Brevet FR2755148A1 — publié le 19980430

La présente invention concerne, de façon générale, la mise en évidence d'une réorganisation du noyau durant la suppression tumorale et les conséquences qui en découlent, tant au niveau du diagnostic que de la thérapie, notamment anticancéreuse. De plus en plus d'indices suggèrent que la régulation de l'expression des gènes, qu'il s'agisse de leur activation ou de leur mise en silence, se déroule en deux étapes dans lesquelles on observe, tout d'abord, une compartimentalisation des chromosomes dans le noyau avant la transcription. La présente invention a mis en évidence le fait que, dans des tissus cancéreux, cette compartimentalisation se faisait différemment par rapport à une cellule normale, ce qui pouvait constituer un élément de diagnostic. Cette observation a pu être réalisée notamment en étudiant le mécanisme du gène p21WAF1 et de son comportement lors de l'activation qui contribue à la suppression du processus tumorigène. Ce phénomène a pu être mis en évidence notamment grâce à un perfectionnement du procédé à la DNase I qui a permis de suivre ce processus. Le procédé à la DNase I repose sur l'observation que la chromatine active au niveau de la transcription est plus particulièrement sensible à l'action des nucléases. Elle contient en particulier des sites hypersensibles à la DNase I (il s'agit de segments d'ADN relativement courts qui sont très sensibles à un grand nombre d'agents de clivage). Ces segments d'ADN exempts de nucléosomes sont associés avec différentes fonctions de l'expression du gène. De telles régions de chromatine ouvertes" peuvent permettre la fixation de facteurs spécifiques et possèdent d'importantes fonctions de régulation, on dit alors que l'ADN marqué est l'ADN exposé. On a donc pu étudié, grâce à ce procédé, les relations possibles entre la transcription des gènes et leur hypersensitivité à la DNase lin situ, notamment comme marqueur permettant l'analyse de l'organisation du génome global dans les phénomènes cancéreux. Le procédé général qui sera appelé ci-après "procédé à la DNase" est décrit notamment dans le brevet Américain publié US-S 264 343, ce document est cité ici à titre de référence explicite et les informations qu'il contient ne seront pas reprises plus en détail. On pourra également se référer à la publication de Puck et al. (Puck T.T., Bartholdi M., Krystosek A., Johnson R. & M. Haag. Somatic Cell and Molec. Genetics 17, 489-503, 1991). Toutefois, le procédé décrit dans le brevet en question ne permet pas l'analyse de tissus fixés par la méthode formol et paraffine, c'est-à-dire des tissus obtenus par la méthode mise en oeuvre dans la plupart des laboratoires d'anatomie pathologie. En effet, le procédé décrit au brevet Américain concerne essentiellement l'analyse de systèmes en culture cellulaire. C'est donc l'un des objets de la présente invention de proposer un nouveau procédé à la DNase permettant d'effectuer des diagnostics sur des tissus fixés. Mais, de plus, la présente invention a pour objet, de façon générale, des procédés destinés à mettre en évidence l'état d'une cellule maligne dans lesquels on met en évidence la conformation précise d'au moins un gène au sein du noyau de ladite cellule par marquage dudit gène in situ et évaluation de l'écart de cette conformation par rapport à une cellule normale comme index de sa malignité. En effet, si la mise en évidence de la position de l'ADN exposé par la méthode à la DNase permet une analyse globale de l'état de malignité d'un tissu, par contre, l'étude de la conformation précise d'au moins un gène au sein d'un chromosome et la mesure de son écart à la normalité permet, non seulement un classement des différents types de cellules malignes, mais également une évaluation de leur index de malignité et bien entendu, par là même, le suivi d'un traitement thérapeutique. n convient de rappeler que, dans ce qui va suivre, on utilisera éventuellement la terminologie de maligne" ou "d'index de malignité" également pour rendre compte de phénomènes non directement liés à l'oncogénèse mais