Brevet FR2757060A1 — publié le 19980619

La présente invention concerne un produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme une composition cosmétique contenant ledit produit. un procédé d'élaboration dudit produit et son utilisation. On sait décrire d'une manière relativement satisfaisante les mécanismes de cicatrisation qui interviennent chez l'homme. On a par exemple noté que la surface d'une plaie humaine évolue généralement suivant les étapes suivantes, entre l'apparition de ladite plaic et son comblement naturel. La première étape n'est observée que pour une plaie présentant à l'origine une surface minimale Il s'agit d'une dilatation de la plaie qui est connue sous le nom de dilatation post-traumatique. La seconde etape s'étend sur une durée de deux à trois jours en moyenne. II s'agit d'une contraction de la plaie, au terme de laquelle la surface de ladite plaie est réduite de 20 à 30 % Cette seconde étape est connue sous le nom de contraction initiale. La troisième étape consiste en une contraction ralentie de la plaie qui s'étend sur une durée de deux à quatre jours. La quatrième et dernière étape consiste en une contraction régulière de la plaie, au terme de laquellc sa surface est en moyenne égale à 35 % de sa surface initiale. Cette dernière étape est connue sous le nom de contraction terminale. Ces deux dernières étapes de contraction constituent le phénomène essentiel de la cicatrisation physiologique. Elles sont notamment activées par les macrophages tissulaires, les monocytes sanguins et les cellules épithéliales du milieu cellulaire, et elles permettent ainsi la r estmcturation des tissus épidermiques. Depuis une quinzaine d'années, la recherche scientifique a largement utilisé un modèle pennettant d'évaluer 1el vilro I'effet de produits censés accélérer ces mécanismes de contraction intervenant dans la cicatrisation. Ce modèle est généralement connu sous le nom de modèle de la lattice ou matrice de collagène. Ledit modèle est obtenu en mélangeant dans des proportions adéquates des fibroblastes à une solution de collagène, de manière à former un gel. Les fibroblastes interagissent avec la matrice de collagène en émettant de longs prolongements cytoplasmi(lues. Ces derniers provoquent une compartimentation de ladite matrice qui aboutit à la formation de faisceaux orientés de collagène. Il en résulte une contraction naturelle du gel après quelques jours. L'expérience a montré que ce gel contracté présente l'aspect macroscopique et la consistance de l'épiderme A l'heure actuelle, divers produits de synthèse destinés à accélérer la contraction de ladite matrice de collagène sont présents sur le marché. Un inconvénient majeur de ces produits de synthèse réside dans leur prix de revient élevé. Le but de la présente invention est de proposer un produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme, qui soit élaboré à partir de constituants largement répandus dans la nature et qui remédie par conséquent à l'inconvénient précité. A cet effet, le produit selon l'invention comprend de l'eau de mer stérilisée et diluée dans un solvant, de telle manière que l'osmolarité dudit produit soit au moins voisine de 350 mosmll et au plus voisine de 400 mosm/l. De préférence, losmolarité dudit produit est voisine de 350 mosm/l. Avantageusement, ledit solvant est constitué d'eau pure déminéralisée. La composition cosmétique selon l'invention est telle qu'elle comprend ledit produit. Le procédé d'élaboration d'un produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme selion l'invention est tel qu'il consiste essentiellement à utiliser de l'eau de mer, à la soumettre à un traitement de stérilisation et à traiter l'eau de mer stérilisée de manière que l'osmolarité du produit obtenu suite à ce traitement soit au moins voisine de 350 mosm/l et au plus voisine de 400 mosm/l. De préférence, ledit procédé d'élaboration est tel que l'osmolarité du produit obtenu suite audit traitement est proche de 350 mosmll. De préférence, I'utilisation dudit produit selon l'invention consiste à le pulvériser sur la peau. Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres. apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un exemple de réalisation, ladite description étant faite en relation avec le dessin joint, dans lequel la Fig unique est un graphique illustrant l'action sur les lattices de collagène de trois produits, dont deux seulement sont selon l'invention Le produit selon l'invention est constitué d'eau de mer stérilisée et traitée de telle manière que son osmolarité soit au moins voisine de 350 mosll et au plus voisine de 400 mosrn"l Dans la suite de la présente description, on entendra par osmolarité d'une solution la grandeur qui est classiquement définie comme étant égale à la molarité du nombre total de particules dissoutes dans ladite solution. Plus précisément. l'osmolarité d'une solution est égale à la somme des molarités des molécules neutres et ioniques à l'état dissout dans ladite solution. Si l'on appelle: m (mol/l) la molarité de ladite solution, o son coefficient de dissociation, et p le nombre d'ions que forme une molécule à l'état dissocié constituant ladite solution, I'on a: osmolarité (mol/l ou osm/l) = m (1-&alpha;)+ map =m[l +o(p-l)]. Selon un exemple préférentiel de réalisation, on stérilise l'eau de mer par filtration à 0,22 m, de telle sorte qu'elle ne contienne plus aucune bactérie, levure ou moisissure. De plus, ledit traitement postérieur à la stérilisation consiste de préférence en une dilution de l'eau de mer filtrée et stérilisée au moyen d'un solvant constitué d'eau distillée déminéralisée, par exemple. Afin de mettre en évidence l'action du produit selon l'invention sur la lattice de collagène de l'épiderme, on a procédé à des expériences i)? vîllo dont on trouvera ci-dessous le compte-rendu détaillé. Pour ces expériences, on a procédé à des mesures d'osmolarité de diverses solutions au moyen d'un micro-osmomètre numérique. On a d'abord mélangé une solution de collagène à des fibroblastes épidermiques humains en suspension dans un milieu de culture cellulaire standard (connu sous la dénomination DMEM ou Milieu d'Eagle Modifié par Dulbecco, voir annexe). A titre indicatif, la concentration de collagène dans ce mélange était de 0,88 mg/ml. Quant au nombre de fibroblastes présents par unité de volume dudit mélange, il était de 50000 /ml. De plus, l'osmolarité dudit mélange était de 300 mosm/l, ce qui est la caractéristique d'un milieu isotonique. On a ensuite prélevé une première partie du mélange ainsi obtenu pour le mélanger à un premier produit selon l'invention. Dans cette étude @@@ l ilro, ce dernier était constitué d'eau de mer préfiltrée à I um et diluée dans de l'eau pure déminéralisée, en sone que l'osmoiarité de la solution finale constituée dudit mélange et dudit premier produit soit de 350 mosll On a alors ensemencé la solution obtenue dans les puits d'une première micro-plaque de culture, de manière a pouvoir procéder à une première série d'observations. On a également prélevé une seconde partie dudit mélange de fibroblastes en culture et de collagène pour le mélanger à un second produit selon l'invention Ce dernier est constitué d'eau de mer diluée dans de l'eau pure déminéralisée dans une moindre mesure que précédemment, en sorte que l'osmolarité de la solution finale soit de 400 mosnl. On a alors ensemencé la solution obtenue dans les puits d'une seconde micro-plaque de culture, de manière à pouvoir procéder à une seconde série d'observations. On a enfin prélevé une troisième partie dudit mélange pour le mélanger à de l'eau de mer qui est diluée dans de l'eau pure déminéralisée dans une mesure encore moindre que précédemment, en sorte que l'osmolarité de la solution finale soit de 560 mosm/l. On a alors ensemencé la solution obtenue dans les puits d'une troisième micro-plaque de culture, de manière à pouvoir procéder à une troisième série d'observations. Pour chacune de ces trois expériences, on notera que l'apport de solvant au milieu de culture permet de diluer suffisamment ce