Brevet FR2751989A1 — publié le 19980206

La présente invention concerne une méthode d'identification de cellules eucaryotes, notamment de mammifères, par simple ou double marquage (cytologique et/ou cytogénétique). La présente invention est applicable à la détermination de caractéristiques permettant d'identifier un type particulier de cellules présentes éventuellement dans une population hétérogène, par exemple par réaction immunologique (certaines cellules métastatiques, cellules leucocytaires résiduelles lors d'allogreffes etc.). Elle est également applicable à la détermination d'une caractéristique génétique de cellules d'un sujet particulier (par exemple sujet porteur du gène de la mucoviscidose, du sida, etc.). La présente invention concerne particulièrement une méthode d'identification d'une caractéristique génétique d'une cellule eucaryote, notamment de mammifères, en particulier une cellule foetale, à partir d'une population hétérogène de cellules eucaryotes. Elle concerne également un support solide fonctionnalisé destiné notamment à la mise en oeuvre desdites méthodes. En ce qui concerne les cellules foetales, de nombreux désordres génétiques affectant le foetus sont désormais détectables in utero. Certains de ces désordres ont des conséquences extrêmement graves qui pourraient rendre désirable pour les parents l'arrêt de la grossesse. Les prélèvements de cellules foetales sont maintenant couramment effectués chez les femmes enceintes dites à risque, c'est-à-dire ayant plus de 38 ans ou appartenant à une famille ayant des antécédents d'anomalies génétiques. Une étude du patrimoine génétique du foetus peut alors être réalisée sur ces cellules et éventuellement permettre de mettre en évidence des trisomies, des translocations ou autres anomalies chromosomiques. Les techniques de prélèvements des cellules foetales utilisées actuellement sont invasives et présentent des risques importants d'avortement spontané. En effet, elles nécessitent de perforer les membranes foetales ou placentaires. C'est le cas notamment de l'amniocentèse, de la choriocentèse ou de la cordocentèse. En outre, bien que l'amniocentèse soit réputée présenter peu de risques de complication, elle ne peut être effectuée qu'après la 17ème semaines d'aménorrhée, soit au second trimestre de grossesse. Or, il est maintenant clairement établi qu'au cours de la grossesse différents types de cellules foetales telles que les cellules trophoblastiques ou les leucocytes ou les érythroblastes peuvent passer du placenta vers la circulation sanguine périphérique de la mère dès la Gème semaine. I1 serait donc hautement souhaitable de pouvoir isoler les cellules foetales à partir du sang maternel prélevé par simple prise de sang (ce qui représente une technique non invasive de prélèvement de cellules foetales ne présentant aucun risque d'avortement), pour établir un diagnostic génétique antenatal. Ivlalheureusement, la population foetale circulante est présente avec un pourcentage inférieur à 1 pour 100 000 cellules nuclées dans le sang de la mère. C'est pourquoi, on a déjà proposé de trier les cellules foetales au moyen d'outils de haute spécificité et de forte affinité, tels que les anticorps. De nombreux procédés d'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon de sang ont donc été proposés. La demande de brevet EP-A-412 700 décrit une préparation d'anticorps monoclonaux spécifiques des cellules cytotrophoblastiques du premier trimestre qui peuvent être utilisées dans les diagnostics prénataux (caryotype, identification des polymorphismes de longueur restreinte, liés à des maladies génétiques telles que les thalassémies, l'anémie falciforme, les diabètes insulino-dépendants et la maladie d ' Huntington). Le brevet US 5 432 054 décrit une méthode de séparation d'érythrocytes nuclées foetaux présents dans un échantillon de sang de femme enceinte. On a également proposé dans la demande de brevet FR-A-2 682 481 un procédé d'obtention de cellules trophoblastiques d'un foetus permettant l'isolement d'une fraction substantiellement pure en cellules trophoblastiques, voire l'obtention d'un nombre suffisant de cellules trophoblastiques dûment isolées. Le procédé selon cette demande prévoit une étape de préenrichissement en cellules trophoblastiques au moyen d'anticorps antileucocytaire commun marquant la majeure partie des leucocytes de la fraction leucocytaire permettant de séparer lesdits leucocytes. Les méthodes de diagnostic non invasives faisant appel à ces techniques présentent cependant certains inconvénients en ce qui concerne la précision des mesures et en définitive, le diagnostic que le praticien sera amené à faire. On conviendra que dans ce domaine, seule une précision égale à 100 % peut être acceptable. On rappelera que ces méthodes de diagnostic antenatales non invasives font appel à des techniques de marquage permettant de repérer d'une part les cellules foetales et d'autre part les caractéristiques génétiques particulières qu'il s'agit d'identifier (technique du double marquage). La présente invention propose une nouvelle méthode d'identification de cellules allant à l'encontre