Brevet FR2755440A1 — publié le 19980507

PROCEDE DE CONSERVATION DE LONGUE DUREE DE MOLECULES D'ADN ET CONDITIONNEMENT POUR SA MISE EN OEUVRE La présente invention a trait à l'ADN (Acide désoxyribonucléique) notamment d'origine humaine, et vise à conserver la molécule d'ADN, laquelle est porteuse des gènes caractéristiques de chaque individu, c'est-àdire de son patrimoine génétique. Plus précisément, I'invention vise la sauvegarde de l'information génétique par la conservation de la molécule d'ADN de façon aussi prolongée que possible et dans des conditions de préservation de l'intégrité de l'information génétique. Cette invention présente de nombreux intérêts notamment pour la médecine prédictive, pour la généalogie génétique et l'identification. Si la molécule d'ADN est relativement stable, des études d'archéogénéticiens ayant révélé qu'elle peut se conserver des millions d'années dans un environnement favorable, elle peut cependant être dégradée en l'absence de conservation dans un tel environnement. Parmi les causes d'altération de l'ADN, on peut citer l'action des radiations ionisantes telles que les rayons X ou gamma, I'action des rayonnements ultraviolets, I'oxydation et l'hydrolyse enzymatique ou chimique. La présente invention vise à proposer une technique de conservation de l'ADN dans un environnement le préservant des effets des actions cidessus. A cet effet, I'invention a pour objet un procédé de conservation de longue durée de molécules d'ADN, caractérisé en ce qu'il consiste, après extraction et purification de 'ADN par toute technique appropriée, conventionnelle ou non, à effectuer une encapsulation dans une capsule métallique, inoxydable, étanche, de la molécule d'ADN préalablement déshumidifiée. Suivant un premier mode de mise en oeuvre du procédé, I'ADN est encapsulé dans une atmosphère constituée d'un ou plusieurs gaz inertes et présentant un degré d'humidité inférieur ou égal à 1 ppm d'eau. Suivant un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé, avant ladite encapsulation physique, I'ADN est soumis à une encapsulation chimique par enrobage dans un (co)polymère approprié. Suivant une variante de ce deuxième mode de mise en oeuvre, I'encapsulation chimique est effectuée à l'aide d'un hybride constitué dudit (co)polymère, de molécules organiques et/ou de sels inorganiques, à des fins de protection renforcée de l'ADN à l'égard des rayonnements ultraviolets ou ionisants. De préférence, et quel que soit le mode de mise en oeuvre du procédé, I'encapsulage physique est complétée par la mise de ladite capsule métallique inoxydable et étanche dans un conteneur résistant aux chocs et à l'écrasement. L'ADN ainsi encapsulé peut être conservé théoriquement pendant plusieurs millions d'années, à l'abri des radiations ionisantes, des ultraviolets, des agressions chimiques et des contraintes mécaniques. L'invention a également pour objet les différents types de conditionnement obtenus conformément au procédé, lesquels se présentent sous la forme soit d'une capsule seule, soit d'une capsule enfermée dans une enveloppe protectrice appelée conteneur. A l'intérieur de la capsule est conservé une quantité d'ADN, par exemple 30 yg, suffisante pour effectuer un nombre substantiel de prises d'échantillons à tout moment. A chaque prise d'échantillon, la capsule est ouverte, la quantité désirée d'ADN est prélevée, le reste étant laissé dans la capsule, le conditionnement étanche étant reconstitué. L'ADN prélevé est ensuite réhydraté à des fins d'analyse. Un tel conditionnement est de nature à assurer une préservation pérenne du patrimoine génétique qui se trouve à l'abri notamment de l'oxydation et des rayonnements ionisants et ultraviolets ainsi que d'autres agressions chimiques ou mécaniques. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de modes de mise en oeuvre du procédé de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement et en regard du dessin annexé sur lequel la figure unique illustre schématiquement une structure d'un conditionnement conforme à l'invention. Préalablement à la mise en oeuvre de l'invention, 'ADN est extrait et purifié. Ceci peut être opéré par toute méthode conventionnelle ou non. L'ADN peut être extrait à partir de n'importe quelles cellules de l'organisme. A titre d'exemple, 'ADN est extrait à partir du sang ou de bulbes de cheveux, de cellules issues de la salive, de muqueuses ou de cellules de la peau. On met en oeuvre ensuite un processus de purification à plusieurs étapes, à savoir : désagrégation des cellules, élimination des protéines par digestion enzymatique, isolement/extraction de l'ADN, amplification par polymérisation, si nécessaire, et conservation à l'abri des facteurs