Brevet FR2751987A1 — publié le 19980206

La présente invention concerne les phytases de plantes, ainsi que leurs applications biotechnologiques. La présente invention concerne également un ou plusieurs fragment(s) d'acide nucléique codant pour une phytase de céréales, plus particulièrement pour la phytase du maïs et un ou plusieurs fragment(s) caractérisé(s) en ce qu'il s'agit de fragments d'ADNc ou d'ADN génomique. En outre, la présente invention concerne un fragment d'acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquences (IDS) n" 1 codant pour une activité phytase ou tout ou partie des séquences génomiques Phyt I ou Phyt II telles que définies ci-après. Enfin, la présente invention concerne un fragment caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nucléotide n" 32 à 1192 de l'IDS n" 1. La plus grande partie du phosphate présent dans les plantes, notamment dans les semences, est sous la forme de phytine, sel complexe de myo-inositol-acide hexaphosphorique (acide phytique). La phytine constitue une réserve de phosphore, d'hydrates de carbone et de divers cations. Ainsi dans les grains de maïs, le phosphore du phytate représente jusqu'a 88 % du phosphore total (O'Dell et al., 1972). La mobilisation de la phytine est due aux phytases, type spécial de phosphatases, capables d'hydrolyser le phosphate à partir de l'acide phytique ainsi qu'à partir d'autres substrats phosphorylés (Gibson et Ullah, 1990). On a signalé des activités de phytase dans une large gamme de semences. Généralement, on peut détecter de très faibles quantités d'activité endogène dans les semences non germées, sauf pour le blé, le seigle et leur hybride triticale (Pointillard, 1994). Une forte augmentation d'activité concomitante avec une diminution de la phytine apparaît au début de la germination. On ne dispose que de peu d'informations sur les mécanismes qui régulent le niveau d'activité de la phytase dans les semences. L'intérêt qui existe pour la phytase vient de l'industrie alimentaire. La phytine, ou acide phytique, provenant des farines de semences sèches, n'est pas digérée par les animaux monogastriques en l'absence de phytase exogène et est donc excrétée telle quelle, contribuant ainsi à la pollution par le phosphate des zones d'élevages intensifs. De plus, elle est considérée comme un facteur antinutritionnel car elle chélate les minéraux essentiels tels que Ca, Fe et Zn lesquels, de ce fait, ne sont pas absorbés par les animaux monograstriques (Graf, 1986). Des recherches poussées ont été entreprises afin de permettre la digestion du phytate par addition de phytases exogènes à de telles farines. Les phytases végétales sont normalement produites en quantités insuffisantes pour leur utilisation dans les processus industriels. On peut obtenir les phytases extracellulaires produites par le champignon Aspergillus niger en grandes quantités et on a trouvé qu'elles conviennent bien pour une utilisation en tant qu'additif alimentaire pour les animaux (Nair et Duvnjak, 1990; Simons et al., 1990). On a séquencé (van Hartingsveldt et al., 1993 ; Ehrlich et al., 1993) des ADNc codant pour deux phytases différentes, Phy A et Phy B d'Aspergillus niger. Récemment, on a obtenu des plants de tabac transgéniques exprimant de façon ectopique la phytase fongique Phy A (Pen et al., 1993 ; Verwoerd et ai., 1995). Avant la présente invention, on n'avait pas pu obtenir d'ADNc codant pour une phytase végétale et les mécanismes moléculaires qui commandent la régulation de l'expression de la phytase au cours de la formation des semences ou de la germination n'étaient pas connus. Etant donné l'importance de l'acide phytique comme forme de stockage du phosphate dans les grains de maïs, le clonage d'un gène de phytase végétal et une meilleure connaissance de ces mécanismes étaient donc très recherchés. Au cours de la germination, les plants de semis de maïs expriment une phytase capable d'hydrolyser la grande quantité de phytine emmagasinée dans le grain sec. Des études antérieures ont permis de purifier et de caractériser cette enzyme (Labouré et al., Biochem. J., 1993, 295, 413 419). Dans ce travail antérieur (Labouré et al., 1993), on a décrit la caractérisation d'une phytase qui s'accumule dans les jeunes plants de maïs au cours des premiers jours de la germination. La protéine native apparaît sous la forme d'un homodimère constitué de deux sous-unités à 38kDa. Cette enzyme présente la plupart des caractéristiques enzymatiques d'autres phytases acides végétales. Selon la présente invention on a isolé et caractérisé un ADNc codant pour la sous-unité de cette phytase de semence de maïs. Ceci constitue la première séquence nucléotidique obtenue pour une phytase végétale. Selon la présente invention, on a utilisé un polysérum de lapin dirigé contre la phytase de maïs purifiée jusqu'à homogénéisation pour cribler une bibliothèque d'expression d'ADNc de jeunes plants de maïs. On a pu isoler plusieurs clones positifs contenant un insert d'environ 1400 pb. On a établi la séquence nucléotidique de l'insert d'un de ces clones. Cet ADNc, appelé phy S11, contient 1335 pb avec un cadre ouvert de lecture pour 387 aa. On a établi les résidus N-terminaux (23 aa) de la phytase purifiée. On trouve ces résidus dans les positions 19 - 41 de la séquence d'aa pour laquelle code phy S11. Ceci confirme que cet ADNc code pour la phytase du maïs. La présente invention fournit donc la première séquence codant pour une phytase végétale. Ehrlich et Montalbano (1992) et Gellatly et Lefebvre (1990) ont mentionné des essais de clonage et séquençage d'ADNc de phytase respectivement provenant de semences de soja et de tubercules de pommes de terre, mais les séquences correspondantes n'ont jamais été publiées, de sorte que la comparaison de l'ADNc du maïs avec d'autres ADNc de phytase végétale n'est pas possible. Les seules séquences nucléotidiques disponibles correspondent aux phytases provenant d'Aspergillus niger (van Hartingsveldt et al., 1993 Ehrlich et al., 1993). Les phytases de microorganismes appartiennent aux phytases de classe 3 qui commencent par retirer l'orthophosphate de la position 3 de l'acide phytique, tandis que les phytases végétales appartiennent aux phytases de classe 6 qui catalysent l'enlèvement de l'orthophosphate de la position 6. Des comparaisons antérieures entre les phytases purifiées d'Aspergillus flcuum et de soja dues à Gibson et Ullah (1990) montrent que peu de caractéristiques physiques au niveau protéique (taille moléculaire, composition en acides aminés, séquences d'aa partielles) semblent être communes aux deux enzymes. En accord avec ces comptesrendus antérieurs, la comparaison entre la séquence d'aa totale pour laquelle code l'ADNc phy S11 et celle de phy A d'Aspergillus niger ne montre pas beaucoup de similitudes significatives. Cependant, on trouve un recouvrement de 33 aa avec une homologie de 84 %. Cette région à 33 aa des deux phytases d'Aspergillus Phy A et Phy B contient le motif consensus RHGxRxP trouvé dans plusieurs phosphatases acides et dont on pense qu'il s'agit de la région accepteur de phosphate (Piddington et al., 1993). Les deux Arg et les résidus His du consensus sont conservés dans la séquence du maïs. Une mutagénèse dirigée sur la phosphatase acide périplasmique de E. coli (EcAP) a montré que le remplacement de ces résidus Arg et His dans le motif conservé aboutit à une forte réduction de l'activité enzymatique (Ostanin et al., 1992). Par conséquent, la présence de ces résidus dans la séquence de la phytase du maïs peut être en relation avec l'activité de phosphatase. On remarque que le motif consensus est généralement localisé à l'extrémité N-terminale des phosphatases acides de microorganisme (position 81 - 87 dans Phy A d'Aspergillus), tandis qu'il est situé entre les positions 204 et 210 dans la séquence du maïs. Ces comparaisons confirment que les phytases végétales sont très différentes des phytases d'Aspergillus bien caractérisées. En outre: a) les deux phytases d'Aspergillus sont excrétées dans le milieu extérieur lors d'une carence en phosphate. Elles possèdent un peptide signal et sont fortement glycosylées. Or, les phytases de plantes sont destinées à hydrolyser la phytine contenue dans la plante. L'analyse de la séquence de la phytase de maïs ne révèle pas de peptide signal évident. Aucun résidu glycosylé n'a été détecté par réaction avec le réactif de Schiff ni avec la phytase de maïs, ni avec la phytase de soja purifiée antérieurement par Gibson et Ullah (1990). Aucun motif consensus d'attachement de résidu glycosylé n'est observé sur la séquence protéique de la phytase de maïs; b) le profil d'hydropathie de Phy S11 révèle la présence dans la région COOH-terminale d'une séquence de 65 aa fortement hydrophobe. Cette séquence peut servir d'ancrage de l'enzyme aux corps protéiques, organites pourvus d'une membrane et dans lesquels la phytine est localisée sous forme de globoïdes. Des expériences déjà anciennes, réalisées sur le pollen (Baldi et al., 1988, Plant Science, 56, 137-147), ont montré que les phytases acides étaient attachées à la membrane des corps protéiques dont elles constituent "un composant externe". L'analyse de la séquence protéique de Phy S11 indique donc que cette phytase de plante est très différente des phytases de champignons seules caractérisées jusqu'ici, et vraisemblablement mieux adaptée à digérer le phytate endogène des graines. La présente invention a donc pour objet les fragments d'acide nucléique isolé codant pour un enzyme phytase de plante. Plus particulièrement, l'enzyme est la phytase de céréale, telle que, maïs, blé, orge, seigle, triticale. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique isolé codant pour une activité phytase, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence de nucléotides telle que montrée dans l'identificateur de séquence n" 1, ou tout ou partie d'une séquence homologue à celle montrée dans l'identificateur de séquence n" 1, ou tout ou partie d'une séquence complémentaire de ladite séquence de l'identificateur de séquence n" 1 ou d'une séquence homologue. Par "fragment d'acide nucléique", on entend ici une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN. Ces termes sont définis dans tous les ouvrages de base de biologie moléculaire. Préférentiellement, un fragment d'acide nucléique selon l'invention est un fragment d'ADN double brin. Le terme "partie" désigne un fragment comportant une portion d'au moins 500 de préférence au moins 1000 nucléotides identiques à une portion d'une longueur équivalente de la séquence nucléotidique indiquée dans l'identificateur de séquence (IDS n l) ou de son complémentaire. Le terme "homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant une ou plusieurs modification(s) de séquence par rapport à tout ou partie de la séquence montrée dans L'IDES n"l, et codant pour un enzyme ayant l'activité mentionnée ci-dessus. Ces modifications peuvent être obtenues par mutation, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotide(s) par rapport à la séquence native. Elles peuvent être introduites notamment pour améliorer l'activité de l'enzyme. Dans ce contexte, on préfèrera un degré d'homologie d'au moins 70 % par rapport à la séquence native, avantageusement d'au moins 80 %, et de préférence d'au moins 90 %. Par exemple, l'invention concerne deux phytases aux séquences d'acides aminés différentes, notamment dans la partie N-terminale. L'homme du métier connaît les techniques permettant d'évaluer si l'homologue généré présente une activité modifiée par production de l'enzyme mutagénisée dans un hôte hétérologue. La séquence de L'IDES n 1 est une séquence d'ADNc, c'est-à-dire dépourvue des introns de la phytase de maïs. De préférence, le fragment selon l'invention comprend la séquence complète de 1335 nucléotides telle que montrée sur L'IDES n" 1, une séquence homologue, une séquence complémentaire, ou une