Brevet FR2749857A1 — publié le 19971219

GENERATION DE MOLECULES REPLICATIVES IN VIVO La présente invention concerne des molécules d'ADN circulaires et réplicatives, utilisables en thérapie génique. L'invention décrit également une méthode particulièrement efficace pour leur génération in situ à partir d'un vecteur viral correspondant. La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc.) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des vecteurs de diverses natures. Il peut s'agir de vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques d'une part ou de vecteurs viraux d'autre part. A titre illustratif des vecteurs viraux, on peut notamment citer les complexes d'ADN et de DEAEdextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), les liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Toutefois, leur utilisation implique notamment la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno-associés,...) sont très efficaces, comparativement aux vecteurs chimiques et/ou biochimiques précédemmment décrits, notamment pour le passage des membranes. Parmi ces virus, les adénovirus présentent tout particulièrement, des propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables de transduire des cellules en division ou bien des cellules quiescentes et le génome de l'adenovirus persiste sous forme extrachromosomale, de plus ils n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. En revanche, l'utilisation du retrovirus dont le génome s'intègre de façon aléatoire dans le génome de la cellule infectée est limité aux cellules en division. Les adénovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans des cellules quiescentes musculaires (myotubes; Ragot et al., Nature 361 (1993) 647)), hépatiques (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), nerveuses (AMi et al., Nature genetics 3 (1993) 224), épithéliales bronchiques (Rosenfeld et al., 1992) , etc. Cependant dans les tissus à renouvellement rapide on observe une perte progressive de l'expression du transgène par effet de dilution au cours des divisions cellullaires. L'amélioration des vecteurs adénoviraux et le développement de nouvelles générations de vecteurs a porté sur la diminution des risques potentiels de pouvoir pathogène résiduels ainsi que de pouvoir immunogène liés à la réplication du vecteur, la recombinaison de son génome et l'expression de protéines virales. Pour prévenir au maximum de tels risques, les constructions de vecteurs viraux actuellement proposées sont modifiées de manière à rendre lesdits vecteurs incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Ils sont dits défectifs. Généralement, le génome des virus défectifs est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ainsi dans le cas particulier des adénovirus, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés des régions El et éventuellement E3 au niveau desquelles sont insérées les séquences d'ADN hétérologues (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). D'autres constructions comportent une délétion au niveau de la région El et d'une partie non essentielle de la région E4 (WO94/12649), ou une organisation génomique modifiée (FR 94 13355). Néanmoins, il demeure, lors de la production de ces vecteurs viraux défectifs, le risque de recombinaisons générant des particules virales réplicatives ou des transcomplémentations in vivo par des fonctions cellulaires de type El. Il est clair que l'utilisation en thérapie génique, de vecteurs ainsi contaminés, peut avoir des conséquences très néfastes comme par exemple induire une propagation virale et provoquer une dissémination incontrôlée avec des risques de réaction inflammatoire et de réponse immunitaire dirigée contre les protéines virales. etc... D'autre part, l'amélioration, de la stabilité de l'expression du transgène dans les cellules transduites par le vecteur adénoviral, et plus particulièrement dans les cellules en division reste un problème important à résoudre. En conséquence, il demeure à ce jour en thérapie génique, un besoin réel en vecteurs de transfert qui manifesteraient essentiellement les avantages de chacun des vecteurs précédemment décrits à savoir de bonnes propriétés de transfection, calquées par exemple sur celles des vecteurs viraux et en particulier celles des adénovirus et une parfaite innocuité se traduisant en particulier par une absence de génération de particules virales réplicatives in vivo, risque inexistant avec les plasmides ou vecteurs non viraux. L'objectif de la présente invention est précisément de proposer un nouveau concept de transfert de gènes satisfaisant aux exigences précitées. La présente invention réside notamment dans la génération in situ, via un vecteur viral, de molécules d'ADN circulaires, réplicatives, thérapeutiques et avantageuses sur le plan de la stabilité de l'expression du transgène et de l' innocuité. En effet, celles-ci sont dépourvues de toute séquence du génôme viral susceptible d'induire une réponse immunitaire de type inflammatoire ainsi qu'une réponse spécifique dirigée contre les protéines virales pouvant avoir un effet délétère sur l'organisme et limiter la durée d'expression du transgène. La présente invention a ainsi pour objet des molécules d'ADN circulaires, réplicatives et comprenant au moins; (i) un ou plusieurs gènes d'intérêt avec les séquences nécessaires à leur expression, (ii) une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules mammiferes, et, (iii) une séquence résultant de la recombinaison site-spécifique entre deux séquences reconnues par une recombinase. La présente invention découle en particulier de la mise au point d'un procédé et de constructions spécifiques, particulièrement efficaces pour la production de ces molécules d'ADN thérapeutiques. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention réside dans la production des molécules d'ADN thérapeutiques définies ci-avant à partir d'un vecteur viral. De manière inattendue, la demanderesse a ainsi mis en évidence qu'il était possible de générer in situ à partir d'un vecteur viral et ceci par recombinaison sitespécifique, une molécule d'ADN circulaire, à caractère thérapeutique et réplicative. De plus, dans un mode de realisation avantageux, le transgène et l'origine de réplication sont inactifs dans le vecteur viral, leur activité etant dependante de l'evenement de recombinaison site-specifique. Encore plus avantageusement, l'évènement de recombinaison est induit de façon conditionnelle par l'expression de la recombinase, ce qui offre un grand niveau de controle sur l'expression du gene d'interet et sur la replication des molecules episomiques produites. Un tel protocole est particulièrement avantageux sur le plan thérapeutique: - il tire partie des bonnes capacités de transfection manifestées de manière générale par les vecteurs viraux comparativement aux vecteurs non viraux, - il réduit considérablement les risques de contamination virale, de réaction inflammatoire locale ainsi que de réponse immunitaire antivirale, compte tenu de la faible quantité de vecteurs viraux mise en oeuvre. Ce dernier n'est introduit que dans une proportion nécessaire à la génération de la molécule d'ADN thérapeutique, - il permet d'elargir le domaine d'application de certains vecteurs viraux Ainsi, les vecteurs adenoviraux sont d'applications limitees dans les cellules proliferatives telles que les cellules souches hematopoietiques. La presente invention permet d'exploiter leur pouvoir infectieux pour generer dans des cellules proliferatives des molecules circulaires replicatives stables. La molécule d'ADN telle que revendiquée, possède donc la faculté d'assurer efficacement le transfert dans les cellules visées du ou des gène(s) thérapeutiques qu'elle contient. Pour ce faire elle contient une origine de réplication caractérisée notamment par le fait qu'elle est fonctionnelle dans des cellules de mammifères et humaines. Avantageusement, l'origine de replication utilisée est une origine de replication conditionnelle, c'est-à- dire dont l'activité peut être régulée. De manière encore plus preférée, l'origine de replication est disposée de telle sorte qu'elle soit inactive dans le vecteur viral, et active aprËs la recombinaison site-spécifique. Avantageusement, l'origine de réplication utilisée est d'origine eucaryote, virale ou mammifère. Un exemple préféré d'origine de réplication susceptible d' être mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention est plus particulièrement l'origine de réplication du virus Epstein Barr (EBV). Le virus de l'EBV appartient à la famille des Herpesviridae. Son origine de replication comprend deux éléments; la séquence oriP (1,7kb) responsable de la replication, dont l'activite est induite par la protéine codee par le gène EBNA1. Cette sequence peut etre portee en trans. Ces éléments permettent à eux seuls à la fois la réplication, le maintien épisomal et à la ségrégation de 5 à 20 copies par cellule d'un vecteur plasmidique. La séquence oriP est composée d'une répétition de 20 motifs de 30bp, séparée de 960bp de l'origine de réplication qui est formée d'un motif inversé répété de 65bp et comprend 4 copies imparfaites du motif de 30 bp. La protéine EBNA1 se fixe sur les motifs de 30bp au niveau de l'origine de réplication et permet le recrutement de facteurs cellulaires au moment de la phase S et la réplication, synchrone à la division cellulaire, d'un plasmide possédant la séquence oriP en cis. De plus EBNA1, vraisemblablement par la fixation simultanée au niveau des motifs répétés et de structures chromosomales, permet le maintien intranucléaire et la ségrégation de l'épisome au moment de la divison cellulaire. Des plasmides contenant l'origine de réplication oriP du génome d'EBV et permettant l'expression de la protéine virale EBNA1 (641 acides aminés) sont maintenus de façon épisomique stable dans les cellules humaines transfectées et leur réplication est synchrone à la division cellulaire (Lupton et Levine, 1985). L'origine de réplication peut également être dérivée des papillomavirus. Les papillomavirus utilisent un système de latence virale avec maintien episomique du genome analogue a celui du virus Epstein Barr (EBV). Ce systeme a particulierement ete etudie pour le papillomavirus bovin de type 1 (BPV-1). L'origine de replication de BPV est active en présence des proteines El et E2. Comme dans le cas d'EBV. le maintien épisomal est indépendant de la replication et est assuré par la fixation d'E2 au niveau de la sequence MME (minichromosome maintenance element), mais necessite aussi la presence d 'El. En revanche, contrairement au systeme oriP/EBNAl d'EBV, la replication de l'épisome n'est pas synchrone à la division cellulaire (Piirsoo et coll., 1996). L'origine de réplication peut encore être constituée de séquences capables de replication autonome, ou ARS (autonomously replicating sequences). Des ARS ont ete isolées à partir de chromosomes de mammifères, notamment l'homme et la souris. A titre préférentiel, on peut citer la séquence ARS localisée en amont du locus c-myc chez l'homme (Ariga et al., 1988)- et le fragment de 4kb du locus du gène de l'adenosine deaminase de la souris (Virta-Pearlman et al., 1993). En ce qui concerne le gène d'intérêt, il peut s'agir d'un gène thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire. Il contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin de transcription et de polyadénylation. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoique, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, le gène d'intérêt peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. On utilise avantageusement un promoteur d'origine virale choioi parmi le promoteur precoce du CMV ou le LTR d'un retrovirus ou un promoteur mammifere. Outre une origine de réplication et au moins un gène d'intérêt, les molécules d'ADN de l'invention comprennent une région résultant de la recombinaison spécifique entre deux séquences. Cette recombinaison site-spécifique peut être obtenue à partir de divers systèmes qui entraînent la recombinaison site-spécifique entre des séquences. Le système de recombinaison spécifique mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention en vue de la génération in situ des molécules d'ADN revendiquées peut être de différentes origines. En particulier, les séquences spécifiques et les recombinases utilisées peuvent appartenir à différentes classes structurales, et notamment à la famille de la recombinase du bactériophageP1. Plus préférentiellement, la recombinaison site-spécifique utilisée selon le procédé de l'invention est obtenue au moyen de deux séquences spécifiques qui sont capables de recombiner entre elles en présence d'une protéine spécifique, généralement désignée recombinase. C'est pour cette raison que les molécules d'ADN circulaires selon l'invention comprennent en outre une séquence résultant de cette recombinaison site spécifique. Les séquences permettant la recombinaison utilisées dans le cadre de l'invention comprennent généralement de 5 à 100 paires de bases, et, plus préférentiellement, moins de 50 paires de bases. Parmi les recombinases appartenant à la famille de l'intégrase du bactériophage 1, on peut citer notamment l'intégrase des phages lambda (Landy et ai., Science 197 (1977) 1147), P22 et F80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), l'intégrase Cre du phage P1, l'intégrase du plasmide pSAM2 (EP 350 341) ou encore la FLP recombinase du plasmide 2 m de la levure Saccharomyces cerevisiae. Lorsque les molécules d'ADN selon l'invention sont préparées par recombinaison au moyen d'un système site spécifique de la famille de l'intégrase du bactériophage lambda, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence résultant de la recombinaison entre deux séquences d'attachement att du bactériophage ou plasmide correspondant. Parmi les recombinases appartenant à la famille du transposon Tn3, on peut citer notamment la résolvase du transposon Tn3 ou des transposons gd, Tn21 et Tn522 (Stark et al., 1992) ; l'invertase Gin du bactériophage mu ou encore la résolvase de plasmides, telle que celle du fragment Zr de RP4 (Abert et ai., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Lorsque les molécules d'ADN selon l'invention sont préparées par recombinaison au moyen d'un système site spécifique de la famille du transposon Tn3, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence résultant de la recombinaison entre deux séquences de reconnaissance de la résolvase du transposon considéré. Selon un mode de réalisation préféré, dans les constructions génétiques de la présente invention, les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées d'un bactériophage. Plus préférentiellement, il s'agit des séquences d'attachement (séquences attP et attB) d'un bactériophage ou de séquences dérivées. Ces séquences sont capables de recombiner spécifiquement entre-elles en présence d'une recombinase désignée intégrase. Le terme séquence dérivée inclut les séquences obtenues par modification(s) des séquences d'attachement des bactériophages, conservant la capacité de recombiner spécifiquement en présence de la recombinase appropriée. Ainsi, il peut s'agir de fragments réduits de ces séquences ou au contraire étendus par addition d'autres séquences (sites de restriction, etc). ll peut également s'agir de variants obtenus par mutation(s), notamment par mutation(s) ponctuelle(s). On désigne selon Invention par séquences attP et attB d'un bactériophage ou d'un plasmide les séquences du système de recombinaison spécifique dudit bactériophage ou plasmide, c'est-à-dire la séquence attP présente dans ledite phage ou plasmide et la séquence attB chromosomique correspondante. A titre d'exemples préférés, on peut citer notamment les séquences d'attachement des phages lambda, P22, F80, P1, HP1 de Haemophilus influenzae ou encore du plasmide pSAM2, ou 2 m. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées du système de recombinaison du phage P1. Ce phage Pi possède une recombinase du nom de Cre qui reconnaît spécifiquement une séquence nucléotidique de 34 paires de bases appelée site lox P. Cette séquence est composée de deux séquences palindromiques de 13pb séparées par une séquence conservée de 8pb. Dans une variante particulière, l'invention concerne donc une molécule d'ADN circulaire et réplicative comprenant (a) une séquence issue de la recombinaison site spécifique entre deux régions loxP du bactériophage P1, au moins un gène d'intérêt et une origine de réplication fonctionnelle dans les cellules de mammifères et humaines et qui selon un mode préférentiel possède une fonctionnalité conditionnelle. A cet égard, la présente invention fournit également des constructions géniques particulières appropriées à la production des molécules d'ADN thérapeutiques définies ci-avant. Ces constructions géniques, ou ADN recombinants selon l'invention comprennent notamment le ou les gènes d'intérêt, l'origine de réplication et le gène de la protéine EBNA1 encadrés par les deux séquences permettant la recombinaison site-spécifique positionnées en orientation directe. Ces séquences peuvent être clonées sous forme de cassettes dans des plasmides bactériens. L'ADN plasmidique pouvant, dans un premier temps, être transfecté dans des cellules humaines afin de tester la fonctionnalité de ces séquences. Ces cassettes sont ensuite utilisées pour construire des vecteurs viraux possédant ces mêmes séquences intégrées dans leur génôme. Comme indiqué précédemment, un autre aspect de la présente invention réside dans un procédé de production in situ de molécules d'ADN thérapeutiques définies ciavant à partir d'un vecteur viral par recombinaison site-spécifique. L'emploi d'un tel vecteur permet avantageusement d'optimiser l'administration de la molécule d'ADN revendiquée dans les cellules à traiter. A cet égard, la présente invention a également pour objet un vecteur viral comprenant, inséré dans son génome, au moins une région d'ADN