Brevet FR2748481A1 — publié le 19971114

Protéine utilisable comme marqueur d'imbibition d'une semence au cours de la germination La présente invention concerne un procédé d'obtention et une nouvelle protéine induite au cours de l'imbibition de semences matures de plantes appartenant à des espèces des familles de chénopodiacées, composées, labiées et cucurbitacées et son utilisation comme marqueur moléculaire de la phase d'imbibition impliquée dans la germination de ces semences et dans les procédés d'osmo- et d'hydro-conditionnement dits de pré-germination de ces semences. La germination est un processus de développement complexe pour lequel on ne dispose à l'heure actuelle que de peu de données moléculaires précises. Ce programme de dveloppemcnt, au cours duquel les cellules de l'embryon passent d'un état de repos à un état d'activité métabolique intense, est mis en place essentiellement au cours de la phase d'imbibition. II se termine, au sens physiologique, par la percée d'un organe de la plantule naissante au travers les enveloppes de la graine (Bewley & Black, 1983). Les principales techniques utilisées pour définir la compétence des semences à germer mettent en oeuvre les tests de germination classiques, c'est-à-dire que l'on mesure, pour un lot de semences donné et dans des conditions codifiées (température, humidité, lumière, substrat), le pourcentage de germination à des temps différents après le semis. Le critère généralement utilisé pour quantifier la germination est la percée de l'enveloppe des graines par un organe de la plante naissante. La plupart des marqueurs biochimiques décrits à ce jour sont corrélés avec cette phase. ll ne s'agit donc pas de marqueurs sensu stricto de la germination, mais plutôt des phases initiales de la croissance (Fincher, 1989). I1 faut noter que la phase initiale d'imbibition (c'est à dire de prise d'eau) est réversible jusqu'à un certain point. Suite à une hydratation contrôle des graines, on peut les sécher, tout en conservant leur intégrité biologique et leur capacité germinative. Dès que la plantule apparaît, l'engagement de celle-ci dans sa croissance devient irréversible. En effet, une déshydratation à ce stade entraîne irrémédiablement la mort des plantules (Bewley & Black, 1983). Les procédés de pré-germination ("priming") développés par les sociétés de semences sont basés sur la réversibilité de la phase initiale d'imbibition. Les semences sont en général hydratées de manière contrôlée, puis elles sont séchées (Coolbear et al., 1987; Karsen et al., 1989 ; Tarquis & Bradford, 1992). Ces procédés apportent une réelle valeur ajoutée aux semences car ils permettent: 1) d'homogénéiser les lots de semences par rapport à la germination, 2) un gain de temps appréciable pour la levée après le semis, car un certain nombre de processus biochimiques nécessaires à l'accomplissement de la germination seraient déjà réalisés au cours du traitement, 3) une amélioration de la qualité germinative de lots de semences âgées, probablement en raison du fait que des mécanismes de réparation de structures biologiques endommagées au cours de la maturation finale des semences, voire au cours de la conservation, se mettent en place au cours du traitement. A l'heure actuelle, l'optimisation de tels procédés repose uniquement sur la conduite de tests de germination, qui demandent plusieurs jours d'expérimentation. De plus, si le traitement échoue (les lots de semences étant par nature hétérogènes, il faut donc optimiser le traitement pour chacun des lots), le lot est perdu. La possibilité de suivre en continu la phase d'imbibition, par l'intermédiaire d'un marqueur moléculaire facile à détecter, constituerait donc un progrès considérable, permettant d'adapter le traitement de prégermination à chaque lot de semences. La présente invention a pour objet une protéine d'origine végétale, induite au cours de l'imbibition des semences, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de culture végétale, qu'elle comprend au moins une unité de 18 à 25 kDa, est exprimée chez les semences et dans aucun autre organe de la plante, et apparaît intensément au cours des phases précoces de la germination (imbibition) et au cours de procédés de pré-germination mettant en oeuvre une prise d'eau contrôlée par les semences. La présente invention a plus particulièrement pour objet une protéine pure, issue de semences imbibées de chénopodiacées, par exemple la betterave, l'épinard et le chénopode blanc, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. Dans la cas de la betterave, la protéine est dénommée SIP. L'invention concerne également de nouveaux anticorps, dénommés anti-SIP, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la protéine SIP de betterave et les protéines équivalentes à cette dernière chez les semences des différentes familles susnommées. Elle concerne également l'utilisation de la spécificité d'expression tissulaire et du patron de développement de ces marqueurs afin de mesurer le plus précisément possible l'état d'avancement de l'imbibition des semences, soit au cours de la germination, soit au cours de procédés de pré-germination des semences, en particulier leur utilisation comme marqueur moléculaire de l'imbibition des semences de chénopodiacées, par exemple la betterave et l'épinard, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. La détection de ces marqueurs est réalisée avec les anticorps spécifiques anti-SIP. Cette détection peut être faite à l'aide d'un dispositif (kit), qui fait aussi partie de l'invention. Caracténsanon d'une protéine induite par imbibition des semences au cours de procédés de pré-germination: On utilise la semence de betterave sucrière (Beta vulgaris, variété Univers) et deux techniques connues de pré-germination comme modèle d'études. Les semences utilisées n'ont subi aucun traitement préalable, leur taux d'hydratation moyen est de l'ordre de 12%. Les techniques de pré-germination utilisées sont d'une part l'hydro-conditionnement des semences 9 basse température et en présence d'eau pure (Coolbear et al., 1987) et d'autre part l'osmo-conditionnement des semences en présence d'un osmoticum inerte, le polyéthylène glycol (PEG) 6000 (Tarquis & Bradford, 1992). 