caractérisés également par une désorganisation des chromosomes au sein du noyau, par exemple la fibrose cystique. Ce second procédé repose, là encore, sur la mise en évidence du fait qu'en évaluant la conformation, c'est-à-dire à la fois la position mais également, si nécessaire, la structure d'un ou plusieurs gènes par toute technique appropriée, notamment par hybridation in situ par fluorescence par exemple (FISH), on constate que, suivant l'état de malignité de la cellule, certains gènes impliqués dans la suppression et/ou l'activation tumorale se déplacent du centre du noyau vers l'extérieur et que leur écart à la normalité constitue un bon indice de l'état de la cellule qui est appelé ciaprès "index de malignité", cet index pouvant être évalué par toute méthode appropriée entre une cellule normale et une cellule dont la malignité sera considérée comme irréversible. Ce procédé permet une classification des tumeurs en fonction de la position des différents gènes dans le noyau et même de la structure tridimensionnelle de ces gènes spécifiques dans le noyau. Dans un premier temps, il sera possible d'étudier la position des gènes dans le noyau simplement en étudiant la position des centromères de choromosome qui les portent. Ce procédé peut être mis en oeuvre avec des sondes d'hybridation de type sonde centromérique, dans ce cas la normalité correspond à une localisation périphérique des chromosomes portant les sondes centromériques et en particulier, comme cela sera développé ciaprès, ces sondes centromériques pourront correspondre aux chromosomes 13q et 16q, lesquels sont porteurs de gènes HUMSIAH et Rbr-2 colocalisés sur le chromosome 16q et le gène Rb localisé sur le chromosome 13q, ces gènes étant impliqués dans le phénomène de suppression cancéreuse. Mais, comme cela a été indiqué, la présente invention concerne également un procédé destiné à mettre en évidence l'état global de malignité des cellules d'un tissu après fixation, caractérisé en ce qu'on marque l'ADN nucléaire exposé et on marque l'ensemble de l'ADN avec un marqueur spécifique de l'ADN, ces deux marqueurs étant capables d'émettre des signaux spécifiques non contaminés. Par signaux spécifiques non contaminés" on entend qu'il est possible de visualiser séparément sans contamination notable les deux signaux correspondant aux deux marqueurs. De façon générale, l'ADN nucléaire exposé est marqué par la méthode à la DNase I, comme cela a été décrit précédemment, et l'ADN est marqué par le marqueur spécifique chromomycine A-3 (CA-3). Parmi les marqueurs de l'ADN nucléaire exposé il faut citer plus particulièrement la tétraméthyl rhodamine utilisée en combinaison avec la peroxydase. Le marquage à la peroxydase peut s'effectuer par toute méthode appropriée, notamment des couplages de type avidine ou streptovidine/biotine ou DIG/antiDIG. En effet, le substrat de la peroxydase, dénommé tyramide TRITC, permet d'amplifier le signal obtenu d'un facteur 15 et permet ainsi d'analyser une distribution fine du signal à l'intérieur du noyau. L'intérêt d'utiliser un marqueur spécifique de l'ADN est qu'il permet d'analyser de façon semi-automatique le cycle cellulaire, donc de faire une corrélation entre l'exposition du génome obtenu grâce à la méthode à la DNase I et les phases du cycle cellulaire. En outre, les deux fluorochromes ainsi utilisés ont une émission dans la même zone du sprectre lumineux, c'est-à-dire 600 nm mais leur excitation spécifique est très différente, 467 nm pour la CA-3 et 514 nm pour la TRITC, de même que les coefficients d'extinction, ce qui permet d'obtenir des signaux spécifiques sans aucune contamination entre les deux marqueurs. En outre, grâce à ces marqueurs, l'analyse peut se faire avec un seul laser à argon qui est le laser le plus répandu en microscopie. Ce procédé selon la présente invention permet d'utiliser des tissus fixés dans le formol selon des méthodes de routine et permet ainsi une analyse de tissus provenant, par exemple, d'une collection de tissus. De façon générale, les méthodes ainsi décrites permettent de diagnostiquer