Brevet FR2756463A1 — publié le 19980605

COMPOSITIONS PESTICIDES, PLUS PARTICULIÈREMENT INSECTICIDES, À BASE DE DITERPÈNES DE LA FAMILLE DES DAPHNANES. La présente invention concerne de nouvelles compositions pesticides, plus particulièrement insecticides, comprenant comme substance active un diterpène de la famille des daphnanes. L'invention concerne également la préparation de ces diterpènes soit par synthèse chimique, soit à partir d'extrait de plantes - L'utilisation intensive des insecticides de synthèse favorise le développement de résistances (1) et justifie la recherche de nouveaux insecticides. Les plantes produisent, selon un même schéma de biosynthèse, des métabolites secondaires les protégeant de l'attaque de divers herbivores (2). Ceuxci constituent une source très importante de substances biologiquement actives et biodégradables mais dont peu présentent des caractéristiques leur permettant de concurrencer les composés agrochimiques synthétiques. Ces substances peuvent être utilisées comme modèles pour la préparation d'analogues susceptibles de présenter des avantages par rapport au composé original (3). Les travaux ayant conduit à la présente invention ont été réalisés dans le cadre d'un programme de criblage de plantes sauvages du Soudan visant à identifier de nouveaux composés chimiques présentant des activités agronomiques intéressantes. Parmi les matériels analysés durant ce programme, l'exploitation d'un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn.) (Thymelaeceae) a permis de caractériser deux terpènes de la famille des daphnanes, connus sous les noms de Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D et répondant à la formule développée cidessous dans laquelle le groupement R représente, - un groupe (E,E)-nona-1,3-diényle, dans le cas de l'Excoecariatoxine, et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotoxine D. La plante Lasiosiphon kraussianus est largement distribuée en Afrique (9), notamment à Darfour à l'ouest du Soudan, où elle est connue sous le nom de "Komma" ou "Mahjiria". Les racines sur lesquelles a été effectuée l'étude ayant conduit à l'invention ont été collectées au Soudan dans le Jebel Marra, situé à Wadi mertagello à 1160 mètres au dessus du niveau de la mer, par K. Uhlig et A. A. Adam du Jebel Marra Fores t Circle, Golol au Soudan, où des spécimens sont conservés. Une description détaillée de Lasiosiphon kraussianus a déjà été réalisée (10) et les études pharmacologiques effectuées à partir d'extraits de ses racines ont permis d'obtenir des résultats intéressants contre des types de leucémie (4, 5), mais aucune activité insecticide n'a été décrite jusqu'à ce jour. La présence d'Excoecariatoxine dans les racines de Lasiosiphon kraussianus (6) et dans d'autres plantes comme Excoecaria agalloa (Euphorbiaceae) (6) et Gnidia lamprantha (Thymelaeceae) (7) a déjà été décrite dans l'art antérieur. La présence de la Wikstrotoxine D dans des plantes, comme Wikstroemi monticola (Thymelaeceae) (8) a également déjà été rapportée mais jamais dans Lasiosiphon kraussianus. Les travaux effectués par les Inventeurs sur un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn.) et sur les deux composés diterpéniques de type daphnane qui en ont été isolés ont maintenant permis de mettre en évidence d'intéressantes propriétés qui permettent leur utilisation dans la lutte contre certains insectes nuisibles. I1 peut s'agir de parasites de végétaux ou de parties de végétaux, du sol, des locaux domestiques ou publics et d'animaux à sang chaud. Parmi-ceux-ci, on peut citer les pucerons et les diptères, parasites importants en agriculture et en santé et hygiène vétérinaire et humaine. En conséquence, l'invention concerne les compositions pesticides, plus particulièrement insecticides, comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes. Par famille des daphnanes, on entend selon l'invention également les produits apparentés aux daphnanes, tels que les ingénanes. Plus particulièrement l'invention concerne les compositions insecticides comprenant comme substance active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un extrait de plante contenant le(s)dits composé(s) dans laquelle - les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un