Brevet FR2763598A1 — publié le 19981127

La présente invention est relative à une nouvelle a-glucosidase et une nouvelle pullulanase thermostables et à leurs utilisations industrielles. Dans l'industrie de l'amidonnerie, la transformation de l'amidon en un sirop de glucose nécessite deux étapes enzymatiques. La première étape est ac tuellement réalisée par action d'une a-amylase thermostable et la seconde par action d'une glucoamylase ou (d'une Aussi un des buts de la présente invention est-il de foumir une a-glucosidase qui agit dans les mêmes conditions que l'a-amylase actuellement mise en oeuvre: ainsi la transformation de l'amidon en un sirop de glucose pourrait être réalisée dans une seule étape. Ce but, ainsi que d'autres qui apparattront par la suite, est atteint par une a-glucosidase qui est caractérisée, selon la présente invention, par le fait qu'elle est obtenue par culture d'une souche la produisant du genre Thermococcus. Avantageusement, cette souche produisant de l'a-glucosidase est Thennococcus hydrothemialis, souche CNCM 11319. Comme énoncé ci-dessus, la présente invention est également relative à une pullulanase qui est caractérisée par le fait qu'elle est produite simultanément à l'a-glucosidase ci-dessus. Un exemplaire de la souche du genre Thermococcus hydrothermalis a été déposé le 16 juin 1993 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro CNCM 11319; elle correspond à la souche référencée AL 662 dans la collection détenue par l'IFREMER. Les deux enzymes issues de Thermococcus hydrothermalis peuvent être utilisées simultanément avec une a-amylase commerciale pour produire un sirop de sucre à partir d'amidon. La présente invention est décrite en référence aux figures annexées, parmi lesquelles . - la figure 1 montre l'influence de la température sur l'activité d'une a-glucosidase selon la présente invention à pH 5,5; - la figure 2 montre l'influence du pH sur l'activité d'une - la figure 3 montre l'effet du pH sur l'activité d'une puliulanase purifiée selon l'invention; et, - la figure 4 montre l'effet de la température sur l'activité d'une pullulanase purifiée selon l'invention ainsi que l'effet protecteur du calcium à une concentration de 1 mM. Selon la présente invention, une a-glucosidase est obtenue à partir d'une souche du genre Thermococcus, en particulier, Thennoeoccus hydrothenna lis, et une pullulanase à partir d'une souche du genre Thermococcus, notamment Thermoexcus hydrothennalis. Une souche de Thermococcus hydrothermalis a été rendue public sous le numéro CNCM 11319 ; elle a été déposée le 16 juin 1993. L'aglucosidase est une enzyme constitutive chez Thermococcus hydrothermalis. La mise au point de la production de cette enzyme chez cette bactérie a montré que certaines sources carbonées (comme l'amidon soluble, le giyco- gène et des dextrines) pouvaient induire par trois la production de l'enzyme. L'ajout de 4 g/l d'amidon soluble au milieu d'induction a été retenu pour la suite de l'étude. Le rapport entre la croissance de la souche et la production enzymatique a été abordé. Ainsi, Thermococcus hydrothermalis, cultivé en fermenteur d'un litre et demi sur milieu BHl+soufre+amidon soluble, possède un temps de génération de 34 min. et atteint sa phase stationnaire en 8 heures environ. Le maximum d'activité est atteint en 6-7 heures au niveau du milieu intracellulaire, puis on constate que l'activité intracellulaire diminue progressivement. L'activité extracellulaire qui est faible dans les premières heures de culture, augmente progressivement jusqu'à 24 heures. Ce phénomène peut entre expliqué par la lyse cellulaire de la souche; en effet, I'a-glucosidase qui est assurément une enzyme intracellulaire, est libérée dans le milieu de culture lors de la phase stationnaire et la phase de déclin, provoquant cette augmentation d'activité extracellulaire. L'étude des propriétés physico-chimiques de l'&alpha;-glucosidase, dans le milieu intracellulaire a montré que cette enzyme est active de façon optimale à pH 5,0-5,5 et à 11000 environ. Elle présente encore 50 % de l'activité maximale entre 96"C et 116"C. A 120"C, L'enzyme est dénaturée. L' La purification de l'enzyme a été abordée afin de pouvoir mettre en évidence ces caractéristiques exactes et afin que l'enzyme puisse être comparée aux autres a^glucosidases déjà décrites. Pour cela, Thermococcus hydrothermalis est cultivé en fermenteur de 200 litres sur milieu BHl+soufre+amidon, en anaérobiose, à 80"C et