Brevet FR2771640A1 — publié le 19990604

La présente demande a pour objet des micelles mixtes de lipopeptides pour l'induction d'une réponse immunitaire. Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces micelles à des fins thérapeutiques. II existe deux types de réponse immunitaire effectrice: la réponse humorale due aux anticorps, et la réponse cytotoxique due aux lymphocytes TCD8+. Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), en association avec les molécules de classe I du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (MHC), mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ (HTL) en association avec les molécules de classe Il du MHC. L'utilisation de lipopeptides pour l'induction d'une réponse cytotoxique, c'est-à-dire la génération in vivo de lymphocytes T cytotoxiques a déjà été décrite. En particulier, la demande FR-90 15 870 publiée sous le n"2 670 787 (Institut Pasteur de Lille, Institut Pasteur, INSERM) décrit des lipopeptides constitués d'une partie peptidique comprenant de 10 à 40 acides aminés et d'une partie lipidique qui peut être dérivée d'acides gras ou de groupements stéroïdes. Ces lipopeptides montrent une bonne aptitude à induire une réponse cytotoxique. II convenait cependant de les rendre capables d'induire une réponse de meilleure qualité par l'adjonction d'une réponse T auxiliaire dont on sait l'importance pour l'induction efficace et le maintien de la réponse cytotoxique. II convenait en outre de les rendre capable d'induire une réponse chez le plus grand nombre d'individus. BOURGAULT et al. (1994,J. Immunol., 2530-2537) ont induit une réponse CTL et HTL à partir de mélange de lipopeptides, sous la forme d'une émulsion avec un adjuvant huileux. Néanmoins, il était nécessaire d'ajouter de l'adjuvant incomplet de Freund (I FA). L'immunogénicité de la préparation vaccinale utilisée impliquait nécessairement la co-présentation fonctionnelle des motifs HTL et CTL situés dans un ou plusieurs lipopeptides du mélange. Cependant, l'efficacité de la co-présentation des différents motifs impliqués dépendait de l'association avec l'adjuvant Incomplet de Freund au sein d'une émulsion très fine. Un article au nom de VITIELLO et al. (1995, J. Clin. Invest., 95, 341-349) évoque la possibilité d'induire une réponse CTL dans une population humaine sélectionnée (HLA-A2) en utilisant un lipopeptide comportant une association séquentielle entre un épitope CTL HLA-A2 et un épitope auxiliaire (HTL) multivalent. On notera que cette étude a été menée sur une population génétiquement restreinte. Cet article rend compte également d'une expérience au cours de laquelle deux types d'associations entre épitope HTL et épitope CTL ont été comparées: d'une part une association covalente séquentielle au sein d'un même lipopeptide, et d'autre part une association par simple mélange d'un lipopeptide comportant le motif CTL avec un peptide comportant le motif HTL. Les résultats de cette étude montrent un avantage très net de l'association covalente par rapport au mélange, tel qu'il a été réalisé par ces auteurs, c'est-à-dire par mélange de solutions comportant du DMSO et du tampon PBS (les peptides ou lipopeptides sont maintenus en solutions stock à une concentration de 10 - 20 mg/ml et dilués extemporanément avec du PBS avant usage). Cependant, la combinaison sur une même molécule lipopeptidique des épitopes cytotoxique et auxiliaire, bien que pouvant induire une réponse immunitaire efficace, nécessite la synthèse de séquences d'acides aminés longues présentant de multiples épitopes susceptibles de s'associer à plusieurs HLA ou superfamilles d'HLA de classe I et de classe Il. L'association covalente de tous ces motifs au sein d'une unique molécule représente des difficultés techniques difficilement surmontables, tant du point de vue des méthodes de synthèse que des méthodes de caractérisation analytique. En tout état de cause , cet article mentionne l'association d'un lipopeptide et d'un peptide, et non de deux lipopeptides. De ce fait aucune formation de micelles mixtes ne peut avoir lieu. Un autre article, publié par DON DIAMOND et al (1997, Blood, 90, ne5), mentionne l'immunogénicité d'un mélange entre un peptide portant un épitope CTL minimal (pp65, séquence 495-503 de la protéine de matrice du cytomégalovirus) et un peptide dipalmitoyle contenant un épitope HTL. Le mélange est réalisé par mélange des solutions dans l'acide acétique dilué ou dans le DMSO, en utilisant un traitement par les ultrasons pendant 15 à 30 secondes. Cet article ne décrit donc pas de mélange de lipopeptides contenant indépendamment un épitope CTL et un épitope HTL, mais le mélange d'un lipopeptide contenant un épitope HTL et d'un nonapeptide correspondant à un épitope CTL minimal. D'ailleurs il n'est pas mentionné de formation de micelles mixtes ou de micro-agrégats. Dans ce cas particulier cependant, la possibilité d'association directe du nonapeptide avec les CMH de classe I exprimés à la surface des cellules peut expliquer le succès de l'approche suivie. L'immunogénicité de la préparation signifie qu'il y a eu effectivement co-présentation des épitopes HTL et CTL par la même cellule présentatrice de l'antigène; cependant, le nonapeptide minimal utilisé présente la capacité à se lier directement avec les CMH de classe I à la surface de la cellule présentatrice de l'antigène, sans que soit nécessaire son apprêtement par la cellule. Les auteurs concluent en reconnaissant que plusieurs obstacles existent encore pour obtenir une immunité à long terme, ce qui confirme le caractère expérimental de cette étude. La difficile obtention d'une réponse immune dépendant d'un double apprêtement de peptides présentant séparément les épitopes HTL et CTL, est maintenant expliquée par une publication de STUHLER (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 622-627). Pour pouvoir observer l'induction d'une réponse CTL, il est absolument nécessaire que les épitopes HTL et CTL soient présentés à la surface de la même cellule présentatrice de l'antigène (CPA) pour pouvoir être reconnu à la fois par les cellules T auxiliaire reconnaissant l'épitope HTL et les cellules T cytotoxiques reconnaissant l'épitope CTL. II ressort donc de ce qui précède que des compositions contenant au sein de mêmes micelles, ou de mêmes micro-agrégats, d'une part des lipopeptides présentant un épitope CTL et d'autre part des lipopeptides comprenant un épitope T auxiliaire, c'est-à-dire des micelles ou microagrégats mixtes, n'ont à la connaissance du demandeur, jamais été décrites. Or, comme indiqué ci-dessus, il est absolument nécessaire que les deux épitopes, cytotoxique et T auxiliaire, soient présentés à la surface de la même cellule présentatrice de l'antigène. Outre la nécessité d'une co-présentation des deux épitopes à la surface de la même cellule, il est aussi indispensable de solubiliser les lipopeptides, afin de permettre leur administration aux patients, et leur stérilisation par filtration. Le demandeur s'est donc attaché à trouver une solution à ces divers problèmes. II a montré que pour obtenir des micelles formées individuellement de tous les peptides présents dans le mélange, qu'ils contiennent des épitopes HTL ou CTL, il était nécessaire d'associer les différents lipopeptides après les avoir au préalable dispersés au stade moléculaire dans un solvant adapté. La présente invention a donc pour objet des micelles ou microagrégats pour l'induction d'une réponse immunitaire contenant au moins: - un premier lipopeptide comprenant au moins un épitope CTL, ou épitope cytotoxique, et au moins un motif lipidique, et - un second lipopeptide comprenant au moins un épitope auxiliaire et au moins un motif lipidique, dont la nature peut être différente du motif du premier lipopeptide. Les micelles selon la présente invention ne sont néanmoins pas limitées à deux lipopeptides, mais peuvent comprendre d'autres lipopeptides présentant indépendamment des épitopes HTL ou CTL. On entend, pour la compréhension de la présente