Brevet FR2753536A1 — publié le 19980320

L'invention concerne un procédé d'évaluation de l'état physiologique de cellules cibles, par la quantification de la phagocytose desdites cellules, in vitro, par des macrophages en culture. Le procédé comprend un marquage fluorescent des cellules cibles, leur phagocytose éventuelle par les macrophages et la détermination du marquage des macrophages résultant de la phagocytose par cytofluorimétrie en flux. L'intérêt de cette évaluation provient de la corrélation entre l'importance de la phagocytose des cellules cibles et leur état physiologique lié à des changements de constituants membranaires (sénescence, infection, transformation néoplasique, etc.). Cette évaluation permet diverses applications diagnostiques ainsi qu'une estimation de la qualité de cellules destinées à un usage thérapeutique. Dans un premier temps, le procédé a été mis au point par la Demanderesse pour évaluer le degré de sénescence des érythrocytes destinés aux transfusions sanguines. Il est connu que les érythrocytes ont une durée de vie de 120 jours, dans la circulation sanguine. Ensuite ils sont phagocytés par les macrophages. Le mécanisme de l'érythrophagocytose est lié à la perte de molécules d'acide sialique des glycoprotéines et des glycolipides des membranes des érythrocytes sénescents. (Bratosin et al. Glycoconjugate J. 12, 1995, 258-267). Les inventeurs ont émis l'hypothèse et ont vérifié que le vieillissement des érythrocytes au cours de leur stockage dans les centres de transfusion induit un phénomène de désialylation analogue à celui qui se produit au cours de la sénescence in vivo, ce qui permet d'expliquer que 3 jours après une transfusion, on ne retrouve que 30 % d'érythrocytes fonctionnels. Le rôle central de la phagocytose par les macrophages, dans les phénomènes observés, a conduit la Demanderesse à tenter de mettre au point un procédé permettant de la quantifier, de manière simple, rapide, sensible et reproductible, pour en tirer diverses applications à but thérapeutique ou diagnostique. Ainsi la Demanderesse a mis en évidence la capacité de macrophages mis en culture in vitro de remplir leur fonction naturelle de phagocytose de cellules étrangères ou anormales, comme les érythrocytes sénescents. La Demanderesse en a déduit un procédé permettant une mesure objective de cette capacité de phagocytose, par le marquage artificiel des érythrocytes par un fluorochrome, leur phagocytose in vitro et la mesure du marquage consécutif des macrophages ayant phagocyté les érythrocytes par cytofluorimétrie en flux. Le même procédé peut, de manière évidente être appliqué à la mesure de la phagocytose de toute cellule dont l'état physiologique peut être corrélé à une modification de sa capacité à être phagocytée. On considérera donc comme "cellule cible" toute cellule dérivée d'un prélèvement sanguin ou d'une biopsie, fraîchement prélevée ou stockée ou mise en culture, qui devient la cible de la phagocytose par les macrophages et qui, par le procédé selon l'invention, trouve une application diagnostique ou de suivi thérapeutique. Parmi ces cellules on peut citer, à titre d'exemple non limitatif, des cellules cancéreuses, des cellules lésées, des cellules infectées ou parasitées... Ces cellules (en particulier les érythrocytes) peuvent également avoir été conservées de manière appropriée en vue d'un usage différé, le procédé permettant d'en contrôler la qualité. Dans son principe général, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: a) la mise en culture de macrophages; b) le marquage des cellules cibles par un fluorochrome; c) la mise en contact des cellules cibles marquées avec la culture de macrophages pendant le temps nécessaire pour permettre leur phagocytose; d) l'élimination des cellules non phagocytées; e) la récolte des macrophages; f) la mesure et l'enregistrement du marquage des macrophages Pour l'étape a., on utilise de préférence des macrophages péritonéaux de souris fraîchement prélevés, qui sont incubés en conditions de culture standard à 37 C, pendant environ une heure en absence de serum puis pendant 2 à 6 heures en présence de sérum de veau foetal. Pour l'étape b., le fluorochrome sera plus particulièrement choisi parmi les colorants lipophiles non cytotoxiques, se fixant spécifiquement et irréversiblement dans les membranes cellulaires, comme le colorant connu sous l'appellation PKH-26 (produit par Zynaxis Cell Science Inc. USA et vendu par Sigma). Ce fluorochrome est constitué par fixation covalente d'une chaîne aliphatique à 26 carbones sur l'acridine orange. Cette "queue" hydrophobe fixe en quelques minutes le marqueur fluorescent dans la couche lipidique de