Brevet FR2769840A1 — publié le 19990423

UTILISATION D'UN EXTRAIT ALCALOIDIQUE DE BUXUS SEMPERVIRENS POUR LA FABRICATION D'UN MEDICAMENT A ACTIVITE ANS L 2 La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait alcaloïdique de Buxus sempervirens pour la fabrication d'un médicament doté d'une activité anti-IL 2. De manière générale, la présente invention a trait à l'utilisation de Buxus sempervirens pour la fabrication de médicament à activité anti-IL 2. I1 peut notamment s'agir de la poudre de la plante qui a révélé une telle activité. De façon préférentielle, I'invention vise un extrait riche en alcaloïdes obtenus dans les conditions décrites par VOTICKY Z. et al.- Alkaloids from Buxus sempervirens. Coll. Czech. Comm. 1975, 40, 3055-3060, avec un gradient de solutions acides. Sur un tel extrait alcaloldique, différentes séparations ont été conduites sur colonnes chromatographiques de manière à purifier et/ou à séparer différents alcaloïdes dont activité anti-IL 2 a été déterminée en comparaison avec celle de la cyclosporine A selon le protocole opératoire décrit par RANDAK C. et al. - Cyclosporin A suppresses the expression of the interleukin-2 gene by inhibiting binding of lympohcyte specific factors to the Il 2 enhancer. EMBO J. 1990, 9, 2529-2536. Les résultats obtenus dans le cadre de cette expérimentation ont été consignés dans le tableau ci-dessous ALCALOïDES ICSO moi (1) Buxzis sempervirens 23,34 Extrait alcaloïdique 0,94 Cycloprotobuxine D 2,00 Buxamine G 1,71 Cycloprotobuxine A 0,93 Buxamine E 0,67 N-benzoyl-O-acétyl buxadiénine E 0,59 Cyclomicrophylline B 0,13 Cyclobuxophylline M 0,09 Cyclovirobuxine D 0,08 Cyclosporine A # 0,05 (2) (1) IC 50 = concentration inhibitrice 50 % de la production d'Interleukine 2. (2) HENDERSON D.J. et al. -Comparison of the effect of FK506, cyclosporin A and rapamycin on IL 2 production. Immunology 1991, 73, 316-321. De manière à décrire plus complètement l'objet de la présente invention, on se référera ciaprès aux exemples non limitatifs d'isolement et d'identification de quelques alcaloïdes principaux du buis commun ou Buxus sempervirens. Les exemples rapportés ci-après consistent d'abord en l'extraction des alcaloïdes totaux selon la méthode décrite par VOTICKY (solutions hydroalcooliques acides), voir référence cidessus. Les alcaloïdes totaux ont ensuite été fractionnés à l'aide de solution de pH décroissant. Après séparation des alcaloïdes par une succession de chromatographies sur colonne ouverte, la structure des différents composés isolés a été déterminée par différentes méthodes spectrales, résonance magnétique nucléaire et spectrométrie de masse. EXEMPLES: Extraction des alcaloïdes totaux du Buxus sempervirens 800 g de poudre verte de faible granulométrie de Buxus sempervirens sont extraits par 4 litres d'une solution hydrométhanolique (50:50 v/v) contenant 5 % (v/v) d'acide acétique. La solution est mise sous agitation pendant 2 heures à température ambiante, la macération se poursuivant au repos pendant une nuit Après centrifugation et filtration, le résidu est à nouveau extrait par 4 litres d'une solution hydrométhanolique (50:50 v/v) contenant 5 % (v/v) d'acide acétique (I'opération est renouvelée jusqu'à concurrence de 4 extractions successives). Au total, 4 kg de poudre de Buxus sempervirens sont traités par cette méthode ce qui permet de récupérer 80 litres