Brevet FR2765078A1 — publié le 19981231

Procédé d'amélioration de l'efficacité d'un probiotique, préparation d'additifs alimentaires et aliments pour animaux la contenant. La présente invention concerne un procédé pour améliorer l'efficacité zootechnique du probiotique formé de Bacillus cereus CIP 5832, une préparation d'additifs alimentaires non médicamenteux et les aliments pour animaux la contenant. Les probiotiques constituent une classe d'additifs alimentaires non médicamenteux de plus en plus utilisés en production et en alimentation animales. Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui, une fois ingérés, sont capables d'améliorer les performances zootechniques des animaux, tant chez les mammifères que chez les oiseaux. Les performances zootechniques les plus recherchées par les éleveurs sont la croissance des animaux et leur indice de consommation (quantité d'aliment nécessaire pour produire une unité de gain de poids). De nombreuses espèces et souches de bactéries, levures ou champignons ont été proposées comme probiotiques. Le mode d'administration d'un probiotique le plus couramment utilisé est l'incorporation de l'additif dans l'aliment ou dans l'eau de boisson des animaux. Que ce soit dans l'aliment ou dans l'eau de boisson, pour que le probiotique soit efficace, il est nécessaire que le microorganisme le constituant conserve son intégrité physiologique et reste vivant. Ainsi, le brevet FR-2 616 662 nous enseigne que le Bacillus cereus CIP 5832 augmente la croissance et diminue l'indice de consommation de plusieurs espèces animales, oiseaux ou mammifères. Pour obtenir ces effets zootechniques, le probiotique doit être incorporé à raison de 100 000 à 000 000 germes revivifiables par gramme d'aliment. Le brevet EP-0 399 819 nous apprend qu'on peut préserver l'efficacité du probiotique constitué de Bacillus cereus var. toyoi en protégeant son intégrité par l'incorporation du probiotique dans un carbohydrate obtenu à partir d'une céréale. R. HAVENAAR et al. (Selection of strains for probiotic use. In Probiotics. The Scientific Basis. Edited by R. FULLER. Chapman & Hall Ed., 1992, pages 209-224) ont décrit les critères de sélection in vitro des microorganismes capables d'être retenus comme probiotiques. Parmi ces critères, la résistance aux antibiotiques et aux substances antimicrobiennes est une nécessité. Le lysozyme est un polypeptide antimicrobien naturel qu'on trouve dans de nombreux organes ou humeurs liquides de l'homme, des animaux, et voire des plantes. Aini, le lysozyme peut être isolé du lait, des larmes, de la salive et du mucus nasal des humains. On le trouve dans le lait et le colostrum de la vache. On a pu aussi isoler le lysozyme dans le jus de chou- fleur. Cependant, la source la plus abondante qui permet une extraction industrielle de lysozyme est le blanc d'oeuf de poule. Le lysozyme est une enzyme (muramidase, EC. 3.2.1.17) qui est capable de lyser la liaison entre l'acide N-acétylmuramique et la N- acétylglucosamine des peptidoglycanes qui se trouvent en grandes quantités dans les parois des bactéries Gram positif. C'est la raison pour laquelle le lysozyme possède une activité antimicrobienne vis-à- vis des bactéries Gram positif. Parmi ce groupe de bactéries, les Bacillus cereus sont sensibles à l'action inhibitrice du lysozyme. Cette propriété antimicrobienne du lysozyme lui permet d'être couramment utilisé comme conservateur en alimentation humaine et comme médicament en pharmacie humaine. Le brevet FR-2 450 110 nous enseigne que le lysozyme est utilisable pour traiter les animaux domestiques, mammifères ou oiseaux. Ce brevet revendique 1.- Une composition pour le traitement d'animaux souffrant d'une infection provoquée par des microorganismes, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif le lysozyme ou un sel non toxique de ce dernier. 2.- Des produits nutritifs solides ou liquides pour animaux domestiques, caractérisés en ce qu'ils comprennent le lysozyme et/ou au moins un sel non toxique de ce dernier. 