Brevet FR2751749A1 — publié le 19980130

La présente invention concerne un procédé de détection de fluorescence et un dispositif de détection de fluorescence pouvant être utilisé dans des dosages immunologiques. Plus particulièrement, la présente invention est relative à un procédé de détection de la fluorescence et à un dispositif pour déterminer la concentration d'une substance-objet avec une précision élevée en mesurant la fluorescence provenant de la substance et la fluorescence due à une substance de référence On connaît des méthodes de dosage immunologique qui utilisent un label fluorescent contenu dans un immunocomplexe ou un produit fluorescent formé par une substance de marquage. Parmi ces procédés, un dosage immunologique marcué par enzyme est conduit, par exemple en mettant en contact un échantillon de sérum contenant une substance-objet et un anticorps marqué par une enzyme avec un anticorps immobilisé sur une phase solide afin de former un immunocomplexe, en enlevant la partie n'ayant pas réagi de l'anticorps marqué par enzyme, en ajoutant un substrat pour l'enzyme maintenue dans le complexe afin de provoquer une réaction de l'enzyme, et en mesurant la fluorescence émise par la substance fluorescente formée par la réaction de l'enzyme. Un dispositif classique de détection de fluorescence pour un tel procédé de détection comprend un système d'irradiation par lumière d'excitation ayant une source lumineuse et une lentille, et un système de mesure optique comprenant au moins un élément de détection et au moins une lentille pour mesurer la fluorescence émise à partir d'une substance-objet (substance fluorescente). On choisit le système optique de façon que le sens de la lumière projetée d'excitation (lumière d'éclairage) coïncide sensiblement avec le sens de convergence de la fluorescence émise, ou soit perpendiculaire à ce sens, en fonction du type de 2 2751749 cellules de mesure et des conditions de l'environnement. Dans le système optique ayant le sens de la lumière d'excitation qui coïncide avec la direction de l'émission de la lumière fluorescente, un miroir à réflexion partielle tel qu'un miroir dichroique est employé pour séparer la lumière fluorescente de la lumière d'excitation. Les dispositifs de détection classiques ont l'inconvénient que la précision de la mesure n'est pas suffisante à cause des variations de la valeur mesurée qui sont dues au changement du ménisque de la surface de l'échantillon ou à la présence de bulles, et que la dépendance linéaire de l'intensité de la fluorescence vis-à-vis de la concentration de la substance-objet est altérée, aux hautes concentrations, à cause de l'absorption de la lumière d'excitation par la substance-objet, ce qui provoque la chute de l'intensité de la fluorescence produite. Pour compenser de tels inconvénients, on a proposé un procédé (brevet JP-A-5-38297 et son correspondant USP 5460943). Dans ce procédé, une substance fluorescente de référence est ajoutée qui est excitée à la même longueur d'onde que la substance-objet dans l'échantillon et émet une fluorescence ayant une longueur différente de celle de la substance-objet, et les intensités de la lumière fluorescente de l'échantillon et de la substance de référence sont mesurées afin d'obtenir la concentration de la substance- objet. Ce procédé, qui utilise des longueurs d'onde différentes de la fluorescence peut être appelé fluorométrie à deux longueur d'onde. Par exemple, dans ce procédé, la lumière fluorescente est séparée en deux faisceaux lumineux fluorescents par un miroir à réflexion partielle tel qu'un miroir dichroique, les faisceaux séparés de la lumière fluorescente sont amenés respectivement à traverser un élément de sélection de 3 2751749 longueur d'onde, et la fluorescence de la substance- objet et celle de la substance de référence sont ainsi détectées de manière sélective, les intensités des lumières fluorescentes respectives sont mesurées, et la valeur mesurée de la lumière fluorescente de la substance-objet est corrigée sur la base de la variation de la lumière fluorescente de la substance de référence. La fluorométrie à deux longueurs d'onde permet une mesure de haute précision. La demanderesse a procédé à des études pour améliorer encore la précision et a trouvé que le rapport des changements des signaux des deux intensités fluorescentes n'est pas toujours constant dans la mesure de nombreux échantillons dans la fluorométrie classique à deux longueurs d'onde qu'on mentionne ci-dessus. La variation du rapport des changements du signal s'est avérée être due aux causes exposées ci- dessous. Par exemple, dans le dispositif de dosage immunologique pour la détermination quantitative d'une substance biologique, des complexes contenant une enzyme sont placés généralement dans des cellules relativement petites, et un grand nombre de ces cellules sont fournies mécaniquement et automatiquement à un poste de mesure optique pour la détermination quantitative. Cependant, il n'est pas facile de fournir constamment et avec précision les cellules à la position prédéterminée dans le poste de mesure sans variation de la position. En particulier, dans les dispositifs du commerce dans lesquels un grand nombre de cellules de mesure sont manipulées, il est extrêmement difficile de placer invariablement les cellules délivrées à la position fixe par rapport au système de mesure optique. La variation de la position des cellules se produit inévitablement. En outre, des bulles peuvent être formées dans le liquide de mesure lors de la distribution du substrat de l'enzyme dans la cellule de