Brevet FR2768346A1 — publié le 19990319

L'invention a pour objet un composé assurant l'inhibition de la Préséniline 1 pour la préparation d'un médicament ainsi qu'un agent du diagnostic. Il a récemment été mis en évidence que les gênes de la Préséniline 1 et 2 étaient impliqués dans les phénomènes moléculaires à la base de la maladie d'Alzheimer familiale. Des mutations non-sens dans le gêne de la Préséniline I (PS1) ont été trouvées dans la forme la plus agressive de la maladie d'Alzheimer familiale et intervenant notamment à un stade précoce de la maladie (Sherrington et al.). A ce jour, une série d'ADNc régulés par p53 durant l'apoptose et la suppression tumorale a été identifiée (WO-A-97/22695). Les ADNc ont été clonés par analyse différentielle des ARNm. L'une deux, TRIP2 (Tumor Suppressor Inhibited Pathway Clone2), a été cloné en un fragment de 90 pb. Utilisé comme sonde, I'ADNc de TSIP2 a révélé au moyen d'une analyse par Northern blot deux bandes, I'une abondante de 3 kb et l'autre plus faible de 7 kb. Ces ARNm sont inhibés après expression de la fonction p53 de type sauvage. Ce système de modèle tire avantage du mutant val-135 de p53 sensible à la température transfecté de façon stable dans des cellules myéloïde M1. Dans l'un de ces transfectants, exemplifié par les cellules LTR 6, le passage de 37 à 320C induit l'expression d'un p53 de type sauvage fonctionnel résultant en un phénomène d'apoptose. Le fragment d'ADNc de TSIP2 initial de 90 bp cloné à l'origine ne présentait pas d'homologie avec une quelconque séquence connue dans les bases de données. Ce fragment a été étendu à la totalité de l'ADNc en utilisant une RACE-PCR. Après séquençage d'un fragment de 700 pb additionnel, il s'est avéré que TSIP2 était identique au gêne PS1 de souris. L'inhibition de l'expression de l'ARNm de PS1 a été confirmée par une analyse par Northern blot utilisant la sonde d'ADNc dans sa totalité dans le modèle M1-LTR6. La régulation intervient très rapidement après le passage à 32CC et est indubitable après deux heures d'induction de p53 de type sauvage. Ceci indique que la modulation de I'expression de PSl intervient à un stade précoce du programme de la mort cellulaire, quand aucune cellule n'est encore morte d'apoptose. Par conséquent, la présente invention concerne un composé assurant l'inhibition; a) de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie du gène de la Préséniline 1, ou b) de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique présentant au moins 90 % d'homologie avec une séquence nucléotidique selon a), ou c) de l'action du produit d'expression d'une séquence selon a) ou b), pour la préparation d'un médicament. Au moins 90 % d'homologie avec a) signifie que la séquence nucléotidique en question présente au minimum 90 % d'homologie avec les parties essentielles du gène de la Préséniline 1, ce qui correspondra, sur la totalité de la séquence, à une homologie en générale d'au moins 50 %. L'invention concerne également un composé tel que précédemment décrit pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers et/ou du traitement de la maladie d'Alzheimer. Parmi les moyens susceptibles d'inhiber tout ou partie du gène de la Préséniline 1 ou d'une séquence nucléotidique fortement homologue, la présente invention comprend l'utilisation d'une séquence nucléotidique anti-sens du promoteur et/ou d'une séquence précédemment mentionnée. Dans le cas où il s'agit d'inhiber l'action du produit d'expression des susdites séquences, c'est-à-dire de la séquence peptidique correspondant aux séquences en question, I'invention comprend l'utilisation d'un anticorps, de préférence monoclonal, dirigé contre cette séquence peptidique. Considérant que PSl est régulé en aval dans un modèle-p53 d'apoptose, il était intéressant d'analyser si un schéma similaire de l'expression de PS1 était conservé dans d'autres modèles de suppression tumorale et d'investiguer la pertinence biologique de cette régulation en aval. Figure 1: a) L'extension du fragment de l'ADNc de TSIP2 (souligné) au clone de la longueur totale montre que cette molécule est identique à PSl (l'étoile indique la position du codon stop). b) Régulation en aval de PSI par p53 de type sauvage dans