Brevet FR2756828A1 — publié le 19980612

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'acide chondroïtine sulfate à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire. L'acide chondroïtine sulfate est un polysaccharide constitué de dimères d'acide glucuronique et de N-acétyl galactosamine. Dans les tissus, les polymères d'acide chondroitine sulfate sont fixés covalemment à des chaines protéiques pour former des protéoglycanes. L'acide chondroïtine sulfate est bien connu pour son utilisation thérapeutique, notamment dans le traitement de la douleur due à l'arthrose. De nombreuses publications décrivent la production d'acide chondroïtine sulfate à partir de cartilages d'animaux tels que les bovins, ovins, porcins, chevaux, requins, poissons et baleines. Classiquement, L'acide chondroïtine sulfate est extrait d'organes cartilagineux d'origine bovine et notamment des trachées de boeufs. Le principe général de l'extraction de l'acide chondroïtine sulfate est le suivant : les organes cartilagineux sont soumis à une déprotéinisation alcaline ou une déprotéinisation enzymatique par une protéase alcaline ou acide de façon à débarrasser l'acide chondroïtine sulfate des glycoprotéines auxquelles il est associé à l'état naturel. La déprotéinisation est ensuite suivie d'une purification de l'acide chondroïtine sulfate réalisée par dialyse, séparation sur résine échangeuse d'ion ou précipitation avec des sels d'ammonium quaternaires du lysat issu de l'étape de déprotéinisation. L'acide chondroïtine sulfate ainsi obtenu est ensuite précipité au moyen d'un solvant organique, puis séché. Par ailleurs, de récents événements relatifs notamment à l'encéphalite spongiforme bovine, dite maladie de la vache folle, posent le problème de l'innocuité de l'acide chondroïtine sulfate en fonction de son origine. De plus, L'acide chondroïtine sulfate est un composé ayant une masse molaire élevée et par conséquent une viscosité également élevée, ce qui gêne sa mise en oeuvre à des fins thérapeutiques. On connaît des techniques pour réduire la masse molaire de l'acide chondroïtine sulfate : par chauffage entre 35 et 95 C en milieu acide, réaction radicalaire, utilisation d'une chrondroïtinase, passage de l'acide chondroïtine sulfate sur résine forme acide et chauffage ou chauffage de l'acide chondroïtine sulfate forme acide et sèche entre 5 et 120"C. Cependant, les procédés de l'art antérieur ne permettent pas de maîtriser avec précision la masse molaire de l'acide chondroïtine sulfate désirée. La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. En effet, elle concerne un nouveau procédé d'obtention d'acide chondroïtine sulfate d'origine aviaire, c'est-à-dire exempt de toute maladie propre aux mammifères, tout en permettant l'obtention d'un acide chondroïtine sulfate ayant la masse molaire désirée. En effet, le procédé d'obtention d'acide chondroïtine sulfate à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire conforme à l'invention, comprend les étapes suivantes: - broyage des organes cartilagineux, de façon à rendre le milieu plus accessible à l'étape suivante d'hydrolyse - hydrolyse du broyat obtenu, ayant pour but de déstructurer les tissus et de solubiliser les constituants; - séparation de l'acide chondroïtine sulfate de l'hydrolysat précédemment obtenu ; et - purification de l'acide chondroïtine sulfate. En fonction de la matière première utilisée, on obtiendra un acide chondroïtine sulfate présentant une masse molaire plus ou moins élevée. Si toutefois, on souhaite obtenir un acide chondroïtine sulfate de masse molaire moindre, on procède alors à une réduction du poids moléculaire avant l'étape de traitement par la soude de l'acide chondroïtine sulfate. Avantageusement, la réduction du poids moléculaire de l'acide chondroïtine sulfate est réalisée par l'acide chlorhydrique à une concentration, température et pendant une durée déterminées selon le poids moléculaire final recherché. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, L'étape de séparation de l'acide chondroïtine sulfate à partir de l'hydrolysat est réalisée par une décantation destinée à séparer les phases solides de la phase contenant l'acide chondroïtinc sulfate et de la phase graisseuse quand elle existe (comme c'est le cas pour les trachées de dindes ou de canards), suivie d'une étape d'isolement de chacune des susdites phases. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, l'étape de purification consiste tout d'abord en une ultrafiltration, ce qui permet d'éliminer toutes les molécules ayant une masse molaire inférieure à celle de l'acide chondroïtine sulfate que l'on cherche à obtenir et susceptibles de le contaminer, telles que les protéines hydrolysées, les glycoprotéines, les sels minéraux, etc., suivie d'un traitement de l'acide chondroïtine sulfate au moyen d'une base, puis d'une précipitation de l'acide chondroïtine sulfate. La base utilisée sera préférentiellement la soude. En effet, le traitement au moyen d'une base permet d'éliminer les résidus d'acides aminés qui sont encore fixés sur l'acide chondroïtine sulfate, mais la soude présente en outre l'avantage d'éradiquer les virus et les prions, bien que les matières premières utilisées dans le cadre de la présente invention n'ont pas été, jusqu'à présent, concernées par les maladies virales ou à prions. En ce qui concerne l'ultrafiltration, la cartouche d'ultrafiltration est à adapter à la masse molaire de l'acide chondroïtine sulfate à obtenir: - le seuil de coupure est de 3 kDa pour un acide chondroïtine sulfate d'au moins 3 000 Da, - le seuil de coupure est de 10 kDa pour un acide chondroïtine sulfate d'au moins 10 000 Da, - le seuil de coupure est de 30 kDa pour un acide chondroïtine sulfate d'au moins 30 000 Da. De façon à permettre une utilisation ultérieure de l'acide chondroïtine sulfate obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, ce dernier peut comprendre, après l'étape de purification, une étape de séchage de l'acide chondroitine sulfate purifié suivie du conditionnement dudit acide éventuellement précédé d'un broyage de façon à lui conférer la granulométrie souhaitée. Selon le mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé conforme à l'invention, les organes cartilagineux sont utilisés à l'état congelé. En effet, la congélation constitue non seulement un mode de stockage permettant d'attendre d'avoir des quantités suffisantes d'organes cartilagineux pour les broyer, mais également facilite le broyage du fait que les organes cartilagineux sont, sous forme congelée, plus aptes aux cassures mécaniques. Cependant, il convient également de souligner que les organes cartilagineux peuvent également être utilisés dans le procédé conforme à l'invention sous forme séchée. En effet, ce mode de conservation permet d'éviter les contraintes nécessaires au maintien de la chaîne du froid dans le cas des organes cartilagineux congelés. De plus, les produits déshydratés sont stables microbiologiquement tout en ayant un poids et un encombrement inférieurs à ceux des produits frais et mène à ceux des produits congelés (1 tonne d'organes cartilagineux congelés correspondant à environ 400 kg d'organes cartilagineux séchés). Les organes cartilagineux salés, notamment dans un but de conservation, peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, les organes cartilagineux susceptibles d'être broyés conformément au procédé de la présente invention, peuvent provenir de poulets, de poules, de coqs, de dindes, de canards, d'oies ou d'autruches. A titre préférentiel, ces organes cartilagineux sont choisis parmi les bréchets et les trachées. La présente invention a également pour objet l'acide chondroïtine sulfate obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention. La Figure 1 représente l'évolution de la masse molaire de l'acide chondroïtine sulfate par un traitement à l'acide chlorhydrique 1N à 48"C 1"C. La Figure 2 représente l'évolution de la masse molaire de l'acide chondroïtine sulfate par un traitement à l'acide chlorhydrique 1N à 55"C 1 C. On constate que, dans le cas de la Figure 1, les conditions opératoires permettent de diminuer le poids moléculaire de l'acide chondroitine sulfate de 3 350 daltons par heure, alors que dans le cas de la Figure 2, la vitesse d'hydrolyse permet une diminution de 8 000 daltons par heure. L'invention ne se limite pas à la description ci-dessus, elle en embrasse au contraire toutes les variantes. Elle sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne sont donnés