Brevet FR2762012A1 — publié le 19981016

-1- La présente invention concerne un procédé technique permettant l'obtention d'un caractère microbiologique particulier, qui est l'obtention d'un état viable non cultivable concernant le type de bactéries inoculées après un traitement à l'acide péracétique. Ce procédé technique s'effectue dans l'eau épurée et dans l'eau de mer synthétique. Ce procédé technique permet l'obtention d'un état viable non cultivable des bactéries inocu- -lées et permet, après avoir effectuer des analyses microbiologiques classiques, de déterminer la pathogénicité de ce type de bactéries. La mise en évidence de la pathogénicité ainsi que de la viabilité d'une bactérie entérique en eau de mer synthétique et en eau épurée après un traitement à l'acide péracétique à la concentration de cinq milligrammes par litre n'a pas été effectuée. La souche utilisée, dans le procédé technique décrit ci-dessous, est Salmonella typhimurium. Cette souche bactérienne est inoculée dans un milieu riche non sélectif qui est le bouillon coeur-cerveau. La souche est inoculée dans deux flacons stériles d'un volume de cent centimètre cube chacun. Ces deux flacons sont placés au bain- -marie pendant environ quinze heures. C'est le temps nécessaire pour que les bactéries soient en phase stationnaire. Ensuite, le contenu de chaque flacon est centrifugé dans des flacons stériles à fond conique, spécifiques pour permettre la centrifugation qui s'ef- -fectue à cinq mille tours pendant quinze minutes. Après avoir effectué la centrifugation, les culots obtenus sont rincés avec de l'eau distillée stérile, filtrée et autoclavée. Le rinçage des culots est effectué par deux fois et à chaque rinçage, une nouvelle centrifugation est effectuée. Tous les culots sont ensuite regroupés en un seul, et ce dernier permet d'inoculer un flacon d'un litre d'eau épurée stérile. L'incubation de ce dernier dure vingt quatre heures à la température ambiante et sous une lente agitation. Le traitement à l'acide péracétique est ensuite effectué à la concentration de cinq milli- -grammes par litre soit trois virgule cinquante huit centimètre cube d'une solution d'acide péracétique concentrée à un virgule quatre grammes par litre. Le volume d'acide péracétique nécessaire est filtré et introduit dans le flacon d'eau épurée. La durée du traitement dure une heure à la température ambiante. Pour arrêter l'action du traitement, un volume de deux centimètre cube, d'une solution de thiosulfate de sodium filtrée et concentrée à un gramme par centimètre cube, est utilisée pendant une durée minimale de quinze minutes. Une fois le traitement effectué et arrêté par l'action du thiosulfate de sodium, une dilution du flacon est effectuée. Une dilution au demi est effectuée dans de l'eau épurée et dans de l'eau de mer. -2- Le flacon d'eau épurée traité ayant un volume de un litre, la moitié de ce demrnier est additionnée à cinq cent centimètre cube d'eau épurée stérile. L'autre moitié est addition- -née à cinq cent centimètre cube d'eau de mer synthétique stérile. A ce moment du procédé, les analyses microbiologiques seront effectuées une fois par jour et cela pendant trois jours. En parallèle, des flacons d'eaux témoins ont été effectués. Le procédé technique utilisé est relativement identique au premier décrit page un, seul le traitement n'a pas été effectué sur ces eaux afin de pouvoir apprécier l'efficacité de ce dernier. La souche utilisée est Salmonella typhimurium, elle est inoculée dans un flacon stérile de vingt centimètre cube de bouillon coeur-cerveau. Ce flacon est placé au bain-marie pendant un temps minimum de quinze heures afin que les bactéries soient en phase stationnaire. Le contenu du flacon est ensuite centrifugé dans un flacon stérile à fond conique, spécifique pour permettre la centrifugation qui s'effectue à cinq mille tours pendant un temps de quinze minutes. Apres avoir effectuer la centrifugation, le