mesure, et la formation de 4 2751749 bulles ne peut être empêchée complètement. La variation du rapport de changement du signal des deux éléments de détection qu'on mentionne cidessus, par cet écart des positions, et la formation de bulles rendent impossible la correction complète de l'écart de position. Lorsque la cellule s'écarte en matière de position ou que des bulles y sont formées, le rapport des changements du signal des deux détecteurs n'est pas constant dans la fluorométrie à deux longueurs d'onde à cause d'une non- équivalence physique, telle que les écarts de position des éléments de détection, des ouvertures devant les éléments de détection respectifs, et des axes optiques des éléments de détection respectifs, et de l'irrégularité en matière de sensibilité des éléments de détection, ce qui-est à l'origine d'une inconformité des rapports de changement des signaux de détection avec les deux éléments de détection. Dans le cas o l'intensité de la fluorescence de la substance de référence est davantage affectée par l'écart de position de la cellule que la substance objet de la mesure, la donnée mesurée qui est corrigée par le même mode opératoire (en employant une équation de correction, ou analogue) implique l'influence de l'écart de position. Un objet de la présente invention est de fournir un dispositif pour la détection de la fluorescence et la mesure de l'activité d'une enzyme qui est moins affectée par l'écart de position de la cellule de mesure par rapport au système optique du dispositif en étant exempt des inconvénients des procédés classiques qu'on a exposés ci-dessus. Selon un aspect de la présente invention, on fournit un dispositif de détection de fluorescence ayant un élément de séparation de la lumière afin de transmettre une partie de la fluorescence émise par une substance fluorescente en projetant une lumière 2751749 d'excitation et en réfléchissant le reste de la fluorescence, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection pour mesurer la fluorescence transmise ou réfléchie par l'élément séparateur de lumière, respectivement, à une longueur d'onde sélectionnée, o les deux éléments de détection sont disposés de manière à être optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de lumière. Selon un autre aspect de la présente invention, on fournit un dispositif de détection de fluorescence pour mesurer une substance fluorescente constituée d'une cellule de réaction par la réaction provoquée par une enzyme contenue dans un immunocomplexe ou une substance fluorescente contenue dans un complexe formé par immunoréaction, comprenant un système de source de lumière optique pour projeter la lumière afin d'exciter une substance fluorescente dans la cellule, un élément séparateur de lumière pour transmettre une partie de la fluorescence émise par une substance fluorescente et réfléchir le reste de la fluorescence, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection afin de mesurer sélectivement la fluorescence transmise ou réfléchie par l'élément séparateur de lumière, et un premier élément de condensation et un second élément de condensation placés sur le trajet optique afin d'introduire la fluorescence de la substance fluorescente dans l'élément séparateur de lumière, o le premier élément de condensation et le second élément de condensation sont disposés de façon que l'image de la substance fluorescente soit formée par le premier élément de condensation sur le second élément de condensation, et l'image du premier élément de condensation soit formée par le second élément de condensation sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection, et les deux éléments 6 2751749 de détection sont disposés de manière à être optiquement équivalents par rapport à l'élément séparateur de lumière. La présente invention sera bien comprise lors de la description suivante faite en liaison avec les dessins ci-joints, dans lesquels: La figure 1 est une vue avant qui représente schématiquement la constitution du dispositif de mesure de l'activité d'une enzyme (dispositif de détection de fluorescence) d'un premier mode de réalisation de la présente invention. La figure 2 est une vue avant qui représente schématiquement la constitution du dispositif de mesure de l'activité d'une enzyme (dispositif de détection de fluorescence) d'in second mode de réalisation de la présente invention. La figure 3 représente les changements des signaux de sortie de la photodiode, lorsque l'axe optique du système de mesure optique du dispositif de détection de la fluorescence et le centre de la cellule sont déplacés dans la direction horizontale. La figure 4 représente un exemple d'une modification du dispositif de la figure 1. La figure 5 représente un exemple d'une modification du dispositif de la figure 2. On procédera maintenant à une description détaillée du mode de réalisation préféré de l'invention. Le dispositif de détection de fluorescence d'un premier mode de réalisation de la présente invention comporte un élément séparateur de lumière afin de transmettre une partie de la lumière fluorescente émise par une substance fluorescente par projection d'une lumière d'excitation et réflexion du reste de la lumière fluorescente, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection pour mesurer sélectivement la lumière transmise ou réfléchie 7 2751749 par l'élément séparateur de lumière, respectivement, à une longueur d'onde sélectionnée, les deux éléments de détection étant disposée de manière à être optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de lumière. Dans ce qui