Brevet FR2760757A1 — publié le 19980918

PROCEDE DE DEPOLYMERISATION D'ALGINATE ET FRAGMENTS D'ALGINATE AINSI OBTENUS La présente invention concerne un procédé de dépolymérisation d'alginatc. Elle concerne également les fragments d'aiginate obtenus conformément à ce procédé. L'alginate est un polysaccharide présent notamment dans les algues brunes et dans certaines bactéries. Il s'agit d'une famille de composés linéaires constitués de copolymèrcs d'acide ss-D-mannuronique et d'acide a-L-guluronique liés en 1-4. Il est communément admis que la molécule d'alginate se présente sous la forme de blocs homogènes polymannuronates (poly M), polyguluronates (poly G), et/ou de blocs mixtes (poly MG). Du fait de ses propriétés intéressantes, à savoir épaississante, stabilisantc et gélifiante, L'alginate a trouvé des applications dans de nombreux domaines dont, notamment, le secteur agro-alimentaire. De plus, de nombreuses alginases, enzymes présentant la spécificité de dégrader l'alginate ont été décrites et isolées à partir de mollusques marins, de bactéries ou d'algues. Elles sont de type alginate-lyase, ce qui signifie qu'elles dépolymérisent l'alginate par une réaction de ss-élimination. En d'autrcs termes, la réaction produit un résidu insaturé à l'extrémité non-réductrice de la liaison coupéc. Ces alginate-lyases peuvent donc être utilisées pour l'élimination d'alginate employé de façon transitoire dans des procédés industriels, notamment dans l'industrie textile. En effet, les alginates sont utilisés comme épaississants des pâtes d'impression ou comme agents d'encollage dc fils avant tissage, ou encore comme agent d'apprêt pour la finition des tissus. Après tissagc, le tissu doit subir un désencollage pour éliminer les alginates, qui peut être réalisé par traitement avec des alginates-lyases. Une autre application potentielle des alginates-lyases est celle dans laqucllc on recherchc à éliminer les alginates utilisés comme épaississants dans des formulations de colorants pour tissus. Encore une autre application potentielle est celle de la lutte contre le "fouling" dans des circuits de refroidissement, notamment de centrales nucléaires, c'està-dire contre le développement de populations bactériennes et micro-algales. Enfin, une autre application de ces alginate-lyases consiste à transformer les alginates de haut poids moléculaire en saccharides de degré de polymérisation inférieur, jusqu'à obtention d'oligosaccharides spécifiques. Par oligosaccharides, on entend des saccharides d'unités monomères M et/ou G, dont le degré dc polymérisation est compris entre 2 et 20. En effet, des travaux ont montré que certaines de ces fractions oligo alginiques avaient des effets bénéfiques sur la flore intestinale, via un effet "bifidogène" semblable à celui qui est déjà connu pour les oligofructosaceharides. En outre, certaines fractions d'oligosaccharides d'alginate ont des effets éliciteurs qui présentent un intérêt dans le domaine de la protection des végétaux. Par ailleurs, des oligosaccharides peuvent également être utilisés pour être introduits dans des préparations cosmétiques. Cependant, quellc que soit l'application envisagéc, on se heurtc à la spécificité des alginate-lyases. Certaines, de type guluronate-lyases, s'avèrent incapables de dégrader les segments poly M. D'autres, de type mannuronate-lyases sont incapables de dégrader les segments poly G. Par conséquent, dès lors que l'on souhaite obtenir les deux activités, par exemple pour réduire le degré de polymérisation moyen du milieu dans lequel est présent l'alginate, il est nécessaire d'utiliser les deux types d'enzyme. On comprend que ceci entraîne inévitablement une complication du processus de dépolymérisation de l'alginate et, bien entendu un surcoût. La présente invention ajustement pour but de pallier ces inconvénients. En d'autres termes, elle a pour but de proposer un procédé de dépolymérisation d'alginate, qui permet d'obtenir