Brevet FR2750604A1 — publié le 19980109

L'invention a trait à une composition comprenant un hétéromère liant des acides gras. Cet hétéromère peut être utilisé notamment pour stimuler et/ou induire la pousse des cheveux et/ou freiner leur chute ou pour augmenter le phénomène de la cicatrisation ou pour tester des substances modulant l'activité des acides gras ou encore comme outil de diagnostic. Les acides gras, tels que l'acide arachidonique et ses dérivés, jouent un rôle important notamment dans la synthèse de membranes cellulaires ou nucléaires, dans le mécanisme de l'inflammation en tant que précurseurs de médiateurs et dans la fonction barrière de l'épiderme, ainsi que dans le contrôle de sa différenciation et prolifération cellulaire. De plus, il est décrit que les acides gras modulent l'expression de nombreux gènes par le biais de récepteurs nucléaires, dénommés les PPARs (peroxisome proliferator-activated n uclear receptors). Du fait de leur caractère labile et hydrophobe, les acides gras sont solubilisés, stabiiisés et transportés dans le milieu biologique par des protéines de transports spécifiques cytosoliques et de bas poids moléculaires (15kDa) que l'on nomme FABP (fatty acid-binding proteins ou protéines se liant à des acides gras). La peau est le tissu le plus actif en ce qui concerne la synthèse de lipides. Mais, certains lipides que l'on nomme les acides gras essentiels, tels que l'acide arachidonique et l'acide linoléïque, ne peuvent être synthétisés par ces cellules et doivent donc être acquis des humeurs. Le mécanisme de capture ou de libération de ces acides gras par les cellules, et plus particulièrement par les kératinocytes, n'est pas connu. Cependant, il semble que ce mécanisme se fasse par le biais de protéines de transports, bien que l'identification de ces protéines soit jusqu'à ce jour sans succès. Récemment, dans les kératinocytes, il a été décrit une protéine particulière (nommée la E-FABP) se liant aux acides gras épidermiques avec une forte affinité pour les acides gras présentant 18 atomes de carbone, tels que l'acide stéarique, L'acide oléique, linoléïque et linolénique, mais avec une affinité faible ou nulle pour l'acide arachidonique et ses dérivés (Siegenthaler, G. et al. (1994) Biochem. J. 302, 363-371). Cette protéine pourrait donc jouer un rôle important dans le transport de certains acides gras, mais pas pour celui de l'acide arachidonique et ses dérivés. De plus, il est connu que des maladies inflammatoires, tels que l'arthrite rhumatoïque, la mucovicidose, ou des désordres dermatologiques à composante inflammatoire liée à la libération d'acide arachidonique ou de ses dérivés, tels que le psoriasis, I'eczéma, la dermatite atopique, ou encore la cicatrisation des blessures de la peau présentent une dérégulation ou une modification du métabolisme des acides gras et plus particulièrement de l'acide arachidonique. Dans le domaine cosmétique, on peut penser qu'une dérégulation ou une modification du métabolisme des acides gras est à l'origine des peaux sèches ou, au contraire, des peaux grasses, ou encore à une fragilisation de la peau. Dans cette optique, on a cherché à comprendre le mécanisme de capture ou de libération et de transport des acides gras par les cellules de la peau, telles que les kératinocytes. C'est ainsi que, de manière tout à fait surprenante, on a pu identifier et isoler à partir de kératinocytes humains un hétéromère se liant aux acides gras et plus particulièrement à l'acide arachidonique. Ainsi, la présente invention a pour objet une composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un hétéromère liant l'acide arachidonique. Du fait de cette propriété, on voit l'intérêt que présente cet hétéromère notamment pour comprendre le mécanisme de capture, de libération ou de transport de l'acide arachidonique ou de ses dérivés et/ou pour identifier des substances susceptibles de modifier ce mécanisme de transport et donc l'activité biologique résultant de l'acide arachidonique. Par dérivés de l'acide arachidonique, on entend tous les dérivés biologiques de l'acide arachidonique, tels que notamment les hydroxyacides, les thromboxanes, les leukotriènes et les prostaglandines. Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation de cet hétéromère en tant qu'outil de diagnostic, plus particulièrement des maladies inflammatoires ou des désordres dermatologiques à composante inflammatoire liée à la libération de l'acide arachidonique ou de ses dérivés (voir ci-dessus). De même, I'hétéromère permet d'évaluer l'activité biologique de substances susceptibles d'être actives dans le traitement de maladies inflammatoires ou de désordres dermatologiques à composante inflammatoire liée à la libération d'acide arachidonique ou de ses dérivés (voir ci-dessus). En effet, grâce au procédé de purification de l'hétéromère qui sera décrit ultérieurement, on s'aperçoit qu'une peau atteinte de psoriasis contient environ dix fois plus de cet hétéromère qu'une peau normale (dont la quantité purifiée est d'environ 