Brevet FR2748027A1 — publié le 19971031

Dérivés de la fluorescéine 4'-méthvl- substituée La présente invention concerne des procédés et des réactifs pour le dosage de ligands dans les liquides biologiques. En particulier, la présente invention concerne une nouveUlle classe de conjugués de la fluorescéine 4'- méthyl-substituée utiles comme traceurs dans des immunotitrages à polarisation de fluorescence. On peut déterminer les niveaux de substance active dans des échantillons de sérum par des immunotitrages compétitifs. Les immuno- titrages compétitifs pour la mesure de la concentration d'un analyte (aussi appelé ligand), telle qu'une substance active dans un échantillon sont fondés sur la compétition entre un ligand dans l'échantillon et un réactif marqué, appelé traceur, vis-à-vis d'un nombre limité de sites de liaison de récepteur spécifiques du ligand et du traceur. La concentration du ligand dans l'échantillon détermine la quantité du traceur qui se lie de façon spécifique à un anticorps. La quantité du conjugué traceur-anticorps produit peut être mesurée de façon quantitative et est inversement proportionnelle à la quantité du ligand dans l'échantillon. Des exemples de ligands ou substances actives dosables selon les procédés de la présente invention incluent les stéroides tels que l'estriol, l'hormone adrénocorticotropique (ACTH), I'estrone, le cholestérol, l'estradiol, le cortisol, la testostérone, la progestérone, l'acide chénodésoxycholique, la digoxine, l'acide cholique, la digitoxine, l'acide désoxycholique, les acides lithocholiques et les dérivés esters et amides de ces composés; des vitamines telles que la vitamine B12, l'acide folique, la thyroxine, la triodothyToxine, l'histamine, la sérotonine, des prostaglandines telles que la prostaglandine E(PGE), la prostaglandine YSUI 25.2.1997 2-- F(PGF), la prostaglandine A(PGA,,: des médicaments contre l'asthme tels que la théophylline; des médicaments contre les néoplasmes tels que la doxorubicine et le méthotrexate; des médicaments antiarythmiques, tels que la disopyramide, la lidocaïne, la procaïnamide, le propranolol, la quinidine, le N-acétyl-procainamide; des médicaments anticonvulsifs tels que le phénobarbital, la phénytoine, la promidone, l'acide valproïque, la carbamazépine, la flécanide, et l'éthosuximide; des antibiotiques tels que les pénicillines, les céphalosporines, l'érythromycine, la vancomycine, la gentamycine, l'amikacine, le chloramphénicol, la streptomycine, et la tobramycine; des médicaments anti-arthritiques, tels que des salicylates; des médicaments anti- dépressifs parmi lesquels des molécules tricycliques telles que la nortriptyline, l'amitriptyline, l'imipramine, et la désipraminne; et des substances semblables ainsi que les métabolites des substances précédentes. De plus, les substances actives peuvent comprendre des15 drogues d'intoxication telles que la morphine, l'héroïne, l'hydromorphone, l'oxymorphone, la méthadone, la codéine, l'hydrocodone, la déhydrocodéine, la dihydrohydroxycodéinone, le dextromethorphane, la phénazocine, la benzoyle ecgonine, les tétrahydro-cannabinoïdes (THC), les barbiturates, la benzodiazépine, le diéthylamide de l'acide lysergique (LSD), le 2 propoxyphène, la phéncyclidine, les amphétamines, la méthaqualone, et les métabolites de ces substances. On peut doser ces substances selon les procédés de la présente invention. De plus, on peut également doser des agents polluants pour l'environnement avec les procédés de la présente invention. Des exemples d'agents polluants pour l'environnement 2 comprennent des pesticides, des herbicides, des insecticides, des fongicides tels que les biphényles polychlorés (PCBs), l'atrazine, la simazine, le terbutryne, les s- triazines, l'amitrole, la trifluraline, la nortflurazone, la perméthrine, la cyperméthrine, le paraquat, l'alachlore, le métolachlore, le chlorsulfuron, les herbicides de phénylurée, l'aldrine, le chlordane, l'endosulane, le parathion, les dioxines, le 2-aminobenzimidazole, le pentachlorophénol, le benzo-c-pyrène. les hydrocarbures polyaromatiques (PAHs) et les métabolites de ces substances. La polarisation de fluorescence (FP) est bien connue dans le domaine des immunotitrages pour fournir un moyen quantitatif de mesure de la quantité du conjugué traceur-anticorps produit dans un immunotitrage compétitif (cf. Biochem. Biophys. Res. Comm. 5:299. 1961). En général, les techniques de polarisation de fluorescence sont fondées sur le principe qu'un composé marqué à la filuorescéine lorsqu il est excité par de la lumière -3 polarisée linéairement émet de la fluorescence à degré de polarisation inversement proportionnel a son taux de rotation. Dans les immunotitrages à polarisation de fluorescence (FPIA), la polarisation de fluorescence est une fonction reproductible de la concentration du ligand ou de la substance active, et convient ainsi aux dosages quantitatifs des concentrations de ligand ou de substance active dans le sérum pour le suivi d'une substance active. Quand on mélange un traceur, du sérum contenant des anticorps spécifiques pour la substance active à doser et du sérum de patients ne contenant pas de substance active, la plupart du traceur se lie aux anticorps. En conséquence, quand on excite le traceur lié avec de la lumière polarisée à 489 rnm, la lumière émise à 520 rnm reste fortement polarisée. En présence toutefois d'une substance active dans l'échantillon du patient, celle-ci entre en compétition avec le traceur pour se lier aux anticorps. Ainsi, une quantité plus grande du traceur reste non liée et la lumière émise est dépolarisée. Un FPIA selon la présente invention peut être n'importe quel type de FPIA automatisé ou manuel. De préférence on effectue le FPIA sur le système clinique automatique COBAS FARA II (Roche Diagnostic Systems Inc., Branchburg, N.J., USA) qui peut mesurer l'attachement de la a substance active marquée à la fluorescéine (le traceur) à des anticorps spécifiques (cf. Dandliker and Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5:299, 1961). Dans un FPIA, on peut quantifier les résultats en unités de millipolarisation (mP) à partir desquels, on peut tracer une courbe de 2 calibration et on peut déterminer l'intervalle de mesure. L'intervalle de mesure ou de variation du signal est la différence (ou delta) entre l'attachement maximum et l'attachement minimum mesurée en unités mP (delta mP) du traceur à l'anticorps lorsque la substance active libre entre en compétition avec le traceur lié pour les sites de liaison de l'anticorps. Un intervalle de mesure plus grand apporte une meilleure précision dans un FPIA. La polarisation de fluorescence diminue de façon régulière lorsque la concentration de l'analyte augmente. Plus grande est la valeur de l'intervalle de mesure, meilleure est la précision et la sensibilité de l'immunotitrage. On peut déterminer la concentration de la substance active dans l'échantillon par comparaison à une courbe de calibration de référence. Plusieurs dérivés de la fluorescéine à partir desquels des composés marqués à la fluorescéine, ou traceurs, peuvent être préparés, sont connus et disponibles commercialement. La majorité des dérivés de la fluorescéine sont dérivés de la position 5 ou 6 de la fluorescéine (appelés isomère I pour la position 5 et isomère II pour la position 6) et comprennent la 5 ou 6-N- hydroxysuccimidylcarboxyfluorescéine, la 5-aminométhylfluorescéine et la - ou 6-dichloro-1,3,5-triazin-2-ylaminofluorescéine (DTAF). Des dérivés de la fluorescéine synthétisés à partir de la position 4' de la fluorescéine sont également connus. Par exemple, la 4'-aminométhyl- o fluorescéine est utile comme nucléophile pour le couplage à des dérivés de substances actives ou ligands portant un groupe carboxylique (cf. les brevets américains Nos. 4'614'823 et 4510'251). Le groupe amine de la fluorescéine réagit avec un groupe carboxy d'un analyte pour former une liaison peptidique. Cependant, ce procédé ne permet pas d'attacher directement un noyau cyclique contenant un analyte à l'atome de carbone 4'-méthyle. La présente invention a donc pour objet de proposer un dérivé de fluorescéine apte à réagir directement avec les amines cycliques pour donner un relieur cyclique entre la molécule de fluorescéine et l'analyte. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet la préparation X d'un dérivé amélioré de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée modifié avec un groupe relieur qui peut être facilement conjugué à un ligand possédant un centre nucléophile. L'invention a également pour objet la préparation d'un dérivé de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée qui peut être facilement conjugué à un ligand modifié avec un groupe relieur possédant un centre 2 nucléophile. De plus, la présente invention a pour objet la préparation d'un dérivé de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée contenant un groupe sortant qui peut être facilement déplacé par un groupe amino, facilitant ainsi l'attachement de la fluorescéine à un dérivé de substance active. La fluorescéine 4'méthyl- substituée peut être modifiée avec un groupe amino, de préférence par réaction avec une amine cyclique. De façon alternative, le groupe amino peut constituer une partie d'un dérivé de substance active auquel on peut conjuguer la fluorescéine 4'-méthvl-substituée. de préférence un dérivé de substance active possédant un relieur cyclique contenant un groupe amine. L'invention a également pour objet d'apporter un dérivé de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée apte à être utilisé pour la préparation d'un traceur de la fluorescéine possédant un intervalle de mesure dynamique plus grand, de façon à permettre plus de précision et de sensibilité dans le FPIA. La présente invention concerne une nouvelle classe de dérivés de la fluorescéine de la formule X HO OOH I dans laquelle X est un groupe partant choisi parmi l'hydroxy, un halogène, et un ester sulfonique de formule -O-SO2-R, dans laquelle R est -C6H4-CH3 ou CH3. Un halogène est choisi parmi le chlore, le brome et l'iode, le chlore et le brome, et en particulier le chlore, étant préférés. Les dérivés de la fluorescéine de formule I sont utiles comme intermédiaires dans la synthèse de nouveaux réactifs qui peuvent être utilisés dans les immunotitrages à polarisation de fluorescence. La présente invention concerne aussi des conjugués substance active- fluorescéine contenant une relieur cyclique utilisables comme traceurs dans les immunotitrages à polarisation de fluorescence. La présente invention peut être plus facilement comprise en se référant aux figures suivantes. Les numéros utilisés ici après les composés correspondent aux numéros de composés apparaissant dans les Figures 1-9. La Figure 1 montre les formules des produits de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse de la 4'-hydroxyméthylfluorescéine: [rac-4'-(hydroxyméthyl)-3',6'-dihydroxyspiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]-xanthène]-3-one] (2) et la 4'pipérazinylméthylfluorescéine: -6 - [rac-3',6'-dihydroxy-4'-( 1-pipérazinylméthyl)spiro[isobenzofuran- 1(3H), 9'- [9H] xanthène]-3-one (4). La Figure 2 montre les formules des produits de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse de l'acide (5-[[[4-[4-[(3',6'- dihydroxy-3-oxospiro-[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'yl)méthyl]- 1- pipérazinyl]-carbonyl]amino]-2-propyl]pentanoïque (il), traceur FP de l'acide valproïque contenant un relieur cyclique. La Figure 3 montre les formules des produits de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse de l'acide rac-5-[[[3',6dihydroxy- 3-oxospiro[isobenzo-furan- 1(3H),9'[9H] xanthène]-6-yl)carbonyl]amino]-2- propylpentanoïque (_), traceur FP de l'acide valproïque contenant un relieur acyclique. La Figure 4 montre les formules des produits de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse de la (S)-4'-[4-[[4-(2- aminopropyl)-phényl)phényl]sulfonyl]- 1-pipérazinyl]méthyl]-3',6'- dihydroxyspiro-[isobenzofuran-1(3H)9'-[9H]xanthène]-3-one (épimères 1:1) (1), traceur FP de l'amphétamine contenant la pipérazine comme relieur cyclique. La Figure 5 montre les formules des produits de départ et des 2 intermédiaires impliqués dans la synthèse du [rac-4-[(3',6'-dihydroxy3- oxospiro[isobenzofuran- 1 (3H),9'-[9H]xanthène]-4'-yl)méthyl]-N-(4- hydroxyphényl)-gamma-oxo-l-pipérazinebutamide (2_), traceur FP de l'acétaminophène contenant un relieur cyclique. La Figure 6 montre les formules des produits de départ et des 2 intermédiaires impliqués dans la synthèse du [rac-4-[3',6'-dihydroxy- 3- oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'-yl)méthyl]amino]-N-(4- hydroxyphényl)-4-oxobutanamide (2), traceur FP de l'acétaminophène contenant un relieur acyclique. La Figure 7 montre les formules des produits de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse de la [(2S)-4'-[[4-[2-amino-3[4(4- hydroxy-3,5-diiodophénoxy)-3,5-diiodophényl]- 1-oxopropyl]- 1pipér- azinyl]méthyl]-3',6'-dihydroxyspiro[i sobenzofuran- 1(3H),9'[9H]xanthène]-3- one (épimères 1:1) (m), traceur FP de la thyroxine contenant un relieur cyclique. La Figure 8 montre les formules des matériaux de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse du [N-[[[1-[3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H)-9'-[9H]-xanthène]-4'-yl)méthyl]-4- pipéridinyl]méthyl]-5H-dibenzo[b,f]azépine-5-carboxamide (Z), traceur FP de la carbamazépine contenant un relieur cyclique. La Figure 9 montre les formules des matériaux de départ et des intermédiaires impliqués dans la synthèse du N-[(5H-dibenz[b,fjazépin-5- ylcarbonyl)méthyl]-N-3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H,9'- [9H]xanthène-5-yl]thiourée dihydrate (4Q), traceur FP de la carbamazépine 0 contenant un relieur acyclique. La présente invention concerne des dérivés de la fluorescéine nouveaux de la formule I définie ci-dessus. Dans cette dernière, X est de préférence l'hydroxy. Un dérivé de la fluorescéine intéressant est en effet la 4'- hydroxyméthyl-fluorescéine de formule OH HO O>0 > OH IL Ce composé a été obtenu par une réaction de Friedel-Crafts effectuée sur la fluorescéine avec utilisation du chlorométhylméthyl éther en présence d'acide méthanesulfonique (Figure 1). Selon un aspect de la présente invention, les nouveaux dérivés de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée peuvent être couplés à un relieur cyclique pour former des nouveaux traceurs substance active-fluorescéine selon l'invention. Par exemple, le dérivé de la fluorescéine 4'-méthylsubstituée a été 2 modifié pour v introduire un groupe partant hydroxy. On a effectué une réaction nucléophile sur le dérive 4-fluorescéine en utilisant une amine cyclique en présence d'une base organique pour donner un dérivé de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée avec un relieur cyclique de façon à obtenir un composé de formule C1, N-R1 N1 HO O OH OH HO'0 III dans laquelle R1 est H ou un dérivé de substance active, par exemple l'acide valproique ou un dérivé de l'acide valproïque tel que celui de formule O N H COOH On a ensuite fait réagir le conjugué de la fluorescéine 4'-méthyl- substituée avec une substance active pour donner les nouveaux traceurs substance active-fluorescéine de la présente invention. Comme démontré ci-dessous, les dérivés nouveaux de la fluorescéine 4'méthyl-substituée de la présente invention constituent un réactif utile dans la préparation de conjugués fluorescéine-substance active. Il est inhabituel pour un groupe hydroxyle d'être substitué par un nucléophile. De façon étonnante, le groupe hydroxy dans la position C-4' peut être déplacé par certains nucléophiles comme décrit ci-dessous. L'incorporation d'un bras relieur cyclique dans le groupe méthyle du C- 4' fournit un plus grand intervalle de mesure dans les immunotitrages à polarisation de fluorescence, ce qui apporte une meilleure précision et une sensibilité plus élevée. En conséquence, les traceurs contenant un bras relieur cyclique sont des réactifs supérieurs dans le FPIA. Selon un mode de réalisation, une réaction nucléophile a été effectuée sur la 4'-hydroxyméthyl-fluorescéine en utilisant le t-butyl-l- pipérazine- -9- carboxylate en présence de 2,6-lutidine dans du diméthylformamide (DMIF), et de l'iodure de sodium à 130-140 C pour donner de l'acide rac-4-(3',6'- dihydroxy-3-oxospiro-[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène-4'yl]méthyl)1- piperazinecarboxylique-1,1-diméthyléthyl ester (3) (Figure 1). La déprotection du groupe t-butyl-carbamate (t-Boc) à l'aide d'acide trifluoroacétique a donné la 4'-pipérazine méthyl-fluorescéine (A) de