Brevet FR2751514A1 — publié le 19980130

-1 - Domaine technique de l'invention L'invention a trait à un procédé pour la préparation d'un produit alimentaire contenant des AFP et à des produits alimentaires contenant des AFP. Contexte de l'invention On a proposé des peptides anti-congélation (AFP) pour améliorer la tolérance des produits alimentaires envers la congélation. Les protéines anti-congélation ont été décrites dans la littérature, voir, par exemple, Marilyn Griffith et K. Vanya Ewart dans Biotechnology Advances, volume 13, n 3, pages 375 à 402, 1995. Les propriétés anti-congélation possèdent en général une ou plusieurs des propriétés suivantes: hystérésis thermique, inhibition de la recristallisation de la glace, régulation de la forme des cristaux de glace et interaction avec des agents de germination de glace. L'hystérésis thermique est la propriété la mieux connue des AFP et on utilise normalement cette propriété afin d'évaluer la présence des AFP. Une hystérésis thermique résulte d'un abaissement de la température de congélation apparente d'une solution contenant un AFP actif ayant une hystérésis thermique sans affecter la température -2- de fusion. On décrit largement dans la littérature l'identification des sources de l'AFP au moyen d'essais d'hystérésis thermique, voir par exemple John G Duman dans Cryobiology 30, pages 322 à 328, (1993). L'inhibition de la recristallisation de la glace constitue une autre propriété des AFP. On désigne également cette activité en tant que suppression de la croissance des cristaux de glace. On peut évaluer cette propriété en comparant à un certain instant la taille des cristaux de glace en présence de AFP et en l'absence de AFP. On décrit dans le brevet US 5 118 792 (DNA Plant Technology Corporation) l'application de ce procédé dans l'évaluation des AFP de poisson. Une troisième propriété des AFP est leur capacité d'influencer la forme des cristaux de glace. Cette propriété a pour origine la liaison sélective des AFP à certaines faces du cristal de glace et ainsi une limitation de la croissance cristalline dans certaines directions. On considère alors que la présence de cristaux de glace ayant une forme bipyramidale hexagonale est indicatrice de la présence de AFP. On décrit par exemple ce procédé pour l'évaluation de l'activité des AFP extracellulaires de seigle d'hiver dans WO 92/22581 (Université de Waterloo). Une quatrième propriété des AFP est leur capacité à inhiber l'activité de substances de germination de glace. Cette interaction entre un AFP et un agent de germination de glace peut par exemple aboutir à une hystérésis thermique accrue. Cette propriété est testée par exemple dans WO 96/40973 (Université de Notre Dame du Lac). On a proposé les AFP pour l'amélioration de la tolérance à la congélation des produits. On a proposé de nombreuses mises en oeuvre dans ce contexte. Par exemple, on a proposé les AFP pour améliorer la conservation par le froid de matières biologiques (WO -3- 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents de l'Université de Californie). De même, on a proposé les AFP pour empêcher des fuites provenant des liposomes, par exemple dans les produits cosmétiques ou les produits pharmaceutiques (voir WO 96/20695). Une mise en oeuvre possible supplémentaire consiste à augmenter la tolérance à la congélation des plantes en y incluant (ou en y produisant de manière transgénétique) un AFP (voir J. Cell. Biochem Suppl. volume 14e, 1990, page 303 XP002030248, Lee et al., abrégé R228). De même on a proposé des AFP de poisson pour une utilisation dans les produits alimentaires, par exemple dans le yaourt ou la crème glacée congelés (US 5 620 732 Pillsbury et WO 96/11586, partenariat limité de recherche et de développement HSC). Toutefois, jusqu'ici, on n'a pas mis en oeuvre l'utilisation de AFP sur une échelle industrielle. Les demandeurs sont de l'avis qu'une des raisons du manque de mise en oeuvre industrielle est que, bien que l'on ait décrit de nombreux AFP, dans la pratique, la mise en oeuvre dans des produits réels industriels soulève de graves problèmes. Les demandeurs ont trouvé qu'une des raisons principales à l'origine de ces problèmes est que parmi le grand nombre de AFP qui ont été décrits dans la littérature, on ne peut mettre en oeuvre de manière appropriée qu'un ensemble limité de AFP pour chaque application; de même les demandeurs ont trouvé que cette sélection de AFP appropriés dépend de l'application et/ou des attributs du produit souhaité à réaliser. 