encadrée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique et positionnées en orientation directe, ladite région d'ADN comportant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt. Selon un mode privilégié de l'invention, l'origine de réplication ainsi que le gène d'intérêt intégrés dans le vecteur viral sont présents sous une forme inactivée, le promoteur étant cloné en orientation directe à l'une des extrémités de la cassette d' expression (figure 1). Après recombinaison entre les deux sites LoxP le promoteur se retrouve devant le gène d'intérêt et séparé de ce dernier par un site LoxP, le premier ATG du transcrit correspondant au codon d'initiation du transgène. La séquence oriP n est active qu'en présence de la protéine EBNA1 celle-ci est exprimée sous le contrôle du même promoteur que le transgène , sous forme d'un messager bi cistronique. La traduction d'EBNA1 est initiée par un mécanisme d'initiation interne au niveau d'une séquence IRES dérivée du virus de l'encéphalomyoeardite (ECMV), de la famille des picornavirus. L'expression du transgène et de la protéine EBNA1 ainsi que la réplication du plasmide sont donc directement conditionnés par l'évènement de recombinaison entre les deux sites LexP. Le vecteur viral utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transduire les cellules animales et de préférence les cellules humaines. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès (HSV) ou des rétrovirus. I1 est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique hétérologue d'intérêt. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son gênome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad2 ou Ad5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple; Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple; SAV). Préférentiellement, les vecteurs viraux de l'invention sont des adénovirus défectifs comprenant inséré dans leur génome, une séquence génique comportant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt et encadrée par deux séquences positionnées en orientation directe. Celles -ci permettent d'induire une activité conditionnelle de l'origine de réplication et du transgène, par l'intermédiaire de la recombinaison site spécifique, dépendant de la présence de la recombinase. Avantageusement, dans le génome de ces adénovirus de l'invention, la région El au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4 et la région d'ADN encadrée par les deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique est insérée au niveau de la région El inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans les régions El et E4 et la région d'ADN encadrée par les deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique est insérée au niveau de la région E4 inactivée. Les vecteurs revendiqués sont obtenus par recombinaison avec des plasmides tels que définis précédemment c'est à dire caractérisés par le fait qu'ils comprennent entre deux régions de recombinaison site-spécifiques, au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt à activité conditionnelle. En ce qui concerne plus particulièrement les définitions de l'origine de réplication, des deux séquences permettant une recombinaison site spécifiques et du gène d'intérêt, présents dans la région d'ADN intégrée dans le vecteur viral revendiqué, on se reportera aux définitions précitées. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre les séquences d'ADN de l'invention, ou par construction d'un genmome viral chez E. coli. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 No) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239 constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par cotransfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant les séquences nucléiques de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env > . Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et les séquences de l'invention est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. A titre de vecteurs préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement proposer des adénovirus comprenant dans leur génome une région d'ADN conforme à l'invention et bordée par des séquences répétées inversées du bactériophage P1 (région loxP) positionnées en orientation directe. A titre illustratif de ce type de vecteurs, on peut plus particulièrement citer les constructions suivantes avec le gène de la bgalactosidase (LacZ) ou le gène de la thymidine kinase du virus de l'Herpes (TK), (figure 1). Le gene d'interet peut etre tout gene (ADNc, ADNg, ARN, acide nucleique synthetique ou semi-synthetique) codant pour un ARN ou une proteine therapeutique ou vaccinale telle que des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (W091/19813) etc. Le gène d'intérêt peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les vecteurs de l'invention sont particulièrement adaptés à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes tueurs capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Le système de l'invention permet en effet de produire des vecteurs notamment viraux contenant ces séquences sans toxicité pour les cellules de production, puis ensuite d'induire l'expression de ces molécules toxiques sélectivement dans des cellules cibles apres recombinaison site-specifique. Ce type de construction est donc particulièrement adapté à des stratégies de thérapies antitumorales par exemple, dans lesquelles l'objectif est de détruire sélectivement les cellules affectées. Ce système est également particulièrement intéressant pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont une production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très marqués. La présente invention vise également toute cellule eucaryote transfectée par au moins un vecteur viral ou une molécule d'ADN, selon l'invention telle que définie ciavant. Un autre objet de la présente invention réside dans un procédé de production d'une molécule d'ADN telle que définie ci-avant selon lequel une culture de cellules hôtes contenant