qu'à titre illustratif et ne sont aucunement limitatifs de la présente invention. EXEMPLE 1 BROYAGE Hydrolyse enzymatique 3 000 kg de bréchets de poulets congelés (correspondant à environ 1 000 000 de poulets provenant d'élevage à surveillancc sanitaire) sont broyés dans un broyeur à couteaux de type alimentaire (ACEC) jusqu'à obtention d'un mélange homogène. Le broyeur est alimenté manuellement par charge de 25 kg de bréchets congelés. En fin de broyage de chaque charge, un apport d'eau potable permet de diluer le broyat qui peut ainsi être transféré dans un réacteur de 12 000 litres par l'intermédiaire d'une pompe. Le réacteur utilisé est un réacteur en acier inoxydable avec système d'agitation type turbine et serpentin extérieur pour réchauffage ou refroidissement. Il faut environ 3 heures pour broyer les 3 000 kg de bréchets congelés. Lorsque les 3 000 kg de bréchets broyés ont été introduits dans le réacteur de 12 000 litres, la température est portée à 60"C par circulation d'eau chaude dans le serpentin, après addition d'eau potable en quantité suffisante pour obtenir un volume de 8 000 litres. Une agitation à 60 tours/minute permet d'homogénéiser le mélange broyat et eau ainsi que la température. Puis, au mélange maintenu à 60 C sous agitation, on ajoute 17 kg d'alcalase en poudre qui sont dispersés par agitation. Le pH est contrôlé toutes les 30 minutes et, si nécessaire, une addition d'hydroxyde de sodium à 30 % dans l'eau est réalisée pour maintenir le pH entre 6 et 7. L'opération d'hydrolyse dure 8 heures. A la fin des 8 heures, I'hydrolysat est porté à 95"C par circulation de vapeur dans le serpentin pendant 15 minutes afin de procéder à la dénaturation thermique de l'alcalase. L'agitation est stoppée et on laisse refroidir, par circulation d'eau froide, jusqu'à température ambiante (25"C - 30 C). Séparation 1. Décantation Lorsque l'hydrolysat est refroidi, on le laisse reposer pendant 8 à 10 heures en maintenant la circulation d'eau froide dans le serpentin. Après l'élimination du surnageant, I'hydrolysat est transféré dans un réacteur en acier inoxydable de 15 000 litres. 2. Ultrafiltration Le volume d'hydrolysat est ajusté à 8 000 litres avec de l'eau potable puis on procède à une filtration sur Celiez au moyen de 100 kg de Celite, la moitié servant à former la "précouche" des plaques du filtre presse, I'autre moitié étant ajoutée à l'hydrolysat. Le filtre est recueilli dans un réacteur en fibres de verre revêtu intérieurement de résines époxy, d'une capacité de 15 000 litres et muni d'un système d'agitation par double hélice marine. L'ultrafiltration effectuée dans un appareil Millipore équipé de dix-huit membranes de 4,6 m2 chacune (Helican UF50 en polyéther sulfone pour 30 KDa) permet de concentrer la solution à un volume de 5 000 litres qui, après filtration sur filtre presse en présence de Celite, est transférée dans une cuve de polyéthylène de 6 000 litres. Le pH du filtrat est ajusté entre 6,5 et 7,5 par addition de solution d'acide chlorhydrique à 35 %. Réduction de la masse molaire L'hydrolysat est soumis à une hydrolyse par l'acide chlorhydrique 1N à 48"C pendant 5-6 heures, il est ensuite neutralisé par de l'hydroxyde de sodium puis refroidi. On procède alors à l'addition, sous une agitation de 60 tours/ minute d'hydroxyde de sodium microperlesn en quantité suffisante pour obtenir une solution normale (40 g/l). La solubilisation de l'hydroxyde de sodium est vérifiée par la mesure du pH (13,8 à 14). Une agitation rapide et intermittente (300 tours/minute) permet de maintenir l'homogénéité du milieu pendant 1 heure, tandis que la température est maintenue constante à 25-30"C grâce à un échangeur graphite. La solution est ensuite neutralisée (pH 6,7 à 7) par de l'acide chlorhydrique à 35 96 (environ 300 litres) tout en maintenant la température à 25-30"C grâce à l'échangeur graphite. Purification La solution obtenue à l'étape précédente est transférée dans un réacteur en acier inoxydable de 20 000 litres muni d'un agiteur à ancre. On y ajoute alors 15 000 litres d'éthanol sous agitation puis on laisse précipiter le sulfate de chondroïtine sodique pendant une huitaine d'heures. Le surnageant est éliminé par aspiration. Le précipité est mis en suspension dans 20 