de solution extractive hydroalcoolique acide. Après évaporation du méthanol sous pression réduite, il reste environ 25 litres de solution aqueuse acide. Après transfert dans une ampoule à décanter, celle solution est alcalinisée par 4 litres d'ammoniaque et épuisée par 4 x 8 litres de dichlorométhane. On atteint ainsi une solution S1. Fractionnement des alcaloïdes totaux en fonction du pH Pour éviter des manipulations de solvants trop imponantes, la solution chlorom8thyldnique S1 est conccntrée par évaporation sous pression réduite jusqu'à obtcnir environ 10 litres de solution. Cette solution est transférée dans une ampoule à décanter et extraite par 4 x 3 litres de solution tampon pH 7. Après alcalinisation à 1'ammoniaque, les phases aqueuses sont épuisées par 3 x 3 litres de dichlorométhane. lLe dichlorométhane est évaporé siccité sous pression réduite e Fraction A (16,2 g). La solution S1. partiellement épuisée, est soumise à une nouvelle extraction par 4 x 3 litres dc solution tampon pH 5,5. Après alcalinisation à l'ammoniaque. les phases aqueuscs sont épuisées par 3 x 3 litres de dichloromEthane. Le dichlorométhane est évaporé à siccité sous pression réduite # Fraction B (17,4 g). Le reste de la solution Si est évaporé à siccité sous pression réduite # Fraction C (154,9 g). Les deux solutions tampons utilisées (pH 7 et pH 5,5) sont préparés selon un protocole décrit à la Pharmacopée française Xèmo édition. Solution tampon phosphate pH 7 (0,067M): Solution I: dissolvez 0.908 g de phosphate monopotassique R dans de l'eau et complétez à 100,0 ml avec le même solvant Solution II: dissolvez 2,38 g de phosphate disodique R dans dc l'eau et complétez à 100,0 ml avec le même solvant Mélangez 38,9 ml de la solution I avec 61,1 ml de la solution TI et ajustez le pH si nécessaire. Solution tampon phosphate pH 5,5: Solution I: dissolvez 13,61 g de phosphatc monopotassique R dans de l'eau et complétez à 1000 ml avec le même solvant Solution Il: dissolvez 35,81 g de phosphat disodique R dans de l'eau et complétez à 1000 ml avec le même solvant. A 96,4 ml de solution I, ajoutez 3,6 ml de solution II. Les trois fractions A, B et C sont ensuite chromatographiees sur colonne ouverte, divers supports étant utilisés (silicc, alumine). Le fractionnement est suivi par chromatographie sur couche mince: Plaques d'aluminium de 20 x 20 cm rccouvertes dc gel de silice 60 F254, épaisseur dc la couche 0.2 mm (Merck). Solvant de migration : Toluène-Acétone-Ethanol-Ammoniaque (40/40/6/2). Révélation par le réactif de Dragendorff préparé selon le protocole décrit à la Pharmacopée française Xème édition: Solution A: Sous-nitratc de bismuth 0,850 g Eau distillée 40 ml Acidc acétique glacial 10 ml Solution B: Iodure de potasslum 8 g Eau distillée 20 ml Solution mère: Mélanger solution A et solution B Solution diluée pour l emploi: Solution mère 20 ml Acide acétique 20 ml Eau distillée 60 ml Fractionnement de A 15 g de lf fraction A sont chromatographiés ur colonne ouverte de gel d'alumine 90 (degré d'activité II-III, 70-230 mesh ASTM, Merck). La colonne est constituée de 450 g d'alumine en suspension dans le dichlorométhane. La fraction A n'étant pas totalement soluble dans le dichlorométhane, il est nécessaire de réaliser préalablement un "montage à sec" par adsorption de A sur 45 g d'alumine. Les fractions sont éluées par du dichlorométhane avec un gradient de méthanol (0 à 100%). 