invention, par épitope T auxiliaire, une séquence d'acides aminés capable de s'associer à au moins un récepteur HLA de classe Il, et capable d'être reconnu par les lymphocytes T auxiliaires. On entend par épitope CTL une séquence d'acides aminés capable de s'associer à au moins un récepteur HLA de classe I et capable d'être reconnue par les lymphocytes T cytotoxiques. Les épitopes T auxiliaires capables de s'associer à plusieurs récepteurs HLA de classe Il différents sont appelés épitopes auxiliaires multivalents (HTL multivalents). En outre, on entend par micelles ou par micro-agrégats des agrégats de lipopeptides présentant une taille les rendant assimilables simultanément par toute cellule présentatrice de l'antigène (CPA) et préférentiellement d'une taille inférieure à environ 1clam. Les micelles mixtes selon la présente invention, c'est-à-dire comprenant des lipopeptides comportant des épitopes cytotoxiques et des lipopeptides comportant des épitopes T auxiliaire, présentent l'avantage d'associer au sein du même microvolume assimilable par une seule CPA une grande diversité d'épitopes CTL et HTL, sans que soit nécessaire leur association covalente, tout en respectant le critère de définition chimique requis. Des micelles constituées chacune d'une seule variété de lipopeptide, contenant un épitope CTL ou un épitope HTL ne permettent pas d'obtenir une coprésentation efficace correspondant à l'induction d'une réponse effectrice forte. En outre, I'obtention d'une réponse CTL grâce à l'emploi de microagrégats ou de micelles mixtes permet d'éviter l'utilisation d'émulsions avec des adjuvants huileux, tels que l'adjuvant incomplet de Freund, dont l'emploi n'est pas admis en thérapeutique humaine. Les micelles et micro-agrégats selon la présente invention sont cependant compatibles avec l'emploi d'émulsions avec des excipients huileux cliniquement acceptables. Un autre avantage des micro-agrégats ou micelles mixtes selon la présente invention, comprenant individuellement au moins deux types de lipopeptides, réside dans le fait que la solubilisation de lipopeptides présentant une faible solubilité dans l'eau ou dans des solvants cliniquement acceptables, ou de lipopeptides insolubles, peut être facilitée par leur combinaison avec d'autre(s) lipopeptide(s) présentant une meilleure solubilité. Les micelles selon la présente invention présentent encore l'avantage, par rapport aux lipopeptides dans lesquels les motifs HTL et CTL sont associés de manière covalente et dont la taille est limitée, tels que décrits par VITIELLO et al. ( 1995, précédemment cité), de permettre l'association d'une grande diversité de motifs et donc de pouvoir être utilisés pour la vaccination de populations humaines ou animales non sélectionnées sur la base de la restriction génétique. Les micelles selon la présente invention peuvent comprendre un lipopeptide présentant au moins un épitope CTL et un autre lipopeptide comprenant au moins un épitope auxiliaire. Néanmoins, de telles micelles peuvent aussi contenir plusieurs lipopeptides différents comprenant différents épitopes cytotoxiq ues et différents lipopeptides présentant différents épitopes auxiliaires. Les motifs lipidiques des lipopeptides peuvent être indépendamment un ou plusieurs motifs en C4 à C18, et en particulier une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras, ou d'alcools gras, en C4 à C18, éventuellement ramifiés et insaturés ou être dérivés d'un stéroïde. Ils peuvent comprendre une ou deux chaînes lipidiques en C4 à C18 associées par liaison covalente à un ou deux acides aminés de la partie peptidique. Ils peuvent ainsi être constitués de deux chaînes d'acide palmitique liées aux groupements NH2, alpha et epsilon, d'une lysine. Ces motifs lipidiques peuvent aussi être constitués de, ou comprendre un résidu d'acide palmitique, d'acide 2-amino-hexadécanoïque, d'acide oléique, d'acide linoléique, d'acide linolénique, de pimélautide, de triméxautide, ou un dérivé du cholestérol, ou tout autre constituant lipidique naturel des membranes cellulaires. De manière avantageuse, les lipopeptides constituant les micelles ou les micro-agrégats mixtes sont hydrosolubles dans une proportion d'au moins 30% (en poids). Ces lipopeptides hydrosolubles ont des propriétés de tensioactifs cationiques, propres à exercer un effet solubilisant vis-à-vis d'autres lipopeptides en milieu acide faible. La partie non lipidique comprend quant à elle entre 10 et 100, et préférentiellement entre 10 et 50 acides aminés. Le nombre d'acides aminés dépend du nombre d'épitopes constituant la partie non lipidique du lipopeptide et de leurs tailles, de la nature de la partie lipidique, et des proportions des parties lipidiques et non lipidiques. De manière avantageuse, les épitopes HTL et CTL employés sont des épitopes capables de s'associer à plusieurs HLA différents, ou épitopes multivalents ( promiscuous épitopes en anglais). L'épitope HTL employé est préférentiellement constitué par le peptide multivalent 830-843 de la toxine tétanique. QYIKANSKFIGITE La glutamine (Q) de cette séquence peut éventuellement être acétylée. D'autres épitopes HTL multivalents peuvent être l'épitope multivalent de l'hémaggîutinine (PREVOST-BLONDEL et al. 1995, J. Virol., vol.62, ne12, pages 8046-8055) ou encore l'épitoge PADRE (ALEXANDER et al., 1994, Immunity, 1, 751). L'épitope CTL peut quant à lui être tout épitope capable d'activer des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ II est préférentiellement un épitope CTL d'une protéine présentée par une cellule tumorale et en particulier par un mélanome, d'une protéine du VIH, du virus de l'hépatite B (VHB) ou du papillomavirus, ou encore de la protéine p53. II peut être en particulier l'un des épitopes suivants: - épitopes de la protéine BCR-ABL, résultant de la translocation BCR Abelson (leucémie myéloïde chronique) tels que mentionnés dans le tableau 1. - épitopes de la protéine p53, tels que ceux mentionnés dans le tableau 2. Les épitopes de la protéine p53 peuvent en outre être pris dans les séquences 25-35, 63-73,129-156, 149-156, 187-205, 187-234, 226-264, ou 249-264 de cette protéine. - épitopes des protéines E6 ou E7 du papillomavirus humain (VPH), tels que ceux mentionnés dans le tableau 3. -épitopes de protéines du virus VI H-I tels que ceux mentionnés dans le tableau 4, - épitopes du mélanome ou d'autres tumeurs, tels que ceux mentionnés dans les tableaux 5, 6 et 7 et en particulier épitopes de l'antigène melan-A/mart-1 du mélanome. D'autres épitopes CTL plurivalents présentant une capacité d'association avec des HLA de classe I peuvent être ceux compris dans le peptide 43-57 de HPV (GQAEPDRAHNIVTF) qui contient des épitopes HLA A2, A24, B7 et B18. Les épitopes CTL peuvent encore être ceux d'antigènes parasitaires, et en particulier de Plasmodium falciparum. Les micro-agrégats ou micelles mixtes de lipopeptides selon la présente invention peuvent être lyophilisés, puis repris par tout tampon cliniquement acceptable pour être administrés aux patients à traiter, en particulier aux personnes à vacciner. Ils peuvent être administrés par toute voie d'administration employée en thérapeutique et à titre non limitatif, par voie parentérale, percutanée, orale, sublinguale ou par nébulisat intra-pulmonaire. Un autre objet de la présente invention est donc l'utilisation de ces lipopeptides pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique, et en particulier, pour l'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre de cancers tels que le mélanome, des virus VIH et VHB, des papillomavirus, de la p53 ou de la malaria. La présente demande a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmacologiquement active d'un ou plusieurs des lipopeptides décrits cidessus, ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles. Les lipopeptides formant les micelles selon la présente invention peuvent être fabriqués par tout procédé adéquat connu de l'homme du métier. Ils peuvent en particulier être obtenus par les méthodes