Brevet FR2759382A1 — publié le 19980814

NOUVEAUX COMPOSES ET COMPOSITIONS LES CONTENANT UTILISABLES POUR LE TRANSFERT D'AU MOINS UNE SUBSTANCE THERAPEUTIQUEMENT ACTIVE, NOTAMMENT UN POLYNUCLEOTIDE, DANS UNE CELLULE CIBLE ET UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE La présente invention concerne de nouveaux composés glycérolipidiques et de nouvelles compositions les comprenant. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation desdits composés ou desdites compositions pour préparer un vecteur de transfert d'une substance thérapeutiquement active comportant des charges négatives, notamment un polynucléotide, dans une cellule cible, particulièrement une cellule de vertébré, et plus particulièrement de mammifère. Le transfert de gène dans une cellule donnée est la base même de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies graves pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces, voire inexistantes, et concerne aussi bien les maladies ci' origine génétique (hémophilie, mucoviscidose, myopathie,...) qu'acquises (cancer, SIDA,...). Au cours des 30 dernières années, de nombreux outils ont été mis au point permettant l'introduction de divers genes hétérologues dans des cellules, notamment des cellules de mammifère. Ces différentes techniques peuvent être divisées en deux catégories. La première catégorie concerne les techniques physiques telles que la microinjection, l'électroporation ou le bombardement particulaire qui, bien qu'efficaces, sont largement limitées à des applications in vitro et dont la mise en oeuvre est lourde et délicate. La seconde catégorie fait appel å des techniques relatives à la biologie moléculaire et cellulaire pour lesquelles le gène à transférer est associé à un vecteur de nature biologique ou synthétique qui favorise l'introduction dudit matériel. Actuellement, les vecteurs les plus efficaces sont des vecteurs viraux, en particulier adénoviraux ou rétroviraux. Les techniques développées reposent sur les propriétés naturelles dont disposent ces virus pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation de leur matériel génétique et faire pénétrer leur génome dans le noyau. Ces virus ont déjà fait l'objet de nombreuses études et certains d'entre eux sont d'ores et déjà employés à titre expérimental comme vecteurs de gènes chez l'homme en vue par exemple d'une vaccination, d'une immunothérapie ou d'une thérapie visant à suppléer une déficience génétique. Toutefois, cette approche virale présente de nombreuses limitations, notamment en raison de la capacité de clonage restreinte dans le génome viral, des risques de dissémination dans l'organisme hôte et dans l'environnement des particules virales infectieuses produites, du risque de mutagénèse artéfactuel par insertion dans la cellule hôte dans le cas des vecteurs rétroviraux, et de la forte induction des réponses immunitaire et inflammatoire in vivo lors du traitement thérapeutique, limitant considérablement le nombre d'administrations pouvant être envisagées (Mc Coy et al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560 ; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442). Ces nombreux inconvénients, notamment dans le cadre d'un usage chez l'homme, ont conduit plusieurs équipes à développer des systèmes alternatifs de transfert de polynucléotides. Plusieurs méthodes non-virales sont disponibles à l'heure actuelle. Citons pour exemple la coprécipitation au phosphate de calcium, l'utilisation de récepteurs mimant les systèmes viraux (pour une revue voir Cotten et Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705-710), ou l'utilisation de polymères tels que le polyamidoamine (Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379) . D'autres techniques non virales s'appuient sur l'utilisation de liposomes dont l'intérêt à titre d'agent permettant l'introduction, à l'intérieur de cellules, de certaines macromolécules biologiques, telles que par exemple l'ADN, l'ARN, les protéines ou certaines substances pharmaceutiquement actives a été largement décrit dans la littérature. A cette fin, plusieurs équipes ont déjà proposé l'utilisation de lipides cationiques qui présentent une forte affinité à l'égard des membranes cellulaires ou des acides nucléiques. De nombreux lipides cationiques sont décrits. Citons pour exemple le DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417), le DOGS ou Transfectamw (Behr et al.,1989,PNAS, 86, 6982-6986), le DMRIE et le DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), le DC-CHOL (Gao et Huang, 1991, BBC, 179, 280285), le DOTAPw (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2,674-622) ou la Lipofectamine", ainsi que ceux décrits dans les demandes de brevet W09116024, W09514651 ou W09405624. La demande W09405624 décrit plus particulièrement des lipides cationiques de formule dans laquelle les radicaux R sont notamment des radicaux octadécènyle, les radicaux Z sont des radicaux méthyle, q est un nombre entier de 1 à 6, X est notamment une chaîne polyamine. Un composé plus particulièrement décrit est le sel de tetra(trifluoroacétate) de l-propanaminium, N-[2--[ [2,5-bis [(3aminopropyl) aminol-l-oxo-pentyl] amino] éthyl] -n,n-diméthyl-2, 3, - bis(9-octadécènyloxy). Il est néanmoins souhaitable de proposer d'autres lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés améliorées ou différentes de ceux déjà décrits. On sait en effet que l'interaction entre les complexes et les membranes cellulaires peut varier considérablement en fonction de la cellule considérée. Les mécanismes qui permettent l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et le transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont, de ce fait, largement méconnus et les chercheurs en sont donc réduits à une approche pour l'essentiel empirique. Le déposant a aujourd'hui identifié de nouveaux composés glycérolipidiques, qui peuvent se présenter sous forme cationique, utiles notamment pour transférer une substance thérapeutiquement active comportant des charges négatives, notamment un polynucléotide, à l'intérieur d'une cellule cible, dont on peut envisager l'utilisation notamment in vivo dans le cadre d'une thérapie génique. Ainsi, la présente invention a tout d'abord pour objet un composé de formule dans laquelle Rl, R2, identiques ou différents sont des radicaux de 6 à 23 atomes de carbone (notés C6-C3) alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-!C6-C23) alkyie ou -C(=O)-(C6-C23) aicényle, ou plus particulièrement -C(=O)-(C1-C20) alkyle ou C(=O)-(Cl2-C20) alcényle, linéaires ou ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des radicaux fluoroalkyle des groupements oxyéthylène ou oxyméthylène éventuellement répétés, linéaires ou ramifiés, eventuellement substitués, X est l'atome d'oxygène ou un radical amino -NR3, R3 étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, n est un nombre entier positif de 1 à 6, de manière préférée de 2 à 4, m est un nombre entier positif de 1 à 6, de manière préférée de 2 à 4, et lorsque n > 1, m peut être identique ou différent dudit n. Par le terme "alcényle", on entend indiquer que la chaîne carbonée dont il est question peut comprendre une ou plusieurs double(s) liaison(s) le long de ladite chaîne. Selon l'invention, les groupements R,, R2 et/ou R3 des composés peuvent être substitués. De telles substitutions peuvent notamment consister en une molécule de marquage (voir molécules de marquage dans US 4711955), une molécule de ciblage cellulaire (peptide GRP, Gastrin Releasing Peptide, par exemple), une molécule d'ancrage. L'invention concerne également un composé tel que présenté ci-dessus conjugué à un ou plusieurs éléments de ciblage par l'intermédiaire d'au moins un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine. De tels éléments peuvent permettre le ciblage vers un type cellulaire particulier, faciliter la pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir par exemple de tout ou partie de sucres, de peptides, d'oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogèniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés. On peut citer plus particulièrement les résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur asyaloglycoprotéique à la surface des cellules hépatiques, le peptide fusogénique INF-7 dérivé de la sous-unité HA-2 de l'hêmagglutinîne du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 (Lanford et Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr (rnbinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478). De tels conjugués peuvent être aisément obtenus selon les techniques largement décrites dans la littérature, et plus particulièrement par couplage chimique, notamment en utilisant des groupes protecteurs tels que trifluoroacétyle ou Fmoc ou Boc sur la polyamine. La déprotection sélective d'un groupe protecteur permet alors de coupler l'élément de ciblage, et l'on déprotège ensuite le glycérolipide. Selon un cas avantageux de l'invention, ledit composé est sous forme cationique, c'est à dire qu'il est sous forme protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes d'azote présents sur la chaîne polyamine. Dans ce cas, ledit glycérolipide cationique est associé à un ou plusieurs anions biologiquement acceptables, tels que par exemple l'anion trifluoroacétate, halogène, monométhylsulfate, acétate ou phosphate, iodure, chlorure, bromure... Les composés selon la présente invention comportent de 2 à 7 charges positives, plus particulièrement de 3 à 5, et préférentiellement 5. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit composé est choisi dans le groupe consistant en les formules suivantes n=2 pcTG18 OU n=3 pcTG33 II n=2 pcTG21 ou n=3 pcTG34 III n=2 pcTG19 ou n=3 pcTG36 IV n=2 pcTG2O ou n=3 pcTG35 ou n=4 pcTG56 V C18:1, [cis]-9 n=2 pcTG22 ou n=4 pcTG90 VI Ces composés cationiques peuvent par exemple être préparés par réaction d'un composé de formule dans laquelle: R4, R5 sont des groupes protecteurs, formant notamment ensemble un radical isopropylidène, X a la même signification que dans la formule I, avec un acide de formule m et n ayant la même signification que dans la formule I, R6 étant un groupe protecteur, notamment le t-butoxycarbonyle (BOC). Les fonctions O-R4, -O-Rs sont ensuite déprotégées pour fixer par estérification ou éthérification les radicaux R1 et R2 de manière connue. Le composé obtenu est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique. L'acide de formule VII est préparé de manière connue. Dans le cas des composés de l'invention pour lesquels m = 3, n = 2 ou 3, on se référera aux exemples indiqués ci-après pour connaître les modalités pratiques de synthèse. Les procédés décrits sont applicables en général aux synthèses des composés selon l'invention moyennant des adaptations à la portée de l'homme du métier. Toutefois, les composés de l'invention ne sauraient se limiter à ceux obtenus par les modes de préparation décrits précédemment. Selon un autre aspect, l'invention concerne également une composition comprenant au moins un composé tel que décrit cidessus et au moins un adjuvant susceptible d'améliorer la formation de complexe entre undit composé et une substance thérapeutiquement active, ou d'améliorer le fonctionnement de ces complexes vis-à-vis de la cellule. De manière préférée, un tel adjuvant sera un lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple un trigycéride, un diglycéride, le cholestérol (voir par exemple US 5 438 044), en particulier, un lipide neutre ou zwitterionique qui est ou qui dérive d'une phosphatidyl éthanolamine (PE), phosphatidylcholine, phosphosholine, sphyngomyeline, ceramide ou cérébroside. De manière avantageuse, on choisira la dioleylphosphatidyl éthanolamine (DOPE). Le rapport en poids entre le composé de l'invention et le lipide neutre ou zwitterionique est généralement compris entre 0,1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la nature des composants considérés. L'homme du métier dispose des connaissances suffisantes pour permettre ces adaptations mineures. Il est également possible d'utiliser un mélange de lipides neutres et/ou zwitterioniques. L'invention concerne en outre un complexe comprenant au moins un composé ou au moins une composition tels que décrits précédemment et au moins une substance thérapeutiquement active comportant au moins une charge négative. Selon un mode particulier de réalisation, ladite substance thérapeutiquement active est choisie parmi les acides nucléiques et les protéines. De préférence, la substance active du complexe selon l'invention est un polynucléotide, ledit composé ou ladite composition permettant alors d'améliorer le pouvoir transfectant du polynucléotide dans une cellule. Par "polynucléotide", on entend désigner un fragment d'ADN et/ou d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire, naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non (voir à titre d'exemple US 5525711), marqués ou non (voir, par exemple, US 4711955 ou EP 302175), permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique sans limitation de taille. Par polynucléotide on entend désigner notamment un cADN, un ADN génomique, un ADN plasmidique, un ARN messager; un ARN antisens, un ribozyme, un ARN de transfert, un ARN ribosomique, ou un ADN codant pour de tels ARN. "Polynucléotide" ou "acide nucléique" sont des termes synonymes dans le cadre de la présente demande. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit polynucléotide comprend un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de réalisation, ledit polynucléotide est avantageusement sous forme de plasmide. Les éléments permettant l'expression sont l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Il s'agit notamment des séquences promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et éventuellement les séquences requisent pour permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. A titre d'exemple, on mentionnera les promoteurs tels que les promoteurs des virus RSV, MPSV, SV40, CMV ou 7.5k, du virus de la vaccine,les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire. Il est en outre possible de choisir une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné, ou activable dans des conditions définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de telles séquences promotrices. Par ailleurs, ledit polynucléotide peut comprendre au moins deux séquences, identiques ou différentes, présentant une activité de promoteur transcriptionnel et/ou au moins deux séquences codantes d'ADN, identiques ou différentes, situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë, éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que la fonction de promoteur transcriptionnel ou la transcription desdites séquences ne soit pas affectée. De même, dans ce type de construction d'acide nucléique, il est possible d'introduire des séquences nucléiques "neutres" ou introns qui n'affectent pas la transcription et sont épissées avant l'étape de traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont décrites dans la littérature. Ledit polynucléotide pourra également renfermer des séquences requises pour le transport intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration. De telles séquences sont bien connues de l'homme de l'art. Par ailleurs, les polynucléotides selon la présente invention peuvent également être des polynucléotides modifiés de sorte qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génôme de la cellule cible ou des polynucléotides stabilisés à l'aide d'agents, tels que par exemple la spermine. Dans le cadre de la présente invention, le polynucléotide peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut être avantageux d'utiliser un polynucléotide qui code pour tout ou partie d'un polypeptide, notamment un polypeptide présentant une activité thérapeutique ou prophylactique, et plus particulièrement une activité immunogène de type cellulaire ou humorale. Le terme polypeptide s'entend sans restriction quant à sa taille ou son degré de modification (par exemple de glycosylation). . On peut à titre d'exemples citer les gènes codant pour un enzyme, une hormone, une cytokine, un récepteur membranaire, un polypeptide structural, un polypeptide formant un canal membranaire, un polypeptide de transport, une molécule d'adhésion, un ligand, un facteur de régulation de la transcription, de la traduction, de la réplication, de la stabilisation des transcripts, ou un anticorps, tels que par exemple le gène codant pour la protéine CFTR, la dystrophine, le facteur VIII ou IX, E6/E7 de HPV, MUSC1, BRAC1, l'interféron , l'interféron y, l'interleukine (IL)2, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-7, l'IL-12, le facteur nécrosant de tumeur (TNF) de type alpha, le GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), le gène tk du virus Herpes Simplex de type 1 (HSV-1), ie géne associé au rétinoblastome ou p53 ou tout ou partie dtimmunoglobulines, telles que les fragments F(ab)2, Fab', Fab ou les anti-idiotypes (US 4,699,880). Bien entendu, cette liste n' est pas limitative et d'autres gènes peuvent être employés. Selon un mode de réalisation préféré, les complexes selon l'invention sont de faible taille (inférieure à 500 nm, avantageusement à 200 nm et de préférence à 100 nm). Par ailleurs, les expériences de transfection réalisées montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit polynucléotide est de 0,01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0,05 à 10. L'invention concerne également un procédé de préparation des complexes composés cationiques/substances actives anioniques, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs composés ou compositions selon l'invention avec une ou plusieurs substances actives anioniques et en ce que l'on récupère ledit complexe. Dans un premier temps, selon une première variante, un ou plusieurs composés cationiques sont mis en solution avec une quantité appropriée de solvant ou mélange de solvants miscibles dans l'eau, notamment l'éthanol, le diméthylsulfoxide (DMSO),ou de façon préférée un mélange éthanol/DMSO 1:1 (v:v), de manière à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9603977, ou selon une seconde variante, sont mis en suspension avec une quantité appropriée d'une solution de détergent comme un octylglucoside tel que le n-octyl ss-D-glucopyranoside, ou le 6-0- (N-heptylcarbomoyl) - méthyl-a-D-glucopyranoside. La suspension peut ensuite être mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où l'on souhaite qu'un lipide neutre ou zwitterionique soit présent dans le complexe final, on forme, de manière connue, préalablement à la mise en solution dans le solvant miscible à l'eau, un film avec un mélange renfermant undit composé cationique et undit lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple la DOPE. Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans le choix du rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active. Sans vouloir être limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre le nombre de charges positives du composé ou de la composition cationique et le nombre de charges négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20, notamment entre 0,1 et 15 et de préférence environ de 5 à 10. Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en considération les charges négatives portées par la substance active et on ajustera la quantité de composé nécessaire pour satisfaire au rapport indiqué ci-dessus. Les quantités et les concentrations pour les autres composants sont ajustées en fonction de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives. Dans le cas de la seconde variante et de manière optionnelle, on peut procéder à une dialyse subséquente pour réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe d'une telle méthode est par exemple décrit par Hofland et al. (1996, PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre II du document Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993). On a montré que la première variante conduit à d'excellents résultats en terme de taille des complexes obtenus. Selon une troisième variante, un ou plusieurs composés ou compositions cationiques, sont mis en suspension dans un tampon puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est ensuite extrudée au travers de deux membranes microporeuses sous pression appropriée. La suspension lipidique est alors mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien connue dans 1' art. L'utilisation d'un lipide neutre ou zwitterionique, tel que la DOPE, peut s'avérer avantageuse pour l'obtention de complexes de faible taille (inférieure à 200 nm, de préférence inférieure à 100 nm). Les caractéristiques des complexes formés peuvent être évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer, par exemple -l'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse sur gel dans le cas où les substances sont des acides nucléiques, -la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière, -l'absence de précipitation à long terme. La présente invention a également pour objet les complexes obtenus par la mise en oeuvre des procédés énumérés ci-dessus. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour transférer au moins une substance thérapeutiquement active, notamment un acide nucléique, dans des cellules cibles, in vitro, ex vivo ou in vivo, plus particulièrement in vivo. Par "cellules cibles" selon l'invention, on entend les cellules procaryotes, les cellules de levure et les cellules eucaryotes, les cellules de plantes, les cellules humaines ou animales, et en particulier les cellules de mammifère. Il convient par ailleurs de citer les cellules cancéreuses. In vivo, l'invention peut être appliquée au niveau de l'espace interstitiel ou luminal de tissus tels que le poumon, la trachée, la peau, le muscle, le cerveau, le foie, le coeur, la rate, la moelle osseuse, le thymus. la vessie, la lymphe, le sang, le pancreas, l'estomac, le rein, les ovaires, les testicules, le rectum, le système nerveux périphérique ou central, les yeux, les organes lympholdes, les cartilages, l'endothélium. Selon un choix avantageux de l'invention, la cellule cible sera une cellule musculaire, une cellule souche hématopolétique ou encore une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de l'épithélium respiratoire. Les complexes selon l'invention sont utilisables à titre de médicament, à but curatif, préventif ou vaccinal. C'est pourquoi l'invention a également pour objet les complexes de l'invention à titre de médicament à but curatif, préventif ou vaccinal. De tels complexes peuvent être mis en oeuvre dans une méthode de traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une substance thérapeutiquement active, notamment un polynucléotide, dans des cellules cibles, notamment une cellule de mammifère, et plus précisemment une cellule musculaire, une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une cellule de l'épithélium respiratoire. Plus largement, la présente invention concerne également un procédé pour introduire une substance active comportant des charges négatives à l'intérieur d'une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules cultivées sur un milieu approprié avec une suspension de complexes composé caticnique/substance active comportant des charges négatives. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées. La vérification de l'introduction de la substance active peut être effectuée (éventuellement après lyse de la cellule) par tout moyen approprié. Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par le terme "introduction" on entend que la substance active comportant des charges négatives est transférée dans la cellule et est localisée, en fin de procédé, à l'intérieur de ladite cellule ou au niveau de la membrane de celle-ci. Dans le cas où la substance active est un acide nucléique, on parlera plus particulièrement de "transfection". Dans ce cas, la vérification de la transfection de l'acide nucléique pourra être effectuée par tout moyen approprié, par exemple par mesure de l'expression du gène considéré ou de la concentration de la protéine exprimée. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'un composé, d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour la préparation d'un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal, destiné au traitement du corps humain ou animal, notamment par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocites du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter in vitro selon la présente invention et de les réadministrer au patient. Les complexes selon l'invention peuvent être administrés par voie intrarnusculaire, intratrachéale, intranasale, intracérébrale, intrapleurale, intratumorale, intracardiaque, intragastrique, intrapéritonéale, épidermique, intraveineuse. intraartérielle par seringue ou tout autre moyen équivalent, les systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou l'aérosolisation. On peut également citer les odes d'administration par application d'une crème, par administration orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art et applicable à la présente invention. Selon la présente invention et dans le cadre d'une thérapie génique in vivo, il est possible de répéter plusieurs fois, chez un patient donné, le procédé tel que proposé sans qu'aucune réaction immunitaire majeure ne soit déclenchée à l'encontre de l'un des composés administrés. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certains délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple de l'individu ou de 13 maladie à traiter ou encore du polynucléotide à transférer. L'invention concerne plus particulièrement une préparation pharmaceutique comprenant au moins un complexe tel que décrit précédemment, renfermant éventuellement en outre au moins un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir de transfection dudit complexe. Un tel adjuvant pourrait par exemple être choisi parmi le groupe consistant en la chloroquine, un composé polaire protique notamment ch plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de l'épithélium respiratoire. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Cette figure illustre le mode de synthèse des composés décrits en A. Figures 2 : Analyse de la taille des particules des complexes formés entre les glycérolipides de l'invention et e plasmide pcTG11033 (patent application ne...) à 0.1 mg/ml préparés par la technique à l'éthanol décrite précédemment. Les résultats sont présentés pour différents ratio de charges. Pour chaque mesure, trois préparations indépendantes ont été testées et la mesure de la reproductibilité est évaluée par la déviation standard entre ces préparations. La taille des particules est mesurée par PCS (Photon Correlation Spectroscopy). Les colonnes hachurées figurent les complexes obtenus en l'absence de DOPE et les colonnes foncées en présence d'une quantité équimolaire de DOPE. Les complexes pour lesquels on observe une précipitation sont représentés par une colonne qui s'étend au delà de l'échelle. A) glycérolipides comportant 3 charges positives (C-14 = pcTG 18, C-16 = pcTG21, C-18 = pcTG19, oleoyl = pcTG20) ; B! glycérolipides comportant 4 charges positives (C-14 = pcTG 33, C-16 = pcTG34, C18 = pcTG36, oleoyl = pcTG35) ; C) glycérolipides comportant des chaines oleoyl et 3 (pcTG 20), 4 (pcTG35), ou 5 charges positives (pcTG56) Figure 3 : Injection intraveineuse de complexes selon l'invention. EXEMPLES Les exemples ci-après illustrent l'invention, sans la limiter en aucune façon, en liaison avec la figure 1 annexée qui fait partie intégrante de la description. A . : Synthèse des acides de formule VII avec m = 3 ; n = 2 BOC (acide 7a) ou m = 3 ; n = 3 : R6 = BOC (acide 7b) (voir figure 11 Amino acides 4, 6 et 15 Une solution d'acrylonitrile (9,6 ml, 146 mmoles) dans 50 ml