Brevet FR2766478A1 — publié le 19990129

L'invention concerne des microrganismes capables de dégrader l'éthyl-tert-butyl éther. Elle s'applique particulièrement à l'industrie du traitement de l'eau. Il est connu que l'éthyl-tert-butyl éther-désigné ci-après sous le terme d'ETBEest un des éthers qui peut être utilisé comme additif oxygéné dans les essences sans plomb dans le but d'augmenter leur indice d'octane. L'utilisation croissante d'additifs comme l'ETBE entraine des volumes importants stockés et transportés, en mélange dans les essences notamment. Il est donc nécessaire de connaitre le devenir de ce composé en cas de déversement accidentel conduisant à une pollution des sols et des eaux souterraines ou de surface. L'ETBE est un éther produit par condensation de l'éthanol sur l'isobutène. Sa structure, qui comporte une liaison éther ainsi qu'un carbone tertiaire, est de nature à le rendre résistant à la biodégradation par les microorganismes présents dans l'environnement. La littérature récente relative à la biodégradation des éthers d'alkyle utilisés dans les essences indique que le métabolisme de ces composés dans l'environnement n'est pas un phénomène commun et qu'il est relativement lent, tant en conditions aérobies qu'anaérobies (Salanitro J.P., 1995, "Understanding the limitations of microbial metabolism of ethers used as fuel octane enhancers". Curr.Op.Biotechnol.,4:337-340). On n'a jamais isolé des bactéries possédant une capacité de dégradation de l'ETBE. Il ressort de ces attendus qu'il est nécessaire de trouver et d'identifier des microorganismes capables de biodégrader l'ETBE et d'étudier leur mise en oeuvre dans des procédés de traitement de l'eau permettant d'abaisser significativement les concentrations résiduelles en ETBE d'eaux résiduaires urbaines ou industrielles ou de nappes aquifères contaminées, désignées sous le nom général d'effluents, contaminées par ce produit. On a découvert des nouvelles bactéries permettant de dégrader l'ETBE en solution dans l'eau. Un des objectifs de l'invention est de décrire un procédé qui met en oeuvre ces nouvelles bactéries dans le but de dégrader l'ETBE contenu en solution dans l'eau, afin qu'il soit utilisé pour le traitement des eaux polluées. De manière plus détaillée, I'invention concerne deux nouvelles souches bactériennes, isolées de l'environnement, qui sont capables de dégrader l'ETBE de façon disjointe ou conjointe. Ces nouvelles bactéries déposées à l'institut Pasteur (CNCM de l'institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15) sont Gordona terrae CIP I-1889 et Rhodococcus equi CIP I-1890. Le procédé découlant de la mise en oeuvre de ces deux nouvelles bactéries séparément ou conjointement est applicable pour traiter des effluents pollués par de l'ETBE de manière à ce que la concentration en ETBE dans les rejets soit compatible avec les normes en vigueur. Le détail des caractères d'espèces est décrit dans l'exemple 3; chacune des deux bactéries est conforme aux caractéristiques de son espèce. Ces nouvelles bactéries ont été isolées de boues activées collectées à une station d'épuration d'eaux résiduaires urbaines, qui ont été traitées selon des techniques d'enrichissement en microrganismes spécifiques. Les souches bactériennes résultantes sont isolées après enrichissement spécifique sur ETBE et testées en culture pure pour leur capacité à dégrader l'ETBE. Dans ces expérimentations, il faut noter que l'ETBE peut être fourni comme seule source de carbone mais d'autres sources de carbone à une concentration comprise entre 10 et 50 g/I de milieu peuvent être rajoutées comme le glucose, le saccharose, le glycérol ou la tryptone au cours de la culture de l'une ou des deux nouvelles bactéries. Des concentrations en ETBE jusqu'à 1500 mg/L, par exemple de 10 à 1000 mg/L et de manière préférée de 50 à 400 mg/L, sont dégradées par les nouvelles bactéries à des taux pouvant aller jusqu'à 100% pour des teneurs en ETBE notamment comprises entre 50 et 400 mg/L. Ceci suggère que la mise en oeuvre d'un réacteur pour dépolluer des effluents contenant de l'ETBE peut éventuellement comprendre une étape de dilution pour obtenir la concentration acceptée par les nouvelles bactéries. Dans ces conditions de concentration, les nouvelles bactéries sont capables de dégrader l'ETBE de façon notable c'est-à-dire de 20% à 100% sur des périodes de temps inférieures à 200 heures et généralement comprises entre 50 et 150 