les états malins à partir de tissus et/ou de cultures cellulaires et permettent, grâce à la classification établie, un facteur de pronostic en pathologie diagnostique. En particulier, ils permettent de faire la différence, par exemple, entre des hyperplasies simples (sein, prostate) qui sont des pathologies bénignes, des hyperplasies atypiques (sein, prostate) à évolution variable difficile à établir et qui constituent des pathologies connues comme étant border line", mais que dans le cas présent on pourra plus facilement classifier grâce aux différents éléments de marquage qui ont été évoqués, et le carcinome in situ. Ces procédés permettent également la mise en place rapide de modèles permettant de tester des produits anticancéreux, et notamment, en étudiant leur action sur la réorganisation de certains chromosomes spécifiques, une classification plus fine de l'activité des différents agents en cause. Bien entendu, par là même, ces procédés permettront un suivi thérapeutique en cas de traitement. Enfin, la présente invention concerne un procédé de traitement de cellules présentant une désorganisation au niveau du noyau et l'application de ce procédé dans le traitement de certaines pathologies, notamment tumorales. La présente invention repose, en effet, sur la mise en évidence des propriétés de réorganisation du noyau associé au gène p21WAF1. L'association de p21WAF1 avec le signal de p53, son rôle comme inhibiteur des kinases dépendant des cyclines (CDKs) et dans le contrôle de l'endoréplication chromosomique indiquent que ce gène joue un rôle majeur dans le contrôle de la croissance cellulaire. Il a maintenant été mis en évidence que la réexpression de p21WAF1 dans un modèle conduisait à une suppression de la tumeur. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de traitement de cellules présentant une désorganisation du noyau, caractérisé en ce qu'on provoque l'expression du produit du gène p21WAF1 ou d'un produit équivalent ou bien on introduit le produit du gène ou le produit équivalent. Le gène p21WAF1 est connu et a déjà été décrit à plusieurs reprises, on pourra se reporter, pour sa caractérisation, son isolement ou certaines de ses propriétés, aux documents ci-après et à leurs références - Weinberg R.A. Science 254. 1138-1146(1991) - Telerman A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9, 8702-8706 (1993) - Amson R.B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USAX, 93. 3953-3957 (1996) - Nemani M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 9039-9042 (1996) - pl-Deiry W.S. etal. Cell 75, 817-825 (1993) - Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K. & Elledge S.J. Cell 75, 805 816 (1993) - Waga S., Hannon G.J., Beach D. & Stillman B. Nature 369. 574-578 (1994) - Yang Z.Y., Perkins N.D., Ohno T., Nabel EG. & Nabel G.J. Nature Medicine 1 1052-1056 (1995). - Xiong Y. et al., Nature 366, 701-704 (1993) - Waldman T., Lengauer C., K.W., K. & Vogelstein B. Nature fi,81 713-716 (1996). Comme cela sera explicité ci-après, la désorganisation du noyau peut être d'origine tumorale, mais il peut s'agir de désorganisations d'un autre type. Par "désorganisation du noyau" on entend un noyau dans lequel le matériel génétique, en particulier les chromosomes, occupe une place différente de celle qu'il occupe dans le noyau de la cellule à l'état normal, désorganisation qui peut, notamment, être mise en évidence par les procédés décrits précédemment. Bien que le phénomène de désorganisation du noyau ait été plus particulièrement mis en évidence dans les phénomènes tumoraux, cette désorganisation peut également intervenir dans d'autres phénomènes de types non tumoraux, comme la fibrose cystique (CFTR). Le procédé selon la présente invention permet ainsi, soit par réinduction de l'expression du gène correspondant p21WAF1, soit par utilisation d'un produit du gène ou d'un produit équivalent, c'est-à-dire ayant la même activité de réorganisation que le produit du gène p21WAF1, de réorganiser le matériel génétique du noyau. Bien entendu, l'induction de l'expression du gène peut être remplacée