de celles précédemment décrites. Les inventeurs ont en effet mis en évidence que le problème en cause pouvait être résolu de façon satisfaisante sans qu'il soit nécessaire de purifier les cellules à identifier. Cette méthode, bien que particulièrement intéressante dans le cas du double marquage peut également être appliquée aux techniques d'identification par simple marquage. C'est pourquoi, l'objet de la présente invention est en général de proposer une nouvelle méthode de diagnostic simple et fiable, permettant la détection d'une caractéristique d'une cellule eucaryote par simple ou double marquage, tout en évitant les différents inconvénients cités ci-dessus. Un autre objet de la présente invention est de proposer une méthode de diagnostic antenatal non invasive qui procure des résultats nets avec un pourcentage de réussite proche de 100 %. Un autre objet de la présente invention est de proposer des supports solides permettant de mettre en oeuvre ladite méthode de diagnostic. L'invention concerne en premier lieu une méthode d'identification d'au moins une caractéristique d'une cellule eucaryote, notamment de mammifères, caractérisée en ce que l'on immobilise de façon covalente une couche substantiellement monocellulaire d'une population de cellules eucaryotes sur un support solide fonctionnalisé et en ce que l'on soumet la couche de cellules immobilisées, à une réaction permettant de déterminer une caractéristique cytologique et/ou cytogénétique et en ce que l'on évalue le résultat. Avantageusement, le support est plan. Pour éviter de purifier les cellules trophoblastiques, on aurait pu envisager d'adsorber l'échantillon de cellules, éventuellement triées, sur une lame de verre par exemple, afin de mettre en oeuvre les méthodes de diagnostic sur la couche de cellules obtenues. Cependant, il est nécessaire dans ce cas de prévoir une étape de séchage afin d'immobiliser ces cellules sur la lame. En effet, sans cette étape de séchage, les cellules sont détachées par les différentes étapes de lavage, ce qui rend la méthode inopérante. Malheureusement, l'étape de séchage dans de nombreux cas, abime ces cellules. La méthode de diagnostic selon l'invention assure une immobilisation des cellules sur un support solide plan tout en évitant les inconvénients décrits ci-dessus. Le support solide est de préférence de nature minérale (verre par exemple) bien que des supports organiques puissent également convenir. Le support solide est fonctionnalisé par un bras espaceur à fonction terminale susceptible de réagir avec des groupements fonctionnels présents sur la paroi cellulaire. Les groupements présents sur la paroi cellulaire sont notamment les groupements thiol, carboxyle ou amino primaire situés sur la partie protéique. Ces groupements réagissent, après activation éventuelle, avec la fonction terminale appropriée de la chaîne. Les groupements peuvent également être présents sur la partie sucre associée aux protéines, tels que les groupements hydroxyle, transformés de manière connue en groupements aldéhyde réactifs. Les fonctions terminales réactives permettront d'assurer une liaison covalente avec lesdits groupements réactifs dans des conditions appropriées - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement thiol ou un pont disulfure (ce dernier sera préalablement réduit), la fonction terminale est un radical maléimido, iodoacétyle, dithio-pyridyle - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement amino primaire, la fonction terminale est un radical aldéhyde, carboxylate activé, N-hydroxysuccinimide, a-dibromo; - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement carboxylate activé (notamment avec des carbodiimides), la fonction terminale est une amine primaire ou secondaire; - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement hydroxyle, la fonction terminale est un radical hydroxysuccinimide, carboxylate activé - lorsque le groupement fonctionnel est l'arginine, la fonction terminale est le glyoxal. Selon une variante préférée, le groupement fonctionnel est un groupement thiol et la fonction terminale est un radical maléimido. De préférence le support solide est de nature minérale, par exemple le verre, et le bras espaceur est attaché à l'extrémité opposée à ladite fonction terminale par l'intermédiaire des fonctions silanols du support solide. La liaison covalente entre le verre et le bras espaceur est assurée notamment par la réaction d'un groupement Si(OR1)- avec un radical silanol du verre d'une manière connue, OR1 étant un groupement susceptible d'être hydrolysé. De préférence R1 est un radical (C1-C8) alkyle et avantageusement (C1-C4) alkyle. De préférence, le bras espaceur est constitué par une chaîne divalente terminée à ses extrémités d'une part par la fonction terminale et d'autre part par Si(OR1)3. La chaîne divalente est avantageusement hydrqcarbonée comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, éventuellement ramifiés, éventuellement insaturés. Elle ne présente essentiellement pas d'affinité vis-à-vis du support dans une variante selon l'invention. Cela permet de limiter les interactions non