aussi bien des fractions formées strictemcnt d'unités mannuronates ou guluronnates que des fractions mixtes. Ainsi, le procédé de l'invention de dépolymérisation d'alginatc consiste à mettre de l'alginate à incuber dans une solution contenant au moins un sel mono- ou divalent à une force ionique au moins égale à 0,05 M, en présence d'une alginate-lyase produite à partir d'une souche de bactérie Pseudomonas alginovora, et, éventuellement, à récupérer la fraction dc fragments d'alginate dépolymérisé obtenus. Dans ces conditions, I'alginate-lyasc dégrade aussi bien les segments poly G, poly M que poly MG de l'alginate. Par ailleurs, selon d'autres caractéristiques avantageuses mais non limitatives de ce procédé: - le pH de la solution est de l'ordre de 7,5; - I'alginate-lyase se présente sous forme sèche ou liquide et dans ce dernier cas, ledit liquide consiste en l'enzyme solubilisée dans une solution tampon à pH 7,5 dc trishydroxyméthylami nométhane (2-amino-2-hydroxyméthyl -1,3 -propanediol) et de chlorure de sodium; - on utilise de 0,1 à 5 % en poids d'enzyme par rapport au poids d'alginate; - on laisse incuber pendant 2 à 20 heures - on laisse incuber pendant 8 heures environ - la solution contenant au moins un sel mono- ou divalent est tamponnée, par exemple avec du trishydroxyméthylaminométhane; - le sel consiste en un chlorure ou en un sulfate - Ic chlorure consiste en un chlorure de sodium ou en un chlorure de magnésium hexahydraté; - le procédé est mis en oeuvre dans le cadre de la production d'oligosaccharides; - le procédé est mis en oeuvre dans le cadre de la réduction de la viscosité d'un milieu contenant de l'alginate; - le procédé est mis en oeuvre dans le cadre de l'extraction des fucanes d'algues brunes. L'invention concerne également les fragments d'alginate dépolymérisé obtenus conformément à ce procédé. Le demandeur a donc mis en évidence qu'en soumettant un alginate à l'action d'une alginate-lyase particulierc dans des conditions d'incubation spécifiques, on arrive à obtenir des fragments de masses moléculaires variées, l'alginate-l yase ayant une action M-lyase, ou M-lyase et G-lyasc. L'alginate-lyase dont il s'agit est celle obtenue à partir dc Pseudomonas alginovora. De manière particulièrement préférée, cette lyasc obtenue à partir de la souche de Pseudomonas alginovora deposée à l'Institut Pasteur Paris sous le n" CIP 102 941, laquelle a été repiquéc un certain nombre de fois. Une telle alginate-lyase est disponible auprès de la demanderesse sous la référence AL 951. Elle présente les paramètres suivants: - Présentation: sous forme sèche, poudre de coulcur crème - Activité:1 000 000 U/g - Qualité microbiologique: FT levures et moisissures -Stabilité: supérieure à 6 mois à- 20 C; - Stabilité après solubilisation: supérieure à 7jours à 22 C; - Conditions d'utilisation: pH: 6,5 à 8,5 température: ambiante; force ionique: 0,1 à 0,5 M. L'activité alginate-lyase est mesurée par l'augmentation de la densité optique à 235 nm grâce à la conjugaison entre la double liaison (formée lors dc la réaction dc 13-élimination) et Ic groupement carboxylique. De façon pratiquc, l'activité alginate lyase est mesurée en incubant 10 à 100 microlitres de préparation enzymatique dans deux millilitres de solution de substrat (à 22"C et à pH 7,5) contenant: - de L'alginate de sodium à 0,5 % (poids/volume) - du chlorure de magnésium hexahydraté à 6.67.10-2 moles/litre (soit une force ionique égale à 0,2 moles/litre) - du trishydroxyméthylaminométhane: 20.10-3 moles/litrc. La préparation enzymatique est réalisée en solubilisant l'enzyme sous forme sèche à 10 grammes/litre dans une solution tampon (trishydroxyméthylaminométhane: 20.10-3 moles/litre, chlorure de sodium 2 moles/litre, pH 7,5). L'unité d'activité arbitraire notée UA correspond à l'augmentation d'une unité dc densité optique à 235 nanomètres en une minute dans le milieu réactionncl. Le coefficient d'extinction molaire des acides uroniques insaturés étant de 5 050 litre/mole/centimètre, l'unité arbitraire (UA) équivaut à 396. 