de 1,4-dioxane est ajoutée goutte à goutte à une solution glacée de glycine (10,0 g, 132 mmoles) et de soude 1N (133 ml) dans un mélange 1/1 d'eau et de 1,4-dioxane (200 ml). Le milieu réactionnel est agité à 0 C pendant 1 h et à température ambiante pendant 4 h supplémentaires. Une solution de dicarbonate de ditertiobutyle (35,0 g, 159 mmoles) dans le 1,4-dioxane (100 ml) est ensuite ajoutée goutte à goutte et le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. Après extraction par l'éther (2 x 100 ml), la phase aqueuse est acidifiée (pH 2-3) avec de .l'acide chlorhydrique 1N et extraite avec de l'acétate d'éthyle (2 x 100 ml). Les phases organiques combinées sont séchées et concentrées. Le cyano acide obtenu 1 (24,4 g, Rdt 81%) se présente sous la forme d'un solide blanc de point de fusion 8789"C. RMN-iH (200 MHz, D2O) : c 3,88 et 3,87 (2 s, 2 H, -CH2-CO2H) , 3,48 et 3,45 (2 t, J = 6,3 Hz, 2 H, -CH2-N(BOC)-j, 2,ire et 2,56 (2 t, J = 6,3 et 6,4 Hz, 2 H, -CH2-CN) , 1,30 et 1,24 (2s, 9 H, t-Bu-). Une solution d'acide 1 (11,5 g, 50,4 mmoles) dans 100 ml d'éthanol contenant 4,04 g (100 mmoles) de soude est hydrogénée en présence de nickel de Raney (3,2 g) pendant 18 h à température ambiante. Le mélange est filtré sur célite et le catalyseur lavé avec du méthanol (2 x 30 ml). Le filtrat est acidifié à pH 4-5 avec de l'acide chlorhydrique à 1C % et concentré sous vide pour donner un solide blanc qui est dissous dans le chloroforme (50 ml) pour précipiter la plus grande partie du chlorure de sodium. Après filtration, concentration sous vide du filtrat et recristallisation dans le tétrachlorure de carbone, on obtient l'amino acide 2 (10,4 g ; Rdt 89 %) dont le point de fusion est de 201-202~C. RMN-tH (200 MHz, D2O) : 3,53 (s, 2 H, -CH2-CO2H) , 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, -CH2-N(BOC)-), 2,83 (t, J =7,5 Hz, 2 H, -CH2-NH2), 1,69 (quint, J = 7 Hz, 2 H, -CH2-), 1,26 et 1,21 (2s, 9 H, t-Bu-). La même procédure que pour l'obtention du cyano acide 1 conduit à l'obtention du cyano acide 3 à partir de l'amino acide 2. RMN-'H (200 MHz, CDCl3) : 6 4,00-3,85 (m, 2 H, -CH2-CO2H), 3,55-3,43 (m, 2 H, -CH2-CH2-CN), 3,31 (t, J = 7,2 Hz, 4 H, -CH2-N (BOC) -) 2,61 (m, 2 H,-CH2-CN), 1,78 (quint, J = 7,2 Hz, 2 H, -CH2-), 1,47 et 1,44 (2s, 18 H, t-Bu-). L'amino acide 4 est obtenu avec un rendement de 87 % après purification par chromatographie sur gel de silice (éluant méthanol/dichlorométhane 3/7, puis 6/4) à partir du cyano acide 3 selon la même procédure qui a conduit à l'amino acide 2. Le point de fusion est 189-1900C. RMN-1H (200 MHz, DO) : 6 3,57 et 3,54 (2s, 2 H, -CH2-CO2H), ,2-3,0 (rn, 6 H, -CH2-N(BOC)-), 2,80 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, -CH2-NH2), 1,801,50 (m, 4 H, -CH2-), 1,27 et 1,22 !2s, 18 H, t-Bu-). La même procédure que pour le cyano acide 1 permet l'obtention du cyano acide 5 à partir de l'amino acide 4. RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : 6 3,85 (s large, 2 H, -CH2-CO2?1), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, -CH2-CH2-CN), 3,35-3,05 (m, 8 H,-CH2-N(BOC)-!, 2,60 (m, 2 H, -CH2-CN) , 1,85-1,6C (m, 4 H, -CH2-' 1,46 et 1,44 (2 s, 27 H, t-Bu-). L'amino acide 6 est obtenu avec un rendement de 83 % après purification par chromatographie sur gel de silice (éluant méthanol/dichlorométhane 3/7 puis 6/4) à partir du cyano acide 5 selon la même procédure qui a conduit à 1'amino acide 2. RMN-1H (200 MHz, D2O) : 5 3,76 et 3,73 (2s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,252,75 (m, 12 H, -CH2-N (BOC) - et -CH2-NH2), 1,85-1,50 (m, 6 H, -CH2-), 1,28 et 1,23 (2s, 27 H,t-Bu-). La même procédure que pour ie cyano acide 1 permet l'obtention du cyano acide 14 à partir de l'amino acide 6. RMN-1H (200 MHz, CDCl3):d 3,95 et 3,87 (2 s larges, 2 H, -CH2-CO2H), 3,47 (t, J = 6,5 Hz, 2 H, -CH2-CH2-CN), 3,40-3,05 (m, 12 H, -CH- N(BOC)-), 2,61 (m, 2 H, -CH2-CN), 1,90-1,60 (m, 6 H, -CH2-), 1,47, 1,45 et 1,44 (3 s, 36 H, t-Bu-). L'amino acide 15 est obtenu avec un rendement de 71% après purification par chromatographie sur gel de silice (éluant methanol/dichlorométhane 1/9 puis 3/7) à partir du cyano acide 14 selon une procédure identique à celle qui a conduit à l'amino acide 2. RMN-iH (200 MHz, D2O - CD3OD):ô 3,57 (m, 2 H, -CHz-CO2H), 3,152,80 (m, 14 H, -CH,-N(BOC)-), 2,70 (t, J = 7,5 Hz, 2 H, -CH2- NH2), 1,75-1,35 (m, 8 H, -CH2-), 1,17 et 1,13 (2 s, 36 H, t-Bu-) Acides 7a, 7b et 7c Une solution de dicarbonate de ditertiobutyle (1,09 g, 5,01 mmoles) dans le tétrahydrofurane (4 ml) est ajoutée à une solution d'amino acide 4 (1,50 g, 3,85 :nnoles) et de triéthylamine (1,07 ml, 7,7 mmoles) dans un mélange 1/1 de tétrahydrofurane et d'eau (8 ml). Le milieu réaztionnel est agité pendant 2 h à température ambiante. Il est alors acidifié à pH 3 par une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique et est extrait avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium et concentrée pour donner une huile incolore qui après chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : acétate d'éthyle) donne l'acide 7a.(1,79 g ; Rdt : 95%). RMN-1H (200 MHz, CD3OD) : ô 3,79 (s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,30-3,15 (m, 6 H, -CH-N(BOC)-), 3,03 (t, J = 6.7 Hz, 2 H, -CH2-N(BOC)-), 1,851,60 (m, 4 H, -CH2-), 1,46 et 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu-) La même procédure que pour l'acide 7a permet l'obtention de l'acide 7b (7,31 g ; Rdt : 95%) à partir de l'amino acide 6 (6,50 g). RMN-tH (200 MHz, CDC1,; : 6 3,93 et 3,86 (m, 2 H, -CH2-CO2H), 3,40-3,05 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 6 H, -CH2-), 1.44 (s large, 36 H, t-Bu). La même procédure que pour l'acide 7a permet l'obtention de l'acide 7c (3,37 g; Rdt : 92% après chromatographie sur gel de silice; éluant : méthanol/dichlorométhane 5/95 puis 10/90) à partir de l'amino acide 15 (3,20 g; 4,55 mmoles). RMN-1H (200 MHz, CDCl3):ô 3,85 (m, 2 H, -CH2-CO2H), 3,45-3,05 (m, 16 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 8 H, -CH2-), 1,45, 1,44 et 1,43 (3 s, 45 H, t-Bu).2 Synthèse de alvcérolipides cationiques Esters 8a 8b et 8c Une solution de dicyclohexylcarbodiimide (0,60 g, 2,9 mmoles) dans le dichlorométhane sec (1 ml) est ajoutée à une solution d'acide 7a (1,10 g, 2,25 mmoles), de (S)-(+)-2,2diméthyl-1,3-dioxolane-4-méthanol (0,39 g, 2,9 mmoles) et de 4 (diméthylamino)pyridine (27 mg, 0,23 mmole) dans le dichlorométhane sec (3 ml). Le mélange réactionnel est agité pendant 18 h à température ambiante. Le précipite de dicyclohexylurée est enlevé par filtration et le filtrat est concentré sous vide puis chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant: éther/hexane 6/4) pour donner l'ester 8a (0,72 g; 538)- RMN-1H (200 MHz, CDC13) : 6 4,40-4,02 (m, 4 H, -CH 2- -), 3,98 et 3,90 (2 s larges, 2 H, -CH2-CO2-), 3,73 (m, 1 H, CH-O-), 3,35-3,00 (m, 8 H), 1,85-1,55 (m, 4 H, -CH2-), 1,45, 1,43 et 1,42 (3 s, 30 H), 1,36 (s, 3 H, Me-). La même procédure que pour l'ester 8a permet l'obtention de l'ester 8b (3,08 g; rdt : 49%) à partir de l'acide 7b (5,32 g, 8,22 mmoles) RMN-tH (200 MHz, CDCl3) : 6 4,40-4,02 (m, 4 H, -CH2-O-), 3,99 et 3,91 (2 s larges, 2 H, -CH2C 2-), 3,73 (m, 1 H, CH-O-), 3,32-3,00 (m, 12 H, -CH, N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-) , 1,45, 1,44, 1,43 et 1,41 (4 s, 39 H, t-Bu- and Me-), 1,36 (2 s, 3 H, Me-). La même procédure que pour l'ester 8a permet l'obtention de l'ester 8c (1,73 g; Rdt : 95%) à partir de l'acide 7c (1,60 g; 1,99 mmole) RMN-1H (200 MHz, CDCl3) :ô 4,35-4,04 (m, 4 H, -CH2-O-), 3,99 et 3,92 (2 s, 2 H, -CH2-CO2-), 3,74 (m, 1 H, > CH-O-), 3,30-3,00 (m, 16 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,42 (4 s, 48 H, t-Bu- et Me-), 1,36 (s, 3 H, Me-). Dihvdroxvesters 9a. 9b et 9c Une solution d'ester 8a (663 mg, 1,10 mmole) et d'acide chlorhydrique 1 N (0,44 ml) dans le méthanol (19 ml) est agitée pendant 16 h à température ambiante. De la triéthylamine (0,5 ml) est ensuite ajoutée jusqu'à neutralité. L'évaporation sous vide suivie de la chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther puis acétate d'éthyle) donne le dihydroxyester 9a (497 mg; rdt : 80%) sous la forme d'une huile incolore. RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : 6~4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 4,00-3,50 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH et -CH2-CO2-), 3,40-3,00 (m, 8 H, -CH2 N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 4 H, -CH2-), 1,45 et 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu ). La même procédure que pour le dihydroxyester 9a permet l'obtention du dihydroxyester 9b (340 mg ; rdt : 71%) à partir de l'ester 8b (500 mg, 0,66 mmole) RMN-lH (200 MHz, CDCl3) : 6 4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 4,00-3,40 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH, et -CH2-CO2-), 3,40-3,00 (m, 12 H, -CH2 N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-), 1,46, 1,45 et 1,43 (3 s, 36 H, t-Bu-). La même procédure que pour le dihydroxyester 9a permet l'obtention du dihydroxyester 9c (1,23 g; Rdt : 83% après chromatographie sur gel de silice; éluant : méthanol/dichlorométhane 5/95) à partir de l'ester 8c (1,55 g; 1,69 mmole) RMN-tH (200 MHz, CDCl3) :5 4,25 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 4,00-3,40 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH et -CH2-CO2-), 3,40-3,00 (m, 16 H, -CH2-N(BOC)-), 1,90-1,60 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,42 (4 s, 45 H, t Bu-).O Triesters 10a, pila, 12a et 13a Une solution de dicyclohexylcarbodiimide (142 mg, 0,69 mmole) dans le dichlorométhane sec (1 ml) est ajoutée à une solution de dihydroxyester 9a (130 mg, 0,23 rrmiole), d'acide oléique (195 mg, 0,69 mmole ; Fluka puriss.) et de 4 (diméthylamino)pyridine (3 mg, 0,02 mmole) dans le dichlorométhane sec (2 ml). Le mélange réactionnel est agité pendant 16 h à température ambiante. Le précipité de dicyclohexylurée est enlevé par filtration et le filtrat est concentré sous vide et chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant éther/hexane 3/7 puis 4/6) pour donner le triester 10a (142 mg; 57%) sous forme d'une huile incolore. RMN-lH (200 MHz, CDCl3) : ô 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,01 (m, 8 H, -CH,-CH=), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,30 et 1,27 (2 s larges, 44 H, -CH2-) , 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). La même procédure que pour le triester 10a permet d'obtenir les triesters îla (rdt : 65%) , 12a (rdt : 64%) et 13a (rdt : 58%j à partir du dihydroxyester 9a et respectivement de l'acide myristique, de l'acide palmitique et de l'acide stéarique. 