d'altération. L'ADN ainsi préparé se présente sous la forme d'un précipité dans de l'alcool. Le protocole ci-dessus est bien connu et peut être remplacé par tout autre procédé, existant ou nouveau. L'ADN est alors, conformément à l'invention, placé dans une capsule métallique, inoxydable et étanche. Une telle encapsulation dite physique est effectuée dans une atmosphère constituée d'un ou plusieurs gaz inertes, tels que des gaz rares et présentant un degré d'humidité très faible, de préférence inférieur à 1 ppm d'eau, ladite atmosphère étant à la pression atmosphérique. Ceci est opéré par exemple à l'aide d'un boîte sèche conventionnelle. La capsule, représentée schématiquement en 1 sur la figure unique, est par exemple une capsule d'or formée d'une petite cuvette circulaire fermée par un opercule serti à la presse à la périphérie de la cuvette. Le diamètre de la capsule d'or est par exemple de l'ordre de 5 mm et son épaisseur de 2 à 3 mm. La solidarisation étanche de la cuvette et de son opercule peut être effectuée par tout autre moyen approprié. L'or est préférable à cause de sa malléabilité et de ses propriétés d'inoxydabilité et de non-contamination de l'ADN. En variante, un alliage à base d'or ou de platine peut être utilisé. L'atmosphère lors de l'encapsulation est desséchée afin d'éviter l'hydrolyse et l'oxydation de l'ADN après sertissage. La quantité d'ADN placée dans la capsule, par exemple une trentaine de microgrammes, est largement suffisante pour autoriser un nombre substantiel de prélèvements distincts d'ADN dans la capsule au cours de sa conservation. Un tel conditionnement peut suffire pour pouvoir assurer la préservation pérenne du patrimoine génétique pendant des centaines voire des milliers ou des millions d'années, dans la mesure bien entendu où ladite capsule reste intègre. Ce conditionnement protège 'ADN en particulier vis à vis - des réactions d'hydrolyses chimiques ou enzymatiques; - de coupures induites par des rayonnements ultraviolets ou toute radiation ionisante telle que rayons X ou gamma - de l'oxydation par l'oxygène de l'air. Avantageusement et pour renforcer la préservation de 'ADN, la capsule 1, à savoir ladite capsule d'or, est elle-même enfermée dans un conteneur étanche 2 en un matériau présentant de bonnes propriétés mécaniques, de façon à mieux protéger la capsule 1 vis à vis d'agressions mécaniques, en particulier les chocs et l'écrasement. Le conteneur 2 peut être une sorte de petit boîtier en deux parties 2a, 2b, scellées ou solidarisées par tout autre moyen pour assurer l'intégrité et l'étanchéité de l'ensemble. Le conteneur 2 peut être par exemple en un matériau approprié, par exemple céramique, composite, métallique, ou polymère. Suivant un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, I'ADN dûment préparé est, avant mise en place dans la capsule 1, soumis à une encapsulation dite chimique. A cet effet, I'ADN est enrobé dans un polymère ou copolymère inerte vis à vis de l'ADN, à des fins de renforcement de la protection à l'égard des facteurs d'altération, les molécules d'ADN étant à l'abri dans les pores du (co)polymère. Le matériau d'enrobage est choisi de telle sorte qu'il puisse être dissous ultérieurement afin de pouvoir récupérer les molécules d'ADN. Tout (co)polymère peut convenir, excepté ceux risquant de réagir contre la molécule ADN, ceux qui empêcheront la redissolution ultérieure de 'ADN et ceux qui nécessitent pour une telle redissolution un solvant acide, c'est-à-dire ayant un pH inférieur ou égal à 4 environ. On peut réaliser une telle encapsulation chimique en plaçant le matériau ADN dûment préparé, par exemple une pelote d'ADN obtenue par précipitation, dans une solution d'acide acrylique ou polyacrylique dans de l'alcool méthylique. Par exemple, on met en solution dans 50 cm3 d'alcool méthylique 1 g d'acide acrylique ou polyacrylique. L'alcool est lentement évaporé jusqu'à l'obtention d'un gel visqueux. Un amas d'ADN d'environ 1 mm3 en suspension dans une solution alcoolique est placé au sein de ce gel. L'ensemble est desséché à 500C jusqu'à l'obtention d'un bloc solide contenant l'ADN, lequel est ensuite mis en place dans la capsule 1 suivant le processus exposé plus haut, avec cette différence qu'il n'est plus nécessaire d'opérer dans une boîte sèche, I'atmosphère neutre étant maintenue. Ultérieurement et à tout moment, après ouverture des enveloppes 1 et 2, I'ADN peut être désencapsulé par immersion pendant 1 heure dans de l'alcool éthylique. On obtient à nouveau un amas de molécules identique à celui obtenu par le processus de purification. Suivant un autre exemple mettant en oeuvre un autre (co)polymère, on prépare une solution de lg de métacrylate ou polymétacrylate