la membrane cellulaire, de manière irréversible et sans en modifier l'intégrité. Tout autre fluorochrome qui présenterait les mêmes avantages pourrait également être utilisé. Pour l'étape c., les cellules marquées seront mises en contact avec la culture de macrophages pendant 1 à 6 heures à 37 C. Pour l'étape d., l'élimination des cellules non phagocytées sera effectuée par 3 lavages en milieu physiologique, et complétée par la lyse des cellules adhérant à la surface externe des macrophages par un traitement de 5 minutes en tampon hypotonique dans le cas des érythrocytes. Pour l'étape e., la récolte des macrophages sera effectuée, de préférence, après traitement de la culture pendant 15 minutes avec une solution de lidocaïne, par leur mise en suspension en tampon physiologique, leur fixation par un traitement à l'éthanol à 70 % pendant 20 minutes et leur remise en suspension en milieu physiologique. Pour l'étape f., la mesure et l'enregistrement de la fluorescence des macrophages sera effectuée de préférence au moyen d'un cytofluorimètre en flux, ladite mesure portant sur un nombre statistiquement significatif de macrophages, par exemple 5000 cellules pour chaque condition expérimentale. Les mesures enregistrées permettent ainsi de calculer, avec un logiciel approprié, le pourcentage de macrophages ayant phagocyté au moins une cellule et de visualiser, sur des histogrammes, des sous-populations de macrophages présentant différents niveaux de phagocytose. Le procédé selon l'invention est plus simple et plus rapide que les procédés utilisant le marquage radioactif au 51Cr et surtout, il évite une cause d'erreur liée aux variations aléatoires du nombre des macrophages. Le premier domaine d'application du procédé selon l'invention est l'évaluation de la sénescence des érythrocytes au cours de leur stockage en vue des transfusions sanguines. Dans ce but, l'érythrophagocytose est mesurée au cours du temps et son augmentation est utilisée comme révélateur de modifications de la structure membranaire des érythrocytes, associées à leur sénescence. La simplicité du procédé permet de l'utiliser comme test de routine. Le même procédé permet également d'évaluer les améliorations des conditions de conservation des érythrocytes destinés aux transfusions sanguines. Il s'applique également au contrôle de qualité et au suivi des améliorations des conditions de conservation des érythrocytes destinés aux analyses, notamment aux tests de compatibilité prétransfusionnels. Le procédé trouve également des applications diagnostiques: par exemple, l'évaluation de l'état de sénescence des érythrocytes dans un prélèvement sanguin peut être utilisée pour identifier des états d'anémie qui nécessitent une transfusion sanguine (le pourcentage d'érythrocytes sénescents indiquant que le sujet ne régénère plus ou plus suffisamment de cellules immatures). Un mode de mise en euvre du procédé est explicité dans l'exemple suivant qui illustre l'invention sans en limiter la portée. Les résultats sont supportés par les figures suivantes: Figure 1: Histogramme de cytofluorimétrie en flux de l'érythrophagocytose après 1 heure d'incubation des érythrocytes marqués à la PKH-26 et des macrophages péritonéaux. 1 à 4:nombre d'érythrocytes phagocytés. Abscisse: logarithme de l'intensité de la fluorescence. Ordonnée:nombre de cellules. Figure 2: Histogramme de cytofluorimétrie en flux de l'érythrophagocytose après 2 heures d'incubation (comme figure 1) Pic 1: contrôle: inhibition de la phagocytose en présence d'azidure de sodium Pic 2: macrophages incubés en présence d'érythrocytes natifs Pics 3A et 3B: macrophages incubés en présence d'érythrocytestraités à la neuraminidase. Figure 3: Analyse graphique "dot-plot" de l'érythrophagocytose après 2 heures d'incubation Ordonnée: fluorescence rouge des érythrocytes marqués à la PKH-26. Abscisse: autofluorescence verte des macrophages. 3A: contrôle en présence d'azide de sodium 3B: macrophages incubés avec des érythrocytes natifs 3C: macrophages incubés avec des érythrocytes traités à la neuraminidase Ri: région de référence des macrophages en absence de phagocytose R2: région de référence de phagocytose. R3 et R4: 2 sous-populations définies par l'intensité de leur fluorescence en rapport avec le nombre d'érythrocytes phagocytés. Exemple 1 - Evaluation de l'érythrophagocytose par des macrophages en culture. 