Brevet FR2750704A1 — publié le 19980109

PROCEDE DE PRODUCTION D'ADN THERAPEUTIOUE La présente invention concerne la préparation d'ADN, notamment plasmidique. Elle concerne plus particulierement la production d'ADN plasmidique bactérien qui soit utilisable en thérapie génique, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relaché ou linéaire, et dont les propriétés immunogènes sont réduites voire supprimées. L'invention concerne également des microorganismes utilisables pour la production d'ADN, ainsi que des compositions pharmaceutiques. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie en introduisant une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe et ensuite réinjectée dans l'organisme, soit in vivo, directement dans le tissu visé. S'agissant d'une molécule de haut poids moléculaire et de charge négative, 1'ADN a des difficultés pour traverser spontanément les membranes cellulaires phospholipidiques. Différents vecteurs sont donc utilisés afin de permettre le transfert de gène : les vecteurs viraux d'une part, les vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques, d'autre part. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno-associés,...) sont très efficaces, notamment pour le passage des membranes, mais présentent un certain nombre de risques tels que la pathogénicité, la recombinaison, la réplication, l'immunogénicité, ... Les vecteurs chimiques et/ou biochimiques permettent d'éviter ces risques (pour revues, voir Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Ce sont par exemple des cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. I1 peut également s'agir de liposomes dans lesquels 1'ADN est incorporé et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou des polymères cationiques qui complexent 1'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celleì. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS, TransfectamTM) ou le chlorure de N-[1 (2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA, LipofectinTM). Des protéines chimères ont aussi été développées : elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Il est ainsi théoriquement possible de "cibler" un tissu ou certaines populations cellulaires, afin d'améliorer la biodisponibilité ln vivo du gène transféré. Les plasmides utilisés actuellement en thérapie génique portent generalement (i) une origine de réplication, (ii) un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampicilline...) et (iii) un ou plusieurs transgènes avec des séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...). Ce type de plasmides est par exemple utilisé actuellement en thérapie génique au niveau d'essais cliniques tels que le traitement de mélanomes, Nabel etal., 1992, ou au niveau d'études expérimentales. L'utilisation d'ADN plasmidique en therapie genique pose toutefois un certain nombre de problemes. En particulier, cela implique la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans ces techniques de thérapie génique, le médicament est constitué par l'ADN meme et il est essentiel de pouvoir fabriquer, dans des quantités adaptées, des ADN ayant des propriétés appropriées à un usage thérapeutique chez l'homme. A cet egard, differentes methodes de production et/ou purification ont ete decrites dans l'art anterieur, permettant d'ameliorer la qualite de l'ADN plasmidique (PCTFR95/01468; FR96 03519). Par ailleurs, l'utilisation d'ADN porteur de genes de resistance a des antibiotiques ou d'origines de replication fonctionnelles peut egalement présenter certains inconvénients, liés notamment à leur dissémination dans l'organisme. Differentes approches ont egalement ete developpees pour limiter ces inconvenients (PCT/E;R96/00274, FR95 10825). Un autre inconvenient des ADN plasmidiques utilises jusqu'a present reside dans leur origine. Il s'agit en effet de molecules produites essentiellement dans des organismes procaryotes (bacteries) ou eucaryotes inferieurs (levures), qui possedent potentiellement des motifs immunogenes chez l'homme. Les propriétés immunologiques de l'ADN sont encore assez peu connues. L'ADN bactérien chez la souris conduit i) à la synthèse d'anticorps reconnaissant l'ADN bactérien double brin et simple brin ayant permis l'immunisation mais ne réagissant pas avec l'ADN double brin mammifère, ii) à la stimulation de la production de macrophages et cytokines (D. Pisetsky "the Immunologic Properties od DNA" J. Immunol. 156 (1996) 1). La macromolécule ADN est anisi dite immunogène. Par ailleurs, une macromolécule peut aussi conduire à une stimulation du système immunitaire sans être immunogène (par exemple corps étranger conduisant à une réponse immunitaire à médiation cellulaire). Les premières évidences suggérant que l'ADN bactérien conduit à une réponse immunitaire ont été décrites par Pisetsky et coîl. (1991 J. Immunol. 147 p1759). Ils ont montré que l'ADN de trois espèces bactériennes peut stimuler la prolifération de lymphocytes de souris alors que l'ADN extrait de trois espèces animales ne conduit pas à cette stimulation. Puis, Yamamoto et coîl. (1992 Microbiol. Immunol. 36 p983) ont observé que l'ADN bactérien de six espèces conduit dans les cellules de rate de souris BALB/c à une augmentation de l'activité NK "natural killer" et à l'induction de la production d'interférons. Mais l1ADN extrait de dix espèces vertébrées ne conduit à aucune de ces réponses. En outre, Krieg et coîl. ont décrit en 1995 (Nature vol374 p546) qu'un fragment d'ADN genomique de E.coli induit in vitro la prolifération de cellules B murines et la secrétion d'immunoglobulines IgM, alors que ce même ADN bactérien, traite in vitro avec une CpG méthylase, n'induit pas une telle réponse. Krieg et coll. ont aussi indique qu'en présence d'ADN non méthylé, l'interféron g est produit, et agit comme facteur costimulant de la différentiation des cellules B en modulant la production d'IL-6 par les cellules B (Krieg et cool. 1996 J. Immunol. 