Brevet FR2757061A1 — publié le 19980619

Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotrachéite infectieuse aviaire. La présente invention a trait à des vaccins à usage aviaire à base de virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV), dans lequel a été insérée, par recombinaison génétique, au moins une séquence nucléotidique hétérologue, notamment codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, dans des conditions assurant une immunisation conduisant à une protection efficace de l'animal vacciné contre ledit agent pathogène. Le virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV) est un alphaherpèsvirus (B. Roizman, Arch. Viol. 1992. 123. 425-449) qui provoque une pathologie respiratoire importante (la laryngotrachéite infectieuse ou ILT) chez le poulet (L.E. Hanson et T.J. Bagust, Diseases of Poultry 9th edn 1991.pp 485-495. Ames, Iowa State University Press). Les vaccins actuellement disponibles contre cette affection contiennent une souche atténuée administrable par différentes voies dont les voies intranasales, conjonctivales, cloacales, dans l'eau de boisson et par aérosol (L.E. Hanson et T.J. Bagust, Diseases of Poultry 9th Edition 1991.pp 485-495. Ames, Iowa State University Press). Les études de biologie moléculaire du virus ILTV ont permis de caractériser le génome viral (M.A. Johnson et ai., Arch. Virol. 1991. 119. 181-198) et d'identifier quelques gènes du virus (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1989. 70. 3085-3089) dont les gènes codant pour la thymidine kinase (UL23) (A.M. Griffin et M.E.G. Boursnell, J. Gen. Virol. 1990. 71. 841-850; C.L. Keeler et al., Avian Dis. 1991. 35. 920-929), la glycoprotéine gB (UL27) (A.M. Griffin, J. Gen. Viol. 1991. 72. 393-398; K. Kongsuwan et al., Virniogy 1991. 184. 404-410; D.J. Poulsen et ai., Virus Genes 1991. 5. 335-347), la glycoprotéine gC (UL44) (D.H. Kingsley et al., Virology 1994. 203. 336-343), la protéine de capside p40 (UL26) (A.M. Griffin, Nucl. Acicis Res. 1990. 18. 3664), la protéine homologue de la protéine ICP4 de l'herpès simplex (HSV-1) (M.A. Johnson et al., Virus Research 1995. 35. 193-204), les protéines homologues aux protéines ICP27 (UL54), glycoprotéine gK (UL53) et DNA hélicase (UL52) de l'HSV-1 (M.A. Johnson et al., Arch. Viol. 1995. 140. 623-634), la ribonucléotide réductase (A.M. Griffin, J. Gen. Viol. 1989. 70. 3085-3089, WO-A-90/02802), les gène UL1 à UL5 (W. Fuchs et T.C. Mettentleiter, J. Gen. Viol. 1996. 77. 2221-2229), les gènes présents dans la séquence unique courte du génome (Us) (M.A. Johnson et al., DNA Sequence- The Journal of Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. ppl91-194; K. Kongsuwan et al., Arch. Virol. 1995. 140. 27-39; K. Kongsuwan et al., Virus Research 1993. 29. 125-140; K. Kongsuwan et al., Virus Gene 1993. 7. 297-303; M.A. Wild et al., Virus Genes 1996. 12. 107-116; WO-A-92/03554; WO-A-95/08622). La présente invention a pour objectif de mettre au point un vaccin aviaire à base de virus ILTV recombinant exprimant un gène hétérologue, ce virus étant capable de se répliquer et d'induire une immunité chez l'hôte vacciné tout en conservant une bonne innocuité. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel vaccin qui soit en même temps particulièrement efficace contre la laryngotrachéite infectieuse (IL19. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel vaccin qui soit utilisable dans la vaccination de masse par voie mucosale, par exemple par voie aérosol ou dans l'eau de boisson, de telle manière que la réplication du virus au niveau mucosal permette d'induire une immunité mucosale et systémique. Une telle immunité mucosale sera particulièrement efficace pour lutter contre les maladies respiratoires, ainsi que contre les autres maladies pour lesquelles la porte d'entrée de l'agent pathogène est mucosale. Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel vaccin qui soit utilisable aussi bien chez les adultes que chez les jeunes animaux. Un objectif spécifique est de proposer un tel vaccin utilisable dans la vaccination de masse par voie mucosale des tout jeunes animaux tels que les poussins d'un jour. Un autre objectif de l'invention est de proposer un vaccin contre l'ILT qui ait une efficacité accrue par rapport à la souche parentale et qui puisse même éventuellement permettre l'insertion et l'expression d'un gène hétérologue. Au cours de leurs travaux sur le virus ILTV, les inventeurs ont trouvé une région génomique qui s'est révélée tout à fait appropriée comme site d'insertion de gènes hétérologues. Cela a permis de mettre au point un vaccin vivant recombinant à base d'un vecteur ILTV dans lequel est insérée au moins une séquence codant pour un immunogène aviaire, en particulier les protéines HN et F du virus de la maladie de Newcastle (NDV), et/ou la glycoprotéine gB du virus de la maladie de Marek (MDV), et/ou la protéine VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV), et/ou les protéines S et M du virus de la bronchite infectieuse (IBV). Un tel vaccin incorporant une séquence codant pour des protéines du NDV, du MDV et/ou de l'IBV assure une protection satisfaisante des animaux contre la maladie de Newcastle, contre la maladie de Marek, contre la maladie de Gumboro, et contre la bronchite infectieuse respectivement. La présente invention a donc pour objet un vaccin vivant recombinant aviaire comprenant, comme vecteur, le virus ILTV comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue, notamment codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, insérée dans le locus d'insertion formé de l'intergène situé entre les codons "stop" des COL-B et COL-C du virus ILTV et qui, dans une souche ILTV particulière, est défini entre les nucléotides 908 et 994 à la séquence SEQ ID NO: 1. Si la séquence particulière décrite dans la demande (SEQ ID NO: 1) provient de la souche vaccinale d'ILTV T-20 12-8-66 provenant de Select Laboratories (10026 Main Street P.O. Box 6 Berlin, Maryland 21811, USA), il est bien évident que l'homme du métier pourra utiliser les autres souches d'ILTV, compte-tenu des informations données dans la présente sur la souche vaccinale. Les COL-B et COL-C correspondent respectivement aux gènes UL3.5 et UL4 décrits dans l'article de W. Fuchs et T.C. Mettentleiter (J. Gen. Virol. 