Brevet FR2764306A1 — publié le 19981211

La présente invention concerne notamment le dépistage de la prédisposition ainsi que le diagnostic de la migraine hémiplégique familiale, ci-après MHF , et la possibilité de mettre en évidence un ou plusieurs gènes impliqués dans cette affection. La migraine hémiplégique familiale est une affection héréditaire. La migraine hémiplégique est une forme de migraine avec aura dans laquelle l'aura comporte un déficit moteur unilatéral, en général associé à des symptômes visuels et sensitifs, suivie par des maux de tête migraineux (2, 3). Dans les attaques sévères, des déficits prolongés, une fièvre, une confusion et un coma, peuvent survenir mais disparaissent généralement sans séquelle (4). Les recherches récentes ont montré que le gène responsable de la survenue d'une MHF dans certaines familles était localisé sur le chromosome 19 (11). Ce gène, CACNL1A4, code pour une sous-unité al d'un canal calcique spécifique du cerveau (1). Toutefois, les inventeurs ont démontré que la MHF était génétiquement hétérogène: en particulier 9 des 21 familles testées jusqu'à maintenant n'étaient pas liées au chromosome 19 (5, 6, 7). Une analyse de liaison conduite sur une de ces familles non liées au chromosome 19 a permis de localiser un deuxième gène responsable de la MHF sur le chromosome 1. Plus particulièrement, le locus de susceptibilité, qui sera dénommé ci-après MHF2, (par opposition au locus situé sur le chromosome 19 dénommé MHF1), est situé dans la région lq21-lq23 dans un intervalle de 21 cM (centimorgan) (8) flanqué par les deux marqueurs D1S2343 et D1S2844. Les marqueurs mentionnés dans la présente description sont connus, il s'agit des marqueurs du Généthon et les amorces permettant de les mettre en évidence sont également connues. Un Lod-score supérieur à 3 a été obtenu dans cette première famille avec deux marqueurs, Dus2635 et Dus2705. Trois autres marqueurs, D1S2343, DIS2707 et D1S2844 montraient des lod-scores supérieurs à 2. L'ensemble de ces données a permis d'établir l'existence d'un deuxième locus pour la MHF situé sur le chromosome 1. Deux autres familles de MEF parmi les 6 familles testées pour leur liaison au chromosome 1 étaient bien liées au chromosome 1. Les 4 familles restantes n'étaient pas liées au chromosome 1, démontrant ainsi l'existence d'au moins un troisième locus pour la MHF puisque ces 4 familles n'étaient pas non plus liées au chromosome 19. Parmi les 3 familles liées au chromosome 1, deux des familles comptaient plusieurs membres chez lesquels le diagnostic de migraine hémiplégique avait été très tardif et difficile en raison de la nature des symptômes qu'ils présentaient. Le diagnostic clinique chez certains de ces patients avait hésité entre migraine hémiplégique et crise d'épilepsie. Par ailleurs, la pénétrance clinique (pourcentage des individus porteurs du gène malade qui expriment le phénotype malade) des formes de MHF liées au chromosome 1 est incomplète et plus faible que dans les formes liées au chromosome 19. Ainsi, un sujet atteint peut se présenter comme un cas sporadique. Ces deux observations, I'intrication avec des crises d'épilepsie et le caractère incomplet de la pénétrance, soulignent l'intérêt d'un test diagnostique génotypique de cette forme de MHF. En outre, ces formes de MHF liées au chromosome 1 pourraient justifier de traitements différents des autres formes de MHF. La connaissance du locus selon la présente invention permet d'envisager le diagnostic de la maladie, notamment au sein des familles à risque, et permet d'orienter le diagnostic lors de la survenue d'un épisode paroxystique. C'est pourquoi, la présente invention concerne une méthode de diagnostic génotypique indirect de la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un individu caractérisée en ce que: on met en évidence dans l'ADN provenant dudit individu