arbouse de formule dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques; - les groupements R11 et R12 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7); - les groupements R6 et R7 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R7 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2); - le groupement Rg est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =0 ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - les groupements R1o, R13 et R14 sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement R15 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =0 ou un dérivé de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement Rs représente un atome d'hydrogène ou une liaison entre les carbones (10) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane; - le groupement R4 est choisi parmi.un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées. Parmi les composés de formule (I) cidessous, l'invention envisage plus particulièrement ceux dans lesquels - les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques; - les groupements R11 et R12 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7); - les groupements R6 et R7 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2); - le groupement Rg est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - les groupements R10, R13 et R14 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement R15 est un atome d'hydrogène; - le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées; - le groupement R8 représente un atome d ' hydrogène; - le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées. Parmi les composés ci-dessus, on peut citer tout particulièrement 1 'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D ou un extrait de plante, comme Lasiosiphon kraussianus, les contenant. Les composés de formule (I), constituant la substance active des compositions pesticides de l'invention, peuvent être synthétiques, hémisynthétiques ou naturels. Les composés naturels, comme l'Excoecariatoxine la Wikstrotoxine D, peuvent être obtenus à partir de plantes, notamment comme décrit dans les exemples ci-après à partir d'un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus. La Wikstrotoxine D n'ayant jamais été décrit dans Lasiosiphon kraussianus, l'invention envisage spécifiquement l'obtention de la Wikstrotoxine D à partir de racines Lasiosiphon kraussianus. Un procédé d'obtention de Wikstrotoxine D à partir de racines Lasiosiphon kraussianus consiste par exemple à - extraire les principes actifs à partir d'organes végétaux par exemple à l'aide de solvants; - purifier les substances recherchées toute opération de purification appropriée. Des opérations de purification susceptibles d'être employées sont par exemple les opérations suivantes : partage avec des solvants non miscibles, chromatographie d'adsorption en phase polaire et en phase inverse, gel filtration; opérations qui sont tout d'abord effectuées à une échelle préparative, puis en HPLC pour obtenir les produits purs. Ces composés, ainsi que leurs analogues et dérivés peuvent aussi être obtenus par synthèse ou hémisynthèse. Outre la substance active, les compositions de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs véhicules habituels des pesticides et insecticides, tels que des solvants, des mouillants, des dispersants, etc.... Ces compositions peuvent se présenter sous forme de poudres, granulés, suspensions, émulsions, solutions, ou autres formulations traditionnellement employées dans ce domaine et permettant divers modes d'applications comme l'épandage, la pulvérisation, etc... La dose à appliquer varie avec le composé mis en oeuvre, le type de composition utilisée et son mode d'application, et dépend en outre de la nature du parasite à combattre ainsi que de l'espèce végétale ou du lieu à protéger, mais en général les compositions de l'invention peuvent contenir de 5 à 80 % en poids de substance active. L'invention concerne bien entendu aussi l'utilisation des composés de formule (I) comme pesticides, plus particulièrement comme insecticides, dans la protection des cultures ou pour le traitement des lieux de stockage des produits desdites cultures ou des locaux domestiques ou publics. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfère à des exemples de préparation des composés de formule (I) et de leur utilisation comme pesticides, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une limitation quelconque de l'objet de 1' invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux dessins en annexe, dans lesquels - La figure 1 représente le chromatogramme d'HPLC préparative en phase inverse sur fraction brute de l'extrait étudié. - La figure 2 représente le chromatogramme d'HPLC analytique en phase inverse sur l'Excoecariatoxine après la collecte. I - MATÉRIEL ET MÉTHODES. 1) Matériel végétal. Les racines ont d'abord été découpées puis séchées pendant deux semaines avant d'être transportées en France, où elles ont été étendues et stockées à la température ambiante (20 C). Elles ont ensuite été broyées pour être utilisées sous forme de poudre. a) Extraction. 100 g de de la poudre de racine ont été placés dans un flacon conique de 2 litres. 1200 ml de méthanol ont été ajoutés et le flacon a été agité pendant deux heures puis laissé une nuit au réfrigérateur. Après filtration sous vide, une extraction supplémentaire a été pratiquée avec 600 ml de méthanol sur le culot solide séché. Les deux filtrats ont été rassemblés et évaporés avec un évaporateur rotatif (4 OOC) sous vide partiel. L'extrait concentré a été finalement dissous dans 25 ml de méthanol, dont 5 ml ont été utilisés pour les essais biologiques grossiers. b) Fractionnement. L'extrait méthanolique (20 ml) a été suspendu dans 40 ml d'eau et partagé dans du dichlorométhane (2 fois 60 ml). La fraction non polaire, où l'activité a été mise en évidence, a ensuite été chromatographiée sur une colonne de gel de silice (40 cm x 2,5 cm). 80 g de gel de silice, dont les particules ont une taille comprise entre 0,063 et 0,125 mm (120-130 mesh ATSM), ont été conditionnées dans du dichlorométhane. Pour l'élution, la fraction a été soumise à une chromatographie avec un gradient de dichlorométhane jusqu'à un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol (0/60/40, v/v), à un débit de 3 ml/mn (Matériel Waters : formeur de gradient modèle 600). Soixante tubes (18 mm x 180 mm) contenant 16 ml chacun, ont été collectés. Tous les tubes ont été soumis à un contrôle par une chromatographie en couche mince (CCM) (Polygram sil G/W 254, épaisseur de couche 0,25 mm, Macherey-Nagel), élués avec un mélange héxane/acétate d'éthyle (30/70, v/v), et observés sous lumière W à 254 nm puis rassemblés en 11 fractions. L'activité insecticide à été montrée dans les fractions No. 3, 4, 9 et 10. Les fractions 9 et 10 ont été rassemblées et rechromatographiées par gel filtration (Colonne : 1,3 m x 2,5 cm. Support Sephadex LH 20 Pharmacia, particules de taille entre 25-100 Am, conditionné dans du méthanol. Phase mobile : méthanol délivré à 2 ml/mn par une pompe Gilson 301. Détection : détecteur WICORD LKB, longueur d'onde = 254 nm. Collecteur de fractions Foxy, isco). Cinquante six tubes (13 mm x 100 mm) de 7 ml chacun ont été collectés. Après contrôle en CCM, tous les tubes ont été rassemblés en 6 fractions. L'activité biologique a été mise en évidence dans la fraction 4, qui a alors été soumise à une HPLC préparative en phase inverse (Waters 600, multi solvent delivery system; Injector U6K; Detector Waters 990, photodiode array detector; Colonne ,U-BONDAPAK C18 Water's (30 cm x 7,5 mm; taille des particules 10 Rm; température de la colonne : 450C); Computer NEC, APCIII; Plotter : Waters 990). Les conditions isocratiques étaient de débit de 3,7 ml/mn; phase mobile MeOH/H2O (74/26, v/v). Chaque pic a été collecté manuellement. 2) Insectes et acariens. Tous les insectes (Aphis gossypii (Glov), Myzus persicae (Sulz), Drosophila melanogaster (Meig), Spodoptera littoralis (Boisd), Sitophilus granarius L. et l'acarien Tetranychus urticae (Koch) sont des souches sensibles. Ils sont élevées dans des conditions contrôlées (20 + 20C, 60 + 10 96 R.H. et 8 h/16 h de nuit/lumière). A. gossypii a été élevé sur des plantules de concombre, M. persicae sur des fèves, Drosophila sur un milieu semi-synthétique, S. granarius sur du blé, S. littoralis sur un régime semi-synthétique et T. urticae sur des haricots. 