Brevet FR2765591A1 — publié le 19990108

La présente invention concerne un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer. La maladie d'Alzheimer est une démence neurodégénérative caractérisée par une perte de neurones corticaux associée à des plaques f3- amyloïdes, des enchevêtrements de neurofibrilles et, dans la plupart des cas, une angiopathie amyloïde. Il existe de fortes présomptions pour une influence génétique dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer (WO 94/01772). Cette composante génétique a été mise en évidence depuis de nombreuses années par des observations indirectes qui suggèrent une 0o hérédité sur le mode autosomique dominant et une pénétrance dépendante de l'âge pour expliquer certaines formes familiales de la maladie d'Alzheimer. Des études de génétique moléculaire récentes ont permis d'isoler des gènes putatifs de la maladie d'Alzheimer par la recherche de marqueurs génétiques polymorphes spécifiques de chromosomes (Bird et al., 1989, Neurobiology of Aging 10, 432-434). Quatre localisations chromosomiques ont été décrites comme étant impliquées: trois sur les chromosomes 1, 14 et 21 dans les formes familiales à survenue précoce (âge de survenue inférieur à 60 ans), et une sur le chromosome 19 dans les formes familiales et sporadiques à survenue tardive. Deux études de liaison ont suggéré que la région chromosomique 19q13.2 était associée à des formes de maladie d'Alzheimer familiales à survenue tardive (Pericak-Vance et ai, Am. J. Hum. Genet. (1991), 48, 1034- 1050). Au sein de cette région chromosomique, le groupe de gènes d'apolipoprotéines (APO) E-CI-C6'-CII est une zone candidate. Parmi les produits de ces gènes, I'apolipoprotéine E (APOE) est particulièrement impliquée dans le système nerveux APOE est présente dans les plaques séniles et possède une affinité de liaison avec le peptide A13. L'APOE se caractérise par trois allèles majeurs s2, s3, ú4. Strittmatter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90, 177-181) ont décrit une fréquence augmentée de l'allèle s4 du gène APOE dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive. Cette observation a été confirmée pour les formes familiales (Corder et ai., Science (1993), 261, 921-923) et les formes sporadiques de la maladie d'Alzheimer (Corder et ai., Science (1993), 261, 921-923; Saunders et ai., Neurology (1993), 13, 1467-1472). FR-2 716 894 décrit un procédé permettant de pronostiquer pour un malade donné les risques de développer la maladie d'Alzheimer par rapport à la population générale. Ce procédé repose sur la mise en évidence des allèles E4 du gène APOE, des allèles courts du marqueur D19S178 et des allèles longs du gène APO CII tous localisés sur le chromosome 19. Plusieurs hypothèses permettent d'expliquer ce phénomène. Des travaux récents des inventeurs auteurs de la présente invention viennent à présent confirmer l'hypothèse de l'existence d'au moins une autre mutation fonctionnelle dans la région 19q13.2. En effet, en plus d'un effet fonctionnel propre du polymorphisme de l'apolipoprotéine E, les études des inventeurs montrent des différences de niveaux d'expression significatifs chez les sujets malades par rapport aux témoins sains, ce qui indique qu'une ou plusieurs mutations dans les régions de régulation du gène APOE sont impliquées dans la survenue de la maladie d'Alzheimer. De plus, des différences d'expression relatives sont retrouvées chez les témoins. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence un nouveau polymorphisme dans la région du promoteur du gène codant pour la protéine APOE se trouvant à proximité d'un site de fixation du facteur de transcription LBP1. Pour la détermination de ce polymorphisme, on prendra comme référence la séquence décrite par Paik et al. (1985, Proc. Natl Aca. Sci., vol. 82, p. 3447). Ce polymorphisme a été dénommé par les inventeurs poly LBP1, dans la mesure o il se situe à proximité d'un site de fixation du facteur de transcription LBP1. La mutation mise en évidence se caractérise par la substitution d'une Thymine en Guanine (T -- G) dans la séquence: GGGTGTCTGT(ou G)ATTACTGGG. Les allèles correspondant à ce polymorphisme sont dénommés ci-après T (lorsque la base est la Thymine) ou G (lorsque la base est la Guanine). La détermination de l'allèle peut être réalisée après amplification par PCR de la région d'ADN comprenant ce polymorphisme: - soit en créant dans une des amorces de la PCR un site de clivage pour une enzyme de restriction, n'existant pas chez les individus porteurs d'un des allèles, - soit par une technique d'hybridation utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques des allèles. Les inventeurs ont étudié l'influence du polymorphisme poly LBP1 sur l'expression des allèles