11a RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : # 5,26 (m, 1 H CH-OC(O)-), 4,45-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,C0 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2 CO2-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t Bu-), 1,26 (s, 40 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6.4 Hz, 6 H, Me-). 12a RMN-tH (200 MHz, CDCl3) : # 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-i, 3,35-3,03 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2 CO2-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t Bu-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). 13a RMN-lH (200 MHz, CDCl3) : ô 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,404,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2 CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-) , 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Triesters 10b, llb, 12b et 13b La même procédure que pour le triester 10a permet l'obtention du triester 10b (137 mg ; rdt : 61%) à partir du dihydroxyester 9h (130 mg, 0,18 mmole) et d'acide oléique (153 mg, 0,54 mmole Fluka puriss.). RMN-lH (200 MHz, CDC13) : 6 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,96 et 3,89 (2 n, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-) , 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-) , 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41 (4 s, 36 H, t-Bu-) , 1,30 et 1,27 (2 s larges, 44 H, -CH2-), 0.88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). La même procédure que pour le triester 10a permet d'obtenir les triesters lîb (rdt : 64%) , 12b (rdt : 58%) et 13h (rdt : 63%ì à partir du dihydroxyester 9b et respectivement de l'acide myristique, de l'acide palmitique et de l'acide stéarique. 11b RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : # 5,26 (m, 1 H, CH-OC (O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2CO2-) , 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41 (4 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 40 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me ).12b RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : ô 5,26 (m, 1 H, CH-OC(Oì-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2CO2-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41 (4 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 ts, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me ). 13b RMN-H (200 MHz, CDCl3) : 6 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2CO2-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46,1,45, 1,44 et 1,41 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Triesters 10c La même procédure que pour le triester 10a permet l'obtention du triester 10c (0,75 g; Rdt : 47%) à partir du dihydroxyester 9c (1,00 g; 1,14 mmole) et d'acide oléique (0,97 g; 3,42 mmoles; Fluka puriss.). RMN-lH (200 MHz, CDCl3):d 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,89 (2 m, 2 H, -N (BOC) -CH2-CO2-) , 3,35-3,00 (m, 16 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,01 (m, 8 H, -CH-CH=), 1,85-1,50 (m, 12 H, -CH2-) , 1,46, 1,44, 1,43 et 1,41 (4 s, 45 H, t-Bu-) , 1,30 et 1,27 (2 s large, 44 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Glycérolipides pcTG20 Le triester 10a (120 mg, 0,11 mmole > en solution dans le dichlorométhane sec (1 ml) est traité pendant 3 h avec un mélange 1/1 d'acide trifluoracétique et de dichlorométhane sec (20 ml) à 0 C. On ajoute ensuite de l'hexane (50 ml) et le mélange est évaporé sous vide et donne un film qui est mis en suspension (vortex) dans de l'éther distillé (5 à 10 ml). La filtration donne une poudre blanche qui est lavée avec de l'éther et séchée sous vide pour donner le glycérolipide pcTG20 (124 mg; 99%). Point de fusion : se décompose à 1600C. RMN-lH (200 MHz, CDCl3 - CF3C O2D) : 6 5,34 (m, 5 H, -CH= et CH OC(O)-), 4,60 - 4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,99 (s large, 2 H, NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,20 (m, 8 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-) , 2,50-2,20 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2'-) , 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=), 1,61 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,30 et 1,27 (2 s, 44 H, CH2-) , 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Analyse élémentaire : Calculé pour C53Hg2F9N3Ol2: C, 56,12%; H, 8,18% ; N, 3,70%. Trouvé : C, 56,3% ; H, 7,9% ; N, 3,7%. Glycérolipide pcTG35 La même procédure que pour le lipide cationique pcTG20 permet l'obtention du lipide cationique pcTG35 (101 mg; rdt : 97%) à partir du triester 10b (100 mg, 0,08 mmole). Point de fusion se décompose à 1900C. RMN-1H (200 MHz, CDCl3 - CF3C O2D) : ô 5,35 (m, 5 H, -CH= et CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 4,00 (s large, 2 H, -NH-CH2-CO2-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH-NH2- ), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,45-2,20 (m, 6 H, -CH2CH2-NH2±), 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=) , 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,30 et 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Analyse élémentaire : Calculé pour C58H100F12N4O14 : C, 53,36%; H, 7,72%; N, 4,29%. Trouvé : C, 53,2% ; H, 7,6% ; N, 4,3%. La spectrométrie de masse a été mesurée à 849,8 Da (calculée 849,3 Da). Glvcérolipide pcTG56 La même procédure que pour le glycérolipide pcTG20 permet l'obtention du glycérolipide pcTG56 (0,51 g; Rdt : 93%) à partir du triester 10c (0,52 g; 0,37 mmole) . Point de fusion : se décompose à 220 C. RMN-1H (200 MHz, CDCl3- CF3CO2D): 5,36 (m, 5 H, -CH= et CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 4,00 (s large, 2 H, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,10 (m, 16 H, -CH2-NH2'-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2 ), 2,28 (m, 8 H, -CH2-CH2-NH2±), 2,01 (m, 8 H, -CH-CH=) , 1,61 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,30 et 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Glycérolipides pcTG18, pcTG21 et pcTG19 La même procédure que pour le glycérolipide pcTG20 permet d'obtenir les glycérolipides pcTG18 (rdt : 97%; solide; se décompose à 165 C), pcTG21 (rdt : 96%; solide; se décompose à 170 C) et pcTG19 (rdt : 92% ; solide ; se décompose à 186 C) à partir respectivement des triesters lla, 12a et 13a. pcTG18 RMN-1H (200 MHz, CDCl3-CF3C 02D) : 6 5,35 (m, 1 H, CH-OC(O) ), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 (s large, 2 H, -NH2±CH2- CO2-), 3,45-3,15 (m, 8 H, -CH2-NH2±), 2,38 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, CH2-CO2-) , 2,45-2,20 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2 -), 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2CO2-), 1,25 (s, 40 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 684,1 Da ; mesurée 684,5 Da. pcTG21 RMN-1H (200 MHz, CDCl3-CD3OD) : 6 5,20 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,45-4,00 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,78 (s large, 2 H, -NH2-CH2-CO2-), 3,15-2,40 (m 8 H, -CH2-NH24-), 2,24 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2, 18-1,92 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2±), 1,52 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,17 (s, 48 H, -CH2-), 0,79 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée : 740,2 Da ; mesurée 740,6 Da. pcTG19 RMN-1H (200 MHz, CDCl3-CF3C O2D) : 6 5,38 (m, 1 H, CH-OC(O) ), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 4,01 (s large, 2 H, -NH2-CH2- CO2-) , 3,45-3,20 (m, 8 H, -CH2-NH2±), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, - CH2-CO2-) , 2,50-2,25 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2±), 1,61 (m, 4 H, -CH2-CH2- CO2-) , 1,26 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 796,3 Da ; mesurée 796,8 Da. Glycérolipides pcTG33, pcTG34 et pcTG36 La même procédure que pour le glycérolipide pcTG20 permet d'obtenir les glycérolipides pcTG33 (rdt : 97% ; solide ; se décompose à 205 