culot est lavé par deux fois à l'eau distillée stérile, filtrée et autoclavée. A chaque rinçage, une nouvelle centrifugation est effectuée. Le culot est ensuite introduit dans un flacon d'eau épurée stérile d'un volume de cent centimètre cube. Ce flacon est incubé à la température ambiante pendant vingt-quatre heures et sous une lente agitation. A partir de ce flacon d'eau épurée, une dilution au demi est effectuée dans de l'eau épurée stérile, dans de l'eau de mer synthétique stérile et dans de l'eau distillée stérile. Le flacon d'eau épurée ayant subit l'incubation a une contenance de cent centimètre cube donc seulement le tiers de ce flacon sera utilisé à chaque dilution soit trente centimètre cube. Le premier tiers sera additionné à un volume de trente centimètre cube d'eau épurée stérile, le second tiers sera additionné à un volume de trente centimètre cube d'eau de mer synthétique stérile et le dernier tiers sera additionné à un volume de trente centimètre cube d'eau distillée stérile. Suite à cette dilution, trois flacons distincts sont obtenus. Ces flacons témoins seront aussi analysés tous les jours pendant deux jours. Les flacons témoins n'étant pas traités, les trois jours d'analyses ne sont pas nécessaires. La veille de chaque prélèvement, il faut ensemencer un tube stérile de bouillon coeur- cerveau crd'un volume de vingt centimètre cube avec la souche Salmonella typhimurum. Un autre tube stérile de bouillon coeur-cerveau doit être ensemencé avec une souche Escherichia coli. Ces deux tubes sont incubés au bain-marie et vont servir respective- -ment de témoin positif et de témoin négatif lors de l'analyse de la pathogénicité. -3- Les prélèvements sont effectués pendant trois jours sur les flacons traités. A chaque prélèvement, trois cent dix centimètre cube sont prélevés dans chaque flacon. C'est un volume qui est nécessaire pour pouvoir effectuer les quatre analyses microbio- -logiques à partir des eaux traitées. Sur les eaux témoins, seulement trente et un centimètre cube sont prélevés par jour et pendant deux jours. Le procédé technique est maintenant décrit. Les analyses microbiologiques ne font pas parties de ce procédé technique mais ce sont les résultats que l'on obtient à la suite des analyses qui permettent de décrire que les bactéries testées acquièrent un état viable non cultivable et sont de plus pathogènes après ce traitement. Les quatre analyses concernées sont respectivement - le dénombrement des bactéries totales - le dénombrement des bactéries viables:"Direct viable count" - étude de la pathogénicité: Technique Adhésion et Invasion - le dénombrement des bactéries cultivables( Unité Formant une Colonie), les analyses sont décrites ci-dessous afin d'apporter une meilleure compréhension. Le dénombrement des bactéries totales s'effectue lorsque les bactéries sont filtrées stérilement sur des dispositifs de filtration. Ces bactéries sont filtrées sur une mem- -brane Nuclépore noire de zéro virgule vingt -deux micromètre. Une fois les bactéries diluées au millième et filtrées, une coloration à l'acridine orange est effectuée. Un volume de deux centimètre cube est de ce colorant est déversé sur le filtre afin de le recouvrir entièrement. Ce colorant se fixe sur les acides nucléiques des bactéries vivantes et mortes. Les bactéries sont ensuite dénombrées par épifluorescence sous un microscope Nikon équipé d'une lampe à mercure. Le dénombrement des bactéries viables encore nommé "Direct viable count" est effectué de la manière suivante: La solution utilisée comprend de l'extrait de levure à la concentration de deux cent cinquante milligrammes par litre, ce qui favorise la croissance bactérienne. Cette solution comprend de l'acide nalidixique à la concentration de quatre milligrammes par litre ce qui permet d'arrêter la division cellulaire en inhibant l'acide désoxyribonucléique girase. Les bactéries apparaissent allongées et le comptage s'effectue à l'aide