du gène de l'APOE et mis en évidence une augmentation de l'effet délétère de I'allèle s4 et de l'effet protecteur de l'allèle s2 lorsque ceux-ci sont associés à l'allèle G. Les inventeurs ont mis en évidence l'influence du nombre de copies de l'allèle G et établi que les individus porteurs des génotypes s464 et TT présentaient un risque moins important que les individus porteurs d'au moins un allèle G et que les individus génotypes s3s4 et GT présentaient un risque plus important de développer la maladie que les individus génotypes s364 et TT. En revanche, l'effet protecteur de l'allèle s2 est renforcé chez les individus porteurs des génotypes 62s3 et GG que chez les individus génotypés 62s3 avec au moins un allèle T. L'invention a ainsi pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E, induisant une modification de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E par rapport à une population témoin ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E. Par diagnostic, au sens de la présente invention, on entend la confirmation d'une mutation dans la région de régulation du gène APOE chez un patient dont le tableau clinique fait état d'une symptomatologie pouvant être attribuée à la maladie d'Alzheimer, ou encore une probabilité accrue chez des sujets de développer la maladie d'Alzheimer par rapport a l'ensemble d'une population, I'accroissement de la probabilité étant statistiquement significative. La région d'ADN chromosomique de régulation du gène APOE est définie de manière large comme étant la région chromosomique 19q13.2 autre que la région codant pour l'apolipoprotéine E (Human Molecular Genetics, 1994, vol. 3, n0 4, 569-574). Avantageusement, la région d'ADN chromosomique dans laquelle on met en évidence une ou plusieurs mutations est située entre le marqueur D19S178 et le gène APOCII, et comprend plus particulièrement les introns et les régions flanquantes du gène APOE, s'étendant sur une distance de 5kb en amont et en aval du gène APOE. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène APOE, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène, la mutation consistant plus particulièrement en le remplacement T --> G dans la séquence définie ci-dessus. L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la détermination du génotype de l'apolipoprotéine E et la recherche d'une mutation du type décrit ci- dessus dans la région de régulation du gène APOE. Conformément à cette méthode de diagnostic, la présence d'au moins un allèle s4 de l'apolipoprotéine E conjointement à l'existence d'une mutation dans la région de régulation du gène APOE, en particulier la mutation définie ci-dessus induisant une modification de l'expression du gène APOE ou une différence d'expression relative des allèles de l'apolipoprotéine E le cas échéant, orientera vers le diagnostic d'une maladie d'Alzheimer chez des patients dont le tableau clinique présente une symptomatologie pouvant être attribuée à une maladie d'Alzheimer ou permettra de classer ses sujets en bonne santé dans une catégorie à risque accru de développer une maladie d'Alzheimer. Par différence d'expression relative des allèles, on entend une différence d'expression d'une allèle par rapport à l'autre, indépendamment du niveau absolu d'expression du gène. La recherche de l'allèle E4 est faite par toute méthode appropriée basée sur la présence d'un résidu ARG en position 112 de l'apolipoprotéine E pour l'allèle s4, d'un résidu CYS en position 158 pour l'allèle s2, par rapport aux résidus CYS et ARG dans ces positions pour l'isoforme s3, la plus répandue. La mise en évidence d'une mutation supplémentaire dans les régions de régulation du gène APOE telles que définies ci-dessus est réalisée par toute méthode appropriée, notamment un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène codant APOE, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comportant simultanément la détermination du génotype de l'apoliprotéine E, la détermination du génotype du polymorphisme poly LBP1, la détermination des allèles du marqueur D19S178 et la détermination de l'allèle du gène APO CII. La présence d'au moins un allèle s4 du gène APOE, d'au moins un allèle court du marqueur D19S178 et d'au moins un allèle long du gène APO CII comme décrit dans FR-2 716 894 et l'existence d'au moins une mutation dans la région de régulation du gène APOE contribueront fortement à orienter le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez des sujets symptomatiques ou constitueront un facteur de risque important chez des sujets asymptomatiques. Dans la mesure o la (les) mutation(s) impliquée(s) dans la maladie d'Alzheimer sont à l'origine d'une variation de l'expression relative des allèles du gène APOE dans le cerveau, il est