3) Tests biologiques. a) Activité contre A. aossy7aii et M. Persicae. Ces tests ont été effectués dans des boîtes de 2,7 cm de diamètre. Ces boîtes ont été remplies d'un gel semi-solide agar-agar. Des disques de feuilles de concombre (de fève dans le cas de M. persicae) ont été placés sur l'agar. Deux à trois heures avant le traitement, quinze aptères adultes ont été placés dans chaque boîte pour s'adapter. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque dose. De l'eau déionisée et de l'acétone (80/20, v/v) ont été utilisés pour la préparation de cinq dilutions (en progression géométrique) pour chaque produit. 0,5 ml de chaque dose a été directement pulvérisé sur les deux boîtes en utilisant un micropulvérisateur (acétone/eau dans le cas du contrôle) , puis les boîtes ont été placées dans les conditions contrôlées décrites précédemment. Les pucerons morts ont été comptés après 24 heures (A. gossypii) ou 48 heures (M. persicae) après l'application. Les insectes ont été considérés morts si ils se présentaient sur le côté ou sur le dos, avaient leurs pattes repliées sur la surface ventrale, montraient des signes de dessiccation, et/ou ne répondaient pas à un coup de pinceau (11). Les pourcentages de mortalité, y compris dans les tests cidessous, ont été corrigés par la formule d'Abbott et les valeurs CL50 ont été calculées par la méthode d'analyse des probits (12) en utilisant un logiciel spécial (13). b) Activité contre la Drosophile. - Incorporation au milieu. Le test de toxicité globale a été effectué dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 cm de diamètre. 35 grammes de milieu semi-synthétique (2,2 1 de son; 260 ml de sucre; 130 ml de levure de bière ; 70 ml de vinaigre ; 20 ml de nipagine; 580 ml d'eau) ont été placés et pressés dans chaque flacon. Chaque traitement a été effectué en double. Dans chaque flacon, 1 ml de chaque concentration a été incorporé dans le milieu (acétone et eau dans le cas du contrôle). Deux à trois heures après le traitement (temps d'évaporation de l'acétone), 15 adultes de 0 à 3 jours (10 femelles et 5 mâles) ont été placés dans chaque flacon. Les flacons ont été bouchés avec un coton et remis dans les conditions de culture. Les adultes ont été enlevés des flacons lorsque dans le témoin quelques larves se sont transformées en pupes (environ après 13 jours). Le nombre d'adultes a été compté tous les deux jours pendant deux semaines (7 lectures) . Le pourcentage d'émergence a été calculé par rapport au témoin et les valeurs CL50 ont été calculées par la méthode indiquée précédemment. - Test tooioue. Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre ont d'abord été lavées avec de l'éther éthylique. De petits cubes de gel d'aga (10 g d'agar/l et une petite quantité de miel) ont été placés dans chaque boîte de Petri. Les insectes ont été refroidis pendant 2,5 minutes. 0,3 ,ul de chaque concentration (méthanol dans le cas du contrôle) ont été appliqués sur le thorax en utilisant un micro-applicateur automatique (Burkard manufacturing co. ltd., UK). Dix insectes ont été utilisés dans chaque traitement avec trois répétitions. Après le traitement, les insectes du test sont remis dans leurs conditions de culture. La mortalité a été mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures. - AxDplication Par contact. Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre avec ou sans papiers filtres ont été utilisées. Dans les deux cas, 1 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) a été placé dans chaque boîte. Après évaporation du solvant, les petits cubes alimentaires cités précédemment et 30 insectes ont été placés dans les boîtes. Chaque traitement a été répété 3 fois et la mortalité a été mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures. c) Activité contre Spodostera littoralis. - Anlication toxique. Des larves de troisième stade (35 + 10 mg) ont été utilisées. 0,5 ,ul de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque larve. Chaque larve traitée a été placée dans une boîte séparée de 2,7 cm de diamètre, approvisionnée en milieu non traité puis replacée dans les conditions de culture. Chaque traitement incluant dix larves et un témoin a été effectué en double. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures. L'effet sur la croissance et le développement a été quantifié chez les insectes par l'apparition de nouveaux adultes. - AIDslication orale. Les insectes (troisième stade larvaire) ont été privés de nourriture pendant 24 heures. A chaque petit cube de régime semi-synthétique (3,2 1 d'eau, 80 g agar-agar, 300 g de farine de maïs, 126 g de germes de blé, 134 g de levure de bière, 200 g de feuilles de chou, 18 g d'acide ascorbique, 4,2 g d'acide benzoïque, 7,2 g de nipagine, 10 g d'un mélange de sel, 30 g de vitamines, 5 g de fumidil, 1,5 ml de formaldehyde, 8 ml d'huile de lin), 0,25 Rl de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués. Après évaporation du solvant, un cube traité a été placé par boîte de 2,7 cm de diamètre. Les larves ont été soumises à une alimentation avec le milieu traité (dix larves pour chaque concentration) . Une alimentation non traitée leur a été donnée après 24 heures. La mortalité a été déterminée 24 et 48 heures après le traitement. Les insectes ont été observés jusqu'à l'apparition de nouveaux adultes pour enregistrer l'effet sur la croissance et le développement. d) Activité contre Sitoshilus csranarius. - Application toxique. Des adultes de 15 jours ont été utilisés dans ce test. 0,5 Fl de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque insecte en utilisant un microapplicateur. Pour chaque traitement, 25 insectes traités ont été placés dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 de diamètre avec une petite quantité de blé et les bouteilles ont été fermées avec une gaze. Chaque traitement y compris le contrôle a été répété deux fois. Pour la toxicité aiguë, les mesures de mortalité ont été effectuées après 24, 48 et 72 heures. Pour les effets sur le développement, les adultes ont été retirés des bouteilles après deux semaines et le nombre d'insectes nouvellement apparus a été compté pendant huit semaines. Le nombre total d'insectes nouvellement émergés a été comparé à ceux du témoin comme décrit précédemment. e) Activité contre Tetranvchus urticae. - Activité contre les adultes. La méthode adoptée dans ce test est sensiblement identique à celle utilisée pour les pucerons. Des boîtes de 2,7 cm de hauteur et 4,5 cm de diamètre ont été remplies avec un gel semi-solide d'agar-agar supportant un disque de feuille de haricot. Trente adultes ont été placés dans chaque boîte pendant trois heures avant le traitement pour s'adapter. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration. 0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le témoin) ont été directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas, les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures. - Activité contre les oeufs. Vingt adultes ont été placés dans les boîtes décrites ci-dessus pendant 48 heures. Les adultes ont ensuite été retirés et les oeufs comptés. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration. 0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas, les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. Le nombre d'oeufs non-éclos et de larves mortes a été compté pendant 7 jours. 4) Analvse sDectroscoDioue. a) Spectrométrie de masse. Les spectres conventionnels (MS) ou d'ionsdescendants (MS-MS) ont été obtenus avec un triple quadrupole Nermag R30-10 (Quad Service, Poissy, France). Les conditions suivantes de la source ont été adoptées température de 1300C; courant dans le filament de 50 CLA; énergie des électrons de 95 eV; NH3 et ND3 comme gaz réactif et la pression dans le compartiment source a été fixée à 10-4 Torr. Les spectres d'ions-descendants ont été obtenus avec une énergie de collision de 20 eV et de l'argon à 7 x 10-2 Torr comme gaz de collision dans le second quadripole. L'introduction des échantillons a été réalisée par désorption-ionisation chimique (DCI) en modes positif ou négatif. b) Résonance maqnétiaue nucléaire. Les deux composés, Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D, ont été soumis à une analyse RMN H1 (Varian Gemini, 300 Mhz) dans une solution de CDC13 en utilisant le signal CHC13 comme référence interne (7,27 ppm). Il - RÉSULTATS. 