Brevet FR2749011A1 — publié le 19971128

l DOMAINE TECHNIQUE: La présente invention concerne la détection et la caractérisation de levures. En particulier elle fournit des sondes spécifiques, notamment nucléiques, et un modèle de développement des dites sondes pour la détection et, en particulier, l'identification et le typage (caractérisation infra-spécifique) des souches de levures de différentes espèces d'intérêt médical et industriel. ART ANTERIEUR: Les levures sont des champignons, micro-organsimes eucaryotes, chez lesquels la forme unicellulaire est prédominante (Barnett J., W., R., W. Payne and D. Yarrow., "Yeasts charactéristics and identification, 2nd Edition, Cambridge university press, Cambridge, 1991). Elles sont divisées en genres (e.g. Candida) et espèces (e.g. Candida krusei) sur la base de critères de reproduction sexuée (lorsqu'elle existe), morphologiques, physiologiques, chimiotaxonomiques et moléculaires. Les levures sont ubiquitaires. Généralement leur innocuité est bien établie. Elles sont souvent utilisées comme agent de transformation (auxiliaires technologiques) dans les procédés agro-alimentaires, mais certaines sont parfois pathogènes. Les levures sont généralement considérées comme étant des pathogènes opportunistes. Les levures pathogènes opportunistes intéressent le domaine de la mycologie médicale. Ces levures sont responsables d'infection superficielles, cutanées, sous- cutanées, et systémiques. Ces dernières sont les plus sérieuses en raison des taux de mortalité élevés qui leur sont imputés. Les levures pathogènes appartiennent le plus souvent au genre Candida. Parmi ce genre les espèces plus particulièrement importantes sont Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida (Torulopsis) glabrata. Les infections qu'elles provoquent sont appelées "Candidoses". La prévalence et la pathogénécité de ces levures opportunistes sont élevées chez les sujets immunodéprimés, notamment chez les patients neutropéniques, atteints de SIDA, cancéreux, etc... Toute la difficulté du traitement de ce type d'infections, provient du fait que certaines espèces sont résistantes à certains antifongiques, notamment au fluconazole (e.g. C. krusei, C. glabrata). En outre, pour une même espèce certaines souches présentent un caractère de résistance alors que d'autres sont sensibles aux antifongiques considérés (e.g. C. albicans, C. lusitaniae). En conséquence, une détection rapide et une identification précise et fiable ainsi qu'un typage des souches de ces espèces sont de plus en plus nécessaires, notamment pour permettre la mise en place d'un traitement antifongique approprié. Il existe, en outre, un réel besoin en marqueurs épidémiologiques fiables, à des fins d'études épidémiologiques dans le domaine médical, ou de traçage des souches dans les industries agroalimentaires ou de fermentation. Mais force est de constater que, les méthodes classiques d'identification des levures ne donnent pas entière satisfaction à tous ces égards. On connaît ainsi notamment celles décrites par Barnett J., W., R. W. Payne and D. Yarrow., dans "Yeasts characteristics and identification", 2nd Edition, Cambridge university press, Cambridge 1991, qui nécessitent un isolement préalable du micro- organisme en culture pure, puis l'étude de ses caractéristiques morphologiques et surtout physilologiques (plus de 80 tests), l'ensemble de ces opérations requérant de 10 à 30 jours pour une identification. Ces méthodes sont donc fastidieuses et particulièrement longues. Elles sont réservées aux laboratoires de référence et inutilisables en pratique courante. Plus rapide et plus rationnelles, les méthodes miniaturisées et standardisées d'identification des levures d'importance médicale, comprennent cependant toujours un isolement préalable puis une identification du micro-organisme à l'aide de tests physiologiques, réalisés par exemple à l'aide de galeries. La durée de tels tests est d'environ 5 jours pour aboutir à une identification. De plus ces techniques donnent parfois des résultats équivoques. Des espèces telles que C. krusei, C inconspicua, C. lipoltica, C. noregensis, C. rugosa et C. valida sont parfois, voire même souvent, confondues. Avec le progrès de la biologie moléculaire, une nouvelle technologie utilisant le principe d'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN s'est développée pour la mise au point des tests d'identification rapides, sensibles et spécifiques. Le matériel génétique des micro-organismes présents dans l'échantillon est decelé directement à l'aide de sondes nucléiques à ADN ou ARN marqué. La détection et l'identification