dernier. de telle sone que ledit milieu de culture puisse apporter aux fibroblastes tous les éléments nutritifs nécessaires à leur métabolisme. Pour chaque expérience. la concentration desdits éléments nutritifs dans la solution finale a été divisée par quatre du fait de la dilution opérée. De plus, on a également utilisé ledit mélange constitué uniquement de la solution de collagène et du milieu de culture contenant les fibroblastes pour l'ensemencer dans une quatrième micro-plaque, afin de procéder à une quatrieme série d'observations, encore appelée série témoin dans la suite de la présente description A titre simplement indicatif, on a utilisé pour chacune-des quatre series une micro-plaque de six puits, le diamètre de chaque puits étant de 35 mm On a ensuite procédé à l'incubation en atmosphère humide de chacune des quatre micro-plaques ensemencées, ladite atmosphère contenant 5 'o de GO2 et étant égalemement caractérisée par une température de 37 C Au bout de quelques heures d'incubation, chacune des quatre solutions ensemencées a forme un gel. et l'on a mesuré à partir de ce moment-là et à des dates diflèrentes pour trois des six pciitz de chaque micro-plaque, le diamètre des quatre lattices de collagene respectivement constituées par lesdits gels. On en a déduit par une méthode d'analyse d'image la surface de la lattice contenue dans chacun de ces puits auxdites dates. de manière à pouvoir rendre compte de l'éventuelle contraction de chaque lattice au cours du temps. Les tableaux présentés ci-dessous détaillent les résultats obtenus à six dates différentes La première d'entre elles ou date de référence (t0 = heure) correspond au moment même où les micro-plaques sont placées dans l'incubateur Pour chaque série d'expériences, on a fait figurer auxdites dates la surface de la lattice mesurée en mm2 pour chacun des trois puits sélectionnés dans une même micrn-plaque la valeur moyenne des trois surfaces obtenues et l'écart type en résultant, ainsi que le pourcentage de contraction du gel par rapport à ladite date de référence t0 (voir tableaux I à IV). On a enfin fait figurer au tableau V en fonction du temps et pour chaque série d'expériences, d'une part, lesdits taux de contraction par rapport à la date t0 et, d'autre part, des gains de contraction relatifs à chaque série et défnis par le quotient: (taux de contraction par rapport à t0 à la date t)séries 1, 2 ou 3 1 (taux de contraction par rapport à t0 à la date t)série témoin TABLEAU I SERIE TEMOIN SURFACE DES LATTICES (en mm2) EN FONCTION DU TEMPS ET POURCENTAGE DE CONTRACTION PAR RAPPORT à f0 Temps(h) 0 21 30 45 74 147 Puits 1 962 907 706 660 615 572 Puits 2 962 706 660 615 615 530 Puits 3 962 706 660 615 615 572 Moyenne 962 773 675 630 615 558 Ecart-type 0 116 27 26 0 24 % de contraction par rapport 0 20 30 35 36 42 à f0 TABLEAU II PREMIERE SERIE D'EXPERIENCES Temps(@) 0 21 30 45 74 147 Puits 1 962 660 615 572 490 379 Puits 2 962 706 615 572 490 415 Puits 3 962 660 615 572 490 415 Moyenne 962 675 615 572 490 403 Ecart-type 0 27 0 0 0 21 % de contraction par rapport 0 30 36 41 49 58 à f0 TABLEAU III: DEUXIEME SERIE D'EXPERIENCES Temps(@)@ 0 21 30 45 74 147 Puits 1 962 706 615 572 490 415 Puits 2 962 706 660 615 490 415 Puits 3 962 706 660 615 490 415 Ecart-type 0 0 26 25 0 0 % de contraction par rapport 0 27 33 38 49 57 à f0 TABLEAU IV TROISIEME SERIE D'EXPERIENCES Temps(@): 0 21 30 45 74 147 Puits 1 962 962 962 962 962 962 Puits 2 962 962 962 962 962 962 Puits 3 962 962 962 962 962 962 Moyenne 962 962 962 962 962 962 Ecart-type 0 0 0 0 0 0 % de contraction par rapport 0 0 0 0 0 0 à f0 TABLEAU V: RESUME Témoin % de contraction 0 20 30 35 36 42 sans produit par rapport à f0 % de contraction 0 0 0 0 0 0 3ème par rapport à f0 Produit Gain de contraction (en %) par rapport 0 0 0 0 0 0 au témoin sans produit % de contraction 0 27 33 38 49 57 2ème par rapport à f0 Produit Gain de contraction (en %) par rapport 0 35 10 9 36 36 au témoin sans produit % de contraction 0 30 36 41 49 58 1er par rapport à f0 Produit Gain de