d'un microscope équipé d'une lampe à mercure. Une fois la solution entièrement préparée, elle est filtrée stérilement. Les bactéries sont filtrées sur une membrane Nuelépore noire de zéro virgule vingt-deux micromètre, puis rincées avec la solution précédem- -ment préparée. Les filtres sont ensuite déposés dans des boites de pétri en verre, stériles contenant trois filtres de germination et trois disques absorbant du diamètre -4- de la membrane utilisée. Un volume de vingt centimètre cube de la solution filtrée est déversé stérilement dans chaque boite de pétri en verre contenant un filtre. Chaque boite de pétri en verre est incubée pendant six heures à la température de trente sept degré centigrade. Chaque filtre est ensuite déposé sur un dispositif de filtration afin d'être coloré à l'acridine orange. Le filtre est ensuite visualisé au microscope et les bactéries viables sont dénombrées. Les bactéries ayant triplé de longueur par rapport à celles observées avant l'incubation sont dénombrées(sur un minimum de vingt champs ou deux cent bactéries) comme étant des bactéries viables. Le dénombrement des bactéries viables nécessite un volume de la suspension bactérienne de un centimètre cube. La suspension bactérienne provient à chaque fois des prélèvements effectués tous les jours sur chaque flacon traité et sur chaque flacon témoin. L'étude de la pathogénicité comprend la technique d'étude de l'adhésion et la technique d'étude de l'invasion. Ces deux techniques étant plus complexes, leur description ne sera pas évoquée car ce sont des techniques classiques utilisées pour la détermination de la pathogénicité. Cette étude nécessite un volume de trois cent centimètre cube de suspension bactérienne. Ce volume est nécessaire car il faut concentrer cent fois afin d'obtenir un résultat satisfaisant. Le dénombrement des bactéries cultivables s'effectue à partir de cent micro litre de suspension bactérienne provenant de chaque prélèvement. Ce volume est étalé sur une boite de pétri stérile contenant de la gélose trypticase soja. La boite de pétri est ensuite incubée à la température de trente sept degré centigrade pendant vingt quatre heures. Cela s'effectue purement et à des dilutions adéquates afin de pouvoir compter les colonies qui se seront développées sur la gélose. Le procédé technique ainsi que les analyses ont été effectuées en double et à deux reprises. Les résultats établis vont être représentés sur des graphes. Les graphes exposés sur les pages suivantes représentent: - le nombre de bactéries totales est symbolisé par le signe AO. - le nombre de bactéries viables est symbolisé par le signe DVC. - le nombre de bactéries viables est symbolisé par le signe UFC. Les résultats concernant la pathogénicité sont représentés par un indice d'association pour l'étude de l'adhésion et par la capacité d'invasion pour l'étude de l'invasion. L'indice d'association est considéré positivement quand ce dernier est au moins égal à deux. Les témoins effectués, cités à la ligne numéro trente deux de la page numéro deux, ont respectivement un indice d'association et une capacité d'invasion positifs pour le témoin positif et un indice d'association négatif en ce qui concerne le témoin négatif. -5- Sur les graphes représentés, le traitement à l'acide péracétique apparaît au temps zéro et ce dernier est symbolisé par le signe PAA. Les graphes ci-dessous représentent les résultats obtenus dans les deux flacons après dilution dans l'eau de mer. ACTON L 1DE LIAClDIE iE CiRAc UQUE óM:IMÈGM damo 1"eEu de Meir) 9.1 îo7] M0 t 10 7. \/ 2 06 oe o AO *$'0 DDVC AzffOm g2$ l'eua- éUFC 0 -24 0 24 48 PAA elt dilution TEMPS EN HEURES au 1/2 ACTH N DE L'ACiDE P TRQU 1o 7"J .. i -o-AO 104 -a--- UFC 1o2 -24 24 48 PAA et dilution au 1/2 TEMPS EN HEURES -6- Les graphes ci-dessous représentent les résultats obtenus dans les deux flacons apres dilution dans l'eau épurée. ACT[HON DIE L"AC]DiE]PERACl:T]IQUE {dInuitAim,rlaimz Peau &p( @)UaÉ 8 a. X X \, ,J _ UFC -24 PA e 24 48 dilution TEMPS EN HEURES au 1/2 AO AóCÂ11C9 IDE ILACUDJE CJERA QJ1 a À |,DVC -o-UFC i-i.