Brevet FR2758563A1 — publié le 19980724

PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE MÉTABOLITES PRIMAIRES ET SECONDAIRES A PARTIR D'ORGANES VÉGÉTAUX CULTIVÉS IN VITRO L'invention concerne un procédé de production de métabolites primaires et secondaires à partir de cellules ou d'organes de plantes cultivés in vitro, et elle concerne plus particulièrement un procédé de production de métabolites secondaires tels que les alcaloïdes tropaniques ou indoliques à partir de racines de plantes supérieures. Les plantes sont largement utilisées pour leur capacité à synthétiser des métabolites primaires et secondaires qui sont des molécules présentant un grand intérêt notamment dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique. Les métabolites primaires et secondaires sont obtenus classiquement par extraction à partir de plantes cultivées en champ ou récoltées dans la nature, le plus souvent dans les pays tropicaux. Ils sont présents en quantités faibles et variables dans la totalité de la plante. Leur production industrielle est dépendante de nombreux et divers facteurs tant climatiques, que politiques ou économiques. A partir des années 1960, afin de s'affranchir des aléas climatiques, économiques et politiques, des procédés de culture in vitro des plantes d'intérêt ont été développés. Cependant les procédés de culture in vitro utilisant des cellules non différenciées ou des cals n'ont pas permis dans la majorité des cas d'obtenir une productivité suffisante pour être utilisés industriellement. Les présents inventeurs ont alors conduit des essais de culture in vitro d'organes végétaux, tels que des racines transformées de Datura innoxia Miii. Ces essais sont décrits dans C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie, 1995 ; 318: 593-8 et dans la thèse "Transformations génétiques d'une plante médicinale : le Datura innoxia Miii. par l'intermédiaire d'Agrobacterium rhizogenes et Agrobacterium tumefaciens et évaluation de la production de métabolites secondaires" Ducrocq Corinne 1994 - Université de Picardie Jules Vernes. Par ailleurs, dans Plant Med. 61(1995) 287-290, les inventeurs ont décrit que la perméabilisation de racines de Datura innoxia Mill. leur permettait d'excréter les métabolites secondaires qu'elles produisent. A l'heure actuelle, à la connaissance des Demandeurs, il n'existe que très peu de procédés industriels permettant la production de métabolites primaires et secondaires de façon suffisante et non aléatoire. Ce nombre limité est dû à la trop faible productivité in vitro par rapport aux procédés traditionnels d'extraction. Or, les inventeurs ont eu le mérite de mettre au point un procédé de synthèse de métabolites primaires et secondaires à partir d'organes végétaux cultivés in vitro, caractérisé par le fait qu'il consiste dans un premier temps à initier et développer dans un milieu de culture des organes végétaux, éventuellement transformés génétiquement, puis, à répéter le cycle d'étapes suivant a - perméabilisation au moins partielle et non totalement irreversible des organes végétaux b - addition dans le milieu de culture d'au moins un précurseur des métabolites c - incubation d - extraction des métabolites synthétisés par lesdits organes végétaux et libérés dans le milieu de culture e - rechargement du milieu de culture en milieu nutritif f - nouvelle incubation. L'invention permet donc d'obtenir une grande quantité de métabolites à partir de la culture in vitro d'organes végétaux. En effet, la synthèse par les organes végétaux des métabolites, la perméabilisation des organes végétaux, l'excrétion des métabolites et leur récupération peuvent être réalisées plusieurs fois à partir des mêmes organes végétaux. Le rendement de ce type de réaction est donc très élevé et le procédé est de ce fait tout à fait approprié pour une utilisation industrielle. Le cycle d'étapes a à f peut être répété au moins une fois, de préférence de 1 à 10 fois et plus préférentiel- lement encore de 2 à 5 fois. Dans la présente demande par "organes végétaux" on entend les organes de plantes supérieures, leurs cellules ainsi que les plantes en totalité. Ainsi, dans le procéde selon l'invention, tout organe végétal peut être mis en oeuvre en culture in vitro. A titre d'exemple peuvent être mentionnés notamment, les cellules, les cals, les bourgeons, les racines, les tiges, les feuilles, les écorces, les embryons et les plantes entières. Les racines sont utilisées préférentiellement. Pour obtenir un développement spécifique des seules racines d'une plante, on transforme génétiquement cette plante par Agrobacterium rhizogenes. Des cultures indéfinies de racines chevelues (hairy roots) sont ainsi obtenues. Ces racines peuvent egalement être transformées génétiquement par des gènes d'intérêt. Pour ce type de culture, il est fait référence à l'article précité C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie, 1995 ; 318: 593-3 et à la thèse Ducrocq 1994 précitée. Les organes végétaux utilisés sont ceux de plantes supérieures choisies dans les familles productrices de métabolites primaires et secondaires, par exemple les Solanacées, les Papavéracées, les Rutacées, les Erythroxylacees ou les Taxacées. Les métabolites primaires et secondaires produits par les organes végétaux selon l'invention sont des molecu- les à forte valeur