1) Activité de l'extrait brut. Les travaux réalisés à partir de l'extrait méthanolique de racine de Lasiosiphon kraussianus (Meisn) (Thymelaeaceae) décrit ci-dessus ont permis d'étudier l'activité insecticide sur cinq types d'insectes et un acarien avec différents modes d'application. La concentration utilisée dans les tests de pulvérisation a été de 24 1ll d'extrait mélangés à 576 pl d'eau distillée, et 0,5 ml de cette solution ont été directement pulvérisés sur ces insectes. Dans les autres tests décrits précédemment, l'incorporation au milieu alimentaire, le contact, les applications topiques et les tests acaricides, l'extrait concentré a été utilisé directement sans dilution. Le tableau I ci-dessous montre l'effet de l'extrait brut sur quelques insectes et un acarien. Tableau I Insectes Application Mortalité (%) A. oss il pulvérisation 83,3 Contact 93 D. melanogaster Topique o Milieu 100 S. granarius topique 0 S. littoralis topique o Milieu o T. urticae Adulte o Oeufs 41,7 L'extrait brut présente une efficacité importante contre Aphis gossypii auquel il cause une mortalité de 83,3 % après 24 heures, contre Drosophila melanogaster avec 100 % de mortalité lorsqu'vil est incorporé au milieu et 93 % par contact, ainsi que visà-vis des oeufs de T. urticae avec un pourcentage de 41,7 %. Aucun effet n'a été observé contre S. littoralis et S. granarius. 2) Activité de fractions de l'extrait brut. L'extr (fractions 3, 4, 9 et 10) présentant des activités insecticides significatives ont été obtenues. Après chromatographie sur une colonne sephadex LH-20, une activité a été mise en évidence dans la fraction 4. Cette fraction a alors été soumise à une HPLC préparative en phase inverse dont le chromatogramme est représenté à la figure 1. Chaque pic a été collecté manuellement, concentré puis repris dans 2 ml de solvant. Les pics actifs sont ceux dont les temps de rétention sont de 28,84 et 53,90 minutes. Les deux fractions ont alors été soumises à une identification et des tests d'activité plus précis contre trois insectes A. gossypii, M. persicae et D. melanogaster. 3) Identification et caractérisation de l'Excoecariatoxine et de la Wikstrotoxine D. L'analyse par spectrométrie de masse (MS et MS-MS) et spectrométrie RMN a révélé que ces deux composés actifs sont des diterpènes avec un squelette de type daphnane répondant à la formule ci-dessous dans laquelle le groupement R représente, - un groupe (E,E)-nona-1,3-diényle, dans le cas de l'Excoecariatoxine ([a]D+61,0 (c=0,190 CH2Cl2)}, et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotoxine D ([a]D+17,3 (c=0,643 CH2Cl2)}. La masse moléculaire de ces composés, considérée de 528 pour l'Excoecariatoxine et de 532 pour la Wikstrotoxine D, selon l'analyse NH3-DCI-MS (les ions à m/z 529 et 533 étant les espèces MH+ en mode positif et les ions à m/z 528 et 532 correspondant à M-O en mode négatif) . Le spectre ND3-DCI dans le mode positif contenant des ions à m/z 533 et 537 a confirmé ces masses moléculaires et indiqué en outre la présence de trois atomes d'hydrogène échangeables dans les deux composés. Afin de disposer d'information et de preuves supplémentaires sur les structures supposées de ces composés, les spectres d'ions-descendants des ions MH+ ou des ions M-" ont été réalisés. En mode positif, par exemple, la décomposition sous collision des espèces MH+ s'effectue principalement selon deux voies conduisant d'une part à l'ion m/z 151 (Excoecariatoxine) ou 155 (Wikstrotoxine D) correspondant à une structure RCO+ avec R représentant la chaîne latérale, et d'autre part, pour les deux composés, à l'ion m/z 361 après élimination d'une molécule RCO2H. Les spectres de RMN H1 ont été enregistrés et ont conduit à des données spectroscopiques identiques à celles rapportées dans la littérature (8) Excoecariatoxine (8(ppm), J(Hz)) 7,64 (bs, H-l); 6,71 (dd, 15, 8, H-23); 6,04 (dd, 15, 8, H-24); 5,83 (dt, 15, 7, H-25); 5,72 (d, 15, H-22);5,04 , 4,92 (2bs, H-16); 4,42 (d, 2, H-14); 4,25 (bs, H-5); 3,85 (2m, H-20); 3,44 (bs, H-7); 2,83 (d, 2, H-8); 2,48 (m, H-ll); 2,05-2,2 (m, H-12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,22 (d, H-18); 0,91 (t, H-30). Wikstrotoxine D ((ppm), J(Hz)Y 7,62 (bs, H-1); 5,04 , 4,92 (2bs, H-16); 4,38 (d, 2, H-14); 4,26 (bs, H-5); 3,83 (2m, H-20); 3,43 (bs, H-7); 2,91 (d, 2, H-8); 2,45 (m, H-ll); 2,2 (3, H 12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-l9) ; 1,16 (d, H-18); 0,89 (t, H-30)- 