le modèle M1 LTR 6. L'analyse par Northern blot montre la régulation rapide de PS1 une fois que la fonction de p53 de type sauvage est activée en amenant la culture à 32"C à différents intervalles de temps (la totalité de l'ADNc de PS1 est utilisée comme sonde). Figure 2 L'analyse par Northern blot montre la régulation de PSl dans divers modèles de suppression tumorale et d'apoptose (la totalité de l'ADNc de PS1 est utilisée comme sonde), a) dans les systèmes K562-KS, quand p53 de type sauvage est réexprimé dans les cellules KS, b) dans le système U937-US (3 et 4), quand p21Waf est réexprimé dans les cellules US c) dans les transfectants stables p21 Wafl des cellules U937. Figure 3: a) Analyse par Western blot avec des anticorps anti-PS1. Bande 1: cellules U937; Bande 2 : cellules U937 transfectées de façon stable avec l'ADNc de PS1 anti-sens, aucune protéine PS1 n'est détectable, Bande 3: cellules U937 transfectée avec le vecteur de contrôle seul Bande 4 : cellules U937 transfectées avec l'ADNc de PS1. b) Tumorigénicité dans les souris scid/scid après injectiOn soit de cellules U937 transfectées avec le vecteur seul, soit les cellules U937 transfectées de façon stable avec l'ADNc de PS1 anti-sens. Pour investiguer la signification de l'inhibition de PSI dans les phénomènes d'apoptose et de suppression tumorale, son expression a été analysée dans une série de systèmes de modèles humains avec réexpression soit de p53 de type sauvage soit de p21 Wafl. Les cellules KS dérivent de la lignée des cellules K562 érythro-leucémiques humaines. Ces cellules KS expriment constitutivement p53 de type sauvage et ceci est détectable à un niveau protéique, tandis que les cellules K562 parentales n'expriment pas de p53. La régulation de PSI est observée dans les cellules KS qui ont le phénotype malin supprimé (Figure 2a) PSl est également régulé dans les cellules US qui dérivent d'un monoclone d'une leucémie monocytaire humain U937 (Figure 2b)). Les cellules US ont la particularité de réexprimer p21 Wafl indépendamment de p53. Ces cellules ont également le phénotype malin fortement supprimé. P21 Wafl fait partie de la série de molécules dont il a été déterminé qu'elle est activée par p53 mais qui peut être également exprimée indépendamment dans une voie alternative à p53. La régulation de l'expression de PSl par p21 Wafl a été ensuite confirmée dans des transfectants stables de cellules U937 avec p21 Wafl (Figure 2c)). Ces expérimentations suggèrent que PS 1 est effectivement régulé en aval par l'activation de p53 et/ou p21 Wafl dans l'apoptose et la suppression tumorale. Ainsi, il est intéressant de pouvoir moduler l'expression cellulaire de PS1 en agissant sur la voie métabolique p53 et/ou la voie métabolique p21. Par ailleurs, si dans certains cas, la mort cellulaire de cellules tumorales est le but à atteindre, il peut y avoir des cas ou l'on cherche précisément le contraire, à savoir à éviter la mort cellulaire. Par conséquent, la présente invention concerne un agent inhibant l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention, et de préférence de PS1, par l'activation de la voie métabolique de p53 et/ou par la voie métabolique de p21, ceci dans le but d'induire la mort cellulaire. Elle concerne également un agent activant l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention, et de préférence de PS1 par l'inhibition de la voie métabolique de p53 et/ou la voie métabolique de p21, ceci dans le but d'empêcher la mort cellulaire. Enfin, dans le but d'investiguer l'impact de la régulation de PS1 sur le phénotype malin, les cellules U937 ont été transfectées avec l'ADNc de PS1 antisens. La figure 3a) montre l'inhibition de l'expression de la protéine PS1 dans des transfectants stables U937 par l'anti-sens de PSl. Ces cellules ont également le phénotype malin fortement supprimé (Figure 3b) quand il est testé pour la tumorigénicité chez les souris scid/scid. Tous les animaux dans lesquels ont a injectés des cellules U937 transfectées avec le vecteur de contrôle seul ont développé d'importantes tumeurs et ont dû être sacrifiés dans les trois semaines. Au contraire, ceux à qui il avait été injecté des cellules U937 transfectées avec l'ADNc anti-sens de PS1 