Brevet FR2750999A1 — publié le 19980116

ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTÉRIES DU GENRE PYROCOCCUS SP. La présente invention concerne de nouvelles ADN polymérases thermos tables provenant d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. Les ADN polymérases sont des enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de l'ADN.On connaît aujourd'hui de nombreuses ADN polymérases isolés de micro-organismes tel que E. coli; par exemple l'ADN polymérase I de E. coli, le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E. coli, 1'ADN polymérase T4. Des ADN polymérases thermostables ont également identifiées et purifiées à partir d'organismes thermophiles, tels que Thermus aquaticus (Chien, A. et al., J. bacteriol. 1976, 127:1550-1557 ; Kaladin et al., Biokhymiyay 1980, 45:644-651), Thermus thermophilus, ou encore des espèces Bacillus (Demande de Brevet Européen No. 699 760), Thermococcus (Demande de Brevet Européen No. 455 430), Sulfobus et Pyrococcus (Demande de Brevet Européen No. 547 359). Parmi celles-ci, on peut citer plus particulièrement la Pfu de Pyroccocus Furiosus (Réf. Biblio.), la Vent DNA polymerase de Thermococcus litoralis (Kong, H. M., R. B. Kucera, and W. E. Jack, 1993. J. Biol. Chemin. 268(3):1965-1975), la 9 -NDNA polymerase de Pyrococcus sp. 90-N et la Deep-Vent DNA polymerase de Pyrococcus sp. GB-D. Le processus de réplication s'effectue selon un mécanisme bien connu consistant à fabriquer, à partir d'une matrice, de l'enzyme ADN polymérase et des quatre nucléotides triphosphates, un brin d'acide nucléique complémentaire de ladite matrice. Les enzymes ayant une activité ADN polymérase sont à présent largement utilisées in vitro dans de nombreux procédés de biologie moléculaire, tels que le clonage, la détection, le marquage et l'amplification de séquences d'acide nucléique. L'amplification de séquences d'acide nucléique par la méthode dite réaction de polymérisation en chaîne (PCR), décrite dans les Brevets Européens No. 200 362 et 201 184, est basée sur la réalisation de cycles successifs d'extensions d'amorces, mettant en oeuvre une ADN polymérase et les quatre nucléotides triphosphates, suivies d'une dénaturation des acides nucléiques double brin ainsi obtenus et servant de matrices pour le cycle suivant. Les températures utilisées à l'étape de dénaturation n'étant pas compatibles avec la conservation des activités de nombreuses ADN polymérases, des travaux de recherche important sont consacrés aux enzymes thermostables décrites précédemment. Il est notamment essentiel ne pas limiter la préparation de ces enzymes aux seuls procédés de purification à partir du microorganisme, mais de chercher à augmenter les rendements de production en utilisant les méthodes du génie génétique. Selon ces méthodes bien connues de l'homme du métier (Maniatis, et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 1982), le gène codant pour l'ADN polymérase est cloné dans un vecteur d'expression, lequel vecteur est inséré dans un hôte cellulaire capable d'exprimer l'enzyme, l'hôte cellulaire est cultivée dans des conditions adéquates et l'ADN polymérase est extraite et récupérée. Cette méthode a par exemple été décrite dans la demande de brevet PCT WO89/06691 pour produire 1'ADN polymérase de Thermus aquaticus. Le développement des technologies d'ADN recombinant tant dans le domaine de la recherche que dans celui de la production industrielle nécessite de disposer de divers types d'ADN polymérase susceptibles d'améliorer quantitativement ou qualitativement des techniques aussi diverses que le clonage, la détection, le marquage ou l'amplification de séquences d'acide nucléique. La présente invention vise précisément à offir de nouvelles enzymes hyperthermostables obtenues des espèces Pyrococcus Sp. qui catalysent la polymérisation de l'ADN. Ces enzymes proviennent d'isolats d'échantillons d'archaebactéries hyperthermophiles (Woese, C. R., O. Kandler, and M. Wheelis, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4576-4579) prélevés dans des sources hydrothermales profondes du bassin Nord-Fiji dans le Pacifique sud (Desbruyères, D., A.-M. Alayse-Danet, and S. Ohta. 1994.Geology. 116:227242 ; Marteinsson, V. T., L. Watrin, D. Prieur, J. C. Caprais, G. Raguenes, and G. Erauso. 1995. International Journal of Systematic Bacteriology. 45(4):623-632). Tous ces isolats sont hyperthermostables avec des températures d'isolement de l'ordre de 80 à 1000C. Une ADN polymérase de l'invention a un poids moléculaire d'environ 89000 daltons et présente une hyperthermostabilité permettant sa mise en oeuvre dans des réactions conduites à des températures de 70 à 900C. Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont permis d'identifier deux nouvelles ADN polymérases thermostables d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. dont la relation phylogénétique a été étudiée. Les gènes codant pour ces deux ADN polymérases ont été clonés et séquencés et leur comparaison a mis en évidence de fortes analogies de séquence et d' organisation. L'invention a plus particulièrement pour objet une ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons. Une première ADN polymérase purifiée thermostable selon l'invention provient de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. déposée à la Collection National de Culture de Micro-organismes (CNCM) à l'institut Pasteur, le 3 Juillet 1996 sous le No I-1764. Cette ADN polymérase sera dénommée dans ce qui suit Pyrococcus sp. GE 23. Sa séquence de 771 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1. Un poids moléculaire de 89 409 daltons et un pI de 8,37 ont été déduits de cette séquence. Une seconde ADN polymérase purifiée thermostable selon l'invention provient de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. déposée à la CNCM le 20 Avril 1993 sous le No I-1302. Cette ADN polymérase sera dénommée dans ce qui suit Pyrococcus sp. GE 5 (alias Pyrococcus abyssi). Sa séquence de 771 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2. Un poids moléculaire de 89 443 daltons et un pI de 8,13 ont été déduits de cette séquence. Les ADN-polymérases Pyrococcus sp. GE 23 et de Pyrococcus sp. GE 5 se distinguent l'une de l'autre par 10 résidus d'acides aminés dont les positions sont indiqués dans le tableau I ci-dessous. Tableau I Positions Pyrococcus sp. GE 23 Pyrococcus sp. GE 5 263 3 Val Ala 277 Ala Thr 281 Ala Val 320 Phe ' Ser 339 Gln His 359 Arg Thr 391 Lys Asn 532 Ser Arg 553 Pro His 554 Asn Glu L'invention concerne également une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour une ADN polymérase purifiée thermostable de l'invention. Une première séquence d'ADN selon 1' invention comprend ou est constituée par les nucléotides 1547 à 3862 de la SEQ ID NO:1 codant pour les 771 acides aminés de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. Une seconde séquence d'ADN selon l'invention comprend ou est constituée par les nucléotides 678 à 2994 de la SEQ ID NO:2 codant pour les 771 acides aminés de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5. L'invention concerne autant 1'ADN polymérase thermostable définie précédemment isolée et purifiée d'une souche de pyrococcus sp. que 1'ADN polymérase thermostable préparée par les méthodes du génie génétique. En conséquence, l'invention a aussi pour objet un vecteur comprenant une séquence d'ADN définie précédemment, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire des ADN polymérases thermos tables de l'invention. Un procédé de production d'une ADN polymérase thermostable conforme à l'invention consiste - à transférer une molécule d'acide nucléique codant pour une ADN polymérase thermostable ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver l'hôte cellulaire obtenu à l'étape précédente dans des conditions permettant la production de l'ADN polymérase, - à isoler, par tous moyens appropriés ladite ADN polymérase. L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes. Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré, il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide. Les ADN polymérases thermos tables de l'invention sont utiles notamment dans des procédés d'amplification enzymatique de séquences d'acides nucléiques. En conséquence, l'invention a pour objet, de tels procédés mettant en oeuvre une ADN polymérase thermostable décrite précédemment, ainsi que les kits d'amplification comprenant, outre les réactifs généralement utilisés, une quantité adéquate de cette ADN polymérase. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif et concernant le clonage, l'expression, la caractérisation et l'activité des ADN polymérases thermostables de l'invention et plus particulièrement de celle de Pyrococcus sp. GE 5. I - Matériels et méthodes. 1) Conditions de culture. plasmides et souches utilisées. Les souches Pyrococcus furiosus (DSM 5262) et Thermococcus litoralis (DSM 5474) ont été obtenues auprès de la collection du Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) Braunschweig - Stocheim, Allemagne. Les souches Pyrococcus sp. G 23 et G 5 ont été isolées de cheminées de sources hydrothermales profondes découvertes lors de la campagne francojaponaise STARMER effectuée en 1989 à 2000 mètres de profondeur dans le bassin Nord-Fiji. Pyrococcus sp. G 5 a été cultivée anaerobiquement dans un fermenteur de 8 litres dans un milieu BHi (DIFCO) supplémenté avec du soufre à un pH de 6,5 et à 900C, comme décrit dans la littérature (Erauso, G., A. L. Reysenbach, A. Godfroy, J.-R. Meunier, B. Crump, F. Partensky, J. A. Baross, V. Marteinsson, G. Barbier, N. R. Pace, and D. Prieur. 1993. Archives of Microbiology. 160:338-349). Pyrococcus sp. G 23 a été cultivée à 850C dans un fermenteur identique dans un milieu 2216S (DIFCO) à un pH de 6,5. La souche E. coli SURE, XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, Calif. USA) a été utilisée comme hôte pour les plasmides recombinants dérivés de pUC18 et pBluescript. Les souches E. coli NOVABLUE, BL21(DE3) et BL21(DE3)pLysS (Novagen, Madison, Wi. USA) ont été utilisées comme hôte pour les plasmides recombinants dérivés. E. coli SURE, XLï-Blue, NOVABLUE, BL21(DE3) et BL21(DE3)pLysS ont été cultivées dans un milieu LB (DIFCO) ou LB supplémenté avec des antibiotiques appropriés (DIFCO). 2) Isolement de 1'ADN, hybridation et ADN recombinants. L'ADN de haut poids moléculaire de Pyrococcus sp. G 23 et G 5 a été isolé par la méthode de Charbonnier modifiée (Charbonnier, F., G. Erauso, T. Barbeyron, D. Prieur, and P. Forterre. 1992. Journal of Bacteriology. 174, 19 :6103-6109) . Les cellules centrifugées ont été resuspendues dans un tampon TE-Nalx, puis lysées à 400C pendant 3 heures avec un mélange de N-lauryl sarcosine 1 %, sulfate de sodium de dodecyl 1% et 0,4 mg/ml de protéinase K. Après centrifugation à 5000 g pendant 10 minutes, l'ADN est extrait par PCI (25-24-1), puis traité par la RNAase à 5 Fg/ml à 600C pendant une heure. Ces étapes sont suivies par une extraction additionnelle par PCI et une extraction au chloroforme. L'ADN est précipité avec de l'méthanol 100 % et les pastilles sont séchées et suspendues dans du TElx. La concentration et la pureté de 1'ADN ont été estimées par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nm avec un appareil GeneQuantII (Pharmacia, Upsalla, SWeden). Pour la construction de la mini-librairie pUC18 (Sutherland, K. J., C. M. Henneke, P. Towner, and D. W. Hough. 1990.European Journal of Biochemistry. 194:839844) de Pyrococcus sp . G 23, l'ADN génomique a été digéré par une série d'enzymes de restriction (BamHI, BRIN, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, SalI, SacI, XbaI et XhoI) par simple ou double digestion. Puis les fragments d'ADN ont subi une migration sur gel d'agarose 0,8 % dans du TBE-lx et ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (Amersham, UK) et hybridés avec des sondes d'ADN préparées par PCR avec des amorces spécifiques sélectionnées à partir des gènes d'ADN polymérases de P. furiosus et T. litoralis, marqués au 32P par random-priming conformément aux recommandations du fabriquant (Magaprime, Amersham, UK). Deux sondes de P. Furiosus ont été utilisées, pFuz et PfuF, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de base 8 à 2316 et 819 à 1915 de la section codante du gène de la polymérase Pfu, comme défini par Uemori et al. (Uemori, T., Y. ishino, H. Toh, K. Asada, and I. Kato. 1993. Nucleic Acids Research. 21(2):259-265). Deux sondes de T. litoralis, TliI et TliT, couvrant respectivement les régions délimitées par les paires de base 297 à 1768 et 4631 à 5378, comme défini par Hodges et al. (Hodges, R. A., F. B. Perler, C. J. Noren, and W. E. Jack. 1992. Nucleic Acids Res. 20(23):6153-6157. Les fragments positifs, identifiés par hybridation ADN-ADN (Southern, E. M. 1975. Journal of molecular biology. 98:503), ont été ensuite préparés par des digestions appropriées de 100 Rg d'ADN génomique, purifiés dans des sacs de dialyse à partir des gels d'agarose, et précipités à l'éthanol 100 %. Les fragments ont été ligaturés dans pUC18, lequel avait été coupé par les enzymes de restriction appropriés pour une digestion simple et déphosphorylé. La transformation des souches hôtes a été réalisée par électroporation (Gene Pulser, Biorad) . Le criblage des clones recombinants a été effectué par hybridation de colonie selon les techniques décrites dans la littérature (Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).La température des Southern blots et d'hybration de colonie était de 550C dans un tampon standard sans formamide. L'ADN de plasmide a été isolé par la méthode de Birnboim et Doly (Birnboim, H. C., and J. Doly. 1979. Nucleic Acids Research. 7:1503), puis purifié par chromatographie échangeuse d'anions en phase solide (Quiagen, Chatsworth, Calif. USA). Les fragments de restriction des plasmides dérivés de pUC ont été purifiés sur gels d'agarose par la méthode de GeneClean (Bio 101, La Jolla, Calif.) pour un clonage ultérieur. Les réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de longs fragments ont été effectuées conformément à la procédure définie par Barnes (Barnes, W. M. 1994. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 91:2216-2220) avec un mélange réactionnel Taq Extender (Stratagene, La Jolla, Calif.). Les ADNr de 16S et 23S de Pyrococcus sp. GE 23 ont été amplifiés par PCR avec un thermocyleur Stratagene 96gradient en utilisant les conditions suivantes - amorce directe Aa (5'-TCCGGTTGATCCTGCCGGA-3'), - amorce indirecte 23Sa (5'-CTTTCGGTCGCCCCTACT-3'), - étape initiale 3 minutes à 940C suivi de 30 cycles (94"C, 1 mn/490C, lmn/720C, 2mn) et, - élongation finale de 5 mn à 720C. Les produits de PCR ont été clonés dans le vecteur pBluescript pour séquençage. Le gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus Sp. GE 5 a été isolé par PCR en utilisant les amorces mises au point pour exprimer le gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23 - GE23DIR (5'-TGGGGCATATGATAATCGATGCTGATTAC-3') - GE2 3REV (5' -GACATCGTCGACTCTAGAACTTAAGCCATGGTCCG-3'). 3) Séauencaqe des ADN. Les séquences d'ADN ont été obtenues par la méthode de terminaison de chaîne didéoxy (Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5467-5473) en utilisant un système d'analyse automatique d'ADN Applied Biosystems. Les deux brins des gènes codant l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. G23 et G5 ont été séquencés alors que l'ADNr 16S de Pyrococcus sp. G23 a été séquencé sur un seul brin, en utilisant des amorces universelles localisées sur des vecteurs et des amorces internes. L'analyse de séquence a été réalisée avec un logiciel DNASTAR (Madison, Wis., USA) et le programme de Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wis., USA) accessible en ligne sur INFOBIOGEN. Les recherches informatisées de similitudes ont été réalisées avec le programme BLAST, les alignements multiples avec CLUSTAL V, et les arbres phylogénétiques ont été établis selon la méthode dite "Neighbour-joining (Saitou, N., and M. Nei. 1987. Mol. Biol. Evol. 4(4):406-425). 4) Construction des recombinants exDrimant ltADN polvmérase de Pvrococcus ss. G 23 et G5. Les ADN polymérases de Pyrococcus sp. G 23 et G 5 ont été exprimées dans E. coli en utilisant le système d'expression pET12, appartenant au système d'expression T7 (Studier, F. W., A. H. Rosenberg, F. J. Dunn, and J. W. Dubendorff. 1990. Methods Enzymol. 185:60-89) acquis auprès de Novagen (Madison, Wi; USA). La PCR a été utilisée pour préparer les fragments de Pyrococcus Sp. G 23 et G 5 contenant les sites de restriction NdeI et SalI compatibles avec l'extréminté des amorces GE23DIR et GE23REV. Le mélange de PCR contenait 1'ADN polymérase GOLDSTAR (Eurogentec, B), l'enzyme Taq extender Taq (Pfu de Stratagene), le tampon d'extension avec les quatres dNTP (chacun à 0,2 mM) et les amorces GE23DIR et GE23REV à 50 pmoles dans un volume final de 50 1. L'amplification a été effectuée sur 20 cycles : lmn à 900C, lmn à 50 C et 3 mn à 720C, en utilisant un thermocycleur Stratagene 96-gradient. Les fragments de PCR digérés par NdeI et SalI ont été ligaturés aux sites NdeI et SalI de pETl2a digérés avec les mêmes enzymes, réétablissant ainsi le codon d'initiation. Les constructions obtenues ont été nommées respectivement pETPAB1 et pETGEl. Ces constructions ont été séquencées toutes les deux aux sites de jonction et entièrement pour pETPABl. Les tests d'expression ont été réalisés conformément aux recommandations du fabriquant du système d'expression pET : sélection des clones dans E. coli Novablue, culture of E. coli BL21(DE3), induction (IPTG 0,2-lmM). 750 1 de cellules de cultures induites à DO6oo=l et non induites ont été centrifuées, resuspendues dans un tampon de lyse B (Tris-HCl 10 mM pH 7,5 ; NaCl 10 mM ; MgCl2 2 mM ; Triton X-100 1% v/v). L'ADN polymérase a été observée par SDS-PAGE après une dénaturation thermique partielle des protéine hôtes (710C, 20 mn) et concentrée sur filtres Millipore (Ultrafree MC). L'activité a été testée par mesure de l'incorporation de 3H-dTTP (Amersham, UK) en utilisant de 1'ADN de thymus de veau activé comme substrat (Sigma Aldrich, F) dans le milieu de réaction C (Tris-HCl 50 mM pH 8,8 ; DTT lmM ; MgC12 10mM ; KCl 10 mM ; BSA 0,4 mg/ml, chaque dNTP à 0,4 mM). il - Résultats. 1) Isolement du ozène de 1'ADN polymérase de Pvrococcus sp. GE 23. Les ADN génomiques des souches Pyrococcus sp. GE 23 et GE 5, digérés par une série d'enzymes de restriction, ont été hybridés à 1'ADN de P. furiosus et à des sondes de T. litoralis préparées par PCR. Comme montré aux Figures 1 et 2, l'analyse en Southern blots a révélé un fragment positif HindIII-HindIII de 2,9 kb avec une sonde TliI marquée au 32P (Figure 2), alors que la sonde PfuF a révélé un fragment positif XbaI-XbaI de 8 kb (Figure 1) (exposition de 24 heures). Le fragment de 2,9 kb a été récupéré et purifié comme décrit précédemment dans Matériels et Méthodes et cloné dans le vesteur pUC18 digéré par HindIII. Environ 600 recombinants (E. coli SURE) ont été criblés avec une sonde TliI radiomarquée et 6 d'entre-eux ont donné un signal positif d'hybridation. Des profils de restriction identiques ont été obtenus pour ces clones indiquant qu ils contiennent probablement le même insert. Le séquençcage ultérieur de l'un de ces clones (désigné pGE23a) et la comparaison de séquence (FASTA) ont démontré qu'il correspond aux 1358 premières paires de base du gène de l'ADN polymérase appartenant à la famille B (Braithwaite, D. K., and J. Ito. 1993. Nucleic Acids Research.21(4):787-802) et qu'il se termine au site HindIII. L'analyse de la séquence nucléotidique montre que le site XbaI est localisé en amont du codon d'initiation et qu'en conséquence le fragment positif XbaI-XbaI de 8 kb devrait contenir la partie 3' du gène. Selon la même méthode, ce fragment de 8 kb a été cloné dans le vecteur pUC18 et 3 clones recombinants positifs parmi 800 ont été identifiés par hybridation de colonie comme précédemment en utilisant une sonde homologue préparée à partir de la partie 5' du gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. Les cultures dans un milieu liquide (LB-ampicillin) de ces clones ont été systématiquement lysées bien avant DO600=0,5. Une culture a été arrêtée à DO600=0,l et 1'ADN plasmidique (désigné pGE23b) a été extrait. La PCR longue distance (avec le Taq Extender) a été effectuée sur cet ADN plasmidique en utilisant une amorce directe localisée sur la partie 5' de la séquence obtenue précédemment et une amorce réverse localisée en aval sur le vecteur pUC18, pour obtenir un produit d'amplification de 8 kb. La partie 3' a été séquencée ultérieurement. Puis, une nouvelle PCR longue distance a été effectuée en utilisant la même amorce directe localisée sur la partie 5' du gène et une amorce réverse localisée sur la partie 3 disponible. Les produits d'amplification de 10 réactions de PCR séparées ont été rassemblés, purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose et séqencés sur les deux brins en utilisant des amorces internes. Ces produits contiennent la partie 3' du gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. G23. 2) Position phvloqénétique de Pyrococcus sD. G23 et G5. Pyrococcus Sp. G23 et G5 apartiennent au même groupe de PCR-RFLP d'ADNr 16S (Meunier, J. R. 1994. Biodiversité et systéinatique des populations de microorganismes hermophiles isolés d'écosystémes hydrothermaux océaniques abyssaux. Thèse, Paris 7) indiquant qu'il pourrait s'agir de deux différentes souches de la même espèce. Toutefois, comme montré sur la Figure 3, les profils RFLP différents des gènes de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. G23 et G5, obtenus avec les différentes sondes (pus , PfuP, TliI) indiquent qu'au moins les gènes de 1'ADN polymérase présentent des différences significatives. Des hybridations ADN-ADN en slot blots (Marteinsson, V. T., L. Watrin, D. Prieur, J. C. Caprais, G. Raguenes, and G. Erauso. 