Brevet FR2761993A1 — publié le 19981016

L'invention concerne des peptides synthétiques utilisables dans les essais biologiques pour la détection des infections dues aux virus VIH-1 groupe O, leur procédé de préparation, des compositions et des trousses contenant de tels peptides ainsi que les essais biologiques mettant en oeuvre de tels peptides. Des rétrovirus VIH-1 du groupe O sont connus dans l'art antérieur. Le brevet EP 0 345 375 et la demande de brevet EP 0 657 532 décrivent les isolats ANT 70 et ANT 70 NA isolés chez des malades Camerounais. Ces documents décrivent plus précisément des antigènes et des compositions antigéniques contenant des lysats ou des protéines de ces isolats, les acides nucléiques correspondant à I'ARN génomique, des méthodes d'hybridation mettant en oeuvre ces acides nucléiques, des méthodes de production des isolats dénommés ci- dessus ainsi que des procédés de préparation de protéines p12, p16, p25, gp41 gp120 de ces rétrovirus. La demande EP 0591 914 décrit l'isolat MVP 5180/91. Cet isolat caractérisé par Western Blot présente, comme l'isolat précédent, des différences par rapport aux isolats du rétrovirus VIH-1, connus depuis longtemps. La demande EP 0 591 914 décrit précisément la séquence d'ADN de l'isolat MVP 5180/91 et indique précisément la localisation des gènes gag, pol et env. La demande EP 0 591 914 décrit encore des peptides synthétiques de la boucle V3 ainsi que de la région immunodominante gp41. Ces derniers sont utiles pour des essais biologiques, notamment pour la détection, in vitro, des anticorps VIH-1 groupe O. La demande EP 0 673 948 décrit des peptides synthétiques ou recombinés constitués de 15 à 50 acides aminés (AA) et comportant la séquence - VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGRdans laquelle X représente soit un résidu cystéine, soit un résidu serine. Ces peptides sont utiles dans le domaine diagnostique pour la détection des infections dues à certains isolats de rétrovirus VIH-1 groupe O. On connaît également la demande EP 0 727 483 qui décrit l'isolat MVP 2901/94 qui fait aussi partie des rétrovirus appartenant à la famille VIH-1 groupe O. Cette demande décrit certains antigènes ayant des séquences peptidiques bien déterminées. Ces séquences peptidiques correspondent à une partie de la séquence de la gp120 de l'isolat MVP 2901/94. La demande WO 96/12809 décrit deux isolats appartenant à la famille VIH- 1 groupe O. Il s'agit des isolats VAU et DUR. Cette demande décrit certaines séquences peptidiques issues des deux virus cités ci-dessus, utiles pour la détection d'anticorps reconnaissant les séquences peptidiques VIH-1 VAU ou DUR. La demande WO 96/32293 décrit deux antigènes issus de la séquence de l'isolat ANT 70. Il s'agit de l'antigène appelé MDL061 et de l'antigène MDL056, de la région immunodominante de la gp41. Selon cette invention décrite dans la demande W096/32293, pour détecter 100% des échantillons des sérums de malades infectés de VIH groupe O, il est nécessaire d'utiliser des compositions contenant ces deux peptides, puisque chaque peptide isolé ne permet pas à lui seul d'obtenir des résultats satisfaisants. En effet, il est connu, que même lorsque l'on utilise des réactifs sérologiques issus des isolats du groupe O, il n'est pas souvent possible de dépister tous les malades infectés par des rétrovirus VIH-1 du groupe O; cela signifie qu'il n'est pas possible d'obtenir des réactifs qui garantissent 100% de sensibilité. Le groupe O soulève ainsi pour la première fois un problème important; il s'agit de l'inadéquation de certains réactifs sérologiques quant à reconnaître des individus contaminés par des groupes ou sous-types particulièrement divergents. C'est le cas justement du VIH groupe O. La demande WO 96/40763 insiste aussi sur la grande divergence du groupe O. Cette demande décrit des peptides qui incorporent dans une séquence naturelle VIH-1 de type B, quelques petites modifications (remplacement de un ou deux acides aminés). Selon cette demande, ces peptides hybrides sont capables de réagir avec des anticorps