également possible de déterminer, au lieu de ou en complément d'une mutation dans les régions de régulation du gène APOE définies ci-dessus, le taux d'expression du gène APOE dans le cerveau et de comparer ce taux d'expression à celui de la population générale. La méthode de diagnostic basée sur la détermination du taux d'expression de l'apolipoprotéine E est particulièrement intéressante chez les sujets hétérozygotes porteurs de l'allèle s4. Chez ces sujets, la méthode de diagnostic au sens de l'invention comprend avantageusement la détermination du taux d'expression de l'allèle s4 par rapport à l'allele s2 ou s3. Une augmentation significative du taux d'expression/de o0 transcription de l'allèle E4 chez un sujet hétérozygote s4s2 ou s4s3, présentant par ailleurs un tableau clinique évoquant la symptomatologie de la maladie d'Alzheimer orientera le diagnostic dans ce sens, alors que cette augmentation chez un sujet ne présentant pas de signes cliniques apparents sera une indication d'une probabilité accrue chez ce sujet de développer ultérieurement la maladie d'Alzheimer. La détermination du taux d'expression du gène APOE, notamment de l'allèle s4 du gène APOE est réalisée avantageusement par mesure du taux relatif des ARNm du gène APOE dans le cerveau, et notamment en établissant le rapport de transcription de l'allèle s4 par rapport à I'allèle s2 ou s3. Le taux de transcription de l'ARNm est réalisé par extraction de l'ARNm, par exemple par biopsie des lobes frontaux et amplification par RT- PCR (Réaction de Polymérisation en chaîne par transcription inverse), à l'aide d'amorces appropriées spécifiques de l'allèle dont on recherche le taux d'expression. Au lieu de pratiquer une biopsie du cerveau, il est également possible de déterminer le taux de transcription de l'ARNm dans des fibroblastes qui constituent un autre moyen de déterminer l'expression relative des ARN de l'APOE. Le rapport de l'expression des allèles du gène APOE est déterminé de la manière suivante: a) on soumet l'ADNc à une amplification par PCR en présence d'amorces permettant l'amplification spécifique d'au moins une séquence polymorphe des allèles; b) on soumet l'ADN amplifié à l'action d'au moins une enzyme de restriction, permettant la différenciation des allèles c) on sépare les fragments d'ADN; d) on évalue la quantité de fragments obtenus au moyen d'un marqueur émettant un signal détectable; e) on détermine le rapport initial en les différents allèles, par la o10 formule suivante: No allèle 1 A 1'allèle 1 No allèle 1 + No alile 2 Aî'allèle 1 + Callèle 2 dans laquelle No est le nombre initial de molécules d'ADN, A est le coefficient de proportionnalité permettant de corriger la différence de taille entre les différents fragments de restriction et est égal au rapport des longueurs de fragments de restriction caractéristiques de chaque allèle, et oa' est déterminé À soit par la formule suivante: c ' DO x K' dans laquelle DOmax est la densité optique maximale qui peut être mesurée, K est une constante, DOmax et K' étant déterminés par la fonction f suivante: DOrV DO =f(V)= -m'+Vx ' V (K'+V)' dans laquelle V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et DO est la densité optique mesurée; * soit par la fonction g suivante: 1 = ( = 1 1 1 DO -Vg) 'V DOn,Ux tO D dans laquelle DO est la densité optique mesurée, V est le volume de l'échantillon obtenu par PCR soumis à l'étape c) et DOmax est la densité optique maximale qui peut être mesurée; le coefficient d'amplification E1 de l'ADN contenant l'allèle 1 étant identique au coefficient d'amplification E2 de l'ADN contenant l'alltle 2, pour les différents allèles de l'APOE. L'ADN amplifié dans l'étape a) est selon l'invention un ADNc comprenant les séquences alléliques d'intérêt, obtenu à partir d'ARNm par la technique usuelle de RT-PCR. Les allèles sont différenciés selon les étapes b) et c) décrites ci-dessus, qui mettent en évidence les polymorphismes de restriction (RFLP). La séparation des fragments d'ADN selon l'étape c) peut être réalisée notamment par électrophorèse sur gel, préférentiellement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Dans le cas du gène APOE, les allèles E3, s2 et s4 peuvent être caractérisés par des fragments de restriction respectivement de 91 pb, 83 pb et 72 pb. Le coefficient de proportionnalité A peut donc être calculé comme étant A= 91/72 pour les allèles s3/s4, A étant 83/72 pour les individus ú2/ú4 et A étant 91/83 pour les individus s2/s3. Pour ce dernier génotype, puisque les deux allèles E2 et s3 donnent une longueur de fragment de restriction de 91 pb, on a la relation ADOalol 1 + DOaele2 = DO91 pb. Cette méthode est en outre particulièrement simple. Il suffit, en effet, soit de reporter la valeur de la