Brevet FR2758568A1 — publié le 19980724

SOUCHES MUTANTES NON PATHOGENES D'E. COLI, LEUR PROCEDE D'OBTENTION ET LEURS UTILISATIONS. L'invention est relative à de nouveaux mutants non pathogènes d'E. coli, utilisables en particulier pour l'obtention de vaccins permettant la prévention de la colibacillose chez le lapereau. La colibacillose est la principale cause de diarrhée chez les lapereaux au sevrage. Cette maladie est une cause importante de mortalité dans les élevages, et des recherches ont été entreprises en vue d'obtenir un vaccin efficace. Les principales stratégies vaccinales développées jusqu'à présent font appel à des souches homologues inactivées ou à des souches hétérologues vivantes non ou peu pathogènes induisant des réponses immunitaires locales (inductions d'immunoglobulines A antilipopolysaccharide) et/ou des effets de barrière écologique s'exerçant à l'égard des souches 0103 pathogènes. Cependant, aucune de ces stratégies n'a abouti jusqu'à présent à l'obtention d'un vaccin conférant une protection totale et d'une parfaite innocuité. Des recherches sont donc poursuivies en vue d'identifier les mécanismes responsables de la pathogénicité de certaines souches d'E. coli. Des souches d'E. coli entéropathogènes (EPEC) de l'homme, qui sont responsables de diarrhées chez l'enfant, sont capables de provoquer la formation de lésions spécifiques de l'épithélium intestinal dites: "lésions d'attachement-effacement". Chez ces souches EPEC humaines, on a défini un phénotype d'attachementeffacement, corrélé à un test in vitro sur cellules épithéliales de lignée Hela ou Hep-2: le test FAS (pour "Fluorescent Actin Staining"). Dans ce test, les bactéries qui adhèrent aux cellules de manière dite localisée, provoquent au niveau des foyers d'adhésion une concrétion d'actine polymérisée qui est détectée par la phalloidine couplée à un fluorochrome [KNUTTON et ai., Infect. Immun. 57, p. 1290-1298, (1989)]. Les déterminants majeurs de ce phénotype d'attachement-effacement sont codés par un locus dénommé LEE ("Locus of Enterocyte Effacement") [Mc DANIEL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, p. 1664-1668, (1995)]. Il a été observé que des souches d'E. coli responsables des diarrhées des lapereaux peuvent provoquer des lésions d'attachement-effacement similaires à celles provoquées par les souches EPEC humaines [LICOIS et ai., Infect. Immun. 59, P. 3796-3800, (1991); MOON et ai., Infect. Immun., 41, p. 1340-1351, (1983); PEETERS et al. Vet. Pathol. 22, p. 54-59, (1985); TAKEUCHI et al., Infect. Immun. , 19, p. 686-694, (1978)]. Ces souches EPEC de lapin sont également dénommées REPEC (pour "Rabbit EPEC") par certains auteurs [ROBINS-BROWNE et al., Infect. Immun. 62, p. 3329-3336, (1994); ROBINS-BROWNE et al., Infect. Immun. 62, p. 1584-1592, (1994)]. Un homologue du locus chromosomique LEE de 35 kpb originellement mis en évidence chez la souche EPEC prototype d'origine humaine E2348/69, a été retrouvé [KARAOLIS et al., In " Proceedings of the first International Rushmore Conference on Mechanisms in the Pathogenesis of Enteric Diseases ". Rapid City, S.D., (1995); Mc DANIEL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, p. 1664-1668, (1995)] chez la souche REPEC de référence dénommée RDEC-1 (sérovar 015:H-), initialement décrite par CANTEY et BLAKE [J. Infect. Dis. 135, p. 454-462, (1977)] Une protéine de membrane externe de 95-100 kDa appelée intimine, codée par un gène dénommé eaeA du locus LEE des souches EPEC humaines participe à la formation des lésions d'attachement-effacement [JERSE et al., Infect. Immun. 59, p. 4302-4309, (1991)]. Une étude concernant le rôle du gène eaeA dans le pouvoir pathogène a été effectuée par DONNENBERG et al. [J. Clin. Invest., 92, p. 1412-1417, (1993)]. La souche E2348/69 a été testée chez 11 volontaires qui ont reçu 2.1010 UFC par voie orale. Onze autres volontaires ont reçu la même dose d'un mutant eaeA isogénique. Les résultats démontrent le rôle de eaeA dans la virulence, et donc indirectement une corrélation entre lésions A/E, FAS positif et locus LEE (non connu à l'époque) avec la virulence, puisqu'il était alors considéré que eaeA était seul impliqué dans les lésions A/E et le phénotype FAS positif. Cependant, le pouvoir pathogène résiduel du mutant démontre l'intervention de gènes de virulence autres que eaeA. En outre, le gène eaeA est également présent chez des souches d'E. coli non-entéropathogènes [CANTEY et MOSELEY, Infect. Immun. 59, p. 3924-3929, (1991); [LEROY et al. J. Med. Microbiol., 40, p. 90-94, (1993)]. Un analogue du gène eaeA qui code pour l'intimine a été mis en évidence chez différentes souches d'E. coli de lapin [AGIN et WOLF, In Proceedings of the First International Rushmore Conference on Mechanisms in the Pathogenesis of Enteric Diseases, Rapid City, SD. p. 43 (1995); LEROY et al. J. Med. Microbiol. 40, p. 90-94, (1993); POHL et ai., Infect. Immun., 61, p. 2203-2206, (1993)]. En Europe de l'Ouest, des études épidémiologiques ont montré que les souches responsables des diarrhées au sevrage du lapin appartiennent à plusieurs sérogroupes, le plus fréquent étant 0103 [BLANCO et al., Vet. Microbiol., 38, p. 193-201, (1994); CANGUILHEM et MILON, J. Clin. Microbiol. 