précède, l'expression "disposé de manière à être optiquement équivalent" signifie que les deux éléments de détection sont disposés de façon que les changements des signaux de sortie soient presque au même niveau (les taux de changement étant aussi proches que possible), lorsque la position de la cellule varie. L'élément séparateur de lumière comprend des miroirs à réflexion partielle tels que des miroirs dichroiques, et des prismes en combinaison, et peut être n'importe quel article qui transmet une partie de la lumière fluorescente et réfléchit le reste de cette lumière. Une plaque transparente telle que des plaques en verre optique et des plaques en verre au quartz sont utiles à cette fin lorsque l'intensité de la fluorescence est suffisamment élevée. Cependant, en général, un miroir à réflexion partielle tel qu'un miroir dichroique est de préférence employé car il introduit la lumière fluorescente dans les éléments de détection avec une efficacité élevée. La plaque transparente ou le miroir dichroïque est placé à un angle de 45 par rapport à l'axe optique. La plaque de l'élément est de préférence plus fine, car l'épaisseur provoque la déviation de l'axe optique, et l'épaisseur est généralement d'environ 1 mm. Un prisme en combinaison constitué de deux primes isocèles à angle droit collés l'un à l'autre sur les hypoténuses convient pour obtenir une équivalence de haute précision car le prisme ne provoque pas la déviation de l'axe optique de la lumière transmise. La sélectivité en matière de longueur d'onde peut être obtenue en formant un film à couches multiples à l'interface collée. 8 2751749 L'élément de détection comprend des photodiodes et des photomultiplicateurs, mais n'est pas limité à ceux-ci. Le dispositif de détection de fluorescence du premier mode de réalisation est caractérisé par une paire d'éléments de détection qui sont disposés de manière à être optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de lumière. Comme on l'a indiqué précédemment, l'expression "optiquement équivalent l'un à l'autre" ne signifie pas une équivalence complète dans toutes les conditions optiques, mais veut dire l'agencement des deux éléments de détection pour égaliser les changements des signaux sortant des deux éléments de détection (afin de rendre minimale la différence entre le rapport des changements) lorsque la position de la cellule varie. Avec l'agencement ci-dessus de la paire des premier et second éléments de détection, le rapport des changements dans les éléments de détection peut être rendu sensiblement constant à tous égards (le rapport des quantités des fluorescences peut être rendu sensiblement constant quel que soit l'écart de la position de la cellule de réaction), et par conséquent l'intensité de la fluorescence peut être mesurée avec une précision élevée sans l'influence, mentionnée ci- dessus, de l'écart de la position de la cellule de réaction. Dans une variante du dispositif de détection de fluorescence ci-dessus, un premier élément de condensation de la lumière et un second élément de condensation de la lumière sont disposés dans cet ordre, sur le trajet optique d'introduction de la lumière fluorescente entre la substance fluorescente et l'élément séparateur de lumière. Ainsi, l'image de la substance fluorescente est formée par le premier élément de condensation sur le second élément de condensation, 9 2751749 et l'image du premier élément de condensation est formée par le second élément de condensation sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection. Le dispositif de détection de fluorescence d'un autre mode de réalisation de la présente invention est un dispositif pour mesurer une substance fluorescente formée dans une cellule de réaction par la réaction provoquée par une enzyme contenue dans un immunocomplexe, ou par une substance fluorescente contenue dans un complexe formé par immunoréaction, comprenant un système de source de lumière optique pour projeter la lumière afin d'exciter une substance fluorescente dans la cellule, un élément séparateur de lumière pour transmettre une partie de la fluorescence émise par une substance fluorescente et réfléchir le reste de la fluorescence, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection pour mesurer sélectivement la lumière transmise ou réfléchie par l'élément séparateur de lumière, et un premier élément de condensation et un second élément de condensation placés sur le trajet optique pour introduire la fluorescence de la substance fluorescente dans l'élément séparateur de lumière, o le premier élément de condensation et le second élément de condensation sont disposés de façon que l'image de la substance fluorescente soit formée par le premier élément de condensation sur le second élément de condensation, et l'image du premier élément de condensation est formée par le second élément de condensation sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection, et les deux éléments de détection sont agencés de manière à ce qu'ils soient optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de lumière. L'élément séparateur de lumière peut être placé entre le premier élément de condensation et le second élément de condensation. Dans cet agencement, deux des seconds éléments de condensation sont employés et l'un est prévu entre l'élément séparateur de lumière et le premier élément de détection et l'autre entre l'élément séparateur de lumière et le second élément de détection. Dans une variante de ce second mode de réalisation, la mesure est effectuée pour une substance fluorescente formée par une enzyme contenue dans un