peuvent être réalisées simultanément sans isolement préalable. Les rares méthodes décrites d'identification des levures à l'aide de sondes nucléiques, présentent l'inconvénient d'être basées sur des sondes de petites tailles (30 à nucléotides) qui nécessitent la mise en oeuvre d'un marquage radioctif plus sensible que le marquage non radioactif mais aussi plus contraignant. Un autre inconvenient de ces sondes lié à leur taille réduite, s'exprime dans le cadre de leur mise en oeuvre dans les techniques de polymérisation en chaine (PCR). Ces dernières consistent à amplifier une séquence ADN donnée, en la multipliant à partir d'un couple d'amorces et l'aide d'une polymérase. De telles amplifications peuvent être employées dans un but diagnostique, afin de faciliter la détection. Dès lors que ces sondes seraient utilisées comme amorces en PCR cela limiterait les possibilités de choix des amorces dans une petite séquence de 30 à 35 nucléotides. Ces sondes sont généralement dirigées contre des séquences cibles d'ADN codant la petite sous unité 18 S de l'ARN ribosomique (ssuARNr). Ces cibles sont classiquement choisies car les séquences d'ADN codant les ARN ribosomaux sont les premières à avoir été déterminées. De même l'utilisation de la partie 3' des séquences codant la grande sous unité 25 S de l'ARN ribosomique (lsuARNr) a été décrite. Il existe un problème lié au choix de séquences codant les ssuARNr ou I suARNr comme cibles. En effet ces séquences ont un caractère universel, c'est-à-dire qu'une partie importante d'entre elles est retrouvée chez tous les micro-organismes (levures, bactéries); elles sont dites "hyper- conservées". Le choix des séquences cibles est donc limitées aux portions limitées variables de ces séquences codantes des ARNr. En outre, parmi les sondes décrites dans l'art antérieur, aucune ne permet le typage des souches, c'est-à-dire la différenciation des individus au sein de l'espèce, ces individus étant uniquement assignés à un groupe: e.g. l'espèce Candida krusei, l'espèce Candida glabrata, l'espèce Candida lusitaniae, etc... En effet, les sondes préalablement décrites ne permettent pas un typage des souches au sein des espèces car elles ne révèlent pas suffisamment de polymorphisme de la taille des fragments de restriction parmi les souches de ces espèces et ainsi ne constituent pas de marqueurs épidèmiologiques fiables. A titre d'illustrations de telles sondes connues et répondant imparfaitement aux besoins techniques existant en la matière, on peut citer: l es sondes oligonuléotdiques développées par la société Genetrak Systems et dirigées contre des séquences de 30 (probes 1351), 33 (probe 1537) et 35 (probe 1530) nucléotides de l'ADN codant l'ARN ribosomal 18 S. Ces sondes sont décrites dans la demande de brevet européen N 0 422 869. Elles ont été testées contre 4 souches de Candida krusei. Il est à noter qu'il n'est pas fait état dans les exemples de cette demande, de détection de Candida krusei par hybridation dans les prélèvements de sang humain, crachats ou liquide céphalorachidien. Par ailleurs, ces sondes ne permettent pas de différencier les souches entre elles au sein de l'espèce Candida krusei. À la sonde décrite par Niesters et collaborateurs (Niesters et al., 1993, Rapid polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species. J. Clin. Microbiol., 31, 904-910) 1993). Il s'agit d'une sonde de 20 nucléotides (oligonucléotide 705) dirigée contre une séquence spécifique du produit d'amplification de la petite sous unité d'ARN ribosomal (ssuARNr). Cette étude est utilisée dans une méthode d'identification des espèces du genre Candida basée sur l'amplification en chaîne (PCR) de séquences du gène codant la ssuARNr, puis le séquençage direct de ces séquences. Cette méthodologie concerne, là encore, I'ARN ribosomal. Elle présente l'inconvénient de nécessiter un séquençage direct du produit d'amplification, technique qui n'est accessible qu'à un nombre limité de laboratoires de recherche et surement pas applicable en routine. De plus, d'après les auteurs, l'oligonucléotide 705 ne permet pas une amplification spécifique de l'ADN de Candida krusei. Les sondes décrites par Niesters et collaborateurs ne perrnettent pas elles non plus de typer les souches de Candida krusei. On connaît également, notamment au travers de l'article rédigé par BALEIRAS COUTO et al - Applied & Environmental Microbiology, Jan. 1996 p.41-46 "Evaluation of molecular typing techniques to assign genetic diversity among Saccharomyces cerevisiae strains". Cet article divulgue la descrimination de souches à l'intérieur