Brevet FR2752526A1 — publié le 19980227

La présente invention concerne une préparation liposomale antihémolytique, plus particulièrement une préparation liposomale comprenant un sulfolipide, une phosphatidylcholine et un cérébroside pour le traitement de l'hémolyse, en particulier d'une hémolyse induite par un complément. Certaines maladies et affections s'accompagnent d'une hémolyse d'érythrocytes, par exemple l'ictère hémolytique du nouveau-né et l'hémoglobinurie nocturne paroxystique. L'hémolyse est possible du fait d'une transfusion sanguine, si le choix du sang n'est pas assez précis, ou du fait d'une transplantation de moelle osseuse dans le cas d'une incompatibilité avec un mauvais groupe sanguin. Le document EP-A2-0 394 035 décrit les formes solubles de MACIF (facteur d'inhibition complexe de l'attaque des membranes) de glycoprotéine dans la membrane d'érythrocytes en vue d'une défense contre l'hémolyse. Récemment, on a obtenu une protéine ayant une activité de MACIF humain à partir de cellules transformées avec les vecteurs d'expression, qui contiennent les gènes codant pour cette protéine. Toutefois, l'utilisation de cette protéine en tant qu'agent thérapeutique est limitée du fait de son coût élevé et de ses effets secondaires possibles. L'objet de la présente invention est de proposer une préparation liposomale antihémolytique comprenant de 16 à 90; en poids de sulfolipides, de 5 à 70% en 2 0 poids de phosphatidylcholine, de 5 à 40% en poids de cérébroside et de 0 à 30% en poids de cholestérol, dans laquelle les sulfolipides sont choisis parmi un ou plusieurs composés de l'ensemble constitué par les sulfates de cérébrosides, les sulfolactosylcéramides, le sulfogalactosyldiacylglycérol et les sulfogalactosylalkylacylglycérols. Parmi ceux-ci, le sulfolipide préférable est un 2 5 sulfate de cérébroside. On peut obtenir la préparation de la présente invention en suivant les deux étapes consistant à: i) obtenir le mélange de lipides de façon à obtenir ladite composition au moyen de lipides disponibles dans le commerce ou de lipides extraits du 3 0 cerveau ou de la moelle épinière de mammifères; et ii) disperser ledit mélange de lipides dans une solution isotonique. La concentration de la préparation pour une activité de 50%(CI50) de la préparation est de 4 à 120 jtg/l en fonction de la teneur en sulfolipides et en d'autres lipides polaires. Toutefois, l'autre objet de la présente invention est de proposer un procédé convenable pour préparer ladite préparation liposomale antihémolytique au moyen du processus suivant, comprenant les étapes consistant à: i) homogénéiser le cerveau ou la moelle épinière de mammifères; ii) éliminer l'eau et les lipides neutres avec de l'acétone; iii) extraire les lipides polaires par un alcool inférieur (méthanol, éthanol, isopropanol); iv) évaporer les extraits sous pression réduite; v) dissoudre le résidu avec du chloroforme ou du dichlorure de méthylène; vi) précipiter les lipides polaires avec de l'acétone; vii) répéter les étapes v) et vi) plusieurs fois; viii) éliminer le solvant organique pour obtenir le mélange de lipides. Le mélange de lipides obtenu par ce procédé contient 18 à 40% de sulfate de cérébroside, 10 à 30% de phosphatidylcholine, 15 à 30% de cérébroside, 10 à 25% de phosphatidyléthanolamine et d'autres phosphatidylsérines et sphingomyélines, etc. La concentration pour une activité de 50%(CI50) de cette préparation est de 4 à ptg/ml. On peut obtenir la préparation liposomale de la présente invention par les procédés suivants. o On obtient la composition de lipides antihémolytique en dissolvant le mélange de lipides polaires contenant des sulfolipides dans du chloroforme, du méthanol et/ou de l'éthanol. Après élimination du