Brevet FR2762593A1 — publié le 19981030

La présente invention a trait à un procédé permettant la réduction ou la suppression de la formation de films, mucilages ou dépôts dans des installations en circuit fermé, telles que, notamment, les installations de l'industrie papetière, par exemple, les machines à fabriquer le papier. Par installation d'eau en circuit fermé on entend, dans le sens de la présente invention, des installations dans lesquelles un circuit d'eau parcourant l'installation est recyclé totalement ou partiellement, notamment dans un but d'économie de consommation d'eau et de préservation de l'environnement. On sait que dans les installations de ce genre, telles que les machines à papier ou les circuits d'eau de refroidissement de différentes installations, il se forme progressivement des films, dépôts ou mucilages d'origine bactérienne générés par des bactéries sessiles qui se développent progressivement grâce aux conditions favorables qu'elles rencontrent (température, pH, présence de substances minérales et organiques, notamment produits d'hydrolyse de la cellulose). La formation de ces matières présentent de nombreux inconvénients Ainsi dans les machines à papier les dépôts finissent par se détacher de la surface sur laquelle ils sont fixés et s'incorporent dans le papier qui devient donc inutilisable La machine doit alors être arrêtée et nettoyée, avec un coût considérable, mais, même dans une machine parfaitement nettoyée, les bactéries, en provenance de l'environnement, finissent par se développer à nouveau et générer ces dépôts Un procédé usuel consiste à éliminer les bactéries à l'aide de biocides. Ce procédé est efficace mais se heurte de plus en plus à des contraintes d'environnement, en raison de la toxicité des biocides. D'autres procédés consistent à ajouter des lignosulfonates ou des enzymes. Ces procédés sont cependant relativement coûteux et peuvent être gênants lorsque les substances sont relâchées dans l'environnement. Un autre procédé, décrit dans EP-A-O 372 520, résout le problème, d'une façon tout à fait différente, par l'adjonction dans le milieu liquide, avant que les dépôts ne se forment, de micro-organismes non sessiles, notamment de bactéries qui, se trouvant dans le milieu favorable du circuit, entrent en compétition avec les bactéries sessiles, ce qui inhibe ou ralentit la formation des dépôts, films ou mucilages Les bactéries préférées sont les bactéries aérobies non sessiles et bien adaptées à un développement rapide dans le milieu considéré, par exemple les préparations bactériennes du commerce déjà utilisées dans le traitement des effluentes de l'industrie concernée, par exemple de l'industrie papetière Ces bactéries peuvent être ajoutées de façon continue ou discontinue, en se basant éventuellement sur la teneur en carbone organique du milieu. Ce procédé présente l'avantage important d'éviter toute utilisation de substance chimique indésirable et d'être parfaitement écologique. EP-A-O 558 360 décrit un perfectionnement de ce procédé, dans le cas particulier de l'industrie papetière, en utilisant des bactéries du genre staphylocoques ou Acinobacter, et notamment Staphylococcus carnosus. Afin d'accroître encore la croissance des bactéries non sessiles ajoutées au circuit et de favoriser la compétition de ces bactéries avec les bactéries sessiles génératrices de dépôts, on a déjà prévu de complémenter le milieu aqueux par des éléments nutritifs adaptés. Ainsi DE-A-4 331 022 prévoit d'augmenter et d'ajuster la teneur des eaux des circuits fermés en azote et phosphore assimilables par les bactéries EP-A-O 673 886 prévoit également de complémenter les eaux par différents nutriments favorisant la croissance des micro-organismes non sessiles, notamment à base d'azote, de phosphore, de soufre, de carbone ou de différents éléments minéraux Ces procédés de complémentation présentent cependant l'inconvénient de devoir contrôler la teneur des eaux en substances nutritives et d'ajouter de telles substances qui, étant progressivement consommées ou perdues, notamment dans les circuits incomplètement fermés, finissent par entraîner un surcout important comparé à la simple adjonction de micro-organismes sans complémentation La présente invention se propose d'éviter tous ces inconvénients et d'améliorer encore l'efficacité de l'adjonction dans le circuit, en vue de la réduction de la formation des dépôts, de bactéries non sessiles limitant, par compétition, la formation des dépôts ou films de mucilage par les bactéries sessiles, dans les eaux ayant une teneur substantielle en carbone organique assimilable. Comme