4) Essais comlDaratifs. L'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D ont été comparés à deux insecticides bien connus, la deltaméthrine et le méthomyl, deux composés présentant un profil dose-dépendant vis-à-vis de Aphis gossypii et Drosophila 'nelanogaster. Le tableau 2 ci-dessous rapporte les valeurs CL5o (,ug/ml) de 1'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D, la deltaméthrine et le méthomyl. Tableau 2 A. gossypii M. persicae D. melanogaster Excoecariatoxine 18,7 89,8 18,7 Wikstrotoxine D 17,0 53,1 22,6 Méthomyl 2,03 7,87 38,9 Deltaméthrine 0,0570 0,0316 1,42 Les deux composés naturels présentent une activité similaire sur A. gossypil. Avec des CL50 respectivement de 2,03 , 18,7 et 17,0 Ag/ml, le méthomyl est environ 9 fois plus actif que l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D. L'activité des deux composés naturels et du méthomyl sur M. persicae est inférieure à celle contre A. gossypii. Le méthomyl est environ 7 fois plus actif que la Wikstrotoxine D et 11 fois plus que 1 'Excoecariatoxine. Les deux composés naturels présentent également une activité similaire vis-à-vis de D. melanogaster (incorporation au milieu), et sont environ 2 fois plus actifs que le méthomyl. Cette activité montre une persistance favorable des deux composés. Les insectes examinés ont été sélectionnés aléatoirement afin de démontrer les diverses activités susceptibles de se produire et de démontrer les différences d'activité entre les deux composés naturels et d'autres composés du commerce. Les essais biologiques montrent que les deux composés présentent une activité variable selon les insectes. Ils sont actifs sur A. gossypii, M. persicae et D. melanogaster mais aucune activité n'a été mesurée sur S. littoralis et S. granarius. Ceci pourrait indiquer que les diterpènes de type daphnane présentent une certaine spécificité et donc pourraient réduire les risques vis-à-vis d'organismes favorables qui semblent avoir un rôle éventuel dans les programmes de protection intégrée d'insectes. Ceci pourrait être attesté par le fait que les deux composés sont des produits naturels et, en conséquence, pourraient être dégradés plus rapidement dans l'environnement que d'autres pesticides conventionnels. Les études déjà réalisées avec l'extrait méthanolique de cette racine de plante ont permis de montrer une activité contre les leucémies lymphocytaire p-388 (5) et d'autres maladies (14). La toxicité de cet extrait à été examinée chez la souris, le rat, le lapin, le chien, et l'iléum ou le coeur isolé de lapin (14). Les auteurs ayant rapportés ces études de toxicité aiguë chez les souris ont estimé la valeur de la DLso respectivement à 27,1 et 330 mg/kg après des administrations orale et intrapéritonéale. Dans les études de toxicité chronique réalisées chez des rats alimentés avec cet extrait pendant 6 mois, ils n'ont observé aucun signe clinique de toxicité et aucune grave lésion n'a été détectée lors des examens postmortem, ce qui permet de conclure que cet extrait à une dose de 2 mg/kg per os n'est pas toxique chez les souris, les rats et les lapins. Ces résultats supportent l'intérêt des composés de l'invention, car il est nécessaire de disposer de nouveaux insecticides ciblés, biodégradables et tolérés par l'environnement. LISTE DES RÉFÉRENCES 1 - METCALF, R.L. 1989. Insect resistance to insecticides. Pestic. Sci 26, 333-358 2 - MAVITUNA, F. 1992. Application of plant biotechnology in industry and agriculture. In Recente advances in biotechnology. Klumer Academic publishers, Netherland. pp.209-226. 3 - BENNER, J.P. 1993. Pesticidal compounds from higher plants. Pestic. Sci 39, 95-102. 4 - BORRIS, R.P. 1982. Antileukemic principles of Gnidia Kraussiana Meisn. and chemical and microbial transformations of uleine. Dissertation Abstracts International 42 (9),3684. 5 - BORRIS, R.P. and CORDELL G.A. 1984. Studies of the Thymelaeaceae. II. Antineoplastic principles of Gnidia kraussiana.J.Nat. Prod. 47(2), 270278. 6 - OHIGASHI, H. KATSUMATA, K.KAWAZU, K.KOSHIMIZU and T. MITSUI.1974. A priscidal constituent of excoecarcia agallocha. Agr. Bio. Chem. 38(5), 10931095. 7 - KUPCHAN, S. M., J.G. SWEENY, R.L. BAXTER, T. MURAE, V.A. ZIMMERLY and B.R. SICKLES. 