Brevet FR2751972A1 — publié le 19980206

La présente invention concerne de nouveaux composés apparentés à la famille des amidiniums dont en particulier les guanidiniums, des compositions pharmaceutiques les contenant et leurs applications. Plus précisément, la présente invention se rapporte à des composés de formule générale I et leurs sels dans laquelle: - R1 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, dans laquelle: - n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4, - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III dans laquelle p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à O ou 1, avec pour r égal à 1 X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2. avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5. A titre de sous-famille préférée, on citera plus particulièrement dans le cadre de la présente invention les composés de formule générale I dans laquelle R2 ou R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule IV dans laquelle n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V avec q et r définis comme précédemment, et avec m, n, p? q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3. Ces nouveaux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoïque, fumarique, méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine). A titre représentatif des composés selon l'invention on peut plus particulièrement citer les composés de sous-formules générales suivantes: (H2N)2+ C- NH - (CH2)2 -NH -COO- R1 VI [(H2N)2+ C- NH - (CH2)3 ] [(H2N)2 C± NH - (CH2)4 ] -N-COO - R1 VII [(H2N)2+ C- NH - (CH2)2 ] 2- N-( CH2)2 -NH -COO- R1 VIII [(H2N)2+ C- (CH2)2]2 N - COO - R1 IX [ [(H2N)2+ C- (CH2)2] 2- N-( CH2)2] 2N - COO - R1 X dans lesquelles R1 possède la définition précédente. A titre représentatif des guanidiniums et amidiniums revendiqués, on peut plus particulièrement citer les composés des sous formules précédentes VII ,VIII et IX avec R1 y représentant un groupement cholestéryle. Les trois composés seront respectivement identifiés ci-après sous la désignation BGSC ( Bis Guanidino Spermidine Cholesterol) et BGTC (Bis Guanidino Tren Cholesterol) et B.A.D.C..(bis chlorhydrate de Bis Amidinium Diéthylènetriamine cholesterol). Les composés revendiqués sont tout particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique pour leurs caractères non toxiques et leur propriétés amphiphiles. Compte -tenu de ces qualités, il peuvent notamment être utilisés pour la complexation d'acides nucléiques dans la perspective d'une transfection cellulaire de ceux-ci. Ces composés peuvent donc être avantageusement employés en thérapie génique. Les composés VII (BGSC) et VIII (BGTC) sont tout particulièrement intéressantS pour le transfert de gène in vivo. Ces deux composés se complexent avec l'ADN et le protègent contre la dégradation due aux variations de pH lors du transport vers la cellule. L'invention concerne donc une composition pharmaceutique qui comprend au moins un composé selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention le composé est le Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC) et dans un autre mode préféré le composé est le Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC). La thérapie génique a pour principal objectif de corriger des maladies génétiques associées à un défaut d'expression et/ou une expression anormale, c'est à dire déficiente ou excessive, d'un ou plusieurs acides nucléiques. On tente de suppléer à ce type d'anomalies génétiques par le biais de l'expression cellulaire in vivo ou in vitro de gènes clonés. Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance intracellulaire de ce type d'information génétique. L'une des technologies actuellement mises en oeuvre, repose précisément sur l'emploi de vecteurs chimiques ou biochimiques. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, à travers les deux membranes nucléaires. Des lipides cationiques chargés positivement comme le chlorure de N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl] -N,N,N-triméthylammonium (DOTMA) ont ainsi été proposés. Avantageusement, ils interagissent, sous la forme de liposomes ou de petites vésicules, spontanément avec de l'ADN, qui est lui chargé négativement, pour former des complexes lipides-ADN, capables de fusionner avec les membranes cellulaires, et permettent ainsi la délivrance intracellulaire de l'ADN. Toutefois, dans le cas particulier du DOTMA, sa bonne efficacité au niveau de la transfection demeure malheureusement associée à un défaut de biodégradabilité et un caractère toxique à l'égard des cellules. Depuis le DOTMA, d'autres lipides cationiques ont été développés sur ce modèle de structure: groupe lipophile associé à un groupement amino via un bras dit "spacer". Parmi ceux-ci, on peut plus particulièrement citer ceux comprenant à titre de groupement lipophile deux acides gras ou un dérivé du cholestérol, et comportant, en outre, le cas échéant, à titre de groupement amino, un groupement d'ammonium quaternaire. Les DOTAP, DOBT ou le ChOTB peuvent notamment être cités à titre représentatifs de cette catégorie de lipides cationiques. De part leur structure chimique et leur caractère biodégradable, les composés revendiqués répondent précisément aux exigences requises pour un vecteur de transfection d'acides nucléiques. La présente invention vise donc également toute application de ces nouveaux composés dans la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo de cellules et notamment pour la vectorisation d'acides nucléiques. Elle se rapporte en particulier à toute composition pharmaceutique comprenant, outre au moins un composé selon l'invention, un acide nucléique. Dans les compositions de la présente invention, l'acide nucléique associé à au moins un composé revendiqué peut être aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences oligonucléotidiques ou polynucléotidiques d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ils comportent de préférence un gène thérapeutique. Un autre objet de l'invention porte donc sur une composition pharmaceutique contenant en outre un acide nucléique. Préférentiellement cet acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. Les lipides cationiques décrits dans la présente invention, et, en particulier, le BGTC et le BGSC, sont capables de se complexer avec l'ADN, et représentent une alternative avantageuse aux vecteurs viraux pour le transfert d'acides nucléiques d'intérêt thérapeutique, in vitro, ex vivo ou in vivo. Du fait des propriétés chimiques des groupes guanidinium, et en particulier de leur pKa élevé, ces lipides cationiques sont capables de protéger les molécules d'ADN contre les dégradations dues aux variations de pH. Les résultats présentés dans les exemples montrent que ces composés permettent la transfection de nombreux types cellulaires, avec une grande efficacité. L'efficacité de la transfection dépend en particulier du rapport lipide cationique / ADN dans les complexes formés. Un rapport entre les deux composés particulièrement favorable pour la transfection consiste à avoir 6 à 8 groupes guanidinium pour un groupe phosphate sur l'ADN. L'efficacité de transfection des complexes lipide cationique /DNA peut en outre être améliorée par addition de lipide neutre, et formation de liposomes cationiques. Ces liposomes sont formés par un complexe entre le lipide cationique et le lipide neutre. Celui-ci peut être choisi parmi - la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), - l'oléoyl-palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), - le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine - leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois; - les phosphatidylglycérols, - les diacylglycérols, - les glycosyldiacylglycérols, - les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), - les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines) - et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2). On utilise préférentiellement la DOPE. Préférentiellement, le composé de l'invention et le lipide neutre sont présents dans un rapport compris entre 1 et 5, plus préférentiellement 2 et 4. En outre le rapport lipide total (composé de l'invention plus lipide neutre) sur DNA est avantageusement choisi de sorte que le rapport net de charges positives soit compris entre 2 et 5. Particulièrement avantageusement, le rapport