anti groupe O. De manière inattendue il a été maintenant trouvé, que certains peptides synthétiques, qui ne correspondent pas à une séquence naturelle, sont d'excellents réactifs diagnostiques et permettent de dépister de manière satisfaisante les malades infectés par les rétrovirus VIH-1 du groupe O. Ces peptides courtes séquences très conservées, présentes dans les isolats des rétrovirus VIH- 1 du groupe O. Les peptides de l'invention permettent d'obtenir des résultats beaucoup plus performants que ceux obtenus avec des peptides synthétiques dont la séquence correspond à une partie de la séquence de l'enveloppe (env) de certains isolats VIH-1 du groupe O et qui contiennent des épitopes immunodominants de la gp41. Par la suite, pour dénommer les acides aminés sera utilisee la nomenclature à trois lettres. Les peptides synthétiques de l'invention comportent de 20 à 50 acides aminés et répondent à la formule générale 1: à-Z -TrpGlyCys- CysTyrThrSerVal-Z-'F (I) dans laquelle: -à représente un radical biotinyle, un radical biocytinyle, un atome o10 d'hydrogène, un radical acétyle (CH3CO-), une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaîne alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou une chaîne alcényle de 2 à 6 atomes de carbone, - Z représente un radical de formule 11 à X: -=, -Ser-_2(11) -Ser-- =2 (111) -.,-Ser (IV) 1 -Gln--2 (V) -Gln-..2 (VI) -=-GIn- (VIl) -=-Asn--2 (VIII) -Asn-E2 (IX) -_=-Asn (X) dans lesquelles: -_ représente une séquence peptidique de 1 à 5 acides aminés et --2 un acide aminé, -E représente une séquence peptidique de formule XI: - (AA,)-(AA2)- (AA3) -(AA4)-(AA)- (Xl) dans laquelle: * (AA,) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA2) représente soit un résidu glycine, soit un résidu asparagine, * (AA3) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA4) représente soit un résidu leucine, soit un résidu alanine, soit un résidu isoleucine, soit un résidu glutamine, * (AA5) représente soit un résidu isoleucine, soit un résidu valine, soit un résidu leucine, soit un résidu thréonine, soit un residu norleucine, soit un résidu norvaline, à condition toutefois que (AA,), (AA2), (AA3), (AA4) et (AA5) ne s forment pas ensemble les séquences peptidiques -Lys Gly Lys Leu lie- et - Lys Gly Lys Leu Val-, -ú représente une séquence peptidique de formule Xll ou de formule XIII: -(AA.)-Trp Asn-(AA7)-(AA)- (Xll) -(AAe)-Trp His-(AA7)-(AAs)- (XIl) dans lesquelles: * (AAe) représente un acide aminé différent de la lysine, * (AA7) représente un acide aminé, * (AAe) représente un résidu serine ou thréonine, -T, fixé sur le reste -CO- de l'acide aminé AA8 libre, représente un groupe OH, un radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone, ou le reste.d'un peptide n, de formule: Z-TrpGlyCys-O-CysTyrThrSerVal-Z-' avec Z, e,: sont tels que définis ci-dessus, et -,' représente un groupe OH ou radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone. Dans le cas o T forme une liaison peptidique entre le reste -CO- de l'acide aminé AA8 et Q, le peptide de formule I est donc un dimère. Les peptides selon l'invention peuvent être, soit sous forme linéaire, soit sous forme cyclisée par l'intermédiaire de ponts disulfure des cystéines. Les peptides selon l'invention peuvent être liés à une phase solide, notamment par leur extrémité N-terminale. On préfère les peptides de formule I dans laquelle: - A représente un radical biotinyle, un radical biocytinyle, un atome d'hydrogène, un radical acétyle (CH3CO-), une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaine alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou une chaîne alcényle de 2 à 6 atomes de carbone, -Z représente une séquence peptidique de formule -Leu Leu Ser Leu- -Leu Leu Gin Ser- -Leu Leu Asn Ser- ou -Leu Leu Ser Ser- - représente une séquence peptidique de formule -Arg Gly Lys Ala Val-, Arg Gly Arg Leu Val-, -Lys Gly Arg Leu Val- ou -Arg Gly Arg Ala Val- et Z représente une séquence peptidique de formule -Gin Trp Asn Glu Thr- ou -Gin Trp Asn Ser Thr-. On préfère tout peptide incluant l'une