la présence d'un marqueur situé sur le chromosome lq21-q23 dans le locus limité par les marqueurs D1S2343 et D1S2844, ledit marqueur étant lié à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille. Cette méthode peut être appliquée notamment dans les deux cas suivants: . d'une part, devant un tableau de migraine hémiplégique familiale, pour mettre en évidence le fait qu'il s'agit d'une MHF2, c'est-à-dire liée au chromosome 1, et qui pourraient justifier de traitements particuliers différents de ceux appliqués dans le cas de MHF1 liée au chromosome 19, . d'autre part, pour déceler chez un individu appartenant à une famille à risque le risque qu'il souffre d'une MHF et éviter ainsi des diagnostics erronés. Par marqueur lié à la survenue de la MHF au sein de la famille de l'individu on entend désigner la présence d'une ou plusieurs séquences d'ADN qui sont liées avec la survenue de l'affection dans la famille, certains de ces marqueurs situés dans le locus précédent sont identifiés plus précisément ci-après. Un marqueur utilisable dans la méthode selon la présente invention peut être mis en évidence par l'analyse de liaison appliquée à des échantillons d'ADN provenant des membres de la famille, affectés ou non. Il s'agit d'un processus qui est connu et qui ne sera donc rappelé que succinctement ci-après. La première étape consiste à établir le lien entre le gène responsable de la pathologie et un ou plusieurs marqueurs. Cette étude est conduite sur des familles dont la structure se prête à ce type d'analyse, c'est-à-dire des familles dans lesquelles la présence de la migraine hémiplégique familiale a été clairement établie par des analyses cliniques aussi complètes que possible. Ensuite, on réalise une analyse de liaison génétique entre les différents marqueurs testés, c'est-à-dire des fragments d'ADN, et la pathologie; on utilise pour ce faire, de préférence, des marqueurs hautement polymorphes: des microsatellites flanquant des unités répétées hautement polymorphes CA ou GATA, ces marqueurs recouvrant l'intervalle dans lequel se trouve le gène mis en cause dans la pathologie, ici le locus situé entre D1S2343 et D1S2844. L'intérêt d'utiliser des marqueurs microsatellites est qu'il s'agit de séquences qui sont très polymorphes, c'est-à-dire qu'elles ont des compositions différentes selon les individus, bien qu'étant situées au même endroit sur le chromosome, ces zones sont dénommées microsatellites et font l'objet de nombreuses publications (Weissenbach J. et al., Nature 359, 794-801, 1992; Gyapay et al. 1996, A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites, Nature, vol. 380 ; Hudson et al., 1992, Genomics 13: 622-629 et Weber et May, 1989 et Weber J. et al., Am. J. Hum. Gen., 1993, 53, 1079-1095). Ces marqueurs sont sélectionnés pour donner les meilleures informations pour une famille déterminée. Plus ces marqueurs sont proches du gène, plus le risque de recombinaison entre le gène et ces marqueurs sera faible et donc le diagnostic sera d'autant plus fiable. Dans le cas de la migraine hémiplégique familiale, les deux marqueurs mentionnés précédemment sont les marqueurs d'extrémité mais d'autres marqueurs ont pu être utilisés, il s'agit notamment des marqueurs: D1 S2343 D1S2635 D1S2707 D1S2705 D1S2844 Ces marqueurs microsatellites, de même que les amorces qui permettent de les mettre en évidence, sont connus, ils ont fait l'objet de nombreuses publications et en particulier figurent dans la carte dite Carte du Généthon . Les allèles sont définis par les différentes tailles des fragments amplifiés avec les oligonucléotides correspondant à un microsatellite donné. L'analyse de plusieurs membres de statut défini au sein d'une famille permet d'identifier pour chaque marqueur l'allèle qui est lié à la maladie dans la famille considérée. Bien entendu, il est possible de mettre en évidence d'autres