Brevet FR2756633A1 — publié le 19980605

METHODE DE DETECTION IN VITRO DU POTENTIEL TRANSMEMBRANAIRE MITOCHONDRIAL L'invention a pour objet une nouvelle méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial, et son application à l'évaluation et/ou au suivi du processus d'apoptose chez un individu, ainsi qu'au diagnostic in vitro de pathologies liées à une modification de ce processus d'apoptose. L'apoptose est habituellement détectée par mesure d'événements nucléaires intervenant en stade final de la cascade apoptotique: fragmentation de l'ADN ou perte de chromatine (7,10-12,17,21). La plupart des techniques cytofluorométriques ou histochimiques utilisées pour la détection de la fragmentation apoptotique de l'ADN conduisent à une sous estimation de la fréquence de cellules apoptotiques in vivo, dans la mesure ou les événements susmentionnés sont accompagnés ou précédés par des changements dans la physico-chimie de la membrane plasmique permettant la reconnaissance phagocytaire et l'élimination des cellules apoptotiques (16,20). Par conséquent, et tout particulièrement dans le cas ou les cellules sont analysées ex vivo ou in vivo, la détection de changements nucléaires pré-apoptotiques est susceptible de constituer un avantage majeur. Il a récemment été démontré que des signes nucléaires d'apoptose dans de nombreux systèmes différents, sont précédés par une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (PTM) (1,5,8,15,19,23,25-27). Cette dissipation du PTM n'est pas accompagnée d'altérations ultrastructurales majeures des mitochondries et remplit les critères suivants: (i) elle est précoce en ce sens qu'elle précède toute autre manifestation d'apoptose dont les altérations de membranes plasmatiques, la condensation de chromatine, et la fragmentation d'ADN; ce stade précoce des cellules en apoptose est encore désigné dans ce qui suit par stade pré-apoptotique; (ii) elle est spécifique en ce sens qu'elle est uniquement observée dans les cellules au stade pré- apoptotique; (iii) elle est universelle en ce sens qu'on la retrouve dans tous les types cellulaires en apoptose, ainsi qu'en réponse à tous les inducteurs d'apoptose étudiés (iv) elle est irréversible en ce sens qu'elle constitue un point de non retour et que les cellules ayant perdu leur PTM vont suivre une apoptose complète même si le stimulus inducteur d'apoptose est supprimé (1,5,8,15,19,23,25-27). Combinées ensemble, toutes ces caractéristiques soulignent le caractère utile de la mesure du PTM pour la caractérisation de l'apoptose précoce. Le PTM est le résultat d'une distribution inégale de protons dans la membrane mitochondriale interne, donnant lieu à la formation de charges négatives du côté interne de la membrane mitochondriale interne. La quantification cytofluorométrique du PTM est basée sur l'utilisation de marqueurs cationiques lipophiles qui, selon l'équation de Nernst, sont séquestrés à l'intérieur de la matrice mitochondriale. Malheureusement, l'utilisation de la plupart des marqueurs sensibles au potentiel (2), à savoir l'iodure de 3,3' dihexyloxacarbocyanine (DiOC6(3)), la rhodamine 123, la tétraméthylrosamine, ou l'iodure de 5,5',6,6'-tétrachloro- 1,1',3,3 '- tétraéthylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1) n'est pas compatible avec la fixation chimique des cellules, ce qui leur confèere au moins trois inconvénients majeurs. Premièrement, la quantification cytofluorométrique de l'incorporation du marqueur doit être effectuée ad hoc, immédiatement après le marquage des cellules. Deuxièmement, le matériel infectieux (tels que les échantillons de sang), doit être manipulé suivant des procédures spéciales de protection des manipulateurs durant l'analyse cytofluorométrique. Troisièmement, l'intégrité des membranes cellulaires doit être maintenue pendant toute l'expérience, empêchant par conséquent la détection simultanée du PTM et d'autres paramètres tels que le niveau d'expression d'antigènes intracellulaires ou le degré de fragmentation d'ADN. Un des buts de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode de détection et/ou de mesure in vitro du PTM présentant les avantages suivants - elle est simple de mise en oeuvre et peut être utilisée en routine, notamment dans des laboratoires d'analyses biologiques ou biochimiques, par exemple en milieu hospitalier; - elle ne nécessite pas de mesures spéciales de protection du manipulateur qui peut analyser les échantillons biologiques en toute sécurité dans la mesure o cette méthode autorise la fixation des cellules étudiées après leur marquage; - elle peut être associée à la détection et/ou à la mesure, simultanée ou non, de marqueurs cellulaires différents de ceux utilisés pour la mesure du PTM, notamment de marqueurs d'antigènes intracellulaires. Un autre but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose dans des populations de cellules humaines ou animales, et présentant outre les avantages susmentionnés, celui de permettre la détection de la présence de cellules à un stade pré-apoptotique, dans la mesure o cette méthode permet de détecter et/ou de mesurer un événement précoce du processus d'apoptose, à savoir celui de la chute du PTM dans ces cellules au stade pré-apoptotique, par rapport au PTM de cellules n'ayant pas enclenché un processus d'apoptose. La détection de cellules à un stade pré-apoptotique constitue un avantage certain par rapport aux méthodes actuellement utilisées susmentionnées pour détecter l'apoptose, dans la mesure o toutes les cellules au stade pré- apoptotique ou apoptotique d'une population cellulaire déterminée pourront être détectées, tandis que seules les cellules au stade apoptotique peuvent être détectées par lesdites méthodes actuelles qui conduisent à une sous estimation du processus d'apoptose réel dans une population cellulaire déterminée, ce qui a pour effet de fausser les résultats de ces dernières méthodes. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour but celui de fournir une nouvelle méthode fiable de dépistage in vitro d'une modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport à un individu sain, cette modification allant soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution de ce processus d'apoptose. La présente invention a également pour but de fournir de nouvelles méthodes de diagnostic in vitro et/ou de suivi de l'évolution de pathologies liées à une modification de processus d'apoptose chez un patient par rapport à un individu sain. Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles méthodes de criblage de produits thérapeutiques susceptibles de modifier le processus d'apoptose dans les cellules d'un patient. Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles méthodes d'évaluation toxicologique de produits, notamment d'intérêt thérapeutique. La présente invention a pour objet l'utilisation de composés lipophiles, cationiques et comportant au moins un groupe halogénoalkyle dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe chlorométhyle, ces composés étant marqués, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, ou étant par eux-mêmes des marqueurs susceptibles de pouvoir être détectés, notamment étant par eux-mêmes des marqueurs fluorescents, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection, et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial. De préférence, les composés susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention, comprennent un groupe d'au moins trois cycles de 4 à 8 chaînons, de préférence de 6 chaînons, chacun de ces cycles comportant un chaînon commun avec au moins un des deux autres cycles, ces cycles étant hétérocycliques ou non, aromatiques ou non, notamment un groupe de formule suivante ^X X,,f L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de composés tels que définis ci-dessus et répondant à la formule générale (I) suivante À ' t I dans laquelle: ( CH2)- - X représente un atome d'halogène, notamment un atome de chlore, - n représente un nombre entier variant de 1 à 5, - R'1, R'2, R'3 et R'4, représentent un atome d'hydrogène, ou R'1 en association avec R1 et Na forment un hétérocycle, et/ou R'2 en association avec R2 et Na forment un hétérocycle, et/ou R'3 en association avec R3 et Nô forment un hétérocycle, et/ou R'4 en association avec R4 et Np forment un hétérocycle, lesdits hétérocycles étant aromatique ou non et comportant de 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle, - R1, R2, R3 et R4, lorsqu'ils ne sont pas associés respectivement avec R'1, R'2, R'3 et R'4 pour former un hétérocycle avec Noc ou Np, représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle (linéaire ou ramifié) de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle. L'invention à plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée en tant que marqueur fluorescent de la chlorométhyl-X- rosamine (CMXRos) ayant la formule suivante: l fI 1 5 CH, C L'invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus normal d'apoptose chez un individu sain. Cette évaluation in vitro est effectuée par mesure de la quantité de cellules qui, au sein d'une population cellulaire déterminée dans un échantillon biologique d'un individu, sont au stade pré-apoptotique ou apoptotique, et comparaison avec la quantité de cellules au stade préapoptotique ou apoptotique mesurée au sein d'une même population cellulaire dans un échantillon biologique d'un individu sain. Cette évaluation in vitro permet ainsi de détecter des éventuelles modifications du processus d'apoptose chez un individu par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain. A ce titre, la présente invention a également pour objet l'utilisation des composés définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain. Le diagnostic susmentionné d'une modification soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution du processus d'apoptose, peut avantageusement être corrélé au diagnostic de pathologies liées à de telles modifications, voire de confirmer le diagnostic de ces pathologies et, le cas échéant, permet d'effectuer un suivi dans le temps de l'évolution de telles pathologies, notamment au cours du traitement thérapeutique de ces dernières (en particulier, suivi du traitement oncologique des lymphomes et leucémies). Parmi les pathologies susmentionnées susceptibles d'être détectées dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les maladies affectant les lymphocytes ou leucocytes dans la circulation sanguine, notamment le SIDA ou d'autres maladies infectieuses (virales, bactériennes, fongiques, parasitaires), les tumeurs et plus particulièrement celles des cellules sanguines (lymphomes, leucémies), aplasies, cancers, les pathologies hématologiques, les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires. Parmi les différents traitements thérapeutiques susceptibles d'être suivis par mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, on peut citer le traitement du SIDA, le traitement des infections (virales, bactériennes, fongiques, parasitaires), la chimiothérapie, la radiothérapie. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés définis ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une augmentation du processus d'apoptose, notamment les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires, les processus dégénératifs lymphocytaires, notamment le SIDA. L'invention concerne également l'utilisation des composés définis ci- dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une diminution du processus d'apoptose, notamment tumeurs, aplasies, cancers. Une augmentation du processus d'apoptose, se traduit par la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui, au sein d'une population cellulaire déterminée, est supérieure à la quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique susceptible d'être mesurée à partir d'une population cellulaire identique provenant d'un individu sain. A l'inverse, une diminution du processus d'apoptose correspond à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui, au sein d'une population cellulaire déterminée, est inférieure à la quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique susceptible d'être mesurée à partir d'une population cellulaire identique provenant d'un individu sain. L'invention a également pour objet l'utilisation de composés définis ci- dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l'apoptose. L'invention concerne également l'utilisation des composés définis ci- dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation toxicologique de produits d'intérêt thérapeutique. De préférence, l'invention a pour objet l'utilisation de la CMXRos pour la mise en oeuvre d'une des méthodes définies ci-dessus. L'invention concerne également toute méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial de cellules humaines ou animales, caractérisée en ce qu'elle comprend: - une étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales, notamment de cellules sanguines, avec au moins un composé tel que défini ci-dessus, - le cas échéant, la fixation des cellules susmentionnées, après l'étape d'incubation précédente, ladite fixation étant avantageusement effectuée à l'aide de formaldéhyde, - la mesure, notamment par analyse cytofluorométrique, de la quantité dudit composé intégrée, lors de l'étape d'incubation précédente, dans lesdites cellules. De préférence la méthode susmentionnée est réalisée à partir de cellules sanguines, notamment de leucocytes, séparées de la plupart des autres constituants du sang selon des procédés classiques pour l'homme du métier dans ce domaine. La population de cellules sur laquelle est effectuée la méthode susmentionnée, est avantageusement telle qu'elle contient environ 5.104 à environ 5.106 cellules par ml, et est notamment d'environ 5.105 cellules/ml. De préférence également la quantité du composé choisi parmi ceux définis ci-dessus, qui est utilisée dans l'étape d'incubation de la méthode susmentionnée, est d'environ 1 nM à environ 300 nM, lorsque ladite méthode ne comprend pas d'étape de fixation, et est notamment d'environ 20 nM à environ 30 nM. Lorsque ladite méthode comprend une étape de fixation, la quantité dudit composé qui est utilisée dans l'étape d'incubation est de préférence d'environ 10 nM à environ 300 nM, notamment d'environ 150 nM. Avantageusement, ladite étape d'incubation des cellules avec ledit composé dans la méthode susmentionnée, est effectuée à une température comprise entre environ 30 C et environ 40 C et pendant un temps d'environ mn à environ 60 mn. De préférence la méthode susmentionnée comprend une étape de fixation des cellules susmentionnées, cette fixation étant avantageusement effectuée par incubation desdites cellules avec du paraformaldéhyde à 4% dans un tampon phosphate (PBS) pendant environ 15 mn à température ambiante. La mesure de la quantité dudit composé intégrée dans les cellules dans la méthode susmentionnée est avantageusement effectuée à l'aide d'un spectrofluorimètre (notamment celui commercialisé par la société Kontron, Zurich, Suisse) à une longueur d'onde d'excitation de 488 nM. L'invention a également pour objet toute méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose, telle que définie ci-dessus, et le cas échéant de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus dans laquelle: - l'étape d'incubation est effectuée entre d'une part une population de cellules provenant d'un échantillon biologique prélevé sur ledit patient, notamment du sang, ou des préparations dérivées du sang telles que des préparations de leucocytes et, d'autre part, au moins un composé tel que défini ci-dessus, - l'éventuelle modification du processus d'apoptose est détectée et/ou mesurée par comparaison à un témoin normal correspondant à la mesure de la quantité du même composé que celui utilisé lors de l'étape d'incubation précédente et intégrée dans une population cellulaire identique à la précédente et provenant d'un échantillon biologique prélevé chez un individu sain. L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, lesdites pathologies étant telles que définies ci-dessus, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation du processus d'apoptose telle que définie ci-dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est supérieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une augmentation du processus d'apoptose chez ce patient. L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, lesdites pathologies étant telles que définies ci- dessus, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation du processus d'apoptose telle que définie ci-dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est inférieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une diminution du processus d'apoptose chez ce patient. Avantageusement les méthodes susmentionnées de l'invention sont effectuées à partir de leucocytes, en tant que population cellulaire étudiée, et