1)Technigue de D-eermination par os par hvdro-conditlonnement à basse température. Cette technique a été décrite dans le cas des semences de tomate (Coolbear et al., 1987). Son principe consiste à imbiber les semences dans des conditions définies, à une température suffisamment basse pour éviter que les semences ne germent. Après traitement, les semences sont séchées, ce qui permet leur conservation. Cette méthode est adaptée ici au cas des semences de betterave. Les expériences de germination et de pré-germination sont conduites de la manière suivante. Chaque expérience porte sur un lot de cent semences de betterave qui sont placées dans des boîtes de Pétri (12 x 12 cm) sur 3 épaisseurs de papier filtre, imbibées avec 6 ml d'eau distillée. On recouvre les semences d'une feuille de papier filtre qui, faisant office de mèche, permet l'imbibition des semences sur toute leur surface, puis on ferme les boîtes avec leur couvercle de façon à minimiser l'évaporation de l'eau. Les boîtes sont ensuite placées dans des armoires à température contrôlée, à l'obscurité. Les courbes de germination obtenues à chaque température, représentées par l'évolution du taux cumulé de germination (exprimé en % du nombre total de semences analysées) en fonction du temps de germination, sont caractérisées par trois phases. Premièrement, une phase de latence, pendant laquelle aucune germination n'a lieu et pendant laquelle la semence s'hydrate. La durée de cette phase de latence est d'autant plus longue que la température d'incubation est basse. Elle est par exemple de 32 h à 250C, de 44 h à 20"C, de 65 h à 15"C, de 120 h à 10 C et de 320 h à 5 C. Deuxièmement, une phase d'augmentation du taux de germination, dont la vitesse augmente avec la température d'incubation dans la plage étudiée qui va de 50C à 25"C. Cette vitesse caractérise également l'homogénéité du lot de semences analysé. Plus les semences ont une capacité germinative homogène, plus cette vitesse est grande, et inversement. Troisièmement, I'atteinte d'un plateau caractérisant la valeur maximum de germination du lot de semences considéré. Lorsque les semences de betterave incubées 1 1 jours à 5"C dans les conditions décrites ci-dessus, et dont aucune n'a germé, sont prélevées, séchées à 20"C jusqu'à les amener à un taux d'hydratation de 10%, ces semences germent beaucoup plus vite que les semences témoins n'ayant subi aucun traitement préalable. Par exemple, pour les semences traitées à 5"C pendant 11 jours, le temps de latence de la courbe de germination à 150C n'est que de 25 h, en comparaison d'un temps de latence de 65 h pour les semences témoins. Ce procédé, tel que décrit par Coolbear et al. (1987) pour la tomate, permet donc la pré-germination (priming) efficace des semences de betterave. Dans le cas de la betterave, l'utilisation de basses températures (5"C par exemple) est bénéfique car si, à 20 et 25"C, I'hydro-conditionnement est plus rapide, il est aussi plus difficilement maîtrisable, les semences germant aisément aux températures élevées. A 50C en revanche, on bloque toute percée radiculaire pendant des temps importants s'étalant sur plusieurs jours, tout en permettant l'hydratation contrôlée des semences. ll y a donc, à basse température, un bon découplage dans le temps entre les processus d'imbibition et de germination. Un tel découplage et le blocage intense de la percée radiculaire à 50C permettent de plus une meilleure maîtrise de la déshydratation ultérieure des semences primées, sans risque de détérioration du lot de semences 0'hydratation est en effet réversible jusqu'au moment où les semences germent). Cette étape de séchage autorise ainsi la conservation des semences traitées pendant plusieurs mois. Parallèlement à ces études de germination, on prélève à des temps différents de l'incubation à température contrôlée une partie des semences pour effectuer des analyses biochimiques. Pour cela, on réalise des extraits bruts de protéines totales et solubles de la manière suivante: broyage des graines dans un mixer type Waring blender pendant 60 sec et en présence d'azote liquide, reprise de la poudre dans un tampon d'homogénéisation (Hepes pH 8,0) contenant divers inhibiteurs de protéases (benzamidine-HCl, phenylmethylsulfonyl fluoride, acide e-amino caproique), centrifugation (30 min à 20 000 g en tubes de centrifugation type Eppendorf) pour éliminer les débris cellulaires, réalisation d'essais reposant sur les techniques classiques de séparation des protéines de l'extrait en gel de polyacrylamide en présence de SDS. Cette dernière technique a été optimisée pour permettre l'utilisation de matériels de microanalyse électrophorétique de protéines en gels de polyacrylamide préformés (PhastSystem et PhastTransfer de Pharmacia), qui présentent l'avantage de conduire l'analyse des échantillons de manière très rapide (électrophorèse et coloration des protéines du gel avec le bleu de Coomassie sont réalisés en moins d'une heure ; 16 échantillons sont