Brevet FR2748477A1 — publié le 19971114

La présente invention a pour objet des protéines d'Hélicohacter pylori nouvellement obtenues sous forme substantiellement purifiées. ainsi que les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. H. pylori est une bactérie à gram négatif retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères, Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori. Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à H. pylori. Un tel vaccin serait très probablement de nature sous-unitaire. Différentes protéines d'H pylori ont été caractérisées ou isolées à ce jour. Il s'agit notamment de l'uréase, composée de deux sous-unités A et B de 30 et 67 kD respectivement ; de la cytotoxine vacuolaire de 87 kD (VacA) ; d'un antigène immunodominant de 128 kD associé à la cytotoxine, des heat shock protéines HspA et HspB de 13 et 58 kD respectivement d'une catalase de 54 kD , d'une hémaglutinine fibrillaire (HpaA) de 2OkD d'une protéine de 15 kD riche en histidine (han); ; d'une protéine de la membrane exteme de 30 kD ; ainsi que d'une famille de porines HopA, HopB, HopC et HopD, de poids moléculaires compris entre 48 et 67 kD. Certaines de ces protéines ont déjà été proposées comme antigènes vaccinaux potentiels. Il reste que la recherche de nouveaux antigènes doit être poursuivie, notamment dans la mesure où l'on prévoit que, pour obtenir un effet vaccinal optimisé, plusieurs antigènes devront être vraisemblablement incorporés dans un vaccin. C'est pourquoi l'invention a pour objet une protéine d'H. pylori sous forme substantiellement purifiée, susceptible d'être obtenue à partir d'une fraction membranaire d'H. pylori, et dont le poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrlamide 10% en présence de SDS, apparaît de l'ordre de 76, 54. 50 ou 30 kD. Lorsque la protéine a un poids moléculaire d'environ 54 kD on précise en outre qu'elle ne réagit pas avec un ante sérum anti-catalase. Un antisérum anti-catalase d'H. pu,lori peut être notamment préparé selon le procédé d'immunisation décrit dans l'Exemple 5 ci-après, en utilisant une préparation de catalase obtenue par chromatographie, tel que décrit dans l'Exemple 6. Par "forme substantiellement purifiée", on entend une préparation notamment dépourvue des protéines cytoplasmiques et périplasmiques d'H pylori. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 76 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl ss-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un surnageant que l'on soumet à dialyse contre du PBS 75 mM pH 7,2, suivie d'une centrifugation; (iii) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (iv) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI 0,1 - 0,5 M, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (v) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,25 - 0,35 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse de cations sur colonne de S-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M, avantageusement en tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 0,25 - 0,35 M est d'abord dialysée contre du tampon acétate pH 5 à 0,1 % de zwittergent 3-14); et (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,15 - 0,2 M. La protéine membranaire de 76 kD a pour fonction biologique présumée d'être une porine, vraisemblablement située au niveau de la membrane externe. Exner et al, Infect. Immun. (Apr.1995) 63 . 1567 caractérise une famille de porines qui chacunes présentent en electrophorése de SDS-Page, un profil de migration différent selon qu'elles ont été chauffées 9 950C (procédé conventionnel) ou non. Tel n'est pas le cas pour ce qui concerne la protéine de 76 kD selon l'invention ; en effet sa migration sur gel n'est pas modifiée avec un échantillon chauffé à 60 C et non à 950C. La séquence N-terminale de la protéine de 76 kD est comme suit (code une lettre) EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 54 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylon par du n-octyl J3-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCl 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en NaCI 1M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI I M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HCI pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse. la fraction en NaCI 1 M est d'abord dialysée contre du tampon Tris-HCI pi-i 75 à 0,1 % de zwittergent 3- 14); et (vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,1 - 0,25 M. La proteine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 50 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl f3-D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation; (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation; (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14, suivi d'un lavage en NaCI 1 M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI I M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est d'abord dialysée contre du tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3 14) ; et (vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,3 - 0,4 M. La protéine membranaire dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 30 kD est susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel: (i) on procède à une extraction des bactéries H pylori par du n-octyl -D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation; (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysos > 'me et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCl 20mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, avantageusement en tampon carbonate pH 9,5 contenant 5 % de zwittergent 3-14 (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement dans un tampon carbonate pH 9,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (vi) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,28 - 0,35M, que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5M, avantageusement en tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3-14 (de manière avantageuse, la fraction en NaCI 1 M est d'abord dialysée contre du tampon Tris-HC1 pH 7,5 à 0,1 % de zwittergent 3 14); et (vii) on récupère la fraction correspondant à l'élut direct (absence de NaCI). Les protéines de 54, 50 et 30 kD selon l'invention sont vraisemblablement des protéines membranaires intrinsèques. La protéine de 54 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase, ni en western blot, ni en dot blot. La protéine de 30 kD ne réagit pas avec des anticorps anti-sous unité A de l'uréase, ni en western blot, ni en dot blot. Selon un mode particulier, les protéines selon l'invention peuvent être notamment obtenues par purification à partir d'H pylori ou exprimées par voie recombinante dans un système hétérologue. Dans ce dernier cas, les protéines peuvent présenter des modifications post traductionnelles qui ne soient pas identiques à celles des protéines correspondantes issues de la souche d'origine. L'invention a aussi pour objet une protéine i.a. d'H. pilori ou un polypeptide sous forme substantiellement purifiée, qui est capable d'être reconnu par un antisérum ou d'un anticorps monoclonal établi à l'encontre d'une des protéines précédemment décrites. Pour ce qui concerne les polypeptides, il s'agit notamment de polypeptides dérivés d'une protéine selon l'invention par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, e.g. par délétion. Enfin l'invention concerne également une composition pharmaceutique notamment destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon l'invention ; I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique ; I'usage d'une protéine ou un polypeptide selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori ; ainsi q'une méthode de prévention ou de traitement d'une infection à H. pylori, selon laquelle on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une protéine ou d'un polypeptide selon l'invention Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration. De manière plus détaillée, on propose à titre d'exemple, d'administrer une protéine ou un polypeptide selon l'invention par voie orale. A cet effet, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être encapsulée seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Black et al, De. Biol. Stand. (1983) 53). La protéine peut également etre encapsulée dans des microsphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole décrit aillcurs (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immuno. (1989) 146 59-66) la protéine peut également être incluse dans des liposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes : a practical approach, Ed. RRC New, D. Rickwood & B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1). Indépendamment de la formulation, la quantité de protéine administrée à l'homme par voie orale est de l'ordre de 1 à 10 mg par prise, et l'on préconise au moins 3 prises à intervalle de 4 semaines. Alternativement, une protéine ou un polypeptide selon l'invention peut être administré par voie parentérale. Pour ce faire, une protéine ou un polypeptide selon l'invention est adsorbée sur gel d'alumine de façon tout à fait conventionnelle. La protéine en solution à 1 mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,5 est mise en contact pendant I heure avec de l'hydroxyde d'aluminium à 10 mg/ml mesuré à Au"'. La composition finale de la préparation est la suivante : protéine à activité catalasique 50 ug/ml, Au+*+250 pg/ml, merthiolate 1/10 000, le tout en PBS. Comme dans le cas de l'administration orale, 3 injections sont préconisées chacune espacée de 4 semaines de la précédente. L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes La Figure 1 est un schéma récapitulatif du protocole de préparation des fractions membranaires I, II et III dtfI. pylori. La Figure 2 présente l'analyse des fractions membranaires I, II et III par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie. Les échantillons déposées sont : la fraction membranaire I (colonne 2), la fraction membranaire II (colonne 3), la fraction membranaire III (colonne 4) et les marqueurs de poids moléculaire (colonne 1). La Figure 3 présente l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, des protéines purifiées à partir d'un gel préparatif (colonnes 3 à 7). Les échantillons déposés sont : la fraction HpPI (colonne 3), la fraction llpP2 (colonne 4), la fraction HpP4 (colonne 5). la fraction HpP5 (colonne 6), la fraction HpP6 (colonne 7), les marqueurs de poids moléculaire (colonnes I et 8) et la fraction membranaire I (colonne 2). La Figure 4 présente l'analyse des fractions issues du passage sur DEAE Sépharose, des fractions 7 et 9 (obtenues après elution sur Q Sépharose). Les fractions ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrwlamide 10% ou 12,5% et colorées au bleu de Coomassie. Les échantillons déposés sont : la fraction 7 (colonne 2A). la fraction 7.1 (colonne 3A), la fraction 7.2 (colonne 4A), la fraction 9 (colonne 2B), la fraction 9. 1 (colonne 3B), la fraction 9.2 (colonne 4B), la fraction 9.3 (colonne 5B) et les marqueurs de poids moléculaire (kDa) (colonne 1A et 1B). La Figure 5 présente, après électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% et coloration au bleu de Coomassie, le profil électrophorétique de la fraction D issue de la chromatographie sur colonne de Q-Sépharose de la fraction membranaire III (colonne 3) et de la fraction D'issue de la chromatographie sur colonne de S-Sépharose de la fraction D (colonne 4). La colonne 1 correspond aux marqueurs de poids moléculaire et la colonne 2, à la fraction membranaire III. EXEMPLE 1 : Préparation des fractions membranaires 1A- Culture La souche H pylori ATCC 43579 est cultivée en milieu liquide dans un fermenteur de 10 1. Un congelat de germes en glycérol est utilisé pour ensemenser un flacon de 75 cm2 contenant du milieu dit "biphasique" (une phase solide en gélose Colombia contenant 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide en trypticase de soja contenant 20 % de sérum de veau foetal). Après 24 heures de culture dans des conditions microaérophiles, la phase liquide de cette culture est utilisée pour ensemenser plusieurs flacons de 75 cm2 en milieu biphasique en l'absence de sang de mouton. Après 24 heures de culture, la phase liqude permet d'ensemenser un biofermenteur de 2 1 en milieu liquide trypticase soja contenant de la bêta cyclodextrine à 10 g/l. Cette culture à DO 1,5-1,8 est inoculée dans un fermenteur de 10 I en milieu liquide. Après 94 heures de culture. les bactéries sont récoltées par centrifugation à 4000 x g pendant 30 minutes à 4 C. Une culture de 10 litres de H pylori ATCC 43579 en fermenteur sous atmosphère microaérophile permet d'obtenir environ 20 à 30 g (poids humide) de bactéries. 1B - Extraction par le n octal p-D glucopyranoside (OG) Le culot de germes obtenu précédemment est lavé avec 500 ml de PBS (Phosphate buffer saline ; NaCI 7,650 g, phosphate disodique 0,724 g phosphate monopotassique 0,210 g pour un litre ; pH 7,2) par litre de culture. Puis les germes sont à nouveau centrifugés dans les mêmes conditions. Le culot bactérien obtenu (C1) est remis en suspension dans une solution d'OG (Sigma) à 1 % (30 ml/litre de culture). La suspension bactérienne est incubée pendant I heure à température ambiante sous agitation magnétique, puis centrifugée à 17 600 x g pendant 30 minutes à 4OC. Le culot (C2) est conservé pour être traité par la suite. Le surnageant (S2) obtenu est dialysé (MWCO= 10 000 Da, Spectra/por) pendant une nuit à 40C sous agitation magnétique contre 2 fois I litre de PBS dilué au 1/2. Le précipité formé au cours de la dialyse est récupéré par centrifugation à 2 600 x g pendant 30 minutes à 40C. Le surnageant (S2d) est éliminé et le culot (Cs2d) qui contient des protéines