des séquences suivantes et comportant de 22 à 50 acides aminés. Ces séquences sont données selon les nomenclatures à une et à trois lettres: séquence N 1 -LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- séquence N 2 -LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn I 5 10 15 20 Glu Thr- 22 seéquence N 3 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- séquence N 4 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr- séquence N 5 -LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr- séquence N 6 -LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- séquence N 7 -LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- Les peptides synthétiques ci-après sont des peptides particulièrement préférés. PEPTIDE N 1 LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr 22 PEPTIDE N 2 LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 3 LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 4 LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr 22 PEPTIDE N 5 LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr PEPTIDE N 6 LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 7 LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr 22 Les peptides synthétiques de formule I, objet de la présente invention, peuvent être obtenus par synthèse en phase solide selon des méthodes classiques R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85. pp. 21492154; R.C. Sheppard, in " Peptides 1971 ", Nesvadba H (ed.) North Holland, Amsterdam, pp. 111; E. Atherton and R.L. Sheppard, in " Solid phase peptide synthesis, a practical approach ", IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, pp. 25-34. Comme synthétiseur automatique on peut utiliser le synthétiseur " 9050 Plus Pep Synthesizer " de Millipore ou un synthétiseur équivalent. Le support solide, utilisé pour les synthèses, doit être compatible avec la technique et la chimie utilisée. Par exemple, pour une synthèse sur le synthétiseur " 9050 Plus pep. Synthesizer ", il est recommandé d'utiliser une résine adaptée à la technique dite " en flux continu "; les résines PEG PS répondent à ces critères. Ces supports sont constitués d'un bras (" spacer ") à base de polyéthylèneglycol (PEG) situé entre le groupement fonctionnel du polystyrène des billes et le point d'accrochage du premier acide aminé. La nature de ce point d'ancrage peut varier selon la fonction C-terminale choisie. La résine PEG-PS est utilisée de préférence pour la synthèse des peptides selon l'invention. La résine de départ et les acides aminés utilisés comme matière première sont des produits disponibles dans le commerce (PerSeptive-Biosystem, ou Néosystem). Pour la synthèse peptidique, les groupements protecteurs de chaînes latérales suivants ont été utilisés: Acides aminés Groupement protecteur Arginine Pentaméthyl-2,2,4,6, 7-dihydrobenzofuran-5-sulfonyle (Pbf) Asparagine, Glutamine Trityle (Trt) Cystéine Trityle (Trt) ou Acétamidométhyle (Acm) Serine, Thréonine, Ether tert-butyle (tBu) Tyrosine Lysine, Tryptophane Tert-butyloxycarbonyle (Boc) La protection temporaire de la fonction amine primaire en a des acides aminés a été effectuée à l'aide du groupement 9- fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). La déprotection est effectuée par- une solution de pipéridine à 20% dans le diméthylformamide. Pour le couplage, on utilise de préférence un excès de lo diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) et d'hydroxy-1-benzotriazole (HOBt). Après synthèse, la résine est lavée avec des solvants organiques, (diméthylformamide, puis dichlorométhane) séchée sous vide puis traitée par une solution à base d'acide trifluoroacétique (TFA) refroidie à 0 C et contenant des inhibiteurs ou agents purificateurs " scavengers " appropriés. On peut utiliser, par exemple, le réactif K contenant 82% d'acide trifluoroacétique, 5% de phénol, 5% d'eau, 5% de thioanisole et 3% d'éthanedithiol. Les peptides synthétiques ainsi isolés sont ensuite précipités et rincés à l'éther. Les peptides synthétiques sont ensuite purifiés par chromatographie liquide en phase