1) Mise en culture des macrophages. On utilise des souris (mâles et femelles) de souche Swiss âgées de 6 à 8 semaines. Les macrophages sont récoltés par lavage de la cavité péritonéale de souris avec 10 ml de solution physiologique de Hanks. La suspension de cellules est centrifugée à 350 g pendant 5 minutes à 4 C. Le culot est resuspendu en milieu DMEM contenant % de serum fetal de veau. La suspension de cellules est inoculée sur boîtes de culture multipuits en polystyrène, à raison de 500 gl de suspension à 2-4 105- 6 cellules/ml par boîte à 24 puits de 16 mm de diamètre, et incubée pendant 4 heures à 37 C, à l'air humidifié et en présence de 5 % de C02. Ensuite les cellules non adhérentes sont éliminées par 2 lavages en milieu DMEM et les macrophages adhérents sont utilisés pour les tests de phagocytose. 2) Marquage des érythrocytes. Pour la mise au point du test et l'élaboration des courbes de référence, on utilise du sang humain collecté en présence d'héparine. Les érythrocytes sont séparés par centrifugation à 2000 g pendant 5 minutes à 4 C. Le culot est lavé 3 fois en tampon phosphate additionné d'un inhibiteur de protéase (PMSF, phénylméthylsulfonyl fluorure, 0,2 mM). Le marquage avec le colorant fluorescent rouge PKH-26 est effectué selon les instructions du fournisseur (Sigma, St Louis, MO. USA - le colorant est fabriqué par Zynaxis - Malverne-PA-USA) Brièvement, 50 Al de suspension d'érythrocytes (à 108 cellules/ml) sont mis en suspension dans 1 ml du "diluent C" du kit et additionnés de 1 ml de PKH- 26 2 AM. Le mélange est agité doucement pendant 4 minutes à 25 C. La réaction de marquage est arrêtée par l'addition de serum humain, de milieu complet et par centrifugation des cellules à 2000 g pendant 5 minutes à 25 C. Le culot est lavé et prêt à l'emploi. 3) Desialylation des érythrocytes. Pour obtenir un étalon de phagocytose maximale, un aliquot d'érythrocytes est désialylé par traitement à la neuraminidase de Vibrio cholerae (il est connu que les cellules d'origine humaine n'ont qu'un type d'acide sialique, l'acide N-acétylneuraminique et qu'il est très sensible à la neuraminidase): mU d'enzyme sont ajoutés à 1 ml de suspension d'érythrocytes (à hématocrite de 30 %) en tampon phosphate pH 7,4. Après 1 heure d'incubation à 37 C sous agitation, les érythrocytes sont centrifugés à 2000 g pendant 5 minutes à 4 C puis le culot est lavé 3 fois en tampon phosphate. La désialylation doit être effectuée après le marquage au PKH-26. 4) Mesure de la phagocytose. Des aliquots de 2.107 érythrocytes natifs ou traités à la neuraminidase, marqués au PKH-26, en suspension dans 250 g1 de milieu DMEM sont mis en contact avec les cultures de macrophages et incubés dans 150 J1 de serum par puits, à 37 C, en air humidifié et à 5 % de C02. L'incubation est poursuivie pendant 1 heure pour obtenir une phagocytose limitée ou pendant 2 heures pour obtenir une phagocytose intense. Les érythrocytes non absorbés sont éliminés par 3 lavages avec 0,5 ml de milieu DMEM. Les érythrocytes adhérents aux membranes des macrophages mais non internalisés sont lysés par un traitement avec 0,5 ml de tampon hypotonique à pH 7,2 (NH4C1 mM, Tris 17 mM) suivi d'un lavage en tampon phosphate. Les macrophages sont ensuite détachés de la boîte de culture par un traitement à la lidocaine (4 mg/ml en tampon phosphate - EDTA). Après 15 minutes d'incubation sur de la glace (selon Rabinovitch et DeStefano - In vitro 11, 1975, 379), ils sont détachés à la pipette, récoltés, centrifugés à 350 g pendant 5 minutes à 4 C, puis lavés en tampon phosphate. Ensuite les macrophages sont traités avec 70 % d'éthanol pendant 20 minutes à température ambiante ce qui fixe les cellules et dissout la PKH-26 des fragments membranaires des érythrocytes encore adhérents. Ensuite ils sont remis en suspension en tampon phosphate à pH 7,4. La suspension de macrophages est ensuite analysée par cytofluorimétrie en flux à l'aide d'un appareil FAC Scan de Becton-Dickinson (San Jose, CA, USA), équipé d'un logiciel PC LYSYS pour l'analyse des résultats. Pour chaque population, 5000 particules fluorescentes sont analysées. On observe un "bruit de fond" de fluorescence endogène des macrophages natifs et des macrophages préincubés en présence de 1 % d'azide de sodium (puissant inhibiteur de phagocytose) Les figures 1 et 2 montrent le suivi au cours du temps de l'internalisation des macrophages au cytofluorimètre en flux. Sur l'histogramme de la figure 1, on observe 4 pics correspondant à l'internalisation de 1 à 4 érythrocytes par macrophage, après 1 heure de contact entre macrophages et érythrocytes désialylés. Après deux heures d'incubation, la phagocytose est plus intense: sur l'histogramme de la figure 2 on observe que les 4 pics précédents ont évolué en 2 pics plus intensément marqués: 3A et 3B (intensité moyenne de fluorescence: 112). Les contrôles (fluorescence endogène) sont réalisés avec les macrophages seuls ou les macrophages et érythrocytes en présence d'azide