Brevet FR2759367A1 — publié le 19980814

L'invention concerne de nouveaux glycérolipides utiles, notamment, pour la préparation de complexes avec des substances actives comportant des charges négatives. Elle concerne également de nouveaux complexes de glycérolipi(ies cationiques et de substances actives comportant des charges négatives permettant l'introduction desdites substances actives dans les cellules. Elle concerne notamment de nouveaux complexes, dont la substance active consiste en un ou plusieurs acides nucléiques, utiles pour transfecter les cellules. Elle concerne également un procédé d'introduction de substances actives comportant des charges négatives à l'intérieur des cellules, notamment un procédé de transfection de cellules, à l'aide de ces complexes. Elle concerne également les complexes glycérolipides cationiques/substances actives pour leur application en tant que produits thérapeutiquement actifs. Elle concerne enfin les kits pour préparer ces complexes, notamment des kits d'analyse ou de diagnostic. Les complexes lipidiques tels que les liposomes sont bien connus en tant qu'agents permettant d'introduire certaines macromolécules biologiques telles que les ADN, les ARN, les protéines ou certaines substances pharmaceutiquement actives à l'intérieur des cellules. On a déja proposé, en particulier, d'utiliser à cette fin des lipides cationiques. Les lipides cationiques sont en effet connus pour posséder une certaine affinité vis-à-vis des membranes cellulaires et vis-à-vis des acides nucléiques. De nombreux lipides cationiques ont déjà été décrits et l'on cite notamment ceux décrits dans les demandes de brevet WO-A-91 ; WO-A-9514651 ; WO-A-9405G24. En particulier la demande de brevet WO-A-9405624 décrit des lipides cationiques de formule: dans laquelle les radicaux R sont notamment des radicaux octadécènyle, les radicaux Z sont des radicaux méthyle, q est un nombre entier de 1 à 6, X est notamment une chaîne polyamine. Un composé plus particulièrement décrit est le sel de tetra(trifluoroacétate) de 1-propanaminium, N-[2-[[2,5-bis [(3-aminopropyl) amino]-1-oxo-pentyl] amino] éthyl]-n,n-diméthyl-2,3-bis(9-octadécènyloxy). Il est néanmoins souhaitable de proposer d'autres lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés améliorées ou différentes de ceux déjà décrits. On sait en effet que l'interaction entre les complexes et les membranes cellulaires peut varier considérablement en fonction de la cellule considérée. Les mécanismes qui permettent l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et le transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont, de ce fait, largement méconnus et les chercheurs en sont donc réduits à une approche pour l'essentiel empirique. D'autres facteurs rendent le choix des lipides a priori non évidents tels que : formation des complexes, stabilité, comportement in vo, éventuelle toxicité. L'objet de la présente invention est donc en premier lieu de résoudre un ou plusieurs des problèmes évoqués ci-dessus en proposant de nouveaux glycérolipides cationiques permettant notamment de réaliser de nouveaux complexes utiles pour le transfert de substances à l'intérieur des cellules. Un autre objet de la présente invention est de réaliser des complexes de faible taille (inférieure à 500 nm, avantageusement à 20() nm et de préférence à 100 nm). L'invention concerne donc un glycérolipide de formule dans laquelle R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 ali;yle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C6-C23) all;ylc ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, X est l'atome d'oxygène ou un radical amino -N R3, R3 étant un d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone, n est un nombre entier positif de 1 à G, m est un nombre entier positif de 1 à G, et lorsque n > 1, m peut être identique ou différent, lesdits glycérolipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquement acceptables. Par l'expression "alcényle", on entend que la chaîne carbonée peut comprendre une ou plusieurs double(s) liaison(s) le long de ladite chaîne. Par "forme cationique", on entend que les glycérolipides sont sous forme protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes d'azote présents sur la chaîne polyamine. Par "anion biologiquement acceptable", on entend que les anions sont tels que les glycérolipides cationiques peuvent être introduits dans la cellule ou être présents dans la membrane cellulaire. On cite par exemple l'anion trifluoroacétate. L'invention concerne également les conjugués du glycérolipide avec un ligand d'intéret par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine. L'invention concerne encore une composition comportant un ou plusieurs glycérolipides décrits ci-dessus et au moins un colipide neutre susceptible d'améliorer la formation de complexes entre lesdits glycérolipides et les substances actives, ou d'améliorer le fonctionnement de ces complexes vis-à-vis de la cellule. De tels colipides neutres stabilisent pour certains glycérolipides les complexes avec les substances actives. Parmi de tels lipides neutres, on peut citer les trigycérides, les diglycérides, le cholestérol et ceux-ci sont bien connus dans l'art, par exemple par le brevet américain n 5 438 . 1.n particulier, on préférera les phospholipides neutres et avantageusement Ies aminophospholipides neutres. De préférence encore, le colipide neutre comprend la phosphatidyléthanolamine (PE) ou un dérivé de la phosphatidyléthanolamine tel que la DOPE ou dioléoyl -phosphatidyléthanolamine. Le rapport en poids entre les glycérolipides et les colipides neutres est généralement compris entre 0,1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la nature des glycérolipides et des colipîdes neutres. On peut également utiliser des mélanges de colipides neutres. On indique ci-après des variantes préférées de réalisation prises ou non en combinaison entre elles. De préférence, R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) alkyle linéaires ou -C(=O) alcényle linéaires. De préférence, R1, Rz, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) alkyle ou -C(=O) alcényle, comprenant 12 à 20 atomes de carbone. De préférence, n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. De préférence, m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. De préférence, les glycérolipides sont choisis dans le groupe constitué par les composés de formule suivante n=2 ; pcTG18 ou n=3 ; pcTG33 II n=2 pcTG21 ou n--3 pcTG34 III n=2 ; pcTG19 ou n=3 ; pcTG36 IV n=2 ; pcTG20 ou n=3 ; pcTG35 V Cl 8:1, [cis]-9 n=2;pcTG22 VI Les glycérolipides cationiques selon l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule: dans laquelle: R4, R5 sont des groupes protecteurs, formant notamment ensemble un radical isopropylidène, X a la même signification que dans la formule I, avec un acide de formule m, n ayant la même signification que dans la formule 1, R6 étant un groupe protecteur, notamment