exemples d'eaux à teneur élevée en carbone organique assimilable on peut citer, notamment, les circuits de l'industrie papetière, dans lesquels l'hydrolyse de la cellulose conduit à des teneurs importantes en glucose et sucres rapidement assimilables par les micro-organismes. L'invention a pour objet un procédé de suppression ou de diminution de la formation des dépôts, films ou mucilages dans les eaux de circuits fermés à teneur élevée en carbone assimilable, par addition de micro-organismes, notamment de bactéries, non sessiles dans les conditions du milieu, de façon à entrer en compétition avec les bactéries génératrices de ces dépôts, films ou mucilages, caractérisé en ce que les micro-organismes ajoutés sont des microorganismes à faible rendement de croissance sur le carbone organique assimilable Par micro-organisme, notamment bactérie, à faible rendement de croissance sur le carbone organique assimilable, on entend des micro-organismes non sessiles qui consomment significativement plus de carbone organique pour leur développement que les micro-organismes ou bactéries usuels. Lorsque l'on considère une biomasse bactérienne habituelle, constituée, par exemple, par l'une quelconque des différentes bactéries enumérées dans les différents documents précités, on constate que les proportions respectives des éléments principaux constitutifs de la biomasse sèche peuvent s'écrire selon la formule C5H,NO2P"., . On voit que dans cette formule les facteurs limitants de la croissance de la masse bactérienne sont constitués par l'azote et le phosphore, les autres éléments étant, dans les eaux d'installation en circuit fermé considérées, disponibles en excès par rapport à ces deux éléments Seule une fraction du carbone organique assimilable consommé est incorporé à la biomasse, I'autre étant oxydé pour la production d'énergie nécessaire aux réactions biochimiques de biosynthèse. On peut donc déterminer les rendements de croissance de la masse bactérienne, c'est-à-dire la quantité de biomasse formée par rapport à la quantité de carbone organique assimilable consommé Dans les eaux blanches de l'industrie papetière le carbone organique assimilable se présente essentiellement sous forme de glucose provenant de l'hydrolyse de la cellulose et de l'amidon. L'analyse montre que pour les bactéries usuelles les rendements de croissance sur les différents substrats de la croissance sont les suivants 0,4 g biomasse/g glucose 8 g biomasse/g azote 36 g biomasse/g phosphore Les consommations spécifiques en substrats, c'est-à-dire l'inverse des rendements peut ainsi être calculées Ainsi, dans le cas des bactéries consommant le glucose, les stoechiométries de consommation de glucose par rapport à l'azote et au phosphore disponible sont 21 g de glucose (ou 8,3 g de carbone) par g d'azote 92 g de glucose (ou 37 g de carbone) par g de phosphore. Conformément à l'invention, on utilise alors des micro-organismes, notamment des bactéries, dont la consommation de glucose, ramenée à j'unité d'azote et/ou de phosphore, est significativement plus importante, et de préférence d'au moins 50 % et plus préférentiellement d'au moins 70 % ou même de 100 % En conséquence, pour la constitution d'une biomasse sensiblement égale à la biomasse constituée par des bactéries non sessiles usuelle, les bactéries utilisées dans l'invention utilisent la meme quantité de carbone pour constituer leur biomasse, mais consomment en outre une quantité significativement accrue de carbone, qui sera éliminé sous forme de gaz carbonique, en raison de leurs rendements réduits dans les réactions de biosynthése Il en résulte que pour une teneur initiale donnée en azote et/ou en phosphore, qui en cas de présence d'un excès de carbone organique, va déterminer le développement et la multiplication des bactéries aussi bien non sessiles que sessiles dans le milieu, la formation de la biomasse des bactéries ajoutées conformément à l'invention va diminuer encore davantage la teneur résiduelle en carbone organique assimilable, qui ne sera donc plus disponible pour que les bactéries sessiles, qui ont réussi à se former, puissent transformer ce carbone en mucilage et en dépôt. L'efficacité de la compétition est donc considérablement augmentée sans qu'il soit nécessaire d'ajouter des substances ou des nutriments, étant entendu que l'adjonction de nutriments, azote, phosphore ou autres peut également être mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention Les bactéries à faible rendement de croissance sur le carbone organique mais métaboliquement actives sont rares dans les conditions naturelles. On