156 p558). De plus un oligonucleotide possédant un motif CpG non méthylé et encadré en 5' par 2 purines et en 3' par 2 pyrimidines conduit in yivo à une secrétion coordonnée des interieukines IL-6 et IL12, et d'interférons g par les cellules NK(IFN-g), les cellules B (IL-6 et IL-12) et les lymphocytes T CD4+( IL-6 et IFN-g) (Krieg et coîl. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 p2879). L'ADN plasmidique utilisé jusqu'à ce jour en thérapie génique est essentiellement produit dans des cellules procaryotes, et presente donc un profil de methylation comparable a celui de l'ADN genomique bacterien. Il a en outre ete demontre que l'ADN plasmidique qui a été injecté dans le muscle ou dans le foie, puis extrait, conserve le profil de méthylation procaroyte (Wolf et coil. 1992 Hum. Mol. Genet.1 p363; Malone et coîl. 1995 J. Biol. Chem. 269 p29903). De ce fait, l'ADN plasmidique bacterien utilisé presente un potentiel de stimulation du système immunitaire important. Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'ADN plasmidique ayant des propriétés immunologiques réduites, voire supprimées. Il serait également particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'un procédé permettant de produire, à une Èchelle compatible avec une utilisation industrielle, des ADN plasmidiques de ce type. La présente invention apporte une solution à ces problèmes. La demanderesse s'est en effet intéressée aux propriétés immunogènes de l'ADN bactérien. La demanderesse a maintenant mis au point un procédé permettant de produire des ADN plasmidiques de qualité pharmaceutique, potentiellement dépourvus d'effets immunogènes indésirables. La demanderesse a également montré que la méthylation de certains résidus de d'ADN permettait de réduire le potentiel immunogène des ADN plasmidiques, sans affecter leur capacité de transfecter des cellules et d'y exprimer un acide nucléique d'intérêt. Un aspect de l'invention est de préparer des ADN, notamment plasmidiques, de qualité thérapeutique. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation en thérapie génique d'ADN plasmidique méthylé sur les cytosines des dinucléotides 5'-CG-3'. Un troisième aspect de l'invention est relatif à des compositions pharmaceutiques comprenant des ADN plasmidiques méthyles. L'invention concerne encore un procédé de méthylation in vivo d'ADN par expression d'une méthylase. L'invention dans d'autres aspects, est relative à des cassettes d'expression, des microorganismes hotes utilisables pour la méthylation, la préparation de compositions thérapeutiques, et des méthodes de transfert de gènes. Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de production d'ADN utilisable en thérapie génique caractérisé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule contenant une c;vtte d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'. La présente invention concerne donc la production d'ADN, notamment plasmidique, méthylé sur les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3'. La méthylation d'ADN plasmidique in vitro est documentée dans la littérature (Adams et coîl. 1992 FEBS Letters 309 p97 ; Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251 ; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Cependant, ce mode de méthylation n'est pas envisageable pour la production industrielle de plasmide qui serait utilisé en thérapie génique. Un procédé de production d'ADN plasmidique doit en effet permettre de produire de façon reproductible des quantités de plasmides importantes et homogènes et de purifier cet ADN par des méthodes acceptables pour un usage pharmaceutique. Il est bien clair qu'un ADN méthylé in vitro peut-être plus ou moins relâché de lot à lot (Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251) et que les quantités produites sont limitées. La présente invention montre maintenant qu'il est possible de méthyler un plasmide d'intérêt directement au cours de la production, en coexprimant dans la cellule hote le gène codant pour une méthylase. La présente invention montre également que, selon ce procédé, des quantités importantes et homogènes de plasmide méthylé peuvent être produites et l'ADN plasmidique méthylé peut être purifié selon des procédés déjà décrits. La demanderesse a egalement demontre, de maniere avantageuse, que l'ADN plasmidique ainsi méthylé conserve la capacite de transfecter des cellules cibles et, le cas échéant, de s'y repliquer. De manière particulièrement remarquable, la demanderesse a encore démontré que l'ADN plasmidique ainsi méthylé peut, in vivo, exprimer des acides nucléiques d'intérêt. De nombreuses études renforcent en effet l'idée que l'hyperméthylation est corrélée avec l'inhibition ou l'inactivation des promoteurs et que des promoteurs activement transcrits sont souvent hypo-ou non méthylés. Ainsi, s'agissant de promoteurs viraux, si le promoteur tardif E2A du génome de l'adénovirus de type 2 est entièrement méthylé sur les dinucléotides 5'-CG-3', dans les cellules transformées de hamster HE1, et non méthylé dans les cellules transformées de hamster HE2; le gène E2A est silencieux dans HE1 et transcrit dans HE2 (W. Doerfler 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 p209). Un autre exemple est décrit par Kohn et coîl. (1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 p2567) qui montrent que l'absence d'expression à partir du vecteur rétroviral LTR transduit dans des cellules souches hématopoiétiques est associée à la méthylation in vivo. L'inhibition de l'expression d'un gène rapporteur, sous le contrôle d'un promoteur viral, lorsque ce gène est introduit en transfection transitoire par un plasmide méthylé in vitro a egalement été démontrée (Adams et coîl. 1992 FEBS Letters 309 p97 ; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251 ; Komura et coîl. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Par ailleurs, Razin et coîl. (precitee) ont montré que le promoteur du gène codant pour la thymidine kinase de l'herpès simplex de type I et celui du gène codant pour la métallothionéine de souris sont inactifs lors d'expression transitoire dans les cellules de souris L et les cellules murines teratocarcinomes F9 si ces promoteurs sont méthylés sur les dinucléotides 5'-CG-3'. La présente invention décrit donc pour la première fois un procédé permettant la production d'ADN plasmidique méthyle, homogène et compatible avec une utilisation industrielle, et démontre la possibilité d'utiliser ce type de plasmide pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in vivo, notamment dans des applications de thérapie génique. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans différents types d'hotes cellulaires. Il s'agit notamment de toute cellule non-humaine, essentiellement dépourvue d'un système de méthylation des cytosines des dinucleotides 5'-CG-3'. L'absence de méthylation peut être le résultat de l'absence d'activité enzymatique appropriée, due soit à une expression insuffisante d'un gène correspondant, soit à l'absence dudit gène. Il s'agit préférentiellement de cellules procaryotes ou eucaryotes simples. Avantageusement, l'hote cellulaire est une bacterie. Parmi les bactéries, on peut citer plus préférentiellement E.coli, B. subtils, Streptomyces, Pseudomonas (P. putida, P. aeruginosa), Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus. Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium ou Clostridium. On peut aussi utiliser des entérobactéries telles que Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, bvinia carotovora ou Serratia marcescens. Preferentiellement, l'hote cellulaire utilisé est un organisme non pathogène et permet de produire des quantités d'ADN plasmidique importantes et homogènes. A titre d'exemple particulierement préfere, on utilise E. coli. Le procédé de l'invention permet la production d'ADN de qualitÈ thérapeutique. L'ADN peut être toute molécule d'ADN, simple-brin ou double-brin, linéaire ou circulaire, replicative ou non, intégrative ou non, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relaché ou linéaire. Dans la suite du texte, l'ADN sera également référencé ADN plasmidique ou plasmide TG (pour plasmide utilisable en thérapie génique). Les plasmides TG généralement utilisés en thérapie génique portent essentiellement (i) une origine de réplication, (ii) un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt (gène thérapeutique) avec des séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...), et éventuellement (iii) un gène marqueur. Le choix de l'origine de replication est principalement détenniné par l'hote cellulaire utilisé pour la production.. Il peut s'agir d'une origine de réplication issue d'un plasmide du groupe d'incompatibilité P (exemple = pRK290) qui permet la réplication dans les souches d'E. coli pol A. Plus généralement, il peut s'agir de toute origine de réplication issue d'un plasmide se répliquant dans les cellules procaryotes ou eucaryote inferieures. Ce plasmide peut être un dérivé de pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95), un dérivé de pUC (Viera et Messing, Gene 19 (1982) 259), ou d'autres plasmides dérivant du même groupe d'incompatibilité, c'est-à-dire de ColE1 ou de pMB1 par exemple. Ces plasmides peuvent être choisis par ailleurs dans d'autres groupes d'incompatibilité se répliquant chez Escherichia coli. Il peut s'agir de plasmides dérivés de plasmides appartenant aux groupes d'incompatibilité A, B, FI, fli, F111, FW, Hî, Hil, 11, I2,J, K, L,N, 0F, P, Q,T, U, W,X, Y, Zou9par exemple. D'autres plasmides peuvent encore être utilisés, parmi lesquels des plasmides ne se répliquant pas chez E. coli mais chez d'autres hôtes tels que L subtils, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium ou Clostridium. A titre préférentiel, on utilise les origines de réplication issues de plasmides se répliquant chez E. coli. Selon une variante particulière. l'origine de replication peut être une origine conditionnelle, c'est-à-dire dont l'activité dépend de la présence de facteurs en trans. L'utilisation de ce type d'origine de replication évite la replication de l'ADN plasmidique après administration, par exemple chez l'homme (FR95 10825). Parmi les gènes marqueur on peut citer un gène de résistance, notamment à un antibiotique (ampicilline, kamamycine, généticine, hygromycine, etc), ou tout gène conférant à la cellule une fonction qu'elle ne possède plus (par exemple un gène qui a été délété sur le chromosome ou rendu inactif), le gène sur le plasmide rétablissant cette fonction. Selon un mode de réalisation particulier, l'ADN plasmidique comporte des séquences permettant d'éliminer, après la phase de production, toutes les régions essentiellement non-thérapeutiques (Origine de replication, gène marqueur, etc). Une approche particulièrement avantageuse pour générer ce type de molécule (minicercles) a été décrite dans la demande PCT/FR96/00274. L'ADN plasmidique selon l'invention est préférentiellement une molécule d'ADN double-brin comportant un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt avec des séquences nécessaires à leur expression. Selon