27, p. 743-747, (1989)]. Les souches 0103, (qui possèdent en outre la particularité de ne pas fermenter le rhamnose), sont très pathogènes chez le lapin après inoculation expérimentale par voie digestive, et produisent des lésions d'attachement-effacement [LICOIS et al. Infect. Immun. 59, p. 3796-3800, (1991); POHL et al., Infect. Immun., 61, p. 2203-2206, (1993); ROBINS-BROWNE et ai., Infect. Immun., 62, p. 3329-3336, (1994); ROBINS-BROWNE et al., Infect. Immun. 62, p. 1584-1592, (1994)] d'aspect similaire à celles observées avec les souches EPEC d'origine humaine. Ce critère lésionnel, associé au fait que l'ADN chromosomique de ces souches hybride avec des sondes spécifiques du gène eaeA de la souche EPEC humaine de référence [LEROY et al. J. Med. Microbiol., 40, p. 90- 94, (1993); POHL et ai., Infect. Immun., 61, P. 2203- 2206, (1993)] comme dans le cas de la souche RDEC-1, permettrait de les rapprocher des EPEC (ou REPEC). Toutefois, aucune homologie avec des gènes du locus LEE autres que le gène eaeA n'a été mise en évidence chez les souches 0103. Les souches d'E. coli 0103 produisent une adhésine spécifique, dénommée AF/R2, qui permet aux bactéries d'adhérer aux entérocytes de lapin et aux cellules de lignée Hela et Hep-2 [MILON et ai., Infect. Immun. 58, p. 2690-2696, (1990)]. Il a été démontré que cette adhésine contribuait au pouvoir pathogène pour le lapereau des souches 0103. Cette démonstration a été effectuée en comparant le pouvoir pathogène d'une souche représentative du sérogroupe 0103, dénommée souche B10, à celui d'un mutant de cette souche ayant perdu la propriété d'adhésion par suite de l'insertion du transposon Tn5::phoA dans l'opéron codant pour l'adhésine AF/R2 [PILLIEN et al., Vet. Microbiol., 50, p. 105-115, (1996)]. L'utilisation vaccinale de ces mutants a été proposée [CHALARENG et ai., Communication aux VIrmes journées de la recherche cunicole, La Rochelle, 6 et 7 décembre 1994; INRA-ITAVI- ASFC Publ.] Afin de préciser le degré de similitude entre les souches E. coli 0103 et les souches EPEC d'origine humaine, les inventeurs ont étudié la réponse des souches 0103 au test FAS; le phénomène de FAS est en effet considéré comme associé au locus LEE des EPEC [Mc DANIEL et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, p. 1664-1668, (1995)]. Or, les Inventeurs ont constaté que la souche B10 répondait négativement à ce test FAS, alors que, dans les mêmes conditions expérimentales, la souche REPEC RDEC-1, ainsi que les souches EPEC humaines produisaient des réactions positives. En revanche, les Inventeurs ont constaté que, de manière surprenante, la souche B10 produisait sur les cellules épithéliales de lignée HeLa un effet cytopathique (ECP) original, se manifestant par une réorganisation du cytosquelette et des plaques d'adhésion focale. Comme dans le cas de la réponse de type FAS, cet ECP est associé à une polymérisation intense de l'actine cellulaire. Toutefois, contrairement à ce qui est observé dans les réponses de type FAS, l'actine polymérisée ne se localise pas au niveau des contacts bactériens, mais s'organise sous la forme de câbles traversant la cellule de part en part. Ces modifications du cytosquelette s'amplifient notablement et irréversiblement avec le temps. En outre, la formation des câbles d'actine s'accompagne de l'augmentation progressive de la quantité de vinculine, un phénomène qui n'est pas observé dans la réponse de type FAS [FINLAY et al., Infect. Immun. 60, p. 2541-2543, (1992)]. Chez les cellules contrôle, la vinculine se présente sous la forme d'amas punctiformes apparaissant sur le contour des cellules, tandis que chez les cellules exposées à B10, la vinculine est distribuée sur toute la surface cellulaire, passant d'une distribution punctiforme à une distribution quasi- fibrillaire, calquée sur celle des câbles d'actine. Cette modification du cytosquelette s'accompagne d'un arrêt de la multiplication cellulaire et d'une augmentation modérée de la taille de cellules. La cytostase est durable mais débouche sur la mort des cellules à l'issue d'une période de 5 à 6 jours. En testant d'autres souches, les Inventeurs ont également constaté que cet ECP se manifestait chez toutes les souches 0103 rhamnose négative de lapin, ainsi que chez la souche RDEC-1. Ils l'ont en outre également observé chez deux isolats cliniques EPEC d'origine humaine. Par contre, la souche de référence d'origine humaine E2348/69, testée dans les mêmes conditions, n'a pas produit d'ECP détectable. Les modifications du cytosquelette qui caractérisent cet ECP évoquent celles produites par les toxine CNF et CNF2 d'E. coli [OSWALD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, p. 3814-3818, (1994)]. Toutefois, les Inventeurs n'ont mis en évidence chez B10 aucun gène homologue à ceux de CNF1 et CNF2 d'E. coli. En outre, alors que l'activité des CNF est détectable dans les lysats de culture des souches produisant, contrairement aux souches produisant CNF, aucune activité n'a pu être détectée dans les lysats de culture de B10. Il est toutefois possible que le mécanisme d'action conduisant à l'ECP induit par B10 soit similaire à celui des toxines CNF, qui est associé à l'activation de Rho, une