Brevet FR2757162A1 — publié le 19980619

L'invention concerne un procédé de fabrication de conjugués fluorescents non agrégés. L'invention concerne également les conjugués fluorescents non agrégés obtenus par ce procédé et leur utilisation comme traceurs fluorescents. L'autoagrégation de colorants hydrophobes tels que la thionine ou le bleu de méthylène, est bien connue en solution aqueuse à haute concentration, comme décrit dans J. Am. Chem. Soc. 63,69 (1941). Ces agrégats entraînent un changement de spectre d'absorption et une réduction de la fluorescence desdits colorants. Les cyanines sont également connues pour s'agréger en provoquant un quenching de fluorescence (J. Phys. Chem. 69, 1894(1965)). Ce phénomène d'agrégation est notamment amplifié dans la fabrication de conjugués fluorescents. Waggoner et al. ont ainsi observé un phénomène d'agrégation après conjugaison de cyanine isothiocyanate sur un anticorps (Cytométrie 10:11-19 (1989)). Ces mêmes auteurs décrivent des cyanines arylsulfonates présentant la particularité de se coupler par voie N-hydroxysuccinimide et de s'agréger faiblement sur conjugués protéiques, propriété qu'ils attribuent à la présence de groupements sulfonates sur le noyau cyanine (brevet US 5 268 486), ainsi que des cyanines à base de naphtalènesulfonate (Bioconjugate Chemistry 7 : 356-362 (1996)). Dans ce dernier article, les auteurs montrent l'importance du nombre de sulfonates dans les processus de désagrégation. Cependant, il a été rapporté que la fluorescence d'un conjugué entre une cyanine désignée par CY5.18 issue du brevet US 5 268 486 et un anticorps anti HCG (rapport molaire = 1,7) est quenchée par rapport à celle de la cyanine libre (Anal. Biochem. 217:197-204 (1994)). D'autre part, la Demanderesse a réalisé des essais sur des anticorps anticancer prostatique et anti-hormone spécifique de la thyroïde marqués avec les composés cYS.18 et Cl5.29 issus du même brevet US 5 268 486 (exemples 1 et 2). Ces exemples montrent un fort quenching des cyanines quelque soit le taux de marquage final. Enfin, dans le même brevet US 5 268 486 , les auteurs soulignent l'importance des cyanines comme remplacant potentiel des phycobiliprotéines et mettent en avant les avantages suivants: -stabilité -cout moindre -procédure de marquage simplifiée -taille adaptée à la reconnaissance de petites molécules. Ces avantages deviennent toutefois inopérants quand les cyanines se retrouvent agrégées sur les conjugués. La demande WO 96/00902 propose, pour pallier l'inconvénient de l'agrégation des cyanines, d'introduire des groupements iminium dans leur structure. Toutefois, cette demande se contente d'apprécier la capacité désagrégeante de structures qui y sont décrites en comparant les spectres UV dans des solutions salines faiblemcnt et fortement concentrées, et ne donne aucun résultat sur les conjugués. Parallèlement, l'augmentation de fluorescence provoquée par l'ajout de cylodextrine dans un milieu contenant un fluorophore est décrite dans la littérature (J. Chromatog. 452(1988); Macromolecules 10(3): 676-681 (mai-juin 1977)). Inversement, certaines molécules fluorescentes sont quenchées par l'addition de cyclodextrines (Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry 18: 385-396 (1994), Kluwer Academic Publishes). La formation de complexes d'inclusion cyanine-cyclodextrine est décrite en littérature (J. Am. Chem. Soc. 112: 5824-5830 (1990)). Selon les conditions et la nature de la cyclodextrine, on peut voir des complexes monomériques ou dimériques, lesquels favorisent l'agrégation des cyanines et donc le quenching de fluorescence desdites cyanines. Pour conserver les propriétés fluorescentes des complexes d'inclusion, l'art antérieur décrit des liaisons covalentes faisant intervenir une fonction de la cyclodextrine (WO 91/02040). La demande WO 91/01090 décrit des chélates d'Europium attachés de façon covalente à une cyclodextrine, qui est ensuite couplée à une protéine. Toutefois, ce type de liaison est difficile à réaliser, notamment parce qu'elle nécessite la modification chimique de la cyclodextrine (sous forme par exemple de N-hydroxysuccinimide, maléimide, thiol ou amine) et présente l'inconvénient: - d'altérer les propriétés des complexes d'inclusion et donc de diminuer les performances de fluorescence; - d'altérer les propriétés de la protéine, par un marquage de la cyclodextrine sur des fonctions biodisponibles. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de préserver les propriétés de conjugués entre une molécule porteuse et un réactif fluorophore. Ainsi, un premier objet de l'invention consiste à obtenir un conjugué hautement fluorescent et non agrégé. Un autre objet de l'invention consiste à obtenir un tel conjugué fluorescent de manière simple et rapide. Ces objets sont atteints, selon un premier aspect de l'invention, par un procédé pour l'obtention d'un conjugué fluorescent entre une molécule porteuse possédant au moins un groupement amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl et un réactif fluorophore possédant au moins un groupement fonctionnel susceptible de réagir avec le(s)dit(s) groupe(s) amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl, qui consiste à mettre en présence ladite molécule porteuse et ledit réactif fluorophore avec une solution aqueuse d'un macrocycle soluble dans l'eau contenant de 1 à 40 % (m/v) dudit macrocycle. Le mécanisme réactionnel peut être représenté par le schéma suivant: où F est le réactif fluorophore et P est la molécule porteuse. La molécule porteuse P réagit avec les fonctions du réactif fluorophore F. Cela a pour effet de conserver les distances intermoléculaires et d'éviter le rapprochement des réactifs fluorophores sur la molécule porteuse. La conséquence en est une diminution de l'agrégation des réactifs fluorophores. Avantageusement, la concentration en macrocycle dans la solution aqueuse de macrocycle est comprise entre 10 et 40 go (m/v). Comme macrocycle soluble dans l'eau, on utilisera avantageusement une cyclodextrine éventuellement substituée ou un calixarène substitué par des groupes hydrophiles. On peut citer à titre d'exemple de cyclodextrine utilisable dans le procédé conforme à l'invention, l'a-cyclodextrine, la ss-cyclodextrine, la y-cyclodextrine, l'hydroxypropyl-&alpha;-cyclodextrine, l'hydroxypropyl-ss-cyclodextrine, l'hydroxypropyl-&gamma;-cyclodextrine, l'hydroxyéthyl-&alpha;-cyclodextrine, l'hydroxyéthyl-sscyclodextrine, l'hydroxyéthyl-&gamma;-cyclodextrine ou la 2,6-di-O-méthyl-heptakist3-cyclodextrine. Les calixarènes qui peuvent être utilisés dans le procédé conforme à l'invention répondent à la structure dans laquelle - Ra et Rb représentent chacun un groupement hydrophile choisi parmi H, (CH2)pCO2H, (CH2)pOH, (CH2)pNH2, (CH2)pSO3H ou (CH2)pN+RCRdRe; - Rc, Rd et Re représentent chacun l'hydrogène ou un (C1 -C3)alky le; - p varie de 0 à 4 pour Rb et de 1 à 4 pour Ra; et -tvariede 1 à5. Le macrocycle soluble dans l'eau forme un complexe d'inclusion, soit avec le réactif fluorophore, soit avec la molécule porteuse et forme ainsi une structure rotaxane stable. Ce complexe d'inclusion peut subsister dans la structure finale du conjugué fluorescent obtenu par le procédé conforme à l'invention. Généralement, le réactif fluorophore utilisé est un chromophore à un ou plusieurs noyaux aromatiques, ledit chromophore ayant un coefficient d'extinction moléculaire élevé, supérieur à 20 000, de préférence supérieur à 50 000. Selon un aspect préféré de l'invention, ledit réactif fluorophore est choisi parmi * une cyanine de structure * une hémicyanine de structure * une mérocyanine de structure ou * un styryl de structure * une rhodamine de structure: ou * une fluorescéine de structure: ou * une naphtofluorescéine de structure: dans lesquelles structures: - les lignes en pointillé représentent chacune les atomes de carbone nécessaires pour former 1 à 3 cycles fusionnés, les groupes R3, R4, R5, R6, R8 et R9 étant attachés à ces cycles; - X et Y représentent chacun O,S ou C(CH3)2; - m vaut 1, 2, 3 ou 4; - au moins un des groupes R1 à R7 est capable de réagir avec un groupement amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl et est choisi parmi -(CH2)nNC3 ; -(CH2)nNCO ; -(CH2)n-S-S-Ar ; -(CH2)n-NH-Ar ; -(CH2)n-N3 ; -(CH2)n-NH2 ou -(CH2)n-SH où n varie de O à 8 et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitue par un atome d'halogène, ceux des groupes R1 à R7 ne représentant pas une des entités réactives ci-dessus étant choisis parmi l'hydrogène ou un groupe -(CH2)r-Z dans lequel r varie de O à 4 et Z représente un groupe CH3, SO3H, OH ou N+R1RoR3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tcls que définis ci-dessus, et au moins un des groupes R8 et R9 représente un groupe S03- ou S03H, l'autre groupe représentant l'hydrogène ou un groupe SO3- ou S03H. Plus particulièrement, on utilisera de manière avantageuse une cyanine de structure dans laquelle les groupes R1, R2, R3, R4, R7, R8 et Rg sont tels que définis précédemment. Une classe de cyanines préférée est composé des cyanines ci-dessus dans lesquelles X et Y représentent chacun un groupe C(CH3)2. Parmi ces cyanines, celles où (i) R1 et R2 représentent chacun un groupe 5-(succinimidooxycarbonyl)pentyl ; R3, R4 et R7 représentent chaucn l'hydrogène ; R8 et Rg représentent chacun un groupe sulfonate ; et m est égal à 2 ou (ii) R1 représente un groupe 5-(succinimidooxycarbonyl)pentyl ; R2 représente un éthyl ; R3, R4 et R7 représentent chaucn l'hydrogène ; R8 et Rg représentent chacun un groupe sulfonate; et m est égal à 2, sont préférés. La molécule porteuse possédant au moins un groupement amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl est une biomolécule destinée d'une manière générale au diagnostic ou à la détection. Cette biomolécule pourra servir elle-même au marquage d'autres molécules, notamment de protéines. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps, un antigène, une protéine, un peptide, un haptène, une lectine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un médicament, un polymère, une particule polymériquc, du verre, une particule de verre ou une surface en verre ou en polymère. Le procédé conforme à l'invention présente les avantages suivants - il évite la fonctionnalisation dc cyclodextrines, ct permet donc un gain de temps et d'argent - il permet la stabilisation dc façon irréversible du complexe d'inclusion entre le macrocycle soluble dans l'eau ct le réactif fluorophore (les complexes d'inclusion ont habituellement des constantes d'équilibre faibles); - il permet d'éviter le quenching dc fluorescence des conjugués obtenus, sans intervenir sur la structure chimiquc du réactif fluorophore. En effet, les propriétés complexantes du macrocycle soluble dans l'eau permettent un éloignement in situ des réactifs fluorophores dont les distanccs intermoléculaires après conjugaison et purification du conjugué sont maintenues. Cet éloignement des réactifs fluorophores sur la molécule porteuse évite le phénomène d'agrégation et donc le quenching de fluorescence. Selon un autre aspect, l'invention concerne également les conjugués fluorescents, obtenus par le procédé décrit précédemment. Lorsque le complexe d'inclusion formé par le macrocycle soluble dans l'eau avec le réactif fluorophore et la molécule porteuse subsiste dans la structure finale du conjugué fluorescent, le réactif fluorophore est lié à la molécule porteuse de telle sorte que la partie hydrophobe du réactif fluorophore traverse le macrocycle soluble dans