de sodium (pic 1 - intensité moyenne de fluorescence: 59,10) et avec les macrophages incubés en présence d'érythrocytes natifs (pic 2 - intensité moyenne de fluorescence: 67) donc comprenant un faible pourcentage d'érythrocytes sénescents et naturellement désialylés. La figure 3 représente une analyse graphique "dot plot" des populations de macrophages phagocytant ou non les érythrocytes, après 2 heures d'incubation. La région Rl comprend les macrophages seuls, en absence d'érythrocytes et correspond au bruit de fond d'autofluorescence (figure A) La région R2 comprend les macrophages ayant phagocyté 1 ou plusieurs érythrocytes. La figure B montre la phagocytose des érythrocytes natifs, donc naturellement sénescents. La figure C montre l'augmentation de phagocytose après traitement de désialylation des érythrocytes et fait apparaître 2 sous-populations R3 et R4 dans la zone R2. Les pourcentages respectifs de distribution des cellules calculés à partir de ces figures 3 (A à C) sont repris dans le tableau suivant: Capacité de phagocytose de macrophages incubés avec égin des érythrocytes natifs des érythrocytes désialylés Régions % du total fluorescence % du total fluorescence moyenne -oyenne RI 89.10 64,00 7,90 73,6 R2 3,70 132,90 81,40 115,00 R3 2,90 128,80 57,50 107,20 R4 0,50 150,40 24,00 135,60 On voit que 7,9 % des macrophages ne phagocytent pas. Le pourcentage de macrophages qui phagocytent passe de 3,7 % avec des érythrocytes natifs à 81,4 % avec des érythrocytes désialylés. Toutes les valeurs expérimentales seront donc comprises entre ces 2 valeurs de référence. REVENDICATIONS 1. Procédé d'évaluation de l'état physiologique de cellules cibles caractérisé en ce qu'il comprend la quantification de la phagocytose desdites cellules in vitro par des macrophages en culture, par la mise en oeuvre des étapes suivantes: a) la mise en culture de macrophages; b) le marquage des cellules cibles par un fluorochrome; c) la mise en contact des cellules cibles marquées avec la culture de macrophages pendant le temps nécessaire pour permettre leur phagocytose; d) l'élimination des cellules non phagocytées; e) la récolte des macrophages; f) la mesure et l'enregistrement du marquage des macrophages 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en culture des macrophages selon l'étape a) est réalisée avec des macrophages péritonéaux de souris fraîchement prélevés et incubés pendant environ 4 heures à 37 C. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules cibles sont des cellules dérivées d'un prélèvement sanguin ou d'une biopsie. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que les cellules sont conservées, de manière appropriée, en vue d'un usage différé. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 4, caractérisé en ce que les cellules sont des érythrocytes. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marquage de l'étape b) est effectué avec un fluorochrome lipophile non cytotoxique capable de se fixer irréversiblement dans les membranes cellulaires. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le fluorochrome est la molécule connue sous l'appellation PKH-26. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé il en ce que, dans l'étape c), les cellules sont mises en contact avec les macrophages pendant 1 à 6 heures à 37 C. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d) est réalisée par 3 lavages en milieu physiologique et par un traitement de 5 minutes en tampon hypotonique pour lyser les cellules adhérant à la surface externe des macrophages. 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape e) comprend la récolte des macrophages après traitement de la culture avec une solution de lidocaïne, leur mise en suspension en tampon physiologique, leur fixation par traitement à l'éthanol à 70 % pendant 20 minutes et leur remise en suspension en milieu physiologique. 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure du marquage des macrophages selon l'étape f) est effectuée par cytofluorimétrie en flux et que son enregistrement permet de visualiser, sur des histogrammes, des sous-populations de macrophages présentant différents niveaux de phagocytose. 12. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour évaluer la sénescence des érythrocytes au cours de leur conservation en vue des transfusions sanguines et des tests d'analyses. 13. Utilisation selon la revendication 12 pour évaluer les améliorations des conditions de conservation des érythrocytes. 14. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 pour évaluer la sénescence des érythrocytes dans un prélèvement sanguin pour diagnostiquer des états d'anémie nécessitant une transfusion sanguine.