petite protéine G qui participe à la régulation du cytosquelette et des foyers d'adhésion focale [FLINN et RIDLEY, J. Cell Sci. 109, p. 1133-1141, (1996)]. Parallèlement, les Inventeurs ont procédé à l'hybridation de l'ADN chromosomique de plusieurs souches 0103, dont la souche prototype B10, avec quatre sondes dérivées du bloc de virulence LEE de 35 kb de la souche, et ont également comparé les protéines sécrétées dans le milieu de culture par les souches 0103 et par la souche E2348/69, par l'analyse de leurs profils électrophorétiques respectifs, et par immunoprécipitations croisées. Ils ont ainsi mis en évidence chez les souches 0103 un locus homologue du bloc de virulence LEE de E2348/69, bien que présentant avec ce dernier quelques différences de structure (détectées par polymorphisme des sites de restriction de l'ADN et des différences mineures de migration électrophorétique des protéines sécrétées). Ce locus analogue au LEE des 5 souches EPEC sera ci-après dénommé également " locus LEE ". Les Inventeurs ont en outre constaté que cet ECP était corrélé au pouvoir pathogène in vive des souches 0103. Les Inventeurs ont construit, à partir d'E. coli 0103, des souches portant des mutations de ce locus LEE, et ont constaté qu'une souche dans laquelle un des gènes de ce locus LEE est inactivé n'induit plus l'ECP, et perd son pouvoir pathogène, bien qu'elle conserve l'adhésine AF/R2, et demeure capable de coloniser l'intestin. Il apparaît donc que le locus LEE des souches 0103 porte des déterminants génétiques responsables de i'ECP et de la pathogénicité. Enfin, les Inventeurs ont également étudié les propriétés immunogènes de ces mutants du locus LEE, et ont constaté que ces souches mutantes conféraient une protection très efficace contre la souche parentale pathogène. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante non-pathogène d'E. coli à partir d'une souche d'E. coli pathogène capable d'induire sur des cellules épithéliales HeLa un effet cytopathique se manifestant par la formation de câbles d'actine polymérisée traversant de part en part lesdites cellules et par une augmentation de la quantité de vinculine, caractérisé en ce que l'on procède à la mutagenèse de ladite souche d'E. coli pathogène, et en ce que l'on sélectionne les mutants ayant perdu la capacité d'induire ledit effet cytopathique.35 A titre d'exemple de souche d'E. coli pathogène capable d'induire l'effet cytopathique 8 2758568 mentionné ci-dessus, et donc utilisable comme matériau de départ pour la mise en oeuvre du procédé selon l'Invention, on citera la souche B10, qui a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, le 15 Janvier 1997 sous le n 1-1807 La présente invention englobe également les souches mutantes non-pathogènes d'E. coli susceptibles d'être obtenues par ledit procédé. Ces souches portent au moins une mutation résultant en l'inactivation d'au moins l'un des gènes du locus LEE. Selon un mode de réalisation préféré d'une souche mutante conforme à l'invention, elle est obtenue à partir d'une souche d'E. coli pathogène du lapin appartenant au sérogroupe 0103. Selon un autre mode de réalisation préféré d'une souche mutante conforme à l'invention, elle porte au moins une mutation résultant en l'inactivation d'au moins l'un des gènes sep du locus LEE. Une souche mutante conforme à l'invention, dénommée B10/CA1 a été déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, le 15 Janvier 1997 sous le n 1-1808. La présente invention a également pour objet des vaccins, et en particulier des vaccins administrables par voie orale, comprenant au moins une souche mutante d'E. coli conforme à l'invention. Avantageusement, ladite souche mutante possède une adhésine AF/R2 fonctionnelle, et conserve de ce fait sa capacité à coloniser l'intestin. Par exemple, des vaccins conformes à l'invention, comprenant la souche BO10/CA1, peuvent être administrés par voie orale, et permettent de protéger des lapereaux au sevrage contre les infections par des E. coli pathogènes du sérogroupe 103. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention de souches mutantes conformes à l'invention, et d'utilisation de ces souches en tant que vaccins. EXEMPLE 1: MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET CYTOPATHIQUE PRODUIT PAR LES SOUCHES D'E. COLI 0103 SUR LES CELLULES HeLa EN CULTURE. Les souches bactériennes utilisées dans cette expérimentation sont: - les souches de référence d'E. coli entéropathogènes de lapin B10 et RDEC-1; la souche B10/16E1, qui est un mutant de B10 obtenu par mutagenèse TnphoA, et ne produisant plus l'adhésine AF/R2 [PILLIEN et al., Vet. Microbiol. 