Brevet FR2762602A1 — publié le 19981030

Tests et kits pour la détection précoce de pathologies auto-immunes inflammatoires. L'invention a pour objet des moyens pour la détection précoce de pathologies auto-immunes inflammatoires. Elle concerne en particulier des outils, méthodes et kits, permettant de prédire de manière précoce la survenue de poussées cliniques, ou de lésions, telles qu'observées dans les maladies auto-immunes du système nerveux central ou périphérique, par exemple dans le cas de la sclérose en plaques, ou des neuropathies périphériques associées à des gammopathies à IgM, ou de la maladie de Guillem-Barré, ou dans des maladies autoimmunes telles que la polyarthrite rhumatoïde. On rappelle que la sclérose en plaques (en abrégé SEP), affection démyélinisante du système nerveux central, est caractérisée par la survenue des lésions inflammatoires et démyélinisantes disséminées ("plaques") dans la substance blanche encéphalique et médullaire. Les mécanismes de la constitution des nouvelles lésions de la SEP commencent à être bien connus. Ils comprennent les étapes de : 1) présentation d'un antigène par des cellules de la ligne macrophagique aux lymphocytes T auxiliaires en présence de cytokines proinflammatoires, 2) prolifération des lymphocytes et leur différention, 3) rupture de la barrière hématoencéphalique et passage de ces cellules immunocompétentes dans le parenchyme qui provoquent une démyélinisation. Les lésions peuvent évoluer vers une perte axonale et/ou une gliose astrocytaire. On distingue, trois formes évolutives principales de SEP, qui se caractérisent par leur évolution clinique, mais aussi par la localisation des lésions, les anomalies d'imagerie en résonance magnétique (IRM) et les perturbations immunologiques associées. La forme la plus fréquente est la forme rémittante caractérisée par une évolution par poussées espacées de rémissions plus ou moins complètes. La forme progressive primaire est caractérisée par une évolution régulière et progressive depuis le début de la maladie. Dans la forme progressive secondaire, une phase d'évolution progressive succède à une phase rémittente. La fréquence des poussées est très variable d'un patient à l'autre et leur sévérité n'est pas prévisible. Ainsi, la rareté des poussées est habituellement un facteur prédictif d'un faible handicap. Certains patients développeront cependant de lourdes séquelles au cours d'un petit nombre de poussées. Au contraire, d'autres patients ne garderont que peu de séquelles malgré une fréquence élevée de poussées. Les études IRM ont montré que la plupart des patients présentent une activité de leur maladie (apparition de lésions nouvelles) en dehors des poussées cliniques, mais que cette activité est très variable d'un patient à l'autre. Ce processus de rémission, suivi de poussées se retrouve dans les autres pathologies auto-immunes inflammatoires évoquées ci-dessus, par exemple dans la polyarthrite rhumatoïde. Les thérapeutiques actuelles consistent essentiellement en un traitement des symptômes cliniques. Elles consistent en effet à la suppression des poussées par des immunosuppresseurs ou par l'administration de corticoïdes. Ces thérapeutiques méritent cependant d'être prescrites à bon escient étant donné les effets secondaires non négligeables des médicaments administrés et leur coût élevé. Cette situation a conduit à rechercher des marqueurs biologiques permettant de prédire la survenue d'une poussée. Pour la SEP par exemple, plusieurs stratégies ont été appliquées. Ainsi, il a été montré que les patients atteints de formes bénignes de SEP avaient tendance à avoir une accumulation plus faible de nouvelles lésions en IRM sur une année, mais ceci est une constatation