inverse et leur pureté est déterminée par spectrométrie de masse. Comme phase solide, on peut utiliser, par exemple, la phase Bondapack C18. Les peptides sont élués en réalisant un gradient linéaire entre deux solutions tampons, le premier essentiellement aqueux (par exemple eau- TFA 0,1 %) et le second plutôt organique (par exemple un mélange contenant d'acétonitrile 60 %, eau 39,92 % et TFA 0,08 %). Les fractions pures collectées sont rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées. Pour la cyclisation, les peptides synthétiques purifiés sont dissous dans une solution d'acétate d'ammonium (10mM). Le pH est ajusté à 8,5 par addition d'ammoniaque 1 M. La solution est vigoureusement agitée. La cyclisation est complète après 18 heures. Le pH est ensuite abaissé à 6 par addition d'acide acétique. Les peptides cyclisés sont lyophilisés, puis purifiés par chromatographie liquide en phase inverse comme décrit précédemment. L'immunoréactivité des peptides de l'invention a été évaluée à l'aide de sérums de malades camerounais infectés par des retrovirus VIH-1 groupe O. Les différents essais effectués ont démontré que les peptides de l'invention seuls ou en association (compositions de peptides), permettent de détecter 100% des sérums infectés par des rétrovirus VIH-1 groupe O. Les peptides synthétiques de l'invention trouvent donc leur application dans les tests immunologiques pour le dépistage des infections dues aux rétrovirus VIH-1 groupe O. Il est également possible d'utiliser des associations de plusieurs peptides synthétiques de formule I. Ces associations, qui peuvent contenir deux ou plusieurs peptides de formule 1, font aussi partie de l'invention. On préfère des associations des peptides N 1 et N 3. Il est aussi possible d'envisager des associations contenant de peptides synthétiques de formule I de la présente invention avec des peptides recombinés VIH-1 groupe O tels qu'ils peuvent obtenus par des méthodes classiques et ayant utilisant les séquences décrites dans EP 0 591 914. De telles associations entrent aussi dans le cadre de la présente invention. Les peptides synthétiques de l'invention peuvent être aussi utilisés en association avec d'autres peptides synthétiques ou recombinés VIH-1 et/ou VIH-2, tels que, par exemple, les peptides décrits dans les demandes de brevets ou brevets EP 0 387 914, EP 0 239 425, EP 0 220 273, EP 267 802 e.t.c. Cette liste de demandes de brevets ou brevets n'est pas exhaustive et est donnée, comme mentionné précédemment, à titre d'exemple. Les compositions contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule I et un ou plusieurs synthétiques ou recombinés VIH-1 ou VIH-2 trouvent leur application dans le diagnostic pour le dépistage de malades infectés par différents rétrovirus VIH. Ces compositions font également partie de la présente invention. Des procédés d'immunodosage utilisant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule I, seuls ou en association avec des peptides recombinés VIH-1 groupe O ou des peptides synthétiques ou recombinés VIH-1 et/ou VIH-2, font également partie de l'invention. L'invention vise également des trousses, pour la mise en oeuvre d'immunodosages, qui incluent un peptide de formule I ou une composition qui contient au moins un peptide de formule 1. Les exemples suivants illustrent l'invention et sont donnes à titre non limitatif. EXEMPLE 1: Préparation d'un composé selon l'invention: PEPTIDE NO 2 LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn I 5 10 15 20 Glu Thr Ce peptide a été synthétisé en phase solide. La technique mise au point en 1963 par Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85. pp. 2149- 2154) consiste à fixer le premier acide aminé sur un support solide polymérique (résine) par sa fonction acide et à allonger la séquence peptidique à partir de ce premier acide aminé, le peptide en cours de synthèse restant ancré sur la résine. Pour la synthèse du peptide N 2, ont été utilisés, comme synthétiseur, le synthétiseur " 9050 Plus Pep Synthetiser " et comme résine, la résine Fmoc Thr (OtBu) PEG PS. Les différentes étapes de la synthèse sont résumées dans le tableau I ci- après Tableau I RESIDU PROTECTION PROTECTION METHODE DE NOMBRE D'EQ - ACIDE AMINE NH2 LATERALE COUPLAGE DUREE DE __________________, COUPLAGE Glu Fmoc OtBu DIPCDI/HOBt 5 eg - 30 min Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq min Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Gin Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq 30 min Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq 30 min Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Tyr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eg - 30 min Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min GIy Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eg - 30 min Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 30 min Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eg - 30 min Après la fin de la synthèse, la résine a été lavee avec du diméthylformamide, puis du dichlorométhane et séchée sous vide. Ensuite, la résine a été traitée avec du réactif K (acide trifluoacetique 82 %; phénol 5 %; eau 5 %; thioanisole 5 %; éthanedithiol 3 %). Le peptide No 2, isolé par précipitation à l'aide de diéthyle oxyde, a été ensuite rincé avec le même solvant. On a ainsi obtenu 140 mg du peptide N 2. Le peptide N 2 a été ensuite purifié par chromatographie liquide en phase inverse. Comme phase solide, il a été utilisé la phase Bondapack C- 18. Le peptide a été élué en réalisant un gradient linéaire entre deux solutions tampons, le premier essentiellement aqueux (par exemple eau- TFA 0,1 %) et le second plutôt organique (par exemple un mélange contenant: 'acétonitrile 60 %, eau 39,92 % et TFA 0,08 %). Les fractions pures collectées ont été rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées. Pour la cyclisation, le peptide synthétique purifié, ainsi obtenu a été dissous dans une solution d'acétate d'ammonium (10mM). Le pH a été ajusté à 8,5 par lO addition d'ammoniaque 1 M. La solution a été vigoureusement agitée. La cyclisation a été complète après 18 heures. Le pH a été ensuite abaissé à 6 par addition d'acide acétique. Le peptide cyclisé a été lyophilisé, puis purifié chromatographie liquide en phase inverse comme décrit précédemment. De manière équivalente, et en utilisant les acides aminés appropriés, ont été synthétisés les autres composés de l'invention. Le tableau Il indique le poids moléculaire de certains peptides de formule 1, sous forme non cyclisée, évalué par spectrométrie de masse. Tableau II Peptide Poids moléculaire (Dalton) 1 PM 2512 2 PM 2583 3 PM 2528 4 PM 2586 PM 2527 EXEMPLE 2: Evaluation de l'immunoréactivité des peptides selon l'invention Dar test immuno-enzvmatique. Les sérums utilisés ESS, DUR, VAU et HAD sont des sérums de malades français infectes par des rétrovirus VIH-1 groupe O. Les autres échantillons de sérums de malades infectés par des rétrovirus VIH-1 groupe O ont été obtenus par le Centre Pasteur de Yaoundé au Cameroun et ont été serotypés groupe O selon l'algorithme sérologique décrit dans AIDS (1977), 11 pp 445-453. Les sérums VIH négatifs (n=48) ont été obtenus à partir de volontaires sains. Les peptides synthétiques utilisés ont été dissous dans l'eau à une concentration de 1 mg/ml (solution mère). Pour l'étape de recouvrement (coating), zl d'une solution à 2 lg/ml de chaque peptide (obtenue par dilution de la solution mère avec de la solution tampon carbonate 0,1 M) ont été ajoutés à chaque cupule des plaques de microtitrage MicrotiterT (NUNC). Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les microplaques ont été d'abord lavées avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20 et du merthiolate de sodium 0,001%, puis saturées avec une solution de PBS contenant 0,5% de RégilaitTM (lait écrémé desséché). Après aspiration de la solution de saturation, les plaques ont été chauffées pendant 10 min a 50 C. Les échantillons de sérums ont été dilués au 1/5 avec une solution de lait écrémé (tampon citrate additionné de 0,01% de rouge de phénol, de chloroforme à 0,25% et de Kathon 0,25%), déposés sur les cupules des plaques et incubés pendant 30 min à 40 C. Après lavage avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20 et du merthiolate de sodium 0,001%, 100 1l d'une solution de conjugué anticorps de chèvre anti IgG et IgM humaines marqués à la peroxydase de raifort, contenant comme conservateur 0,01% de merthiolate de sodium, en solution dans une solution tampon citrate additionné de glycérol à 30% et du sérum normal de veau foetal à 25% ont été ajoutés à chaque cupule de plaques puis ces dernières ont été incubées pendant 30 min à 40 C. Après lavage avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20 et du merthiolate de sodium 0,001%, le développement de la coloration a été obtenu par addition dans chaque cupule de 100.1 de Ophenylène diamine en solution dans du peroxyde d'hydrogène. Les microplaques ont été ensuite incubees pendant 30 min à température ambiante et dans l'obscurité. La réaction colorée a ensuite été arrêtée par addition de 100 gl d'acide sulfurique 4N. L'absorbance (A) a été déterminée à 490 et 620 nm. L'intensité relative (A490-A620) lue dans chaque cupule est proportionnelle à l'immunoréactivité de chaque peptide. Cela indique l'aptitude de chaque peptide à réagir avec l'échantillon biologique avec lequel est effectué l'essai. La valeur seuil (cut-off) a été déterminée comme étant une absorbance égale à 0.15. Elle correspond à la moyenne de valeurs négatives (n=48) plus 12 écart-types. La réactivité des peptides de l'invention, (peptide N 3, peptide N 2 et peptide N 1 tous sous forme cyclisée) a été comparée à celle de deux peptides synthétiques ayant comme séquence une partie de la séquence naturelle de l'enveloppe (env) de l'isolat VAU (rétrovirus VIH-1 groupe O) et comportant un épitope immunodominant de gp41. Ces deux peptides, sous forme cyclisée, ont la séquence suivante: VAU 22 AA Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Ala le Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn 1 5 10 15 20 Lys Thr 22 VAU 35 AA Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe le Glu Glu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15 20 Lys Asn Arg Ala lle Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr 30 35 Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau III. Tableau III SERUM ABSORBANCE PEPTIDE PEPTIDE PEPTIDE VAU 22 AA VAU 35 AA N 3 N 2 N 1 ESS** >**, 2,494 > > DUR** > > > 0,118 0,872 HAD > 0,518 0,041 0,789 0,871 VAU' 1,342 > > > > 3935* > 0,893 0,307 0,138 0,227 6891 > 0,614 0,062 0,359 0,496 6512"' 0,746 0,785 > 0,120 0,174 1105" 1,421 1,031 0,099 0,129 4021*" 0,430 0,119 > 0,050 1,957 5969"* > 0,282 > 2,491 2700 > 0,274 > >À 5453 0,555 0,081 > 1,267 1,482 5931* > > > 0,202 2,225 3136* > 0,992 0,302 > > 3653 1,352 > 0,044 1,441 1,322 2352 > > 0,205 > > 3016 > > 0,243 > > 3302 > > 0,386 > > 2294 > > 0,447 > > 3771 > > 0,544 > > 1581 >À > 1,112 0,894 5373 > > > 1,359 0,856 7443 >À > > 0,920 0,574 3637r > > > 0,779 1,647 6295** 1,718 1,063 >_ 0,972 > 6689*' 0,710 > > > À> 1754 > À> 1,263 1,948 4489** > > > 1,318 1,718 4364* > > 1,382 > > 3884" > > 1,839 > > 3529 > > 1,803 > > 3482 2,402 > 1,473 > > 1702 > > 1,162 > > 6487* 1,017 2,687 2,889 2,891 *5164* > > > > > 5766** > > > > > 3945* > > > > > * sérotypés * sérotypés / génotypés > = signal supérieur à la capacité de lecture de spectrophotomètre. -- 2761993 Tableau III (suite) SERUM ABSORBANCE PEPTIDE PEPTIDE PEPTIDE VAU-22 AA VAU 35 AA N 3 N 2 NO 1 4434* > OVER > 2,273 > 4288*- > > 2,802 2,337 N.T.