1996. 77. 22212229) d'une souche pathogène provenant de D. Lütticken, Boxmeer, Pays-Bas. Cet article ne suggère en aucune manière que cet intergène puisse être utilisé comme locus d'insertion. La séquence référencée SEQ ID NO:19 reproduit pour cette souche pathogène, la séquence équivalente à SEQ ID NO:1. L'intergène servant de locus d'insertion conformément à l'invention est compris à la SEQ ID NO:19 entre les nucléotides 908 et 994. Par séquence hétérologue, on entend une séquence qui ne provient pas de ce locus d'insertion, c'est-à-dire aussi bien une séquence n'ayant pas pour origine le virus ILTV, qu'une séquence provenant d'une autre région génomique de ce virus, ou encore provenant d'une autre souche ILTV, notamment une souche virulente. Par insertion dans la région d'insertion, on entend notamment insertion simple ou après délétion totale ou partielle du locus d'insertion. On peut insérer une ou plusieurs cassettes d'expression chacune comprenant au moins une séquence à exprimer. Pour exprimer la séquence insérée, on préfère utiliser un promoteur eucaryote fort tel que le promoteur CMV immediate early (IE), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), et le promoteur précoce du virus SV40. Par promoteur CMV immediate early (IE), on entend notamment le fragment donné dans les exemples ainsi que ses sous-fragments conservant la même activité promotrice. Le promoteur CMV IE peut être le promoteur humain (HCMV IE) ou le promoteur murin (MCMV IE), ou encore un promoteur CMV IE d'une autre origine, par exemple du singe, du rat, du cobaye ou du porc. D'autres promoteurs d'origine virale ou cellulaire peuvent également être utilisés. Parmi les promoteurs d'origine virale, on peut encore citer les promoteurs de gènes du virus ILTV (gènes considérés comme précoce-immédiats (ICP4, ICP27, ...), précoces (thymidine kinase, DNA helicase, ribonucléotide réductase, ...), ou tardifs (gB, gD, gC, gK, ...)), du virus de la maladie de Marek (MDV) (gènes gB, gC, pp38, pp14, ICP4, Meq,...) ou du virus de l'herpès de la dinde (herpèsvirus of turkey) (gènes gB, gC, ICP4, ...). La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur ILTV pour être exprimée peut être toute séquence codant pour un polypeptide antigénique, d'un agent pathogène aviaire, capable, une fois exprimé dans les conditions favorables procurées par l'invention, d'assurer une immunisation conduisant à une protection efficace de l'animal vacciné contre l'agent pathogène. On pourra donc insérer, dans les conditions de l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour les antigènes d'intérêt pour une maladie donnée. Cette séquence nucléotidique insérée dans le vecteur ILTV peut également coder pour un polypeptide immunomodulateur, et notamment une cytokine. De manière remarquable, les vaccins selon l'invention pourront être utilisés pour la vaccination in ovo, des poussins d'un jour ou plus et des adultes. Différentes voies d'administration pourront être utilisées: la voie parentérale, ou les voies mucosales telles que oronasale (eau de boisson, aérosol), conjonctivale (goutte dans l'oeil) ou cloacale, avec une préférence pour les voies permettant une vaccination mucosale de masse (eau de boisson, aérosol). L'invention se révèle particulièrement utile aussi bien pour la protection contre les pathologies respiratoires que contre les pathologies systémiques en bloquant les voies d'entrée naturelles de l'agent pathogène. L'invention peut notamment être utilisée pour l'insertion d'une séquence nucléotidique codant convenablement pour une protéine antigénique du virus NDV et en particulier, la glycoprotéine HN ou la glycoprotéine F. On obtient ainsi un vaccin vivant recombinant assurant, en plus d'une protection contre la laryngotrachéite infectieuse, une protection satisfaisante contre la maladie de Newcastle. Le vaccin recombinant contre la maladie de Newcastle contiendra de préférence de 10 à 104 PFU/dose. D'autres cas préférés de l'invention sont l'insertion de séquences nucléotidiques codant pour des antigènes d'autres agents pathogènes aviaires, et notamment, mais de manière non limitative, des antigènes du virus de la maladie de Marek, en particulier gènes gB, gC, gD, et gH+gL (WO-A-90/02803), du virus de la maladie de Gumboro, en particulier gène VP2, du virus de la bronchite infectieuse (IBV), en particulier gènes S et M (M. Binns et al., J. Gen. Virol. 1985. 66. 719-726 ; M. Boursnell et al., Virus Research 1984. 1. 303-313), du virus de l'anémie du poulet (CAV), en particulier VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N.H.M. Noteborn et ai., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139), du virus ILTV, en particulier les gènes codant pour gB (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1991. 72. 393-398), ou pour gD (M.A. Johnson et al., DNA Sequence-The Journal of Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. pp191-194. Harwood Academic Publishers GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et ai., Virus Genes 1993. 7. 297-303), et du virus du syndrome infectieux du gonflement de la tête ("swollen head syndrome" ou pneumovirose du poulet ou turkey rhinotracheitis virus (TRTV) de la dinde; pneumovirus), en particulier la glycoprotéine de fusion F (Q. Yu et al., J. Gen. Virol. 1991. 72. 75-81), ou la glycoprotéine d'attachement G (R. Ling et al., J. Gen. Virol. 1992. 73. 1709-1715; K. Juhasz et J. Easton, J. Gen. Virol. 1994. 75. 