Boc-benzyle ou Fmoc-tertiobutyle, en particulier comme décrits dans la demande FR-90 15 870, dont le contenu est intégré par référence à la présente demande L'introduction de la chaîne lipidique peut être réalisée en phase solide, après déprotection sélective de la ou les fonction(s) concernées, comme décrit dans l'article de DEPREZ et al. (1996 , Vaccine, volume 14, n"5,375-382). La chaîne lipidique peut être introduite sur la fonction -NH2 d'une lysine protégée sur la fonction a-N H2 par un groupe F-moc. La Fmoc lys (Palm) obtenue peut être ensuite utilisée en synthèse en phase solide pour élaborer le lipopeptide. Les micelles et micro-agrégats selon la présente invention peuvent être obtenus en dispersant chaque lipopeptide dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80% puis en mélangeant les solutions ainsi obtenues. La qualité de la dissolution, c'est à dire la dispersion effective à l'état moléculaire de chaque lipopeptide avant la préparation du mélange est vérifiée par la méthode de résonance magnétique nucléaire en deux dimensions (RMN2D). La résolution du signal obtenu lors d'expériences en deux dimensions homonucléaires dans un champ de 600 Mhz confirme la dispersion complète, au stade moléculaire, des lipopeptides en solution. La limpidité du mélange n'est pas un critère suffisant : en particulier, la reprise des lipopeptides par du DMSO ou un mélange DMSO/eau ne permet pas, dans la plupart des cas, d'obtenir cet état de dispersion, ce qui explique l'inefficacité du mélange étudié par VITIELLO ET al. (1995, précédemment cité). La dissolution par des mélanges acide acétique/eau plus dilués en acide acétique ne permet pas non plus de préparer dans tous les cas un mélange de micro-agrégats ou micelles mixtes comportant une proportion statistique de chaque constituant du mélange au stade du microvolume. Dans ces deux cas, même en présence d'un mélange apparemment limpide, la filtration stérilisante sur membrane de 0,22 pm est soit impossible, soit irrégulière, avec des rendements de filtration différents selon les constituants, ce qui signifie qu'à l'échelle d'une particule de cette taille, la représentation de chacun des constituants du mélange n'est pas obtenue. Cette microhétérogénéité compromet l'immunogénicité du mélange, puisqu'elle compromet la capture et la présentation simultanée de tous les constituants par une seule cellule présentatrice d'antigène (CPA), dans le cas d'épitopes CTL et HTL présents sur des lipopeptides distincts. La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples qui suivent. La figure 1 représente la structure chimique de la résine de type KNORR-MBHA. Les figures 2 et 3 représentent des spectres de résonance magnétique nucléaire en deux dimensions (RMN 2D), respectivement d'un lipopeptide seul (lipopeptide ENV), et d'un mélange de lipopeptides. La figure 4 illustre la réponse auxiliaire de huit macaques immunisés avec un mélange de lipopeptides. Les figures 5A à 5F illustrent la réponse cytotoxique du macaque n 109. Les figures 6A à 6D illustrent la réponse cytotoxique du macaque n 129. Les figures 7A et 7B illustrent la réponse cytotoxique du macaque n 127. Les figures 8, 9, 10 et Il illustrent respectivement les réponses cytotoxiques des macaques Nos 102,105,120 et 125. EXEMPLE 1 : PréParation de micelles ou micro-agrégats selon l'invention: 1-description des lipopeptides employés dans le mélange nom formules: poids moléculaire NEF 66 VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLK(Pam)-NH2 3862,77 NEF 117 TQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVP K(Pam)-NH2 4017,754 NEF 182 EWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKN K(Pam)-NH2 3451,04 GAG 183 DLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDR K(Pam)-NH2 3983,65 GAG 253 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD K(Pam)-NH2 4063,05 ENV TRPNNNTRKSIHIGPGRAFYATGEIIGDIRQAH K(Pam)-NH2 4027,69 épitopes CTL représentés RPNNNTRKSI HLA-B27 TQGYFPDWQNY HLA-B62 PPIPVGEIY HLA-B35 YFPDWQNYT HLA-B17, B35 KRWIILGLNK HLA-B27 TPGPGVRYPL HLA-B7 LGLNKIVRMY HLA-B62 RYPLTFGW HLA-B27.2 QVPLRPMTYK HLA-A3, A11, B27.2 YPLTFGWC HLA-B18 VPLRPMTY HLA-B35 AFHHVAREL HLA-B52 AVDLSHFL HLA-B62 FLKEKGGL HLA-B8 AVDLSHFLK HLA-A11 L'ensemble des épitopes représentés permettait d'espérer l'induction de réponses CTL chez une importante proportion de la population humaine, à condition de pouvoir bénéficier de l'effet auxiliaire des épitopes HTL non-définis, mais très probablement présents pour de simples raisons statistiques dans l'un quelconque des lipopeptides à condition toutefois de réunir tous les épitopes, et donc, tous les peptides constituants du mélange dans chaque micro-unité de volume. 2- Svnthèse L'approche phase solide a été choisie, en utilisant la stratégie Fmoc pour la protection de la fonction a-amine, et t Bu pour la protection des chaînes latérales. Le protocole utilisé est un protocole standard basé sur les méthodes de synthèse décrites par ATHERTON (Solid-Phase synthesis, a practical approach. IRL press, 1989) et FIELDS et NOBLE (Int. J. Pept. Prot. Res., 1990, 35, 161-214). La Fmoc-Lys(Palm)-OH est couplée sur une résine de type KNORR-MBHA (figure 1). Après déprotection de la fonction alpha-amine, on couple le premier acide aminé (Fmoc-Leu-OH dans le cas de NEF 66 par exemple). L'agent de couplage a été le TBTU (3 eq) en présence de DIPEA (4.5 eq), en vérifiant les couplages par un test colorimétrique. Une acétylation systématique a été réalisée après qu'une réaction négative ait été obtenue à ce test, pour minimiser au maximum le risque d'obtenir des peptides à délétion. On répète cette succession d'opérations jusqu'à ce que tous les acides aminés constitutifs de la séquence aient été introduits. Après la synthèse, et déprotection du groupe Fmoc terminal, les peptides sont déprotégés et clivés par un mélange TFA/eau/DTT (NEF 66, ENV), TFA/eau/DTT/Ac-Trp-OH (GAG 183, GAG 253, NEF 117) ou TFAleau/EDT/Ac-Trp-OH (NEF 182). Les peptides sont purifiés chacun sur une colonne Vydac C18 qui a été exclusivement utilisée à cet effet, à température ambiante, avec un système solvant eau-acétonitrile, en tampon perchlorate ou TFA. Ils sont ensuite mis sous forme d'acétate par échange d'ions sur colonne Dowex SBR, puis lyophilisés dans de l'acide acétique à 40 %. Chaque peptide provient d'un lot unique de synthèse et purification. Aucune opération de recyclage de fractions de purification n'est pratiquée. 3 - Etudes de la solubilité des lipopeptides : 3-1) Utilisation de l'eau pure: Les peptides NEF66, NEF117, NEF182 et ENV ont pu être dissous dans l'eau pure, à des concentrations allant jusque 5 mg/ml. Le peptide NEF117 donne cependant une solution très légèrement opalescente. Les peptides GAG 182 et GAG 253 ne sont pas solubles dans ces conditions. Le mélange des lipopeptides est cependant soluble dans l'eau pure, indiquant un rôle potentiellement solubilisant des lipopeptides hydrophiles vis-à-vis des peptides peu solubles. 3-2) Utilisation du DMSO: La mise en solution de lipopeptides est fréquemment réalisée à l'aide de solutions aqueuses de DMSO (diméthylsulfoxyde) . Ce solvant organique très puissant est en effet compatible après dilution avec la plupart des essais biologiques réalisés sur cellules ou chez l'animal, voire chez l'homme. L'utilisation de DMSO s'est avérée efficace pour une bonne reprise des peptides GAG 182 et GAG 253; les solutions obtenues ont ensuite pu être diluées par de l'eau pour atteindre une concentration finale de 1 mg/ml dans le DMSO à 20% dans l'eau; dans ces conditions, la plupart des peptides donnent des solutions claires, sauf GAG 183, pour lequel on obtient une suspension. II est intéressant de souligner que même dans le cas de solutions claires, et malgré la compatibilité du DMSO avec les filtres Durapore, les solutions de lipopeptides dans le DMSO ne sont pas filtrables sur des filtres de porosité 0,22 pm , parce qu'elles imposent une pression incompatible avec la résistance mécanique des filtres. Cette observation indique la formation d'agrégats de taille supérieure à 0,22 um . Dans certains cas, on a même observé une impossibilité de filtration sur des filtres résistant aux solvants, d'une porosité de 1 um, en raison de la formation de gels (cette taille de filtre est en effet utilisée pour filtrer des solutions concentrées de lipopeptides avant purification par RP-HPLC). 