4 pmol/mg de protéines). La quantité de l'hétéromère trouvée, notamment par le procédé de purification décrit ultérieurement, est donc une façon de diagnostiquer un désordre dermatologique, tel que le psoriasis. A partir de cette découverte, on peut aussi envisager de doser l'évolution de quantité d'hétéromère purifié à partir de kératinocytes d'un être humain qui est en train d'être traité par une substance susceptible de traiter sa maladie inflammatoire ou son désordre dermatologique. De préférence, cet hétéromère présente une constante de dissociation Kd inférieure ou égale à 300nM vis-à-vis de l'acide arachidonique, de préférence inférieure ou égale à 200nM. Ces constantes de dissociation sont obtenues en réalisant les mesures par la technique de charbon-dextran. La technique du charbon-dextran est la suivante des aliquots de O,5ug d'hétéromère en solution dans 100 p de tampon Tris (50mM Tris/HCI, 25mM NaCI, 2,5mM EDTA, 1mM DTT à pH 7,5) contenant 0,5 % de gélatine et 1 % DMSO sont incubés durant 1 heure à 37"C en présence de quantités croissantes de ligand radio-marqué, c'est-à-dire de 0-10,uM pour l'acide oléique et l'acide arachidonique. Puis, chaque aliquot est traité avec SOul de suspension de charbon-dextran T408 (5 % et 0,05 % respectivement) à 00C durant 10 minutes, puis centrifugé à 10 000 g et la radioactivité du surnageant est mesurée. On établit une courbe de saturation et, à partir du graphique de Scatchard, on calcule le Kd. Par ailleurs, cet hétéromère présente une constante de dissociation vis-à-vis de l'acide oléique plus basse que celle de la E-FABP vis-à-vis du même ligand, la E- FABP étant la protéine décrite dans la publication de Siegenthaler, G. et al. (1994) Biochem. J. 302, 363-371. De manière plus particulière, ithétéromère selon l'invention est une protéïne, celle-ci présentant un poids moléculaire d'environ 34 kDa + 10% (analyse dans des conditions non dénaturantes (filtration sur gel)). De manière générale, les poids moléculaires ont été déterminés par chromatographie de filtration sur colonne [(Superose 12) couplée à un HPLC]. La colonne équilibrée avec un tampon 50mM Tris/HCI contenant 0,2M de NaCI est étalonnée avec des standards protéiques de poids moléculaires allant de 6,5kDa à 150kDa, puis, un aliquot d'hétéromère est passé sur la colonne pour la détermination de son poids moléculaire. Le profil d'élution des protéines est analysé par la mesure de densité optique (DO) à 280nm. Cet hétéromère peut également lier en quantité jusqu'à 1,5 fois plus d'acide arachidonique que d'acide oléique. En effet, lorsqu'une quantité déterminée d'hétéromère en solution est incubée en présence de 600nM d'acide arachidonique radiomarqué, puis analysée sur une colonne de filtration sur gel [(Superose 12) équilibrée avec un tampon Tris/HCI contenant 0,2M NaCI et connectée à un HPLC], le pic radioactif qui co-élue à 34 kDa et qui correspond au complexe hétéromère - acide arachidonique radiomarqué est 1,5 fois plus important que si l'expérience est réalisée dans les mêmes conditions, mais avec 600nM d'acide oléique radiomarqué. De manière tout à fait surprenante, sous des conditions dénaturantes pour les protéines (méthode SDS-PAGE), I'analyse révèle que cet hétéromère correspond à un complexe non-covalent de différentes sous-unités, constitué d'une protéine appelée MRP8 et d'une autre protéine appelée MRP14. Ces deux protéines sont notamment décrites dans la publication de Odink et al., (1987) Nature 330, 80-82. Le procédé de purification de l'hétéromère correspond à des étapes classiques d'extraction protéinique à partir de kératinocytes. Le procédé de purification de l'hétéromère mis en oeuvre comprend plus particulièrement les étapes suivantes : environ 5g de squames de psoriasis sont homogénéisés dans 15 ml de tampon Tris/HCI en utilisant un homogénéisateur (Polytron) puis la suspension est centrifugée à 100 000 g durant 1 heure à 4"C. Le culot est collecté et suspendu dans 5ml de même tampon et centrifugé à 10 000 g. Le surnageant est éliminé. Cette opération de lavage est effectuée 2 fois encore. Puis, le culot est traité dans 15 ml de tampon KCI (1 OmM Tris/HCI, 0,8M KCI, 10mM monothioglycérol, 10% glycérol, 1mM PMSF, 1OU/ml aprotinin, îOmg/ml leupeptine) à pH 7,4 durant 90 minutes à 4"C. Ce traitement est répété encore une fois. Les surnageants sont réunis et dialysés une nuit contre un tampon 20mM imidazole à pH 6, concentré en utilisant une cellule de filtration avec une membrane à dialyse de dimension de pores 3500 Da, puis la solution est chargée sur une colonne échangeuse de cations (Resource S). L'élution est effectuée par un gradient constitué du tampon de dialyse mais contenant 0,5M NaCI. La colonne est d'abord standardisée avec un échantillon incubé avec de l'acide oléique tritié. Les fractions qui co-éluent avec le pic radioactif sont collectées, dialysées contre un tampon 20mM Tris/HCI, pH 8,0 et la solution est concentrée. Cette solution est passée sur une colonne échangeuse de cations (Resource Q) équilibrée avec