de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, par recours aux techniques d'identification du type de celles faisant intervenir des fragments d'ADN polymorphiques amplifiés de manière aléatoire (RAPD) et du type réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à l'aide d'amorce nucléotidique. Les fragments obtenus par ces techniques sont ensuite soumis à des digestions à l'aide d'enzyme de restriction. Toutes les séquences et fragments ainsi obtenus sont testés dans l'identification intraspécifique de 16 souches différentes de Saccharomyces cerevisiae. La RAPD et la PCR ont permis de reconstituer les régions d'espacement intergénique transcrite (IGR - ITS) et les régions intergéniques non transcrites (IGR - NTS) de cistrons d'ADNr codant pour la synthèse d'ARN ribosomial (ARNr). Ce document ne décrit nullement le contenu des séquences reconstituées par RAPD et PCR dont la longueur est d'ailleurs d'au moins 7 kbases (kb). Cet article enseigne qu'il n'existe pas de polymorphisme significatif entre les souches de Saccharonmyces cerevisiae A. Dans le meilleur des cas, correspondant à celui ou l'on utilise des TaqI, il n'est possible de discriminer que 6 souches sur 16. Ce résultat est tout- à-fait - perfectible. Par ailleurs, BALEIRAS COUTO et al incitent plutôt le lecteur à s'intéresser aux régions intergéniques d'espacement non transcrite (ITS, pour la différenciation infraspécifique de levure). Il présente les régions intergéniques transcrites comme étant plus appropriées que les régions intergéniques non transcrites (NTS). En outre, les amorces (Primers) utilisées dans la technique de (PCR) préconnisées dans ce document, ne fonctionnent pas de façon universelle sur toutes les espèces de levures, ceci constitue un facteur limitatif de la technique en particulier les auteurs indiquent que l'amplification n'a pas été possible pour les espèces C. valida, C krusei, Z. bailii, ou Z. rouxii. Il apparaît donc que les techniques décrites dans cet article ne conviennent que pour du typage infraspécifique de levure et notamment pas pour l'identification d'espèces de levure. La demande de brevet internationale WO 95/11 991 décrit une sonde et un procédé de détection des levures de l'espèce C. lkrusei. Les outils génétiques constituant cette sonde sont formés par un fragment d'ADN et/ou d'ARN de taille comprise entre 7 et 4 kb, hybridant spécifiquement avec I'ADN et/ou l'ARN de Candida k'usei et ne codant pas pour I'ARN ribosomal (ARNr). Sont également compris dans ces outils génétiques, les produits de transcription et de traduction du susdit fragment, de même que les associations entre ces différents outils. Cette demande de brevet ne divulgue pas la structure des fragments d'ADN mis en oeuvre dans cette sonde. Le moyen de caractérisation utilisé pour ces fragments, est formé par leur carte de restriction enzymatique. L'espèce de levures exclusivement concernée par ce document est Candida krusei. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION Dans cet état de la technique, l'un des objectifs essentiel de la présente invention est de fournir une sonde de détection et d'identification spécifique et/ou infraspécifique de levure, à vocation universelle dans le domaine des levures. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde, notamment nucléique, qui permette à la fois une détection spécifique et une identification infra spécifique de levure, de manière performante, fiable et reproductible. Un autre objectif de l'invention est de fournir une sonde, notamment nucléique, qui soit de taille suffisante pour autoriser l'utilisation d'un marqueur, autre que radioactif et donc de mise en oeuvre plus commode. Un autre objectif de l'invention est que cette sonde nucléique soit dirigée contre des séquences cibles d'ADN différent de celui codant pour des petites sous-unités 5,8 S ou 18 S d'ARN ribosonmique, qui sont globalement peu représentatifs de l'espèce, car très conservées chez les micro-organismes. Un autre objectif de l'invention est que cette sonde puisse être utilisée dans des milieux complexes biologiques du type sang humain, crachat, ou liquide céphalorachidien. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde notamment à Candida krusei qui permette de dépasser la simple détection d'espèces pour accéder à l'identification précise et au typage des levures au sein même de l'espèce Candida krusei. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde notamment à Geotrichum candidurn qui permette de dépasser la simple détection d'espèces pour accéder à l'identification précise et au typage des levures au sein même de l'espèce Geotrichum candidurn. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde de détection de levure qui soit composée d'outils génétiques du type séquence d'ADN et/ou d'ARN 3 5 parfaitement identifiée et reproductible. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde de détection de levure qui soit significativement performante pour l'identification inter et infraspécifique d'un suffisamment grand nombre de levures, pour pouvoir être économique viable. Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de détection et d'identification inter/infraspécifique de levures qui soit simple, non délicat et économique à mettre en oeuvre et dans lequel on a recours à la sonde susvisée. Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir une sonde applicable notamment à la détection spécifique à l'identification infraspécifique de levure mais également comme marqueur épidémiologique, comme traceur de souches, ou dans le cadre d'une stratégie thérapeutique visant les affections à levure, entre autres. Ces objectifs, et d'autres encore, sont atteints par la présente invention qui concerne une sonde notamment de détection spécifique et/ou infraspécifique de levures, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants: - au moins une partie: * d'au moins un fragment F d'acide nucléique ADN et/ou ARN recopié, construit et/ou isolé à partir d'au moins une séquence-source d'ADN ribosomal (ADNr): --> ne codant pas pour la synthèse d'ARN ribosomal (ARNr), localisée dans la région d'espacement intergénique (IGR) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sous- unité 25 S d'ARNr, et l'ADNr codant pour la sous-unité 18 S d'ARNr, -> et itérative comprenant au moins deux sous-séquences répétées, le degré d'homologie entre ces sous-séquences étant supérieur ou égal à 50 %, de préférence 55 %, et plus préférentiellement encore à 60%; * et/ou d'au moins un analogue Fa de ce fragment, résultant de la dégénérescence du code génétique; * et/ou d'au moins un fragment Fc d'ADNc complémentaire du fragment F, - au moins une partie des produits de transcription primaire du fragment F et/ou Fa et/ou Fc; - et une association des outils énumérés ci-dessus DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION: Il est donc du mérite des inventeurs cités dans la présente demande d'avoir pu isoler et caractériser un certain nombre de fragments F d'acide nucléique ayant une structure tout-à-fait particulière et qui defacto, constitue une véritable empreinte digitale non seulement d'une espèce donnée de levure mais également des différentes souches contenues dans cette espèce. Le mérite des inventeurs est d'autant plus grand que l'isolement et la caractérisation desdits fragments a été réalisé au sein des zones d'espacement intergénique non transcrites de cistrons ribosomaux, alors qu'il existait un courant scientifique, illustré notamment par l'article de BALEIRAS COUTO et al visé ci- dessus, selon lequel il semblait préférable et recommandé de s'intéresser aux régions transcrites des gènes ribosomaux pour la détection et l'identification de levures. Il relève également du mérite des inventeurs d'avoir proposé des outils génétiques ou apparentés constitués par les susdits fragments pour la détection et l'identification inter-espèce de levures, de même que pour la mise en évidence infraspécifique (discrimination des levures d'une espèce donnée) et, en particulier, sans que cela ne soit limitatif, des espèces Candida krusei et Geotrichum candidum Les fragments F, Fa, Fc d'acide nucléique selon l'invention ont pour caractéristique originale et avantageuse d'être non transcrits et de comprendre un ou plusieurs modules séquentiels de bases nucléiques (dénommés également séquences-sources itératives dans le présent exposé) comportant chacun une ou plusieurs sous-séquences répétées qui sont des copies très proches les unes des autres. C'est ou ce sont ces modules qui constituent un ou plusieurs motifs primaires utiles pour la détection/identification inter et infraspécifique d'une pluralité de levures. Le nombre de bases nucléotidiques de ces modules ou séquences-sources varient dans une espèce à l'autre, mais on retrouve cette organisation similaire récurrente dans de multiples espèces de levures. Sans vouloir être lié par la théorie, il semble que le moyen d'identification infraspécifique des sondes conformes à l'invention, puisse être fondé sur le polymorphisme qui, au sein d'une espèce donnée de levure, découle du nombre de sous-séquences dans les modules ou sequences-sources itératives, ou entrant dans la constitution des fragments F, Fa, Fc des sondes selon l'invention. Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, premier mode qui est d'ailleurs préféré, la séquence-source de F est localisée dans la région d'espacement intergénique 2 (IGR2) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sous-unité 5S d'ARNr et l'ADNr codant pour la sous-unité 18 S d'ARNr (Cf Fig.2 annexée). Selon une variante avantageuse du premier mode de réalisation de l'invention, la séquence-source itérative de F correspond à une séquence Fa et comprend au moins trois sous-séquences répétées comportant chacune au moins 80, de préférence au moins et plus préférentiellement encore entre 150 et 300 bases nucléotidiques. En pratique, la séquence-source Fa comprend entre 3 et 10 sous-séquences répétées comprenant entre 150 et 250 bases nucléotidiques. De préférence, les séquences-sources itératives de F et, en particulier Fa, de la sonde selon l'invention comprennent chacune au moins une sous-séquence de longueur tronquée par rapport aux autres sous-séquences, cette sous-séquence tronquée étant de préférence terminale. S'agissant de la séquence-source itérative Fa, il est à considérer, sans pour autant vouloir être lié par la théorie, que le nombre de sousséquences répétées élémentaires détermine le polymorphisme au sein d'une même espèce de levures. Cela pourrait résulter d'une répliquation (duplication d'une ou plusieurs des sous-séquences répétées). Le tronc commun structurelles entre les différentes souches d'une même espèce tient à une similitude dans l'organisation des répétitions de chaque sous-séquence. Les phénomènes de réplication (duplication) à l'origine du polymorphisme entre souches sont liés à des recombinaisons, dont l'éventuelle séquence tronquée terminale évoquée ci- dessus, serait le reflet. Toujours dans le cadre du mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, selon lequel la séquence source F est dans l'IGR2, il est prévu, conformément à une autre variante avantageuse, que la séquence-source itérative de F correspond à une séquence F3 et comprend au moins trois sous-séquences répétées comportant chacune au moins 4, de préférence au moins 6 et, plus préférentiellement encore entre 7 et 25 bases nucléotidiques, chaque sous-séquence comprenant au moins un motif commun (Com 1) à toutes les sous-séquences et ayant une longueur inférieure ou égale à celle de la sous- séquence à laquelle il appartient. En pratique, ces séquences-sources F13 comprennent chacune 8 à 12 sousséquences répétées comportant individuellement entre 7 et 13 bases nucléotidiques. Conformément aux deuxième mode de réalisation de la sonde selon l'invention, la séquence source de F: est localisée dans la région d'espacement intergénique 1 (IGR,) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sous-unité 5S d'ARNr et l'ADNr codant pour la sous-unité 25 S d'ARNr À et correspond à au moins une séquence Fy et comprend au moins trois sous- séquences répétées comportant chacune au moins 4, de préférence au moins 5 et, plus préférentiellement encore entre 5 et 40 bases nucléotidiques, chaque sous-séquence comprenant au moins un motif commun (Com 2 ou 3) à toutes les sous-séquences et ayant une longueur inférieure ou égale à celle de la sous-séquence à laquelle il appartient. un cas de figure particulièrement préféré étant celui dans lequel F correspond à au moins deux séquences Fy F y et Fy2 ayant respectivement avantageusement de 5 à 20 et de 9 à 25 bases nucléotidiques. Selon un autre de ces aspects, la présente invention concerne également des séquences d'ADN, de préférence ribosomal (ADNr), susceptibles de correspondre aux fragments F sus-évoqués: Fc, F3, Fy, Fy et Fy2, ou susceptibles de contenir tout ou partie d'un ou plusieurs desdits fragments F noyés au sein d'une longue séquence d'ADNr. La présente invention a donc ainsi également pour objet une séquence d'ADNr caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe des séquences annexées suivantes: SEQIDNO: 1:;SEQIDNO: 2:;SEQIDNO: 3:; SEQIDNO: 4:; SEQID NO: 5:; les SEQ ID NO: 2: à: 5: étant particulièrement préférés. En l'occurrence, la SEQ ID NO: 1 annexée contient toutes les SEQ ID NO 2 à 5 - SEQ ID NO: 2: -> base N 2256 à base 3512 - SEQ ID NO: 3: --> base N 4823 à base 4903 - SEQ ID NO: 4: - base N 923 à base 1011 - SEQ IDNO: 5: X base N 1012 à base 1151 Selon un exemple particulier d'illustration de l'invention, la sonde qu'elle concerne est caractérisé en ce que: Fca correspond à SEQ ID NO: 2 F13 correspond à SEQ ID NO: 3 Fy1 correspond à SEQ ID NO: 4: FY2 correspond à SEQ ID NO: 5 Cet exemple de réalisation correspond à une souche de Candida krusei. Suivant une