- C-> 4 i033 -24 PAA et 24 48 PAA et dilution TEMPS EN HEURES au 1/2 TEMPS EN HEURES ACTú,2I DIE ILACHDIE PERAC2TQUIE 108$' 1 _.._ o06---AO toi DVC 5 UFC 14. 103. 102À 101. -24 PAA et 24 48 dilution au]1/2 TEMPS EN HEUJRES -7- Les résultats de la pathogénicité des deux flacons d'eau de mer et des deux flacons d'eau épurée sont représentés dans les deux tableaux ci-dessous. Les chiffres notés un et un prime sont les numéros des deux flacons d'eau épurée et les chiffres notés deux et deux prime sont les numéros des deux flacons d'eau de mer. Le tableau ci-dessous représente la capacité d'invasion de la souche au bout d'une heure d'adhésion. La capacité d'invasion notée est la moyenne de trois essais effectués à chaque fois et sur chaque flacon. Les trois jours d'analyses sont symbolisés par le signe J0 pour le jour du traitement et par le signe J1 et J2 pour les deux autres jours. Temps(jours) JO J1 J2 Eau 1 0 270 1500 épurée 1' 0 60 670 2 100 130 38000 Eau de mer 2' O 305 2000 T+ = 28000 5000 180000 Le tableau ci-dessous représente les indices d'association de la souche Salmonella typhimurium dans l'eau de mer et dans l'eau épurée traitées. L'indice d'association noté est en fait la moyenne de trois essais. temps(jours) J 0 J1 J2 I.A 1 dans reau 0,55(-) 0,32(-) 3,30(+) épurée 1' 0,14(-) 0,08(-) 1,44(-) I.A 2 dans reau 4,89(+) 1,75(-) 13,60(+) de mer - 2,04(+) 1,75(-) 7,10(+) Témoin + 13,76 Témoin - 0,20 -8- Dès le jour du traitement, la totale disparition des bactéries cultivables est observée dans les deux flacons après dilution dans l'eau de mer et seulement dans un des deux flacons après dilution dans l'eau épurée. Dans le premier flacon après dilution dans l'eau épurée, une chute quasi totale des bactéries cultivables est observée. Une chute des bactéries viables est obtenue dès le jour du traitement jusqu'à un chiffre avoisinant dix mille bactéries par centimètre cube dans tous les flacons traités. Ce chiffre de dix mille bactéries viables par centimètre cube reste pratiquement constant dans tous les flacons pendant vingt quatre heures. Au bout de quarante huit heures, le nombre de bactéries viables augmente pour atteindre un chiffre avoisinant un à dix millions de bactéries viables par centimètre cube. Les résultats cités ci-dessus sont représentés sur les graphes de la page numéro cinq et sur la page numéro six. D'après les résultats figurant à la page numéro sept, le témoin positif est adhérent et invasif. Le témoin négatif lui est non adhérent et non invasif. Dans les flacons après dilution dans l'eau de mer, les bactéries sont adhérentes et invasives le jour du traitement et ainsi qu'au bout de quarante huit heures. Le fait que les bactéries ne soient pas adhérentes et invasives au bout de vingt quatre heures est dû au nombre de bactéries déposées. La quantité de bactéries déposées apparaît insuffisante afin d'obtenir des résultats positifs. Dans les flacons après dilution dans l'eau épurée, les bactéries sont adhérentes seule- -ment au bout de quarante huit heures et seulement dans un des flacon. La souche est pourtant invasive au bout de vingt quatre et quarante huit heures. La souche Salmonella typhimurium semble donc viable et pathogène dans les flacons après dilution dans l'eau de mer et cela dès le jour du traitement. La souche Salmonella typhimurfum semble donc viable et paraît pathogène seulement au bout de vingt quatre à quarante huit heures dans les flacons après dilution dans l'eau épurée. Le procédé technique et les analyses ont été expérimentés une seconde fois et en double. Les résultats sont représentés sur les graphes de la page numéro neuf pour les flacons après dilution dans l'eau de mer et sur les graphes de la page numéro dix pour les flacons après dilution dans l'eau épurée. Les résultats concemrnant la