Brevet FR2770226A1 — publié le 19990430

La présente invention concerne un dispositif pour la mise en oeuvre de cultures cellulaires en milieu liquide ou tout autre procédé chimique ou biochimique en milieu liquide nécessitant notamment une agitation. L' invention concerne plus particulièrement la culture cellulaire notamment de micro-organismes qui doivent faire l'objet de nombreuses cultures (plusieurs milliers par jour) dans des volumes relativement importants (plusieurs millilitres). Ce type de cultures est nécessaire notamment pour le séquençage de longs fragments d'ADN (gènes eucaryotes ou procaryotes par exemple) par les méthodes mettant en oeuvre les Bac-s (Bacterial artificial chromosome) ou les Pac-s. Ce type de séquençage nécessite de grandes quantités d'ADN différents obtenus par culture bactérienne. Il est possible de réaliser de nombreuses cultures en utilisant des a microplaques de 96 puits ou cupules, en plaçant chaque culture dans un puits. Ces microplaques présentent un format standard en longueur et en largeur, et portent de manière également standardisée 96 puits ou cupules identiques agencés en 12 rangées juxtaposées de 8 puits ou cupules. Cette disposition de même que le diamètre des puits et la dimension des plaques seront dénommés ci-après format microplaque . L'utilisation de ces microplaques de format standard est extrêmement avantageux car elles sont compatibles avec des outils automatiques de traitement standardisés au format microplaque tels que des pipettes multi-canaux, des racks d'aiguilles de prélèvement, des robots de manipulation et de traitement, ce qui permet de manipuler de manière automatique un grand nombre d'échantillons. Toutefois, les puits ou cupules de ces microplaques présentent de faibles volumes inférieurs à 1,5 ml. Ces microplaques ne peuvent donc pas être utilisées lorsque l'on souhaite obtenir des grandes quantités d'ADN bactérien par culture, ce qui nécessite donc des cultures de micro-organismes de 2 à 5 ml de volume. Ainsi dans les grands projets de séquençage pour lesquels on utilise la méthode de séquençage d'extrémités de Bac-s ou de Pac-s, il est nécessaire d'utiliser pour chaque culture au moins 5 ml de cultures avec 5,5 DO600. De telles cultures doivent donc être réalisées dans des tubes à essais, des flacons ou mini boîtes de Pétri d'au moins 15 ml de volume et assez larges pour assurer une bonne agitation et oxygénation de la culture pendant la période d'incubation, ces tubes, flacons ou boîtes étant bien entendu incompatibles avec le format standard microplaque des outils automatiques, le remplissage de ces tubes pour la mise en culture et le prélèvement d'échantillons de la culture pour le transfert vers une microplaque devant alors s'effectuer manuellement. Dans les procédés de grand séquençage par la méthode de séquençage d'extrémités de BAC-s - s ou de PAC-s, il faut prévoir un grand nombre de cultures bactériennes (quelque milliers par jour) en volume de 2 à 5 mi, soit par exemple de l'ordre de 4000 ensemencements par jour, ce qui, s'ils sont réalisés manuellement, demande une main d'oeuvre très importante. Vis-à-vis de l'état de la technique précité, la présente invention propose alors un nouveau dispositif pour la mise en oeuvre de procédés chimiques ou biologiques, notamment des cultures cellulaires en milieu liquide, qui permet de réaliser automatiquement la mise en place des produits, notamment les ensemencements de culture, les injections de réactifs, ainsi que les prélèvements d'échantillons de culture ou de composition chimique, ce dispositif étant compatible avec les outils automatiques de traitement déjà disponibles standardisés au format microplaque. Plus particulièrement, selon l'invention, le dispositif comprend une première plaque percé d'une pluralité d'orifices disposés suivant un format prédéterminé, ladite plaque étant montée sur un support de façon à pouvoir occuper plusieurs positions, notamment une position verticale d'agitation et une position horizontale de remplissage ou de prélèvement, et une pluralité de tubes de grande longueur, ouverts à chaque extrémité, solidaires de ladite première plaque de sorte qu'une de leurs extrémités coïncide avec un orifice de la plaque, lesdits tubes s'étendant suivant une direction