Ic t-butoxycarbonyle (BOC). Les fonctions O-R4, -O-R5 sont déprotégées ensuite pour fixer par estérification ou éthérification les radicaux R1 et R2 de manière connue. Le composé obtenu est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique. Les acides de formule Vll sont préparés de manière connue. Dans le cas des glycérolipides où m = 3, n = 2 ou 3 on se référera aux exemples indiqués ci-après pour connaître les modalités pratiques dc synthèse. Les procédés décrits sont applicables en général aux synthèses des glycérolipides selon l'invention moyennant des adaptations à la portée de l'homme du métier. L'invention concerne encore les conjugués d'un glycérolipide selon l'invention avec un ou plusieurs ligands d'intérêt par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire dc la chaîne polyamine. De tels ligands peuvent permettre le ciblage vcrs un type cellulaire particulier, faciliter la pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir par exemple dc sucre, peptide, hormone, vitamine, anticorps, peptide fusogénique, peptide de localisation nucléaire. On peut citer plus particulièrement les résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur asyaloglycoprotéique à la surface des cellules hépatiques, le peptide fusogénique IN1:-7 dérivé de la sous-unité HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 265), 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène 1 du virus SV40 (Lanford et Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA- 1 du virus Epstein Barr (Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65,1466-1478). De tels conjugués peuvent être obtenus par couplage chimique, notamment en utilisant des groupes protectcurs tels que trifluoroacétyle ou Fmoc ou Boc sur la polyamine. La déprotection sélective d'un groupe protecteur permet alors de coupler le ligand et l'on déprotège ensuite le glycérolipide. L'invention concerne également un procédé de préparation des complexes glycérolipides cationiques-substances actives anioniques, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs glycérolipides ou une composition selon l'invention avec une ou plusieurs substances actives et en ce que l'on récupère ledit complexe. Selon une première variante, un ou plusieurs glycérolipides cationiques sont mis en solution avec une quantité appropriée de solvant ou mélange de solvant miscible dans l'eau, notamment l'éthanol, ou le diméthylsulfoxide de manière à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9603977. La suspension mise dans un milieu tampon est ensuite mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en solution dans le solvant miscible à l'eau, un film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE de manière connue. Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans le choix du rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active. Sans vouloir être limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20, notamment entre 0,1 et 1 5 et de préférence environ de 5 à 10. Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en considération les charges négatives portées par la substance active et on ajustera la quantité de glycérolipides nécessaires pour satisfaire au rapport indiqué ci-dessus. Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en fonction de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives. On a trouvé que, dans le cas des glycérolipides selon l'invention, cette première variante conduisait à d'excellents résultats en termes de tailles des complexes obtenus. Selon une seconde variante, un ou plusieurs glycérolipides cationiques sont mis en suspension avec une quantité appropriée d'une solution de détergent comme un octylglucoside tel que le n-oct?l i,-D-glucopyranoside, ou le 6-O-(N-heptylcarbomoyl)-méthyl-&alpha;-D- glucopyranoside. La suspension mise dans un milieu tampon est ensuite mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension dans la solution de détergent, un film du mélange lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE sous forme d'une solution sèche de manière connue. Les mêmes remarques concernant le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette seconde variante. De manière optionnelle, on peut procéder à une dialyse subséquente pour réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe d'une telle méthode est par exemple décrit par Hofland et al. (19')(), PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre Il du document Philippot et aI. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993). Selon une troisième variante, un ou plusieurs glycérolipides cationiques, sont mis en suspension dans un tampon puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes microporeuses sous pression appropriée. La suspension lipidique est mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives. Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension, un film du mélange dc lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE sous forme d'unc solution sèche de manière connue. Les mêmes remarques concernant Ic rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives dc la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette troisième variante. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien connue dans l'art. Il apparaît que l'utilisation d'un lipide neutre tel que la DOPE peut pour certains glycolipides s'avérer avantageuse pour l'obtention de complexes de faible taille (inférieure à 200 nm, de préférence inférieure à 100 nm). Les caractéristiques des complexes formés sont évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer - I'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse sur gel dans le cas où les substances sont des acides nucléiques. - la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière. - I'absence de précipitation à long terme. L'invention concerne les complexes de glycérolipides cationiques ou d'une composition selon l'invention et d'une ou plusieurs substances actives comportant des charges négatives, notamment les acides nucléiques et les protéines. De préférence, leur taille est inférieure à 500 nm, avantageusement à 200 nm, et de manière préférée, inférieure à 100 nm. Ledit acide nucléique peut être un ADN ou un ARN sens ou antisens. Les applications sens et anti sens sont bien connues de l'homme de l'art. En bref, on entend par: - "anti sens" un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible; et - "sens" un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéique et impliquée dans l'expression d'un gène donné. Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique comporte un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de réalisation, ledit fragment d'acide nucléique est avantageusement sous forme de plasmide. Dans le cadre de la présente invention, l'acide nucléique peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut être avantageux d'utiliser un acide nucléique codant pour une cytokine (interleukine dont l'lL-2, interféron, facteur stimulateur de colonies...), un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation (Facteur VII, Facteur VIII, Facteur IX...), la protéine CFTR (Cystic librosis fransmembrane Conductance Regulator en anglais), l'insuline, la dystrophine, une hormone de croissance, une enzyme (uréase, rénine, thrombine...), un inhibiteur d'enzyme (inhibiteur d'une protéase virale, ct 1-antitrypsine...), un polypeptide à effet antitumoral (produit de gènes suppresseurs de tumeurs, polypeptide stimulant le système immunitaire...), un polypeptide capable d'inhiber ou de ralentir le développement d'une infection bactérienne, virale ou parasitaire (polypeptide antigénique, variant trans-dominant...), un anticorps, une toxine, une immunotoxine et enfin un marqueur (luciférase, ss-galactosidase, produit conférant la résistance à un antibiotique...). Bien entendu, cette liste n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent également etre employés. Avantageusement, I'acide nucléique est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte. Par "éléments nécessaires", on désigne l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Ces éléments comprennent un promoteur régulable ou constitutif, lequel peut être hétérologue ou au contraire homologue au gène d'intérêt. On peut citer, à titre d'exemples, le promoteur du gène l > GK (Phospho Glycérate Kinase) humain ou murin, le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus), le LTR (Long Terminal Repeat) du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur TK (Thymidine Kinase) du virus IISV-1 (Llerpes Simplex virus) le promoteur CNlV (Cytomegalovirus) et les promoteurs adénoviraux E1A et MLP. Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionnels (séquence intronique, séquence signal de sécrétion, séquence de localisation nucléaire, site d'initiation de la traduction, signal poly A de terminaison de la transcription...). Les expériences de transfection montrent qu'avantageusement Ic rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit fragment d'ADN est de 0,01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0,05 à 10. L'invention concerne également les complexes glycérolipidessubstances actives tels qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par mise en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment l'éthanol ou le diméthylsulfoxyde, des glycérolipides selon l'invention ou par mise en suspension dans une solution de détergent des glycérolipides cationiques ou composition selon l'invention ou par sonication-extrusion d'une suspension de lipides cationiques ou composition selon l'invention et mélange avec une substance active. L'invention concerne également un procédé pour introduire une substance active comportant des charges négatives à l'intérieur d'une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules cultivées sur un milieu approprié avec une suspension de complexes glycérolipides-substances actives comportant des charges négatives. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées. La vérification de l'introduction de la substance active est effectuée (éventuellement après lyse de la cellule) par tout moyen approprie. Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par le terme "introduction" on entend que la substance active comportant des charges négatives est transférée dans la cellule et est localisée, en fin de procédé, à l'intérieur de ladite cellule ou au niveau de la membrane de celle-ci. L'invention concerne également un procédé pour transfecter une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules cultivées sur un milieu approprié avec une suspension de complexes glycérolipides-substances actives comportant des charges négatives. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées. La vérification de la transfection de l'acide nucléique est cffcctuéc par tout moyen approprié, par exemple par mesure dc l'expression du gène considéré ou de la concentration dc la protéine exprimée. Le procédé de transfection est bien connu en soi. Par le terme "transfection" on entend l'introduction d'un acide nucléique exprimable dans une cellule aux fins d'expression dudit acide nucléique. Le terme "acide nucléique" recouvre les acides ribonucléiques ou deoxyribonucléiques. Parmi les cellules, on cite les cellules de mammifères et en particulier une cellule humaine. Ladite cellule peut être une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoietique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...) hépatique, épithéliale, fibroblaste... et tout particulièrement une cellule musculaire (myoblaste, cardiomyocyte..), une cellule trachéale ou pulmonaire. L'invention concerne enfin les complexes glycérolipides cationiques/substances actives pour leur application en tant que produits thérapeutiquement actifs et les compositions thérapeutiques comportant de tels complexes et un véhicule inerte approprié au mode d'administration. Ilnc telle composition est particulièrement adaptée à la thérapie génique par transfert d'un acide nucléique à l'intérieur d'une cellule cible. Une composition selon l'invention peut être administrée par voie intragastrique, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale ou nasale. On préfèrera tout particulièrement les voies d'administration intracardiaque, intramusculaire, intrapulmonaire ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'invidu ou de la maladie à traiter ou encore de l'acide nucléique à transférer. Une composition selon l'invention est destinée à la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal et, préférentiellement, par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadministrer-au patient. Cette dernière composition est avantageusement utilisée pour transférer un acide nucléique dans une cellule musculaire ou une cellule pulmonaire. L'invention concerne enfin un procédé de thérapie génique consistant à administrer à un patient une quantité appropriée d'unie composition selon l'invention, éventuellement à renouveler plusieurs fois le traitement. Les exemples ci-après illustrent l'invention, sans la limiter en aucune façon, en liaison avec la figure 1 annexée qui fait partie intégrante de la description. Svnthèse des acides de formule VII avec m = 3 ; n = 2 ; R6=BOC(acide 7a) ou m = 3 ; n = 3 ; R6 = BOC (acide 7b) (voir figure 1) Amino acides 4 et 6 Une solution d'acrylonitrile (9,G ml, 146 mmoles) dans 50 ml de 1,4-dioxane est ajoutée goutte à goutte à une solution glacée de glycine (10,0 g, 132 mmoles) et de soude 1N (133 ml) dans un mélange 1/1 d'eau et de 1,4-dioxane (200 ml). Le milieu réactionnel est agité à 0=C pendant 1 h et à température ambiante pendant 4 h supplémentaires. Une solution de dicarbonate de ditertiobutyle (35,0 g, 159 mmoles) dans le 1,4-dioxane (100 ml) est ensuite ajoutée goutte à goutte et le milieu réactionnel est agité pendant deux heures à température ambiante. Après extraction par l'éther (2 x 1()0 