1995. International Journal of Systemati-c Bacteriology. 45(4):623-632) ont conduits à des niveaux contradictoires de relation : 79 % entre GE 23 non marqué et GE 5 marqué, et 98 % entre GE 5 non marqué et GE 23 marqué. L'amplification des gènes des ADNr 16S-23S a été effectuée comme décrit précédemment dans Matériels et Méthodes. La bande amplifiée de 1,9 kb a été purifiée et séquencée sur un brin. La séquence complète de l'ADNr 16S a été comparée avec sa contrepartie de Pyrococcus Sp. GE 5 et d'autres espèces de Pyrococcus sp. et Thermococcus. Le niveau de similitude entre Pyrococcus sp. GE 23 et Pyrococcus Sp. GE 5 est de 97,8 % et Pyrococcus sp. GE 23 a été regroupé avec Pyrococcus sp. GE 5 (Pyrococcus abyssi) dans l'arbre phylogénétique des ADN polymérases de Thermococcales de la Figure 4. De même la Figure 5 représente la situation phylogénétique de Pyrococcus sp. GE23 et Pyrococcus Sp. GE 5 (Pyrococcus abyssi) sur la base des séquences d'ADNr 16S. Dans ces deux figures, le dendongramme a été établi par la méthode "Neighbour-joining" et l'échelle représence la distance relative entre les séquences. 3) Identification du gène de l'ADN Dolvmérase de Pyrococcus ss. GE 5. Déduisant de la relation entre ces deux souches que l'isolement direct du gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 était possible par PCR, les deux amorces GE23DIR et GE23REV, préparées pour cloner le gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23 dans le vecteur pET12, ont été utilisées dans une réaction de PCR contenant l'ADN génomique de Pyrococcus sp. GE 5. Les produits d'amplification de 5 réactions de PCR ont été rassemblés, purifiés et séquencés sur les deux brins. La séquence nucléotidique présente une forte homologie (97 %) avec le gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. Afin d'obtenir la séquence du gène 1'ADN polymérase de Pyrococcus Sp. GE 5, différents essais de clonage ont été réalisés. Tout d'abord, un fragment HindIII-HindIII de 2,9 kb, identifié par hybridation ADN-ADN, comme montré à la Figure 3, a été cloné dans le vecteur pUC18, transformé dans E. coli SURE et séquencé. Il se présente comme homologue au fragment HindIII-HindIII de 2,9 kb de Pyrococcus sp. GE 23 cloné précédemment et contenant la partie 5' du gène cible. Deuxièmement, un fragment positif XbaI-XbaI de 2,6 kb, contenant potentiellement la totalité de la portion codante, a été identifié par hybridation ADN-ADN en utilisant le gène de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 produit par PCR comme sonde radio-marquée. Ce fragment a été cloné dans les vecteurs pUC18, pBluescript et pET12 et transformé dans E. coli Novablue (souche recA-). Trois clones recombinants positifs parmi 600 ont été obtenus avec pET12 et aucun avec pUC18 et pBluescript. Les profils de restriction des clones recombinants pET12 démontrent que l'intégrité de la construction n'a pas été préservée. La figure 3 montre que la majeure partie de l'insert a été délétée dans le procédé et seul subsiste le fragment 3' de 342 pb HindIII-XbaI. La séquence définitive du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 est composée d'une partie 5' génomique Hindîli-Hindili, d'une portion 4) Séquences nucléotidique et DolYPeptdique des ADN olvmérase de Pyrococcus sp. GE 23 et GE 5. a) ADN DolYmérase de Pvrococcus s > . GE 23. Le fragment de Pyrococcus sp. GE 23 HindIII HindlII de 2,9 Kb qui a été cloné ainsi qu'un fragment contigu dans le sens 3' de 1,6 Kb obtenu par PCR longue distance ont été séquencés sur les deux brins et assemblés. La séquence de 4447 pb obtenue a été étudiée pour déterminer les régions susceptibles d'être traduites. Deux cadres de lecture ouverts ont été mis en évidence. Le premier, dans le cadre 2, s'étendant de la paire de bases 1547 à la paire de bases 3862 correspond au gène de l'ADN polymérase codant pour une protéine de 771 acides aminés, dont le poids moléculaire déduit de la séquence est de 89 409 Daltons et le point isoélectrique théorique de 8,37. Ce poids moléculaire correspond au poids moléculaire apparent estimé par SDS PAGE de 1'ADN polymérase recombinante. Le second ORF a été localisé sur le cadre 4 entre les paires de bases 1439 et 627. La séquence déduite a une longueur de 270 aminés et les recherches de similitude effectuées avec les programmes BLAST et FASTA n'ont révélé aucune homologie significative avec les séquences disponibles dans les bases de données Swiss-Prot et PIR. b) ADN Polvmérase de Pvrococcus SD. GE 5. La séquence codante complète du gène de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 produit par PCR en utilisant les amorces préparées à partir du gène de Pyrococcus sp. GE 23 a été obtenue par séquençage des deux brins. Afin de confirmer la séquence de ce produit de PCR, le fragment de Pyrococcus sp. GE 5 HindIII HindIII de 2,9 Kb qui a été cloné a également été séquencé sur les deux brins, et les mêmes résultats ont été obtenus. La région 3' du gène a également été séquencée à partir de l'insert HindIII-XbaI restant de 342 pb résultant de la délétion d'une partie du fragment XbaI-XbaI de 2,6 kb. Seule la région interne HindIII HindIII de 611 pb de la séquence du gène obtenue à partir des produits de PCR n'a pas été confirmée au niveau génomique. Un cadre de lecture ouvert entre les paires de bases 679 et 2994 a été identifié dont la traduction produit une séquence polypeptidique de 771 acides aminés, longueur identique à celle de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23. c) Comparaison des séquences des deux nolvmérases. L'alignement des parties codantes des deux gènes montre leur forte parenté, puisqu'ils ne diffèrent que de 64 nucléotides dispersés le long des séquences à deux exceptions près. On observe tout d'abord 14 substitutions entre les paires de bases 1541 et 1603, faisant de cette région, la plus variable de la toute séquence, puis on constate un nombre limité de substitutions dans la région 3' entre les paires de bases 1890 et 2316. La plupart de ces substitutions sont sans conséquence au niveau des séquences polypetidiques, notamment les 23 premières substitutions sont sans effet sur la composition des protéines. La comparaison avec d'autres gènes d'ADN polymérases de Thermococcales disponibles dans les bases de données révèle que la région hautement variable entre les paires de bases 1541 et 1603 de Pyrococcus sp. GE 23 et GE 5 semble être une caractéristique de ces deux souches, la diversité étant bien distribuée sur les autres séquences de gènes codant pour des ADN polymérases. La comparaison au niveau des séquences polypeptidiques montre la forte similitude des deux ADN polymérases, 98 % d'homologie avec la méthode CLUSTAL V, et seulement 10 résidus différents. Les substitutions d'acides aminés sont donnés dans le tableau I et les alignements avec les ADN polymérases d'autresThermococcales sont représents aux Figures 6 et 7. La Figure 6 représente l'alignement de la séquence polypeptidique de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23 avec celle des ADN polymérases de Deep Vent (intein-), Pyrococcus sp. KOD1, Pyrococcus furiosus, Vent (Tli intein-), Pyrococcus sp. 90N. La Figure 7 représente l'alignement de la séquence polypeptidique de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 avec celle des ADN polymérases de Pyrococcus sp. GB-D, Pyrococcus sp. KOD1, Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. 