séquence homologue à ladite séquence complémentaire. Le fragment comporte en particulier la séquence leader allant du nucléotide n" 1 à 31 de l'IDS n" 1, ainsi que la séquence de terminaison allant du nucléotide 1 193 à 1335 de L'IDES n" 1. En outre, de façon classique, il peut comporter ladite séquence de terminaison augmentée d'une queue poly A à son extrémité 3'. Selon une variante encore préférée, le fragment selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nucléotide n" 32 à 1192 de l'IDS n" 1, ou son complémentaire, ou d'une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence homologue. L'invention inclut également toute séquence capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec l'une des susdites séquences. A partir d'un fragment originaire d'une plante particulière, on peut ainsi isoler des fragments homologues d'autres plantes. D'autre part, à l'aide de l'ADNc, on a isolé les ADN génomiques correspondants. La présente invention a donc également pour objet l'ADN génomique codant pour la phytase de la plante. La présente invention a également pour objet un fragment constitué par de l'ADNc et comportant en outre une partie seulement des fragments introniques de l'ADN génomique. Les introns permettent dans certains cas d'améliorer la structure conformationnelle de la protéine et ses taux d'expression. Il doit être bien entendu que l'invention a également pour objet toute séquence d'ADN équivalente, c'est-à-dire qui diffère des séquences mentionnées ci-dessus seulement par une ou plusieurs mutations neutres, c'est-à-dire dont le changement ou la substitution de nucléotides en cause n'affecte pas la séquence primaire de la protéine résultante. De préférence, le fragment d'ADN selon l'invention sera associé à une séquence régulatrice appropriée pour sa transcription, sa traduction et son adressage tels que des promoteurs et ses éventuels enhancers, et des terminateurs, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces différents signaux de régulation sont bien connus de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation, le fragment selon l'invention comporte le promoteur de l'ADN génomique de la plante. La présente invention a donc également pour objet le promoteur d'un gène de phytase de plante. Avantageusement, ce promoteur contient tout ou partie du fragment allant du nucléotide n0 1 au nucléotide n" 2096 de la séquence telle que représentée sur la Figure 4 décrite ci-après, ou tout ou partie du fragment allant du nucléotide n" 1 au nucléotide n" 1328 de la séquence telle que représentée sur la Figure 5 décrite ci-après. La présente invention a aussi pour objet une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comporte un fragment d'acide nucléique selon la présente invention, placé sous le contrôle de séquences régulatrices capables de commander l'expression de ladite phytase. Avantageusement, ces séquences régulatrices comprennent un promoteur tel que défini plus haut. Dans une variante de réalisation lesdites séquences régulatrices sont capables de commander l'expression spécifiquement dans un type particulier de tissu, notamment dans l'albumen. Comme exemple de signaux d'adressage chloroplastiques, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la petite sous-unité de la ribulose 1,5-biphosphate carboxylase de Pisurn sativum. Comme signaux d'adressage mitochondrial, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la sous-unité bêta de l'ATP-aseFl mitochondriale de Nicotiana plumbaginifolia Ces peptides transits, ainsi que la méthionine N-terminale, sont normalement clivés dans les chloroplastes ou les mitochondries. L'expression des protéines dans les plastes a donc également l'avantage de produire une molécule dépourvue de la méthionine N-terminale comme la molécule naturelle. Selon une autre variante, les séquences d'adressage peuvent être des séquences codant pour un peptide signal N-terminal ("prépeptide"), éventuellement en association à un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique (signal du type KDEL), ou un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". La présence du peptide signal N-terminal ou prépeptide permet la pénétration de la protéine naissante dans le réticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de maturations post-traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les Nglycosylations, si la protéine en question présente des sites de Nglycosylation, et la formation des ponts disulfures. Parmi ces différents signaux, le prépeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le réticulum endoplasmique, est très utile. I1 s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés et étant d'origine animale ou végétale. De préférence, il s'agit d'un prépeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de l'a-mating factor, de la protéine de pathogénèse 1 ou 2. Normalement, le peptide signal est clivé par une signal peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du polypeptide naissant dans la lumière du RER (Reticulum Endoplasmique Granuleux). La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale. Pour obtenir la sécrétion, on peut par exemple utiliser le peptide signal de la sporamine A des racines tubérisées de la patate douce. Les séquences d'adressage peuvent, outre le prépeptide, aussi comporter un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, SEKDEL ou HEKDEL Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et subsistent sur la protéine mature. La présence de ce signal a tendance à augmenter les rendements en protéines recombinantes. Les signaux d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, après passage dans le RER, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps protéiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines. L'adressage de la protéine vers les corps protéiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40 % des protéines par rapport à la matière sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps protéiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté. Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant particulièrement préférés, par exemple la pro-sporamine. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTFP), ou C-terminal (CTTP). Dans la mesure où les propeptides sont normalement clivés dès l'entrée de la protéine dans la vacuole, il n'est pas présent dans la protéine mature. L'utilisation du peptide signal ou prépeptide, peut conduire à la glycosylation de la protéine. En l'absence de tout signal d'adressage, la protéine est exprimée dans le cytoplasme. Comme vecteur de clonage ou d'expression comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus etc.... On utilisera de préférence toutefois, des plasmides. La présente invention a donc aussi pour objet un procédé pour accroître la teneur en phytase dans une plante, caractérisé en ce qu'on induit une surexpression de l'enzyme phytase dans la plante à l'aide d'une cassette d'expression selon la présente invention. En d'autres termes, on induit une surexpression de l'activité phytase dans la plante. On entend ici par "phytase" une définition fonctionnelle qui inclut toute phytase de plante capable de fonctionner comme un marqueur de sélection en conférant l'activité phytase à une cellule hôte déficiente en phytase. Cette définition inclut aussi toute phytase de plante capable de fonctionner dans une plante donnée pour accroître l'activité phytase de ladite plante. Ce terme inclut donc non seulement l'enzyme spécifique de la plante spécifique à traiter, mais tout autre enzyme phytase d'autres plantes si cette phytase est capable de fonctionner dans les plantes à traiter. On entend ici par surexpression" aussi bien une augmentation du taux d'activité de phytase par rapport au taux exprimé dans une plante normale, qu'une dérégulation de l'expression conduisant à l'expression de l'activité phytase dans un tissu ou un compartiment et/ou à un stade de développement où celle-ci n'est normalement pas exprimée. L'obtention de plantes exprimant de façon dérégulée la phytase, est obtenue en introduisant par les méthodes du génie génétique, un gène de phytase de plante éventuellement modifié de façon appropriée à obtenir la modification de l'expression, et de préférence la surexpression de la phytase dans la plante à améliorer. Ces plantes pourront être modifiées par les méthodes du génie génétique décrites dans la littérature, par transformation de cellules suivie de leur régénération, ou par transformation de tissus ou de gamêtes. Dans un mode préféré de réalisation du procédé de l'invention, on introduit dans le génome de la plante une séquence codante fonctionnelle dans des conditions permettant son expression. On entend par "séquence codante fonctionnelle" une séquence d'ADN codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus comme "phytase", ladite séquence peut donc être plus courte ou plus longue que la séquence codante totale du gène complet de l'enzyme. En particulier, la "séquence codante fonctionnelle" inclura la séquence codante pour un peptide signal en 5' et/ou en 3'. Le gène étranger peut être un gène hétérologue, c'est-à-dire qui provient d'une plante différente que la cellule hôte, le gène codant pour un polypeptide ordinairement non produit par la plante dans le génome de laquelle il est introduit. Le gène étranger introduit dans le génome de la plante peut aussi être un gène homologue au gène endogène, c'est-à-dire dont l'expression produit la phytase ordinairement produite par la plante. Par "conditions permettant son expression", on entend que le gène codant la phytase est placé sous le contrôle d'éléments assurant son expression. En particulier, la séquence d'ADN codant pour la phytase est associée à une séquence régulatrice appropriée pour sa transcription, sa traduction et son adressage tels que des promoteurs et ses éventuels enhancers, et des terminateurs, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces différents signaux de régulation sont bien connus de l'homme du métier. Ledit gène fonctionnel codant pour la phytase peut être introduit dans des cellules de plantes selon des techniques connues. On pourra utiliser par exemple dans ce cas, mais non obligatoirement, le système de régulation du gène de la phytase. On peut citer, tout d'abord, les méthodes de transfert direct de gènes telles que la micro-injection directe dans des cellules d'embryon de la plante (Neuhaus et Coll., 1987) ou l'électroporation (Chupeau et Coll., 1988) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (Schocher et Coll., 1986) ou le bombardement par canon de particules (Mc Cabe et Coll., 1988). On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et Van Montagu, 1983) ou d'Agrobacterium rhizogenes notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation (Chilton et Coll., 1982). La souche bactérienne comportera le gène codant pour la phytase sous le contrôle d'éléments assurant l'expression dudit gène. La souche pourra être transformée par un vecteur dans lequel est inséré le gène codant la phytase sous le contrôle d'éléments assurant l'expression dudit gène. Ce gène sera inséré par exemple dans un vecteur binaire tel que pBIN19 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et Klee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides Ti et Ri. Il pourra aussi être utilement introduit par recombinaison homologue dans un plasmide Ti ou Ri désarmé, tel que pGV 3850 (Zambryski et Coll., 1983) avant la transformation de la plante. I1 a été montré récemment que des plantes monocotylédones telles que le riz et le maïs pouvaient être avantageusement transformées par Agrobacterium tumefaciens, riz : Hiei et al. 1994, The Plant Journal 6 : 271282 ; maïs : Ishida et al. 1996, Nature biotechnology 14: 745-750). Par exemple, on transformera les espèces monocotylédones, notamment le riz et le maïs, en utilisant Agrobacterium tumefaciens. A titre de