spécifiques avec le support. Le bras espaceur comprendra avantageusement 8 à 30 atomes et répondra à la formule: - Si - Rz - fonction terminale R2 étant une chaîne hydrocarbonée de 8 à 30 atomes comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, éventuellement ramifiée, éventuellement insaturée. De préférence, le bras espaceur répond à la formule n, m indépendamment l'un de l'autre étant un nombre entier positif inférieur ou égal à 10, de préférence inférieur ou égal à 5. Avantageusement Un procédé pour fonctionnaliser le support solide consiste à le silaniser à l'aide d'un oméga-aminoalkyltrialcoxy silane de formule (R1O)3Si- (CH2)nNH2, R1 étant un radical alkyle de C1 à C8, préférentiellement C1 à C4, puis à faire réagir le support greffé obtenu avec une chaîne divalente munie à une extrémité d'une fonction réactive vis-à-vis du radical amino et à l'autre extrémité d'une fonction réactive (fonction terminale) vis-à-vis du groupement fonctionnel présent sur la cellule. De préférence, le support solide est fonctionnalisé par silanisation à l'aide de 3-aminopropyltrialcoxy silane puis réaction subséquente avec l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide y-maléimido butyrique. Le support solide fonctionnalisé ainsi obtenu est lavé avec un tampon de couplage adapté à la réaction considérée. Selon une variante, la méthode dite de simple marquage est caractérisée en ce que la population de cellules eucaryotes est choisie dans le groupe constitué par: - la population de cellules susceptibles de comprendre des cellules métastatiques, - la population de cellules issues de préparation de moelle osseuse lors d'allogreffes susceptible de contenir des cellules leucocytaires résiduelles, - la population de cellules susceptible de contenir des bactéries circulantes, et en ce qu'on marque les cellules à identifier avec un marqueur spécifique desdites cellules à identifier. Selon une variante, la méthode dite de simple marquage est caractérisée en ce que la population de cellules eucaryotes est choisie dans le groupe constitué par: - la population de cellules suceptibles de contenir des cellules ayant une caractéristique génétique anormale, et en ce que l'on soumet la couche de cellules immobilisées à une réaction cytogénétique permettant de révéler la caractéristique génétique à identifier. Selon une autre variante, la méthode d'identification de double marquage est caractérisée en ce qu'un échantillon de cellules prélevées sur un individu est soumis aux réactions suivantes a) on immobilise de façon covalente les cellules eucaryotes sur un support fonctionnalisé, b)on perméabilise éventuellement les cellules immobilisées, c) on marque les cellules à identifier avec un marqueur spécifique desdites cellules à identifier, d) on soumet la couche de cellules immobilisées à une réaction cytogénétique permettant de révéler la caractérististique génétique à identifier, e) on évalue le résultat. I1 est souhaitable, afin d'enrichir l'échantillon en cellules à détecter, d'effectuer préalablement à l'étape a) un tri cellulaire dudit échantillon pour obtenir une fraction enrichie en cellules eucaryotes à identifier. Dans le cas d'un échantillon sanguin, les cellules anuclées représentent plus de 99 % des cellules sanguines circulantes et bloquent la fixation des cellules nucléés sur le support activé. Dans le cas des cellules foetales, cette opération est d'autant plus nécessaire que la population foetale circulante est présente avec un pourcentage inférieur à 1 pour 100 000 cellules nuclées dans le sang de la mère. Cette élimination peut être effectuée de manière connue par tri négatif, notamment par centrifugation sur gradient de densité, par exemple selon la méthode FICOLLS dans le cas des cellules sanguines. On rappelera que le FICOLLs est un polymère de saccharose dont l'utilisation pour purifier des cellules mononuclées sanguines est parfaitement normalisé. Des solutions de FICOLL, de densités précalibrées, sont disponibles commercialement et s'emploient sous la forme de coussins, de gradients de densité discontinue ou de gradients de densité continue, sur lesquels sont séparées les cellules sanguine s. Par ailleurs, les cellules sont de préférence lavées intensivement afin d'éliminer la majeure partie des protéines contaminantes provenant du milieu dans lequel elles se trouvaient initialement, le sang notamment. Les cellules sont mises en suspension dans du tampon de couplage à une concentration qui, usuellement, varie entre 105 à 107 cellules/ml bien que cet intervalle ne soit pas critique, étalées sur le support fonctionnalisé et stockées en chambre humide à température appropriée, notamment ambiante, pendant une durée déterminée, une heure par exemple, pour permettre aux cellules de sédimenter et de former une liaison covalente avec la fonction terminale du bras espaceur. Le support est alors rincé pour achever la fixation des cellules qui n'auraient pas encore réagi et éliminer les cellules qui ne sont pas liées de façon covalente. Après l'immobilisation covalente des cellules, il est avantageux de les fixer par exemple par traitement avec du