un mode préféré, il s'agit d'une molécule circulaire, replicative ou integrative. Avantageusement, l'ADN plasmidique contient essentiellement un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt avec des séquences nécessaires à leur expression (miniplasmide). L'acide nucléique d'intérêt peut être tout acide nucléique (ADNc, ADNg, ADN synthétique ou semi-synthétique, etc) dont la transcription et éventuellement la traduction dans une cellule génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire. Parmi les acides nucléiques ayant des proprietes thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAW, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides: Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (WO91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. L'acide nucléique d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Généralement, dans les plasmides, l'acide nucléique d'intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible (i.e. les mammiferes, en particulier l'homme), ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. I1 peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CF'TR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroides, récepteur de l'acide rétinoique, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par tailleurs, le gène d'intérêt peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. Selon l'acide nucleique d'intérêt, les ADN plasmidiques methyles de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc. Ils sont particulierement avantageux pour le traitement des pathologies dans lesquelles une expression durable sans reaction immunologique est souhaitee, notamment dans le domaine des maladies génétiques, neurodégénératives et cardiovasculaires. Comme indique ci-avant, le procede selon l'invention utilise une cellule hote contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'. Après synthèse de l'ADN, certaines purines et pyrimidines sont modifiées chimiquement, par exemple par methylation. Ainsi, la 5-méthylcytosine ou la N6méthyladénine entrent dans la composition de certaines ADN. Ces modifications ont lieu à l'aide d'ADN méthyltransférases, de maintien ou de nove, qui transfèrent un groupe méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine à des résidus adénine ou cytosine qui peuvent être situés à des positions spécifiques dans les séquences. Par exemple, chez E. coli deux ADN méthyltransfèrases sont bien connues, l'ADN méthyltransférase dam, qui méthyle les résidus adénosine au sein des séquences 5'-GATC-3', et l'ADN méthyltransférase dcm, qui méthyle le second résidu cytidine des séquences 5' CCA/TGG-3'. D'autres ADN méthylases ont été étudiées chez les bactéries, qui méthylent un résidu contenu dans un site de reconnaissance d'une enzyme de reseriction. Par exemple, l'enzyme M. vII méthyle le second résidu cytosine dans la séquence 5'-CCGG-3'. La plupart des eucaryotes simples et des invertébrés contiennent relativement peu de 5-méthylcytosine et de N6-méthyladénine. Cependant la méthylation de bases chez les vertébrés est plus importante et dans ce cas la 5-méthylcytosine est la plus fréquente des bases méthylées. En effet plus de 95 pour cent des groupes méthyle de l'ADN des vertébrés se trouve sur les résidus C des rares dinucléotides 5'-CG-3' (la fréquence de 0,8 fis de 5'-CG-3' sur les séquences mammifères est très faible bien que le pourcentage en GC soit en moyenne de 40% et qu'un arrangement non biaisé conduirait à une fréquence de 4% de 5'-CG-3'). Et, plus de 50 pour cent de l'ensemble des dinucléotides peuvent être méthylés. Différentes évidences suggèrent que le degré de méthylation de certaines séquences contenant le dinucléotide 5'-CG3' puisse être un facteur déterminant chez les mammifères dans la régulation de l'expression de gènes particuliers, l'inactivation du chromosome X, l'oncogénèse (1993 in DNA methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Eds Jost et Saluz), et encore des maladies héréditaires (Bates et coîl. 1994 BioEssays 16 p277). La presente invention utilise une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine sur les dinucléotides 5'-CG-3'. De ce fait, au sens de la presente invention, ADN methyle signifie plus particulierement ADN methyle sur les residus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3'. Avantageusement, l'ADN méthyltransférase utilisee methyle preferentiellement les residus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3', c'est-a-dire n'affecte quasiment pas les residus adenine, ni les residus cytosine qui sont presents dans un contexte different des dinucleotides 5'-CG-3'. Avantageusement, on entend par ADN plasmidique methyle un ADN plasmidique dont au moins 50 to des residus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3' sont methyles. Plus préférentiellement, au moins 80 to, avantageusement 90 to desdits résidus sont méthyles. La méthylation de l'ADN plasmidique peut être vérifiée de différentes manières. En particulier, elle peut être contrôlée en digérant les préparations plasmidiques par des enzymes de restriction dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coupure, est méthylé. On peut citer par exemple les enzymes de restrictions vII, AII, XBI. La methylation peut egalement etre determinee par chromatographie. Ainsi, la quantité de plasmide non méthylé presente dans la préparation de plasmide méthylé a ete quantifiée de la façon suivante: au plasmide non méthylé non digéré sont ajoutés 1 % ou 5 % de plasmide non méthylé et totalement digéré par vII. Ces échantillons, ainsi que le plasmide méthylé digéré par vII, sont analysés par chromatographie liquide échangeuse d'anions et détection à 