Brevet FR2748569A1 — publié le 19971114

PROCÉDÉ ET INSTALLATIONS DE SÉPARATION DE PARTICULES MAGNÉTIQUES DANS UN FLUIDE POUR L'ANALYSE BIOLOGIQUE, ET APPLICATION DUDIT PROCEDE. La présente invention concerne un procédé et une installation de séparation de particules magnétiques dans un fluide pour l'analyse biologique d'événements rares. L'invention trouve plus particulièrement son application dans les domaines du diagnostic médical et du contrôle de qualité notamment dans l'industrie agroalimentaire, mais aussi dans le domaine thérapeutique pour détecter et prélever dans des échantillons un type cellulaire à faible occurrence. On peut citer à titre d'exemples d'applications médicales de l'invention - La séparation de cellules foetales présentent dans le sang maternel. I1 s'agit dans ce cas de recueillir, de façon sélective, des cellules présentes à raison de environ 1 cellule foetale pour 10 millions de cellules non foetales. La mise en oeuvre de la présente invention devrait permettre de remplacer les prélèvements à risque de cellules amniotiques. - La préparation de cellules souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimio ou radiothérapie. Comme dans le cas des cellules foetales, le nombre de cellules de la moelle osseuse dans le sang périphérique est très inférieur à celui des autres cellules, de l'ordre de 1 pour 200 000. - La détection précoce des cellules cancéreuses circulantes ou micro métastase, qui est du plus haut intérêt pour déterminer des stratégies exploratoires et thérapeutiques. Là encore, l'objectif est d'isoler et d'identifier 1 cellule pour environ 5 millions de cellules nucléées. Dans le domaine du contrôle biologique des aliments ou de l'environnement, l'objectif est d'obtenir un résultat rapide sans passer par la phase traditionnelle de multiplication en culture. Les sensibilités attendues sont de l'ordre de 1 cellule (bactérie, levure ou moisissure) pour 1 gramme voire 10 grammes de produit. il existe dans l'art antérieur de nombreux dispositifs permettant d'atteindre ce but. On peut citer parmi ceux-ci - Les méthodes physiques basées sur les différences de taille, de densité ou de charge électrique (De Duve, 1971 ; Zeiller, 1972 ; Pretlow et Pretlow, 1982).Mais ces méthodes présentent un manque de spécificité. - Les méthodes d'immuno-affinité consistant à fixer un anticorps sur un support, lequel anticorps réagit vis-à-vis d'un motif antigénique présent à la surface des cellules recherchées (Forsgren et Sjoquist, 1986 ; Langone, 1982). Différents procédés dérivant des méthodes d'immuno-affinité, tels que la chromatographie d'affinité shunt et al., 1982), ont été proposés. - La séparation cellulaire associée à une détection de fluorescence relevant de la méthode dite "FACS" pour l'expression anglaise "Fluorescence Activated Cell Sorting". Cette méthode largement décrite met en oeuvre des équipements sophistiqués comprenant un flux liquide dans lequel défilent les cellules. Un faisceau laser excite la fluorescence et déclenche ainsi un signal qui permet de dévier électriquement la cellule dans un récipient. Cette méthode est très efficace et permet d'atteindre un enrichissement de près de 100 % mais elle n'est pas adaptée au tri de populations importantes. - Les méthodes de séparation magnétique désignées "MACS" pour l'expression anglaise "Magnetic Affinity Cell Sorting", qui reposent sur l'utilisation de particules magnétiques ingérées par les cellules (Melville et al., 1975) ou fixées sélectivement aux cellules par le biais d'anticorps (Molday et al., 1977). Les méthodes FACS et MACS sont aujourd'hui bien connues et ont déjà donné lieu à une mise en oeuvre industrielle. D'une façon générale, les résultats obtenus avec chacune de ces méthodes diffèrent peu en terme d'efficacité et permettent entre 70 et 100 % de récupération. Toutefois, elles sont plus ou moins adaptées aux diverses applications envisagées. La présente invention est fondée également sur la mise en oeuvre de particules magnétiques à la surface desquelles est immobilisée une substance capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente sur la surface de cellules. L'analyse est réalisée en milieu liquide en soumettant le milieu biologique dans lequel a été introduit lesdites particules magnétiques