rétrospective peu utile en pratique thérapeutique. La production de TNF-a par les cellules mononucléaires circulantes du sang a été considérée comme un marqueur prédictif de la survenue d'une poussée clinique ou d'une nouvelle lésion, mais les données d'une étude à l'autre restent contradictoires et ce marqueur ne permet de prévoir ni la sévérité, ni les séquelles de la poussée. Ce marqueur n'est donc pas utilisé en routine. Les travaux des inventeurs dans le domaine de ces neuropathies (1) et (2) les avaient amenés à mettre en évidence des taux élevés d'anticorps anti-NO-cystéine ou encore d'anticorps anti-acides gras chez les malades atteints d'affections de ce type. En utilisant un modèle animal d'encéphalite autoimmune expérimentale (EAE), dont les symptomes sont proches de la SEP humaine, ils ont réussi à mettre en évidence le rôle de ces anticorps comme marqueurs précoces de l'évolution de la maladie. Les expériences réalisées ont permis de généraliser ces résultats aux affections auto-immunes en général, qu'elles concernent le système nerveux central ou périphérique et autres affections auto-immunes inflammatoires. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux marqueurs et tests permettant de prédire la survenue, la sévérité et l'évolution d'une poussée et de procéder ainsi à un traitement préventif précis des poussées. Les marqueurs prédictifs d'une poussée clinique ou d'une nouvelle lésion d'une maladie auto-immune de système nerveux central ou périphérique sont caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps tels que développés durant la maladie, du groupe constitué par les anticorps anti NO-P, où P représente une protéine, un peptide ou un acide aminé capable d'accepter NO, tel que la cystéine, ou les anticorps anti-acides gras. D'une manière inattendue, la présence de ces anticorps dans le sérum des malades peut être corrélée à la survenue ultérieure d'une poussée ou d'une lésion. Les expériences réalisées sur un modèle EAE, qui sont rapportées dans les exemples donnés ci-après, permettent d'établir une corrélation entre le taux d'anticorps anti-NO-cystéine, le déficit fonctionnel mesuré par la force musculaire et le degré de démyélinisation du cervelet. De même, une corrélation a été établie entre la production d'anticorps anti-acides gras à un stade préclinique et l'évolution ultérieure de la maladie. L'invention fournit également un test de diagnostic précoce de la survenue de poussées et de lésions, caractérisé en ce que les marqueurs du processus inflammatoire, de démyélinisation, et de déficit musculaire sont constitués par des anticorps anti-NO-P, où P est tel que défini ci-dessus, et/ou anti-acide gras. Ce test comprend avantageusement la mesure qualitative et quantitative des anticorps anti-NO-P et/ou anti-acide gras dans le sérum d'un patient par mise en contact du sérum avec un antigène comportant P ou un acide gras, et la révélation de la réaction antigèneanticorps lorsqu'elle s'est produite. La mise en contact comprend l'incubation de l'échantillon testé et de l'antigène à une température appropriée pour la formation du complexe antigèneanticorps. On opère généralement à une température de l'ordre de 37*C. L'antigène est habituellement couplé à une protéine porteuse. Des protéines communément utilisées comprennent la KLH (hémocyanine de patelle) ou la BSA (albumine de sérum bovin), utilisée sous forme délipidée lorsque le test est appliqué à la détermination d'anticorps anti-acide gras. La protéine porteuse est séparée généralement de l'haptène par un bras d'écartement. Il s'agit par exemple de glutaraldéhyde. L'antigène comprend de préférence, comme entité P, un résidu cystéine, et comme acide gras un acide gras quelconque, choisi par exemple parmi l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide palmitoléique, l'acide stéarique, l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide linoléique, l'acide arachidonique, l'acide eicosapentanoique et l'acide docosahexaénoique. L'antigène est préférentiellement fixé sur un support tel qu'une microplaque à multipuits. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le test correspond à une méthode ELISA, un deuxième anticorps étant fixé à l'antigène et révélé selon les techniques connues. L'invention vise également des kits ou trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre des tests ci-dessus. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent: - lesdits antigènes, de préférence fixés sur des supports tels que des microplaques à multipuits, et avantageusement - au moins un tampon de lavage, - au moins un tampon d'incubation, renfermant avantageusement des protéines permettant de fixer les anticorps qui ne sont pas spécifiquement dirigés contre P ou les acides gras, et pour réaliser un test ELISA, - des marqueurs constitués avantageusement par un deuxième anticorps, en particulier un anti-IgM humain, - des révélateurs tels que l'orthophénylènediamine, et - des sérums de contrôle positifs, provenant des patients, et négatifs, provenant de sujets sains. Des notices d'utilisation décrivant les tests et leur mise en oeuvre sont avantageusement joints aux kits. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement, - la figure 1, la densité optique (taux d'anticorps anti-NO-cystéine), et le déficit fonctionnel mesurés durant une EAE chez le rat, - la figure 2, des photographies au microscope optique de sections du cervelet durant l' EAE, et - la figure 3, les coefficients de corrélation entre les anticorps anti-NO-cystéine au 6ème jour après l'induction de l'EAE et la force musculaire. Exemple l : Matériels et méthodes a) Couplage de la cystéine à la BSA (bovine serum albumin ou albumine de sérum bovin) via le glutaraldéhvde. Pour un rapport de couplage de 9, on procède comme suit On prépare tout d'abord - 5 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 5 % (l ml de glutaraldéhyde à 2,5 % + 4 ml d'eau) - du tampon d'acétate de sodium (1,5 M, pH 88,5) - une solution de borohydrure de Na (eau dans un tube de 3 ml avec une petite spatulée de NaBH4) On pèse séparément 3 mg de L-cystéine et 10 mg de BSA. On reprend la L-cystéine dans 1 ml de tampon acétate, puis on ajoute l ul de tyrosine tritiée (H) 1,9 TBq/mmole dans la solution de L-cystéine ; et extemporanément 100 ul de glutaraldéhyde 5 % ainsi que la BSA. Le mélange est soumis à un traitement au Vortex. On laisse jaunir le mélange pendant au moins 5 min, tout en poursuivant de temps en temps le traitement au vortex. On ajoute ensuite 100 ,ul de borohydrure de sodium et on laisse la réaction s'effectuer ensuite pendant 30 min environ en agitant régulièrement. On soumet ensuite le mélange réactionnel à une dialyse pendant 24 h contre de l'eau, en utilisant 3 bains. La radioactivité est comptée sur des aliquots de 100 p1 pris avant et après la dialyse pour calculer le taux de couplage de l'acide aminé à la BSA. La concentration de BSA est évaluée en mesurant la densité optique (DO) à 280 nm. Le rapport de couplage est de 9. Ce rapport est conservé lorsqu'on multiplie par 2 tous les volumes. le produit de couplage formé, désigné ci-après en abrégé par Cys-g-BSA, où g = glutaraldéhyde, répond à la formule b) Nitrosylation de Cvs-g BSA avec NaNO2 On pèse 2 mg de NaNO2 pour l mg de Cys-g-BSA dans un tube à l'abri de la lumière. On ajoute ensuite NaNO2 à 1 ml de Cys-g-BSA, puis HCl (41,7 ul de HCl 12N concentré pour 1 ml). On observe un changement de coloration de la solution vers