260 nm, ce qui permet de séparer et quantifier l'AD Spiroplasma sp. MQ1. Son poids moléculaire est de 42 KD et le gène a été cloné et surexprimé chez E. çQli (Razin et coll. 1990 Nucl. Acids Res. 18 pi 145 et EP0412676A1 derwent 91045812). Preferentiellement, l'ADN méthyltransférase est choisie parmi la methylase M.SssI, la methylase de souris et la methylase humaine. Avantageusement, on utilise la methylase M. SssI. La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase comprend generalement un acide nucleique codant pour une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' sous le controle d'un promoteur. Le promoteur utilise a cet effet peut etre tout promoteur fonctionnel dans la cellule hote choisie. A cet egard, il peut s'agir d'un promoteur tel que defini ci-avant. S'agissant d'hotes cellulaires procaryotes, on peut citer plus particulierement les promoteur de l'operon lactose (Plac), de l'operon tryptophane (Ptrp), les promoteurs hybrides Plac/Ptryp, le promoteur PL ou PR du bactériophage lambda, le promoteur du gène tetA (in Vectors 1988 p179 Rodriguez et Denhardt editeurs), etc. Dans un mode de realisation prefere, on utilise un promoteur different de celui responsable de l'expression de lacide nucleique d'interet dans l'ADN plasmidique. Il est tout particulierement avantageux d'utiliser un promoteur inductible, permettant de controler l'expression de la methylase. Le promoteur inductible peut etre par exemple le promoteur du bacteriophage T7 ou le promoteur Plac. Avantageusement, la cassette d'expression contient egalement des signaux de fin de transcription (terminateurs transcriptionnels), tels que des terminateurs ribosomaux. La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase peut etre portee par un vecteur replicatif, ou etre integree dans le genome de la cellule hote. S'agissant d'un vecteur replicatif, on utilise avantageusement un vecteur compatible avec le plasmide TG, c'est a dire capable de co-resider dans la meme cellule. Deux plasmides différents peuvent se répliquer dans la même cellule si le controle de la réplication de chaque plasmide est différent. Ainsi des plasmides compatibles appartiennent à deux groupes d'incompatibilité. Or il existe environ 30 groupes d'incompatibilité de plasmides se répliquant chez les entérobactéries (Maas et coll. 1988 Microbiol. Rev. 52 p375). De ce fait, il existe de nombreuses possibilités pour répliquer deux plasmides dans la même cellule et plusieurs exemples sont décrits dans la littérature. On peut citer par exemple la coréplication des plasmides dérivés de ColE1 avec les plasmides ayant pour réplicon R6K ou p15A ou RSF1010 ou RK2 ; on peut encore citer la coréplication des plasmides dérivés de RK2 avec des plasmides dérivés de R6K ou RSF1010 ou pSa ou ColE1(in Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt editeurs). Cette liste n'est pas limitative et d'autres exemples sont encore décrits dans Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt éditeurs. Avantageusement, le vecteur replicatif utilise presente un nombre de copies différent dans la cellule hote que le plasmide TG. Ainsi, le vecteur portant le gène codant pour la méthylase, dont l'expression peut être inductible, est à faible nombre de copies (dérivé par exemple de pACYC184 ou RK2), alors que le plasmide TG est à haut nombre de copies (dérivé de ColE1). On peut aussi cloner dans le plasmide TG une séquence permettant de former avec un oligonucléotide approprié une séquence triple hélice de telle sorte que le plasmide TG peut être séparé de l'autre plasmide par une purification d'affinité. La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase peut egalement être intégrée dans le génome de la cellule hôte. L'integration peut etre realisee par recombinaison homologue, dans la mesure où la cassette d'expression est encadrée par des fragments adjacents d'un gène, non essentiel, du génome de l'hôte et clonée sur un plasmide ne pouvant se répliquer dans l'hôte considéré. Ce plasmide peut être i) un dérivé de ColE1 dans une souche de E. çQli ts (Gutterson et coll. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 p4894); ii) un dérivé thermosensible de pSC101 dans une souche quelconque de E. coli (S. Kushner et coîl. 1989 J. Bacteriol. 171 p4617); iii) un vecteur suicide tel que M13mplO dans les souches de E. çQli gde+ (Blum et coîl. 1989 J. Bacteriol. 171 p538) ou encore iv) un plasmide ne comportant que l'origine g de R6K dans toute souche de E. Li dépourvue du gène X (Filutowicz et coll. 1994 Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48 p239). La cassette d'expression peut etre introduite dans la cellule hote avant, apres ou en meme temps que l'ADN plasmidique. S'agissant d'une cassette integrative, elle est generalement introduite avant, et les cellules contenant ladite cassette sont selectionnees et utilisees pour la production de l'ADN plasmidique. Un aspect particulier de l'invention est d'exprimer le gene codant pour la methylase M. SssI dans des cellules bacteriennes (notamment E. coli) contenant un plasmide TG. Comme indique dans les exemples, ledit plasmide est alors methyle sur les cytosines des dinucleotides 5'-CG-3'. Plus spécifiquement, le plasmide TG est transformé dans une souche de E. coli n'crA mcrB D(mcrC-mrr) contenant déjà un plasmide portant le gène codant pour la méthylase M. = et compatible avec le plasmide TG. Au cours de la croissance de la bactérie les deux plasmides corésidant se répliquent et sont méthylés (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793). L'ADN plasmidique ou la cassette d'expression peuvent etre introduits dans la cellule hote par toute technique connue de l'homme du metier (transformation, transfection, conjugaison, electroporation, pulsing, precipitation, etc). La transformation peut notamment être effectuée par la technique de transformation au CaCl2 (Dagert et Ehrlich, Gene 6 (1979) 23), ou celle mise au point par Hanahan et al. (J.Mol.Biol. 166 (1983) 557) ou toute technique dérivée de celle-ci (Maniatis et al., 1989), ainsi que par électrotransformation (Wirth et al., Mol.Gen.Genet. 