à un champ magnétique. Les particules magnétiques plus particulièrement envisagées dans le cadre de l'invention sont des microbilles du type de celles commercialisées par les Sociétés Dynal, Rhône Poulenc ou Sigma. Ces microbilles paramagnétiques de taille micronique peuvent comporter à leur surface différents ligands selon l'application qui est envisagée. Ces ligands sont fixés à la surface des microbilles par les techniques décrites dans l'art antérieur, ces ligands peuvent être - Des anticorps poly ou monoclonaux spécifiques d'antigènes présents à la surface de certains types cellulaires, comme les protéines CD2, CD4, CD8 exprimées à la surface des lymphocytes T. Ces anticorps sont fixés à la surface des microbilles par exemple par le biais d'immunoglobulines. - Des oligonuléotides, par exemple oligo(dT) ou oligo(dA) de tailles variables, biotinylés et donc fixés à la surface des microbilles par le biais de streptavidine. Ces oligonucléotides permettent par hybridation de purifier ou extraire de 1'ARN ou de 1'ADN d'échantillons préalablement traités de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider. La mise en oeuvre de ces oligonucléotides fixés à la surface des billes paramagnétiques peut aussi constituer une phase préparative pour un protocole d'amplification par PCR ou un clonage après PCR, ou encore être utilisée pour un séquençage en phase solide. Les billes ainsi chargées d'un ligand sont mises en contact avec l'échantillon ayant éventuellement subi un traitement préalable, afin de réaliser la ségrégation de l'événement recherchée par l'action d'un champ magnétique. Mais l'utilisation de cette technique présente l'inconvénient de nécessiter des manipulations multiples et conduit à un ensemble de billes plus ou moins agrégées par l'action de l'aimant parmi lesquelles se trouvent quelques rares cellules. La disproportion du nombre de billes par rapport au nombre de cellules, de l'ordre de 1 pour 10, rend alors l'identification et le recueil de ces cellules impossible. Diverses solutions sont proposées dans l'art antérieur pour supprimer ces inconvénients, comme l'action d'un détergent qui libèrent les noyaux cellulaires mais interdisent ultérieurement l'usage ou l'identification visuelle ou par un anticorps des cellules séparées, ou encore l'usage de produits de détachement qui agissent de façon variable. Or, dans certains cas, le caractère vital des cellules séparées est primordial, soit parce que l'on envisage une réutilisation thérapeutique des cellules, cas des cellules souches hématopoïétiques, soit une remise en culture cellulaire in vitro pour amplifier un signal, cas des cellules foetales. Les techniques classiques mettant en oeuvre des microbilles décrites ci-dessus peuvent alors avoir une action lésante sur les cellules et empêchent l'utilisation de colonnes séparatrices imposant aux cellules un parcours compliqué et traumatisant. Les procédés de l'état de la technique ne sont donc pas totalement satisfaisants. Notamment des artefacts réduisent les performances théoriquement prévisibles. En effet, les billes paramagnétiques excédentaires ont parfois tendance à former une gangue emprisonnant totalement une cellule cible. Compte tenu de la très faible occurrence des cellules cibles, ce phénomène est particulièrement néfaste. Par ailleurs, les opérations de séparation nécessitent le respect minutieux d'un protocole fastidieux et répétitif, qui est source d'erreur. Le but de la présente invention est donc d'offrir un procédé supprimant les étapes de rinçage et d'élimination des cellules et liquides non recherchés et conjointement la sélection automatique des éléments recherchés et la ségrégation d'avec les billes paramagnétiques libres. Un autre but de la présente invention est d'améliorer l'efficacité des procédés magnétique en évitant les artefacts relevés dans les procédés de l'art antérieur et en simplifiant le protocole de mise en oeuvre. Elle a pour but de faciliter la séparation en vue de la numération, de l'analyse, ou du traitement, de matériel biologique présent à de très faibles concentrations dans un échantillon. Les sensibilités recherchées dans les domaines susvisés peuvent être de l'ordre de 1 cellule pour 1 voire 10 grammes d'échantillon. Ces buts sont atteints