Brevet FR2748483A1 — publié le 19971114

MOYENS POUR LA LUTTE OU LE DIAGNOSTIC D'UNE INFECTION PAR HIV L'invention a pour objet des moyens pour la lutte ou le diagnostic d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine, HIV, agent causal du sida. Dès 1984, plusieurs auteurs ont décrit la liaison de HIV au récepteur CD4 des lymphocytes T CD4+ et de macrophages (voir Dalgleish et al., 1984, Nature, 312, 763-767 et Klatzman et al., 1984, Nature, 312, 767-768). Cette liaison du virus au récepteur CD4 met en jeu la protéine d'enveloppe gpl20 qui présente une affinité élevée pour la molécule de CD4 (Lasky et al. 1987, Cell, 50, 975-985). D'autres récepteurs de la gap120, différents du CD4, ont été décrits, tels que le galactose-céramide sur les cellules nerveuses (Harouse et al, 1991, Science, 253, 320-323), ou le récepteur du complément CR (Montefiori et al, 1993, J. Virol. 67, 2699-2706). Des récepteurs secondaires différents de CD4 et de ceux déjà rapportés ont été mis en évidence par les inventeurs dans des expériences en ELISA et FACS réalisées sur des cellules vivantes En bloquant le récepteur CD4 avec des anticorps monoclonaux anti-CD4, les inventeurs ont constaté que la liaison de la gap120 à des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) et à des cellules CEM CD4+, vivantes ou adhérentes à des microplaques, n'était pas limitée au récepteur CD4, mais qu'il existait également une interaction avec un autre récepteur. Cette interaction a pu être démontrée en l'absence du sérum et pour certains rapports gpl20/cellule. Au contraire, en présence de sérum, une inhibition de l'interaction de la gp120 avec le récepteur secondaire de cellules entières a pu être observée, indiquant l'implication de facteurs sériques. Ainsi, en ELISA, il s'est avéré que la liaison de la gpl20 à des cellules cibles pouvait être pratiquement complètement empêchée par blocage préalable du récepteur CD4 avec un anticorps monoclonal anti-CD4, lorsqu'une pré-incubation avec la gp120 avait été réalisée, et la présence de sérum (10 % de sérum de veau foetal) maintenue pendant ltexpérience. En revanche, la liaison de la gpl20 aux cellules PBMC ou CEM n'a été que partiellement réduite (de 50 à 80 %) par le blocage de CD4 par l'anticorps anti-CD4, lorsque la gp120 a été pré-incubée avec BSA 3 % et que tout contact avec du sérum a été évité. Ces résultats montrent que la gap120 "résiduelle" doit être liée à des sites de liaison présents sur les cellules entières, différant de la région CDR2 de CD4. Ces sites sont désignés par les inventeurs "sites de liaison secondaires" ou encore "récepteurs inhibés par le sérum" (RIS en abrégé). Le phénomène évoqué ci-dessus est apparu encore plus prononcé avec les cellules CEM séchées, adhérentes à des microplaques, ayant des sites de liaison intracellulaires accessibles. La liaison de la gap120 aux sites de liaison secondaires augmente également lorsque les cellules sont perméabilisées avec du paraformaldéhyde. L'analyse FACS confirme l'existence de sites de liaison secondaires sur la membrane cellulaire externe des cellules CEM vivantes. La présence simultanée de CD4 et des récepteurs secondaires, mais dans des régions distinctes, a été démontrée par double marquage de cellules CEM pour CD4 et gap120, dans des conditions où le récepteur CD4 était totalement bloqué. La présence des sites de liaison secondaires a été révélée sur plus de 95 % des cellules. De même, les inventeurs ont identifié deux sites de liaison différents sur la gp120. En utilisant de l'iode, il a été ainsi constaté que l'activité de liaison de la gap120 au CD4 pouvait être complètement supprimée alors que l'activité de liaison aux récepteurs inhibés par le sérum n'était réduite que de 30 %. La liaison de la gp120 aux cellules a été partiellement inhibée par un anticorps anti-CD4 ou par du sérum et ces effets se sont révélés cumulatifs l'utilisation conjointe d'anticorps et de sérum a conduit à une inhibition plus importante, mais cependant incomplète, permettant d'envisager la formation d'un pont entre le CD4 et le RIS par les molécules de gpl20. La poursuite des travaux des inventeurs dans ce domaine leur a permis de caractériser la région RIS impliquée dans la liaison avec la gap120, fournissant ainsi des moyens spécifiques pour inhiber une infection par HIV ou pour détecter la présence de HIV lorsque l'infection s'est déjà produite ou pour caractériser la réponse immune contre le HIV. Les inventeurs ont en effet mis en évidence