Brevet FR2763077A1 — publié le 19981113

L'invention concerne le contrôle de la croissance cellulaire chez une plante par l'utilisation d'un gène d'endo-1,4-1-D-glucanase. L'architecture des plantes est en grande partie déterminée par des événements d'élongations cellulaires contrôlés. La paroi cellulaire primaire est un réseau de polysaccharides et de protéines hautement dynamiques qui jouent un rôle central dans le contrôle de l'élongation cellulaire (Carpita, 1993). La structure de la paroi cellulaire est formée de microfibrilles de cellulose auxquelles sont étroitement associés des polymères de xyloglucane. Les xyloglucanes forment la structure porteur entre les microfibrilles et ainsi jouent un rôle crucial dans les possibilités d'extension de la paroi. Une activité enzymatique impliquée dans le relâchement de la tension de la paroi a été identifiée dans des tests d'extensibilité de la paroi in vitro. Les protéines correspondantes sont appelées des expansines S15 (Cosgrove, 1996) et semblent contrôler la liaison hydrogène entre les microfibrilles et les xyloglucanes. D'autres activités enzymatiques potentiellement impliquées dans l'extension de la paroi ont été identifiées au sein de celle-ci, par exemple les XETs (Desilva, 1994) et les endo-1,4-13-D-glucanases. Des endo-1,4-1-D-glucanases ont été identifiées dans des bactéries et des plantes (Brummel et al., 1994), et dans les plantes elles sont principalement représentées par de grandes familles de gène, comptant par exemple chez Arabidopsis au moins 5 membres et chez la tomate au moins 6 membres. Cette enzyme semble jouer un rôle dans le processus de la dégradation de la paroi cellulaire intervenant par exemple durant la maturation du fruit et l'abscission des feuilles (Del Campillo et al., 1996). Des isoformes d'endo-1,4-1-D-glucanase avec des schémas d'expression compatibles avec ces activités, ont été identifiées dans la tomate (Del Campillo et al., 1996; Gonzales-Bosch et al., 1996), dans l'avocat (Cass et al., 1990) et dans le poivre (Ferrarese et al., 1995). Par ailleurs, il a été décrit que le ramollissement des fruits et la dégradation polysaccharidique de la paroi cellulaire pouvaient être réduits par l'inhibition de l'activité endo-1,4-1-D- glucanase au moyen de constructions d'ADN anti-sens (WO91/16426, WO96/01555). Un rôle des endo-1,4-9-D-glucanases a également été suggéré dans le contrôle de l'élongation cellulaire, basé sur des schémas d'expression (Fry, 1989; Fry 19952). Enfin, il a été avancé le fait que les endo-1,4-13-D-glucanases pouvaient avoir un rôle dans la croissance cellulaire (Inouhe et al., 1991) par l'inhibition de la croissance induite par les auxines sur des sections d'hypocotyles de coléoptiles de maïs par l'application d'anticorps dirigés contre des endo-1,4-1-D-glucanases. Cependant, aucune relation directe n'a été établie in vivo quant au rôle que pouvait avoir une endo-1,4-1-D-glucanase dans le contrôle de la croissance cellulaire chez les plantes. Or, ce contrôle chez les plantes cultivées revêt une importance économique certaine. La réduction de la longueur des tiges de certaines variétés de culture confère une protection contre la verse. Les dommages causés par la verse sont importants dans les espèces cultivées suivantes: le blé, l'orge, le sorgho, le maïs, le riz, les espèces de Brassica, les lentilles, le tabac, le soja, le mûrier et autres. La réduction de la longueur des tiges contribue également à une augmentation des rendements. Des gènes de nanisme dominants ou semi-dominants ont également été utilisés dans des programmes de reproduction pour un certain nombre d'espèces: le blé, le riz, le colza, le maïs etc. La présente invention concerne plus particulièrement une endo-1,4-f-D-glucanase, appelée également KORRIGAN ou KOR directement impliquée dans le phénomène d'élongation cellulaire. Elle se distingue des autres endo-1,4-1-D-glucanases en ce sens que son inhibition spécifique permet l'obtention de résultats particulièrement intéressants en terme de limitation de la croissance cellulaire chez les plantes sans réduire les phénomènes de la maturation des fruits