pathogénicité sont représentés sous forme de tableaux à la page numéro onze. -9- Les graphes ci-dessous représentent les résultats obtenus dans les deux flacons après dilution dans l'eau de mer. Sur les graphes représentés, le traitement à l'acide péracétique apparaît au temps zéro de l'expérience et ce dernier est symbolisé par le signe PAA. ACTUf]H DE LvACMDE!PElA(ClT]QU1E dd:abtaO itU'$ luE 2f fl 109- 0 0 1 6 "J 'c AO 4-1' DVC 4. u UFC Io 1 -24 0 24 48 PAA et dilution TEMPS EN HEURES au 1/2 ACTUON DE L'ACiHDM F QACiT Q (dIIwÈC2I da-mm P eav De meTD 109a 0 7 6./ |,0 i \ \../--- DVC ----.. UFC 3, lO1 -24 0 24 48 PAA et dilution TEMPS EN HEURES au 1/2 -10- Les graphes ci-dessous représentent les résultats obtenus dans les deux flacons après dilution dans l'eau épurée. ACTroH DE L'AC]DE PEIRACgT]IQUE 10 9 8 ' 1-0 2 -o-8 10. = AC) P4 lo9. i -:--- DVC j-e Co 4. - UFC 103' îo2 , -24 0 24 48 PAA et TEMPS EN HEURES dilution au 1/2 A.CT[O' DIE!L'AC:_D:E:P i"ú&u1E i09; 108. lO7. 6 los, \O j-i -.--- Dvc 3 0 2 .,/ 100. -24 0 24 48 PAA et TEMPS EN HEURES dilution au 1/2 -11- Les résultats de la pathogénicité des deux flacons d'eau de mer et des deux flacons d'eau épurée sont représentés dans les deux tableaux ci-dessous. La durée de l'expérience lors du renouvellement est seulement de deux jours en ce qui concerne les résultats de pathogénicité. Ceci est dû à un problème technique. Le tableau ci-dessous représente la capacité d'invasion de la souche au bout d'une heure d'adhésion. La capacité d'invasion notée est la moyenne de trois essais effectués à chaque fois et sur chaque flacon. Les trois jours d'analyses sont symbolisés par le signe J0 pour le jour du traitement et par le signe J1 pour le second jour. Temps(jours) J0 Ji 1 70 73000 Eau épurée 1' 0 70000 Eanu de 2 0 85000 mer 2' 1000 84000 Témoin+ 210000 140000 Le tableau ci-dessous représente les indices d'association de la souche Salmonella typhimurium dans l'eau de mer et dans l'eau épurée traitées. L'indice d'association noté est en fait la moyenne de trois essais. Temps(jours) JO J1 I.A 1 1,30(-) 3,36(+) dans l'eau épurée 1' 0,44(-) 0,08(-) I.A 2 0,50(-) 1,56(-) dans l'eau _ de mer 2' 10,60(+) 11,44(+) Témoin + 13,76(+) Témoin 0,20(-) -12- Dès le jour du traitement, une chute quasi totale des bactéries cultivables est observée dans les flacons après dilution dans l'eau de mer. La totale disparition des bactéries cultivables est observée dans les deux flacons après dilution dans l'eau épurée. Une chute des bactéries viables est obtenue dès le jour du traitement jusqu'à un chiffre avoisinant dix mille bactéries par centimètre cube dans tous les flacons traités. Ce chiffre de dix mille bactéries viables par centimètre cube reste presque constant dans tous les flacons pendant vingt quatre heures. Au bout de quarante huit heures, le nombre de bactéries viables augmente pour atteindre un chiffre avoisinant un million de bactéries viables par centimètre cube. Le nombre de bactéries totales reste presque constant tout au long de l'expérience. Les résultats cités ci-dessus sont représentés sur les graphes de la page numéro neuf et sur la page numéro dix. Les résultats exprimés ci-dessous sont représentés sous forme de tableau à la page numéro onze. Dans un des flacon après dilution dans l'eau de mer, les bactéries sont adhérentes et invasives le jour du traitement ainsi que vingt quatre heures plus tard. Les bactéries contenues dans le second flacon après dilution dans l'eau de mer sont seulement invasives. Le fait, que les bactéries ne soient pas adhérentes, est dû au nombre de bactéries déposées. Dans les flacons après dilution dans l'eau épurée, les bactéries ne sont pas adhérentes, seul le premier flacon montre que les bactéries sont invasives le jour du traitement. Au bout de vingt quatre heures, un flacon sur deux après dilution dans l'eau de mer et dans l'eau épurée montre que les bactéries sont adhérentes. Par contre toutes les