de membrane externe, est conservé à -20 C. 1C - Cassage des germes Le culot (C2) obtenu après centrifugation des germes traités par l'OG est remis en suspension dans du tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 et Pefabloc 100 I1M (tampon A) puis homogénéisé à l'aide de l'ultra-turrax (3821, Janke & Kungel). L'homogénat obtenu est mis en présence de lysosyme (0,1 mg/ml final) et d'EDTA (lmM final). L'homogénat est soniqué 3 fois 2 minutes à 40C (+ sonde=0,5 cm, puissance=20%, Sonifier 450 Branson), puis ultracentrifugé à 210 000 x g pendant 30 minutes à 40C. Le surnageant (S3) qui contient des protéines cytoplasmiques et périplasmiques, est éliminé, alors que le culot (C3) est récupéré. lavé en tampon A puis ultracentrifugé à 210 000 x g pendant 30 minutes à 4"C. Après élimination du surnageant (S4), le culot (C.4) est conservé à -200C. Ce culot contient des protéines intrinsèques et périphériques. La procédure peut être poursuivie par un double lavage du culot C4 pour éliminer les protéines membranaires périphériques. Le culot C4 est remis en suspension dans du tampon NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc et 100 pM (tampon B). La suspension est ultracentrifugée à 210 000 x g pendant 30 minutes à 40C. Le surnageant (Sy) est éliminé puis le culot (Cg) est lavé et ultracentrifugé dans les memes conditions que précédemment. Après élimination du surnageant (S6), le culot (C6) qui contient essentiellement des protéines membranaires intrinsèques, est conservé à -20 C. Les fractions C4, C6 et CS2d sont appelées par la suite respectivement fractions membranaires I, II et III. 1D - Analyse des fractions membranaires Les différentes fractions membranaires sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Les protéines sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie. Si on considère les protéines majeures de chaque fraction, les profils SDS PAGE (Figure 2) montrent que la fraction membranaire I est très proche de la fraction membranaire II. Par contre ces deux dernières différent sensiblement de la fraction membranaire III. Le profil de la fraction membranaire I présente 7 bandes protéiques majeures de poids moléculaires respectifs 87, 76, 67, 54, 50, 47 et 35 kDa (colonne 2). Par western blot en présence d'anticorps anti-ureB ou d'anticorps anti-catalase, on a montré que la bande à 67 kDa correspondait à la sous-unité B de l'uréase et la bande à 54 kD correspondait à la catalase. Ces deux protéines ne se retrouvent pas dans le profil de la fraction II (colonne 3) puisque le lavage en tampon carbonate élimine les protéines faiblement associées à la membrane. Quant au profil protéique de la fraction membranaire III, il montre la présence de 4 bandes majeures à 76, 67, 50 et 30 kDa (colonne 4). EXEMPLE 2 : Purification des protéines de la fraction membranaire I par SDS-PAGE préparative Une électrophorèse est réalisée sur gel de polyacrylamide selon la méthode de Laemmli (1970) avec un gel de concentration de 5% et un gel de séparation de 10%. La fraction membranaire est remise en suspension dans du tampon A, puis diluée au demi dans le tampon échantillon 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95"C. Environ 19 mg de protéines sont déposés sur un gel de dimension 16 x 12 cm et d'épaisseur 5 mm. Une prémigration est effectuée à 50 V pendant 2 heures, suivie d'une migration à 65 V pendant la nuit. La coloration du gel au bleu de Coomassie R250 (0.05 X0 dans de l'eau ultrafiltrée) permet une bonne visualisation des bandes. Les bandes majeures HpPl, HpP2, HpP4, HpP5 et HpP6 sont découpées au scalpel et broyées à l'ultra-turrax en présence de 10 ou 20 ml de tampon d'extraction Tris-HC1 25 mM pH 8,8, urée 8 M, SDS 10%, phényl méthyl sulfonyl fluorique (PMSF) 100 pLM et Pefabloc 100 I1M (tampon C). Chaque broyat est filtré sur un préfiltre Millipore AP20 (filtre = 4,7 cm, 4)pore = 20 ,um) à l'aide d'un extrudeur à une pression de 7 bars, à température ambiante. Chaque broyat est lavé avec 5 à 10 ml de tampon C et filtré comme précédemment. Les deux filtrats obtenus à partir de chaque broyat correspondant sont rassemblés. Chaque filtrat est précipité avec 3 volumes d'un mélange 50 : 50 méthanol 75% et isopropanol 75%, puis ultracentrifugé à 240 000 x g pendant 16 heures à 10"C sur rotor 70 TFT (J8-55, Beckman). Chaque culot est repris par 2 ml de tampon de solubilisation NaP04 10 mM pH 7,0, NaCI I M, Sarkosyl 0,1%, PMSF 100 pM, Pefabloc 100 M et urée 6 M (tampon D). L'échantillon solubilisé est dialysé successivement contre 100 ml de tampon D à 4 M d'urée et 0,1% de