l'eau. Si la molécule porteuse P et le réactif fluorophore F sont des groupements encombrants, le complexe réalisé sera stable et formera un rotaxane Le complexe obtenu est original car la cyclodextrine ne contient aucune liaison covalente avec le réactif fluorophore ou la molécule porteuse. Comme indiqué précedemment, les conjugués fluorescents selon l'invention, notamment les complexes rotaxane, ne présentent pas de quenching de fluorescence en raison de l'éloignement des réactifs fluorophores sur la molécule porteuse. Les conjugués fluorescents selon l'invention se révèlent être d'excellents traceurs fluorescents. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation des conjugués fluorescents décrits ci-dessus comme traceurs fluorescents. Ces traceurs trouvent application par exemple en microscopic dc fluorescence, en cytométrie de flux ou en immunodiagnostic en fluorescence, de préférence en microscopie de fluorescence ou en cytomctrie de flux. les conjugués fluorescents de l'invention peuvent également être utilisés pour la détection et/ou la détermination par fluorescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir. L'invention sera mieux comprisc à l'aide des exemples ci-après, donnés à titre purement illustratifs. EXEMPLE 1 - Fabrication des conjugués et analvse UV o3s so3 130 StNCtUfe 1 structure 2 1/ Influence de la présence de la cyclodextrine Conjugué N. 1 Un échantillon à 1 mg/ml d'anticorps marqueur tumoral du pancréas (référence : CA 19-9) en tampon carbonate 0,1M pH 9 est mélangé à température ambiante avec un excès molaire de 17 pour 1 de sulfoindodicarbocyanine de structure 1. Au bout de deux heures, l'échantillon est purifié par filtration sur gel Séphadex t)G25. Le rapport molaire cyanine/anticorps final est de 3,90. On observe des raies en UV à 650 et 605 nm. Le rapport DO65DO605 est de 1,62. L'apparition de la raie à 605 nm est signe d'une agrégation et d'un quenching de la molécule fluorescente. Conjugué N 2 On prépare une solution tampon carbonate 0,1 M pH 9 dans laquelle on dissout 40 % (m/v) d'hydroxypropyl-ss-cyclodextrine. L'anticorps utilisé dans la préparation du conjugué ne 1 est dialysé dans ce tampon, auquel on ajoute une solution de sulfoindodicarbocyanine de structure 1. Le rapport molaire initial cyanine/anticorps est de 17 pour 1. Au bout de deux heures, l'échantillon est purifié sur gel Séphadex # G25. On analyse par UV. On observe des raies à 650 et 605 nm. On obtient un rapport molaire final cyanine/anticorps de 5,89 et un rapport D065dD0605 de 3,18. Cet exemple montre bien que l'utilisation du complexe cyaninecyclodextrine a permis d'éviter le phénomène d'agrégation constaté pour le conjugué N 1. Conjugué N 3 Un anticorps anti-PSA (antigène spécifique de la prostate, de l'anglais "Prostate Specific Antigen", référence : PSA) est dialysé dans du tampon carbonate 0,1 MpH9. La solution à 0,85 mg/ml en anticorps est mise en contact avec la sulfoindodicarbocyanine de structure 1. Le rapport molaire initial cyanine/ anticorps est de 15 pour 1. Deux heures après, on purifie sur gel Séphadex (l G25. Le produit est analysé par UV. On observe des raies à 650 et 605 nm. On obtient un rapport molaire final cyanine/anticorps de 4,54 et un rapport DO650/DO605 de 1,40. Conjugué N 4 On proccde comme décrit pour ltobtention du conjugué n 3, excepté qu'on rajoute 15 % (m/v) d'hydroxypropyl-ss-cyclodcxtrine dans le tampon carbonate 0,1 M pH 9. Le conjugué analysé cn UV donne les résultats suivants DO65qt0605 = 2,60 Rapport molaire final cyanine/anticorps = 0,96 En comparant au conjugué N 3 on note une forte augmentation du rapport DO65qtO605. Cela traduit une réduction importante de l'agrégation et un quenching sensiblement diminué. 