ou de l'abscission des feuilles. La KOR de la présente invention présente une séquence hautement conservée parmi les espèces de plantes notamment les dicotylédones tels que Arabidopsis thaliana et Lycopersicon Esculentum et les monocotylédones tels que Oryza sativa. SEQ ID n 1 représente la séquence en ADNc du gène de la KOR chez Arabidopsis. SEQ ID n 2 représente la séquence protéique correspondante. Ainsi, la présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique au moins partiellement constituée d'une séquence nucléotidique codant pour une endo-1,4-g- D-glucanase correspondant à la séquence protéique selon SEQ ID n 2 ou un fragment de SEQ ID n 2 pour inhiber totalement ou partiellement la croissance cellulaire chez une plante. En effet, l'un des buts de la présente invention est de bloquer l'expression de la séquence nucléotidique de la KOR afin de limiter le phénomène d'élongation cellulaire. La séquence à bloquer est donc une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie de SEQ ID n* 2 compte tenu de la dégénérescence du code génétique, étant entendu que la séquence nucléotidique susceptible d'être utilisée dans le cadre de la présente invention peut être également constituée en partie de séquences nucléotidiques non codantes en amont et/ou en aval de la séquence nucléotidique correspondant à la susdite séquence protéique, y compris de séquences introniques. La séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de la présente invention peut également être au moins partiellement constituée d'une séquence nucléotidique codant pour une endo-1,4-p-D- glucanase correspondant à une séquence protéique dont l'extrémité Nterminale présente au moins 70 % d'homologie avec les 166 premiers acides aminés de SEQID n 2. En effet, SEQID n 2 correspond à la séquence protéique de la KOR chez Arabidopsis et il est à souligner que les KORs des autres plantes ont une séquence protéique présentant au moins 70 % d'homologie avec celle des 166 premiers acides aminés de la KOR d'Arabidopsis, ce qui distingue la KOR et ses orthologues des autres membres de la famille des endo-1,4-p-D- glucanases. Il n'est donc pas nécessaire que la séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de l'invention comprenne en tout ou partie une séquence identique ou fortement homologue aux 166 premiers acides aminés de la séquence de SEQ ID N* 2, il suffit que la séquence en question constitue au moins une partie d'une séquence nucléotidique dont la partie N-terminale est identique ou fortement homologue aux 166 premiers acides aminés de SEQID N* 2. Avantageusement, la séquence nucléotidique utilisée dans le cadre de la présente invention a une longueur comprise entre 20 pb et 2 kpb. Plus particulièrement, la susdite séquence nucléotidique est utilisée dans le cadre de la présente invention dans une orientation anti-sens. Il s'agit en effet d'insérer dans une orientation anti-sens la séquence nucléotidique en question dans un vecteur apte à transformer directement ou indirectement les cellules de plantes. La cellule végétale ainsi transformée voit l'expression de sa KOR bloquée par la séquence anti-sens correspondante insérée dans le génome. Le gène de la KOR ne pouvant donc s'exprimer, les phénomènes d'élongation cellulaires sont ainsi inhibés. Il est rappelé que la transformation des cellules de plantes peut être soit directe, soit indirecte. Ce que l'on appellera par la suite, transformation directe, est une transformation pour une cellule de plante réalisée directement par un vecteur selon des techniques connues de l'homme du métier telles qu'au moyen d'une micropipette pour assurer le transfert mécanique de l'ADN, à l'aide de polyéthylène glycol, par pénétration ballistique à haute vitesse au moyen de petites particules contenant soit à l'intérieur soit à leur surface l'acide nucléique à faire pénétrer dans la cellule de plante, par fusion de protoplastes avec d'autres entités, cellules, lysosomes ou autres corps de surfaces lipidiques susceptibles de fusionner, ou par électroporation. La transformation de cellules de plantes peut également être réalisée par l'insertion