bactéries sont invasives au bout de vingt quatre heures. La pathogénicité de la souche Salmonella typhimurium se confirme dans au moins un des flacons après dilution dans l'eau de mer dès le jour du traitement. La viabilité de la souche est confirmée dans tous les flacons traités. Le taux de bactéries déposées, étant semble-t-il insuffisant, la pathogénicité est confirmée dans un des deux flacons après dilution dans l'eau épurée dès le jour du traitement. Les flacons témoins non traités ont été analysés sur une durée de deux jours en ce qui concerne la pathogéricité et les résultats se situent à la page numéro treize. Les graphes de ces flacons témoins se situent sur la page numéro quatorze pour le flacon témoin après dilution dans l'eau de mer, sur la page numéro quinze pour le flacon témoin après dilution dans l'eau épurée et sur la page numéro seize pour le flacon témoin après dilution dans l'eau distillée. -13- Dans chaque flacon témoin, le nombre de bactéries totales décelé est de cent million de bactéries par centimètre cube. Les eaux témoins possèdent la même quantité de bactéries et il apparaît que la quantité de bactéries viables est supérieure à la quantité de bactéries cultivables dans les flacons après dilution dans l'eau de mer et dans l'eau épurée. Le nombre de bactéries viables est identique au nombre de bactéries cultivables au bout de vingt quatre heures d'expérience. La souche Salmonella typhimurium est adhérente et invasive pendant la durée de l'expérience. La quantité de bactéries déposées étant supérieure à cinq et dix millions de bactéries, nous confirmons ainsi ce qui a été dit précédemment au sujet de la quantité de bactéries déposées. Ce seuil est nécessaire afin d'obtenir un résultat positif quant à l'adhérence de la souche dans certains flacons. Les résultats confirmant la pathogénicité de cette souche dans toutes les eaux testées sont représentés dans les deux tableaux ci-dessous. Le premier tableau représente la capacité d'invasion et les chiffres notés dans ce tableau représente le nombre de bactéries, le second tableau représente les indices d'association qui sont symbolisés par le signe l. A. Temps (jours) JO J1 Eau épurée 7.10 7,8. 108 Eau de mer 1,5.103 1,2.105 Eau distillée 1,5.10 1. 105 Témoin + 2,1.105 1,4.105 Témoin - O Temps(jours) JO J i1 I.A dans l'eau épurée 5,36(+) 19,80(+) I.A dans l'eau de mer 6, 08(+) 9,80(+) I.A dans E.D 7,24(+) 6,47(+) Témoin + 4,53(+) Témoin - 0,22(-) Dans le flacon après dilution dans l'eau distillée, les bactéries viables ne sont pas décelées au bout de quarante huit heures d'expérience tandis que le nombre de bactéries cultivables a augmenté. S.RIflEH NUJ SdNEI LOL 0 O LúOL -0 L DAO [] ov À sOL i 0 6 01 SUIflIaH NU SdNUIJ OOL 0LO ZOL SOL :DAC] o' L S 0 L IEr Jaw ap nee,I suep uoIn!P sejde u!oWe uooel el,ueweouoo snossep-!o $seues.JdeJ seLjCI se-1 zTOz9LZ -15- Les graphes représentés ci-dessous concement le flacon témoin après dilution dans l'eau épurée. 11 lHg9 I AU lIPUIR1Et2 o8 1lo6 ---- P S -05 DVC 7 106- lo'.". AO 44À--- DVC -24 4 24 48 TEMPS EN HEURES TSM'DR IEAU SU - 104' UFC 103- 2 *10 3 -24 -24 o 24 48 TEMPS EN HEURES 1O9. 106À ! [] DVC 1 04'[ UFC l O 3 102' O00 -24 0 24 48 TEMPS EN HEURES -16- Les graphes représentés ci-dessous concemrnent le flacon témoin après dilution dans l'eau distillée. TI2MOIN IEIAU D;THLLI.IE 107 8. l 0l6 105 - "- AO o40 DVC X1. 104 UFC 103. iOZ 1 o2 101 100. -24 24 48 TEMPS EN HEURES T2MOUN Au DU$T LLIE 108À lO 7 l 0 1 06' s. À AO IO [ o vc 104' [ UFC 103. 