Brevet FR2759371A1 — publié le 19980814

La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune. Selon l'invention, on entend par "une maladie dégénérative", une maladie dans laquelle un processus de mort cellulaire ou de destruction cellulaire est associé aux troubles physiologiques et/ou cliniques. On entend par "maladie auto-immune", une hyperréactivité du système immunitaire vis-à-vis de un ou plusieurs auto-antigènes on classe notamment dans les maladies auto-immunes, la sclérose en plaques (SEP), la polyarthrite rhumatoïde (PR) et le lupus érythémateux. Selon l'invention, le polypeptide comprend au moins un fragment d'une protéine, ladite protéine ayant, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 1, identifiée en fin de description. Par "polypeptide" selon l'invention, on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Ainsi il peut être obtenu par des méthodes de synthèse classique, par exemple dans un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules eucaryotes ou procaryotes. Un polypeptide de l'invention peut être glycosylé, et il peut ainsi consister en une glycoprotéine. Par "fragment d'une protéine", on comprend selon l'invention, un enchaînement d'au moins 5 acides aminés consécutifs, ou 5 acides aminés voisins non consécutifs définissant un épitope, un site actif ou un domaine d'interaction spécifique, compris dans la séquence peptidique de ladite protéine. Par "séquence de la protéine à l'état natif", on comprend la succession d'acides aminés telle qu'elle est retrouvée dans la structure primaire de la protéine produite dans une cellule. Conformément à la présente invention, le polypeptide comprend avantageusement au moins un fragment de la protéine, qui présente, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 2, et de préférence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, identifiées en fin de description. Selon une utilisation préférentielle du polypeptide, ladite protéine est glycosylée, et éventuellement ledit fragment lui-même est glycosylé. La protéine peut notamment être choisie dans le groupe des protéines produites par les granulocytes éosinophiles et/ou celui des protéines ayant une activité ribonucléasique. En particulier, ladite protéine est choisie dans le groupe qui consiste en la neurotoxine dérivée d'éosinophile (EDN) (SEQ ID NO: 13), la protéine cationique d'éosinophile (ECP) (SEQ ID NO: 14), la ribonucléase hépatique humaine (HLR) (SEQ ID NO: 15), et la ribonucléase non-sécrétée humaine (HNSR) (SEQ ID NO: 16). Selon une utilisation préférée du polypeptide de l'invention, celui-ci comprend un fragment de la protéine, qui correspond à un site actif de la protéine, notamment un site enzymatique, tel que celui d'une ribonucléase, ou il comprend un fragment de la protéine, qui correspond à un ou plusieurs épitopes de la protéine. Avantageusement, ledit polypeptide consiste en ladite protéine. Dans une application particulière à la détection ou au traitement de la sclérose en plaques, ledit polypeptide consiste en la protéine EDN. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un ligand spécifique du polypeptide défini ci-dessus, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune. La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un fragment nucléotidique, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune. Selon l'invention, ledit fragment nucléotidique est choisi dans le groupe comprenant des premiers fragments qui codent pour la séquence peptidique SEQ ID NO: 1, des seconds fragments complémentaires des premiers fragments, et des troisièmes fragments ayant au moins 70 % d'homologie avec les premiers ou les seconds fragments. Avantageusement, ledit fragment nucléotidique comprend la séquence SEQ ID NO: 6 ou sa séquence complémentaire. Selon l'invention, un fragment nucléotidique est un enchaînement de monomères, ou un biopolymère, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à tout autre fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures chimiques différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Ainsi un monomère peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique, dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans 1'ARN le sucre est le