un vecteur viral selon l'invention est mise en contact avec la recombinase permettant d'induire la recombinaison site-spécifique. Plus précisément la présente invention concerne de manière générale tout procédé de préparation caractérisé en ce qu'il met en présence: (i) des cellules hôtes modifiées contenant au moins un vecteur viral, ledit vecteur comprenant dans son génome au moins une région d'ADN, encadrée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique et positionnées en orientation directe, ladite région comprenant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt et (ii) la recombinase permettant d'induire in situ la recombinaison site-spécifique, en vue de générer lesdites molécules d'ADN circulaires et réplicatives. Différents protocoles peuvent être proposés dans le cadre de la présente invention pour effectuer cette mise en contact du vecteur viral avec la recombinase spécifique. Elle peut notamment être réalisée au niveau de la cellule hôte soit par cotransfection avec un plasmide ou co-infection avec un vecteur viral contenant le gène de la dite recombinase; soit par induction de l'expression d'un gène codant pour la dite recombinase directement présent dans le génome de ladite cellule hôte. Le gène codant pour la recombinase peut donc être présent dans la cellule hôte sous une forme intégrée au génome, sur un plasmide ou encore sur un vecteur viral annexe de type adénovirus par exemple. Dans ce cas, le vecteur viral mis en oeuvre en vu de générer la molécule d'ADN selon l'invention, est tel que défini ci-avant. Selon une autre méthode, la cassette d'expression du gène est portée sur le vecteur viral également responsable de l'expression du gène d'intérêt. Dans ce cas particulier, le procédé selon l'invention met en oeuvre un vecteur viral comprenant dans son génome outre une région d'ADN délimitée par deux séquences codant pour des sites de recombinaison spécifique et comprenant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt, une cassette d'expression du gène de la recombinase. Un tel vecteur constitue un autre objet de la présente invention. Selon un mode préféré de l'invention, il serait par ailleurs souhaitable de pouvoir contrôler et en particulier d'induire l'expression de cette recombinase au sein de la cellule hote. A ces fins, il est avantageusement propose dans le cadre de la présente invention de contrôler l'expression du gène codant pour la recombinase. Pour ce faire il est proposé de placer l'expression dudit gène sous contrôle d'un élément régulateur. Il peut notamment s'agir d'un promoteur inductible, permettant de contrôler les niveaux et/ou les périodes d'expression de ce gène comme par exemple le promoteur du LTR de MMTV (Pharmacia), qui est induit par la déxaméthasone ou un promoteur régulé par la tétracycline (W094/29442; W094/04672). ll est entendu que d'autres promoteurs peuvent être utilisés, et notamment des variants du LTR de MMTV portant par exemple des régions hétérologues de régulation (régions "enhancer" notamment), Dans un autre mode de réalisation, l'expression du gène codant pour la recombinase est sous le contrôle de promoteurs régulés afin d'éviter soit une accumulation constitutive de ladite protéine dans la cellule hôte, ou pour minimiser la "fuite" vers le compartiment nucléaire et une certaine cytotoxicité. Il peut ainsi leur être associés des éléments qui fonctionnent comme des domaines de transactivation de transcription. A titre représentatif de ce type d'éléments on peut notamment citer les récepteurs d'hormones incluant les récepteurs stéroides, d'acide rétinoique et thyroïdes parmi lesquels on peut plus particulièrement citer ceux des glucocorticoides, minéralcorticoides, thyroïdes, oestrogène, aldostérone et acide rétinoique. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant au moins un vecteur viral selon l'invention ou une cellule transfectée selon l'invention. Ces compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux d'utiliser directement les cellules d'encapsidation ou des cellules infectées ex vivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo-organes (W094/24298). Les doses de vecteur utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 106 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Selon le gène d'intérêt, présent dans les molécules d'ADN de l'invention ou les régions intégrées dans le gènome desdits vecteurs viraux ceux-ci peuvent être utilisées pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (myodystrophie, mucoviscidose, etc), les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou awr dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. Légende des figures Tableau 1: Origine des séquences utilisées pour la construction de épisome Figure 1: Schéma de construction de l'épisome Figure 2: Representation de la structure de l'episome. Figure 3: Séquence entre le promoteur (P-RSV) et la cassette d'expression (TK-CITE-EBNA1) dans le plasmide pLoxP-ori-TK- EBNA1 (A) et dans l'épisome après recombinaison (B, C et D) Figure 4: Schéma des étapes de clonage de la cassette LoxP-on-TK-EBNAl FigureS: Schéma des étapes de clonage de la cassette LoxP-ori-LacZ EBNA1 Techniques générales de clonage et de biologie moléculaire Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E. coli, la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., 1989, Ausubel et al 1987). Les séquences nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté (Ausubel et ai., 1987). Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham). Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose à 0,7 % ou d'aciylamide à 8 %, purifiés par électrophorèse puis électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs > . Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en b par un groupement cyanoéthyl (Sinha et al., 1984, Giles 1985) avec le synthétiseur automatique d'ADN Biosearch 8600 en utilisant les recommandations du fabricant. Les ADN plasmidiques sont purifiés suivant la technique de lyse alcaline (Maniatis et ai., 1989). EXEMPLES Exemple 1. Description d'un vecteur conforme à l'invention (figures 1-3) La Figure 1 decrit la structure generale d'un vecteur selon l'invention et, plus particulierement, de la region comprise entre les sequences permettant la recombinaison site-specifique. Une construction plus detaillee est donnee sur la figure 2. L'orientation du promoteur (P) et de la cassette d'expression du transgène (TG) et de la protéine EBNA1 est indiquée par des flèches et ne permet donc l'expression de ces deux gènes qu'après recombinaison en présence de la recombinase Cre. Le détail des séquences entre le promoteur (P) et le gene apres recombinaison est présenté dans la figure 3. Sur cette figure, le promoteur est le LTR du virus RSV (P RSV) et le gène est le gene de la thymidine kinase TK. Le premier ATG de l'ARN messager, correspondant à celui du gène TK, est souligné. Comme illustre sur la figure 1, l'expression d'EBNA-1 est obtenue à partir d'un messager polycistronique par initiation interne de la traduction en utilisant la séquence IRES (Internal Ribosome Entry Site) aussi appelée séquence CITE ("Cap Independent Translation Entry") du virus de 1 'Encephalomyocardite (ECMV). La séquence signal de fin de transcription et de polyadénylation du virus SV40 (pA) a été introduite à l'extrémité 3' de la séquence codante d'EBNA1. La séquence oriP est placée entre la cassette d'expression TK EBNA-1 et le promoteur RSV. Cette séquence n'est active pour la réplication qu'en présence d'EBNA-1, par conséquent, elle ne fonctionne qu'après recombinaison et formation de l'épisome. Exemple 2. Construction des plasmides LoxP-oriP-TK-EBNAl et LoxPori-LacZ-EBNAl Les étapes de la construction des plasmide sont présentées dans les figures 4 et 5 et l'origine des séquences utilisées est résumée dans le tableau 1. 2.1. Construction du plasmide pLoxP-oriP-TK-EBNA1 (Figure 4) 1. Le plasmide pSLori a ete digere avec les enzymes de restriction HpaI et EcoRI et le fragment de 1817 bp obtenu, correspondant a la sequence d'oriP, a ete clone entre les sites SmaI et EcoRI du plasmide pIC19H prealablement dephosphoryle, pour donner le plasmide pIC-ori (Figure 4A). 2. Le plasmide pIC-ori a ete digere aux sites HindIII et BglII, dephosphoryle, et le fragment de 1900 pb obtenu a ete clone entre les sites HindIII (174) et BamHI (208) du vecteur pBS246 pour donner le vecteur pLox-ori (Figure 4A). 3. Le fragment BamHI-SalI de 399 bp du vecteur pCEP4, correspondant a la sequence du signal d' arret de transcription et de polyadenylation du virus SV40, a ete repare avec i' ADN polymerase Klenow puis clone entre les sites SmaI et SalI (repare avec l'ADN polymerase Klenow) du vecteur pIC20R prealablement dephosphoryle, pour donner le vecteur pICpA (Figure 4A). 4. La sequence IRES d'ECMV comprise entre les nucleotides 16 et 518 du vecteur pCITE-2 a ete amplifiee par PCR a l'aide des oligonucleotides synthetiques 1 (5'-GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3') et 2 (5' GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3' > comprenant les sites XbaI et PvuII (oligo 1) et BamHI (oligo 2) a leur extremite 5'. Le produit obtenu a ete digere avec les enzymes de restriction XbaI et BamHI et clone entre les sites XbaI et PstI du vecteur pCMV-EBNA1 prealablement dephosphoryle, pour donner le vecteur pCITE EBNA1. La sequence comprise entre l'ATG 12 de l'IRES, correspondant au codon d'initiation de la traduction, et le codon serine suivant le codon methionine de la proteine EBNA1, a ete deletee par mutagenese dirigee a l'aide de la technique PCR (ex-site PCR). La sequence complete de l'IRES et d'EBNA1 obtenue apres PCR a ete entierement sequencee (Figure 4A). 5. Le fragment XbaI-PstI du vecteur pCITE-EBNA1 (2546 bp) a ete clone entre les sites XbaI et PstI du plasmide pICpA prealablement dephosphoryle, pour donner le vecteur pCITE-EBNA1-pA (Figure 4A). 6. Le fragment ClaI-EcoRI du vecteur pCITE-EBNAi-pA (2945 pb) a ete clone dans le vecteur pLox-ori, digere de facon partielle au site EcoRI situe a l'extremite d'ori, puis digere avec ClaI et dephosphoryle pour donner le vecteur pLox-ori-CITE-EBNAl-pA (Figure 4B). 7. Le fragment ClaI-BsaW1 (1270 pb) du vecteur pCMV-TK, obtenu par digestion partielle avec BsaW1 et reparation du site BsaW1 avec l'ADN polymerase Klenow, a ete clone entre les sites ClaI et PvuII du vecteur pLox-ori-CITE-EBNAl- pA pour donner le vecteur pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA (Figure 4B). 8. Le fragment BamHI-SalI (600 pb) du plasmide pRSV-TK, correspondant a la sequence du promoteur du LTR de RSV, a ete clone entre les sites BamHI et SalI du vecteur pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA, prealablement dephosphoryle, pour donner le plasmide pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNA1-pA (Figure 4B). 2.2. Construction du plasmide pLoxP-oriP-LacZE:BNA1 (Figure 5) Les clonages 1-6 decrits dans l'exemple 2.1 ci-dessus et illustres sur la figure 4A sont communs a la construction des vecteurs pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNA1- pA et pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA. 7. Le clonage du promoteur du LTR de RSV a ete effectue selon l'etape 7. de l'exemple 2.1. (Figure 5). 8. La fragment BamHI-StuI (3205 pb) du vecteur pRSV-GalIX, correspondant au gene LacZ precede d'un signal de localisation nucleaire (NLS), a ete clone entre les sites 5maI et BglII du vecteur pIC20H, prealablement dephosphoryle, pour donner le plasmide pICLacZ (Figure 5). 9. Le fragment XbaI-NruI (3205 pb) du vecteur pICLacZ a ete clone entre les sites XbaI et PvuII du vecteur pLox-ori-pRSV-CITE-EBNA1-pA pour donner le vecteur pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA (Figure 5). Exemple 3. Validation du système par co-transfection de cellules humaines (Hela-EBNAl; 143B-TK-) à l'aide des plasmides CMV-Cre (pBS185) et LoxP-oriP-TK-EBNA. 1 ou LoxP-oriP-LacZ-EBNAî. 