1975. Gnididin, Gniditrin, and Gnidicin, novel potent antileukemic diterpenoid esters from Gnidia lamprantha. J. Am. Chem. Soc. 97, 672-673. 8 - JOLAD, S.D., J.J. HOFFMANN, B.N. TIMMERMANN, K.H. SCHRAM, J.R. COLE, R.B.BATES, R.E. KLENCK and M.S. TEMPESTA. 1983. Daphnane diterpenes from Wikstroemia monticola : Wikstrotoxins A-D, huratoxin, and excoecariatoxin. J. Nat. Prod.46(5),675-680. 9 - WICKENS, G.E.1976. Thymelaeaceae. In The flora of jebel Marra (Sudan Republic) and it's geographical affinities. Her Majestiy's Stationary Office publishers, London.pp.95. 10 - ANDREWS, F.W. 1950. Thymelaeaceae. In The flowering plants of the Anglo-Egyptian Sudan. T. BUNCLE and Co. Ltd publisher, Arbroath, Scotland.pp.l50. 11- GUBRAN, E.M.E.; R. DELORME, D. AUGE, and J.P. MOREAU.1992. Insecticide resistance in cotton aphid Aphis gossypii (glov). in the Sudan Gezira. Pstic. Sci., 35(2), 101-107. 12 - FINNEY, D.J. 1980 Probit analysis. Cambridge University Press, pp.33. 13 GINER, M. Analyse de la dose Iétale 50, présentation du module d'analyse et du gestionnaire de base de données. In Atelier d'entomologie appliquée Lutte intégrée contre les ravageurs des cultures, 1993, CIRAD-CA, Montpellier. pp.149-155. 14 - EBONG, 0.0., and N. NWUDE. 1981. Toxicity of methanol extract of Lasiosiphon kraussianus root. Planta medica., 41, 267-273. REVENDICATIONS 1) Composition pesticide, plus particulièrement insecticide, comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes. 2) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un extrait de plante contenant le(s)dit(s) composés dans laquelle - les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques; - les groupements R11 et R12 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7); - les groupements R6 et R7 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R7 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2); - le groupement Rg est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =0 ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - les groupements R1o, R13 et R14 sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement Rîs est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =0 ou un dérivé de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement Rs représente un atome d'hydrogène ou une liaison entre les carbones (10) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane; - le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées. 3) Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un composé de formule (I) ou un extrait de plante contenant le(s)dit(s) composés de formule (I) dans laquelle - les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques; - les groupements R11 et R12 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7); - les groupements R6 et R7 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2); - le groupement Rg est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule =0 ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - les groupements R10, R13 et R14 representent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment; - le groupement R15 est un atome d'hydrogène; - le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées; - le groupement R8 représente un atome d'hydrogène; - le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées. 4) Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un des composés choisis parmi l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D, ou un extrait de plante les contenant. 5) Composition selon l'une quelconque des revendications des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance active est un extrait de Lasiosiphon kraussianus. 6) Composition selon l'une quelconque des revendications des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs véhicules habituels des pesticides. 7) Utilisation des diterpènes de la famille des daphnanes ou d'un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes et des composés de formule (I) définis aux revendications 2 ou 3, comme pesticide, plus particulièrement comme insecticide, dans la protection des cultures ou pour le traitement des lieux de stockage des produits desdites cultures ou des locaux domestiques ou publics. 8) Wikstrotoxine D substantiellement pure obtenue à partir de racines de Lasiosiphon kraussianus.