densité optique (DO) en fonction du volume V de l'échantillon, la courbe représentative de la fonction f telle que DO = f(V) pouvant être tracée en utilisant la méthode des moindres carrés, et de déterminer DOm,x et K à partir de cette courbe; soit de reporter la valeur 1/Do en fonction de l'inverse du volume de l'échantillon, à savoir 1N, la courbe Io représentative de la fonction g telle que = g pouvant être tracée par régression linéaire, la pente de la droite obtenue étant égale à l'inverse de a'. L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant les déterminations de la phase des polymorphismes s et polyLBP1 du gène APOE. Au niveau de la population génotypée s3s4, le risque associé au génotype GT est supérieur à celui associé au génotype GG. Cette observation pourrait être expliquée en tenant compte de la phase des polymorphismes PolyLBP1 et s2, E ou s4 de l'APOE. En effet, au niveau des hétérozygotes GT et s3s4, le risque de développer la maladie dépend de l'association de l'allèle G et de l'allèle s4 sur le même chromosome, déterminant ainsi la phase des polymorphismes s et polyLBP1 de l'APOE. Suivant cette phase, deux possibilités existent: (i) un taux d'expression plus important de s4, (ii) un taux d'expression plus important de l'allèle s3. La première possibilité entraînerait une réponse physiologique en faveur des propriétés de l'isomorphe APOs4 et expliquerait un effet plus marqué au niveau des individus porteurs de génotypes s3s4 et GT. Cette différence du taux d'expression liée à la phase sera vraie pour tous génotypes hétérozygotes. Cependant, le risque associé à l'allèle G est probablement atténué en raison des différentes combinaisons possibles entre les polymorphismes ú et polyLBP1 de l'APOE. Conformément à l'invention la phase des polymorphismes de l'APOE et de polyLBP1 est étudiée de la manière suivante: Un fragment de 4600 pb contenant les polymorphismes E de l'APOE et polyLBP1 est amplifié par PCR. Cette amplification est réalisée en utilisant le kit: extend long template PCR system (Boehringer) avec pour oligonucléotide sens: '-GGGGGAGGTGCTGGAATCT-3' et pour oligonucléotide antisens: '-CAGATGCGTGAAACTTGGTGA-3'. Le produit d'amplification est ensuite digéré par l'enzyme de restriction Afl III, dont le seul site de coupure sur le fragment amplifié permet de différencier l'allèle s4 de l'allèle s3. Après migration du produit de digestion sur gel d'agarose à 0,8 %, I'ADN est transféré sur membrane de nitrocellulose et fixé sous UV. La discrimination entre l'allèle T et l'allèle G est réalisée par un protocole similaire à celui utilisé pour le génotypage par ASO de ce polymorphisme. En fonction des phases des polymorphismes APOE et polyLBP1, il sera possible de définir des sous-groupes de sujets malades et de déterminer pour chaque sous-groupe la thérapie optimale. Ainsi, on sait que les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer ont une prédisposition à répondre à certaines thérapies, notamment aux thérapies de type cholinomimétique en fonction du type et du nombre de copies des allèles du gène de l'APOE. L'invention a donc également pour objet une méthode d'identification de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer susceptibles de répondre à une thérapie donnée, par exemple de type cholinomimétique comprenant: a) la détermination du génotype de l'apolipoprotéine E; b) la détermination du génotype du polymorphisme polyLBP1; et c) éventuellement, la détermination de la phase des polymorphismes de l'apolipoprotéine E et de polyLBP1. On donnera ci-après les résultats d'une étude des taux d'expression des ARNm du gène APOE dans le cerveau. s EXEMPLE 1: Expression dans le cerveau du gène APOE chez des malades atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à des témoins sains 1) Extraction de l'ARN et amplification des transcripts Les tissus ont été choisis chez des témoins âgés de 65 ans ou plus et chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer à survenue tardive, dont le diagnostic a été confirmé par examen neuropathologique, avec des génotypes APOE hétérozygotes. L'extraction de l'ARN a été réalisée sur des échantillons de lobes frontaux telle que décrit dans J. Biol. Chem. 247, 4621-4627 (1972), puis ARN a été digéré par DNase (Eurogentec). La RT-PCR a été effectuée à l'aide des amorces décrites dans J. Lipid. res. 31, 545-548 (1990). La réaction de transcription inverse a été conduite pendant 1h 30 à 37 C, à l'aide de l'amorce F4 (5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-3') à 50 pmolaire avec 1 pg d'ARN total comme matrice pour la transcriptase inverse M- MLV, conformément aux instructions du fabricant (Gibco/BRL). La PCR a été effectuée à 94 C pendant 10 minutes, suivie de 30 cycles à 58 C