36 fractions, d'un volume de 400 ml, sont éluées. Dans la fraction A7 (3,54 g), éluée par un mélange dichlorométhane-méthanol (99/1). deux alcaloïdes majoritaires sont mis en évidence. Dans les fractions A8 à A10 (2,72 g), éluées par le même solvant que A7, deux alcaloïdes majontatres sont mis en évidence, le premier d'entre eux dejà repéré dans A7. Les fractions A6 à A16 dans lesquelles sont mis en évidence ces trois alcaloïdes représentent environ 2/3 de la fraction A. Fractionnement de A7 La fraction A7 est chromatographie sur colonne ouverte de gel de silice 60H (Merck). La colonne est constituée par 100 g de silice en suspension dans un mélange Acétate d'éthyl- Méthanol-Diéthylamine (90/10/1.5). La colonne est munie d'un filtre de verre fritté (3). Un "montage à sec" est réalisé avec 2,5 g de fraction et 5 g de silice 60H 140 fractions de 7 ml, éluées par le meme solvant, sont recueillies. Dans les fractions A795 à A7.106 (350 mg), est identifié un des alcaloïdes majoritaires mais c'est à partir des fractions A7.98 à A7.100 que sont isolés environ 80 mg de cet alcaloïde monobasique déjà décrit dans Buxus sempervirens: la cycloprotobuxine O Dans les fractions A7.81 à A7.96 (640 mg) est identifiée la buxamine G et dans les fractions A7.68 à A7.76 (230 mg) est identifiée la buxamine E. Fractionnement de A8 à A10 Les fractions AS à A10 (2,7 g) sont chromatographiées sur une colonne ouverte de gel de silice 60H et munie d'un filtre en verre fritté (3). La colonne est constituée de 80 g de silice en suspension dans un mélange cétate d'éthyle Méthanol-Diéthylamine (90/10/2). Un "montage à sec" à l'aide dc 8 g de silice est nécessaire. 111 fractions d'un volume de 7 ml. sont Fluées. Des fractions A8.53 à A8.55 (225 mg), par précipitation dans l'acétone sont isolés environ 80 mg d'un alcaloïde se présentant sous forme d'une poudre blanche amorphe : la buxamine G (Réf. 21, 50, 51). Cet alcaloïde est présent dans les fractions A8.43 à A8.61 (900 mg). Des fractions A8.76 à A8.85 (380 mg) est isolé de la $même façon que précédemmenc, environ 200 mg d'une poudre blanche amorphe qui apparaît comme étant un mélange de deux alcaloïdes décrits dans Buxus sempervirens: la cyclobuxine D et la cyclovirobuxine D Ces deux alcaloïdes, dans le système de chromatographie sur couche mince utilisé, possèdent le même rapport frontal et il n'a pas été possible pour le moment de les séparer. Le mélange de ces deux alcaloïdes est prisent dans les fractions A8.68 à A8.100 (1,0 g). Fractionnement de B 15 g de la fraction B sont chromatographiés sur colonne d'alumine ouverte de gel d'alumine 90 (degré d'activité II-III. 70-230 mesh ASTM, Merck). La colonne est constituée de 450 g d'alumine en suspension dans le dichlorométhane. Un "montage à sec" est réalisé avec 45 g d'alumine. Les fractions, d'un volume de 400 ml. sont éluées par du dichlorométhane et des gradicnts d'acétate d'éthyle (0 à 100%) et de méthanol (0 à 100%). 