3ô WO 90/13571 décrit des peptides anti-congélation produits chimiquement ou à l'aide de techniques de recombinaison d'ADN. On peut utiliser de manière appropriée les AFP dans des produits alimentaires tels que la crème glacée. L'exemple 3B présente des formes de cristaux de -4- glace modifiés si on gèle un mélange eau-glace en un film en combinaison avec 0,01% en poids d'AFP. WO 02/22581 décrit des AFP provenant de végétaux que l'on peut utiliser pour maîtriser la croissance de cristaux de glace dans de la crème glacée. Ce document décrit également un procédé d'extraction d'une composition de polypeptide provenant d'espaces extra-cellulaires de plantes en infiltrant les feuilles avec un milieu d'extraction sans briser les cellules végétales. WO 94/03617 décrit la production de AFP provenant de levure et leur utilisation possible dans la crème glacée. WO 96/11586 décrit des AFP de poisson produits par des microbes. La présente invention vise à fournir des solutions aux problèmes ci-dessus. En particulier, l'invention vise à fournir des produits alimentaires congelés qui ont une texture relativement molle bien que fragile, ladite texture étant conservée lors d'un entreposage prolongé aux basses températures. De manière étonnante, on a trouvé que l'on peut incorporer de manière commode des AFP dans des produits alimentaires congelés afin d'aboutir aux propriétés de produits souhaitées tant que l'on fait varier les conditions de traitement de sorte que la forme des cristaux de glace satisfasse aux conditions spécifiques. Selon un premier aspect, l'invention a trait à un procédé pour la production d'un produit alimentaire congelé contenant un AFP, dans lequel on choisit les conditions de sorte que les cristaux de glace dans le produit aient un rapport d'aspect de 1,1 à 1,9. Si les produits alimentaires sont congelés, il se forme des cristaux de glace dans tout le produit. Si on inclut des AFP dans des produits alimentaires à congeler, ceci peut aboutir à une modification des propriétés de -5- recristallisation de glace. L'agrégation des cristaux de glace des produits contenant de l'AFP peut provoquer la fragilisation du produit. De nombreux consommateurs sont en faveur de produits ou composants alimentaires relativement mous et fragiles tels que la crème glacée et la glace à l'eau. Par exemple, on peut utiliser la glace à l'eau molle en tant que composant intéressant dans des produits congelés de confiserie, de plus un grand nombre de consommateurs aiment bien la crème glacée relativement fragile. De manière étonnante, nous avons trouvé que les AFP offrent l'occasion de formuler des produits alimentaires congelés qui d'une part sont relativement mous mais fragiles et d'autre part conservent des propriétés de recristallisation de glace améliorées. Les demandeurs ont trouvé que de manière étonnante, cette combinaison avantageuse de propriétés-peut être réalisée si le produit contient des AFP et si les cristaux de glace dans le produit possèdent un rapport d'aspect compris entre 1,1 et 1,9. On définit le rapport d'aspect des cristaux de glace comme le rapport de la longueur et de la largeur des cristaux de glace. Un rapport d'aspect compris entre 1,1 et 1,9 correspond à des cristaux de glace presque ronds, qui n'ont pas une forme allongée. On peut déterminer le rapport d'aspect des cristaux par tout procédé approprié. On illustre un procédé préféré dans les exemples. De préférence, le rapport est compris entre 1,2 et 1,8, de manière tout particulièrement entre 1,3 et 1,7. De préférence les produits alimentaires de l'invention sont fragiles. De préférence l'épaisseur de couche minimale à laquelle on peut observer un comportement de rupture est inférieure à 10 mm, de manière particulièrement préférée de 1 à 5 mm. On peut mesurer le comportement de rupture soit -6- en préparant des couches d'épaisseur variable et en déterminant à quelle épaisseur minimale il se produit un comportement de rupture soit on peut le calculer d'après le module de Young tel que décrit dans les exemples. Pendant la formulation et la congélation consécutive des produits alimentaires, plusieurs paramètres peuvent influencer le rapport d'aspect des cristaux de glace qui se forment. On donne ci-dessous des exemples de facteurs qui influencent le rapport d'aspect. Les demandeurs pensent qu'il est