ajoutée, utilisées notamment dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique. Des exemples de telles molécules sont les alcaloïdes tropaniques tels que notamment l'hyoscyamine, l'atropine et la scopolamine ou autres alcaloïdes tels que notamment l'ajmaciline, la catharanthine, la vinblastine, la quinine, la vincristine et la cinchonine, ou les glucosides ou autres métabolites primaires ou secondaires. Une etape importante du procédé selon l'invention consiste à perméabiliser les organes végétaux afin qu'ils libèrent dans leur milieu de culture les métabolites qu' ils ont synthétisés. Cette étape de perméabilisation est realisée par addition d'un agent de perméabilisation. L'agent de permeabilisation est un composé qui doit permettre la perméabilisation au moins partielle des organes végétaux et qui ne doit pas conduire à une perméabilisation irréversible. Conformement à l'invention, un tel agent de perméabilisation est choisi parmi les esters d'acide gras polyoxyéthylénés contenant en particulier les esters d'acide laurique ou de ses dérivés, plus particulièrement parmi les polyoxyéthylènes sorbitan contenant de l'acide laurique ou ses derivés. On peut citer à titre d'exemple le monolaurate de sorbitan vendu sous la marque Tween 20. L'agent de perméabilisation est ajouté au milieu de culture à une concentration comprise entre 1 et 5 %, de preference 3 % en volume par rapport au volume total du milieu réactionnel. Les étapes de perméabilisation et d'addition d'au moins un précurseur sont réalisées dans un ordre indifférent ou simultanément, de préférence simultanément. Les précurseurs utilisés sont des intermédiaires de synthèse des métabolites primaires et secondaires. Parmi ces précurseurs, on peut citer, notamment, l'ornithine, l'arginine et la phénylalanine. Ces précurseurs sont utilisés seuls ou en combinaison. De préférence, on utilise la phénylalanine. Ces précurseurs sont ajoutés au milieu de culture à une concentration comprise entre 10-4 et 10-3 mole/l, de préférence entre 0,5.10-3 et 10-3 mole/l. Dans le procédé selon l'invention, la première incubation permet aux organes végétaux de synthétiser et d'excréter dans le milieu de culture les métabolites synthétisés. La durée de cette incubation est comprise entre 15 et 24 heures, de préférence entre 16 et 20 heures, et plus préférentiellement encore entre 16 et 18 heures. L'incubation suivante permet aux organes végétaux de synthétiser à nouveau des métabolites. La durée de cette incubation est bien entendu fonction de la nature des organes végétaux et des végétaux utilisés, elle est comprise entre 4 et 8 jours, de préférence entre 4 et 6 jours, et plus préférentiellement encore de 4 jours. L'étape d'extraction des métabolites excrétes dans le milieu de culture consiste 8 : - soutirer le milieu de culture du réacteur, - séparer sur une colonne de séparation les métabolites du milieu de culture contenant l'agent de perméabili sation, - rincer au moins une fois les organes végétaux, - separer sur une colonne de séparation les métabolites des solutions de rinçage, - récupérer les métabolites par solution des colonnes de séparation. Les colonnes de séparation utilisées sont géneralement des colonnes classiques, de préférence de type Amberlite XAD4 ou Amberlite XAD7. Cette étape d'extraction est de façon avantageuse réalisée en faisant circuler en boucle les milieux de culture et les solutions de rinçage sur les colonnes de séparation. L'invention va être décrite plus en détail en relation avec l'exemple de synthèse suivant. Exemple a - Initiation et culture des racines de Datura innoxia Mill. Des graines stérilisées de Datura innoxia Mill. sont mises à germer in vitro puis transformées génétiquement par inoculation d'une suspension d'Agrobacterium rhizogenes sur des disques foliaires ou par piqûres dans les tiges des plantules comme décrit dans la thèse précitée Ducrocq C. 1994. Les racines transformées sont transférées sur un milieu solide puis liquide en présence d'un agent bacteriostatique (Claforan ) afin d'éliminer définitivement les agrobactéries encore présentes dans les explants. On obtient des racines se développant sous la forme d'un chevelu qui est régulièrement scindé en plusieurs fractions servant d'inoculum à de nouvelles cultures. On place 10 g de matière fraîche de racines dans un bioréacteur d'une capacité totale de 2 litres contenant le milieu de culture B5 (Gamborg 1968). La quantité de milieu de culture est augmentée progressivement par tiers jusqu'à 1,5 1., de telle sorte qu'il y ait toujours environ la moitié du chevelu hors du milieu liquide. Les racines puisent l'oxygène dans l'air et les éléments nutritifs dans le milieu de culture. La croissance conduit à une production exponentielle de biomasse racinaire qui atteint le stade final de croissance exponentielle après environ 21 jours et donne environ 200 à 250 g de matière fraîche. A ce stade, les racines ont accumulé des alcaloïdes tropaniques, en particulier l'hyoscyamine et leur métabolisme énergétique est encore en activité. b - Cycles de permeabilisation excrétion - récupération synthèse de métabolites. Le milieu de culture est conservé ou évacue et renouvelé. On ajoute au milieu de culture 45 ml de Tween 20 et 1,5 mmole de phénylalanine. On laisse incuber entre 15 et 24 h et on soutire le milieu contenant les alcaloïdes que l'on fait circuler sur des colonnes XAD4 afin de retenir les alcaloïdes. Puis on e élimine le milieu contenant le Tween 20 . On fait circuler sur les racines un milieu de rinçage contenant un mélange d'eau et de saccharose à pH 5,8. On fait circuler plusieurs fois sur les colonnes XAD4 le milieu de rinçage afin de récupérer la totalité des alcaloïdes qui sont encore excrétés par les racines pendant environ 3 à 4 heures. Ensuite, les colonnes sont éluées afin de récupérer les differents alcaloïdes tropaniques qui sont séparés de façon classique. Après 21 jours de croissance et 1 jour de perméabilisation / excretion, on récupère l'équivalent du contenu racinaire initial soit 0,5 g d'hyoscyamine pour 100 g de matière sèche. 