suivante: Smax S=f(V)=(K'+V).V dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et S est le signal mesuré émis par le marqueur; soit par la fonction g suivante: dans laquelle S est le signal mesuré émis par le marqueur, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et Smax est le signal maximum qui peut être mesuré; sous réserve que le coefficient d'amplification E1 de 'ADN contenant l'allèle 1 soit identique au coefficient d'amplification E2 de 'ADN contenant l'allèle 2. Cette nouvelle méthode de semi-quantification d'allèles est valable indépendamment de l'efficacité de la PCR, des variations courantes de signal d'une expérience à l'autre, et prend en considération l'éventuel phénomène de saturation du signal. Elle est en outre particulièrement simple. II suffit, en effet, soit de reporter la valeur S du signal émis en fonction du volume V de l'échantillon, la courbe représentative de la fonction f telle que S = f(V) pouvant être tracée en utilisant la méthode des moindres carrés, et de déterminer Smax et K' à partir de cette courbe; soit de reporter la valeur 1/S en fonction de l'inverse du volume de l'échantillon, à savoir IN, la courbe représentative de la fonction g telle que pouvant être tracée par régression linéaire, la pente de la droite obtenue étant égale à l'inverse de a'. Ledit ADN amplifié selon l'étape a) peut être un ADN génomique ou un ADNc comprenant les séquences alléliques d'intérêt, cet ADNc pouvant être obtenu à partir d'ARNm par la technique usuelle de RT-PCR. Les alléles sont différenciés selon les étapes b) et c) décrites ci-dessus, qui mettent en évidence les polymorphismes de restriction (RFLP). La séparation des fragments d'ADN selon l'étape c) peut être réalisée notamment par électrophorèse sur gel, préférentiellement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La méthode conformément à l'invention telle que écrite précédemment n'est applicable que si la condition E1=E2 est vérifiée. En effet, si, théoriquement, la PCR est un processus exponentiel dans lequel, à la fin de chaque cycle, la quantité d'ADN amplifié est directement liée à la quantité de molécules d'ADN initialement présentes, il n'est cependant pas exclu que, dans la pratique, le rapport entre deux cibles similaires amplifiées ne soit pas conservé à la fin du processus d'amplification. La quantité de produits PCR augmente de manière exponentielle selon l'équation suivante: N = No(1 + dans laquelle N est le nombre de produits de PCR, No est le nombre initial de molécules d'ADN, n est le nombre de cycles d'amplification; et E est le coefficient d'amplification, qui est représentatif de l'efficacité de la PCR pour chaque population amplifiée. No, le nombre initial de molécules d'ADN, est donc estimé à partir de N, nombre de produits PCR, cette relation dépendant du coefficient E. Pour comparer les valeurs No de deux matrices différentes, à savoir l'ADN, qu'il soit ADN génomique ou ADN complémentaire, correspondant à un allèle 1 et à un allèle 2, à partir des valeurs N, il est donc nécessaire d'évaluer en premier lieu la variation du coefficient E pour une matrice (allèle 1) par rapport à l'autre (allèle 2). Le pourcentage des produits PCR de l'allèle 1 comparés à tous les produits PCR peut s'exprimer par la formule suivante: N0allèle1(1+Eallèle)n Nallèle 1 N0allèle1(1+Eallèle11)n+N0allèle2(1+Eallèle2)n = Nallèle1+Nalléle2 soit, si E1=E2 N0allèle1 = Nallèle1 N0allèle1+N0allèle2Nallèle1+Nallèle2 Le pourcentage final en alléle 1 est alors égal au pourcentage initial en allèle 2. Les coefficients E1 et E2 peuvent être calculés, dans la pratique, par des expériences de cinétique, utilisant notamment des dilutions d'ADN génomique d'individus homozygotes permettant d'obtenir des pourcentages initiaux en allèles connus. La réaction de PCR est alors stoppée au bout d'un nombre variable de cycles, de préférence à partir de 25 et jusqu'à 35 cycles. Les produits de PCR sont ensuite soumis à une digestion par des enzymes de restriction permettant la