le jaune pâle. Le mélange est soumis à incubation 4 h à 37-C sous agitation, puis est dialysé pendant 24 h contre le tampon Tris 0,0lu, pH 7,4 (HCl). Pour les 2 bains suivants, on utilise de l'eau. Le conjugué NO-Cys-g-BSA est analysé par spectrophotométrie entre 240 et 500 nm : le NO absorbe entre 320 et 360 nm (3). c) Synthèse de BSA-g On ajoute 100 mg de BSA dans 1 ml de tampon acétate 3M, pH 8, et 2 ml d'eau. On ajoute ensuite l ml de glutaraldéhyde à 1 % et, après 5 min, tout en soumettant de temps en temps le mélange à un traitement au vortex, on ajoute 200 ul de NaBH4. On laisse la réaction s'effectuer pendant 30 min en agitant régulièrement, et on dialyse le mélange réactionnel pendant 24 h contre H20 en utilisant 3 bains. d) Préparation de BSA délipidée (dBSA) On pèse 8 x l g de BSA dans des tubes de 50 ml, puis on ajoute 10 ml d'H20 et on soumet à un traitement au Vortex pour une dissolution complète. On ajoute ensuite 10 ml de fréon (l,l,2-trichlorotrifluoroéthane C2C13F3) conservé à 49 C. Après un vortex de 1 min pour mélanger les 2 phases (le tube est rempli de mousse blanche), on centrifuge 10 min à 2000 tpm pour séparer les 2 phases et on récupère la phase supérieure aqueuse, qu'on met à lyophiliser dans un grand bécher en couvrant de parafilm ou dans 8 tubes de 50 ml congelés penchés. e) délipidation du sérum ou d'une Protéine La délipidation se fait volume à volume avec du fréon, en agitant 2-3 minutes, puis en centrifugeant 15 min à 10000 tpm. La phase aqueuse (couche supérieure) est récupérée. f) Synthèse des acides gras-dBSA par l'éthylchloroformate Dans des tubes préalablement délipidés au méthanol, on pèse ou on introduit avec une pipette 1 mg 2,5 mg- ou 5 mg d'acides gras, selon le rapport de couplage désiré, respectivement 10 ; 20 et 40. On pèse ensuite 20 mg de dBSA On reprend l'acide gras dans 1 ml de méthanol anhydre + 10 pl de triéthylamine anhydre + 1 pl de palmitate C14 et on laisse h minimum sur silicagel. On reprend ensuite la dBSA dans 2 ml de phosphate Caca2 1 mM + 10 pi de triéthylamine. En opérant en chambre froide, on ajoute 200 pi d'éthyichioroformate dilué au 1/16 dans du diméthylformamide anhydre (12,5 d d'éthyichloroformate dans 187,5 pi de diméthylformamide) dans l'acide gras. On soumet le mélange réactionnel à un traitement au vortex 30 sec et on laisse 3 min (activation des COOH). On ajoute ensuite la dBSA en agitant avec le vortex. On ajoute 2 ml de la solution du ler bain de dialyse pour favoriser la solubilité du conjugué, puis on mesure la radioactivité (10 pl d'échantillon + 90 pi d'H20 dans 2 ml de liquide scintillant). On procède ensuite à une dialyse 12 heures dans un mélange 1/3 méthanol, 1/3 diméthylformamide et 1/3 phosphate Caca2, 1 mM, puis on effectue 2 bains de phosphate Cal2, lmM. On mesure la radioactivité avec 100 pi d'échantillon dans 2 ml de liquide scintillant. On établit un spectre de 240 à 320 nm afin de déterminer sa concentration en relevant les DO à 300 et 280 nm (e BSA : 34500). Les conjugués acides gras se conservent plusieurs mois à -80-C. g) Test ELISA avec NO-Cys-g-BSA On utilise des plaques Nunc MaxisorpX à 96 puits (test à 200 pi). Le revêtement des plaques est effectué à l'aide de 10 pg de NO-Cys-g-BSA/ml dans du tampon carbonate pH 9,6 (témoin BSA-g) pendant environ 16h, à 4C, sous agitation. Pour saturer tous les sites non spécifiques, on utilise comme tampon PBS Tween 20X, auquel on ajoute 10% de glycérol et 1 mg/ml de BSA (tampon X) pendant 1 h à 37il. On procède à 2 rinçages au PBS Tween 20. Le sérum ou les anticorps du patient, ainsi que les témoins, sont dilués à 1/500 dans le tampon X additionné de 0,1 % BSA-g. On procède à 2 rinçages au PBS Tween On utilise, comme anticorps secondaire, un