3.1. Validation in vitro Une lignée de cellules Hela exprimant le gène EBNA1 de façon stable a ete transfectée avec les plasmides pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1 et un plasmide exprimant le gene de la recombinase Cre sous le controle du promoteur du cytomegalovirus (pBS185). L'efficacité de recombinaison et la fonctionnalité de la cassette d'expression du gène LacZ ont ete évaluées par l'activité bgalactosidase dans les cellules, observee uniquement en presence de la recombinase Cre. Les resultats obtenus démontrent l'efficacité de génération du réplicon sous l'action de la recombinase Cre, mise en évidence par l'activation de l'expression du gène LacZ après recombinaison entre les sites LoxP et formation de l'épisome. De plus, apres 3 semaines de culture des cellules co-transfectees [passage une fois par semaine (dilution 1:10)], on observe un maintien de la proportion de cellules exprimant le gene LacZ, alors que l'expression de LacZ a disparu dans les cellules transfectees avec le plasmide controle ne possedant pas l'origine de replication oriP, ce qui demontre le caractere fonctionnel d'orin dans la construction. De la meme facon, une lignée de cellules TK- (143TK-) est co-transfectée par les plasmides LoxP-ori-TK-EBNAl et pBS185. Les cellules transfectées exprimant le gène TK sont sélectionnées en milieu HAT. La stabilité de l'expression du gène TK au cours des divisions cellulaires et donc l'activité du système oriP-EBNAl est vérifiée par immunofluorescence, à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique de la protéine TK du virus de l'Herpès. La présence de l'épisome et sa transmission au cours des divisions cellulaires est mise en évidence par la technique du Hirt, suivie d'une amplification de l'ADN épisomique par la technique PCR, à l'aide d'amorces spécifiques. 3.1. Validation in vivo L'activite de ces constructions in vivo est testee par injection intratumorale (electroporation) d'ADN des plasmides pLoxP-ori-TK-EBNAl ou pLoxP-ori-LacZ EBNA1 et pBS185 dans des tumeurs induites par injection sous-cutannee de cellules Hela ou Hela-EBNA1 chez la souris nude. L'injection de cellules prealablement cotransfectees avec ces memes plasmides est effectuee en parallele. Le maintien du transgene (TK ou LacZ) dans les tumeurs transduites par ces constructions est analyse par immunohistochimie, par comparaison a un plasmide controle ne possedant pas l'origine de replication. Exemple 4. Construction des adenovirus recombinés de 1ère génération et de 3ième génération à partir des plasmides pBS185, pLoxP-oriP-TK-EBNAl et pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1. Cet exemple decrit la construction de vecteurs viraux selon l'invention, comprenant une region pouvant generer, par recombinaison site-specifique, une molecule circulaire et replicative in vivo. Ces vecteurs viraux comprennent en outre une sequence codant poyur la recombinase permettant la recombinaison. 4.1. Preparation d'adenovirus de 1ère génération La cassette d'expression de la recombinase Cre et la séquence complète du réplicon incluant les sites LoxP sont clonés à partir des vecteurs pBS185 et pLox- oriP-TK-EBNA1 ou pLoxP-oriP-LacZEBNA1 dans la région El de vecteurs adénoviraux comprenant une deletion de tout ou partie de la region El (Addl327; DE1-DE3). Les adénovirus recombinants sont isolés par les techniques classiques de recombinaison homologue dans les cellules 293. Les vecteurs viraux peuvent egalement etre prepares par double recombinaison dans E.Coli à l'aide de plasmides contenant le génome de l'Adéno 5 DE1DE3, le genome viral etant ensuite encapsule dans une particule adeno vira le dans une lignee appropriee. 4.2. Preparation d'adenovirus de 3eme génération L'utilisation d'adenovirus de 3eme generation présente certains avantages par rapport à ceux de 1ère génération; non seulement sur le plan de l'innocuité mais aussi de la diminution de la réponse inflammatoire et de l'augmentation de la stabilité de l'expression du transgène. Les vecteurs de 3ième génération (Ad007; DE1DE3DE4) peuvent egalement etre prepares par les techniques classiques de recombinaison homologue dans les cellules d'empaquetage appropriees (REF) ou par double recombinaison dans E.Coli puis empaquetage. Exemple 5. Validation du système par co-infection avec les deux adénovirus recombinés: La fonctionalite des vecteurs viraux de l'invention est controlee in vitro et in vivo: - in vitro, par infection de lignées de cultures de cellules (Hela; 143B-TK-; HT29) - in vivo, par administration dans des cellules normales (modèle de kératinocytes humains greffés chez la souris nude) ou cancéreuses (modèle de tumeurs intestinales produites par les cellules HT29 chez la souris nude). L'expression des gènes TK et LacZ et la stabilité de l'épisome au cours des divisions cellulaires sont vérifiées par les techniques précédemment décrites. Tableau 1 Origine des séquences utilisées pour la construction de l'épisome Sequence Fragment Taille (pb) origine LoxP NotI 34 pBS246 (GIBCO-BRL) (1-296) LTR de RSV BamHI-SalI 602 pRSV-TK (WO95/14101) (478-1080) v oriP EcoRI-HpaI 1817 pSLori (W095/14101) (5052-3235) SV40 polyA BamHI-SalI 399 pCEP-4 (In Vitrogen) (406-7) EBNA-1 BamHI-PstI 2044 pCMV-EBNA (Clontech) (759-2803) IRES (16-518) 502 pCITE 2a (Novagen) TK claI-BsawI 1165 pCMV-TK-E1 Gene Therapy (172il556) 3 (1996) 315) pIC19H 2700 Marsh et al., Gene 32 pIC20H 2700 (1984) 481 pIC20R 2700 pBluescriptII-KS 2850 (Stratagene) hCMV BgllI-BglII 753 pCEP4 (IN VITROGEN) (473-1226) LacZ StuI-BamH1 3205 pRSVGalIX (L.Stratford (1149-4354) Perricaudet, J.Clin.Invest 1992 p 626) hCMV-Cre-MTpA HindIII-HindIII 3400 pBS185 (GIBCO-BRL) (0-3400) REVENDICATIONS 1. Vecteur viral comprenant une région d'ADN encadrée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique et positionnées en orientation directe, ladite région comportant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt. 2. Vecteur viral selon la revendication 1 caractérisé en ce que Origine de réplication est choisie parmi l'origine de replication du virus EBV, l'origine de replication du virus du papillome, et les sequences ARS. 3. Vecteur viral selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'origine de réplication est conditionnelle. 