grâce à un procédé et une installation combinant, après la mise en contact de l'échantillon et des billes, à la fois le flux et la séparation magnétique. A cet effet, l'invention concerne tout d'abord un procédé de séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes, du type consistant à fixer les cellules cibles sur des billes paramagnétiques et à faire agir un champ magnétique sur un échantillon contenant les cellules fixées, les cellules libres et les billes paramagnétiques excédentaires, pour isoler les billes paramagnétiques, caractérisé en ce que l'on fasse circuler l'échantillon dans un tube dont la section est très inférieure à la longueur sur laquelle s'applique le champ magnétique. L'échantillon s'écoule de préférence à une vitesse de quelques centimètres par seconde. Les billes excédentaires, en raison de leur densité inférieure à celle des cellules marquées ou non marquées, ou les amas de billes paramagnétiques, du fait de leur forte sensibilité au champ magnétique, sont rapidement attirées contre la paroi du tube et sont immobilisées dans la partie proximale du tube. Les cellules non fixées sont insensibles au champ magnétique et traversent le tube. Les cellules fixées sur des billes paramagnétiques sont entraînées par le flux à l'intérieur du tube, avant d'être immobilisées contre la paroi du tube, dans la partie distale du tube. On procède ainsi à une séparation géométrique des composants de l'échantillon, qui permet une récupération des cellules cibles par différents moyens simples à mettre en oeuvre. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, on fait circuler l'échantillon dans un tube enroulé en spiral placé dans un champ magnétique dont les lignes de flux sont sensiblement perpendiculaires au plan de la spirale. Avantageusement, la section du tube est comprise entre 0,5 et 3 millimètres et la longueur du tube est supérieure à 10 centimètres. De préférence, le tube est placé dans un champ magnétique non homogène. Ce champ peut être produit par un aimant permanent ou par un électroaimant. Selon une variante avantageuse, la préparation est introduite dans un réservoir raccordé au tube de séparation, ledit réservoir étant surélevé par rapport au tube pour assurer une circulation de l'échantillon par gravité. L'invention concerne également une installation pour l'immunoséparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur, ledit tube étant enroulé pour former une spirale, et par au moins un aimant disposé pour créer un champ magnétique sensiblement perpendiculaire au plan de la spirale formée par ledit tube. Selon un mode de réalisation particulier, elle comporte un tube présentant deux tronçons de section croissante, la deuxième section étant au moins 10 fois supérieure à la première section. L'invention concerne également des applications de ce procédé pour I'immunofiltration du sang en circulation extracorporelle le diagnostic prénatal l'analyse biologique en laboratoire. L'invention sera mieux comprise à la lecture de ce qui suit, faisant référence aux dessins annexés relatifs à des exemples non limitatifs de réalisation, où - la figure 1 représente une vue de face d'un dispositif selon l'invention ; - la figure 1' représente une vue de face d'un dispositif selon l'invention - la figure 2 représente une vue en coupe de la tubulure - la figure 3 représente une vue d'une variante de réalisation. - la figure 4 représente une vue en coupe transversale d'une variante de réalisation - la figure 5 représente une vue d'une deuxième variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique - la figures 6 représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique; - la figures 6' représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique; - la figures 6" représente une vue d'une autre variante de réalisation en oeuvre une pompe péristatique; - la figure 7 représente une vue en coupe d'un module de filtration pour la séparation des particules magnétiques. La figure 1 représente une vue de face d'un exemple de réalisation d'un dispositif selon l'invention. I1 est composé d'un réceptacle (1) pouvant contenir environ 10 à 50 millilitres, raccordé à une tubulure (2) enroulée en spirale et se terminant par une tubulure de sortie (3) munie d'une vanne (4). Un ensemble