anticorps anti-IgM humain (anti-IgM, IgA, IgG de Pasteur Diagnostics), dilué à 1/5000 dans le tampon PBS Tweens additionné de 1 mg/ml de BSA, pendant 1 h à 37*C. On procède à 3 rinçages au PBS Tween La révélation est effectuée à l'aide de OPD 2g/l en tampon citrate phosphate + H202 0,1 % pendant 10 min à l'obscurité. Pour arrêter la réaction, on ajoute 50 pi de H2SO4 4N. Les lectures de la DO sont effectuées à 490 nm. h) Test ELISA avec Ole-dBSA (Ole = acide oléique) - Tests pour les malades On utilise des plaques de polystyrène Polysorp, Nunc qu'on recouvre avec 200 pi d'une solution contenant le conjugué acide gras -dBSA ou la dBSA, à une concentration de 50 pg/ml dans du tampon carbonate (pH 9,6) + 1 mM de CaCl2, pendant 16 h à 4iC, sous agitation (témoin : dBSA). On n'effectue pas de saturation. Les plaques sont rincées 2 fois avec 1 mM CaCl2 et du PBS. On ajoute l'anticorps I (AcI) dilué au Y250 dans du tampon PBS (450 mM, NaCi), CaCl2 1 mM + 1 mg/ml de BSA pendant 2 h à 37'C. On effectue 2 rinçages avec PBS + CaCl2 1 mM. On ajoute le 2ème anticorps (AcII) dilué au 1/5000 (anti-IgM, anti-IgA et anti-IgG humain, Institut Pasteur, Diagnostics) dans du tampon PBS + CaCl2 1 mM + 1 mg/ml de dBSA, pendant 1 h à 37 C. On procède à 3 rinçages avec PBS-Tween R et à une révélation avec OPD 1 g/l + H202 0,05 % pendant 10 min (demi-obscurité). On arrête la réaction par addition de H2SO4 4N et on procède à la lecture de la DO à 490 nm. - Tests pour les rats. On opère comme indiqué ci-dessus mais Ac I est dilué au 1/500 et AcII (anti-IgM et anti-IgG de rat, Jackson Immunoresearch) est utilisé à raison de 0,12 mg/l de tampon. i) Tampons Acétate pH 8 3 M 12,3 g/ 50 ml HCl 0,5 M 41,7 pl/ml PBS pH 7.2 NaCl 9 g/l d'eau Na2HPO4 1,42 g/l d'eau NaH2PO4, H20 0,276 g/l d'eau PBS-Tween 50 pi de Tween 20#/l de PBS Revetement (tampon de carbonate pour test ELISA) Na2CO3 2,65 g/500 ml d'eau NaHCO3 4,2 g/ l d'eau Le pH est ajusté à 9,6 en versant Na2C03 dans NaHCO3 Citrate phosphate pH 5 citrate de Na 10,5 g/l d'eau Na2HPO4 17,8 g/l d'eau Orthophénylène diamine OPD 4 g/100 ml d'eau Exemple 2: Etude de l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE) chez le rat corrélation entre le taux d'anticorps anti-NO cystéine et l'intensité du déficit musculaire ultérieur et la démyélinisation ultérieure. En opérant selon Wekerle (4) on provoque chez le rat Lewis, une encéphalite autoimmune expérimentale active par injection d'un peptide de protéine basique myélinique (acide aminé en position 68 à acide aminé en position 84). Au cours d'une étude suivie sur 4 semaines, trois parametres ont été analysés et corrélés : (a) le taux d'anticorps sérique anti-NO cystéine, (b) le déficit fonctionnel déterminé par la force musculaire durant le développement de 1'EAE et (c) le degré de démyélinisation du cervelet. Dans une première étape, on mesure par ELISA le taux d'anticorps sériques anti- NO-cystéine. Les valeurs sont exprimées en DO moyenne +/- S.E.M. Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure la qui donne la DO mesurée. Dès le 6ème jour après l'induction, on observe une réponse IgM anti-NO-cystéine significative, dans les sérums des animaux EAE, par rapport aux témoins. La DO est en effet de 0,51 + 0,05 (moyenne + S.D; intervalle de 0,32 à 0,72) contre 0,13 i 0,01 (intervalle de 0,08 à 0,15) chez les témoins [F448= 21,43; p Les essais de compétition montrent que les anticorps sont spécifiquement dirigés contre l'épitope NO-cystéine. Dans les sérums des rats avec EAE, on n'observe aucune réponse IgG, mais seulement une réponse IgM dirigée contre la NO-cystéine, cette réponse n'étant plus détectable ensuite durant la EAE. Dans une deuxième étape, on examine si l'altération des titres en anticorps