Brevet FR2768627A1 — publié le 19990326

MÉDICAMENT VETÉRINAIRE CONTENANT DE LA CHORIOGONADOTROPINE ÉQUINE MODIFIÉE POUR INDUIRE L'OVULATION CHEZ LA JUMENT ET STIMULER LA PRODUCTION DE TESTOSTÉRONE CHEZ L'ÉTALON L'invention concerne l'induction de l'ovulation chez la jument et la stimulation de la production de testostérone chez l'étalon. Elle a plus particulièrement pour objet un médicament contenant, en tant que principe actif, au moins une choriogonadotropine équine modifiée sur sa partie glycannique. Les choriogonadotropines sont des glycoprotéines qui sont synthétisées chez deux espèces, à savoir les primates dont l'homme, et les équidés. Ces choriogonadotropines s'appellent respectivement choriogonadotropine humaine (hCG) et choriogonadotropine équine (eCG) ou gonadotropine du sérum de jument gravide (Pregnant Mare Serum Gonadotropin : PMSG). Dans les espèces autres que la sienne, la eCG présente une double activité d'hormone lutéinisante (LH) et d'hormone folliculostimulante (FSH). Cette caractéristique associée au fait que l'a eCG présente une demi-vie plus longue que celles de la LH et de la FSH explique son très grand intérêt zootechnique. De fait, son activité hormonale est utilisée dans le monde entier dans des traitements de synchronisation des chaleurs des femelles ainsi que dans des traitements d'induction de superovulation dans de nombreuses espèces. Dans sa propre espèce, la eCG native présente une activité FSH nulle et une activité LH très faible qui est d'environ 4% de celle de la LH équine selon les travaux de F. Stewart et coll., J. Reprod. Fert., Suppl. 27 (1979), 431-440 et de F. Guillou et coll., Biochem. et Biophys. Acta, 755 (1983) 229236. Jusqu présent elle n'a donc pu être utilisée dans sa propre espèce et chez la jument aucune ovulation n'a jamais été obtenue en utilisant de la eCG native. Chez la jument, l'induction de l'ovulation est habituellement obtenue soit indirectement par implant de facteur libérant l'hormone lutéinisante (Luteinizing Hormone Releasing Factor RHLH) qui stimule le pic de eLH, soit directement avec un extrait hypophysaire équin contenant de la eLH, soit encore par injection de hCG. Chez l'étalon, la stimulation de la production de testostérone, utilisée pour tester son aptitude à produire de la testostérone et donc son aptitude à se reproduire, est obtenue par injection de hCG. Toutes ces méthodes présentent des inconvénients. En effet, l'implant de LHRH est une technique indirecte et qui demande un minimum de savoir-faire pour poser l'implant, l'utilisation d'extrait hypophysaire présente un risque de contamination virale ou par prion et la hCG risque d'induire la production d'anticorps. Le but de l'invention est de fournir un médicament vétérinaire dont le principe actif a une demi-vie suffisamment prolongée dans l'organisme des équidés pour qu'une seule injection suffise et qui ne présente aucun des inconvénients énumérés ci-dessus. Selon l'invention, on a maintenant trouvé que ce but est atteint si on utilise une eCG modifiée de façon particulière. La eCG est une glycoproteine hétérodimère constituée de deux sous-unités associées de façon non covalente, appelées respectivement a et ss. La sous-unité a contient deux sites de N-glycosylation et la sous-unité ss contient un site de N-glycosylation et au moins quatre sites de O-glycosylation situés dans la région C-terminale de la protéine. Il a été démontré [C. H. Hokke et coll., Glycoconjugate J. (1994) ll 35-41] que la eCG possède des structures glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine). Une structure de ce type est représentée ci-après (partie soulignée) L'invention a pour objet un médicament vétérinaire pour induire l'ovulation chez la jument ou stimuler la production de testostérone chez l'étalon, caractérisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, au moins une forme de choriogonadotropine équine (eCG) modifiée qui est, au moins en partie, dépourvue des structures glycanniques de type poly-(Nacétyllactosamine) de l'hormone native. Selon une forme préférée de mise en oeuvre de l'invention, la choriogonadotropine équine (eCG) modifiée utilisée est, au moins en partie, dépourvue des structures O-glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine) de l'hormone native. Plusieurs formes de eCG modifiées par hydrolyse plus ou moins poussée des structures O-glycanniques de type poly-(Nacétyllactosamine) ont été testées par