Brevet FR2760640A1 — publié le 19980918

i Utilisation d'une souche de Pasteurella hacmolytica sérotype A6 pour la préparation d'un vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica La présente invention a pour objet l'utilisation d'une souchc de Pasteurella haemolytica d'un sérotype particulier, pour la préparation d'un vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica. Les maladies respiratoires des jeunes bovins, essentiellement du type "broncho-pneumonies infectieuses enzootiques", restent l'un des problèmes pathologiques majeurs des élevages producteurs de viandes rouge et blanche. La mortalité, les frais sanitaires et les mauvais résultats zootechniques qu'elles engendrent sont responsables de lourdes pertes économiques. Parmi ces maladies respiratoires figure la pasteurellose bovine dont l'apparition est liée à l'intervention de deux germes bactériens, Pasteurella haemolytica et Pasteurella multocida, le premier de ces germes étant le plus fréquemment rencontré dans ces affections et le plus pathogène. Cela étant, il convient de rappeler qu'à ce jour, on connaît deux biotypes de Pasteurella haemolytica, à savoir le biotype A et le biotype T; la différence entre ces deux biotypes porte non seulement sur leur capacité à fermenter les sucres (biotype A: arabinose +, tréhalose -; biotype T: arabinose -, tréhalose +), mais aussi sur leurs caractéristiques en culture, leur antibiorésistance, leur génome et leur pathogénicité. Par ailleurs, chacun des biotypes A et T peut en outre être subdivisé en sérotypes. A ce jour, on connaît 17 sérotypes (13 de biotype A et 4 de biotype T). Il a été procédé antérieurement par divers auteurs à des études de la distribution des sérotypes (sérotypages) de Pasteurella haemolytica à partir de prélèvements réalisés sur divers espèces d'animaux. Ainsi, par exemple - H.J. BALL et Coll., Br. Vet. J. (1993), 149, 561 ont montré que sur 165 prélèvements bovins de tous âges, obtenus en Irlande du Nord de 1989 à 1991, le sérotype le plus fréquemment identifié par la méthode de sérotypage par hémagglutination directe a été le sérotype 1 du biotype A ou sérotype A1 (62 prélèvements), suivi dans l'ordre de fréquence décroissante par Pasteurella haemolytica non Typable (38 prélèvements), le sérotype A2 (13 prélèvements), le sérotype T10 (12 prélèvements), le sérotype T15 (8 prélèvements), le sérotype T4 (7 prélèvements), les sérotypes A8 et All (6 prélèvements chacun), les sérotypes A6 et A9 (5 prélèvements chacun) et les sérotypes A14 et A13 (respectivement 2 et 1 prélèvements). On observera toutefois que dans cette étude, seuls 33 prélèvements proviennent du poumon, de sorte qu'il existe un doute sur le caractère significatif des résultats de ladite étude; on sait en effet que comme la partie supérieure du tractus respiratoire des bovins n'est pas un environnement stérile, Pasteurella haemolytica est fréquemment présent dans la cavité nasale des animaux sains et que ce n'est que chez les animaux malades que le germe prolifère et envahit la partie profonde du tractus respiratoire - M.W. ODENTAAL et M.M. HENTON, Journal of Veterinary Research, 62: 223-226 (1995) ont étudié la distribution des sérotypes de Pasteurella haemolytica à partir de prélèvements ovins, caprins et bovins, effectués en Afrique du Sud sur une période de 8 ans, de 1986 à 1994 et montré que sur les 67 prélèvements typables sur 96, le sérotype le plus fréquemment identifié par la méthode d'hémagglutination passive a été le sérotype A1 (38 prélèvements), suivi par le sérotype A14 (8 prélèvements), le sérotype A6 (6 prélèvements) et les sérotypes A2 et A15 (5 prélèvements chacun); - F. TRIGO T. et Coll. lors du Congrès Mondial de Buiatrie d'Edimbourg en 1996, ont présenté une étude sur la distribution des sérotypes de Pasteurella haemolytica et Pasteurella multocida chez les petits ruminants, au Mexique; cette étude a montré que chez les bovins 58 % des prélèvcments sont de sérotype A1, 17 % de sérotype A6, 17 % de sérotype A2, 8 % des prélèvements étant non typables; - J.L. MARTEL et F. POUMARAT lors du Congrès de la Société Française de Buiatrie de Paris en 1988, ont présenté une étude sur les bactéries et les mycoplasmes associés aux maladies respiratoires des jeunes bovins en France et montré la prévalence du sérotype A1, cette espèce représentant environ les 2/3 des prélèvements de pasteurelles chez les bovins malades; J.L. MARTEL et R. SANCHIS ont étudié la fréquence des sérotypes de Pasteurella haemolytica isolés chez les bovins, en France et présenté leurs résultats lors du Congrès annuel de la Société Française de Buiatrie du 29-30 Novembre 1995. Les souches ont été sérotypées par la méthode d'hémagglutination passive. Ils ont ainsi montré que sur les 155 souches d'origine bovine étudiées, 77 % sont de sérotype Ai et environ 6 % ne sont pas typables; les autres souches, très minoritaires, appartiennent aux sérotypes 2 (8 %), 6 (3 %), 11 (2 %), 14 (1 %), 5 et 10( les prélèvements. Ces études antérieures montrent donc clairement que ce sont les souches Pasteurella haemolytica de sérotype A1 qui sont le plus fréquemment rencontrées chez les bovins et donc considérées comme les plus virulentes. Il n'est pas étonnant dans ces conditions que ce sont les souches de ce sérotype qui ont jusqu'ici été le plus largement utilisées dans la mise au point de vaccins contre la pasteurellose bovine. La Demanderesse a elle-même procédé à une étude épidémiologique et a ainsi été amenée à sérotyper 107 souches de Pasteurella haemolytica d'origine bovine, de 1992 à 1995. Les résultats de cette étude sont rassemblés dans le tableau ciaprès. Prélèvement Sérotype Sérotype Sérotype Sérotype Non Total Al A6 A2 A9 typable ATI 23 16 2 0 2 43 (21,49%) (14,95%) (1,86%) (0 %) (1,86%) (40,18%) Autres ú 15 27 2 1 9 54 (14,01%) (25,23%) (1,86%) (0,93%) (8,41%) (50,46%) Inconnu $ 6 1 1 1 1 10 (5,60 %) (0,93 %) (0,93%) (0,93%) (0,93%3 (9,34 %) Total 44 44 5 2 12 107 (41,10%) (41,10 %) (4,67) (1,86) (11,21) ATT = Prélèvement par aspiration trans-traché ú = Prélèvement par écouvillonnage nasal, écouvillonnage naso-pharyngé ou sur poumon sans précision $ = Prélèvement inconnu Ces résultats montrent que si on ne fait aucune distinction au niveau du mode de prélèvement (donc du site de prélèvement), on observera la présence parmi les souches étudiées, d'autant de souches de sérotype A6 que de souches de sérotype A1. L'écouvillonnage nasal ou naso-pharyngé reflète certes l'infection de l'animal, mais on sait que les bovins sont fréquemment des porteurs sains au niveau des voies respiratoires supérieures, et l'examen du mucus nasal reste peu représentatif de la flore pulmonaire. On observe cependant environ 25 % de prélèvements de sérotype A6 contre seulement environ 14 % de prélèvements de sérotype A1 au niveau du tractus respiratoire supérieure. En fait, ce sont les prélèvements trachéo-bronchiques qui reflètent réellement la flore présente au niveau pulmonaire et susceptible d'induire des lésions et comme le montre la ligne AIT du tableau ci- dessus, le sérotype A1 est représenté à environ 21,5 % suivi par le sérotype A6 représenté à environ 15 %. Une proportion significative de Pasteurella haemolytica de sérotype A6 est donc trouvé au niveau du site pulmonaire, observation qui, de manière totalement inattendue, va à l'encontre des conclusions auxquelles étaient parvenus les auteurs des études passées évoquées ci-dessus. Cette différence fondamentale entre l'observation de la Demanderesse et les résultats de ces études antérieures peut s'expliquer notamment: - par les modes de prélèvement qui, dans le plupart des cas de l'étude de la Demanderesse, ont été l'écouvillonnage naso-pharyngé ou l'aspiration trans-trachéale qui présentent la particularité de permettre des prélèvements jusque dans la partie profonde du tractus respiratoire, alors que dans les études antérieures le mode de prélèvement n'est pas précisé ou concerne essentiellement des sites correspondant à la partie supérieure du tractus respiratoire, par le statut pathologique des animaux sur lesquels ont été effectués les prélèvements et qui, dans le cas de l'étude de la Demanderesse, sont tous des animaux malades alors que cette information est inexistante dans certaines des études antérieures. En vue de confirmer l'observation ci-dessus quant au rôle joué par Pasteurella haemolytica sérotype A6 dans les pasteurelloses bovines, la Demanderesse a étudié la pathogénicité de Pasteurella haemolytica sérotype A6. On notera que jusqu'à présent, des infections expérimentales ont été effectuées avec succès sur des pré-ruminants avec Pasteurella haemolytica sérotype A1. En revanche, à la connaissance