de la séquence nucléique d'intérêt au sein d'un plasmide recombinant par exemple d'origine bactérienne dans lequel a été préalablement inséré le génome d'un ADN viral tel que celui du virus de la mosaïque du choux- fleur, le plasmide résultant étant utilisé pour transformer S les cellules de plantes. Ce que l'on appellera par la suite la transformation indirecte des cellules de plantes est également connue de l'homme de métier. Elle consiste par exemple à transformer un microorganisme tel qu'Agrobacterium tumefaciens au moyen de la susdite séquence nucléique ledit microorganisme étant ensuite utilisé pour transformer les cellules de plantes. Avantageusement, au sein de l'un des susdits vecteurs, la séquence nucléotidique utilisée peut être précédée d'un promoteur spécifique de certains types cellulaires, tissus ou organes afin de limiter l'élongation de la plante aux seules parties visées sans affecter le reste de la plante. L'invention concerne également un procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante comprenant une étape de transformation directe ou indirecte d'une cellule de plante au moyen d'un vecteur tel que ceux ci-dessus mentionnés. Plus particulièrement, le contrôle en question consiste en une inhibition partielle ou totale de ladite croissance cellulaire. L'invention concerne également des cellules de plantes transformées susceptibles d'être obtenues ou non par le susdit procédé, les plantes comprenant les susdites cellules ainsi que les semences issues desdites plantes. Les plantes plus particulièrement concernées par la présente invention sont les espèces de Brassica, le maïs, le soja, le coton, le blé, le riz, l'orge, le sorgho, le tabac, le mûrier, la lentille et le pélargonium. Préférentiellement, les plantes sont Brassica oleracea, Brassica napus et le colza. Par ailleurs, il est intéressant de noter que l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus peut être mise en oeuvre à des fins de criblage de composés susceptibles d'agir sur l'élongation cellulaire des plantes en particulier en inactivant la KOR. Il s'agit en effet, selon des techniques connues de l'homme de métier, de faire exprimer une séquence nucléotidique de l'invention dans un vecteur d'expression comprenant les séquences nécessaires pour assurer l'initiation de la transcription dans des microorganismes, de mettre ceux-ci en culture et d'observer l'apparition d'un halo coloré attestant de l'expression de la KOR, par des techniques de coloration classiques. La mise en contact de ces microorganismes avec les composés à cribler permettra de mettre en évidence, avec l'observation de l'inhibition de la formation du susdit halo, les composés inhibant l'activité de la KOR. La figure 1 représente la philogénie des sous-groupes de cellulases de plantes des endo-1,4-9-D-glucanases de type E2. Il apparaît sur cette figure que la séquence de KOR et celle de la tomate TOM15590 se distinguent des autres membres de la famille endo-1,4-- D-glucanase (pour les abrévations des enzymes, se rapporter au tableau 3 ci-dessous). La figure 2 illustre une comparaison d'une partie de la séquence de la KOR (Korrigan) avec la séquence d'autres familles de cellulases de bactéries. Il est à noter que deux domaines d'acides aminés sont conservés parmi les 16 endo-1,4-19-D-glucanases de la famille E (pour les abréviations des enzymes, se reporter au tableau 3 ci-dessous). Les positions des résidus identiques sont indiqués par des astérisques. Le signe *1 indique le résidu histidine qui semble être critique pour l'activité de l'endo-1,4-9I-D-glucanase selon Tomme et al., 1991. La figure 3 représente une comparaison de séquence en acides aminés entre des EST de riz et la KOR. La séquence soulignée correspond au domaine transmembranaire prédit selon Von Heyne. Les séquences partielles d'ADNc de riz (D46633 et D40576) sont hautement similaires à la KOR: 82 % sur 76 acides aminés pour D46633 et 73 % pour 64 acides aminés pour D40576. La figure 4 représente une comparaison de séquence en acides aminés de 200 premiers acides aminés de la KOR avec la séquence en acides aminés prédite de deux