10-9 moles de coupures/minute. L'unité alginate lyase (notée U) est exprimée en nanomoles de coupures/minute (1U = 10-9 moles de coupures/minute). Les Pseudomonas sont des bactéries Gram (-) qui se présentent sous forme de bâtonnets trapus à extrémités arrondies et qui portent un ou plusieurs flagelles polaircs caractéristiques des Pseudomonas. La souche CIP 102 941 de Pseudomonas alginovora a été isoléc de frondes de Laminaria digitata cn décomposition. Cette bactérie marine est aérobie strictc. Elles poussent cn colonies rondes, convexes, de couleur crème allant au brun foncé lorsque la colonie vieillit. A l'état frais, la mobilité de la souche est duc à un flagelle polaire monotriche. Celle-ci ne produit pas de spores. Comme indiqué plus haut, la production d'alginate-lyases (EC 4.2.2.3.) préférée est obtenue par culture immergée en batch de Pseudomonas alginovora CIP 102941. Le milieu de culture de I 'alginate-lyase comprend: - une source d'azote: protéine de pommes de terre; - une source de carbone: dextrose monohydraté standard; - un extrait de levure - de l'eau de mer filtrée à 1 micromètre - un anti mousse: huile de soja. Le pH est ajusté à 8,2 avant l'autoclavage. Le fait que l'alginate ne soit pas indispensable pour la production de l'enzyme et puisse être remplacé par une autre source de carbone indique que l'alginatelyase est constitutive. La production d'alginate-lyase est effectuée en fermentcur (de 2 à 20 litres), l'inoculum représentant 1 à 5 % du volume du fcrmenteur. L'arrêt de la fermentation est réalisé après 10 à 20 heures de croissance, selon la taille de l'inoculum. Pour procéder à la récupération de l'enzyme, on procède en trois étapes: - étape 1: centrifugation et microfiltration sur filtres à 1,6 micromètres, ou microfiltration à 0,45 micromètres ; à ce stade, une microfiltration à 0,2 microns peut être réalisée (non obligatoire); - étape 2: concentration 10 fois du volume de fermentation par ultrafiltration sur membrane à 8000 ou 10 000 Dalton; - étape 3: lyophilisation. Le produit enzymatique final est conservé à -20"C. I - Production de fragments d'alginate utilisables comme oligosaccharides: Exemple 1 1,25 grammes d'alginate de sodium de Laminaria digitata sont placés dans 250 millilitres de solution à pH 7,5 contenant 20. 10-3 moles/litre de tampon trishydroxyméthylaminométhane ct 6,67.10-2 moles/litrc de chlorure dc magnésium hexahydraté, ce qui correspond à une force ionique de 0,2 M. Cette préparation est mise à incuber dans 6,25 millilitres dc préparation enzymatique. Cette dernière contient 5% en poids d'enzyme par rapport au poids d'alginate, soit 62,5mg (ou 66 000 U). La préparation contient une solution tampon à pH 7,5 contenant 20.10-3 moles/litre de trishydroxyméthylaminométhane et 2 moles/litres de chlorure de sodium. Bien entendu, le sel contenu dans la préparation liquide d'enzyme n'est pas forcément le même que celui ajouté à l'alginate. Par ailleurs, des sels mono- ou divalents, autres que les chlorures, peuvent être employés. Il peut s'agir par exemple de sulfates. L'incubation enzymatique est réalisée à 250C sous agitation magnétique avant d'êtrc arrêtée par baisse dc pH à 6,5 ct traitement thermique une heure à 100"C. Lc produit obtenu est ensuite centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes à température ambiante avant d'être filtré sur tamis à 0,22 zm. Un premier fractionnement est réalisé sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique en polyacrylamide (45-90 micromètres) (colonne 1 mètre x 4,5 centimètres). Les fragments d'alginate sont élués isocratiquement avec du nitrate dc sodium (5.10-2 moles/litre) et de l'azoture de sodium (0,2 %). Le système comprend, en outre, une pompe délivrant un débit de 90 millilitres/heure, un détecteur réfractométrique et un enregistreur. Les fractions sont récupérées avec un