ml), la phase aqueuse est acidifiée (pH 2-3) avec de l'acide chlorhydrique 1N et extraite avec de l'acétate d'éthyle (2 x 100 ml). Les phases organiques combinées sont séchées et concentrées. Le cyano acide obtenu 1 (24,4 g, Rdt 81%) se présente sous la forme d'un solide blanc de point de fusion 87-89C. RMN-1H (200 MHz, D2O) : #3,88 et 3,87 (2 s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,48 et 3,45 (2 t, J = 6,3 Hz, 2 H, -CH2-N(BOC)-), 2,58 et 2,56(2 t, J = 6,3 et 6,4 Hz, 2 Il -CII2-CN), 1,3() et 1,24 (2s, 9 H, t-Bu-). Une solution d'acide 1 (11,5 g, 50,4 mmoles) dans 100 ml d'éthanol contenant 4,04 g (100 mmoles) de soude est hydrogénée en présence dc nickel de Raney (3,2 g) pendant 18 h à température ambiante. Le mélange est filtré sur célite et le catalyseur lavé avec du méthanol (2 x 30 ml). Le filtrat est acidifié à pH 4-5 avec de l'acide chlorhydrique à 10 % et concentré sous vide pour donner un solide blanc qui est dissous dans le chloroforme (50 ml) pour précipiter la plus grande partie du chlorure de sodium. Après filtration, concentration sous vide du filtrat et recristallisation dans le tétrachlorure dc carbone, on obtient l'amino acide 2 (10,4 g ; Rdt 89 %) dont le point de fusion est de 201-202 C. RMN-H(200 MHz, D2O): # 3,53 (s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH2 N(BOC)-), 2,83 (t, J =7,5 Hz, 2 2H, -Cl-l2-NII2), 1,69 (quint, J = 7 Hz, 2 H, -CH2-), 1,26 et 1,21 (2s, 9 H, t-Bu-). La même procédure que pour l'obtention du cyano acide 1 conduit à l'obtention du cyano acide 3 à partir de l'amino acide 2. RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : Ô 4,00-3,85 (m, 2 H, -CH2-CO2H), 3,55-3,43 (m, 2 II, - CH2-CH2-CN), 3,31 (t, J = 7,2 Hz, 4 H, -CH2-N(BOC)-), 2,61 (m, 2 II,-ClI2-CN), 1,78 (quint, J = 7,2 Hz, 2 H, -CH2-), 1,47 et 1,44 (2s, 18 Il, t-Bu-). L'amino acide 4 est obtenu avec un rendement de 87 % après purification par chromatographie sur gel de silice (éluant méthanol/dichlorométhane 3/7, puis 6/4) à partir du cyano acide 3 selon la même procédure qui a conduit à l'amino acide 2. Le point de fusion est 189-190 C. RMN-H (200 Mllz, D2O) : Ô 3,57 et 3,54 (2s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,2-3,0 (m, G H, -CH2- N(BOC)-), 2,80 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, -CH2-NH2), 1,80-1,50 (m, 4 H, -CH2-), 1,27 et l,22 (2s, 18 H, t-Bu-). La même procédure que pour le cyano acide 1 permet l'obtention du cyano acide 5 à partir de l'amino acide 4. RMN-1H (200 MHz, CDCl3): Ô 3,85 (s large, 2 H, -CH2-CO2H), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2 H, -CH2-CH2-CN), 3,35-3,05 (m, 8 H,-CH2-N(BOC)-), 2,60 (m, 2 M, -CH2-CN), 1,85-1,6() (m, 4 H, -CH2-), 1,46 et 1,44 (2 s, 27 H, t-Bu-). L'amino acide 6 est obtenu avec un rendement de 83 % après purification par chromatographie sur gel de silice (éluant méthanol/dichlorométhane 3/7, puis 6/4) à partir du cyano acide 5 selon la même procédure qui a conduit à l'amino acide 2. RMN-H (200 Ml-lz, D2O) : Ô 3,7G et 3, concentrée pour donner une huile incolore qui après chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : acétate d'éthyle) donne l'acide 7a. (1,79 g ; Rdt : 95%). RMN-1H (200 MHz, CD3OD) : Ô 3,79 (s, 2 H, -CH2-CO2H), 3,30-3,15 (m, 6 II, -CH2-N(BOC)-), 3,03 (t, J = 6.7 Hz, 2 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 4 H, -CH2-), 1,46 et 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu-) La même procédure que pour l'acide 7a permet l'obtention de l'acide 7b (7,31 g; Rdt : 95%) à partir de l'amino acide 6 (6,50 g). RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 3,93 et 3,86 (m, 2 H, -CH2-CO2H), 3,40-3,05 (m, 12 H -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 6 H, -CH2-), 1.44 (s large, 36 H, t-Bu). Synthèse de glvcérolipides cationiques Esters 8a et 8b Une solution de dicyclohexylcarbodiimide (0,60 g, 2,9 mmoles) dans le dichlorométhane sec (1 ml) est ajoutée à une solution d'acide 7a (1,10 g, 7,25 mmoles), de (S)-(+)-2,2-diméthyl-1,3-dioxolane-4-méthanol (0,39 g, 2,9 mmoles) et de 4-(diméthylamino)pyridine (27 mg, 0,23 mmole) dans le dichlorométhane sec (3 ml). Le mélange réactionnel est agité pendant 18 h à température ambiante. Le précipité de dicyclohexylurée est enlevé par filtration et le filtrat est concentré sous vide puis chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant: éther/hexane 6/4) pour donner l'ester 8a (0,72 g; 53%). RMN-H(200 MHz, CDCl3): Ô 4,40-4,02 (m, 4 Il, -CH2-O-), 3,98 et 3,90 (2 s larges, 2H,-CH2-CO2-), 3,73 (m, 1 H, CH-O-), 3,35-3,00 (m, 8 H), 1,85-1,55 (m, 4 H, -CH2-), 1,45, 1,43 et 1,42 (3 s, 30 H), 1,36 (s, 3 H, Me-). La même procédure que pour l'ester 8a permet l'obtention de l'ester 8b (3,08 g; rdt: 49%) à partir de l'acide 7b (5,32 g, 8,22 mmoles). RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 4,40-4,02 (m, 4 H, -CH2-O-), 3,99 et 3,91 (2 s larges, 2 H, -CH2CO2-), 3,73 (m, 1 H, CH-O-), 3,32-3,00 (m, 12 II, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-), 1,45, 1,44, 1,43 et 1,41 (4 s, 39 1-1, t-Bu- and Me-), 1,36 (2 s, 3 H, Me-). Dihydroxyesters 9a et 9b Une solution d'ester 8a (6G3 mg, 1,10 mmole) et d'acide chlorhydrique 1 N (0,44 ml) dans le méthanol (19 ml) est agitée pendant 1G h à température ambiante. De la triéthylamine (0,5 ml) est ensuite ajoutée jusqu'à neutralité. L'évaporation sous vide suivie de la chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : éther puis acétate d'éthyle) donne le dihydroxyester 9a (497 mg; rdt : 80%) sous la forme d'une huile incolore. RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 4,00-3,50 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH et -CH2-CO2-), 3,40-3,00 (m, 8 H, -Cll2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 41-1, -Cll -), 1,45 et 1,43 (2 s, 27 H, t-Bu-). La même procédure que pour le dihydroxyester 9a permet l'obtention du dihydroxyester 9b (340 mg ; rdt : 71%) à partir de l'ester 8b (50() mg, 0,66 mmole). RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 4,26 (m, 2 H, -CH2-OC(O)-), 4,00-3,40 (m, 5 H, CH-OH, -CH2OH, et -CH2-CO2-), 3,40-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6 H, -CH2-), 1,46,1,45 et 1,43 (3 s, 36 H, t-Bu-). Triesters 10a, 11a, 12a et 13a Une solution de dicyclohexylcarbodiimide (142 mg, 0,G9 mmole) dans le dichlorométhane sec (1 ml) est ajoutée à une solution de dihydroxyester 9a (130 mg, 0,23 mmole), d'acide oléique (195 mg, 0,69 mmole; Fluka puriss.) et de 4-(diméthylamino)pyridine (3 mg, 0,02 mmole) dans Ic dichlorométhane sec (2 ml). Le mélange réactionnel est agité pendant 1G h à température ambiante. Le précipité de dicyclohexylurée est enlevé par filtration et le filtrat est concentré sous vide et chromatographiE sur colonne de gel de silice (éluant : éther/hexane 3/7 puis 4/6) pour donner Ic triester 10a (142 mg; 57%) sous forme d'une huile incolore. RMN-H (200 Mllz, CDCl3) : 6 5,34 (m, 4 Il, -Cll=), 5,2G (m, 1 H, CI-I-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,4G, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 Il, t-Bu-), 1,3() et 1,27 (2 s larges, 44 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, G H, Me-). La même procédure que pour le triester 10a permet d'obtcnir les triesters 11a (rdt : 65%) , 12a (rdt : 64%) et 13a (rdt : 58%) à partir du dihydroxyester 9a et respectivement dc l'acide myristiquc, dc l'acide palmitique et de l'acide stéarique. 