216 (1989) 175) ou par TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coîl. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580). Voir également les techniques générales de Biologie Moléculaire ci-après. L'ADN plasmidique methyle selon l'invention peut ensuite etre purifie par toute technique connue de l'homme du metier (precipitations, chromatographies, centrifugations, dialyse, etc). Dans le cas particulier de l'utilisation d'un vecteur d'expression de la methyltransferase replicatif, le plasmide TG doit en outre etre separe dudit vecteur. Differentes techniques peuvent etre utilisees, basees sur les differences de taille ou de masse des deux plasmides, ou sur la digestion du vecteur au niveau de sites de restriction presents uniquement dans le vecteur et pas dans le plasmide TG. Une methode de purification particulierement avantageuse repose sur la l'affinite entre une sequence specifique presente sur le plasmide TG et un oligonucleotide immobilise. Cette purification triple-helice a ete decrite en detail dans les demandes FR96 03519 et FR94 15162, qui sont incorporees a la presente par reference. Un résultat particulierement avantageux de l'invention est que l'ADN plasmidique méthylé dans les conditions de l'invention conduit à l'expression du gène sous le contrôle du promoteur aussi bonne que celle obtenue avec le même ADN plasmidique non méthylé. Cet ADN plasmidique méthylé ne devrait pas entrainer la stimulation immunitaire associée aux ADN bactériens et possède donc un avantage certain pour être utilisé en thérapie génique non virale. Les ADN plasmidiques méthylés selon l'invention peuvent être utilisés dans toute application de vaccination ou de thérapie génique et cellulaire, pour le transfert d'un gène à un organisme, un tissu ou une cellule donnée. En particulier, elles peuvent être utilisées pour une administration directe in vivo, ou pour la modification de cellules in vitro ou a vivo. en vue de leur implantation à un patient. A cet égard, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles (sous forme d'ADN nu), ou en association avec différents vecteurs chimiques et/ou biochimiques, synthétiques ou naturels. Il peut s'agir notamment de cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels la molécule d'ADN est incorporée et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celleci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le DOGS (TransfectamTM) ou le DOTMA (LipofectinTM). Des protéines chimères ont aussi été développées: elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent également être utilisées pour le transfert de gènes dans des cellules par des techniques physiques de transfection telles que le bombardement, l'électroporation, etc. En outre, préalablement à leur utilisation thérapeutique, les molécules de l'invention peuvent éventuellement être linéarisées par exemple par coupure enzymatique. A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne toute composition pharmaceutique comprenant un ADN plasmidique méthylé tel que défini ci-avant. Cet ADN peut être nu ou associé à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transciermique, etc. De préférence, la molécule d'ADN est utilisée sous une forme injectable ou en application. Elle peut être mélangée à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. I1 peut s'agir notamment de tampons Tris ou PBS dilués dans du glucose ou du chlorure de sodium. Une injection directe de l'acide nucléique dans la région atteinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1. Carte du plasmide pXL2784 Figure 2. Carte de restriction du plasmide pXL2784 Figure 3. Profil de digestion des plasmides 1-pXL2784, 2-pXL2784 méthylé, 3-pXL2784+pAIT2 méthylés et 4-pAIT2 méthylé, digérés par les enzymes A-=II, B-BstBI, C-dHindIII, D-II, E-RI (M est le marqueur de poids moléculaire 1KB ladder). TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE ET DE BIOLOGIE MOLE CULAI RE Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E. coli, la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et ., 1989, Ausubel et al., 1987). Les séquences nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté (Ausubel et al., 1987). Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose à 0,7 to ou d'acrylamide à 8 to, purifiés par électrophorèse puis électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en b par un groupement cyanoéthyl (Sinha et al., 1984, Giles 1985) avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer en utilisant les recommandations du fabricant. Les milieux de culture LB et 2XTY sont utilisés pour la partie bactériologique (Maniatis et al., 1989). Les ADN plasmidiques sont purifiés egalement suivant la technique de lyse alcaline (Maniatis ss ., 1989). EXEMPLES Exemple 1. Description du plasmide TG De nombreuses cassettes d'expression eucaryote portées par des plasmides réplicatifs chez la bactérie ss i sont connues de l'homme de l'art. Ces cassettes peuvent exprimer des gènes raporteurs comme le gène codant pour la b-galactosidase de E.coli, ou la chloramphénicol acétyltransférase du transposon Tn9, ou la luciférase, ou des gènes d'intérêt en thérapie génique. Ces cassettes comportent un promoteur qui peut être viral ou eucaryote. ces systèmes