peut les obtenir par les moyens suivants - recherche de micro-organismes hétérotrophes aérobies isolés à partir du milieu naturel et présentant les caractéristiques de l'invention, - recherche dans les collections de souches microbiennes officielles ou privées accessibles, - obtention à partir d'une population soumise à l'action d'un agent mutagène, - construction spécifique par des méthodes génétiques, - modification du systéme d'énergie cellulaire bactérienne par des méthodes de biologie moléculaire. Pour l'obtention de ces bactéries, la présente invention fournit également une méthode de test comprenant l'ensemencement et la culture d'une souche candidate dans un milieu de croissance de composition déterminée contenant un excès significatif de carbone assimilable, par exemple de glucose, par rapport aux teneurs en azote et en phosphore déterminant la masse bactérienne qu'il est possible d'obtenir A la fin de la croissance de la biomasse on détermine la concentration résiduelle en carbone organique. Une teneur sensiblement abaissée par rapport à l'équilibre normal signifie que la souche bactérienne est utilisable dans la présente invention De préférence le milieu de croissance est constitué de façon que les concentrations en sources d'azote et de phosphore correspondent, pour des bactéries usuelles, à une consommation totale de l'ordre de 20 à 40 %, de préférence 30 %, du glucose initialement présent Le milieu comprend, bien entendu, différents autres éléments indispensables pour la croissance bactérienne. De préférence, dans le cas de la présente invention, on cible des souches bactériennes déjà bien adaptées au traitement des circuits conformément, par exemple, à EP-A-0 372 250, par exemple des souches appartenant à des microorganismes ou mélanges de micro-organismes usuellement utilisées pour le traitement des effluents de l'industrie papetière. Selon un perfectionnement de l'invention on effectue un traitement de ces souches à l'aide d'un agent mutagène, par exemple par un agent chimique tel que la nitrosoguanidine, suivi d'une séparation des différents clones et puis de la soumission des clones isolés au test par inoculation du milieu de test selon l'invention Une espèce bactérienne particulièrement préférée est Bacillus subtilis. D'autres souches candidates à traiter par mutagenése puis soumission au test selon l'invention sont définies dans les différents documents précités, par exemple Staphylococcus, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus, les entérobactéries, Streptococcus, Alcaligenes, Micrococcus, Aeromonas. De façon particulièrement préférée on traite les bactéries isolées à partir de mélanges bactériens ou de préparations bactériennes du commerce destinés au traitement des effluents de l'industrie concernée, par exemple l'industrie papetière, par exemple du type vendu sous les marques déposées suivantes - DBC+ type A2 - produits de la série BIOSTAT de la société Bevaloid (France) - produits de la série BIOLEN de la société Gamlen Industries, (USA) - produits de la série BI-CHEM, par exemple DC-1005 PC et LC 1005 PC, de la société Sybron (USA) - produits de la série ECOLYTE M.X. de la société Compagnie Française de Produits Industriels, (France) - produits de la série BIOLYTE la Société International Biochemical Limited (USA) De préférence la quantité de micro-organismes ou de bactéries que l'on ajoute au circuit à protéger est proportionnelle à la teneur en carbone organique assimilable, sans que cela soit pour autant une obligation. On préfère ajouter de 10" à 108 bactéries par kilo de carbone organique assimilable, ce qui peut correspondre à un poids sec en bactéries de l'ordre de I mg à 100 mg par kilo de carbone organique assimilable. Le cas échéant, le circuit d'eau peut être oxygéné, par exemple par brassage ou amenée d'oxygène ou d'air ou d'autres sources génératrices d'oxygène L'apport des micro-organismes ou bactéries peut être effectué soit périodique, soit d'une façon relativement continue, par exemple chaque heure. Bien entendu lorsque l'installation a été nettoyée, on préfère amener immédiatement une quantité suffisante de micro-organismes pour provoquer une croissance rapide de la biomasse et réduire dès le début du fonctionnement de l'installation la teneur résiduelle en carbone organique disponible. Pour l'apport des bactéries on peut utiliser, par exemple, une installation de distribution de bactéries telle que définie dans EP-A-0 372 roi20. L'apport des micro-organismes ou bactéries selon l'invention à l'installation peut aussi être complété par un apport d'agents classiques utilisé