2873-2880). Les doses seront de préférence les mêmes que celles pour le vaccin de Newcastle. Dans le cadre de la présente invention, on peut bien entendu insérer plus d'une séquence hétérologue dans le même virus ILTV, notamment dans ce locus. On peut notamment y insérer des séquences provenant d'un même virus ou de virus différents, ce qui comprend également l'insertion de séquences d'ILTV et d'un autre virus aviaire. On peut également y associer des séquences codant pour des immunomodulateurs, et en particulier des cytokines. Par exemple, on associe au promoteur CMV IE un autre promoteur de façon que leurs extrémités 5' soient adjacentes (ce qui implique des transcriptions dans des sens opposés), ce qui permet d'insérer, dans la zone d'insertion, deux séquences nucléotidiques, l'une sous la dépendance du promoteur CMV IE, l'autre sous celle du promoteur associé. Cette construction est remarquable par le fait que la présence du promoteur CMV IE, et notamment de sa partie activatrice (enhancer), active la transcription induite par le promoteur associé. Le promoteur associé peut être en particulier un promoteur d'un gène du virus ILTV ou du virus MDV ou HVT. Un cas intéressant de l'invention est un vaccin comprenant une séquence nucléotidique codant pour HN de NDV et une séquence nucléotidique codant pour F de NDV ou un antigène d'une autre maladie aviaire, notamment celles citées plus haut, l'un des gènes étant sous le contrôle du promoteur CMV IE, et l'autre sous le contrôle du promoteur associe. On peut aussi monter deux promoteurs CMV IE d'origines différentes avec leurs extrémités 5' adjacentes. L'expression de plusieurs gènes hétérologues insérés dans le locus d'insertion peut également être rendu possible par insertion entre les cadres ouverts de lecture de ces gènes d'une séquence appelée "IRES" (Internal Ribosome Entry Site) provenant notamment d'un picornavirus tel le virus de la maladie vésiculaire du porc (swine vesicular disease virus, SVDV; B.-F. Chen et al., J. Virology, 1993, 67, 2142-2148), le virus de l'encéphalomyocardite (EMCV; R.J. Kaufman et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 4485-4490), le virus de la fièvre aphteuse (FMDV; N. Luz et E. Beck, J. Virology, 1991, 65, 6486-6494), ou encore d'une autre origine. Le contenu des 3 articles cités est incorporé par référence. La cassette d'expression de deux gènes aurait donc la structure minimale suivante: promoteur - gène 1 - IRES - gène2 - signal de polyadénylation. Le vaccin vivant recombinant selon l'invention pourra donc comprendre, insérée dans le locus d'insertion, une cassette d'expression comprenant successivement un promoteur, deux ou plusieurs gènes séparés deux à deux par un IRES, et un signal de polyadénylation. En plus de l'insertion dans le locus selon l'invention, on peut réaliser une ou plusieurs autres insertions, une ou plusieurs mutations, ou une ou plusieurs délétions ailleurs dans le génome; si la souche parentale est virulente, on peut par exemple inactiver (par délétion, insertion ou mutation) des gènes impliqués dans la virulence tels que le gène thymidine kinase, le gène ribonucléotide réductase, le gène gE,... Dans tous les cas, l'insertion dans un autre locus que celui décrit dans l'invention, permet d'exprimer d'autres gènes. La présente invention a aussi pour objet un vaccin contre l'ILT comprenant un virus ILTV recombinant dans lequel on a inséré en amont des gènes codant pour des immunogènes majeurs de l'ILTV, de préférence les gènes codant pour gB (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1991. 72. 393-398), ou pour gD (M.A. Johnson et al., DNA Sequence The Journal of Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. pp191-194. Harwood Academic Publishers GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et al., Virus Genes 1993. 7. 297303), un promoteur exogène, en particulier un promoteur fort tel que décrit plus haut. Cela permet d'augmenter le niveau d'expression de l'un ou plusieurs de ces gènes et ainsi conduire à un vaccin à efficacité accrue contre l'ILT. On peut bien sûr combiner cela avec une construction telle que décrite plus haut comprenant l'insertion d'une séquence hétérologue dans le locus d'insertion. La présente invention a aussi pour objet une formule de vaccin multivalent, comprenant, en mélange ou à mélanger, un vaccin tel que défini plus haut avec un autre vaccin, et notamment un autre vaccin vivant recombinant aviaire tel que défini plus haut, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes, notamment de pathogènes différents. La présente invention a aussi pour objet une méthode de préparation des vaccins selon l'invention, telle qu'elle ressort de la description. La présente invention a aussi pour objet une méthode de vaccination aviaire comprenant l'administration d'un vaccin vivant recombinant ou d'une formule de vaccin multivalent tel que défini plus haut. Elle a notamment pour objet une telle méthode pour la vaccination in ovo, des poussins d'un jour ou plus et des adultes. Différentes voies d'administration du vaccin peuvent être utilisées (voir plus haut) avec une préférence pour les voies permettant une vaccination de masse par voie mucosale (aérosol, eau de boisson), la dose de vaccin étant choisie de préférence entre 10' et 104 par animal. La présente invention a aussi pour objet un virus ILTV comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue telle que décrite ci-dessus insérée dans le locus d'insertion tel que défini plus haut. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de réalisation non limitatifs, pris en référence au dessin, dans lequel Figure 1 : Carte de restriction du fragment cloné et position des COLs Figure 2 : Séquence de 4161 pb et traduction des COLs A, B, C et D de la souche vaccinale T-20 de Select Laboratories Figure 3 : Schéma d'obtention du plasmide pEL157 Figure 4 : Schéma d'obtention du plasmide pEL024 Figure 5 : Schéma d'obtention du plasmide pEL027 Figure 6 : Schéma du plasmide pEL158 Figure 7 : Schéma d'obtention du plasmide pCD009 Figure 8 : Schéma d'obtention du plasmide pEL070 Figure 9 : Schéma du plasmide pEL159 Figure 10 : séquence du gène HN du NDV Figure 11 : Schéma d'obtention du plasmide pEL030 Figure 12 : Schéma du plasmide pEL160 Figure 13 : Schéma du plasmide pEL033 Figure 14 : Schéma du plasmide pEL161 Figure 15 : Schéma de double cassette d'expression Figure 16 : Schéma du plasmide pCD011 Figure 17 : Schéma du plasmide pEL163 Figure 18 : Séquence de 4161 pb et traduction des UL3, 3.5, 4 et 5 de la souche pathogène de Lütticken Liste des séquences SEQ ID NO:1 Séquence du fragment KpnI-KpnI (4161 pb, voir figure 2) SEQ ID NO:2 Oligonucléotide EL001 SEQ ID NO:3 Oligonucléotide EL002 SEQ ID NO:4 Oligonucléotide EL003 SEQ ID NO:5 Oligonucléotide EL004 SEQ ID NO:6 Oligonucléotide MB070 SEQ ID NO:7 Oligonucléotide MB071 SEQ ID NO:8 Séquence du gène HN du NDV (voir figure 10) SEQ ID NO:9 Oligonucléotide EL071 SEQ ID NO:10 Oligonucléotide EL073 SEQ ID NO:11 Oligonucléotide EL074 SEQ ID NO:12 Oligonucléotide EL075 SEQ ID NO:13 Oligonucléotide EL076 SEQ ID NO:14 Oligonucléotide EL077 SEQ ID NO:15 Oligonucléotide CD001 SEQ ID NO:16 Oligonucléotide CD002 SEQ ID NO:17 Oligonucléotide CD003 SEQ ID NO:18 Oligonucléotide CD004 SEQ ID NO:19 Séquence du fragment KpnI-RpnI (4161 pb, voir figure 18) EXEMPLES Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A lsboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA). Le virus utilisé comme virus parental peut être choisi parmi les souches vaccinales décrites dans J.R. Andreasen et al. (Avian Diseases 1990. 