de la Demanderesse, une infection expérimentale induisant une pneumonie pasteurellique suite à un challenge par un germe Pasteurella haemolytica sérotype A6 n'a encore jamais été décrite dans la littérature. Il a donc été procédé à deux études dont l'objectif était d'induire une pneumonie chez de jeunes veaux par une injection unique de Pasteurella haemolytica sérotype A6 isolée du terrain, pour mettre au point un modèle d'infection expérimentale. Plus précisément, deux veaux de trois semaines ont reçu chacun par injection trans-trachéale pour une introduction dans les bronches 25 ml d'une suspension (dans un milieu liquide maintenant les bactéries en vie, par exemple de l'eau physiologique ou un milieu de culture) contenant pour l'une environ 108 UFC/ml d'une première souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et pour l'autre, 109 UFC/ml de cette même première souche; par ailleurs, deux autres veaux de trois semaines ont recçu chacun par injection trans-trachéale pour une introduction dans les bronches 25 ml d'une suspension contenant pour l'une environ 108 UFC/ml d'une seconde souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et pour l'autre, 109 UFC/ml de cette même seconde souche. Il a été confirmé que les deux souches du terrain testées induisaient après environ 48 heures une pneumonie sévère, quelle que soit la taille de l'inoculum. Il a ainsi été démontré la nature pathogène de Pasteurella haemolytica sérotype A6. Il s'ensuit que, contrairement à ce qui était très largement admis jusqu'à ce jour, non seulement Pasteurella haemolytica sérotype A1, mais également Pasteurella haemolytica sérotype A6 sont tous deux des agents pathogènes majeurs des voies respiratoires bovines, avec bien entendu la possibilité d'utiliser Pasteurella haemolytica sérotype A6 ou Pasteurella haemolytica sérotype A6 conjointement avec Pasteurella haemolytica sérotype A1 pour la mise au point d'un vaccin. Ainsi, l'un des objets de la présente invention est l'utilisation d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 ou d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 conjointement avec une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A1, pour la préparation d'un vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica, étant précisé que chacune de ces souches est de préférence utilisée sous la forme d'un surnageant biologiquement inactivé (avantageusement concentré) d'une culture de la souche. On pourra ainsi disposer d'un vaccin efficace non seulement pour prévenir les pasteurelloses liées à l'intervention de Pasteurella haemolytica sérotype A1, mais également celles liées à l'intervention de Pasteurella haemolytica sérotype A6; un tel vaccin permettra donc de protéger l'espèce bovine de manière beaucoup plus étendue qu'avec les vaccins existant à ce jour et dont la conception est basée sur la seule souche Pasteurella haemolytica sérotype A1. Un autre objet de la présente invention est un vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica, ce vaccin étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément choisi dans le groupe constitué par: a) les cellules bactériennes entières et biologiquement inactivées de Pasteurella haemolytica sérotype A6, b) les fractions de telles cellules biologiquement inactivées, et c) une première substance antigène comprenant un ou plusieurs composants antigènes ayant respectivement une structure chimique sensiblement identique à celle des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6, ladite première substance ou lesdits composants antigènes étant biologiquement inactivés. Par ailleurs, le vaccin selon l'invention peut en outre comprendre au moins un élément choisi dans le groupe constitué par: a') les cellules bactériennes entières et biologiquement inactivées de Pasteurella haemolytica sérotype A1, b') les fractions de telles cellules biologiquement inactivées, et c') une deuxième substance antigène comprenant un ou plusieurs composants antigènes ayant respectivement une structure chimique sensiblement identique à celle des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A1, ladite deuxième substance ou lesdits composants antigènes étant biologiquement inactivés. Dans la mesure o les cellules bactériennes entières susmentionnées et les fractions de celles-ci sont susceptibles de présenter