d'expression peuvent être tissu spécifique et/ou inductible ou bien avoir une ubiquité d'expression. La cassette utilisee dans cet exemple comprend le gène 11am codant pour la luciférase de Photinus pyrales et le promoteur pCMV, promoteur/enhanceur intermédiaire du cytomégalovirus humain. Le gène luc possède 4,78% de dinucléotides 5'-CG-3', et le promoteur viral pCMV 5 to. Ces pourcentages sont donc élevés par rapport à la fréquence faible de 0,8 % de 5'-CG-3' sur les séquences mammifères. En présence d'une méthylase (telle que le methylase M. SI ou les CpG méthylases endogènes aux mammifères), le promoteur pCMV et le gène luc peuvent être donc hautement méthylés. Cette cassette d'expression a ete clonée dans le plasmide réplicatif chez E. molli pXL2784 dont la carte est présentée sur la figure 1. Le plasmide a une taille de 6390 bp et comporte 5,8 % de dinucléotides 5'-CG-3'. Le plasmide pXL2784 a été construit à partir du vecteur pXL2675 (2,513 kb), réplicon minimal de ColE1 issu de pBluescript (ORI) et ayant pour marqueur de sélection le gène du transposon Tn5 codant pour la résistance à la kanamycine. Le plasmide pXL2784 contient aussi une séquence TH (GAA)17 pouvant se lier à un oligomère (CTT)n où n=1 à 17, pour générer localement une structure triple hélice et permettre une purification par affinité. Le plasmide pXL2784 possède le locus = (382 bp) issu de ColEl ; le locus cet contient une séquence site spécifique des recombinases XerC/XerD et conduit à la résolution de dimères de plasmides (Summers et coll. 1988 EMBO J. 7 p851). Le transgène cloné sur ce plasmide pXL2784 est une cassette d'expression (3,3 kb) du gène luc codant pour la luciférase de Photinus pyralis (provenant de pGL2 basic de Promega) sous contrôle du enhanceur/promoteur pCMV cytomégalovirus humain (provenant de pcDNA3 d'Invitrogen). Exemple 2 : Construction d'une cassette d'expression d'une ADN methyltransferase Cet exemple decrit la structure d'une cassette d'expression de la méthylase M. SssI de Spiroplasma sp. MQ1. Il est entendu que le meme principe peut etre applique a la construction de cassette d'expression de toute autre enzyme selon l'invention. La cassette d'expression utilise comprend le gène codant la méthylase M. SEI de Spiroplasma sp. MQ1 qui est exprimé sous le contrôle du promoteur plac. Ainsi, en présence IPTG (isopropylthio- & D-galactoside) la méthylase est synthétisée et active (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793). Cette cassette est presente dans le plasmide pAIT2, qui a pour réplicon le pACYC184 et porte en outre le gène du transposon TniQA codant pour la résistance à la lividomycine, permettant la selection des cellules hotes transformees. Exemple 3. Production d'ADN plasmidique pXL2784 méthylé aux résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3'. Le plasmide pXL2784 est méthylé sur les cytosines de tous les dinucléotides 5'-CG-3' avec la méthylase M. SI de Spiroplasma sp. MQ1. Le mode de méthylation selon l'invention utilise cette enzyme et le plasmide est méthylé au cours de la production chez la bactérie. Pour cela, la souche de E. çQli ER 1821 dont le génotype est F l- endAl thi- j supE44 mcrA5 D(mrr-hsdRMS-mcrB)1-::IS10, et portant le plasmide pAIT2, est transformée par la methode TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580) par le plasmide pXL2784. Les trformants sont sélectionnés sur milieu LB contenant de la kanamycine 50 mg/l et de la lividomycine 100mg/l afin de sélectionner le pXL2784 qui porte le gène du transposon TE codant pour la résistance à la kanamycine et le pAIT2 porte le gène du transposon Tn903 codant pour la résistance à la lividomycine. Lorsqu'un transformant ER1821, pAIT2, pXL2784 est cultivé en milieu LB kanamycine 50mg/l + lividomycine 100 mg/l + IPTG 2,5 mM à 37 C pendant 15 heures, l'ADN plasmidique extrait est méthylé. La méthylation est vérifiée en digérant les préparations plasmidiques par les enzymes de restrictions vII, AII, BBI. L'intégrité et la présence des deux plasmides sont vérifiées en digérant ces préparations par les enzymes de restrictions llifldIII et BçQRI, voir figure 2. Les enzymes de restrictions HpaII, AatII, BIBI sont trois enzymes dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coupure, est méthylé. Sur le promoteur pCMV sont localisés quatre sites de reconnaissance de MII; sur le gène luc sont cartographiés deux sites de reconnaissance de BstBI et onze sites de reconnaissance de HpaII ; ce dernier enzyme coupant le plasmide pXL2784 en 30 fragments. Sur la photographie du gel d'agarose coloré au bromure d'éthydium (figure 2), on constate qu'avec la préparation plasmidique pAIT2+pXL2784 méthylée ou avec la préparation plasmidique pXL2784 méthylée et purifiée par chromatographie d'affinité (voir exemple 4) aucune digestion n'a lieu avec les enzymes HpaII, AatII, BBI alors que les digestions par les enzymes HindIII et EcoRI conduisent bien au profil attendu d'après la carte de restriction. Les digestions contrôles par les enzymes vII, MII, BstBI du plasmide pXL2784 présentent le profil escompté d'après la carte de restriction. Ces resultats demontrent que l'ADN plasmidique extrait est méthylé, sur les résidus cytosine du dinucléotide 5'-CG-3'. Ces resultats montrent en outre que la methylation concerne plus de 90010 de ces cytosines. Exemple 4. Utilisation de plasmides methyles pour le transfert de matériel génétique Cet exemple demontre que l'ADN plasmidique methyle selon l'invention conserve sa capacite de transfecter des cellules, de s'y repliquer, et d'y exprimer un gene d'interet. A protocole de préparation des solutions utilisees pour la transfection Deux lots de plasmides sont