anti-NO-cystéine est associée aux variations de signes cliniques, en déterminant les variations de la force musculaire.des membres postérieurs. On a représenté sur la figure lb les résultats obtenus, les déficits musculaires étant exprimés en % de la force musculaire des membres postérieurs des animaux témoins (n=5). Les valeurs données sont des moyennes i S.E.M.. On a effectué 10 mesures sur chaque animal (n=9) par jour. Le déficit fonctionnel est significatif au 18ième jour après l'injection et persiste jusqu'au 26ème jour. Les rats EAE montrent une perte importante de leur force musculaire de l'ordre de 50 à 60 % par rapport aux animaux témoins. On observe également chez les rats EAE, par rapport aux témoins, une diminution du poids corporel au moment où les signes cliniques apparaissent, mais aucune corrélation n'a été établie entre les signes cliniques et le poids corporel. corrélation entre le taux d'anticorns et la démyélinisation du cervelet. On mesure à la fin de l'étude l'étendue de la démyélinisation chez les animaux EAE. On procède à une coloration spécifique de la myéline en opérant selon la méthode de SPIELMEYER (1). Sur la figure 2 on a représenté les photos au microscope de sections sagittales du cervelet de témoins (a, b, c) et de rats EAE (d, e, f). Les flèches sur les figures a) et d) indiquent les parties représentées, respectivement, sur les figures b) et e). Les sections sagittales adjacentes sont immunocolorées à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés vers la protéine basique de myéline (PBM) (c,f). La quantification de la myéline est effectuée en déterminant la réaction immunohistochimique avec les anticorps anti-PBM en utilisant le système Samba 2640 (Alcatel, TITN, Answare, France). Pour chaque animal, on étude 4 sections, en mesurant la DO moyenne (DOm) par surface définie ( E ). Pour chaque section, le marquage de la PBM est mesuré dans la partie intérieure de la couche granulaire à l'intérieur de 3 lobes différents (4, 6, 8). Comme valeurs témoins, on utilise la couche moléculaire du cervelet connue pour contenir principalement des fibres dépourvues de myéline. Les données quantitatives sont exprimées en unités arbitraires (DOn/surface). Les symboles utilisés ont les significations suivantes : cp = pédoncule du cervelet m - moelle du cervelet ; gl = couche granulaire du cortex du cervelet ; la tête de la flèche indique la partie distale de la moelle du cervelet. Les barres représentent 350 pm pour (a, c, d, f) et 85 pm pour les détails donnés sur b et e. La diminution de fibres de myéline apparaît la plus prononcée dans le pédoncule et la moelle du cervelet, ainsi que dans le premier tiers de la couche granulaire du cortex du cervelet. De plus, l'importance de la maladie apparaît corrélée avec le processus de démyélinisation comme montré par la disparition complète des fibres de myéline dans la moelle distale en contact avec le cortex du cervelet des animaux les plus affectés (fig. 2e). L'analyse quantitative du marquage immunohistochimique de la myéline du cervelet avec les anticorps anti-protéine basique de myéline confirme les résultats de la disparition de myéline dans le cervelet (fig. 2 f). Les animaux EAE les plus affectés présentent une diminution de 28 % de PBM par rapport aux rats témoins (df = 8 ; t = 2,64 ; O = 002) coefficient de corrélation entre les anticorps anti-NO-cvstéine au 6ème jour et la force musculaire Les résultats obtenus montrent que le taux d'anticorps anti-NO-cystéine permet de prédire les signes pathophysiologiques dans i'EAE. En réalité, un rapport inverse direct existe entre d'une part le taux d'anticorps anti-NO-cystéine au 6ème jour après l'induction et d'autre part la force musculaire des