analysés en une seule fois) et avec peu de matériel (1 pl d'échantillon protéique déposé par piste de gel). Cet appareillage effectue également le transfert électrophorétique des protéines du gel sur feuille de nitrocellulose selon la technique de Towbin et al. (1979), ce qui permet par la suite une révélation de certaines des protéines de l'extrait analysé avec des anticorps spécifiques (méthode de "Western blot"). Utilisant ces méthodes, nous avons observé l'induction massive d'une protéine de masse moléculaire (22 i: 3) kDa au cours de l'hydro-conditionnement des semences de betterave à 50C. Nous dénommons cette protéine SIP (pour Seed Imbibition Protein). Elle est présente à un niveau basal dans les semences témoin non traitées et devient très abondante chez les semences traitées (5 à 7 fois le niveau basal des témoins), représentant environ de 5 à 10% des protéines solubles des semences pré-germées. La protéine SIP a été purifiée à l'état d'homogénéité à partir d'un extrait protéique (réalisé comme décrit ci-dessus) de semences de betterave pré-germées grâce au procédé d'hydro-conditionnement à 50C (réalisé comme décrit ci-dessus). Les protéines de l'extrait sont sépares électrophorétiquement dans un gel préparatif de polyacrylamide à 20% en présence de SDS. Après électrophorèse, la protéine SIP, repérée selon sa masse et sa migration, est électroéluée du gel selon la technique de Teissère et al. (1990). La solution subit alors un passage par centrifugation (6000 g) sur Filtron Green, ce qui permet la concentration de l'échantillon et l'élimination de la majeure partie du SDS. Cet échantillon a été utilisé pour immuniser un lapin (3 injections successives de 100 pg de SIP en présence de l'adjuvant complet de Freund, la première au temps zéro, les deux suivantes 3 semaines et 7 semaines après la première). Les anticorps ainsi obtenus (anti SIP), qui font également partie de l'invention, permettent, à une dilution de 1/6000, la détection d'environ 5 ng de protéine SIP selon les techniques classiques ELISA en plaques de micro-titration, 2) Technique de pré-germination par osmo-conditionnement. Cette technique de prégermination a été décrite par de nombreux auteurs, par exemple par Tarquis & Bradford (1992) dans le cas des semences de laitue. Son principe consiste à incuber les semences en présence d'un osmoticum inerte, le PEG, de façon à inhiber la germination, c'est-à-dire la percée radiculaire, tout en permettant l'hydratation des semences. Puis, les semences ainsi traitées sont séchées, ce qui permet leur conservation. Dans le cas de l'osmo- conditionnement des semences de betterave, on utilise la même technique que pour l'hydroconditionnement, à la différence près que les semences (cent semences par boîte de 12 x 12 cm) sont incubées à 290C en présence de 6 ml d'eau distillée contenant du polyéthylène glycol (PEG 6000). L'ajustement de la concentration de PEG 6000 permet d'obtenir des potentiels osmotiques variables (Michel & Kaufmann, 1973). L'abaissement du potentiel osmotique entraîne un ralentissement progressif de la vitesse de germination. Ainsi, à -7,5, 10, -15 et -20 bars, il n'y a pas de percées radiculaires observables pendant au moins 200 h à 20"C. Les semences témoins incubées en absence de PEG 6000 germent après une phase de latence de 50 h. Lorsque les semences de betterave incubées 8 jours à 20 C et à -7,5 bars dans les conditions décrites ci-dessus, et dont aucune n'a germé, sont prélevées, lavées brièvement pour éliminer la solution de PEG 6000, séchées à 20"C jusqu'à les amener au taux d'hydratation de 10%, ces semences germent beaucoup plus vite que les semences témoins n'ayant subi aucun traitement préalable. Par exemple, pour les semences traitées à 20"C et -7,5 bars pendant 8 jours, le temps de latence de la courbe de germination à 200C est inférieur à 8 h, en comparaison d'un temps de 50 h pour les semences témoins. Ce procédé dc traitement, décrit par exemple par Tarquis & Bradford (1992) pour la prégermination des semences de laitue, permet donc également la pré-germination (priming) efficace des semences de betterave. Utilisant ces méthodes, nous avons observé l'induction massive de la protéine SIP au cours du procédé d'osmo-conditionnement (8 jours d'imbibition à 200C en présence de PEG 6000 donnant des potentiels osmotiques de -7,5 bars, -10 bars et -15 bars). Corrélation entre taux d'induction de la protéine SIP et intensité du gnmmg des semences L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que la protéine SIP est fortement induite (d'un facteur 5 à 7) pendant l'osmo-conditionnement des semences en présence de PEG 6000. lu en est de même lors du procédé d'hydro-conditionnement des semences en présence d'eau seule à 50C. Dans ce dernier cas, la protéine apparaît après 6,5 jours d'incubation dans ces conditions, le niveau maximum (environ 6 à 7 fois le niveau basal des semences non traitées) étant atteint après 11 jours d'incubation. On caractérise l'intensité du traitement de pré-germination des semences comme suit. On prélève des échantillons de semences au cours du traitement d'hydro-conditionnement à 50C, on les sèche, puis on les remet à germer à 15"C. On mesure alors, pour chacun des échantillons, le taux de germination obtenu à la température de 15"C pour un temps fixe de 63 heures. Ces mesures indiquent que plus le temps d'incubation à 5"C est long, plus le taux de germination à 63 heures et 150C des semences traitées est élevé, c'est-à-dire que l'intensité du priming augmente avec la durée de l'hydro-conditionnement à 50C. L'utilisation des anticorps anti-SIP