immunocomplexe (qu'on désigne ci-après par "substance fluorescente formée") et pour une substance fluorescente de référence émettant de la fluorescence sans action enzymatique. L'un des éléments de détection mesure sélectivement la fluorescence à la longueur d'onde de la fluorescence de la substance fluorescente formée, et l'autre des éléments de détection mesure sélectivement la fluorescence à la longueur d'onde de la fluorescence de la substance fluorescente de référence. La substance fluorescente formée par la réaction enzymatique, et la substance fluorescente de référence insensible à la réaction enzymatique dans la présente invention sont données à titre d'exemple par les substances indiquées, par exemple, dans le brevet japonais JP-A-5-38297 mentionné ci-dessus et son équivalent américain USP 5460943. Un exemple de la substance fluorescente formée est la 4-méthyl- umbelliferone(substance fluorescente formée) obtenue à partir du phosphate de 4-méthylumbelliféryle par réaction enzymatique telle que la phosphatase alcaline. Cette 4-méthylumbelliferone émet de la fluorescence avec un pic à environ 450 nm en excitant une lumière de 365 nm dans un milieu alcalin (pH d'environ 10). D'autre part, une substance fluorescente de référence est donnée à titre d'exemple par la densyl-L-alanine qui émet une fluorescence ayant un pic à environ 550 nm dans les mêmes conditions que ci-dessus (pH, longueur d'onde de la lumière d'excitation). Dans une autre variante de ce second mode de réalisation de la présente invention, la substance fluorescente est un label contenu dans un complexe résultant de l'immunoréaction d'une substance objet de la mesure. La source lumineuse employée dans les modes de réalisation de la présente invention comprend des tubes à décharge électrique, des lampes fluorescentes, etc. L'influence de la lumière perturbante peut être éliminée en utilisant une source de lumière modulée et en faisant une détection synchrone avec l'élément de détection (côté réception de la lumière). Une ouverture est de préférence ménagée à proximité de l'élément de détection ou de la source lumineuse de manière à limiter le trajet optique. Par exemple, une ouverture ronde ménagée à proximité d'un élément de détection rectangulaire pour limiter la face de détection diminuera le changement de la lumière réfléchie provoqué par la paroi de la cellule de réaction lorsque cette cellule dévie par rapport à la position prescrite. Avec une constitution dans laquelle un échantillon, un premier élément de condensation, un second élément de condensation, et une paire d'éléments de détection sont disposés comme on l'a mentionné ci- dessus, même lorsque la position de la cellule de réaction dévie, les intensités de la lumière projetée changent à un rapport constant à chaque point des premier et second éléments de détection. Par conséquent, l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente formée par l'enzyme contenue dans l'immunocomplexe et l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence peuvent être mesurées, alors que le rapport est constant, sans influence de l'écart de position de la cellule de mesure. Ainsi, le rapport de l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence qui ne change pas dans le temps et l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente formée qui varie dans le, temps peuvent être mesurées comme information optique par une paire d'éléments de détection prévus dans une équivalence optique avec haute précision et une faible influence d'un écart de position de la cellule. Dans le dispositif de détection de fluorescence de la présente invention tel que décrit ci-dessus, la sélection de la longueur d'onde dans le système de détection optique peut être effectuée par un élément sélecteur de longueur d'onde prévu sur le trajet optique entre l'élément séparateur de lumière et l'élément de détection. La sélection de la longueur d'onde de la lumière transmise peut être effectuée aussi en conférant la fonction de sélection de longueur d'onde à l'élément séparateur de lumière. Un filtre est généralement employé comme élément de sélection de longueur d'onde. Par exemple, à l'avant d'un des éléments de détection, un filtre est prévu qui transmet la fluorescence provenant de la substance objet mais intercepte la fluorescence de la substance fluorescente de référence, et à l'avant de l'autre élément de détection, un autre filtre est prévu qui transmet la fluorescence provenant de la substance fluorescente de référence mais intercepte la fluorescence de la substance objet. Le filtre comprend des filtres à bande passante, et des filtres de coupure. Un filtre d'interférence, qui est une sorte de filtre à bande passante utilisant une membrane d'interférence, est utile pour la sélection de la longueur d'onde d'un détecteur de fluorescence à cause de sa caractéristique de sélection nette. Pour la sélection de la partie à longueur d'onde plus grande de la fluorescence provenant de l'objet de la mesure, un filtre de coupure est utile ainsi qu'un filtre d'interférence. Avec une source lumineuse ayant une large distribution de la longueur d'onde, un élément de sélection de longueur d'onde est de préférence prévu sur le trajet optique de la source de la lumière d'excitation afin d'éliminer la lumière de longueur d'onde inutile. Un filtre d'interférence, ou un filtre à bande de verre colorée est utile à cette fin. La caractéristique désirée du filtre peut être obtenue par un simple filtre, par une combinaison d'éléments séparateurs de lumière présentant de la sélectivité vis- à-vis de la lumière, par