tout à fait de la compétence de l'homme de métier de choisir les conditions telles que le rapport d'aspect des cristaux de glace tombe dans la gamme souhaitée. Un facteur qui influence le rapport d'aspect des cristaux de glace est la vitesse de congélation du produit. De manière générale, une augmentation de la vitesse de congélation aboutit à une diminution du rapport d'aspect des cristaux de glace. Dans ce contexte, la température de congélation peut influencer la vitesse de congélation et ainsi le rapport d'aspect des cristaux de glace. Dans ce contexte, on préfère quelquefois des procédés de congélation comprenant une étape de durcissement, par exemple à une température inférieure à -34 C (-30 F). La température de stockage et la durée de stockage peuvent également influencer le rapport d'aspect, ainsi des températures de stockage plus élevées, et/ou des durées de stockage plus longues tendent à favoriser la formation de rapports d'aspect élevé. Un autre facteur qui influence le rapport d'aspect des cristaux de glace est la mobilité du produit au cours de la congélation. Par exemple, si on doit congeler un mélange liquide eau-glace ou crème-glace, un refroidissement tranquille aboutira à un rapport d'aspect relativement élevé des cristaux de glace, tandis qu'une agitation aboutira à un rapport d'aspect plus faible. Un mélange à -7- cisaillement élevé aboutira à des rapports d'aspect encore plus faibles. Un autre facteur qui influence le rapport d'aspect des cristaux de glace est la présence et les quantités d'ingrédients. Par exemple, la présence d'ingrédients qui tendent à former une structure réticulée dans le produit (par exemple des gommes ou des matières grasses) peuvent aboutir à un rapport d'aspect plus faible que dans les produits exempts de ces ingrédients. De même d'autres ingrédients peuvent aboutir à des rapports d'aspect plus faibles, par exemple, des concentrations élevées en matière solide, par exemple des concentrations élevées en sucre peuvent aboutir à des rapports d'aspect plus faibles. Finalement, la nature et la quantité des AFP présents peuvent aboutir à une modification des rapports d'aspect. Certains AFP semblent favoriser la formation de rapports d'aspect faibles, tandis -que d'autres AFP semblent induire des rapports d'aspect plus élevés. On décrit dans les exemples un essai approprié afin de choisir ces AFP. Une variation de la quantité des AFP peut aboutir à une modification des rapports d'aspect. Selon un deuxième mode de réalisation, l'invention a trait à un procédé pour la production d'un produit alimentaire congelé comprenant de l'AFP, dans lequel on choisit la formulation, les conditions de congélation et de stockage de sorte que les cristaux de glace dans le produit possèdent un rapport d'aspect de 1,1 à 1,9. On peut appliquer le procédé de l'invention à tout produit alimentaire congelé contenant des AFP. Des exemples de produits appropriés sont les sauces, les repas tous prêts, etc. Les produits alimentaires préférés sont les produits de confiserie tels que la crème glacée et la glace à l'eau. -8- Les demandeurs ont trouvé que les AFP à utiliser dans le procédé de l'invention peuvent provenir d'une diversité de sources telles que les végétaux, les poissons, les insectes et les micro-organismes. On peut utiliser des espèces naturelles ou des espèces que l'on a obtenues au moyen d'une modification génétique. Par exemple on peut modifier génétiquement des micro-organismes ou des végétaux afin d'exprimer des AFP puis on peut utiliser les AFP selon la présente invention. On peut utiliser les techniques de manipulation génétique afin de produire des AFP de la manière suivante: on transformerait une cellule ou un organisme hôte approprié au moyen d'un produit de recombinaison de gène qui contient le polypeptide souhaité. On peut insérer le code de séquence de nucléotide pour le polypeptide dans un vecteur d'expression approprié qui code les éléments nécessaires à la transcription et la traduction et d'une telle manière qu'ils seront exprimés dans des conditions appropriées (par exemple selon une orientation correcte et selon un cadre de lecture correct avec un ciblage approprié et des séquences d'expression). Les procédés requis à la construction de ces vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme de métier. On peut utiliser un certain nombre de systèmes d'expression afin d'exprimer la séquence de codage de