vecteur d'expression comprenant le gène fonctionnel de la phytase selon l'invention, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus, etc.... On utilisera de préférence toutefois des plasmides. Lorsque l'on introduit un gène fonctionnel codant pour une phytase selon l'invention dans le génome de la plante, ce sera de préférence sous le contrôle d'un promoteur hétérologue. Enfin, la présente invention a également pour objet des plantes ou organes végétaux à teneur en phytase accrue pouvant être obtenus par le procédé selon l'invention. La teneur en phytase peut être accrue globalement ou seulement localement, c'est-à-dire dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire particulier. On cite comme plantes transgéniques selon l'invention les céréales, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le seigle et le pois. La présente invention a plus particulièrement pour objet une plante transgénique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle produit des semences transgéniques exprimant une quantité accrue de phytases dans ses semences. La présente invention a également pour objet des semences séchées de plantes transgéniques selon l'invention et notamment des semences comportant une teneur en phytase accrue obtenue par expression spécifique du fragment d'ADN selon la présente invention, dans la semence. La présente invention a en effet également pour objet un hôte végétal consistant en une plante ou organe végétal transgénique dans lequel la phytase de plante peut être exprimée dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire où cet enzyme n'est pas produite naturellement, caractérisé en ce qu'on a introduit une cassette d'expression selon l'invention comportant des séquences régulatrices qui induisent une expression spécifique dans ladite partie de la plante ou ledit compartiment cellulaire. La plante ou l'organe végétal en question est avantageusement une céréale et plus avantageusement encore du maïs ou leurs organes correspondants. La présente invention a également pour objet une farine obtenue à partir d'une semence selon l'invention. Enfin, la présente invention a pour objet une composition alimentaire comprenant des semences, une farine de semence ou une phytase selon la présente invention. De plus, la plante ou une partie de celle-ci peut être utilisée dans la ration alimentaire d'animaux monogastriques, d'une part pour réduire le taux de phytate dans le fumier et d'autre part pour améliorer la digestibilité du phytate. Par exemple, la phytase exprimée agira sur la plante au cours de son développement. La phytase sera également utilisée dans les procédés de préparation alimentaire ou dans les procédés d'extraction de l'amidon (procédé de trempage). L'activité phytasique générée est également utilisable pour valoriser les eaux de trempage récupérées. En effet, la disponibilité accrue du phosphore rend ces eaux très utiles comme additifs pour milieux de culture ou supports de fermentation. En outre, l'activité phytasique générée permet une meilleure récupération de l'innositol et de ses dérivés à partir des eaux de trempage. Si on utilise la phytase recombinante et non la plante elle-même, l'activité de la phytase s'exerce sur des phytates d'une autre origine végétale présentes dans la ration. Les fragments d'AD a) transformation d'un hôte eucaryote ou procaryote, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme avec une cassette d'expression selon la présente invention, comportant des séquences régulatrices capables de commander l'expression d'une quantité accrue de phytase dans l'hôte végétal ou le microorganisme respectivement b) culture du microorganisme transformé ou croissance de la plante transformée, et c) extraction de la phytase de la culture de microorganismes ou des tissus végétaux transgéniques. La présente invention a également pour objet une phytase recombinante obtenue par le procédé selon l'invention, préférentiellement sous forme d'un dimère ou d'un hétérodimère, et des anticorps dirigés contre la phytase de la plante selon l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la phytase pour augmenter l'extractabilité des amidons des grains où elle s'exprime. Le phytate fait précipiter les protéines avec l'amidon de sorte que si l'on réduit le taux de phytate, l'extraction de l'amidon s'en trouve facilitée. L'ajout d'une phytase aux grains de plantes à partir desquels on souhaite extraire l'amidon permet de pallier la précipitation des protéines par les phytates. Plus précisément, la présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une phytase et/ou de semences contenant une phytase pour extraire l'amidon à partir de grains de plantes. Enfin, on peut utiliser les fragments d'ADN selon l'invention comme marqueur d'un phénotype lié à l'expression de la phytase. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux Figures 1 à 6. La Figure 1 représente la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés déduite de l'ADNc phy S11. Les acides aminés soulignés correspondent à deux résidus Nterminaux obtenus à partir de la phytase de maïs purifiée. La séquence d'aa qui présente une homologie avec 33 aa de la phytase d'Aspergillus Phy A (van Hartingsveldt et al., 1993) est soulignée en pointillé. Les sites NcoI (CCATGG) et Asel (ATTAAT) utilisés pour le clonage dans le vecteur d'expression pET 14 (b) sont encadrés. La Figure 2 représente la comparaison des régions de recouvrement de 33 aa de la séquence protéique déduite de l'ADNc phy S11 et des séquences de phytases Phy A et Phy B d'Aspergillus. Les ombres foncées indiquent les acides aminés conservés et les ombres claires correspondent à des acides aminés similaires. La séquence consensus RHGxRxP dont on suppose qu'elle correspond au motif accepteur de phosphate est soulignée. On procède à la comparaison en utilisant le programme FastA de GCG. La Figure 3 représente les cartes de restriction déduites des clones génomiques isolés de la banque EMBL3. Légende: El : EcoRI; HIII: Hind III; SI: Sali séquence génomique adjacente région c. chimérique La Figure 4 représente la séquence nucléotidique du clone de classe I (P19.14 fragment Hindlll / Sal I de 4,7 Kb) codant pour une protéine phytase de classe I correspondant au gène PHYT I. Légende : les lettres minuscules correspondent à la séquence non codante, les lettres majuscules correspondent à la séquence transcrite, la séquence protéique déduite est indiquée en utilisant le code à trois lettres de la représentation des acides aminés. La Figure 5 représente la séquence nucléotidique du clone de classe II (P23.7 fragment HindIII de 3 Kb) codant pour une protéine phytase de classe II correspondant au gène PHYT II. Légende : les lettres minuscules correspondent à la séquence non codante, les lettres majuscules correspondent à la séquence transcrite, la séquence protéique déduite est indiquée en utilisant le code à trois lettres de la représentation des acides aminés. (+ 1161): départ du produit Race n 92 (+ 1175): départ de l'EST (+ 1314): départ du produit Race n 93 (+ 1351): départ du produit Race n" 87 (+ 1548): départ du produit Race n" 54. La Figure 6 représente la comparaison de séquences protéiques des phytases de l'ADNc phy S11, de classe I et de classe Il. L'alignement a été réalisé avec le programme "Clustal V multiple alignement". La séquence protéique est indiquée en utilisant le code à une lettre de la représentation des acides aminés. I. MATERIELS ET PROCEDES I.1) Conditions de germination des semences de maïs On utilise successivement deux lignées homozygotes de Zea mays pour ce travail. On construit la bibliothèque d'ADNc avec des ARN extraits à partir de Zea mays c.v. M017 (Maisadour). L'ARN utilisé pour des analyses de Northern blot est extrait de Zea mays c.v. AM0406 (Maisadour). On imbibe des semences de maïs pendant douze heures dans de l'eau distillée aérée à la température ambiante puis on les transfère dans du sable humide à 26"C, avec une photo-période de huit heures (50 iÈ/s par m2). Des germinations de grains de maïs de la lignée B73 sont réalisées sur vermiculite à l'obscurité à 28"C. La lignée B73 a été choisie pour l'analyse des départs de transcription car les séquences génomiques ont été déterminées à partir de ce matériel génétique. Ainsi, les différences éventuelles notées entre les séquences des transcrits et celles de fragments génomiques ne pourront pas être attribuées à du polymorphisme intervariétal. I.2) Construction et criblage d'une bibliothèque d'ADNc I.2a) ADN complémentaire On purifie l'ARN total à partir d'embryons congelés (scutellum et axe embryonnaire) de jeunes plants de maïs âgés de trois à quatre jours, en utilisant du chlorhydrate de guanidine (Logemann et al., 1987). On sélectionne la fraction poly(A)+ sur des colonnes d'oligo dT (Pharmacia). On a synthétisé l'ADNc à deux brins en utilisant un nécessaire d'ADNc (Promega) et un adaptateur d'amorce d'oligo (dT)-Notl. Après ligature des adaptateurs Eco RI (Pharmacia), on digère l'ADNc avec Notl et on le clone de façon directionnelle dans kgtll (Promega). On obtient environ 1 x 106 recombinants indépendants après encapsidation (Stratagène) et infection d'E coli souche LE392 (Promega). On amplifie la bibliothèque d'ADNc de Agtll dans E. coli souche RY1090. On procède au criblage immunologique des plages du phage en utilisant le système d'immuno-criblage ProtoBlot de Promega selon le protocole du fournisseur. On effectue le criblage avec un antisérum brut de lapin dirigé contre la phytase purifiée de maïs (Labouré et al., 1993). Après dilutions (1:1000 pour le premier criblage et 1: 5000 pour les étapes de criblage suivantes), on traite l'antisérum avec des extraits de E. coli comme il est indiqué dans les directives Promega. On isole plusieurs phages recombinants positifs après criblage de 1,5 x 105 plages. On soumet alors ces phages positifs à un second criblage avec un anticorps plus spécifique purifié par affinité sur la sous-unité de phytase (Labouré et al., 1993). On estime la taille des inserts par réaction PCR avec des amorces U5 (5' AACAGCTATGACCATG-3') et U3 (5'-GTAAAACGAACGGCCAGT-3), en utilisant les conditions d'amplification décrites par Marin et al., (1996). On sous-clone alors les inserts des phages intéressants dans les sites Eco RI - Notl d'un vecteur pBS-SK+ (Stratagène). On détermine les séquences nucléotidiques sur un ADN à deux brins en utilisant la trousse PRISM Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), en suivant les instructions du fabricant et en utilisant un appareil à cycle thermique d'ADN Perking Elmer Cetus PEC480 et un séquenceur ABI 373A (Applied Biosystems). On procède à des hybridations de plages de phages avec l'ADNc de phy AM10 partiel comme sonde, afin d'isoler des ADNc de pleine longueur, sur 360 000 plages selon la technique de Benton et Davis (Sambrook et al., 1989) : on plonge le filtre, côté ADN vers le haut, dans la solution dénaturante pendant dix minutes, puis pendant six minutes dans la solution neutralisante. On effectue l'analyse de la séquence totale de l'insert à 1,4 kb de phy S11 sur les deux brins par le procédé de la terminaison de chaîne didésoxy (Sanger et al., 1977) en utilisant les matrices à un seul brin M13 mp18 et mpl9 (la teneur élevée en GC dans cet insert ne permet pas son séquençage sur l'ADN à deux brins). On procède à des analyses de séquence en utilisant la trousse UWGCG (University of Wisconsin Genetics Computer Group), manuel du programme de la trousse Wisconsin, version 8, septembre 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711. Le programme Mac Vector (Kaufman et al. 1994, Eastman KODAK company New Haven, CT, USA) a aussi été utilisé pour les traitements des séquences génomiques. I.2b) ADN génomique L'ADNc phytase phy S11 (fragment Eco RI / Not I contenant la séquence phy S11 de 1335 pb) est utilisé comme sonde pour le criblage d'une banque génomique lambda de