102. N.D. - Non Déterminé 1 -24 0 24 48 TEMPS EN HEURES -17- Ce procédé technique permet de déceler, par l'intermédiaire des analyses microbiologiques effectuées, un passage à l'état viable non cultivable des bactéries car le nombre de bactéries viables mesuré chute alors que le nombre de bactéries totales mesuré demeure presque constant. En milieu salin ou non, la disparition des Salmonella cultivables est très rapide dès le jour du traitement. L'action de l'acide péracétique semble efficace le jour du traitement car une quasi disparition des bactéries cultivables est constatée sur toutes les eaux testées. L'acide péracétique agit à la concentration testée sur les bactéries cultivables mais la concentration d'acide péracétique utilisée semble insuffisante pour qu'une éradication complète soit observée dans les différentes eaux testées. Ayant pu déceler, par l'intermédiaire de ce procédé technique, la pathogénicité de la souche lors du passage des bactéries à l'état viable non cultivable notamment dans l'eau de mer, nous pouvons ainsi confirmer ce qui a été dit précédemment au sujet de l'efficacité de l'acide péracétique à cette concentration. Par contre ce traitement agirait pendant une durée de vingt quatre heures dans l'eau épurée. Néanmoins, les bactéries en phase stationnaire paraissent adaptées pour résister à un stress oligotrophique. Par l'intermédiaire de l'eau distillée utilisée comme témoin, le nombre de bactéries viables n'est pas décelé au bout d'une durée de quarante huit heures car le stress appliqué pour la souche Salmonella typhimurium dans cette eau distillée ne semble pas suffisant afin qu'elle acquière un éventuel état viable non cultivable. La souche Salmonella typhimurium étant une souche entérique et pathogène pour l'homme et d'après les problèmes décelés par l'intermédiaire de ce procédé technique, la norme ou la concentration d'acide péracétique appliquée ici apparaît très insuffisante afin que ces bactéries ne survivent pas en eau de mer ni en eau épurée. Le procédé technique selon l'invention est particulièrement destiné à prouver la survie et le pathogènicité des bactéries entériques en eau de mer et en eau épurée après avoir subies un traitement à l'acide péracétique. -18- REVENDICATIONS 1) Procédé technique permettant de déceler la survie et la pathogénicité des bactéries entériques en eau de mer et en eau épurée, comportant une phase de centrifugation caractéristique de cinq mille tours pendant quinze minutes (2) et une phase de rinçage comportant deux lavages à l'eau distillée stérile, filtrée et autoclavée (3), le culot recueillit est ensuite introduit dans un litre d'eau épurée stérile (4) et ensuite il est incubé à la température ambiante sous une lente agitation pendant un temps de vingt quatre heures (5); le traitement est ensuite appliqué à la concentration de cinq milligrammes par litre d'acide péracétique (6) et l'arrêt de ce traitement s'effectue par l'intermédiaire d'une solution de thiosulfate de sodium concentrée à deux grammes par litre (7), ensuite une dilution au demi est effectuée dans de l'eau épurée stérile et dans de l'eau de mer synthétique stérile. 2) La phase de centrifugation selon la revendication 1 est caractérisée par le nombre de tours effectuées et ce nombre se situe dans l'intervalle de deux à sept mille tours et le temps de cette phase est comprise dans l'intervalle de cinq à vingt minutes. 3) La phase de rinçage comportant deux lavages est caractérisée par le nombre de lavages effectués et ce nombre est compris dans l'intervalle de un à dix lavages. 4) le culot est introduit dans un litre d'eau épurée stérile et ce volume est caractérisé par un intervalle de cent centimètre cube à plusieurs litres. 5) L'incubation est caractérisée par l'intervalle de vingt à trente heures. 6) Le traitement à l'acide péracétique est caractérisé par la concentration comprise dans l'intervalle de un à vingt milligrammes par litre. 7) L'arrêt de ce traitement s'effectue par l'intermédiaire d'une solution de thiosulfate de sodium qui a une concentration caractérisée dans l'intervalle de zéro virgule cinq à dix grammes par litre. 8) Le procédé technique est caractérisé par une dilution au demi qui est effectuée dans de l'eau épurée et dans de l'eau de mer synthétique stériles et cette dilution est caractérisée dans l'intervalle du quart à aucune dilution.