50, p. -115, (1996)]. - 18 souches d'E. coli isolées de cas séparés de diarrhées du lapin et étudiées antérieurement pour leur pouvoir pathogène expérimental et la possession de certains caractères de virulence, tels que AF/R2 et eaeA [CANGUILHEM et MILON, J. Clin. Microbiol., 27, p. 743- 747, (1989); LEROY et al., J. Med. Microbiol., 40, p. 90- 94, (1993)]; et à titre de témoin, des souches humaines FAS positives: - la souche de référence EPEC humaine E2348/69; - deux souches humaines EPEC dénommées CF11201 et CF517 (aimablement fournies par Christiane Forestier, Faculté de Pharmacie de ClermontFerrand), provenant de diarrhées d'enfant, hybridant avec les sondes spécifiques de eaeA et bfp et répondant positivement au FAS test. - Test d'interaction sur les cellules HeLa La veille du test d'interaction, les cellules HeLa sont ensemencées en lames à compartiments (LAB-TEK, MILES SCIENTIFIC) ou en plaques de titrage pour cultures cellulaires (NUNC), à raison de 4.104 cellules par ml de milieu minimum essentiel de EAGLE avec sels de EARLE (MEME, GIBCO) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF, GIBCO) et 50 kg/ml de gentamicine (GIBCO). La veille du test également, les bactéries sont pré-cultivées en bouillon PENASSAY (DIFCO). Après 24 H d'incubation à 370C en présence de 5% de C02, les cellules sont lavées au tampon salin de EARLE (EBSS, GIBCO) puis mises en présence des bactéries dans du MEME contenant 25 mM de tampon HEPES (GIBCO), 1% de D-mannose (SIGMA) et 5% de SVF (sérum de veau foetal). Après 4 h d'incubation à 37 C en présence de 5% de CO2, les cellules sont lavées abondamment à l'EBSS puis remises en MEME contenant 10% de SVF, et 80 gg/ml de gentamicine pour détruire les bactéries résiduelles. Après des temps d'incubation variables (de 1 à 6 jours à 37 C) en présence de 5% de CO2, les cellules sont lavées à l'EBSS, fixées au formol à 1% en PBS pendant 30 min. à température ambiante. Les modifications morphologiques ont été recherchées, et la croissance cellulaire quantifiée à l'issue de ces différents temps d'incubation. * Modifications du cytosquelette: L'actine-F est visualisée par la phalloidine couplée à la rhodamine (MOLECULAR PROBES) dans les conditions recommandées par le fabricant. La vinculine est mise en évidence par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-vinculine (clone VIN-11-5; SIGMA) à la dilution 1/100, et d'un anticorps de chèvre anti-souris couplé à la fluorescéine (n 0819, IMMUNOTECH). Les lames sont observées avec un microscope à fluorescence LEICA DMR (objectif x40). Les résultats sont illustrés par les Figures 1 et 2. La Figure 1 représente les modifications morphologiques du cytosquelette des cellules HeLa en FAS test après exposition aux souches d'E. coli B10(A et B) et E2348/69 (C et D), suivie de 4 heures d'incubation. Coloration de l'actine-F par la phalloidine- rhodamine. Pour chaque souche un même champ microscopique est montré en contraste de phase (A et C) et en fluorescence (B et D). Objectif x40. Barre = 20 gm. La Figure 2 représente les modifications du cytosquelette et des plaques d'adhésion focale induites dans les cellules HeLa à la suite de l'exposition à la souche d'E. col i B10, 24h (B et E), et 48h (C et F) après l'interaction, ou au mutant B10/CA1 (obtenu comme décrit à l'Exemple 2 ci-après), 24h après l'interaction (A et D). A gauche (A,B,C): coloration de l'actine-F par la phalloidine-rhodamine. A droite (D,E,F): coloration de la vinculine par immunofluorescence indirecte avec des anticorps anti- vinculine. Barre = 20 gm. * Ouantification de la croissance cellulaire: Le bleu de méthylène colore spécifiquement les protéines cellulaires et permet d'une part, d'observer la morphologie des cellules et, d'autre part, de doser le contenu protéique total des tapis cellulaires. Les protéines cellulaires sont colorées par le bleu de méthylène à 1% en tampon borate 0,01 M selon la méthode décrite par WILSON [Animal cell culture: A practical approach. R.I. Frishney (ed.) IRL Press Oxford, (1992)]. La quantification des protéines résiduelles des tapis cellulaires est effectuée le jour de l'interaction et 72 heures plus tard, par extraction du colorant par HCl 0,1 M, puis mesure de la densité optique à 630 nm sur un lecteur automatique de plaque ELISA (Modèle M 5000/7000, DYNATECH). Les résultats sont illustrés par les Figures 3 et 4. La Figure 3 illustre la morphologie des cellules HeLa quatre jours après l'interaction avec la souche B10 (B), ainsi qu'avec le mutant B10/CA1 (A). Coloration au bleu de méthylène. Barre = 20 gm. La Figure 4 illustre l'effet de la dose d'inoculum bactérien sur la croissance des cellules Hela, à la suite de l'interaction avec les souches d'E. coli B10 (O), B10/CA1(M), et B10/16El(*). La multiplicité d'infection = nombre d'UFC par cellule au début du test d'interaction, est portée en abscisse; Le coefficient de croissance cellulaire = DO 72H après l'interaction/DO le jour de l'interaction est porté en ordonnée. Chaque point représente la moyenne de quatre puits. L'écart-type du coefficient de croissance cellulaire est dans tous les cas inférieur à 0,2. Conclusion Comme le montre la figure 1, la souche B10 n'induit pas de réponse de type FAS, c'est à dire ne provoque aucune concrétion significative d'actine polymérisée au point de contact des bactéries avec les cellules, et ceci en dépit d'une forte adhésion, contrairement à la souche E2348/69 qui exerce dans les mêmes conditions une réponse FAS fortement positive. Une réponse de type FAS positive a également été observée avec la souche RDEC-1, malgré une adhésion très clairsemée, ainsi qu'avec les souches humaines CF11201 et CF517. Parmi les autres souches d'E. coli de lapin testées, 4 souches de lapin de phénotype 0103 rhamnose négatives n'induisent