Brevet FR2767924A1 — publié le 19990305

NOUVELLE MÉTHODE DE CRIBLAGE POUR MOLÉCULES ACTIVES DU POINT DE VUE BIOLOGIQUE La présente invention concerne une nouvelle méthode de criblage de composés pour une possible activité biologique. Dans le domaine pharmaceutique ainsi que dans celui de la protection des plantes, il existe un besoin pour de nouveaux autres et meilleurs composés. I1 existe également un besoin pour de nouveaux composés possédant de nouveaux modes d'action. Mme si il existe déjà un grand nombre de composés sur les marchés pharmaceutique et agronomique, le nombre de modes d'action des dits composés existants est généralement limité. De manière à découvrir des composés potentiellement utiles, il existe un besoin d'identifier de nouveaux modes d'action à un stade précoce. De manière à économiser du temps et de l'argent dans le procédé global de criblage, il est préférable de savoir à un stade précoce si le mode d'action est connu et peut etre alors non acceptable mais en revanche, si le mode d'action est nouveau, de poursuivre plus avant sa recherche. Un moyen de répondre aux besoins de découverte précoce du mode d'action est de cribler des composés sur une lignée cellulaire. Il existe des avantages généraux qui s'y rapportent : une lignée cellulaire peut tre cultivée quasiment indéfiniment, afin que les cellules issues de la lignée cellulaire utilisée pour tester les différents composés chimiques pendant plusieurs années ne varient pas dans leur morphologie et ainsi fournissent des résultats consistants, généralement fiables. Un objet de l'invention est de créer une nouvelle méthode de criblage pour trouver des matières actives du point de vue biologique. Un autre objet de l'invention est de créer une nouvelle méthode de criblage pour distinguer les matières actives de celles qui sont inactives. Un autre objet de l'invention est de créer une nouvelle méthode de criblage qui puisse tre automatisee. Un autre objet de l'invention est de créer une nouvelle méthode de criblage qui puisse distinguer un mode d'action d'un autre. Ces objets sont atteints en totalité ou en partie dans la présente invention. Cette invention se rapporte à une méthode de criblage d'un composé pour une propriété biologique qui comprend: (a) contrôle du mouvement d'un groupement de cellules, substantiellement ancré, animé de mouvements spontanés (b) application du composé au dit groupement ; et (c) contrôle du mouvement subséquent des cellules et comparaison du mouvement avant et après application du composé. Généralement, les matières actives possèdent une application pharmaceutique, une application vétérinaire, ou une application comme pesticide. Par le terme "substantiellement ancré" on entend que le groupement de cellules est généralement lié à un milieu de croissance, de préférence un milieu de croissance translucide à la lumière, de préférence encore un milieu de croissance transparent à la lumière, sur lequel les cellules sont mises en culture. Par le terme "groupement", on entend un groupement de plusieurs cellules, de préférence de nombreuses cellules, en conglomérat, qui sont liées par des moyens biochimiques, généralement par des liaisons protéiniques ou des attractions de charges ou des liaisons covalentes. Le groupement comprend des cellules individuelles, des liaisons entre elles ainsi que des conglomérats de cellules individuelles et des liaisons entre des conglomérats individuels. Par le terme "animé de mouvements spontanés", on entend que le groupement de cellules, généralement après une étape de préparation, suit un mouvement généralement périodique sans autre stimulation. Le groupement est généralement dérivé d'une lignée cellulaire continue ou d'une lignée cellulaire immortelle. De préférence, la lignée cellulaire est une lignée cellulaire d'insecte. De préférence encore, le groupement est dérivé d'un disque imaginal d'un oeuf embryonnaire hyménoptère d'un parasitoïde Trichogramma exlguum. Les stocks de cellules sont généralement maintenus a température ambiante. La lignée cellulaire immortelle Trtchogramma est disponible au Département d'Agriculture des États-Unis à Beltsville, MD,USA. Elle est généralement maintenue sous forme de cultures de cellules. Le traitement des cellules par du 20-hydroxyecdysone (20HE) conduit à la différenciation en amas de cellules. La dite différenciation est observée entre environ un et environ cinq jours après le traitement. Le traitement des cellules commence par une dilution du stock au moment du passage et du placement dans des