Brevet FR2771420A1 — publié le 19990528

DESCRIPTION L'invention trouve sa place dans le champ des dispositifs techniques permettant d'analyser des extraits biologiques. Les biologistes et les chercheurs disposent à ce jour d'un grand nombre de dispositifs, de trousses, d'appareillages, permettant de révéler beaucoup d'activités enzymatiques. Parmi ces activités enzymatiques, il en est une variété qui nécessite des protocoles lourds à mettre en oeuvre; il s'agit des collagénases, enzymes digérant spécifiquement le collagène de type I sous sa forme native. En effet, la structure particulière du collagène type I (la protéine la mieux représentée dans le corps humain) interdit toute utilisation de petits peptides de substitution comme on le fait pour identifier de nombreuses enzymes. Si l'enzymographie, dispositif associant l'électrophorèse de séparation, et la digestion d'un substrat spécifique in situ, permet la mise en évidence d'un certain nombre d'activités enzymatiques, elle n'autorisait pas la caractérisation des collagénases. Les méthodes utilisées pour quantifier l'activité collagénase dans un tissu, un milieu de culture cellulaire ou dans des liquides corporels incluent l'usage de collagène radiomarqué, de substrats et d'oligopeptides liés à des substances colorées ou fluorescentes, ou l'utilisation d'immunotechniques (Bigg, H.F., Clark, l.M. and Cawston, T.E. (1994) Biochim. Biophys. Acta. 1208, 157-165; Knight, C.G., Willenbrock, F., Murphy G. (1992) FEBS Lett. 296, 263-266; Bergmann, U., Michaelis, J., Oberhoff, R. Knauper, V., Beckmann, R. Tschesche (1989). J. Clin. Chem. Clin Biochem. 27, 351-359). Ces techniques, cependant, manquent souvent de sensibilité ou de spécificité. Par exemple 1' ENLISA ne peut distinguer la forme active d'une enzyme de sa forme inactive, forme inactive soit dans sa forme originelle, soit associée à un inhibiteur tissulaire de métalloprotéinases matricielles. Une technique de dégradation sur film de collagène pour la mise en évidence de la collagénase a été décrite, mais ne fait que visualiser une collagénolyse sans en préciser l'origine (BirkedalHansen, H and Taylor, R.E. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1173-1178.). Depuis sa première présentation par Heussen et Dowdle ( Heussen C and Dowle E.B. (1980) Anal. Biochem. 102,196-202), l'électrophorèse d'un gel de polyacrylamide contenant un substrat s'est révélée une technique fiable pour la mise en évidence de gélatinases 72 et 92 kDa et apparaît comme une technique autorisant la quantification (Kleiner, D.E. and Stetler Stevenson, W.G. (1994) Anal. Biochem. 218, 325-327; Beranger, J.Y., Godeau, G., Francis, C., Robert, L. And Hornebeck, W. (1994). Cell Biol. Int. 18,715-722). Bien que l'introduction de fibrilles de collagène de type I dans des gels de polyacrvlamide parut d'abord impropre pour des techniques zymographiques, nous supposions qu'un détergent comme le SDS pouvait modifier l'essentiel de l'organisation des fibrilles du polymère permettant aux protéines de migrer dans de tels gels et que l'utilisation de détergent tel que Triton X-100 pourrait restaurer une partie de la conformation originelle du collagène en triple hélice, rendant possible sa dégradation par la collagénase. L'invention concerne donc un procédé électrophorétique permettant à la fois de séparer les protéines composant un extrait biologique, et de mettre en évidence parmi ces protéines une ou plusieurs formes porteuses d'une activité enzymatique dirigée contre le collagène de type I natif. MODE de REALISATION Les électrophorèses sont réalisées avec un système conventionnel du commerce (type mini protean Il (Biorad)). Les gels 10% de polyacrylamide (10 cm de haut, 1,5 mm d'épaisseur, Duracryl de Millipore) contiennent de 0,2 à 1 mg/ml de collagène de type I de peau de veau en solutiondilué dans la solution tampon composée de 2,5 ml de gel 1,5M Tris-HCI pH 8,8, 100cul SDS 10%, 4 ml polyacryamide et 4 ml d'eau bidistillée à pH 8,8. Le gel contient 4% de polyacrylamide dans 0,1 25M de Tris, pH 6,8. Les gels sont polymérisés en ajoutant 50 pg de TEMED 0,1%. Des échantillons de collagénase en solution 1M Tris pH 6,8 contenant 50% de glycérol et 0,4% de bleu de bromophénol sont déposés dans les puits d'électrophorèse. Le tampon de migration est réalisé selon Laemmli et la migration électrophorétique