membres postérieurs au 22ème jour (Bravais Pearson coefficient, r3-0,72 ; p = 0,016) à 24 dpi (r=0,81 ; p = 0,008) à 26 dpi (r=0,96 ; p = 0,0001). et les valeurs de myéline des rats EAE (r = 0,77 ; p 5 0,014). Sur la figure 3, on a représenté le coefficient de corrélation entre le taux d'anticorps anti-NO-cystéine au 6ème jour après l'induction et les valeurs de la force musculaire des membres postérieurs au cours de l'étude pour les rats EAE (n = a) du jour O au 26ème jour. Chaque symbole ( + ) représente la valeur r du coefficient de corrélation de Bravais Pearson. La ligne en pointillés représente le niveau significatif de 0,05 (df = 7). Pour chaque valeur r, on représente le relevé dispersé des anti-NO-cystéine individuels contre la force musculaire des membres postérieurs en association avec la courbe de régression. L'augmentation du coefficient de corrélation entre les anticorps anti-NO-cystéine au 6ème jour et la force musculaire durant L'EAU indique une dynamique fonction du temps. De plus, la disparition de myéline et la perte de force musculaire des membres postérieurs au 24ème jour, sont corrélées de manière significative pour le 24ième jour (r = 0,72 ; p = 0,029) et le 26ème jour (r = 0,72 ; p = 0,027) En conclusion, ces résultats montrent l) la présence d'anticorps anti-NO-cystéine dans les échantillons de sérums de patients atteints de SEP 2) la présence de ces anticorps anti-NOcystéine à un stade préclinique au cours d'une EAE chez le rat ; et que 3) le taux des anticorps anti-NO-cystéine est un marqueur précoce de l'évolution pathologique de la maladie. ExemDle 3 : Etude cliniaue Un groupe de 10 patients présentant une SEP évoluant par poussée, caractérisé par une activité clinique importante l'année précédent l'inclusion, a été suivi sur le plan clinique et biologique. Les critères d'inclusions des 10 patients sont indiqués ci-après Il s'agit de patients - présentant une SEP certaine selon les critères de Poser et al (5), - ayant une forme rémittente avec ou sans séquelles selon Lublin et Reingold (6), - ayant un handicap modéré mesuré selon l'échelle Expanded Disability Status Scale de Kurtzke (11) (EDSS), score EDSS - présentant une SEP active, à savoir ayant eu au moins deux poussées dans les deux ans précédant l'inclusion, - à plus d'un mois de la fin de la dernière poussée lors de l'inclusion, - n'ayant pas pris de corticoïdes depuis au moins un mois au moment de l'inclusion, - éventuellement sous un traitement de fond par azathioprine ou béta-interféron, mais ayant débuté depuis au moins 3 mois. - ayant signé une feuille de consentement éclairé après avoir reçu une lettre les informant des objectifs de l'étude. On procède tout d'abord à une évaluation clinique (vérification des critères d'inclusion, signature du consentement, examen neurologique pour mesure du score de l'EDSS et de l'index Ambulatoire de Hauser et al. (7) et Rine Hole peg test (9HPT) pour mesurer les fonctions motrices des membres supérieurs. On effectue ensuite les prélèvements biologiques. Un prélèvement de 0,5 ml de sang sur tube sec, par ponction digitale à l'inclusion, puis tous les 15 jours au domicile du patient par l'infirmière enquêtrice pendant toute la durée du suivi. En cas de poussée clinique, on évalue le score EDSS maximum au cours de la poussée. Le traitement habituel des poussées a été effectué (méthylprednisolone 1 g/j/5j IV) Un prélèvement sanguin a été effectué lors de cette évaluation clinique et le patient convoqué pour une évaluation clinique de contrôle un mois après la poussée (EDSS, Index ambulatoire, 9 HPT). Le suivi biologique est ensuite poursuivi jusqu'à la fin de l'étude. dosages On a mesuré par ELISA le taux (DO) d'anticorps anti-NO cystéine selon la méthode ci-dessus. Le criètre principal d'évaluation a consisté à rechercher une corrélati Références bibliographiques 1. A. I. Boullerne et al, J. Neuroimmunol. 