plaques de microtitration (pouvant tre utilisées dans un procédé automatisé) avec un milieu de culture cellulaire contenant du 2OHE. Environ 5 à 7 jours après le traitement, une morphogénèse et une différenciation significatives des cellules sont apparues ainsi qu'une agglomération significative, c'est-à-dire un conglomérat de cellules. A ce point, le conglomérat est généralement formé et le groupement animé de mouvements spontanés ; il est prt pour l'expérience. Le mouvement peut généralement durer une semaine. L'invention se rapporte à une méthode dans laquelle le mouvement après application du composé au groupement de cellules est comparé au mouvement avant application du composé au groupement de cellules. Éventuellement, le résultat d'un traitement du groupement de cellules par un composé à cribler par la méthode est comparé au résultat obtenu lorsqu'un composé "inactif" est mis en contact avec le groupement de cellules ou à un autre mouvement modifié. Généralement, un composé "inactif" ne provoque pas de changement dans le comportement du groupement de cellules. La comparaison peut tre effectuée par référence à un témoin obtenu précédemment. Selon un aspect préféré de l'invention, le groupement est généralement modifié dans son mouvement lorsqu'il est mis en contact physique avec une solution du composé possédant une propriété du point de vue biologique. Dans ce cas, le test est mis en oeuvre de la manière la plus efficace. Éventuellement, les cellules peuvent entrer en contact avec le composé sous forme solide ou sous forme gazeuse. Ld modification du mouvement peut tre une augmentation ou une diminution dans la fréquence du dit mouvement du groupement de cellules ou peut tre un arrt substantiel du dit mouvement du groupement de cellules. Généralement, le groupement est animé de mouvements avec une périodicité et avec un certain déplacement latéral ou une amplitude par rapport à une position moyenne. L'amplitude est le mieux décrite comme étant un mouvement à l'intérieur d'un plan cartésien virtuel que l'on regarderait depuis le dessus du milieu de culture. La modification de mouvement peut tre une augmentation ou une diminution de l'amplitude du mouvement du groupement de cellules. L'invention se rapporte également à une méthode de criblage de composés dans laquelle les cellules sont observées ou mesurées en utilisant un moyen de grossissement, de préférence un microscope, et de préférence encore un microscope optique de pouvoir de grossissement allant de 10 à 1000 x, de préférence de pouvoir de grossissement allant de 50 à 500 x. L'invention se rapporte également à une méthode de criblage dans laquelle la modification de mouvement est enregistrée sur un moyen de stockage permettant sa restitution. De tels moyens comprennent la pellicule photographique, la bande magnétique et les images numériques. De préférence, la modification de mouvement est enregistrée sur une base de données électronique qui est de préférence reliée à un ordinateur. L'invention se rapporte de plus à une méthode dans laquelle: (a) un enregistrement du mouvement du groupement de cellules après application du composé est comparé à un enregistrement du mouvement du groupement de cellules avant application du composé; (b) une évaluation du niveau d'activité de la propriété biologique produite par le composé est effectuée ; et (c) le composé est sélectionné ou non sélectionné pour criblage ultérieur. La comparaison dans l'étape (a) est éventuellement effectuée avec d'autres modifications de mouvements. L'évaluation est de préférence réalisée à l'aide d'un ordinateur. L'évaluation par un ordinateur fournit de préférence un résultat indiquant qu'une modification de mouvement a ou n'a pas eu lieu. Généralement, l'enregistrement est celui d'une image de mouvement ou d'une série d'images de mouvement. L'enregistrement peut tre un ensemble d'images, un film ordinaire ou équivalent. L'enregistrement est, selon une caractéristique préférée, un film numérique qui est produit par le "stacking" d'images de la modification du mouvement. "Stacking" est un terme connu de l'homme de l'art travaillant dans le domaine des films numériques. Selon la vitesse d'action ou la modification particulière du mouvement un délai est établi avant d'effectuer un "stacking". Dans certains cas plusieurs "stacking" sont réalisés à des intervalles déterminés. Eventuellement, les étapes d'évaluation et de sélection sont effectuées indépendamment par des moyens automatisés, par exemple un programme d'ordinateur. Selon une