par un blocage de la répression du même gène. L'expression du gène p21WAF1 ou d'un produit équivalent peut être effectuée par tout procédé connu, dans les exemples, en particulier, on utilisera un vecteur d'expression d'origine virale dans lequel a été introduit le gène correspondant sous le contrôle d'un promoteur s'exprimant dans les cellules, cette introduction, que le vecteur reste non chromosomique ou qu'il s'intègre dans les chromomes, conduit à l'expression du produit de p21WAF1 et à la réduction de la malignité des cellules. Parmi les vecteurs viraux il faut citer, notamment, les vecteurs à adénovirus, à rétrovirus, à virus herpès ou même des systèmes de type synthétique ou même des ADN nus. Bien que l'on puisse exprimer le gène p21WAF1 dans son entier, certaines versions tronquées, délétées ou mutées peuvent présenter des propriétés équivalentes et donc font également partie du procédé selon la présente invention. Bien entendu, on peut utiliser les produits du gène p21WAF1 obtenus, par exemple, par culture cellulaire, de même que des cultures produisant, comme cela a été dit précédemment, des produits équivalents. Il est également possible d'envisager une réactivation in situ du promoteur de p21WAF1 naturel, ou bien le blocage des systèmes de répression de son expression in situ. De façon générale, la présente invention concerne l'utilisation du produit d'expression du gène p21WAF1 ou d'un produit équivalent ou bien d'un composé assurant l'expression dudit produit pour la réalisation d'un médicament destiné à assurer la réorganisation du noyau cellulaire des cellules dans des processus cancéreux ou de type non cancéreux avec désorganisation du noyau, ainsi qu'une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte, à titre de principe actif, le produit d'expression du gène p21WAF1 ou un produit équivalent ou bien un composé assurant l'expression dudit produit. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lectures des exemples ci-après qui seront décrit en se référant aux figures annexées sur lesquelles - la figure 1 représente l'expression différentielle d'ARNm pour différents types cellulaires transfectés ou non, - la figure 2 schématise en fonction du temps la variation des volumes tumoraux traités avec p2 lWAF1 et non traités. EXEMPLE 1 Réexpression de D21WAF1 dans un svstème modèle L'ADNc complet codant pour le gène humain p21WAF1 a été cloné dans le site EcoRI du phagemide pBK-RSV (Stratagène). Les constructions ont été transfectées en utilisant le réactant Lipofectin (Gibco BRL). 3,5x106 cellules sont incubées 8 heures avec un complexe Lipofectin (30 Fg) ADN (20 Fg). Les cellules transformées sont les cellules d'une lignée cellulaire tumorale U937 qui n'exprime pratiquement pas p21WAFl, aussi bien au niveau de l > ARNm qu'au niveau protéique. On a observé que les cellules filles US3-US4 qui en sont dérivées et qui présentent un phénomène malin supprimé expriment, par contre, de façon constitutive des niveaux très élevés de p21WAFl. C'est pourquoi, on transfecte avec les vecteurs précédents les cellules U937 et on constate que les cellules U937 transfectées de façon stable par p21WAFl montrent une disparition significative du phénotype malin. On constate d'ailleurs, figure 1, que les cellules ainsi transfectées présentent un taux très élevé d'ARNm de l'homologue humain du gène de la Drosophile "seven in absentia" (HUMSIAH). Ce gène est activé par la protéine p53 sauvage à un stade très précoce de l'apoptose et de la suppression tumorale. En outre, le gène de susceptibilité au rétinoblastome Rb et le gène codant pour la p130 en liaison avec Rb (Rbr-2) sont également très fortement activés dans les transfectants p21 des cellules U937. L'expression du gène Rb établit ses propriétés suppresseurs de tumeurs, de même que pour le gène Rbr-2 pour ses implications dans le cycle cellulaire et la localisation chromosomique de HUMSIAH. L'extraction d'ARNm et les analyses Northern blot sont effectuées en utilisant la procédure standard, la sonde p21WAFl correspond à un ADNc de 2,1 kb. Pour HUMSIAH, un