59 fractions sont recueillies. Les deux alcaloïdes majoritaires de la fraction B sont identifiés dans les fractions B42 à 1356 (7,5 g), éluées par des mélanges acétate d'éthyle-méthanol (90/10, 80/20, 50/50) puls du méthanol pur. Fractionnement de B56 la fraction B56, eluée par du méthanol pur, est chromatographiée sur colonne ouverte de gel de silice 60H. La colonne est constituée de 25 g de silice en suspension dans un mélange Acétate d'éthyle-Méthanol-Diéthylamine (90/1012). Elle est munie d'un filtre en vcrre fritté (3). Un "montage à sec" est préparé avec 450 mg de B56 et 1,4 g de silicc 60H. 82 fractions d'un volume de 7 ml sont recueillies. La fraction BS6.9 (50 mg) est très majoritairement constitué d'un alcaloïde précédemment décrit dans Buxus sempervirens : la buxamine E Cet alcaloïde est également identifié dans les fractions B56.7 à B5G.10 (140mg). Fractionnement de B42 à B46 Les fraction B42 à B46 (2 g), éluées par des mélanges acélanges acétate d'éthyle-méthanol (90/10 et 80/20), sont chromatographiées sur colonne dc gel dc silice 60 H. La colonne. munie d'un filtre cn verrc fritté (3) est constituée de 75 g dc silice en suspension dans un mélange acétate d'éthyle-méthanol-diéthylamine (90/10/1,5). UP "montage à sec" est préparé avec 5 g de silice 60H. 209 fractions d'un volume de 6 ml sont recucillies. L'alcaloïde majoritaire de ces fractions est identifié dans les fractions B42.86 à 1342.125 (650 mg). Une purification dc ces fractions est entreprise par chromatographie sur colonne dc gel dc silice 60H (15 g de silice cn suspension dans un mélange acétate d'éthyle-méthanol-diéthylamine (90/10/1). Un "montage à sec" est préparé avec 1 g de silice. 107 fractions de 2 ml sont recueillies. Les fractions B24.86.64 à B42.86.72 (70 mg) sont constituées très majoritairement d'un alcaloïde de structure pour le moment indéterminé Sa masse molaire est dc 580 ce qui n'est le cas d'aucun alcaloïde décrit dans Buxus sempervirens (masse molairc généralement plus faible). Les études spectrales réalisées à ce jour (masse, RMN 1H et RMN 13C) ne permettent pas pour le moment de donner la structure de cet alcaloïde. Fractionnement de B47 à BSS Les fractions B47 à B55 (4 g), éludes par des mélanges acétatc d'éthyle-méthanol (80/20 ct 50/50), sont chromatographiées sur colonne de gel de silicc 60 H. La colonne. munie d'un filtre en verrc fritté (3) est constituée de 120 g de silice en suspension dans un mélange acétate d'éthyle-méthanol-diéthylamine (09/10/1,5). Un "montage à sec" est préparé avec 10 g de silice 60H. 150 fractions d'un volume de 6 ml sont recueillies L'alcaloïde principal de cette fraction est éluée majoritairement dans les fractions B47.97 à B47.113 (520 mg). Il apparaît que cet alcaloïde est la buxamine E en mélange avec la buxamine G. Un autre alcaloïde, de structure indéterminée, est identifiée dans les fractions B47.81 à B47.85(60 mg). Fractionneinent de C 15 g de la fraction A sont chromatographiés sur colonne ouverte de gel d'aluminc 90 (degré d'activité II-III, 70-230 mesh ASTM, Merck). La colonne est constituée de 450 g d'alumine en suspension dans le dichlorométhane. La fraction C est chromatographiée sur colonne de gel d'alumine 90 (degrc d'activité II-III. 70230 mesh ASTM, Merck). La colonne est constituée de 4 kg d'alumine en suspension dans le cyclohexane. Un "montage à sec" est préparé avec 150 g de C ct 400 g d'alumine. Les fractions, d'un volume de 400 mi, sont éluées par du cyclohexanc et des gradients de dichiorométhane (0 à 100%) puis de méthanol (0 à 100%). 