1 la RMN-1H (200 MHz, CDCl3) : 6 5,26 (m, 1 Il CH-OC(O)-), 4,45-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,2G (s, 40 H, -CH2-), 0,88 (t, J = G.4 Hz, G Il, Nie-). 12a RMN-H (200 MHz, CDCl3): 6 5,26 (m, 1 II, CII-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CII2CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 11, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 1,85-1,50 (m, 8 1-1,-CI-I2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = G,4 Hz, G II, Me-). 13a RMN-lH (200 Mllz, CDCl3) : # 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 Il, -CH2-OC(O)-), 3,95 et 3,88 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 8 H, -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 1,85-1,50 (m, 8 H, -CH2-), 1,46, 1,44 et 1,42 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,26 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = G,4 Hz, G H, Me-). Triesters 10b, 11b, 12b et 13b La même procédure que pour le triester 10a permet l'obtention du triester 10b (137 mg ; rdt : 61%) à partir du dihydroxyester 9b (130 mg, 0,18 mmole) et d'acide oléique (153 mg, 0,54 mmole ; Fluka puriss.). RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 5,34 (m, 4 H, -CH=), 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,9G et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CII2CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H,-CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41(4 s, 3G H, t-Bu-), 1,30 et 1,27 (2 s larges, 44 H, -CH2-), 0.88 (t, J = G,4 Hz, 6 H, Me-). La meme procédure que pour le triester 10a permet d'obtenir les triesters llb (rdt : 64%), 12b (rdt : 58%) et 13b (rdt : 63%) à partir du dihydroxyester 9b et respectivement de l'acide myristique, de l'acide palmitique et de l'acide stéarique. 11b RMN-H(200 MHz, CDCl3) : # 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 Il, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,()0 (m, 17 Il -CH2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 411, -CH2-CO2-), 1,85-1,5() (m, 10 H, -CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41 (4 s, 27 I-I, t-Bu-), 1,26 (s, 40 Il, -CII2-), 0,88 (t, J = 6,4 liz, G II, Me-). 12b RMN-H (200 MHz, CDCl3) : Ô 5,26 (m, 1 II, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CH2-N(BOC)-), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 1,85-1,50 (m, 10 H,-CH2-), 1,46, 1,45, 1,44 et 1,41 (4 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 48 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, G II, Me-). 13b RMN-H (200 MHz, CDCl3): # 5,26 (m, 1 H, CH-OC(O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 et 3,89 (2 m, 2 H, -N(BOC)-CH2-CO2-), 3,35-3,00 (m, 12 H, -CII2-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2CO2-), 1,85-1,50 (m, 10 H, -CH2-), 1,46,1,45, 1,44 et 1,41 (3 s, 27 H, t-Bu-), 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Glycérolipides pcTG20 Le triester 10a (120 mg, 0,11 mmole) en solution dans le dichlorométhane sec (1 ml) est traité pendant 3 h avec un mélange 1/1 d'acide trifluoracétique et de dichlorométhane sec (20 ml) à 0 C. On ajoute ensuite de l'hexane (50 ml) et le mélange est évaporé sous vide ct donne un film qui est mis en suspension (vortex) dans de l'éther distillé (5 à 10 ml). La filtration donne une poudre blanche qui est lavée avec de l'éther et séchée sous vide pour donner le glycérolipide pcTG20 (124 mg; 99%). Point de fusion se décompose à 160 C. RMN-H (200 MHz, CDCl3 - CF3CO2D) : # 5,34 (m, 5 H, -CH= et CH-OC(O)-), 4,60 4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,99 (s large, 2 H, -NH2±CH2-CO3-), 3,45-3,20 (m, 8 H, -CH2-NI-12±), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 I-I, -CII2CO2-), 2,50-2,2() (m, 4 H, -CH2-CII2-NH2±), 2,01 (m, 8 H, -CH2-CH=), 1,61 (m, 4 Il, -CH2-CH2-CO2-), 1,3() et 1,27 (2 s, 44 H, -Cl-12-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Analyse élémentaire: Calculé pour C53H92F9N3O12 : C, 56,12%; H, 8,18%; N, 3,70%. Trouvé: C, 56,3%; H, 7,9%; N, 3,7%. Glycérolipide pcTG35 La même procédure que pour le lipide cationique pcTG20 permet l'obtention du lipide cationique pcTG35 (101 mg; rdt : 97%) à partir du tricstcr 10b (100 mg, 0,08 mmole). Point de fusion: se décompose à 190 C. RMN-H(200MHz,CDCl3-CF3CO2D): #5,35(m,5H,-CH=et CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m,4H,-CH2-OC(O)-), 4,00(s large,2H,-NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,10(m,12H, -CH2-NH2±), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 4 II, -CH2CO2-), 2,45-2,20 (m, 6 II, -CH2-CH2-NH2±), 2,01(m,8H,-CH2-CH=), 1,60(m,4H,-CH2-CH2-CO2-), 1,30 et 1,27 (2 s, 44 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 I-lz, 6 II, Me-). Analyse élémentaire: Calculé pour C58H100F12N4O14: C, 53,36%; H, 7,72%; N, 4,29%. Trouvé : C, 53,2%; Il, 7,6%; N, 4,3%. La spectrométrie de masse a été mesurée à 849,8 Da (calculée: 849,3 Da). Glycérolipides pcTG18, pcTG21 et pcTG19 La même procédure que pour le glycérolipide pcTG20 permet d'obtenir les glycérolipides pcTG18 (rdt : 97%; solide; se décompose à 165 C), pcTG21 (rdt: 96%; solide; se décompose à 170 C) et pcTG19 (rdt : 92%; solide se décompose à 186 C) à partir respectivement des triesters 11a, 12a et 13a. pcTG18 RMN-H(200MHz,CDCl3-CF3CO2D): # 5,35(m,1H,CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -CH2-OC(O)-), 3,97 (s large, 2 H, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,15 (m, 8 I-I, -CH2-NH2±), 2,38(t,J=7,5Hz,4H,-CH2-CO2-), 2,45-2,20(m,4H, -CH2-CH2-NH2±), 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,25 (s, 40 H, -CII2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, G H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 684,1 Da; mesurée 684,5 Da. pcTG21 RMN-H(200MHz,CDCl3-CD3OD): # 5,20(m,1H,CH-OC(O)-), 4,45-4,00 (m, 4H, -Cl-12-OC(O)-), 3,78 (s large, 2 II, -NH±CH2-CO2-), 3,15-2,4() (m, ö Il, -CH2-NH2±), 2,24 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,18-1,92 (m, 4 H, -CH2-CH2-NH2±), 1,52 (m, 4 H, -CH2-CH2CO2-), 1,17 (s, 48 Il, -Cl12-), 0,79 (t, J = 6,4 Hz, G H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée : 740,2 Da; mesurée 740,6 Da. pcTG19 RMN-H(200MHz,CDCl3-CH3CO2D): # 5,38(m,1H,CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 II, -CH2-OC(O)-), 4,01 (s large, 2 I-I, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,20 (m, 8 II, -CH2-NH2±), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4 II, -CH2-CO2-), 2,50-2,25 (m, 4 II, -CH2-CH2-NH2±), 1,61(m,4H,-CH2-CH2-CO2-), 1,26(s,56H,-CH2-), 0,88(t,J= 6,4 Hz, G H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 796,3 Da; mesurée 796,8 