collecteur. Exemple 2 On répète les étapes décrites à l'exemple 1, mais en utilisant cette fois-ci 1 % en poids d'enzyme par rapport au poids d'alginate (qui reste inchangé), soit 12,5 milligrammes (13 200 U). Exemple 3 On répète à nouveau les étapes de l'exemple 1, mais en utilisant 0,t C7c en poids d'enzyme par rapport au poids d'alginate (toujours inchangé), soit 1,25 milligrammes (1 320 U). Analyse des produits obtenus conformément aux exemples 1 à 3 Une étudc de l'évolution des degrés de polymérisation moyen des produits formés en fonction de la quantité d'enzyme ajoutée et du temps d'incubation a été réalisée. Comme cela est bien connu, le degré de polymérisation moyen peut se calculer à partir de la densité optique du produit à 235 nanomètres. Une unité dc densité optique équivaut à la présence de 1,98 x 10-4 moles/libre de produits insaturés. Le rapport concentration initiale en alginate/concentration en produits insaturés correspond au degré de polymérisation moyen. Cette étude montre que quelle que soit la concentration de l'enzyme ajoutéc, le degré de polymérisation chute rapidement, ce qui confirme le comportement endolytiquc dc l'enzyme. A 5 Gc d'enzyme et au terme de 2 heures d'incubation, I'ensemble des polysaccharides est dégradé et les fragments produits sont, au plus de degré 10 (degré dc polymérisation moyen). Ces degrés de polymérisation sont inférieurs et égaux à 6 et 5 respectivement au terme de 8 et 20 heures d'incubation. En pratique, la réaction enzymatique peut être considéréc comme globalement terminée au terme de 8 heures d'incubation, les fragments produits étant majoritairement de degré de polymérisation 3 et 4. A 1 % d'enzyme, une dégradation d'une heure est insuffisante pour dépolymériser l'ensemble des hautes masses. Une incubation de 20 heures est nécessaire pour produire des fragments de degré de polymérisation moyen dc l'ordre de 4. II - Nature des fragments produits: On notera que les fragments étudiés ci-dessous sont ceux produits par incubation à 5 % d'enzyme. Un deuxième fractionnement est nécessaire car chaque fraction correspond à un mélange de fragments. Les fractions collectées lors du premier fractionnement sont d'abord dessalces sur une colonne en polymère d'éthylèneglycol et de méthacrylate (30-60 micrometrcs) avant d'être purifiées sur une colonne échangeuse d'anions seml-prcparativc (colonne chromatographique constituée d'une phasc ammonium quaternaire sur silice (5 micromètrcs)). L'élution est isocratiquc (nitratc dc sodium, débit de la pompe : 0,8 millilitres/heure), la concentration de l'éluant étant de 0,12 moles/litre pour les fragments de degré de polymérisation 4 ct 5. Les fractions sont à nouveau collectécs et dessalécs. Les fragments "purifiés" sont analysés: - en chromatographie liquide haute performance (colonne chromatographique constituée d'une phase ammonium quaternaire sur silice (5 micromètres), éluant nitrate de sodium 0,12 moles/litre pour les oligosaccharides de degré de polymérisation 2 et 3, 0,15 moles/litre pour les oligosaccharides de degré de polymérisation 4 et 5); - en résonance magnétique nucléaire. La structure des fragments d'alginate a pu être détcrminée de façon relativement précise jusqu'à des fragments de degré de polymérisation 4. Les molécules sont données selon le modèlc AX où - A représente l'unité possédant une fonction insaturée, qui est la même, que l'alginate-lyasc ait coupé un bloc poly M, poly G ou poly MG. Elle présente la formule suivante: qui résulte de l'action de l'alginate-lyase sur les blocs M et G suivants: AX étant l'acide 4-désoxy-L-érythro-5-hexose-ulasc-uroniquc. - X représente une unité uronique (X = M pour l'acide mannuroniquc, X = G pour l'acide guluronique). L'unitc uroniquc sc trouvant à droite de la molécule possède une fonction réductrice. Le degré de polymérisation de la molécule représentée AX est ici de 2. Les structurcs des fragments produits mises en évidence sont données