contraction (en %) par rapport 0 50 20 17 36 38 au témoin sons produit Le graphique de li FI- unlque illustre les résultats consignés dans le tableau V ci-dessus Comme on peut le voir sur cette Fig., le premier produit selon l'invention relatif à la première série d'expériences (osmolarité de 350 mosm/l) accélère très nettement la contraction de la lattice de collagène pendant toute la durée de l'expérience. par rapport à It contraction naturelle observée avec la solution "témoin" (osmolarité de 300 mosm/l) ()n notera en particulier que le gain de contraction moyen obtenu avec ledit premier produit selon l'invention avoisine 50 % Quant au second produit selon l'invention (osmolarité de 400 mosm/l), il accélère un peu moins nettement la contraction de la lattice de collagène que ledit premier produit, notamment au cours des 45 premières heures d'expérience. De plus, il procure un gain de contraction moyen de la lattice avoisinant 36 % On notera par contre que le produit correspondant à la troisième série d'expériences exerce une inhibition totale de la contraction des lattices. Il résulte de ces expériences que l'ajout d'eau de mer stérilisée additionnée d'eau pure déminéralisée audit milieu de culture cellulaire contenant les fibroblastes et la solution de collagène permet d'accélérer la contraction naturelle de la lattice de collagène, lorsque l'osmolarité de l'ensemble est comprise entre 350 et 400 mosm/l Comme le milieu de culture contenant les fibroblastes et la solution de collagène est isotonique, on en déduit que l'eau de mer stérilisée et diluée a une telle action sur les lattices de collagène lorsque son osmolarité est comprise dans le domaine précité. On notera que les produits selon l'invention à base d'eau de mer stérilisée pourraient également être obtenus par un traitement autre qu'une dilution, pourvu que leur osmolarité suite audit traitement vérifie la condition ci-dessus ANNEXES 1. Composition du milieu de culture DMEM (en mg/l): SELS INORGANIQUES: CaCl2 + 2H20 264,00 CaCl2 (anhydre) Fe(NO3) + 9H20 0,10 KCI 400,00 MgSO4(anhydre) MgSO4 + 7H20 200,00 NaCI 6400,00 NaHC03 3700,00 NAH2PO4 + 2H20 141,00 NAH2PO4 + H20 AUTRES COMPOSANTS: D-Glucose 1000,00 Rouge de Phénol 15,00 HEPES Pyruvate de Sodium 110,00 Aminoptérine Hypoxanthine Thymidine ACIDES AMINES: L-Alanine L-Asparagine L-Arginine + HCl 84,00 Acide L-Aspartique L-Cystine 48,00 L-Cystine + 2HCl Acide l -Glutamique L-Glutamine 580,00 L-Alanyl-L-Glutamine Glycyl-L-Glutamine Glycine 30,00 L-Histidine HCl + H20 42,00 L-lsoleucine 105,00 L-Leucine 105,00 L-Lysine + HCl 146,00 L-Méthionine 30,00 L-Phénylalanine 66,00 L-Proline L-Sérine 42,00 L-Thréonine 95,00 L-Tryptophane 16,00 L-Tyrosine 72,00 L-Tyrosine (sel disodique) L-Valine 94,00 VITAMINES: Pantothénate de Calcium 4,00 Chlorure de Choline 4,00 Acide Folique 4,00 i-lnositol 7,20 Nicotinamide 4,00 Pyridoxal + HCI 4,00 Riboflavine 0,40 Thiamine + HCI 4,00 ll. Etude de la cytotoxicité du premier et du second produit selon l'invention: On a ensemencé dans un premier temps dans les puits d'une micro-plaque des fibroblastes épidermiques humains en suspension dans ledit milieu de culture cellulaire DMEM, à raison de 2000 fibroblastes par puits. A titre indicatif on a utilisé une micro-plaque de 96 puits, le diamètre de chaque puits étant de 6 mm Après une incubation de 24 heures, on a retiré de la micro-plaque deux prélèvements dudit milieu de culture auxquels on ajoute respectivement le premier et le second produit selon l'invention. On a ensuite disposé chacun de ces deux produits mélangés au milieu de culture dans plusieurs puits distincts appartenant à ladite micro-plaque et l'on a soumis cette dernière à une nouvelle incubation pour une période de 4S heures A titre indicatif, les conditions relatives à chaque Incubation effectuée dans ce protocole ont été, d'une part, une température de 37 C et. d'autre part, un taux de CO2 de 5 %. Après ce laps de temps, on a éliminé lesdits produits selon l'invention, et on les a remplacés par un produit connu sous la dénomination MTT et dont le nom développé est le 3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium bromide. Le MTT est couramment utilisé pour révéler la viabilité des cellules en culture ou dans les tissus, c'est-à-dire pour évaluer la cytotoxicité d'un produit vis-à-vis du milieu cellulaire. On pourra se reporter à l'article suivant pour une description détaillée de cette méthode: MOSSMANN, Journal ofImmunological Methods. 