solvant, on ajoute la solution isotonique. Puis on homogénéise et disperse la préparation de lipides, par une agitation et un traitement aux ultrasons suffisants. Finalement, on filtre la 2 5 dispersion sur un filtre à membrane de 0,7 ou 0,4 lim d'ouverture de maille, dans des conditions stériles. La taille des liposomes de cette invention est inférieure à 1 gm et de préférence ne dépasse pas 0,5 llm, parce qu'ils sont destinés à une administration par voie intraveineuse. Les indications de la préparation liposomale antihémolytique de la présente 3 o invention sont les suivantes. 1) Inhibition de l'hémolyse induite par un complément La préparation de la présente invention peut inhiber l'hémolyse induite par un complément, telle que l'ictère hémolytique du nouveau-né et l'hémoglobinurie nocturne paroxystique. La concentration efficace pour une telle hémolyse est 3 5 d'environ 0,5 ftg/ml à 20 mg/ml. 2) Inhibition de l'hémolyse hypotonique On sait bien que les cellules de mammifèeres sont éclatées en solution hypotonique du fait de la différence d'osmolalité à l'intérieur et à l'extérieur des cellules. Plusieurs infections peuvent s'accompagner d'une hémolyse hypotonique. Cette préparation a une forte charge négative en raison du groupe acide fort dans les sulfolipides. Par conséquent, cette préparation peut être utilisée comme protection contre une hémolyse hypotonique. Dans ce cas, la concentration efficace est de 0,01 mg/ml à 0,0 mg/ml. 3) Utilité pour le stockage de sang et de produits contenant des érvthrocytes La présente invention est utile pour le stockage et la manipulation de sang et de produits, tissus ou organes contenant du sang. Ces produits sanguins peuvent en outre comprendre des additifs pour le stockage du sang, par exemple un anticoagulant et un ingrédient nutritif. Des additifs caractéristiques comprennent le chlorure de sodium, l'acide citrique, le citrate de sodium, le glucose, le dihydrogénophosphate de sodium, le glycérol, l'acide folique, l'adénine et l'acide L- ascorbique. La préparation de la présente invention est aussi utile en tant qu'additif pour le stockage du sang. La présente invention peut être expliquée plus concrètement par les exemples suivants. Mais le cadre de cette invention n'est pas limité à ces exemples. 2 o Exemple 1 Cet exemple montre un procédé de préparation de la présente invention à partir de moelle épinière de bovin. Ce procédé est utilisable pour n'importe quelle autre source: moelle épinière de tous marmmifèeres, cerveau de tous mammifèeres et tissu quelconque de mammifère contenant des sulfolipides. Etape 1 - Obtention du mélange de lipides contenant des sulfolipides On homogénéise 1 kg de moelle épinière de bovin fraîche ou surgelée avec 0, 5 à 1 litre d'acétone dans un désintégrateur tissulaire. On place la moelle épinière broyée dans un réacteur, et on y ajoute 2,5 litres d'acétone refroidi à -10 C. On agite le mélange pendant 5 minutes, puis on le filtre sur un filtre à succion. On retire la solution d'acétone. On transfere le résidu dans un réacteur. On ajoute dans le réacteur 3 litres d'acétone refroidi à -10 C, et on agite intensément pendant 2 heures. On filtre le résidu sur un filtre à succion (extrait d'acétone 2). On répète ce protocole une fois de plus (extrait d'acétone 3). On lave le résidu avec 0,2 litre d'éthanol sur un filtre à succion. On peut utiliser les extraits d'acétone 2 et 3 pour la séparation du cholestérol. On introduit le résidu dans un réacteur. On ajoute 3 litres d'éthanol. On agite le mélange pendant 2 heures à 20-22 C. On filtre le résidu sur un filtre à succion. On place l'extrait d'éthanol (extrait 1) dans un réfrigérateur à - /-20 C. On introduit le résidu dans un réacteur et on ajoute 4 litres