disposition ou une modalité intéressante de l'invention, la sonde décrite ci-dessus est caractérisée - en ce qu'elle comprend au moins une partie d'au moins l'un des fragments Fca, F13, Fy1, Fy2, le fragment Fa étant particulièrement préféré. - en ce qu'elle est appliquée: D> à la détection/identification spécifique et infraspécifique de levures, r> ou comme marqueur épidémiologique, > ou encore comme traceur de souche, r> ou bien enfin dans le cadre d'une stratégie thérapeutique visant des affections à levures. Dans le cadre de l'application en détection / identification, les fragments F, Fa et Fc sont utilisés comme sonde selon le principe d'hybridation ADN-ADN ou ADNARN. Une sonde constituée de tels fragments permet la réalisation de tests de détection et d'identifications rapides, sensibles, et inter/infraspécifiques d'une pluralité d'espèces de levure. En d'autres termes, cette sonde peut notamment constituer un excellent marqueur de typage des souches d'une espèce donnée et en particulier de Candida krusei ou Geotrichum candidurn, ces dernières espèces ayant été sélectionnées, parmi d'autres, pour servir de support à l'exemplification du présent exposé. Il faut considérer que l'hybridation de la sonde nucléique de l'invention avec des séquences cibles d'acide nucléique de levure (e.g. C krusei), peut se faire à l'aide de la totalité des fragments F visés ci-dessus mais aussi avec seulement une fraction de tout ou partie de ces fragments, dont la taille reste, de préférence, supérieure ou égale à 5 Bases, de préférence à 10 Bases et, plus préférentiellement encore à 100 Bases. Une autre des caractéristiques avantageuses de la sonde nucléique selon l'invention est liée au fait que cette dernière peut être marquée à l'aide de moyens de marquage aptes à révéler l'hybridation. Ces moyens de marquage peuvent être radioactifs ou non. Parmi les marqueurs radioactifs classiques, on peut citer le p32. S'agissant des marqueurs non radioactifs, on peut mentionner à titre d'exemples, les enzymes fixés tels que la peroxydase. Par ailleurs, la sonde selon l'invention peut éventuellement être employée comme source d'amorce spécifique utilisable dans des réactions de polymérisation en chaîne (PCR). Ces amorces constituent un autre objet de l'invention. Comme cela a déjà été signalé, la sensibilité de la sonde selon l'invention est excellente, de sorte qu'elle est parfaitement adaptée à la détection et/ou au typage de levures (e.g. Candida knrsei ou Geotrichum candidum) par hybridation en "dot-blot" ou en "southern- blot". Cette sensibilité se vérifie dans des essais indirects d'hybridation (méthode des dépôts, dot-blot, southern-blot) mais aussi dans des expériences d'hybridation directe in situ. Ces dernières consistent à faire une empreinte sur filtre, de colonies en croissance sur un milieu de culture solide et à amener la sonde d'hybridation directement sur le filtre. Comme cela ressort du texte supra ainsi que de la revendication 1, la sonde selon l'invention est de préférence de nature nucléique, c'est-àdire constituée d'acides nucléiques du type ADN, ADNc, ARNm Iaire issus de la transcription primaire de l'ADN ou leurs variants et analogues. Il est intéressant de noter que la sonde selon l'invention peut être employée efficacement dans tout milieu complexe, comme peuvent l'être les milieux biologiques: sang, crachat, liquide céphalorachidien, etc. Cela n'interfère nullement sur ses qualités de détection et d'identification. La présente invention concerne également un procédé de détection et d'identification inter et/ou infraspécifique de levure caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une sonde nucléique telle que décrite ci- dessus. Ce procédé s'inscrit dans le cadre des méthodologies connues dans le domaine de la détection et de l'identification génétique des microorganismes. De préférence, ce procédé comprend les étapes suivantes: - on extrait l'ADN total génomique des souches à étudier, - on soumet éventuellement cet ADN total à une digestion enzymatique à l'aide d'au moins une enzyme de restriction, - on dénature l'ADN total éventuellement digéré, 1l - on met en présence l'ADN total ainsi dénaturé, avac la sonde elle-même préalablement dénaturée et dotee d'au moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation, - on élimine l'ADN et la sonde non hybridée, - et on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur. Il s'agit d'une technique d'hybridation dans laquelle l'ADN cible du micro-organisme à étudier, est soumis à une dénaturation, avec ou sans digestion enzymatique préalable. L'étape qui suit est celle de