Da. Glycérolipides pcTG33, pcTG34 et pcTG36 La même procédure que pour le glycérolipide pcTG20 permet d'obtenir les glycérolipides pcTG33 (rdt: 97%; solide ; se décompose à 205 "C), pcTG34 (rdt: 94%; solide; se décompose à 215 C) et pcTG36 (rdt : 92%; solide; se décompose à 220 C) à partir respectivement des triesters llb, 12b et 13b. pcTG33 RMN- 1H (200 MHz, CDCl3-CF3 CO2D) : Ô 5,37 (m, 1 II, Cl l-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH2-OC(O)-), 4,00 (s large, 2 II, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,15 (m, 12 1-1, -CH2-NH2±), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CIl2CO2-), 2,45-2,17 (m, G Il, -CH2-CH2-NH2±), 1,60 (m,4H,-CH2-CH2-CO2-), 1,25 (s,40H,-CH2-), 0,87 (t,J= 6,4 I-lz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 741,2 Da; mesurée 741,G Da pcTG34 RMN-H(200MHz,CDCl3-CF3CO2D): #5,37 (m,1H,CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 H, -Cl-12-OC(O)-), 3,98 (s large, 2 H, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-N112±), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2-CO2-), 2,45-2,15 (m, 6 II, -C1I2-CI-I2-NH2±), 1,60 (m, 4 H, -CH2-CH2-CO2-), 1,25 (s, 48 II, -Cl 12-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 797,3 Da ; mesurée 797,8 Da. pcTG36 RMN-H(200MHz,CDCl3-CF3CO2D): #5,35 (m,1H,CH-OC(O)-), 4,60-4,15 (m, 4 M, -CH2-OC(O)-), 3,98 (s large, 2 H, -NH2±CH2-CO2-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH2-NH2±), 2.37 (t, J = 7,5 Hz, 4 H, -CH2CO2-), 2,45-2,15 (m, G l-l, -CH2-CH2-NH2±), 1,59 (m, 4 H, -CH2-CH2CO2-), 1,25 (s, 56 H, -CH2-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6 H, Me-). Spectrométrie de masse : calculée 854,4 Da; mesurée 854,0 Da. Glycérolipide pcTG22 Une voie un peu différente de celle décrite ci-dessus a permis l'obtention du glycérolipide pcTG22 à partir du 3-amino-1,2-propanediol. RMN-H(200MHz,CDCl3-CD3OD): #5,04 (m,1H,CH-OC(O)-), 4,27-3,92 (m,2H, -CH2-OC(O)-), 3,63 (s large, 2 H, -CH2-C(O)-NH-), 3,10-2,90 (m, 8 H, -CH2-NH2±), 2,24 et 2,23 (2t,J=7,5Hz,4H,-CH2-CO2-), 2,15-1,95 (m,4H,-CH2-CH2-NH2+), 1,51 (m, 4H, -CH2-CH2-CO2-), 1.17 (s, 56 H, -Cl12-), 0,79 (t, J = 6,7 Hz, G il, Nie-). Spectrométrie de masse: calculée 795,3 Da; mesurée 795,3 Da. Préparation des complexes glycérolipides-ADN par mise en solution dans I 'éthanol 1. Préparation des complexes glycérolipides pcTG20, éventuellement DOPE.-ADN Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais en cultures cellulaires), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG20/DOPE et de l'ADN plasmidique à un rapport de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par l'ADN à une concentration d'ADN finale de 0,1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon le calcul le suivant 0,1 mg d'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives (330Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à : (),3() mole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration de 3,0 @ mole/ml de charges positives apportées par le lipide cationique. La masse molaire de pcTG20 sous forme de trifluoroacétate est de 1134 g/mole et la molécule contient 3 charges positives. Donc il faut 1,0 stmole/ml de pcTG20 ce qui correspond à 1,13 mg/ml. Pour obtenir une concentration équimolaire en L-&alpha;-Dioleoyl-phosphatidyléthanolamine (DOPE, 744 g/mole, Sigma ; 1 > 0510) il en faut 0,74 mg/ml dans la préparation lipidique. Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives. Les lipides repris dans du chloroforme sont évaporés puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (v:v) et à nouveau évaporés. Les lipides cationiques sont pesés et la quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10 ou 20 mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2mM en lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (200 mbar) pendant 45 min à 45 C en utilisant un vortex de 40 tours par minute (ĭbconco, Rapid'ap, Uniequip, Martinsried, Allemagne). Le film lipidique est repris dans dc l'éthanol pour être à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique. pcTG20/DOPE 1,13 mg + 0,74 mg = 1,87 mg dans 23 1 d'ethanol. Cette solution est complétée par 20mM HEPES pli 7,5 (ajusté avec NaOH) pour préparer une solution à Smg/ml finale en lipide cationique. pcTG20/DOPE:230 l final - 23 l lipides=207 l d'HEPES. L'ADN-plasmidique est préparé dans un tube plastique à partir d'une solution mère à I mg/ml (Tris lOmNI, EDTA ImM, pli 7,5). Pour une solution de 0,5 ml finale, on prelève 50 cil de la solution mère (50 g ADN) auquel on ajoute 335 l de 20mM HEPES pH 7,5. Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par aspiration/refoulage à la pipette (10-fois). Les complexes sont conservés à + 4 C. 115 l de pcTG20/DOPE sont ajoutés à 385 l de la solution ADN pour obtenir 0,5 ml de complexe à 0,1 mg/ml ADN et un rapport dc charges de 1(). La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux laminaire. On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-après. 2. Préparation des complexes glycérolipides pcTG35, pcTG22 et pcTG18 éventuellement DOPE.-ADN Selon le même protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-après. Préparation des complexes glycérolipides-ADN par mise en suspension dans une solution de détergent 1. Préparation des complexes glycérolipides pcTG20, éventuellement DOPE,-ADN Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in itro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre, stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2mM en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et Ic film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, ss-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, O 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole:mole). On prélève 253 cil d'une solution d'octylglucoside 20 mNI dans de L'HERPES 20 mM pH 7,5 avec lesquels on reprend le film de mélange lipidique pcTG20/DOl'E. L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont 50 cil sont placés dans 0,5 mi (0,1 mg/ml final) auquel on ajoute 323,5 l d'HEPES 20 mM pH 7,5. 12G,5 l de la suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale à 0,1 mg/ml d'ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour éliminer le détergent, une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de PHEPES 20 mM pH 7,5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion de 13,2 kD ; Sartorius, Göttingen, Allemagne). Les complexes ADN/lipide dialysés sont conservés à + 4 C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire. On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau I ci-dessous. 2. Préparation des complexes glycérolipides pcTG35. éventuellement DOPE,- ADN On applique le même protocole que précédemment. Préparation des complexes linides-ADN par sonication extrusion Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre, stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 1 d'HEPES 20 mM pl-l 7,5 à 4 C pendant environ 16h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221 ) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0,2 m de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rinçée avec de l'HEPLS 20 mM pli 7,5 (Extruder de Lippes Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure. 450 1 de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 1 d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4 C.-Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire. Protocole d'évaluation de la complexation de l'ADN par les lipides Un gel à 1% (w:v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE (TAL Tris 4,8 g/l + acétate de sodium 0,68 g/1 + EDTA 0,33G g/1 pl-l 7,8. Si nécessaire, l'échantillon est dilué dans du TAE puis on ajoute le tampon d'échantillon (0,083% bleu de bromophénol, 0,083% cyanol xylène I:F, 10% glycérol dans I'eau) de façon à se trouver à 50 ngADN/pI. L'échantillon est brièvement vortexé et laissé 30 min à température ambiante. A titre de témoin, on utilise le plasmide non-complexé préparé à la même concentration. 10 pl (50() ng d'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. Le gel est révélé dans du TAE contenant 0,006% (v:v) de bromure d'éthidium à 10 mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV. Protocole de mesure de la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics France S.A., Margency, France) à 25 C après équilibration de l'échantillon pendant 20 min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'être pipettée. L'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénisé. La mesure de la lumière diffractée à 90 est faite pendant 180 sec après 180 sec d'attente. La gamme utilisée va de 3 nm à 10 000 nm en utilisant 31 bins. Pour être valable, I'échantillon doit donner entre 50 000 et 1 000 000 counts/sec. Caractéristiques physico-chimiques Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol", "dialyse de détergent" et "sonication/extrusion" sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10, ou 5. Les formulations sont considérées comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes présentent un diamètre déterminé par diffusion quasi élastique de la lumière inféricur à 500 nm. I.e tableau résume les résultats de ces analyses. Tous les complexes ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement. TABLEAU I glycérolipide Rapport Taille (nm) Formulation cationique pcTG20/DOPF 10 84+/-20 éthanol pcTG20/DOPE 10 212 +/-141 détergent pcTG20/DOPE 5 9G +/-17 éthanol pcTG35/DOPE 10 67 +/-22 éthanol pcTG35/DOPE 5 93 +/-39 éthanol pcTG35 10 83 +/-11 éthanol pcTG35 5 693 éthanol pcTG33 10 223 +/-138 sonication pcTG33/DOPE 10 243 +/-172 sonication pcTG22 10 79 +/-59 éthanol pcTG22 5 87 +/-52 éthanol pcTG22/DOPE 1(5 261 +/-98 sonication pcTG22/DOPE 10 89 +/-146 éthanol pcTG22/DOPE 5 72 +/-44 éthanol pcTG18 10 68 +/-53 éthanol pcTG18 5 72 +/-30 éthanol pcTG18/DOPE 10 62 +/-43 éthanol pcTG18/DOPE 5 109 +/-64 éthanol : Rapport entre les charges positives du lipide cationique ct les charges négatives de l'ADN. 2 : déterminée 24 à 48 heures après la préparation (+/- représentc la déviation standard de la mesure). 3 : déterminée 8 jours après la préparation Ces analyses montrent que les formulations remplissent les exigences requises. La méthode "injection d'éthanol" donne les meillcurs résultats pour de nombreuses préparations qui présentent une taille inférieure à 100 nm. Les méthodes par dialyse dc détergent et sonication/détergent permettent également d'obtenir certains complexes répondant aux buts de la présente invention. Transfection in vitro de cellules satellites Des cultures de muscles de chien et de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté avec 1() % de sérum foetal de veau (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 g/ml d'insulinc (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky IlilI, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux), et 40 pg/ml de gentamycine (Schering Plough). Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la transfection, dans une boîte de cellules à 9G puits avec environ 5x103 à 104 cellules par puits, à environ 30 % de confluence, et maintenues à 37"C en atmosphère 5 % CO2 et 95 % d'air. Les transfections sont effectuées avec des mélanges de quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN optimales par puits. Les complexes utilisés sont préparés 24 h à 48 h avant la transfection et dilués dans HamF 14 plus 40 llg/ml de gentamycine et de la glutamine 2mM. Après élimination du milieu de culture, 100 ctl de mélanges de transfection avec ou sans 10 % de FCS sont transférés dans chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37 C. Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à 10 % de FCS, 1() g/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ), de la glutamine 2mNl (bioMérieux), et 40 Fg/ml dc gentamycine (Schering Plough) pour un volume final de 250 cil. Les cultures sont incubées pendant 48 h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations de protéines sont déterminées par le système de test de quantité de protéine (Promega). Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques Les cellules A549 (cellules épithéliales dérivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 9G puits (2 x 1()4 cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37 C et 5% C02/95% air. Pour la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et remplacé par du milieu sans sérum. Dans une autre microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes sont préparés (complexes lipides/ADN à 0,1 mg/ml d'ADN et au rapport de charges indiqué): 44 l (4,4 g ADN), 22 l (2,2 cig ADN), 5,5 cil (0,55 g ADN) de solution stock dans les 3 premiers puits, et 11 I (0,11 sFtg ADN) de la solution stock diluée 10 fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 1 avec du DNIEM et 100 ,ul sont transférés sur les cellules A549. L'incubation se fait avec 4, 2, 0,5 et 0,1 g d'ADN par puits pendant 4 heures. Ensuite, 50 l de DMEM + 30% de sérum de veau foetal sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis 100 cil de DMEM + FCS 24 heures après le début de la transfection. Les transfections en présence de 10% de sérum de veau foetal sont réalisées d'une façon identique sauf que la transfection se passe dans du milieu avec sérum. Analyse de la transfection 48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 1 de solution phosphate PBS et lysées avec 50 1ll de tampon de lyse (Promega). Les lysats sont congelés à -80 C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase. Celle-ci se fait sur 20 FI de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la "Luciférase" (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 9G puits en mode cinétiquc. Transfection in vitro Quelques-unes de ces préparations ont été évaluées en transfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les cellules satellites primaires dc chien. Les résultats sont résumés dans le tableau Il ci-dessous et montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les