pendant 1 minute, 72 C pendant 1 minutes et 94 C pendant 1 minute. Le volume réactionnel de la PCR de 25 pIl contenait l'amorce F6 (5'- TAA GCT TGC CAC GGC TGT CCA AGG A-3') à 50 pmolaire, les dNTP à 0,5 mM, du MgCI2 à 0,1 mM, du triton X-100 à 0,1%, du glycérol à 15 % et de la Taq-Polymérase à 0,05 unités (Eurogentec). La méthode de calcul de l'expression différentielle des ARNm est celle décrite ci-dessus. La DO a été estimée par le logiciel lmagemaster (Pharmacia). La longueur des fragments de restriction a été déterminée à 91 pb pour l'allèle s3, 83 pb pour l'allèle s2 et 72 pb pour l'allèle s4. La valeur du coefficient A correspond pour les génotypes s3s4 et s284 à A = 91/72 et A = 83/72 respectivement. La valeur du coefficient A correspond pour les génotypes s2s3 à A=91/83. Le génotype 82s3 est caractérisé par les bandes à 94 et 83 pb. Dans ce cas, étant donné que les deux allèles E2 et c3 donnent des fragments de restriction de 91 pb, AODs2 = ODs3 = OD 91 pb. 2) Résultats Les résultats sont rapportés aux Figures 1 et 2, - la Figure 1 représentant les produits d'amplification par RT-PCR après coloration; la Figure 2 représentant l'expression des ARNm d'individus hétérozygotes E2s3, s3s4 et s2s4 atteints de la maladie d'Alzheimer et de témoins. Le nombre de sujets était de 14 pour les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et 12 pour les témoins. Les résultats montrent que l'expression de l'ARNm de l'allèle s3 était dans tous les cas supérieure à celle de l'ARNm de l'allèle 84, ceci dans tous les cas de figure. Ce résultat est concordant avec les mesures connues des niveaux des protéines APOE trouvés dans les cerveaux des individus dont le génotype a été déterminé. Dans cette étude, il a été montré que le niveau de l'APOE chez les homozygotes s3 était supérieur à celui des hétérozygotes 8384 qui lui-même était supérieur à celui des homozygotes 84. Ajoutés les uns aux autres, ces résultats peuvent suggérer soit qu'il existe une différence de stabilité des différentes espèces d'ARNm ou qu'il existe une variabilité génétique de l'expression des deux allèles en déséquilibre avec le polymorphisme génétique. Toutefois, étant donné qu'il existe de plus une différence claire et consistante dans le rapport d'expression allélique entre les patients et les témoins, la seconde hypothèse est probablement la bonne. Les patients atteints de la maladie d'Alzheimer présentant une expression relative plus élevée de l'ARNm s4 que les témoins (35,4 + 2,6 % contre 23,9 + 1,9 % respectivement; p = 0,001 dans le test de Mann et Whitney). La même tendance était apparente chez les hétérozygotes s2s4, comparée à l'expression allélique de s4 chez les malades et les témoins. Tous ces résultats concordent avec la notion que le risque génétique de développer une maladie d'Alzheimer est au moins en partie corrélé à l'expression de la protéine APOE dans le cerveau. Il semble que les individus hétérozygotes qui expriment une proportion relativement élevée de l'allèle s4 présentent un risque plus élevé de développer la maladie d'Alzheimer que ceux qui expriment une proportion relativement faible. Jusqu'à présent, toutes les hypothèses étaient basées sur le fait 0 que les différents allèles de APOE étaient exprimés de façon équivalente et à des concentrations identiques dans le cerveau. Les résultats de la présente invention montrent pour la première fois que ce n'est pas le cas et que les allèles sont exprimés de manière différente et que cette différence est significativement plus marquée chez les malades atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport à la population témoin. Ces résultats sont en accord avec l'existence d'une mutation dans les régions de régulation du gène APOE contrôlant l'expression de ce gène dans le cerveau. On donnera ci-après les résultats ayant conduit à la mise en évidence du polymorphisme poly LBP1. EXEMPLE 2: Mise en évidence du polymorphisme poly LBP1 1. Séquencaqe de l'APOE Un fragment de 375 paires de bases a été amplifié par PCR avec les amorces pour le brin sens 5'TACTTTCTTTCTGGGATCCAGG 3' et pour le brin antisens 5'ACTCAAGGATCCCAGACTTG 3'. L'amplification est réalisée sur 35 cycles (température d'hybridation des oligonucléotides: 53 C) dans un tampon contenant 1 mM de MgCI2 final. Le fragment obtenu a été séquencé en suivant les conditions décrites dans les kits de prétraitement (US 70993- Amersham) et séquençage (USB-Amersham-T7 PCR product sequencing kit). 