d'éther de pétrole. On agite le mélange pendant 2 heures à 20-22 C. On filtre le résidu sur un filtre à succion. On place l'extrait d'éther de pétrole (extrait 2) dans un réfrigérateur à -10/-20 C. On introduit le résidu dans un réacteur, et on ajoute 3 litres d'éther de pétrole. On agite le mélange intensément pendant 2 heures à 20-22 C. On filtre le résidu sur un filtre à succion. On place l'extrait d'éther de pétrole (extrait 3) dans un réfrigérateur à -10/-20 C. On évapore à siccité les extraits 1, 2 et 3, à 35-40 C sous vide. On dissout le résidu avec 0,5 litre de chloroforme tout en agitant. On ajoute 2,5 litres d'acétone à la solution de lipides, tout en agitant. On place le mélange dans un compartiment de réfrigérateur à 0-4 C pendant 18 heures (par exemple, jusqu'au lendemain). On centrifuge le précipité. On élimine le surnageant. On dissout le précipité sous agitation avec 0,3 litre de chloroforme. On ajoute 1,5 litres d'acétone à la solution de lipides. On place le mélange dans un compartiment de réfrigérateur à 0-4 C pendant 18 heures. On centrifuge le précipité. On élimine le surnageant. On dissout le précipité avec 0,3 litre de chloroforme. On ajoute 1,2 litres d'éthanol à la solution de lipides, sous agitation. On évapore le mélange jusqu'au tiers de son volume. On place le mélange dans un compartiment de réfrigérateur à 0-4 C pendant 18 heures. On centrifuge le précipité. On élimine le surnageant. On dissout le précipité avec 0,3 litre de chloroforme. On ajoute 1,5 litres d'éthanol à la solution de lipides, sous agitation. On place le mélange dans un compartiment de réfrigérateur à 0-4 C pendant 18 heures. On centrifuge le précipité. On élimine le surnageant. On dissout le précipité avec 0,3 litre de chloroforme. On ajoute 0,3 litre de solution salée et 0,1 litre d'éthanol à la solution de lipides. On mélange le mélange pendant 5 minutes. On sépare la solution chloroformique dans un entonnoir de séparation. On élimine la phase aqueuse. On déshydrate la solution chloroformique avec 0,1-0,2 kg de Na2SO4 anhydre. Puis on la place dans un compartiment de réfrigérateur à 0-4 C pendant 2 heures. On sépare par filtration la solution chloroformique. On élimine le Na2SO4. On place la solution chloroformique de lipides dans un réfrigérateur à -10/-20 C pour le stockage. On détermine la concentration de lipides. Etape 2 - Obtention de la préparation de la présente invention On évapore la solution chloroformique, on la disperse dans de la solution salée (ou une autre solution isotonique) jusqu'à une concentration de lipides de 2,6 %. On fait passer la dispersion de liposomes dans un appareil Microfluidizer 3 à 4 fois (jusqu'à une D.O. constante). On stérilise la dispersion. On filtre la dispersion sur un filtre ayant une ouverture de maille de 0,4 jim. On détermine la concentration finale de lipides. On dilue la dispersion jusqu'à 2% avec une solution isotonique stérile. On met la préparation en bouteilles dans des conditions stériles. Exemple 2 Cet exemple montre un procédé de préparation d'une composition antihémolytique sous la forme d'une émulsion grasse préparée à partir de moelle épinière de bovin et d'huile de soja. Ce procédé est utilisable pour n'importe quelle autre source: moelle épinière de tous mammifèeres, cerveau de tous mammifèeres, tissu quelconque de mammifère contenant des sulfolipides, et concerne également les triglycérides: on peut utiliser n'importe quel type d'huiles et graisses dans cette invention, mais il est souhaitable d'utiliser une huile comestible telle que l'huile de soja, l'huile de maïs, l'huile de coprah, l'huile de colza, l'huile de sésame ou l'huile d'arachide. Toutes les opérations se déroulent sous atmosphère d'azote. 