34. 646-656) ou la souche T20 12-8-66 provenant de Select laboratories 10026 Main Street P.O. Box 6 Berlin, Maryland 21811, USA. On peut également utiliser des souches virulentes telles que la souche de Lütticken (voir ci-dessus), la souche N-71851 (ATCC VR-783) ou la souche 83-2 de l'USDA, que l'on peut atténuer par les techniques connues, par exemple celle décrite dans WO-A-95/08622. Exemple 1: Culture du virus ILTV: Le virus ILTV (souche T20 de Select Laboratories) est cultivé sur des cellules primaires de reins de poulets (CRP); ces cellules sont mises en culture en milieu MEM complémenté avec 3% de sérum de veau foetal (SVF) dans des flacons de culture de 75 cm2 (2 105 cellules/cm2) un ou deux jours avant inoculation. Le jour de l'inoculation, un flacon de 1000 doses de vaccin lyophilisé est resuspendu dans 10 ml de milieu MEM complémenté avec 1% de SVF; environ 0,5 ml de cette solution est ensuite déposé sur la culture de CRP. Le lendemain, le milieu est changé, et le surlendemain, lorsque l'effet cytopathogène (ECP) se généralise, les flacons de culture sont congelés à -70 C. La culture du virus ILTV peut également être faite sur des cellules immortalisées de foie de poulet, et notamment sur la lignée LMH (W.M. Schnitzlein et al., Avian Diseases 1994. 38. 211-217). Exemple 2: Préparation de l'ADN génomique de I'ILTV: Aprés 2 cycles de congelation/décongelation, la culture d'lLTV (2 flacons de 75 cm2) est récoltée et centrifugée à basse vitesse (5000 tr/min dans un rotor 20, centrifugeuse Beckman JA21, pendant 5 minutes) pour éliminer les gros débris cellulaires. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé (100000 tr/min rotor TLA100.3, centrifugeuse Beckman TL100, pendant 1 heure). Le culot est alors repris dans 1,6 ml de TEN-SDS (Tris pH 8,0 10mu; EDTA lmM; NaCi 0,5M; sodium dodecyl sulfate 0,5%), et 35 ,ul d'une solution de protéinase K à 20 mg/ml sont ensuite ajoutés; la solution est incubée 3 à 4 heures au bain marie à 37"C, et l'ADN est ensuite extrait 3 fois au phénol/chloroforme et 1 fois au chloroforme, puis il est précipité à l'éthanol à -20"C. Après centrifugation, le culot est rincé à l'éthanol 70%, séché et resuspendu dans 200 111 TE (Tris pH8.0 10mu; EDTA lmM). La concentration en acide nucléique est ensuite dosée au spectrophotomètre (DO260). L'ADN peut être directement digéré par les enzymes de restriction appropriées, pour être ensuite cloné dans le plasmide pBlue Script II SK+ ; de même, il pourra également être utilisé dans les expériences de transfection pour l'obtention d'un virus recombinant. Exemple 3: Isolement et purification de virus recombinant ILTV Le plasmide donneur composé d'une cassette d'expression d'un polypeptide inséré entre deux régions flanquantes du locus d'insertion est digéré par une enzyme de restriction permettant la linéarisation du plasmide, puis il est extrait avec un mélange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol absolu, et repris dans de l'eau stérile. Des cellules CRP primaires de 24 heures sont ensuite transfectées avec le mélange suivant: 0,2 à 1 /lg de plasmide donneur linéarisé + 2 à 5 Hg d'ADN viral d'ILTV (préparé comme dans l'exemple 2) dans 300 jil de milieu OptiMEM (Gibco BRL Cat&num; 041-01985H) et 100 yg de LipofectAMINE dilués dans 300 yl de milieu (volume final du mélange = 600 yl). Ces 600y1 sont ensuite dilués dans 3 ml (volume final) de milieu et étalés sur 5.106 CRP. Le mélange est laissé en contact avec les cellules pendant 5 heures, puis éliminé et remplacé par 5 ml de milieu de culture. Les cellules sont alors laissées en culture pendant 3 à 8 jours à + 37"C, puis, lorsque l'effet cytopathogène est apparu, elles sont congelées à -70"C. Après décongelation et éventuellement sonication, cette population virale est clonée en dilution limite en microplaques (96 puits) afin d'isoler une population homogène de virus recombinant. Ces plaques sont laissées en culture pendant 1 à 3 jours, puis le surnageant est récolté dans une plaque 96 puits vide et la plaque contenant les surnageants est placée à 4"C ou à -70 C. Les cellules restant dans les autres plaques sont ensuite fixées à l'acétone 95 % pendant 20 à 30 minutes à 20"C, ou pendant 5 minutes à température ambiante. Une réaction d'immunofluorescence indirecte (IFI) est réalisée avec un anticorps monoclonal dirigé contre le polypeptide exprimé pour rechercher les plages exprimant ce polypeptide. Un nouveau clonage est ensuite effectué de la même manière (en dilution limite en plaques 96 puits) à partir du surnageant présent dans les cupules des plaques mises à 4"C ou à -70 C et correspondant aux cupules présentant des plages positives en IFI. En général, 4 cycles d'isolement successifs (dilution limite, récolte du surnageant, contrôle des cellules par IFI, dilution limite à partir du surnageant...) suffisent pour obtenir des virus recombinants dont la totalité de la progénie présente une fluorescence spécifique. L'ADN génomique de ces virus recombinants est caractérisé au niveau moléculaire par des techniques classiques de PCR et de Southern blot en utilisant les oligonucléotides et les sondes d'ADN appropriés. L'isolement de virus recombinant peut également se faire par hybridation avec une sonde spécifique de la cassette d'expression insérée. Pour cela, la population virale récoltée après transfection est diluée et déposée sur des cellules CRP (cultivées en boîte de Petri) de manière à obtenir des plages isolées. Après un contact dl 1 heure à 37"C, le milieu d'infection est éliminé et remplacé par 5 ml de milieu MEM à 1 % d'agarose, maintenu en surfusion à 42"C. Lorsque l'agarose est solidifié, les boîtes sont incubées 48 à 72 heures à 37"C en étuve CO2jusqu'à apparition de plages. La couche d'agarose est alors éliminée et un transfert des plages virales est réalisé sur une membrane stérile de nitrocellulose