montre l'existence d'une corrélation positive entre le taux de SIP synthétisée pendant le traitement des semences et l'intensité du traitement de pré-germination. Ces résultats démontrent de plus la possibilité de suivre en continu l'avancement d'un procédé de pré-germination grâce à l'utilisation des anticorps ariti-SIP et d'une technique classique ELISA. Dans le cas de la betterave sucrière modèle (variété Univérs), une augmentation d'un facteur 6 à 7 du contenu des semences traitées en protéine SIP (par rapport au niveau basal des semences témoins) correspond aux conditions optimales de pré-germination de ces semences. Lorsque ce niveau de SIP est atteint, on doit arrêter le traitement, car si on le prolonge on risque de faire germer une partie des semences, et ces semences traitées trop intensément seront perdues lors de la déshydratation ultérieure nécessaire à la conservation des semences traitées, entraînant donc une perte de qualité du lot de semences traité (la déshydratation n'est pas réversible après la percée radiculaire). La cinétique d'apparition et la quantification du taux de SIP au cours de la mise en oeuvre d'un quelconque procédé de pré-germination des semences font également partie de l'invention. Caractnsatlon de protéines de semences induites au cours de la phase d'imbibition de la eermination Les résultats précédents démontrent l'induction massive de la protéine SIP au cours des procédés de pré-germination des semences de betterave. La question est de savoir si l'induction de cette protéine accompagne normalement la germination, ou si elle s'établit spécifiqutmcnt en réponse aux procédés de pré-germination mis en oeuvre. Pour répondre à cette question, on réalise des expériences de germination à température optimale de germination des semences de betterave. Dans les conditions de germination définies (cent semences par boîte de Pétri 12 x 12 cm, 6 ml d'eau par boîte) une telle germination optimale est obtenue dans la plage de 200C à 25"C. Dans ces conditions, on mesure d'une part le taux de germination cumulé des lots de semences de betterave à divers temps d'incubation dans l'armoire thermostatée, et d'autre part on prélève à des temps différents une partie des semences pour quantifier le taux de SIP, en réalisant des extraits bruts de protéines totales et solubles comme décrit cidessus, et en utilisant les anticorps anti-SIP. La protéine est présente à un niveau basal dans les semences matures et sèches, puis elle est fortement induite au cours de la germination, à une vitesse bien plus rapide que n'apparaissent les radicules. Ainsi, pour les semences mises à germer à 20"C, le taux de SIP est environ multiplié par trois, alors qu'aucune semence n'a encore germé. Puis, la quantité de protéine SIP augmente progressivement jusqu'à sa valeur maximum (5 à 7 fois le niveau basal), atteignant sa valeur maximum après 96 h à 20"C, alors que le pourcentage cumulé de germination augmente aussi. Enfin, la protéine SIP disparaît graduellement après 96 h de germination à cette température, et que la croissance de la plantule s'installe. En conclusion, la protéine SIP est normalement induite au cours de l'imbibition et de la germination des semences de betterave. Distribution tissulaire de la protéine L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que l'expression de la protéine SIP est spécifiques des semences. Elle n'est pas détectée dans les organes végétatifs de la plante tels que les feuilles et les racines. Présence de protéines équivalentes à la protéine SIP chez d autres espèces de semences On a recherché la présence éventuelle de protéines équivalentes à la protéine SIP chez diverses semences. Ayant observé que, dans le cas de la betterave sucrière (variété Univers), la protéine SIP est induite au cours des phases précoces de la germination à 20"C, on a fait germer divers lots de semences (100 semences par boîte de Pétri, 6 ml d'eau par boîte, T = 200C). Des échantillons sont prélevés lorsque les lots atteignent 50% de germination dans ces conditions. L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que la protéine est présente dans toutes les variétés de semences germées de betterave sucrière (Univers, Adonis, Alizé, Accord), et fourragère (Monoval Géant Rouge, Eckendorf) que nous avons analysées, et chez différentes chénopodiacées (épinard, chénopode blanc), papilionacées (lupin, haricot, pois, luzerne), composées (tournesol, chicorée, matricaire, laitue), labiées (lamier), cucurbitacées (courgette, cornichon), crucifères (colza, moutarde, radis, Arabidopsis thaliana) et solanacées (tomate). Pour l'épinard, la chicorée, la matricaire, le lamier et la courgette, le taux de protéines équivalentes à la protéine SIP augmente fortement au cours de la germination. Pour ces semences, les anticorps révèlent une ou plusieurs protéines (deux pour la chicorée, trois pour l'épinard et la courgette) dont la masse est voisine de 20 kDa (18 à 25 kDa). I1 pourrait donc s'agir d'isoformes de la protéine SIP (famille multigénique ou modifications post-traductionnelles). Pour les espèces appartenant à la famille des céréales (orge, maïs, blé, riz) et à la famille des ombellifères (carotte), la réactivité des anticorps anti-SIP est très faible. Conduite d'un procédé de pré-germmatlon à l'aide d'un kit de diagnosflc La présente invention concerne également un procédé pour conduire de manière optimale un traitement de pré-germination de semences qui, au cours du traitement, synthétisent une protéine reconnue par les anticorps anti-SIP de betterave, telles que les semences de la famille des chénopodiacées, par