maïs. La banque est une banque commerciale (Clontech, Palo Alto, CA, USA) construite à partir de fragments d'ADN extraits de plantules de la lignée B73. L'ADN est digéré partiellement par l'enzyme Mbo I. Les fragments génomiques ainsi obtenus, d'une taille de 8 à 22 Kb, sont clonés au site Bam HI du phage EMBL-3 (Frischauf et ai. 1983, J. Mol. Biol. 170 : 827) et peuvent être excisés par une digestion enzymatique Sal I. Le criblage de la banque génomique a été réalisé suivant les indications de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 106 phages recombinants par banque d'ADN génomique (soit six équivalents génome maïs au total) sont étalés à différentes concentrations sur des boîtes de pétri en présence de la bactérie hôte. Des réplicats des plages de lyse sont réalisés sur filtre de nitrocellulose. Les phages recombinants contenant des fragments génomiques homologues à l'ADNc phytase sont repérés après hybridation des filtres avec la sonde phytase. Par superposition du filtre présentant des signaux positifs avec la boîte correspondante, la plage de lyse intéressante est prélevée et les phages remis en suspension. Les phages sont ensuite redilués, réétalés sur boîte de pétri pour subir un crible supplémentaire. Trois cribles successifs ont été réalisés afin d'obtenir des clones positifs isolés. Après le troisième tour de criblage, treize clones étaient positifs. Après purification de l'ADN des treize clones génomiques isolés (protocole Qaagen , Chatsworth, CA, USA), ceux-ci sont caractérisés par digestion enzymatique, hybridation et séquençage selon la technique classique de Sanger et aL (1977) à l'aide du kit commercial "fmol DNA Sequencing System" (Promega, Madison, WI, USA). Les ADN des treize clones sont digérés par les enzymes de restriction Sal I, Hind III, Eco RI (simples digestions) et Sal I + Hind III (double digestion). Après électrophorèse sur gel d'agarose des différents fragments et transfert sur membranes de nylon Hybond N+ (Amersham, Buckinghamshire, UK), ces dernières sont hybridées avec la sonde d'ADNc phySîl. Plusieurs fragments issus des clones phagiques ont été sousclonés dans le plasmide pBS II SK+ (Stratagène, La Jolla, CA, USA) selon les techniques classiques de clonage (Sambrook et al. 1989, Molecular cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York). Les fragments sous-clonés présentés ci-dessous, contiennent une séquence homologue à l'ADNc phy S11. Classe I: P19.14 (fragment Sal I/Hind III de 4,7 Kb) Classe Il : P13.2 (fragment Sal I de 5,5 Kb) P13.6 (fragment Hind III de 2,6 Kb) P13.13 (fragment Eco RI de 3,8 Kb) P23.7 (fragment Hind III de 3 Kb) Le séquençage a été initié aux extrémités de ces inserts avec les amorces universelles Reverse et M13-20 (Biolabs, Beverly MA, USA) de "façon manuelle" (utilisation du Kit "fmol DNA Sequencing System" de Promega). La stratégie de progression par oligonucléotides a été adoptée pour compléter les données. Les séquences déterminées avec les oligonucléotides internes ont été obtenues par séquençage automatique auprès d'une société de service (Genome Express, Grenoble, France). I.3) Analyses de gel d'ARN On extrait les ARN totaux en utilisant du chlorhydrate de guanidine (Logeman et al., 1987) provenant d'embryons congelés à divers stades de germination. On fractionne la taille de quantités égales d'ARN sur un gel d'agarose à 1,2 % contenant du formaldéhyde (Sambrook et al., 1989) et on les transfère sur une membrane Hybond N (Amersham). On procède aux préhybridations et hybridations à 42"C dans: formamide à 50 %, 5 x Denhardt, 5 x SSPE, Sarkosyl à 0,5 %, ADN de sperme de saumon à 100 Fg/ml. On lave deux fois les membranes à 42"C avec 2 x SSC, SDS à 0,1 % et une fois à 600C pendant dix à trente minutes avec SSC à 0,2 %, SDS à 0,1 %, avant exposition au film. I.4) Surexpression de la protéine codée phy S11 dans E. coli On clone un fragment Nocl-Asel à 1150 pb de l'ADNc phy S11 (voir figure 1) entre les sites Noci et NdeI du vecteur d'expression pET14 (b) (Novagen). On obtient l'expression de la protéine en clonant le vecteur recombinant dans E coli souche BL21 (Novagen). On procède aux extractions et aux analyses des protéines selon les procédés décrits par le fournisseur. On effectue les analyses de Western blot avec l'anticorps purifié par affinité et on détecte l'activité de phosphatase sur gel de polyacrylamide non dénaturant, comme il a été décrit antérieurement (Labouré et al., 1993). I.5) Détermination de la séquence N-terminale On électrophorèse de la phytase de maïs purifiée sur SDS PAGE à 12,5 % et on effectue un électro-transfert sur une membrane de PVDF "Problott" (Applied Biosystems). La région correspondant à la sous-unité à 38 kDa est révélée par coloration avec du noir amido. On procède à une dégradation automatisée d'Edman de la protéine en utilisant un séquenceur Applied Biosystems 473 A avec les réactifs et les procédés du fabricant. I.6) Cartographie des départs de transcription Afin de déterminer le départ de transcription, nous avons choisi d'utiliser la méthode de RACE PCR (Rapid Amplification cDNA Ends, Chenchik 1995). La mise en application de cette technique a été réalisée grâce au kit "Marathon cDNA Amplification" de Clontech (Palo Alto, CA, USA). Les embryons (axe embryonnaire et scutellum) âgés de un jour et un jour et demi ont été broyés séparément dans l'azote liquide. Les ARN totaux et les ARN messagers ont été extraits et purifiés à partir d'un gramme de broyat suivant les indications des kits utilisés : "RNAgents Total RNA Isolation System" et "polyATtract mRNA Isolation Systems" (Promega, Madison WI, USA). 1.7) Cartographie génétique des loci homologues à 1'ADNc phytase La technique R F L P (Restriction Fragment Length Polymorphism) a été utilisée. C'est un outil très performant pour le développement de cartes de liaisons génétiques saturées (Murigneux et a). 1993, Theor. Appl. Genet. 87 : 278-287). La méthode Southern (1975, J. Mol Biol. 98 : 503-517) permet la mise en évidence des différences individuelles dans la taille des fragments de restriction obtenus avec une enzyme donnée et une sonde donnée, qui correspondent à des emplacements définis sur le génome c'est-à-dire à des loci génétiques. Pour la localisation chromosomique du gène ou des gènes correspondant à l'ADNc phytase, la sonde phy S11 - fragment Eco RI / Not I de 1361 pb - a été hybridée sur un transfert d'un gel d'électrophorèse contenant l'ADN digéré par Eco RI et Hind III de différentes lignées de maïs pour lesquelles des descendances en ségrégation étaient disponibles et utilisées pour la cartographie génétique du maïs. Le croisement A188 x HD7 a été choisi car un polymorphisme de la taille des fragments de restriction homologues à la sonde a été mis en évidence entre les deux lignées parentales. A188 est une lignée américaine (Université du Minnesota) et HD7 est une lignée haploïde doublée (Murigneux et al. 1993, Theor. Appl. Genet. 87 : 278-287) issue d'une population synthétique comprenant du matériel d'origine chinoise essentiellement. La sonde phy S11 a par la suite été hybridée sur des membranes contenant l'ADN de 58 lignées recombinantes SSD ("Single Seed Descent" : lignées recombinantes obtenues par filiation monograine) issues de ce croisement. Sur les membranes contenant l'ADN digéré par Hind III, deux bandes de tailles différentes étaient observées pour chacun des parents. Dans la descendance, ces bandes coségrègent pour 55 individus, 2 individus possèdent les 4 bandes et un seul individu présente une bande de chacun des parents. Le même type de ségrégation est observé pour l'hybridation réalisée sur les membranes contenant l'ADN des lignées recombinantes digéré par Eco RI. I.8) Construction des gènes chimériques I.8a) Fusions GUS Le plasmide pBIOS 255 a été obtenu par l'insertion du fragment de 1,3 kb provenant de P19.14 restreint à Sac I (position + 749) / Nco I (Nco I se situe au niveau de la première méthionine du gène porté par ce fragment génomique), dans le plasmide pRPA-RD-100 coupé à Sac I / Nco I. Ce dernier contient le gène GUS et le terminateur Nos (Bevan et al., 1983, Nature 304: 184-187). Une deuxième construction avec un fragment promoteur plus grand (2,1 kb) a été élaborée. Le fragment P19.14 restreint à Eco RI / Sph I a été inséré dans le plasmide pBIOS 255 coupé à Eco RI / Sph I. Le plasmide résultant s'appelle pBIOS 261. Le plasmide pBIOS 262 a été obtenu par l'insertion du fragment de 1,3 kb provenant de P23.7 coupé à Eco RI / Nco I (Eco RI, site du polylinker du vecteur et Nco I situé au niveau de la première méthionine du gène porté par ce fragment génomique) dans le plasmide pRPA-RD-100 (Eco RI / Nco I). I.8b) Construction de gènes chimériques permettant une expression ectopique de la phytase de classe I (correspondant au clone P19.14, cf. II.4) ci-après) dans le grain et/ou la plante de mais Dans un premier temps, les inventeurs ont élaboré un vecteur plasmidique de base, dénommé pBIOS 256 contenant l'ADNc phytase accolé au terminateur du gène de la nopaline synthétase (ter Nos) qui amène un signal de polyadénylation fonctionnel chez de nombreuses espèces végétales. Ce plasmide a été obtenu par clonage du fragment Sma I / Eco RV de 300 pb comportant le terminateur Nos (Bevan et al. 1983, Nature 304: 184 187) du plasmide pBIOS 250 au site Bst XI (rendu "bouts francs" grâce à l'action de la T4 DNA polymérase) du plasmide phy S11. Le vecteur pBIOS 2500 avait été généré par délétion du fragment Sma I du plasmide pDM 302 (Cao et al 1992, Plant Cell Reports 11:586-591). I.8bl) Construits porteurs des gènes PHYT I (phytase de classe I exprimée de façon constitutive dans le cytoplasme) Les constructions permettant l'expression de la phytase dans le cytoplasme de façon constitutive ont été réalisées de la manière suivante - clonage du fragment Hind III de pBIOS 250 comportant le promoteur Actine - intron Actine (pAct) (Mc Elroy et al. 1991, M.G.G. 231: 15S160), dans pBIOS 256 restreint à Hind III. Le vecteur obtenu est appelé pBIOS 259 porteur du gène pAct - PHYT I - ter Nos - clonage du fragment Bam HI / Nsi I (PHYT I - fragment ter Nos) de pBIOS 256, dans les sites Bam HI / Nsi I de pBIOS 220. Le plasmide pBIOS 220 est un construit comportant le promoteur 35S du CaMV et le terminateur Nos. Le vecteur obtenu est appelé pBIOS 264 porteur du gène p35S - PHYT I - ter Nos. Les constructions permettant l'expression de la phytase dans le cytoplasme de l'albumen ont été réalisées de la façon suivante - clonage du fragment Bam HI / Nsi I de pBIOS 256 dans les sites BamHI / Nsi I de pDV 03000, plasmide contenant le promoteur HMWG (promoteur du gène d'une protéine de réserve du blé, la "High Molecular Weight Glutenin" ; Robert et al. 1989, The Plant Cell 1: 569-578) et le terminateur Nos. Le vecteur obtenu est appelé pBIOS 258, porteur du gène pHMWG PHYT I - ter Nos; - clonage du fragment Hind III / Bam HI du plasmide py63 dérivé de celui décrit dans Reina et al. (1990, N.A.R. 18 : 6425-6426) comportant le promoteur y-zeine, dans pBIOS 259 digéré à Hind III et Bam HI, substituant ainsi le promoteur Actine et l'intron Actine de riz. Le vecteur obtenu, porteur du gène py-zeine - PHYT I - ter Nos, est appelé pBIOS 263. I.8b2) Construits porteurs des gènes Sec-PHYT I (phytase de classe I exprimée de façon constitutive dans l'espace extracellulaire) Pour l'ajout du signal d'adressage extracellulaire, nous avons choisi d'utiliser celui porté par la "Pathogenesis Related Protein", PR-S homologue à la thaumatine du tabac (Cornelissen et al. 1986, Nature 321: 531532). Les auteurs ont opté pour une stratégie de mutagénèse dirigée utilisant la PCR grâce au kit "Ex-SiteTM PCR based Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene, La Jolla-USA) selon les recommandations du fournisseur. Le plasmide pBIOS 256 sert de construction de base. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification sont les suivants - ol MUP1 5' CAT GAA cTr CCT CAA AAG 7 CCC CTT TIA TGC CTT CCT TTG 7 TGG CCA ATA CTT TGT AGC TGT TAC TCA TGC TGA CTC GGA AGG AGT AGC AGC AAAGGTGGC 3', - olMUP2: 5' GAT CAA ACA CTA AGC TCA ATA AGG ATG G 3'. Plusieurs plasmides recombinants triés par analyse de digestion restrictive ont été séquencés avec le Reverse primer. Un plasmide a été retenu et la structure du gène Sec-PHYT I a été confirmée par séquençage grâce à trois oligonucléotides - M13-20 primer - phy 5 (position 718/737 de phy S11) - phy 6 (position 816 / 797 de phyS11) Le plasmide résultant de l'addition du signal d'excrétion et contenant la partie codante de la phytase de classe I fusionnée est appelé pBIOS 265. La construction permettant une expression constitutive de la phytase excrétée a été obtenue de la manière suivante - clonage du fragment Hind III de pBIOS 250 comportant le promoteur Actine et l'intron Actine, dans le site Hind III de pBIOS 265. Ce vecteur a été appelé pBIOS 268 et il porte le gène chimérique pAct - Sec-PHYT I - ter Nos. Les constructions permettant une expression dans l'albumen de la phytase excrétée ont été obtenues de la manière suivante - clonage du fragment Hind III / Bam HI de py63 comportant le promoteur y zein dans les sites Hind III et Bam HI de pBIOS 265. Ce vecteur est appelé pBIOS 269 et il porte le gène chimérique przein - Sec-PHYT I - ter Nos. - clonage du fragment Bam HI / Nsi I de pBIOS 265 comportant Sec-PHYT I et une partie du terminateur Nos dans les sites Bam HI / Nsi I de pDV 03000. Ce vecteur est appelé pBIOS 270 et il porte le gène chimérique pHMWG - Sec PHYT I - ter Nos. I.9) Evaluation de l'activité promotrice par analyse de l'activité transitoire Une étude de l'activité promotrice peut être avantageusement réalisée en introduisant, par la méthode du canon à particule, dans des cellules issues du tissu où cette activité est recherchée, la zone promotrice à évaluer fusionnée à un gène rapporteur dont l'activité est facilement décelable. Le gène GUS (E. coli p-glucuronidase) peut être utilisé à cet effet. Chaque cellule ayant reçu ce gène chimérique dans des conditions permettant son expression, produit la protéine p-glucuronidase. Cette protéine peut être aisément détectée in situ 48 h après bombardement par la méthode décrite par Jefferson (1987, Plant. Mol. Biol. Report., 5(4) 387 : 405). Les cellules produisent alors un pigment bleu qui permet leur observation. Si le promoteur est actif dans le tissu bombardé et au stade considéré, plusieurs dizaines de cellules à la surface de l'explant vont acquérir cette couleur bleue. Aucun spot ne sera visible si le promoteur est inactif dans les conditions utilisées. Des grains de mais sont stérilisés par immersion de 20' dans une solution saturée en Hypochlorite de calcium, puis mis à germer en condition stérile entre deux feuilles de papier buvard imbibées d'eau et placées à 25"C. 1 jour, 3 jours et 4 jours après germination les grains sont disséqués de façon à placer sur un milieu gélosé de bombardement, des fragments de tissus tels que aleurone, scutellum, épicotyle et mésocotyle. Le milieu de bombardement peut être par exemple composé de 0,2 M de Mannitol et de 0,2 M de Sorbitol solidifié avec 8 g/l d'Agar. Les tissus sont ensuite bombardés. Les plasmides contenant le promoteur à étudier fusionné au gène GUS sont purifiés sur colonne Qiagen > en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987, Nature 327 : 70-73). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon. L'optimisation des conditions de bombardement peut dépendre du type d'appareil utilisé et fait partie des techniques normalement maîtrisées par l'homme de l'art. Quarante-huit heures après le bombardement, les tissus sont colorés comme décrit par Jefferson puis observés. I.10) Production de maïs transgéniques I.10a) Méthode de transformation génétique La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation, Agrobacteriurn, microfibres, canon à particules) requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hi II ou A188 x B73 selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (in The Maize Handbook; 1994, M. Freeling, V. Walbot Eds ; pp 665: 671), les cals ainsi obtenus peuvent être multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989, Plant Cell Tissue and Organ Culture 18 :143-151). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées. On utilise une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules. Les cellules cibles sont des fragments de cals d'une surface de 10 à 20 mm2. Ils sont disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte, au centre d'une boîte de pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les tissus sont ensuite bombardés comme décrit précédemment. Les boîtes de cals ainsi bombardés sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais puis cultivées à l'obscurité à 27"C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les 15 jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif dont la nature et la concentration peuvent varier selon le gène utilisé. Les agents sélectifs utilisables sont généralement des composés actifs de certains herbicides (Basta, Round up(íD) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine,...). Il apparaît après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées. I.lOb) Utilisation du gène Bar pour la sélection Le gène Bar de Streptomyces hygroscopicus code pour une phosphinothricine acyl transférase (PAT) qui inactive par acétylation la phosphinotricine - molécule active de l'herbicide Basta. Les cellules portant ce gène sont donc rendues résistantes à cet herbicide et peuvent être sélectionnées par son intermédiaire. Pour la transformation des céréales, la séquence codante du gène Bar est sous le contrôle d'une région régulatrice permettant une expression forte et constitutive dans les cellules végétales. Une telle région peut avantageusement être constituée par le promoteur et le premier intron du gène Actine de riz tels que décrits par Mc Elroy (1991, Mol. Gen. Genet. 231: 150-160). Ce gène chimérique est cloné sur un plasmide permettant son amplification par Escherichia coli. Ce plasmide pDM 302 Cao (1992, Plant Cell Report Il : 586-591), après amplification puis purification sur colonne Ciagen peut être utilisé en transformation génétique du maïs en utilisant par exemple la méthode décrite précédemment. Dans ce cas les milieux de cultures destinés à la sélection des cellules transformées sont additionnés de 2 mg/l de Phosphinothricine. Pour l'introduction des construits phytase devant conduire à une expression ectopique des protéines issues des gènes PHYT I et Sec-PHYT I, une technique dite de cotransformation peut avantageusement être utilisée. On procède à une coprécipitation des deux plasmides (le plasmide porteur du gène de selection et l'un des différents plasmides "phytase") sur les particules de tungstène, la quantité totale d'ADN précipité sur les particules restant identique à ce qu'elle est dans le protocole standard (5 g d'ADN pour 2,5 mg de particules) chaque plasmide représentera environ la moitié du poids total d'ADN utilise. L'expérience montre qu'avec cette méthode, la cointégration des plasmides dans les cellules végétales est l'événement le plus fréquent (de l'ordre de 90 %) c'est-à-dire que pratiquement chaque plante ayant intégré le gène Bar et ayant été sélectionnée par son intermédiaire portera aussi le gène "phytase". Ainsi, le pourcentage de plantes sélectionnées exprimant le gène "phytase" est d'environ 70 %. Les gènes ainsi introduits sont généralement liés au sens génétique, le gène phytase peut ainsi avantageusement être suivi dans les descendances grâce à la résistance à l'herbicide qui lui est étroitement associée. II. RESULTATS II.1) Isolement et caractérisation d'un ADNc codant pour une phytase de jeunes plants de maïs On construit une bibliothèque d'ADNc dans le vecteur d'expression gel 1 en utilisant des ADNc synthétisés avec des ARNm polyadénylés isolés à partir de jeunes plants de maïs âgés de trois à quatre jours. On crible la bibliothèque avec l'antisérum brut de lapin dirigé contre la sous-unité de phytase purifiée à partir des jeunes plants de maïs. Le criblage initial aboutit à l'isolement de douze clones positifs. Lorsqu'on teste avec l'antisérum purifié par affinité sur la sous-unité de phytase, un seul clone donne une forte réponse positive. On sous-clone I'insert correspondant dans le vecteur pBS-SK+ et on le séquence. Il contient 930 pb avec un cadre ouvert de lecture codant pour 139 aa. On utilise cet ADNc marqué, appelé phy AM10, comme sonde pour cribler la même bibliothèque afin de rechercher des clones de pleine longueur correspondants. On isole plusieurs clones positifs contenant un insert d'environ 1400 pb. On séquence entièrement l'insert d'un de ces clones, appelé ADNc phy S11. La séquence nucléotidique de l'ADNc phv S11 contient 1335 pb avec une teneur élevée en GC (65 %) et présente un cadre ouvert de lecture pour un polypeptide à 387 aa (figure 1). La présence d'un codon d'arrêt (TGA) deux codons en amont du premier ATG suggère que cet ATG est le codon d'initiation et montre que la séquence de codage est complète. Cet ADNc présente 31 pb de séquences non traduites en 5' et 147 pb de séquence non traduite en 3'. On trouve un signal de polyadénylation AATAAA décrit pour les plantes supérieures (Joshi, 1987) (position 1236 - 41) à 63 nucléotides en amont de l'extension poly-A. La taille de la protéine codée déduite de la séquence d'acides aminés est de 41 kDa, correspondant à la taille de la sous-unité phytase détectée par analyse Western blot des protéines totales extraites de jeunes plants (Labouré et al., 1993). Il faut mentionner que la sous-unité de la phytase purifiée selon le procédé décrit antérieurement est toujours légèrement plus petite (environ 38 kDa), ce qui suggère que des clivages spécifiques apparaissent au cours de la purification. On détermine l'extrémité N sur la sous-unité purifiée. Le peptide à 38 kDa semble être un mélange de deux peptides : un peptide mineur avec une extrémité N XXEDGESKAGMTDL et un peptide majeur commençant par la séquence d'acides aminés AGMTDLLMLTDKSQL. Ces deux séquences qui se recouvrent partiellement sont localisées respectivement dans les positions 19 - 32 et 27 - 41 sur la séquence d'aa déduite de l'ADNc phy Sll (figure 1), ce qui confirme que cet ADNc code bien pour la sous-unité de phytase et que le premier ATG est le codon d'initiation. Une recherche sur ordinateur des similitudes entre la séquence d'acides aminés déduite et d'autres protéines dans plusieurs bases de données utilisant le programme FastA de la trousse UWGCG a révélé une homologie à 96 % avec un EST indéterminé à 162 pb de Zea mays (numéro d'accès : T20338). On a également trouvé une similitude de 55 % (30 % d'identité) avec une séquence d'aa encodée par un ADNc d'Hordeum vulgare (numéro d'accès : X82937) dont on a signalé qu'elle est induite par le jasmonate, et dont la fonction est inconnue (J. Leopold, 1994, non publié). Lorsqu'on compare la séquence d'acides aminés pour laquelle code l'ADNc phy S11 avec celle de la phytase phy A d'Aspergillus niger en utilisant le programme Best Fit de la trousse UWGCG, on trouve que la seule zone significative de similitude correspond à un recouvrement de seulement 33 aa (souligné en pointillés dans la figure 1). La figure 2 montre l'alignement de cette séquence de maïs avec les séquences correspondantes des phytases Phy A et Phy B d'Aspergillus : cette séquence du mais présente 84 % de similitude (27 % d'identité) avec la séquence correspondante de la phytase Phy A d'Aspergillus et 79 % de similitude avec celle de la phytase de Phy B. Ces séquences des phytases d'Aspergillus contiennent le motif consensus RHGxRxP (souligné en figure 2) caractéristique des phosphatases acides de la levure, de E coli et de certains mammifères, et dont on pense qu'il s'agit de la région