C), pcTG34 (rdt : 94% ; solide ; se décompose à 215 C) et pcTG36 (rdt : 92% ; solide ; se décompose à 220 C) à partir respectivement des triesters 11b, 12b et 13b. pcTG33 RMN-1H (200 MHz, CDCl3-CF3C O2D) : ô 5,37 (m, 1 H, CH-OC (O)- ), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 4,00 (s large, 2 H, -NH2-CH2- CO2-), 3,45-3,15 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, CH2-CO2-) , 2,45-2,17 (m, 6 H, -CH2-CH2-NH2'-) , 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2CO2-) , 1,25 (s, 40 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-) Spectrométrie de masse : calculée 741,2 Da ; mesurée 741,6 Da pcTG34 RMN-'H (200 MHz, CDCl3-CF3 C O2D) : # 5,37 (m, 1 H, CH-OC (O) ), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,98 (s large, 2 H, -NH2±CH2 CO2-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH2-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, CH2-CO2-) , 2,45-2,15 (m, 6 H, -CH2-CH2-NH2±), 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2- CO2-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0, 87 (t, J - 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 797,3 Da ; mesurée 797,8 Da. pcTG36 RMN-1H (200 MHz, CDCl3-CF3C O2D) : ô 5,35 (m, 1 H, CH-OC(O) ), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,98 (s large, 2 H, -NH2±CH2- CO2-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH-), 2.37 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, CH2-CO2-), 2,45-2,15 (m, 6 H, -CH2-CH2-NH2±), 1,59 (m, 4 H, -CH2-CH2- CO2-) , 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-) Spectrométrie de masse : calculée 854,4 Da ; mesurée 854,0 Da. Clycérolipide pcTG22 Une voie un peu différente de celle décrite ci-dessus a permis l'obtention du glycérolipide pcTG22 à partir du 3-amino-1,2propanediol. RMN-lH (200 MHz, CDCl3 - CD3OD) : ô 5,04 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,273,92 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 3,63 (s large, 2 H, -CH2-C(O)-NH-), 3,10-2,90 (m, 8 H, -CH2-NH2'-), 2,24 et 2,23 (2 t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-) , 2,15-1,95 (m, 4 H, -CH,-CY-N-'), 1,51 (m, 4 H, -CM -CH CO2-), 1.17 (s, 56 H, -CH2-), 0,79 (t, J = 6,7 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 795,3 Da ; mesurée 795,3 Da. Glycérolipide pcTG90 Une procédure analogue à celle décrite pour la synthèse du lipide pcTG56 permet l'obtention du lipide pcTG90 en utilisant le 3amino-1,2 propanediol à la place du glycérol. B : Préparation des complexes alycérolipides-ADN par mise en solution dans 1'éthanol 1. Préparation des complexes alycérolipides ocTG20 éventuellement DOPE, -ADN Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais en cultures cellulaires), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG20/DOPE et de l'ADN plasmidique à un rapport de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par l'ADN à une concentration d'ADN finale de 0,1 mg/mi, on mélange les différents ingrédients selon le calcul le suivant 0,1 mg d'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives (330Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à : 0,30 umole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration faut 0,74 mg/ml dans la préparation lipidique. Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives. Les lipides repris dans du chloroforme sont évaporés puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (v:v) et à nouveau évaporés. Les lipides cationiques sont pesés et la quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10 ou 20 mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2mM en lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (200 mbar) pendant 45 min à 45"C en utilisant un vortex de 40 tours par minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Allemagne). Le film lipidique est repris dans de l'éthanol pour être à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique. pcTG20/DOPE 1,13 mg + 0,74 mg = 1,87 mg dans 23 pl d'ethanol. Cette solution est complétée par 20mM HEPES pH 7,5 (ajusté avec NaOH) pour préparer une solution à Smg/ml finale en lipide cationique. pcTG20/DOPE : 230 1 final - 23 ul lipides = 207 121 d'HEPES. L'ADN piasmidique est préparé dans un tube plastique à partir d'une solution mère à l mg/ml (Tris 10mM, EDTA lmM, pH 7,5)- Pour une solution de 0,5 ml finale, on prelève 50 pi de la solution mère (50 pg ADN) auquel on ajoute 335 pi de 20mM HEPES pH 7,5. Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par aspiration/refoulage à la pipette (10fois). Les complexes sont conserves à + 4 C. 115 pi de pcTG20/DOPE sont ajoutés à 385 pî de la solution ADN pour obtenir 0,5 ml de complexe à 0,1 mg/ml ADN et un rapport de charges de 10. La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux laminaire. On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-après. 2. Préparation des complexes olycérolipides pcT35, pcTG22 et pcTG18 éventuellement DOPE,-ADN Selon le même protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-après. C . PréParation des complexes alvcérolipides-ADN par mise en suspension dans une solution de détergent 1. Préparation des complexes glycérolipides scTG20 éventuellement DOPE, -ADN Les quantités de lipides sont calculées comme décrit cidessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre, stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2mM en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, ss-D- glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, O 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole:mole). On prélève 253 121 d'une solution d'octylglucoside 20 mM dans de l'HEPES 20 mM pH 7,5 avec lesquels on reprend le film de mélange lipidique pcTG20/DOPE. L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont 50 121 sont placés dans 0,5 ml (0,1 mg/ml final) auquel on ajoute 323,5 121 d'HEPES 20 mM pH 7,5. 126,5 121 de la suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale à 0,1 mg/ml d'ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour éliminer le détergent, une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de l'HEPES 20 mM pH 7,5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion de 13,2 kD ; Sartorlus, Gottingen, Allemagne). Les complexes ADN/lipide dialysés sont conservés à + 4"C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire. On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-dessous. 2. Préoaration des complexes alycérolipides pcTG35 éventuellement DOPE,- ADN On applique le même protocole que précédemment. D . Préparation des complexes lipides-ADN par sonication extrusion Les quantités de lipides sont calculées comme décrit cidessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre, stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 121 d'HEPES 20 mM pH 7,5 à 4 C pendant environ 16h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0,2 um de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rinçée avec de l'HEPES 20 mM pH 7,5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure. 450 121 de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 121 d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4~C. Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire. E . Protocole d'évaluation de la complexation de 1'ADN par les lipides Un gel à 1% (w:v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE (TAE : Tris 4,8 g/l + acétate de sodium 0,68 g/l + EDTA 0,336 g/l pH 7,8. Si nécessaire, l'échantillon est dilué dans du TAE puis on ajoute le tampon d'échantillon (0,083% bleu de bromophénol, 0,083% cyanol xylène FF, 10% glycérol dans l'eau) de façon à se trouver à 50 ngADN/,ul. L'échantillon est brièvement vortexé et laissé 30 min à température ambiante. A titre de témoin, on utilise le plasmide non-complexé préparé à la même concentration. 10 pi (500 ng d'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. Le gel est révélé dans du TAE contenant 0,006% (v:v) de bromure d'éthidium à 10 mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV. F . Protocole de mesure de la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics France S.A., Margency, France) à 250C après équilibration de l'échantillon pendant 20 min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'être pipettée. L'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénisé. La mesure de la lumière diffractée à 900 est faite pendant i80 sec après 180 sec d'attente. La gamme utilisé va de 3 nm à 10 000 nm en utilisant 31 bins. Pour être valable, l'échantillon doit donner entre 50 000 et 1 000 000 counts/sec. G . Caractéristiques physico-chimiques Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol", "dialyse de détergent" et "sonication/extrusion" sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10, ou 5. Les formulations sont considérées comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes présentent un diamètre déterminé par diffusion quasi élastique de la lumière inférieur à 500 nm. Le tableau résume les résultats de ces analyses. Tous les complexes ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement. TABLEAU I glycérolipide Taille (nm)2 Formulatior cationique Rapport pcTG20/DOPE 10 84 +/-20 éthanol pcTG20/DOPE 10 212 +/-141 détergent pcTG20/DOPE 5 96 +/-17 éthanol pcTG35/DOPE 10 67 +/-22 éthanol pcTG35/DOPE 5 93 +/-39 éthanol pcTG35 10 83 +/-11 éthanoi pcTG35 5 693 éthanol pcTG33 10 223 +/-138 sonication pcTG33/DOPE 10 243 +/-172 sonication pcTG22 10 79 +/-59 éthanol pcTG22 5 87 +/-52 éthanol pcTG22/DOPE 10 261 +/-98 sonication pcTG22/DOPE 10 89 +/-146 éthanol pcTG22/DOPE 5 72 +/-44 éthanol pcTG18 1G 68 +/-53 éthanol pcTGi8 5 72 +/-30 éthanol pcTGl8/DOPE 10 62 +/-43 éthanol pcTG18/DOPE 5 109 +/-64 éthanol Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN. 2 : déterminée 24 à 48 heures après la préparation (+/ représente la déviation standard de la mesure). 