d'aimants permanents (5) est disposé radialement pour créer un champ magnétique non homogène. La disposition des aimants est indiquée à titre d'exemple, une disposition différente, par exemple sous forme d'aimants parallèles, étant également applicable. Les aimants (5) sont constitués par des barreaux en samarium-cobalt. Ces barreaux magnétiques peuvent éventuellement être montés sur un disque support rotatif. Cette variante permet d'entraîner à une étape du procédé les billes paramagnétiques fixées vers la sortie de la tubulure. A titre d'exemple, ils tournent alternativement de + 200. La vitesse maximale d'entraînement est de quelques millimètres par secondes, de façon à optimiser l'efficacité sur les particules paramagnétiques. On peut prévoir différents modes d'entraînement des aimants Si le mouvement se fait continûment dans le sens de l'écoulement, on facilitera l'évacuation des cellules et des particules Si le mouvement se fait continûment en sens inverse de l'écoulement, on retardera l'évacuation des cellules et des particules Si le mouvement est alternatif, on réalisera un brassage des particules facilitant le rinçage et l'élimination des cellules et des particules. La section de la tubulure (2) est d'environ 0,5 millimètres. Elle est réalisée en un matériau tel que le TEFLON (marque déposée). La longueur est d'environ 50 centimètres. L'utilisation du dispositif est la suivante: a) on introduit tout d'abord un liquide de rinçage de type PBS (nom commercial) dans une pipette de 20 millilitres b) on aspire l'échantillon de sang (7) qui a été préalablement incubé avec des particules paramagnétiques. On ajoute 9 millilitres de sérum physiologique (8). c) on connecte le réceptacle (1) à la tubulure en spirale (2) en évitant scrupuleusement la formation de bulles d) on surélève le réceptacle (1) de 30 centimètres environ par rapport à la spirale e) on ouvre la vanne (6) prévue entre le réceptacle (1) et la tubulure (2). Les liquides s'écoulent alors continûment du réceptacle (1) vers la tubulure (2) en spirale sous l'effet de la pression hydrostatique. f) on arrête l'écoulement après avoir laisser passer la moitié des 20 millilitres de liquide de rinçage. On peut, pendant cette phase, augmenter l'efficacité du rinçage en faisant tourner les aimants (5) de façon alternative, par exemple en répétant 5 fois un cycle de déplacement de 20 dans le sens trigonométrique, puis retour à la position initiale, puis 200 dans le sens antitrigonométrique. L'étape suivante consiste à la récupération des rosettes ou des noyaux des cellules recherchées. 1) Récupération des rosettes On éloigne la spirale (2) de l'influence des barreaux magnétiques (5), et on reprend l'écoulement du reste de liquide de rinçage. Celui ci va entraîner toutes les particules paramagnétiques et les cellules porteuses de particules paramagnétiques. Les particules recherchées pourront ainsi être récupérées par filtrage, à l'aide d'un filtre laissant passer les particules paramagnétiques, mais pas les cellules. 2) Récupération des noyaux des cellules recherchées. Pour récupérer les noyaux des cellules, on maintiendra l'influence magnétique et on fera agir un nouveau réactif qui aura la propriété de lyser les cellules fixées en libérant les noyaux durcis et colorés. A titre d'exemple, un tel réactif est constitué par le mélange suivant - Détergent, par exemple CETRIMIDE (Marque commerciale) - Fixateur, par exemple formaldehyde - Colorant nucléaire, par exemple iodure de propidium. Ce mélange est introduit dans le réceptacle (1) de telle sorte que le volume ne dépasse pas celui de la spirale (2). La coloration facilite la visualisation de la progression du liquide. On laisse ce mélange en contact 10 minutes avec la spirale. On actionne en mouvements alternés les aimants pour faciliter la libération des noyaux. On peut alors rincer pour récupérer les noyaux purs. Les aimants (5) étant toujours présents, aucune particule magnétique ne viendra contaminer la préparation. En revanche, les cellules étant détruites, l'identification des noyaux implique l'utilisation de réactifs d'hybridation moléculaire. Ceux-ci permettent de détecter des anomalies génétiques comme la présence d'un centromère surnuméraire (trisomie 21) ou des expressions amplifiées