paraformaldéhyde, lavage puis neutralisation des fonctions aldéhydiques résiduelles. La perméabilisation, si nécessaire, est effectuée de manière connue, notamment par traitement avec du Triton X1008 par exemple. Cette perméabilisation est notamment utile dans le cas des motifs antigéniques intracellulaires. Le marqueur spécifique est un anticorps substantiellement spécifique desdites cellules à identifier associé à une substance capable d'être repérée par un moyen approprié. Le marquage membranaire doit être compatible avec la méthode selon l'invention qui fait appel au double marquage. On a constaté que les anticorps spécifiques qui portent directement des produits chromophores tels qu'un groupement chimique fluorescent (fluorescéine) ne convenaient pas dans le cadre de la présente invention car le signal fluorescent disparaissait après l'étape de dénaturation ultérieure nécessaire à l'hybridation. C'est le cas, notamment des anticorps anti-cellules trophoblastiques. Par cellules "trophoblastiques" au sens de la présente invention, on entend toute cellule du trophoblaste, syncytiotrophoblaste ou cytotrophoblaste d'origine villeuse ou extravilleuse quel que soit son type, anuclée, mononuclée, polynuclée et quelle que soit l'époque de leur apparition dans le sang maternel par rapport à la durée de la gestation. On a trouvé que le procédé de marquage au moyen de la phosphatase alcaline permettait une identification satisfaisante des cellules. Cela nécessite une révélation subséquente de cette enzyme par un substrat approprié qui par réaction avec l'enzyme conduira à une visualisation. Dans ce cas, ladite substance est un conjugué couplé à la phosphatase alcaline et on révèle le marqueur au moyen d'un substrat chromogène. Par exemple, le substrat de révélation dénommé "Fast Red", hydrolysé par la phosphatase alcaline (PA) donne un précipité insoluble rose-rouge visualisable avec un filtre dichroïque et en optique. Selon cette variante, l'anticorps spécifique est fixé sur les cellules puis on met en contact les cellules avec un anticorps anti-anticorps spécifique des cellules, couplé à la phosphatase alcaline. Parmi les anticorps anti-cellules trophoblastiques retenus on utilisera avantageusement un anticorps du type GB 17, GB 25 développés par Aster Biotechnologies. Ces deux types d'anticorps présentent une spécificité stricte restreinte à ces seules cellules. Il est possible cependant d'envisager l'emploi d'un troisième anticorps, un anti-cytokératine 1 8. Bien que non spécifique des trophoblastes, celui-ci a été développé contre les kératinocytes, il ne donne pas de réaction croisée avec les cellules sanguines. Les anticorps seront associés par un épitope à un anticorps spécifique des chaînes lourdes et légères desdits anticorps anti-cellules trophoblastiques, couplé à la phosphatase alcaline (GAM-PA). Selon un mode de réalisation, une saturation des cellules est effectuée avec un tampon approprié. Après quoi, l'anticorps monoclonal spécifique est incubé à la concentration appropriée pendant une durée déterminée, une heure par exemple, en chambre humide et à température ambiante. Puis le deuxième anticorps, couplé à la phosphatase alcaline, et pouvant se conjuguer à un épitope de l'anticorps spécifique, est laissé en incubation dans des conditions similaires audit anticorps spécifique. Les techniques de lavage sont utilisées de manière connue au cours et après la procédure de marquage à la phosphatase par exemple avec le tampon TBS. La révélation de l'enzyme phosphatase alcaline est effectuée par incubation des lames durant une durée de l'ordre de 30 minutes avec un tampon tel que le Tris dans lequel a été ajouté le substrat de révélation. De préférence, celui-ci contient le "Fast Red" qui hydrolysé par la phosphatase alcaline donne un précipité insoluble rose rouge visualisable avec un filtre dichroïque et en optique. Après l'incubation les lames sont lavées au TBS. Selon un mode de réalisation préféré, la révélation avec le substrat chromogène est effectuée en présence d'un inhibiteur des phosphatases alcalines endogènes tel que le levamisole. En effet, en absence d'un tel inhibiteur, un bruit de fond résiduel est observé en raison de la présence de phosphatases alcalines endogènes toujours actives. A partir d'une concentration en levamisole de 5 mM, le bruit de fond est suffisamment diminué pour ne pas affecter l'intensité du signal positif. Il est souhaitable, de plus, de choisir un temps de révélation suffisamment court de l'ordre d'une dizaine de minutes usuellement entre 5 et 15 minutes. La dilution de l'anticorps couplé à la phosphatase alcaline doit être avantageusement comprise entre 1/60ème et 1/480ème afin d'obtenir un signal optimal. Néanmoins, cet intervalle varie selon les anticorps. La dilution optimale d'un anticorps de deuxième couche, conjugué à une enzyme (phosphatase alcaline ou autre), va dépendre de la concentration à laquelle il se trouve dans la solution mère. Cette dilution sera optimisée par des manipulations à la portée de l'homme du métier. La technique d'hybridation in situ permet la détection rapide de défauts cytogénétiques. Cette