2. Détection du polymorphisme poly LBP1 par enzyme de restriction L'amplification d'un fragment de 228 paires de base contenant le polymorphisme poly LBP1 est réalisée durant 40 cycles en présence de 0,5 mM de MgCI2, 0,5 % en DMSO. La température d'hybridation des oligonucléotides est de 53 C. L'oligonucléotide antisens est identique à celui utilisé pour le séquenç,age. L'oligonucléotide sens est le suivant 'AGAATGGAGGAGGGTGCCTG 3'. En caractère gras, est représenté le nucléotide modifié permettant la création d'un site de coupure avec l'allèle G pour l'enzyme de restriction Bstn I. La digestion est effectuée à 60 C toute la nuit. Les produits de digestion sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 12% (acrylamide: bisacrylamide 19:1) et colorés dans un bain de bromure d'éthidium. L'allèle T est caractérisé par un fragment de restriction à 49 pb et lI'allèle G par un fragment de restriction à 31 pb. 3. Détection du polymorphisme par hybridation d'oliqonucléotides spécifiques de chaqcue allèle (Annealinq Specific Oliqonucleotide ou ASO) La technique ASO utilisée pour détecter le polymorphisme poly LBP1 est basée sur le protocole décrit par Tiret et al., (1994, Lancet, vol. 344, 910-913). Les modifications spécifiques à la détection du polymorphisme poly LBP1 concernant les oligonucléotides et les températures de lavage sont les suivantes: I'oligonucléotide spécifique de l'allèle G a pour séquence 'GCCCAGTAATCCAGACACCC 3' avec une température de lavage 61 C, I'oligonucléotide spécifique de l'allèle T a pour séquence 5' GCCCAGTAATACAGACACCC 3' avec pour température de lavage 62 C. Les inventeurs ont utilisé les méthodes décrites à l'exemple 2 pour tester l'impact des allèles T, G et s de l'APOE dans une étude de population cas-témoins comportant 276 sujets affectés de formes sporadique précoces et tardives de la maladie d'Alzheimer et 308 témoins afin de déterminer si ce polymorphisme était susceptible de modifier le taux d'expression des allèles de l'APOE. L'étude des allèles s2, s3 et s4 du gène de I'APOE a été effectuée selon la technique décrite par Hixon et Vernier (J. Lipid. Res., 1990, vol. 31, 545-548) et celle du nouveau polymorphisme poly LBP1 par les deux techniques décrites précédemment. La tendance à développer I maladie est exprimée par un facteur d'approximation du risque relatif OR (pour "Odds Ratio"). IC représente l'intervalle de confiance à 95 %. Les résultats sont rapportés aux tableaux 1 à 3. La population sélectionnée est adaptée à l'étude de l'impact de I'APOE dans la maladie d'Alzheimer, puisque l'allèle s4 apparaît comme facteur de risque (OR= 4,67 IC 95 % [3,28-6,67], p de liaison marqué entre ceux-ci et les allèles de l'APOE. Afin de supprimer ce biais qui risquait de cacher un effet potentiel du polymorphisme poly LBP1, les inventeurs ont étudié le risque de développer la maladie d'Alzheimer en stratifiant les populations étudiées en fonction du nombre de copies de l'allèle s4, et regardé si ce risque était modifié par ce nouveau polymorphisme. Le pourcentage de l'allèle G chez les individus génotypés 64s4 est augmenté chez les patients (19,3 %) par rapport aux témoins (12,5 %). L'étude du risque de développer la maladie pour les individus génotypés 64s4 par rapport aux individus s3s4, démontre que le risque de développer la maladie pour les individus génotypés s4s4 par rapport aux individus génotypés s3s4 est augmentée de 3,91 fois (IC 95 % [1,31-11,70], p=0,014, tableau 2). Cependant, ce risque varie en fonction du génotype poly LBP1, étant le plus faiblement marqué chez les sujets porteurs des génotypes s4s4 et TT (OR=3,42 IC 95 % [0,97-12,03], p=0,06) et le plus important chez les individus génotypés s4s4 avec au moins un allèle G (OR=5,43 IC 95 % [0, 68-43,40], p=0,09). Ces différentes observations laissent donc supposer que l'allèle G modifierait le risque associé à la présence de deux copies de l'allèle s4. Par ailleurs, I'âge d'apparition de la maladie semble lui aussi être influencé par la présence d'une copie de l'allèle G provoquant un début plus précoce de la maladie (tableau 3). Un effet similaire de l'allèle G est retrouvé au niveau du risque de développer la maladie pour les individus de génotype s3s4 par rapport aux 0 individus de génotype 83s3. De la même manière que pour le génotype s4s4, une augmentation du pourcentage de l'allèle G existe entre les populations de malades et de témoins génotypés s3s4 (42,6 % contre 36,1 % respectivement). Les individus génotypés s3s4 ont un risque accru de développer la maladie d'Alzheimer par rapport aux individus génotypés s3s3 (OR=3,49 IC 95 % [2,33-5,22], p [1,05-3,35], p=0,035, tableau 3). Cependant, le risque de développer la maladie d'Alzheimer associé à l'allèle G au sein des individus s3s4 diffère en fonction du nombre de copies de l'allèle G. Par rapport aux individus génotypés s3s3, les individus génotypés s3s4 et GT ont un risque plus important de développer la maladie (OR=4,86 1C 95 % [2,86-8,28], p individus génotypés c3c4 et TT. Ainsi, au sein de la population