d'oncogènes, ou encore des expressions de gênes particuliers type P53. Par ailleurs, les noyaux purs colorés de façon stoechiométriques permettent de définir un niveau de ploïde qui caractérise les stades de cellules tumorales. La figure 1' présente une variante de réalisation d'un dispositif selon l'invention. Le dispositif comporte trois récipients (31 à 33) de réactifs et d'échantillons reliés à un tuyau séparateur (35) enroulé en spiral. Des robinets ou vannes automatiques ouvrent ou ferment le débit de chacun des récipients (31 à 33) vers le tuyau séparateur (35). Ce tuyau séparateur est placé dans un gradient de champ magnétique engendré par des aimants permanents (36) disposés en étoile, en sens radial alterné. L'extrémité aval du tuyau séparateur (35) débouche d'une part dans un tuyau de recueil (37) et d'autre part dans un tuyau d'évacuation (38). Des vannes ou robinets sont prévus sur chacun de ces tuyaux pour commander l'écoulement sous vers un récipient de rejet (39), sous vers des moyens d'analyse formés par un système de receuil sur filtre (40), par un récipient de recueil (41) ou par un détecteur de flux de particules (42). La figure 2 représente une vue en coupe d'un segment de tubulure. Sous l'effet des forces de Bernoulli, les particules ont tendance à se concentrer dans le centre du flux, où la vitesse est la plus importante. Sous l'effet des flux magnétiques, les billes paramagnétiques (10) plus légères et moins volumineuses que les particules non marquées (11) que les cellules marquées (12) sont très rapidement attirées vers la paroi (13) de la tubulure. La trajectoire des cellules non marquées (11) n'est pas perturbée par les flux magnétiques et celles-ci restent donc dans le centre du flux où elles sont rapidement entraînées vers la sortie. Les cellules (12) marquées se retrouvent dans la dernière partie de la tubulure (2). Eventuellement, la tubulure peut être réalisée par deux segments de section croissante, la première servant à retenir les billes excédentaires, et la seconde à retenir les cellules marquées. Les figures 3 et 4 représentent des vues respectivement en coupe médiane et en coupe transversale d'une variante de réalisation. La tubulure (2) est formée par une rainure (14) réalisée dans une plaque de matière plastique (15). Elle débouche d'une part sur l'un des bord latéraux pour permettre le raccordement à une tubulure de liaison avec le réceptacle (1) d'alimentation, et d'autre part avec un orifice transversal (16) traversant la plaque (15) permettant l'évacuation des fluides. Le dispositif est formé de deux plaques symétriques (15, 15') et sont raccordées de manière à définir entre elles la tubulure de circulation du liquide. Elles présentent sur les surfaces extérieures des logements pour les aimants (17). La figure 5 représente une vue d'une deuxième variante de réalisation mettant en oeuvre une pompe péristatique. Dans cette variante, la progression des liquides n'est pas conditionnée par la gravité, mais par une pompe péristatique. Le dispositif est constitué par un élément tubulaire (22) formant une boucle séparatrice. L'une des extrémités aspire l'échantillon traité comme dans les exemples précédents. L'élément tubulaire (22) est disposé dans le champs d'aimants permanents (24 à 28) orientés perpendiculairement à la direction de déplacement du liquide, en sens alternés. L'élément tubulaire (22) est jetable, ce qui évite toute contamination de ses parois intérieures. Cet élément tubulaire (22) est raccordé au tube d'aspiration d'une pompe péristaltique (29) de type connu. Les déchets sont recueillis dans un tube d'essai (30) à la sortie de la pompe (29). La circulation du fluide à l'intérieur du tube est de préférence continu, avec une vitesse de l'ordre de 1 cm par seconde. La circulation en continu évite la formation d'adhésions cellulaires sur la paroi du tube de séparation. Les figures 6, 6 et 6" représentent une vue partielle d'une variante de réalisation. Les aimants forment une cage d'écureuil (32) constitué par une pluralité de barreaux magnétiques (33 à 40) aimantés radialement en sens alterné. Cette structure permet de positionner un ou plusieurs éléments tubulaires (22), et de traiter en parallèle plusieurs échantillons. L'utilisation d'un tel dispositif est