dans le tableau ci-dessous. Degré de polymérisation Structure mise en évidence 2 AM AG 3 3 AGG AMM AMG 4 AGGG AMGG AGGM AMGM AMMM III - Mode de fonctionnement de l'enzyme: La mise cn évidence d'oligosaccharides de type AGG, AGGG, AMM, AMGM ct AMMM révèle que l'enzyme AL 951 utilisée en présence dc sel(s) mono- ou divalent(s) coupe à la fois les blocs polymannuronates et polyguluronates, y compris les blocs mixtes. Deux activités sont donc présentes : une activité M-lyasc (rupture de la liaison M-M) et une activité G-lyase (rupture de la liaison G-G). IV - Utilisation de l'alginate-lyase pour réduire la viscosité d'une solution d'alginate: L'alginate-lyase peut être mise en oeuvre comme auxiliaire technologique pour abaisser rapidement la viscosité d'extraits contenant de l'alginatc. Ainsi, des tests sont réalisés sur un alginate de sodium solubilisé à 0,4 % (poids/volume) dans une solution tampon à pH 7,5 contenant du trishydroxyméthylaminoe méthane à 10. 10-3 moles/litre, et du chlorure de sodium à 0,1 mole/litre. L'enzyme est additionnéc à trois teneurs différentes (0,1; 1; 10 % poids/poids). La baisse de viscosité est suivie directement dans le corps de mesure d'un viscosimètrc selon un programme de mesure de la viscosité en fonction du temps à un gradicnt de vitesse égal à 200 s-1. La température est maintenue à 220C. Les résultats montrent, que pour les trois essais, la chute de viscosité est rapide (abaissement dc 30 à 80 % de la viscosité initiale apparentc cn quelques minutes), cc qui confirmc bien que l'alginate-lyase est une endolyasc (coupc au sein de la molécule d'alginate). V - Utilisation de l'alinate-lvase comme auxiliaire industriel pour l'extraction des fucanes L'alginate-lyase constituc un outil tcchnologiquc intéressant pour améliorer les rendements d'extraction des fucanes, polysaccharides pariétaux complexes des algues brunes présentant des propriétés anticoagulantes et antithrombiques. Les procédés d'extraction par voie aqueuse déjà connus aboutissent à des rendements faibles (2 à 3 % de la matière algale) alors que les teneurs en fucanes varient entre 15 et 25 % de la masse de l'algue. Pour améliorer les rendements d'extraction, I'idée est de solubiliser les alginates contenus dans les parois pour extraire conjointement les fucanes. La mise en oeuvre de l'alginate-lyase selon le procédé conforme à l'invention présente un double intérêt: - réduction de la viscosité de la solution et donc traitement ultéricur dc l'extrait techniquement facilité; - amélioration des rendements d'extraction. On obtient ainsi des rendements de 15 à 24 Go selon des essais, ce qui améliore significativement les résultats obtenus par la voie classique. La méthode d'extraction comportc différentes étapes: 1) Fabrication d'une farine finement broyée à partir d'Ascophyllum nodosum; 2) Mise en solution de la farine à 5 % 3) Solubilisation des alginates par: - lixiviation Cette étape consiste à faire macérer les algues en milieu acide afin de transformer les alginates d'ions divalents en acide alginique. Un mélange à 5 % en algues est réalisé à partir de la farine placée dans une solution d'acide sulfurique à 0,1 mole/litre pendant 2 heures sous agitation. -Ajout d'un séquestrant des ions calcium et ajustement de pH à 7,5. 17 % d'acide citrique (par rapport à la masse d'algues sèches) sont ajoutés au milieu acide. Le pH de la suspension est ajusté à pH 7,5 par ajout d'une solution d'hydroxyde de sodium. L'alginate passe alors sous une forme soluble. Les ions calcium sont séquestrés par Ic citrate de sodium. 