la combinaison d'un élément séparateur de lumière et de filtres, ou par la combinaison de plusieurs filtres. La sélectivité nécessaire de la longueur d'onde des filtres ci-dessus dépend de la précision exigée pour la détection, et il n'est pas nécessairement indispensable de transmettre seulement la lumière ayant la longueur d'onde de détection. La sélectivité doit être suffisante pour que la fluorescence de la substance fluorescente formée et celle de la substance fluorescente de référence puissent être détectées séparément. Dans le dispositif de détection de fluorescence de la présente invention ayant la description ci-dessus, un élément de condensation pour projeter l'image de la source lumineuse sur la cellule, et les premier et second éléments de condensation pour projeter l'image de la substance fluorescente dans la cellule ci-dessus sont fournis sur des trajets optiques respectifs. Les fonctions du premier élément de condensation et de l'élément de condensation du système optique de la source lumineuse peuvent être remplies par un seul élément, ou par des éléments séparés. En général, on emploie une lentille comme élément de condensation de la lumière. Le rayon de courbure de la lentille est choisi de manière appropriée en fonction de la position de l'image et le diamètre de l'ouverture est sélectionné de manière appropriée en fonction de l'étalement de la lumière employée. Le système de lentille est constitué de deux unités de lentille. Chaque unité peut être une lentille simple ou une lentille en combinaison. La lentille peut être une lentille convexe double ou une lentille plano-convexe. Le système de lentille est choisi en considération de l'aberration sphérique. Dans la présente invention, "projection de l'image" signifie non seulement la formation d'une image complète mais également celle d'une image floue, mise au point de manière incomplète. La présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation cidessus, et comprend d'autres constitutions nécessaires. L'axe optique de la lumière d'excitation projetée, et l'axe optique de l'émission de la fluorescence peuvent être conçus pour coïncider l'un avec l'autre, ou pour être perpendiculaires l'un à l'autre. L'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente formée est corrigée de diverses manières selon l'intensité mesurée de la fluorescence de la substance fluorescente de référence dans la présente invention. Un exemple est une constitution employant une unité à microprocesseur qui comprend un programme permettant le calcul nécessaire. Le système de correction, en plus du système de calcul, comporte une comparaison avec une courbe d'étalonnage prédéterminée, la lecture de l'information mémorisée dans le moyen de mémoire (mémoire morte, etc.), etc. Dans la présente invention, une substance fluorescente de référence, qui ne change pas de quantité dans le temps, coexiste avec la substance fluorescente formée qui change quant à sa quantité dans le temps par réaction enzymatique dans une cellule. Les intensités de la fluorescence à deux longueurs d'onde émises par la cellule sont mesurées par une paire d'éléments de détection placés de manière à être optiquement équivalents. L'intensité mesurée de la fluorescence émise par la substance fluorescente formée par la réaction enzymatique est corrigée en fonction du changement de l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence, qui ne change pas quant à sa quantité et maintient constante de manière inhérente l'intensité de la fluorescence, d'o l'obtention de la quantité vraie de la substance fluorescente formée. La figure 1 représente schématiquement un exemple de la constitution du dispositif de détection de fluorescence (dispositif de mesure de l'activité enzymatique de la présente invention). Une source lumineuse 1 projette une lumière d'excitation par l'intermédiaire d'une ouverture 12, d'un filtre 9 comme élément de sélection de longueur d'onde, et d'un miroir à réflexion partielle (demi-miroir) 7, et d'une lentille 4 comme élément de condensation afin de former une image de source lumineuse (l'image de la source lumineuse elle-même, ou l'image de la source de lumière) dans une cellule 13. La cellule 13 contient un immunocomplexe formé par l'immunoréaction d'une substance biologique, marquée anticorps avec un anticorps immobilisé. Dans la cellule, un substrat est injecté qui forme une substance fluorescente par réaction avec l'enzyme contenue dans le complexe. Ensuite, la cellule est placée à la position indiquée dans la figure par un mécanisme d'entraînement non représenté dans le dessin, et y est fixée pour la mesure souhaitée. Une substance fluorescente de référence, insensible aux enzymes, peut être fixée au préalable dans la phase solide dans la cellule, peut être injectée simultanément au substrat, et à un autre moment antérieur à la 'mesure, ou peut être ajoutée à la solution du substrat au préalable. La référence 14 indique le liquide contenant les substances fluorescentes dans la cellule 13. Comme on l'a décrit ci-dessus, la cellule 13 est délivrée à la position de mesure de la fluorescence. Lorsqu'une lumière d'excitation est projetée par la source lumineuse 1, la substance fluorescente qui est produite par la réaction enzymatique et est accumulée, et la substance fluorescente de référence qui n'est pas affectée par l'enzyme sont excitées pour produire de la fluorescence. On laisse cette fluorescence traverser la lentille 4, le miroir à réflexion partielle 7 et la lentille 5. Une partie de la fluorescence est réfléchie par le miroir à réflexion partielle 