formule N H N\_nj HO O OH IV. La 4'-pipérazine-méthyle fluorescéine peut être conjuguée à un ligand ou une substance active pour former un traceur FP. Par exemple, la 4'- pipérazineméthylfluorescéine a été utilisée pour préparer un traceur FP de l'acide valproïque contenant un relieur cyclique (Figure 2). La pipérazinyl- méthyl-fluorescéine a été couplée à un dérivé de l'acide valproïque (9) de façon à former un dérivé de l'urée (.Q). La déprotection du groupe t- Boc dans l'acide trifluoroacétique a fournit le traceur de l'acide valproïque contenant un relieur cyclique, l'acide 5-[[[4-[(3',6'-dihydroxy-3oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'-yl)méthyl] - 1-pipérazinyl]carbonyl]amino]-2- propylpentanoïque (Li), de formule OH COOH OH O - v 5 0 V - 10- Le conjugué substance active-fluorescéine de l'acide valproiïque contenant un relieur acyclique, l'acide rac-5-[[[3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'[9H] xanthène]-6-yl)carbonyl]amino]-2- propylpentanoique (13), a aussi été préparé (Figure 3). Le 6-carboxy-N- hydroxysuccinimide ester a été couplé avec le dérivé de l'acide valproique possédant une fonctionalité amino. La déprotection du groupe t-Boc dans l'acide trifluoroacétique a fourni le traceur de l'acide valproïque sans relieur cyclique. Deux traceurs de l'acide valproïque, l'acide 5-[[[4-[(3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H] xanthène]-4'-yl)méthyl]- 1-pipéra- zinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentanoïque (1_) et l'acide rac-5-[[[3',6'- dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'[9H] xanthène]-6-yl)carbonyl] amnino]-2-propylpentanoïque (1_), ont été évalués sur l'analyseur chimique COBAS FARA II en utilisant des anti-sérums polyclonaux (réactif COBAS-FP No. 44065). L'intervalle de mesure (delta mP) observé dans la courbe de calibration était plus élevé pour le traceur contenant le relieur cyclique (146 mP) que pour le traceur contenant le relieur acyclique (121 mP). Le dérivé de la fluorescéine réagit directement avec les amines cycliques pour donner un relieur cyclique entre la molécule de fluorescéine O et l'analyte. Ce type d'arrangement moléculaire empêche plus de liberté de rotation du conjugué substance active-fluorescéine possédant le relieur cyclique après son attachement à l'anticorps, ce qui fournit un plus grand intervalle de mesure que pour le conjugué substance active-fluorescéine préparé en l'absence de relieur cyclique. Le nouveau traceur avec le relieur 2 cyclique a montré une partie dynamique améliorée de la courbe d'étalonnage et une polarisation accrue pour un usage dans le FPIA. La présente invention concerne un dérivé de la fluorescéine 4'-méthyl- substituée couplé directement à une substance active modifiée avec un relieur cyclique pour donner des nouveaux conjugués substance active- fluorescéine de formule générale - 11 - zY-Q HO, O OH VI dans laquelle Y est un relieur cyclique choisi parmi la pipérazine, l'homopipérazine, la 4-aminométhylpipéridine, la 4- carboxypipéridine, la proline et la 3-carboxydihydropyridine, et Q est une substance active, un agent thérapeutique, ou un agent polluant pour l'environnement comme décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré, Y est choisi parmi la pipérazine, l'homopipérazine et la 4-aminométhylpipéridine, et Q est une substance active choisie parmi la thyroxine, l'acétaminophène, l'amphétamine, et la carbamazépine. De préférence, Y est la pipérazine et Q l'amphétamine ou l'acétaminophène, ou Y est l'homopipérazine et Q est la thyroxine, ou Y est la 4-aminométhylpipéridine et Q est la carbamazépine. En général, le procédé pour coupler le dérivé de la fluorescéine 4'- méthyl-substituée, de préférence la 4'-hydroxyméthylfluorescéine, à une substance active contenant un relieur cyclique choisi parmi la pipérazine, l'homopipérazine, ou la pipéridine, comprend la réaction de la 4'hydroxy- méthylfluorescéine avec une substance active ou ligand contenant un relieur cyclique en présence de 2,6-lutidine et d'iodure de sodium dans du diméthylformamide, à une température de 120 C à 140 C. On a synthétisé un traceur FP de l'amphétamine contenant un relieur pipérazine à l'aide d'un dérivé de l'amphétamine contenant un noyau pipérazine, le (S)-2,2,2-trifluoro-N-[l-méthyl-2-[4-(1-pipérazinyl- sulfonyl)phényl]éthyl]- acétamide (1 7), que l'on l'a fait réagir avec la 4'- hydroxy-méthylfluorescéine en présence de 2,6-lutidine et d'iodure de sodium dans du diméthylformamide à 120 C. On a ainsi obtenu du (S)-N-[2- [4-[[4-[(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'[9H]xanthène]-4'- yl)méthyl]- 1-pipérazinyl]sulfonvl]phényl]- 1méthyléthyl]-2,2,2- - 12 - trifluoroacétamide, comme mélange d'épimères 1:1 18) (Figure 4). Lors de la déprotection par de la méthylamine dans de l'éthanol, on a obtenu le dérivé de l'amphétamine (S)-4'-[[4-( 2-aminopropyl;phényl]-sulfonyl]-1- pipérazinyl]- méthyl]-3',6'-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H)-9'- [9H]xanthène]-3-one (épimères 1:1) (19). Pour la synthèse du traceur FP de l'acétaminophène comprenant un relieur pipérazine, on a utilisé le pnitrophénol comme produit de départ et on l'a converti en méthoxyéthoxyméthyléther (L) (Figure 5). Le nitrophénol protégé a été réduit en amino en présence de formate d'ammonium et de io 10% de Pd-C dans de l'éthanol pour donner de la 4-[(2-méthoxy- éthoxy)méthoxy]benzamine (22). Le groupe amino a été succinylé et le dérivé acide obtenu a été couplé à la pipérazine. Le dérivé de l'acétaminophène contenant le groupe pipérazine a été couplé à la 4'-hydroxyméthyl- fluorescéine, ce qui a été suivi par la déprotection du méthoxyéthoxyméthyl- éther en présence d'acide trifluoroacétique pour former le rac-4-[(3',6'- dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H] xanthène]-4'-yl)méthyl]N- (4-hydroxyphényl)-gamma-oxo-1-pipérazinebutamide (2). Pour la synthèse d'un traceur FP de l'acétaminophène possédant un relieur acyclique, on a déprotégé le p-nitrophénol comme méthoxyéthoxy- 2 méthyléther (Figure 6). On a réduit le groupe nitro en un groupe amino en présence de formate d'ammonium et de 10% de Pd-C dans de l'éthanol pour obtenir la 4-[(2-méthoxy-éthoxy)méthoxy]benzènamine (22). On a succinylé le groupe amino et couplé le dérivé acide produit à la 4'-aminométhyl- fluorescéine. La déprotection du méthoxyéthoxyéther (27) en présence 2 d'acide trifluoroacétique a donné le rac-4-[[[3',6'-dihydroxy-3oxospiro- [isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H] xanthène]-4'-yl)méthyl]amino]-N-(4- hydroxyphényl)-4-oxobutamide (28). On a évalué les performances des deux traceurs FP de l'acétaminophène sur un analyseur chimique COBAS FARA II à l'aide d'anticorps polyclonaux (lot No. P34, Binding Site, Californie, USA). Les résultats de la comparaison des courbes de calibration générées par les traceurs FP de l'acétaminophène à partir de la position 4'- de la fluorescéine contenant des relieurs cycliques et acycliques, ont été obtenus à l'aide d'un protocole de titrage tel que 3s celui décrit dans l'Exemple 31 et sont exposés dans le tableau I cidessous. - 13- TABLEAI I Calibrateur Traceur de Traceur de quantité l'acétaminophène l'acétaminophène d'acétaminophène comportant un comportant un libre relieur cyclique 26 relieur acyclique 28 mP mP 0 gg/ml 273,9 208 pg/ml 235,4 182 gg/ml 217,6 158 g/ml 177 135 lg/ml 117,2 96 intervalle de 156,7 112 mesure (delta mP) Comme le montre le Tableau 1, le traceur de l'acétaminophène comportant le relieur cyclique, le rac-4-[(3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène]4'-yl)méthyl]-N-(4hydroxyphényl)-gamma-oxo-l-pipérazinebutamide (20), présente un intervalle de mesure plus élevé (156,7 mP) et est en conséquence plus polarisé que le traceur d'acétaminophène comportant le relieur acyclique, le rac4-[[[3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'[9H]xanthène]4'- 1o yl) méthyl]amino]-N-(4-hydroxyphényl)-4-oxobutamide (2) (112 mP). Ce résultat montre que le traceur comportant un relieur cyclique permet de meilleures sensibilité et précision dans le FPIA. Pour la synthèse d'un traceur FP de la thyroxine contenant comme relieur l'homopipérazine, on a traité de la thyroxine avec du di-t-butyl- dicarbonate pour donner le dérivé de la thyroxine (30) (Figure 7). On a activé le groupe carboxy du dérivé de la thyroxine (X) en un n-hydroxy- succinimide ester et on l'a couplé à l'homopipérazine. Le dérivé de la thyroxine contenant le groupe homopipérazine (31) a été conjugué à la 4'hydroxyméthyl fluorescéine. Après déprotection, on a obtenu de la (2S)-4'-[4'- - 14 - [[4-[2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophénoxy)-3,5-diiodophenyl]- 1- oxopropyl]- 1-pipérazinyl]méthyl] -3',6'-dihydroxyspiro-[isobenzofuran- 1(3H)9'-[9H]xanthène]-3-one (épimères 1:1) (a). On a évalué le traceur de la thyroxine par FPIA sur l'analyseur chimique COBAS FARA II a l'aide d'un anticorps monoclonal (réactif COBAS FP No. 46200) et un protocole de titrage semblable à celui montré dans l'Exemple 31. Le tableau 2 ci-dessous expose les données générées pour la courbe de calibration à l'aide du nouveau traceur de la thyroxine contenant un relieur cyclique. ii TABLEAU 2 Calibrateur Traceur de la Thyroxine, 33 Quantité de thyroxine libre mP 0.0 g/ml 266,8 3. 