pas de réponse de type FAS. Les cellules exposées à la souche B10 présentent cependant de profondes modifications du cytosquelette décelables après la fin de l'interaction (figure 1), et s'amplifiant avec le temps (figures 2B, 2C, 2E et 2F). Ces modifications, désignées ici sous le terme d'ECP, se traduisent par le développement de nombreux câbles d'actine polymérisée traversant la cellule sous la forme de faisceaux souvent parallèles (figures 2B et 2C). Parallèlement au renforcement des faisceaux d'actine, on observe une augmentation progressive des formations de vinculine associées aux plaques d'adhésion focale. Ces formations qui sont habituellement punctiformes et périphériques chez des cellules exposées à la souche E2348/69, adoptent une distribution généralisée et pseudo-fibrillaire chez les cellules exposées à la souche B10, après 48 à 72H d'incubation (figure 2 E et 2 F). La taille des cellules exposées à la souche B10 augmente sensiblement avec le temps, d'un facteur d'environ 2,5 après 4 jours d'incubation et selon le diamètre du noyau (figure 3); parallèlement, la croissance cellulaire est bloquée, comme l'indique le dosage de protéines totales dans les tapis résiduels (figure 4). La mortalité des cellules n'intervient qu'à partir du 5ème jour d'incubation. On a d'autre part estimé qu'un inoculum de 50 à 100 unités formant colonies (UFC) de B10 par cellule en début de test permettait d'obtenir un ECP sur au moins 50% de cellules. La souche mutante B10/16E1 ne produisant pas l'adhésine fimbriaire AF/R2 [PILLIEN et al., Vet. Microbiol., 50, p. 105-115, (1996)], produit le même ECP que la souche B10 parentale, mais, comme le montre la figure 4, son pouvoir cytopathique est environ 50 fois moins élevé. Parmi les autres souches provenant de diarrhée de lapin qui ont été testées, les onze souches présentant le même phénotype que B10 (sérogroupe 0103, absence de fermentation du rhamnose, eaeA positive) produisent toutes les modifications morphologiques définissant l'ECP. Celui-ci est également induit par trois des six autres souches testées, ainsi que par la souche de référence RDEC-1. Parmi les souches EPEC d'origine humaine, la souche E2348/69 n'a pas produit d'ECP détectable tandis que les deux souches CF11201 et CF517 étaient fortement positives pour cet ECP. Il n'a pas été possible de reproduire i'ECP avec des surnageants de culture d'interaction de B10 concentrés dix fois, ni avec des lysats de corps bactériens produits à partir des mêmes cultures et concentrés également dix fois. EXEMPLE 2:PRODUCTION, SELECTION ET ANALYSE GENETIQUE DE MUTANTS ECP-NEGATIFS Pour aborder le déterminisme moléculaire de cet ECP et examiner la corrélation éventuelle de i'ECP avec le pouvoir entéropathogène chez le lapin, des clones ayant perdu la capacité de produire i'ECP ont été isolés à partir d'une banque de mutants de B10 obtenus par insertion au hasard du transposon Tn5IS50L::phoA (TnphoA) [MANOIL et BECKWITH, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, p. 8129- 8133, (1985)]. TnphoA est introduit dans la souche B10 par conjugaison du plasmide suicide pRT733 hébergé par la souche E. coli SM10 (Xpir+) [TAYLOR et al., J. Bacteriol. 171, p. 1870-1878, (1989)]. Les clones ayant reçu le transposon sont sélectionnés en deux temps: 1) Les mélanges de conjugaison sur gélose LURIA-BERTANI (milieu LA) sont d'abord enrichis en clones transposés par ensemencement en bouillon minimal M9 contenant de la kanamycine (20 gg/ml), puis incubation à 37 C pendant 48h. Dans ce milieu, les souches parentales ne poussent pas, SM10 étant auxotrophe (thy thr leu) et B10 sensible à la kanamycine. 2)Dans un deuxième temps, les cultures d'enrichissement sont étalées sur du milieu LA contenant de la kanamycine (50 ig/ml) et du 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-phosphate (XP) (40 tg/ml). Les clones de couleur bleue sont alors répliqués sur de la gélose au rouge de phénol contenant 1% de L- rhamnose, et sur du milieu LA contenant de la kanamycine (100 gg/ml) ou de l'ampicilline (100 gg/ml) de manière à éliminer les clones dans lesquels le plasmide pRT733 dans son entier a été co-intégré au génome de B10. Les clones possédant le phénotype: rhamnose- négatif, résistance à la kanamycine et sensibilité à l'ampicilline sont conservés pour l'analyse ultérieure. Les mutants ainsi sélectionnés sont alors cultivés en milieu PENASSAY contenant de la kanamycine (50gg/ml) pendant une nuit puis conservés à 20 C après addition de glycérol (20% final). La détection de leur aptitude à produire i'ECP sur les cellules HeLa est réalisée ensuite sur plaques de cultures cellulaires à 96 puits (FALCON) selon les modalités décrites à l'exemple 1 ci-dessus. Sur environ 2700 clones testés, 7 clones indépendants (c'est à dire issus de mélanges de conjugaison séparés) étaient ECP- négatifs et n'avaient pas intégré le plasmide suicide dans son intégralité. La perte de i'ECP par l'un de ces mutants (B10/CA1) est illustrée par la Figure 2 (A et B), qui montre que les cellules exposées à ce mutant ne subissent pas les modifications du cytosquelette caractéristiques de i'ECP induit par la souche sauvage B10. La figure 3 A montre également que le mutant B10/CA1 ne