est de 3 environ. L'invention concerne donc également toute composition pharmaceutique comprenant un composé selon l'invention, un lipide neutre et un acide nucléique. Préférentiellement le composé selon l'invention est choisi parmi le BGTC et le BGSC. Tout aussi préférentiellement le lipide neutre est la DOPE. L'acide nucléique est soit un acide désoxyribonucléique soit un acide ribonucléique. Préférentiellement l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. Outre cette application des dérivés d'amidinium revendiqués, il est également possible d'envisager leur valorisation dans les applications suivantes: interférence au niveau d'interactions entre acides nucléiques et protéines résultant dans une inhibition ou stimulation de certains processus par exemple de régulation d'expression génétique ou d'activité enzymatique ( polymérase, transcriptase, etc....), complexation sélective d'espèces anioniques pour leur extraction, leur élimination ou leur détection à l'aide de sondes/électrodes à membrane par exemple. En conséquence, la présente invention a également pour objet toute application thérapeutique des dérivés d'amidinium tels que décrits précédemment, soit directement, soit au sein de compositions pharmaceutiques. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent également un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. FIGURES Figure 1 Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BGSC et BGTC. Figure 2 Représentation schématique des protocoles opératoires de préparation du BADC. Figure 3 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport composé lipidique/ADN. Figure 4 : Mesure de l'efficacité de transfection en fonction du rapport lipides totaux / ADN MATERIEL ET METHODES A. Mesures physiques Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton ( RMN 1H) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker AC200. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au TMS. B. Chromatographies sur silice .Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de gel de silice Merck de 0,2 mm d'épaisseur .Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60 Merck de granulométrie 0,040-0,063mm. EXEMPLE 1: PREPARATION DU GUANIDINO SPERMIDINE CHOLESTEROL BGSC -1; Préparation du Di-Boc carbamate (1) On ajoute une solution de chloroformate de cholesteryle(0,9g, 2mmol) et de Et3N (0,214g, 2mmol) dans CH2Cl2 (40ml) à une solution de lN,8N-Boc2-spermidine (0,690g, 2mmol) dans CH2Cl2 (20ml). Après reflux pendant 5 heures, le mélange est lavé à l'eau (2x50ml), séché sur Na2SO4 et le solvant est évaporé. Le produit brut est purifié par chromatographie sur un gel de silice utilisant Cil2Cl2/MeOH 95/5 comme éluant pour donner du pur carbamate (1,3g, 86%). 'H NMR #(CDCl3, 200 Mhz); 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl, Boc signal et groupes centraux CH2 depuis le spermidine), 3,1-3,3(m, 8H, N-CH2), 4,50(m,1H,H3&alpha;), 5,37(d,1H,H6). - 2. Préparation de I'aminocarbamate(2) On dissout le composé (1) (1,3g) dans 20ml de CH2Cl2 et l'on ajoute à cette solution refroidie (lit de glace) 2ml de CF3CO2H fraîchement distillé pour libérer les groupes protecteurs BOC. Après agitation à température ambiante pendant 3 heures, on ajoute 50ml de 'N NaOH et le mélange est extrait avec CH2Cl2 Les couches organiques sont lavées à l'eau, séchées sur Na2SO4 et évaporées pour obtenir l'aminocarbamate (2) brut (0,945g, 98%). 'H NMR. #(CDCl3, 200 Mhz) ; 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl et groupes centraux depuis le spermidine), 2,7(m, 4H, CH2-N-C0-), 3,25 (large m,4H,N-CH2), 4,49(m,1H,H3&alpha;), 5,35(d,1H,H6). 3.- Synthèse du BGSC. On dissout le carbamate (2) brut (0,94g) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Puis on ajoute du lH-pyrazolecarboxamidine (0,495g, 3,4mmol) et du diisopropylethylamine (0,436, 3,4mmol) dans 30ml de THF/MeOH 85/15. Après agitation à température ambiante pendant 18 heures on ajoute lentement 250 ml de diethylether et on sépare le précipité obtenu par décantation. Le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation pour donner du GSC pur (0,570g, 47%). 