64 fractions sont diluées (28,2 g), les fractions C30 à C36 fluées par un mélange dichlorométhane-méthanol (95/5) représentent à elles scules 20,2 g. L'alumine est ensuite récupérée et épuisée par 4 x 3 litres de méthanol à 2% (v/v) d'acide chlorhydrique. Après concentration cL alcalinisation à la soude, la solution cst noyée par 3 litres d'eau et épuisée par 3 x 1 litre de dichlorométhane. La solution chlorométhylénique est évaporée à siccité sous pression réduite ce qui pcrrnet d'obrenir la fraction C5 (3,33 g) qui ne contient pas d'alcaloïdes. Fractionnement de C32 La fraction C32 (7,3 g) est la plus importantc des fractions obtenus à partir de C. Elle est chromatographiée sur colonne de gel dc silice 60 (70-230 mcsh ASTM, Merck). La colonne est constituéc de 200 g de silice en suspension dans le dichlorométhane et les fractions sont éluées par du dichlorométhane et des gradients de méthanol (0 à 15%). Un "montage à sec" est préparé avec 20 g de silice. 76 fractions, d'un volume de 200 ml, Sont éludes. Jusqu'à la fraction 44 il n'y a pas ou trs peu d'alcaloldes. De la fraction C32.18 (170 mg), élude par un mélange dichlorométhanc-méthanol (99.5/0,5), est isolé et identifié un acide triterpénique précédemment décrit dans Buxus sempervirens: la bétuline. De la fraction C32.55 (178 mg), éluée par un mélange dichlorométhane-méthanol (90/10), est isolé par cristallisation successive dans l'acétone 20 mg d'un alcaloïde également décrit: la cyclobuxophylline M. Fractionnement de C31 La: fraction C31 (5,8 g) est éluée dans les mêmes conditions que la fraction C32. Elle est chromatographiée sur colonne de gel de silice 60. La colonne est constituée de 180 g de silice en suspension dans le dichlorométhane et ]es fractions sont éluées par du dichlorométhane et des gradients de méthanol (O à 15%). Un "montage à sec" est préparé avec 18 g de silice. 61 fractions. d'un volume dc 200 ml, sont recueillies. Des fractions C31.53 à C31.57 (800 mg), éluées par des mélanges dichlorométhaneméthanol (90/10 et 85/15), est isolé par cristallisations successives dans l'acétone 110 mg du meme alcaloïde que celui présent dans C32.55 : la cyclobuxophylline M. Cet alcaloïde cxiste sous deux formes le dérivé trans, majoritaire. et son isomère cis. Les fractions C31.42 à C31.44 (400 mg), éluées par un mélange dichlorométhane-méthanol (95/5) contiennent un alcaloïde majoritaire qui est purifié par chromatographie sur colonne dc gel de silice 60H. La colonne est constituée de 12 g de silice 60H en suspcnsion dans un mélange Acétate d'éthyle-Méthanol-Diéthylamine (90/10/2). Elle est munie d'un filtre en verre fritté (3). Un "montage: à sec" est préparé avec 1 g de silice 60H. 22 fractions d'un volume de 2 ml sont recueillies. Des fractions C31.42.1O et C31.42.11 est isolé 130 mg d'un alcaloïde déjà décrit dans Buxux sempervirens: la N-Bentoyl-O-Acétylbuxadiénine E. Identification des composés isolés de Buxux sempervirens Cycloprotobuxine D Masse L'ion moléculaire apparait à m/z 386 (6) ce qui signe la présence d'un nombre pair d'atomes d'azote (alcaloïdes dibasiques). Les ions M-15 (m/z 371; 10), M-30 (m/z 356; 18), M-56 (rn/z 330; 6) et à rn/z 70 (25), m/z 58 (100), m/z 57 (17) et m/z 44 (9) sont caractéristiques des groupements méthylaminosubstituant les carbones 3 et 20 Il apparaiffit, sur le spectre de RMN 1H. 2 singulets à 2,38 et 2.44 ppm intégrant chacun pour 3 protons et correspondant aux deux groupements N-CH3 portés par la molécule. A 0,31 et 0,52 ppm, sont visibles 2 doublets (J = 4Hz) intégrant chacun pour 1 proton et caractéristiques du groupement