s3s4, posséder une copie de l'allèle G (c'est-à-dire être hétérozygote pour cet allèle) s'exprime par un risque accru de développer la maladie par rapport aux individus de génotype TT (OR=2,14 IC 95 % [1,03-4,46], p=0,04, tableau 3). Cette observation est confirmée sur une population plus importante de témoins et de malades génotypés s3e4 (OR=2,09 IC 95 % [1,13-3,84], p=0,018: tableau 3). Par ailleurs, la variation du risque en fonction du génotype poly LBP1 se répercute au niveau des âges d'apparition de la maladie. En effet, les patients porteurs des génotypes s3s4 et GT développent en moyenne la maladie 1,1 an plus tôt que les patients porteurs des génotypes s3s4 et GG (p=0,65) et 2,9 ans plus tôt que les patients porteurs des génotypes s3s4 et TT (p=0,13). Lorsqu'on agrandit la population étudiée des sujets génotypés s3s4 (tableau 3), les patients porteurs des génotypes s3s4 et GT développent la maladie 1,7 ans plus tôt que les patients porteurs des génotypes s3s4 et GG (p=0,40) et de façon significative, 3,4 ans plus tôt que les patients porteurs des génotypes ú364 et TT (p=0,04). L'âge d'apparition de la maladie est plus précoce de 1,7 ans chez les individus génotypés ú3s4 et GG par rapport aux individus génotypés s3s4 et TT (tableau 3). Toutes ces observations indiquent que l'allèle G accentue le risque associé à l'allèle s4, et ceci quel que soit le nombre de copies de l'allèle s4. Ceci est compatible avec une modification du taux d'expression des allèles de l'APOE. Si l'allèle G provoque une modification du taux d'expression des allèles de l'APOE, une relation similaire entre l'allèle G et le génotype s2s3 devrait être observée, I'allèle G favorisant alors l'effet protecteur de l'allèle s2 (ou alors l'allèle T devrait être associé à une augmentation du risque de développer la maladie d'Alzheimer). Une diminution de la fréquence de l'allèle G est observée chez les patients (70 %), comparée à celle des témoins (78,7 %). L'étude de l'impact du polymorphisme poly LBP1 sur le risque de développer la maladie pour les individus de génotype s2s3 par rapport aux individus génotypés 63s3 (tableau 2) montre un effet protecteur plus marqué chez les individus porteurs des génotypes s2s3 et GG (OR=0,27 IC 95 % [0,08-0,84], p=0,02 avec correction de Yates) que chez les individus génotypés s2ú3 avec au moins un allèle T (OR=0,67 IC 95 %[0,23-1,92], p=0,57 avec correction de Yates). Cette différence est significative (p=0,01 avec test de Fisher, tableau 3). De plus, comme pour les autres génotypes étudiés, le génotype poly LBP1 semble aussi influencer l'âge d'apparition de la maladie chez les patients génotypés s2s3 (tableau 3). Ainsi, I'allèle G agit comme un facteur de risque lorsqu'il est associé à l'allèle s4 et a un effet protecteur lorsqu'il est associé à l'allèle s2. Ces résultats suggèrent que ce nouveau polymorphisme pourrait amplifier les effets des isoformes de l'APOE en modifiant le taux d'expression de chacun des allèles. Les résultats des inventeurs montrent qu'une modification du taux d'expression des allèles s de l'APOE existe dans le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux témoins. Cette observation suggère que des mutations dans le promoteur de l'APOE sont susceptibles d'entraîner cette modification. Les résultats ayant abouti à la découverte d'un nouveau polymorphisme appelé poly LBP1 qui renforce l'impact des différents alleles de l'APOE sur le risque de développer la maladie d'Alzheimer serait au moins en partie responsable de la différence d'expression observée. Cette hypothèse est renforcée par le fait que l'allèle G semble influer sur l'âge d'apparition de la maladie quel que soit le génotype étudié (tableau 3) laissant supposer un rôle physiologique de ce polymorphisme. TABLEAU 1: Fréquence allelique et distribution génotypique du polymorphisme poly LBP1 dans une population de sujets affectés de la maladie d'Alzheimer et une population de témoins Fréquence Distribution génotypiqueb alléliquea (nbre d'individus) Rapport Age + n femme/homme Ecart-typec allèle T allèle GGG GT TT Témoins 308 62,5 % 73,6 +11,0 0,469 0,531 98 131 79 Patients 276 67,5 % 74,5 + 9,3 0,534 0,466 56 145 75 p = 0,02 p = 0,005 C p = 0,24 (o TABLEAU 2: Etude de l'impact du polymorphisme poly LBP1 sur le risque de développer la maladie d'Alzheimer en fonction du nombre de copies des allèles P4 et 2 Risque associé à une copie de l'allèle ú4 entre Risque associé à une copie de l'allèle ú4 Risque associé à une copie de l'allèle E2 entre les génotypes E4c4 et ú3&4 en fonction du entre les génotypes ú3ú4 et ú3ú3 en les génotypes ú2ú3 et c3r3 en fonction du polymorphisme polyLBP1 fonction du polymorphisme polyLBP1 polymorphisme polyLBP1 Total TT GT + GG Total TT GT + GG Total