fragment de 1,4 kb d'ADNc est utilisé, la sonde Rbl est HP126 (Medgene) et la sonde Rbr-2 est un fragment PCR de 393 bp obtenu avec les amorces suivantes: 5 '-TGGGACAGCTACCGCAGCATGAGCGA-3 ' et 5 S%ACAGTACAGGGCTGTCGCCGCTGTT-3" L'injection dans des souris Scid/Scid est effectuée comme cela a été décrit précédemment. La comparaison est effectuée avec des cellules transfectées par le vecteur seul (pRSV). La GAPDH est utilisée comme contrôle. Les cellules transfectées de façon stable avec pRSV-P21 présentent un phénotype malin supprimé par rapport à la lignée U937 EXEMPLE 2 Méthode à la DNase I - Influence de DZ1WAF1 sur la réorganisation du noyau Cet exemple a pour objet d'étudier le rôle de p2 lWAFl dans une possible réorganisation du noyau. Le procédé utilisé pour cette mise en évidence du fait que la position des chromosomes dans le noyau pourrait avoir une influence sur le phénotype cellulaire, est le procédé dit à la DNase I qui permet de visualiser l'ADN exposé, c'est-à-dire des portions de chromosome qui sont plus sensibles à la DNase I dans certaines conditions, ce qui permet de les marquer. Pour ce faire, on a repris la méthode à la DNase I telle que décrite dans le brevet US 5 264 343 mais de façon à pouvoir l'appliquer à des tissus. Les tissus sont fixés dans un mélange à 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes, déshydratées et stockées à -80 C. Le marquage par "nick-translation" est effectué en utilisant un tampon de anick-translation" (NTB) et une solution 10x (100 ml). NTB comprend 50 mM Tris HCL pH 8, 5 mMgCl2, 10 mM ss mercaptoéthanol et 50 ng/ml de BSA. La solution 10x (100 ml) contient 50 ml de Tris HCl pH 8 (1 M), 3,3 ml de MgCl2 (1,5 M), 700 ml de frmercaptoéthanol (14,2 M) et 1,66 cru de BSA (à 3%). On traite les tissus avec 100 y1 de NTB contenant 30 U de DNase I pour chaque coupe. On incube pendant 3 minutes à la température ambiante, on bloque avec L'ENTA 20 mM, pH 8, pendant 3 minutes puis on lave 3 fois avec NTB. On utilise ensuite 100 s 1 de NTB avec 40 U de DNA polymérase I et 100 FM de dNTP digoxigénine (10% de la solution 10x pour chaque coupe). On incube pendant 6 minutes à la température ambiante et on bloque avec l'EDTA comme précédemment, on lave 3 fois avec NTB. Le marquage est effectué après saturation avec 3% de BSA, révélation avec des anticorps anti-DIG marqués à la peroxydase, après lavage 3 fois 3 mintues avec PBS, on utilise comme substrat la thyramide TRITC puis on lave 3 fois pendant 3 minutes avec PBS. Les plaques sont ensuite contrecolorées avec la chromomycine 3-A. L'analyse est effectuée par microscopie laser cofocale (MRC 600 Bio-Rad) en mode fluorescent. Les cellules cancéreuses U937 parentales ou les mêmes cellules transfectées avec le vecteur de contrôle présentent une apparence diffuse telle qu'elle est observée dans les biopsies de carcinomes mammaires. Les cellules U937 transfectées avec p21WAFl présentent un changement radical dans l'exposition du génome à la DNase I en présentant une apparence similaire à celle des cellules US3-US4 ayant le phénotype supprimé, de même qu'elles présentent une apparence correspondant à celle des biopsies de seins normaux, c'est-à-dire un marquage selon une couronne périphérique. EXEMPLE 3 Marquage in situ On effectue une hybridation de l'ADN in situ avec une sonde centromérique 16 alphoïde, comme cela est décrit précédemment (Klinger K. et al. Am. J. Hum. Genet. 51, 55-65 (1992)). HUMSIAH et Rbr-2 étant colocalisés sur le chromosome 1 6q tandis que Rb est localisé sur le chromosome 13q, on utilise des sondes correspondantes. En utilisant la fluorescence par hybridation in situ (FISH), combinée avec l'optomicroscopie digitale, avec ces sondes centromériques alphoïdes correspondant au chromosome 16, on peut montrer, comme cela est représenté aux figures 3 a et b, que les cellules U937 présentent un signal d'hybridation près du centre du noyau. Au contraire, les cellules U937 transfectées par p21WAFl ou les cellules US3-US4 dont le phénotype tumoral a été supprimé présentent un signal qui est détecté dans la région