exemple la betterave, le chénopode blanc et l'épinard, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. Le kit de diagnostic proposé est constitué de ces anticorps spécifiques. I1 est complété par des anticorps secondaires antianticorps de lapin (les anti-SIP étant faits dans le lapin). Ces anticorps secondaires sont disponibles commercialement (par exemple Sigma pour les anticorps anti-anticorps de lapin faits dans la chèvre). Ils sont couplés à la peroxydase, permettant la quantification aisée de la protéine SIP (s'il s'agit de betterave) ou de son équivalent (s'il s'agit de semences autres que la betterave) dans des extraits protéiques conduisant à l'extraction de la totalité des protéines solubles tels que décrits pour la betterave. Cette quantification est réalisée grâce à une méthode ELISA classique, utilisant des plaques de micro-titration et la lecture spectrophotométrique du développement de la réaction peroxydasique en présence de substrats de la peroxydase [H202 et 2-2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Aldrich] à l'aide d'un lecteur de plaques de micro-titration (lecteur EL340 de Bio-Tek Instruments par exemple). Dans un premier temps, on réalise une expérience de germination à température optimale de germination des semences considérées (par exemple 20 à 25"C pour les semences de betterave sucrière de la variété Univers), et on mesure le taux cumulé de germination et l'induction de la synthèse de la protéine réagissant avec les anticorps anti SIP. Ceci permet de déterminer le taux maximum (TMax) de synthèse de la protéine reconnue par les anticorps anti-SIP. Cette valeur maximum, TMax, fixera la limite supérieure du taux de protéine reconnue par les anticorps anti-SIP, à ne pas dépasser lors de la mise en oeuvre d'un procédé de pré-germination. On réalise alors le traitement de prégermination, en suivant au cours du temps de ce traitement l'augmentation du taux de synthèse de la protéine reconnue par les anticorps anti-SIP. Lorsque TMaX est atteint, on doit arrêter le traitement, car si on le prolonge on risque de faire germer une partie des semences, et ces semences traitées trop intensément seront perdues lors de la déshydratation ultérieure, nécessaire à la conservation des semences traitées, entraînant donc une perte de qualité du lot de semences traité. L'invention a encore pour objet un procédé de contrôle de l'imbibition ou de la prise d'eau lors de la germination desesemences soit naturelle soit au cours de traitement de prégermination, caractérisé en ce qu'on utilise comme marqueur moléculaire une protéine SIP ou une protéine équivalente. Les exemples suivants illustrent l'isolement de la protéine SIP, le rôle de la protéine SIP et les protéines équivalentes et leur utilisation pour le contrôle de la l'imbibition lou de la prise d'eau lors de la germination des semences soit naturelle soit au cours d'untraitement de prégermination. EXEMPLE 1. Évolution des protéines totales et de la protéine SIP au cours de la prégermination des semences de betterave. Isolement de la protéine SIP (A) Traltement des semences de betterave par hvdroonditionnement à 50C Les expériences de pré-germination sont conduites selon le procédé d'hydroconditionnement. Les semences de betterave sont incubées pendant 11 jours à 50C en présence de 6 ml d'eau pour cent semences. Les protéines totales et solubles sont extraites par broyage dans un tampon Hepes (pH 8.0) contenant des inhibiteurs de protéases. Ces protéines sont analysées après électrophorèse en gel de polyacrylamide (20%) PhastSystem de Pharmacia en présence de SDS et coloration des protéines au bleu de Coomassie. La figure 1A, piste 1 montre le profil des protéines des semences traitées. La piste 2 est relative aux semences témoins non traitées. La piste 3 correspond à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la droite de la photographie. La flèche indique la migration de la protéine SIP. On peut constater sa forte induction au cours du procédé de pré-germination des semences. (B) Traitement des semences de betterave par osmo-conditionnement en présence de PEG 4aM1 Les expériences de pré-germination sont conduites selon le procédé d'osmoconditionnement Les semences de betterave (cent semences par lot) sont incubées pendant 8 jours à 200C en présence de 6 ml d'eau contenant du PEG 6000 EXEMPLE 2. révolution de la protéine SIP au cours de la germination des semences de betterave Les expériences de germination sont réalisées en boîtes de Pétri (12 x 12 cm), à l'obscurité (cent semences et 6 ml d'eau par boîte) et à la température de 20"C. On mesure d'une part révolution du taux cumulé de germination en fonction du temps et d'autre part, on prélève des échantillons pour réaliser des extraits bruts et quantifier le taux de protéine SIP comme indiqué. La figure 2A représente l'évolution en fonction du temps d'incubation à 200C du taux cumulé dc germination des semences (o), et d'induction de la protéine SIP (9), cette dernière étant révélée spécifiquement en conduisant des tests ELISA avec les anticorps anti-SIP. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum obtenu à 96 h de germination) et par rapport à une semence. On peut constater que la protéine SIP est présente à un niveau basal (de 10 à 15% du niveau maximum) dans les semences sèches et que son niveau d'expression est multiplié par un facteur 6 à 7 au cours de la germination. Une quantité importante de SIP est synthétisée avant que n'apparaissent les radicules. Enfin, lorsque le lot de semences atteint son pourcentage maximum de germination (entre 90 et 130 h), la protéine SIP disparaît lentement La figure 2B représente l'évolution du profil des protéines dans les extraits protéiques au cours de l'imbibition et de la germination à 20"C, après analyse des protéines en gel de polyacrylamide 20% contenant du SDS (PhastSystem de Pharmacia) et coloration des protéines au bleu de Coomassie. La figure 2B, pistes 2, 3, 4, 5 et 6 montre le profil des protéines des semences témoins, et des semences obtenues après 13 h, 24 h, 36 h et 48 h de germination, respectivement. La piste 1 correspond à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la gauche de la photographie. La flèche noire à droite indique la migration de la protéine SIP. On peut constater sa forte induction au cours de la germination à 20"C. EXEMPLE 3. Osmo-Qndlponnement des semences de betterave en présence de polvéthvlènc glycol (PEG et induction de la protéine SIP Les expériences de germination sont conduites à 200C et à l'obscurité comme décrit. La figure 3A représente l'évolution du taux cumulé de germination des semences témoins incubées en présence d'eau seule (9), des semences incubées en présence de PEG 6000 dans l'eau donnant des potentiels osmotiques de -3 bars (o) et de -7,5 bars (+). On peut constater le fort ralentissement de là percée radiculaire pour les échantillons incubés en présence de PEG 6000. Ce traitement d'osmo-conditionnement conduit d'une part à l'induction massive de la protéine SIP et d'autre part à la pré-germination des semences de betterave. La figure 3B représente l'évolution du contenu des semences en protéine SIP au cours de l'incubation pendant 200 h à 200C (aucune semence n'a germé, voir figure 3A) en présence de solutions de PEG 6000 donnant des potentiels osmotiques de -7,5 bars, -10 bars, - 15 bars et -20 bars. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum) et par rapport à une semence. On peut constater la forte induction de la protéine SIP au cours du traitement. Les semences incubées à -7,5 bars, 20"C et à l'obscurité pendant 200 h sont prélevées, lavées rapidement pour les débarrasser du PEG, puis séchées pour les ramener à un taux d'hydratation proche de celui des semences témoins non traitées (10% d'eau). Ces semences sont mises à germer à 20"C, en présence d'eau seule, comme décrit. La figure 3C représente l'évolution du taux de germination cumulé des semences ainsi traitées (O) et des semences témoins (9). On peut constater que les semences traitées présentent une forte avance à la germination, attestant de l'efficacité du priming par osmo-conditionnement. EXEMPLE 4. Hydroconditionnement des semences de betterave en présence d'eau à différentes terrpératures et induction de la protéine SIP Les expériences sont conduites à différentes températures et à l'obscurité comme indiqué. La figure 4A représente l'évolution du taux cumulé de germination des semences incubées à 200C (9), 100C (O) et 50C (+). On peut constater le fort ralentissement de la percée radiculaire lorsque la température de l'expérience de germination diminue. Ce traitement d'hydroconditionnement conduit d'une part à l'induction massive de la protéine SIP et d'autre part à la pré-germination des semences de betterave. La figure 4B représente la cinétique d'induction de la protéine SIP au cours de l'incubation à 50C (aucune semence n'a germé, voir figure 4A). Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum mesuré après il jours de traitement) et par rapport à une semence. On peut constater la forte induction de la protéine SIP au cours du traitement, en comparaison des semences témoins non traitées. Les semences incubées à 50C et à l'obscurité pendant 1 1 jours sont prélevées, puis séchées pour les ramener à un taux d'hydratation proche de celui des semences témoins non traitées (10%). Ces semences sont mises à germer à 15"C, en présence d'eau seule, comme décrit. La figure 4C représente l'évolution du taux de germination cumulé des semences ainsi traitées (O) et des semences témoins (9). On peut constater que les semences traitées présentent une forte avance à la germination, attestant de l'efficacité de cette méthode de pré-germination. On a également prélevé des échantillons de semences au cours de l'incubation à 50C. Tous ces échantillons ont été séchés pour les ramener au niveau d'hydratation des témoins non traités (10%), puis mis à germer en présence d'eau seule (6 ml pour cent semences) à 150C. La figure 4D montre l'évolution du taux de germination (exprimé en % des semences analysées) mesuré après 63 h d'incubation à 150C en fonction du taux de protéines SIP contenu dans les différents échantillons prélevés au cours de la première incubation à 5"C. On peut constater l'existence d'une corrélation positive entre intensité du priming et contenu en SIP. EXEMPLE 5. Dlstnbutlon tlssulalre de la protéine SIP au cours du cvcle des plantes de betterave Les semences de betterave matures (variété Univers) sont mises à germer (T = 200C) au temps zéro soit sur papier filtre en boîtes de Pétri (100 semences et 6 ml d'eau par boîte), soit sur terreau pour obtenir des plantes. Dans ce dernier cas, elles sont arrosées chaque jour avec de l'eau. Des extraits bruts de protéines totales et solubles sont préparés à partir de divers organes (graines sèches, graines germées après 96 h, cotylédons après 8 jours de germination, racines et feuilles après 48 jours de germination). Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum mesuré dans les graines germées après 96 h) et par rapport à un mg de protéines totales dans chacun des extraits. EXEMPLE 6. Présence de protéines équivalentes à la protéine SIP chez d'autres espèces de semences Différents lots de semences appartenant aux chénopodiacées (betterave, épinard), papilionacées (lupin, haricot, pois, luzerne), composées (tournesol, chicorée, matricaire, laitue), labiées (lamier), cucurbitacées (courgette, cornichon), crucifères (colza, moutarde, radis), céréales (orge, maïs, blé, riz), solanacées (tomate), ombellifères (carotte) sont mis à germer à 200C en boîtes de Pétri comme décrit pour la betterave. Lorsque chaque lot atteint un pourcentage de germination de 50%, les semences sont prélevées et on réalise des extraits bruts protéiques comme décrit pour la betterave. Ces extraites sont analysés grâce à une technique ELISA pour quantifier leur niveau de réactivité vis-à-vis des anticorps anti SIP de betterave. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux mesuré chez la betterave) et par rapport à un mg de protéines totales dans chaque extrait. La figure 6A montre l'existence de protéines reconnaissant les anticorps anti-SIP chez de nombreuses espèces, à l'exception des céréales. La figure 6B montre que, pour l'épinard la chicorée, le lamier et la courgette, le taux de protéines équivalentes à SIP augmente fortement au cours des phases précoces de la germination. EXEMPLE 7. Comparaison de la masse moléculaire de la protéine SIP chez la betterave aucridre et d'autres espèces de semences Différents lots de semences (betterave sucrière, épinard, chicorée, matricaire, lupin, lamier) sont mis à germer à 200C en boîtes de Pétri comme décrit pour la betterave. Lorsque chaque lot atteint un pourcentage de germination de 50%, les semences sont prélevées et on réalise des extraits bruts protéiques comme décrit pour la betterave. Ces extraits sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide 20% en présence de SDS (PhastSystem de Pharmacia) et coloration au bleu de Coomassie ou révélation avec les anticorps anti-SlP après électrotransfert des protéines du gel sur feuille de nitrocellulose selon Towbin et al. (1979). (A) La figure 7A montre l'analyse des semences de betterave et d'épinard après coloration au bleu de Coomassie. La piste 2 correspond aux semences de betterave témoins. La piste 3 correspond aux semences de betterave germées. La piste 4 correspond aux semences d'épinard témoins. La piste S correspond aux semences d'épinard germées. On peut constater que, comme pour la betterave, les semences d'épinard germées contiennent une protéine soluble majoritairc d'environ 22 kDa. La masse moléculaire de protéines étalons est indiquée en kDa (piste 1). (B) La figure 7B montre les mêmes échantillons que dans la figure 7A, après transfert électrophorétique des protéines sur feuille de nitrocellulose et réaction avec les anticorps anti-SIP. La numérotation des pistes est la même que dans la figure 7A. La révélation est effectuée avec les anticorps secondaires anti-anticorps de lapin couplés à la peroxydase (Sigma) et développement de la réaction peroxydasique. (C) La figure 7C montre l'analyse des semences germées de chicorée (piste 1), courgette (piste 2), épinard (piste 3), lupin (piste 4), lamier (piste 5), matricaire (piste 6) et betterave (piste 7) après électrophorèse, transfert des protéines sur feuille de nitrocellulose et réaction avec les anticorps anti-SIP. La révélation est effectuée avec les anticorps secondaires antianticorps de lapin couplés à la peroxydase (Sigma) et développement de la réaction peroxydasique. La masse moléculaire de protéines étalons est indiquée en kDa. Dans le cas de la chicorée, de la courgette, de l'épinard, les anticorps anti-SIP révèlent un petit groupe de protéines (doublet ou triplet), de masses moléculaires très voisines de celle de la protéine SIP de betterave. La synthèse de ces protéines est fortement induite au cours de la germination. L'ensemble de ces résultats suggère un rôle de la protéine SIP dans la prise d'eau contrôlée des semences au cours de la germination et au cours des traitements de priming (osmo-conditionnement et hydro-conditionnement). Notons que la protéine SIP représente la protéine soluble majoritaire des semences de betterave et d'épinard imbibées. Elle pourrait donc être impliquée dans la distribution des molécules d'eau (et/ou de solutés) au sein des différentes parties constitutives de la semence. Dans le cadre de cette hypothèse, il est intéressant de comparer les propriétés de la protéine SIP avec celles de protéines végétales récemment décrites par l'équipe de Chrispeels aux États-Unis [voir par exemple Chrispeels & Maurel (1994) pour une revue]. Ces chercheurs ont en effet mis en évidence l'existence chez les plantes (haricot, Arabidopsis thaliana) de protéines membranaires liées au tonoplaste, qu'ils ont dénommées aquaponnes ou protéines TIP fTonoplast lntrinsic Proteins'). C'est une famille multigénique et certaines de ces protéines sont exprimées spécifiquement dans les semences. On les trouve notamment dans le système membranaire entourant les vacuoles où se retrouvent stockées les protéines de réserve de la semence, et leur rôle serait de maintenir l'intégrité du tonoplaste au cours de la déshydratation des semences en fin de maturation, et au cours de leur hydratation pendant la germination (Johnson et al., 1991). Ces aquaporines possèdent des masses moléculaires de l'ordre de 27 kDa, très proches de la masse de la protéine SIP. Toutefois, plusieurs éléments indiquent que les deux types de protéines difRrent radicalement. a) La protéine SIP est facilement extractible en solvant aqueux, alors que les protéines TIP sont extrêmement hydrophobes et ne peuvent être extraites des tissus végétaux qu'en pence de détergents (Triton par exemple). b) Les protéines TIP spécifiques des semences sont abondantes dans les semences matures et disparaissent rapidement au cours de la gennination (Mader & Chrispeels, 1984; Johnson et al., 1989). En revanche, la protéine SIP est à un niveau basal dans les semences matures et est induite de manière considérable au cours des phases précoces de la germination. En conclusion, la protéine SIP définit une nouvelle classe de protéines spécifiques des semences. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bewley, J. D. & Black, M. (1983) in Physiology and Biochemistry of Seeds in Relation to Germination, Vol. 1, pp. 177-244, Springer-Verlag, Berlin Chrispeels, M. J. & Maurel, C. (1994) Plant Physiol. 105, 9-13 Coolbear, P., Newell, A. J. & Bryant, J. A. (1987) Ann. Appl. Biol. 110, 185-194 Fincher, G. B. (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 305-346 lohnson, K D., Hennan, E. M. & Chrispeels, M. J. (1989) Plant Physiol. 91, 1006 1013 Karsen, C. M., Haigh, A., van der Toorn, P. & Weges, R. (1989) in Recent Advances in the Development and Germination of Seeds (Taylorson, R. B., ed.) NATO ASI serins, Series A, Life sciences, vol. 187, pp. 269-280 Mader, M. & Chrispeels, M. J. (1984) Planta 160, 330-340 Michel, B. E. & Kaufmann, M. R. (1973) Plant Physiol. 51, 914-916 Tarquis, A. M. & Bradford, K. J. (1992) J. Exp. Bot. 43, 307-317 Teissère, M., Sergi, I., Job C. & ! Job, D. (1990) Eur. J. Biochem. 193, 913-919 Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,43504354. L'invention a encore pour objet des sondes moléculaires, protéiques ou nucléiques, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de la protéine (séquence d'amino-acides de la protéine, séquence en bases de l'ADN complémentaire codant pour la protéine) ci-dessus. La pressente invention a encore pour objet un procédé d'obtention de plantes transformées, caractérisé en ce qu'on insère dans le génome de plantes qui n'exprimeraient pas naturellement la protéine SIP (ou une protéine équivalente), , ou qui exprimeraient cette protéine mais à un niveau faible, une ou plusieurs copies du gène codant pour la protéine SIP selon l'invention, afin d'exprimer ou de surexprimer cette protéine chez les semences de plantes transformées au moment de la germination et d'augmenter la capacité germinative de ces semences. REVENDICATIONS 1. Protéine pure d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est issue de semences d'une espèce végétale, qu'elle comprend au moins une unité de 18 à 25 kDa, est exprimée spécffiquement dans les semences, et apparaît rapidement au cours des phases précoces de la germination. 2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que la germination est effectuée au cours d'un procédé de pré-germination. 3. Protéine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de chénopodiacées. 4. Protéine selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est issue de la betterave de l'épinard ou du chénopode blanc. 5. Protéine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de composées. 6. Protéine selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est issue de la chicorée ou de la matricaire. 7. Protéine l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de labiées. 8. Protéine selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est issue du lamie 9. Protéine selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de cucurbitacées. 10. Protéine selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est issue de la courgette. 11. Protéine selon les revendication 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est de plus reconnue spécifiquement par les anticorps dirigés contre la protéine SIP de betterave. 12. Protéines équivalentes à la protéine SIP de betterave selon les revendications 1 et 11, et issues de différentes semences selon les revendications 2 à 10. 13. Anticorps, dénommés anti-SIP, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la protéine selon l'une des revendications 1 à 11. 14. Sondes moléculaires, protéiques ou nucléiques, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de la protéine (séquence d'amino-acides de la protéine, séquence en bases de l'ADN complémentaire codant pour la protéine) et des anticorps anti-SIP (tout anticorps polyclonal ou monoclonal reconnaissant spécifiquement au moins un épitope porté par la protéine de betterave, selon l'une des revendications 1 à 12. 15. Utilisation de protéines susceptibles d'être induites au cours de tout processus d'imbibition de semences, en particulier au cours de la germination et au cours de procédés de pré-germination, selon les revendications 1 à 12, ou de sondes moléculaires selon la revendication 14, comme marqueur du stade d'imbibition des semences. 16. Dispositif (kit) pour la détermination du stade d'imbibition des semences, en particulier au cours des procédés de pré-germination (priming), caractérisé en ce qu'il est basé sur la reconnaissance par des anticorps selon la revendication 13 utilisables dans une technique ELISA. 17. Procédé d'obtention de plantes transformées, caractérisé en ce qu'on insère dans le génome de plantes qui n'exprimeraient pas naturellement la protéine SIP (ou une protéine équivalente) , ou qui exprimeraient cette protéine mais à un niveau faible, une ou plusieurs copies du gène codant pour la protéine SIP selon les revendications 1 et 10, afin d'exprimer ou de surexprimer cette protéine chez les semences de plantes transformées au moment de la germination et d'augmenter la capacité germinative de ces semences.