technique utilise généralement une sonde fluorescente et est connue sous l'appellation FISH (en anglais : fluorescence in situ hybridization). Cette technique utilise des sondes spécifiques d'un chromosome associé à un marqueur pour permettre l'identification d'aberrations chromosomiques en nombre comme en structure. On peut utiliser de façon générale un marquage chaud (radioactif) ou froid (enzyme ou radical biotinyle). Cette méthode est utilisée avec succès pour le diagnostic des trisomies. Une méthode de diagnostic de la trisomie 18 a été utilisée avec succès avec une sonde de séquences répétitives et spécifique de la région centromérique du chromosome 18. De même, les sondes ADN qui marquent spécifiquement la bande terminale 21q 22.3 permet par hybridation in situ une détection rapide du nombre d'aberrations du chromosome 21 ainsi que de la structure de ces aberrations. En général, l'hybridation in situ peut être appliquée directement aux cellules foetales isolées du sang maternel et sont disponibles pour les chromosomes 18, X et Y ainsi que pour les deux chromosomes 13 et 21. Bien entendu, la méthode selon l'invention n'est pas limitée à l'application aux cellules foetales, notamment trophoblastiques circulant dans le sang maternel, mais s'étend au contraire à la détection d'autres cellules eucaryotes, par exemple - recherche et identification de cellules métastiques non seulement dans le sang, mais également dans d'autres liquides physiologiques tels que la lymphe, - recherche de cellules leucocytaires résiduelles dans les préparations de moelle osseuse lors d'allogreffes, - analyse fine d'anomalies génétiques ou détection de la présence d'ADN étranger par amplification génique (PCR) in situ, sur cellules fixées (cette technique est actuellement difficilement réalisable sur lame en raison de la perte cellulaire importante qui se produit au cours du processus). Cette dernière application présente un intérêt primordial dans le dépistage précoce du sida chez des patients séronégatifs au stade de primo-infection ou chez des enfants nés de mères séropositives, et également dans l'exploration des séronégativations (disparition des anticorps alors que le processus infectieux est toujours présent). Toujours dans le cadre de cette pathologie, le modèle pourrait être applicable au dépistage cellulaire et non plus sérologique, de l'antigène P24/P25 (dépistage immunologique de la protéine ou de son ARNMm par TR PCR), - recherche et identification de bactéries circulantes. Toutes les techniques relatives à l'hybridation in situ peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention. I1 existe sur le marché des sondes qui sont directement couplées à des fluorochromes. Elles génèrent en général des signaux de faible intensité après hybridation. On leur préfère actuellement deux autres types de sondes - des sondes qui sont conjuguées à de la biotine ; la révélation est réalisée alors avec de l'avidine ou avec un anticorps antibiotine, conjugués à un fluorochrome (fluorescéine ou rhodamine). - des sondes qui sont conjuguées à la digoxigénine et que l'on révèle après hybridation avec des anticorps anti-digoxigénine conjugués à un fluorochrome. Cette méthode d'identification dite de double marquage trouve une application particulièrement avantageuse dans le cas de la détection d'anormalité chromosomique des cellules foetales et permet une détection de celles-ci dans les premiers mois de la grossesse avec une résolution particulièrement nette et un pourcentage de réussite très élevé approchant 100%. L'invention concerne donc en particulier une méthode de diagnostic antenatal comprenant les étapes suivantes a) on prélève un échantillon de sang du système de circulation périphérique de la mère portant le foetus, b) on élimine les érythrocytes dudit échantillon par tri négatif, c) on immobilise de façon covalente la fraction leucocytaire sur le support solide fonctionnalisé précédemment décrit, d) on perméabilise éventuellement les cellules immobilisées, e) on marque les cellules à identifier avec un marqueur spécifique des cellules trophoblastiques, f) on soumet la couche de cellules immobilisées à une méthode d'analyse cytogénétique permettant de révéler la caractérististique génétique à identifier, g) on évalue le résultat. Les différentes variantes décrites ci-dessus sont comprises dans la méthode de diagnostic antenatale indiquée. De préférence, l'étape f) consiste à mettre en contact la couche de cellules immobilisées avec une sonde marquée complémentaire spécifique de la caractéristique génétique à identifier. De préférence, le marqueur spécifique est un anticorps monoclonal associé à une substance couplée à la phosphatase alcaline. Lors de la révélation, il est avantageux de mettre la fraction leucocytaire immobilisée en présence d'un inhibiteur de phosphatase alcaline endogène tel que le levamisole à une concentration de préférence comprise entre 1 et 5 mM. Au-delà de 5 mM, le lévamisole inhibe également la phosphatase alcaline d'origine intestinale couplée aux anticorps. I1 existe également un inhibiteur utilisé moins couramment, le tripeptide