heures. La mise en oeuvre de ces bactéries pour le traitement d'effluents pollués par de l'ETBE peut être réalisée de la manière suivante: par exemple dans un biofiltre où les bactéries sont fixées sur un support minéral ou organique ou bien elles peuvent être ajoutées comme inoculum à des boues de station d'épuration. Le débit d'effluents contenant l'ETBE traités dans le biofiltre peut être compris entre 0,03 et 7 L/L de biofiltre par heure, avantageusement 0,1 et 4 L/L de biofiltre par heure et préférentiellement 0,3 à 2 L/L de biofiltre par heure. EXEMPLE I La méthode d'isolement de bactéries utilisée constitue un point important pour l'obtention des nouvelles bactéries. Des échantillons de boues activées ont été prélevés dans l'usine de traitement des eaux usées d'Achères (Yvelines, 78) et inoculés dans une fiole à une concentration en matière sèche de l'ordre de 300 mg/L dans un réacteur respirométrique (Sapromat, Voith, Allemagne) permettant de mesurer en continu la demande en oxygène de la culture sur le milieu salin suivant: -KH2PO4 .. .85 mg -K2HP04..... .....217,5 mg -Na2HPO4, 2H20 334 mg -NH4Cl.... ....5 mg -MgS04,7H20.... ...22,5mg -CaCl2,2H20.... . .36,4 mg -FeCl3,6H20.... 0,25 mg -H2Oq.s.p.1 Iitre et dans lequel on rajoute de l'ETBE à la concentration finale de 100 mg/L. En parallèle, une fiole ne contenant pas d'ETBE est également incubée afin de mesurer la demande en oxygène de la microflore introduite qui correspond à la respiration liée à la dégradation des matières organiques en suspension dans les boues activées. C'est en comparant les courbes de demande en oxygène des deux types de fioles qu'on peut juger de la consommation de l'ETBE. Le calcul de la demande théorique en oxygène (D.Th.O.) est effectué sur la base de la quantité d'ETBE ajouté et permet de déterminer quand la consommation est totale, sachant que la D.Th.O. pour 1 mg d'ETBE est de 2,82 mg d'oxygène. On ajoute alors un nouvel aliquot d'ETBE dont on suit la consommation. Cette opération est répétée 3 fois au total. Au terme de ces opérations, un prélèvement de la microflore sélectionnée est effectué et les souches présentes sont isolées de façon classique par étalement sur un milieu solide complet dont la composition est la suivante: -Bacto-tryptone 1 0g -Extrait de levure Sg -NaCl.... ....5g -Glucose .... ....1g -Bacto-Agar 20g -H2O.... ....q.s.p.1 litre Les différentes souches bactériennes sont purifiées et sont testées pour leur capacité à dégrader 1'ETBE. Deux nouvelles bactéries CIP I-1889 et CIP I-1890 ainsi isolées se sont avérées capables de dégrader 1'ETBE et ont alors été identifiées. EXEMPLE 2 Le milieu suivant est utilisé pour cultiver les bactéries: -KH2PO4 . ....85 mg -K2HPO4 ....217,5 mg -Na2HPO4, 2H20 334 mg -NH4Cl . '.5 mg -MgSO4, 7H20 ....22,5 mg -CaC12, 2H2O... ....36,4 mg -FeC13, 6H20 .......0,25 mg -H20. ....q.s.p.1 litre pH=6,8 Chaque bactérie est ensemencée dans une fiole de ce milieu dans lequel on rajoute l'ETBE à la concentration finale de 100 mg/L. Les cultures sont incubées à 30 C. Les concentrations résiduelles en ETBE sont déterminées de la façon suivante: Un échantillon de culture est prélevé et injecté sur un appareil de chromatographie à phase gazeuse (CPG) équipé d'un intégrateur calculant les concentrations résiduelles par intégration de la surface des différents pics obtenus sur les chromatogrammes. Les résultats obtenus sont illustrés dans le Tableau 1. TABLEAU I Capacité de dégradation de l'ETBE des nouvelles bactéries N" d'expérience Bactérie testée | % d'ETBE dégradé Durée Bactérie CIP I-1889 100% 50 heures 2 Bactérie CIP 1-1890 100% 150 heures EXEMPLE 3 Les bactéries isolées qui dégradent l'ETBE ont été soumises à l'examen morphologique du microscope optique, à la coloration de Gram, à différents tests biochimiques et identifiées selon les méthodes de classification du "Bergey's Manual for Determinative Bacteriology". Les résultats de l'ensemble des tests biochimiques sont résumés dans le Tableau 2. TABLEAU 2 Caractères dridentification des nouvelles bactéries Caractères conventionnels Bactérie CIP I-1889 Bactérie CIP I-1890 étudiés Catalase positif positif Oxydase négatif Nitrate réductase positif positif Nitrite réductase négatif négatif Urée positif positif Hydrolyse de l'ONPG négatif Citrate de Simmons négatif négatif Esculine négatif positif Pyrazinamidase positif faiblement positif Amylase positif négatif Protéolyse négatif négatif DNase négatif