ribose, dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose; selon qu'il s'agit de l'ADN ou 1'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou le nucléotide peut être modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine et toute autre base modifiée favorisant l'hybridation; au niveau du sucre, la modification peut consister dans le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide, et au niveau du groupement phosphate, la modification peut consister dans son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyl et arylphosphonate et de phosphorothioate. Par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de monomères, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence, constituent ou non une information fonctionnelle de même qualité que celle des acides nucléiques naturels, Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions opératoires appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires, s'apparient pour former une structure complexe, notamment double ou triple, de préférence sous forme d'hélice. L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques comparés ; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé par comparaison directe de séquences nucléoditiques, par rapport à des séquences nucléotidiques de référence, D'autres objets de l'invention sont - un procédé pour détecter une protéine associée à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, dans un échantillon biologique, selon lequel on met l'échantillon biologique en contact avec un ligand spécifique d'un polypeptide de l'invention ; ledit ligand étant notamment un anticorps susceptible de reconnaître ladite protéine, ou un substrat de ladite protéine, ou un récepteur de ladite protéine - un procédé pour détecter un anticorps associé à une maladie auto-immune, dans un échantillon biologique, selon lequel on met l'échantillon biologique en contact avec un polypeptide de l'invention. Avantageusement pour mettre en oeuvre les procédés précités, on choisit l'échantillon biologique dans le groupe comprenant le liquide céphalo-rachidien, le sérum et l'urine. La présente invention est illustrée par les Exemples 1 à 4 suivants, dans une application particulière à la sclérose en plaques. L'étude a porté sur des urines de patients ayant une sclérose en plaques (SEP) avérée, ainsi que sur des témoins sains sans pathologie connue. EXEMPLE 1 : sêquençage d'urine brute Des gels d'électrophorèse en une dimension ont été effectués aussi bien sur les urines SEP que sur les urines témoins. Les protéines de poids moléculaire inférieur à 20 000 daltons ont été étudiées et, à l'intérieur de cette catégorie, des protéines différentes entre les urines SEP et témoins ont été recherchées. Le séquençage d'urine brute SEP a été réalisé après électrotransfert de gel SDS-PAGE sur membrane Pora Blot commercialisée par la société PALL. Des dépôts d'urine sont effectués dans les puits d'un gel SDS (15,1 % T, 1,14 % C, épaisseur 0,5 mm). Après migration des protéines, un transfert sur membrane Pora Blot 0,22 ym est effectué dans un tampon Tris borate 50 mM, pH 8,3, durant 16 heures. Après coloration au Rouge Ponceau et analyse des bandes obtenues, les bandes correspondant à des protéines d'environ 10-20 kD ont été séquencées. Parallèlement des urines de témoins sains ont été analysées de la même manière. Dans les urines positives, on a retrouvé deux séquences principales que l'on peut identifier dans les banques de données - SEQ ID NO: 7 présentant une homologie avec le précurseur de la glycoprotéine CD 59, et - SEQ ID NO: 8 présentant une homologie avec la neurotoxine dérivée d'éosinophile (EDN). Une séquence minoritaire peut bien sûr être masquée par ces séquences qui sont majoritaires, et une séquence bloquée peut également être présente. Dans les urines négatives, on a aussi retrouvé deux séquences principales que l'on peut identifier dans les banques de données - une séquence majoritaire SEQ ID NO: 9 présentant une homologie avec le précurseur du polypeptide spasmolitique, et - une séquence minoritaire SEQ ID NO: 10 présentant une homologie avec le précurseur de la glycoprotéine CD 59. EXEMPLE 2 : Purification des urines Des pools d'urines SEP et de témoins sains ont été purifiés afin