90N. Le tableau II ci-dessous indique les pourcentage de similarités entre les séquences polypeptidiques de : (1) Pyrococcus Sp. GE 23, (2) Pyrococcus Sp. GE 5, (3) Pyrococcus Sp. GB-D, (4) Pyrococcus Sp. KOD1, (5) Pyrococcus furiosus, (6) Therinococcus litoralis, (7) Pyrococcus sp. 90N. Tableau II (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 98,6 89,2 81,3 83,5 76,3 81,5 (1) *** 88,4 80,6 82,8 75,5 80,9 (2) 81,6 85,1 77,1 83,0 (3) = = *** 79,2 78,1 90,4 (4) *** 74,0 80,1 (5) *** 77,0 (6) (7) La plupart des substitutions d'acides aminés entre les ADN polymérases de Pyrococcus sp. GE 23 et GE 5 sont non conservatives, mais aucune n'est localisée dans les motifs connus pour être impliqués dans l'action catalytique de l'enzyme, ni dans les domaines 3'- 5' exonucléase ou polymérase. Les deux gènes ne possèdent aucune séquence intronique (IVS ou intéines) contrairement aux gènes d'ADN polymérase de T. litoralis, Thermococcus sp. KOD1, Pyrococcus sp. GB-D, et présentent la même organisation que les gènes d'ADN polymérase de P. furiosus et Pyrococcus sp. 90N. 5) Expression, caractérisation et activité de 1'ADN olvmérase de Pyrococcus ss. GE 5. a) Clonage et exoression. Un insert de 2320 pb couvrant la séquence d'ADN de 2316 pb de SEQ ID NO:I codant pour 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 a été cloné aux sites NdeI et BamHI d'un vecteur pour transformer la souche E. coli BL21(DE3). Des mini-préparations d'ADN plasmidien ont été réalisées sur une vingtaine de clones transformants et un seul a été sélectionné sur la base de la taille des fragments d'ADN libérés après digestion par les enzymes de restriction NdeI et BamHI. Des essais d'expression ont ensuite été réalisés à 37"C, en erlenmeyer, avec le clone sélectioné. L'expression est induite en phase exponentielle de croissance (DO 600nm = 0,6 - 0,7) avec les concerntations en IPTG de 0 ; 0,5 ; 1 et 1, 5 mM. Des échantillons sont prélevés à différents moments au cours de la culture et les protéines analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie. La Figure 8 représente les résultats des essais d'expression, dans lesquels - Le puits No. 1 correspond à la protéine Ladder de 10 kDA (Gibco BRL). - Le puits No. 2 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, temps 0 (phase exponentielle de croissance). - Le puits No. 3 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 1 heure après l'induction. - Le puits No. 4 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 4 heure après l'induction. - Le puits No. 5 correspond à l'échantillon induit sans IPTG, 18 heure après l'induction. - Le puits No. 6 correspond à la protéine Ladder de 10 kDA (Gibco PRL). - Le puits No. 7 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, temps 0 (phase exponentielle de croissance). - Le puits No. 8 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, 1 heure après l'induction. - Le puits No. 9 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, 4 heure après l'induction. - Le puits No. 10 correspond à l'échantillon induit avec 1 mM d'IPTG, 18 heure après l'induction. On observe que seules les cellules cultivées en l'absence d'IPTG expriment l'ADN polymérase et le taux est maximum après une nuit de culture. Le poids moléculaire de la protéine exprimée est estimé à 89 Kda. b) Fermentation et extraction des cellules. La culture de la souche Pyrococus sp. GE 5 a été réalisée selon un protocole standard. On a ajouté le facteur de sélection du plasmide au milieu R12 choisi pour la préculture et la culture. Le transfert de la préculture vers le fermenteur a été effectué lorsque la densité optique à 600 nm de la préculture était d'environ 0,8. Le fermenteur NBS MICROS (25 litres) a été employé pour cette production, avec un volume de culture de 24 litres. Les conditions de fermentation ont été les suivantes : température = 370C ; agitation = 300 rpm ; aération = 30 l/m ; oxygène dissous = 15 %. Le pH est régulé à 6,8 avec NaOH pendant la phase d'acidification. Lors de la phase de basification, le pH est demeuré en libre évolution. Les bactéries ont été récoltées près 16 à 17 heures de culture. La densité optique finale était d'environ 10 unités et le pH final de 8. La culture a ensuite été concentrée par filtration sur fibres creuses (AMICON), jusqu'à obtenir un volume final de 2 litres. Ce concentré de bactéries a alors été utilisé pour la purification des protéines. Après concentration cellulaire, les cellules sont broyées en continu au moyen d'un broyeur à billes et le broyat cellulaire est additionné de PMSF 1 mM. c) Purification de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5. Après centrifugation du broyat cellulaire (15 minutes à 10000 g), le surnageant (fraction soluble) est récupéré et chauffé 15 minutes à 750C. Le précipité formé après dénaturation thermique est éliminé par centrifugation (15 minutes à 10000 g). Le surnageant est chargé sur une colonne d'échange d'anions - Matrice Q Sépharose Fast Flow dans une colonne XK 16/30 (Pharmacia). - Système chromatographique : Bio Pilot (Pharmacia). - Tampon A : Tris-HCl 50 mM, pH 8 et tampon B : Tris-HCl 50 mM, pH 8 + NaCl 0,5 M. - Débit : 10 ml/mn ; gradient 0-50% B en 60 minutes. - Fractions : 10 ml/tube. La Figure 9 représente le profil d'élution de l'échantillon constitué de 450 ml de protéines solubles après dénaturation thermique à 750C. La Figure 10 représente l'analyse par SDS PAGE (Phast System, Pharmacia), en présence de - mercaptoéthanol, de différentes fractions issues de la purification - Gels : Phast gel 8-15% (Phast System, Pharmacia). - Lignes 1 et 8 : marqueur de poids moléculaire (10 Kda, Bio-Rad). - Ligne 2 : Protéines totales. - Ligne 3 : protéines solubles après broyage. - Ligne 4 : protéines solubles après dénaturation thermique. - Lignes 5, 6 et 7 : fractions 1, 2 et 3 après chromatographie sur QFF de la Figure 2. Comme illustré par la Figure 10, l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 est soluble et thermostable. Elle est éluée vers 0,15 M NaCl lors de la chromatographie d'échange d'ions. Les fractions contenant l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 ont été rassemblées (fraction 2; 50 ml) et chromatographiées sur hydroxyapatite (type II, Biorad) - Matrice : hydroxyapatite type II dans une colonne 10/5 (Biorad). - Système chromatographique : FPLC (Pharmacia). - Tampon A: Phosphate 50 mM pH 8; tampon B Phosphate 500 mM pH 8. - Débit : 10 ml/min; gradient 0-100% B en 30 minutes. La Figure 11 représente le profil d'élution de l'échantillon constitué de 50 ml de la fraction 2 après chromatographie d'échange d'ions. Les différentes fractions ont été analysées par spectrométire W et par SDS-PAGE. La fraction non absorbée contient principalement des acides nucléiques tandis que les fractions 1 à 3 contiennent l'ADN polymérase de Pyrococcus Sp. GE 5. Après chromatographie, 1 mM de