de méthyle dissous dans 50 cm3 de dichlorométhane. Le solvant est évaporé jusqu'à obtention d'un gel visqueux. Un amas d'ADN d'environ 1 mm3 en suspension dans une solution alcoolique est placé au sein de ce gel. L'ensemble est desséché à 500C jusqu'à obtention d'un bloc solide contenant l'ADN, lequel est ensuite mis en place dans la capsule 1 dans les mêmes conditions que l'exemple précédent. Ultérieurement et à tout moment, après ouverture des enveloppes 1 et 2, 'ADN initial peut être régénéré par dissolution du (co)polymère par le dichlorométhane. Suivant une variante de telles encapsulations chimiques, le (co)polymère est associé à des molécules organiques et/ou des sels inorganiques à des fins de meilleure protection vis à vis des rayonnements ultraviolets et des radiations ionisantes. On peut notamment ajouter au (co)polymère des ions de métaux lourds dans la mesure toutefois où il n'y a pas de risques de lésion de l'ADN. Suivant un exemple, on dissous 1g d'acrylamide ou de polyacrylamide dans 25 cm3 d'eau distillée. On ajoute à la solution 50 mg d'acétate de cuivre et 50 mg d'acétate de zinc. L'eau est évaporée lentement jusqu'à obtention d'un gel visqueux. Un amas d'ADN d'environ 1 mm3 en suspension dans une solution alcoolique est placé au sein de ce gel. L'ensemble est desséché à 500C jusqu'à obtention d'un bloc solide contenant l'ADN, lequel est ensuite mis en place dans la capsule 1 dans les mêmes conditions que les exemples précédents. II est à noter que l'encapsulation chimique à l'aide d'un (co)polymère présente l'avantage de réaliser une polymérisation en billes individuelles, ce qui rend plus pratique les prélèvements ultérieurs d'ADN, puisqu'il suffit de retirer de la capsule une bille, sans toucher aux autres. Comme polymère utilisable selon l'invention, on peut également citer l'agarose. Enfin, I'invention n'est évidemment pas limitée aux modes de mise en oeuvre illustrés ci-dessus mais en couvre au contraire toutes les variantes, notamment en ce qui concerne la nature des matériaux constitutifs des capsules 1 ou conteneurs 2, les conditions d'encapsulations physique et chimique, la nature du (co)polymère d'encapsulation chimique et de ses éventuels additifs, ainsi que les forme et dimensions desdites capsules 1 ou conteneurs 2. REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation de longue durée de molécules d'ADN, caractérisé en ce qu'il consiste, après extraction et purification de 'ADN par toute technique appropriée, conventionnelle ou non, à effectuer une encapsulation dans une capsule (1) métallique, inoxydable, étanche, de la molécule d'ADN préalablement déshumidifiée. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que 'ADN est encapsulé dans une atmosphère constituée d'un ou plusieurs gaz inertes et présentant un degré d'humidité inférieur ou égal à 1 ppm d'eau. 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'avant ladite encapsulation physique, 'ADN est soumis à une encapsulation chimique par enrobage dans un (co)polymère approprié. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'encapsulation chimique est effectuée à l'aide d'un hybride constitué dudit (co)polymère, de molécules organiques et/ou de sels inorganiques, à des fins de protection renforcée de l'ADN à l'égard des rayonnements ultraviolets ou ionisants. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que l'hybride est constitué d'un (co)polymère et d'ions de métaux lourds. 6. Procédé suivant l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le (co)polymère et ses éventuels additifs organiques ou inorganiques sont dissous dans un solvant, évaporé ensuite jusqu'à obtention d'un gel visqueux, puis un amas déterminé d'ADN en suspension dans une solution alcoolique est placé au sein dudit gel et l'ensemble est desséché à une température appropriée jusqu'à l'obtention d'un bloc solide contenant l'ADN. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'encapsulation chimique est suivie d'une encapsulation dans une capsule (1) métallique, inoxydable, étanche, dans une atmosphère constituée d'un ou plusieurs gaz inertes. 8. Procédé suivant l'une des revendication 1 à 7, caractérisé en ce que ladite capsule (1) est placée dans un conteneur étanche (2) résistant aux chocs et à l'écrasement. 9. Conditionnement de conservation obtenu conformément au procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une capsule 10. Conditionnement selon la revendication 9, plus particulièrement destiné à la mise en oeuvre du procédé de la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est enfermé dans un conteneur (2) dans un matériau choisi dans le groupe comprenant les céramiques, les composites, les métaux, les polymères.