4. Vecteur viral selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'activite de l'origine de réplication est dependante de la recombinaison site-spécifique. 5. Vecteur viral selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'origine de réplication comprend la region oriP du virus EBV et une sequence codant pour la proteine EBNA1 dont l'expression est dependante de la recombinaison site-spécifique. 6. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 a 5 caractérisé en ce que l'expression du gène d'intérêt est dependante de la recombinaison site-spécifique. 7. Vecteur viral caractérisé en ce qu'il comprend une région d'ADN délimitée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique et positionnées en orientation directe, ladite région comprenant successivement un promoteur fonctionnel dans les cellules mammiferes, la séquence oriP du virus EBV, une cassette d'expression comportant un gène et le gène de la protéine EBNA1 séparés par une séquence IRES dérivée du virus ECMV, le promoteur et la cassette d'expression etant orientés de telle sorte que l'expression des deux genes n'est possible qu'apres la recombinaison site-spécifique. 8. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 a 7 caractérisé en ce que les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont des séquences capables de recombiner spécifiquement en présence d'une recombinase. 9. Vecteur viral selon la revendication 8 caractérisé en ce que les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées d'un bactériophage. 10. Vecteur viral selon la revendication 9 caractérisé en ce que les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées du bactériophage P1. 11. Vecteur viral selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit des séquences répétées inversées du bactériophage P1 (région loxP), dont la recombinaison est induite par la recombinase Cre. 12. Vecteur viral selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend en outre, hors de la région délimitée par les deux séquences permettant une recombinaison site spécifique, le gène codant pour la recombinase correspondante. 13. Vecteur viral selon la revendication 12 caractérisé en ce que le gène codant pour la recombinase est placé sous contrôle d'un promoteur inductible. 14. Vecteur viral selon la revendication 13 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur MMTV inductible par la déxaméthasone et un promoteur inductible par la tétracycline. 15. Vecteur viral selon la revendication 13 caractérisé en ce que le gene de la recombinase comprend en outre un élément régulateur codant pour le domaine de liaison d'un récepteur d'une hormone. 16. Vecteur viral selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un récepteur choisi parmi les récepteurs de glucocorticoïde, mineralcorticoide, thyroïde, oestrogène, aldostérone et acide rétinoique. 17. Vecteur viral selon l'une des revendications precedentes caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant défectif. 18. Vecteur viral selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus comprenant une délétion de tout ou partie de la région El. 19. Vecteur viral selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus comprenant en outre une délétion de tout ou partie de la région E4. 20. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 a 16 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus recombinant défectif. 21. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un AAV recombinant défectif. 22. Cellule modifiee par insertion d'un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 21. 23. Cellule selon la revendication 22 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote. 24. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 21 ou une cellule selon la revendication 22. 25. Procédé de préparation in situ de molécules d'ADN circulaires réplicatives caractérisé en ce que une population de cellules contenant un vecteur viral selon la revendication 8 est mise en présence de la recombinase permettant d'induire in situ la recombinaison site-spécifique. 26. Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que la mise en présence avec la recombinase est effectuée par transfection ou infection desdites cellules avec un plasmide ou un vecteur viral contenant le gène de ladite recombinase. 27. Procédé de préparation in situ de molécules d'ADN circulaires réplicatives comprenant: (i) la transformation de cellules au moyen d'un vecteur viral comprenant: - une région d'ADN encadrée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique en presence d'une recombinase et positionnées en orientation directe, ladite région comportant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt, et, - le gène codant pour ladite recombinase sous controle d'un promoteur inductible, et, (ii) l'induction de l'expression de la recombinase. 28. Utilisation d'un vecteur viral pour generer in situ des molécules d'ADN circulaires réplicatives. 29. Procede pour le transfert d'acides nucleiques dans une cellule comprenant (i) la transformation de cellules au moyen d'un vecteur viral comprenant: - une région d'ADN encadrée par deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique en presence d'une recombinase et positionnées en orientation directe, ladite région comportant au moins une origine de réplication et un gène d'intérêt, et, - le gène codant pour ladite recombinase sous controle d'un promoteur inductible, et, (ii) l'induction de l'expression de la recombinase. 30. Molécule d'ADN circulaire réplicative caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (i) un ou plusieurs gènes d'intérêt avec les séquences nécessaires à leur expression, (ii) l'origine de réplication oriP du virus EBV, et, (iii) une région résultant de la recombinaison spécifique entre deux séquences.