ce dernier tampon. L'élution sous forme de gradient s'effectue avec ce tampon Tris contenant 0,5M NaCI. De la même manière que ci-dessus, la colonne a été standardisée et seulement les protéines co-éluant avec le pic radioactif sont collectées, dialysées contre un tampon 100mM phosphate de sodium à pH 7,0 et concentré. La dernière étape de purification s'effectue sur une colonne de filtration (Superose 12) équilibrée avec le tampon phosphate. Le pic de protéine éluant à 34kDa correspond à l'hétéromère purifié. De préférence, les kératinocytes sont des kératinocytes différenciés humains et encore plus avantageusement les kératinocytes viennent de squames psoriatiques. Cet hétéromère peut être également purifié à partir de neutrophiles humains. La présente invention a donc plus particulièrement trait à une composition cosmétique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, dans un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable, l'hétéromère décrit cidessus. La composition cosmétique a notamment pour but d'améliorer l'aspect cosmétique de la peau, notamment en améliorant la fonction barrière de l'épiderme. Lorsqu'elle est pharmaceutique, la composition est de préférence dermatologique. Elle concerne aussi l'utilisation de cette protéine à titre de médicament, notamment pour traiter de manière préventive ou curative la chute des cheveux ou encore pour augmenter le phénomène de la cicatrisation. En effet, sans vouloir se lier à une quelconque théorie, lors de la cicatrisation, on observe une prolifération et une différenciation cellulaire qui sont supérieures à l'état habituel (peau non lésée) et ce phénomène est concommitant à une augmentation de la quantité de l'hétéromère selon l'invention, ainsi il semble que cet hétéromère soit impliqué dans le processus de cicatrisation. Ainsi, I'invention concerne l'utilisation de l'hétéromère tel que décrit ci-dessus dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, ledit hétéromère ou la composition pharmaceutique étant destiné à traiter la chute des cheveux ou à augmenter le phénomène de cicatrisation. La quantité de l'hétéromère présent dans cette composition peut varier dans une large mesure, notamment en fonction de l'effet recherché. Pour donner un ordre de grandeur, 'hétéromère peut être présent à des concentrations comprises entre 10-6 et 20 % en poids par rapport au poids total de la composition. La composition selon l'invention peut être administrée par voie entérale, parentérale ou topique. De préférence, on utilise la voie topique. Par voie topique, on préfère l'application directe sur la peau, le cuir chevelu, les ongles ou les muqueuses. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes galéniques. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. Un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable correspond généralement à un milieu compatible avec la peau, le cuir chevelu, les ongles ou les muqueuses. La composition comprenant l'hétéromère peut donc être appliquée sur le visage, le cou, les cheveux et les ongles, ou toute autre zone cutanée du corps (régions axillaires, sous-mammaires, plis du coude etc.). Par voie topique, les compositions selon l'invention se présentent notamment sous forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, de dispersions du type lotion ou sérum, de gels anhydres ou lipophiles, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou d'émulsions de consistance molle, semi-solide ou solide du type crème ou gel1 ou encore de microémulsions, de microcapsules, de microparticules ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. Par voie entérale, les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou de nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, les compositions peuvent se présenter sous forme de solutions ou de suspensions pour perfusion ou pour injection Elles peuvent être également utilisées pour le cuir chevelu sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, de mousses ou encore sous forme de compositions pour aérosol contenant également un agent propulseur sous pression. Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces compositions constituent notamment des mousses à raser, des crèmes de nettoyage, de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains, pour les pieds, pour les grands plis anatomiques ou pour le corps, (par exemple crèmes de jour, crèmes de nuit, crèmes démaquillantes, crèmes de fond de teint, crèmes anti-solaires), des fonds de teint fluides, des laits de démaquillage, des laits corporels de protection ou de soin, des laits anti-solaires ou mieux après solaires, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau, comme des lotions de nettoyage ou de désinfection, des lotions anti-solaires, des lotions de bronzage artificiel, des compositions pour le bain, des compositions désodorisantes contenant un agent bactéricide, des gels ou lotions après-rasage, des crèmes épilatoires, des compositions contre les piqûres d'insectes, des compositions anti-douleur ou des