réassociation des brins séparés d'ADN dénaturé avec la sonde pour reformer des appariements de paires de base originaux. Lors de cette étape de réassociation, les molécules simple brin de la sonde et de la cible sont mises en condition plus ou moins favorables pour l'appariement (plus ou moins stringentes). Dans des conditions très stringentes seules les molécules dont les séquences sont complémentaires pour un grand nombre de bases, s'hybrident pour former une molécule double brin. La sonde est alors spécifique de la cible. Avec une sonde marquée à l'aide d'un élément radioactif, tel que le p32, ou d'une enzyme greffée comme par exemple le peroxydase, l'hybridation est aisément révélée qualitativement et quantitativement. Il ressort de de ce qui précède que la sonde nucléique selon l'invention ainsi que le procédé en faisant application, sont parfaitement spécifiques des levures (e.g. Candida krusei ou Geotrichum candidurn) et offrent une excellente sensibilité. Cela leur ouvre des débouchés tout à fait intéressants dans les domaines applicatifs de l'identification et du criblage différenciation des souches de différentes espèces. (diagnostic médical, contrôles industriels en alimentaire, fermentation...). La sonde et le procédé selon l'invention intéressent diverses espèces de levure et, en particulier, celles d'intérêt médical telles que celles du genre Candida ou d'intérêt industriel (agroalimentaire tel que Geotrichum Candidum). Outre, la détection qui regroupe l'identification et le typage de microorganisme de type levure, la sonde selon l'invention pourrait être appliquée dans le cadre d'une stratégie thérapeutique dirigée à l'encontre des affections à levures. Plus précisément, cela signifie que les fragments F formant la sonde peuvent être employés comme cibles à atteindre, pour des principes médicamenteux actifs contre les levures. Ce rôle de cible pour médicament pourrait notamment être tenu par l'ADN ou par ses produits de transcription primaire. L'emploi de la sonde selon l'invention comme marqueur épidémiologique ou comme traceur de souches constituent d'autres variantes d'applications de la sonde selon l'invention. L'illustration de la présente invention effectuée ci-après sur la base de travaux réalisés pour les espèces de levures Candida krusei et Geotrichun7 candiduin, mais il va de soi que les exemples basés sur Candida la'usei et Geotrichum cantdidurn pourront être extrapolés aux autres espèces de levures et, notamment à celles d'intérêt industriel et médical. En tout état de cause, l'invention sera mieux comprise, d'autres de ses avantages et variantes de réalisation ressortiront bien, à la lumière des exemples non limitatifs qui suivent et qui décrivent en référence aux dessins annexés la structure d'une sonde selon l'invention et en particulier à des fragments F qui la constitue, ainsi que plusieurs procédures de détection et d'identification en faisant application. DESCRIPTION DES FIGURES: - la liste des séquences annexée donne la structure des SEQ ID: 1 à 5: correspondant respectivement aux fragements F1 et Fa, F3, Fy7 et Fr2. Le fragment F1 donne le séquençage de la région intergénique d'espacement (IGR) entre l'ADNr 25S et l'ADNr 18 S d'un cistron ribosomal de Candida krusei. Les exemples de fragment Fa, F3, Fy7 et Fy2.seront également dénommés respectivement CKRSI/ b / al / a2, dans ce qui suit. - la Figure 1 annexée représente l'hybridation Southern-blot de Candida krusei LMCK31 par des sondes Fl et/ou F2. - la Figure 2 est une représentation schématique d'un cistron d'ADN ribosomal (ADNr) montrant la localisation du fragment Fl dans la région d'espacement intergénique (IGR) et, au sein de cette dernière, l'existence des fragments Fa, F13, (IGR2) de même que Fy et FY2 (IGR,), conformes à l'invention. - la Figure 3 est une carte de restriction du fragment F1 de la Figure 2. - la Figure 4 est une représentation schématique de la stratégie de séquençage, en corrélation avec le fragment Fl de la figure 3. - la Figure 5 est une représentation schématique éclatée du fragment Fa montré aux Figures 2 et 3. - la Figure 6 donne le séquençage de Fa, en particulier de ses sousséquences Kre-0 à 7, en faisant une comparaison entre les différentes sous-séquences. Des étoiles représentent des bases analogues à celles de la sous-séquence Kre-1. "ivrl inversée comprenant 8 bases. > est un Palindrome de 8 bases. - Les Figures 7A, 7B et 7C sont des représentations comparées des sousséquences formant les séquences-sources itératives F1, Fy1 et FY2 respectivement. - les Figures 8A et 8B sont des éléctrophorèses à champ pulsé de chromosomes de C. kl-usei et de C. albicans, respectivement avant et après hybridation avec des sondes Fl, Fa et F13, Fy, et Fy2. - la Figure 9A est une photographie d'une séparation par électrophorèse sur gel d'agarose, de fragments d'ADN de souches de différentes espèces de levures (1 à 11), digéré par EcoRI. 