l'équipe de G. R. Bousfield [V. Y. Butnev, Endocrinology 137(6) (1996), 25302542] afin d'évaluer l'impact de la suppression de ces structures sur l'activité biologique de la eCG et notamment sur ses activités LH et FSH. Les travaux de cette équipe concernent l'étude de l'affinité de fixation aux récepteurs LH et FSH de testicules de rat et de poulet. Dans l'article publié par cette équipe, il est indiqué que l'augmentation de la glycosylation diminue l'affinité avec lesdits récepteurs mais aucun essai sur des cellules ou in vivo, même avec ces espèces chez lesquelles l'eCG native est active, n'est décrit. Or comme il a été indiqué plus haut, dans sa propre espèce l'eCG native présente une activité FSH nulle et une activité LH très faible, de sorte qu'on ne pouvait envisager de l'utiliser chez les équidés. De fait, jusqu'à présent aucune ovulation n'a été obtenue chez la jument en utilisant de la eCG native. La connaissance de cet article pouvait donc éventuellement inciter l'homme du métier à tester des formes de eCG modifiées, au moins partiellement dépourvues de structures O-glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine) sur des espèces pour lesquelles il était connu que l'activité hormonale LH et FSH était augmentée sous l'effet de la eCG native. En revanche, la connaissance de cet article qui décrit des résultats obtenus sur des modèles de récepteurs de rat et de poulet, n'incite d'aucune manière l'homme du métier à utiliser des formes de eCG modifiées de ce type pour induire l'ovulation chez la jument ou stimuler la production de testostérone chez l'étalon puisque ces animaux appartiennent à une espèce pour laquelle il est bien connu que l'activité FSH de la eCG native est nulle et son activité LH très faible. De plus, des essais de venue des chaleurs et d'ovulation chez la brebis, effectués par le Demandeur en comparant la eCG native et une de ses formes modifiées définies plus haut, avaient montré que les deux hormones présentent sensiblement la même activité d'induction de l'ovulation et qu'il semblait même qu'à dose égale l'activité de l'hormone modifiée soit légèrement inférieure. Ces essais confirment donc le caractère inattendu de l'induction de l'ovulation chez la jument chez qui, contrairement à la brebis, aucune ovulation n'est obtenue avec l'hormone native. Les eCG modifiées utilisées selon l'invention peuvent être obtenues notamment par hydrolyse plus ou moins complète des structures glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine) au moyen d'une enzyme capable d'hydrolyser les glycannes de ce type. Une enzyme bien connue qui présente cette aptitude est l'endo-ss-D-galactosidase (EBGA, 3.2.1. 103) qui est décrite notamment par M. Fukuda et coll., dans J. Biol. Chem. 259 (1984), 8260-8273 ; E. Spooncer et coll., dans J. Biol. Chem. 259 (1984), 4792-4801 ; P. Scudder et coll., dans J. Biol. Chem. 259 (1984), 6586-6592. Cette enzyme est disponible dans le commerce. D'autres voies d'obtention de ces eCG modifiées peuvent être utilisées par l'homme du métier sur la base de ses connaissances usuelles dans le domaine de la production de substances d'origine biologique modifiées. Pour obtenir ces eCG modifiées au moyen d'une enzyme telle que 1'EBGA, on procède de façon générale comme suit. La eCG - commerciale ou purifiée au laboratoire - est incubée en présence de l'enzyme EBGA. La déglycosylation est suivie par chromatographie d'exclusion de taille HPLC (chromatographie liquide haute pression). Après action de l'enzyme jusqu'au degré de déglycosylation souhaité, la eCG modifiée est aliquotée sous forme de doses unitaires d'environ 20 000 unités dans 10 ml, puis congelée à -200C jusqu'à son utilisation. Le médicament vétérinaire selon l'invention peut être administré à la jument ou à l'étalon par voie intramusculaire ou intraveineuse. La voie intramusculaire est préférée. Ce médicament peut se présenter notamment sous forme d'une solution pour injection. I1 se présente de préférence sous forme d'une dose unitaire permettant d'effectuer le traitement en une seule application. Pour l'induction de l'ovulation chez la jument, une dose unitaire contient avantageusement de l'ordre de 20 000 unités de eCG modifiée, une unité de eCG modifiée correspondant, par dosage immunologique, à une unité de eCG native. Pour l'injection intramusculaire, la dose unitaire peut être constituée d'une solution de 20 000 unités de eCG modifiée, dans du