la suivante - on immerge l'extrémité libre (23) du tuyau séparateur (22) dans l'échantillon qui a reçu au préalable les particules paramagnétiques. - on met en action la pompe (29) qui va faire passer les particules magnétiques et les cellules dans la boucle séparatrice disposée dans le champ magnétique. Les particules magnétiques et les rosettes constituées par les cellules marquées vont s'arrêter dans cette boucle tandis que les autres cellules vont s'évacuer. Pour procéder ainsi à une purge cellulaire, notamment dans un but thérapeutique, consistant à éliminer les cellules marquées afin de ne recueillir que les cellules non marquées, il est préférable de remplacer la pompe péristaltique par un autre moyen d'aspiration, par exemple une seringue aspirante ou une source de dépression, afin d'éviter l'écrasement des cellules non marquées. Ce mode de réalisation présente plusieurs avantages - il permet de traiter en parallèle un grand nombre d'échantillons, - il permet d'automatiser la gestion des étapes, - il permet de traiter de très grand volumes - il évite les volumes morts en amont de la zone de traitement de l'élément tubulaire. En effet, après le passage de l'échantillon, on peut éliminer le tube est passer les réactifs à partir de récipients non contaminés. Le risque de récupérer des cellules non spécifiques est très réduit. Par ailleurs, on peut alors faire plonger tous les tuyaux dans le même récipient réactif, ce qui simplifie les manipulations. La séparation des cellules marquées et des particules magnétiques non fixées après la mise en oeuvre d'un système de traitement selon l'une des variantes précédentes s'effectue avantageusement au moyen d'un dispositif de filtration dont un exemple de réalisation est décrit en figure 7. La recherche d'événements aussi rares que les cellules foetales ou les micrométastases implique d'extrêmes qualités et efficacité de toutes les étapes du procédé. I1 faut tout d'abord que les anticorps soient très efficaces pour assurer une bonne récupération des cellules visées. Il faut éviter les pertes cellulaires lors des manipulations de rinçage et de recueil. I1 faut aussi réduire au maximum les faux positifs résultant de cellules non spécifiques, mais aussi de cristaux de colorants et de résidus variés qui en fluorescences peuvent se confondre avec des cellules. L'analyse d'image est capable de résoudre certaines discriminations. Toutefois, dans le cas d'éléments rares de l'ordre de 1 à 50 cellules par échantillon, le nombre total d'artefact doit rester inférieur à ces valeurs, ce qui nécessitent des performances élevées de la chaîne de séparation des cellules marquées et des cellules non marquées, et une grande qualité de la récupération des cellules. Les procédures habituelles de recueil sur lame et de coloration génèrent un "bruit" qui n'est pas compatible avec de telles exigences. Le dispositif de filtration selon l'invention permet par contre de répondre à ces exigences. I1 est constitué par une pièce (41) en silicone moulé, à usage unique. Cette pièce (41) présente une épaisseur de l'ordre de 2 millimètres et présente douze protubérances (51) d'un diamètre de 6 millimètres et d'une hauteur de 10 millimètres. Ces protubérances (51), normalement obturées, peuvent être perforées par une aiguille creuse (48) prévue à l'extrémité du tube séparateur (42). La pièce en silicone (41) est positionnées dans une plaque perforée (43) rigide. Les perforations sont disposées de manière complémentaire aux protubérances (51) de la pièce (41). Cette plaque (43) peut être raccordée de manière étanche à un support (45) et maintenu en position par des griffes (44). Un joint torique vient compléter l'étanchéité de cet assemblage. Le support (45) présente également des perforations disposées en regard des perforations de la plaque (43). Le support est raccordé à une source de dépression. Une membrane de filtration microporeuse (47) est disposée entre la plaque (43) et le support (45). Il s'agit avantageusement d'une membrane microporeuse en polycarbonate dont les alvéoles présentent une section de 2 microns. Le fonctionnement de ce module de filtration est le suivant La pièce (41) est livrée avec un film protecteur placé sous la face inférieure. On peut ouvrir une ou plusieurs