EST de riz. Les oligos 1 et 2 correspondent à des séquences hautement conservées entre des cellulases de dicotilédone et monocotilédone et peuvent être utilisés pour amplifier des KOR orthologues à partir de n'importe quelle espèce de plante supérieure. La figure 5 représente la construction d'ADN p35S2-ROK utilisé pour l'inhibition par voie anti-sens de l'expression de la KOR chez Arabidopsis transgène. La présente invention ne se limite pas à la description ci- dessus. Elle sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre purement illustratif. Exemple 1: Inhibition de l'élongation cellulaire chez des plantes d'Arabidopsis. mutant pour le gène de la KOR. 1.1 Phénotype du Mutant Les plantes d'Arabidopsis (écotype Wassilevskja) homozygote pour la mutation kor ont les caractéristiques suivantes: l'hypocotyle de jeunes plantes ayant poussé dans l'obscurité est 4 fois plus petit que celui du type sauvage, ceci étant le résultat d'une longueur cellulaire réduite (Tableau 1 ci-dessous). L'hypocotyle ayant effectué une croissance à la lumière est seulement légèrement plus court que celui du type sauvage. La taille de tous les autres organes est également réduite, y compris les racines, les tiges, les feuilles de la coiffe et de la rosette, les organes de fleurs, les siliques etc... Le mutant kor est pleinement fertile. Tableau 1 Longueur de l'hypocotyle de plants de 7 jours de type sauvage et du mutant kor Longueur de Jeunes plants Jeunes plants l'hypocotyle de type sauvage du mutant kor Obscurité 1,78+/-0,040 0,506+/-0,007 Lumière 0,49+/-0,009 0,38 +/-0,006 Des hormones de plantes sont connues pour influencer l'élongation cellulaire. Les hormones telles que GA4+7, IAA et Brassinostéroides stimulent tandis que l'éthylène, les cytokinines et ABA inhibent la croissance. Le phénotype sauvage ne peut être restauré chez le mutant avec l'une quelconque des hormones testées ou au moyen d'inhibiteurs de la synthèse de l'éthylène telle que la L- a-2 (Acide 2 aminoéthoxyVinylique)-glycine (AVG, données non montrées). La mutation est récessive nucléaire (Tableau 2 ci-dessous). Tableau 2 Analyse de la ségrégation du mutant kor N' de graines Jeunes plants Jeunes plants Xhi2a de type sauvage du mutant kor Nombre Nombre Nombre Nombre attentu observé attentu observé 1522 1142 1136 380 386 0,12 a Les valeurs calculées sont basées sur un rapport attendu d'un jeune plant mutant pour 3 jeunes plants de type sauvage. 1.2 Clonage du gène de la KOR Le gène de la KOR a été cloné à partir du mutant marqué à partir de son ADN-T selon la procédure suivante. L'analyse de la ségrégation a confirmé une liaison étroite entre l'insertion du ADN-T et de l'allèle mutant (634 plantes mutantes testées). L'analyse par Southern blot a révelé la présence d'une insertion unique d'ADN-T. Une séquence voisine a été obtenue par IPCR utilisant la méthode décrite par Lindsey et al., 1996. Le fragment voisin a été utilisé comme une sonde pour cribler une banque génomique d'Arabidopsis produite par John Mulligan et distribuée par le EEC-BRIDGE Arabidopsis DNA Stock Center et une banque d'ADNc (D'allessio et al., 1992). Les séquences d'ADNc et de la protéine obtenue sont montrées dans SEQID n 1 et SEQ ID n 2. Une analyse par Northern blot a été effectuée avec 8 Fg d'ARN total de jeunes plants de 7 jours de phénotype sauvage cultivés à la lumière, de feuilles, de tiges, de fleurs, de silliques, de racines, de jeunes plants de 7 jours de phénotype Korrigan cultivés à la lumière et des organes entiers de plantes adultes de phénotype Korrigan hybridé avec un fragment PstI-PstI de 765bp (entre les positions 114-879). Une bande de 2 kb correspond au transcrit KORRIGAN qui est hautement exprimé dans les tiges et les racines de type sauvage. Le transcrit KORRIGAN est aussi détecté chez les plants de phénotype Korrigan mais son expression est considérablement réduite. Un fragment d'ADN de 8,5 kb dont on présume qu'il contient le gène entier de kor a été introduit dans le vecteur de ADN-T binaire pBIB-HYG (Becker, 1990) contenant un marqueur de résistance à l'hygromycine. Le ADN-T a été transformé chez les plantes