d'obtenir une concentration en protéines plus élevée et d'éliminer au maximum les protéines de haut poids moléculaire. a) Première étape : précipitation Des précipitations au sulfate d'ammonium sont menées sur les pools d'urine. Le pourcentage de 60 % de sulfate d'ammonium saturé pour 40 % d'urine soit 390 g de sulfate d'ammonium par litre d'urine est celui qui conduit au meilleur rendement de précipitation en protéines de bas poids moléculaire. La précipitation est effectuée durant 2 x 8 heures, à température ambiante, sous agitation. La nuit, entre les deux journées, les flacons sont laissés à +4OC. Après centrifugation de l'urine précipitée, le culot obtenu est repris dans un tampon Tris 20 mM contenant des ions divalents (CaCl2 1 mM) et de l'urée à 0,25 M (proche du taux physiologique). Ce tampon a été déterminé après de nombreux essais en petit volume et a permis une meilleure dissolution des protéines. b) Deuxième étape : purification La technique de séparation utilisée est une chromatographie d'exclusion stérique basée sur la différence de taille et de forme des protéines à éluer. Au cours de l'élution, les protéines de faible masse moléculaire seront retenues et donc éluées plus tardivement que les grosses molécules. Les purifications sont effectuées sur HPLC avec une colonne TosoHaas TSK Prep G 3000 SW, (caractéristique de la colonne : support silice greffée, diamètre 21,5 mm, longueur 300 mm, la limite d'exclusion en masse moléculaire est de 500 000 daltons). Le tampon d'élution utilisé contient du phosphate 100 mM, Na2S04 100 mM, à pH 6,8. Le débit optimal est 2,5 ml/min. La séparation du mélange de protéines s'effectue en 60 min. Seule la fraction correspondant à une masse de 1520 000 Daltons (temps de rétention 42-50 min) est conservée. Cette fraction est dialysée contre un tampon Tris 20 mM CaCl2 0,2 mM, pH 7,2 puis lyophilisée. Des contrôles en taux de protéines sont effectués à chaque étape. Des contrôles sur gel SDS-PAGE permettent de suivre l'analyse des protéines de l'urine et le degré de purification. Les échantillons lyophilisés sont repris en vue du séquençage. EXEMPLE 3 : Séquençage d'urines purifiées réalisé â partir de protéines obtenues dans un gel à deux dimensions Le séquençage d'urines purifiées SEP et témoin obtenues selon l'exemple 2, a été réalisé après électrotransfert de gel SDS-PAGE une dimension sur membrane Pora Blot (PALL) de manière identique à l'urine brute. L'analyse des "blots" colorés au Noir Amido permet de voir un degré de purification important avec des bandes restantes à 43 et 60 kD. Le séquençage d'urines purifiées SEP et témoin a été aussi réalisé après électrotransfert de gel en deux dimensions : première dimension, Immobiline (marque de commerce) pH 3 à 10, puis deuxième dimension, SDS-PAGE (14-17%) et transfert sur membrane Pora Blot (PALL). Dans les urines SEP purifiées, on retrouve uniquement la séquence SEQ ID NO: 11 qui présente une homologie avec EDN. Cette séquence est également retrouvée sur 4 pools différents d'urine purifiés. Dans les urines purifiées SEP et témoin, on retrouve la séquence SEQ ID NO: 12 qui présente une homologie avec le précurseur du polypeptide spasmolitique. EXEMPLE 4 : Séquençage d'urines purifiées réalisé à partir de protéines obtenues sur une colonne de phase inverse Le séquençage d'urines purifiées SEP et témoin a été ensuite réalisé après passage des échantillons d'urines purifiées sur colonne de chromatographie liquide haute performance à polarité de phase inversée. Les polypeptides sont séparés en fonction de leur hydrophobicité. La colonne utilisée est une colonne Brownlee C8 rp 300, (caractéristique de la colonne diamètre de particules 7 pm, diamètre des pores 300 longueur de la colonne 30 mm, diamètre de la colonne 2,1 mm). L'élution se fait à l'aide d'un gradient. Le tampon A est constitué d'une phase aqueuse contenant de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % dans l'eau et le tampon B d'une phase organique contenant de l'acétonitrile composée de 0,09 % de TFA dans 80 % d'acétonitrile. Le gradient correspond à 0,7 % d'acétonitrile par min, le débit est de 100 ssl par min, la longueur d'onde de détection est de 205 nm. Avant injection, le produit de lyophilisation est repris