GG GT + TT oC ORa 3,91 3,42 5,43 3,49 2,21 4,48 0,43 O.27a 0.67 IC 95 % [1,31-11,70] [0,97-12,06] [0,68-43,40] [2,33-5,22] [1,224, 00] [2,75-7,18] [0,19-0,92] [0,08-0,84] [0,23-1,92] p 0,014 0,06 0,09 TABLEAU 3: Impact du polymorphisme polyLBP1 sur le risque de développer la maladie d'Alzheimer en fonction du génotype APOE et effet sur l'âge d'apparition de la maladie Génotype s2F3 Génotype F44 Génotype E3s4 Population F3F4 P=10, T=40 P=31, T=4 P=108, T=58 agrandie P = 132, T=98 Génotype OR Age OR Age OR Age OR Age polyLBP1 d'apparition d'apparition d'apparition d'apparition TT - 1 68,4 + 5,2 1 72,0 + 8,4 1 73,6 + 8,3 GT 8,31a 66,0 + 8,1 1,65 65,1 +4,0 2,15b 69,1 +8, 1 2,09c 70,2+8,1 GG 1 69,3 + 8,6 66,0 1,61 70,2 + 7,3 1,31 71,9 + 8,1 P = patients atteints de la maladie d'Alzheimer T = témoins r O') a p=0,01 test de Fisher cn b REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E, induisant une modification de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E par rapport a une population témoin ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E. 2. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 1, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région chromosomique 19q13.2, induisant une différence de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E ou une différence de l'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E, à l'exception de la région d'ADN chromosomique codant pour l'apolipoprotéine E. 3. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN chromosomique située entre le marqueur D19S178 et le gène APO CII, à l'exception de la région d'ADN chromosomique codant pour l'apolipoprotéine E. 4. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans les introns et les régions flanquantes du gène de l'apolipoprotéine E, s'étendant sur une distance de 5kb en amont et en aval du gène APOE. 5. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant la mise en évidence d'au moins une mutation dans le promoteur du gène de l'apolipoprotéine E, située à 186 bases de la boîte TATA de ce gène. 6. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 5, caractérisé en ce que la mutation consiste en: GGGTGTCTG(T-> G)ATTACTGGG 7. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mutation est mise en évidence: - soit en créant dans l'une des amorces d'amplification par PCR de la région polymorphique un site de clivage pour une enzyme de restriction n'existant pas chez les individus porteurs d'un des allèles, - soit après amplification par PCR de la région comprenant ce polymorphisme par une technique d'hybridation utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques des allèles. 8. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par les étapes suivantes: a) détermination du génotype de l'apolipoprotéine E, notamment de l'allèle ú4, b) mise en évidence d'une mutation, notamment de type induisant une modification de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E ou une modification de l'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E dans la région d'ADN génomique de régulation de l'expression du gène de l'apolipoprotéine E, en particulier une mutation telle que définie aux revendications 2 à 6. 9. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par les étapes suivantes: a) détermination du génotype de l'apolipoprotéine E, b) détermination du génotype du polymorphisme polyLBP1. 10. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en outre par les étapes suivantes: c) détermination du génotype du marqueur D19S178, d) détermination du génotype du gène APO CII, 11. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer consistant à déterminer le taux de transcription du gène de I'apolipoprotéine E chez un individu, notamment de l'allèle ú4, et à le comparer aux taux de transcription de la population témoin de même génotype, ou à déterminer le taux d'expression relative des allèles du gène de l'apolipoprotéine E. 12. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer selon la revendication 8, consistant à déterminer les rapports des taux de transcription de l'allèle E4 par rapport aux allèles s2 ou E3, chez un même individu. 13. Procédé de diagnostic de la maladie d'Alzheimer comprenant les déterminations de la phase des polymorphismes s et polyLBP1 du gène de l'apolipoprotéine E. 14. Méthode d'identification de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer susceptibles de répondre à une thérapie donnée, par exemple de type cholinomimétique comprenant: a) la détermination du génotype de l'apolipoprotéine E; b) la détermination de l'allèle du polymorphisme polyLBP1 et du nombre de copies de cet allèle; et c) éventuellement, la détermination de la phase des polymorphismes de l'apolipoprotéine E et du polyLBP1.