par exemple dans l'industrie papetière, tel que des biocides, lignosulfates, enzymes, etc D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple I - Obtention d'une souche à faible rendement de croissance. On isole, à partir d'un mélange de bactéries du commerce utilisé pour le traitement des effluents cellulosiques, par exemple mélange Biostat ne souche de Bacillus subtilis. On effectue ensuite un traitement mutagène de cette souche de la façon suivante - la souche est mise en croissance en milieu liquide PCA BioMérieux Lorsqu'une masse suffisante est obtenue on lave les cellules en tampon MOPS à pH 7. Les bactéries sont soumises par lots à des traitements mutagénes à 25, 50, 100, 200 et 400 mg/l de nitrosoguanidine pendant 30 minutes à '.0 C et pH 7. Un lot à teneur nulle en agent mutagène sert de témoin - à la fin du traitement les cellules sont lavées en tampon MOPS à pH 7 puis incubées en milieu liquide PCA pour une durée de croissance de trois heures. On détermine la concentration optimale d'agent mutagène par le taux de résistance à l'antibiotique rifamycine 2 mg/l puis l'on conserve les suspensions mutagénéisées à - I 80 C, glycérol 20 % On prépare un milieu liquide de croissance pour la sélection de souches à faible rendement ayant la teneur suivante Glucose 600 mg/l Sulfate d'ammonium 150 mg/l Phosphate monopotassique 30 mg/l Sulfate de magnésium 200 mg/l Chlorure de potassium 200 mg/l Extrait de levure 50 mg/l pH 7 Dans ce milieu une souche de B subtilis non mutagénéisée produit une biomasse correspondant à une consommation de 30 % du glucose initial Dans un tel milieu une diminution du rendement de croissance de 50 % est détectable par un accroissement de la consommation de glucose de l'ordre de 50 % correspondant à une concentration finale en carbone organique résiduelle diminuée de 25 à 30 % L'inoculation du milieu s'effectue à partir d'une préculture réalisée en bouillon trypcase-soja I g/l, ensemencée par une suspension de spores de la souche B subtilis à étudier, et incubée pendant 24 heures à 30 C Pour procéder au test on récupère les cellules mutagénéisées conservées â -180 C, on procède aux dilutions puis étalements sur milieu gélosé PCA de façon à obtenir entre 30 à 50 colonies par boîte Après incubation à 30 C, pendant 48 heures, on procède à un repiquage ordonné des colonies en patch sur milieu gélosé PCA pour une incubation de 48 à 72 heures Les clones peuvent ensuite être mis en conservation à+40C Les différentes colonies des patches peuvent être utilisées pour l'ensemencement du milieu de culture liquide de test. Le clone ensemencé est laissé à incubation sur table d'agitation à 30 C pendant 40 heures On procède ensuite à la centrifugation de la culture puis au dosage de la concentration résiduelle de glucose dans le milieu Les souches sélectionnées à l'issu de ce test peuvent être mises en conservation à long terme sous forme de patches. Un tel procédé a permis l'obtention de clones mutants caractérisés par une surconsommation de glucose de 50 à 70 % par rapport à la souche B subtilis initiale. Exemple 2 Efficacité de la souche sélectionnée en pilote de circuit d'eau blanche L'installation pilote présente les caractéristiques suivantes Température du circuit d'eau 3 70C Température du réacteur (hors eau) 250C Débit d'alimentation en eau blanche 700 ml/j Temps de séjour hydraulique. 30 h Débit de recyclage 300 ml/h L'eau blanche provient d'un circuit d'une machine de fabrication de papier Avant d'être introduites dans le pilote, les souches utilisées sont activées en bouillon trypcase-soja I g/l, inoculé par une suspension de spores conservées à -180 C, I'incubation étant effectuée à 300C pendant 24 heures sur un agitateur rotatif La culture est ensuite additionnée à l'eau blanche dans les pilotes à la dose de 1 %, cinq fois par semaine Trois installations pilotes identiques sont utilisées, I'une ne recevant aucune souche, I'autre recevant le mélange Biostat et le troisième une souche B subtilis sélectionnée à l'issue du test et présentant une diminution de rendement du métabolisme de carbone de l'ordre de 70 % Les dépôts sont observés et prélevés dans les trois pilotes à intervalle 1, 4, 6 et 7 jours puis analysés en microscopie à contraste de phase après coloration à l'encre de chine selon la méthode Duguid (1947) qui permet de quantifier l'étendue des dépôts ainsi que leur composition (cellules bactériennes, mucilages polysaccharidiques, fibres et particules). Dans le pilote témoin on constate une apparition rapide au premier jour de cellules libres entourées d'une capsule de polysaccharide et de biofilms