se fait conventionnellement à 40 mA pendant une heure. Après électrophorèse, les gels sont lavés à deux reprises dans 200 ml de Triton X-100 à 2,5% pendant 30 mn chaque fois sous agitation permanente; ils sont alors incubés dans 100 mM de Tris-Hcl, 5mM de CaCI2, 0,005% de Brij-35, 0,001% NaN3 à pH 8,0 durant 6 à 48 heures à 370 C. Les gels sont colorés avec 0,25% de bleu de Coomassie G-250 (50% de méthanol, 10% d'acide acétique) et décolorés par une méthode spécifique (40% de méthanol, 10% d'acide acétique). L'activité de la collagénase est révélée par les zones digérées (non colorées) . Enfin les gels sont incubés durant une heure dans 5% de méthanol, 7,5% d'acide acétique et conservés sous cellophane. Influence du substrat sur la migration des protéines dans les gels de polyacrylamide. L'introduction de la gélatine dans les gels de polyacrylamide SDS-PAGE était réputée réduire la migration des protéines standard de 15 à 20%, ce qui pouvait conduire à des estimations erronées du poids moléculaire de la protéase dans le cas d'utilisation de substrats contenant du SDS-PAGE (Hummel, K.M., Penheiter, A.R., GAthman, A.C., Lilly, W.W. (1996). Anal. Biochem. 233, 140-142). Remplacer la gélatine par du collagène renforce cet effet (Fig.1). Bien qu'une concentration de 500 pg/ml de collagène dans les gels entraîne une réduction de 9,6% de la migration des protéines standard, une telle quantité de substrat s'est révélée donner les meilleurs résultats en terme de sensibilité et de spécificité de la technique; donc, cette concentration de collagène a été retenue. Sensibilité de la zymographie sur collagène pour la quantification de la collagénase. 50 picogrammes de procollagénase ont été déposés sur un gel de collagène afin d'évaluer l'activité enzymatique (6 à 48 h. d'incubation); après les 6 premières heures d'incubation, deux bandes de lyse pouvaient être déjà détectées, dont l'intensité s'accrut linéairement avec le temps (Fig 2). Elles montraient une équivalence apparente de poids moléculaire, respectivement de 57 et 52 kDa. Révélée sur Western blot, la collagénase avait un poids moléculaire évalué à 52 kDa (poids moléculaire réel: 51,929kDa). La bande de lyse la plus basse correspond à l'activité générée par la collagénase dans sa forme active. Des taux croissants de procollagénase (de 10 à 50 pg) ou d'enzymes activés par l'APMA (de 0,1 à 50 pg) sont déposés sur les gels et les intensités des bandes de lyse ont été quantifiées après 36 heures d'incubation (Figure 3). Dans ces conditions expérimentales, 0,1 pg de collagénase active (bande de 52 kDa) peut être clairement identifiée et quantifiée. Par comparaison, les bandes de lyse ne peuvent être obtenues avec la proforme qu'à partir d'une concentration de 10 pg. En résumé, l'intensité de 1 pg de bande de lyse de collagénase est équivalente à celle atteinte par 22 pg de procollagénase dans notre technique. Cela indique qu'une évaluation correcte de la procollagénase et de l'activité enzymatique dans les fluides en employant une telle technique nécessitera un calibrage des gels avec les formes originelles et activées de collagénase ( Makowski, G.S., Ramsky, M.L., (1996). Anal. Biochem. 236,353-356). La sensibilité de la zymographie sur collagène est comparée avec la technique d'immuno-blot par chémiluminescence. Les dot-blot sont évalués par analyse d'images et la Figure 4 montre que les courbes obtenues par cette technique sont linéaires pour des quantités de collagénase de 10-90 pg, une sensibilité comparable à celles obtenues en utilisant une zymographie sur collagène avec la procollagénase. Il faut rappeler que le dotblot ne peut distinguer entre les formes originelles et les formes actives d'enzyme, contrairement à la zymographie-collagène. Spécificité de la zymographie sur collagène pour la collagénase. Nous avons d'abord vérifié le profil inhibiteur de la collagénolyse dans notre expérience de zymographie sur collagène: - pour nous assurer de la pureté de notre préparation enzymatique et pour exclure l'intervention d'un autre substrat dégradé par l'enzyme; - pour montrer que l'inhibition enzymatique pouvait être utilisée, comme avec les zymographies sur gélatine, pour valider l'identification de la collagénase. La figure 5 montre que la bande 57 kDa (300 pg de procollagénase) peut être totalement inhibée en y introduisant durant l'incubation un tampon contenant 2 mM d'EDTA (ligne b), lmM de 1-10phénanthroline (ligne c) ou 3mM de Batimastat (ligne d), un inhibiteur spécifique des MMP (Botos, I., Scapozza, L., Zhang, D., Liotta, L.A., Meyer, E.F. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 2749-2754). En revanche, l'intensité de la bande reste inchangée en présence de péfabloc (2 mM; ligne e). Aucune bande n'est discernable quand on introduit sur les gelscollagène et dans les mêmes conditions, 300 pg de gélatinase A ou 300 pg de stromélysine activées par l'APMA (Fig 5; lignes h, k); des bandes discrètes et diffuses apparaissent pour une quantité de gélatinase > 5 ng (non montré ici), ce qui s'explique par la faible activité collagénolytique connue pour cette enzyme (Aimes, R.T., and Quigley, J.P. (1995). J. Biol. Chem. 270, 5872-5876); par contre, 300 pg de procollagénase traitée par APMA sont inactifs sur un zymogramme-gélatine (ligne i) alors que la gélatinolyse est nette pour des quantités de progélatinase équivalentes (ligne j). CONCLUSION Nous venons de décrire l'utilisation de la zymographie sur collagène pour l'identification et la quantification de la collagénase. Des niveaux aussi bas que 10 pg de proenzyme et 0,1 pg d'enzyme active peuvent être détectés et une détermination exacte des deux formes d'enzymes est réalisable. La spécificité de cette méthode pour la collagénase est démontrée. Sa simplicité de mise en oeuvre pourrait justifier son emploi dans le domaine expérimental et clinique. FIGURE 1. Migration des protéines standards: lysozyrne (14,3 kDa); inhibiteur de trypsine (21,5 kDa); anhydrase carbonique (30 kDa); ovalbumine (46 kDa), phosphorylase (97,4 kDa) et myosine (220 kDa) dans la gélatine et le collagéne. 0,1% SDS-10% PAGE. FIGURE 2. Zymographie sur collagéne de 50 pg de procollagénase intersticielle. Les gels ont été incubés pendant 0-48h et les bandes de lyses ont été quantifiées par analyse d'images. Les poids moléculaires (kDa) sont indiqués. 57 kDa: # 52 kDa: # FIGURE 3. Comparaison de zymogrammes sur collagène obtenus en utilisant une gamme de 10 à 50 pg de procollagénase (A) et une gamme de 0,1 à 5 pg de procollagénase activée par l'APMA (B). temps d'incubation 36 h.. Les poids moléculaires (kDa) sont indiqués. Q proforme 57 kDa, forme active 52 kDa FIGURE 4. Quantification de la procollagénase en utilisant la technique d'immuno dot blot. Gamme d'enzymes de 10-100 pg; les points ont été quantifiés par analyse d'images. FIGURE 5. Spécificité de la technique de la zmrmotraphie sur collagène A-Gels de collagène ligne a: contrôle: 300 pg de procollagénase déposée; incubation dans un tampon: 100 mM de Tris/Hcl, 5 mM de Ca C12, 0,001% de NaN3 à pH 8,0. ligne b: 300 pg de procollagénase mais avec un tampon d'incubation contenant 10 mM EDTA liene c: 300 pg de procollagénase mais avec un tampon d'incubation contenant mM 1-10 phénanthroline lient t: 300 pg de procollagénase mais avec un tampon d'incubation contenant 3 nM de batimastat. ligne e: 300 pg de procollagénase mais avec un tampon d'incubation contenant 2 mM de Pefabloc ligne @ 300 pg de procolliagénase activée par l'APMA ligne # 300 pg de progélatinase 72kDa activée par l'APMA ligne # 300 pg de prostromélysine activée par l'APMA B-Gels de gélatine ligne i: 300pg de procollagénase activée par l'APMA ligne i: 300pg de pro gélatines. 72 kDa activée par l'APMA Les poids moléculaires sont indiqués. REVENDICATIONS 1) Dispositif destiné à mettre en évidence des activités collagénolytiques, caractérisé par la constitution d'un gel homogène de collagène natif de type I, et de polyacrylamide à 10%, permettant une séparation électrophorétique d'un mélange de protéines d'une part et une digestion localisée de collagène de type I sous forme native d'autre part. 2) Dispositif selon la revendication 1 en ce que la digestion du substrat est spécifique des collagénases à l'exclusion des autres métalloprotéinases connues. 3) Dispositif selon la revendication 1 en ce que les conditions de préparation du gel permettent la mise en évidence aussi bien des proformes réputées inactives que des formes activées des collagénases. 4) Dispositif selon la revendication 1 adaptable à un substrat incorporable dans le gel d'électrophorèse, et qui conservera sa structure native, et n'entravera pas la migration électrophorétique.