marqueurs dans le même locus qui pourraient être liés à la survenue de la maladie dans la famille en cause. Afin de détecter la présence d'un allèle microsatellite, la méthode la plus couramment utilisée consiste, après avoir hybridé les amorces correspondant aux marqueurs microsatellites par exemple, à procéder à une amplification par PCR ou par toute méthode analogue, puis à séparer le produit d'amplification, notamment par électrophorèse sur gel d'acrylamide, puis mise en évidence par marquage à l'aide des séquences de type polyCA ou polyGATA à titre de sonde pour les microsatellites. Une analyse statistique, méthode des lod-scores , permet d'estimer, à partir de la distribution observée des allèles au sein de la famille, s'il existe ou non une liaison génétique entre la pathologie en cause et le marqueur testé. L'analyse statistique dite de lod-score est une technique statistique connue et on admet couramment qu'un lod-score supérieur à 3 établit de façon non ambiguë le lien entre le gène de la pathologie et le marqueur testé. Si un marqueur et un gène sont très proches (on dit qu'ils sont liés), la portion de chromosome les contenant sera transmise telle quelle à la descendance, par contre, si le marqueur est plus éloigné, il peut se trouver séparé du gène lors de la transmission ( crossing over ) et sa présence n'est plus nécessairement associée à la présence du gène défectueux. Bien entendu, lorsque cette analyse a été réalisée, comme c'est le cas dans le cadre de la présente invention, il est possible d'utiliser directement des informations ainsi collectées pour réaliser le dépistage d'une prédisposition à la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un membre de cette famille, il n'est pas nécessaire de refaire l'ensemble de l'analyse. La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre aussi bien chez l'adulte, chez l'enfant, que chez le foetus à titre de diagnostic prénatal. Afin de simplifier la détection, lorsque l'on utilise différents marqueurs, il est possible d'utiliser la PCR multiplex . Le principe est de réaliser plusieurs réactions de PCR simultanément à partir d'un même échantillon d'ADN génomique. L'intérêt est d'économiser les réactifs ainsi que l'ADN à typer, et de réduire le risque d'erreur en diminuant le nombre de manipulations. Bien entendu, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'amplification que la PCR, qui sont parfois appelées PCR-like , ou autres. De même, les méthodes de révélation sont connues et ne seront pas décrites en détail. A titre indicatif, on donne ci-après un protocole de diagnostic sur la base des polymorphismes qui ont été décrits précédemment. Bien entendu, toute méthode de diagnostic génotypique indirect peut être utilisée. Afin de sélectionner les marqueurs les plus informatifs en fonction de ce qui est connu sur la famille ou bien du fait qu'on cherche à établir un diagnostic sur la famille, on réalisera les opérations suivantes On obtient de l'ADN des différents membres de la famille, chacun d'entre eux ayant été étudié sur le plan clinique afin de mettre en évidence l'existence ou non de la maladie chez l'individu en question. . L'ADN nucléaire peut, par exemple, être isolé à partir des leucocytes du sang périphérique, des cellules lymphoblastoïdes, des cellules du liquide amniotique, mis en culture ou autre, traité de façon appropriée. . Ensuite on amplifie les allèles polymorphiques des microsatellites par la méthode PCR en utilisant un appareil thermocycleur, . puis on analyse la taille des produits d'amplification par électrophorèse sur gel, fixation sur membrane et hybridation avec des sondes appropriées tel que cela a été mentionné précédemment. II est également possible de pratiquer une analyse par RFLP, c'est-à-dire analyse des fragments de restriction polymorphes sur un gel d'agarose après Southern blotting. . Les