avec un tampon urée 0,5 M. Chaque pic de protéine obtenu sur le chromatogramme est séquencé et contrôlé sur gel SDS-PAGE. Sur les urines SEP, le pic élué au temps de rétention 42-43 min ayant une masse de 17 000 Daltons a été identifié. Sa séquence SEQ ID NO: 11 présente une homologie avec EDN. Cette séquence est retrouvée sur 3 pools d'urines différents purifiés. Au temps de rétention 40 min, le pic est identifié comme ayant une homologie avec le précurseur du polypeptide spasmolitique. Au temps de rétention 47 min, le pic est identifié comme correspondant à la chaîne légère des immunoglobulines IgG. Les urines témoins présentent les mêmes pics au temps de rétention 40 min identifié comme le précurseur du polypeptide spasmolitique et 47 min identifié comme la chaîne légère des IgG ; seul le pic au temps de rétention 42 min n'apparaît pas. En conclusion seule la séquence SEQ ID NO: 1 est retrouvée dans toutes les urines testées chez les patients SEP, et non pas chez les témoins. Cette protéine constitue donc un marqueur utilisable pour suivre cette pathologie. A titre d'exemples, la protéine peut être clonée, exprimée dans un vecteur dans un vecteur euraryote ou procaryote et utilisée pour produire des anticorps permettant de développer un test immunologique qualitatif et/ou quantitatif. Par ailleurs, une méthode de dosage peut utiliser une combinaison d'anticorps et de lectine(s). La protéine peut aussi être utilisée pour développer un test sérologique visant à mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre cette protéine. On peut également produire des anticorps dirigés contre un complexe immun, protéine-anticorps, en vue de la détection de ce dernier dans un échantillon biologique. Par ailleurs, l'activité enzymatique de la protéine peut être utilisée en vue de sa détection à l'aide de substrat(s) approprié(s). De même 1'ARNm codant pour cette protéine peut être détecté dans un échantillon biologique par l'application de techniques connues en soi. LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID NO: 1 Xaa Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Gln His 1 5 10 15 Xaa en position 1, Xaa en position 7, Xaa en position 9, Xaa en position 10, Xaa en position 12 et Xaa en position 13 représentent chacun un acide aminé quelconque, et sont choisis indépendamment les uns des autres. SEQ ID NO: 2 Xaa Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Gln His l 5 10 15 Xaa en position 1 = Lys ou Arg Xaa en position 7 = Trp ou Arg Xaa en position 9 = Gln, Lys ou Thr Xaa en position 10 = Trp ou Lys Xaa en position 12 = Glx ou Ala Xaa en position 13 = Thr ou lie ou Arg SEQ ID NO: 3 Lys Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Gln Xaa Phe Glu Xaa Gln His 1 5 10 15 Xaa en position 7 = Trp ou Arg Xaa en position 10 = Trp ou Lys Xaa en position 13 = Thr ou Ile ou Arg SEQ ID NO: 4 Lys Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile 1 5 10 15 Xaa en position 7 = Trp ou Arg SEQ ID NO: 5 Lys Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Gln Lys Phe Glu Thr Gln His Ile 1 5 10 15 Xaa en position 7 = Trp ou Arg SEQ ID NO: 6 AAACCTCCAC AGTTTACCTG GGCTCAATGG TTTGAAACCC AGCACATC 48 SEQ ID NO: 7 Leu Gin Xaa Tyr Asn Xaa Pro Asn Pro Thr Ala Asp Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 15 Xaa en position 3, Xaa en position 6, Xaa en position 13, Xaa en position 14 et Xaa en position 15 sont indéterminés. SEQ ID NO: 8 Lys Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Gin Trp Phe Glu Thr Gln His Ile 1 5 10 15 Xaa en position 7 est indéterminé. SEQ ID NO: 9 Glu Lys Pro Ser Pro Xaa Gln Xaa Xaa Arg Leu Xaa Pro 1 5 10 Xaa en position 6, Xaa en position 8, Xaa en position 9 et Xaa en position 12 sont indéterminés. SEQ ID NO: 10 Leu Gln Xaa Tyr Asn Xaa Pro Asn Pro Thr Ala Asp Xaa Lys 1 5 10 Xaa en position 3, Xaa en position 6 et Xaa en position 13 sont indéterminés. SEQ ID NO: 11 Lys Pro Pro Gln Phe Thr Xaa Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile 1 5 10 15 Xaa en position 7 est indéterminé. SEQ ID NO: 12 Glu Lys Pro Ser Pro Xaa Gln Xaa Xaa Arg Leu Xaa Pro 1 5 10 Xaa en position 6, Xaa en position 8, Xaa en position 9 et Xaa en position 12 sont indéterminés. SEQ ID NO: 13 Séquence peptidique de la neurotoxine dérivée