4) Dépolymérisation des alginates: L'enzyme sous forme lyophilisée est préalablement solubilisée dans un tampon (trishydrométhylaminométhane à 20.10-3 moles/litre, chlorure de sodium à 2 moles/litrc, pH 7,5) puis est additionnée à raison d'un rapport enzyme/algue variant de 1 à 5 %. La réaction se déroule à pH 7,5 ct 250C. Elle est suivie jusqu'à 24 heures. L'extrait obtenu est très visqucux en raison dc la présence de l'alginate. Cette forte viscosité rend techniquement difficile le traitement ultérieur dc la solution pour extraire les fucanes. L'addition d'alginate-lyase présente un intérêt puisqu'elle permet une réduction importante de la viscosité de l'extrait. La baisse de viscosité est observée pour un rapport enzyme/algue de 1 %. On observe que la chute de viscosité de l'extrait est très rapide. Au terme de 4 heures de réaction, la viscosité correspond à environ 12 % dc la valeur initiale. Le test est réalisé sur un viscosimètre selon un programme de mesure dc la viscosité cn fonction du temps à un gradient de vitesse égal à 1 350 s- 5) Arrêt de la réaction par acidification à pH 4 (addition d'acide chlorhydnque l mole/l) et incubation 20 minutes à 850C. 6) Centrifugation de l'extrait obtenu et récupération du surnageant qui contient principalement les fucanes et les alginates dépolymérisés. 7) Précipitation des alginates non dépolymérisés résiduels de l'extrait par traitement au chlorure de calcium anhydre. 8) Centrifugation de l'extrait t et récupération du surnageant. 9) Purification de l'extrait par dialyse sur mcmbrance à seuil de coupure 3 500 Dalton ou par ultrafiltration sur membrane à 30 000 Dalton. 10) Lyophilisation de l'extrait final. Le lyophilisat final a ensuite été caractérisé par: - le dosage des fucoses ("oses" majoritairement constitutifs des fucanes) - le dosage de sulfates; - I'évaluation de la teneur en macromolécules en fin de purification. Elles sont essentiellement constituées de fucanes; La caractérisation du lyophilisat final a permis d'obtenir selon les différents essais (pourcentage d'enzyme, temps d'incubation) des rendements en macromolécules de 15 à 24 %. Les rendements obtenus sont donc meilleurs que ceux atteints par les méthodes actuelles qui sont de 2 à 3 Go. REVENDICATIONS 1. Procédé de dépolymérisation d'alginate qui consiste à mettre de l'alginate à incuber dans une solution contenant au moins un sel mono- ou divalent à une force ionique au moins égale à 0,05 M, en présence d'une alginate-lyase produite à partir d'une souche de bactérie Pseudomonas alginovora, ct éventuellement, à récupérer la fraction de fragments d'alginate dépolymérisé obtenus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le pH de la solution est de l'ordre de 7,5. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que. I'alginate-lyase se présente sous forme sèche ou liquide et que dans ce dernier cas, ledit liquide consiste en l'enzyme solubilisée dans une solution tampon à pH 7,5 de trishydroxyméthylaminométhane (2-amino-2-hydroxyméthyl- 1,3-propanediol) et de chlorure de sodium. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé par le fait que l'on utilise de 0,1 à 5 % en poids d'enzyme par rapport au poids d'alginate. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'on laisse incuber pendant 2 à 20 heures. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on laisse incuber pendant 8 heures environ. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la solution contenant au moins un sel mono- ou divalent est tamponnée, par exemple avec du trishydroxyméthylaminométhane. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que le sel consiste cn un chlorure ou en un sulfate. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par Ic fait que Ic chlorure consiste cn un chlorure de sodium ou cn un chlorure de magnésium hexahydraté. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans le cadre de la production d'oligosaccharides. Il. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans Ic cadre de la réduction dc la viscosité d'un milieu contenant de l'alginate. 12. Procédé d'alginate selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait qu'il est mis en oeuvre dans le cadre de l'extraction des fucanes d'algues brunes. 1 3. Fragments d'alginate dépolymérisé obtenus conformément au procédé selon l'une des revendications 1 à 12.