de CMXRos en tant que composé utilisé dans l'étape d'incubation avec ladite population cellulaire. L'invention concerne également toute méthode de diagnostic in vitro et/ou de suivi de pathologies liées à une augmentation ou à une diminution du processus d'apoptose telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que l'étape d'incubation de la population de cellules avec ledit composé est précédé par, et/ou suivie par, et/ou effectuée avec une étape d'incubation de cette même population de cellules avec des marqueurs cellulaires autres que les composés tels que définis ci-dessus, ces autres marqueurs étant spécifiques desdites pathologies, notamment des anticorps marqués spécifiques d'antigènes hétérologues ou d'autoantigènes du patient présents dans lesdites cellules, ces antigènes ou autoantigènes étant spécifiques desdites pathologies. L'utilisation de ces autres marqueurs dans cette dernière méthode de diagnostic in vitro permet notamment de confirmer le diagnostic par évaluation du processus apoptotique selon l'invention des pathologies en question. Parmi ces autres marqueurs, on peut citer notamment les marqueurs spécifiques des antigènes suivants du système CD et des antigènes viraux, et donc spécifiques des pathologies suivantes: leucémies, lymphomes, autres néoplasies, SIDA et autres infections virales. L'invention concerne également toute méthode de criblage in vitro de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l'apoptose, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini ci-dessus, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits d'intérêt thérapeutique. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de criblage de produits capables d'augmenter l'apoptose, ladite méthode étant effectuée par mise en oeuvre d'une méthode de criblage telle que définie ci- dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité de composé tel que défini ci- dessus, dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont capables d'augmenter le processus d'apoptose dans lesdites cellules. Les produits sélectionnés pour leur propriété d'augmenter l'apoptose dans des cellules in vitro selon la méthode de criblage précédemment décrite, sont donc susceptibles d'être utilisés en tant que produits capables d'accélérer le processus d'apoptose dans le cadre du traitement des pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet encore, toute méthode de criblage de produits capables de diminuer l'apoptose, ladite méthode étant effectuée par mise en oeuvre d'une méthode de criblage telle que définie ci- dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité de composé tel que défini ci- dessus, dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont capables de diminuer le processus d'apoptose dans lesdites cellules. Les produits sélectionnés pour leur propriété de diminuer l'apoptose dans des cellules in vitro selon la méthode de criblage précédemment décrite, sont donc susceptibles d'être utilisés en tant que produits capables de retarder le processus d'apoptose dans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, telle que définies ci-dessus. Avantageusement, les méthodes de criblage décrites ci-dessus sont effectuées à partir de cellules sanguines, notamment de leucocytes, provenant soit d'un individu sain, soit d'un patient atteint de la pathologie susceptible d'être traitée par lesdits produits, et le composé marqué est la CMXRos. II En variante, les méthodes de criblage susmentionnées, et plus particulièrement celles de criblage de produits capables de diminuer le processus d'apoptose en vue de restaurer ce dernier, comprennent une étape d'induction de l'apoptose des cellules utilisées dans lesdites méthodes. Cette étape d'induction d'apoptose est effectuée préalablement à l'étape d'incubation desdites cellules avec le composé tel que défini ci-dessus. Puis l'on mesure la capacité éventuelle desdits produits à restaurer un processus d'apoptose normal de la manière indiquée ci-dessus. Avantageusement, cette étape d'incubation de l'apoptose est effectuée par incubation desdites cellules avec un corticoïde telle que la dexaméthasone. L'invention a également pour objet toute méthode d'évaluation toxicologique in vitro de produits, notamment d'intérêt thérapeutique, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini ci- dessus, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits. La mesure d'une quantité dudit composé dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits qui, dans le cadre de la méthode d'évaluation biologique susmentionnée, est supérieure ou inférieure, à la mesure de la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont susceptibles d'être toxiques pour l'organisme, dans la mesure o un effet de modification du processus d'apoptose n'est pas recherché pour ces produits. Avantageusement les méthodes d'évaluation toxicologiques susmentionnées de l'invention sont effectuées à l'aide de cellules humaines ou animales notamment de leucocytes provenant d'individus sains, et le composé utilisé est la CMXRos. L'invention a également pour objet des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre d'une des méthodes décrites ci-dessus, contenant au moins un composé tel que défini ci-dessus, avantageusement aux concentrations indiquées ci- dessus. Le cas échéant, les kits de l'invention comprennent également un fixant cellulaire, tel que du paraformaldéhyde à la concentration indiquée ci- dessus, ainsi qu'un protocole d'utilisation contenant notamment les valeurs standard d'apoptose chez un individu sain. L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de mesure du PTM avec la CMXRos. I MATERIELS ET METHODES 1) Cellules et induction de l'apoptose Les thymocytes de souris BALB/c femelles (6-10 semaines) ont été cultivés dans un milieu RPM1640 complété avec de la L-glutamine et 10 % de sérum foetal de veau (1 x 106 cellules/ml). Pour l'induction de l'apoptose, les cellules ont été cultivées en présence de DEX (dexaméthasone 10 IM; Sigma, St Louis, MO). Après incubation pendant l'intervalle de temps indiqué, les paramètres mitochondriaux ou nucléaires d'apoptose ont été mesurés. 