différenciation des allèles et les fragments obtenus sont séparés, de préférence par électrophorèse sur gel. Un marqueur émettant un signal quantifiable permet de détecter les fragments. En première approximation, le signal S émis par le marqueur est directement proportionnel au nombre N de molécules amplifiées, selon la relation S=aN, où ci est le coefficient de proportionnalité. Sachant que N et n sont liés par la relation: log N = nlog (1 + E)+ No qu'implique la relation (1), alors il suffit de reporter, pour chaque allèle, le logarithme de la valeur du signal S émis par le marqueur en fonction du nombre de cycles de PCR, la courbe correspondante pouvant être obtenue par régression linéaire. Ceci permet la détermination et la comparaison des coefficients d'amplification E des deux allèles. La validité de cette détermination est confirmée en représentant les valeurs Saltèlel en fonction de Sallèle2. La pente de la droite obtenue par régression linéaire est appelée p et est telle que 5a1Iè1e2 = pSall En reprenant la formule (3) N0allèle1 = Nallèle1 NOaílèb1 + NOaílèíe2 Nalleíb1 + NAllèle2 avec S = aN on obtient Sallèle1 Noallele1 a, NOallèle1 + NOalleb2 S allblel'SallbleS a1 a2 Le signal dépend en outre de la longueur des fragments d'ADN marqué, ce qui s'exprime selon la relation &alpha;allèle 2 = Ao'aiïèiei, A étant le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les fragments de restriction et est égal au rapport entre les longueurs des fragments. Le pourcentage initial en alléle 1 peut alors être exprimé par la formule suivante: N0allèle1 = ASaiiei N0allèle1 + N0allèle2 ASallèle1 + Sallèle2 soit N0allèle1 = A N09101 + N Oalsele2 A + p N0allèle1 Le rapport étant connu, la détermination de p N0allèle1 +N0allèle2 permet la vérification de l'égalité ci-dessus, ce qui valide les conditions de cinétique. L'égalité entre les coefficients d'amplification E1 et E2 étant vérifiée, la méthode de l'invention telle que décrite précédemment peut s'appliquer. Cette méthode a été mise au point afin de rendre compte de la variation observée du coefficient a, due notamment à un phénomène de saturation du signal. Elle s'applique donc à tout traitement d'un signal émis par un marqueur, que celuisi soit soumis ou non à un phénomène de saturation. Conformément à l'invention, le phénomène de saturation est décrit par analogie avec l'interaction ligand-récepteur ou enzyme-substrat et peut être exprimé comme équivalent de l'équation de Michaelis-Menten, selon les formules suivantes: SmaxN SmaxV S=K+N ou S=K'+V dans lesquelles Smax est le signal maximum émis par le marqueur qui peut être mesuré, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à la séparation des fragments, K K et K sont des constantes, avec K'= ou C est la C' concentration finale en chaque produit de PCR correspondant aux alléles. La valeur du coefficient a peut être exprimée en fonction du volume V, comme étant la dérivée de la fonction f telle que S=f(V)=SmaxV K'+V soit &alpha;'=f'(V)= SmaxK' (K'+V) avec a'= Ca. Lorsque les valeurs de V tendent vers zéro &alpha;'=limf'(V)=Smax v- > 0 K' Conformément à l'invention, on étudie la relation entre la dilution de l'échantillon de PCR et le signal mesuré. Les valeurs du signal mesurées permettent d'obtenir une courbe représentative de la fonction f telle que définie précédemment. Cette méthode permet d'estimer la constante K et la valeur Smax et ainsi de calculer les coefficients o"aiiè,, r et &alpha;'allèle 2. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, les valeurs du signal mesurées permettent d'obtenir une courbe représentative de la fonction g, qui découle de la fonction f comme suit: SrnaxV =f(V) K'+V d'où, comme &alpha;'=Smax K' 111 1 1 = x + =g( ) S &alpha;' V Smax V Cette méthode donne directement la valeur des coefficients a'a,lèh 1 et &alpha;'allèle2 et permet d'évaluer par régression linéaire la validité de l'équation décrivant le phénomène de saturation. La méthode de semi-quantification d'allèles selon l'invention présente plusieurs avantages: Elle permet notamment de tenir compte du phénomène de saturation. L'introduction des constantes K et K permet en outre de normaliser le signal, quelles que soient les variations inéluctables d'un gel à l'autre dues à la technique utilisée. Enfin, comme la méthode vise l'évaluation d'un rapport d'ADN pour chaque allèle, I'efficacité de la PCR n'a aucune incidence sur les résultats finaux. Cette méthode peut être appliquée aux produits de RT-PCR. Une bande spécifique d'un allèle pouvant être utilisée comme contrôle interne comparé à un autre allèle, cette application supprime la difficulté technique majeure de la RT-PCR d'avoir des données comparatives. En outre, cette méthode nécessite de faibles quantités de matériel biologique, ce qui est un avantage important lorsqu'on analyse des ARNm. La méthode conformément à l'invention est particulièrement adaptée pour normaliser le phénomène de saturation. Le marqueur utilisé peut être notamment un agent de coloration de l'ADN tel qu'un agent intercalant de l'ADN, ou un agent de complexation avec l'ADN, un agent fluorescent, un agent radioactif ou un agent luminescent, en particulier un agent chimioluminescent, pouvant être détectés sur films autoradiographiques. Le marqueur utilisé de préférence est le nitrate d'argent ou le bromure d'éthidium. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans la limiter. LEGENDE DES FIGURES La figure 1 représente un exemple d'expérience cinétique. La figure lA représente un gel digitalisé des produits de PCR digérés correspondant aux allèles s3 et E4 du gène APOE après coloration par l'argent. Cet exemple correspond au rapport initial en alléle S4 de 27,3 %. La figure 1B représente la quantification par densitométrie de la quantité de fragments de restriction. Une zone de linéarité (25-30 cycles d'amplification) a été établie entre le logarithme de l'intensité de coloration de deux fragments de restriction (72 pb, 91 pb) et le nombre de cycles de PCR. Les valeurs correspondant au fragment de 72 pb (paires de base) ont été obtenues par multiplication de l'intensité correspondant au fragment de 72 pb mesuré sur le gel multiplié par le coefficient A égal à 91/72. La figure 1 C représente un domaine linéaire entre la densité optique correspondant aux fragments de 72 pb et 91 pb, qui a été établi en incluant l'amplification par PCR. Le rapport calculé en allèle s4 était de 27,6 %. La figure 2 représente un exemple d'expérience de semiquantification et des traitements mathématiques différents développés pour interpréter les mesures expérimentales. Cet exemple correspond à un rapport initial en allèle s4 de 20 %. La figure 2A représenté un gel digitalisé de produits de PCR digéré correspondant aux allèles E3 ets4 après coloration par l'argent. La figure 2B représente la relation entre l'intensité des colorations de deux fragments de restriction (72 pb O, 91 pb O) et le volume des produits de PCR appliqués sur le gel. La courbe a été réalisée en utilisant la méthode des moindres carrés pour les valeurs de densité optique correspondant aux fragments de 72 pb (O) et 91 pb (O). Pour le fragment de 72 pb (allèle s4), S," = 2,881 et K' = 6,448 ,ul. Pour le fragment de 91 pb (allèle s3), les valeurs calculées sont Sma, La figure 2C représente la relation entre l'inverse de l'intensité de coloration des deux fragments de restriction (72 pb O, 91 pb O) et l'inverse du volume des produits de PCR. Les régressions linéaires ont été réalisées pour une valeur de densité optique correspondant aux fragments de 72 pb et 91 pb. L'équation obtenue pour l'allèle s4 (valeur de densité optique correspondant au fragment de 72 pb) était y= 1,702x + 0,615 (r2=O,995) et y= 0,348x + 0,281 (r2=0,999) pour l'allèle 3 (valeur correspondant au fragment de 71 pb). Le pourcentage final en allèle s4 calculé à partir de ces données était de 20,53 %. EXEMPLES Semi-quantification des produits de PCR correspondant aux allèles APOE par coloration à l'argent. Le gène de l'apolipoprotéine E est impliqué