polypeptide stable envers la température. Ceux-ci comprennent, mais ne s'y limitent pas, les systèmes cellulaires de bactérie, de levure, d'insecte, les systèmes de culture de cellules végétales et les végétaux, tous transformés avec les vecteurs d'expression appropriés. On peut transformer une large diversité de plantes et de systèmes de cellules végétales avec des produits de recombinaison de l'acide nucléique des polypeptides souhaités. Les formes de réalisation préférées incluraient, -9-_ mais ne s'y limiteraient pas, le maïs, la tomate, le tabac, les carottes, les fraises, le colza et la betterave à sucre. Pour les besoins de l'invention, on dérive les AFP préférés de poisson. On préfère particulièrement l'utilisation d'AFP ayant une origine végétale (à savoir, des protéines obtenues directement à partir de plantes ou les protéines produites de manière transgénique par d'autres organismes), en particulier dérivées du seigle d'hiver ou des herbes vivaces. Pour certaines sources naturelles, les AFP peuvent se composer d'un mélange de deux ou plusieurs AFP différents. On choisit de préférence les AFP qui possèdent des propriétés d'inhibition de la recristallisation de la glace significatives. On indique dans les exemples un essai approprié à la détermination des propriétés de recristallisation. De préférence, les AFP selon l'invention fournissent une taille de particules de glace lors de la recristallisation - de préférence telle que mesurée selon les exemples - de moins de 20 pm, de manière particulièrement préférée de 5 à 15 pm. On pense que la petite taille des cristaux de glace combinée avec le rapport d'aspect spécifique est particulièrement avantageux en vue d'obtenir les caractéristiques structurales souhaitables. Un mode de réalisation très avantageux de l'invention a trait à des formulations de produits que l'on choisit telles que l'on puisse utiliser des conditions de congélation tranquilles dans la préparation du produit, tout en obtenant le rapport d'aspect tel que défini ci- dessus. Des exemples de tels produits alimentaires sont: les mélanges congelés de confiserie tels que les mélanges de crème glacée et les mélanges de glace à l'eau qui sont -10- destinés à être stockés à la température ambiante ou au réfrigérateur. Les formes de produits appropriées sont, par exemple: un mélange de poudres qui est emballé par exemple dans un sac ou dans des sachets. Ledit mélange étant capable de former la base du produit alimentaire congelé par exemple après ajout d'eau et éventuellement d'autres ingrédients et une éventuelle aération. Un autre exemple d'un mélange approprié pourrait être un mélange liquide (éventuellement aéré) que l'on peut congeler, si nécessaire après ajout de composants supplémentaires et après une aération éventuelle supplémentaire. L'avantage net des mélanges susmentionnés est que la présence de l'ingrédient AFP permet de congeler les mélanges dans des conditions tranquilles, par exemple dans un congélateur de magasin ou domestique. On emballe ces mélanges de manière très commode dans des récipients fermés (par exemple les cartons, les sacs, les boîtes, les récipients en matière plastique, etc). Pour des portions uniques, la taille de l'emballage sera en général de 10 à 1000 g. Pour des portions multiples, des tailles d'emballage allant jusqu'à 500 kg peuvent convenir. En général, la taille d'emballage sera de 10 g à 5000 g. Comme indiqué ci-dessus, les produits préférés dans lesquels on utilise les AFP sont des produits congelés de confiserie tels que la crème glacée ou la glace à l'eau. De préférence la concentration en AFP est de 0,0001 à 0,5% en poids par rapport au produit final. Si on utilise des mélanges à sec ou des concentrés, la concentration sera plus élevée afin d'assurer que la concentration dans le produit congelé final est dans les gammes ci-dessus. De manière étonnante, il s'est avéré que des compositions de l'invention peuvent contenir de très faibles quantités de AFP tout en étant d'une bonne qualité. -1 1- Jusqu'ici, on a cru généralement qu'il fallait des concentrations relativement élevées en AFP afin d'obtenir une amélioration acceptable des propriétés de recristallisation. La raison pour cela est que l'on pense couramment que les AFP agissent sur des parties importantes de la surface des cristaux de glace et donc ils doivent être présents à des concentrations relativement élevées, par exemple, 0,01% ou