Sarkosyl, contre 100 ml de tampon D à 2 M d'urée et 0,5% de Sarkosyl et contre 2 fois 100 ml de tampon D sans urée et à 0,5% de Sarkosyl. La dialyse est effectuée pendant I heure sous agitation magnétique à température ambiante. Le dialysat final est incubé pendant 30 minutes dans un bain de glace, puis centrifugé à faible vitesse pendant 10 minutes à 40C (Biofuge A, Heraeus Sepatech). Le surnageant est récupéré, filtré sur filtre Millipore à 0,45 llm et conservé à -20 C. Une analyse SDS-PAGE a été réalisée pour chaque fraction (Figure 3). L'analyse du profil électrophorétique de chaque fraction montre que les fractions HpPl, HpP2 et HpP4 sont pures avec une seule bande sur gel pour chacune de ces fractions (respectivement à 87, 76 et 54 i EXEMPLE 3 Purification des protéines membranaires de 30, 50 et 54 kD à partir de la fraction membranaire I 3A - Chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose Une colonne de Q Sépharose de 40 ml (+=2,5 cm, h=8 cm) est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 CIM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie a été suivie par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne. Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire I préalablement solubilisée sont déposées sur la colonne qui est ensuite lavée avec le tampon d'équilibre (NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100C1M et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un gradient de 0,1 à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois VT) suivi d'un lavage en tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1 M de NaCI (2 fois VT). Les fractions collectées sont analysées par SDS-PAGE et rassemblées en différents pools selon leur profil électrophorétique, puis conservées à -20 C. Les fractions sont comme suit fractions élution fractions élution 1 éluat direct 6 NaCI 0,25-0,28M 2 lavage 7 0,28-0,35M tamp.équilibre 3 NaCI O -O, 1M 8 NaCI 0,35-0,5M 4 NaCI O,i-O,2M 9 début lavage NaCI I M 5 NaCI 0,2-0, 25M 10 fin lavage NaCI 1M Le bilan protéique montre que 53% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI O-O,SM, 14% des protéines ne se sont pas fixées sur la colonne et 33% des protéines sont éluées au cours du lavage en NaCI 1M positivement à pH 7,5, alors que les protéines éluées en 1M NaCI correspondent à des protéines acides fortement chargées à ce pH. La purification des fractions 7 et 9 est poursuivie comme suit. 3B- Séparation des protéines des fractions 7 et 9 par chromatographie échangeuse d'anions sur DEAE Sépharose Une colonne de DEAE Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (+=1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/mi de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon Tris-HC1 50 mM pH 7,5, Pefabloc 100 pLM et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La chromatographie est suivie comme précédemment par une détection UV à 280nm à la sortie de la colonne. La fraction 7 dialysée au préalable contre le tampon d'équilibre (Tris-HC1 50 mM pH 7,5, Pefabloc 100 HM et Zwittergent 3-14 0,1%) contenant 10 mg de protéines, est déposée sur la colonne de DEAE Sépharose. La colonne est lavée en tampon d'équilibre jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Les protéines sont éluées par un gradient de O à 0,5 M de NaCI dans le tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage en tampon d'équilibre contenant 1 M de NaCI (2 fois x VT). Les fractions collectées sont analysées par SDS-PAGE, puis rassemblées en différents pools selon leur profil protéique et conservées à -20 C. Par SDS-PAGE, on montre que la fraction 7.1 (éluat direct) est d'intérêt. Une purification identique est reconduite avec la fraction 9 contenant 3 1 mg de protéines. Par SDS-PAGE on montre que les fractions 9.1, 9.2 et 9.3 respectivement éluées à 0,1 -0,25 M NaCI, 0,3 -0,4 M NaCI et 1 M NaCI sont d'intérêt. Pour la fraction 7 (Figure 4A), les résultats obtenus montrent que seulement une protéine de 30 kDa (colonne 3 ; fraction 7.1) a été enrichie et partiellement séparée après passage sur la colonne de DEAE Sépharose, les autres protéines n'ont pas été séparées. Pour la fraction 9 (Figure 4B). les profils electrophorétiques montrent que deux protéines de 54 et 15 kDa (colonnes 3 et 5 fractions 9.1 et 9.3) ont été séparées et une protéine de 50 kD a été enrichie (colonne 4 , fraction 9.2). La protéine de 54 kD de la fraction 9.1 ne réagit pas avec des anticorps anti-catalase. EXEMPLE 4 : Purification de la protéine membranaire de 76 kD à partir de la fraction membranaire III 4A - Séparation des protéines de la fraction