accepteur de phosphatase (Piddington et al., 1993). II.2) Analyse de l'expression du gène de phytase par Northern blot à divers stades de la germination du grain de maïs Pour examiner si l'accumulation de la protéine signalée dans les jeunes plants de maïs au cours des premiers jours de la germination (Labouré et al., 1993) est en relation avec une augmentation de la teneur en ARNm correspondant, on détermine les niveaux de produit de transcription par analyse de Northern blot. On extrait l'ARN total de semences sèches, on hydrate les semences pendant douze heures dans de l'eau aérée, on transfère les semences dans du sable humide pendant 1, 2, 3, 5 et 6 jours. On compare avec l'ARN extrait de feuilles matures. Dans chaque cas, on soumet 10 g d'ARN à une analyse de Northern blot, en utilisant l'ADNc phy S11 comme sonde. On ne détecte aucun produit de transcription Phy S11 dans les ARN totaux provenant de semences sèches ou provenant de semences imbibées pendant douze heures dans de l'eau aérée. On trouve que l'ADNc phy S11 s'hybride à un ARNm unique d'environ 1400 pb, qui apparaît au cours du premier jour de germination à 26"C, atteint son plus haut niveau au jour 2, puis diminue progressivement du jour 3 au jour 6. On n'observe qu'une très légère hybridation avec l'ARNm provenant de feuilles matures. Cette cinétique de l'accumulation d'ARNm est compatible avec ce qui a été décrit antérieurement pour l'accumulation de phytase, mais le niveau maximum d'ARN est obtenu deux jours avant le niveau maximum signalé pour l'accumulation de protéine. II.3) Expression de l'ADNc phy Sll dans E coli Pour tester si l'ADNc phy S11 code pour la phytase fonctionnelle du maïs, on cherche à exprimer le gène dans E coli. On insère la séquence de codage complète en phase au site Nco I du vecteur pET-14b, sous la commande des signaux de transcription et de traduction du bactériophage T7. On transfère le plasmide pET.S11 résultant dans l'hôte d'expression BL21 dans lequel on peut induire l'expression de T7 par IPTG. On extrait les protéines solubles totales provenant de E coli non transformées ou transformées avant et après induction avec IPTG, dans des conditions dénaturantes, et on analyse sur SDS-PAGE. La coloration du gel par le bleu Coomassie révèle une bande faible à 40 kDa, qui n'est présente qu'après induction par IPTG (non représentée). Lorsqu'on analyse les mêmes extraits par analyse de Western blot, on procède comme suit : on sépare les protéines totales (10 llg par piste) extraites de E coli BL21 sur SDS/PAGE à 12,5 % et on effectue un électrobuvardage sur une membrane de nitrocellulose. On repère la protéine avec l'anticorps purifié pour : 1) BL21 non transformé, 2) BL21 transformé avec pET14 recombinant, sans induction par IPTG, 3), 4) et 5) BL21 transformé avec pET14 recombinant au bout de 1, 2 ou 3 heures d'induction respectivement, 6) 10 Fg de protéines totales de jeunes plants de mais de cinq jours et 7)1 llg de phytase purifiée à partir de jeunes plants de maïs. L'anticorps de phytase réagit de façon croisée avec un polypeptide provenant des extraits de E coli induits qui migrent exactement aux mêmes niveaux que le polypeptide détecté sur les protéines totales extraites de jeunes plants de mais de cinq jours. De façon intéressante, la protéine synthétisée dans E. coli subit des clivages aboutissant à un peptide de même taille que la sous-unité de la phytase purifiée. Lorsqu'on sépare des protéines solubles sur PAGE dans des conditions non dénaturantes et qu'on les analyse par Western blot, on observe une protéine d'environ 80 kDa dans les extraits de E coli induits. Cette protéine migre au même niveau que la protéine native provenant de jeunes plants de maïs, ce qui indique que les sous-unités synthétisées dans E. coli sont capables de s'assembler. Cependant, lorsqu'on teste l'activité de phosphatase sur le gel, on n'observe pas d'activité au niveau de la protéine réassemblée provenant de l'extrait de E coli. Lorsqu'on ajoute de la phytase de maïs purifiée à l'extrait de E coli une activité est présente, ce qui montre qu'aucune substance inhibitrice n'est présente dans l'extrait. En résumé, l'immunocriblage d'une bibliothèque d'ADNc de jeunes plants de maïs a permis l'isolement d'un ADNc appelé phy S11, codant pour un polypeptide à 41 kDa qui correspond en fait à la sous-unité de phytase détectée par des analyses de Western blot dans des extraits de protéine totale provenant de jeunes plants de semis. On a déterminé la séquence N-terminale de la sous-unité de phytase purifiée : on trouve un mélange de deux séquences correspondant aux acides aminés 19 - 32 et 27 - 41 de la séquence déduite de l'ADNc phy S11. Ce résultat est en accord avec les différences observées entre la taille de la sous-unité révélée par Western blot sur les extraits protéiques totaux provenant de jeunes plants de semences et celle de la protéine purifiée. La correspondance entre les séquences d'aa déterminées sur la protéine purifiée et celle déduite d'après la séquence nucléotidique de l'ADNc phy S11, confirme que cet ADNc code bien pour la sous-unité de phytase. L'utilisation de l'ADNc phy S11 comme sonde pour estimer les niveaux d'ARNm de phytase au cours des premiers jours de germination montre clairement que l'accumulation de la protéine signalée antérieurement (Labouré et al., 1993) est en corrélation avec une forte augmentation du niveau de produit de transcription correspondant. En fait, on ne détecte aucun ARNm dans les grains secs ou dans des grains échelonnés en douze heures, tandis qu'on mesure déjà une accumulation significative du produit de transcription un jour après transfert dans des conditions de germination. Le niveau maximum d'ARNm est atteint au bout de deux jours, ce qui correspond au stade de l'extrusion radiculaire. Par conséquent, l'induction de l'accumulation d'ARNm de phytase se produit à un stade très précoce du processus de germination. Dans des travaux antérieurs, on a montré que l'accumulation de la protéine ne culmine qu'au bout de quatre jours d'imbibition. Cette différence entre la cinétique d'accumulation du produit de transcription et de la protéine suggère qu'une commande de traduction peut apparaître outre la régulation du niveau d'ARNm. L'expression dans E. coli en utilisant le vecteur pET14 permet la production de la sous-unité de phytase et son assemblage comme on le détecte par Western blot. Cependant, la protéine cible est produite en faible quantité, et on n'observe aucune accumulation au bout d'une heure d'induction. La forme assemblée migre à la même taille que la phytase purifiée native, mais la protéine résultante ne montre aucune activité de phosphatase. Ceci suggère ou bien que l'assemblage qui se produit dans la bactérie n'est pas correct et aboutit à une protéine non fonctionnelle, ou bien qu'une modification post-traductionnelle de la protéine nécessaire qui ne se produit pas dans E. coli est nécessaire pour l'activité. II.4) Deux gènes phytase sont présents chez le maïs et ils sont localisés sur le chromosome 3 Sur les treize clones génomiques isolés et analysés, dix clones positifs sont finalement retenus dont sept sont différents. Les inventeurs ont pu établir au moins deux classes - la classe I qui comprend trois clones différents chevauchants : P3 = P4 (12 kb), P19 (13,5 kb), et P22 (16 kb). Les cartes de restriction sont présentées à la Figure 3, - la classe II qui comprend deux clones chevauchants : P5 = P26 (17 kb) et P13 = P24 (18,5 kb). Les cartes de restriction sont également présentées à la Figure 3. En ce qui concerne les 2 clones restants - P23 (12,7 kb, Figure 3) présente un seul fragment de taille identique à un des fragments des clones de classe II, fragment qui n'est pas révélé à l'hybridation. Ce clone a finalement été rattaché à cette classe après comparaison des séquences effectuées sur les clones phagiques réalisées avec l'oligonucîéotide Phy 8, désigné sur l'ADNc phy S11 à la position 1129 / 1148. Ces dernières se sont retrouvées parfaitement homologues - P25 quant à lui ne présente aucun fragment retrouvé chez les autres clones. L'hybridation des blots contenant l'ADN des phages digérés par les différentes enzymes énumérées ci-dessus, avec le fragment P23.7 Hind III de 3 kb (Figure 3), a montré des différences d'intensité des signaux d'hybridations qui concordent avec la classification proposée des fragments génomiques : signal intense pour les clones de la classe II et faible pour ceux de la classe I dont P25 ferait partie. L'appartenance de P25 à cette classe a pu être confirmée par hybridation avec le fragment Eco RI / Sph I du plasmide portant le fragment P19.14 cloné à Sal I / Hind III (Figure 4, EcoRI : site du polylinker du vecteur et Sph I: site du fragment génomique à la position 1794). Des réactions de séquences ont été également menées sur les clones phagiques P3, P19 et P22 à l'aide d'oligonucléotides spécifiques de l'ADNc phytase phy S11. Les résultats des séquences P3 et P22 obtenues avec l'oligonucléotide Phy 8, désigné sur l'ADNc phy S11 à la position 1129 / 1148, indiquent que le fragment Sal I de 6,9 kb commun aux deux clones et homologue à I'ADNc, est adjacent à l'un des deux bras du vecteur phagique, au petit bras pour P3 et au grand bras pour P22. P3, P22 et P19 ont ainsi pu être positionnés les uns par rapport aux autres (Figure 3). Les séquences complètes du clone de classe I, P19.14 (4,7 kb) et du clone de classe Il, P23.7 (3 kb) ont été déterminées et sont présentées aux Figures 4 et 5. Les tailles exactes sont 4695 pb pour P19.14 et 2991 pb pour P23.7. Des séquences incomplètes du clone P13.2 (5,5 kb) et P13.6 (2,6 kb) ont montré que le clone phagique dont ils dérivent est certainement chimérique. En effet, on ne trouve pas d'homologie avec les 100 premières pb de l'ADNc phy S11. La présence d'un site Mbo I (enzyme utilisée pour la digestion partielle de l'ADN génomique lors de la construction de la banque Clontech) à cette position semble conforter cette hypothèse (position + 122 de phy S11). Les analyses de restriction et d'hybridation du clone P5, révèlent que ce dernier est aussi chimérique. En ce qui concerne le fragment génomique P19.14 (classe I), la comparaison de la séquence tirée du fragment génomique et de la séquence de l'ADNc phy S11, met en évidence un seul intron de 131 pb dans la région 5' leader non traduite. L'épissage de l'intron se situerait après la 13ème base nucléotidique de l'ADNc phy S11. Quelques différences ponctuelles sont observées par rapport à la séquence de phy S11. Ces différences pourraient correspondre à du polymorphisme intervariétal (phy S11 vient de la lignée Mol7 et P19.14 de la lignée B73). La séquence de phy S11 est entièrement retrouvée dans la séquence génomique. Du site Nco I situé au niveau du triplet codant pour la première méthionine, au site Hind III de clonage, 2,1 Kb permettent de déterminer la région promotrice de ce gène. Le cadre de lecture ouvert déterminé est le même que celui de phy S11, le codon de terminaison est également TAA. Ce gène coderait donc pour une protéine de 387 acides aminés, identique à celle déduite de l'ADNc phy S11. La séquence complète du clone P23.7 (fragment Hind III de 3 kb) a été déterminée. D'après l'alignement des séquences de phy S11 et P23.7, le gène phytase cloné dans P23.7 semble plus éloigné de phy S11 que ne l'est P19.14. Les différences observées ne sont toutefois pas très importantes. L'alignement des séquences débute à la première base de l'ADNc phytase et à la base 1174 du fragment génomique séquencé. Un intron de 125 pb est situé dans la région 5' leader non traduite. Une vingtaine de mutations ponctuelles sont observées et on peut noter une plus grande variation entre les séquences au niveau de la région 3' non traduite. Nous avons également observé une addition de deux fois 3 bases dans la région 5' traduite. Le cadre de lecture ouvert demeure ainsi le