1983, 65, pp. 55-63 On a procédé à nouveau à l'incubation de ladite micro-plaque pendant 3 heures, de manière que le MTT puisse pénétrer dans les cellules Au contact des déshydrogénases mitochondriales, qui sont des enzymes uniquement produites par les cellules vivantes, le MTT est réduit en cristaux bleus de formazan Ces cristaux permettent donc de révéler les cellules vivantes. Puis on a dissout les cristaux de formazan obtenus dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), de manière à disposer d'une solution homogène On a ensuite procédé à des mesures de densité optique pour chaque puits ainsi que pour un puits de référence n'ayant pas reçu de produit selon l'invention. en partant du fait que l'intensité de coloraticru blcue due au fi,rniazan est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes dans chacjtie puits On a calculé un taux de mortalité cellulaire pour chaque puits defini par la relation suivante: DO moy (puits avec produits) Taux de mortalité cellulaire = 1 - - DO moy (puits témoin) où DO moy (puits avec produits) est la moyenne des densités optiques mesurées pour plusieurs puits ayant reçu l'un des produits selon l'invention, et DO moy (puits témoin) est la moyenne des densités optiques mesurées pour plusieurs puits "témoin" n'ayant pas reçu de produit particulier. Comme on peut le voir à la relation ci-dessus, on a ainsi attribué un taux de mortalité nul aux cellules desdits puits "témoin" On a fait figurer dans le tableau ci-dessous les valeurs qui ont été obtenues pour les taux de mortalité cellulaire relatifs à l'adjonction de chacun des deux produits selon l'invention précités, cela dans six puits de ladite micro-plaque. Mesures ler 2nd sur les produit selon produit selon puits l'invention I'invention témoin (350mosm/l) (400 mosm/l) Puits 1 0,500 0,534 0,480 Puits 2 0,505 0,483 0,498 Puits 3 0,519 0,538 0,517 Puits 4 0,488 0,544 0,462 Puits 5 0,475 0,517 0,558 Puits 6 0,516 0,538 0,514 DO moy 0,501 0,526 @ 0,505 Ecart-type 0,017 0,023 Taux de O - 5 @0 - 0,8 O mortalité (en %) On remarquera que les produits selon l'invention ne sont pas du tout toxiques pour les cellules. Quant aux quelques cellules supplémentaires mises en évidence par ces mesures (taux de mortalité négatifs), leur nombre n'est pas significatif. REVENDICA7IONS 1) Produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme, caractérisé en ce qu'il comprend de l'eau de mer sterilisée et diluée dans un solvant. de telle manière que l'osmolarité dudit produit soit au moins voisine de 350 mosnil et au plus voisine de 400 mosm/l. 2) Produit selon la revendication t caractérisé en ce que son osmolarité est voisine de 350 mosnVl 3) Produit selon la revendication t ou 2. caractérisé en ce que ledit solvant est constitué d'eau pure déminéralisée. 4) Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend un produit selon l'une des revendications précédentes. 5) Procédé d'élaboration d'un produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser de l'eau de mer, à la soumettre à un traitement de stérilisation et à traiter l'eau de mer stérilisée de manière que l'osmolarité du produit obtenu suite à ce traitement soit au moins voisine de 350 mosm/l et au plus voisine de 400 mosnVl. 6) Procédé d'élaboration d'un produit destiné à accélérer la cicatrisation de plaies de l'épiderme selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'osmolarité du produit obtenu suite à ce traitement est proche de 350 mosm/l. 7) Utilisation d'un produit selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle consiste à pulvériser ledit produit sur la peau