dans le développement de la maladie d'Alzheimer. La variabilité du locus modifie le risque de développer la maladie. Mais, bien qu'il soit prouvé que les effets spécifiques des isoformes pouvaient influencer le développement de la maladie, le fait que ces effets ne soient pas vus sur tous les porteurs d'un isoforme déterminé a incité les auteurs de la présente invention à rechercher les variabilités supplémentaires concernant ce locus. Dans le cadre de cette étude, il a été suggéré que des différences dans le niveau d'expression des différents allèles pouvaient expliquer les différences observées entre les individus partageant le même génotype sur ce locus. II a donc été nécessaire de quantifier le niveau d'expression des allèles par RT-PCR suivi par une analyse RFLP, cette technique étant le seul moyen de prouver les différences spécifiques entre les allèles. EXEMPLE 1: Vérification des conditions de la méthode semiquantitative : cinétique a) Conditions de PCR pour la validation de la méthode semiquantitative Des dilutions d'ADN génomique à partir d'individus homozygotes s3 et 4 ont été utilisées pour obtenir un pourcentage initial connu en allèle s4 (allant de 10 à 70 %). L'échantillon de PCR contenait 20 ng d'ADN génomique. L'ADN génomique a été amplifié par PCR dans un thermocycleur d'ADN (Equibio Thermojet Eurogentec) avec l'amorce F4 5'ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3' et l'amorce F6 5'TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'. (Hixon et al., 1991, J. Lipid Res., 31, 545-548). Brièvement, la PCR a été effectuée selon les conditions de RT PCR dans un volume total de 25 ,ul, contenant 2,5 unités d'ADN polymérase Taq, 2 pM de chaque amorce, 0,2 mM de chaque dNTP, 4 mM de DTT, 0,1 mM de MgCl2, 0,04 % de Triton X-100, 15 % (VN) de glycérol, IX de tampon RT-PCR (GibcolBRL), 0,5 ul de tampon de conservation de la transcriptase inverse M-MLV (Gibco/BRL). La réaction a été stoppée dans de la glace après 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 et 35 cycles (1 minute à 94"C, 1 minute à 58"C et 1 minute à 72"C pour chaque cycle). b) Electrophorèse Après digestion par ajout de 12 unités d'endonucléase Cfo I (Promega), les fragments d'ADN ont été résolus dans un gel de polyacrylamide à 8 %, pendant quatre heures à 12 V/cm. 1 à 2 p d'échantillons digérés ont été chargés sur le gel. c) Coloration Par l'arpent Le gel a été fixé pendant 90 minutes dans 10 % (VN) d'éthanol, 0,5 % (VN) d'acide acétique. Après deux lavages avec de l'eau désionisée, le gel a été placé dans une solution de nitrate d'argent (1 mg/ml) pendant 25 minutes. Puis, le gel a été lavé deux fois avec de l'eau désionisée. Les fragments polymorphes d'ADN ont été colorés pendant 30 minutes dans du formaldéhyde à 0,037 % (VN), et de l'hydroxyde de sodium (15 mg/ml). Finalement, la réaction a été stoppée avec une solution de carbonate de sodium (15 mg/ml). Le développeur et les solutions de nitrate d'argent ont été préparés extemporanément. Le gel a été digitalisé sur un scanner couleur haute résolution Sharp JX-325 et l'intensité des fragments a été mesurée en utilisant le logiciel Image Master (Pharmacia) en soustrayant le bruit de fonds. d) Méthode de calculs mathématique et statistique Les ajustements de courbe utilisant la méthode des moindres carrés ont été réalisés par calcul matriciel avec le logicel Matlab. La régression linéaire a été effectuée avec le logiciel SAS 6.04 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). e) Validation des conditions Par des exPériences cinétiques Les coefficients E ont été calculés par cinétique (figure 1A), la quantité d'allèle E4 allant de 10 à 50 %, en utilisant la formule: log N = n log (1 + E)+ N, Jusqu'à trente cycles, I'amplification exponentielle a été vérifiée (figure 1 B, tableau 1). Les coefficients E sont hétérogènes parmi les échantillons de PCR mais homogènes entre les allèles s3 et s4 dans un échantillon de PCR (tableau 1). Cependant, si on estime le pourcentage initial d's4 à partir des