3-3) Utilisation d'acide ascétique concentré à 25%: La mise en oeuvre de l'indispensable étape de filtration stérilisante nécessite donc l'emploi d'un solvant organique plus apte à dissocier les agrégats, compatible après dilution avec la lyophilisation, et non toxique à faible dose . L'acide acétique a été testé. Dans un premier temps, une quantité minimale de ce solvant, a été mise en oeuvre qui est définie comme étant la quantité permettant l'obtention de solutions limpides à des concentrations de 5 mg/ml : pour les peptides GAG 183 et GAG 253, 25% d'acide acétique a été introduit; pour les autres peptides, une mise en solution dans l'eau pure a été réalisée. Les solutions ont été soumises à une analyse par Résonnance Magnétique Nucléaire dans un champ de 600 Mhz. II a été constaté que, malgré l'apparente limpidité des solutions les lipopeptides de cette série, même les lipopeptides les plus hydrophiles, forment des agrégats de taille importante qui interdisent ce type d'étude, en l'absence de signaux résolus. La mise en solution dans ces conditions ne permet pas la dispersion statistique, au stade moléculaire, de chacun des constituants, malgré l'apparente limpidité des solutions. 3-4) Utilisation d'acide acétique concentré à 80% : L'utilisation d'acide acétique concentré à 80%, a alors été testée. Les peptides ont été mis en solution à une concentration de 1mM dans 1 ml d'acide acétique à 80% (correspondant à : NEF 66 : 3,86 mg/ml; NEF 117 4,02 mg/ml; NEF182 : 3,45 mg/ml;GAG 183 : 3,98 mg/ml; GAG 253 : 4,063 mg/ml; ENV : 4,027 mg/ml). Analyse des lipopeptides par RMN du proton à 600 Mhz Les échantillons de lipopeptides ont été préparés en dissolvant les lipopeptides dans une solution d'acide acétique (CD3COOD, 99,5% atom D. EURISO-TOP. France) tH20 ; 80:20 (V:V). 4 ul d'une solution 50 mM de TMSP [3-(triméthylsilyl)-propane sulfonate de sodium] dans D20 sont ajoutés pour référencer les déplacements chimiques. La concentration finale de chaque peptide est de îmM dans au moins 2 ml de solvant, qui sont transférés dans des tubes R.M.N. de 8 mm de diamètre (WILMAD 513A7PP, Interchim, France). Les spectres de R.M.N. du proton ont été réalisés sur un spectromètre RMN BRUKER DMX600 équipé d'une sonde BBI 8 mm avec gradient z, à une température de l'échantillon à 31 0 K. Les expériences en deux dimensions homonucléaires NOESY (Nuclear-Overhauser effect spectroscopy) selon Kumar et al. (1980, Biochem. Biophys. Res; Comm., 95, 1-6) et TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) selon Bax et Davis (1985 J. Magn. Reson., 65, 355-360) et Griesinger et al. (1988 J.A.C.S., 110, 7870-7872) ont été obtenues avec 2048 x 512 points complexes et traitées après multiplication dans les deux dimensions par un sinus déplacé de x/4 avec 2048 x 1024 points, ceci pour une fenêtre spectrale de 12 ppm. Les temps de mélange étaient de 300 ms pour la NOESY et 160 ms pour la TOCSY. Durant le temps de mélange du TOCSY, un MLEV 16 était appliqué avec un champs B1 de 7,8 Khz. Afin d'être dans les mêmes conditions de température, le temps de spin-lock du TOCSY était appliqué hors résonance (+ L'analyse par RMN à haut champ des solutions a montré des signaux parfaitement résolus, permettant des expériences TOCSY-NOESY, et l'attribution séquentielle complète de chaque lipopeptide. Ce résultat signifie la dispersion complète, à l'échelon moléculaire, des lipopeptides dans l'acide acétique à 80%. Le spectre RMN 2D du peptide ENV est représenté sur la figure 2 Les spectres de tous les peptides ont pu être obtenus dans les mêmes conditions et interprétés. Afin de vérifier si le mélange des solutions entreelles n'altérait pas la dispersion des lipopeptides, un spectre RMN 2D du mélange virtuel, a été obtenu par superposition sur une même représentation des 6 spectres obtenus individuellement. II a été comparé avec le spectre RMN 2D effectivement obtenu par mélange des solutions (figure 3). La résolution des signaux est restée comparable, attestant qu'aucun des peptides n'a altéré la solubilité des autres constituants du mélange. L'analyse des séquences a nécessité une accumulation des signaux pendant 120 heures pour chaque lipopeptide, période au cours de laquelle aucune altération sensible des peptides n'a pu être détectée, ni par RMN, ni par RP-HPLC. Cette observation a donc permis d'envisager l'utilisation de ce solvant pour la solubilisation des lipopeptides, leur mélange, puis la filtration, même avec un temps de séjour de l'ordre de 1 ou 2 heures, éventuellement nécessaire à la manipulation de volumes relativement importants. 4 - Etudes de l'étape de filtration stérilisante: 4-1) Lipopeptides isolés: Des essais de filtration stérilisante ont été réalisés à partir de solutions à 5 mg/ml de chaque lipopeptide dans l'eau pour les peptides NEF66, NEF117, NEF 182 et ENV et dans l'acide acétique à 25% pour les peptides GAG 183 et GAG 253. Les rendements de filtration de 1 ml sur filtres Millex GV SLGV 0130S (0,22 pm) Millipore, suivie d'une lyophilisation figurent dans le tableau 8 (à la précision du dosage prés) Ces résultats sont en accord avec les études de solutions réalisées par RMN, et donnent des indications sur la taille des agrégats ou micelles détectés: certains peptides forment des agrégats de taille supérieure à 0,22 pm, et conduisent par conséquent à des mélanges comportant des microhétérogénéités et une capture simultanée peu probable à l'échelle de la cellule présentatrice d'antigènes. 4-2) Préparation de divers mélanges de lipopeptides: a) Préparation du lot CK2. Mélange simple des solutions, et obtention d'un mélange limpide, mais microhétéroqène: Pour la mise en solution des lipopeptides et la préparation du mélange, des solutions d'aspect totalement limpide ont été mélangées entre elles, afin d'évaluer l'éventuelle contribution du caractère tensioactif des lipopeptides ENV, NEF 66, NEF117 et NEF182. Les conditions sont résumées dans le tableau 9 Les solutions obtenues ont été soumises à l'action d'ultrasons pour faciliter la dispersion des agrégats, mélangées pour donner un volume final de 5,5 ml. le mélange a été de nouveau soumis à l'action d'ultrasons, puis dilué par 9,5 ml d'eau pour obtenir une concentration finale d'environ 8 % en acide acétique (AcOH), compatible avec une lyophilisation de bonne qualité. Cette solution, après un dernier séjour dans le bain à ultrasons, a été filtrée sur filtres Millex GV SLGV 0130S (0,22 pm) Millipore. Les rendements de filtration des peptides en mélange ont été calculés pour chaque lipopeptide, pour donner les résultats représentés dans le tableau 9 en dernière colonne (à la précision du dosage près). L'hétérogénéité des rendements selon les peptides atteste de l'hétérogénéité de la solution. Chaque peptide s'est comporté comme s'il était filtré individuellement : ce comportement est particulièrement évident avec le peptide GAG253, dont le rendement de filtration à partir de cette solution à 8 % d'acide acétique est inférieur au rendement de filtration observé lorsqu'il est filtré seul à partir d'une solution à 25% d'acide acétique. Ce résultat confirme que, en dépit de l'apparente limpidité du mélange en solution acétique diluée, le mélange entre les lipopeptides n'a pas fourni de micro-agrégats ou micelles mixtes, incorporant notamment les peptides les plus hydrophobes. Les échanges de lipopeptides entre micelles se font mal dans ces conditions, et la fonction tensioactive des lipopeptides ENV, NEF66 NEF 117 et NEF182 ne peut se manifester. b) Préparation du lot CK3 : préparation de micelles ou de micro-agrégats mixtes ne comportant pas de microhétérogénéité Pour garantir le mélange