cyclopropyle (protons portés par lc carbone 19). Les trois protons du groupement méthylique en C21 apparaissent sous forme d'un doublet à 1,04 ppm (J = 6 Hz) alors que ]es autres protons méthyliques (carbones 18, 30, 31 et 32) apparaissent sous forme de singulets (pas de protons vicinaux) à 0,75, 0,90, 0,94 et 0,98 pprn. Buxamine G L'ion moléculaire apparaît à m/z 370 (100). ce composé est un alcaloïde dibasique. L'ion à m/z 327 (52) est important et est du à la pertc du radical éthylamino- porté par le carbone 17. Lc carbone 20 porte une amine primaire. Les ions M-15 (m/z 355; 12) et à m/z 70 (46), m/z 58 (22). m/z 57 (16) et m/z 44 (78) sont caractéristiques du groupement méthylamino substiruant le carbone 3. RMN Sur le spectre de RMN 1H, il apparaît un singulet à 2,43 ppm intégrant pour protons et correspondant au groupement N-CH3 porté par le carbone 3. Deus signaux ont une grande importance: le singulet à 5,94 ppm. intégrant pour un proton. et le doublet à 5,51 ppm (J = 2,5 Hz). intégrant également pour un proton. Ceux-ci correspondent respectivement aux protons H18 ct H11. Ces déplacements chimiques sont caratéristiques des protons éthyléniques et, pour les alcaloïdes du Buxus sempervirens, des structures nor-19- homo-B-5-a-pregnanes. Comme pour la cycloprotobuxine D, les protons méthyliques sont aisément repérables: doublet à 1,07 ppm (J = 6Hz) pour les protons méthyliques en C21. singulet à 0,68, 0,69. 0,73 et 1,00 ppm pour les protons méthyliques cn C30, C32, C18 et C31. Un autre signal est aisément repérable sur le spectre; il s'agit d'un quadruplet dédoublé. intégrant pour un proton, et qui correspond au proton H20. Celui-ci couple avec les protons méthyliques cn C21 (J = 6Hz) et le proton porté par le carbone 17 (J = 9,5 Hz). Sur le spectre de RMN 13C, les signaux les plus caractéristiques apparaissent à 128.7. 128.8. 136,0 et 138,3 ppm et correspondent aux carbones éthyléniques, respectivement C18, Cli, ClO et C9. L'étude du restc des spectres de RMN 'H et de RMN '3C ainsi que des spectres de corrélations (Cosy, X-H et HMBC) confirme la structure de la buxamine G. Cyclobuxine D et Cyclovirobuxine D Ces deux composés étant en mélange, il apparaît sur les spectres de masse et de résonnance magnétique nucléaire, des signzux caractéristiques de chacun d'entre eux. Cyclobuxine D Cyclovirobuxine D Masse Les ions moléculaires apparaissant à m/z 402 ct m/z 386, ces deux composés sont des alcaloïdes dibasiques. Commc pour la cycloprotobuxine D, les ions M-15 (m/z 387; 36 et m/z 371; 19), M-30 (m/z 372; 36 et m/z 356; 18), M-56 (m/z 346; 23 et m/z 330; 5) et à m/z 70 (19), m/z 58 (100), mJz 57 (15) et m/z 44 (5) sont caractéristiques des groupements méthylamino- substituant les carbones 3 et 20. RMN Les protons H19 du groupement cyclopropyle apparaissent sous forme de doublets (J = 4 Hz) à 0,05 et 0,27 ppm pour la cyclobuxine D et 030 et 0.53 ppm pour la cyclovirobuxine D. Les déplacements chimiques du carbone 19 étant respectivement à 28,0 et 30,4 pprn. Les protons du groupement méthylique porté par l'aniline en C20 apparaissent sous forme de singulet à 2,44 ppm pour les deux composés. alors que ceux du groupement méthylique porté par l'amine en C3 apparaissent sous forme de singulet à 2,44 ppm pour la cyclovirobuxine D et 2,49 ppm pour la cyclobuxine D. Le carbone méthylique porté par l'amine en C20 apparalt à 