une certaine toxicité intrinsèque, il est préférable selon l'invention qu'elles soient présentes en faible quantité dans le vaccin, voire même non présentes dans le vaccin. Selon une première variante de l'invention, la première substance antigène susmentionnée comprend une partie au moins des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6 et/ou la deuxième substance antigène susmentionnée comprend une partie au moins des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A1. Dans ce cas, lesdits composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6 sont de préférence ceux contenus dans le surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et lesdits composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A1 sont de préférence ceux contenus dans le surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1. On ajoutera que dans le cadre de cette première variante, les composants antigènes sus-visés générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6 et par Pasteurella haemolytica sérotype A1 sont notamment constitués par des protéines et des polysaccharides. Selon une seconde variante de l'invention, particulièrement préférée, la première substance antigène comprend un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et la deuxième substance antigène comprend un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1, ledit ou lesdits concentrés ou surnageant étant biologiquement inactivés. Ainsi, un vaccin tout particulièrement préféré, comprend un mélange d'un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et d'un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1, lesdits concentrés ou surnageants étant biologiquement inactivés. On précisera que l'inactivation des cellules bactériennes, composants antigènes, concentrés ou surnageants susmentionnés peut être effectuée par n'importe quel moyen bien connu dans la technique antérieure; il pourra ainsi s'agir par exemple d'une inactivation chimique, de préférence par le formaldéhyde, ou d'une inactivation thermique. Il est avantageux, mais non obligatoire, d'incorporer au moins un adjuvant d'immunisation dans le vaccin selon l'invention. Cet adjuvant peut être n'importe quel adjuvant d'immunisation habituellement utilisé dans la technique antérieure et on citera à titre d'exemples, l'hydroxyde d'aluminium sous forme de gel (par exemple celui disponible sous la marque ALHYDROGEL auprès de la société danoise SUPERFOS A/S) et une saponine telle que la saponine de quillaja (par exemple celle disponible sous la marque QUIL-A auprès de la société danoise SUPERFOS A/S). Cet adjuvant peut être utilisé à diverses concentrations que l'homme de métier pourra aisément établir. On notera que dans le cas o le vaccin comprend un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et un concentré du surnageant d'une culture de la souche Pasteurella haemolytica sérotype A1, celui-ci a fait preuve d'une bonne efficacité lorsque la quantité du premier concentré est telle que ce vaccin ait une activité leucotoxique 50 % d'au moins 8 unités et la quantité du second concentré est telle que ce vaccin présente une activité leucotoxique 50 % d'au moins 8 unités. La définition de l'activité leucotoxique 50 % sera explicitée ci-après, étant précisé que les activités seuils ci-dessus de 8 unités ne sont données qu'à titre illustratif de l'invention et que des activités inférieures à ces seuils entrent parfaitement dans la portée de la présente invention. La présente invention s'étend par ailleurs à toute culture bactérienne de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et à tout concentré du surnageant d'une telle culture, ce concentré ou surnageant étant ou non biologiquement inactivé. La présente invention s'étend enfin à un procédé de préparation d'un vaccin susmentionné. Ce procédé comprend de préférence les opérations de: (a) culture d'une souche-mère de Pasteurella haemolytica sérotype A6, (b) culture séparée d'une souche-mère de Pasteurella haemolytica sérotype A1, (c) séparation par filtration d'une partie au moins des cellules bactériennes du surnageant obtenu par l'opération (a) ci-dessus, (d) séparation par filtration d'une partie au moins des cellules bactériennes du surnageant obtenu par l'opération (b) ci-dessus, (e) concentration du surnageant obtenu par l'opération (c) et du surnageant