mercaptoéthanol, 0,1 % Tween 20 et 50 % glycérol ont été ajoutés avant conservation à -200C. d) Caractérisation des fractions purifiées. Les 3 fractions obtenues après chromatographie sur hydroxyapatite ont été analysées par SDS-PAGE en présence de 2-mercap;Loéthanol (Figure 12) - Gels : gel 15 % (Laemli, Babygel). - Lignes 1 et 5: Marqueur de poids moléculaire (Bio-Rad, Broad Range). - Ligne 2 : fraction 1 (5 fol). - Ligne 3 : fraction 2 (5 fol). - Ligne 4 : fraction 3 (5 Rl). - Ligne 6 : fraction 1 (10 Rl). - Ligne 7 : fraction 2 (10 Fol). - Ligne 8 : fraction 3 (10 Rl). Comme illustré par la Figure 12 et et la Figure 13 ci-après, la fraction 1 contient de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 homogène en SDS-PAGE, alors que les fractions 2 et 3 sont contaminées par 2 protéines de 35 Kda et 65 Kda. e) Activité des fractions purifiées. L'activité d'ADN polymérase des différentes fractions a été testée dans une réaction d'amplification de type PCR. Un fragment de 1300 pb environ a été amplifié à partir d'un ADN cible et d'amorces spécifiques. Le tampon utilisé est composé de - Tris-HCl : 75 mM pH 9,0. - (NH4)2SO4 : 20 mM. - 0,01 % (w/v) Tween 20. - MgCl2 : 1,5 mM. Trente cinq cycles ont été réalisés, chacun comprenant une étape de dénaturation de 1 minute à 940C, une étape d'appariement des oligonucléotides de 1 minute à la température appropriée et une étape d'élongation de 3 minutes à 720C. La Figure 13 rapporte les résultats obtenus avec un volume réactionel de 100 1 pour des quantités d'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 de 2,5 g, 1 g, 0,1 g et 0,01 Ol : - Puits No. 1 : 1 kb DNA ladder (Gibco BRL). - Puits No. 2 : fraction 1 (2,5 g). - Puits No. 3 : fraction 1 (1 g). - Puits No. 4 : fraction 1 (0,1 g). - Puits No. 5 : fraction 1 (0,01 g). - Puits No. 6 : fraction 2 (2,5 g). - Puits No. 7 : fraction 2 (1 g). - Puits No. 8 : fraction 2 (0,1 g). - Puits No. 9 : fraction 2 (0,01 g). - Puits No. 10 : fraction 3 (2,5 g). - Puits No. 11 : fraction 3 (1 g). - Puits No. .12 : fraction 3 (0,1 g). - Puits No. 13 : fraction 3 (0,01 g). - Puits No. 14 : 1 kb DNA ladder (Gibco BRL). - Puits No. 15 : Contrôle positif avec la Taq polymérase. LISTE DE SÉQUENCES (1) INFORMATION GÉNÉRALES (i) DEPOSANT : APPLIGENE - ONCOR (ii) TITRE DE L'INVENTION: ADN POLYMERASE THERMOSTABLE D'ARCHAEBACTÉRIES DU GENRE PYROCOCCUS SP. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:1 : (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 4446 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: séquence codante de 1'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 23 (B) EMPLACEMENT:de 1547 à 3862 (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: codon stop (B) EMPLACEMENT:de 3860 à 3862 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:1 CGAAGATGAG AGATTTGGTG GAATGCCGAC TTACGGGCAA GAAATTTGAG AGAGATAAAA 60 TCAACGTTAA GATAGCGGTG GCCTATTCTG GAGGAAGCGA TAGCTCAGCC ACAGTAAAGA 120 TACTGAGATG GGCTGGCTTT GATGTGGTCC CAATAACGGC GAGGCTTCCC CACATAAGCA 180 AAGAGGAGTT ACGGGAAGAA ACTCTATTCG TGGAAGTTCC TGGGTACCTT GAGGAGATGG 240 AGAGGTTAAT AGAAAAGAGG GCCCCTATCT GTGGAAGGTG CCACTCTATG GTTATGAGAG 300 CTGTTGCGAG AAAAGGTTAG GGAGCTTAAA ATAAGAATAC TCGCTACTGG AGACATGCTC 360 AGCATAGGAA GCGGGTCAAT CTACGAGAAA GAAAATCTTG TGATTTTGAA CTTACCAGCT 420 TTCCTATCAC TAAACAAGGT TGACCTTCTG AGCATACTAG GCTGGGAGGA TTATGAGTTT 480 AAGTATGGAT GCCCCCTTTG GAGGGAGGCC GTGAAAAGGG CTCCAATAAT GAAGAGGTTT 540 GCAATCCAGA GGGTTCTGAG GGAATTGAGG GCAGGGGCAA TAAACGAGAA TATTGCTAAG 600 AAACTTATTT TTGATATATT AAGGGCCTAA ACGAACCTCG CCGGTCTGAG GGTTTTCACT 660 TTAATTTCCT TGTCTATCGT AACCCTGAAC CCTTCCTTGG CCACATAGGT TTTCACGCCG 720 GTAACGTTTT GGATATACTG GGCCTCCTTA TAGGGACCAG CGAAGTGCAT CTTCATGCCG 780 AGATGCGTCA TCACGAGAAC TTCAGGCCTT TGCTTCATTG CCTTTAGCAT GTAAACTATG 840 TCGTCGGTTG ATAAGTGGTA GGGAATCTTC ATGTCCCTGG GCCTCGTTAC TGAGGCTATC 900 AAAACTCTCG ACCCATCATG CCAGCTTACC AGCTCTGGAA AATACTCAGT ATCCGCTATG 960 TACGAGATAT CCCCAAGGCT GGTTTTTAAT CTAAAGCCTA TCGTTGTTGA GTCGCTGTGC 1020 TGGGATGGAG TTATTATCAT CTCCTCATTT CCTAACCTAA ACCTGTCCCC AGGATTGGGG 1080 GCATGGACTT CCTCTAATGC CTCCAAGTGG TACTTGCTCA GGGCTGGGGT ATGATCCTCG 1140 CCCCCATAAA ACACGCTTCT AGAACCTATT AGGGTTCCCC TCTTCTTAGT AACACCGTAT 1200 GTCATTCCCA CAACGAACAC CTCGGCGGCG GTGGAGTGAT CGGTGTGTCT ATGCGAAATG 1260 AAGAGAACAT CTATCTTCCT GGGGTCTAAC TTGTATCTAA TCATCCTAAC TAGCGCTCCA 1320 GGCCCAGGAT CCACAAAGAT ATTTTTGCTT GCCTTGATGA AGAATCCCCC TGTGGATCTT 1380 ACTTGAGTTA TCGTCACGAA CCTGCCCCCA CCGGCACCCA AGAACGTAAT CTCTATCATT 1440 TTTAGTCCCG AAATTAAAGT GCGAGGCTTA TGCTTTTAAG GATGTATGGC GAAAGGTGAA 1500 GTTTATTAGA AGTTAGAATC TAAAGATTTC AGATTGGGTG GGGGTA ATG ATA ATC 1555 Met 11e Ile 1 3 GAT GCT GAT TAC ATA ACG GAA GAT GGC AAG CCG ATA ATA AGA ATA TTC 1603 Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Ile Ile Arg Ile Phe 5 10 15 AAA AAG GAA AAG GGA GAG TTT AAG GTA GAA TAC GAT AGG ACG TTT AGA 1651 Lys Lys Glu Lys Gly Glu Phe Lys Val Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Arg 20 25 30 35 CCC TAC ATT TAC GCT CTT TTA AAG GAT GAT TCG GCC ATA GAT GAG GTT 1699 Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Asp Glu Val 40 45 50 AAG AAG ATA ACC GCC GAG AGG CAC GGA AAG ATA GTC AGG ATA ACC GAA 1747 Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg Ile Thr Glu 55 60 65 GTT GAG AAA GTC CAG AAG AAA TTC CTA GGA AGG CCA ATA GAA GTC TGG 1795 Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp 70 75 80 AAG CTG TAC CTT GAG CAT CCA CAA GAC GTT CCA GCT ATC AGA GAG AAG 1843 Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Glu Lys 85 90 95 ATA AGG GAA CAT CCA GCT GTA GTT GAT ATA TTC GAA TAC GAC ATA CCC 1891 Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro 100 105 110 115 TTT GCG AAA CGC TAC CTA ATA GAT AAG GGA TTG ACT CCA ATG GAG GGG 1939 Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Thr Pro Met Glu Gly 120 125 130 AAC GAG GAG CTA ACG TTT CTA GCA GTT GAC ATA GAA ACA TTG TAC CAT 1987 Asn Glu Glu Leu Thr Phe Leu Ala Val Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His 135 140 145 GAA GGA GAG GAG TTC GGG AAA GGC CCT ATA ATC ATG ATC AGC TAC GCC 2035 Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala 150 155 160 (,AC GAG GAA GGG GCC AAG GTG.ATA ACT TGG AAG AGC ATA GAC TTA CCT 2083 Asp GLu Glu Gly Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Ser Ile Asp Leu Pro 165 170 175 TAC GTT GAA GTG GTT TCA AGC GAG AGG GAG ATG ATA AAG AGG CTC GTG 2131 Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Leu Val 180 185 190 195 kAG GTA ATT AGA GAG AAG GAT CCC GAC GTG ATA ATA ACG TAC AAT GGT 2179 Lys Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr Tyr Asn Gly 200 205 210 GAT AAT TTC GAC TTT CCG TAC CTC TTA AAG AGG GCT GAA AAG CTC GGA 2227 Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly 215 220 225 ATA AAG CTC CCC CTT GGA AGG GAC AAT AGC GAG CCG AAG ATG CAG AGG 2275 Ile Lys Leu Pro Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Pro Lys Met Gln Arg 230 235 240 ATG GGG GAT TCA TTA GCT GTA GAG ATA AAG GGC AGA ATA CAC TTC GAT 2323 Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu Ile Lys Gly Arg Ile His Phe Asp 245 250 255 TTA TTC CCC GTC ATA AGA AGA ACG ATC AAC CTT CCA ACA TAC ACC CTC 2371 Leu Phe Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu 260 265 270 275 GAA GCG GTT TAT GAG GCT ATA TTT