3.- Des aliments pour animaux domestiques, caractérisés en ce qu'ils comprennent le lysozyme et/ou au moins un sel non toxique de ce dernier. K. KOUDELA et al. (Zivocisna Vyroba, 1995, 40(7), 313-317) ont montré des effets favorables du lysozyme sur la croissance et l'indice de consommation des poulets ingérant 5, 10, 15 et 20 milligrammes de lysozyme par kilogramme d'aliment. La croissance et l'indice de consommation ont été améliorés sans que les concentrations de corticostérone plasmatique des poulets soient modifiées. Bien que le Bacillus cereus CIP 5832 soit inhibé in vitro par le lysozyme, nous avons découvert, de façon inattendue, que les effets zootechniques favorables de ce probiotique sont renforcés in vivo chez les animaux, mammifères ou oiseaux, par le lysozyme administré par voie orale, de préférence simultanément. La présente invention concerne donc l'utilisation du lysozyme pour renforcer les effets zootechniques du probiotique constitué de Bacillus cereus CIP 5832. Dans la mesure de nos connaissances, cette synergie entre le lysozyme et un Bacillus n'a jamais été décrite et, bien évidemment, le mécanisme pouvant expliquer cette action synergique est inconnu. Les doses d'utilisation du probiotique formé de Bacillus cereus CIP 5832 sont celles couramment utilisées pour ce probiotique, à savoir de 100 000 à 000 000 germes revivifiables par gramme d'aliment. Les doses d'administration de lysozyme ou de l'un de ses sels sont, en fonction de l'effet technique et économique recherché, de 5 à 200 milligrammes par kilogramme d'aliment, avec préférentiellement des doses de 10 à 100 milligrammes par kilogramme d'aliment. Les exemples non exhaustifs et non limitatifs suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1: On coule dans deux boites de Pétri une gélose PCA pour dénombrement (de Biokar, Beauvais, France) et après solidification, on l'ensemence en surface avec une culture de Bacillus cereus CIP 5832. On creuse dans la gélose de chaque boite de Pétri cinq puits à l'emporte pièce de 10 mm de diamètre. On distribue dans le premier puits de chaque boite de Pétri 125 1 d'eau et dans les quatre puits restant 125 il de solutions aqueuses de chlorhydrate de lysozyme (d'Ovonor, Béthune, France) titrant respectivement 10, 50, 100 et 1 000 mg/litre. On fait incuber les boites de Pétri à l'étuve à 37 C pendant 48 heures. Après l'incubation, on observe les résultats suivants: les colonies caractéristiques de Bacillus cereus CIP 5832 se sont développées à la surface de la gélose. Autour des puits contenant des solutions de lysozyme, on observe un halo clair montrant une certaine inhibition du Bacillus. Ce halo n'existe pas autour du puits contenant seulement de l'eau. Les diamètres des halos sont les suivants Lysozyme (mg/litre) Diamètre du halo (mm) 12,0 14,5 16,5 1000 20,3 EXEMPLE 2: On divise 96 porcelets, en parfait santé, en trois lots homogènes de 32 animaux chacun. Pendant l'essai qui a duré 27 jours, on distribue à chacun des lots respectivement l'un des trois aliments ayant la même composition de base mais qui diffèrent par leurs supplémentations en additifs. L'aliment de base a été formulé pour apporter les nutriments suivants Energie nette 2 300 kcal/kg Protéines 17,00% Lysine disponible 1,00 % Méthionine disponible 0,35 % Thréonine disponible 0,61% Matières grasses 2,17 % Cellulose 3,14 % Calcium 0,77 % Phosphore 0,59 % Les supplémentations d'additifs des trois lots sont respectivements LOT 1: Bacillus cereus CIP 5832. (Paciflor C10, N.D., de Prodeta, Vannes, France). l 000 000 germes revivifiables par gramme d'aliment. LGT 2 Bacillus cereus CIP 5832. 1 000 000 germes par gramme d'aliment et chlorhydrate de lysozyme (d'Ovonor, Béthune, France). 10 mg par kilogramme d'aliment. LOT 3 Bacillus cereus 5832. 