obtenu par l'opération (d) ci-dessus, (f) mélange des concentrés obtenus par l'opération (e) ci-dessus dans une proportion appropriée, (g) inactivation biologique des deux concentrés obtenus par l'opération (e) ci-dessus, avant ou après leur mélange par l'opération (f) ci-dessus, (h) adjonction éventuelle d'un ou plusieurs adjuvants d'immunisation au mélange de concentrés inactivés obtenu précédemment, et (i) réglage éventuel du pH du mélange obtenu par l'opération (h) ci-dessus à la valeur souhaitée. L'invention sera maintenant illustrée par les éléments techniques suivants donnés à titre nullement limitatif de l'invention. Production d'un vaccin 1/ Souches utilisées Utilisation a été faite d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A1 et d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6, dont le sérotype peut notamment être réalisé par la méthode bien connue d'hémagglutination passive. Il est à noter toutefois qu'il peut être fait utilisation de n'importe quelle souche Pasteurella haemolytica sérotype A6 et de n'importe quelle souche Pasteurella haemolytica sérotype A1, la seule condition qu'elles doivent remplir étant qu'elles soient de sérotype A6 et de sérotype A1 respectivement. Ainsi, utilisation peut être faite de n'importe quelle souche provenant du terrain après avoir vérifié par une opération classique de sérotypage qu'elle appartient au sérotype recherché, ou provenant d'une collection [comme par exemple l'American Type Culture Collection (ATCC)]. 2/ Multiplication des souches Chaque souche est utilisée pour ensemencer une gélose (DSA = Dextrose Starch Agar) en boîtes de Pétri, avec incubation à 37 C, sous CO2 (5 %) jusqu'à apparition de colonies visibles à l'oeil nu (généralement 12 à 14 heures). Chaque gélose résultante est utilisée pour ensemencer un milieu gélosé (DSA) coulé en bouteilles de culture cellulaire, ce milieu gélosé étant ensuite incubé 15 à 18 heures à 37 C, dans une atmosphère à 5 % de CO2 3/ Culture de production La suspension récoltée, pour chaque souche, à partir des bouteilles de culture cellulaire est ensuite utilisée pour ensemencer un fermentateur utilisant, à titre de milieu de culture, du milieu RPMI 1640 contenant 5 % de DSB (Dextrose Starch Broth). On procède à la culture à 37 C jusqu'en fin de la phase logarithmique de croissance. On précisera que d'autres milieux de culture pourront être utilisés parmi ceux actuellement disponibles sur le marché. Ces opérations peuvent être répétées jusqu'à obtention de la quantité souhaitée de surnageant. 4/ Récolte Pour chaque souche, les cellules bactériennes sont ensuite séparées du surnageant par exemple par filtration sur des membranes présentant une ouverture de mailles de 0, 22,tm. 5/ Dosage de la leucotoxine L'efficacité du vaccin étant fonction notamment de son titre en leucotoxines qui sont des antigènes produits lors de la culture des souches Pasteurella haemolytica mises en oeuvre, il convient de soumettre les surnageants susmentionnés à des concentrations suffisantes pour atteindre les activités leucotoxiques souhaitées. Cette activité est donc dosée sur les surnageants afin de déterminer à quelles concentrations il faut les soumettre pour obtenir les activités leucotoxiques finales voulues. Le principe de ce dosage est le suivant L'activité leucotoxique est déterminée par un test sur microplaque utilisant des cellules BL3 (pour Bovine Leukemia Cell provenant de la collection de l'ATCC o elles sont enregistrées sous le code 8037-CRL). Des cellules équivalentes sensibles à la leucotoxine peuvent également être utilisées. Ces cellules sont incubées (1 heure, 37 C) en présence de différentes dilutions de l'échantillon (surnageant) à titrer (pur, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16... 