informations obtenues des autoradiographies sont analysées par le programme statistique. La confirmation du lien ou de l'absence de lien entre les fragments analysés et la MHF ont fait l'objet d'une analyse statistique pour laquelle un score de liaison supérieur à 3 établit de façon non ambiguë la liaison entre le gène responsable de la pathologie et le marqueur testé. Un lod-score positif mais inférieur à 3 peut être obtenu en cas de liaison au locus MHF2, en raison de la petite taille de la famille explorée. Un calcul de probabilité que la famille soit liée peut alors être réalisé en utilisant la méthode HOMOG (12). Ceci permet ensuite de déterminer les microsatellites les plus informatifs pour la famille en cause. Le protocole de diagnostic pour un individu à risque d'une maladie met en oeuvre les informations obtenues précédemment: on sélectionne les marqueurs les plus informatifs pour la famille en cause, on sépare l'ADN de l'individu par des procédés appropriés, . on amplifie les séquences situées dans le locus de survenue de la maladie, comme cela a été décrit précédemment, on analyse les produits d'amplification, . on utilise ensuite les marqueurs polymorphes et les résultats trouvés précédemment de façon à pouvoir calculer le risque de survenue de la pathologie chez l'individu en cause. La présente invention concerne également la séquence d'ADN et les gènes impliqués dans MHF2. La localisation du gène MHF2 permet, en effet, par une stratégie de clonage fonctionnel d'identifier ce gène. Il est possible d'isoler le gène, notamment par . recherche simultanée de nouveaux marqueurs polymorphes et de nouveaux haplotypes recombinants qui permettront de rétrécir encore la région contenant le gène; recherche directe de gènes par plusieurs méthodes sélection de transcrits par hybridation piégeage d'exons séquences phylogénétiquement conservées îlots CpG expansion de triplets C'est pourquoi la présente invention concerne également la séquence d'ADN située sur le locus situé entre les marqueurs DIS2343 et D1S2844 et liée à la survenue de la migraine hémiplégique familiale ainsi que le gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 et situé sur un ADN selon l'invention. D'autres caractéristiques et modalités de mise en oeuvre du procédé pourront être déduits de la lecture de l'exemple qui suit. La figure 1 schématise le pedigree des 3 familles MHF liée au chromosome I q21 -q23. Les individus affectés sont représentés par des symboles noircis, les individus non affectés sont représentés par des symboles vides, lorsque le statut de l'individu est inconnu, le symbole est hâchuré, les individus n'ayant pas d'information sont rayés. On a également représenté la position des différents marqueurs de la région. Les allèles pour les marqueurs sont représentés pour chaque individu, les parties noircies indiquent des régions qui coségrègent avec la maladie. EXEMPLE Méthode de génotvPaze de l'ADN génomisue humain avec des marqueurs microsatellites de la région la21-lu23 La famille P est une grande famille caucasienne de 3 générations provenant du nord de la France. Les familles C, D et V sont originaires du sud de la France, les familles H et N du centre de la France et la famille W du nord de l'Espagne. Un total de 102 sujets comprenant 20 époux a été examiné dans le cadre de la présente étude. Dans la famille P, 12 membres soufflent de crises de migraine hémiplégique caractéristiques (2). En plus des attaques typiques, 5 d'entre eux ont subi des épisodes sévères dans lesquels l'hémiplégie a été associé à de la fièvre, de la confusion et un coma. Dans les 6 autres pedigrees, 35 patients ont été identifiés remplissant les critères de l'international Headache Society. Les 47 sujets soufflant de lvlHF avaient un examen neurologique normal en dehors des crises. Ces 47 membres ont été classés comme affectés. 