périphérique du noyau. Du point de vue physiologique, ces observations confirment l'évidence d'une organisation territoriale chromosomique à l'interphase. La conformation topologique précise du gène dans le noyau présente une répercussion fonctionnelle évidente. En particulier, cette réorganisation du noyau pourrait être responsable de l'activation des gènes impliqués dans la suppression des tumeurs, lesquels sont silencieux dans les processus tumoraux. REVENDICATIONS 1) Procédé destiné à mettre en évidence l'état d'une cellule maligne, dans lequel on met en évidence la conformation précise d'au moins un gène au sein du noyau de ladite cellule par marquage dudit gène in situ et évaluation de l'écart de ladite conformation par rapport à une cellule normale comme index de sa malignité. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la conformation dudit gène est évaluée par l'hybridation in situ par fluorescence. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les sondes d'hybridation sont des sondes centromériques. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la normalité correspond à une localisation périphérique du chromosome portant ledit gène. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les chromosomes sont les chromosomes 13q et/ou 16q. 6) Procédé destiné à mettre en évidence l'état de malignité des cellules d'un tissu après fixation, caractérisé en ce qu'on marque l'ADN nucléaire exposé et on marque l'ensemble de l > ADN avec un marqueur spécifique de l'ADN, les deux marqueurs étant capables d'émettre des signaux spécifiques non contaminés. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ADN nucléaire exposé est marqué par la méthode à la DNase I et l'ADN est marqué par la chromomycine A-3. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'ADN nucléaire exposé est marqué par la tétraméthyl rhodamine pour révéler le nucléotide exposé. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la molécule rapporteur de la méthode à la DNase I est la peroxydase couplée à l'avidine ou la streptovidine ou à un anticorps anti-DIG. 10) Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'on évalue la position de l'ADN nucléaire exposé par rapport à la phase du cycle cellulaire mise en évidence par le marqueur spécifique de l'ADN comme index de l'état de malignité des cellules de tissus. 11) Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que les tissus proviennent d'une collection de tissus. 12) Procédé de traitement de cellules présentant une désorganisation du noyau, caractérisé en ce qu'on provoque l'expression du produit du gène p21WAFl ou d'un produit équivalent, ou bien on introduit le produit du gène ou le produit équivalent. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la désorganisation du noyau est due à un phénomène tumoral. 14) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la désorganisation du noyau est due à un phénomène non tumoral. 15) Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'expression à p21WAFl est obtenue par induction de l'expression du gène. 16) Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'expression à p21WAFl est obtenue, par blocage de la répression du gène ou d'un produit d'expression. 17) Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'expression à p21WAFl est obtenue par introduction d'une séquence codant pour le produit d'expression ou son équivalent. 18) Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'expression à p21WAFl est obtenue par introduction du produit du gène ou d'un produit équivalent. 19) Utilisation du produit d'expression du gène p21WAFl ou d'un produit équivalent ou bien d'un composé assurant l'expression dudit produit pour la réalisation d'un médicament destiné à assurer la réorganisation du noyau cellulaire des cellules dans des processus cancéreux ou de type non cancéreux avec désorganisation du noyau. 20) Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte, à titre de principe actif, le produit d'expression du gène p21WAFl ou un produit équivalent ou bien un composé assurant l'expression dudit produit.