34.0 ppm, celui porté par l'amine en C3, à 34,7 ppm pour la cyclobuxine et 35.8 ppm pour la cyclovirobuxine D. La présence d'une fonction hydroxyle sur le carbone 16 est confirmé par le déplacement chimique du proton H16 qui apparaît sous forme dun multiplet à 4,10 ppm et celui du carbone 16 à 78,8 ppm. Parmi les autres signaux communs aux deux molécules, il est facilc de repérer ceux du pruton H19 (multiplct à 2,49 ppm). des protons méthyliques en C21 (doublet à 1,09 ppm, J = 6,5 Hz), en C18 et C32 (singulet à 0.96 et 1,1 1 ppm). Ce qui signe nettement la différence entre les deux molécules, c'est le déplacement chimique des protons éthyléniques pour la cyclobuxine D (singulet large à 4.80 et 4.57 ppm) et des piotons méthyléniques pour la cyclovirobuxine D (singulet à 0,74 et 0,94 ppm). Les déplacements chimiques des carbones 3 et 5 étant également modifiés (63,9 et 44,9 ppm pour la cyclobuxine D contre 68,8 et 48,8 ppm pour la cyclovirobuxine D) de même que celui du proton H3 (doublet dédoublé à 2,88 ppm. J1 = 10 Hz et J2 = 3 Hz, pour la cyclobuxine D contre 1,95 ppm pour la cyclovirobuxine D). Les spectres de corrélation (Cosy, X-H. HMBC) confirment ces structures. Buxamine E Les spectres présentent une très grande similitude avec ceux de la buxamine G puisqu'il n'y a qu'un groupement méthyle dc différence. Sur le spectre de masse, l'ion moléculaire apparaît à m/z 384 ct les ions ont une différence de masse dc 14 avec ceux observés pour la buxamine G. Cyclobuxouhylline M L'ion moléculaire apparaissant à m/z 369, révèle que ce composé est un alcaloïde monobasique (nombre impair d'atomes d'azote). Sur le spectre de masse, sc retrouvent les ions caractéristiques des groupements méthylamino- substituant le carbone 3 : les ions M-15 (m/z 354; 11) et à m/z 70 (48), m/z 58 (9), m/z 57 (100) et m/z 44 (10). Egalement caractéristique de cc composé, l'ion M-43 (m/z 326, 6)* RMN Le déplacement des protons H19 qui apparaissent sous forme de doublet à 0,38 et 0,63 ppm (J =4Hz), révèle la présence d'un groupement cyclopropyle et permet dc rattacher ce composé au groupe des 9ss,19-cyclo-5-&alpha;-pregnanes. Lc proton H20 apparaît sous forme d'un quadruplet (J = 7.5 Hz), par couplagc avec les protons méthyliques en C21. d 6 55 ppm (dérivé rrans) ou 5.71 ppm (dérivé cis). Les protons méthyliques en C21 apparaissant sous forme d'un doublet (J = 7,5 Hz) à 1,82 ppm (dérivé trans) ou 20,9 ppm (dérivé cis). Les autres protons méthyliques. en C18, C30, C31 ct C32, ont des déplacements chimiques de 0.76. 0,94, 0,95 et 1.32 ppm à à l'exception de ceux du groupement méthyle porté par l'azote en C3 et qui apparaissent à 2,44 ppm sous forme d'un singulet Sur le spccue de RMN 13C, Ic carbone 16. porteur de la fonction cétone, apparaît à 207 ppm. N-Benzoyl-O-Acétylbuxadiénine E Masse L'ion moléculaire est à m/z 546 (8), ce composé est donc un alcaloïde dibasique. L'ion à m/z 503 (11) résulte de la perte d'un groupement diméthylamino sur le carbone 3 ou le carbone 20. L'ion à m/z 105 (50) est caractéristique d'un groupement benzoyle (C6H5CO+). Ce qui permet de placer ce groupement benzoyle (azote en C3 ou en C20), c'est l'ion à m/z l 148 qui correspond à l'ion C6H5CONHCHCH3+.C Cet ion n'apparaît que si le groupement benzoyle est fixé sur l'azote porté par le carbone 20. Les deux protons H11 et H19 apparaissent respectivement sous forme d'un singulet élargi à 5,52 ppm et d'un singulet à 5.91 ppm et indiquent que ce composé à un structure dc nor-19homo-B-%-&alpha;-pregnane. Les protons aromatiques sont aisément repérables: doublet à 7.72 ppm (J = 7 Hz) pour les protons en orrho, triplet à 7,40 ppm (J = 7 Hz) pour les proton en mera et doublct à 7,46 ppm (J = 7 Hz) pour le proton en para. Le proton porté par l'azote apparat sous forme d'un doublet à 6.37 ppm (J = 8 Hz) et le proton H20 sous forme d'un mutiplet.