3 : déterminée 8 jours après la préparation Ces analyses montrent que les formulations remplissent les exigences requises. La méthode "injection d'méthanol donne les meilleurs résultats pour de nombreuses préparations qui présentent une taille inférieure à 100 nm. Les méthodes par dialyse de détergent et sonication/détergent permettent également d'obtenir certains complexes répondant aux buts de la présente invention. H . Transfection in vitro de cellules satellites Des cultures de muscles de chien et de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté avec 10 % de sérum foetal de veau (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 ,ug/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux), et 40 ug/ml de gentamycine (Schering Plough). Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la transfection, dans une boîte de cellules à 96 puits avec environ 5x103 à 104 cellules par puits, à environ 30 % de confluence, et maintenues à 370C en atmosphère 5 % CO2 et 95 % d'air. Les transfections sont effectuées avec des mélanges de quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN optimales par puits. Les complexes utilisés sont préparés 24 h à 48 h avant la transfection et dilués dans HamF 14 plus 40 ug/ml de gentamycine et de la glutamine 2mM. Après élimination du milieu de culture, 100 121 de mélanges de transfection avec ou sans 10 % de FCS sont transférés dans chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37"C. Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à 10 % de FCS, 10 pg/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ), de la glutamine 2mM (bioMérieux), et 40 ,ug/ml de gentamycine (Schering Plough) pour un volume final de 250 121. Les cultures sont incubées pendant 48 h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations de protéines sont déterminées par le système de test de quantité de protéine (Promega). I . Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques Les cellules A549 (cellules epithéliales dérivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 96 puits (2 x 104 cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37"C et 5% C02/95% air. Pour la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et remplacé par du milieu sans sérum. Dans une autre microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes sont préparées (complexes lipides/ADN à 0,1 mg/ml d'ADN et au rapport de charges indiqué) : 44 121 (4,4 12g ADN), 22 pi (2,2 pg ADN), 5,5 pi (0,55 12g ADN) de solution stock dans les 3 premiers puits, et 11 121 (0,11 g ADN) de la solution stock diluée 10 fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 121 avec du DMEM et 100 121 sont transférés sur les cellules A549. L'incubation se fait avec 4, 2, 0,5 et 0,1 g d'ADN par puits pendant 4 heures. Ensuite, 50 121 de DMEM + 30% de sérum de veau foetal sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis 100 121 de DMEM + 10% FCS 24 heures après le début de la transfection. Les transfections en présence de 10% de sérum de veau foetal sont réalisées d'une façon identique sauf que la transfection se passe dans du milieu avec sérum. J . Analvse de la transfection 48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 121 de solution phosphate PBS et lysées avec 50 121 de tampon de lyse (Promega). Les lysats sont congelés à -80 C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase. Celle-ci se fait sur 20 pi de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la "Luciférase" (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 96 puits en mode cinétique. K .Transfection in vitro Quelques-unes de ces préparations ont été évaluées en transfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les cellules satellites primaires de chien. Les résultats sont résumés dans le tableau II ci-dessous et montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les valeurs données sont obtenues avec 2 pg d'ADN par puits. Tous les complexes sont préparés en utilisant la méthode d'injection d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA, Pierce). A titre indicatif, un puits contienenviron 20 à 30 ug de protéine. TABLEAU II Lipide rapport1 A5492 A549+ sérum myoblastes yobiastes + sérum 10 3,6 x 105 6,1 x 106 8,9 x 105 2,3 x 107 pcTG20/DOPE pcTG20/DOPE 5 8,25 x 106 2,8 x 107 8,8 x 105 1,3 x 106 pcTG35/DOPE 10 4 x 106 1,0 x 107 7,1 x 103 6,5 x 107 pcTG35jDOPE 5 3,3 x 6,8 x 107 4,3 x 106 1,0 x 108 107 pcTG35 10 1,2 x 106 7,6 x 106 1,8 x 107 6,2 x 108 pcTG35 5 1,6 x 6,6 x 107 3,4 x 108 1,7 x 108 108 Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de i'ADN. 2 :ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative. L'expression de la luciférase (RLU/min) rapportée en mg de protéines donne les valeurs suivantes pcTG35 R +/- 10 (A549) 3,4 x 1010 RLU/min/mg protéine pcTG35 R +/- 5 (A549) 2,8 x 10l RLU/min/mg protéine pcTG35/DOPEv R +/- 5 (A549 + sérum) 1,0 x 1010 RLU/min/mg protéine Les composés pcTG20 et pcTG35 sont capables de transfecter efficacement les deux types de cellules testées. On notera que certaines formulations donnent des résultats plus élevés en présence de sérum et que le sérum n'a pas d'effet inhibiteur sur ce type de préparation. L . Analyse de la taille des particules (selon le protocole décrit en F). Les analyses conduites par PCS montrent que la taille des particules et leur aggrégation dépend forternent du rapport de charge, de la structure du lipide ainsi que de la présence ou absence de DOPE. Des complexes stables de 100 à 200 nm ont été obtenus de manière reproductible pour un rapport de charge de 10, lorsque le glycérolipide cationique est en excés par rapport à l'ADN (voir Figures 2). Les résultats montrent que seuls les complexes renfermant un glycérolipide C18 (pcTG19, pcTG36) présentent un problème de suspension, donnant lieu à de grands complexes dont la taille est variabl.e. Au contraire, les lipides de type oleyl renfermant 4 ou 5 charges (pcTG35, pcTG56) permettent d'obtenir des complexes d'environ 200 nm pour un rapport de charge de 5. Par ailleurs, nous avons montré qu'une quantité équimolaire de DOPE accroire légèrement la taille des particules et diminue la tendance qu'ont les complexes à s'agréger à un faible ratio de charge (voir Figures 2A et 2B). La DOPE permet en outre d'obtenir un effet stabilisant pour les complexes renfermant des glycérolipides C-14 OU C-i6 avec trois groupes amine (Figure 2A) ; cet effet n'est pas observé pour les composés homologues renfermant quatre groupes amine (Figure 2B > . La tendance des complexes à s'aggréger augmente considérablement pour un rapport de charge de 2.5 suggérant que les répulsions de charges est un facteur déterminant pour éviter le phénomène d'aggrégation. La comparaison des complexes renfermant des glycérolipides portant des acides gras de longueur croissante présentent des différences mineures entre les dérivés C-14, C-16 et cleyl pour un rapport de charge de 10, en particulier dans le cas des glycérolipides renfermant 4 groupes amine. Le nombre de groupes amine au niveau de la tête polaire des glycérolipides contenant des oleyl présente unt léger effet sur la taille des complexes (figure 2C). Il convient en outre de noter que les résultats observés par cette technique de mesure de la taille des complexes ont été confirmés par mesures réalisées par microscopie électronique. M - Injection intraveineuse de comPlexes selon l'invention. Les résultats sont résumés sur la figure 3. Des complexes selon l'invention ont été synthétisés selon les méthodes décrites précédemment à partir des glycérolipides pcTG35, pcTG56 et pcTG90, en présence d'une quantité équimolaire de DOPE, à un ratio de charge fixe de 5, en utilisant un plasmide contenant le gène de la luciférase pTG11033 (demande de brevet français n" 97108267). Les souris utilisées sont des souris femelles C57BL/6 de 9 à 11 semaines. Les injections intraveineuses sont effectuées dans la queue après désinfection de la peau a I'éthanol 70%. Le volume injecté est 200pu et la concentration en ADN est 0.24 mg/ml. Les tissus sont congelés dans de azote liquide et conservés à 80"C. Afin de mesurer l'activité luciférase, les tissus sont broyés mécaniquement à l'aide d'un pilon dans un mortier placé sur la carbogiace. 