8, et le reste de la fluorescence passe par le miroir à réflexion partielle 8. La fluorescence réfléchie par le miroir à réflexion partielle est introduite dans le filtre 10, et la longueur d'onde prescrite de la fluorescence est projetée sur la photodiode 2. La fluorescence transmise par le miroir à réflexion partielle est introduite dans le filtre 11, et la longueur d'onde sélectionnée de la fluorescence est projetée sur la photodiode 3. Dans la constitution ci-dessus, la lentille 4 (premier élément de condensation) et la lentille 5 (second élément de condensation) sont disposées sur le trajet optique de la fluorescence entre la cellule et l'élément séparateur de lumière de sorte que l'image de la substance fluorescente est formée par la lentille 4 sur la lentille 5, et l'image de la lentille 4 est formée par la lentille 5 sur chacune de la photodiode 2 (premier élément de détection) et de la photodiode 3 (second élément de détection). Une ouverture est de préférence prévue à l'avant des photodiodes 2, 3 respectivement (non représentée) dans le dessin. Par exemple, des ouvertures circulaires de 5 mm de diamètre à l'avant des éléments de détection respectifs ayant une face de réception de la lumière carrée de 6 mm x 6 mm compensera effectivement l'influence de la paroi latérale de la cellule de réaction provoquée par l'écart de position de la cellule. L'agencement de la paire de photodiodes 2, 3 égalise sensiblement (ou rend minimale la différence) du rapport du changement de la fluorescence projetée vers tout point de chacune des photodiodes à partir de la cellule par l'intermédiaire du système de projection optique (comprenant la lentille 4, le miroir à réflexion partielle 5, la lentille 5, et le miroir à réflexion partielle 8). Ainsi, la différence dans les taux de changement du signal peut être sensiblement réduite qui peuvent être provoqués par l'écart de position de la cellule par rapport au système de mesure optique (en figure 1, l'écart de position dans le sens latéral sur le plan du papier du dessin et dans sa direction perpendiculaire). Les signaux correspondant aux intensités de la fluorescence mesurées par les photodiodes 2, 3 sont transférés à une unité à microprocesseur non représentée dans le dessin pour un traitement de correction afin de déterminer la quantité de la substance fluorescente formée par la réaction enzymatique et accumulée, ou la quantité de l'enzyme contenue dans l'immunocomplexe, et donc pour déterminer la substance physiologiquement active présente dans l'échantillon. En figure 1, la lentille 5 (second élément de condensation) est fournie avant le miroir à réflexion partielle 8 dans le trajet optique de la projection de la lumière. Au contraire, le même effet peut être obtenu en plaçant les lentilles 5 à l'arrière du miroir à réflexion partielle 8 comme cela est représenté en figure 4. En figure 4, les mêmes références qu'en figure 1 sont utilisées pour indiquer l'élément correspondant. La figure 2 est une vue en plan qui représente schématiquement un autre exemple de la constitution d'un dispositif de mesure de l'activité enzymatique (dispositif de détection de fluorescence). Dans cet exemple, les trajets optiques du système de source lumineuse et le système de mesure sont disposés de manière à être perpendiculaires l'un à l'autre. Les mêmes références qu'en figure 1 sont utilisées pour indiquer les articles correspondant à ceux de la figure 1 sans procéder à leur explication. Dans cet exemple, une longue lampe fluorescente est utilisée comme source lumineuse 101, et la lumière d'excitation est projetée par celle-ci par l'intermédiaire d'une ouverture 112, d'un filtre 109, et d'une lentille 106différente de la lentille 4 ci-dessus jusqu'à la cellule 113 (constituée d'un matériau transparent). L'image de la source lumineuse est formée par la lentille 106 presque entièrement dans la cellule, et l'image de la substance fluorescente est formée par la lentille 4 sur la lentille 5. En outre, la quasi- totalité de l'image de la lentille 4 est formée sur chacune des faces de détection de la paire de photodiodes 2, 3 par la lentille 5. Ce dispositif donne le même effet que celui de la figure 1, et un effet supplémentaire tel qu'une seule source lumineuse 10 peut être utilisée en commun pour plusieurs dispositifs de détection de fluorescence juxtaposés. En figure 2, la lentille 5 est prévue avant le miroir à réflexion partielle 8 dans le trajet optique de la lumière projetée. Au contraire, on peut obtenir le même effet en plaçant les lentilles 5 à l'arrière du miroir à réflexion partielle 8 comme représenté en figure 5. En figure 5, les mêmes références qu'en figure 2 sont utilisées pour indiquer des éléments correspondants. On décrira maintenant un premier exemple. On peint en noir la partie périphérique d'une feuille de papier fluorescent tout en maintenant non peinte la partie centrale. On place cette feuille de papier au fond d'une coupe noire de 8 mm de diamètre ayant une ouverture au sommet comme cela est représenté en figure 1, le centre de la feuille du papier fluorescent étant fixé au centre de la coupe. On mesure la fluorescence avec le dispositif de la figure 1 (en employant une longue lampe fluorescente comme source lumineuse). On effectue les mesures avec le centre de la coupe noire (centre de la feuille de papier fluorescent) pour qu'il coïncide approximativement avec le trajet optique du système de mesure de la lumière du dispositif de détection de fluorescence, et avec le centre de la coupe noire écarté dans le sens horizontal. Les changements des signaux de