valeurs donnécs sont obtenues avec 2 g d'ADN par puits. Tous les complexes sont préparés cn utilisant la méthode d'injection d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA, Pierce). A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 g de protéine. TABLEAU II Lipide rapport A549 A549 myoblastes my oblastes + sérum + pcTG20/DOPE 10 3,G N 105 G,1 N 106 8,9 N 105 2,3 N 10; pcTG20/DOPE 5 8,25 x 106 2,8 N 10 8,8 N 105 1.3 N 106 pcTG35/DOPE 10 4 x 106 1,0 N 10 7,1 N 103 G.5 x 10 pcTG35/DOPE 5 3,3 x 107 6,8 x 107 4,3 x 106 1,0 x 108 pcTG35 10 1,2 x 108 7,G N 106 1,8 N 10 G,2 N 108 pcTG35 5 1,G x 108 6,6 N 107 3,4 N 108 1,7 N 105 : Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de l'ADN. 2: ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative. L'expression de la luciférase (RLU/min) rapportée en mg de protéines donne les valeurs suivantes : pcTG35 R +/- 10 (A549) 3,4 x 1010 RLU/min/mg protéine pcTG35 R +/- 5 (A549) 2,8 x 1010 RLU/min/mg protéine pcTG35/DOPE R +/- 5 (A549 + sérum) 1,0 x 1010 RLU/min/mg protéine Les composés pcTG20 et pcTG35 sont capables de transfecter efficacement les deux types de cellules testées. On notera que certaines formulations donnent des résultats plus élevés en présence de sérum et que le sérum n'a pas d'effet inhibiteur sur ce type de préparation. REVENDICATIONS 1. Glycérolipide de formule I: CH2-O-R1 CH-O-R2 CH2-X-C-CH2-(-N-(CH2)m-)n-NH2 O H dans laquelle R1, K2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 allyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C6-C23) allyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés, X est l'atome d'oxygène ou un radical amino -NR3, R3 étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone, n est un nombre entier positif de 1 à G, m est un nombre entier positif de 1 à G, et lorsque n > 1, m peut être identique ou différent, lesdits glycérolipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquement acceptables. 2. Glycérolipide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) alkyle linéaires ou -C(=O) alcényle linéaires. 3. Glycérolipide selon la revendication 1 ou 7, caractérisé en ce que R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O) allyle ou -C(=O) alcényle, comprenant 12 à 20 atomes de carbone. 4. Glycérolipide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. 5. Glycérolipide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4. 6. Glycérolipide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les glycérolipides sont choisis dans le groupe constitué par les composés de formule suivante n=2;pcTG1Öoun=3;pclG33 1 1 n=2 ; pcTG2î ou n=3 ; pcTG34 III n=2 ; pcTG19 ou n=3 ; pcTG36 IV n=2; pcTG~0 ou n=3 ; pcTG35 V C18:1, [cis]-9 n=2;pcTG22 VI 7. Glycérolipide selon l'une des revendications 1 à G, caractérisé en ce que le glycérolipide est conjugué à un ou plusieurs ligands d'intérêt par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire dc la chaine polyamine. 8. Glycérolipide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ligand d'intérêt est choisi dans le groupe constitué par un sucre, un peptide, une hormone, une vitamine, un anticorps, un peptide fusogénique, un peptide de localisation nucléaire. 9. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un glycérolipide selon l'une des revendications précédentes et au moins un colipide susceptible d'améliorer la formation d'agrégats lipidiques entre lesdits glycérolipides et des substances actives biologiquement acceptables. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le colipide est choisi dans le groupe constitué par la phosphatidyléthanolamine (PE) ou un dérivé de la phosphatidyléthanolamine tel que la DOPE ou dioléoyl-phosphatidyléthanolamine. 11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le rapport en poids glycérolipide/colipide est compris entre 0,1 et 10. 12. Procédé de préparation d'un complexe glycérolipide/substance active, caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs glycérolipides selon l'une des revendications 1 à 8 ou une composition selon l'une des revendications 9 à 1 1 avec une ou plusieurs substances actives et en ce que l'on récupère ledit complexe. 13. Procédé de préparation selon la revendication 12, caractérisé en ce que le rapport entre les charges positives du ou des glycérolipides cationiques et les charges négatives de la substance active est compris entre 0,05 et 20, de préférence entre 5 et 10. 14. Procédé de préparation selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que lesdits complexes sont obtenus par mise en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment l'éthanol ou le diméthylsulfoxyde, des glycérolipides ou des compositions selon l'une des revendications 1 à 11 ou par mise en suspension dans une solution de détergent des glycérolipides ou des compositions selon l'une des revendications 1 à 11, puis mélange avec la substance active, et éventuellement dialyse dans le cas de la solution de détergent pour réduire le détergent ou par sonication/extrusion d'une suspension de glycérolipide ou composition selon l'une des revendications 1 à 11 et mélange avec une substance active et récupération des complexes. 15. Complexe de glycérolipide cationique selon l'une des revendications 1 à 8 ou d'une composition selon l'une des revendications 9 à 1 1 et d'une ou plusieurs substances actives comportant des charges négatives. 16. Complexe selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance active est choisie parmi les acides nucléiques, les protéines. 17. Complexe selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 500 nm, avantageusement inférieure à 200 nm. 18. Complexe selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 100 nm. 19. Complexe selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 14. 20. Kit pour préparer des complexes selon l'une des revendications 15 à 19, comprenant un ou plusieurs glycérolipides selon l'une des revendications 1 à 8 ou une ou plusieurs compositions selon l'une des revendications 9 à 11. 21. Procédé pour introduire une substance active dans une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact un ou plusieurs complexes selon l'une des revendications 15 à 19 avec les cellules cibles. 22. Procédé pour transfecter une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact avec les cellules cibles un ou plusieurs complexes selon l'une des revendications 16 à 19 comprenant des acides nucléiques. 23. Complexes selon l'une des revendications 1 5 à 19, pour leur application en tant que produit thérapeutiquement actif, notamment pour transférer un acide nucléique à l'intérieur d'une cellule. 24. Complexes selon la revendication 23, caractérisés en ce que le glycérolipide correspond à la formule I où R1, R2 correspondent au radical oléoyle; n = 2 ;m = 3 ou n = 3 ; m = 3. 25. Complexes selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisés en ce que les cellules sont des cellules musculaires ou pulmonaires.