générale sensiblement horizontale en position d'agitation, et étant aptes, en position de remplissage ou de prélèvement, à présenter une portion redressée sensiblement verticalement. Ainsi, avantageusement selon l'invention, le dispositif utilise une plaque de façade à un format déterminé, compatible avec des outils de traitement automatique standardisés du type pipettes à multi-canaux par exemple, portant des tubes de grande longueur, présentant un volume suffisant pour la réalisation de cultures bactériennes de 2 à 5 ml de volume. Selon un mode de réalisation préférentiel du dispositif conforme à l'invention, le format prédéterminé de ladite première plaque est un format microplaque. Un tel dispositif permet de réaliser automatiquement et simultanément 96 cultures bactériennes de volume précité, ce qui permet d'augmenter le rendement de cultures de 60 à 100% par rapport au système des tubes à essais selon l'état de la technique. Selon une caractéristique préférentielle du dispositif selon l'invention, en position d'agitation, les tubes sont légèrement cintrés. Lesdits tubes sont avantageusement réalisés en matière souple et présentent une longueur comprise entre 10 et 30 cm, de préférence égale à environ 25 cm. Lesdits tubes peuvent être montés sur ladite première plaque. Leur diamètre externe est sensiblement égal au diamètre interne des orifices de la première plaque. Ainsi, le montage des tubes sur la première plaque peut être réalisé par engagement à force desdites extrémités des tubes dans les orifices correspondants de ladite plaque. Selon une variante de réalisation, il peut être prévu que les tubes soient montés sur des amorces tubulaires bordant les orifices de ladite première plaque. Selon une autre variante de réalisation préférentielle, lesdits tubes et ladite première plaque forment une seule pièce. Les autres extrémités des tubes peuvent être engagées à force dans des orifices d'une deuxième plaque identique à la première plaque et solidaire du support. En outre le dispositif selon l'invention peut comporter une troisième plaque identique à la première plaque et solidaire dudit support, dans laquelle sont enfilés lesdits tubes, ladite troisième plaque étant positionnée à mi-chemin entre les deux extrémités des tubes et située à un niveau légèrement inférieur à celui de la première plaque de manière à réaliser le cintrage desdits tubes. Selon l'invention, la deuxième plaque est positionnée en regard de la première plaque en position verticale. La première plaque peut avantageusement être montée à pivotement sur le support. Les tubes peuvent être réalisés en matériau plastique ou élastomère. En outre, conformément à l'invention, le dispositif comporte des moyens pour contrôler l'atmosphère gazeuse et le taux d'humidité dans les tubes, en particulier pour augmenter la concentration d'oxygène à l'intérieur des tubes en position d'agitation pendant la période d'incubation des cultures qu'ils contiennent. La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée. Sur les dessins annexés : - la figure 1 est une vue partielle en coupe de côté du dispositif selon l'invention, - la figure 2 est une vue schématique de la face avant du dispositif de la figure 1, - la figure 3 est une vue schématique de côté de l'agencement de tubes flexibles du dispositif selon l'invention, - la figure 4 est une vue schématique en coupe de côté du support du dispositif selon l'invention, - la figure 5 est une vue schématique de la face avant du support du dispositif selon l'invention, - la figure 6 est une vue schématique de dessus du moyen de pivotement prévu sur la figure 5, et - La figure 7 est une vue de côté de la figure 6. Sur les figures 1 et 2 on a représenté vu de côté et de face un dispositif pour la mise en oeuvre de procédés chimiques ou biologiques, notamment des cultures cellulaires en milieu humide. Ce dispositif comporte une première plaque 10 à un format déterminé, ici le format microplaque, percée d'une pluralité d'orifices identiques 11 disposés suivant ce format. Plus particulièrement, conformément au format microplaque, cette première plaque 10 présente ici une longueur de 124 mm et une largeur de 82,2 mm. Elle comprend 96 orifices circulaires de diamètre interne égal environ à 8 mm. Ces orifices