provoque pas les modifications morphologiques induites par la souche BO10. La figure 4 montre que le pouvoir cytopathique de ce mutant est quasiment nul. Caractérisation génétique des mutants ECP-négatifs. Les techniques utilisées sont, sauf indication contraire, mises en oeuvre selon les protocoles standard décrits par [SAMBROOK et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]. Pour déterminer le nombre d'insertions dans les mutants ECP-négatifs, un fragment HindIII de 3,4 kpb de Tn5 a été couplé à la digoxigénine (DIGUTP) par un kit commercial (DIG DNA, BOEHRINGER), en suivant lesrecommandations du fabricant. Cette sonde a été testée en transfert de Southern contre les fragments de digestion ClaI, BamHI et SalI de l'ADN total. Deux des 7 clones sélectionnés précédemment ont été éliminés car ils contenaient une double insertion. La localisation des inserts des 5 mutants restant a été effectuée comme suit: Les Inventeurs ont observé que l'ADN chromosomique de B10 s'hybridait avec quatre fragments spécifiques (A, B, C, D représentés sur la Figure 5) du locus LEE de la souche E2348/69 décrit par Mc DANIEL et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. 92, p. 1664-1668, (1995)], et représenté sur la figure 5a. Cette hybridation s'effectue au niveau d'une région de plus de 35 kb (représentée sur la Figure 5b) qui apparaît donc comme constituant un locus analogue au LEE de E2348/69, avec toutefois des différences importantes dans le polymorphisme de restriction. Des sondes ont été fabriquées en marquant les fragments A, B, C, D à la digoxine-UTP. Après digestion de l'ADN total par diverses enzymes de restriction puis Southern Blot, les profils d'hybridation des mutants ECP- négatifs de B10 avec ces sondes sont comparés à celui de la souche parentale B10 et à celui de E2348/69. L'utilisation de ces sondes a permis de conclure que les cinq mutants ont reçu l'insert TnphoA dans la région correspondant au locus LEE. L'emplacement de l'insertion TnphoA pour ces 5 mutants est indiqué sur la Figure 5b par une flèche entourée d'un cercle. Pour 3 d'entre eux (B10/CA1, B10/E2, BlO/FA12), l'insert a été localisé dans un fragment EcoRI de 8 kb hybridant avec la sonde B, c'est à dire au voisinage de gènes homologues aux gènes de sécrétion (sepA à sepD). L'insert du mutant B10/H12 se situe entre les régions hybridant avec les sondes B et C, et celui du mutant BO10/A9 dans le voisinage de gènes analogues à espA et espB. EXEMPLE 3: COMPARAISON DES PROFILS DE PROTEINES DES SOUCHES INDUISANT UNE REPONSE FAS, DES SOUCHES INDUISANT UN ECP, ET DES MUTANTS ECP-NEGATIFS. Afin d'identifier d'éventuelles protéines bactériennes sécrétées associées à l'ECP, les profils de migration électrophorétique des protéines de surnageant de culture ont été analysés chez la souche EPEC humaine E2348/69, chez les souches B10, RDEC-1 et B10/16E1, et chez les mutants ECP-négatif de B10. Les bactéries sont cultivées dans les conditions du test d'interaction décrit à l'exemple 1 ci- dessus, mais en l'absence de cellules, et avec un inoculum de départ d'environ 107 UFC par ml. Après 2h d'incubation, les bactéries sont centrifugées (4000 g, 15 min., 20 C) et suspendues dans 1 ml de MEME sans méthionine (n 31900-020, GIBCO) additionné de 5% de SVF dialysé. Après 20 min. d'incubation à 37 C, pour épuiser le stock de méthionine endogène, de la méthionine marquée S est additionnée à raison de 100 gCi/ml. Après lh d'incubation supplémentaire, les bactéries sont éliminées par deux centrifugations successives (12 000 g, 10 min.) et les protéines du surnageant de centrifugation sont alors précipitées par le polyéthylène glycol (PEG) 4000 (200 mg/ml) (Merck). Après lh d'incubation à 0 C, une nouvelle centrifugation est effectuée (12 000 g, 30 min) Le culot de centrifugation est suspendu dans 30 pl de tampon de charge d'électrophorèse et les protéines sont séparées par migration électrophorétique en gel de polyacrylamide à 12% en présence de SDS (SDS-PAGE). Le gel est séché sous vide puis mis en contact pendant 6 jours avec un film ^-Max (AMERSHAM), à température ambiante. La révélation se fait selon la méthode standard. Les résultats sont illustrés par la Figure 6A. Chez la souche parentale B10 (piste 3), trois protéines majeures, de poids moléculaires respectifs d'environ 39, 37 et 25 kDa, ainsi qu'une bande moins importante à 40 kDa sont identifiées. Le profil de la souche de lapin RDEC-1 (piste 1), et celui du mutant B10/16E1 sont identiques à celui de B10, tandis que celui de la souche EPEC de référence humaine E2348/69 (piste 6) présente quatre bandes de poids moléculaires assez proches (40, 39, 36 et 26 kDa), ainsi qu'une bande majeure supplémentaire d'environ 29 kDa qui n'a pas d'équivalent dans le profil de B10 (Figure 6A). Aucune de ces bandes n'apparaît chez le mutant ECP-négatif BO10/CA1 (piste 4). La piste 2 contient les marqueurs de poids moléculaire. Ces protéines ont également été analysées sur la base de leur parenté immunologique, en utilisant un sérum polyclonal de lapin produit contre les protéines de surnageant de B10 précipitées par le PEG. L'immunoprécipitation avec l'antisérum contre les protéines de surnageant est réalisée sur les surnageants