1H NMR 6(DMSO d6) 200 Mils; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl et CH2 central), 3,1(m, 8H, N-CH2), 4,3(m,1H,H3&alpha;), 5,3(d,1H,H6) ; 7,2 (large s, 8H,NH2+), 7,8(s,2H,NH), Anal. Calc. pour C37H67N702,2HC1,C,62,15 ; H,9,67 ;N,13,71. Résultat d'analvse élémentaire: C,62,28 ; H,9,81 ; N,13,15. EXEMPLE 2: PREPARATION DU GUANIDINO TREN CHOLESTEROL, BGTC 1.préparation de l'Aminocarbamate (5) On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (1,8g, 4mmol) dans 100 ml de CH2Cl2 à une saturation de tris(2-aminoethyl)amine(TREN) (11,68 g, 80 mmol) dans 400 ml de CH2Cl2. Après agitation à température ambiante pendant deux heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3xlOOml) et après séchage sur Na2SO4 on évapore le solvant. On isole (5) sous forme de trihydrochloride de la manière suivante : on dissout le produit brut dans 10ml de MeOH et l'on ajoute goutte à goutte une solution saturée de HCI methanolique (5ml) ; le précipité obtenu est séparé par décantation et, pour obtenir un composé pur, est mis en suspension trois fois dans MeOH et séparé par décantation. Après séchage sous vide le trihydrochloride (6) pur est obtenu (1,71g, 64%). 1H NMR 6(CDC13 + gCDssOD. 200MHz). 0,5-2,4(m, structure de cholesteryl), 2,5(m,2H,CH2NHCO), 2,8(large s,4H,+HN-CH2), 3,06(large s,4H,CH2NH3+), 3,20(m,2H,+HN-CH2), 4,4(m,1H,H3&alpha;), 5,3(d,1H,H6), Anal. Calc. pour C34H62N402,3HC1 ;C,61,10 ; H,9,80 ; N,8,38. Résultat : C,61,25 ; H,9,96 ;N,8,22. 2- Préparation du B.GTC On ajoute lentement une solution de chloroformate de cholesteryle (2,24g, Smmol) dans 100ml de CH2C12 à une large saturation de tris(2aminoéthyl)amine(TREN)(29,2g, 200mmol) dans 250ml de CH2Cl2. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, on libère l'amine inerte par lavage à l'eau (3x1 00ml) et après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé. Le produit brut (3,2g) est dissous dans THF/MeOH 50/50 (20ml) ; puis l'on ajoute au mélange du 1Hpyrazole-1-carboximidine (1,465g,10mmol) et du diisopropylamine (1,3g, lOmmol). Après agitation à température ambiante pendant 18 heures, on ajoute du diethylether et le précipité obtenu est séparé par décantation. Afin d'obtenir un échantillon pur, le composé brut est mis en suspension trois fois dans du diethylether et séparé par décantation (2,15g), 60% après séchage sous vide. 1H NMR(DMSOd6, 200MHz) ; 0,5-2(m, structure du cholesteryl), 2,2(m,2H,N-CH2), 2,6(large s,4H,N-CH2), 3.0(d,2H,N-CH2), 3,2(large s,4H), 4,3(m,1H,H3&alpha;), 5,3(d,1H,H6), 7,3(large s,8H,NH2+), (7,8(large s,2H,NH). Anal. Calc. pour C36H66N8O2,2HCl ; C,60,39 ; H,9,57 ; N,15,65. Résultat : C,60,38 ; H,9,67 N,15,56. EXEMPLE 3: PREPARATION DU BIS-CHLORHYDRATE DE BIS AMIDINIUM BACD. 1.Préparation du dinitrile On ajoute une solution de chloroformate de cholestéryle (8,97g; 20mmol.) dans du CH2CI2 (100ml) goutte à goutte à une solution d'iminopropionitrile (2,46g, 20mmol.) et Et3N ( 2.02 g, 20 mmol dans du CH2Cl2 (100mi). Après agitation à la température ambiante, pendant 6 heures, on lave à l'eau (2x 100ml) et sèche sur Na2SO4. Le solvant est évaporé et le produit brut (10,5g) est recristallisé dans le méthanol. (8,59g; 80%). 1H NMR #(CDCl3, 200MHz). 0,5-2,5(m, structure de cholesteryl), 2,7 (m, 4H; -CH2CN), 3,62 (m, 4H, -CH2-N-), 4,50 (m,1H,H3&alpha;), 5,39(d,1H,H6), 2. Préparation du dithioamide Dans une solution du dinitrile, préparé comme décrit précédemment, (0,324g, 6mmol.) et de diéthylamine ( 0,884g; 12mmol) dans du DMF (30ml), maintenue à 50 C, on fait barboter pendant 2 heures un léger courant de H2S. On verse la solution bleue sur de la glace et on sépare le précipité ainsi obtenu par filtration. On dissout ce produit brut dans du CH2Cl2 et lave à l'eau (2x50ml). Après séchage sur Na2SO4, le solvant est évaporé et le produit obtenu recristallisé deux fois dans du méthanol (1,86g; 51,5%). 1H NMR(DMSOd6. 200MHz) ; 0,5-2,5(m, structure du cholesteryl), 2,67(t,4H,N-CH2), 3,50(t,4H,S=C-CH2), 4,3(m,1H,H3&alpha;),5,33(d,1H,H6). 3. Préparation du bis-iodure de dithioamidate A une solution de dithioamide (0,603g; Immol) dans de l'acétone (20ml), on ajoute de l'iodure de méthyle (2ml) et on laisse reposer à la température ambiante pendant 48 heures. On filtre le précipité obtenu (0,741g; 83,5%). Ce produit est utilisé directement sans purification annexe. 