25 sujets âgés de plus de 15 ans n'ont pas d'histoire de migraine hémiplégique, aucune migraine avec aura non hémiplégique ou autre épisode non déterminé comme méningite aseptique ou confusion épisodique. Ces 25 ont été classés comme sains. 9 sujets souffrant de migraine avec aura sensitive et visuelle, ou ayant des enfants chez lesquels existait un doute diagnostique, ont été classés de statut inconnu. Du sang a été collecté de tous les membres consentants et l'ADN a été préparé comme cela est décrit. Du fait de la présence de I ou 2 sujets asymptomatiques porteurs obligatoires du gène muté dans chaque famille, la pénétrance pour l'analyse de liaison a été fixée à 80%. Le résultat de cette analyse est représenté dans la figure 1 annexée selon les représentations habituelles. L'analyse des marqueurs figurant sur cette figure a été effectuée de la façon suivante: L'ADN est extrait du sang des différents individus par des méthodes connues. 5 marqueurs ont été choisis dans la carte de liaison du Généthon. L'ADN a été amplifié par la méthode PCR en utilisant l'appareil PHC3 Techne. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 50 p1 contenant 200 ng d'ADN génomique, 125 mM mélange 4dNTP, I x tampon PCR Cetus Taq polymérase, I U BRL Taq polymérase, 1 mM de chaque amorce. Les échantillons sont traités pendant 30 cycles de température (1 cycle, 94"C pour 5 min; 28 cycles incluant une étape de dénaturation à 92"C pour 1 min et une étape de fixation à 55"C pendant 1 min et une extension à 720C pendant 1 min, le dernier cycle autorise une extension à 72"C pendant 10 min). Après addition de 75 pI de tampon de charge, les échantillons sont dénaturés pendant 5 minutes à 94"C puis placés sur un gel d'acrylamide à 6%. Après transfert sur membranes de nylon, celles-ci sont fixées dans 0,4 M d'hydroxyde de sodium et hybridées avec une sonde marquée au P32 (CA)12 pendant 14 heures. Les produits amplifiés sont alors visualisés grâce à un film sensible aux rayons X après 4 à 6 heures d'exposition. L'analyse de liaison bipoint est effectuée en utilisant le programme Linkage (9). Les paramètres de l'analyse de liaison étaient les suivants mode de transmission autosomique dominant, pénétrance estimée à 80%, fréquence du gène muté fixée à 0,0001, fréquences de recombinaison supposées identiques dans les deux sexes. La fréquence allélique pour chaque locus est obtenue à partir de la Genome Data Base. Analvse des résultats 30 membres de la famille P ont été génotypés avec 260 marqueurs microsatellites couvrant tous les chromosomes. Un score de liaison significatif de 3,64 a été obtenu à e = 0,05 pour DIS2705. 4 marqueurs supplémentaires à proximité de DIS2705 ont alors été testés dans la famille P (tableau 1). Le marqueur DIS2635 a montré une liaison significative avec un Zmax de 3,33 à 0 = 0,05. Afin de confirmer qu'un gène de la FMH se trouvait sur le bras long du chromosome 1, on a effectué une analyse de liaison dans 6 autres familles. 2 ont montré des scores de liaison positifs avec différents marqueurs (tableau 1). Avec D1S2635 le score de liaison combiné maximum pour les 3 familles montrant des lod-scores positifs a été de 4,21. Ce score de liaison maximum a été identifié à une fraction de recombinaison de 0,07 indiquant que certains individus étaient recombinants. 