1,5 1 de milieu de culture est à nouveau introduit dans le bioréacteur, les racines sont maintenues sur ce milieu pendant 4 à 8 jours afin de synthétiser à nouveau des alcaloïdes tropaniques. Le cycle de perméabilisation - excrétion - récupération - synthèse est répété cinq fois. Ainsi, après 42 jours (soit 21 jours de croissance + 1 jour de perméabilisation-excrétion + 4 x 5 jours de perméabilisation-excrétion-synthèse), 2,5 g d'hyoscyamine pour 100 g de matière sèche végétale ont été récupérés. REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse de métabolites primaires et secondaires à partir d'organes végétaux cultivés in vitro, caractérisé par le fait qu'il consiste dans un premier temps à initier et developper dans un milieu de culture des organes végétaux éventuellement transformés génétiquement, puis à répéter le cycle d'étapes suivant a - perméabilisation au moins partielle et non totalement irréversible des organes végétaux ; b - addition dans le milieu de culture d'au moins un précurseur des métabolites c - incubation d - extraction des métabolites synthétisés par lesdits organes végétaux et libérés dans le milieu de culture e - rechargement du milieu de culture en milieu nutritif f - nouvelle incubation, les étapes a et b étant réalisées dans un ordre quelconque ou simultanément, de préférence simultanément. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les organes végétaux sont choisis notamment parmi les cellules, les cals, les bourgeons, les racines, les tiges, les feuilles, les écorces, les embryons de plantes supérieures et les plantes entières, les plantes étant choisies dans les familles de plantes supérieures productrices de métabolites primaires ou secondaires tels que notamment les Solanacées, les Papavéracées, les Rutacées, les Erhythrolacées et les Taxacées. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que les métabolites sont choisis parmi les alcaloïdes tropaniques tels que notamment l'hyoscyamine, la scopolamine et l'atropine ou d'autres alcaloïdes tels que notamment l'ajmaciline, la catharanthine, la vinblastine, la quinine, la vincristine, la cinchonine ou les glucosides ou d'autres métabolites secondaires ou primaires. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le cycle d'etapes a à f est répété au moins une fois, de préférence de 1 à 10 fois, et plus préférentiellement encore de 2 à 5 fois. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que la permeabilisation est réalisée, par addition d'un agent de permeabilisation. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'agent de perméabilisation est choisi parmi les esters d'acide gras polyoxyéthylénés, en particulier les esters d'acide laurique ou de ses dérivés, plus particulièrement parmi les polyoxyéthylènes sorbitan contenant de l'acide laurique ou ses dérivés, plus préférentiellement e encore un monolaurate de sorbitan tel que le Tween 20 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'agent de perméabilisation est ajouté au milieu reactionnel à une concentration comprise entre 1 et 5 % en volume par rapport au volume total du milieu reactionnel, de préférence 3 t en volume par rapport au volume total du milieu reactionnel. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les précurseurs sont des intermédiaires de synthèse des métabolites, utilisés seuls ou en combinaison, de préférence choisis parmi l'arginine, l'ornithine et la phénylalanine. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la concentration en précurseur est comprise entre 10-4 et 10-3 mole/l, de préférence entre 0,5.10-3 et 10-3 mole/l. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que la durée de la première incubation est comprise entre 15 et 24 h, de préférence 16 à 20 h, et plus préférentiellement encore 16 et 18 h et la durée de l'incubation suivante est comprise entre 4 et 8 jours, de préférence 4 et 6 jours, et plus préférentiellement encore 4 jours. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que l'étape d'extraction des métabolites consiste à - soutirer le milieu de culture, - séparer sur une colonne de séparation les métabolites du milieu contenant l'agent de permeabilisation, - rincer au moins une fois les organes végétaux, - soutirer la solution de rinçage, - separer sur une colonne de séparation les métabolites de la solution de rinçage, - récupérer les métabolites par élution des colonnes de séparation, les différentes separations étant de préférence realisées par circulation en boucle du milieu de culture et des solutions de rinçage sur les colonnes de séparation.