d'éosinophile (EDN) et identifiée dans l'article de H.F. ROSENBERG et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, 4460-4464 (1989). SEQ ID NO: 14 Séquence peptidique de la protéine cationique d'éosinophile (ECP) et identifiée dans l'article de H.F. ROSENBERG et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, 4460-4464 (1989). SEQ ID NO: 15 Séquence peptidique de la ribonucléase hépatique humaine (HLR) et identifiée dans l'article de H.F. ROSENBERG et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, 4460-4464 (1989). SEQ ID NO: 16 Séquence peptidique de la ribonucléase non sécrétée humaine (HNSR) et identifiée dans l'article de H.F. ROSENBERG et al, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, vol. 86, 4460-4464 (1989). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un polypeptide comprenant au moins un fragment d'une protéine, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, ladite protéine ayant, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 1. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine à l'état natif, comprend SEQ ID NO: 2. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine à l'état natif, comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5. 4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine est glycosylée. 5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit fragment de la protéine est glycosylé. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine est choisie dans le groupe des protéines produites par les granulocytes éosinophiles. 7. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine a une activité ribonucléasique. 8. Utilisation selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que ladite protéine est choisie dans le groupe qui consiste en la neurotoxine dérivée d'éosinophile (EDN), la protéine cationique d'éosinophile (ECP), la ribonucléase hépatique humaine (HLR), et la ribonucléase non-sécrétée humaine (HNSR). 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polypeptide consiste en ladite protéine. 10. Utilisation d'un ligand spécifique d'un polypeptide, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, selon laquelle ledit polypeptide comprend au moins un fragment d'une protéine, ladite protéine ayant, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 1. 11. Utilisation d'un fragment nucléotidique, pour obtenir une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique destinée à détecter, prévenir ou traiter un état pathologique associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, selon laquelle ledit fragment nucléotidique est choisi dans le groupe comprenant des premiers fragments qui codent pour la séquence peptidique SEQ ID NO: 1, des seconds fragments complémentaires des premiers fragments, et des troisièmes fragments ayant au moins 70 % d'homologie avec les premiers ou les seconds fragments. 12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le fragment nucléotidique comprend la séquence SEQ ID NO: 6 ou sa séquence complémentaire. 13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la maladie dégénérative et/ou auto-immune est la sclérose en plaques. 14. Procédé pour détecter une protéine associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon biologique en contact avec un ligand spécifique d'un polypeptide, ledit polypeptide comprenant au moins un fragment d'une protéine et ladite protéine ayant, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 1. 15. Procédé pour détecter un anticorps associé à une maladie dégénérative et/ou auto-immune, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon biologique en contact avec un polypeptide, ledit polypeptide comprenant au moins un fragment d'une protéine et ladite protéine ayant, à l'état natif, une séquence qui comprend SEQ ID NO: 1. 16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que la maladie dégénérative et/ou autoimmune est la sclérose en plaques. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que la séquence de ladite protéine à l'état natif, comprend SEQ ID NO: 2, et de préférence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. 18. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi dans le groupe comprenant le liquide céphalo-rachidien, le sérum et l'urine.