GGA AAG TCT AAG GAG AAA GTC TAT 2419 Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Ser Lys Glu Lys Val Tyr 280 285 290 GCC CAT GAG ATA GCT GAG GCC TGG GAA ACC GGG AAA GGG CTA GAG AGG 2467 Ala His Glu Ile Ala Glu Ala Trp Glu Thr Gly Lys Gly Leu Glu Arg 295 300 305 GTA GCT AAG TAT TCA ATG GAA GAT GCG AAG GTA ACC TTT GAG CTC GGA 2515 Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe Glu Leu Gly 310 315 320 AAG GAG TTC TTC CCA ATG GAA GCC CAG CTA GCT AGG CTC GTT GGC CAG 2563 Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ala Arg Leu Val Gly Gln 325 330 335 CCA GTT TGG GAC GTT TCA AGG TCG AGC ACC GGA AAC CTC GTT GAG TGG 2611 Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp 340 345 350 355 TTT CTC CTT AGG AAG GCC TAC GAG AGA AAT GAG CTC GCG CCC AAT AAA 2659 Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys 360 365 370 CCG GAC GAG AGG GAA TAC GAG AGA AGG CTA AGA GAG AGC TAT GAA GGG 2707 Pro Asp Glu Arg Glu Tyr Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Glu Gly 375 380 385 GGT TAC GTT AAG GAG CCA GAG AAG GGA TTG TGG GAA GGG ATA GTC AGC 2755 Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Gly Ile Val Ser 390 395 400 TTA GAC TTT AGG TCC CTA TAT CCG TCT ATA ATT ATA ACT CAC AAC GTC 2803 Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val 405 410 415 TCA CCA GAC ACT TTG AAT AGA GAA AAT TGC AAG GAA TAC GAC GTT GCC 2851 Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Asn Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala 420 425 430 435 CC CAA GTG GGG CAC AGA TTC TGC AAG GAT TTC CCA GGA TTC ATA CCA 2899 Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro 440 445 450 AGC TTA CTG GGT AAC TTA CTG GAG GAG AGA CAA AAG ATA AAA AAG AGA 2947 Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Lys Arg 455 460 465 ATG AAA GAA AGT AAA GAT CCC GTC GAG AAG AAA CTC CTT GAT TAC AGA 2995 Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val Glu Lys Lys Leu Leu Asp Tyr Arg 470 475 480 CAG AGA GCT ATA AAA ATA CTT GCA AAC AGC TAT TAT GGC TAT TAT GGA 3043 Gln Arg Ala Ile Lys île Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly 485 490 495 TAT GCA AAG GCC AGA TGG TAC TGT AAG GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACT 3091 Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr 500 505 510 515 GCA TGG GGG AGG CAA TAC ATA GAT CTA GTT AGA AGA GAG CTT GAA AGC 3139 Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Asp Leu Val Arg Arg Glu Leu Glu Ser 520 525 530 AGC GGA TTC AAG GTT CTG TAC ATA GAC ACT GAT GGC CTC TAC GCG ACC 3187 Ser Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr 535 540 545 ATT CCT GGG GCC AAG CCA AAT GAG ATA AAA GAA AAG GCC CTT AAG TTC 3235 Ile Pro Gly Ala Lys Pro Asn Glu Ile Lys Glu Lys Ala Leu Lys Phe 550 555 560 GTC GAG TAC ATA AAC TCC AAG TTA CCT GGG CTT CTT GAA TTG GAA TAC 3283 Val Glu Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr 565 570 575 GAA GGT TTC TAC GCG AGA GGG TTC TTC GTG ACG AAG AAA AAG TAC GCA 3331 Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala 580 585 590 595 CTA ATC GAC GAG GAA GGA AAG ATA GTT ACG AGG GGG CTC GAA ATA GTA 3379 Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val 600 605 610 AGG AGA GAT TGG AGT GAA ATA GCA AAG GAG ACC CAA GCT AAG GTT CTC 3427 Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Lys Val Leu 615 620 625 GAG GCA ATA CTC AAG CAC GGT AAC GTT GAT GAG GCC GTA AAA ATA GTA 3475 Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn Val Asp Glu Ala Val Lys Ile Val 630 635 640 AAG GAG GTT ACA GAA AAA CTC AGT AAA TAT GAA ATA CCA CCC GAA AAG 3523 Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys 645 650 655 CTT GTA ATT TAT GAG CAG ATA ACG AGG CCT CTG AGC GAG TAT AAA GCG 3571 Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Lys Ala 660 665 670 675 ATA GGC CCT CAC GTT GCA GTA GCT AAA AGG CTC GCA GCG AAG GGA GTA 3619 Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gly Val 680 685 690 AAA GTT AAG CCA GGG ATG GTT ATC GGT TAC ATA GTT TTG AGG GGA GAC 3667 Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp 695 700 705 GGG CCA ATA AGC AAG AGG GCC ATA GCT ATA GAG GAG TTC GAT CCC AAA 3715 Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile Ala Ile Glu Glu Phe Asp Pro Lys 710 715 720 AAG CAT AAG TAC GAT GCC GAA TAC TAC ATA GAG AAC CAA GTT CTG CCA 3763 Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro 725 730 735 GCG GTG GAG AGG ATA TTG AGA GCA TTT GGT TAT CGC AAA GAA GAT TTG 3811 Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu 740 745 750 755 AGG TAT CAA AAA ACT AAA CAA GTG GGC CTC GGA GCA TGG CTT AAG TTC 3859 Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Phe 760 765 770 771 TAG CTACCCAGAT GTCACCGTAT CTCAACAGGT ATTCCTGGAG ATCTCTTAAA 3912 TCAACTACAA GCTCTTCCTC AAGTTCCATA AAGTTTATTG ACTTTATCGG TTTAATTATG 3972 AGCTTATAGG AGCCTAGAAC CCCAGAAATC TTAACTCTAA AGACTCTTGA AGCTAGCTCT 4032 ATCAGTTCAA GAACTATGTC CTTCTTAAGG AACGAGGAAT TAATGAAAAC TATTCCTTTA 4092 CCGTTCGGAT CCTGGAGAGC CATTTTCCCA ACTAATGTGA AGAAGAGTTC GCTTTCAATG 4152 TAGTTACTCT CCCTTGTTTT TAGAAGTCTC TCTAAGCCGA CGTTTATAGT GAACCGTCTT 4212 TTCCCCGTGC TTCTCAAGGG TAGTGAAAAG TTGTTTTCTC CAAACTCCGA TATCCGAGCC 4272 TATTTCTATT CTCTTCACTA CGCTGCCCGT TTTTATAAAT CCACCAAGTT TAACGACCCT 4332 GGCACTATCT ATAACATCGG TCTTCAGACC CAATAGCCTT AAGGTGGTTT CTCAAAACTG 4392 AGACCTTCCC TTTAGAGCAT TCAAGACCAT TAGAAGATCA GGTCTATTGG CTCG 4446 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2 (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2995 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: séquence codante de l'ADN polymérase de Pyrococcus sp. GE 5 (B) EMPLACEMENT:de 678 à 2994 (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: codon stop (B) EMPLACEMENT:de 2992 à 2994 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID NO:2 TCATGTCCTG GGGCTTGGTT ACGGAGGCTA TCAAAATATT GGACCXTTCG TGCCAGCTTA SO 65 70 75 CTA GGA AGG CCA ATA GAA GTC TGG AAG CTC TAT CTT GAG CAT CCC CAG 951 Leu Gly Arg Pro Ile Glu Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln 80 85 90 GAT GTT CCA GCC ATA AGA GAG AAG ATA AGG GAA CAT CCA GCT GTA GTT 999 Asp Val Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val 95 100 105 GAT ATA TTT GAA TAC GAC ATA CCC TTT GCG AAG CGC TAC CTC ATA GAC 1047 Asp 11e Phe Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp 110 115 120 AAG GGA TTG ACT CCA ATG GAG GGG AAC GAG GAG CTA ACG TTT CTA GCC 1095 Lys Gly Leu Thr Pro Met Glu Gly Asn Glu Glu Leu Thr Phe Leu Ala 125 130 135 GTT GAT ATA GAA ACA TTG TAC CAT GAA GGA GAG GAG TTC GGG AAA GGG 1143 Val Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly 140 145 150 155 CCA ATA ATA ATG ATC AGC TAC GCC GAC GAG GAA GGG GCC AAG GTG ATA 1191 Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Lys Val Ile 160 165 170 ACT TGG AAG AGC ATA GAC TTA CCT TAC GTT GAA GTG GTT TCG AGC GAG 1239 Thr Trp Lys Ser Ile Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu 175 180 185 AGG GAG ATG ATA AAG AGG CTC GTG AAG GTA ATT AGA GAG AAA GAT CCC 1287 Arg Glu Met Ile Lys Arg Leu Val Lys Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro 190 195 200 GAC GTG ATA ATA ACG TAC AAT GGT GAT AAT TTC GAC TTT CCG TAC CTC 1335 Asp Val Ile Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu 205 210 215 TTA AAG AGG GCT GAA AAG CTC GGA ATA AAG CTC CCC CTT GGA AGG GAC 1383 