utilisés pour des étude comparatives: a) le pXL2784, b) le pXL2784 méthylé. Le plasmide pXL2784 méthylé est obtenu sous forme d'un mélange avec le plasmide pAIT2 qui en a assuré la méthylation après co-transformation bactérienne. Un fractionnement par chromatographie d'affinité a ete realise pour purifier le plasmide d'intérêt et la technique utilisée est décrite dans la demande NO FR 94t15162. Une étape de dialyse contre du NaCl 0,15M peut être réalisée pour éliminer le tampon qui constitue la phase d'élution de la colonne. Lorsque le plasmide pXL2784 est utilisé en référence il est purifié selon le même protocole que celui décrit ci-dessus. Dans cet exemple la vectorisation de l'ADN est assurée par un lipide cationique, RPR120535A, appartenant à une série décrite dans la demande de brevet N" FR 95 13490. ll est entendu que tout autre vecteur de transfert chimique ou biochimique peut etre utilise. Les solutions de transfection sont préparées à partir d'un mélange volume à volume d'ADN à 30 pg/ml et de solution aqueuse de lipide cationique RPR 120535 à 90 CLM ; le ratio lipide cationique/ADN est donc de 3 nanomoles lipide cationique/ ADN. Après homogénéisation au vortex et incubation d'au moins 15 minutes à température ambiante les solutions ADN/lipofectant sont distribuées à 4,8% (V/V) final dans les puits où les cellules ont été lavées par du milieu dépourvu de protéines (sérum) et remises en croissance pendant le temps de la transfection en milieu dépourvu de sérum. B protocole de transfection Des échantillons de 1.105 cellules [NIH3T3 (fibroblastes de souris) et Hela (carcinome utérin humain)] en phase exponentielle de croissance sur 2 cm2 (500 l de milieu sans sérum/puits) sont traités par 25 l de solution de transfection ce qui correspond à l'apport de 0,375 g d'ADN/1.105 cellules. Après une incubation de 2theures à 37 C sous 5 % de C02 en atmosphère humide le milieu de croissance est supplémenté par du sérum de veau foetal à 8 to final (V/V). A 40 heures post-transfection les cellules sont lavées par du PBS et lysées par un tampon contenant du Triton X-100 à 1 % et du DTT 2mM. L'activité luciférase exprimée est dosée par l'émission de lumière [RLU = relative light unit] en présence de luciférine, coenzyme A et ATP pendant 10 secondes et rapportée au mg de protéines extraites par le tampon de lyse. C résultats Les résultats obtenus selon les conditions décrites ci-dessus figurent dans le tableau suivant. Cellule Cellules NIH 3T3 Cellules Hela Plasmide X12784 XL2784CH3 X12784 oXL2784CH3 purifié par 2,O.1O1O+i 2,11010+1 3,1.108+! 1,7. 108 +/ chromatographie 4% 10% 15% 11% d'affinité et dialysé 2,3.1010+1 3,1.101 +/ 3,8.108 +/- 2,4. 108+1 21% 10% 14% 7% Activité enzymatique en RLU/10 secondes/mg protéine (coefficient de variation to [3 expériences de transfection par résultat] Compte tenu des coefficients de variation obtenus pour ce type d'expériences nous pouvons conclure qu'il n'existe pas de différences significatives quant à l'expression des deux plasmides utilisés dans les mêmes conditions de transfection. De plus l'activité luciférase obtenue est du même ordre de grandeur pour les deux étapes de purification considérées. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'ADN utilisable en thérapie génique caractérisé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'. 2. Procédé selon la revendication 1 caracterise en ce que la cellule est une cellule procaryote. 3. Procédé selon la revendication 2 caracterise en ce que la cellule est une bacterie. 4. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est portée par un vecteur replicatif. 5. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est intégrée dans le génome de la cellule. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la cassette d'expression comprend un acide nucléique codant pour une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5' CG-3' sous le contrôle d'un promoteur. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible. 8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ADN méthyltransférase méthyle preferentiellement les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'. 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'ADN méthyltransférase est choisie parmi la méthylase M.SssI, la mÈthylase de souris et la méthylase humaine. 10. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles. 11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 80 to des résidus cytosine des dinucléotidè 5'-CG-3' de lADN plasmidique sont méthyles. 12. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de lADN plasmidique sont méthyles. 13. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la prÈparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thÈrapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 50 to des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles. 14. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 80 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles. 15. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles. 16. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes: - la production d'ADN par culture d'une cellule comprenant ledit ADN et une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3', - la récupération dudit ADN, et, - le conditionnement dudit ADN avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un ADN plasmidique comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique. 18. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un minicercle comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique. 19. Composition comprenant un ADN bactérien dont au moins 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' sont méthyles.