pH 6,0. Au bout de 6 heures de croissance, les cellules bacté- riennes sont récupérées par centrifugation du milieu de culture et cassées par passage sur presse de French. Le milieu intracellulaire contenant l'a-glucosidase est dialysé avec une cellule d'ultrafiltration dont le seuil de coupure est de 30 kDa et concentré par précipitation des protéines au sulfate d'ammonium (70 % de saturation). Après centrifugation, le culot protéique est repris dans un faible volume de tampon et dialysé afin d'éliminer le sulfate d'ammonium. L'échantillon protéique est déposé en plusieurs fois sur une colonne échangeuse d'ions (Hitrap Q sépharose High Performance). Les protéines sont éluées grâce à un gradient discontinu de tampon Tris-HCL contenant 1 M de NaCI. Les fractions possédant l'activité apNPGase sont regroupées et concentrées sur cellule UF. La 3ème étape de purification emploie une chromatographie d'affinité sur gel de sépharose sur lequel sont greffés des résidus glucose. L'enzyme est éluée de la colonne grace à un gradient continu de tampon phosphate contenant 1 M de NaCI. La dernière étape consiste à faire passer l'échantillon protéique sur une colonne de tamisage moléculaire (Séphacryl S200 High performance). L'enzyme purifiée est obtenue après toutes ces étapes. La protéine est monomérique et possède une masse molaire d'environ 118000 daltons. Pour la mise en évidence de la production d'une pullulanase, on a utilisé un milieu de culture, appelé BHIS, composé d'infusion de coeur-cervelle (9 girl), de NaCI (23 g/l), de soufre élémentaire (5 gA), de tampon PIPES (6,05 gn), de résazurine (1 mg/l). Après tyndallisation (40 min à 1000C deux jours successivement), le milieu est réduit par du Na2S (0,5 gn) dans une enceinte anaérobie où la composition en gaz est N2!H21CQ2 dans les proportions 90 % /5 % /5 %. L'incubation est réalisée à 800C. Après croissance, les milieux sont dégazés à l'azote pour éliminer l'H2S formé par l'isolat, filtrés pour retenir le soufre élémentaire, puis cellules et surnageants sont séparés par centrifugation (10.000 9 pendant 40 min). L'activité pullulanase est déterminée en mesurant les sucres réducteurs libérés, par la méthode à l'acide dinitrosalicylique (Miller 1959), quand l'extrait enzymatique est incubé à 80"C en présence de pullulanase (0,75 %) dans du tampon phosphate de sodium (200 mM, pH 6.0). Pour l'étude du pH, les conditions sont identiques à celles citées précédemment avec un tampon citrate-phosphate 200 mM pour les pH 3.0-7.0 et un tampon phosphate de sodium 200 mM pour les pH 6.0-8.0. Pour l'étude de l'induction de l'activité pullulanase par les sucres, une autre technique a été utilisée. II s'agit de suivre l'hydrolyse du pullulane coloré (bleu brillant de rémazol-pullulane) par la libération du groupement coloré (bleu brillant de rémazol). La purification de l'enzyme a été abordée afin de pouvoir mettre en evi- dence ces caractéristiques exactes et afin que l'enzyme puisse etre comparée aux autres pullulanases déjà décrites. Pour cela Thermococcus Hydrothermalis a été cultivé dans les conditions précédemment décrites, avec les différences suivantes: le maltrose est utilisé à la place de l'amidon et la culture dure 23 heures les autres conditions sont inchangées. Les protéines précipitées au sulfate d'ammonium ont été remises en solution dans du tampon phosphate de sodium pH 6,0 et déposées sur une colonne de chromatographie d'interactions hydrophobes. L'élution a été réalisée avec un gradient décroissant de sulfate d'ammonium (de 1 à 0 molaire) dans du tampon phosphate de sodium pH 6,0. Après cette première étape, le rendement de récupération de l'activité pullulanase a été de 31 % et le taux de purification de 10. On a ensuite réalisé une chromatographie par échange d'ions à pH 8,5 après une concentration et une diafiitration des fractions contenant l'activité pullulanase. Les protéines ont été éluées avec un gradient de chlorure de sodium (de O à 1 molaire) dans du tampon Tris-HCI pH 8,5. Par rapport à l'extrait brut de départ, le rendement de récupération était de 15 % et le taux de purification de 30. La dernière étape a été une chromatographie d'affinité après concentration et diafiltration des fractions récupérées précédemment. Le malotriose a été utilisé comme ligand d'affinité, et a été couplé à du sépharose activé L'enzyme a été éluée avec un gradient de chlorure de sodium (de o a 0,6 molaire) dans du tampon acétate de sodium pH 5,5. Le rendement