500ut ou 200pu d'un tampon de lyse (Promega) sont ajoutés aux débris de tissus obtenus à partir des poumons ou de la trachée, respectivement, et soumis à trois étapes de congélation/décongélation. Les débris cellulaires sont éliminés par centifugation et l'activité luciférase (en RLU/min, Unité de lumière relative par minute) est mesurée sur 20 121 de surnageant conformément aux instructions du fournisseur (Promega) en ajoutant 100 121 de réactif et en mesurant l'activité par luminescence. L'activité luciférase mesurée est standardisée par rapport à la quantité protéique à l'aide d'une gamme étalon réalisée à partir de luciférase disponible dans le commerce (Promega). La quantité de protéine totale est, par ailleurs, déterminée par la méthode colorimétrique d'acide bicinchoninique BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) à partir d'un alicote de surnageant. Ceci permet d'exprimer l'activité luciférase en RLU par milligramme de protéine extraite des tissus. Les résultats montrent que l'expression du gène reporteur luciférase dans les poumons après injection intraveineuse de complexes renfermant l'un des trois glycérolipides indiqués précédemment en présence de DOPE est nettement améliorée par rapport à l'injection de l'ADN seul d'un facteur environ 15 à 30 fois. Les valeurs indiquées sont des valeurs moyenne obtenues à partir de 2/6 souris injectées. REVENDICATIONS 1. Composé de formule I dans laquelle Rl, R2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C6-C23) alkyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, X est l'atome d'oxygène ou un radical amino -NR3, R3 étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6, et lorsque n > 1, m peut être identique ou différent. 2.Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) alkyle linéaires ou -C(=O! alcényle linéaires. 3.Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Rl, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) alkyle ou -C(=O) alcényle, comprenant de 12 à 20 atomes de carbone. 4.Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. 5.Composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. 6.Composé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est en outre conjugué à un ou plusieurs éléments de ciblage par l'intermédiaire d'au moins un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine. 7.Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit élément de ciblage est choisi parmi le groupe consistant en tout ou partie de sucres, de peptides, d'oligonucléotides, de lipides, d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de iigands spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogèniques, de peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels composés. 8.Composé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est sous forme cationique. 9. Composé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comporte de 2 à 7 charges positives, plus particulièrement de 3 à 5, et préférentiellement 5. 10. Composé selon les revendications 8 ou 9 caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les composés de formule suivante n=2 pcTG18 ou n=3 pcTG33 II n=2 pcTG21 ou n=3 pcTG34 III n=2 pcTG19 ou n=3 pcTG36 IV n=2 pcTG20 ou n=3 pcTG35 ou n=4 pcTG56 C18:1, [cis]-9 n=2 pcTG22 ou n=4 pcTG90 VI ll.Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications précédentes et au moins un adjuvant capable notamment d'améliorer la formation de complexe entre undit composé et une substance thérapeutiquement active. 12. Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que ledit adjuvant est un lipide neutre ou zwitterionique. 13.Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est ou dérive d'une phosphatidyl éthanolamine (PE), phosphatidylcholine, phosphosholine, sphyngomyeline, ceramide ou cérébroside. '4. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est la dioleylphosphatidyl éthanolamine (DOPE) 15.Composition selon les revendications 11 à 14, caractérisée en ce que le rapport en poids composé/adjuvant est compris entre 0,1 et 10. 16.Complexe comprenant au moins un composé selon l'une des revendications 8 à 10 ou au moins une composition selon l'une des revendications 11 à 15 et au moins une substance thérapeutiquement active comportant au moins une charge négative. 17.Complexe selon la revendication 16 caractérisé en ce que ladite substance thérapeutiquement active est choisie parmi les acides nucléiques et les protéines. 18. Complexe selon la revendication 17 caractérisé en ce ladite substance thérapeutiquement active est un acide nucléique choisi parmi le groupe consistant en un cADN, un ADN génomique, un ADN plasmidique, un polynucléotide antisens, un ARN messager, un ARN ribosomique, un ribozyme, un ARN de transfert, ou un ADN codant pour de tels ARN. 19. Complexe selon la revendication 18 caractérise en ce ledit acide nucléique comprend un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. 20.Ccmplexe selon l'une des revendications 16 à 19 caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 500 nm, avantageusement inférieure à 200 nm. 21. Complexe selon l'une des revendications 16 à 20 caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 100 nm. 22. Complexe selon l'une des revendications 16 à 21, caractérisé en ce que le rapport entre le nombre de charges positives du ou des composés et/ou compositions cationiques et le nombre de charges négatives de ladite substance thérapeutiquement active varie de 0,05 à 20, plus particulièrement de 0,1 à 15 et de préférence de 5 à 10. 23. Procédé de préparation d'un complexe selon les revendications 16 à 22, caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs composés selon l'une des revendications 8 à 10 et/ou au moins une composition selon l'une des revendications 11 à 15 avec une ou plusieurs substances thérapeutiquement actives comportant au moins une charge négative et en ce que l'on récupère ledit complexe. 24. Procédé de préparation selon la revendication 23, caractérisé en ce que lesdits composés et/ou des compositions sont au préalable mis en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment l'méthanol ou le diméthylsulfoxide ou un mélange des deux. 25. Procédé de préparation selon la revendication 23, caractérisé en ce que lesdits composés et/ou des compositions sont au préalable mis en suspension dans une solution de détergent. 26. Procédé de préparation selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'on procède en outre à une étape de purification dudit complexe par dialyse. 27. Procédé de préparation selon la revendication 23, caractérisé en ce que lesdits composés et/ou des compositions sont au préalable soumis à une étape de sonication/extrusion. 28. Complexe caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 24 à 27. 29. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 16 à 22 pour transférer au moins une substance thérapeutiquement active, notamment un acide nucléique, dans des cellules cibles in vitro. 30. Utilisation selon la revendication 29 caractérisée en ce que ladite cellule cible est une cellule de mammifère. 31. Utilisation selon la revendication 30 caractérisée en ce que ladite cellule cible est sélectionnée parmi une cellule musculaire,une cellule souche hématopoïétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire. 32. Procédé de transfert in vitro d'une substance thérapeutiquement active dans une cellule cible, caractérisé en ce qu'on met en contact ladite cellule avec un complexe selon l'une quelconque des revendications 16 à 22. 33. Complexe selon l'une des revendications 16 à 22, à titre de médicament, à but curatif, préventif ou vaccinai. 34. Complexe selon la revendication 33 pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une substance thérapeutiquement active, notamment un acide nucléique, dans des cellules cibles. 35.Complexe selon la revendication 34 caractérisé en ce que ladite cellule cible est une cellule de mammifère. 36. Complexe selon la revendication 35 caractérisé en ce que ladite cellule cible est sélectionnée parmi une cellule musculaire, une cellule souche hématopolétique, une cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une cellule de l'épithélium respiratoire. 37. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, d'une composition selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 16 à 22 pour la préparation d'un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal destiné au traitement du corps humain ou animal, notamment par thérapie génique. 38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré par injection intramusculaire, par inhalation, par injection intratrachéale, par instillation, par aérosolisation, par voie topique ou par voie orale. 39. Préparation pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un complexe selon l'une quelconque des revendications 16 à 22 ou 28. 40. Préparation selon la revendication 39 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir de transfection dudit complexe. 41. Préparation selon la revendication 40 caractérisée en ce que ledit adjuvant est choisi parmi le groupe consistant en la chloroquine, un composé polaire protique notamment choisi parmi le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol, l'éthanol, le 1-methyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, ou un composé polaire aprotique notamment choisi parmi le diméthylsulfoxide (DMS0), le diéthylsulfoxide, le di-n-propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la diméthylformamide, le diméthylacetamide, la tetraméthylurée, l'acétonitriie ou leurs dérivés. 42. Préparation selon l'une des revendications 39 à 41 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique permettant son administration à l'homme ou l'animal. 43. Cellule transfectée par un complexe selon l'une quelconque des revendications 16 à 22.