une forte interaction entre la gap120 et les protéines de familles de protéines à multiples passages transmembrannaires telles que présentes à la surface d'hématies humaines ou de cellules lymphocytaires, comme les CEM. Les protéines de la famille des protéines du type bande 3 sont prises comme exemple pour illustrer l'invention. Elles sont connues pour être ubiquitaires, pouvant se trouver aussi bien dans la membrane plasmatique, le Golgi ou les mitochondries dans diverses cellules. Les protéines de cette famille, appelées ciaprès de manière générale la famille de protéines bande 3, ont un PM de l'ordre de 102, 112 et 137 Kd en SDS-PAGE selon la banque SWISS-PROT à INTERNET. La protéine bande 3 est une protéine transmembranaire qui traverse la membrane 12 fois ou plus et sert d'échange d'anions étant très fortement chargée positivement. Elle porte en effet à sa surface extracellulaire 3 fois plus de charges positives que négatives, ce qui est interprété comme une aide pour le transport d'anions (Jay et al. 1986 Amm. Rev. Biochem. 55 : SM-538). Les récepteurs ou sites de liaison de la gap120 de HIV sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une partie des protéines de la famille du type de la protéine bande 3, telle que présente à la surface des hématies humaines. Ces récepteurs ou sites de liaison sont également caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec la gap120, en l'absence de sérum humain, à 37'C. Ces récepteurs sont de nature érythrocytaire ou sont tels que présents sur des cellules infectables par HIV comme le CEM CD4+. On notera que l'interaction de la gpl20 avec la protéine bande 3 est inhibée par du sérum. L'invention vise les protéines transmembranaires avec plusieurs passages de l'intérieur à l'extérieur de la cellule, sous forme purifiée, et les fragments de celles-ci, en particulier les régions extérieures par rapport à la membrane, tout spécialement les régions chargées positivement, dès lors que ces fragments et régions présentent une activité de liaison spécifique vis-à-vis de la gap120 présente sur HIV. Le terme "protéine", tel qu'utilisé dans la description et les revendications désigne aussi bien une protéine de la famille des protéines transmembranaires, sous forme purifiée, ou en vésicule, ou en liposomes reconstitués, que ses fragments ou régions tels qu'identifiés ci-dessus. Elle couvre également les formes recombinantes de cette protéine, par exemple les protéines de fusion, ou les formes dépourvues de leur séquence intramembranaire. L'invention vise également les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre cette protéine. Les fragments de ces anticorps, en particulier les fragments correspondant à la partie Fab invariable, entrent également dans le cadre de l'invention. L'invention vise également les anticorps antianticorps ou anti-idiotypes, caractérisés par leur capacité à réagir, selon une réaction du type antigèneanticorps, avec les anticorps précédemment définis. De même, l'invention couvre les fragments de ces anticorps. Les anticorps polyclonaux sont obtenus selon les méthodes classiques par immunisation d'animaux à l'aide de la protéine bande 3, de fragments ou de régions de celles-ci, récupération des anticorps produits à partir des cellules spléniques, et purification. Pour la production d'anticorps monoclonaux, on établit des cultures d'hybridomes obtenues de manière classique, par fusion de cellules spléniques sécrétrices d'anticorps avec des cellules myélomateuses, on sélectionne les clones d'hybridomes sécréteurs et on les injecte à des souris pour produire des ascites tumorales à partir desquelles on récupère les anticorps monoclonaux recherchés et on les purifie. Les protéines et anticorps définis ci-dessus sont utilisés, conformément à l'invention, pour l'élaboration de moyens de détection, de compositions thérapeutiques ou de compositions prophylactiques. L'invention vise ainsi des compositions, méthodes et kits de détection ou de diagnostic caractérisés en ce qu'ils comprennent ces protéines ou ces anticorps en quantité suffisante pour caractériser une infection par HIV et, le cas échéant, pour quantifier le taux de HIV dans un échantillon à analyser ou la réponse immune contre HIV. Dans les compositions de détection ou diagnostic, les protéines ou les anticorps comportent avantageusement un marqueur permettant la révélation d'une réaction immunologique. Selon l'invention, la méthode de détection de la présence de HIV ou de détection