homozygotes pour kor par un protocole d'infiltration décrit par Bechtold et al., 1993. Tous les transformants T1 obtenus résistant à l'hygromycine étaient du type sauvage indiquant que le fragment d'ADN transformé a complémenté la mutation kor. 1.3 Comparaisons de séquence La séquence d'ADNc a été comparée avec des bases de données publiques utilisant les programmes BLASTX et TBLASTN (Altschul et al., 1990) ceci a donné lieu à un grand nombre de résultats hautement signicatifs avec des membres de la famille du gène de l'endo-1,4-f-D- glucanase. Parmi cette famille, 100 % d'identité de séquence a été observé avec la séquence U37702 d'Arabidopsis et 74 % avec la séquence 155990 de tomate (demande de brevet US 5 554 743). Ces trois membres de la famille sont clairement distincts du reste de la famille de gène tel montré par l'arbre phylogénique (Tableau 3 ci-dessous et Figure 1). Tableau 3 Famille E d'endo-1,4-B-D-glucanases Espèces Enzyme Abréviation Référence 5.ou n d'accès Sous-uroune El Bactérie Clostridium thermocellum CelD CthCelD Joliff, 1996 Sous-groupe E2 Bactérie Clostridium stercocarium CelZ CstCelZ Jauris, 1990 Plante Arabidopsis thaliana Cel ATCell U17888 Cel2 KORRIGAN U37702 Capsicum annum CX1 PepperCXl Ferrarese, 1995 CX2 PepperCX2 Ferrarese, 1995 CX3 Pepper CX3 Ferrarese, 1995 Lycopersicum esculentum Cell TomCell Lashbrook,1994 Cel2 TomCel2 Lashbrook, 1994 Toml55990 Bennet, 1996 Oriza sativa CeI1D46633 RiceD46633 D46633 CellD40076 RiceD40076 D40076 Persea americana Cell AvoCel1 Tucker, 1991 Cel2 AvoCeI2 Cass, 1990 Pisum sativum EGL1 EGL1 Wu, 196 Phaseolus vulgaris BACI1 BACI1 Tucker, 1991 Populus albas Cel Poplar Nakamura,1995 Sambucus nigra Cell Sambucus Taylor, 1994 1.4 KOR lié à la membrane La traduction conceptuelle de la séquence d'ADN n'a pas révélé la présence d'une séquence de peptide signal potentielle telle que celle trouvée dans la plupart des autres membres de la famille. Au contraire, une séquence de 16 acides aminés hydrophobes ayant une forte probabilité de constituer un signal d'ancrage dans la membrane (selon les prédictions de Von Heyne et al., 1986 et Klein et al., 1985) est observée. La localisation membranaire de la protéine KOR a été confirmée en faisant produire des anticorps polyclonaux par un lapin contre les 72 acides aminés N-terminaux de KOR fusionnés au C- terminus de la protéine Glutathion-S-Transferase de Schistosoma japonicum produite dans E-coli à l'aide du vecteur pGEX-2T'6 (Pharmacia, Upsala, Suède). La protéine fusion a été purifiée à l'aide de glutathion-sépharose selon les instructions du fournisseur. Une fraction microsomale, préparée à partir de feuilles de la plante sauvage, selon la méthode décrite par Hôfte et al. 1992, lavée avec Na2CO3, pHll 1, contenait une protéine de la taille attendue (70 kDa) réagissant spécifiquement avec l'anti-KOR antiserum, cette protéine était absente dans le mutant. Ces résultats confirment que KOR est une protéine membranaire intrinsèque, ce qui la distingue, outre la séquence, des autres membres de la famille des endo-1,4-p-D-glucanases. 1.5 La KOR code pour une activité endo-1,4-9-D- glucanase La comparaison de la séquence avec tous les membres connus d'autres familles de cellulase à partir de bactéries (Fig. 2) indique que les résidus montrés comme étant critiques pour une activité enzymatique sont conservés, ceci suggérant que la KOR est une endo- 1,4-1-D-glucanase bona fide En conclusion, ces données démontrent que la KOR code pour une protéine membranaire de la famille des endo-1,4-1-D-glucanases et que son inactivation par mutation résulte en une réduction de la taille cellulaire de tous les organes d'Arabidopsis. Exemple 2. Procédé pour l'isolement de KOR ortholoRues dans n'importe quelle espèce de iplante supérieure Les comparaisons de la séquence de la KOR avec des séquences de protéines partiellemment déduites issues du riz (Oryza sativa) et de la tomate (Lycopersicon esculentum) indique une forte observation de l'évolution de séquences de la protéine (Fig.1 et 3). De façon intéressante, la région N-terminale contenant le domaine transmembranaire prédit, qui est absent