mucilagineux. Ces dépôts croissent continuellement en taille avec accumulation de fibres et capture de particules de carbonate de calcium Les supports ont un aspect visqueux et brillant et fin d'essai. Le pilote ensemencé par le mélange de bactéries Biostat montre un ralentissement de l'apparition des dépôts mucilagineux avec une tendance moins marquée à l'incrustation des particules Dans le pilote ensemencé par la souche B. subtilis, à rendement de croissance diminué, I'apparition de dépôts mucilagineux est considérablement retardée, les premier dépôts apparaissant à quatre jours. En fin d'essai les supports ont un aspect luisant mais sont significativement moins épais. Pour la mise en oeuvre industrielle de l'invention dans une machine à papier, on préférera commencer à ensemencer les eaux blanches de la machine, conformément au brevet EP-A-0 372 320 dès que la machine sera nettoyée. Le circuit des eaux sera alimenté par des eaux dont le taux de contamination sera le plus bas possible; par exemple, par traitement des eaux par un agent désinfectant tel que H202 On préférera poursuivre cet ensemencement initial par l'apport régulier des bactéries comme indiqué dans ce brevet. Bien entendu d'autres agents, tels que des dispersants, enzymes, etc , peuvent être ajoutés au sein des eaux du circuit REVENDICATIONS 1. Procédé de suppression ou de diminution de la formation des dépôts, films ou mucilages dans les eaux de circuits fermés à teneur élevée en carbone assimilable, par addition de micro-organismes, notamment de bactéries, non sessiles dans les conditions du milieu, de façon à entrer en compétition avec les bactéries génératrices de ces dépôts, films ou mucilages, caractérisé en ce que les micro-organismes ajoutés sont des micro-organismes à faible rendement de croissance sur le carbone organique assimilable. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que l'on utilise des micro-organismes, notamment des bactéries, dont la consommation de glucose, ramenée à l'unité d'azote et/ou de phosphore, est significativement accrue d'au moins 50 % et plus préférentiellement d'au moins 70 % ou même de 100 %. 3. Procédé selon l'une des revendications I et 2, caractérisé en ce que l'on ajoute les micro-organismes dans un circuit d'eau préalablement nettoyé 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les micro-organismes sont des bactéries. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la bactérie ajoutée est une souche de B subtilis à faible rendement de croissance sur le carbone 6 Procédé selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que l'on ajoute des micro-organismes, notamment des bactéries, en fonction de la teneur en carbone organique assimilable du milieu aqueux du circuit. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on ajoute entre 10" et 10 s de bactéries par kilo de carbone organique assimilable. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisé en en ce que l'on ajoute également au moins un autre agent de lutte contre les dépôts, films ou mucilages. 9 Procédé de test pour l'obtention de bactéries à faible rendement de croissance sur le carbone organique assimilable, comprenant l'ensemencement et la culture d'une souche candidate dans un milieu de croissance de composition déterminée contenant un excès significatif de carbone assimilable, notamment de glucose, par rapport aux teneurs en azote et en phosphore déterminant la masse bactérienne qu'il est possible d'obtenir, et que l'on détermine la concentration résiduelle en carbone organique à la fin de la croissance de la biomasse. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le milieu de croissance est constitué de façon que les concentrations en sources d'azote et de phosphore correspondent, pour des bactéries usuelles, à une consommation totale de l'ordre de 20 à 40 %, notamment 30 %, du glucose initialement présent. 11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que l'on cible des souches bactériennes déjà bien adaptées au traitement des circuits notamment des souches appartenant à des micro-organismes ou mélanges de micro-organismes usuellement utilisées pour le traitement des effluents de l'industrie papetière. 12. Procédé d'obtention d'une souche de bactérie à faible rendement de croissance sur le carbone assimilable, caractérisé en ce que l'on effectue un traitement de mutagénéisation d'une pluralité de souches à l'aide d'un agent mutagène, suivi d'une séparation des différents clones, puis de la soumission des clones isolés au test par inoculation du milieu de test selon l'une quelconque des revendications 9 à Il