2 0 Etape 1 - Obtention du mélange de lipides contenant des sulfolipides Cette étape est identique à celle de l'Exemple 1. Etape 2 - Obtention d'une émulsion grasse antihémolytique On ajoute de l'huile de soja, à raison de 100 parties d'huile pour 12 à 16 parties de la préparation de l'Exemple 1 et 25 parties de glycérol, dans une solution chloroformique, puis on l'évapore, on la disperse dans de la solution salée ou une autre solution isotonique jusqu'à une concentration de lipides polaires de 2,6 %. On fait passer cette dispersion dans un appareil Microfluidizer 3 à 4 fois jusqu'à une DO constante). On stérilise la dispersion. On filtre la dispersion sur un filtre ayant une ouverture de maille de 0,4 tim. On détermine la concentration finale de lipides. 3 0 On dilue la dispersion jusqu'à 2% de lipides polaires avec une solution isotonique stérile. On met la préparation en bouteilles dans des conditions stériles. Exemples 3 à 6 Ces exemples illustrent l'inhibition de l'hémolyse immune, à savoir l'ictère hémolytique du nouveau-né (in vitro), par la préparation de la présente invention. Protocole On utilise des érythrocytes provenant d'enfants souffrant d'ictère hémolytique du nouveau-né et du sérum de leurs mères. On défibrine 1 ml de sang provenant de la veine préparate, puis on ajoute de la solution salée aux érythrocytes (9 ml + 1 ml), et on agite doucement le mélange pendant 0,5 minute. On centrifuge ensuite l'échantillon pendant 3 minutes à 3000 t/mn et on décante le surnageant. On répète ce protocole deux fois, on ajoute 0,9 ml de solution salée à 0, 3 ml d'érythrocytes. On sédimente 3 ml de sang provenant de la mère, à 20 C pendant 2 heures, puis on le centrifuge pendant 3 minutes à 300 t/mn. On dilue le sérum au dixième avec de la solution salée. Dans l'expérience, on mélange 0,5 ml d'érythrocytes avec 0,5 ml de la préparation de la présente invention, 0,5 ml de sérum et 0,5 ml de solution salée. Dans l'expérience témoin, on mélange 0,5 ml d'érythrocytes avec 0,5 ml de sérum et 1,0 ml de solution salée. Dans le contrôle de la dispersion de la lumière, on mélange 0,5 ml de préparation avec 0,5 ml de sérum et 1,0 ml de solution salée. Afin de prendre en compte le pourcentage d'hémolyse, on réalise une hémolyse totale. On mesure la DO418 pour tous les échantillons. On calcule la proportion d'hémolyse conformément à l'équation suivante: H = (DOex - DOLs - DObl) x 100/DO100 dans laquelle DOex = DO de l'expérience étudiée, DObl = DO de l'expérience témoin, DO 100 = DO sous une hémolyse de 100 %, DOLs = densité optique d'une préparation, diluée jusqu'à une concentration égale à la concentration d'une préparation dans l'expérience (contrôle de la dispersion des liposomes). Ces expériences se déroulent avec une concentration finale de la préparation de 0,04 mg/ml, 0,2 mg/ml et 1 mg/ml. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 1. Tableau 1 Hémolyse (%) aux différentes concentrations de la préparation de la présente invention Concentration de la préparation de la présente invention (mg/ml) Exemple N 0 0,04 0,2 1 3 43 15 3 3 4 21 13 2 48 18 3 2 6 29 14 2 2 On voit qu'en l'absence de préparation, l'hémolyse se produit à raison d'environ 20 à environ 50% en fonction de la gravité de la maladie. Dans tous les cas, il se produit un ralentissement important de l'hémolyse pour une concentration de la préparation de 0,2 mg/ml et plus. Exemples 7 à 14 Ces exemples illustrent l'inhibition de l'hémolyse par la préparation de la présente invention dans le cas de l'hémolyse immune chez les mammiferes (les moutons et les lapins), ainsi que le procédé pour traiter les maladies et les affections accompagnant l'hémolyse induite par un complément. On administre à des animaux la dose létale du sérum antihémolytique. On administre aux animaux faisant l'objet de l'expérience, par voie intraveineuse et en 10 minutes, 20 mg/ml de la préparation de la présente invention. On administre de la solution salée aux animaux témoins. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2. Tableau 2 Activité antihémolvtique de la préparation in vivo - Inhibition de l'hémolvse induite par un complément chez les animaux Echan- Ani- Poids, Nombre Volume de Quantité de Volume Observa- tillon maux kg d'ani- sérum lipides par de tions N maux hémolyti- kg de poids solution que (titre), corporel de salée, ml l'animal, ml ___mg Lapins 3,5 2 4 (1/100) 15,7 5,0 Faiblesse, respiration fréquente, récupéra- tion en 24 h 8 Lapins 3,2 2 4 (1/100) 21,2 5,0 Bonne santé 9 Lapins 4,2 2 4 (1/100) 32,2 6,0 Bonne santé Lapins 4,1- 4 4 (1/100) 0 6,0 Décès en6 3,8 à 16h 11 Mouton 60 2 15 (1/200) 14,2 75 Langueur, respiration fréquente, récupéra- tion en 24 h 12 Mouton 63 2 15 25,1 75 Bonne (1/1200) santé 13 Mouton 57 2 15 36,8 70 Bonne (1/1200) santé 14 Mouton 62 2 15 0 70 Décès en (1/1200) 36h Les animaux qui n'ont pas reçu de préparation de la présente invention meurent en 6 à 36 heures après l'administration de la dose létale de sérum hémolytique. La quantité de bilirubine sanguine des animaux témoins augmente à 29-36 ItM, la quantité d'érythrocytes des animaux témoins diminue de moitié en 4 à 6 heures. Les animaux auxquels on a administré la préparation à une dose de 14 à 16 mg/kg présentent certains troubles (faiblesse, respiration fréquente, langueur), mais récupèrent en l'espace de 24 heures (Exemples 7 et 11). Avec une administration de la préparation à 21 mg/kg ou plus, tous les animaux sont en bonne santé. La quantité de bilirubine sanguine chez les animaux de l'expérience est égale à zéro, et la quantité d'érythrocytes des animaux de l'expérience ne change pas. Ces exemples montrent que la dose thérapeutique est d'environ 20 mg/kg de poids corporel. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci- dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Préparation liposomale antihémolytique, comprenant 16 à 90% en poids de sulfolipides, 5 à 70% en poids de phosphatidylcholine, 5 à 40% en poids de cérébroside et 0 à 30% en poids de cholestérol, caractérisée en ce que les sulfolipides sont choisis parmi un ou plusieurs composés de l'ensemble constitué par les sulfates de cérébrosides, les sul folactosylcéramides, le sulfogalactosyldiacylglycérol et les sulfogalactosylalkylacylglycérols. 2. Préparation liposomale antihémolytique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le sulfolipide et un sulfate de cérébroside. 3. Procédé pour préparer une préparation liposomale antihémolytique, en suivant les deux étapes consistant à: i) obtenir le mélange de lipides de façon à obtenir la composition décrite dans la revendication 1 au moyen de lipides disponibles dans le commerce ou de lipides extraits du cerveau ou de la moelle épinière de mammiferes: et ii) disperser ledit mélange de lipides dans une solution isotonique. 4. Procédé pour preparer une préparation liposomale antihémolytique selon la revendication 3, dans lequel ledit mélange de lipides est obtenu en suivant les étapes consistant à: i) homogénéiser le cerveau ou la moelle épinière de mammiferes; 2 0 ii) éliminer l'eau et les lipides neutres avec de l'acétone; iii) extraire les lipides polaires par un alcool inférieur (méthanol, éthanol, isopropanol); iv) évaporer les extraits sous pression réduite; v) dissoudre le résidu avec du chloroforme ou du dichlorure de méthylène; 2 5 vi) précipiter les lipides polaires avec de l'acétone; vii) répéter les étapes v) et vi) plusieurs fois; viii) éliminer le solvant organique pour obtenir le mélange de lipides.