2) Détermination du PTM Afin d'évaluer le PTM, les cellules (5 x 105 /ml) ont été incubées avec DiOC6(3) (Molecular Probes, Eugene; OR; 20nM dans PBS, 15 mn 37 C) (26) et/ou avec de la CMXRos (Molecular Probes; doses standard: 30 nM pour les expériences sans fixation et 150 nM avant la fixation). La CMXRos (lmM) a été préparée sous forme d'une solution dans du diméthylsulfoxide (DMSO) et stockée à -20 C. Des solutions intermédiaires ont été préparées dans du DMSO à une concentration de 200fois la concentration finale, suivi par une dilution par 1: 200 avec le milieu contenant les cellules. La solution de DiOC6(3) (40 gM dans DMSO) a été diluée jusqu'à une solution de travail de 400 nM (10 Ftl solution + 1 ml PBS), suivi par une dilution de 1: 20 avec le milieu contenant les cellules. Pour contrôle négatif, des cellules ont été traitées simultanément avec l'agent non couplant cyanure carbonyle de m- chlorophénylhydrazone (mC1CCP, 50,iM, Sigma). Dans une expérience de contrôle, les cellules ont été gardées pendant 5 minutes à 37 C en présence de 137 mM KC1 dans du PBS isotonique (pH=7,2) ou uniquement du PBS, suivi par le marquage avec CMXRos. 3) Fixation La fixation par l'aldéhyde a été réalisée par incubation de culots cellulaires avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Durant cette période de 15 minutes, les cellules ont été gardées dans un mélangeur horizontal (150 rpm). Puis les cellules ont été stockées pendant 1 à 10 jours à 4 C à l'obscurité. 4) Mesures spectrofluorométriques Les spectres de fluorescence de FITC (1 /M dans l'éthanol), PE (2.5 pM dans de l'eau) et CMXRos (1 AM dans l'éthanol) ont été obtenus en utilisant un spectrofluorimètre Kontron SFM25 (Kontron, Zurich, Suisse) à une longueur d'onde d'excitation de 488 nM. ) Marquages des antigènes de surface cellulaire Après marquage par la CMXRos, les cellules ont été lavées dans du PBS refroidi dans de la glace avec 2 % de sérum de veau foetal (FCS), incubées pendant 30 minutes à 4 C avec un anticorps monoclonal (mAB) couplé avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) cet anticorps monoclonal étant spécifique du CD4 de souris (RM4-5; 240 ng/106 cellules dans 100 /11; Pharmagen, San Diego, CA) et avec un mAB conjugué à la R- phycoérythrine (PE) ce mAB étant spécifique de la chaîne cx du CD8 de souris (53-6.7; 240 ng/106 cellules dans 10/l; Pharmagen). Puis les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS + 2 % de FCS et fixées avec du paraformaldéhyde comme décrit ci-dessus. 6) Détermination de l'expression de Bcl-2 intracellulaire Après marquage par la CMXRos et la fixation, les cellules ont été lavées dans du PBS, perméabilisées avec de l'acétone refroidie dans la glace pendant minutes, lavées 2 fois dans du PBS + 2 % de FCS, et incubées pendant une nuit avec un anticorps monoclonal spécifique de Bcl-2 (4Cll, 400 ng/106 cellules dans 100 /1; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Après deux lavages dans du PBS + 2 % de FCS, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4 C en présence d'IgG anti souris de F(ab)2-FITC (1:100; Silenus, Dandenong, Victoria, Australia), lavées deux fois et resuspendues dans du PBS auquel a été rajouté 2 % de paraformaldéhyde en tant que conservateur. 7) Détermination de la fragmentation apoptotique d'ADN Après marquage par la CMXRos et fixation, les cellules (1 x 106) ont été lavées dans du PBS et perméabilisées 2 minutes dans du citrate de sodium à 0,1 % contenant du triton X100 à 0,1 %, lavées deux fois dans du PBS isotonique (pH=7,2), resuspendues dans un volume final de 50 AI contenant 0,3 nmoles de FITC-12-déoxy-2-uridine triphosphate (FITC-dUTP), 3 nmoles de dATP, 50 nmoles de CoC12, et 5 U de déoxynucléotidetransférase terminale (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne) dans un tampon de réaction contenant 200 mM de cocadylate de potassium, 250 /g/ml de BSA, mM de Tris-HC1 (pH=6,6). Après incubation (1 heure à 37 C), les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS et resuspendues dans du PBS contenant 2 % de paraformaldéhyde. 8) Mesures cytofluorométriques Les analyses ont été réalisées en utilisant un analyseur EPICS Profile II (Coulter, Hialeh, FL) équipé avec un laser argon refroidi par l'air (488 nM, 15 mW). L'instrument a été installé afin de mesurer les faisceaux de lumière frontaux (FS) et latéraux (SS), fluorescence FITC/DiOC6(3) (FL1, 525 nm), fluorescence PE (FL-2,575 nm) et fluorescence CMXRos (FL3, 630 nm). Dans toutes les expériences les paramètres FS et SS ont été reportés sur la population majeure de taille normale. Pour les mesures de fluorescence de CMXRos, le photomultiplicateur de voltage a été calibré chaque jour avec des billes fluorescentes standardisées (Standard Immunobrite, Coulter). II RESULTATS 1) La CMXRos est un fluorochrome sensible au PTM, et fixable au formaldéhyde. Les thymocytes induits pour suivre une apoptose manifestent une chute précoce du PTM (1,19). Cette chute précoce du PTM affecte les thymocytes susceptibles à l'induction de l'apoptose par le glucocorticoïde dexaméthasone (DEX) et peut être détecté par des marqueurs