Leu Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Pro Leu Gly Arg Asp 220 225 230 235 AAT AGC GAG CCG AAA ATG CAG AGG ATG GGG GAT TCA TTA GCC GTA GAG 1431 Asn Ser Glu Pro Lys Met Gln Arg Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu 240 245 250 ATA AAG GGC AGA ATA CAC TTC GAT TTA TTC CCC GCC ATA AGA AGA ACG 1479 Ile Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Phe Pro Ala Ile Arg Arg Thr 255 260 265 ATC AAC CTT CCA ACA TAC ACC CTC GAA ACG GTT TAT GAG GTT ATA TTT 1527 Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Thr Val Tyr Glu Val Ile Phe 270 275 280 GGA AAG TCT AAG GAG AAA GTC TAT GCC CAT GAG ATA GCT GAG GCC TGG 1575 Gly Lys Ser Lys Glu Lys Val Tyr Ala His Glu Ile Ala Glu Ala Trp 285 290 295 GAA ACC GGG AAA GGG CTA GAG AGG GTA GCT AAG TAT TCA ATG GAA GAT 1623 Glu Thr Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp 300 305 310 315 GCG AAG GTA ACC TCT GAG CTC GGA AAG GAG TTC TTC CCG ATG GAA GCC 1671 Ala Lys Val Thr Ser Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala 320 325 330 CAG CTA GCT AGG CTC GTT GGC CAT CCA GTT TGG GAC GTT TCA AGG TCG 1719 Gln Leu Ala Arg Leu Val Gly His Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser 335 340 345 AGC ACC GGA AAC CTC GTT GAG TGG TTT CTC CTT ACG AAG GCC TAC GAG 1767 Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu Thr Lys Ala Tyr Glu 350 355 360 AGA AAT GAG CTC GCG CCC AAT AAA CCG GAC GAG AGG GAA TAC GAG AGA 1815 Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Tyr Glu Arg 365 370 375 AGO CTA AGA GAG AGC TAT GAA GGG GGT TAC GTT AAC GAG CCA GAG AAG 1863 Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Asn Glu Pro Glu Lys 380 385 390 395 GGA TTG TGG GAA GGG ATA GTC AGC TTA GAC TTT AGG TCC CTA TAT CCC 1911 Gly Leu Trp Glu Gly Ile Val Ser Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro 400 405 410 TCT ATA ATT ATA ACT CAC AAC GTC TCA CCA GAC ACT TTG AAT AGA GAA 1959 Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu 415 420 425 AAT TGC AAG GAA TAT GAC GTT GCC CCC CAA GTG GGG CAC AGA TTC TGC 2007 Asn Cys Lys Glu Tyr Asp Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys 430 435 440 AAG GAT TTC CCA GGA TTC ATA CCA AGC TTA CTG GGT AAC CTA CTG GAG 2055 Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Glu 445 450 455 GAG AGA CAA ARG ATA AAA AAG AGG ATG AAA GAA AGT AAA GAT CCC GTC 2103 Glu Arg Gln Lys Ile Lys Lys Arg Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val 460 465 470 475 GAG AAG AAA CTC CTT GAT TAC AGA CAG AGA GCT ATA AAA ATA CTT GCA 2151 Glu Lys Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala 480 485 490 AAC AGC TAT TAT GGC TAT TAT GGA TAT GCA AAG GCC AGA TGG TAC TGT 2199 Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys 495 500 505 AAA GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACC GCA TGG GGA AGG CAG TAC ATA GAC 2247 Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Asp 510 515 520 CTG GTT AGG AGG GAA CTT GAG AGC AGA GGA TTT AAA GTT CTC TAC ATA 2295 Leu Val Arg Arg Glu Leu Glu Ser Arg Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile 525 530 535 GAC ACA GAT GGC CTC TAC GCA ACG ATT CCT GGA GCC AAG CAT GAG GAA 2343 Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr île Pro Gly Ala Lys His Glu Glu 540 545 550 555 ATA AAA GAG AAG GCA TTG AAG TTC GTC GAG TAC ATA AAC TCC AAG TTA 2391 Ile Lys Glu Lys Ala Leu Lys Phe Val Glu Tyr île Asn Ser Lys Leu 560 565 570 CCT GGG CTT CTT GAA TTG GAA TAC GAA GGT TTC TAC GCG AGA GGG TTC 2439 Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe 575 580 585 TTC GTG ACG AAG AAA AAG TAC GCA CTA ATC GAC GAG GAA GGA AAG ATA 2487 Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile 590 595 600 GTT ACG AGG GGG CTC GAA ATA GTA AGG AGA GAT TGG AGT GAA ATA GCA 2535 Val Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala 605 610 615 AAG GAG ACC CAG GCC AAG GTT CTC GAG GCA ATA CTC AAG CAC GGT AAC 2583 Lys Glu Thr Gln Ala Lys Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn 520 625 630 635 GTT GAT GAG GCC GTA AAA ATA GTA AAG GAG GTT ACA GAA AAA CTC AGT 2631 Val Asp Glu Ala Val Lys Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser 640 645 650 AAA TAT GAA ATA CCA CCC GAA AAG CTT GTA ATT TAT GAG CAG ATA ACG 2679 Lys Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr 655 660 665 AGG CCT CTG AGC GAG TAT AAA GCG ATA GGC CCT CAC GTT GCA GTA GCT 2727 Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala 670 675 680 AAA AGG CTC GCA GCG AAG GGA GTA AAA GTT AAG CCA GGG ATG GTT ATC 2775 Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gly Val Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile 685 690 695 GGT TAC ATA GTT TTG AGG GGA GAC GGG CCA ATA AGC AAG AGG GCC ATA 2823 Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile 700 705 710 715 GCT ATA GAG GAG TTC GAT CCC AAA AAG CAT AAG TAC GAT GCC GAA TAC 2871 Ala Ile Glu Glu Phe Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr 720 725 730 TAC ATA GAG AAC CAA GTT CTG CCA GCG GTG GAG AGG ATA TTG AGA GCA 2919 Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala 735 740 745 TTT GGT TAT CGC AAA GAA GAT TTG AGG TAT CAA AAA ACT AAA CAA GTG 2967 Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val 750 755 760 GGC CTC GGA GCA TGG CTT AAG TTC TAG A 2995 Gly Leu Gly Ala Trp Leu Lys Phe 765 770 771 REVENDICATIONS 1) ADN polymérase purifiée thermostable d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. ayant un poids moléculaire compris entre environ 89 000 et 90 000 daltons. 2) ADN polymérase selon la revendication 1 de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. GE 5 déposée à la CNCM sous le No. I-1302 3) ADN polymérase selon la revendication 2 ayant un poids moléculaire d'environ 89 443 daltons et un pI d'environ 8,13. 4) ADN polymérase selon la revendication 1 purifiée de la souche d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. GE 23 déposée à la CNCM sous le No. I1764. 5) ADN polymérase selon la revendication 4 ayant un poids moléculaire d'environ 89 409 daltons et un pI d'environ 8,37. 6) Une ADN polymérase purifiée thermostable dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1. 7) Une ADN polymérase purfiée thermostable dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:2. 8) Une séquence d'ADN constituée par ou comprenant la séquence codant pour 1'ADN polymérase purifiée thermostable de l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9) Une séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant ou constituée par les nucléotides 1547 à 3862 de la SEQ ID NO:1. 10) Une séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant ou constituée par les nucléotides 678 à 2994 de la SEQ ID NO:2. 11) Un vecteur contenant la séquence d'ADN de l'une quelconque des revendications 8 à 10. 12) Un hote transformé par un vecteur selon la revendication 11. 13) Procédé de préparation d'une ADN polymérase d'archaebactéries du genre Pyrococcus sp. caractérisé en ce que l'on cultive l'hôte selon la revendication 12 dans des conditions permettant llexpression de ladite ADN polymérase et en ce que l'on extrait et récupére celle-ci par tout moyen approprié. 14) Procédé d'amplification enzymatique d'une séquence d'acide nucléique caractérisé en ce que l'on met en oeuvre une ADN polymérase thermostable selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.