4 familles, C, N, H et W, montrent des scores de liaison négatifs avec tous les marqueurs testés de l'intervalle Dl S2343-D 1 S2844. Ces informations démontrent l'existence d'au moins un 3ème locus pour la MHF. La région où a été localisé le gène MHF2 contient deux gènes candidats pour cette affection, GIRK3 (15, 16, 17) qui code pour un canal potassique, et CACNL1A6 (13, 14) qui code pour un canal calcique. L'invention concerne également l'utilisation des gènes hGIRK3 et CACNL1A6 pour la mise en évidence de la migraine hémiplégique familiale. TABLEAU i Score de liaison Dour la FMH et les marqueurs du chromosome 1 (pénétrance 80%) Locus Famille 0,00 0,01 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40 Zmax à8 D1S2343 D -3,19 -0,81 -0,18 0,02 0,12 0,09 0,03 0,12 0,20 P -0,98 1,67 2,72 2,86 2,47 1,72 0,80 2,87 0,09 V -2,63 -0,46 0,13 0,30 0,32 0,22 0,09 0,34 0,16 Total -6,81 0,40 2,67 3,18 2,92 2,04 0,92 3,22 0,12 DIS2635 D -2,89 0,51 0,09 0,27 0,33 0,24 0,11 0,33 0,17 P -1,26 2,98 3,33 3,18 2,'9 1,60 0,69 3,33 0,05 V 0,84 0,82 0,75 0,67 0,49 0,32 0,16 0,84 0,00 Total -3,31 3,29 4,18 4,12 3,31 2,16 0,95 4,21 0,07 D1S2707 D 0,60 0,59 0,53 0,46 0,32 0,17 0,05 0,60 0,00 P -6,06 1,26 2,34 2,51 2,19 1,52 0,66 2,51 0,10 V 1,40 1,37 1,25 1,09 0,77 0,46 0,19 1,39 0,00 Total -4,06 3,22 4,11 4,07 3,28 2,15 0,90 4,15 0,07 Dol 52705 D -4,01 -1,60 -0,88 -0,57 -0,26 -0,10 -0,02 - P -1,63 3,28 3,64 3,49 2,81 1,90 0,85 3,64 0,05 V 1,34 1,31 1,19 1,05 0,76 0,46 0,19 1,34 0,00 Total -4,31 2,99 3,95 3,98 3,32 2,26 1,02 4,02 0,08 D1S2844 D -6,55 -2,21 -0,88 -0,38 0,02 0,14 0,12 0,02 0,20 P -3,08 1 1,00 2,13 2,36 2,12 1,50 0,69 2,36 0,11 V 0,78 0,77 0,68 0,58 0,37 0,18 0,05 0,76 0,00 Total -8,87 -0,46 1,90 2,53 2,49 1,81 0,85 2,64 0,14 D 1 S2635 C -3,79 -3,23 -1,93 -1,28 -0,61 -0,25 -0,06 H -8,16 -5,23 -2,80 -1,17 0,67 -0,22 -0,03 N -6,35 -3,73 -1,99 -1,19 -0,49 -0,18 -0,03 W -4,43 -2,66 -1,81 -1,34 -0,78 -0,43 -0,17 D1S2707 C -4,41 -1,88 -1,11 -0,73 -0,34 -0,14 -0,03 H -12,04 -5,96 -3,27 -2,09 -0,99 -0,45 -0,15 N -3,06 -1,40 -0,73 -0,46 -0,21 -0,08 -0,02 W -4,09 -1,80 -1,07 -0,75 -0,44 -0,28 -0,14 D1S2705 C -3,63 -1,12 -0,45 -0,19 -0,01 0,02 0,01 H -8,44 -4,49 -2,38 -1,47 -0,62 -0,23 -0,05 N -2,79 -2,50 -1,42 -0,88 -0,38 -0,15 -0,03 W -4,13 -3,34 -2,01 -1,40 -0,78 -0,43 -0,18 D1S2844 C -4,51 -2,39 -1,28 -0,76 0,28 0,01 0,01 H -11,87 -6,82 -3,96 -2,52 -1,18 -0,52 -0,16 N -3,10 -2,50 -1,28 -0,75 -0,30 -0,10 -0,02 W -4,13 -3,35 -2,01 -1,40 -0,79 -0,43 -0,18 Références 1. 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REVENDICATIONS Méthode de diagnostic génotypique indirect de la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un individu, caractérisée en ce que on met en évidence dans l'ADN dudit individu la présence d'un marqueur situé sur le chromosome 1q21-q23 dans le locus limité par les marqueurs DIS2343 et D1S2844, ledit marqueur étant lié à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur est choisi parmi les marqueurs microsatellites du locus défini. 3) Méthode selon l'une des revendications I et 2, caractérisée en ce que le marqueur est mis en évidence après amplification du locus dudit marqueur. 4) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'amplification est effectuée par PCR. 5) Méthode selon l'une des revendications I à 4, caractérisée en ce que les marqueurs microsatellites sont choisis parmi Du 52343 D1S2635 Du 52707 D1S2705 Dol 52844 6) Méthode selon l'une des revendications I à 5, caractérisée en ce que le prélèvement biologique est un prélèvement de sang. 7) Méthode selon l'une des revendications I à 6, caractérisée en ce que l'on prélève l'ADN d'un individu, on amplifie les marqueurs microsatellites liés à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille, on met en évidence la présence ou l'absence des allèles microsatellites liés à la survenue de la MHF dans sa famille pour évaluer les risques de survenue de la pathologie. 8) Séquence d'ADN située sur le locus situé entre les marqueurs DIS2343 et Du 52844 et liée à la survenue de la migraine hémiplégique familiale de type 2. 9) Gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 et situé sur un ADN selon la revendication 8. 10) Gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les gènes hGIRK3 et CACNLI A6. il) Utilisation du gène hGIRK3 ou du gène codant pour le canal calcique CACNLIA6 selon la revendication 9 pour la mise en évidence de la migraine hémiplégique familiale.