de culture après marquage au 35S, comme décrit plus haut. L'immunoprécipitation est mise en oeuvre selon les modalités standard [SAMBROOK et al., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]. Les résultats sont illustrés par les figures 6 B et 7. Légende de la Figure 6B: Pistes 1: B10 avec le sérum pré-immun; 2: B10; 3: B10/CA1, 4: B10/16E1; 5: marqueurs de poids moléculaires; 6: RDEC-1; 7: E2348/69. La figure 6 B montre que l'antisérum permet de précipiter les trois protéines majeures(39, 37 et 25 kDa) de B10 (piste 3) et RDEC-1 (piste 6) ainsi que les quatre protéines majeures de E2348/69 (39, 36, 29 et 26 kDa). Les trois protéines majeures de B10 sont présentes dans le surnageant du mutant AF/R2 négatif B10/16E1 (piste 4), mais n'apparaissent pas dans celui du mutant ECP-négatif B10O/CA1 (piste 3). Il convient de noter que le sérum pré- immun possède également un léger pouvoir immunoprécipitant pour la protéine mineure de 40 kDa de B10. Ces résultats indiquent que les protéines de surnageant de B10 sont homologues à celles de RDEC-l et de E2348/69 (même si les poids moléculaires de ces dernières sont sensiblement différents), et que la production de ces protéines dans le surnageant est affectée chez un mutant ECP-négatif. Afin de déterminer si cette perte des protéines de surnageant résultait d'un défaut d'expression des gènes correspondants, ou d'un défaut de sécrétion par la bactérie, les profils d'immunoprécipitation des protéines de surnageant de la20 souche B10 et de ses mutants ECP-négatifs CA1, FAl2, E2, A9, et H12 ont été comparés avec les profils d'immunoprécipitation des lysats bactériens des mêmes cultures. Les lysats sont obtenus par trois cycles de congélation-décongélation (- 20 C à 20 C), suivis d'une centrifugation (12 000 g, 10 min.), puis de la récupération du surnageant de lyse. L'immunoprécipitation est effectuée, après marquage au 35S, dans les mêmes conditions que celles utilisées pour les protéines de surnageant. L'antisérum est épuisé au préalable avec un lysat bactérien de la souche d'E. coli de laboratoire HB101, pour éliminer les réactions non spécifiques. Les résultats sont illustrés par les figures 7A (profils d'immunoprécipitation des protéines de surnageant) et 7B (profils d'immunoprécipitation des lysats bactériens). Légende de la Figure 7 A: Pistes 1: B10; 2: marqueurs de poids moléculaire; 3: CAl; 4: FAl2; : E2; 6: A9; 7: H12. La figure 7A montre que chez tous les mutants, on observe une diminution significative des protéines de surnageant par rapport à B10. Chez trois d'entre eux, à savoir CAl, E2, et A9, cette diminution apparaît plus accentuée. L'immunoprécipitation permet également de mettre en évidence une bande à environ 110 kDa, d'intensité sensiblement équivalente chez toutes les souches et qui n'est donc pas affectée par les mutations. Légende de la Figure 7 B: Pistes 1: marqueurs de poids moléculaire; 2: B10; 3: CAl; 4: FAI2; 5: 2E; 6:A9; 7: H12. La figure 7B montre que les protéines majeures décrites plus haut sont présentes en quantité sensiblement équivalentes dans les lysats de B10 et ceux des mutants, à l'exception du mutant CAl qui apparaît plus particulièrement déficient pour la protéine de 25 kDa. EXEMPLE 4: PERTE DU POUVOIR PATHOGENE CHEZ UN MUTANT ECP-NEGATIF DE B10 Afin d'examiner si la perte de l'ECP avait un impact sur la virulence, le pouvoir pathogène par voie orale chez le lapin de la souche B10 a été comparé à celui de l'un de ces mutants, en l'occurrence la souche BlO/CA1. Le pouvoir pathogène est testé sur des lapereaux de race New Zealand White (souche INRA 1077) âgés de 35 jours, sevrés à l'âge de 28 jours selon les modalités décrites par PILLIEN et al. [Vet. Microbiol. , p. 105-115, (1996)]. Cinquante et un lapins sont allotés en trois groupes homogènes sur la base du poids et de la portée d'origine, puis inoculés par voie orale avec 2.107 UFC des souches d'épreuve, à savoir, respectivement: la souche parentale B10 (18 animaux), le mutant ECP-négatif B10/CA1 (18 animaux) et une souche de laboratoire K12 non pathogène BM21 (15 animaux). L'enregistrement des épisodes de diarrhée, de la mortalité et du poids, ainsi que le dénombrement et typage des souches d'E. coli des fèces, sont effectués comme décrit par PILLIEN et al., (1996, publication précitée). L'inoculation orale de la souche parentale B10 a provoqué une chute de poids chez les 18 animaux inoculés, la diarrhée chez 17, puis la mort chez 16 d'entre eux. Les décès se sont échelonnés du 3ème au 12ème jour suivant l'inoculation. Par comparaison, les animaux inoculés avec la même dose du mutant B10/CA1, comme ceux inoculés avec la souche d'E. coli K12, n'ont montré aucune chute de poids ni aucun signe clinique. Les courbes de poids enregistrés dans ces deux derniers groupes étaient quasiment identiques. La figure 8A représente le poids moyen des animaux survivants dans chacun des groupes au cours de l'expérimentation: B10 (2 survivants/18 animaux) = A; K12 (contrôle; 15 survivants/15 animaux) = O; B10/CA1 (18 survivants/18 animaux) = O; La figure 8B représente la population colibacillaire fécale, à différents temps après l'inoculation, chez les animaux inoculés avec la souche contrôle K12, avec la