caractéristique préférée, le programme d'ordinateur intitulé NIH IMAGE version 1.6 est utilisé sur un ordinateur Appelez Mackintosh. La propriété biologique est de préférence une propriété pharmacologique, c'est-à-dire une propriété du composé qui affecte la cellule ou l'organisme sur le plan pharmacologique. Dans la présente invention, la propriété biologique est de préférence une propriété pesticide, de préférence encore une propriété insecticide. Dans le cas présent, il a été découvert de manière inattendue qu'une propriété d'un composé qui peut tre découverte par la présente invention est une propriété de blocage du canal calcique. La méthode de la présente invention se rapporte également à une méthode de criblage d'un composé chimique ou d'un mélange de composés chimiques. Ces composés ont généralement un poids moléculaire situé entre 200 et 2000 daltons. La présente invention se rapporte également à une méthode d'automatisation de détection de la modification de mouvement de manière telle qu'une série de composés puisse tre criblée et évaluée sans intervention humaine substantielle. De préférence, l'automatisation comprend un conteneur ou récipient qui comporte des compartiments individualisés pour criblage de composés individuels. Un tel récipient comprend une plaque 96 puits. Ainsi, la présente invention se rapporte également à un kit comprenant (a) un conteneur comprenant un groupement de cellules qui est animé d'un mouvement modifié lorsque mis en contact avec un composé possédant une propriété biologique (b) un moyen d'amener le composé à cribler pour la propriété biologique au contact du groupement de cellules ; et (c) un moyen pour enregistrer la modification du mouvement du groupement de cellules en présence du composé, dans une base de données électronique permettant de restituer la dite modification du mouvement. Le moyen d'amener le composé à cribler pour la propriété biologique en contact avec les cellules comprend une manipulation automatisée ou manuelle du composé ; celle-ci est de la manière la plus avantageuse effectuée au moyen d'un mécanisme robotisé. Le moyen d'enregistrer la modification du mouvement dans une base de données électronique comprend un moyen de visualisation, un moyen de prise de vues connecté au moyen de visualisation, et un moyen de stockage d'image connecté au moyen de prise de vues. Le moyen de visualisation comprend généralement un appareil grossissant pour observer les cellules, tel qu'un microscope. Le microscope est de préférence un microscope optique ou un équivalent de celui-ci. Le moyen de prise de vues comprend généralement un appareil électronique destiné aux prises de vues, tel qu'un appareil photographique numérique. Un appareil photographique reflex peut aussi tre utilisé. Le moyen de prise de vues est de préférence une caméra vidéo. Le moyen de prise de vues est généralement monté sur le moyen de visualisation, et selon une caractéristique préférée comprend une caméra vidéo montée à la sortie d'un microscope optique de manière à capturer l'image des cellules en mouvement. Le moyen de stockage d'image comprend généralement un ordinateur avec une base de données électronique placée sur un support de stockage permanent ou temporaire. Le moyen de prise de vues est relié électroniquement au moyen de stockage, de préférence par un câble ou une série de câbles connectes à une carte permettant l'interface avec l'ordinateur. Les Exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Dans une étape de préparation, le traitement de cellules dérivées d'un disque imaginal d'un oeuf embryonnaire hyménoptère d'un parasitoïde Trichogramma exiguum par 0,2 yM de 20HE conduit à une différenciation en amas de cellules. La dite différenciation est observée entre environ un à cinq jours après traitement. Des stocks de ces cellules sont maintenus à environ 260C. Le traitement des cellules commence par une dilution du stock au moment du passage et du placement dans des plaques de microtitration (pouvant tre utilisées dans un procédé automatisé) avec le milieu de culture cellulaire ExCell 400 contenant 0,2 yM de 20HE. Après environ sept jours, le milieu contenant le 20HE est éliminé par aspiration et remplacé par un nouveau milieu ne contenant pas de 20HE. Environ 5 à 7 jours après le traitement, une morphogénèse et une différenciation significatives des cellules sont apparues ainsi qu'une agglomération significative, c'est-à-dire un conglomérat de cellules. A ce point le conglomérat est généralement formé et le groupement animé de mouvements