à Sept alcaloïdes majoritaires ont été isolés, pur ou en mélange, de Buxus sempervirens. Il s'agit de quatre alcaloïdes de type 9ss,19-cyclo-5-a-pregnane, la cycloprotobuxine D, la cyclobuxine D, la cyclovirobuxine D et la cyclobuxophylline M, et de trois alcaloïdes de type nor-19-homo-B-5-a-pregnane, la buxamine G, la buxamine E et la N-benzoyl-Oacétylbuxadiénine E. Parmi ces composés, seule la cyclobuxophylline M est un alcaloïde monobasique, les autres étant des alcaloïdes dibasiques. Si certains de ces alcaloïdes, comme la buxamine E, la cyclobuxine D ou lacyclovirobuxine D, sont d'après les données bibliographiques tenus comme étant majoritaires, d'autres, comme la cyclobuxophylline M et la N-benzoyl-O-acétylbuxadiénine E ne semblaient pas apparaître comme des composés importants. Les alcaloïdes totaux (A, B et fraction alcaloïdique de C) représentent environ 1 % de la drogue traitée mais aucun des composés identifiés ne semblent dépasser 2 % du total des alcaloïdes. Malgré tout, la buxamine G et la cyclobuxophylline M semblent un peu plus importants que les autres. Ce sont d'ailleurs les alcaloïdes qui ont présenté le moins de difficultés pour leur isolement. Au vu des plaques de chromatographie sur couche mince, il apparaît qu'il existe un très grand nombre d'alcaloïdes dans le Buxus sempervirens. Toutefois, il serait possible d'isoler l ou 2 nouveaux alcaloïdes importants. Les médicaments préparés en mettant en oeuvres des extraits enrichis de Buxus sempervirens selon l'invention peuvent être utilisés pour la prévention du rejet de greffon dans des greffes d'organes et de tissus, ainsi que pour le traitement de rejet après greffe de moelle osseuse. De façon plus générale, de tels médicaments démontrent une activité anti-IL 2 et peuvent dont favoriser de nombreux mécanismes immunitaires. REVENDICATIONS 1. Utilisation de Buxus sempervirens pour la fabrication d'un médicament doté d'une activité anti-IL 2. 2. Utilisation d'un extrait de Buxus sempervirens enrichi en alcaloïdes pour la fabrication d'un médicament doté d'une activité anti-IL 2. 3. Utilisation de Buxus sempervirens selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait de Buxus sempervirens a été enrichi en alcaloïdes par extraction à l'aide d'un gradient de solutions hydroalcooliques acides. 4. Utilisation de Buxus sempervirens selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'extrait enrichi en alcaloïdes contient un ou plusieurs alcaloïde(s) obtenu(s) par des méthodes de séparation sur colonne chromatographique. 5. Utilisation de Buxus sempervirens selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ou lesdits alcaloïdes sont choisis parmi les différents alcaloïdes: Cycloprotobuxine D, Buxamine G, Cycloprotobuxine A, Buxamine E, N-benzoyl-O-acétyl buxadiénine E, Cyclomicrophylline B, Cyclobuxophylline M, Cyclovirobuxine D, ainsi que leurs dérivés et leurs mélanges.