dans toutes les isoformes solubles, est également hautement conservé dans les séquences d'Arabidopsis et celles de riz. C'est à la base de la comparaison entre ces deux dernières séquences, que des amorces pour PCR peuvent être déterminées pour amplifier les orthologues de la KOR dans toutes les espèces de plantes supérieures testées (Fig. 4). Ceci a été démontré avec l'amplification par PCR, chez des espèces de monocotylédones et de dicotylédones, de fragments correspondant aux orthologues de la KOR tels que révélés par la séquence. Des méthodes alternatives pour l'isolement des orthologues de la KOR sont des hybridations à faible stringence utilisant le fragment BglI- BgI de 273 bp (entre les positions 6 et 279 de la SEQID N 2). Exemple 3. Construction pour l'inhibition par anti- sens de l'expression de la KOR dans les espèces cultivées Le plasmide pKYLX71-35S2 (Maiti et al., 1993) a été digéré avec HindIll. Les extrémités 5' dépassantes ont été complétées en utilisant le fragment de Klenow de l'ADN PolI et l'ADN a été redigéré avec XhoI. Le clone pZL1 d'ADNc a été digéré avec Xbal, les extrémités 5' dépassantes ont été complétées avec le fragment de Klenow et l'ADN a été redigéré avec SalI. Le fragment de 2,3 kb contenant le gène de la KOR a été ligaturé entre le site XhoI et le site HindIll du vecteur pKYLX71-35S2. De cette façon, l'ADNc de la KOR a été inséré dans une orientation anti- sens derrière le promoteur 35S2. La terminaison 3' de transcription et un signal de poly-adenylation sont fournis par le fragment 3'RbcS présent dans le vecteur. s Exemple 4. Transformation d'Arabidopsis avec la construction anti-sens de la KOR La construction p35S2-ROK a été introduite dans la souche C58C1 (pMP90) d'Agrobacterium tumefaciens (Koncz et al., 1986) par électroporation et les transformants ont été sélectionnés sur un milieu contenant de la Tétracycline telle que décrit par Olszewski et al. , 1988. Un transformant Agrobacterium obtenu a été utilisé pour transformer Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) utilisant la méthode d'infiltration décrite par Bechtold et al., 1993. FExemvle 5. Expression de la KOR dans Pichia pastoris et test d'activité endo-1.4-B-D-Elucanase L'extrémité C-terminale de la protéine, correspondant au domaine extracellulaire prédit, a été exprimée dans Pichia pastoris à l'aide du vecteur pPIC9 (Invitrogen, Leek, Pays- Bas) en fusion avec le signal de sécrétion facteur a. La protéine KORRIGAN produite dans ce système pourra servir de cible dans des tests de recherches de molécules herbicides ou des régulateurs de croissance inhibiteurs de l'activité glucanase. Les inhibiteurs de l'activité endo-1,4-t3-D- glucanase ainsi identifiés pourraient être utilisées pour inhiber la croissance de certaines espèces végétales agronomiquement intéressantes. 2763077 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORM-:ATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) (B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE (C) VILLE: PARIS PE) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75007 (ii) TITRE DE L' INVENTION: CONTROLE DE LA CROISSANCE CELLULAIRE CHEZ UNE PLANTE PAR L'UTILISATION D'UN GENE D'ENDO-1,4-BETA-D-GLUCANASE. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2257 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana (B) SOUCHE: Wassilevskja (F) TYPE DE TISSU: Racines, jeunes plantes étiolées, rosettes, tiges, fleurs, siliques (vii) SOURCE IMMEDIATE: (A) BIBLIOTHEQUE: Arabidopsis thaliana ABRC, D'Alessio et al.Lambda Ziplox / Automatic subcloning of cDNA. Focus 14.76-79, 1992 (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: U37702 = Korrigan (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GCACGAGATC TGATCCCAAA CCTTTGATTC ATTGTTGTTG TTCTCTGCTG CTTTATCAGA 60 GAGCATCATC ATGTACGGAA GAGATCCATG GGGAGGTCCA TTGGAGATAA ACACTGCAGA 120 TTCCGCCACC GACGATGATC GTAGTCGGAA TTTAAACGAT TTGGATCGTG CGGCTCTTTC 180 ACGTCCACTA GATGAGACGC AGCAGAGTTG GTTACTTGGT CCAACGGAGC AGAAGAAGAA 240 GAAGTACGTC GATCTCGGTT GTATTATCGT TAGCCGCAAG ATCTTCGTCT GGACTGTTGG 300 TACTCTTGTT GCCGCCGCGT TACTCGCCGG ATTCATTACC TTGATCGTTA