protubérances. On place la plaque (41) sur le support (43) après avoir positionnée la membrane microporeuse, et on verrouille l'ensemble à l'aide des griffes (44). Le tube de séparation (2) est livré avec un capuchon protecteur qui évite toute contamination. On retire ce capuchon et on perfore l'une des protubérances de la pièce (41). Lors du recueil des rosettes issues du séparateur, les particules paramagnétiques isolées traversent la membrane tandis que les rosettes restent en surface. La porosité de la membrane microporeuse laisse passer les particules paramagnétiques dont la section est de l'ordre du micron, mais pas les rosettes, dont la section est de l'ordre de 5 microns. Pour le recueil des noyaux, en l'absence de billes, la porosité peut être de 1 à 2 microns. La coloration peut se faire avant la filtration par des colorants fluorescents de type IP ou BET (nom commerciaux) ou encore par coloration sur le filtre après que ce dernier ait été extrait du système de contention. L'association d'un dispositif séparateur formé par un tube de section très inférieure à la longueur placé dans un gradient de champ magnétique, et d'un système de filtration tel que décrit ci-dessus, présente de nombreux avantages. Une telle association facilite tout d'abord l'automatisation de l'analyse biologique. Elle permet également de procéder à des analyses et à des utilisations à fins thérapeutiques nécessitant un haut degré de stérilité. Les billes paramagnétiques permettent un tri des cellules, et notamment une séparation des cellules recherchées et des autres cellules. Le filtre permet d'éliminer certaines cellules excédentaires, telles que des plaquettes, ainsi que les billes paramagnétiques excédentaires. Le filtre a également pour fonction la concentration des cellules rares recherchées sur une surface réduite facilitant l'analyse par imagerie. Ce filter permet également, pour des applications thérapeutiques notamment, de procéder à une culture des cellules recherchées. A cet effet, le filtre sert de support de cellules et peut etre alimenté avec un liquide nutritif propre à favoriser la mulitplication cellulaire. L'invention sera mieux comprise dans ce qui précède à titre d'exemple non limitatif. REVENDICATIONS 1 - Procédé d'immunoséparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de cellules cancéreuses circulantes, du type consistant à fixer les cellules cibles sur des billes paramagnétiques et à faire agir un champ magnétique sur un échantillon contenant les cellules fixées, les cellules libres et les billes paramagnétiques excédentaires, pour isoler les billes paramagnétiques, caractérisé en ce que l'on fait circuler l'échantillon dans un tube (2) dont la section est très inférieure à la longueur sur laquelle s'applique le champ magnétique. 2 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on fait circuler l'échantillon dans un tube (2) enroulé en spirale placé dans un gradient de champ magnétique. 3 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la section du tube est comprise entre 0,5 et 3 millimètres. 4 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la longueur du tube est supérieure à 10 centimètres. 5 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la préparation est introduite dans un réservoir raccordé au tube de séparation, ledit réservoir étant surélevé par rapport au tube pour assurer une circulation de l'échantillon par gravité. 6 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'on introduise sans mélange et sans couche interface dans le réservoir un premier volume de l'échantillon et un second volume d'un liquide de rinçage. 7 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la préparation est aspirée dans le tube placé dans le gradient de champs magnétique, l'extrémité aval dudit tube étant reliée à une pompe péristaltique. 8 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les aimants sont mobiles par rapport au tube, de préférence selon un mouvement alternatif. 9 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les réactifs et les échantillons s'écoulent de façon continue dans le tube de séparation magnétique, à une vitesse comprise entre 0,1 cm/s et 10 cm/s. 10 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une étape ultérieure de filtration à l'aide d'un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et inférieure au diamètre des cellules fixées. 