0 pg/ml 254,9 6.0 gg/ml 237,9 12 gg/ml 202,8 18 pg /ml 167,1 24 pg /ml 133,5 Intervalle de mesure 133,3 (delta mP) Comme le montre le Tableau 2, la polarisation de fluorescence du nouveau traceur de la thyroxine décroit proportionnellement lorsque la concentration du calibrateur de thyroxine augmente, ce qui génère une courbe de réponse de référence adaptée au dosage quantitatif de la thyroxine dans l'échantillon. Ainsi, ce traceur FP de la thyroxine est un réactif efficace dans le FPIA. Pour la synthèse du traceur de la cabamazépine contenant le relieur cyclique pipéridine, on a couplé le chlorure de N-carbamoyle ( à la 4- aminométhylpipéridine de façon à obtenir un dérivé de la carbamazépine 15- contenant un groupe pipeéridine (36) (Figure 8). Ce dérivé de lacarbamazépine a été conjugué à la 4'-hydroxyméthylfluorescéine pour donner un traceur FP de la carbamazépine contenant un relieur cyclique, le N-[[1-[(3',6'-di-hydroxy-3-oxospiro-[i sobenzofuran- 1 ( 3H)-9'-[9H]xanthène]-4'- yl)méthyl]-4-pipéridinyl]méthyl]-5 H-dibenzo[b,f] azépine-5-carboxamide (_). En plus de la présence d'un relieur cyclique entre la fluorescéine et la substance active, le positionnement du bras relieur à côté du noyau phénolique induit de la chiralité, ce qui a pour conséquence d'empêcher la rotation de l'ensemble substance active-fluorescéine, et par là d'améliorer la ID portée dynamique de la courbe de calibration dans le FPIA. La préparation d'un traceur FP de la carbamazépine possédant un relieur acyclique est illustrée dans la Figure 9. On a fait réagir de l'iminostilbène avec du bromure de l'a-bromoacétyle pour fournir le dérivé bromé (38). On a fait réagir ce dernier avec de l'ammoniac et de l'iodure de sodium de façon à obtenir le dérivé de la carbamazépine contenant un groupe amino (M3). Ce dernier a été couplé au 5- fluorescéinisothiocyanate et a fournit le traceur de la carbamazépine comportant un relieur acyclique, le N-[(5H-dibenz[b,f]azépin-5-ylcarbonyl)méthyl]-N'-3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène-5-yl]thiourée dihydrate (. Q). 2D On a évalué les traceurs de la carbamazépine par FPIA à l'aide d'un protocole de titrage semblable à celui montré dans l'Exemple 31 en utilisant des anticorps polyclonaux (Réactif COBAS-FP No. 46206). La comparaison des courbes de calibration générées par les traceurs FP de la carbamazépine contenant des relieurs cyclique et acyclique est exposée dans le Tableau 3. - 16- TABLEAUL3 Calibrateur, Traceur de la Traceur de la Concentration de Carbamazépine Carbamazépine carbamazépine comportant un comportant un libre relieur cyclique 37 relieur acyclique 40 mP mP O 4g/ml 311,5 262,8 1,25 jg/ml 292,3 241,8 10.g/ml 263,7 217,4 eg/ml 221,6 185,8 pg/ml 183,1 151,8 g/ml 144,5 126,4 Intervalle de 167 135,9 mesure (delta mP) Les données du Tableau 3 indiquent que la présence d'un relieur cyclique dans le traceur de la carbamazépine 40 substituée à partir d'un des noyaux phénoliques de la fluorescéine fournit une polarisation accrue (intervalle de mesure de 167 mP) par rapport au traceur FP de la carbamazépine comportant un relieur acyclique dérivé de la position 5 de la fluorescéine (différence de signal de 135.9 mP) ce qui permet une meilleure sensibilité et une meilleure précision dans le FPIA. Exemples Les exemples ci-après illustrent de façon non-limitative la synthèse de nouveaux dérivés de la fluorescéine 4'-méthyl-substituée selon l'invention et un protocole d'immunotitrage à polarisation de fluorescence. Les numéros des composés dans les titres et dans les exemples 1 à 30 se réfèrent aux15 formules structurelles montrées dans les Figures 1 à 9. - 17 - Tous les solvants utilisés ont été obtenus de Fisher Scientific (Springfield, NJ, USA), sauf indications contraires. Les plaques de gel de silice 60 F254 pour la chromatographie sur couche mince et le gel de silice pour la chromatographie sur colonne ont été obtenus de E.M. Science (Gibbstown, NJ., USA). La 6-carboxyfluorescéine et le 4'aminométhylfiuorescéine acide chlorhydrique ont été achetés à Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide (EDC), la L-thyroxine et le d-amphétamine sulfate ont été achetés à Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). L'éthyl 4- bromobutyrate et le di-t-butyl dicarbonate ont été obtenus de Fluka (Suisse). Toutes les autres substances chimiques ont été obtenues de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA). ExemDle 1 Préparation de la rac-4'-(hvdroxvméthvl)-3'.6'-dihvdroxvs-Diro- risobenzofuran-1(3H).9'-r9H]xanthènel-3-one (2). On a ajouté à une solution de 50 mg (0,15 mmol) de fluorescéine dans 0,3 ml d'acide méthanesulfonique, 13 gl (0,16 mol) de chlorométhylméthyl- éther à température ambiante. On a agité le mélange à température ambiante pendant 48 heures. On a versé le mélange réactionnel dans 10 ml 2 d'eau glacée. On a filtré le solide jaune-orange précipité. On a purifié le produit brut par chromatographie sur couche mince préparative (gel de silice, 2 rmm) en utilisant du chloroforme/méthanol/toluène 8/1/1 pour donner 20 mg (37%) de rac-4'-(hydroxyméthyl)-3',6'-dihydroxyspiro- [isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène]-3-one (2). Les données RMN 2 (Résonnance Magnétique Nucléaire), IR (Spectrométrie Infra-rouge), et SM (Spectrométrie de Masse), ont confirmé l'identité du produit. Pour confirmer l'identité struturale du composé (a), on a dérivé de ce composé le triacétate correspondant. Les données RMN, et SM ont confirmé l'identité du triacétate. L'hydrolyse du triacétate a fourni le produit (2). Exemple 2 Préparation de l'acide rac-4-(3'.6'-dihvdroxv-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H).9'-r9Hlxanthène-4'-vllméthvl)- 1-Dipérazinecarboxvliaue 1.1- diméthvléthvl ester (3) A une solution de 25 mg (0,065 mmol) de rac-4'- hydroxyrnéthyl)-3',6'- dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3HI.9-[9H]xanthène]-3-one dans 2 ml de 18- diméthylformamide anhydre, on a ajouté 50 mg (0,26 mmol) de t-butyl- pipérazinecarboxylate, puis 100 1 (0,85 mmol) de 2,6-lutidine et 100 mg (0,66 rmmol) d'iodure de sodium. On a chauffé le mélange à 120 C pendant 3 heures et on l'a laissé refroidir à température ambiante. On a concentré le mélange réactionnel sous pression réduite. On a purifié le résidu 2 fois par chromatographie sur couche mince à l'aide de chloroforme/méthanol 7/3 comme éluant pour donner 10 mg (0,018 mmol, 30%) de l'acide rac-4-(3',6'- dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H)-9'-[9H]xanthène-4'-yl]méthyl)1- pipérazinecarboxylique 1,1-diméthyléthyl ester (O) comme poudre orange- rouge. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 3 Préparation de la rac-3'.6'-dihvdroxv-4'(1-pipérazinvlméthyl)- snirofisobenzofuran- 1(3H).9'-r9Hlxanthènel-3-one (4) On a agité à température ambiante pendant 15 minutes, un mélange de 40 mg (0,75 mmol) de l'acide rac-4-(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène-4'-yl]méthyl-1-pipérazinecarboxylique 1,1- diméthyléthyl ester (3) dans 5 ml d'acide trifluoroacétique. On a concentré le mélange sous pression réduite. L'acide trifluoroacétique résiduel a été éliminé par codistillation avec 3 X 5 ml de toluène. On a purifié le produit X brut restant par chromatographie sur couche mince à l'aide de 1% de triéthylamine dans du méthanol pour obtenir 20 mg (0,46 rmmol, 63%) de rac- 3',6'-dihydroxy-4'-( 1-pipérazinylméthyl)spiro[isobenzofuran- 1(3H),9'- [9H]xanthène-3-one (O), comme solide orange. Les données RMN, IR, et SM * ont confirmé l'identité du produit. Exemple 4 Prénaration de la tétrahvdro-3-proovlhvridine-2(1H)-one (6). On a refroidi à -78 C sous atmosphère d'argon une solution de 4,2 g (42, 3 mmol) de 8-valérolactame (a) dans 35 ml de tétrahydrofurane. A cette solution réfrigérée, on a ajouté goutte à goutte pendant une durée de 40 minutes, 32 ml de n-BuLi (solution 2,5 M dans l'hexane, 80 mmol). On a réchauffé le mélange réactionnel à température ambiante et on l'a agité pendant 2 heures. On a refroidi le mélange réactionnel à 0 C et on a ajouté une solution de 3,87 ml (42,5 mmol) de 1-bromopropane dans 20 ml de tétrahydrofurane. On a réchauffé le mélange réactionnel à température ambiante et on l'a agité pendant 16 heures. On a traité le mélange - 19réactionnel avec 75 ml d'eau et on l'a concentré pour éliminer le tétrahydrofurane. On a extrait le résidu avec 3 X 200 ml de diéthyléther. On a combiné les fractions organiques, lavé avec de la saumure, séché au MgSO4 et concentré de façon à obtenir un solide blanc qui a été recristallisé à partir d'éther de pétrole pour donner 3,2 g (22,6 mmol, 54%) de tétrahydro-3- propylpyridin-2(1H).one (fi). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 5 Préparation de l'acide rac-5-amino-2-proovlpentanoiaue mono acide chlorhvdrioue (7) Un mélange de 2,0 g (14,1 mmol) de tétrahydro-3-propylpyridin-2(1H)- one (fi) et 10 ml d'acide chlorhydrique 6N a été chauffé sous reflux pendant 6 heures, refroidi à température ambiante et concentré sous pression réduite. Le résidu a été codistillé avec 2 X 50 ml de toluène pour donner 1,9 g (11,9 mmol, 84%) d'acide 5-amino-2-propylpentanoïque mono acide chlorhydrique (.) comme huile jaune pâle. Les données RIMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemole 6 Préparation de l'acide rac-5-amino-2-oro vloentanoiïaue 1.1- 2 diméthvléthvl ester (8) A une solution refroidie de 7 ml de dioxane, on a ajouté 0,7 ml d'acide sulfurique concentré goutte à goutte. La solution a pris une couleur pourpre. A cette solution, on a ajouté doucement 700 mg (3,5 mmol) d'acide 5amino-2- propylpentanoïque mono acide chlorhydrique (_) et on a transféré la solution 2 obtenue dans une bouteille à pression. A cette solution, on a ajouté 12 ml d'isobutylène et on a agité de façon magnétique lentement la solution sous pression à température ambiante pendant 20 heures. On a refroidi le récipient réactionnel dans de la glace sèche, relâché la pression et chauffé le mélange réactionnel jusqu'à température ambiante pour vaporiser l'isobutylène en excès. On a versé le mélange réactionnel dans 100 ml d'eau froide. On a extrait la partie aqueuse avec 2 X 150 ml d'éther, basifié avec l'hydroxyde de sodium 4N jusqu'à un pH de 10, et extrait avec 3 X 100 ml d'éthylacétate pour donner 380 mg 1,76 mmol, 49c%) d'acide rac-5-amino-2- propylpentanoiïque 1,1-diméthylester (8) comme huile. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. - 20 - ExemDle 7 Préparation de l'acide rac-5-rrf(4-nitroohénoxv'carbonvllamino]-2- proovIlpentanoïiue- 1.1-diméthvléthvlester (9) A une suspension de 160 mg (0,74 rneol) d'acide rac-5-amino-2- propylpentanoïque-1,1-diméthyléthylester (a) dans 1 ml d'eau et i ml de dichlorométhane, on a ajouté 153 mg (0,76 mmol) de 4-nitrophénylchloro- formate et 267 mg de bicarbonate de sodium à 0 C. On a agité le mélange à température ambiante pendant une nuit et on l'a dilué avec 50 ml de dichlorométhane et 30 ml d'eau. On a séparé la phase organique. La phase aqueuse a été extraite avec 2 X 50 ml de dichlorométhane. Les phases organiques ont été combinées et lavées avec 2 X 50 ml de bicarbonate de sodium 5%, puis 50 ml d'eau, séchées sur MgSO4 et concentrées. On a purifié le résidu par chromatographie sur couche mince à l'aide d'éthylacétate/hexane 1/1 comme éluant pour obtenir 185 mg (0,48 mmol, 66%) d'acide rac-5-[[(4-nitrophénoxy)carbonyl]amino]-2propyl]pentanoïque- 1,1-diméthyléthylester (9), comme solide blanc cassé. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 8 Préparation de l'acide 5-rrr4-[(3'.6'-dihvdroxv-3-oxospirofisobenzofuran- 1(3).9'-f9Hlxanthènel-4'-vl)méthvll- 1-Dioérazinvllcarbonvllaminol-2- oronvloentanoïaue- 1.1-diméthvléthvl ester (10) A 20 mg (0,052 mmol) de (O, on a ajouté 1 ml de pyridine et 1 ml de diméthylformamide sec. On a ajouté à la solution obtenue 26 mg (0,068 mmol) d'acide rac-5-[[(4-nitrophénoxy)carbonyl]amino]-2propylpentanoïque- 1,1-diméthyléthyl ester (). On a chauffé le mélange obtenu dans un bain d'huile à 120 C pendant 30 minutes. On a refroidi le mélange réactionnel à la température ambiante et on l'a concentré sous pression réduite. Le résidu résultant a été purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide d'éthylformate/chloroforme 1/1 comme éluant pour donner 10 mg (0,01430 rmmol, 28%) d'acide 5-[[[4-[(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3),9'- [9H]xanthène]-4'-yl)méthyl]- 1-pipérazinyl]carbonyl]-amino]-2propylpentanoïque-1,1-diméthyléthyl ester (10). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. - 21 - Exemple 9 Préparation de l'acide 5-rrr4-r(3'.6'-dihvdroxv-3-oxospirofisobenzofuran- 1(3H).9'-r9Hlxanthènel-4'-vllméthvll-p1-ipérazinvllcarbonvllaminol-2- DroovlDentanoïoue (11) On a ajouté 2 ml d'acide trifluoroacétique à 15 mg (0,022 mmol) d'acide -[[[4-[(3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran1(3H9,9'-[9H]xanthène]-4'- yl)méthyl]- 1-pipérazinyl]carbonyllaminno-2-propylpentanoïque-1, 1diméthyl- éthyle ester (1). Le mélange a été agité à température ambiante pendant 15 minutes. Le mélange réactionnel restant a été concentré et purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide d'éthylacétate/méthanol 10/2 comme éluant pour donner 8 mg (0,013 mmol, 61%) d'acide 5-[[[4-[(3',6'- dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]-xanthène]-4'yl)méthyl]-1- pipérazinyl]carbonyl]amino]-2-propylpentanoïque (11). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemole 10 Prénaration de l'acide rac-5-r[(3'.6'-dihvdroxv-3-oxosoirorisobenzofuran- 1(3H).9'-r9H]xanthènel-6-vl)carbonvllaminol-2-oropvlpentanoïaue (13) On a refroidit à 0 C une solution de 50 mg (0,13 mmol) de 6-carboxy- fluorescéine dans 1 ml de diméthylformamide. On a ajouté à cette solution 40 2 mg (0,19 mrnol) de dicyclohexylcarbodiimide, puis 30 mg (0,26 mmol) de N- hydroxysuccinimide. On a agité le mélange à 4 C pendant 24 heures et on l'a ajouté goutte à goutte à une solution de 50 mg (0,23 mmol) de (O) dans 1 ml de pyridine et 0,3 ml de diméthylformamide sec. On a agité le mélange à température ambiante pendant 6 heures et on l'a concentré. On a purifié le 2 résidu par chromatographie sur couche mince préparative à l'aide d'éthylacétate/chloroforme 6/4 pour donner 80 mg d'acide rac-[[[3',6- dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-(9H)-xanthène]-6-yl)carbonyl]- amino]-2-propyl]-pentanoïque-1,1-diméthyléthyl ester (12). A 80 mg de (1), on a ajouté 3 ml d'acide trifluoroacétique et on agité le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. On a concentré le mélange réactionnel et on l'a purifié par chromatographie sur couche mince préparative (silice, 0,25 mm) pour obtenir 42 mg (0,081 mmol, 62%) d'acide rac-5-[[(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'[9H]xanthène]-6- yl)carbonyl]amino-2-propyl pentanoique 113). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. - 22 - Exemple 1 1 Préparation du (S)-N-( 1-méthvl-2-phénvléthvl)-trifluoroacétamide (15) On a traité une suspension de 10 g de d-amphetamine sulfate (14) dans ml de dichlorométhane avec 54 ml d'hydroxyde de sodium 1N. La phase organique a été séparée et la phase aqueuse extraite avec 2 X 100 ml de dichlorométhane. Le pH de la phase aqueuse était d'environ 7. On a ajouté 5 ml d'hydroxyde de sodium IN à la phase aqueuse. On a ensuite extrait la phase aqueuse avec 2 X 50 ml de dichlorométhane. On a combiné toutes les phases organiques et on les a lavées avec 100 ml de saumure, séché sur du MgSO4 et concentré pour donner 6,6 g de base libre amphétamine. A une solution de 6,6 g (48,8 mmol) de base libre amphétamine dans 50 ml de dichlorométhane distillé, on a ajouté 40 ml d'anhydride trifluoroacétique goutte à goutte pendant une période d'une heure sous atmosphère d'argon à 0 C. On a agité le mélange à température ambiante pendant 18 heures. Au mélange réactionnel, on a ajouté 1 g de glace et 250 ml d'éther. On a lavé la phase organique avec 2 X 100 ml d'eau, 100 ml d'acétate de sodium saturé, puis 100 ml d'eau. Ensuite on a séché sur MgSO4 pour obtenir 8,35 g (36,7 mmol) 74%) du (S)-N-(1- méthyl-2-phényléthyl)trifluoroacétamide (Xj). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. a) Exemple 12 Préparation du chlorure de (S)-4-r2-f(trifluoroacétvl)aminol]ronvll- benzènesulfonyle (16) A une solution de 2,0 g (8,64 mmol) de (S)-N-(1-méthyl-2-phényl-éthyl)- trifluoroacétamide (_.) dans 200 ml de chloroforme, on a ajouté 24 ml d'acide chlorosulfonique goutte à goutte à 0 C. On a agité le mélange à 0 C pendant 4 heures. On a versé le mélange réactionnel dans 100 ml d'eau glacée et on l'a extrait avec 3 X 200 ml de chloroforme. Les phases organiques ont été combinées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et évaporées pour donner 2, 58 g (7,82 mmol, 90%) de chlorure de (S)-4-[2[(trifiuoroacétyl)-3D amino]propyl]benzènesufonyle, comme solide blanc. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 13 Préparation de I S)-2.2.2-tri fl uorn-N-r 1 n-mnéthvl-2-f4-1 1inérazinvl- sulfonvl)Dhénvlléthvllacétamide ( 17, - 23 - A 856 mg (9,9 mmol) de pipérazine. on a ajouté 40 ml de tétrahydrofurane fraîchement distillé, puis 850 41(6,09 mmol) de triéthylamine. On a agité le mélange à température ambiante. Une solution de 830 mg (2,51 mmol) de chlorure de (S)-4-[2[(trifluoroacétyl)amino]propyl]- benzène sulfonyle (X) dans 25 ml de tétrahydrofurane fraîchement distillé a été ajoutée goutte à goutte à la solution ci-dessus. On a agité le mélange réactionnel à température ambiante pendant 18 heures et on l'a filtré. Le filtrat a été concentré et redissous dans 200 ml d'éthylacétate, lavé avec 2 X ml d'eau, séché sur MgSO4 et concentré. Le résidu a été purifié par 1D chromatographie sur couche mince à l'aide d'une solution de 10% de méthanol dans du chloroforme comme éluant pour donner 780 mg (2,05 mmol, 82%) du (S)-2,2,2-trifluoro-N-[1-méthyl-2-[4-(1pipérazinylsulfonyl)- phényl]éthyl]acétamide (_7.). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. ExemDle 14 Préparation du (S)-N-f2-r4-rf4-f(3'.6'-dihvdroxv-3-oxospirofisobenzo- furan-1(3H).9'-r9Hlxanthènel4'-vl)méthvll- 1oioérazinvllsulfonvll]hénvll- 1- méthvléthvll2.2.2-trifluoroacétamide (18) Un mélange de 61 mg (0,160 mmol) de rac-4'-(hydroxyméthyl)-3',6'- 2 dihydroxyspiro]isobenzofuran-1(3H9,9'-[9H]xanthène]-3-one (2), 125 mg (0,33 mrnol) de (S)-2,2,2-trifluoro-N-[1-méthyl-2-[4-(l-pipérazinylsulfonyl)phényl]- éthyl]acétamide (I), 150 mg (1,0 mmol) d'iodure de sodium et 60 pl (5,15 mmol) de 2,6-lutidine dans 4,5 ml de diméthylformamide anhydre, a été chauffé à 120 C pendant 2 heures. Le mélange réactionnel a été concentré et 20 mi d'un mélange méthanol/THF 1/1 a été ajouté. On a séparé par filtration le sel minéral et concentré le filtrat. Le résidu a été purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide d'une solution de 50% de chloroforme dans de l'éthylacétate pour donner 41 mg de (S)-N-[2-[4-[[4- [(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'- yl)méthyl]- 1-pipérazinyl]-sulfonyl]phényl]- 1-mé thyléthyl]-2,2,2trifluoroacétamide (épimères 1/1) (_i) (0,056 mmol, 35%), comme poudre orange-rouge. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. - 24 - Exemple 1.5 Préparation de la (S)-4'-[[4-(2-aminopropvl)mhénvllsulfonvll-1- pipérazinvllméthvll-3'.6'-dihvdroxvspi rorisobenzofuran- 1(3H)-9'-f9HI- xanthène-3-one (19) A 31 mg (0,042 mmol) du (S)-N-[2-[4-[[4-[(3', 6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène-4'-yl)méthyl]- 1pipérazinyl]- sulfonyl]phényl]-1-méthyléthyl]-2,2,2-tnrifluoroacétamide (l.) on a ajouté 2 ml de méthanol, puis 2 ml d'une solution de méthylamine saturée dans du méthanol. On a chauffé le mélange à 60 C pendant 24 heures et on l'a lO concentré. Le résidu a été purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide de chloroforme/méthanol 8/2 pour donner 10 mg (0,015 mmol, 38%) de (S)-4'-[[4-(2-aminopropyl)phényl]sulfonyl]- 1-pipérazinyl]méthyl]-3',6'- dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H)-9'-[9H]-xanthène-3-one (19) (épimères 1/1), comme poudre orange-rouge. Les données RMN, IR et SM ont confirmé -5 l'identité du produit. Exemole 16 Préparation du 1-f(2-méthoxvéthoxv)méthoxvl-4-nitrobenzène (21) A 200 mg (0,5 mrnol) d'hydrure de sodium (dispersion 60% dans de l'huile), on a ajouté 10 ml d'hexane. Après avoir laissé reposer, on a décanté r l'hexane. Au résidu on a ajouté 10 ml de tétrahydrofurane fraîchement distillé et on a refroidi la suspension à 0 C. On a ajouté lentement 200 mg (1,43 mmol) de 4-nitrophénol (2) à l'état solide par parties. Le mélange réactionnel a été agité à 0 C pendant 5 minutes et on a ajouté 197 p (1,71 mmol) de chlorure de 2-méthoxyéthoxyméthyle. On a agité le mélange à température ambiante pendant 18 heures. Au mélange réactionnel, on a ajouté lentement 25 ml d'eau et on a dilué le mélange réactionnel avec 50 ml d'éthylacétate. La phase organique a été séparée, et la phase aqueuse extraite avec 2 X 50 ml d'éthylacétate. Les phases organiques ont été combinées et lavées avec 7 X 100 ml de solution de carbonate de sodium saturé, puis 100 ml d'eau. La phase éthylacétate a été séchée sur MgSO4 et concentrée pour fournir 225 mg (0,99 mmol, 69%) de 1-[(2- méthoxyéthoxy)- méthoxy]-4-nitrobenzène (21), conmme huile jaune pâle. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. - 25 - Exemple 17 Préparation de la 4-r(2-méthoxvéthoxv)méthoxvlbenzènamine (22) On a agité a température ambiante pendant 18 heures un mélange de mg (0,88 rmmol) de 1-[(2-méthoxyvéthoxy)méthoxy]-4-nitrobenzène (21), 100 mg de Pd/C 10%, et 550 mg (8,7 mmol) de formate d'ammonium dans 10 ml d'éthanol absolu. On a dilué le mélange réactionnel avec 100 ml d'éthanol absolu et on l'a fait passer à travers une couche de CéliteTM. On a concentré le filtrat et on l'a purifié par chromatographie sur colonne de silice à l'aide d'acétate/hexane 8/2 comme éluant pour donner 130 mg (0,65 rmmol, 75%) de la 4-[(2-méthoxyéthoxy)méthoxy]benzènamide (22). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 18 Préparation de l'acide 4-fr4-f(2-méthoxvéthoxv)méthoxvlyhénvllaminol- 4-oxobutanoïque (23) A une solution de 510 mg (2,58 mmol) de 4-[(2-méthoxyéthoxy)méthoxy]- benzénamine (22) dans 8 ml de dichlorométhane et de 2 ml de pyridine anhydre (Aldrich) on a ajouté 380 mg (3,8 mmol) d'anhydride succinique par portions. On a agité le mélange à température ambiante pendant 18 heures. On a ajouté au mélange réactionnel 20 ml de méthanol et on a agité le t mélange réactionnel à température ambiante pendant 2 heures. Le mélange a été concentré et purifié par chromatographie sur couche mince préparative à l'aide de chloroforme/méthanol 8/2 comme éluant pour donner 420 mg (1,41 rmmol, 55%) de l'acide 4-[[4-[(2méthoxyéthoxy)méthoxy]phényl]- amino]-4-oxobutanoïque (2. Les données RMN, IR et SM ont confirmé Z2 l'identité du produit. Exemple 19 Préparation du N-r4-r(2-méthoxvéthoxv)méthoxvlphénvll-y-oxo-1ninérazinebutamide (24) A une solution de 407 mg (1,36 mmol) d'acide 4-[[4-[(2-méthoxyéthoxy)- 3 méthoxy]phényl]amino]-4-oxobutanoïque (23) dans 8 ml de diméthylformamide anhydre (Aldrich), on a ajouté 339 mg (1,64 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide et 236 mg (2,05 mmol) de N-hydroxy-succinimide à 0 C. On a agité le mélange à 4 C pendant 18 heures. On a utilisé l'ester actif -26- in situ sans l'isoler dans la réaction suivante. A une solution de 1,4 g (16,2 mmol) de pipérazine dans 20 ml de tétrahydrofurane fraichement distillé, on a ajouté 1,5 ml de triéthylamine. A ce mélange on a ajouté la solution d'ester de N- hydroxysuccinimide préparée précédemment, goutte à goutte à température ambiante et on a agité le mélange avec un agitateur magnétique à température ambiante pendant 2 jours. Le mélange réactionnel a été concentré. Le résidu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice à l'aide d'acétate/méthanol 6/4 pour donner 384 mg (1,05 mmol, 77%) du N-[4-[(2-méthoxyéthoxy)méthoxy]phényl]-y-oxo-1- pipérazinebutamnide (24). Les données RMN, IR, et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemole 20 Préparation du rac-4-f(3'.6'-dihvdroxv-3-oxosDirorisobenzofuran- 1(3H).9'-r9Hlxanthènel-4'-vl)méthvl1-N-(4-hvdroxvyhénvl)-y-oxo- 1pinérazine- butamide (26) A un mélange de 30 mg (0,082 mmol) de N-[4-[(2-méthoxyéthoxy)- méthoxy]phényl]-y-oxo-1-pipérazine butamide (24) et 35 mg (0,091 rmmol) de la rac4'-(hydroxyméthyl-3',6'-dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H)9'- [9H]xanthène]-3-one (2) dans 2,5 ml de diméthylformamide, on a ajouté 250 m j1 (2,14 rmmol) de 2,6-l1utidine et 100 mg (0,66 mmol) d'iodure de sodium. On a chauffé le mélange à 140 C pendant 3 heures sous atmosphère d'argon. On a suivi la réaction par chromatographie sur couche mince à l'aide de l'éluant chloroforme/méthanol 9/1, laquelle a indiqué la présence du produit nouveau ainsi que d'une quantité importante de N-[4-[(2-méthoxyéthoxy)- 2 méthoxy]phényl]--oxo-1-pipérazine-butamide (24). On a ajouté au mélange réactionnel 25 mg (0,065 mmol) du composé (2) et on chauffé le mélange pendant 2,5 heures. On a concentré le mélange réactionnel et on l'a purifié deux fois par chromatographie sur couche mince. On a ainsi obtenu 15 mg (0,021 mmol, 26%) du rac-4-[3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'-yl)méthyl]-N-[(4-[2-méthoxyéthoxy)méthoxy]- phényl]-y-oxo-1-pipérazinebutamide (25). A 15 mg (0,021 mmol) de (2,), on a ajouté 3 ml d'acide trifluoroacétique et on a agité le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel résultant a été concentré et purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide de chloroforme/méthanol 9/1 comme éluant pour donner 7 mg (0,011 mmol, 54%) du rac-4-[(3',6'-dihvdroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]- -27, xanthen]-4'-yl)méthyl]-N-(4-hydroxyphénvl)-'?-oxo- 1-pipérazinebutamide (2). Les données RMNIN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 21 Préparation du rac-4-[rr3'.6'-dihvdroxv-3-oxospirorisobenzofuran- 1(3H).9'-r9H1xanthènel-4'-vl)méthvllaminolN-(4-hvdroxvyhénvl)-4oxobutamide (28) A une solution de 120 mg (0,40 mmol) de l'acide 4-[[4-[(2-méthoxy- éthoxy)-méthoxy]phényl]amino-4-oxobutanoïque (2-.) dans 2,5 ml de diméthylformamide anhydre, on a ajouté 83 mg (0,40 mmol) de dicyclohexyl- o carbodiimide et 60 mg (0,52 rmmol) de N-hydroxysuccinimide à 0 C sous atmosphère d'argon. Le mélange obtenu a été agité à 4 C pendant 24 heures. L'ester de N-hydroxysuccinimide généré in situ à été ajouté goutte à goutte sous atmosphère d'argon à une solution agitée de façon magnétique de 25 mg (0,062 rmmol) de 4'-aminométhylfluorescéine acide chlorhydrique dans 2 mi de pyridine sèche. On a agité le mélange réactionnel résultant à température ambiante pendant 48 heures et on l'a concentré sous pression réduite pour obtenir 15 mg (0,023 mmol, 38%) du rac-4-[3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzuofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène]-4-yl)méthyl]amino]-N-[(4- [(2-méthoxyéthoxy)méthoxy]phényl]-4-oxobutamide (2), cornmme résidu morange. A 15 mg (0,023 mmol) de (2_Z), on a ajouté 3 ml d'acide trifluoroacétique et on a agité le mélange à température ambiante pendant minutes. Le mélange réactionnel a été concentré et purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide de chloroforme/méthanol 8/2 pour donner 8 mg (0,014 mmol, 67%) du rac-4-[[[3',6'-dihydroxy-3- z oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-4'-yl)-méthyl]amino]-N(4- hydroxyphényl)-4-oxobutamide (2.), comme poudre orange. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 22 Préparation de l'acide (S)-4-r(4-hvdroxv-3.5-diiodo)phénoxv-3.5-diiodol- a.rf(1.1-diméthvléthoxv'carbonyllaminolbenzèneorooanoïoue (30) A un mélange agité de façon magnétique de 4.5 g (5,8 mmol) de L- thyroxine (2_) dans 18 ml de diméthylformamide. 495 mg (5,9 mmol) de bicarbonate de sodium et 18 ml d'eau, on a ajouté goutte à goutte une solution de 1,28 g (5,8 mmol) de di-t-butvl dicarbonate dans 18 ml de35 diméthylformamide. Le mélange réactionnel obtenu a été agité pendant 4 - 28 - heures, puis concentré sous vide poussé a température ambiante. Au résidu on a ajouté 45 ml de méthanol et on a séparé par filtration la matière non dissoute. On a ajouté au filtrat 20 ml d'acide chlorhydrique 1N jusqu'à précipitation complète. On a séparé par filtration le solide et on l'a séché à l'air pour obtenir 4,2 g (4,8 mmol, 83%) de l'acide (S)-4-[(4-hydroxy-3,5- diiodo)-phénoxy-3,5-diiodo]-a-[[(1,1-diméthyléthoxy)carbonyl]amino]- benzènepropanoïque (].), comme poudre de couleur blanc cassé. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 23 1D PréDaration de l'acide (S)-r1-r(hexahvdro-lH-1.4-diazéDin-lvlcarbonvll- 2-[4-(4-hvdroxv-3.5-diiodo)thénoxvl3.5-diiodoDhénvlléthvllcarbamioue- 1. 1- diméthvléthvl ester (31) A une solution agitée de façon magnétique de 1, 8 g (2,05 mmol) de l'acide (S)-4-[(4-hydroxy-3,5-diiodo)-phénoxy-3,5-diiodol-a-[[(1,1- dimethyléthoxy)carbonyl]amino]-benzènepropanoïque (_Q), dans 55 ml de diméthylformamide sec (Aldrich, 99%), on a ajouté 539 mg (4,68 mmol) de N- hydroxysuccinimide, puis 1,02 g (5,32 mmol) de 1-éthyl-3-(3diméthylamino- propyl)carbodiimide. Le mélange a été agité à température ambiante pendant 2,5 heures, puis ajouté goutte à goutte à une solution de 3,6 g (36 mmol) d'homopipérazine dans 20 ml de pyridine sèche pendant une période de 25 minutes. Le mélange réactionnel résultant a été agité à température ambiante pendant une nuit et concentré sous vide poussé. Au résidu résultant collant, on a ajouté 250 ml de solution de bicarbonate de sodium saturée. On a filtré le mélange et ainsi obtenu 2,5 g de produit brut solide z2 blanc cassé. Ce solide a été purifié par chromatographie sur colonne flash à l'aide de méthanol/chloroforme 1/1. On a ainsi obtenu 1,3 g (1,35 rmmol, 66%) de l'acide (S)-[1-[(hexahydro- 1H-1,4-diazépin- 1-yl)-carbonyl]-2-[4-[(4hydroxy- 3,5-diiodo)phénoxy]-3,5-diiodophényl]é thyl]carbamique- 1,1diméthyléthyle ester (3.), comme solide blanc cassé. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. ExemDle 24 Préparation de la (2S)-4'-F[4-,2-amino-3-[4-(4-hvdroxv-3.5diiodonhénoxv)-3.5-diiodoohénvii- 1-oxooroovil- l-oieérazinvllméthvll-3'. 6'- dihvdroxv-sniro-risobenzofuran-1(3H.9'-r9H]xanthènel-3-one (épimères 1/1)35 3 - 29- A une solution de 126 mg (0,131 mmol) de l'acide (S)-[1-[(hexahydro-lH- 1,4-diazépin- 1-yl)-carbonyl]-2-[4-[(4-hydroxy-3,5-diiodo)phénoxy]-3,5- diiodophényl]éthyl]carbamique-1,1-diméthvléthyle ester (3) dans 2 ml de diméthylformamide anhydre, on a ajouté 400 gil (3,4 mmol) de 2,6lutidine, 200 mg (1,3 mmol) d'iodure de sodium, puis 50 mg (131 mmol) de rac-4'- (hydroxyméthyl)-3',6'-dihydroxyspiro[isobenzofuran- 1(3H),9'[9H]xanthène]- 3-one (2). On a chauffé le mélange à 130 C pendant 3 heures et on l'a concentré sous pression réduite pour obtenir 52 mg (0,048 mrnol, 37%) de (2S)-4'-[4'-[[4-[2[(1,1-diméthyléthoxy)carbonyl]amino-3-[4-(4-hydroxy-3, 5- diiodo-phénoxy)-3,5-diiodophényl]- 1-oxopropyl]- 1-pipérazinyl]méthyl]3',6'- dihydroxyspiro[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]-xanthène]-3-one () comme résidu. A 52 mg, (0,048 mmol) de (32) on a ajouté 3 ml d'acide trifluoroacétique. On a agité le mélange à température ambiante pendant 5 minutes et l'a concentré. Le résidu a été purifié deux fois par chromatographie sur couche mince préparative à l'aide de chiloroforme/méthanol 8/2 pour donner 15 mg (0,011 mmol, 24%) de (2S)-4'- [[4-[2-amino-3-[4-(4-hydroxy-3,5-diiodophénoxy)-3,5-diiodophényll- 1- oxopropyll-1-pipérazinyl]méthyl]-3',6'-dihydroxy-spiro-[isobenzofuran- 1(3H),9'-[9H]xanthène]-3-one (épimères 1/1) (.), comme poudre orange. Les m données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 25 Préparation du chlorure de 5H-dibenzrb.flazéoine-5-carbonvle (35) Une solution de 2,8 g d'iminostilbène (14) dans 100 ml de dichlorométhane a été traitée avec 1,5 g de triphosgène, puis par 3 ml de 2 pyridine et agitée à température ambiante pendant une nuit. La chromatographie sur couche mince dans une solution de 40% d'éthylacétate dans l'hexane a indiqué la formation d'un seul produit. Le mélange réactionnel a été lavé avec de l'eau et concentré sous vide. On a chromatographié le résidu sur de la silice à l'aide d'une solution de 10% d'éther dans du dichlorométhane et ainsi obtenu 3,2 g de 5H- dibenz[b,f]azépine-5-carbonyle chlorure (XW), comme poudre de couleur blanc cassé. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 2E; Préparation du N-(4-pipéridinvlmnéthvl '-5H-dibenzofb.flazéDine-5- carboxamide (36 - 30 - A une solution de 511 mg (2 mmol) de chlorure de 5H- dibenzo[b,flazépine-5-carbonyle (35) dans 15 ml de diméthylformamide anhydre, on a ajouté 280 gl de triéthylamine, puis 2,3 g (2,0 mmol) de 4- aminométhyl-pipéridine. On a agité le mélange à température ambiante pendant une nuit et on l'a concentré sous pression réduite. Au résidu, on a ajouté 200 ml de dichlorométhane et 150 ml d'une solution de bicarbonate de sodium saturée. On a séparé la phase organique et extrait la phase aqueuse avec 2 X 100 ml de dichlorométhane. On a combiné les phases organiques et on les a séchées sur MgSO4 pour obtenir un produit brut qui a été purifié par 0 chromatographie sur couche mince à l'aide de méthanol/hydroxyde d'ammonium concentré 9,5/0,5, pour fournir des produits isomères. Le composant ayant migré plus lentement a été isolé et a fourni 350 mg (1,04 mmol, 53%) du N-(4-pipéridinylméthyl(-5H-dibenzo[b,flazépine-5- carboxamide (.3), comme solide blanc cassé. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 27 Prénaration du N-r[3-r(3'.6'-dihvdroxv-3-oxospirorisobenzofuran- 1(3H).9'-r9Hlxanthènel-4'-vl)méthvll-4-DiDéridinvllméthvll-5H- dibenzo[b.flazéoine-5-carboxamide (37) A une solution de 35 mg (0,104 mmol) de N-(4-pipéridinylméthyl)-5H- dibenzo[b,flazépine-5-carboxamide (36) dans 3 ml de diméthylformamide anhydre, on a ajouté 200 l (1,71 mmol) de 2,6-l1utidine, 200 mg (1,3 mrnmol) d'iodure de sodium, puis 40 mg (0,105 mmol) de rac-4'-(hydroxyméthyl)-3', 6'- dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène]-3-one (2). Le mélange a été agité à 140 C pendant 3 heures sous atmosphère d'argon et concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur couche mince à l'aide d'acétate d'éthyl/chloroforme/méthanol 7/3/1 comme éluant et a donné un produit orange qui contenait des impuretés. Ce dernier a été repurifié par chromatographie sur couche mince à l'aide de chloroforme/méthanol 8/2 comme éluant et a fournit 15 mg (0,022 mmol, 21%) du N-[[3-[(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran- 1(3H),9'- [9H]xanthène]-4'-yl)méthyl]-4-pipéridinyl]méthyl]-5H-dibenzo[b,flazépine5- carboxamide (37), comme poudre orange. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. -31 - Exemple 28 Prédaration du N-bromoacétvliminostilbène (38) Une solution de 6,0 g (0, 03 mol) d'iminostilbène dans 250 ml de chloroforme a été ajoutée à une solution de 10 g (0,09 mol) de carbonate de sodium dans 100 ml d'eau et on a agité énergiquement le mélange. Au mélange agité énergiquement, on a ajouté 6,2 g (0,03 mol) de bromure de bromoacétyle goutte à goutte à l'aide d'un entonnoir supplémentaire. L'analyse en chromatographie sur couche mince à l'aide de THF/hexane 2/1 indiquait à ce moment que la réaction n'était pas terminée. On a ajouté 1,0 g o (0,005 mol) de bromure de bromoacétyle supplémentaire. La chromatographie sur couche mince à alors indiqué que le produit de départ avait été totalement consommé. On a séparé la phase chloroforme, on l'a séchée sur Na2SO4 et concentrée. On a ainsi obtenu 11,0 g de Nbromoacétyl- iminostilbène (X), comme huile jaune pâle. On a utilisé cette dernière matière pour la réaction suivante. Exemple 29 Préoaration de 5-(aminoacétvl)-5H-dibenzo[b.flazéoine-acide chlorhvdrique (39) On a ajouté soigneusement une solution de 2,2 g (7 mmol) de N-bromo- acétyliminostilbène brut (X) dans 25 ml de chloroforme à 250 ml d'ammoniac liquide condensé à -33 C. A ce mélange réactionnel, on a ajouté 6,0 g (40 mmol) d'iodure de sodium, on a agité le mélange à -33 C pendant 2 heures et on a laissé l'évaporation se produire pendant une nuit. On a ajouté ml d'eau à la solution huileuse de couleur blanc-eau. Cette solution a été extraite avec 2 X 150 ml de chloroforme. On a séché le solvant sur Na2SO4 et on l'a évaporé pour obtenir une huile claire qui a été dissoute dans 25 ml de méthanol saturé avec de l'acide chlorhydrique. La solution résultante a été concentrée et on y a ajouté 25 ml d'acétonitrile. On a récupéré la matière solide précipitée et on l'a lavée avec 10 ml d'acétonitrile. La recristallisation dans du méthanol/éther a donné 1,8 g (6,2 mmol, 90%) de 5-(aminoacétyl)- H-dibenzo[b,f]azépine-acide chlorhydrique (39). Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. -32- Exemple 30 Préparation du N-[(5H-dibenz[b.flazéoin-5-vlcarbonvl)méthvll-N'-3'.6'- dihvdroxv-3-oxosDiro isobenzofuran- 1(3H).9'-f9Hxanthène-5-vllthiourée dihxdrate (40) On a traité une solution de 1,0 g (4 mmol) de 5(amrninoacétyl)-5H- dibenzo[bflazépine-acide chlorhydrique (X) dans un mélange de 75 ml de * méthanol sec et 75 ml de tétrahydrofurane sec avec 1,4 g (3,6 rmmol) de 5- fluorescéine isothiocyanate (isomère I) et on a agité le mélange réactionnel à température ambiante pendant une nuit. On a éliminé le solvant sous pression réduite et on a purifié le résidu par chromatographie sur colonne à l'aide d'une solution de 12% de méthanol avec du chloroforme comme éluant. On a ainsi obtenu 800 mg (1,8 mrnol, 35%) du N-[(5H- dibenz[b,flazépin-5-ylcarbonyl)méthyl]-N'-3',6'-dihydroxy-3- oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthène-5-yl]thiourée dihydrate (. Q), comme solide rouge. Les données RMN, IR et SM ont confirmé l'identité du produit. Exemple 31 Immunotitrage à oolarisation de fluorescence utilisant les nouveaux traceurs de la fluorescéine 4'-méthvl-substituée de la orésente invention On a évalué les performances des nouveaux composés de la présente invention sur l'analyseur chimique automatique COBAS FARAO II (Roche Diagnostic Systems Inc., Branchburg, N.J., USA) en utilisant des réactifs d'immunotitrage et des protocoles en accord avec le manuel d'utilisation de cet instrument. A titre d'exemple, l'instrument a été configuré pour des mesures de polarisation de fluorescence pour l'acétaminophène dans des échantillons de sérum ou de plasma de la façon suivante. Formulation de réactifs: a) Immunoréactifs Tampon phosphate 0,1M pH 7,5 contenant 0,1%qc d'azide de sodium et 0,1% de -y-globuline bovine; anticorps dilués dans un rapport de 1,5 à 1/40. - 33 - b) Réactif-traceur Tampon phosphate 0,1M pH 7,5 contenant 0,1% de fglobuline bovine et 0,1% d'azide de sodium; X 10-7 M de traceur. c) Calibrateurs de l'acétaminophène: solutions de 0, 10, 20, 50, 100 et 200 gg/ml d'acétaminophène dans du sérum humain normal. Pour chaque échantillon du traceur acétaminophène décrit dans les exemples ci-dessus: 1) 200 AI d'immunoréactif sont mélangés avec 30 gl de solution de calibrateur; 2) on prend une mesure de la polarisation de fond; 3) on ajoute 5,2 pl du réactif traceur; 4) on incube le mélange pendant 30 secondes; 5) On prend une mesure de polarisation; et 6) on calcule l'intervalle de variation du signal (intervalle de mesure) du traceur. - 34 - Revendications 1. Composé de formule X HO O OH O I dans laquelle X est choisi parmi un halogène, l'hydroxy ou un sulfonate ester de formule -O-S02-R, dans laquelle R est -C6H4- CH3 ou CH3. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que X est l'hydroxy. 3. Composé de formule $ N-R, HO O OH oN III dans laquelle R1 est H ou un dérivé de substance active. 4. Composé selon la revendication 3 caractérisé en ce que R1 est H. 5. Composé selon la revendication 3 caractérisé en ce que Ri est l'acide valproïque ou un dérivé de l'acide valproique de formule - 35 - o O N H COOH 6. Composé de formule Y-Q HO OOH VI dans laquelle Y est un relieur cyclique choisi parmi la pipérazine, l'homopipérazine, la 4-aminométhylpipéridine, la 4- carboxypipéridine, la proline et la 3-carboxydihydropyridine, et Q est une substance active, un agent thérapeutique, ou un agent polluant pour l'environnement. 7. Composé selon la revendication 6 caractérisé en ce que Q est une substance active choisie parmi l'amphétamine, l'acétaminophène, la thyroxine et la carbamazépine. 8. Composé selon la revendication 6 caractérisé en ce que Y est la pipérazine et Q est l'amphétamine ou l'acétaminophène. 9. Composé selon la revendication 6 caractérisé en ce que Y est l'homopipérazine et Q est la thyroxine. 10. Composé selon la revendication 6 caractérisé en ce que Y est la 4aminométhylpipéridine et Q est la carbamazépine.