compositions pour traiter certaines maladies de la peau comme celles citées précédemment. Les compositions selon l'invention peuvent également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage. Les compositions peuvent aussi être conditionnées sous forme de composition pour aérosol contenant également un agent propulseur sous pression. L'hétéromère peut être aussi incorporé dans diverses compositions pour soins ou traitements capillaires, et notamment des shampooings éventuellement antiparasitaires, des lotions de mise en plis, des lotions traitantes, des crèmes ou des gels coiffants, des compositions de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampooings colorants, des lotions restructurantes pour les cheveux, des compositions de permanente (notamment des compositions pour le premier temps d'une permanente), des lotions ou des gels antichute, etc. Les compositions de l'invention peuvent aussi être à usage bucco-dentaire, par exemple une pâte dentifrice ou un bain de bouche. Dans ce cas, les compositions peuvent contenir des adjuvants et additifs usuels pour les compositions à usage buccal et notamment des agents tensioactifs, des agents épaississants, des agents humectants, des agents de polissage tels que la silice, divers ingrédients actifs comme les fluorures, en particulier le fluorure de sodium, et éventuellement des agents édulcorants comme le saccharinate de sodium. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en poids, et de préférence de 5 % à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans les domaines cosmétique et pharmaceutique. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 à 30 % ou mieux de 0,5 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques. Lorsque la composition de l'invention est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus de 90 % du poids total de la composition. De façon connue, la composition de l'invention peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les bactéricides, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, et par exemple de 0,01 % à 10 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques. Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matières grasses des alcools gras, des acides gras (acide stéarique), des cires (paraffine, carnauba, cire d'abeilles). Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de TefoseR 63 par la société Gattefosse. Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol. Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, ou encore l'éthylcellulose, le polyéthylène. Comme actifs hydrophiles, on peut utiliser les protéines ou les hydrolysats de protéine, les acides aminés, les polyols, I'urée, I'allantoïne, les sucres et les dérivés de sucre, les vitamines hydrosolubles, I'amidon et des extraits végétaux, notamment ceux d'Aloe Vera. Comme actifs lipophiles, on peut utiliser le rétinol (vitamine A) et ses dérivés, le tocophérol (vitamine E) et ses dérivés, les céramides, les huiles essentielles. Dans tout ce qui suit ou ce qui précède les pourcentages donnés sont exprimés en poids, sauf mention contraire, EDTA signifie l'acide éthylène diamine tétraacétique, DTT signifie le dithiothreitol, DMSO signifie le diméthylsulfoxyde et PMSF le fluorure de phényl méthanesulfonyle. REVENDICATIONS 1. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un hétéromére liant l'acide arachidonique. 2. Composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'hétéromère présente une constante de dissociation Kd inférieure ou égale à 300nM vis-à-vis de l'acide arachidonique, de préférence inférieure ou égale à 200nM. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hétéromère est une protéine présentant un poids moléculaire de 34 kDa + 10 %. 5. Procédé pour améliorer l'aspect cosmétique de la peau, caractérisée en ce que l'on applique sur la peau la composition selon l'une quelconque des revendications précédentes. 6. Utilisation de l'hétéromère défini à l'une des revendications précédentes 1 à 4 à titre de médicament. 7. Utilisation de l'hétéromère dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, l'hétéromère ou la composition pharmaceutique étant destiné à traiter la chute des cheveux. 8. Utilisation de l'hétéromère dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, I'hétéromère ou la composition pharmaceutique étant destiné à augmenter le phénomène de cicatrisation. 9. Utilisation de l'hétéromère défini à l'une des revendications 1 à 4 en tant qu'outil de diagnostic. 10. Utilisation de l'hétéromère selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il permet de diagnostiquer des maladies inflammatoires ou des désordres dermatologiques à composante inflammatoire liée à la libération d'acide arachidonique ou de ses dérivés. 11. Utilisation de l'hétéromère défini à l'une des revendications 1 à 4 pour tester des substances susceptibles d'être actives dans le traitement des maladies inflammatoires ou de désordres dermatologiques à composante inflammatoire liée à la libération d'acide arachidonique ou de ses dérivés.