même que celui de phy S11 et le codon stop est également TAA. Le gène cloné dans P23.7 coderait pour une protéine de 389 acides aminés. La comparaison des séquences génomiques de P19.14 et P23.7 en amont et en aval de la région transcrite de ces deux gènes phytase montre que ces séquences étaient totalement différentes. L'interrogation des banques de données en utilisant la séquence phy S11 et le logiciel de comparaison FastA avait montré l'existence d'un EST de maïs de 162 pb, n d'accession T20338, fortement homologue. Celui-ci provient d'une banque d'ADNc obtenue à partir d'ARNm de plantules étiolées de 10 jours de la lignée B73. Il se révèle complètement homologue au début de transcription du gène phytase de classe II (P23.7). On peut noter en particulier, la présence des deux acides aminés supplémentaires. Les séquences protéiques déduites des parties codantes de P19.14 (classe I), P23.7 (classe II) et phy S11 ont été comparées grâce au logiciel d'alignement "clustal V multiple séquence alignement" (Figure 6). Cette analyse a permis de confirmer l'appartenance des protéines codées par P19.14 et P 23.7 à des classes différentes dénommées ci-après respectivement phytase de classe I et phytase de classe II. L'analyse du cadre de lecture ouvert de P19.14 et de phy S11 montre que les deux protéines se distinguent uniquement pour deux acides aminés (on trouve une Alanine et une Valine pour phy S11, et une Glycine et une Isoleucine respectivement pour Pi9-14). En conclusion, ces résultats semblent indiquer que les fragments génomiques de classe I correspondraient à l'ADNc phy S11. Toutes ces données attestent donc de la présence de deux gènes phytase transcriptionnellement actifs dans la plantule de maïs en germination. Les séquences protéiques de ces deux phytases sont quasiment identiques. Parallèlement, les résultats de cartographie génétique (cf. matériels et procédés) semblent indiquer l'existence de deux loci présentant des homologies de séquence avec l'ADNc phytase phy S11. Le traitement des données avec le logiciel de cartographie Mapmaker version 2.0 pour Macintosh (Lander et al. 1987, Genomics 1:174-181) a montré que ces deux loci dénommés phy I et phy 11 sont très liés, positionnés à 1 cm l'un de l'autre sur le chromosome 3 du maïs. Ils sont encadrés par les loci umcO10 et umcO26 (MNL 69 : p 249). Phy I est à environ 4,6 cm du locus umcO10 du côté du bras court du chromosome et phy II, positionné au même endroit que bnl 06.06, est distant de 4,2 cm du marqueur uni c02 6. Une hybridation complémentaire a été réalisée sur les membranes contenant l'ADN digéré des lignées recombinantes afin d'établir la correspondance entre ces deux loci et les gènes de classes I et II caractérisées à partir des fragments génomiques. Pour ce faire, le fragment Eco RI / Sph I spécifique de la séquence en amont du gène de classe I (P19.14) a été utilisé comme sonde. Les résultats des hybridations démontrent que le gène de classe I correspond au locus phy L Il.5) Détermination du départ de transcription et des régions promotrices des gènes phytase 11.5 a) Cartographie des départs de transcription Pour déterminer les départs de transcription des gènes phytase, nous avons utilisé la méthode 5'RACE. Plusieurs combinaisons d'oligonucléotides ont été testées AP1 et AP2 (Kit Marathon) / phy 20 (position + 95 / + 75 de phy S11); AP1 et AP2 / phy 18 (position + 294/ + 273 de phy S11). Les produits d'amplification obtenus dans les conditions suivantes : 1 min 94"C ; 40 cycles (30 sec 94"C, 30 sec 55"C, 2 min 68"C), n'ont pu être détectés par coloration au bromure d'éthidium après migration sur gel d'agarose à 2 %. Leur mise en évidence a été réalisée par hybridation avec la sonde ADNc phy S11 (EcoR I / Not I). Les produits positifs ont alors été clonés dans le vecteur plasmidique pGEM-T (Promega) selon les recommandations du fournisseur, puis séquencés. Différents produits, que l'on peut classer en deux groupes, se sont révélés informatifs - le clone n" 53 (obtenu à partir de l'oligonucléotide phy 18), beaucoup plus court que le produit minimal attendu défini par la séquence de l'ADNc phy S11, semble mettre en évidence la présence d'une structure secondaire forte en 5' de L'ART messager, qui empêcherait une bonne activité de la réverse transcriptase. La réverse transcriptase a été stoppée à la position +245dephyS11; - les clones n" 92, 93 et 87 (obtenus à partir de l'oligonucléotide phy 20), de taille sensiblement équivalente à la taille du fragment attendue à partir de l'ADNc phy S11. On a pu noter un arrêt de la réverse transcriptase à 10 pb en amont du début de l'ADNc pour le n" 92 à la position + 19 pour le n" 93, + 54 pour le n" 87. La séquence du clone n" 92 présente 100 % d'homologie avec la séquence déterminée pour le fragment P23.7 et également avec l'EST de maïs, n" d'accession T20338. Le départ de transcription se situe à la position 1261 de la séquence génomique déterminée sur P23.7 ou légèrement en amont. Les expériences visant à mettre en évidence les départs de transcription des différents gènes phytase se sont donc révélées fructueuses pour le gène phytase de classe II. L'isolement de l'ADNc phy S11 atteste que l'initiation de la transcription du gène de classe I a lieu à la position 1935 de la séquence génomique ou légèrement en amont (Figure 4). Pour les deux gènes on constate la présence d'une boîte TATA à environ 60 à 70 pb en amont des transcrits trouvés. 11.5 b) Expression transitoire Afin d'étudier la spécificité des promoteurs des deux gènes phytase (classes I et II) vis-à-vis des différents tissus de grains de maïs en germination, trois constructions plasmidiques ont été réalisées. Il s'agit de fusions traductionnelles au niveau du codon d'initiation avec le gène rapporteur codant pour la ss-glucuronidase (Jefferson, 1987, Plant Mol. Report 5 : 387-405). En ce qui concerne l'étude de la région promotrice du gène de classe I, deux fragments génomiques du plasmide P19.14 ont été fusionnés au gène GUS pour analyser l'expression transitoire de la p-glucuronidase. Un fragment long de 2,1 kb et un fragment plus court de 1,3 kb. Pour le gène de classe II, un fragment de 1,3 kb a été fusionné (cf. matériels et procédés). Après bombardement de grains en germination (cf. matériels et procédés), une expression transitoire faible (un à deux spots visibles par embryon) a pu être ainsi détectée au niveau du noeud cotylédonnaire d'embryons bombardés un jour après la mise en germination avec les construits suivants - pBIOS 261 (fragment promoteur de 2,1 kb de classe 1) - pBIOS 262 (fragment promoteur de 1,3 kb de classe II). Aucune expression n'a été décelée dans le scutellum ni dans la couche d'aleurone pour ces construits. Aucune expression n'a été constatée dans aucun tissu avec le fragment promoteur court du gène de classe I (pBIOS 255). Nous avons donc déte gibbéréllines. Ceci peut être obtenu par l'expression d'enzymes de biosynthèse de ces hormones. 11.6) Expression ectopique de la phytase de classe I dans le maïs pour améliorer la digestibilité du phosphore et augmenter l'efficacité d'extraction de l'amidon de grain de maïs Afin d'augmenter la digestibilité du phosphore du grain de maïs et/ou d'améliorer l'extraction de l'amidon durant l'étape industrielle du trempage, nous avons adopté plusieurs stratégies utilisant toutes une expression ectopique de la phytase de classe I. II.6a) Expression constitutive dans le cytoplasme La première consiste à diminuer directement la quantité d'acide phytique produite dans l'embryon de maïs. Il est connu que certains mutants de maïs, low phytic acid 1 et 2 peuvent avoir une réduction de leur teneur en acide phytique pouvant atteindre 33 % de la quantité totale sans voir une diminution de leur contenu en phosphore total (Raboy et al., 37Th Annual Maize Genetics Conference 1995, Asilomar : Asbstract p. 6). Nous avons aussi choisi de produire la phytase de classe I dans toute la plante via l'utilisation de promoteurs constitutifs et ceci afin qu'elle hydrolyse l'acide phytique en cours de production dans l'embryon. Comme il semble que l'acide phytique soit nécessaire au cours du développement de l'embryon - en effet Raboy et al. (37Th Annual Maize Genetics Conference 1995, Asilomar Asbstrac p. 6) ont isolé des allèles du mutant Ipa 1 qui sont léthaux, ces derniers n'ont plus du tout d'acide phytique - nous avons testé tout d'abord un promoteur d'expression constitutive faible chez le mais, le promoteur 35S (Guilley et al. 1982, Cell 30 : 763-773). Parallèlement l'utilisation d'un promoteur fort, le promoteur associé au premier intron du gène Actine 1 de riz (Mc Elroy et al. 1991, M.G.G. 231:150-160) a été développée. Ces promoteurs dirigeront pour cette stratégie l'expression de la phytase de classe I telle qu'elle est naturellement exprimée au cours de la germination, c'est-à-dire qu'elle sera produite dans le cytoplasme de toutes les cellules de la plante (PHYT I). II.6b) Expression dans un compartiment cellulaire et/ou un tissu différent de celui contenant l'acide phytique Dans une autre stratégie, nous visons à produire ectopiquement de la phytase de classe I dans le grain de maïs sec de manière à ce qu'elle n'interfère pas avec l'acide phytique produit dans le germe au cours de la maturation du grain. Cette stratégie vise à pallier à d'éventuels effets délétères causés par une expression phytasique constitutive même faible. Le but est de procéder de telle manière que la phytase ne soit pas dans le même compartiment que la phytine, et de ce fait n'exercera son activité qu'au moment où les grains seront broyés et ingérés par l'animal ou lors de l'opération de trempage, première étape industrielle de l'extraction de l'amidon. Pour cette deuxième stratégie, nous utilisons deux approches différentes qui peuvent être combinées pour en faire une troisième. * 11.6 bi) Expression cytoplasmique dans l'albumen La première consiste à tirer partie de la morphologie du grain de maïs en exprimant la phytase de classe I de type cytoplasmique (PHYT I) dans le compartiment qui ne contient pas d'acide phytique, c'est-àdire dans l'albumen. Ce compartiment tissulaire est très volumineux et peut permettre l'expression d'une grande quantité de phytase. Des promoteurs d'expression spécifique de ce tissu sont connus et nous avons choisi d'utiliser 2 promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserves de céréales : le premier vient du gène de rzéine de maïs (Reina et aL 1990, N.A.R. 18 : 6425- 6426) le deuxième vient du gène d'une protéine de réserve du blé, la "High Molecular Weight Glutenin" (Robert et al. 1989, The Plant Cell 1: 569-578). II.6b2) Expression constitutive dans l'espace extracellulaire La deuxième approche est semblable à la réalisation utilisant une phytase fongique (Pen et aL 1993, Biotechnology 1 1 : 811-814 et brevet d'invention de Pen et al. n" EP-0 449 375) chez le tabac et le colza via l'expression dans un compartiment cellulaire différent de celui où se trouve l'acide phytique. Le compartiment choisi étant l'espace extracellulaire. Pour cela on rajoute un signal d'adressage extracellulaire au début de la protéine phytase de classe I via une fusion en phase, pour donner une nouvelle protéine (Sec-PHYT I). Les signaux d'adressage qui permettent un transit via le réticulum endoplasmique puis l'appareil de golgi pour terminer dans les vésicules excrétrices sont bien connus de l'homme de l'art. Ils sont de plus clivés lors de la maturation de la protéine ; ceci garantit la production d'une protéine quasiment identique à la phytase originelle. Pour cette réalisation, nous avons choisi le peptide transit d'une "Pathogenesis Related Protein", la thaumatine du tabac (Cornelissen et aL 1986, Nature 321: 531-532). Ce peptide a été utilisé avec succès pour la production d'albumine du sérum humain (Sijmons et aL 1990, Biotechnology 8 : 217-221) et pour la production de phytase d'Aspergillus (Pen et aL 1993, Biotechnology Il : 811-814). Des promoteurs constitutifs peuvent être bien évidemment utilisés comme dans la réalisation de Pen et al. (1993, Biotechnology 11: 811-814). Nous avons choisi le promoteur fort déjà mentionné : Actine de riz avec son premier intron. II.6b3) Expression extracellulaire dans l'albumen Prenant en compte l'opportunité que le maïs et les céréales en général ont un albumen développé, on peut combiner les deux approches précédentes à savoir : utiliser des promoteurs spécifiques de l'albumen pour exprimer la phytase excrétée (Sec-PHYT I). Les mêmes promoteurs que ceux utilisés pour l'expression de la phytase cytoplasmique, ont été choisis. Cette troisième approche garantit un fort taux d'expression de la phytase dans le grain de maïs assurant son absence d'expression dans le germe riche en acide phytique. L'expression ectopique de PHYT I et de Sec-PHYT I est détectée dans les différents organes des maïs transgéniques par la méthode Western. REFERENCES - Armstrong C. L (1994) Regeneration of plants from somatic cell cultures applications for in vitro genetic manipulation. Freeling M., Walbot V. Eds 665-671. - Basso B., Bagnaresi P., Bracale M., Soave C. 