cationiques lipophiles tels que DiOC6(3) et CMXRos, 2 fluorochromes qui marquent essentiellement la même population de cellules. L'incorporation de tous les marqueurs lipophiles cationiques, dont ceux utilisés en routine pour la détermination du PTM (rhodamine 123, JC-1, DioC6(3) est dirigé à la fois par le potentiel de membrane plasmique et le PTM (2,9). Ceci s'applique également à la CMXRos en ce sens qu'à la fois l'interruption du potentiel de membrane plasmique (qui est principalement un gradient de potassium) et la disparition du PTM (qui est principalement un gradient de proton) consommant un excès extracellulaire de potassium ou le protonophore mC1CCP, respectivement, réduisent tous les deux l'incorporation. Toutefois, il semble que la contribution du PTM à la fluorescence de CMXRos est plus importante que celle du potentiel de membrane plasmique. Comme on pouvait s'y attendre, le protonophore mClCCP supprime le PTM de toutes les cellules, à la fois les cellules sensibles ou résistantes au DEX, éliminant ainsi les différences entre cellules avec un PTM élevé et les cellules avec un faible PTM. Conformément à des études antérieures (19,26), ceci indique que les différences dans s l'incorporation du marqueur entre les cellules normales (avec PTM élevé) et les cellules pré-apoptotiques (avec PTM faible) est dicté par un gradient de protons mitochondrial plutôt que par d'autres potentiels de membranes. CMXRos et DiOC6(3) sont incorporés dans les cellules suivant une corrélation linéaire stricte. Par opposition au DiOC6(3), qui est chimiquement relativement inerte, CMXRos possède un groupe chlorométhyle qui réagit de façon covalente avec les thiols intramitochondriaux pour former une liaison thioester. Ainsi, lorsque les cellules sont fixées à l'aide de paraformaldéhyde, un procédé qui interrompt ipso facto la compartimentalisation ionique intracellulaire, DiOC6(3) s'échappe des cellules tandis que la CMXRos demeure in situ. 2) Détermination des paramètres optimum pour le marquage par CMXRos Des essais dose/réponse et de cinétique montrent qu'à une dose optimale de 3 à 30 nM, le marquage par CMXRos est limité par le PTM plutôt que par le contenu en thiol cellulaire. Même après la fixation par le formaldéhyde, une différence significative persiste entre les cellules non traitées (PTM élevé) et les cellules traitées au mC1CCP (faible PTM). Pour obtenir cet effet, la concentration de CMXRos doit être augmentée (concentration optimale 30-200 nM). Le lavage du marqueur avant la fixation par le paraformaldéhyde n'améliore pas le rapport signal/bruit du marquage au CMXRos. Une substitution similaire par d'autres aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde) ou des changements dans la concentration de paraformaldéhyde utilisée lors de la fixation n'améliore pas les résultats. Bien qu'après la fixation le rapport PTM élevé/PTM faible de la fluorescence de CMXRos chute 0,5 plus ou moins 0,1 logs, il est toujours possible de distinguer les cellules à PTM élevé des cellules à faible PTM. Après la fixation au paraformaldéhyde, le marquage obtenu avec 150 nM de CMXRos demeure inchangé durant au moins dix jours. 3) Détermination simultanée de deux antigènes de surface et de la suppression apoptotique du PTM A une longueur d'onde d'excitation de 488 nm, CMXRos émet à un maximum de 605 nm. Par conséquent, la CMXRos est compatible avec l'utilisation simultanée à la fois de FITC (émission: 515 nm) et TE (émission :580 nm), les deux fluorochromes classiques utilisés en immunofluorescence. Sur la base de cette information, une coloration à trois couleurs de thymocytes traités au DEX a été réalisée afin de déterminer le niveau d'expression de deux marqueurs de surface (CD4 et CD8) en utilisant FITC et PE, ainsi que le PTM en utilisant une dose optimale de CMXRos (150 nM), après fixation au paraformaldéhyde. Cette méthode permet de détecter le PTM parmi les quatre populations de thymocytes principaux: CD4+CD8+ ("double positif"), CD4- CD8- ("double négatif") et CD4+CD8- ou CD4-CD8+ ("simple positif"). Conformément à des études antérieures (3,18,24), les cellules CD4+CD8+ ("double positif") sont particulièrement sensibles à l'induction de l'interruption pré-apoptotique du PTM par les glucocorticoides. Ainsi, après traitement au DEX, environ la moitié des cellules CD4+CD8+ ont incorporé des quantités sub-optimales de CMXRos, alors que ce pourcentage est plus faible (10-30 %) parmi les cellules "simple positif". Comme cela a été décrit précédemment (3,22), les thymocytes pré-apoptotiques (PTM faible) présentent une régulation partiellement négative de l'expression de CD4 et CD8. Ces résultats confirment l'utilité de CMXRos pour la détermination du PTM en association avec les deux fluorochromes les plus fréquemment utilisés pour le marquage immunologique, à savoir FITC et PE. 4) Détermination simultanée de la réduction du PTM apoptotique et de l'expression intracellulaire de Bcl-2 La détermination du PTM dans les cellules fixées ouvre la possibilité de détecter en même temps le niveau d'expression d'antigènes intracellulaires. Le proto-oncogène Bcl- 2 est bien connu pour son rôle d'inhibiteur endogène de l'apoptose qui est présent dans les noyaux et les mitochondries mais pas dans les membranes plasmiques (4). Le niveau d'expression de Bcl-2 a été mesuré simultanément avec la détermination du PTM. Les cellules ont été marquées avec CMXRos, fixées avec le paraformaldéhyde, puis imperméabilisées avec l'acétone et marquées avec un anticorps monoclonal spécifique de la protéine Bcl-2. Le traitement avec DEX a deux effets sur les thymocytes: (i) comme décrit ci-dessus, cela cause une interruption du PTM; et (ii) provoque la réduction de Bcl-2. Ces changements affectent la même population de cellules, ce qui indique un lien intime entre les niveaux d'expression de Bcl-2 et le maintien du PTM. Ces données sont en conformité avec des études précédentes, indiquant que le DEX cause une régulation négative de l'expression de Bcl-2 (13) et que Bcl-2 stabilise le PTM (27). En conclusion, l'utilisation de CMXRos est compatible avec le marquage immunofluorescent des antigènes intracellulaires. 