souche B10 et avec la souche BlO/CA1: : Flore colibacillaire identifiée comme constituée par la souche B10/CA1 I: Flore colibacillaire identifiée comme constituée par la souche B10. Chez les lapins inoculés avec la souche parentale B10, une colonisation colibacillaire massive a été observée, atteignant chez les survivants un niveau de 109 UFC par g de contenu fécal, et ce pendant plus de deux semaines après l'inoculation. La totalité de la flore colibacillaire identifiée était constituée par la souche B10. Ce niveau de population colibacillaire totale était 103 à 104 fois plus élevé que celui des lapins du groupe contrôle inoculés avec la souche d'E. coli K12, laquelle n'a d'ailleurs pas été détectée chez les animaux correspondants. Chez les lapins inoculés avec le mutant B10/CA1, la souche a colonisé l'intestin à un niveau élevé puis la population colibacillaire s'est stabilisée à un niveau d'environ 10 UFC par g de contenu fécal pendant au moins deux semaines. Pendant cette période, la souche B10/CA1 constituait de 70 à 100% de la population colibacillaire totale. EXEMPLE 5: PROTECTION CONFEREE PAR UN MUTANT ECP-NEGATIF VIS A VIS D'UNE INFECTION PAR LA SOUCHE PARENTALE B10. L'effet de l'inoculation orale d'une dose de 104 CFU de la souche pathogène B10 a été comparé dans deux groupes de 18 lapereaux de 35 jours dont l'un avait reçu une semaine plus tôt la souche mutante B10/CA1 par voie orale (2.107 CFU). Trente six lapereaux (même race et mêmes conditions d'élevage que celles décrites à l'Exemple 4 ci-dessus) sont répartis en deux groupes homogènes sur la base du poids et de la portée d'origine. A l'âge de 30 jours, les animaux de l'un des deux groupes reçoivent par voie orale 2.107 UFC du mutant B10/CA1 dans 2 ml de PBS. Sept jours plus tard, les animaux des deux groupes reçoivent la souche parentale pathogène B10 par voie orale, à la dose de 2.104 UFC (c'est à dire environ 1 dose létale 50 %). L'enregistrement des épisodes de diarrhée, de la mortalité, et du poids, ainsi que le dénombrement et typage des souches d'E. coli des fèces sont effectués comme décrit à l'Exemple 4 ci-dessus. Chez les lapereaux ayant reçu la souche mutante B10/CA1 par voie orale, aucune manifestation clinique, et aucune perte de poids n'ont été observées pendant toute la période d'observation. En revanche, 11 des 18 lapins non vaccinés avec B10/CA1 ont présenté une chute de poids, 9 de la diarrhée, et 7 sur 18 sont morts. L'analyse de la colonisation intestinale montre que la souche B10/CA1 a colonisé efficacement l'intestin jusqu'à l'administration de la souche parentale pathogène B10, puis s'est maintenue ensuite10 pendant deux semaines à un niveau stable d'environ 107 CFU/g, empêchant l'installation de B10 à un niveau détectable. Parallèlement, les IgA locales anti-LPS 0103 ont été dosées par ELISA dans les fèces. La Figure 9 montre l'évolution des IgA fécales après inoculation orale de la souche ECP-négative B10/CAl, (au jour 0), puis de la souche virulente B10 (au jour 7) ([l), ou bien de la seule inoculation de la souche virulente B10 au jour 7 (O). On observe que la réponse anticorps augmente significativement environ 15 jours après l'inoculation orale de la souche B10/CA1. REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'une souche mutante non-pathogène d'E. coli à partir d'une souche d'E. coli pathogène capable d'induire sur des cellules épithéliales HeLa un effet cytopathique se manifestant par la formation de câbles d'actine polymérisée traversant de part en part lesdites cellules et par une augmentation de la quantité de vinculine, caractérisé en ce que l'on procède à la mutagenèse de ladite souche d'E. coli pathogène, et en ce que l'on sélectionne les mutants ayant perdu la capacité d'induire ledit effet cytopathique. 2) Souche mutante non-pathogène d'E. coli, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 1. 3) Souche mutante non-pathogène d'E. coli selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle porte au moins une mutation inactivant au moins l'un des gènes du locus LEE. 4) Souche mutante non-pathogène d'E. coli selon une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'une souche d'E. coli pathogène du lapin appartenant au sérogroupe 0103. 5) Souche mutante selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite souche d'E. coli pathogène du lapin appartenant au groupe 0103 est la souche dénommée B10, déposée à la CNCM le 15 Janvier 1997 sous le nO 1-1807... 6) Souche mutante non-pathogène d'E. coli selon une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce qu'elle porte au moins une mutation résultant en l'inactivation d'au moins l'un des gènes sep du locus LEE. 7) Souche mutante non-pathogène d'E. coli dénommée B10/CA1, déposée auprès de la CNCM le 15 Janvier 1997 sous le n 1-1808. 8) Vaccin comprenant au moins une souche mutante non-pathogène d'E. coli selon une quelconque des revendications 2 à 7.5 9) Vaccin selon la revendication 7, administrable par voie orale. ) Utilisation d'une souche mutante d'E. coli selon une quelconque des revendications 2 à 7, pour l'obtention d'un vaccin.10 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit vaccin est destiné à être administré à des lapins.