phénylalanine-glycine-glycine. Les anticorps monoclonaux sont de préférence choisis dans le groupe constitué par le GB17 ou le GB25. La sonde marquée complémentaire est de préférence spécifique de la région centrométrique du chromosome 18 ou de la bande terminale 21q22.3 du chromosome 21. Selon une variante avantageuse, les cellules sont fixées, après immobilisation covalente sur le support solide, par tout moyen approprié, notamment par traitement avec du paraformaldéhyde. L'invention concerne donc également un support solide fonctionnalisé de façon covalente par un bras espaceur à fonction terminale susceptible de réagir avec des groupements fonctionnels présents sur la paroi cellulaire tel qu'il vient d'être décrit précédemment. De préférence, le support est de nature minérale et est attaché au bras espaceur par l'intermédiaire des radicaux silanols du support. Bien que toutes les variantes décrites précédemment sont comprises dans la définition du présent support fonctionnalisé, avantageusement le bras espaceur répond à la formule n, m indépendamment l'un de l'autre étant un nombre entier positif inférieur ou égal à 10, de préférence inférieur ou égal à 5, et de préférence : 0 J - CH2CH2al2 - N -C I 11 \R LI o MODE OPERATOIRE Préparation du support fonctionnalisé Les supports sont des lames de verre utilisées en microscopie. Les lames sont placées dans un bain contenant de 1'HCL 12N et de l'éthanol (lv: 9v). Après une heure de trempage à température ambiante, les lames sont rincées à l'eau et séchées à 37oC. Ce traitement a pour effet de nettoyer les lames et de générer les silanol (Si-OH) sur leur surface. Après rinçage à l'eau distillée, séchage à 200"C, les lames sont mises à tremper dans du toluène à reflux contenant 5 % d'amino ou de thiosilane et maintenues à reflux pendant 16 h. Pour cette étape, on utilise préférentiellement de l'aminopropyl triethoxysilane. Les lames sont rincées successivement avec du toluène et de l'éthanol, puis séchées avant stockage. Les lames peuvent être utilisées immédiatement ou séchées et stockées à l'abri de la poussière. Cette étape peut être évitée en utilisant des lames présilanisées disponibles commercialement. Les lames silanisées sont rincées dans du tampon phosphate de sodium 100 mM, NaCI 50 mM, pH 6.8 (tampon de couplage). Une solution de lester n-hydroxysuccinimide de l'acide ymaleimido butyrique (GMBS)(200 mg/ml) est préparée extemporanément dans du N,N-diméthylformamide ou du DMSO puis diluée au 1 KCl 2,6 mM, Na2HP04 6,4 mM, KH2PO4 1,46 mM), à une concentration de 1,5 à 2,5 106 cellules/ml. Cette suspension (200 s l) est étalée sur une lame à l'aide d'une pointe de pipetman et stockée en chambre humide à température ambiante pendant 1 heure pour permettre aux cellules de sédimenter et de former des liaisons thioether avec le GMBS. Les lames sont finalement rincées avec du PBS protéiné pour bloquer les groupements maléimyl qui n' auraient pas réagi et éliminer les cellules qui ne sont pas liées covalemment. La densité surfacique des cellules est de l'ordre de 2500 cellules/mm2. Après élimination du tampon de couplage, les cellules liées covalemment au support sont rincées avec du PBS (NaCl 134 mM, KC1 2,6 mM, Na2HPO4 6,4 mM, KH2P04 1,46 mM) puis fixées en les incubant pendant 17 min à 20"C dans du paraformaldéhyde (PFA) en solution à 2 % dans du PBS. Les lames sont rincées dans du PBS et le PFA résiduel est neutralisé par un bain de 15 min à 20"C dans du NH4Cl en solution à 50 mM dans du PBS (pH 7,2). Identification des cellules foetales Après rinçage des lames dans du PBS (5min à 20"C), les cellules sont perméabilisées avec du Triton X100 (0,1 % dans du PBS ; 4 min d'incubation à 4"C). Après 3 lavages de 10 min à 20"C avec du tampon PBS, les lames sont saturées pendant 10 min à température ambiante avec du sérum de chèvre dilué à 10 % dans du tampon TBS (NaCl 136 mM, KCl 2,6 mM rouge de phénol 0,042 mM, Tris 25 mM pH 7,4). Les cellules sont ensuite incubées pendant 16 h à 4"C avec les anticorps suivants - GB 17 (syncytiotrophoblastes) - GB 25 (syncytio+cytotophoblastes) - anti-cytokératine 18 (syncytio + cytrotrophoblastes) - anti-hémoglobine foetale (érythroblastes) - anti-récepteur de la transferrine CD 71 (érythroblastes) utilisés seuls ou de préférence en combinaison en solution dans du tampon TBS contenant 10 % de sérum de chèvre. Après lavage, les cellules sont incubées (lh à température ambiante avec des anticorps polyclonaux de chèvre anti-immunoglobulines de souris conjugués à la phosphatase alcaline. Les complexes immunoenzymatiques sont révélés en utilisant comme substrat de la phosphatase alcaline du fast red amené en solution dans du tampon Tris/HCl 100 mM pH 8,2 contenant un inhibiteur des phosphatases alcalins endogènes (on utilise de préférence du levamisole à une concentration de 5 mM). L'hydrolyse des phosphates est poursuivie pendant 20 min à 20"C. Détermination cvtozénétique Après les avoir rincées avec du PBS, les cellules sont post-fixées avec du PFA dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Les cellules sont alors incubées à 50"C pendant 3 bains successifs de tampon 2 SSC (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 0,06 M pH 7,2) contenant du Tween 20 à 0,05 % avant de subir une déshydratation progressive dans des bains successifs, d'éthanol à 70, 80 et 100 %. L'ADN cellulaire est ensuite dénaturé en incubant les lames pendant 8 min à 70"C dans du tampon 2 SSC contenant 70 % de formamide. Les lames sont ensuite déshydratées à l'éthanol comme décrit précédemment. Parallèlement, les sondes chromosomiques (chromosome Y: DYZ1/DYZ3 biotinylée ; chromosome X : DXZ1, digoxigeninylées) sont dénaturées à 70"C (10 min d'incubation) et stockées à 4"C avant d'être déposées (séparément ou en combinaison) sur les cellules entre lames et lamelles scellées au latex. L'hybridation des sondes à 1'ADN cellulaire est poursuivie pendant 16 hà37 C. Après rinçage des lames par 3 bains successifs dans du tampon 2SSC et saturation avec une solution protéinée (2 SSC contenant 1 % d'albumine bovine ou 5 % de lait écrémé en poudre), les sondes (utilisées de préférence sous forme biotinylées et digoxigéninylées), hybridées à l'ADN cellulaire sont révélées respectivement avec de l'avidine et des anticorps antidigoxigénine conjugués à des fluorochromes (par exemple de la fluorescéine). Les cellules sont finalement rincées, recouvertes d'un milieu de montage contenant du DAPI (0,3 cig/ml) pour contrecolorer les noyaux et d'une lamelle, puis examinées en microscopie à fluorescence. REVENDICATIONS 1. Méthode d'identification d'au moins une caractéristique d'une cellule eucaryote, notamment de mammifères, caractérisée en ce que l'on immobilise de façon covalente une couche substantiellement monocellulaire d'une population de cellules eucaryotes sur un support solide fonctionnalisé et en ce que l'on soumet la couche de cellules immobilisées, à une réaction permettant de déterminer une caractéristique cytologique et/ou cytogénétique et en ce que l'on évalue le résultat. 2. Méthode d'identification selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules sont immobilisées de façon covalente sur un support solide plan fonctionnalisé, de nature minérale. 3. Méthode d'identification selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le support solide est fonctionnalisé par un bras espaceur à fonction terminale susceptible de réagir avec des groupements fonctionnels présents sur la paroi cellulaire. 4. Méthode d'identification selon la revendication 3, caractérisée en ce que le support solide est en verre et le bras espaceur est attaché à l'extrémité opposée à ladite fonction terminale par les fonctions silanols du support solide. 5. Méthode d'identification selon la revendication 3, caractérisée en ce que: - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement thiol ou un pont disulfure (préalablement réduit), la fonction terminale est un radical maléimido, iodoacétyle, dithio-pyridyle. - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement amino primaire, la fonction terminale est un radical aldéhyde, carboxylate activé, N-hydroxysuccinimide, a-dibromo, - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement carboxylate activé (notamment avec des carboiimides), la fonction terminale est une amine primaire ou secondaire, - lorsque le groupement fonctionnel est un groupement hydroxyle, la fonction terminale est un radical N-hydroxy succinimide, carboxylate activé, - lorsque le groupement fonctionnel est l'arginine, la fonction terminale est le glyoxal. 6. Méthode d'identification selon la revendication 3, caractérisée en ce que le bras espaceur comporte une chaine divalente hydrocarbonée comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, éventuellement ramifiée, éventuellement insaturée. 7. Méthode d'identification selon la revendication 6, caractérisée en ce que le bras espaceur répond à la formule - Si - R2 - fonction terminale R2 étant une chaîne hydrocarbonée de 8 à 30 atomes comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, éventuellement ramifiée, éventuellement insaturée. 8. Méthode d'identification selon la revendication 7, caractérisée en ce que le bras espaceur répond à la formule: n, m indépendamment l'un de l'autre étant un nombre entier positif inférieur ou égal à 10. 9. Méthode d'identification selon la revendication 8, caractérisée en ce que le bras esDaceur répond à la formule 10. Méthode d'identification selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la population de cellules eucaryotes est choisie dans le groupe constitué par - la population de cellules susceptibles de comprendre des cellules métastatiques, - la population de cellules issues de préparation de moelle osseuse, lors d'allogreffes, susceptibles de contenir des cellules leucocytaires résiduelles, - la population de cellules susceptibles de contenir des solutions des bactéries circulantes, et en ce que l'on marque les cellules à identifier avec un marqueur spécifique desdites cellules à identifier. 11. Méthode d'identification selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la population de cellules eucaryotes est choisie dans le groupe constitué par - la population de cellules susceptibles de contenir des cellules ayant une caractéristique génétique anormale, et en ce que l'on soumet la couche de cellules fixées à une réaction cytogénétique permettant de révéler la caractéristique génétique à identifier. 