2/ Influence de la nature de la cyclodextrine Différentes cyclodextrines (conjugués 5 à 8) sont testées afin d'apprécier l'influence de la nature de la cyclodextrine sur l'apparition de la raie parasite à 605 nm. Un conjugué témoin (conjugué N-9) ne contenant pas de cyclodextrine est ainsi testé à titre de comparaison. Les conjugués sont obtenus en suivant le mode opératoire décrit pour l'obtention du conjugué n 2, en appliquant les conditions expérimentales suivantes: nature de l'anticorps : anticorps anti-PSA concentration de l'anticorps : 0,75 mg/ml concentration de la cyclodextrine dans le tampon carbonate 0,1 M pH 9 13 % (m/v) rapport molaire initial cyanine/anticorps:17 pour 1 temps d'incubation : 2 h Après deux heures, la cyanine libre est épuisée sur cône amicon par centrifugation pendant 5 min. à 4000 g. On purifie ensuite sur gel Séphadex # G25. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1: Tableau 1 conjugue N'5 conjugué N06 conjugué N'7 conjugue N'8 conjugue N'9 hydroxypropyl- hydroxypropyl- hydroxypropyl- diméthyl-ss- a-cyclodextrine y-cyclodextrine ss-cyclodextrine cyclodextrine rapport molaire 1,8 1,8 1,2 2,0 2,6 final cyanine/ anticorps D0650/DO6OS 1,9 2,0 2,6 2,55 1,45 Les fortes valeurs du rapport DO650/DO605 (2,6 et 2,55) obtenues avec les deux ss-cyclodextrines montrent leur capacité à desagréger la cyanine de structure 1. Ces valeurs sont aussi le reflet de constantes dc stabilité élevées. 3/Influence de la concentration de couplage les concentrations sont un élément important dans les phénomènes d'agrégation. Différentes concentrations en anticorps sont donc testées. Les conjugués sont obtenus en suivant le mode opératoire décrit pour l'obtention du conjugué ne 2, en appliquant les conditions expérimentales suivantes: nature de l'anticorps : anticorps anti-PSA rapport molaire initial cyanine/anticorps: 17 pour 1 temps de couplage : 2h nature de la cyclodextrine : diméthyl-ss-cyclodextrine concentration en cyclodextrine dans le tampon carbonate 0,1 M pH 9 13%(m/v) Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 2. Tableau 2 Conjugué N 10 Conjugué N 11 Conjugué N 12 concentration en anticorps m mI 0,75 1,5 3,0 rapport molaire final cyanine/anticorps 1,2 1,8 2,3 DO650/DO605 2,7 2,6 2,45 Avec une concentration de 3 mg/ml on obtient un rapport molaire final cyanine/anticorps élevé (2,3) avec un bon rapport DO650/DO605 (2,45). Ces valeurs sont à comparer à celles du Tableau 1 dans lequel un rapport molaire final cyanine/anticorps de 2,6 est associé à un rapport D06501DO605 faible (1,45). Le procédé selon l'invention permet donc d'augmenter le rapport molaire final cyanine/anticorps tout cn conservant un bon rapport DO650/DO605. Cela n'est pas possible sans l'utilisation dc cyclodcxtrines. 4/Influence de la concentration en cvclodcxtrine Les conjugués sont obtenus cn suivant le mode opératoire décrit pour l'obtention du conjugué n 2, en appliquant les conditions expérimentales suivantes: nature de l'anticorps : anticorps anti-TSH (hormone thyréotrope, de l'anglais "Thyroid-Stimulating Hormonc", référence : TSH) rapport molaire initial cyanine (de structure 2)/anticorps:17 pour 1 temps de couplagc :1 h nature de la cyclodextrine : hydroxypropyl-B-cyclodextrine Après épuisement sur cône amicon, le conjugué est purifié sur gel Séphadex # G25. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 3. Tableau 3 Conjugué N 13 Conjugué N 14 Conjugué N 15 concentration en cyclodextrine (m/v) 5 % 14 % 32 % rapport molaire final cyanine/anticorps 3,9 2,74 2,45 DO650/D0605 1,7 2,2 2,6 On voit nettement dans le Tableau 3, l'influence du pourcentage de cyclodextrine. La loi d'action de masse est déplacée dans le sens de formation du complexe par augmentation de la concentration de cyclodextrine. EXEMPLE 2: Performances de fluorescence des conjugués L'analyte choisi est le PSA. Les mesures sont effectuées sur un fluorimètre LS50 de PERKIN-ELMER (kmax d'émission = 660 nm). Deux milieux sont testées - milieu 1: tampon phosphatc 0,1 M pH 7 - milieu 2 : milieu 1 + 1/3 sérum veau nouveau né Le conjugué N 16 a été fabriqué selon le mode opératoire décrit pour l'obtention du conjugué n 2. Les conjugués N 17 et 18 ont été fabriqués selon le mode opératoire décrit pour l'obtention du conjugué n 1 mais avec des concentrations d'anticorps respectivement de 0,1 et 0,3 mg/ml. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 4. TABLEAU 4 unités de fluorescence (a) milieu 1 milieu 2 rapport molaire excitation excitation excitation excitation final DO650/ 600 nm 650 nm 600nm 650 nm cyanine/anticorps DO605 Conjugué n 16 1 1 0,97 1,1 0,85 2,94 Conjugué n 17 0,12 0,26 0,13 0,28 1,0 2,5 Conjugué n 18 0,4 0,69 0,44 0,74 3,0 2,0 (a)les unités de fluorescence sont exprimées: -par unité de densité optique -en relatif par rapport au conjugué N 16 dans le milieu 1. L'examen du tableau 4 montre tout l'intérêt du procédé conforme à l'invention: - dans tous les cas le conjugué fabriqué avec le complexe cyanine + cyclodextrine (conjugué N0 16) est supérieur en fluorescence aux conjugués fabriqués avec la cyanine sans cyclodextrine (conjugués N- 17 et 18). - il n'y a pas en présence de sérum de quenching des conjugués fabriqués. EXEMPLE 3 : Performance dans un immunoessai L'immunoessai est conduit selon la méthode homogène décrite par G. Mathis dans Clin. Chem., Vol 39, n 9, 1993. Les performances des conjugués 16, 17 et 18 ont comparées entre elles, en utilisant des échantillons standards à différentes concentrations d'antigène. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 5 Tableau 5 conjugué n 16 conjugué n 17 conjugué n 18 échantillon N0 1 113 67 86 0,53 ng/ml échantillon N0 2 380 1378 1885 5,3 ng/ml échantillon N0 3 4175 2289 3323 31 ng/ml Les grandeurs sont exprimées en unités dc fluorescence Ce tableau montre bien que le gain dc fluorescence observé sur le conjugué 16 par rapport aux conjugués 17 ct 18 (Tableau 4) se répercute également sur l'immunoessai. Les conjugués fabriqués avec une cyclodextrine permettent donc d'augmenter la sensibilité des dosages dans un immunocssai. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un conjugué fluorescent entre une molécule porteuse possédant au moins un groupement amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl et un réactif fluorophore possédant au moins un groupement fonctionnel susceptible de réagir avec le(s)dit(s) groupe(s) amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl, qui consiste à mettre en présence ladite molécule porteuse et ledit réactif fluorophore avec une solution aqueuse d'un macrocycle soluble dans l'eau contenant de 1 à 40 % (m/v) dudit macrocycle. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le macrocycle soluble dans l'eau est choisi parmi une cyclodextrine éventuellement substituée ou un calixarène substitué par des groupements hydrophiles. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le macrocycle soluble dans l'eau est une cyclodextrine choisie parmi l'a-cyclodextrine, la ss-cyclodextrine, la y-cyclodcxtrine, lthydroxypropyl-a-cyelodextrine, l'hydroxypropyl-ss-cyclodextrine, lthydroxypropyl-y-eyelodextrine, l'hydroxyéthyl-&alpha;-cyclodextrine, l'hydroxyéthyl-ss-cyclodextrine, l'hydroxyéthyl-y-cyclodextrine, ou la 2,6-di-O-méthyl-heptakis-ss-cyclodextrine. 4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le macrocycle soluble dans l'eau est un calixarène de structure dans laquelle: - Ra et Rb représentent chacun un groupement hydrophile choisi parmi H, (CH2)pCO2H, (CH2)pOH, (CH2)pNH2, (CH2)pSO3H ou (CH2)pN+RcRdRe; - Rcs Rd et Re représentent chacun l'hydrogène ou un (C1-C3)alkyle; - p varie de 0 à 4 pour Rb et de 1 à 4 pour Ra; et -tvariede 1à5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la solution aqueuse de macrocycle contient de 10 à 40 % (m/v) de macrocycle. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le réactif fluorophore est un chromophorc à un ou plusieurs noyaux aromatiques possédant un coefficient d'extinction moléculaire élevé. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le réactif fluorophore est choisi parmi * une cyanine de structure * une hémicyanine de structure * une mérocyanine de structure * un styryl de structure * une rhodamine de structure: * une fluorescéine de structure * une naphtofluorescéine de structure: dans lesquelles structures - les lignes en pointillé représentent chacune les atomes de carbone nécessaires pour former 1 à 3 cycles fusionnés, les groupes R3, R4, R5, R6, R8 et Rg étant attachés à ces cycles; - X et Y représentent chacun O,S ou C(CH3)2 - m vaut 1,2,3 ou 4; - au moins un des groupes R1 à R7 est capable de réagir avec un groupement amino, hydroxy, carboxy et/ou sulfhydryl et est choisi parmi -(CH2)nNCS ; -(CH2)nNCO -(CH2)n-S-S-Ar ; -(CH2)n-NH-Ar ; -(CH2)n-N3 ; -(CH2)n-NH2 ou -(CH2)n-SH où n varie de 0 à 8 et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène, ceux des groupes R1 à R7 ne représentant pas une des entités réactives ci-dcssus étant choisis parmi l'hydrogène ou un groupc -(CH2)r-Z dans Icqucl r varie dc 0 à 4 et Z représente un groupe CH3, SO3H, OH ou N+R1R2R3 dans lequel R1, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus, et au moins un des groupes R8 et R9 représente un groupe SO3- ou SO3H, l'autre groupe représentant l'hydrogène ou un groupe SO3- ou SO3H. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le réactif fluorophore est une cyanine de structure dans laquelle R1, R2, R3, R4, R7, R8 et Rg sont tels que définis dans la revendication 7. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel X et Y représentent chacun un groupe C(CH3)2 dans la structure de la cyanine. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel dans la structure de la cyanine, - R1 et R2 représentent chacun un groupe - R3, R4 et R7 représentent chacun l'hydrogène; - R8 et Rg représentent chacun un groupe S03- ; et - m est égal à 2. 11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel dans la structure de la cyanine, - R1 représente un groupe - R2 représente un éthyl - R3, R4 et R7 représentent chacun l'hydrogène - R8 et Rg représentent chacun un groupe SO3-; ct -mestégalà2. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la molécule porteuse est un anticorps, un antigène, une protéine, un peptide, un haptène, une lectine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un médicament, un polymère, une particule polymérique, du verre, une particule de verre ou une surface en verre ou en polymère. 13. Conjugué fluorescent, obtenu par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14. Conjugué fluorescent selon la revendication 13, issu de l'accrochage du complexe d'inclusion formé par le macrocycle soluble dans l'eau et le réactif fluorophore sur la molécule porteuse. 15. Conjugué fluorescent selon la revendication 14, dans lequel le complexe d'inclusion subsiste dans la structure finale du conjugué et forme un rotaxane stable. 16. Conjugué fluorescent selon la revendication 13, issu de l'accrochage du complexe d'inclusion formé par le macrocycle soluble dans l'eau et la molécule porteuse sur le réactif fluorophore. 17. Conjugué fluorescent selon la revendication 16, dans lequel le complexe d'inclusion subsiste dans la structure finale du conjugué et forme un rotaxane stable. 18. Utilisation d'un conjugué fluorescent selon l'une quelconque des revendications 13 à 17 comme traceur fluorescent. 19. Utilisation selon la revendication 18, pour la détection et/ou la détermination par fluorescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir. 20. Utilisation selon la revendication 18, en microscopie de fluorescence ou en cytométrie de flux.