faiblement positif Tween 80 estérase positif négatif Pyrrolidonyl arylamydase positif Phosphatase alcaline faiblement positif Réaction de Voges négatif Proskauer - : caractère non déterminé. Pour compléter l'identification de la bactérie CIP I-1889, une analyse de la croissance sur divers sucres a été réalisée (Tableau 3). TABLEAU 3 Croissance sur sucre de la bactérie CIP 1-1889 Sucre testé Croissance de la bactérie CIP I-1889 D-Glucose positive Saccharose positive Glycérol positive D-Fructose positive D-Mannose positive Mannitol faiblement positive Sorbitol faiblement positive Maltose faiblement positive Tréhalose faiblement positive Xylitol positive Raffinose positive D-Turanose positive D-Lyxose faiblement positive D-Fucose faiblement positive L-Fucose positive D-Arabitol positive L-Arabitol faiblement positive Inositol négative Rhamnose négative Cellobiose négative Galactose négative La bactérie CIP I-1889 qui est un bacille aérobie strict à Gram positif, coryneforme, immobile, ne ramifiant pas et formant sur boite de milieu nutritif ordinaire des colonies colorées par un pigment orange vif, a été identifiée comme une souche de Gordona terrae. La bactérie CIP I-1890 qui est un bacille aérobie strict à Gram positif, coryneforme, immobile, ramifiant et formant sur boite de milieu nutritif ordinaire des colonies colorées par un pigment rose pâle a été identifiée comme une souche de Rhodococcus equl. EXEMPLE 4 La souche Gordona terrae CIP I-1889 est cultivée sur 2L du milieu complet suivant: -Bacto-tryptone 1 0g -Extrait de levure 5g -NaCI.... -Glucose.... . -H20 q.s.p.l litre sous agitation à 30"C, pendant 48 heures. Les cellules sont collectées par centrifugation puis introduites sur un système de biofiltre percolant de 3L. Le biofiltre contient 3 L d'un lit fixe constitué d'un matériau poreux qui peut être de nature variée minérale ou organique et qui, dans l'exemple présenté, est constitué de pierre ponce. Ce matériau constitue le support sur lequel se fixent et se développent les bactéries dégradant l'ETBE. Lorsque l'ensemencement du support est réalisé, il contient une biomasse immobilisée d'environ lg/L. On alimente alors par le haut le biofiltre, qui est maintenu à une température de 20"C, avec un effluent aqueux synthétique qui percole à travers le lit de bactéries immobilisées et qui contient les sels suivants: -KH2PO4 ........... 85 mg -K2HP04 .............. 217,5 mg -Na2HP04, 2H20 334 mg -NH4Cl .......... 5 mg -MgSO4, 7H20 ..... 22,5 mg -CaC12, 2H20 .... 36,4 mg -FeC13, 6H20 .... 0,25 mg -H2O.... ....q.s.p.1 litre ainsi que de l'ETBE à une concentration comprise entre 100 et 200 mg/L. Le débit d'injection est compris entre 0,3 et 0,6 L/L de biofiltre par heure. Une pompe de recirculation du liquide prélevé en fond de biofiltre et recyclé par le haut permet de varier le débit de percolation indépendamment de l'alimentation en effluent. L'aération est assurée par une circulation d'air ascendante à travers le support. Dans l'exemple présenté, le débit d'aération est compris entre 0,5 et 2 L/L de biofiltre par heure. Un évent permet d'évacuer les gaz du biofiltre et l'effluent traité est soutiré en fond du biofiltre. L'ETBE est dosé par chromatographie en phase gazeuse en entrée et en sortie de biofiltre et cela permet de calculer le pourcentage d'ETBE dégradé qui est typiquement de 100%. REVENDICATIONS 1) Procédé de traitement d'effluents aqueux contenant de l'éthyl-tert-butyl éther (ETBE) afin de réduire la concentration en ETBE, caractérisé en ce qu'on fait croître en présence des dits effluents au moins une bactérie choisie dans le groupe formé par Gordona terrae CIP I-1889 et Rhodococcus equi CIP I-1890. 2) Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite bactérie est préalablement sélectionnée dans une boue activée avant d'être ensemencée en présence dudit effluent contenant de l'ETBE. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel la concentration en ETBE de l'effluent est au plus égale à 1500 mg/L. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la concentration en ETBE de l'effluent est comprise entre 50 et 400 mg/L. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on fait développer ladite bactérie sur un système de biofiltre de volume adéquat, on introduit l'effluent contenant l'ETBE dans le biofiltre à un débit d'alimentation de 0,03 à 7 L/L de biofiltre et par heure et on soutire l'effluent débarrassé au moins en partie de l'ETBE.