5) Quantification simultanée du PTM et fragmentation de l'ADN nucléaire Les techniques classiques pour la détection des cellules apoptotiques sont basées sur la détermination de cassures de l'ADN qui crée des sites accepteurs potentiels pour l'ADN polymérase ou la désoxyribonucléotidyltransferase terminale (Tdt) (7,10-12,21). Malheureusement, l'utilisation de marqueurs sensibles du PTM tel que DiOC6(3) ou JC1 n'est pas compatible avec la détermination simultanée de la fragmentation d'ADN, en raison du fait qu'une perméabilisation est nécessaire pour l'action des enzymes modifiant l'ADN. Encore une fois, ce problème peut être résolu à l'aide de la CMXRos. Après marquage par la CMXRos, fixation, des cassures d'ADN ont été révélées avec Tdt en utilisant la méthode Tunel. La population entière de cellules apoptotiques (Tunel+) présente une faible incorporation de CMXRos. Ce résultat est en accord avec le fait que les deux paramètres, à savoir l'interruption du PTM et la fragmentation de l'ADN, sont des événements irréversibles. Conformément à des résultats fonctionnels et cinétiques antérieurs (19,25), une population mineure mais significative de cellules à faible PTM ne permet pas de détecter de fragmentation d'ADN, ce qui indique que l'interruption pré-apoptotique du PTM doit précéder la fragmentation nucléaire de l'ADN. Ces résultats apportent une réponse à la controverse concernant la séquence des caractéristiques mitochondriales et nucléaires de l'apoptose dans les thymocytes qui selon une étude (6) sont des éléments simultanés alors que d'autres études (19,26,27) indiquent que la suppression du PTM précède l'apoptose nucléaire. En conclusion, cette méthode permet d'identifier une population de cellules pré-apoptotiques ayant un PTM en dessous de la normale mais ne présentant pas encore de fragmentation d'ADN. III CONCLUSION Le travail présenté ci-dessus est une méthodologie simple pour la quantification du PTM. L'incubation des cellules avec le marqueur CMXRos réagissant avec les fonctions thiol et sensible au PTM, suivi par la fixation au paraformaldéhyde, constitue une méthode pratique pour la détermination des variations pré-apoptotiques du PTM. Bien que cette procédure cause une réduction du rapport signal/bruit entre les populations de cellules à PTM élevé et à faible PTM, en comparaison aux méthodes n'utilisant pas de fixation avec un aldéhyde, cette procédure a de nombreux avantages majeurs. Premièrement la fixation au paraformaldéhyde inactive les agents infectieux dont le virus de l'immunodéficience humaine (HIV). Ainsi, la méthode basée sur la CMXRos pour la détermination du PTM autorise la détection en routine de l'interruption de PTM associée au SIDA (14) parmi les lymphocytes de donneurs séropositifs. Deuxièmement cette méthode supprime la nécessité de o détermination de PTM ad hoc. Ceci est important pour les expériences à grande échelle ainsi que pour la standardisation inter-expérimentale des résultats. Troisièmement cette approche basée sur la CMXRos est compatible avec les détections simultanées du PTM et d'autres paramètres dont la détermination requière la perméabilisation des membranes cellulaires. Le marquage au CMXRos peut être combiné avec le marquage par immunofluorescence d'antigènes intracellulaires ainsi qu'avec la technique Tunel pour la détermination de la fragmentation d'ADN. L'approche est également valable avec les thymocytes, qui sont de petites cellules et qui contiennent relativement peu de mitochondries en comparaison avec d'autres types cellulaires (19). Ainsi, cette approche multiparamétrique est appropriée pour mesurer l'apoptose dans de nombreux types cellulaires différents, dont les lymphocytes périphériques normaux, les cellules CEM-7 de lymphome humain, les cellules hybrido- murins, et les cellules WEHI-231 de leucémie pré-B. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Castedo M, Macho A, Zamzami N, Hirsch T, Marchetti P, Uriel J, Kroemer G: Mitochondrial perturbations define lymphocytes undergoing apoptotic depletion in vivo. Eur. J. Immunol. 25:3277-3284, 1995. 2. Chen LB: Mitochondrial membrane potential in living cells. Ann. Rev. Cell Biol. 4:155- 181, 1988. 3. Cohen GM, Sun X-M, Snowden RT, Ormerod MG, Dinsdale D: Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. J. Immunol. 151:566574, 1993. 4. Cory S: Regulation of lymphocyte survival by the Bcl-2 gene family. Ann. Rev. Immunol. 13:513-543, 1995. 5. 