coefficients E (tableau 1) on fait une erreur de 14 % à 74 % après trente cycles d'amplification. Pour limiter les variations de point à point due à l'approximation expérimentale, une régression linéaire a été réalisée à partir de la formule DOaiièie 2 = pDOallèle 1, DO étant la densité optique mesurée. N0allèle1 A L'équation = permet de calculer le N0allèle1 +N0allèle2 A+p pourcentage initial en allèle E;4 dans les populations 82/s4 et #3/#4. Dans le cas du gène APOE, les alléles E3, E2 et E4 peuvent être caractérisés par des fragments de restriction respectivement de 91 pb, 83 pb et 72 pb. Le coefficient de proportionnalité A peut donc être calculé comme étant A= 91/72 pour les allèles E3/E4, A étant 83/72 pour les individus E2/E4 et A étant 91/83 pour les individus E2/E3. Pour ce dernier génotype, puisque les deux allèles E2 et E3 donnent une longueur de fragment de restriction de 91 pb alors on a la relation A DOaiïèiei + DOallèle 2 = DO 91 pb Le pourcentage initial en allèle E2 dans la population E2/E3 peut être calculé comme étant N0allèle1 = A N0allèle1 +N0allèle2 p Par cette méthode de calcul du pourcentage de l'allèle E4, une erreur de 0,01 % à 11,5 % dans la zone de linéarité (tableau 1) a été trouvée. Par cette approche, il a ainsi été démontré que les coefficients E étaient similaires quel que soit l'allèle étudié dans le même échantillon de PCR: I'efficacité n'est pas une limite pour conserver le pourcentage initial en E4. Le rapport initial étant conservé, toutes les conditions nécessaires pour l'expérience de semiquantification sont vérifiées. EXEMPLE 2: Méthode semi-quantitative prenant en compte un phénomène de saturation a) Conditions de PCR L'ADN génomique (20 ng à 100 ng) a été amplifié par PCR selon les conditions décrites dans l'exemple 1. La réaction de PCR a été effectuée jusqu'à 30 cycles. b) ElectroPhorèse Les échantillons de PCR digérés ont été déposés sur le gel à raison de 4 p à 0,1 l. c) Coloration sar l'arqent La coloration par l'argent a été réalisée selon le protocole décrit à l'exemple 1. d) Validation de la méthode de semi-quantification La relation entre la dilution d'un échantillon PCR et la densité optique mesurée sur le gel pour des rapports initiaux différents en allèle #4 a été étudiée. La densité optique résultant du traitement des gels a été reportée selon deux méthodes: i) la méthode 1 correspond à l'ajustement de courbes par l'utilisation de la méthode des moindres carrés (figure 2B), cette méthode permet l'estimation de la constante K' et de la densité optique maximale Donax et permet ainsi de calculer les coefficients a'. ii) la méthode 2 consiste à traiter les données mesurées selon la courbe g représentative de la fonction DO = g(V) = a' x v + S (figure 2C). Cette méthode donne directement les valeurs des coefficients a' et permet d'évaluer par régression linéaire la validité de l'équation décrivant le phénomène de saturation. La méthode 1 accentue principalement l'importance des points correspondants à une quantité élevée de produits PCR, tandis que la méthode 2 insiste plus particulièrement sur les faibles dilutions. L'intérêt majeur de l'utilisation de ces deux méthodes est de vérifier que la formule S SmaxV est K'+V capable de décrire le phénomène de saturation quels que soient les points utilisés. Pour ces deux méthodes, les courbes obtenues par régression peuvent suivre la distribution des points (figures 2B et C). Ceci a été confirmé par la régression linéaire obtenue à partir de la méthode 2 et pour laquelle les coefficients de régression linéaire ont toujours été trouvés très proches de 1 ,(figure 2C). Indépendamment du traitement mathématique, le rapport final calculé correspond au rapport initial en alléle s4 quel que soit le pourcentage étudié (tableau 2). Pourtant, la méthode 2 a donné de meilleures approximations que la méthode 1. En effet, l'étroitesse des bandes permet une quantification plus efficace pour des dilutions faibles que pour de fortes quantités de produits de PCR. Par