circulaires 11 sont, comme le prévoit le format microplaque, répartis en 12 rangées de 8 orifices, juxtaposées sur une longueur de 107,4 mm. Cette première plaque 10 orientée avec ses bords de plus grande longueur horizontaux, est montée à pivotement sur un support 20 de façon à pouvoir occuper plusieurs positions, notamment une position verticale d'agitation et une position horizontale de remplissage ou de prélèvement (voir figure 1). Selon le mode de réalisation représenté, le support 20 comporte deux parois latérales 21, 22 s'élevant verticalement à partir d'un fond horizontal 23. I1 est ouvert supérieurement. Les parois latérales 21, 22 présentent une hauteur d'environ 12 cm, la première plaque 10 étant montée par l'intermédiaire d'une bascule 25 à une hauteur d'environ 4 cm du fond 23 du support 20 de telle sorte que le bord supérieur horizontal de la première plaque 10 vienne à effleurement du bord supérieur des parois latérales du support 20. Le support 20 s'étend sur une longueur d'environ 30 cm, et la première plaque 10 positionnée à une extrémité du support, constitue la face avant du dispositif. Comme le montre la figure 3, le dispositif selon l'invention comporte en outre 96 tubes 30 (dont une seule rangée est représentée) de grande longueur, ouverts à chaque extrémité 31, 32. Ces tubes, réalisés avantageusement en matière souple, sont agencés de la même manière que les orifices de la première plaque, en 12 rangées juxtaposées de 8 tubes, et sont montés sur la première plaque de sorte qu'une de leurs extrémités 31 coïncide avec un orifice de la première plaque. Lesdits tubes 30 s'étendent sensiblement selon une direction générale horizontale A en position d'agitation et sont aptes en position de remplissage ou de prélèvement, ici en se déformant, à présenter une portion redressée sensiblement verticalement. Selon le mode de réalisation représenté, les tubes flexibles 30 comporte un diamètre externe sensiblement égal au diamètre interne des orifices de la première plaque, et le montage des tubes dans la première plaque est réalisé par engagement à force des extrémités des tubes dans les orifices de la première plaque. Bien entendu, selon une première variante de réalisation non représentée, il peut être prévu que les tubes soient montés sur des amorces tubulaires bordant les orifices de ladite première plaque (les amorces et la plaque forment une seule pièce). Selon une deuxième variante de réalisation (non représentée), les tubes viennent de formation avec ladite première plaque, de sorte qu'ils forment une seule pièce. Les autres extrémités 32 des tubes 30 sont ici engagées à force dans des orifices d'une deuxième plaque identique à la première plaque 10. Cette deuxième plaque est solidaire du support 20 en étant orientée comme la première plaque. En variante non représentée, ces extrémités de tubes peuvent être montées sur des amorces de tube bordant les orifices de ladite deuxième plaque. Comme le montre la figure 1, cette deuxième plaque 40 percée d'orifices 41, est positionnée à l'autre extrémité du support 20, à la même hauteur que la première plaque 10 en position verticale, de sorte que ces deux plaques verticales sont placées en regard l'une de l'autre. En position d'agitation, comme le montre la figure 3, lesdits tubes 30 sont légèrement cintrés. Le cintrage des 96 tubes souples est réalisé avantageusement à l'aide d'une troisième plaque 50 identique à la première plaque 10, lesdits tubes étant enfilés dans les orifices 51 de ladite troisième plaque 50 positionnée selon la même orientation que la première plaque sur le support 20 à mi-chemin entre les deux extrémités desdits tubes, c'est à dire entre les deux première et seconde plaques, à un niveau légèrement inférieur à celui de la première plaque 10. La troisième plaque 50 est décalée ici d'environ 4 cm vers le bas par rapport à la première plaque 10 en position verticale, de sorte que son bord inférieur arrive au voisinage du fond 23 du support 20 (voir figure 2). Ainsi, les tubes souples enfilés dans les première, deuxième et troisième plaques suivent un profil légèrement cintré comme le montre la figure 3. Les tubes utilisés présentent une longueur comprise environ entre 10 et 30 cm et préférentiellement, conformément au