de récupération de cette dernière étape était de 8 % et le taux de purification de 97 par rapport à l'extrait brut. L'enzyme purifiée est obtenue après toutes ces étapes et possède une masse molaire d'environ 128000 daltons. Les propriétés de l'enzyme purifiée sont illustrées sur les figures 3 et 4. Les enzymes, selon la présente invention, sont d'une grande utilité notamment dans l'amidonnerie: la conversion de l'amidon en divers sirops de sucre se déroule à hautes températures du fait de la très faible solubilité de l'amidon. L'utilisation d'une a-glucosidase compatible avec l'a-amylase mise en oeuvre lors du premier stade de transformation permet de réduire le procédé de transformation en une seule étape. De meme, I'utilisation d'une pullulanase qui présente une activité maximale dans cette même zone de température, permet de concourir à la conversion de l'amidon en divers sirops de sucre en une seule et même étape. L'utilisation de ces enzymes est illustrée par les deux exemples suivants: Exemple 1: Action d'un extrait brut de la souche Thermococcus Hydrothermslls riche en aglucosidase. 2 essais sont réalisés en parallèle avec de l'amidon de blé natif comme substrat essai 1: Amidon natif 90 g CaC12 60ppm Termamyl 1201 150 micro-litres tampon phosphate pH 6,0 200 mM en quantité suffisante pour avoir un volume réactionnel de 300 ml. essai 2 identique à l'essai 1 mais avec 30 unité aglucosidase issue de Thermo coccus hydrothermalis Pour les deux essais, la température d'incubation est de 90"C. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant; Temps Essai I Essai 1 I Essai2 Essai2 (heures) Glucose g/l DE t Glucose g/l DE g/l 0 0 6 0 6 1 3,6 14,7 7,7 17,4 3 6,5 16,8 14,4 22 7 7,5 1875 26 1 29 Les essais n'ont pas été poursuivis au delà de 7 heures, car comme nous avons utilisé un extrait brut comme source d'enzyme, très riche en protéine, cela a entratné la formation de composé de Maillard dans le milieu réactionnel rendant difficile l'analyse des produits de la réaction. Mais, cet exemple préliminaire montre qu'il est possible de réaliser en une seule étape la réaction de liquéfaction et la réaction de saccharification. Exemple 2 Action d'un extrait brut de la souche Thennococcus hydrothennalis riche en pullu lanase 2 essais sont réalisés en parallèle avec de l'amidon de blé natif comme substrat essai 1: Liquéfaction Amidon 160 g/l Termamyl 120 1 150 micro-litre CaCI2 60 ppm tampon phosphate pH 6,2 200 mM en quantité suffisante pour avoir un volume réactionnel de 300 ml. Incubation 2 heures à 90 C. Saccharification ajout de 55 Unité amyloglucosidase AMG 300 L commercialisée par la société Novo Nordisk. La réaction est suivie pendant 22 heures à 60 C. essai 2 identique à l'essai 1 mais durant l'étape de liquéfaction, diverses quantités de pullulanase de Thermococcus hydrothermalis ont été ajoutées soit: 34 Unités, 68 Unités, 136 Unités. Les résultats sont présentés sur la figure 5 ci-jointe. Ils montrent clairement que l'ajout de la pullulanase thermostable lors de l'étape de liquéfaction permet de réduire significativement le temps de saccharification. Ainsi qu'on peut le remarquer la pullulanase présente une activité à un pH compris entre 5,0 et 6,2 pour une température comprise entre 85 et 115"C, le substrat étant l'amidon ou le pullulane. Cette activité est maximale à une température de 110 C et à un pH de 5,5, le substrat étant le pullulane ou l'amidon. REVENDICATIONS 1. Pullulanase, caractérisée par le fait qu'elle est obtenue par culture d'une souche la produisant du genre Thermococcus. 2. Pullulanase, selon la revendication 1, caractérisée par le fait, que la souche la produisant est Thermococcus hydrothermalis. 3. Pullulanase, selon la revendication 2, caractérisée par le fait que la souche la produisant est Thermococcus hydrothermalis, CNCM 11319. 4. Pullulanase, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait qu'elle présente une activité à un pH compris entre 5,0 et 6,2 pour une température comprise entre 85 et 115"C, le substrat étant l'amidon ou le pullulane 5. Pullulanase, selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle présente une activité maximale à une température de 110 C et à un pH de 5,5, le substrat étant le pullulane ou l'amidon. 6. Procédé pour produire un sirop de sucre à partir d'amidon, caractérisé par le fait que l'on utilise simultanément une a-amylase commerciale, une aglucosidase et une pullulanase issues de Thermococcus hydrothermalis.