AAACTGTGCC 360 O0Z úúúDú&Yú9ú IDV %DDVIV 9úú91úYV$ 9ú1DúDOV$úú 9DDúYúDúY$ YvúLVDivúY 091Z 9V9úDú$Dúú 9ú$229úD92 2999ú2úúú$ IDI2ú$DIII DúDú$YDD9 DVDDVú&$DV OOIZ 2ú999ú9999 DVDVrWDVIú 9VúDVIúúD9 DilivDúlli 99 LDYV9 WDDVDD 0 0Z 9VD29tfDYD I9Sf9W9 úúE9VDVDD V9D959ú999 &úú999 ú99Y9úrW9 0861 L W011V91D DEDúDD9Dú 9úDúY919 9úúDYD9 WDYDV9ADD99ú DD OZ6I DgEDDVDDúD DYDDDDDúDW $DDDú29ú ú D3D3D3 923 9!DúDL$lll úDVDyVrYVD 0981 Y9Y2W9Wf2 9DDdDD9%f9 hV9 999 DlúllúD992 DúúDúD9WD9 Dú9úVDL99ú 0081 DD99DD D2232DYDDD YVúDVDYLD %SDdlDW9L VIfú LDDDúY9 ú9DD$L999D ObLI EDOD9hfD 9LDDL99LD9 úú99&YDDOY DDh'DLú9D YDYDDDW DD9WD 0891 lDYDYDYDY9 VSDDO9 Y99 fD93 Wúú9 WDú 9DDW9DWDDDVLú DIú OZ91 D9DgY9YDY DúYDD95VD YDfDDDYW %VvDYDE9úú LL99LL9DL9 úYúúDV92taf 09 SI W9DDúDOOY 2DDDú WWL999D YúVY ú9ú &E9DDDúY9 VúD91úúDV9 ú9D úD9ú91 OOSI 9D %fDYDD2 LDLLLWLfDD YDDú9DLDYú Lú99LDúD3ú YúY9DúDDD9 úY99DDúDYú 0I b DúL1 ú DúDI)D9Y&$ DleúDDID9ú hlki29úDúúY LWfD9D9DD 9YDYDDúD9Y 08ú1 99úEUV 92 ú9M92Wú$ $DDYDDúWD DSfgYDhSf LV VD.DúL 1 DDDIID OZú I vvD2DDú9ú9 VDúEDVID9E DDEYDLWDúhD VDDLLDDED9 YVfLDúLú hSD %SYlúVDDL 09ZI VIVEDDIDLD V91D0292ú DDY9úVú99DD 92ú92391 L2 DYDLD9109 úDD9LDDVVD OOZI hSfDEYDDiD9 YúúI29ú99DD úúDVIúDD3 99L9999LDL LDD9L99LD9 LVD9DYVDD99 0IbI I úD%úDDtW DDDYD2LV'ID l& IDúDiVL9 DhL9 9DDúDDúYú i ú9ú 9iú 0801 D9L99S9999 úLLLdiDY9s úY9992úYú9 $LV9t3DúL$ VúDú$L9dyf 39úD 99 OZOI D923DÉD99D &9YúY2YL9Y 999YDD9 9 DW99hSfDgú $9YD2 ú9L9 9L99WLfD9ú 096 9DúYDD292ú Dg hSWf2D& LfWSDgtVf W'f99WDL úDú&V'LDú 39 3ú2399 006 IDúDDIDDYD 9E'D2YDS úDgDúD&Y99 DLL9L'f99L9 9LWLSLLDf &LDf9LSDDD9 Ob8 9V úY&D 99& 9YDDYD 91YD1D99ú&9ú3VúLúDDf9LWLDD9 D'fW 08L 99úY9LDú9DD2tD99ED&E&úgDYD DL9L9LLDLf 9L'fSLfDDLDSLDL OZL 9 $YDOL2LD 'fSWDLDLLL D fLIL'&DIff S999DLWWDL LiLDD9V LLDL'fDILD'D 099 LDD'Df9LDSD 9LDDW9D'fL WWúDSL Vú9Yú YhLLVLú DLDVD&LDDV DSiLOLDVID 9 009 LI'DDSI'fLLD SDLfDDDDL LWDLLSD úIVLDEVD9LD 9iLDDiYDLúV úfúúD1D O O0 bS LSDLLL'fS 'fL'fDúLDS YgD9DhSfV9 99YtDD99LúW DDYYDúúD99 úDúúWLD99 08b 9V9L'dDYDú 9DWLWL'fD 9 tefDDgúú %'YD9&DúV YS'fDúDDú DLLDLL9WL OZb úDúDWVVD'f DVúD&DDVúV úDY&Yú2 Lú'99DDSDD9D DúDefúD3 úYDúYDú9D9 LLOú.9LZ 9I 17 2763077 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 621 acides aminés (B) TYPE: acide aminé jD) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYFE DE 'MOLECULE: proteine (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Arabidopsis thaliana (B) SOUCHE: Columbia (F) TYPE DE TISSU: Racines, jeunes plantes étiolées, rosettes, tiges, fleurs, siliques (vii) SOURCE IMMEDIATE: (A) BIBLIOTHEQUE: Arabidopsis thaliana ABRC, D'Alessio et al.Lambda Ziplox / Automatic subcloning of cDNA. Focus 14.76-79, 1992 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Met Tyr Gly Arg Asp Pro Trp Gly Gly Pro Leu Glu Ile Asn Thr Ala 1 5 10 15 Asp Ser Ala Thr Asp Asp Asp Arg Ser Arg Asn Leu Asn Asp Leu Asp 25 30 Arg Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Asp Glu Thr Gln Gln Ser Trp Leu 40 45 - Leu Gly Pro Thr Glu Gln Lys Lys Lys Lys Tyr Val Asp Leu Gly Cys 55 60 Ile Ile Val Ser Arg Lys Ile Phe Val Trp Thr Val Gly Thr Leu Val 70 75 80 Ala Ala Ala Leu Leu Ala Gly Phe Ile Thr Leu Ile Val Lys Thr Val 90 95 Pro Arg His His Pro Lys Thr Pro Pro Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Ala 105 110 Leu His Lys Ala Leu Lys Phe Phe Asn Ala Gln Lys Ser Gly Lys Leu 120 125 Pro Lys His Asn Asn Val Ser Trp Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gln Asp 135 140 Gly Lys Gly Glu Thr Gly Ser Phe Tyr Lys Asp Leu Val Gly Gly Tyr 150 155 160 Tyr Asp Ala Gly Asp Ala Ile Lys Phe Asn Phe Pro Met Ala Tyr Ala 170 175 Met Thr Met Leu Ser Trp Ser Val Ile Glu Tyr Ser Ala Lys Tyr Glu 185 190 Ala Ala Gly Glu Leu Thr His Val Lys Glu Leu Ile Lys Trp Gly Thr 200 205 Asp Tyr Phe Leu Lys Thr Phe Asn Ser Thr Ala Asp Ser Ile Asp Asp 210 215 220 18 2763077 Leu Val Ser Gln Val Gly Ser Gly Asn Thr Asp Asp Gly Asn Thr Asp 225 230 235 240 Pro Asn Asp His Tyr Cys Trp Met Arg Pro Glu Asp Met Asp Tyr Lys 245 250 255 Arg Pro Val Thr Thr Cys Asn Gly Gly Cys Ser Asp Leu Ala Ala Glu 260 265 270 Met Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ser Ile Val Phe Lys Asp Asn Lys 275 280 285 Glu Tyr Ser Lys Lys Leu Val