mode de réalisation représenté sur les figures, égale environ à 25 cm. Ils représentent chacun un volume disponible d'environ 12 ml, ce qui est amplement suffisant pour y réaliser des cultures de volume 2 à 5 ml. Comme le montrent les figures 4 à 7, selon le mode de réalisation représenté, le support 20 comporte dans ses parois latérales 21 (dont une seule est représentée) deux paires de glissières verticales 24a, 24b en vis-àvis, positionnées respectivement à l'extrémité arrière et au milieu dudit support pour le montage par coulissement des deuxième et troisième plaques 40, 50. Ces glissières 24a, 24b ont une longueur d'environ 8 cm (correspondant à la largeur des plaques) et sont décalées verticalement d'environ 4 cm. A l'extrémité avant du support 20 il est prévu une bascule 25 représentée plus particulièrement sur les figures 5 à 7, qui comporte un fond 25a surmonté de deux flasques latéraux 25b, 25c verticaux, généralement en forme de triangle à angle droit, avec un bord avant vertical de plus grande longueur que le bord arrière. Les flasques 25b, 25c de la bascule 25 sont pourvus au niveau de leur bord avant de glissières pour le montage de la première plaque 10. Les flasques 25c, 25b sont montées à pivotement au niveau de leur bord arrière par l'intermédiaire d'un axe 26 engagé dans un palier correspondant prévu dans les parois latérales 21, 22 du support 20. Ainsi, comme le montrent les figures 1 et 4, la première plaque 10 au format microplaque peut basculer entre une position verticale et une position horizontale. Les tubes utilisés sont réalisés en matière plastique ou élastomère et préférentiellement en caoutchouc synthétique. Le dispositif représenté sur les figures 1 à 7 fonctionne de la manière suivante. Dans une première étape, la première plaque au format microplaque est positionnée horizontalement en position de remplissage, position dans laquelle les tubes souples sont légèrement pliés pour présenter une portion redressée sensiblement verticalement (position des tubes non représentée sur les figures). Ainsi, à l'aide d'un outil automatique de remplissage standardisé au format microplaque, tel qu'un ensemble de pipettes multi-canaux, on peut mettre en place le produit dans les tubes, notamment réaliser l'ensemencement des cultures de micro-organismes ou l'injection de réactifs et de composés chimiques ou biochimiques dans lesdits tubes. Puis, on bascule la première plaque 10 en position verticale d'agitation. Dans cette position, les tubes s'étendent comme le montre la figure 3 selon une direction sensiblement horizontale tout en étant légèrement cintrés. Le produit contenu dans lesdits tubes se positionne alors dans leur partie cintrée comme le montre la figure 3. Pendant la période d'incubation ou de réaction, l'ensemble du dispositif peut être agité pour, par exemple, permettre l'oxygénation des cultures en train de pousser. A cet effet, avantageusement le dispositif selon l'invention comprend des moyens pour contrôler l'atmosphère gazeuse et le taux d'humidité dans les tubes, en particulier pour augmenter la concentration d'oxygène à l'intérieur des tubes en position d'agitation pendant la période d'incubation des cultures qu'ils contiennent. Pour se faire, le dispositif peut être placé en chambre humide contenant 60% d'oxygène. Ceci évite une évaporation trop importante du produit de culture à l'intérieur des tubes. On peut également prévoir d'apporter de l'oxygène directement dans les tubes. Lorsque la période d'incubation ou la réaction chimique est terminée, la première plaque au format microplaque est de nouveau basculée en position horizontale de prélèvement d'échantillons, position dans laquelle les tubes présentent à nouveau une portion redressée sensiblement verticalement. Dans cette position horizontale de la première plaque, des échantillons de cultures ou de composition chimique peuvent alors être transvasées à l'aide d'un système automatique de prélèvement standardisé au format microplaque, dans une microplaque classique, par exemple dans une microplaque deepwell à puits profonds, ou la suite des manipulations des échantillons seront réalisées. Le dispositif représenté sur les figures 1 à 7 présente comme principal avantage de pouvoir automatiquement ensemencer ou injecter