12. Méthode d'identification selon l'une des revendications 1 à 9, d'une caractéristique génétique d'une cellule eucaryote, notamment de mammifères, à partir d'une population hétérogène de cellules eucaryotes, caractérisée en ce qu'un échantillon de cellules prélevées sur un individu est soumis aux réactions suivantes a) on immobilise de façon covalente les cellules eucaryotes sur un support fonctionnalisé, b) on perméabilise éventuellement les cellules immobilisées, c) on marque les cellules à identifier avec un marqueur biologique spécifique desdites cellules à identifier, d) on soumet la couche de cellules immobilisées à une réaction cytogénétique permettant de révéler la caractérististique génétique à identifier, e) on évalue le résultat. 13. Méthode d'identification selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'avant l'étape a) on effectue un tri pour obtenir une fraction enrichie en cellules eucaryotes. 14 Méthode d'identification selon la revendication 10 ou 12, caractérisée en ce que le marqueur spécifique est un anticorps substantiellement spécifique desdites cellules à identifier, associé à une substance capable d'être repérée par un moyen approprié. 15. Méthode d'identification selon la revendication 14, caractérisée en ce que la substance est un conjugué couplé à la phosphatase alcaline et on révèle le marqueur au moyen d'un substrat chromogène. 16. Méthode d'identification selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que les cellules immobilisées de façon covalente au support sont fixées par un moyen approprié, notamment le paraformaldéhyde. 17. Méthode d'identification selon la revendication 16, caractérisée en ce que la réaction cytogénétique consiste à mettre en contact la couche de cellules immobilisées et fixées avec une sonde marquée complémentaire spécifique de la caractéristique génétique à identifier. 18. Méthode d'identification selon la revendication 17, caractérisée en ce que la sonde est radio-active ou attachée à une enzyme ou à un radical biotinyle ou digoxigénine. 19. Méthode d'identification selon la revendication 12, caractérisée en ce que les cellules à identifier sont choisies dans le groupe constitué par les cellules trophoblastiques. 2Q Méthode d'identification selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au diagnostic antenatal et en ce qu'un échantillon de sang du système de circulation périphérique d'une femme enceinte, est soumis aux étapes suivantes a) on élimine les érythrocytes dudit échantillon notamment par tri négatif, b) on immobilise de façon covalente la fraction leucocytaire sur le support solide fonctionnalisé selon les revendications 2 à 9, c) éventuellement on perméabilise les cellules, d) on marque les cellules à identifier avec un marqueur spécifique des cellules trophoblastiques, e) on soumet la couche de cellules immobilisées à une méthode d'analyse cytogénétique permettant de révéler la caractérististique génétique à identifier, f) on évalue le résultat. 21. Méthode d'identification selon la revendication 20, caractérisée en ce que le marqueur spécifique est un anticorps monoclonal. 22. Méthode d'identification selon la revendication 20 ou 21, caractérisée en ce que le marqueur spécifique est associé à une substance capable d'être repérée par un moyen approprié, notamment un conjugué couplé à la phosphatase alcaline. 23. Méthode d'identification selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'on met en présence la fraction leucocytaire avec un inhibiteur de phosphatase alcaline endogène, lors de la révélation au moyen du substrat chromogène. 24. Méthode d'identification selon la revendication 23, caractérisée en ce que l'inhibiteur de phosphatase alcaline endogène est le levamisole. 25. Méthode d'identification selon la revendication 23 ou 24, caractérisée en ce que la concentration en inhibiteur de phosphatase alcaline endogène est comprise entre 1 et 5 mM. 26. Méthode d'identification selon la revendication 21, caractérisée en ce que l'anticorps monoclonal est choisi dans le groupe constitué par le GB17, GB25 ou un anti-cytokératine 18. 27. Méthode d'identification selon la revendication 20, caractérisée en ce que l'étape e) consiste à mettre en contact la couche de cellules immobilisées avec une sonde marquée complémentaire spécifique de la caractéristique génétique à identifier. 28. Méthode d'identification selon la revendication 27, caractérisée en ce que les cellules sont fixées, après immobilisation covalente, notamment par du paraformaldéhyde. 29. Méthode d'identification selon la revendication 27 ou 28, caractérisée en ce que la sonde marquée complémentaire est spécifique de la région centrométrique du chromosome 18 ou de la bande terminale 21 q 22.3 du chromosome 21. 30. Support solide fonctionnalisé par un bras espaceur utile notamment pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une des revendications 1 à 29, tel que décrit aux revendications 2 à 9.