His Gly Ala Lys Val Val Tyr Gln Phe 290 295 300 Gly Arg Thr Arg Arg Gly Arg Tyr Ser Ala Gly Thr Ala Glu Ser Ser 305 310 315 320 Lys Phe Tyr Asn Ser Ser Met Tyr Trp Asp Glu Phe Ile Trp Gly Gly 325 330 335 Ala Trp Met Tyr Tyr Ala Thr Gly Asn Val Thr Tyr Leu Asn Leu Ile 340 345 350 Thr Gln Pro Thr Met Ala Lys His Ala Gly Ala Phe Trp Gly Gly Pro 355 360 365 Tyr Tyr Gly Val Phe Ser Trp Asp Asn Lys Leu Ala Gly Ala Gln Leu 370 375 380 Leu Leu Ser Arg Leu Arg Leu Phe Leu Ser Pro Gly Tyr Pro Tyr Glu 385 390 395 400 Glu Ile Leu Arg Thr Phe His Asn Gin Thr Ser Ile Val Met Cys Ser 405 410 415 Tyr Leu Pro Ile Phe Asn Lys Phe Asn Arg Thr Asn Gly Gly Leu Ile 420 425 430 Glu Leu Asn His Gly Ala Pro Gln Pro Leu Gln Tyr Ser Val Asn Ala 435 440 445 Ala Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Ala Ala Asp Thr 450 455 460 Pro Gly Trp Tyr Cys Gly Pro Asn Phe Tyr Ser Thr Ser Val Leu Arg 465 470 475 480 Asp Phe Ala Arg Ser Gln Ile Asp Tyr Ile Leu Gly Lys Asn Pro Arg 485 490 495 Lys Met Ser Tyr Val Val Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Pro Arg His Val 500 505 510 His His Arg Gly Ala Ser Ile Pro Lys Asn Lys Val Lys Tyr Asn Cys 515 520 525 Lys Gly Gly Trp Lys Trp Arg Asp Ser Lys Lys Pro Asn Pro Asn Thr 530 535 540 Ile Glu Gly Ala Met Val Ala Gly Pro Asp Lys Arg Asp Gly Tyr Arg 545 550 555 560 Asp Val Arg Met Asn Tyr Asn Tyr Thr Glu Pro Thr Leu Ala Gly Asn 565 570 575 Ala Gly Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Ser Gly Glu Glu Glu Ala 580 585 590 Thr G y Lys Ile Asp Lys Asr Thr Ile Phe Ser Ala Val Pro Pro Leu 595 600 605 Phe Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Trp Lys Pro 610 615 620 REFERENCES Altschul, S. 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REVENDICATIONS 1/ Utilisation d'une séquence nucléotidique au moins partiellement constituée, a) d'une séquence nucléotidique codant pour une endo-1,4-p-D- glucanase correspondant à la séquence protéique selon SEQ ID N 2 ou un fragment de SEQ ID n 2, b) d'une séquence nucléotidique codant pour une endo-1,4-p-D- glucanase correspondant à une séquence protéique dont l'extrémité Nterminale présente au moins 70 % d'homologie avec les 166 premiers acides aminés de SEQID N 2, pour inhiber la croissance cellulaire chez une plante. 2/ Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a une longeur comprise entre 20 pb et 2 kpb. 3/ Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique est dans une orientation anti-sens. 4/ Vecteur dans lequel est insérée une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 ou 2 dans une orientation anti- sens. / Vecteur selon la revendication 4 apte à transformer directement les cellules de plante. 6/ Vecteur selon la revendication 4 apte à transformer un microorganisme, lui-même apte à transformer une cellule de plante. 7/ Vecteur selon la revendication 6 caractérisé en ce que le microorganisme est Agrobacterium tumefaciens. 8/ Vecteur selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur spécifique de types cellulaires, tissus ou organes de la plante. 9/ Procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante comprenant une étape de transformation directe ou indirecte d'une cellule de plante par un vecteur selon l'une des revendications 4 à 8. 10/ Procédé de contrôle de la croissance cellulaire d'une plante selon la revendication 9, caractérisé en ce que le contrôle consiste en une inhibition partielle ou totale de ladite croissance cellulaire. 11/ Cellule de plante transformée susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9 ou 10. 12/ Cellule de plante transformée directement ou indirectement par un vecteur selon l'une des revendications 4 à 8. 13/ Plantes comprenant des cellules selon la revendication 1 1 ou 12. 14/ Plantes selon la revendication 13 choisies dans le groupe comprenant les espèces de Brassica, ainsi que le maïs, le soja, le coton, le blé, le riz, l'orge, le sorgho, le tabac, le mûrier, la lentille et le pélargonium. / Plantes selon la revendication 14 choisies dans le groupe comprenant Brassica oleracea, Brassica napus et le colza. 16/ Semences issues de plantes selon l'une des revendications 13 à 15.