sortie de la photodiode 2 et de la photodiode 3 sont mesurés en changeant la position de la coupe. Les rapports des deux signaux (rapport de fluorescence à deux longueurs d'onde) sont enregistrés pour la déviation de la coupe, prenant égale à 100 la valeur du centre de la coupe noire placé suivant l'axe optique du système de mesure optique. A titre de comparaison, le changement des signaux de sortie de la photodiode 2 (fluorescence à une longueur d'onde) est enregistré pour l'écart de la coupe, prenant comme égale à 100 la valeur de la coupe noire placée au centre de l'axe optique du système de mesure optique. On indique les résultats en figure 3. Les résultats montrent que, dans l'expérience de comparaison, un écart de la coupe de 3 mm provoque une chute du signal de 70-80 %, alors que, selon la présente invention, le même écart ne provoque une chute que de 5- 12 %. Ainsi, on confirme que l'influence de l'écart de position est remarquablement diminué par la présente invention. Exemple 2. On effeçtue une expérience pour rechercher le degré de la variation des signaux de la substance fluorescente formée ci-dessus et de la substance fluorescente de référence provenant de la photodiode comme élément de détection, provoquée par l'écart de position de la cellule de réaction. La substance fluorescente, la 4-méthylumbelliférone (4MU), est constituée de phosphate de 4-méthylumbelliféryle (substrat: 4MUP) par phosphatase alcaline. Dans une,coupe colorée en noir (cellule de réaction), on place 220 gL d'une solution échantillon contenant 4000 nM de 4- méthylumbelliférone (4MU) comme substance fluorescente objet, et 0,1 mg/mL de dansylalanine (DA) comme substance fluorescente de référence. On maintient cette cellule dans la cavité d'un mécanisme de délivrance par intermittence, et on la place à la position de mesure de la lumière du système de mesure optique d'un appareil de dosage immunologique enzymatique AIA1200 (fabriqué par la société Tosoh Corporation). Pour assurer un maintien et une libération sûrs de la cellule réactionnelle, un jeu d'environ 1,5 mm est prévu dans la cavité du mécanisme de délivrance par intermittence pour la cellule de réaction, ce qui provoque un écart de position de la cellule par rapport à l'axe optique du système de mesure optique. Dans l'exemple, pour obtenir davantage de mesures, on emploie le dispositif de la figure 1 qui est capable d'exciter des substances fluorescentes dans plusieurs cellules avec une lampe (source lumineuse), et deux systèmes de mesure optique de la même constitution sont utilisés, et deux cellules réactionnelles sont délivrées au même moment. Quant aux résultats, dans les mêmes conditions à l'exception de l'écart de position, le coefficient de variation (écart standard/moyenne) de l'intensité de la fluorescence est aussi grand que 23-24 %, alors que le coefficient de variation du rapport de l'intensité de la fluorescence entre la 4MU et celui de la DA (dansylalanine) est aussi faible que 1,06-1,83 %. Par conséquent, en corrigeant l'intensité de la fluorescence de la 4MU (substance fluorescente formée) basée sur l'intensité de la fluorescence d'une substance fluorescente de référence, la DA (dansylalanine), le coefficient de variation de la donnée détectée de la 4MU (objet de la mesure) peut être remarquablement ramené à 1/10 ou moins par rapport à celui d'un procédé ou dispositif de détection classique, 1/16 dans les résultats expérimentaux ci-dessus, et une précision bien meilleure peut être obtenue dans la détection de la fluorescence. La présente invention permet d'obtenir les avantages qu'on expose ci-après. Dans le premier mode de réalisation de la présente invention, deux éléments de détection disposés de manière à être optiquement équivalents par rapport à un élément séparateur de lumière égalisent sensiblement le rapport d'intensité de la fluorescence aux deux éléments de détection, d'o il résulte que la fluorescence peut être détectée avec une précision élevée en rendant minimale l'influence de l'écart de position de la cellule de mesure dans le système de mesure optique. Dans une variante du mode de réalisation ci- dessus de la présente invention, les premier et second éléments de condensation constitués respectivement d'une lentille ou analogue sont disposés dans cet ordre sur le trajet optique d'introduction de la fluorescence émise par la substance fluorescente dans la cellule de réaction dans l'élément séparateur de lumière d'une manière telle que l'image de la substance fluorescente est formée par la première lentille sur la seconde lentille et l'imnage de la première lentille est formée par la seconde lentille sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection, d'o il résulte que l'influence de l'écart de la position de la cellule de réaction par rapport au système de mesure optique est encore réduite de manière effective. Dans le second mode de réalisation de la présente invention, et dans une de ses variantes, la quantité d'une enzyme contenue dans un immunocomplexe peut être mesurée efficacement en formant une substance fluorescente obtenue par activité enzymatique par l'emploi du dispositif de détection de fluorescence ci- dessus. Dans des variantes du second mode de réalisation, une première information optique sur l'intensité de la fluorescence provenant d'une substance fluorescente de référence ne présentant aucun changement dans le temps, et une seconde formation optique sur l'intensité de la fluorescence d'une substance fluorescente formée qui change en quantité par réaction enzymatique sont mesurées par deux éléments de détection disposés de manière à être optiquement équivalents, d'o il résulte que l'information sur la mesure optique peut être obtenue sans influence de l'écart de position de la cellule contenant une substance fluorescente. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATIONS 1 - Dispositif de détection de fluorescence comportant un élément séparateur de la lumière pour transmettre une partie de la fluorescence émise par une substance fluorescente par projection d'une lumière d'excitation et réflexion du reste de la fluorescence, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection pour mesurer la fluorescence transmise ou réfléchie par l'élément séparateur de la lumière, respectivement, à une longueur d'onde sélectionnée, caractérisé en ce que les deux éléments de détection sont disposés de manière à être optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de la lumière. 2 - Dispositif de détection de fluorescence selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un premier élément de condensation et un second élément de condensation sont disposés dans cet ordre sur le trajet optique d'introduction de la fluorescence émise par la substance fluorescente dans l'élément séparateur de la lumière de sorte que l'image de la substance fluorescente est formée par le premier élément de condensation sur le second élément de condensation, et l'image du premier élément de condensation est formée par le second élément de condensation sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection. 3 Dispositif de détection de fluorescence selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'élément séparateur de la lumière est un miroir à réflexion partielle tel qu'un miroir dichroîque et un prisme combinatoire. 4 - Dispositif de détection de fluorescence pour mesurer une substance fluorescente formée dans une cellule de réaction par une réaction provoquée par une enzyme contenue dans un immunocomplexe, ou une substance fluorescente contenue dans un complexe formé par immunoréaction, comprenant un système de source lumineuse optique pour projeter de la lumière afin d'exciter une substance fluorescente dans la cellule, un élément séparateur de la lumière pour transmettre une partie de la fluorescence émise par une substance fluorescente et réfléchir le reste de la fluorescence, et une paire d'un premier élément de détection et d'un second élément de détection pour mesurer sélectivement la fluorescence transmise ou réfléchie par l'élément séparateur de la lumière, et un premier élément de condensation et un second élément de condensation placés sur le trajet optique afin d'introduire la fluorescence de la substance fluorescente dans l'élément séparateur de la lumière, caractérisé en ce que le premier élément de condensation et le second élément de condensation sont disposés de façon que l'image de la substance fluorescente soit formée par le premier élément de condensation sur le second élément de condensation, et l'image du premier élément de condensation soit formée par le second élément de condensation sur chacun du premier élément de détection et du second élément de détection, et les deux éléments de détection sont disposés de manière à être optiquement équivalents l'un à l'autre par rapport à l'élément séparateur de la lumière. - Dispositif de détection de fluorescence selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance fluorescente formée dans une cellule de réaction par une réaction provoquée par l'enzyme contenue dans l'immunocomplexe et une substance fluorescente de référence émettant de la fluorescence sans l'action de l'enzyme dans la cellule sont mesurées optiquement, et l'un des éléments de détection mesure l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente formée à-une longueur d'onde sélectionnée de la fluorescence et l'autre des éléments de détection mesure l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence à une autre longueur d'onde sélectionnée de la fluorescence. 6 Dispositif de détection de fluorescence selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance fluorescente contenue dans un complexe formé dans une cellule de réaction par immunoréaction et une substance fluorescente de référence émettant de la fluorescence dans la cellule sont mesurées optiquement, et l'un des éléments de détection mesure l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente formée à une longueur d'onde sélectionnée de la fluorescence et l'autre des éléments de détection mesure l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence à une autre longueur d'onde sélectionnée de la fluorescence. 7 - Dispositif de détection de fluorescence selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un moyen de correction afin de corriger le résultat mesuré de l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente sur la base du résultat mesuré de l'intensité de la fluorescence de la substance fluorescente de référence. 8 - Dispositif de détection de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la longueur d'onde de la mesure est choisie par un élément de sélection de longueur d'onde prévu sur le trajet optique entre l'élément séparateur de la lumière et l'élément de détection. 9 - Dispositif de détection de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'élément séparateur de la lumière a la fonction de sélection de la longueur d'onde de la lumière transmise. - Dispositif de détection de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend un élément de condensation de la lumière afin de former une image de la source lumineuse dans la cellule.