réel au niveau de chaque micro-unité de volume des différents lipopeptides, une stratégie différente a été suivie - chaque lipopeptide a été mis en solution dans l'acide acétique à 80% afin d'exploiter les propriétés dissociantes de ce solvant. - afin d'exploiter les propriétés de tensioactif cationique attendues des peptides ENV, NEF66 , NEF 117 et NEF182 en milieu acide faible lors de l'étape de dilution, les lipopeptides ont été dispersés en solution d'acide acétique à 80% selon la répartition suivante : 1 : ENV, 2 : NEF66 , 3 : NEF 117 , 4 : NEF182, en terminant par la dispersion des deux lipopeptides les plus hydrophobes dans une solution désormais concentrée en agents dissociants ' acide acétique et détergents cationiques . Le cinquième lipopeptide introduit a été GAG 183 et le sixième : GAG 253. Les ultrasons sont utilisés à chaque étape pour assurer une dispersion efficace des agrégats. Les solutions sont mélangées, puis filtrées sur filtres Millex GV SLGV 0130S (0,22 um). La filtration nécessite une pression plus faible que lors de la filtration de la solution à 8%. Les récipients utilisés et le filtre sont ensuite rincés avec de l'eau, en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale en acide acétique de 8 % (volume final 15 ml comme précédemment), afin d'assurer la qualité de l'étape de lyophilisation. Les rendements de filtration des peptides en mélange ont été calculés pour chaque lipopeptide, pour donner les résultats donnés dans le tableau 10 en dernière colonne (à la précision du dosage près). L'homogénéité des rendements confirme l'homogénéité de la solution résultant de la dispersion à l'échelon moléculaire au moment de la filtration dans l'acide acétique concentré. La dilution ultérieure ne peut participer à un regroupement de chaque peptide en entités monovalentes, en application des lois de l'entropie. Cette méthode de préparation du mélange a donc permis l'obtention de micelles mixtes, comportant nécessairement chacune une représentation statistique de chaque lipopeptide. Les propriétés tensioactives des lipopeptides peuvent s'exercer et garantir la solubilité dans l'eau des doses de vaccins après lyophilisation ainsi que la stabilité des solutions pendant le temps des manipulations. c) Préparation du Lot CK9 La procédure utilisée est la même que pour le lot précédent, aux quantités près. La solution de peptide (20 mg/ml dans l'acide acétique à 80 %) a été filtrée en 4 fois, avec changement de filtre avant leur saturation, en utilisant des membranes identiques (unités stériles STERIVEX GV 0,22 um Durapore (Millipore), puis complétée avec de l'eau utilisée pour rincer les filtres et diluer. Le volume final atteint était de 1516 ml (dont 154 ml d'acide acétique : solution finale a 10%). Le volume de répartition était de 1,3 ml par dose. Les doses réparties ont été lyophilisées, et dosées en utilisant une méthode de dosage validée par HPLC. Le rendement de filtration pour chaque lipopeptide est indiqué ci-dessous dans le tableau 11, et prend en compte la sensibilité du dosage de chaque lipopeptide. Lors de la préparation de ce lot, on observe encore une bonne homogénéité des rendements de filtration confirmant la formation de micelles ou micro-agrégats mixtes, chaque micro-unité comprenant une proportion équivalente de chaque constituant du mélange. Le mélange après dilution et lyophilisation fournit une poudre blanche formant un gâteau compact et homogène, très facilement remis en solution par de l'eau pure, ou un solvant capable de restaurer l'osmolarité de la solution (glucose à 5%, mannitol à 5%). La solution présente une très légère opalescence. Le pH obtenu lors de la reprise par un solvant non tamponné est de 4,90. L'élévation du pH de 1 point provoque la formation lente d'un précipité: ce comportement contribue à la formation d'un dépôt lors de l'injection sous-cutanée ou intramusculaire. d) Essai d'uniformité de teneur sur le lot CK9 Selon la Pharmacopée, les poudres pour usage parentéral sont soumises à l'obligation d'uniformité de teneur. L'essai doit être réalisé sur 10 unités prises au hasard, pour lesquelles on réalise individuellement un dosage du principe actif au moyen d'une méthode analytique appropriée. La préparation satisfait à l'essai si la teneur de chaque unité est comprise entre 85 et 115 % de la teneur moyenne. L'essai a été réalisé sur 15 échantillons pris au hasard, remis en solution et dilués dans de l'acide acétique à 80 % selon une procédure opératoire standardisée, de façon à injecter une proportion toujours identique d'environ 15 pg, définie lors de l'obtention de la droite étalon. Chaque échantillon a été injecté trois fois, le dosage de chaque principe actif correspondant à la moyenne des trois valeurs obtenues. Les valeurs obtenues figurent dans le tableau 12 ci-après. La répartition des valeurs est clairement statistique. On observe toutes les valeurs à l'intérieur d'un espace défini pour un test bilatéral avec un P = 0,975 (sauf trois valeurs aberrantes, toutes retrouvées dans le flacon n 1, pouvant correspondre à une erreur de dilution). Les valeurs minimales et maximales définies se situent à l'intérieur des limites imposées par la Pharmacopée (I'écart observé se situe entre 4 et 14,95% selon les peptides, variation liée à l'imprécision inhérente au dosage). L'absence de microhétérogénéité de la solution est confirmée par le fait que les doses de vaccins réparties ont satisfait à l'essai d'uniformité de teneur. EXEMPLE 2- Préparation d'un mélanqe de lipopeptides (SlV-Mortara 1) et essai d'immunoqénicité chez le macaque. 1) Préparation du lotSlV-Mortara 1 Ce lot de petite taille a été préparé pour réaliser une étude préclinique chez ie macaque, pour vérifier la tolérance et l'immunogénicité. Ce lot résulte du mélange des lipopeptides suivants: nom formules: NEF 101 SVRPKVPLRAMTYKLAIDMSHFIKEK K(Pam)-NH2 NEF 125 EKGGLEGIYYSARRHRILDMYLE K(Pam)-NH2 NEF 155 DWQDYTSG PGIRYPKTFGWLWKLV K(Pam)-NH2 NEF 201 SKWDDPWGEVLAWKFDPTL AYTYEA K(Pam)-NH2 NEF221 YTYEAYARYPEELEASQACQRKRLEEG K(Pam)-NH2 GAG165KFGAEVVPGFQALSEGCTPYDINQMLNCVGDK(Pam)-NH2 GAG 246 QIQWMYRQQNPIVGNIYRRWIQLGLQKCVRMYNPTN K(Pam)-NH2 TT Ac- QYIKANSKFIGITELKK K(Pam)-NH2 Leur mélange a été réalisé à partir des solutions dans l'acide acétique concentré, comme lors de la préparation du lot CK3. 2) Immunogénicité chez le macaque. a) Matériels et méthodes Les macaques, numérotés respectivement 102, 105, 109, 117, 120, 125,127 et 129 ont été immunisés par injection sous-cutanée du lot préparé ci-dessus (500 pg), dans de l'eau stérile et ont été réinjectés dans un délai de trente jours et de soixante jours. Ces immunisations ont été effectuées en accord avec les directives de l'Union Européenne. Obtention de lignées CTL Des cellules sanguines (PBMC) ont été isolées par centrifugation dans un gradient de densité à travers un milieu de séparation de lymphocytes (Pharmacia, Uppsala, Suède). Elles ont été utilisées immédiatement, ou stockées à -1800C dans de l'azote liquide. Des lignées CTL anti-peptide ont été obtenues en cultivant les PBMC des singes (2 x 106 cellules/ml) dans des plaques de microtitration , dans du RPMI 1640 complété avec de la pénicilline (100U/ml), de la streptomycine (100 ug/ml) de la L-glutamine (2 mM), des acides aminés non essentiels (1%), du pyruvate de sodium (1 mM), du tampon HEPES (10 mM), du 2mercaptoéthanol (2 x 10-5 M) et du sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) à10%. Le mélange des sept peptides libres, c'est-à-dire sans motif lipidique, (5 um de chaque) correspondant aux séquences lipopeptidiques a été ajouté dans chaque puits. Les plaques ont alors été incubées durant trois jours à 37 C et de l'lnterleukine-2 a été ajouté dans chaque plaque (10 lU/ml). Après sept jours et quatorze jours, les cellules effectrices ont été stimulées en ajoutant de nouveaux PBMC autologues, qui ont été mis en contact durant deux heures avec le mélange de peptide (5 pm de chaque), puis lavés et irradiés (4000 rads). Mise en évidence de la prolifération