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LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES (i) DEPOSANT (A) NOMS : INRA et BIOCEM (B) RUE : INRA : 147 RUE DE L'UNIVERSITE, BIOCEM (C) VILLE : INRA : PARIS et BIOCEM (E) PAYS : FRANCE (F) CODE POSTAL : INRA : 75338 et BIOCEM (G) TELEPHONE : INRA : 42 75 9 z O&commat; et BIOCEM (H) TELECOPIE : INRA : 42 75 93 64 et BIOCEM (ii) TITRE DE L'INVENTION : "FRAGMENT D'ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UNE PHYTASE DE PLANTE & APPLICATIONS BIOTECHNOLOGIQUES" (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 1 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1., Version #1.3 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR : 1335 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc (ix) CARACTERISTIQUE (A) NOM/CLE : ADNc de la phytase de mais (B) EMPLACEMENT : 32..1192 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO: 1 ATCCATCCTT ATTGAGCTTA GTGTTTGATC C ATG GAC TCG GAA GGA GTA GCA 52 Met Asp Ser Glu Gly Val Ala 1 5 GCA AAG GTG GCA GAT GAG ACT ACT AAA CCG GCA AGC CAA GAA GAC GGC 100 Ala Lys Val Ala Asp Glu Thr Thr Lys Pro Ala Ser Gin Glu Asp Gly 10 15 20 GAG AGC AAG GCC GGG ATG ACT GAT CTG CTG ATG CTG ACC GAC AAG TCG 148 Glu Ser Lys Ala Gly Met Thr Asp Leu Leu Met Leu Thr Asp Lys Ser 25 30 35 CAG CTG CAG GCG CTA GCG ATG CTG CTG CGG AAC AAC GAG GAG CTC ATG 196 Gin Leu Gin Ala Leu Ala Met Leu Leu Arg Asn Asn Glu Glu Leu Met 40 45 50 55 ATG AGC CAA GCG ATC AAG TCG GAG ACG GAG CGC GTT GAG TAC CTC AAG 244 Met Ser Gln Ala île Lys Ser Glu Thr Glu Arg Val Glu Tyr Leu Lys 60 65 70 ACG GTG AGC GAC TGC TAC ACG CGG ACA ATG AAG CTC CTT GAC GAC TCC 292 Thr Val Ser Asp Cys Tyr Thr Arg Thr Met Lys Leu Leu Asp Asp Ser 75 80 85 ATG GCC GCC AGG ATC ACG TAC GAG CGT TCG GGC GGA ACG AGG AGC CTC 340 Met Ala Ala Arg île Thr Tyr Glu Arg Ser Gly Gly Thr Arg Ser Leu 90 95 100 GTC GCC CGG GAC ATG GAC GAC TAC GTC GTC TAC GGC CTC AAC GCG TGC 388 Val Ala Arg Asp Met Asp Asp Tyr Val Val Tyr Gly Leu Asn Ala Cys 105 110 115 TTG CAG AAC GTC CGC AAC TGC TGC GTG CGT CTG GAC GCC ATC GAC AAG 436 Leu Gîn Asn Val Arg Asn Cys Cys Val Arg Leu Asp Ala île Asp Lys 120 125 130 135 CTG CGG GCG CAC TAC GAC GCC CTC GCC GAC GCC GTC GCC GAA CCG GCC 484 Leu Arg Ala His Tyr Asp Ala Leu Ala Asp Ala Val Ala Glu Pro Ala 140 145 150 GCC AAC GTC GAG GGC CTC GCC GCG GAG GCG TCC GAG TAC AAG GCC GCC 532 Ala Asn Val Glu Gly Leu Ala Ala Glu Ala Ser Glu Ïyr Lys Ala Ala 155 160 165 ATG TGG CAG TAC TGC TAC AAC CAG CGG AGC GCC TCC GCG CGG GCG CAC 580 Met Trp Gîn Tyr Cys Tyr Asn Gln Arg Ser Ala Ser Ala Arg Ala His 170 175 180 TCC CGC GCC TAC TCC CAG GCG CTC AAG CTG GAG GGC ATC GAC TTC GCC 628 Ser Arg Ala Tyr Ser Gîn Ala Leu Lys Leu Glu Gly Ile Asp Phe Ala 185 190 195 GAG CTT GTG CGG AGG CAC CAG CTC CGG CTC GGG TAC GGC AGC AAG GGC 676 Glu Leu Val Arg Arg His Gin Leu Arg Leu Gly Tyr Gly Ser Lys Gly 200 205 210 215 GAG GAG TTC GAG GAC CTG GAC GAC ACC CAG AAG CTG GAG GTG TAC AAC 724 Glu Glu Phe Glu Asp Leu Asp Asp Thr Gln Lys Leu Glu Val Tyr Asn 220 225 230 AGC ATC ATC GTC GAG TCG GGG CGG GCG GGG CTA CCG GTG CGG ATG TTC 772 Ser lie Ile Val Glu Ser Gly Arg Ala Gly Leu Pro Val Arg Met Phe 235 240 245 TCA TCG GGC CGC TCT GCC GGT GGC CCT AAG ATT GCA GCC ACG ACG TGG 820 Ser Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Pro Lys île Ala Ala Thr Thr Trp 250 255 260 GCG CAG GCG GTG AGC GTC TTC ATC ATG GCG GCG GGC AAC CTG GCG TGG 868 Ala Gln Ala Val Ser Val Phe île Met Ala Ala Gly Asn Leu Ala Trp 265 270 275 GAC GTG TTC ACC ACG GAG CAC GAG GTG GAG GCC ATC CTC AAG GGC AGC 916 Asp Val Phe Thr Thr Glu His Glu Val Glu Ala île Leu Lys Gly Ser 280 285 290 295 CTC AAC CTC CTG GCG GGG CTA GGG GGC TTC GCC GTG GAG GCC GTC GTC 964 Leu Asn Leu Leu Ala Gly Leu Gly Gly Phe Ala Val Glu Ala Val Val 300 305 310 GGC GCG GCT GTC ACC AAG GCG GTC GCA AAC GTC GCC GCC GGC GTC TTT 1012 Gly Ala Ala Val Thr Lys Ala Val Ala Asn Val Ala Ala Gly Val Phe 315 320 325 GCT TGC TCT CTC GCG GGC TTC GTC GTG GGC GCC ATC GCC GGG CTG ATC 1060 Ala Cys Ser Leu Ala Gly Phe Val Val Gly Ala Ile Ala Gly Leu île 330 335 340 TTC GTC GGC GTC AGC GGC CTC CTC ATT AAC CTC ATC ATC GGC TCC CCT 1108 Phe Val Gly Val Ser Gly Leu Leu île Asn Leu île île Gly Ser Pro 345 350 355 AGG AAG GTG CCT GAC ATG AGC AAG CTC ATG TTC CAC ACC GCC GTC ATG 1156 Arg Lys Val Pro Asp Met Ser Lys Leu Met Phe His Thr Ala Val Met 360 365 370 375 CCC GAT GGA ATG GCC CTT GCG TAT GCG GTA TCT CAT TAATTACTTA 1202 Pro Asp Gly Met Ala Leu Ala Tyr Ala Val Ser His 380 385 TTATCATCGC AGTCACTACC AATGCAACTG CTTCAGATCC TACTGTTGGA ACGCGTGTGG 1262 AAATAATAAA GCAATAATAA TAATTATTAT TGTAATAACA ATAATTATGA TATATTGATA 1322 ATGATTATAT ATC 1335 REVENDICATIONS 1/ Fragment d'acide nucléique codant pour une phytase de plante. 2/ Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une phytase de céréale. 3/ Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il code pour une phytase de maïs. 4/ Fragment selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment d'ADNc. 5/ Fragment d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence de nucléotides substantiellement telle que montrée dans l'identificateur de séquences (IDS) n" 1 codant pour une activité phytase. 6/ Fragment selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence codante allant du nucléotide n" 32 à 1192 de l'IDS n 1. 7/ Fragment selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence complète de 1335 nucléotides telle que montrée sur l'IDS n" 1. 8/ Fragment selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment d'ADN génomique. 9/ Fragment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence telle que représentée sur la Figure 4 ou 5. 10/Fragment caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence complémentaire, homologue ou complémentaire de l'homologue d'une séquence telle que selon l'une des revendications 5 à 9. 11/Fragment d'acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend de l'ADN génomique de la plante. 12/Fragment d'acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est constitué par de l'ADNc et comporte en outre une partie des fragments introniques de l'ADN génomique. 13/Promoteur d'un gène de phytase de plante. 14/Promoteur d'un gène de phytase de plante selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie du fragment allant du nucléotide n" 1 au nucléotide n" 2096 de la séquence telle que représentée sur la Figure 4. 15/Promoteur d'un gène de phytase de plante selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient tout ou partie du fragment allant du nucléotide n 1 au nucléotide n" 1328 de la séquence telle que représentée sur la Figure 5. 16/Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comporte un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 12, placé sous le contrôle de séquences régulatrices capables de commander l'expression de ladite phytase. 17/Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comporte un promoteur tel que défini dans l'une des revendications 13 à 15. 18/Cassette d'expression selon la revendication 16, caractérisée en ce que lesdites séquences régulatrices sont capables de commander l'expression spécifiquement dans un type particulier de tissu. 19/Procédé pour accroître la teneur en phytase d'une plante, caractérisé en ce qu'on transforme ladite plante avec un vecteur comportant une cassette d'expression selon l'une des revendications 16 à 18 dans laquelle lesdites séquences régulatrices sont capables de commander l'expression de ladite phytase dans ladite plante. 20/ Hôte végétal consistant en une plante ou organe végétal transgénique contenant une quantité accrue de phytase, caractérisé en ce que l'hôte végétal a été transformé avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 16 à 18. 21/ Plante transgénique selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle produit des semences transgéniques exprimant une quantité de phytases dans ses semences accrue. 22/Hôte végétal consistant en une plante ou organe végétal transgénique dans lequel la phytase de plante est exprimée dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire où cette enzyme n'est pas produite naturellement, caractérisé en ce qu'on a introduit une cassette d'expression selon la revendication 16 comportant des séquences régulatrices qui induisent une expression spécifique dans ladite partie de la plante ou ledit compartiment cellulaire. 23/Plante ou organe végétal selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisée en ce qu'il s'agit de céréales. 24/ Plante ou organe végétal selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit de maïs. 25/Semences sèches de plante selon l'une des revendications 20 à24. 26/Semences selon la revendication 25, caractérisées en ce qu'elles comportent une teneur globalement ou localement accrue en phytase obtenue par une expression spécifique dans la semence du fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 12. 27/ Farine de semences obtenue à partir d'une semence selon l'une des revendications 25 et 26. 28/Méthode de production de phytase, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de: a) transformation d'un hôte eucaryote ou procaryote, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme avec une cassette d'expression selon la revendication 16, comportant des séquences régulatrices capables de commander l'expression d'une quantité accrue de phytase dans l'hôte végétal ou le microorganisme respectivement b) culture du microorganisme transformé ou croissance de la plante transformée ; et c) extraction de la phytase de la culture de microorganismes ou des tissus végétaux transgéniques. 29/Phytase recombinante obtenue par le procédé de la revendication 28. 30/ Phytase selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle est un dimère ou un hétérodimère. 31/Anticorps dirigés contre la phytase de la plante selon la revendication 29. 32/Composition alimentaire comprenant des semences de plante selon l'une des revendications 25 et 26 ou une farine de semence selon la revendication 27. 33/Composition alimentaire comprenant une phytase de plante selon la revendication 29. 34/ Composition alimentaire selon la revendication 32 ou 33, caractérisée en ce que la plante est choisie parmi le blé, l'orge, le sorgho, le maïs et le pois. 35/Utilisation d'un fragment selon l'une des revendications 1 à 12 comme marqueur d'un phénotype lié à l'expression de la phytase. 36/Utilisation d'une phytase selon la revendication 29, pour l'extraction d'amidon à partir de grains de plantes et/ou pour la valorisation des eaux de trempage. 3 7/ Utilisation de semences contenant une phytase selon la revendication 26, pour l'extraction d'amidon à partir de grains de plantes et/ou pour la valorisation des eaux de trempage.