plus, afin d'obtenir un effet acceptable. De manière étonnante à présent on a également trouvé que pour des produits congelés, on pouvait déjà obtenir des propriétés de recristallisation améliorées et une tolérance améliorée envers la température si on utilise de faibles concentrations en AFP. De manière étonnante, il s'est avéré que la concentration en AFP peut être aussi faible que 0,1 à ppm tout en offrant encore des propriétés de cristallisation et une tolérance envers la température adéquates dans les produits congelés de confiserie. Bien que les demandeurs ne veuillent en aucun cas être liés à une quelconque théorie, il se peut que la raison pour cela soit que l'interaction entre les matières solides de la confiserie congelée et les AFP offre un excellent mécanisme d'inhibition de la croissance cristalline. De manière plus commode, la concentration en AFP est de 1 à 40 ppm, de manière particulièrement préférée de 2 à 10 ppm. Pour le besoin de l'invention, le terme "produit congelé de confiserie" inclut les confiseries congelées contenant du lait telles que la crème glacée, le yaourt congelé, le sorbet, le lait congelé et la crème anglaise congelée, les glaces à l'eau, granitas et les purées de fruits congelées. Pour certaines applications, on préfère moins l'utilisation d'AFP dans les produits alimentaires fermentés congelés. -12- De préférence la teneur en solides dans la confiserie congelée (par exemple, sucre, matière grasse, arôme, etc.) est supérieure à 30% en poids, de manière particulièrement préférée de 40 à 70% en poids. Dans une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, on utilise les formulations de confiserie congelées molles mais fragiles afin de créer un contraste de la texture dans les confiseries de glace. De préférence de telles confiseries de glace contiennent en tant qu'éléments discrets dans leur structure la composition contenant l'AFP selon l'invention. Par exemple, on peut revêtir une partie centrale de crème glacée relativement dure d'une couche mince de la composition de l'invention offrant ainsi une couche externe relativement molle mais fragile entourant la partie centrale de la crème glacée. Une autre forme de réalisation serait l'incorporation de la formulation de l'invention sous forme d'inclusions dans des confiseries de glace. Un troisième mode de réalisation serait l'alternance de couches de crème glacée avec la formulation de l'invention afin de créer des couches minces molles mais fragiles en alternance avec des couches de crème glacée. Exemple I Isolation des AFP à partir de seigle d'hiver. On a coupé le seigle d'hiver (variété Halo) en janvier (la température moyenne pendant ce mois était de 3,5 C assurant l'acclimatation correcte au froid des plantes). On a transporté rapidement le tissu dans le laboratoire pour un traitement supplémentaire et on l'a lavé minutieusement avec de l'eau afin d'éliminer les salissures. On a homogénéisé 400 g des tiges à la température ambiante dans un mélangeur Waring avec 800 g d'eau jusqu'à ce que le tissu de feuille soit complètement délité. On a -13- recueilli le jus riche en AFP en filtrant à travers 4 couches de mousseline. Puis on a soumis le jus riche en AFP à un traitement thermique en faisant bouillir le jus pendant 10 minutes. Ceci a provoqué la précipitation de la protéine tandis que l'AFP à utiliser selon l'invention est resté en solution. On a séparé le surnageant du précipité par une centrifugation à 15 000 g pendant 20 minutes ou par un complément de filtration à travers de la mousseline. On peut isoler les AFP du surnageant par une lyophilisation. Exemple II Isolation d'AFP à partir de graminées On a coupé le tissu d'un mélange de graminées (contenant Poa Trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus et Bromus sterilis) en janvier (la température moyenne pendant ce mois était de 3,5 C assurant l'acclimatation correcte au froid des plantes). On a transporté rapidement le tissu de graminée dans le laboratoire pour un complément de traitement et on l'a lavé minutieusement avec de l'eau afin d'éliminer les salissures. On a placé 500 g de tiges de graminées dans un four à micro-ondes de 650 Watts et on a chauffé à pleine puissance pendant 5 minutes, on a élevé la température jusqu'à 85 à C. Puis on a refroidi les tiges de graminées à la température ambiante. Après l'étape de chauffage, on a séparé le jus riche en AFP à partir des tiges au