de même diamètre que la boite de Petri ayant servi à la culture. Cette membrane est elle-même transférée sur une autre membrane de nitrocellulose de manière à obtenir une "copie" inversée du premier transfert. Les plages transférées sur cette dernière copie sont alors hybridées, selon les techniques usuelles connues de l'homme de l'art, avec un fragment d'ADN de la cassette d'expression marqué à la digoxigénine (DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, CAT &num; 1175033). Après hybridation, lavages et mise en contact avec le substrat de révélation, la membrane de nitrocellulose est mise en contact avec un film autoradiographique. Les images d'hybridation positive sur cette membrane indiquent quelles sont les plages qui contiennent des virus ILTV recombinants ayant inséré la cassette d'expression. Les plages correspondant à ces plages positives sont découpées stérilement sur la première membrane de nitrocellulose, placées dans un tube Eppendorf contenant 0,5 ml de milieu MEM et soniquées pour libérer les virions de la membrane. Le milieu contenu dans le tube Eppendorf est ensuite dilué en milieu MEM et les dilutions ainsi obtenues servent à infecter de nouvelles cultures de cellules CRP. Exemple 4: Clonage et caractérisation d'une région génomique de J'ILTV L'ADN extrait du virus ILTV a été digéré par l'enzyme de restriction Kpnl pendant 2 heures à 37"C. L' enzyme de restriction a ensuite été éliminé par une extraction au phénol/chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Les fragments résultant de cette digestion ont ensuite été ligaturés (une nuit à 14"C) avec le plasmide pBlueScriptII SK+ (pBS SK+; Stratag Le séquençage complet de l'insert présent dans pEL112 (voir figure 1) a permis de mettre en évidence deux cadres ouverts de lecture (COLs) complets (COL B et COL C), et une grande partie de deux autres COLs (COL A et COL D). La carte de restriction de cette région génomique clonée et séquencée, est montrée à la figure 1; la séquence de 4161 pb (SEQ ID NO: 1) est montrée à la figure 2. La position et la séquence en acides aminés des COLs A, B, C et D sont également montrées sur les figures 1 et 2 respectivement. La séquence entre les codons STOP des COL B et C (position de 908 à 994 sur SEQ ID NO: 1), est utilisable pour insérer des cassettes d'expression de polypeptides dans le génome de l'lLTV. Cette séquence est appelée locus d'insertion. L'insertion peut se faire avec ou sans délétion dans la région intergénique (voir exemple 5). Exemple 5: Construction du plasmide donneur pEL157 pour l'insertion dans la région intergénique entre les COIs B et C Le plasmide pEL112 (7116 pb), a été digéré par les enzyme NotI et SpeI pour isoler le fragment NotI-SpeI de 4,5 kb. Le fragment ainsi digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs après ligature et transformation des bactéries E. coli, le clone pEL156 (4503 pb) a été obtenu. Les oligonucléotides EL001 (SEQ ID No:2) et EL002 (SEQ ID No:3) ont servi d'amorce pour une première amplification en chaîne par la Taq polymérase (PCR). Les oligonucléotides EL003 (SEQ ID No:4) et EL004 (SEQ ID No:5) ont servi d'amorce pour une deuxième amplification en chaîne par la Taq polymérase (PCR). EL001 (SEQ ID No:2) : 5' TATGCTTTCTACCGAAGTCGG 3' EL002 (SEQ ID No:3) : 5' ACGCGAATTCAAATACGAGCATTTAATTATTGCG 3' EL003 (SEQ ID No:4) : 5' TCTCCAGAATCGCTGGAGTGTCC 3' EL004 (SEQ IDNo : 5) : 5' TGCGCGAATTCGTAAGCTTTGATATCCAGTCGACA TAATTTGGTG?TTATTACTI1TA3' Les PCR ont été effectuées en présence de tampon PCR, de dNTP, d'ADN du plasmide pEL156, de Taq polymérase, et pour la première PCR, des oligonucléotides EL001 et EL002, et pour la deuxième PCR, des oligonucléotides EL003 et EL004. Pour les deux PCR, 25 cycles ont été effectués (30 secondes à 94"C ; 30 secondes à 60"C et 30 secondes à 72"C). Les produits des deux PCR ont été purifiés par une extraction au phénol/chloroforme, suivie d'une purification par l'éthanol. Le produit de la première PCR (EL001/EL002) a ensuite été digéré par les enzymes de restriction XbaI et EcoRI pendant 2 h à 37"C pour donner un fragement d'ADN xbaî-EcoPJ de 120 pb qui a été élué après électrophorèse en gel d'agarose. Le produit de la deuxième PCR (EL003/EL004) a ensuite été digéré par les enzymes de restriction )choI et EcoRi pendant 2 h à 37 C pour donner un fragment d'ADN XlwI-EcoEJ de 85 pb qui a été élué après électrophorèse en gel d'agarose. Le plasmide pEL156 a été digéré par les enzymes XbaI et XhoI. Les deux fragements de PCR XbaI-EcoI (120 pb) et XhoI-EcoRI (85 pb) ont été ligaturés une nuit à 140C avec le plasmide pEL156 digéré par XbaI et X71oI. Après transformation des bactéries E. coli, et culture sur boîtes de milieu complémenté en ampicilline, le clone pEL157 (4531 pb), comprenant un polylinker EcoRi - HindIII EcoRV - SalI a été obtenu (voir schéma d'obtention de pEL157 à la figure 3). Exemple 6: Construction du plasmide donneur pEL158 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur HCMV IE dans le site intergénique entre les COLs B et C, et isolement de vILTV8: 6.1 - Clonage du gène VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV) et construction d 'une cassette d 'expression de VP2 sous controle du promoteur HCMV IE Le plasmide pEL004 (voir figure 4; = plasmide pGH004 décrit dans la demande de brevet français 92.13109) contenant le gène IBDV VP2 sous forme d'une cassette BamHI-HindllI a été digéré par BamHI et XbaI pour isoler le fragment BamHI-XbaI (gène VP2 tronqué) de 1104 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS SK+, préalablement digéré avec xbaî et BamHI pour donner le plasmide pEL022 de 4052 pb (figure 4. Le vecteur pBS-SK+ a été digéré par EcoRV et XbaI, puis ligaturé sur luimême pour donner pBS-SK* (modifié). Le plasmide pEL004 a été digéré par KpnI et HindIII pour isoler le fragment KpnI-HindIII de 1387 pb contenant le gène IBDV VP2 complet. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK*, préalablement digéré par KpnI et Hind lI, pour donner le plasmide pEL023 de 4292 pb (figure 4). Le plasmide pEL022 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 1122 pb (fragment A). Le plasmide pEL023 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 333 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pEL024 de 4369 pb (figure 4). Le plasmide pEL024 a été digéré par Notl pour isoler le fragment Notl-NotI de 1445 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pCMVB (Clontech Cat&num; 6177-1, figure 5), préalablement digéré par NotI, pour donner le plasmide pEL026 de 5095 pb (figure 5). Le plasmide pEL026 a été digéré par EcoRS, SalI et Xmnl pour isoler le fragment EcoRI-SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pEL027 de 5379 pb (figure 5). 6.2 - Construction duplasmide donneurpELi58 Le plasmide pEL027 a été digéré par EcoRS, SalI et XmnI pour isoler le fragment EcoRI SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pEL157 (voir exemple 5 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pEL158 de 6950 pb (figure 6). 6.3 - Isolement et punfication du virus recombinant vILTV8 Le virus vlLTV8 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pEL158 préalablement linéarisé par l'enzyme Kpnl et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette HCMV-IE/IBDV VP2 dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemple 5). Exemple 7: Construction du plasmide donneur pEL159 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur MCMV IE dans le site intergénique entre les COLs B et C et isolement de vILTV9: 7.1 - Construction de pEL070 contenant une cassette d'expression du gène VP2 de l'lBDV sous controle du promoteur iminediate early (IE) du MCMV (Mouse CytoMegaloVirus) Le plasmide pCMVB (Clontech Cat&num; 6177-1, figure 7) a été digéré par SalI et SmaI pour isoler le fragment SalI-SmaI de 3679 pb contenant le gène lacZ ainsi que le signal de poly-adénylation du gène tardif du virus SV40. Ce fragment a été inséré dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par SalI et EcoRV, pour donner le plasmide pCD002 de 6625 pb (figure 7). Ce plasmide contient le gène reporter lacZ mais aucun promoteur n'est situé en amont de ce gène. Le virus MCMV souche Smith a été obtenu de l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC N" VR-194). Ce virus a été cultivé sur cellules d'embryon de souris Balb/C et l'ADN viral de ce virus a été préparé comme décrit par Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983. 47. 421-433). Cet ADN génomique viral a été digéré par PstI pour isoler le fragment PstI-PstI de 2285 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par PstI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pCD004 (figure 7). Le plasmide pCD004 a été digéré par HpaI et PstI pour isoler le fragment HpaI-PstI de 1389 pb qui contient la région promotrice/activatrice du gène Immediate-Early du cytomégalovirus murin (Murine CytoMegaloVirus = MCMV) (Dorsch-Häsler K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. 82. 8325-8329, et demande de brevet WO-A-87/03905). Ce fragment a été cloné dans le plasmide pCD002, préalablement digéré par PstI et SmaI, pour donner le plasmide pCD009 de 8007 pb (figure 7). Un oligonucléotide double brin a été obtenu par hybridation des deux oligonucléotides suivants MB070 (SEQ ID NO:6) 5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3' MB071 (SEQ ID NO:7) S'CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3' Cet oligonucléotide double brin a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pEL067 (figure 8). Le plasmide pCD009 a été digéré par PstI et SpeI pour isoler le fragment PstI-SpeI de 1396 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pEL067, préalablement digéré par PstI et SpeI, pour donner le plasmide pEL068 de 4297 pb (figure 8). Le plasmide pEL024 (voir exemple 6, paragraphe 6. 1 et figure 5) a été digéré par HindIII et NotI pour isoler le fragment HindIlI-NotI de 1390 pb (fragment A). Le plasmide pEL027 (voir exemple 6, paragraphe 6.1 et figure 5) a été digéré par HindI!! et SalI pour isoler le fragment HindIII-SalI de 235 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le plasmide pEL068, préalablement digéré par NotI et Sali, pour donner le plasmide pEL070 de 5908 pb (figure 8). Ce plasmide contient donc une cassette d'expression constituée du promoteur IE du MCMV, du gène VP2 et du signal polyA de SV40. 7.2 - Construction du plasmide donneur pELl 59 Le plasmide pEL070 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment EcoRI SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pEL157 (voir exemple 5 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donneur le plasmide pEL159 de 7545 pb (figure 9). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV. 7.3 - Isolement et purification du virus recombinant vIL7V9 Le virus vILTV9 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pEL159 préalablement linéarisé par l'enzyme BglI et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/IBDV VP2 dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemple 5). Exemple 8: Construction du plasmide donneur pEL160 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène HN du NDV dans le site intergénique entre les COLs B et C et isolement de vILTVlO: 8.1 - Clonage du gène HN du virus de la maladie de Newcastle (NDV) La constitution d'une banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (NDV), souche Texas, a été réalisée comme décrit par Taylor J. et al. (J. Virol. 1990. 64. 1441-1450). Un clone pBR322 contenant la fin du gène fusion (F), la totalité du gène hémagglutinine-neuraminidase (HN) et le début du gène de la polymérase a été identifié pHNO1. La séquence du gène NDV HN contenue sur ce clone est présentée sur la figure 10 (SEQ ID NO:8). Le plasmide pHNO1 a été digéré par SphI et XbaI pour isoler le fragment SphI-XbaI de 2520 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pUC19, préalablement digéré par SphI et XbaI, pour donner le plasmide pHN02 de 5192 pb. Le plasmide pHN02 a été digéré par ClaI et PstI pour isoler le fragment ClaI-PstI de 700 pb (fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: EL071 (SEQ ID NO:9) 5' CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC3' EL073 (SEQ ID NO: 10) 5' GTATTCGGGACAATGC 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 270 pb. Ce fragment a été digéré par HindIII et PstI pour isoler un fragment HindIII-PstI de 220 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par ClaI et HindIII, pour donner le plasmide pEL028 de 3872 pb (figure 11). Le plasmide pHN02 a été digéré parBsphI et Cial pour isoler le fragment BsphI-ClaI de 425 pb (fragment C). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: EL074 (SEQ ID NO: 11) 5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3' EL075 (SEQ ID NO:12) 5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 465 pb. Ce fragment a été digéré par Bsphl et NotI pour isoler le fragment BsphI-NotI de 390 pb (fragment D). Les fragments C et D ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par ClaI et NotI, pour donner le plasmide pEL029bis de 3727 pb (figure 11). Le plasmide pEL028 a été digéré par ClaI et SacII pour isoler le fragment ClaI-SacII de 960 pb (fragment E). Le plasmide pEL029bis a été digéré par ClaI et NotI pour isoler le fragment ClaI-NotI de 820 pb (fragment F). Les fragments E et F ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et SacII, pour donner le plasmide pEL030 de 4745 pb (figure 11). 8.2 - Construction du plasmide pEL160 contenant une cassette d'expression de HN du NDV dans le site intergénique entre les COLs B et C Le plasmide pEL030 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1780 pb (gène NDV HN entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pEL159 (exemple 7, figure 9) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pEL160 de 7921 pb (figure 12). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-HN dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV. 8.3 - Isolement etpurification du virus recombinant vlLTV10 Le virus vJLTVl0 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pEL160 préalablement linéarisé par l'enzyme BgA et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV HN dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemple 5). Exemple 9: Construction du plasmide donneur pEL161 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène F du NDV dans le site intergénique entre les COLs B et C et isolement de vILTV1î: 9.1 - Clonage du gène F du virus de la maladie de Newcastle (NDV) Un clone provenant de la banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (voir exemple 8, paragraphe 8.1) et contenant le gène fusion (F) en entier a été appelé pNDV81. Ce plasmide a été décrit précédemment et la séquence du gène NDV F présent sur ce clone a été publiée (Taylor J. et al. J. Virol., 1990, 64, 1441-1450). Le plasmide pNDV81 a été digéré par Narl et PstI pour isoler le fragment Narl-PstI de 1870 pb (fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: EL076 (SEQ ID N" 13) 5' TGACCCTGTCTGGGATGA 3' EL077 (SEQ ID N" 14) 5'GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC3' et la matrice pNDV81 pour produire un fragment de 160 pb. Ce fragment a été digéré par PstI et San pour isoler le fragment PstI-SaA de 130 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par ClaI et SalI, pour donner le plasmide pEL033 de 4846 pb (figure 13). 9.2 - Construction du plasmide pEL161 contenant une cassette d'expression du gène F du NDV dans le site intergénique entre les COLs B et C Le plasmide pEL033 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1935 pb (gène F entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pEL159 (exemple 7, figure 9) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pELî61 de 8074 pb (figure 14). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-F dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV. 9.3 - Isolement etpunfication du virus recombinant vLTVI l Le virus vILTV11 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pEL161 préalablement linéarisé par l'enzyme Bgn et de l'ADN virai, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV F dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemple 5). Exemple 10: Construction d'un plasmide donneur pour l'insertion d'une double cassette d'expression des gènes RN et F du NDV dans le site intergénique entre les COLs B et C et isolement d'un virus recombinant ILTV: Une double cassette d'expression de deux gènes, par exemple les gènes HN et F du virus NDV, peut être construite. Une telle construction est schématisée à la figure 15. Dans cette construction, l'extrémité 5' des deux promoteurs sont adjacentes de manière que la transcription des deux gènes se fasse en sens opposés. Un des deux promoteurs est le promoteur MCMV IE et l'autre promoteur (appelé promoteur associé) est le promoteur SV40 (présent dans le plasmide pSVbeta, Clontech Laboratories, Palo Alto, California 94303-4607, USA). Dans cette configuration, le promoteur associé est activé par la région activatrice du promoteur CMV IE. Cette double cassette d'expression peut ensuite être insérée dans le plasmide donneur décrit ci-dessus (pEL157 décrit dans 1' exemple 5 et représenté dans la figure 3). L'isolement des virus recombinants se fait de la même manière que ci-dessus (voir exemple 3). Exemple 11: Construction du plasmide donneur pEL163 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène gB du MDV dans le site intergénique entre les COIs B et C et isolement de vILTV12: 11.1 - Clonage du gène gB du virus de la maladie de Marek Le fragment EcoRI-SalI de 3,9 kpb de l'ADN génomique du virus MDV souche RB1B contenant le gène MDV gB (séquence publiée par Ross N. et al. J. Gen. Virol. 1989. 70, 1789-1804) a été ligaturé avec le vecteur pUC13, préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pCD007 de 6543 pb (figure 16). Ce plasmide a été digéré par SacI et XbaI pour isoler le fragment SacI-XbaI de 2260 pb (partie centrale du gène gB = fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: CDOO1 (SEQ ID NO: 15) 5' GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3' CD002 (SEQ ID NO:16) 5' TTCGGGACATTTTCGCGG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 222 pb. Ce fragment a été digéré par KpnI et XbaI pour isoler un fragment KpnI-XbaI de 190 pb (extrémité 5' du gène gB = fragment B). Une autre PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: CD003 (SEQ ID NO:17) 5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3' CD004 (SEQ ID NO:18) 5' rfGC GAGCTCGCGGCCGCTTATI'ACACAGCATCATCTTCTG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 195 pb. Ce fragment a été digéré par SacI et SacII pour isoler le fragment SacI-SacII de 162 pb (extrémité 3' du gène gB = fragment C). Les fragments A, B et C ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pCD011 de 5485 pb (figure 16). 