des cellules T Des cellules PBMC (2 x 105 dans 200 l par puits) ont été cultivées dans des plaques contenant 1 pg/ml du lipopeptide TT (830-846), et 10, ug/ml du peptide issu de la toxine tétanique (TT). Après cinq jours de culture, 1 pCi de [3H]TdR a été ajouté dans chaque puits et l'incubation a été poursuivie durant dix huit heures. Les cellules ont été alors récoltées à l'aide d'un récolteur automatique de cellules puis l'incorporation de la thymidine tritiée a été quantifiée à l'aide d'un compteur à scintillation. Analvse phénotypique des lignées cellulaires CTL Le phénotype des lignées cellulaires a été déterminé le jour où le test de largage du chrome a été effectué, en incubant les cellules avec des anti-CD4 conjugués à du FITC (OKT4, Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ) et avec un anti-CD8 conjugué à de la phycoérythrine (Leu-2a, Becton Dickinson, Mountain View, CA) durant trente minutes à 4"C. Les cellules ont été lavées avec du tampon PBS puis le pourcentage de cellules colorées a été déterminé à l'aide d'un cytomètre de flux Epics Elite (Coulter, Margency, France). Des anticorps présentant un mélange d'isotypes ont été utilisés comme témoins. Transformation in vitro des lignées cellulaires B (B-LCL) Les lignées cellulaires B (B-LCL) ont été obtenues en incubant des dilutions en séries de PBMC à l'aide du surnageant de la lignée cellulaire S 594. Cette lignée est infectée par le virus de l'herpès du babouin qui immortalise les cellules (herpès virus papio). Les B-LCL ont été ensuite cultivées dans du milieu de culture complémenté avec 10% de FCS. Test de relarquaqe du chrome. Des cellules cibles ont été sensibilisées avec les peptides. 106 cellules B-LCL ont été incubées soit durant la nuit soit durant 1 heure, respectivement avec des peptides longs ou courts (gamme de concentration 10-5 M-103M) à 37"C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Afin d'obtenir les cellules cibles présentant les produits du gène SlVmac, les B LCL ont été incubés à une concentration de 106 cellules/ml avec un virus de la vaccine recombinante (20 PFU/cellule) durant dix huit heures dans les mêmes conditions. Les BLCL ont été ensuite lavées et marquées avec 100pm Ci Na25'CrO4 (NEN Life Science Products, Courtaboeuf Les Ullis, France) durant 1 heure, lavées deux fois et utilisées comme cellules cibles. Le relarguage du 51Cr a été effectué dans des plaques de microtitration. L'activité cytolytique des lignées cellules anti-SIV a été mesurée en mélangeant 5 x 103 cellules cibles marquées au chrome avec des cellules effectrices, dans des rapports cellules effectrices/cellules cibles divers, dans un volume final de 200 ul/puits. Les plaques ont été incubées durant 4 heures à 37"C, puis 100 ul de surnageant ont été pris dans chaque puits et analysés dans un compteur de rayonnement gamma. Le relarguage spontané du chrome a été déterminé en incubant les cellules cibles avec du milieu seul. II n'excède jamais 20% du chrome total incorporé. Le relarguage spécifique du chrome a été mesuré de la manière suivante: 100 x (cpm expérimentaux - cpm spontané)/(cpm maximum-cpm spontané). La variation à l'intérieur d'un échantillon n'excède jamais plus de 5%. b) Résultats La figure 4 illustre la réponse T auxiliaire des huit macaques. Les figures 5 a 1 1 illustrent la réponse cytotoxique des macaques. Les résultats des immunisations avec divers peptides sont résumés dans le tableau 13. Ils montrent que sept des huit macaques testés reconnaissent divers peptides, les macaques ne109, 129 et 127 montrant une réponse particulièrement importante. L'efficacité de l'induction d'une réponse CTL confirme que les CPA des animaux ont pu capturer et présenter un ou plusieurs épitopes CTL,et simultanément l'épitope auxiliaire fort présent dans l'anatoxine tétanique et reconnu par certains des animaux. EXEMPLE 3 : Préparation d'un mélanqe de lipopeptides (Lot HG 1) en vue d'un essai clinique chez l'homme. Un mélange de lipopeptides a été défini en vue de la réalisation d'un essai clinique (VAC10), associant au sein de micelles le même peptide TT à des séquences choisies sur le principe de sélection développé pour VAC04 (existence d'un ou plusieurs épitopes CTL par séquence). - la cystéine du peptide NEF117 a été remplacée par une Leucine après synthèse et essai sur test cellulaire de plusieurs analogues du nonapeptide épitope CTL renfermant cet acide aminé, il a en effet été observé que ce remplacement était possible; cette modification permet d'éviter les problèmes de stabilité dus à la formation de pont disulfure. - le peptide GAG 17 a été choisi parmi d'autres candidats pour son caractère nettement tensioactif cationique susceptible d'aider au maintien en solution des autres peptides, et en particulier de GAG253, toujours présent dans le mélange, en raison de son immunogénicité chez l'homme. La composition de ce mélange, dans laquelle Pam représente un motif dérivé de l'acide palmitoïque et Ac le groupe acétyl, est la suivante: GAG 17 EKIRLRPGGKKKYKLKHIV K(Pam)-NH2 GAG 253 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD K(Pam)-NH2 POL 325 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY K(Pam)-NH2 NEF 66 VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL K(Pam)-NH2 NEF 116 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL K(Pam)-NH2 TT Ac-QYIKANSKFIGITELKK K(Pam)-NH2 L'ensemble de ces peptides a été synthétisé comme indiqué dans les exemples précédents. Le mélange des solutions a été réalisé sur un échantillon de 5 mg de chaque peptide, dissous à une concentration de 20 mg/ml dans l'acide acétique à 80% puis mélangé dans l'ordre suivant : 1 GAG17; 2 : NEF66; 3 : NEF 116; 4 : TT; 5 : GAG253 ; 6 : POL 325. Les rendements de l'opération de filtration des solutions acide acétique concentrées, suivie d'une dilution par l'eau se sont avérés comparables aux rendements observés pour les mêmes opérations avec le mélange CK3 (à la précision du dosage près). L'homogénéité des solubilités et de comportements vis-à-vis de la filtration stérilisante en dépit des hétérogénéités de comportement chimique au stade individuel traduit la formation de micelles mixtes. EXEMPLE 4: Préparation d'un mélange de lipopeptides dérivés de l'antiqène LSA3 en vue d'un essai pré-clinique de vaccination contre le stade intrahépatique de Plasmodium falcíparum, réalisé chez la souris et le chimpanzé, puis d'un essai clinique chez l'homme. LSAE CT1 LLSNlEEPKENllDNLLNNlK(Pam)-NH2 LSA3 NRI Ac-DELFNELLNSVDVNGEVKENILEESQK(Pam)-NH2 LSA3 NRII Ac-LEESQVNDDIFNSLVKSVQQEQQHNVK(Pam)-NH2 LSA3 RE K(Pam)VESVAPSVEESVAPSVEESVAENVEESVAENV-NH2 L'ensemble de ces peptides a été synthétisé comme indiqué dans l'exemple 1. Le mélange des solutions a été réalisé sur un échantillon de 5 mg de chaque peptide préalablement dissous à une concentration de 20 mg/mL dans de l'acide acétique à 80% puis mélangés dans l'ordre suivant 1 LSA3 NRl; 2:LSA3 NRII; 3:LSA3 CTî; 4: LSA3 RE. Les rendements de l'opération de filtration des solutions d'acide acétique concentrées, suivie d'une dilution par l'eau, se sont avérés comparables pour tous les lipopeptides. TABLEAU 1 : Epitopes de BCR-ABL Peptide Séquence Fixation au HLA 247-255 EDAELNPRF B44 488-496 SELDLEKGL B44.768-776 DELEAVPNI B44 903-934 b2a2 KEDALQRPV B44 902-935 b2a2 EDALQRPVA B44 986-994 GEKLRVLGY B44 1176-1184 EDTMEVEEF B44 1252-1260 MEYLEKKNF B44 1691-1699 NEEAADEVF B44 49-57 VNQERFRMI B8 580-588 LFQKLASQL B8 720-730 ARKLRHVFL B8 786-794 ALKIKISQI B8 886-893 CVKLQTVH B8 928-936 b3a2 KALQRPVAS B8 1830-1838 GAKTKATSL B8 1975-1983 IQQMRNKFA B8 1977-1984 QMRNKFAF B8 252-260 NPRFLDNL B7 329-338 TPDCSSNENL B7 693-701 TPRRQSMTV B7 1058-1066 SPGQRSISL B7 1195-1205 HPNLVQLLGV B7 1560-1569 SPKPSNGAGV B7 1717-1725 KPLRRQVTV B7 1878-1884 SPAPVPSTL B7 36-44 ERCKASIRR B27 71-79 DRQRWGFFRR B27 575-583 QRVGDLFQK B27 834-842 FRVHSRNGK B27 642-650 LLYKPVDRV A2 684-692 FLSSINEEI A2 708-716 QLLKDSFMV A2 714-722 FMVELVEGA A2 817-825 KLSEQESLL A2 881-889 MLTNSCVKL A2 908-917 GLYGFLNVIV A2 912-920 FLNVIVHSA