conséquent, il semble que la méthode 2 soit plus adaptée au traitement de ces résultats. En outre, différentes concentrations d'ADN génomique (20 ng, 50 ng et 100 ng) ont été utilisées pour vérifier que les conditions d'application de la méthode semiquantitative étaient vérifiées pour des concentrations différentes d'ADN génomique. La qualité de la méthode de quantification n'a pas été modifiée par la concentration initiale en ADN génomique (tableau 2). Tableau 1 Comparaison des paramétres de PCR en fonction du pourcentage initial en allèle #4 Rapport initial en Efficacité de la PCR Rapport final allèle e4 Coefficient Coefficient Limite supérieure de estimé calculé (b) E91 pub E72pb la zone de linéarité (a) 10,5 /0 0,556 0,585 30 cycles 18, 3 % 11,5 % 20 % 0,811 0,819 30 cycles 22,8 % 22,3 % 27,3 % 0,718 0,729 30 cycles 33,1 % 27,6 % 50 % 1,014 1,018 32 cycles 53,1 % 49,1 % (a) le pourcentage final estimé a été calculé à partir des valeurs des coefficients E dans la zone de linéarité d'amplification (b) le pourcentage final calculé a été calculé à partir de la formule 8 dans la zone de linéarité de l'amplification Tableau 2 Comparaison entre le rapport final calculé et estimé en allèle E4 en fonction de la quantité d'ADN génomique dans l'échantillon de PCR et le rapport initial #4 connu Rapport initial Quantité d'ADN génomique initiale en allèle E4 dans chaque échantillon de PCR 20 ng 50 ng 100 ng Méthode 1 (a) Méthode 2 (b) Méthode 2 (b) Méthode 2 (b) 10% 11,49 # 0,26 10,17 # 0,04 11, 37 # 1,13 10,53 + 1,61 20 % 18,85 + 0,03 20,87 + 30 % REVENDICATIONS 1. Méthode de quantification relative d'un premier allèle, appelé allèle 1, par rapport à un second allèle, appelé allèle 2, comprenant les étapes consistant à: a) soumettre l'ADN à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles; b) soumettre I'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles; c) séparer les fragments d'ADN d) évaluer la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable; e) déterminer le pourcentage initial en les différents allèles1 par la formule suivante: Allèle 1 Aalallele i NOallèle i + NOallèle 2 A&alpha;'allèle 1 + &alpha;'allèle 2 dans laquelle No est le nombre initial de molécules d'ADN, A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de chaque allèle, et a' est déterminé " soit par la formule suivante: &alpha;'=Smax K' dans laquelle Smax est le signal maximum qui peut être mesuré, et K' est une constante1 Smax et K étant déterminés par la fonction f suivante: S=f(V)= max V (K'+V) dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et S est le signal mesuré émis par le marqueur; soit par la fonction g suivante: dans laquelle S est le signal mesuré émis par le marqueur, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et Smax est le signal maximum qui peut être mesuré; sous réserve que le coefficient d'amplification El de l'ADN contenant l'allèle 1 soit identique au coefficient d'amplification E2 de l'ADN contenant l'allèle 2. 2. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle SmaX et K' sont déterminés à l'aide de la courbe représentative de la fonction f telle que S = f(V) tracée en utilisant la méthode des moindres carrés. 3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle a' est déterminé à l'aide de la droite représentative de la fonction g telle que: tracée par régression linéaire. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit ADN amplifié selon l'étape a) est un ADN génomique ou un ADNc comprenant les séquences alléliques d'intérêt. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le signal est soumis à un phénomène de saturation. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le marqueur utilisé est un agent de coloration, un agent fluorescent, un agent luminescent ou un agent radioactif. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le marqueur utilisé est du nitrate d'argent. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les fragments d'ADN sont séparés selon l'étape c) par électrophorèse sur gel.