4. Préparation du bis chlorhydrate de bis amidinium BADC. Dans une suspension au reflux du bis-iodure (0,741g; 0,83mmol.), tel qu'obtenu précédemment, dans de lisopropanol (lOml) on fait barbotter un courant de NH3 pendant 2 heures puis on continue de chauffer au reflux 4 heures supplémentaires. On évapore l'isopropanol et le résidus est repris dans du méthanol (10ml). Après passage de cette solution sur une résine échangeuse d'ions basique, on fait passer un courant d'acide chlorhydrique dans l'éluant et on évapore à sec. Le bis chlorhydrate ainsi obtenu, est dissous dans le minimum d'éthanol ( environ 5ml). On filtre un léger insoluble et on rajoute au filtrat un large excès d'éther diéthylique. On obtient une poudre que l'on filtre et l'on sèche (320mg; 60%). Une recristallisation dans l'isopropanol permet d'isoler le produit attendu, sous une forme analytiquement pure. 1H NMR(DMSOd6. 200MHz); ; 0,5-2,6(m, structure du cholesteryl et-CH2- amidinium), 3,57 (s, large 4H, N-CH2) 4,3(m, 1H,H3a),5,3(d, 1H,Hs), 8,64 (s, large; 2H; NH2), 9,07 (s; large; 1H; NH), 9,18 (s; large; 2H). Anal. Cal. Pour C34H56N402, 2HCl: C, 65,25. H, 9,32; N, 8,94. Résultat C, 65,40. H, 9,87; N, 9,55. EXEMPLE 4 : ETUDES DES PROPRIETES DE TRANSFECTION DU BGSC ET DU BGTC 1 - Preparation du BGSC et du BGTC Le protocole utilisé pour la préparation de ces deux composés est identique à celle décrite dans les exemples 1 et 2. 2 - Preparation des liposomes Un mélange de lipide cationique et de DOPE (dans un rapport molaire de 3/2) dans du chloroforme (CHCl3) est évaporé sous vide et remis en suspension dans une solution de tampon HEPES 20 mM à PH 7,4, sous une atmosphère N2. La concentration finale en lipide est de 1,2 mg/ml. Le mélange est vortexé pendant 5 mn, puis soniqué pendant 5 mn avec un sonificateur (Branson Ultrasonic 2210), enfin stocké a + 4"C pendant 24 h pour hydratation. La dispersion résultante est soniquée de nouveau (Sonifier Branson 450) pendant 5 à 10 mm pour former des liposomes. Après centrifugation, la solution est filtrée sur un filtre de diamètre de pore 0.22Cl (Millex GS, Millepore) et stockée à + 40C. La taille des liposomes contenant BGSC ou BGTC a été étudiée à l'aide d'un appareil à diffraction laser (Autosizer 4700, Malvern Instruments). Cette étude montre un pic unique correspondant à un diamètre moyen de 50nm en analyse multimodale par nombres. 3 - Cultures cellulaires L'origine (espèce et tissus) de la plupart des lignées cellulaires utilisées pour les expériences de transfection est donnée dans la table I. Les cellules de la lignée cellulaire HeLa (P Briand, ICGM Paris) sont dérivées d'un carcinome humain d'origine épitheliale cervicale. Les cellules NIH 3 T3 (C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) sont des fibroblastes de souris. La lignée cellulaire NB2A (C. Gouget, Paris) est derivée d'un neuroblastome de souris. Toutes les cellules à l'exception des cellules AtT-20 et PC12, ont été cultivées dans du milieu Dulbecco modifié (DMEM, GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal (FCS; GIBCO), de la pénicilline à 100 unités/ml (GIBCO) et de la streptomycine (GIBCO) à 100g/ml. Les cellules AtT-20 ont été cultivées dans du DMEM/F12 (GIBCO) complementé avec 10 % de sérum de veau fetal. Les cellules Pu 12 ont été cultivées dans du DMEM complementé avec 10 % FCS et 5 % de sérum de cheval. Toutes les cellules ont été maintenues en culture dans des boîtes plastiques (Falcon) sous atmosphère humide à 5 % de C02. 4 - Plasmides Le plasmide pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris), dans lequel le gêne marqueur de la luciferase est sous le contrôle transcriptionnel du LTRRSV (Rous Sarcoma Virus), a été amplifié dans E. Coli et préparé par purification sur gradient CsC1 par des techniques standard. 