sérum physiologique. Le demandeur, en utilisant un modèle expérimental porcin qui lui permet de réaliser l'injection des hormones natives et des hormones modifiées qu'il teste, puis de prélever le sang régulièrement et ainsi de mesurer la cinétique de disparition de l'hormone considérée dans le sang, a pu démontrer que la demi-vie de la eCG modifiée est identique à la demi-vie, de longue durée, de la eCG native. Cette caractéristique est très importante puisqu'elle permet à la eCG modifiée d'être disponible et donc active sur une période prolongée. PARTIE EXPÉRIMENTALE Exemple 1 Prénaration d'une eCG modifiée nar hvdrolvse de la eCG native au moven de l'EBGA La eCG lyophilisée est reprise dans du tampon acétate de sodium 0,1 M, pH 5,50 à une concentration de 10 mg de protéines par ml de tampon. L'EBGA est ajoutée à raison de 10 mU par mg de proteines. L'incubation a lieu à température ambiante pendant 24 heures. L'analyse est effectuée par HPLC en chromatographie d'exclusion de taille et éventuellement dosage des fractions obtenues afin de vérifier l'augmentation du temps de rétention de la eCG modifiée, ce qui prouve que la déglycosylation a bien eu lieu. Exemple 2 Induction de l'ovulation chez la jument Une quantité de eCG modifiée obtenue selon l'exemple 1, équivalente à la quantité de eLH utilisée couramment soit 20 000 unités par jument (la eCG et la eLH ont une même structure peptidique ce qui fait que l'on retrouve, par dosage immunologique, la même quantité une unité de eCG équivaut à une unité de eLH) et qui donne 100% d'ovulation, a été injectée à cinq ponettes en présence d'un follicule préovulatoire de 33 à 36 mm de diamètre. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant Numéro Injection Taille Date Nombre Heure ponet- folli- ovula- d'ovula- échogra te. cules tion tions phie Date Heure W388 13/06/96 llh45 35 15/06/96 1 9h W225 14/06/96 llh40 34-30 16/06/96 2 7h40 W380 14/06/96 llh40 36 18/06/96 1 9h W263 13/06/96 llh45 33 15/06/96 1 9h15 W373 17/06/96 lOhl5 33 19/06/96 1 9halo Conclusion Les juments finissent presque toujours par ovuler - sans stimulation - dans un délai de 1 à 5 jours. La grande variabilité de ce délai est un inconvénient, c'est pourquoi on cherche à contrôler le moment de l'ovulation par des traitements, par exemple par injection de eLH ou, comme ici, de eCG modifiée. L'ovulation provoquée doit avoir lieu dans les 48 heures, sinon il peut s'agir d'une ovulation spontanée. D'après le tableau ci-dessus, on constate que toutes les ponettes ont ovulé dans un délai de 48 heures, sauf la ponette W380. On peut donc en conclure qu'avec la eCG modifiée, il y a eu ovulation dans 80% des cas. REVENDICATIONS 1. Médicament vétérinaire pour induire l'ovulation chez la jument ou stimuler la production de testostérone chez l'étalon, caractérisé en ce qu'il contient, en tant que principe actif, au moins une forme de choriogonadotropine équine (eCG) modifiée qui est, au moins en partie, dépourvue des structures glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine) de l'hormone native. 2. Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que la choriogonadotropine équine (eCG) modifiée utilisée est, au moins en partie, dépourvue des structures O-glycanniques de type poly-(N-acétyllactosamine) de l'hormone native. 3. Médicament vétérinaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une solution pour injection par voie intramusculaire ou veineuse. 4. Médicament vétérinaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une dose unitaire permettant d'effectuer le traitement en une seule application. 5. Médicament vétérinaire selon la revendication 4, caractérisé en ce que la dose unitaire pour induire l'ovulation chez la jument contient 20 000 unités de eCG équivalant à 20 000 unités de eLH. 6. Utilisation d'au moins une forme de choriogonadotropine équine (eCG) modifiée qui est, au moins en partie, dépourvue des structures glycanniques, notamment O-glycanniques, de type poly-(N-acétyllactosamine) de l'hormone native, pour l'obtention d'un médicament vétérinaire pour induire l'ovulation chez la jument. 7. Utilisation d'au moins une forme de choriogonadotropine équine (eCG) modifiée qui est, au moins en partie, dépourvue des structures glycanniques, notamment O-glycanniques, de type poly-(N-acétyllactosamine) de l'hormone native pour l'obtention d'un médicament vétérinaire pour stimuler la production de testostérone chez l'étalon.