11.2 - Construction duptasmidepELl63 contenant une cassette d'expression du gène gB du MDV dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV Le plasmide pCD011 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 2608 pb (gène gB MDV entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pEL159 (exemple 7, figure 9) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IEDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pEL163 de 8749 pb (figure 17). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/MDV-gB dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV. 11.3 - Isolement et purification du virus recombinant vlLTVl2 Le virus vlLTV12 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pEL161 préalablement linéarisé par l'enzyme BgtI et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/MDV gB dans le site intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemple 5). Exemple 12: Construction d'un plasmide donneur pour l'insertion d'une cassette d'expression de gène(s) de l'IBV dans le site intergénique entre les COIs B et C et isolement de virus recombinant ILTV: Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemples 6, 7, 8, 9 et 11) ou pour l'insertion de doubles cassettes (exernple 10), dans le site décrit ci-dessus (exemple 5), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé les protéines Membrane (M) ou Spike (S), ou partie de Spike (S1 ou S2), ou Nucléocapside (N) du virus de la bronchite infectieuse aviaire (IBV). On réalise notamment une double cassette d'expression avec le gène S sous controle du promoteur CMV IE et le gène M sous controle du promoteur associé. Exemple 13: Construction de plasmides donneurs pour l'insertion de cassettes d'expression de gène(s) d'autres agents pathogènes aviaires ou de peptide immunomodulateur dans les trois sites décrits et isolement de virus recombinants ILTV: Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemples 6, 7, 8, 9 et 11) pour l'insertion de doubles cassettes (exemple 10), dans le site décrit ci-dessus (exemple 5), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé des immunogènes du CAV (et notamment une double cassette d'expression des gènes codant pour VP1 et pour VP2), du virus de la pneumovirose du poulet, ou d'autres agents pathogènes aviaires, ou encore des peptides immunomodulateurs et notamment des cytokines. Exemple 20: Production de vaccins: Les virus recombinants obtenus selon l'invention sont produits sur oeufs embryonnés. La solution virale récoltée est ensuite diluée dans une solution stabilisatrice pour la lyophilisation, répartie à raison de 1000 doses vaccinales par flacon, et enfin lyophilisée. REVENDICATIONS 1 - Vaccin vivant recombinant aviaire comprenant, comme vecteur, un virus ILTV comprenant et exprimant au moins une séquence nucléotidique hétérologue, cette séquence nucléotidique étant insérée dans le locus d'insertion formé par l'intergène situé entre les codons stop des COL B et COL C d'ILTV et qui, dans une souche d'ILTV particulière, est défini entre les nucléotides 908 et 994 à la SEQ ID NO: 1. 2 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées par insertion simple, ou après délétion totale ou partielle du locus d'insertion. 3 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que, pour exprimer la séquence nucléotidique insérée, le vecteur comprend un promoteur eucaryote fort. 4 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur fort est choisi parmi le groupe consistant en: promoteur CMV immediateearly, de préférence le promoteur CMV immediate-early murin ou humain, promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous (RSV), promoteur précoce du virus SV40. 5 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences nucléotidiques insérées dans le locus d'insertion sous le contrôle de promoteurs eucaryotes différents. 6 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que les promoteurs eucaryotes sont des promoteurs CMV immediate-early d'origines animales différentes. 7 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend une première séquence nucléotidique associée au promoteur CMV immediate early et un autre promoteur sous la dépendance duquel se trouve une autre séquence nucléotidique, ces deux promoteurs étant disposés de manière que leurs extrémités 5' soient adjacentes. 8 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend, insérée dans le locus d'insertion, une cassette d'expression comprenant successivement un promoteur, deux ou plusieurs gènes séparés deux à deux par un IRES, et un signal de polyadénylation. 9 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, cette séquence étant insérée dans le locus d' insertion. 10 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour un antigène d'un agent pathogène aviaire choisi parmi le groupe consistant en le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le virus de la maladie de Gumboro (IBDV), le virus de la maladie de Marek (MDV), le virus de la bronchite infectieuse (IBV), le virus de l'anémie du poulet (CAV), le virus de la pneumovirose du poulet. 1 1 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides F et HN du virus NDV. 12 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides gB, gC, gD, gH+gL du virus MDV. 13 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique choisie parmi le groupe des séquences correspondant aux antigènes VP2 de l'IBDV, aux antigènes S, ou partie de S, M et N du virus IBV, aux antigènes VP1 et VP2 du CAV, aux antigènes G et F du virus de la pneumovirose du poulet. 14 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide immunomodulateur, cette séquence étant insérée dans le locus d'insertion. 15 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que cette séquence nucléotidique est choisie parmi le groupe des séquences codant pour des cytokines. 16 - Formule de vaccin multivalent comprenant, en mélange ou à mélanger, au moins deux vaccins vivants recombinants tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 15, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes. 17 - Un virus ILTV comprenant au moins un séquence nucléotidique hétérologue insérée dans le locus d'insertion formé par l'intergène situé entre les codons stop des COL B et COL C d'ILTV et qui, dans une souche d'ILTV particulière, est défini entre les nucléotides 908 et 994 à la SEQ ID NO: 1.