5 - Protocole de transfection Le jour précédent la transfection 2 X 105 cellules sont déposées par puits (plaques à 6 puits Falcon). Chaque puits contient une lignée cellulaire différente. Ainsi au jour de la transfection les cellules sont a demi confluentes. L'ADN plasmidique (5llg) et la quantité désirée de lipide bis-guanidinium ont été chacun dilué dans 250 l de DMEM sans FCS et vortexé. Après environ 5 min les deux solutions ont été laissées à incuber à température ambiante pendant 15min. Le mélange de transfection est alors ajouté aux cellules (0,5 ml par puits) qui ont été lavées avec un milieu sans sérum. Après 4 à 6 heures d'incubation à 370C, 1 ml de milieu avec sérum est ajouté dans chaque puits sans que l'on enlève le mélange de transfection. 24 heures après la transfection, le milieu est remplacé par 1 ml de milieu de culture frais. Les cellules sont recueillies 2 jours après la transfection pour mesurer l'expression de la luciferase. Des transfections témoins ont été faites en utilisant des agents de transfections commercialisés: - la lipopolyamine Transfectam 8 (JP Behr, Strasbourg, France) a été utilisée en solution alcoolique à un rapport optimum de charges ioniques Transfectam (g)/DNA 6-8. - la Lipofectin 8 (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, France) qui est une formulation de liposomes ayant pour lipide neutre la DOPE et pour lipide cationique le DOTMA. (N[ 1(2,3 -dioleyloxy) propyl]-N, N, N- trimethylammonium chloride). Les complexes ADN/Liposomes ont été obtenus dans les conditions standard recommandées par le fabricant. - des cellules ont été transfectées par précipitation au phosphate de calcium. (Keown, W.A., Campbell, C.R. ; Kucherlapati, R.S. (1990) Methods in Enzymology; Academic Press : New York, 185, 527-537). 6 - Mesure de la luciferase L'activité luciferase est mesurée 48 heures après transfection en utilisant une variante la procédure de De Wet et al. (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R. & Subramani, S. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.) - on retire le milieu de culture - les cellules sont lavées avec une solution saline de tampon phosphate froid - puis elles sont lysées par incubation dans 250 ssl de tampon de lyse (25mM triphosphate pH7;8, 8 mM MgC12, lmM dithiotreitol, 15 % de glycerol et 1 % de triton X-100). - on obtient un lysat clair après élimination des matériaux insolubles par centrifugation (15mm a + 40C) dans une microcentrifugeuse. - un Aliquot (20cul1) d'extrait cellulaire est dilué dans 100Cl1 de tampon de lyse auquel on ajoute 9ul d'ATP 25 mM (sigma) et 20R1 de luciferine 25mM (sigma). - les échantillons sont placés dans un luminomètre (Lurmet LB9501 Berthold, Nashua, NH) et on mesure l'émission lumineuse pendant 10 secondes. L'étalonnage de la courbe RLU/Luciferase a été fait en utilisant differentes dilutions de luciferase de luciole purifiée (sigma) et montre que la partie linéaire de la courbe va de 104 a 107 RLU (relative light units). La concentration en protéine a été mesurée par le test BCA (acide bicinchoninique) en utilisant la serumalbumine bovine comme témoin. Les données pour l'activité luciférase sont exprimées en RLU/mg de protéine. 7 - Résultats 7.1 - Etude du rapport composé/ADN Afin d'optimiser l'efficacité de transfection obtenue avec des agrégats BGTC/ADN, la demanderesse a étudié l'influence du rapport BGTC/ADN sur le taux de transfection dans 3 types différents de cellules de mammifères connus pour leur relative sensibilité au méthodes de transfection classique (Fig. 3). Des expériences de transfection ont donc été réalisées avec des fibroblastes murins 3 T3 des cellules épithéliales humaines HeLa et des neuroblastomes de souris NB2A. Au cours de ces expériences une certaine quantité fixe de plasmide pRSV-Luc a été mise en contact avec des quantités variables de BGTCen solution. Pour déterminer la fourchette de rapport à étudier la demanderesse est partie du principe qu'un g d'ADN équivaut à 3 nm de phosphate chargé négativement et que seulement deux groupes guanidinium sont chargés positivement au pH neutre de formation des agrégats et de transfection. On mesure l'activité luciférase 48h après la transfection. L'expression de la luciférase est maximale pour des agrégats contenant de 6 (cellules HeLa) à 8 (cellules 3T3, NB2A) groupes guanidinium pour un groupe phosphate de l'ADN c'est à dire des agrégats ayant une charge positive importante. 