-** 6782 > 2,091 2,462 2,190 2,214 2313 > > > > >À 2312 > > > > > 1062 > > > 402 > À >> > À> 134 >À, > > 7120 > > > >_ 7212 > > > >À 6976** > >À_ >_ 3600** _ À > 2,743 > > 3236 À > > > > 3235 > _ > > 2551 > > > > > 5270" ** >_ > > 5210 > >__ > > > 5149'* > > > > >_ 4477 >__ _ >___ _ >___ _ 2,511 > 3891 > _ ÀJ > 2,780 > > 3627* >, 2,910 > > 7258** > >___ 2,477 > 7007 2,136 2,334 > 2, 151 6697 >-> > > >_[_À_À 6998 ' _ _ >_ > > 6627 >>> > >À|ÀÀ 6198* >>> _ > >_ 6165 > _ _ 2,714 > > 7439 > > > > > 7297"* >À > > _À 6111 >À_ >__ > > 625 > > > > 2,885 * sérotypés ** sérotypés / génotypés > = signal supérieur à la capacité de lecture de spectrophotomètre. Non testé Les résultats du tableau III démontrent que le peptide N 3 donne les meilleures performances de tous les autres peptides. Ce peptide permet la meilleure discrimination de sérums de malades infectés par des rétrovirus VIH-1 groupe O par rapport aux deux peptides ayant une partie de la séquence de l'isolat VAU correspondant à l'épitope immunodominant degp41. Par ailleurs, les peptides N0 2 et N 1 de l'invention sont plus immunoréactifs par rapport au peptide VAU 22 MAA qui comporte le même nombre d'acides aminés. EXEMPLE 3: Evaluation de I'immunoréactivité des compositions contenant des peptides selon l'invention par test immuno-enzvmatiaue. Pour cet essai, il a été procédé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 et les mêmes sérums ont été utilisés. Les microplaques utilisées ont été recouvertes soit avec le peptide N 1 cyclisé, soit avec le peptide N 3 cyclisé, soit avec une composition contenant ces deux peptides (1:1 p/p). Dans chaque cupule ont été déposés, soit 100 lI1 d'une solution contenant 2 l.g/ml de peptide N 1, soit 100 l1 d'une solution contenant 2 plg/ml de peptide N 3, soit 100 p.i d'une solution contenant 1 jug/ml de peptide N 1 et 1 j!g/ml de peptide N 3. Les résultats de cet essai sont donnés dans le tableau IV. Tableau IV SERUM ABSORBANCE PEPTIDE N I PEPTIDE No 3 PEPTIDE N 1 ( lJg/ml) (2 pgiml) (2 pg/mI) + PEPTIDE N 3 (1 pi /ml) 3529 1,803 > - 1105,o ] > 1,421 > 3891 2,780 > > 3236 > > >] 2700 >À À 5931 > > > 3935 0,307 >> 7443 > > > 1062 _> > > 1754 >À À 3136 0,302 > > 6891 0,062 > > 5149 > > > 5270 > > > 2551 > À 3600 2,743 > > 6976 > >> 4489 > >, 6165 2,714 > > * > = signal supérieur à la capacité de lecture de spectrophotomètre. Tableau IV (suite) SERUM ABSORBANCE PEPTIDE N* I PEPTIDE N 3 PEPTIDE N I ( 1pg/ml) (2 pg/ml) (2 pg/mi) + PEPTIDE N 3 (1 i U/ml) 6198 >* > 6627 > > > 6998 > > 6697 > > > 7258 2,477 > >- 3627 2,910 > À T >_T 4477 >À À 3771 0,544 > > 1702 1,016 >À 2294 0,447 >À 2352 0,205 > > 3016 0,243 > > 3302 0,388 > > 3482 1,473 > > 3653 0,044 1,322 1,105 4364 1,382 > > 3637 > > > 4288 2,802 > > 5969 > > > 258 > > 6111 > > > 625 > > > 6853 > 2,769 > 3136 0,302 > > 6689 > 0,710 > 6295 > 1,718 > 4021 _ _ 0,430 2,381 3884 1,839 > À> 6512 > 0,746 > 6487 2,687 > > ESS 2,494 > > HAD 0,041 > > DUR >>> * = signal supérieur à la capacité de lecture de spectrophotomètre. Les résultats du tableau IV démontrent que les compositions des peptides de l'invention, lorsque utilisées en diagnostic permettent la détection de tous les sérums de malades infectés par des rétrovirus VIH-1 groupe O. 2761993- Revendications 1. Peptides synthétiques comportant de 20 à 50 acides aminés et répondant à la formule générale 1: A-Z -TrpGlyCys-O- CysTyrThrSerVal--g-T (I) dans laquelle: -A représente un radical blotinyle, un radical biocytinyle, un atome d'hydrogène, un radical acétyle (CH3CO-), une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaîne alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou une chaîne alcényle de 2 à 6 atomes de carbone, - Z représente un radical de formule Il à X: 1,-Ser--2 (11) -Ser---- 2 (111) -i--Ser (IV) -1l-Gln--=2 (V) -Gln---2 (VI) 1-Gln- (Vil) wl-Asn--2 (VIII) -Asn-_=2 (IX) -W1-Asn (X) dans lesquelles: --= représente une séquence peptidique de 1 à 5 acides aminés et --2 un acide aminé, - représente une séquence peptidique de formule Xi: -(AA,)-(AA2)- (AA3) - (AA4)-(AA)- (Xl) dans laquelle: * (AA1) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA2) représente soit un résidu glycine, soit un résidu asparagine, * (AA3) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA4) représente soit un résidu leucine, soit un résidu alanine, soit un résidu isoleucine, soit un résidu glutamine, (AA,) représente soit un résidu isoleucine, soit un résidu valine, soit un résidu leucine, soit un résidu thréonine, soit un résidu norleucine, soit un résidu norvaline, à condition toutefois que (AA,), (AA2), (AA3), (AA4) et (AA5) ne forment pas ensemble les séquences peptidiques -Lys