moyen d'une filtration. On a j Jagité en continu la masse pendant 5 minutes en présence d'un volume égal d'eau puis on l'a écrasée à travers 3 couches de mousseline. On peut lyophiliser le surnageant afin d'isoler l'AFP. -14- Exemple III On a préparé un prémélange pour une préparation de crème glacée, en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 11,39 Saccharose 3,14 Maltodextrine (MD40) 4,00 Sirop de maïs 63DE 20,71 Matière grasse du lait 9,00 Monoglycéride (palmitate) 0,45 Vanilline 0,01 Gomme de caroube 0,07 Gomme de guar 0,05 Carraghénine 0,02 Cellulose microcristalline 0,24 Gélatine 0,14 AFP (de l'exemple I*) 0,01 ou aucun (témoin) Eau le complément * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée; le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. On peut stocker ce mélange de manière commode à la température ambiante, par exemple dans un récipient en matière plastique. On peut battre le mélange avec un mixeur domestique classique jusqu'à un gonflement d'environ 100%, suivi par une congélation tranquille dans un congélateur domestique. Après 2 mois de stockage, la composition selon l'invention possédait une structure notamment meilleure que l'échantillon témoin. -15- Exemple IV On a préparé un prémélange liquide pour la préparation de crème glacée en mélangeant: Ingrédient % en poids Poudre de lait écrémé 10,00 Saccharose 13,00 Maltodexrtine (MD40) 4,00 Gomme de caroube 0,14 Matière grasse du lait 8,00 Monoglycéride (palmitate) 0,30 Vanilline 0,01 AFP (de l'exemple II*) 0,01 ou aucun (témoin) Eau le complément * remarque: on ajoute l'AFP sous forme de solution concentrée; le pourcentage se réfère à la quantité d'AFP. Exemple V On a préparé des crèmes glacées en congelant et en aérant avec un gonflement de 70% la formulation selon l'exemple IV: On a équilibré des échantillons des deux produits à -18 C dans une armoire climatique Prolan pendant environ 12 heures. On a préparé des lames pour microscope en étalant une couche mince de crème glacée à partir du centre de lames minces de verre. On a transféré chaque lame sur une platine de microscope à température régulée (à -18 C) o l'on a enregistré les images des cristaux de glace (environ 400 cristaux de glace individuels) et on les a relayés à -16travers une caméra vidéo vers un système de stockage d'image et d'analyse. On a souligné manuellement les images de cristaux de glace enregistrés en dessinant autour du périmètre ce qui souligne alors le cristal entier. On a alors mesuré des images des cristaux soulignés en utilisant le logiciel d'analyse d'image qui compte le nombre de pixels nécessaires pour compléter la ligne droite la plus longue (longueur), la ligne droite la plus courte (largeur), le rapport d'aspect (longueur:largeur). On a calculé le rapport d'aspect moyen pour les cristaux. Pour l'échantillon témoin, le rapport d'aspect était de 1,45. Pour l'échantillon contenant du AFP, le rapport d'aspect était de 1,7. Exemple VI On a déterminé la fragilité de la crème glacée de l'exemple IV par des calculs sur le comportement de rupture de la crème glacée. On a mesuré le module de Young en utilisant un essai de flexion en 3 points. On a mesuré le module de Young en préparant des bandes de crème glacée, en les équilibrant pendant 18 heures dans * une armoire de réfrigération et en les transférant vers une armoire thermostatée. On a placé les bandes sur un dispositif de flexion en 3 points tel que décrit dans Handbook of Plastics Test Methods (2ème édition), éditeur R.P. Brown, George Godwin Ltd, 1981. On a effectué immédiatement l'essai des échantillons à une vitesse de déformation de 50 mm/minute. On a mesuré la pente initiale de la courbe effort-déformation et on l'a utilisée pour calculer le module de Young selon l'équation suivante: -17- pentex L3 Module de Young (Pa) = pentex3 4xBxW3 o L = portée de la poutre (110 mm), B = largeur de l'échantillon, W = hauteur de l'échantillon. On a évalué habituellement 8 échantillons afin d'obtenir une valeur moyenne du module de Young. En utilisant les calculs décrits par Williams & Cawood dans Polymer Testing 9 pages 15 à 20 (1990), on peut calculer la résistance à la rupture. Les résultats étaient les suivants: pour l'échantillon témoin on a calculé qu'il fallait une épaisseur de 966 m pour obtenir une couche fragile. Pour l'échantillon contenant du AFP, on a déjà trouvé une fragilité (comportement de rupture) à une épaisseur de 