de la réponse immune est caractérisée par - la mise en contact d'un échantillon à analyser avec le récepteur secondaire tel que défini cidessus, capable de se lier au produit de la réaction HIV RIS que renferme éventuellement l'échantillon, ou au site RIS ou en variante, avec la protéine définie ci-dessus capable de se lier à HIV, où l'inhibition de la fixation de protéines virales sur le RIS indiquera la présence d'anticorps capables d'empêcher la fixation du virus sur son deuxième récepteur, - la révélation de la réaction antigèneanticorps éventuellement produite. L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions suffisantes, notamment en ce qui concerne la durée, la température, le tampon, pour obtenir la fixation de HIV lorsqu'il est présent. L'échantillon à analyser est constitué en particulier par un fluide corporel tel que sang, plasma, urine, salive, fluide cérébro-spinal, liquide séminal. L'anticorps ou la protéine sont en solution ou fixées sur un support. Pour la révélation de la réaction, on a recours à des moyens de marquage, par exemple au marquage par des agents fluorescents tels que la fluorescéine, à des enzymes telles que la peroxydase, ou à des agents colorants. Pour détecter la présence de HIV ou d'anticorps anti-HIV à des fins d'études ou de diagnostic, on aura avantageusement recours à un kit comprenant la protéine ou l'anticorps, le cas échéant fixés sur une microplaque, en une quantité suffisante pour la realisation d'un test, les réactifs et tampons pour effectuer la détection, ainsi qu'une notice d'utilisation. Selon un autre aspect, l'invention vise des compositions utilisables en thérapeutique comprenant, en association avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables, une quantite efficace d'au moins un anticorps, ou une protéine, telle que définie ci-dessus. Ainsi, les anticorps sont utilisés comme agents inhibiteurs vis-à-vis de l'interaction avec le virus HIV. La protéine bande 3, ou ses fragments, est utilisée comme protéine leurre de manière à entrer en compétition avec la protéine transmembranaire constitutive des cellules du site RIS. Avantageusement, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent des agents capables de protéger les anticorps ou protéines administrés contre l'action des protéases cellulaires. Les compositions de l'invention peuvent être également utilisées en association avec des agents antiviraux. Pour ces applications thérapeutiques, les anticorps ou les protéines sont administrés sous des formes galéniques utilisables par voie intraveineuse ou parentérale. Ils sont également administrables sous forme de liposomes. On rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention. On utilise les produits suivants: gal20: il s'agit de la gap120 recombinante, glycosylée, de HIV-1/IIIB, produite dans baculovirus (Intracell, commercialisée par Neosystem, Strasbourg, France). Anticorps de laDin anti-gpl20: Ces anticorps sont obtenus après une première immunisation avec gap120 dans l'adjuvant complet de Freund, suivie d'hyperimmunisations tous les mois, sans adjuvant, à des doses de 1 pg/kg. Les anticorps anti-IgG de lapin couplés à la peroxydase sont commercialises par Amersham, Grande Bretagne. Exemple 1 : Fixation de la gap120 sur des hématies humaines A) Courbe dose réponse de la fixation de la gap120. Des hématies AB du Centre de Transfusion Sanguine Régional ont été lavées en PBS (3x) et incubées dans des plaques de microtitration Maxisorb R (NUNC) à 4 x 10 par puits pour les faire adherer. Les puits ont eté ensuite saturés par la BSA 3% et après lavage incubés avec différentes doses de gpl20/HIV1 en PBS-BSA 3% pendant 1h à 37il. Après 3 lavages en PBS-BSA 0,3%, la gap120 a été détectée par un antisérum de lapin anti-gpl20 suivi d'un anti-lg de lapin marqué à la phosphatase alcaline et révélé par le pNPP. Les puits ont été évalués dans un lecteur de plaques à 414 nm. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 1A qui donne la variation de la DO en fonction de doses croissantes de gpl2O. On observe une fixation dose dépendante de la gpl20 sur les hématies humaines. Cette fixation est visible en ELISA à partir d'une concentration de 0,25 pg/ml de gap120. Elle est lineaire jusqu'à une concentration de 4 ,ug/ml et atteint un plateau de saturation pour des concentrations supérieures. B) Inhibition par le sérum humain Des hématies ont été adsorbées sur des plaques et saturées comme décrit plus. A une dose unique de 1 pg/ml de gp120 ont été ajoutees différentes concentrations de sérum humain ou de sérum foetal de veau pendant 1h à 37'C. Ce melange a été ensuite incubé avec les hématies humaines pendant 1h à 37 C. Les lavages et la révélation de la gp120 étaient identiques à la méthode décrite ci-dessus pour la méthode à la phosphatase alcaline. La figure lB donne la variation de la DO en fonction de la concentration en serum humain (courbe et en sérum de veau foetal (courbe-n, ) On constate une inhibition de la fixation de la gap120, qui atteint pratiquement 100% en présence de serum humain. EXEMPLE 2 : Fixation de la gp120 sur des protéines transmembranaires purifiées d'hématies Pour mettre en évidence la nature d'un récepteur érythrocytaire, deux protéines transmembranaires majeures de la membrane qui sont accessibles à la surface des hématies, ont été etudiées au regard de leur capacité de fixation de la gp120: a) la glycophorine qui porte 60% des sucres de l'hématie qui sont responsables de sa charge négative et des groupes sanguins, b) la protéine bande 3, qui, à elle seule, représente plus de 25% des protéines transmembranaires et sert d'échangeur d'anions. La glycophorine purifiée, obtenue commercialement, a été fixée en doses croissantes sur des puits de microtitration MaxisorbE à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-glycophorine du commerce (DAKO) adsorbé au préalable sur des plaques de microtitration. Elle a été incubee avec de la gpl20 recombinante et révélée par un anticorps anti-gpl 20 de lapin, puis d'un anti-Ig de lapin couplé à la peroxidase, suivi d'OPD. On observe une fixation de la gpl20 sur la glycophorine insolubilisée, mais seulement avec une faible DO au bout de 30 minutes d'incubation avec OPD. Cette réaction faible ne peut donc pas expliquer l'ampleur de la fixation de la gpl20 sur les hématies. Le système a aussi été inversé en insolubilisant d'abord la gpl20 sur un anticorps antigap120. Un anticorps anti-gpl20 (Aalto Bioreagents, Dublin, Ireland), dirigé contre un peptide de sa partie C-terminale, a été préalablement adsorbé sur des plaques Maxisorb, puis mis à incuber avec la gap120. Après une seconde incubation avec la glycophorine à différentes concentrations, sa présence a été révélée par l'anticorps monoclonal anti-glycophorine, puis par un anti-Ig de mouton couplé à la peroxidase. Dans ces conditions une fixation de la gap120 sur la glycophorine a eté observée, mais elle est restée très faible aussi. Ces deux approches n'ont donc pas montré une interaction de la gap120 avec la glycophorine purifiée qui puisse suffisamment bien expliquer la fixation de la gap120 sur des hématies. Afin de tester l'interaction de la gpl20 avec la deuxième protéine transmembranaire la plus abondante de l'hématie, la protéine bande 3, on a procédé à la purification de cette protéine à partir des fantômes d'hématies selon WOLOSIN et al, 1977 J. Biol. Chem. 252,2419-2427. Cette méthode a la particularité de maintenir cette protéine transmembranaire dans la membrane érythrocytaire en enlevant la plupart des autres protéines transmembranaires ou associées à la membrane. Partant de fantômes d'hématies une grande partie des protéines associées à la membrane a été éliminée par un pH alcalin à faible force ionique. Ensuite la glycophorine a été enlevée à l'aide d'un detergent doux, l'octyl-glycopyranoside (3 x CMC). D'autres protéines qui restaient encore associées à la membrane interieure, ont été enlevées par un bref passage à pH 12 à faible force ionique. Après ces traitements, il restait des vésicules, bien plus petites que les hématies de départ qui ont été récoltées après centrifugation à 50 OOOg et qui etaient fortement enrichies en protéine bande 3 à environ 3 mg/ml. Il restait cependant une contamination de quelques autres protéines avec un poids moléculaire élevé, donc plutôt localisées à l'intérieur de la vésicule d'hématies. Afin de vérifier, si ces vésicules riches en protéine bande 3 pouvaient fixer la gap120, elles ont été adsorbées sur des puits de plaques MaxisorbE et, après saturation avec BSA 3%, incubées avec la gpl20 qui a été révélée comme décrit en haut. Après insolubilisation des vésicules en concentrations décroissantes, on a constaté que la gap120 se fixait fortement sur les vésicules à 3 mg/ml de protéine bande 3. La fixation diminue pour de plus faibles concentrations et disparaît à des concentrations inférieures à 0,3 mg/ml de protéine bande 3. EXEMPLE 3 : Etude de la fixation de la gap120 sur