000 litres d'éthanol par agitation à 60 tours/minute, puis est laissé au repos pendant une huitaine d'heures. La phase surnageante est alors éliminée. Le lavage à l'éthanol est répété une seconde fois et le surnageant éliminé à nouveau. Le produit est entraîné sur un filtre type Büchner en acier inoxydable d'une capacité de 300 à 400 kg où l'éthanol présent est éliminé sous un vide de 100 mm de Hg. Séchage Le produit obtenu est ensuite disposé régulièrement (2 à 3 cm d'épaisseur de produit) sur les vingt-huit plateaux d'une étuve à plateaux en acier inoxydable dans laquelle on peut faire le vide et monter la température. La température est amenée à 80"C et le vide à 200 mm de Hg. Le séchage dure 8 heures au bout desquelles on vérifie la perte à la dessiccation (selon Ph. Eu. 2ème éd. V. 6.22 sur 1 g de produit à 100 - 105"C pendant 6 heures) qui doit être comprise en 6,0 et 14,0 % avant de sortir le produit de l'étuve. Le produit sec est ensuite conditionné en sac de polyéthylène et fût en carton. Le stockage ne dépasse pas 24 heures avant l'opération de broyage. Broyage et conditionnement Le sulfate de chondroïtine sodique est broyé sur grille de 1,5 mm puis conditionné dans des poches scellées, constituées par de l'aluminium (7 microns) et du polyéthylène. Chacune des poches est ensuite placée dans un emballage de carton qui la protège. L'extraction de 3 000 kg de bréchets de poulets congelés a conduit à l'obtention de 100 kg s 10 % de sulfate de chondroïtine sodique (PM: 20 000 daltons) ce qui correspond à un rendement d'environ 3,3 %. EXEMPLE 2 On procède comme dans l'exemple 1 mais à partir de trachées de dindes. 32 kg de trachées de dindes congelées sont broyés et on y ajoute 47 litres d'eau de ville. Le pH est ajusté à 8,0 t 0,5 par addition de soude à 30 %. L'opération d'hydrolyse dure environ 8 heures. Puis, la température de l'hydrolysat est amenée à 60"C. La digestion enzymatique est réalisée par addition d'alcalase comme dans l'exemple 1. La décantation permet de séparer trois phases : la graisse, le jus d'acide chondroïtine sulfate et les résidus solides. La purification est réalisée par ultrafiltration. Le produit obtenu est traité à l'hydroxyde de sodium 1N pendant une heure à 25"C puis neutralisé par HCI. Une précipitation éthanolique permet de laver l'acide chondroïtine sulfate qui est ensuite séché et broyé. L'acide chondroïtine sulfate ainsi obtenu a un poids moléculaire compris entre 20 et 21 kdaltons. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'obtention d'acide chondroïtine sulfate à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire, comprenant les étapes suivantes - broyage des organes cartilagineux, - hydrolyse du broyat obtenu, - séparation de l'acide chondroïtine sulfate de l'hydrolysat, - purification de l'acide chondroïtine sulfate. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, avant ou après l'étape de purification, une étape de réduction du poids moléculaire de l'acide chondroïtine sulfate. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réduction du poids moléculaire est réalisée avec de l'acide chlorhydrique. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de séparation consiste en une décantation de l'hydrolysat suivie de l'isolement des phases obtenues. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de purification consiste en une ultrafiltration suivie d'un traitement au moyen d'une base, de préférence la soude, puis d'une précipitation de l'acide chondroïtine sulfate. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend, après l'étape de purification, les étapes suivantes - séchage de l'acide chondroïtine sulfate purifiée, - conditionnement éventuellement précédé d'un broyage de l'acide chondroïtine sulfate sec. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les organes cartilagineux sont utilisés à l'état congelé, sec ou salé. 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les organes cartilagineux proviennent de poulets, de poules, de coqs, de dindes, de canards, d'oies ou d'autruches. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les organes cartilagineux sont choisis parmi les bréchets et les trachées. 10/ Acide chondroïtine sulfate obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 9.