3 mm. Ceci indique nettement la fragilité améliorée des produits de l'invention. Les produits avec AFP étaient relativement durs. Exemple VII Cet exemple décrit une méthodologie pour choisir les AFP qui favorisent lformation de formes de cristaux de glace préférées dans l'invention. La croissance des cristaux de glace dans les conditions normales a lieu à partir de l'axe a du cristal. Si des AFP sont présents, la croissance est modifiée. On peut expliquer cette influence sélective sur la forme du cristal par le fait que les AFP ont tendance à se lier à certaines parties du cristal de glace et en le faisant, ils inhibent la croissance du cristal de glace dans certaines directions. Une fixation peut, par exemple, avoir lieu au niveau des plans de prisme (perpendiculaire à l'axe a) ou au niveau des plans pyramidaux (en saillie sur ces plans). -18- Les demandeurs ont trouvé que l'on peut trouver les AFP qui favorisent la formation des rapports d'aspect selon la présente invention en choisissant les AFP qui tendent à se fixer sur le plan pyramidal. La méthodologie pour le choix de ces AFP à fixation spécifique peut être toute méthodologie appropriée. Un essai approprié utilise la dite "expérimentation de croissance 'hémisphérique' de monocristal de glace", basée sur la technique décrite dans Knight C. A. Cheng et A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) pages 409 à 418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on specific ice cristal surface planes. On a rempli un bêcher en matière plastique de 5 litres bien isolé avec de l'eau désionisée et on l'a placé dans une armoire thermostatée à -1 C. Puis on l'a laissé se refroidir lentement à partir du haut. Après deux jours, un unique cristal de glace épais d'environ 4 cm a recouvert le bécher. On a déterminé l'orientation cristallographique de ce cristal en utilisant les procédés de diffraction des rayons X sur monocristal. On a découpé des cubes de glace à partir du gros monocristal, d'une taille d'environ 2 cm, de sorte que l'une des surfaces était parallèle au plan de prisme et l'autre était parallèle au plan de base. Ainsi on a produit des monocristaux de glace orientés. On utilise un appareil constitué d'un doigt froid en laiton (d'un diamètre d'environ 1 cm) sur lequel on congèle un germe de cristal orienté. On a d'abord évidé le germe de sorte que le cristal de germe puisse s'adapter autour du doigt. Puis on a fait circuler un réfrigérant à travers le doigt et le germe congelé s'y est fixé. Puis on a trempé le doigt, avec le cristal de germination, dans un bécher de 100 ml isolé contenant une solution de la matière étudiée. La température initiale de la solution était la température ambiante (18 C), et l'unique refroidissement était produit par le doigt froid. -19- Initialement, le cristal de germination a fondu partiellement puis il a crû en une hémisphère monocristallin. Après plusieurs heures (6 à 8), il s'est formé une hémisphère avec un diamètre de 5 à 7 cm. On a effectué l'expérimentation avec diverses solutions d'AFP. Les solutions d'AFP utilisées avaient une concentration en AFP de 10-3 mg/ml. Puis on a retiré l'hémisphère du doigt froid et on l'a déplacé dans une armoire thermostatée à -15 C. On a gratté la surface et on l'a laissé dans l'armoire au moins pendant une nuit (16 heures ou plus). On a fait circuler de l'air à travers l'armoire au moyen d'un ventilateur intégré. Pendant ce temps, il s'est produit une évaporation des couches superficielles de la glace. Ainsi la surface de l'hémisphère de glace s'est transformée en une surface miroir lisse. Toutefois, pour un hémisphère contenant de l'AFP, on a observé des -taches rugueuses sur la surface. Ceci correspond aux taches o l'AFP s'est fixé sur la surface de l'hémisphère. Les grosses molécules de l'AFP empêchent l'évaporation des molécules de glace et ainsi s'accumulent en tapis rugueux de molécules AFP au niveau des surfaces o se produit une liaison préférentielle à la glace. Puisqu'on connaît l'orientation de l'hémisphère, on peut mesurer la distance angulaire entre ces taches rugueuses et les directions de base et de prisme au moyen d'un goniomètre optique, on peut facilement déterminer la nature du plan des liaisons. On peut utiliser cet essai afin de choisir les AFP qui ont tendances à se lier aux plans pyramidaux. Par exemple, les AFP des exemples I et II ont tendance à se lier aux plans pyramidaux. De même un