membranaire III sur la colonne Q Sépharose Cent quarante mg de protéines de la fraction membranaire III préalablement solubilisée ont été déposées sur une colonne Q Sépharose préparée comme précédemment en 3A. Après que la colonne ait été lavée avec le tampon d'équilibre (NaC03 50 mM pH 9,5, Pefabloc 100 IlM et Zwittergent 3-14 0,1%) jusqu'au retour à la ligne de base, un lavage avec NaCI 0,1M en tampon d'équilibre a été réalisé jusqu'au retour à la ligne de base (fraction A), suivi d'un gradient de NaCI de 0,1 à 0,5 M en tampon d'équilibre (fractions B, C, D et E), puis d'un lavage avec NaCI 1M en tampon d'équilibre (fraction F). Les résultats sont représentés dans le tableau ci dessous. fractions élution protéines totales (mg) A lavage eNaClO,lM 18 B NaCI 0,1-0,2M 14 C NaCI 0,25M 10 D NaCI 0,25-0,35M 27 E NaCI 0,35-0,45M 26 F lavage NaCI 1M 20 Le bilan protéique nous montre que 55% des protéines sont éluées au cours du gradient de NaCI 0,1-0,5M, 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 0,1M et 15% sont éluées au cours du lavage avec NaCI 1 M. Les profils SDS-PAGE de chacune des fractions obtenues après passage de la fraction membranaire III sur la colonne Q Sépharose, sont différents. De plus, certaines protéines sont enrichies par rapport à la fraction membranaire III de départ. On observe notamment un enrichissement de la protéine de 76 kDa sur le profil correspondant à la fraction D dont la purification est poursuivie comme suit. 4B - Purification sur colonne S Sépharose, de la protéine de 76 kDa à partir de la fraction D obtenue sur colonne Q Sépharose Une colonne de S Sépharose est préparée selon les indications du fabricant (Pharmacia) pour un volume de gel d'environ 10 ml (4)1,5 cm, h=5 cm) (maximal 10 mg protéine/ml de gel). La colonne est lavée, puis équilibrée avec le tampon acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 I1M et Zwittergent 3-14 à 0,1%. La fraction D dialysée préalablement contre le tampon d'équilibre (acétate 50 mM pH 5,0, Pefabloc 100 I1M et Zwittergent 3-14 0,1%) est déposée sur la colonne de S Sépharose. La colonne est ensuite lavée avec le même tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm soit stabilisée. Environ 3 volumes de colonne sont nécessaires pour le retour à la ligne de base. Les protéines sont éluées par un gradient de O à 0,5 M de NaCI en tampon d'équilibre (10 fois VT), suivi d'un lavage avec le tampon d'équilibre contenant 0,5 et 1M de NaCI (4 fois VT). Les fractions collectées sont analysées, rassemblées et conservées comme précédemment. La fraction D' sortant au cours du gradient NaCI 0-0,5M, entre 0.15 et 0,20 M NaCI a été récupérée. Sur cette fraction, une analyse par SDS-PAGE et par western blot est effectuée. Les résultats sont représentés à la Figure 5. Ces résultats montrent qu'après deux colonnes échangeuses d'ions, la protéine de 76 kDa est enrichie ; mais elle demeure contaminée avec une protéine de 54 kDa et une protéine de 67 kDa (colonne 4). La protéine de 54 kDa ne réagit pas avec les anticorps anti-catalase, par conséquent elle ne correspond donc pas à la catalase, de même la protéine de 67 kDa ne réagissant pas avec l'anticorps anti-ureB en western blot, par conséquent elle ne correspond pas à la sous-unité B de l'uréase. L'analyse par western blot en présence d'un antisérum anti-76 kDa montre que les faibles bandes observées en dessous de la bande à 76 kDa correspondent à une dégradation de la protéine de 76 kDa, puisqu'elles réagissent faiblement avec cet ante sérum (colonne 7). EXEMPLE 5 : Préparation de sérums hnperimmuns à ltencontre des protéines membranaires de 76, 50 et 35 kD. Des sérums polyclonaux spécifiques des protéines membranaires majeures H. pilori sont obtenus par hyperimmunisation des lapins respectivement avec les antigènes purifiés par SDS-PAGE préparative HpP2, HpP5 et HpP6. La première injection JO (sous-cutanée multisites et intramusculaire) est effectuée avec une préparation contenant 50 g de protéine membranaire émulsionnée en adjuvant complet de Freund, puis les rappels J21 et J42 se font par injection de 25 pg de protéine membranaire en adjuvant incomplet de Freund. Les animaux sont sacrifiés à J60. Les sérums obtenus sont décomplémentés pendant 30 minutes à 56"C et stérilisés par filtration sur membrane de porosité 0,22 pm (Millipore). L'antisérum anti-HpP2 réagit avec la protéine de 76ltD telle qu'isolée selon l'Exemple 4, tandis que I'antisérum anti- HpP5 réagit avec la protéine de 5OkD isolée dans la fraction 9.2 obtenue dans l'Exemple 3. Bien evidemment, le protocole d'immunisation