ont développé de petites tumeurs qui ne sont dévenues apparentes qu'en seulement 12 à 20 sites d'injections. Depuis la découverte des Présénilines en 1995, un effort important a été fait pour comprendre leur fonction et les associer à un schéma moléculaire bien défini, spécialement celui impliqué dans la mort cellulaire programmée. Tout ceci suggère que les Présénilines sont des gènes pour la vie et la mort . PSI et PS2 sont de protéines membranaires intégrales avec 7 à 9 domaines transmembranaires situés dans le réticulum endoplasmique et le complexe précoce de Golgi. PSI est fortement homologue à PS2, cette dernière étant mutée dans un sous-groupe de la maladie familiale d'Alzheimer. Le produit du gène de la Préséniline 2 forme des complexes stables avec des protéines précurseurs de béta-amyloïde. Le bétaamyloïde est la principale molécule formée dans les plaques typiques apparaissant chez les personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. Les souris transgéniques mutantes pour PS1 montrent un taux élevé de la protéine 42 précuseur de bétaamyloïde, fournissant par-là même un lien fonctionnel avec ce qui a lieu dans la maladie d'Alzheimer. L'expression intracellulaire de protéines béta-amyloide sous un promoteur spécifique des neurones dans les souris transgéniques conduit à la neurodégénération et il a été observé dans certaines de ces lésions une expression accrue de p53. La surexpression de PS2 dans les cellules PC12 différenciées du facteur de croissance nerveuse accroît l'apoptose initiée par l'élimination de facteurs trophiques. De plus, des mutations dans PS2 pourraient induire l'apoptose, même sans élimination de facteurs trophiques. Durant le développement, des anomalies du squelettes et du système nerveux central apparaissent chez les souris déficientes en Préséniline 1. De plus, PS I est nécessaire pour l'expression de Notch 1 et de DLL1 dans le développement du mésoderme paraxial. Les protéines de Préséniline semblent présenter un clivage alternatif complexe durant l'apoptose. PSI semble être un membre actif des voies moléculaires p53-p21 Wafl de l'apoptose et de la suppression tumorale et il est important de rappeler qu'une expression de p53 intacte est nécessaire pour assurer les fonctions complexes du système nerveux central. Outre la thérapie de maladies telles que les cancers ou la maladie d'Alzheimer, il est par conséquent très important de pouvoir disposer du système permettant la détection aussi précoce que possible des maladies en question. La présente invention a donc également pour objet un agent de diagnostic pour la détermination et le suivi des cancers et/ou de la maladie d'Alzheimer comprenant une séquence conforme à l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification. L'invention concerne également un agent de diagnostic pour la détermination et le suivi des cancers et/ou de la maladie d'Alzheimer comprenant au moins un anticorps, de préférence monoclonal, correspondant à la séquence peptidique définie plus haut comme étant le produit d'expression d'une séquence conforme à l'invention. L'invention ne se limite pas à la description ci-dessus et sera mieux comprise à la lumière de l'exemple ci-après qui n'est cependant donné qu'à titre illustratif. EXEMPLE : Matériel et Méthodes Clonage de la longueur totale de l'ADNc de TSIP2 L'ADNc de TSIP2 (90 pb) isolé par analyse différentielle des ARNm a ensuite été étendu à la région codante totale de ce gène par RACE-PCR (amplification rapide des extrémités d'ADNc). La longueur totale de l'ADNc de TSIP2 a été amplifiée au moyen du kit d'amplification d'ADNc de Marathon (Clontech Laboratories), conformément aux instructions du fabricant. L'amorce anti-sens utilisée pour amplifier 2,7 kb du segment 5' du transcrit est le suivant: 5'CACCAGCCACTCATCGCTTTAAT3'. Le produit amplifié a été cloné au moyen du système de clonage TA (Invitrogène), conformément aux instructions du fabricant. Analyse par Northern blot Des Northern blots ont été réalisés en utilisant 2 pLg d'ARN polyA comme décrit antérieurement (Sambrook et al.). L'ADNc total de TSIP2 (2,8 kb) a été utilisé comme sonde. Les Northern blots ont été hybridés avec des sondes marquées au P32 amorcées au hasard. Cellules