A2 1240-1248 VLLYMATQI A2 1903-1911 FIPLSTRV A2 1932-1940 VVLDSTEAL A2 50-58 NQERFRMIY A1 223-231 VGDASRPPY A1 549-558 KVPELYEIHK A3/A11 583-591 KLASQLGVY A3/A11 715-724 MVELVEGARK A3/A11 916-923 IVHSTGFK A3/A11 920-928 b3a2 ATGFKQSSK A3/A11 924-932 b3a2 KQSSKALQR A3/A11 1156-1165 EVYEGVWKKY A3/A11 1311-1320 SLAYNKFSIK A3/A11 1499-1509 NLFSALIKK A3/A11 1724-1734 TVAPASGLPHK A3/A11 1905-1914 LISTRVSLRK A3/A11 1922-1930 RIASGAITK A3/A11 924-936 b3a2 KQSSKALQRPVAS OR4 TABLEAU 2 - Epitopes de la p53 - épitopes de la p53 se liant au HLA-A1: RVEGNLARVEY (196-205) GSDCTTIHY (226-234) - épitopes de la p53 se liant au HLA-A2: LLPENNVLSPL (25-35) RMPEAAPPV (65-73) RMPEAAPRV ALNKMFCQL (129-137) STPPPGTRV (149-157) GLAPPQHLIRV (187-197) LLGRNSFEV (264-272) PLDGEYFTL (322-330) - épitopes de la p53 se liant au HLA-A3: RVRAMAIYK (156-164) RRTEEENLR (282-290) ELPPGSTKR (298-306) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B7: LPENNVLSPL (26-35) APRMPEAAPPV (63-73) APRMPEAAPRV APPQHLIRV (189-197) RPILTIITL (249-257) KPLDGETYFTL (321-330) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B8: CQLAKTCPV (135-143) GLAPPQHLl (187-195) NTFRHSVVV (210-218) - épitopes de la p53 se liant au HLA-B51: LLPENNVLSPL (25-35) RMPEAAPPV (65-73) LIRVEGNLRV (194-203) TABLEAU 3 Epitopes des protéines Eh et E7 YMLDLQPETT (E7 11-20) LLMGTLGIV (E7 82-90) TLGIVCPI (E7 86-93) TIHDIILECV (E6 29-38) KLPQLCTEL (E6 18-26) RPPKLPQL (E6 8-15) LRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (E6 45-67) ISEYRHYCY (E6 80-88) EKQRHLDKKQRFHNIRGRWT (E6 121-140) GQAEPDRAHYNIVTF (E7 43-57) QAEPDRAHY (E7 44-52) EPDRAHYNIV (E7 46-55) TABLEAU 4 : Epitopes du vitûs VIH-1 HLA-A1 (Nef 96-106: GLEGLIHSQRR (Nef 121-128: FPDWQNYT (Nef 137-145: LTFGWCYKL (Nef 184-191: RFDSRLAF (Nef 195-202: ARELHPEY HLA-A2 Gp120 121-129: KLTPLCVTL P17 77-85: SLYNTVATL RT 200-208: ALVEICTEM RT 275-285: VLDVGDAYFSV RT 346-354: KIYQYMDDL RT 368-376: KIEELRQHL RT 376-387: LLRWGLTTPDK RT 476-484: ILKEPVHGV RT 588-596: PLVKLWYQL RT 683-692: ELVNQHEQL, Nef 136-145: PLTFGWCFKL Nef 180-189: VLQWRFDSRL Nef 190-198: ALHVAREL Gp41 818-826: SLLNATVDI P24 185-193: DLNTMLNTV RT 346-354: VIYQYMDDL RT 588-596: PLVKLWYQL Pro 143-152: VLVGPTPVNI (Gp120 37-44: TVYYGVPV (Gp120 115-122: SLKPCVKL (Gp120 313-321: RIQRGPGRA (Gp120 197-205: TLTSCNTSV (Gp120 428-435: FINMWQEV (Gp41 836-844: VVQGAYRAI (p24 219-228: HAGPIAPGQM (p15 422-431: QMKDCTERQA (p15 448-456: FLQSRPETA (RT 681-691: ESELVNQHEG HLA-A3 P17 18-26: KIRLRPGGK P17 20-28: RLRPGGKKK@ RT 200-210: ALVEICTEMEK RT 325-333: AIFQSSMTK RT359-368: DLEIGQHRTK Nef 73-82: QVPLRPMTYK @ Gp120 37-46: TVYYGVPVWK Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR P17 18-26: KIRLRPGGK HLA-A11 RT 325-333: AJFQSSMTK RT 507-517: QIYQFPFKNLK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 84-92: AVDLSHFLK p24 349-359: ACQVGGPGHK P17 83-91: ATLYCVHQR Tableau 4 (suite) HLA-A24 (A9) Gp120 52-61: LFCASDAKAY Gp41 591-598: YLKDQQLL ou 590-597: RYLKDQQLL (RT 482-492: VYYD (RT 508-516: IYQEPFKNL (RT 681-691: ESELVNQHEG HLA-A25(A10) P24 203-212: ETINEEAAEW HLA-A26(A10) P24 167-175: EVIPMFSAL HLA-A30(A19) (Gp41 845-852: RAIRHIPRR HLA-A31(A19) Gp41 75-/85 : RLRDLLLIVTR HLA-A32(A19) Gp120 424-432: RIKQHNMW Gp41 774-785: HRLRDLLLI@ RT 559-568: PIQKETWETW HLA-A33(A19) (P24 266-275: HLGLNKIVR HLA-B7 RT 699-707: YLAWVPAHK Nef 68-77: FPVTQVPLR Nef 128-137: TPGPGVRYPL Gp120 303-312: RRNNNTRKSI Gp41 848-856: IPRRIRQGL RT 699-707: YLAWVPAHK HLA-B8 Gp120 2-10: RVKEKYQHL P17 24-32: GGKKKYKLK Nef 90-97: FLKEKGGL = P24 259-267: GETYKRWH Gp41 591-598: YLKDQQLL (Gp41 849-856: PRRIRQGL ou 851-859: RIRQGLERIL (P24 329-337: DCKTILKAL (RT 185-193: GPKVKQWPL (Nef 182-189: EWRFDSRL @ HLA-B14 Gp41 589-597: ERYLKDQQL P24 298-306: DRFYKTLRA (P24 183-191 ? : -191 ? : DLNTMLNTV (p24 304-313: LRAEQASVQEV (p24 305-313: RAEQASVQEV HLA-B18 Nef 135-143: YPLTFGWCY Nef 135-143: YPLTFGWCF Tableau 4 (suite) HLA-B27 P24 263-272: KRWTILGLNK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 134-141: RYPLTFGW ou 133-141: YPLTFGW Gp41 589-597: ERYLKDQQL (Gp41 791-800: GRRGWEALKY HLA-B35 Gp120 78-86: DPNPQEVVL Gp120 257-265: RPVVSTQLL RT 285-294: VPLDKDFRKY RT 323-331: SPAIFQSSM : RT 342-350: NPDIVIYQY (consensus clade B) RT 460-468: IPLTEEAEL RT 598-608: EPIVGAETFY Nef 68-76: FPVRPQVPL Nef 74-81: VPLRPMTY Gp41 611-619: TAVPWNASW Gp120 42-52: VPVWKEATTTL P17 124-132: NSSQVSQNY (consensus clade B) P24 254-262: PPIPVGEIY (consensus clade B) HLA-B37 Nef 120-128: YFPDWQNYT HLA-B44 (B12) P24 178-186: SEGATPQDL (p24 175-184: LESGATPQDL HLA-B51 (B5) gp41 562-570: RAIEAQQHL RT 200-208: ALVEICTEM RT 209-217: EKEGKISKI RT 295-302: TAFTIPSI HLA-B52 (B5) Nef 190-198: AFHHVAREL HLA-B55 (B22) Gp120 42-51: VPVWKEATTTL HLA-B57 et B58 (B17) P24 240-249: TSLTQEQIGW Nef 116-125: HTQGYFPDWQ ou 116-124: HTQGYFPDW Nef 120-128: YFPDWQN (P24 147-155: ISPRTLNAW (P24 164-172: FSPEVIPMF HLA-Bw62 (B15) P17 20-29: RLRPGGKKKY P24 268-277: LGLNKIVRMY RT 427-438: LVGKLNWASQIY Nef 84-91: AVDLSHFL Nef 117-127: TQGYFPDWQNY Tableau4(suite) HLA-Cw4 gp120 380-388: SFNCGGEFF HLA-Cw8 RT 663-672: VTDSQYALGI: P24 305-313: RAEQASQEV Nef 82-91: KAALDLSHPL HLA-Cw? P24 308-316: QATQEVKNW TABLEAU 5 - Epitopes de Mélanome humain Gene/protéine MHC restriction Peptide Position des acides aminés Tyrosinase HLA-A2 MLLAVLYCL 1-9 HLA-A2 YMNGTMSQV 369-377 YMDGTMSQV HLA-A24 AFLPWHRLF 206-214 HLA-B44 SEIWRDIDF 192-200 HLA-DR4 QNILLSNAPLGPQFP 56-70 SYLQDSDPDSFQD 450-462 Pmel17gp100 HLA-A2 KTWGQYWQV 154-162 HLA-A2 AMLGTHTMEV 177-186 HLA-A2 MLGTHTMEV 178-186 HLA-A2 ITDQVPFSV 209-217 HLA-2 YLEPGPVTA 280-288 HLA-A2 LLDGTATLRL 457-466 HLA-A2 VLYRYGSFSV 476-485 HLA-A2 SLADTNSLAV 570-579 HLA-A3 ALLAVGATK 17-25 Melan-AMART-1 HLA-A2 (E)AAGIGILTV 26(7)-35 HLA-A2 I LTVI LGVL 32-40 gp75TRP-1 HLA-A31 MSLQRQFLR TRP-2 HLA-A31 LLGPGRPYR 197-205 TABLEAU 6: Epitopes de tumeurs résultant de mutations Gene/proteine Tumeur MHC Peptide Position des Restriction acides aminés MUM-1 Mélanome HLA-B44 EEKLIVVLF 30-38 CDK4 Mélanome HLA-A2 ACDPHSGHFV 23-32 ss-catenine Mélanome HLA-A24 SYLDSGIHF 29-37 HLA-A2 carcinome - rénal CASP-8 carcinome HLA-B35 FPSDSWCYF 476-484 squameux de la tête et du cou TABLEAU 7 Antigènes communs à diverses tumeurs Gene tissue où a MHC Peptide antigénique Position des lieu acides aminés I'expression restriction normale MAGE-1 testicules HLA-A1 EADPTGHSY 161-169 HLA-Cw16 SAYGEPRKL 230-238 MAGE-3 testicules HLA-A1 EVDPIGHLY 168-176 HLA-A2 FLWGPRALV 271-279 HLA-B44 MEVDPIGHLY 167-176 BAGE testicules HLA-Cw16 AARAVFLAL 2-10 GAG testicules HLA-Cw6 YRPRPRRY 9-16 1/2 RAGE-1 rétine HLA-B7 SPSSNRIRNT 11-20 GnTV aucun HLA-A2 VLPDVFIRC 38-64 mucine seins lors pas de PDTRPAPGSTAPPA de la HGVTSA* restriction lactation * transcript aberrant de la N-acétyl glucosaminyl transferase V (GnTV) trouvé uniquement dans les mélanomes. TABLEAU 8 LIPOPEPTIDES RENDEMENT DE FILTRATION NEF66 quantitatif NEF117 80% NEF182 quantitatif GAG183 80% GAG253 77% ENV quantitatif TABLEAU 9 Peptide Solvant concentration Volume prélevé Rendement de (mg/mL) (mL) filtration(%) après mélange NEF66 eau 5 1 95 NEF 117 AcOH 25% 5 1 81 NEF 182 AcOH 25% 5 1 92 GAG 183 AcOH 80% i 10 0,5 73 GAG 253 AcOH 25% 5 1 31 ENV eau 5 1 95 TABLEAU 10 rendement Peptide solvant concentration volume de filtration (mglml) prélevé (ml) (%) après mélange * NEF 66 AcOH 80% 20 0,250 quantitatif NEF 117 AcOH 80% 20 0,250 quantitatif NEF 182 AcOH 80% 20 0,250 quantitatif GAG 183 AcOH 80% 20 0,250 quantitatif GAG 253 AcOH 80% 20 0,250 quantitatif ENV AcOH 80% 20 0,250 quantitatif * à la précision du dosage près. TABLEAU 11 peptide pesée peptide quantité quantité*** rendement ** exacte*** attendue* obtenue (pg (%) (mg) net ( g par dose par dose) NEF 66 764 641 550 505+/-15 89,14 -94,6 NEF117 739 641 550 621+/-21 109,08 116,72 NEF182 742 641 550 545+/-16 96,23-102,05 GAG183 741 642 550 478+/-13 84,50 - 89,23 GAG253 780 641 550 571+/- 28 98,76 - 108,95 ENV 810 642 550 593+/- 17 104,71 110,89 * la dose ciblée était de 500 pg par peptide; un surdosage de 10% a été délibérément prévu au moment de la