60, 117-124 (1995) 2. A.I. Boullerne et al, J. Neuroimmunol. 65. 75-81 (1996) 3. J.S. Stamler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 444 (1992) 4. H. Wekerle, Curr. Opin. Neurobiol. 3, 779 (1993) 5. C.M. Poser et al, Ann. Neurol. 13, 227-231 (1983) 6. F.D. Lublin et al, Neurology, 46, 907-911 (1996) 7. S.L. Hauser et al, N. Engl. J. Med., 308 ; 173-180 (1983) REVENDICATIONS 1/ Marqueurs prédictifs d'une poussée clinique ou d'une nouvelle lésion d'une pathologie autoimmune inflammatoire, caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps tels que développés durant la maladie, du groupe constitué par les anticorps anti-NO-P, où P représente une protéine, un peptide, ou un acide aminé, capable d'accepter NO, tel que la cystéine, ou les anticorps anti-acides gras. 2/ Test de diagnostic précoce de la survenue de poussées et de lésions, dans une pathologie auto-immune inflammatoire, caractérisé en ce que les marqueurs du processus inflammatoires, de démyélinisation, et de déficit musculaire sont constitués par des anticorps anti-NO-P, où P est tel que défini dans la revendication 1 et/ou anti-acide gras. 3/ Test selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend avantageusement la mesure qualitative et quantitative des anticorps anti-NO-P et/ou anti-acide gras dans le sérum d'un patient par mise en contact du sérum avec un antigène comportant P ou un acide gras, et la révélation de la réaction antigèneanticorps lorsqu'elle s'est produite. 4/ Test selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on incube le sérum et l'antigène à une température d'environ 37il. 5/ Test selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'antigène est couplé à une protéine porteuse, telle que KLH ou l'albumine de sérum bovin, utilisée sous forme délipidée lorsque le test est appliqué à la détermination d'anticorps anti-acide gras. 6/ Test selon la revendication 5, caractérisé en ce que la protéine porteuse est séparée de l'haptène par un bras d'écartement, tel que le glutaraldéhyde. 7/ Test selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 caractérisé en ce que l'antigène comprend de préférence comme protéine P un résidu cystéine et comme acide gras un acide choisi parmi l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide palmitoléique, l'acide stéarique, l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide linoléique, l'acide arachidonique, l'acide eicosapentanoique et l'acide docosahexaénoïque. 8/ Test selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il est réalisé selon ELISA et comprend l'utilisation d'un deuxième anticorps fixé à l'antigène et révélé selon les techniques connues. 9/ Kits ou trousses de diagnostic de survenue de poussée ou de lésions dans les pathologies autoimmunes inflammatoires, caractérisés en ce qu'ils comprennent - les antigènes tels que définis pour la mise en oeuvre du test selon la revendication 7, de préférence fixés sur des supports tels que des microplaques à multipuits et, avantageusement, - au moins un tampon de lavage, - au moins un tampon d'incubation, renfermant avantageusement des protéines permettant de fixer les anticorps qui ne sont pas spécifiquement dirigés contre P tel que défini dans la revendication 1 ou les acides gras et, pour réaliser un test ELISA, - des marqueurs, constitués par un deuxième anticorps, en particulier un anti-IgM humain, - des révélateurs tels que l'orthophénylènediamine, et - des sérums de contrôle positifs et des sérums de contrôle négatifs, avec des notices d'utilisation décrivant les tests et leur mise en oeuvre.