Les cellules M1-LTR6 transfectées de façon stable avec un mutant sensible à la température val 135 p53, les cellules K562 / KS et les cellules U937 / US ont été décrites antérieurement. Pour les transfectants p21 Wafl des cellules U937, I'ADNc total codant pour le gène humain p21WAF-' a été cloné dans le site EcoRI du vecteur phagemide pBK-RSV (Stratagène). Après sélection, ces cellules expriment à un niveau élevé la protéine p21 et ont un phénotype malin fortement supprimé. Transfections de PS1 L'ADNc total de TSIP2 (2,8 kb) a été cloné dans le site EcoRI du vecteur pBK - RSV (Stratagène). Les cellules U937 (3 x 106) Ont été transfectées avec 20 ,xLg d'ADN/30 g de Lipofectine (Gibco, BRL). Les transfectants stables, contenant l'ADN anti-sens de TSIP2, ont été obtenus après trois semaines de sélection avec 1,5 mg/ml de G418 (SIGMA). Analyse par Western blot Des Western blots ont été réalisés avec 10 llg de blots de protéine préhybridée dans 1X PBS, matière grasse de lait à 5 %, pendant deux heures à température ambiante et hybridée à un anticorps polyclonal de chèvre S182 (C-20, Santa Cruz Laboratories) toute la nuit à 40C, lx PBS, matière grasse de lait à 0,5 %. Les signaux ont été détectés par un anti-corps secondaire (anti-chèvre, couplés à une péroxidase). Analyse de la Tumorigénicité Une injection à des souris scid/scid a été réalisée comme précédemment décrit (Telerman et al.)107 cellules ont été injectées par site. Les animaux ont été suivis pendant trois mois. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour l'analyse statistique. REFERENCES Sambrook J., Fritsch E.F. & Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual. Sherrington, R. et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in earlyonset familial Alzheimer's disease. Naittre 375, 754-760 (1995). Telerman, A. et al. A model for tumor suppression using H-l parvovirus. Proc. Natal. Acad Sci. USA 90,8702-8706(1993). REVENDICATIONS 1. Composé assurant l'inhibition: a) de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie du gène de la Préséniline 1, ou b) de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique présentant au moins 90 % d'homologie avec une séquence nucléotidique selon a), ou c) de l'action du produit d'expression d'une séquence selon a) ou b), pour la préparation d'un médicament. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le médicament est destiné au traitement des cancers. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le médicament est destiné au traitement de la maladie d'Alzheimer. 4. Composé selon l'une des revendications I à 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une séquence nucléotidique anti-sens du promoteur et/ou d'une séquence selon la revendication 1.a) ou l.b). 5. Composé selon l'une des revendications I à 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps, de préférence monoclonal, dirigé contre la séquence peptidique telle que définie par la revendication l.c). 6. Agent inhibiteur de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique selon la revendication l.a) ou l.b) caractérisé en ce qu'il active la voie métabolique de p53 et/ou la voie métabolique de p21. 7. Agent activateur de l'expression cellulaire d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1.a) ou l.b) caractérisé en ce qu'il inhibe la voie métabolique de p53 et/ou la voie métabolique de p21. 8. Agent de diagnostic pour la détermination et le suivi des cancers comprenant une séquence selon la revendication i.a) ou l.b) à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification. 9. Agent de diagnostic pour la détermination et le suivi des cancers comprenant au moins un anticorps, de préférence monoclonal, correspondant à la séquence peptidique telle que définie par la revendication 1.c). 10 Agent de diagnostic pour la détermination et le suivi de la maladie d'Alzheimer comprenant une séquence selon la revendication l.a) ou l.b) à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification. il. Agent de diagnostic pour la détermination et le suivi de la maladie d'Alzheimer comprenant au moins un anticorps, de préférence monoclonal, correspondant à la séquence peptidique telle que définie par la revendication i.c).