et prélever des lots de 96 cultures de micro-organismes ou réactifs chimiques de 2 à 5 ml de volume. Le rendement des cultures est alors de 60 à 100% plus élevé que les cultures faits de manière classique dans des tubes à essai. La présente invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés mais l'homme du métier saura y apporter toute variante conforme à son esprit. En particulier, on pourra prévoir d'autres moyens de cintrage des tubes, comme en particulier l'utilisation de tubes préformés plus rigides. REVENDICATIONS l.Dispositif pour la mise en oeuvre de procédés chimiques ou biologiques, notamment des cultures cellulaires en milieu liquide, caractérisé en ce qu'il comporte - une première plaque (10) percée d'une pluralité d'orifices (11) disposés suivant un format déterminé, ladite plaque étant montée sur un support (20) de façon à pouvoir occuper plusieurs positions, notamment une position verticale d'agitation et une position horizontale de remplissage ou de prélèvement, et - une pluralité de tubes (30) de grande longueur, ouverts à chaque extrémité, solidaires de ladite première plaque (10) de sorte qu'une de leurs extrémités (31) coïncide avec un orifice (11) de la plaque (10), lesdits tubes (30) s'étendant suivant une direction générale sensiblement horizontale en position d'agitation, et étant aptes, en position de remplissage ou de prélèvement, à présenter une portion redressée sensiblement verticalement. 2.Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le format prédéterminé de ladite première plaque (10) est un format microplaque. 3.Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'en position d'agitation lesdits tubes (30) sont légèrement cintrés. 4.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits tubes (30) sont réalisés en matière souple. 5.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits tubes (30) présentent une longueur comprise entre 10 et 30 cm, de préférence égale environ à 25 cm. 6.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits tubes (30) sont montés sur ladite première plaque (10). 7.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits tubes (30) présentent un diamètre externe sensiblement égal au diamètre interne des orifices (11) de la première plaque (10). 8.Dispositif selon la revendication 7 dans sa dépendance à la revendication 6, caractérisé en ce que le montage desdits tubes (30) sur la première plaque (10) est réalisé par engagement à force desdites extrémités (31) des tubes (30) dans les orifices correspondants (11) de ladite plaque (10). 9.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdits tubes sont montés sur des amorces tubulaires bordant les orifices de ladite première plaque. 10.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits tubes et ladite première plaque forment une seule pièce. 11.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les autres extrémités (32) desdits tubes (30) sont engagées à force dans des orifices (41) d'une deuxième plaque (40) identique à la première plaque (10) et solidaire du support (20). 12.Dispositif selon l'une des revendications 3 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte une troisième plaque (50) identique à la première plaque (10) et solidaire dudit support(20), dans laquelle sont enfilés lesdits tubes (30), ladite troisième plaque (50) étant positionnée à mi-chemin entre les deux extrémités des tubes (30) et située à un niveau légèrement inférieur à celui de la première plaque (10) de manière à réaliser le cintrage desdits tubes (30). 13.Dispositif selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la deuxième plaque (40) est positionnée en regard de la première plaque (10) en position verticale. 14.Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la première plaque (10) est montée à pivotement sur le support (20). 15.Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les tubes flexibles (30) sont réalisés en matériau plastique ou élastomère. 16.Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour contrôler l'atmosphère gazeuse et le taux d'humidité dans les tubes, en particulier pour augmenter la concentration d'oxygène à l'intérieur desdits tubes en position d'agitation pendant la période d'incubation des cultures qu'il contiennent.