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Utilisation de composés lipophiles, cationiques et comportant au moins un groupe halogénoalkyle dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe chlorométhyle, ces composés étant marqués, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, ou étant par eux-mêmes des marqueurs susceptibles de pouvoir être détectés, notamment étant par eux-mêmes des marqueurs fluorescents, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection, et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial. 2. Utilisation selon la revendication 1, de composés comprenant un groupe d'au moins trois cycles de 4 à 8 chaînons, de préférence de 6 chaînons, chacun de ces cycles comportant un chaînon commun avec au moins un des deux autres cycles, ces cycles étant hétérocycliques ou non, aromatiques ou non, notamment un groupe de formule suivante: 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de composés répondant à la formule générale (I) suivante R, Rôt R3 R3 X6' / t"a' (CHz) - dans laquelle - X représente un atome d'halogène, notamment un atome de chlore, - n représente un nombre entier variant de 1 à 5, - R'1, R'2, R'3 et R'4, représentent un atome d'hydrogène, ou R'1 en association avec R1 et Na forment un hétérocycle, et/ou R'2 en association avec R2 et Na forment un hétérocycle, et/ou R'3 en association avec R3 et N forment un hétérocycle, et/ou R'4 en association avec R4 et Np forment un hétérocycle, lesdits hétérocycles étant aromatique ou non et comportant de 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle, - R1, R2, R3 et R4, lorsqu'ils ne sont pas associés respectivement avec R'1, R'2, R'3 et R'4 pour former un hétérocycle avec Na ou Np, représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle (linéaire ou ramifié) de i à 10 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de la chlorométhylX- rosamine (CMXRos), de formule suivante: II 1.+ N (e CHZ a 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies dans lesquelles intervient une modification, dans le sens d'une diminution ou d'une augmentation, du processus d'apoptose, et/ou pour la mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de l'évolution de telles pathologies, notamment au cours du traitement thérapeutique de ces dernières. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une augmentation du processus d'apoptose, notamment les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires, les processus dégénératifs lymphocytaires, notamment le SIDA. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une diminution du processus d'apoptose, notamment tumeurs, aplasies, cancers. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l'apoptose. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation toxicologique de produits, notamment d'intérêt thérapeutique. 11. Méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial, caractérisée en ce qu'elle comprend: - une étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales, notamment de cellules sanguines, avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, - le cas échéant, la fixation des cellules susmentionnées, après l'étape d'incubation précédente, ladite fixation étant avantageusement effectuée à l'aide de formaldéhyde, - la mesure, notamment par analyse cytofluorométrique, de la quantité dudit composé intégrée, lors de l'étape d'incubation précédente, dans lesdites cellules. 12. Méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11, dans laquelle: - l'étape d'incubation est effectuée entre d'une part une population de cellules provenant d'un échantillon biologique prélevé sur ledit patient, notamment du sang, ou des préparations dérivées de sang telles que des préparations de leucocytes, et, d'autre part au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, - l'éventuelle modification du processus d'apoptose est détectée et/ou mesurée par comparaison à un témoin normal correspondant à la mesure de la quantité du même composé que celui utilisé lors de l'étape d'incubation précédente et intégrée dans une population identique à la précédente et provenant d'un échantillon biologique prélevé chez un individu sain. 13. Méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, telles que définies dans la revendication 7, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 12, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré- apoptotique ou apoptotique qui est supérieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une augmentation du processus d'apoptose chez ce patient. 14. Méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, telles que définies dans la revendication 8, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 12, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré- apoptotique ou apoptotique qui est inférieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une diminution du processus d'apoptose chez ce patient. 15. Méthode de diagnostic in vitro et/ou de suivi de pathologies liées à une augmentation ou à une diminution du processus d'apoptose selon la revendication 13 ou la revendication 14 respectivement, caractérisée en ce que l'étape d'incubation de la population de cellules avec ledit composé selon l'une des revendications 1 à 3, est précédée par, et/ou suivie par, et/ou effectuée avec une étape d'incubation de cette même population de cellules avec des marqueurs cellulaires autres que ledit composé, ces autres marqueurs étant spécifiques desdites pathologies, notamment des anticorps marqués spécifiques d'antigènes hétérologues ou d'autoantigènes du patient présents dans lesdites cellules, ces antigènes ou autoantigènes étant spécifiques desdites pathologies. 16. Méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l'apoptose, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits d'intérêt thérapeutique. 17. Méthode d'évaluation toxicologique de produits, notamment d'intérêt thérapeutique, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits. 18. Trousses pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 17, contenant au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 4, et, le cas échéant, un fixant cellulaire, tel que du paraformaldéhyde, ainsi qu'un protocole d'utilisation contenant notamment les valeurs standard d'apoptose chez un individu sain.