1/64). Les cellules survivantes à la fin de la période d'incubation sont révélées par coloration au rouge neutre. Après solubilisation des cellules, la coloration est titrée au spectrophomètre à 550nm. Le pourcentage d'activité toxique est déterminé pour chaque dilution de la manière suivante: % de toxicité = x 100 A dans laquelle A = densité optique moyenne de 4 puits de contrôle contenant seulement du milieu de culture (cette préparation n'étant pas toxique, la totalité des cellules BL3 survivent), et B = densité optique moyenne de 4 puits test (échantillon à tester). Le % de toxicité est calculé pour chaque dilution de l'échantillon à titrer. On s'aperçoit qu'au fur et à mesure qu'on dilue l'échantillon à titrer, sa toxicité diminue (car on dilue la leucotoxine responsable de la toxicité). En représentant graphiquement la toxicité en fonction de la dilution, on obtient une courbe à partir de laquelle on peut déduire la dilution la plus forte de l'échantillon, donnant encore au moins 50 % de toxicité. Ainsi, si par exemple la dernière dilution donnant encore au moins 50 % de toxicité est la dilution 1/2, l'activité de l'échantillon testé (surnageant avant concentration) est de 2 unités (en fait l'inverse de la dilution). Ceci signifie que si une valeur de 8 unités est souhaitée pour l'activité leucotoxique du vaccin, il faudra concentrer le surnageant entre 4 et 8 fois pour espérer atteindre le titre de 8 unités souhaité. 6/ Concentration du surnageant Le surnageant mentionné aux points 4/ et 5/ ci-dessus, est concentré au degré voulu par passage sur des membranes d'une porosité correspondant à des poids moléculaires de 1 à 10 kD. 7/ Inactivation biologique Chaque concentré ainsi obtenu (concentré correspondant à la souche de sérotype A1 et concentré correspondant à la souche de sérotype A6) est ensuite inactivé par addition d'une solution aqueuse à 40 % de formaldéhyde et incubation à 37 C, sous agitation et pendant au moins 24 heures. La quantité de solution aqueuse de formaldéhyde sera généralement de 0,1 à 0,5 % (V/V) par rapport au concentré. Ensuite, le formaldéhyde est neutralisé par addition d'une solution de métabisulfite de sodium. 8/ Mélange Les deux concentrés inactivés ainsi obtenus sont ensuite mélangés dans la proportion souhaitée. On fait suivre par l'addition d'ALHYDROGEL (par exemple à la dose de 7,5 mg/ml, ce qui correspond à 25 volumes d'un gel aqueux à 3 % d'hydroxyde d'aluminium pour 75 volumes de vaccin sans gel) et de QUIL-A (par exemple à la dose de 0,05 mg/ml, ce qui correspond à 0,0033 ml d'une solution mère de QUIL-A à 15 mg/ml d'eau, par ml de vaccin final), l'ajustement du pH à 6,5-8,0 à l'aide d'une solution aqueuse à 7,5 % de bicarbonate de sodium, de soude ou d'acide chlorhydrique et le conditionnement en ampoules stériles. 9/ Exemple de composition du vaccin Un exemple de composition du vaccin selon l'invention est comme suit - 36 % en volume de concentré, inactivé et neutralisé, provenant de la culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1, ayant avant inactivation une activité leucotoxique 50 % d'au moins 8 unités, - 36 % en volume de concentré, inactivé et neutralisé, provenant de la culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6, ayant avant inactivation une activité leucotoxique 50 % d'au moins 8 unités, - 25 % en volume de gel aqueux à 3 % d'hydroxyde d'aluminium, - 0,33 % en volume de solution mère de QUIL-A, et - 2,67 % en volume de solution à 7,5 % de bicarbonate de sodium. Etude de l'efficacité du vaccin Elle porte sur au moins deux groupes de 10 veaux pré-ruminants chacun; un groupe est traité avec un placebo, l'autre avec le vaccin selon l'invention, selon le schéma thérapeutique suivant: injection intramusculaire (ou sous-cutanée) de 2 ml de placebo ou de vaccin au jour zéro et injection intramusculaire (ou sous-cutanée) d'un rappel de 2 ml après trois semaines. Tous les animaux de l'étude sont éprouvés avec une culture Pasteurella haemolytica sérotype A6 deux semaines après la seconde injection, avant d'être sacrifiés une semaine plus tard. Pendant toute l'étude, on suit la température rectale, les paramètres respiratoires, l'état général, la prise de poids; à l'autopsie, on effectue un examen macroscopique et une pesée des poumons. Cette étude montre que le vaccin selon l'invention protège les animaux testés contre l'épreuve virulente de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et donc l'efficacité de ce vaccin. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 ou d'une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A6 conjointement avec une souche de Pasteurella haemolytica sérotype A1, pour la préparation d'un vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque souche est utilisée sous la forme du surnageant concentré biologiquement inactivé d'une culture de cette souche. 