11 - Procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une étape ultérieure de filtration à l'aide d'un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et de certaines des cellules excédentaires, et inférieure au diamètre des cellules fixées. 12 - Dispositif de filtration pour la mise en oeuvre du procédé d'immunoséparation magnétique selon la revendication 10 ou 11 caractérisé en ce qu'il est constitué par un filtre à membrane microporeuse dont la porosité est supérieure au diamètre des billes paramagnétiques et de certaines des cellules excédentaires, et inférieure au diamètre des cellules fixées. 13 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur et par au moins un aimant disposé pour créer un champ magnétique dans l'espace traversé par ledit tube. 14 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un réservoir disposé en amont du tube. 15 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 ou 14 caractérisée en ce qu'elle comporte un tube présentant deux tronçons de section croissante, la deuxième section étant au moins 10 fois supérieure à la première section. 16 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte deux plaques symétriques (15, 15') présentant une rainure formant une spirale, lesdites plaques supportant des aimants. 17 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de cellules cancéreuses circulantes caractérisée en ce qu'elle est constituée par un tube dont la section est très inférieure à la longueur, ledit tube présentant une première extrémité pour l'aspiration de l'échantillon et une seconde extrémité reliée à une pompe péristaltique, le tube étant placé dans un gradient de champs magnétiques. 18 - Installation pour l'immuno-séparation magnétique de cellules, en particulier de bactéries, de cellules foetales, de cellules souches de la moelle osseuse et de celles cancéreuses circulantes selon la revendication 17 caractérisée en ce que les champs magnétiques alternés sont produits par des aimants permanents disposés en cage d'écureuil. 19 - Dispositif de filtration pour la mise en oeuvre du procédé de séparation selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est constitué par un support relié de manière étanche à une source de dépression, et par un couvercle complémentaire présentant des moyens pour le raccordement de l'extrémité aval du tube de séparation cellulaire, la membrane de filtration interchangeable étant disposée entre le support et le couvercle. 20 - Dispositif de filtration selon la revendication 19 caractérisé en ce que le couvercle est constitué par une plaque perforée et par une pièce moulée présentant des zones perforables par l'extrémité d'un ou de plusieurs tubes de séparation cellulaire. 21 - Procédé de séparation de cellules foetales présentes dans le sang maternel caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler l'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène. 22 - Procédé de détection précoce des cellules cancéreuses circulantes ou micro métastase caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler l'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène. 23 - Procédé de préparation de cellules, notamment de souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimio ou radiothérapie caractérisé en ce que l'on fixe les cellules cibles sur des microbilles paramagnétiques à l'aide d'un ligand capable de se lier spécifiquement à une substance complémentaire libre ou présente à la surface de cellules et en ce que l'on fait circuler l'échantillon à travers une tubulure présentant une longueur très supérieure à la section, ladite tubulure traversant un champ magnétique non homogène. 24 - Procédé de préparation de cellules, notamment de souches de la moelle osseuse permettant de re-ensemencer des moelles détruites à la suite de traitement anticancéreux par chimio ou radiothérapie selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'on procède à une filtration des cellules ressortant de la tubulure placée dans le champ magéntique, à l'aide d'un filtre à membrane présentant une porosité supérieure à la section des billes paramagnétiques, et inférieure aux cellules recherchées fixées.