pesée, compte tenu des rendements obtenus lors de la préparation du lot CK6. **Les fourchettes des rendements reflètent la précision du dosage, et non une variation importante d'un flacon à l'autre. *** Les valeurs en excès sont dues aux imprécisions des pesées de poudres électrostatiques par un opérateur revêtu du scaphandre standard. TABLEAU 12 Essai uniformité de teneur net 66 nef 117 total nef 182 gag 183 gag 253 env 303 14,40 17,74 16,19 13,28 16.74 17,53 14,38 17,75 16,21 13,27 17,27 17.63 14.67 16,36 16.61 13,41 16,89 18,36 échantillon 1 14,49 17,28 16,34 13,32 16,97 17,84 13,42 17,11 15,32 12,66 15,56 16,36 13,81 17,04 15,32 12.67 15,89 16,51 13,77 17,06 15,33 12,45 15,16 16,41 échantillon 2 13,67 17,07 15,32 12,59 15,54 16,43 13,58 17,08 15,33 12,68 15,64 16,29 13,70 17,08 15.31 12,62 15,82 16,28 13,59 17.05 15,31 12,32 14,85 16,37 échantillon 3 13,62 17,07 15,32 12,54 15,44 16,31 13,20 16,80 15,14 12,23 16,05 16,15 14.53 17,34 15,74 13,06 15,93 17.17 13,49 16,86 15,17 12,31 15,44 16,15 échantillon 4 13,74 17,00 15,35 12,53 15,80 16,49 13,88 17,21 15,40 12,52 14,78 16,80 13,94 17,17 15,39 12,59 15,20 16,72 13,98 17,19 15,47 12,96 15,49 16,71 échantillon 5 13,94 17,19 15,42 12,69 15,16 16,74 14,03 17,26 15,75 11,62 15,78 16,97 13,99 17,20 15,73 11,39 15,77 17,02 14,20 17,26 15,74 12,19 15,90 16,80 échantillon 6 # 14.07 17.24 15.74 11,73 # 15,81 16.93 13,78 17,29 15,67 12,69 16,13 18,04 13,94 17,22 15,57 12,67 16,40 17,50 13,95 17.23 15,55 12.28 16,19 17,37 échantillon 7 13,89 17,25 15,60 12,55 16,24 17,64 13,84 17,06 15,38 12,50 15,62 17,90 13,65 17,09 15,45 12,44 16,02 17,73 13,73 16,94 15,37 nd 16,21 17,54 échantillon 8 13,74 17,03 15,40 12,47 15,95 17,73 14,03 17.40 15,66 12,77 16,46 18.56 14,07 17,33 15,72 11,92 16,61 18,41 13.89 17,39 15,72 12,68 15,94 18,37 échantillon 9 14,00 17,37 15,70 12,46 16,34 18,45 13,34 16,88 15,33 12,07 14,70 17,92 13,71 17,24 15,66 12,36 15,12 18,50 13.53 16,93 15,44 12,28 14,44 18,01 TABLEAU 12 (suite) Essai uniformité de teneur échantillon 10 13,53 17,02 15,48 12,24 14,76 18,14 13,72 17.22 15,64 12,41 14,89 18,32 13,75 17,33 15,72 12,36 14,82 18,31 13,67 17,21 15,72 11,86 14,61 18,69 échantillon 11 13,71 17,25 15,69 12,21 14,77 18,44 13,62 17,11 15,60 12,28 14,75 18,42 13,74 17,13 15,70 12,44 14,98 18,31 13.75 17,16 15,63 12,51 15,37 18,32 échantillon 12 13,70 17,13 15,65 12,41 15,03 18,35 13,32 16,36 14,74 12,47 16,17 15,44 13,31 16,41 14,68 12.51 16,26 15,56 13,34 16,38 14,67 12,53 16,17 15,43 échantillon 13 13,32 16,38 14,70 12,50 16,20 15,48 13,76 16,72 14,75 12,67 16.10 15,59 13,56 16,35 14,75 12,64 16,16 15,64 13,60 16,67 14,76 12,64 16,06 15,64 échantillon 14 13,64 16,58 14,76 12,65 16,10 15,62 13,36 16,40 14,53 12,48 15,90 15,64 13,41 16,35 14,57 12,52 15,84 15,80 13,44 16.43 14,50 12,46 15,77 15.60 échantillon 15 13,40 16,39 14,53 12,49 15,84 15,68 m 13,69 16,91 15,28 12,49 15,81 16,82 écart type 0,27 0,37 0,42 0,28 0,59 1,19 t@s 0,58 0,79 0,89 0,59 1,24 2,51 min 13,11 16,12 14,39 11,91 14,57 14.30 max 14,27 17,70 16,18 13,08 17,05 19,33 t = 2,110 3 valeurs abhérrantes sur échantillon 1 (erreur de dilution probable) essai uniformité de teneur min accepté (-15%) 11,64 14,37 12.99 10,62 13.44 14,29 max accepté (+15%) 15,74 19,45 17.58 14,37 18,18 19,34 écart observé 4,23% 4,67% 5,84% 4,70% 7,84% 14,95% TABLEAU 13 Lignées CTL Peptides reconnus Petits peptides reconnus anti-7 peptides 92102 GAG 2466281 921 OS NEF 125-147 92109 NEF 101-126 NEF 101-110 NEF 116-126 NEF 125-147 NEF 128-136 NEF 155-178 NEF 169-178 NEF 201-225 NEF 215-225 GAG 246-281 92120 GAG 246-281 92125 NEF 155-178 NEF 169-178 92129 NEF 125-147 NEF 128-136 NEF 155-178 NEF 169-178 NEF 201-225 NEF 201-211 NEF 211-219 92117 négative 92127 NEF 101-126 NEF 125-147 NEF 155-178 REVENDICATIONS 1. Micelles mixtes ou micro-agrégats pour l'induction d'une réponse immunitaire contenant au moins: - un premier lipopeptide comprenant au moins un épitope CTL et au moins un motif lipidique, et - un second lipopeptide comprenant au moins un épitope T auxiliaire et au moins un motif lipidique, dont la nature peut être différente du motif du premier lipopeptide. 2. Micelles ou micro-agrégats selon la revendication 1, caractérisés en ce que les lipopeptides comprennent indépendamment un ou plusieurs motifs lipidiques en C4 à C18. 3. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisés en ce que les lipopeptides comprennent indépendamment une ou deux chaînes lipidiques en C4 à C18 associées par liaison covalente à un ou deux acides aminés de la partie peptidique. 4. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que les motifs lipidiques des lipopeptides sont constitués de deux chaines d'acide palmitique liées aux groupements NH2 d'une lysine. 5. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les motifs lipidiques des lipopeptides comprennent indépendamment un résidu d'acide palmitique, d'acide 2-amino hexadécanoïque, d'acide oléique, d'acide linoléique, d'acide linolénique de pimélautide, de triméxautide ou un dérivé du cholestérol. 6. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que la partie non lipidique des lipopeptides, comprenant les épitopes. comprend entre 10 et 100, et préférentiellement entre 10 et 50 acides aminés. 7. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que l'épitope T auxiliaire est un épitope multivalent. 8. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que I'épitope T auxiliaire est le peptide 830-843 de la toxine tétanique présentant la séquence suivante: QYIKANSKFIGITE 9. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que l'épitope T auxiliaire est 'épitope de l'hémagglutinine ou 'épitope PADRE. 10. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisés en ce que les lipopeptides contiennent au moins un épitope CTL d'une protéine spécifique du mélanome, d'une protéine du VIH, du VHB, du papillomavirus, de la protéine p-53, ou d'une protéine spécifique de Plasmodium falciparum. 11. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisés en ce qu'ils comprennent les lipopeptides suivants: GAG 17 EKIRLRPGGKKKYKLKHIV K(Pam)-NH2 GAG 253 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD K(Pam)-NH2 POL 325 AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY K(Pam)-NH2 NEF 66 VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL K(Pam)-NH2 NEF 116 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL K(Pam)-NH2 RR Ac-QYIKANSKFIGITELKK K(Pam)-NH2 12. Micelles ou micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisés en ce qu'ils comoprennent les lipopeptides suivants: LSAE CTî LLSNlEEPKENllDNLLNNlK(Pam)-NH2 LSA3 NRI Ac-DELFNELLNSVDVNGEVKENILEESQK(Pam)-NH2 LSA3 NRII Ac-LEESQVNDDIFNSLVKSVQQEQQHNVK(Pam)-NH2 LSA3 RE k(Pam)VESVAPSVEESVAPSVEESVAENVEESVAENV-NH2 13. Utilisation de micelles ou de micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 12 pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique. 14. Utilisation de micelles ou de micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 12 pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre du VIH, du VHB, du papillomavirus, de la p53, du mélanome ou de la malaria induite par Plasmodium falciparum. 15. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une dose pharmacologiquement efficace de micelles ou de micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 12 et des excipients pharmaceutiquement compatibles. 16. Médicament ou vaccin, caractérisé en ce qu'il contient des micelles ou des micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 12. 17. Procédé de fabrication de micelles ou de micro-agrégats selon l'une des revendications 1 à 12, comprenant les étapes suivantes: - dispersion de chacun des lipopeptides les constituant dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80% puis - mélange des solutions ainsi obtenues 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que l'obtention d'une dispersion des lipopeptides mis en solution dans l'acide acétique est vérifiée par la méthode de résonance magnétique nucléaire en deux dimensions.