Gly Lys Leu lie- et - Lys Gly Lys Leu Val-, -Z représente une séquence peptidique de formule Xll ou de formule XIII: -(AA)-Trp Asn-(AA7)-(AAS)- (Xll) -(AAa)-Trp His-(AA7)-(AA.8)- (XlII) dans lesquelles: * (AAe) représente un acide aminé différent de la lysine, * (AA7) représente un acide aminé, * (AAa) représente un résidu serine ou thréonine, -T, fixé sur le reste -CO- de l'acide aminé AAs libre, représente un groupe OH, un radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone, ou le reste. d'un peptide , de formule: Z-TrpGlyCys- -CysTyrThrSerVal-*-,' avec Z, e, E sont tels que définis ci-dessus, et - w' représente un groupe OH ou radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone, sous forme linéaire ou sous forme cyclisée par l'intermédiaire de ponts disulfure des cystéines, et peptides de formule I liés à une phase solide. 2. Peptides synthétiques de formule I selon la revendication 1, dans laquelle: - A représente un radical biotinyle, un radical biocytinyle, un atome d'hydrogène, un radical acétyle (CH3CO-), une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaîne alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou une chaîne alcényle de 2 à 6 atomes de carbone, -Z représente une séquence peptidique de formule -Leu Leu Ser Leu- -Leu Leu Gln Ser- -Leu Leu Asn Ser- ou -Leu Leu Ser Ser- - représente une séquence peptidique de formule -Arg Gly Lys Ala Val-, Arg Gly Arg Leu Val-, -Lys Gly Arg Leu Val- ou -Arg Gly Arg Ala Val- et Y représente une séquence peptidique de formule -Gln Trp Asn Glu Thr- ou -Gln Trp Asn Ser Thr-. 3. Peptides synthétiques de formule I selon la revendication 1 comportant de 22 à 50 acides aminés et incluant l'une des sequences suivantes: SEQUENCE N 1 -LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- 22 SEQUENCE N 2 -LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- SEQUENCE N 3 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- SEQUENCE N 4 -LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr- SEQUENCE N 5 o -LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST- ou -Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr- SEQUENCE N 6 -LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET- OU -Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- SEQUENCE N 7 -LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET- ou -Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr- 4. Peptides synthétiques, selon la revendication 1, de séquence: PEPTIDE N 1 LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 2 LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 3 LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 4 LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr PEPTIDE N 5 LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST ou Leu Leu Gin Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Ser Thr 22 PEPTIDE N 6 LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr PEPTIDE N 7 LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET ou Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gin Trp Asn 1 5 10 15 20 Glu Thr 5. Composition contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule I selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Composition contenant le peptide N 3 et le peptide N 1 selon la revendication 4. 7. Composition contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule I selon la revendication 1 et un ou plusieurs peptides recombinés VIH-1 groupe O. 8. Composition contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule 1, selon la revendication 1, et un ou plusieurs peptides synthétiques ou recombinés VIH-1 et/ou VIH-2. 9. Procédé d'immunodosage mettant en oeuvre ou plusieurs peptides synthétiques de formule 1, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 10. Procédé d'immunodosage mettant en oeuvre une composition selon l'une quelconque de revendications 5 à 8. 11. Trousse de diagnostic incluant au moins un peptide synthétique de formule 1, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou une composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 8.