des cellules CEM avec le CD4 A) Fixation de la gpl20 sur les CEM Afin de vérifier, si la gap120 redonnait un récepteur différent du CD4 sur les cellules CEM, ces cellules ont été adsorbées sur des plaques de microtitration à l'aide d'un mélange d'anticoprs monoclonaux dirigés contre le CD5 et le CD100. La gpl20 en doses croissantes a été ensuite incubée avec ces cellules vivantes, adsorbées sur des plaques de microtitration à l'aide d'anticorps monoclonaux. Sa présence a été démontrée comme decrit plus haut avec un anticorps de lapin, un anti-Ig de lapin-POD, suivi de OPD. Une forte fixation de la gap120 sur ces cellules avec un récepteur CD4 accessible a été ainsi observée. B) Inhibition par le sérum humain. On fait adhérer des cellules CEM (10 /puits) sur des anticorps anti-CD5 et CD100 préalablement fixés sur des plaques de microtitration et saturés par de la BSA 3%. Le CD4 a ensuite été bloqué par incubation avec l'anticorps F101.69 (lOoug/ml), spécialement dirigé contre le site de fixation de la gap120. La gpl20 a été pré-incubée avec différentes concentrations de sérums (lh à 37C) et ensuite le mélange incubé avec les cellules CEM adhérentes (lh à 37 C). La gpl20 a été detectée par un antisérum de lapin anti-gpl20, suivi d'un anti-Ig de lapin marqué à la peroxidase, révélé par l'OPD et lu à 492 nm. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 2A qui donne la variation de la D.O. en fonction de concentrations croissantes en sérum de veau foetal (courbe ) et en sérum humain (courbe ). Ces expériences mettent en évidence l'effet inhibiteur du sérum. L'inhibition est de l'ordre de 90 % avec le sérum humain. C) Inhibition de la fixation de la gpl2O/HIV sur des cellules cibles par la protéine bande 3, enrichie en vésicules d'hématies. Des cellules CEM adhérentes et saturées ont été bloquées au niveau du CD4 comme décrit plus haut. La gap120 a été préalablement incubée avec les vésicules contenant la protéine bande 3 (lh à 37'C) et ensuite incubée avec les cellules CEM bloquées. Le contact préalable de la gap120 avec la protéine bande 3 à des doses d'environ 1 mg/ml a inhibé la fixation de la gpl20 sur le RIS d'environ 75 - 80% et était dose dépendant. La fixation de la gap120 a été détectée comme décrit ci-dessus par ELISA avec des anticorps marqués à la peroxidase. Sur la figure 1B, on rapporte la variation de la D.O. en fonction de concentrations croissantes en protéine bande 3. Un palier est observé jusqu'à une concentration de 12pg/ml en protéine bande 3, puis on note une diminution de la DO étant interprété comme l'inhibition de la gpl20 par la protéine bande 3. Les mêmes expériences que celles décrites cidessus peuvent être réalisées afin de fixer - du virus concentré sur une protéine transmembranaire telle que celle de la famille de la bande 3, - du virus concentré sur des globules rouges préalablement digérés par des enzymes protéolytiques, - du virus concentré sur des membranes séchées de globules rouges. On observe dans chaque cas une forte fixation de la gp120, ceci pouvant être vérifié avec du HIV fonctionnel. REVENDICATIONS 1. Récepteurs ou sites de liaison de la gpl20 de HIV caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une partie de protéines de familles de protéines à plusieurs passages transmembranaires, comme les protéines du type bande 3 telles que présentes à la surface des hématies humaines ou des cellules lymphocytaires, comme par exemple les CEM. 2. Récepteurs ou sites de liaison selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec la gap120, à 37il. 3. Récepteurs ou sites de liaison selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont de nature érythrocytaire ou tels que présents à la surface de cellules infectables par HIV, comme les cellules CEM CD4+. 4. Anticorps polyclonaux et anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs ou sites de liaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. 5. Applications des récepteurs ou sites de liaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et des anticorps selon la revendication 4 à l'élaboration de moyens de détection. 6.- Applications des récepteurs ou sites de liaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et des anticorps selon la revendication 4 à l'élaboration de compositions thérapeutiques. 7. Applications des récepteurs ou sites de liaison selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et des anticorps selon la revendication 4 à l'élaboration de compositions prophylactiques.