3. Vaccin contre la pasteurellose bovine due à Pasteurella haemolytica, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément choisi dans le groupe constitué par: a) les cellules bactériennes entières et biologiquement inactivées de Pasteurella haemolytica sérotype A6, b) les fractions de telles cellules biologiquement inactivées, et c) une première substance antigène comprenant un ou plusieurs composants antigènes ayant respectivement une structure chimique sensiblement identique à celle des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6, ladite première substance ou lesdits composants antigènes étant biologiquement inactivés. 4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un élément choisi dans le groupe constitué par: a') les cellules bactériennes entières et biologiquement inactivées de Pasteurella haemolytica sérotype A1, b') les fractions de telles cellules biologiquement inactivées, et c') une deuxième substance antigène comprenant un ou plusieurs composants antigènes ayant respectivement une structure chimique sensiblement identique à celle des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A1, ladite deuxième substance ou lesdits composants antigènes étant biologiquement inactivés. 5. Vaccin selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend ladite première substance antigène et éventuellement ladite deuxième substance antigène. 6. Vaccin selon la revendication 3, 4 ou 5, caractérisé en ce que ladite première substance antigène comprend une partie au moins des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6 et/ou ladite deuxième substance antigène comprend une partie au moins des composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A1. 7. Vaccin selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits composants antigènes générés par Pasteurella haemolytica sérotype A6 et par Pasteurella haemolytica sérotype A1 sont constitués par des protéines et des polysaccharides. 8. Vaccin selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la première substance antigène comprend un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et en ce que la deuxième substance antigène comprend un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1, ledit ou lesdits concentrés ou surnageants étant biologiquement inactivés. 9. Vaccin selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange d'un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A6 et d'un concentré du surnageant d'une culture de Pasteurella haemolytica sérotype A1, lesdits concentrés ou surnageant étant biologiquement inactivés. 10. Vaccin selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que lesdites cellules bactériennes, lesdites substances antigènes, lesdits composants antigènes, lesdits concentrés ou lesdits surnageants ont été inactivés par le formaldéhyde. 1il. Vaccin selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un adjuvant d'immunisation. 12. Vaccin selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit adjuvant d'immunisation est choisi dans le groupe constitué par l'hydroxyde d'aluminium sous forme de gel et une saponinc. 13. Culture bactérienne de Pasteurella haemolytica sérotype A6. 14. Concentré du surnageant de la culture selon la revendication 13, ce concentré ou ce surnageant étant inactivé ou non. 15. Procédé de préparation du vaccin selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations de: (a) culture d'une souche-mère de Pasteurella haemolytica sérotype A6, (b) culture séparée d'une souche-mère de Pasteurella haemolytica sérotype A1, (c) séparation par filtration d'une partie au moins des cellules bactériennes du surnageant obtenu par l'opération (a) ci-dessus, (d) séparation par filtration d'une partie au moins des cellules bactériennes du surnageant obtenu par l'opération (b) ci-dessus, (e) concentration du surnageant obtenu par l'opération (c) et du surnageant obtenu par l'opération (d) ci-dessus, (f) mélange des concentrés obtenus par l'opération (e) ci-dessus dans une proportion appropriée, (g) inactivation biologique des deux concentrés obtenus par l'opération (e) ci-dessus, avant ou après leur mélange par l'opération (f) ci-dessus, (h) adjonction éventuelle d'un ou plusieurs adjuvants d'immunisation au mélange de concentrés inactivés obtenu précédemment, et (i) réglage éventuel du pH du mélange obtenu par l'opération (h) ci-dessus à la valeur souhaitée.