grand nombre d'autres extraits de plantes ont tendance à aboutir à une liaison pyramidale. Il est bien de la compétence de l'homme de métier d'utiliser l'essai cidessus afin de déterminer les AFP qui -20- ont tendance à favoriser la formation de rapports d'aspect élevés pour des cristaux de glace. Afin d'évaluer leur adaptabilité aux produits congelés de l'invention, on peut réaliser de véritables produits et on peut déterminer le rapport d'aspect des cristaux dans les produits. Exemple VIII Essai pour la détermination de la taille de cristaux de glace lors d'une recristallisation. On a ajusté un échantillon d'une solution contenant de l'AFP dans de l'eau à une concentration en saccharose de % en poids (si la concentration initiale de l'échantillon dépassait 30%, on l'y a amenée par une dilution, si la concentration initiale était plus faible, on a ajouté du saccharose jusqu'à atteindre la concentration de 30%). En général, on peut appliquer l'essai à toute composition appropriée comprenant de l'AFP et de l'eau. En général, la concentration en AFP dans une telle composition d'essai n'est pas très critique et elle peut, par exemple, être de 0,0001 à 0,5% en poids, de manière particulièrement préférée de 0,0005 à 0,1% en poids, de manière tout particulièrement préférée de 0,001 à 0,05% en poids, par exemple 0,01% en poids. On a placé une goutte de 3 pl de l'échantillon sur une lame porte-objet de 22 mm. Puis on a placé une lame couvre- objet de 16 mm de diamètre par-dessus et on a placé un poids de 200 g sur l'échantillon afin d'assurer une épaisseur uniforme de lame. On scelle les bords de la lame porte-échantillon avec un vernis à ongle transparent. On place la lame sur une platine de microscope régulée en température Linkham THM 600. On refroidit rapidement la platine (50 C par minute) jusqu'à -40 C afin de produire une grande population de petits cristaux. Puis on élève -21- rapidement la température de la platine (50 C par minute) jusqu'à -6 C et on la maintient à cette température. On examine la phase de glace à -6 C en utilisant un microscope Leica Aristoplan. On a utilisé des conditions de lumière polarisée conjointement avec une lame onde afin d'améliorer le contraste des cristaux de glace. On a enregistré l'état de la phase de glace (taille des cristaux de glace) au moyen d'une microphotographie en 35 mm à T=0 et T=1 heure. Une taille de particule moyenne (détermination visuelle, moyenne en nombre) inférieure à Mm, de manière particulièrement préférée comprise entre et 15 Mm indique les AFP préférés pour une utilisation dans les produits selon l'invention. -22- REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production d'un produit alimentaire congelé comprenant un AFP, dans lequel les conditions sont choisies de sorte que les cristaux de glace dans le produit possèdent un rapport d'aspect compris entre 1,1 et 1,9. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les conditions visant à influer sur le rapport d'aspect sont choisies dans le groupe comprenant: la vitesse de congélation, la mobilité du produit au cours de la congélation, la température et la durée de stockage, la formulation du produit et la nature et la quantité des AFP, et leurs combinaisons. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le produit alimentaire congelé est un produit congelé de confiserie. 4. Produit congelé de confiserie comprenant des AFP à raison de 0,0001 à 0,5% en poids, ledit produit possédant un rapport d'aspect des cristaux de glace de 1,1 à 1,9. 5. Produit congelé de confiserie selon la revendication 4, dans lequel les AFP se lient de préférence aux plans pyramidaux des cristaux de glace. 6. Produit congelé de confiserie possédant un contraste de texture, ledit produit comprenant des éléments discrets d'un produit de confiserie selon la revendication 4. 7. Produit congelé de confiserie selon la revendication 6, comprenant des couches minces de crème glacée en alternance avec des couches minces de glace à l'eau, dans lequel les couches de glace à l'eau comprennent des AFP à raison de 0,0001 à 0,5% en poids et possèdent un rapport d'aspect des cristaux de glace de 1,9 à 3,0. -23- 8. Mélange de crème glacée adapté à une utilisation dans la préparation d'un produit congelé de confiserie selon la revendication 4. 9. Mélange de crème glacée selon la revendication 8, dans lequel la préparation implique une aération et une congélation tranquille.