décrit ci-avant peut être utilisé de manière similaire pour produire des antisérums à l'encontre de chacune des protéines purifiées aux Exemples 3 et 4. Les préparations obtenues dans ces exemples pourront être avantageusement soumises à une electrophorêse préparative sur gel de SDS-PAGE. Les bandes protéiques seront traitées comme précédemment afin d'obtenir une préparation destinée à l'immunisation. EXEMPLE 6 : Purification d'une catalase à partir d'lI. pylori Une culture est réalisée comme décrit dans l'Exemple 1A. Le culot bactérien lavé est remis en suspension dans du tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7,5 contenant du PMSF (phenylmethylsulionyl fluoride Sigma) 100 I1M (tampon A) à concentration finale de 0,1 g (poids humide) par millilitre. La suspension est homogénéisée à l'aide d'un mixeur de type Ultraturrax. Les cellules bactériennes sont ensuite cassées par sonication avec un appareil de type Sonifier (Branson) équipé d'une sonde de diamètre 1,8 cm. La sonication s'effectue par intermittence, 1 min de sonication et 1 min de repos sur glace. Une sonication de 10 min est suffisante pour casser complètement 5 g de germes en suspension. Le lysat ainsi obtenu est centrifugé pendant 15 min à 40C à 4 000 g. Le surnageant est récupéré puis, centrifugé à nouveau à 100 000 g pendant 30 min à 4"C. Le surnageant de cette deuxième centrifugation (S2) est récupéré pour une purification chromatographie. La fraction S2 préparée de cette façon conserve environ 90% de l'activité enzymatique "catalase" totale, telle que mesurée selon la technique de Hazell et al (supra) ou Beers & Sizer, J. Biol. Chem. (1952)195 :133. La fraction S2 est chargée sur une colonne S-Sépharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec du tampon A. La colonne est lavée avec le même tampon. La chromatographie est suivie avec un détecteur UV à 280 nm pour les protéines et par l'activité enzymatique pour la catalase. Après élimination des protéines non-fixées (I'absorption à 280 nrn revient à la ligne de base), la colonne est ensuite lavée avec un gradient de NaCI, O à 1M dans du tampon A. Les fractions correspondant au pic de l'activité catalase sont recueillies, concentrées dans une cellule de concentration de type Amicon équipée de membrane dont le seuil de coupure est de 100 000 Daltons. La fraction concentrée ainsi obtenue est chargé sur une colonne Séphacryl S-300 HR préalablement équilibrée avec du tampon PBS. Les fractions contenant de l'activité catalase sont recueillies, concentrées à 1 mg/ml et dialysées contre le tampon PBS. La solution finale est filtrée sur une membrane de porosité 0,22 urn et conservée à -700C. La protéine ainsi purifiée présente les caractéristiques suivantes: (i) Une activité enzymatique de catalase typique, en l'absence d'activité peroxydase. (ii) Un spectre visible typique d'une hémoprotéine, un pic de Soret à 406 nm et les pics d'alpha et de bêta entre 520 nm et 550 nm. (iii) Une forme monomerique à 54 kD en SDS-PAGE avec la séquence N-terminale suivante: MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG Revendications 1. Une protéine dont le poids moléculaire apparent est de l'ordre de 54 kD et qui ne réagit pas avec un antisérum anti-catalase, ladite protéine étant susceptible d'être obtenue par un procédé dans lequel (i) on procède à une extraction des bactéries H. pylori par du n-octyl -D glucopyranoside 1%, suivie d'une centrifugation (ii) on récupère un culot bactérien que l'on traite par du lysosyme et que l'on soumet à sonication, suivie d'une centrifugation (iii) on récupère un culot de centrifugation que l'on soumet à un lavage en tampon Tris HCI 20 mM pH 7,5, suivi d'une centrifugation (iv) on récupère la fraction membranaire constituée du culot de centrifugation que l'on resuspend en milieu aqueux, (v) on soumet la fraction membranaire à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Q-Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M, suivi d'un lavage en NaCI 1 M, (vi) on récupère la fraction éluée en début de lavage en NaCI 1 M que l'on soumet à une chromatographie échangeuse d'anions sur colonne de DEAE Sépharose en gradient de NaCI O - 0,5 M, et (vii) on récupère la fraction éluée en NaCI 0,1 - 0,25 M. 2. Une protéine ou un polypeptide sous forme substantiellement purifiée, qui est capable d'être reconnu par un antisérum établi à l'encontre d'une protéine selon la revendication 1. 3. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à H. pylori, qui comprend à titre de principe actif une protéine ou un polypeptide selon la revendication 1 ou 2.