spontanés ; il est prt pour l'expérience. Le mouvement peut généralement durer une semaine. Le mouvement du groupement de cellules est enregistré pendant environ une à trois minutes en utilisant un programme d'ordinateur intitulé NIH IMAGE version 1.6 fonctionnant sur un ordinateur Asple Mackintosh. Du vérapamil est ajouté dans la chambre d'échantillonnage et le groupement de cellules est à nouveau enregistré pendant environ une à trois minutes. Une comparaison est effectuée entre les enregistrements. Le mouvement du groupement de cellules a substantiellement diminué en fréquence et en amplitude. L'application de vérapamil à des concentrations croissantes ralentit, jusqu'à complète inhibition du mouvement du groupement de cellules. EXEMPLE 2 Les composés suivants ont été criblés de la mme manière que dans l'Exemple 1 avec généralement des résultats similaires nifédipine sérotonine octopamine maléate de dizoclipine imidaclopride chlordiméform glutamate mono sodique acide aspartique acide quisquillique proctalline EXEMPLE 3: Les composés suivants ont été criblés de la mme manière que dans l'Exemple 1 sans changement observable du mouvement du groupement de cellules dieldrine deltaméthrine ivermectine abamectine fipronil lufénuron REVENDICATIONS 1. Méthode de criblage d'un composé pour une propriété biologique qui comprend: (a) contrôle du mouvement d'un groupement de cellules, substantiellement ancré, animé de mouvements spontanés (b) application du composé au dit groupement ; et (c) contrôle du mouvement subséquent des cellules et comparaison du mouvement avant et après application du composé. 2. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle la modification de mouvement est une augmentation ou une diminution dans la fréquence du dit mouvement du groupement de cellules. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la modification de mouvement est un arrt substantiel du dit mouvement du groupement de cellules. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la modification de mouvement est une augmentation ou une diminution de l'amplitude du mouvement du groupement de cellules. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le mouvement du groupement de cellules est enregistré sur un moyen de stockage permettant sa restitution. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans (a) un enregistrement du mouvement du groupement de cellules après application du composé est comparé à un enregistrement du mouvement du groupement de cellules avant application du composé; (b) une évaluation du niveau d'activité de la propriété biologique produite par le composé est effectuée ; et (c) le composé est sélectionné ou non sélectionné pour criblage ultérieur. 7. Méthode selon la revendication 6 dans laquelle l'évaluation du mouvement est réalisée à l'aide d'un ordinateur. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le groupement de cellules est obtenu à partir d'une lignée cellulaire immortelle. 9. Méthode selon la revendication 8 dans laquelle la lignée cellulaire immortelle est une lignée cellulaire d'insecte. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la propriété biologique est une propriété pesticide, de préférence une propriété insecticide. 11. Méthode selon la revendication 10 dans laquelle la propriété insecticide est une propriété de blocage du canal calcique. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle le composé est un composé chimique ou un mélange de composés chimiques, de préférence dans laquelle le composé a un poids moléculaire situé entre 200 et 2000 daltons. 13. Kit comprenant: (a) un conteneur comprenant un groupement de cellules qui est animé d'un mouvement modifié lorsque mis en contact avec un composé possédant une propriété biologique; (b) un moyen d'amener le composé à cribler pour la propriété biologique au contact du groupement de cellules; et (c) un moyen pour enregistrer la modification du mouvement du groupement de cellules en présence du composé, dans une base de données électronique permettant de restituer la dite modification du mouvement. 14. Kit selon la revendication 13 dans laquelle le moyen d'enregistrer la modification du mouvement comprend un moyen de visualisation, un moyen de prise de vues connecté au moyen de visualisation, et un moyen de stockage d'image connecté au moyen de prise de vues. 15. Kit selon la revendication 14 dans laquelle le groupement de cellules est obtenu à partir d'une lignée cellulaire immortelle. 16. Kit selon la revendication 15 dans laquelle la lignée cellulaire