7.2 - Etude de la transfection de différents types cellulaires. Le transfert de gènes par l'intermédiaire de lipides cationiques est une technique de transfection attractive non seulement du fait qu'elle ne nécessite pas d'intermédiaires mais aussi parce qu'elle permet de transfecter une très grande variété de cellules de tissus et d'organismes différents. Pour étudier l'étendue de l'efficacité du BGTC comme agent de transfection plusieurs lignées cellulaires d'origines diverses ont été testées. Les résultats sont exposés dans la table 1 ci-après. Le rapport de charges a été choisi entre 6 et 8 pour une efficacité maximale. Afin d'établir une comparaison, des cellules des mêmes lignées ont également été transfectées en utilisant une lipopolyamine d'une part et d'autre part du phosphate de calcium. Les résultats montrent que le BGTC est normalement aussi efficace que le Transfectam et deux fois plus efficace que le phosphate de calcium. Expression de la luciferase dans differentes lignées cellulaires de mammifères transfectées soit par du BGTC, du phosphate de calcium ou du Transfectam (E). RLU/mg de protéines cellulaires Espèces Lignées Tissus BGTC Phosphate Transfectam# cellulaire de Calcium Humain A549 Carcinome du 4 X 105 7 X 103 3,1 X 105 poumon Singe COS-7 Rein transformé par 2,1 X 107 3,7 X 105 8,4 X 106 SV40 Chien MDCK-1 Rein 3 X 106 4,5 X 105 2,2 X 106 Rat RIN-m5F Cellule tumorale 2 X 107 2 X 105 3,3 X 105 d'ilot pancreatique ROS Osteosarcome 4,,0 X 4,5 X 105 2,3 X 106 106 PC12 Pheochromocytome 3 X 107 1,7 X 105 6 X 106 Souris AtT-20 Tumeur pituitaire 2 X 107 8 X 105 3 X 107 Toutes les transfections ont été faites au moins deux fois (n12). 7.3- Transfection en présence d'un lipide neutre Le composé BGSC étant moins soluble en milieu aqueux que le BGTC la demanderesse a utilisé le premier sous forme de liposomes en présence d'un lipide neutre la DOPE (dioléoylphosphatidyléthanolamine). les formulations sont préparées dans un rapport molaire 3/2. Une deuxième préparation contenant cette fois ci du BGTC a également été préparée avec de la DOPE dans les mêmes conditions. 7.3.1 - Détermination du rapport lipide total / ADN. La demanderesse a tout d'abord déterminé le rapport lipide/ ADN au cours d'une expérience de transfection sur des cellules HeLa. La courbe obtenue est représentée figure 4. Les optima de transfection sont obtenus pour des rapports liposomes BGSC/ADN compris entre 1.5 et 5 avec un centre à 2.5 - 3. Les groupes guanidinium étant protonés à pH neutre les meilleurs agrégats BGSC-DOPE/ ADN ont une charge positive d'environ 3 (figure 4). Les meilleurs rapports BGSC-DOPE/ADN sont donc inférieurs à ceux obtenus avec des agrégats de type BGTC/ADN (entre 6 et 8). La transfection en présence de liposome cationique est facilitée par la présence de DOPE et les propriétés fusogéniques de celle-ci. 7.3.2 - Transfection de différentes lignées cellulaires par des liposomes cationiques. La demanderesse a procédé à des expériences de transfection dans différentes lignées cellulaires en utilisant des formulations de liposomes cationiques BGSC-DOPE et BGTC-DOPE dans des rapports molaires 3/2. Le rapport de charges guanidinium des lipides / phosphates de 1'ADN est d'environ 2.5 (-3) pour ces deux systèmes de transfert de gènes. Une transfection avec la LipofectinB sert de témoin. Les résultats sont exposés dans le tableau 2 ci-dessous. Ces résultats montrent que les dérivés du cholestérol portant des groupes guanidiniums sous forme de liposomes cationiques sont au moins aussi efficaces pour la transfection que la Lipofectin. Ces résultats peuvent bien entendu être optimisés pour chaque lignée cellulaire. Expression de la luciferase dans différentes lignées cellulaires eukaryotiques transfectees au moyen de liposomes BGSC/DOPE. de liposomes BGTC/DOPE et de Lipofectin #. RLU/mg de protéines cellulaires Lignées liposomes BGSC liposomes BGTC Lipofectin OR Cellulaires HeLa 4,6 X 106 7,7 X 106 3,3 X 106 A 549 6 X 106 2 X 105 4 X 106 COS-7 ND 1,4 X 107 9,5 X 106 MDCK-1 1 X 106 7 X 106 1,9 X 106 ROS ND 9X106 6X106 NB2 Aa 1,5 X 107 1,4 X 107 ND NIH3T3a 7X106 1,5 X 106 ND Toutes les transfections ont été faites au moins trois fois (n23) mesure moyenne en RLU de l'activité luciferase pour 100 g/500 g de lysat total (n#4). REVENDICATIONS 1. Composé de formule générale I et ses sels dans laquelle: - R1 représente un dérivé du cholestérol ou un groupement alkyle amino NR'R" avec R' et R" représentant indépendamment l'un de l'autre un radical aliphatique, saturé ou non, linéaire ou ramifié en C12 à C22 R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale II avec au moins l'un d'entre eux différent d'un atome d'hydrogène, dans laquelle: - n et m représentent indépendamment l'un de l'autre et de manière distincte entre les groupements R2 et R3 un entier compris entre 0 et 4 - R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule III III dans laquelle p et q représentent indépendamment l'un de l'autre un entier compris entre 0 et 4 et r est égal à 0 ou 1, avec pour r égal à 1 X représentant un groupement NH et x étant alors égal à 1 ou X représentant un atome d'azote et x étant alors égal à 2. avec p, q et r pouvant varier indépendamment entre les groupements R4 et R5. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que R2 et R3 y représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupement de formule générale IV dans laquelle n, m et p sont définis comme précédemment et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement de formule V avec q et r définis comme précédemment, et avec m, n, p q et r pouvant varier de manière indépendante entre les différents groupements R2 et R3. 3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit préférentiellement d'un composé représenté par l'une des sous formules générales suivantes: (H2N)2+ C- NH - (CH2)2 -NH -COO- R1 VI [(H2N)2+ C- NH - (CH2)3 ] [(H2N)2+ C- NH - (CH2)4] -N-COO - R1 VII [(H2N)2+ C- NH - (CH2)2 ] 2- N-( CH2)2 -NH -COO- R1 VIII [(H2N)2+C-(CH2)2]2N - COO - R1 ou IX [[(H2N)2+ C- (CH2)2] 2-N-( CH2)2] 2N - COO - R1 X dans lesquelles R1est défini selon la revendication 1. 4. Composé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en qu'il est choisi parmi [[(H2N)2+C - (CH2)2]2- N-(CH2)2]2N - COO - R1 [(H2N)2+C-NH - (CH2)3] [(H2N)2+ C- NH - (CH2)4] -N-COO - R1 et [(H2N)2+ C - (CH2)2] 2 N - COO - R1 dans lesquels R1 représente un groupement cholesteryle. 5. Composé selon l'une des revendications précedentes caractérisé en ce qu'il s'agit du Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC). 6. Composé selon l'une des revendications précedentes caractérisé en ce qu'il s'agit du Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC). 7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications précédentes. 8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 caractérisée en ce que le composé est le Bis Guanidino Spermidine Cholesterol (BGSC). 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 caractérisée en ce que le composé est le Bis Guanidino Tren Cholesterol (BGTC). 10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un acide nucléique. 11. Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique. 12. Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 13. Composition selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. 14. Composition pharmaceutique comprenant un composé selon la revendication 1, un lipide neutre et un acide nucléique. 15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce que le composé est choisi parmi le BGTC et le BGSC. 16 Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisé en ce que le lipide neutre est la DOPE. 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide désoxyribonucléique. 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 caractérisée en ce que l'acide nucléique est un acide ribonucléique. 19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 17 ou 18 caractérisée en ce que l'acide nucléique comporte un gène thérapeutique. 20. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 19 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable. 21. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 19 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses. 22. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications de 1 à 6 pour la transfection in vitro, ex vivo et/ou in vivo de cellules.