1 000 000 germes revivifiables par gramme d'aliment et chlorhydrate de lysozyme. mg par kilogramme d'aliment. s Pendant l'essai, les porcelets reçoivent leur aliment et leur eau de boisson ad libitum. Les performances zootechniques mesurées sont - le poids vif initial et le poids vif final, dont on peut calculer la vitesse de croissance exprimée par le gain de poids moyen quotidien, - la consommation d'aliment divisée par le gain de poids ce qui donne l'indice de consommation alimentaire. Les résultats moyens obtenus pendant cet essai de 27 jours sont les suivants LOT 1 LOT 2 LOT 3 Poids vif initial (kg) 14,2 14,2 14,2 Poids vif final (kg) 29,5 29,8 30,7 Gain de poids quotidien 566 577 611 (g/jour) (100 %) (101,9%) (107,9%) Consommation d'aliment 978 954 1 005 (g/jour) Indice de consommation 1,72 1,65 1,64 (100 %) (95,9 %) (95,3 %) Ces résultats montrent que les associations de Bacillus cercus CIP 5832 et de lysozyme permettent aux porcelets d'obtenir des performances zootechniques supérieures à celle obtenues avec le Bacillus cereus CIP 5832 tout seul. Il est à noter que les porcelets dc cet essai sont en parfaite santé et non pas des animaux souffrant d'une infection provoquée par des microorganismes, comme cela est mentionné dans la revendication du brevet FR-2 450 110 cité précédemment. EXEMPLE 3 s On répartit 240 poussins mâles d'un jour en quatre lots de 60 animaux chacun. Les oiseaux sont élevés dans des cages grillagées à raison de 20 animaux par cage et reçoivent leur aliment et de l'eau à volonté. Pendant l'essai qui a duré 21 jours, les 4 lots de poussins reçoivent respectivement l'un des 4 aliments expérimentaux ayant la même formule de base mais contenant des supplémentations différentes. La formule de base apporte les nutriments suivants: Energie métabolisable 11,8 MJ/kg Protéine brute 22,0% Matières grasses 3,7 % Cellulose 2,8 % Matières minérales 6,1% Extractif non azoté 53,4 % Les supplémentations sont respectivements LOT1: aucun additif (témoin négatif) LOT2 Bacillus cereus CIP 5832 à 500 000 germes revivifiables par gramme d'aliment. LOT 3 Chlorhydrate de lysozyme à 10 milligrammes par kilogramme d'aliment. LOT4: Bacillus cereus CIP 5832 à 500 000 germes revivifiables par gramme d'aliment et chlorhydrate dc lvsozyme à 10 milligrammes par kilogramme d'aliment. Le Bacillus cereus CIP 5832 et le chlorhydrate de lysozyme proviennent des mêmes fournisseurs que dans l'exemple précédent. Après 21 jours d'expérience, la croissance des animaux exprimée par le poids final et leur indice de consommation sont les suivantes LOT 1 LOT 2 LOT 3 LOT 4 Poids vif (g) 568 608 546 622 (100%) ( 107%) (96,1%) (109,5%) Indice de 1,575 1,506 1,560 1,502 consommation (100%) (95,6 %) (99,0%) (95,3 %) Ces résultats montrent que - le Bacillus cereus CIP 5832 seul améliore les performances zootechniques des poussins (Lot 2 versus Lot 1); - le lysozyme seul n'a pas amélioré la croissance des poussins et que son effet sur l'indice de consommation est bien faible (Lot 3 versus Lot 1) l'apport simultané de lysozyme augmente les performances zootechniques du probiotique (Lot 4 versus Lot 2). REVENDICATIONS 1. Procédé pour améliorer l'efficacité zootechnique du probiotique formé de Bacillus cereus CIP 5832, caractérisé en ce que l'on administre aux animaux le probiotique et le lysozyme ou l'un de ses sels, par voie orale. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'adminsitration apporte aux animaux de 100 000 à 5 000 000 germes revivifiables de Bacillus cereus CIP 5832 par gramme d'aliment, et de 5 à 200 milligrammes de lysozyme ou d'un de ses sels par kilogramme d'aliment. 3.- Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le probiotique et le lysozyme ou l'un de ses sels sont administrés simultanément. 4.- Préparation d'additifs alimentaires non médicamenteux, caractérisée en ce qu'elle contient le Bacillus cereus CIP 5832 et le lysozyme ou l'un de ses sels. 5.- Aliments pour animaux contenant simultanément le Bacillus cereus CIP 5832 et le lysozyme ou l'un de ses sels