27490 1 1 - la Figure 9B est une hybridation selon Southern d'ADN de différentes espèces de la Figure 9A, illustrant la spécificité de la séquence-source itérative Fa (ou CKRS-I) utilisée comme sonde. - la Figure O10A est une photographie du gel d'électrophorèse de l'ADN de plusieurs souches de l'espèce Candida krusei. - la Figure lOB est une hybridation selon Southern de l'ADN de différentes souches de C. krusei, illustrant le polymophisme mis en évidence lorsque la séquence Fac (ou CKRS-1) est utilisée comme sonde. - la Figure 11 montre le résultat de l'amplification sélective en PCR de la région comprenant Fca. - la Figure 12 est une représentation schématique de la Carte de restriction du Fragment FN forment la sonde A2027 de Geotrichum candidum. Cette sonde comprenant un sous- fragment F dont la séquence-source itérative est FA (région variable GCRS-A). - la Figure 13 représente un profil d'hybridation (Southern) avec la sonde A2027 spécifique de Geotrichum candidum et développée selon le mode de la sonde F(FaO, F13, F l, Fy2) de Candida krusei. EXEMPLES EXEMPLE I: SEQUEN AGE D'UN FRAGMENT Fl D'ADNr DE C. KRUSEI PROVENANT DE LA DIGESTION DE LA SOUCHE LMCK I PAR ECORI 1.1. La souche LMCK 31 a été isolée dans un prélèvement bronchoalvéolaire chez un patient hospitalisé. Cette souche a été déposée le 22 Octobre 1993 à la CNCM de l'Institut Pasteur de PARIS sous la référence 1-1372. Cette souche LMCK 31 est cultivée sur des milieux de culture du type gel AGAR YM (1% glucose, 0,3 % extrait levure, 0,3 % extrait de malt, 0,5 % de pactopeptone) ou AGAR SM (1% glucose, 1% bactopeptone, 0,1 % MGSO4. 7H20, 0,22 % KH2PO4, 0,1% K2 HPO4, 0,1% extrait levure). 1.2. Isolement et clonage d'un fragment Fl Un fragment Fl de longueur approximativement égale à 5,4 kb est isolé à partir d'ADN génomique de la souche LMCK31, conformément au protocole décrit dans la demande de brevet PCT WO-95 11 991. Le fragment Fl a été sélectionné parmi la multitude de fragments produits par la digestion de l'ADN totale de LMCK3 1 par EcoRI ou par Hinfi. Plus précisément on a réalisé une hybridation "southern blot" en mettant en oeuvre 5 lg d'ADN génomique de Candida krusei LMCK31 digéré soit par EcoRI ou HinfI puis séparé par électrophorèse selon leur taille sur un gel d'agarose (0,8 % m/v). L'ADN séparé est dénaturé dans le gel par une solution de soude puis neutralisé par un tampon tris. L'ADN est ensuite transféré sur une membrane en nylon (Amersham life science inc., ARLINGTON HEIGHTS, IL) puis hybride avec la sonde contenant des fragments Fl et F2 correspondant à l'IGRI et 2 d'ADNr ou avec des plasmides contenant, soit le fragment F1, soit le fragment F2. La révélation de l'hybridation par "southern-blot" est effectuée à l'aide du kit ECL d'amersham. Les bandes d'hybridation sont obtenues par marquage avec la péroxydase et révélation par chimiluminescence. La Figure 1 annexée donne les résultats obtenus. La colonne A correspond aux produits de la digestion par EcoRI de l'ADN de Candida krusei non hybridé avec une sonde. La colonne B correspond à l'hybridation avec une sonde comprenant des fragments F1 et F2. La colonne C correspond à une hybridation avec une sonde plasmidique contenant F I et la colonne D à l'hybridation avec une sonde plasmidique contenant F2. Les poids moléculaires estimés des quatre bandes d'hybridation des colonnes B, C, D sont données en kilobase (kb) en marge gauche. 1.3. Séquençage de Fl F1 est séquencé dans son intégralité dans les deux directions. La méthode utilisée pour ce séquençage est une méthode classique dans le domaine technique considéré. Il s'agit de la méthode par les terminaisons DIDEOXY utilisant la séquénase version 2.0. (US biochemical, cleveland OH). Les moyens utilisés sont le kit ERASE-A-base (Promega - Madison, WI). La Figure 2 montre de manière schématique la localisation du fragment F1 dans le cistron d'ADN ribosomal de LMCK 31. La Figure 3 annexée donne la carte de restriction du fragment Fl. Les abbréviations utilisées pour les enzymes de restriction ont les significations suivantes: E = EcoRI (0,5261), Ev = EcoRV(1803), H=Hilfl (229, 1155; 1551, 4828, 4864), N =NsiI (401, 4383), P =PstI (2183), S = SmaI (803); St = StyI (2425, 2589, 2754, 2919, 3084, 3249, 3414). La Figure 4 annexée donne la stratégie de séquençage adoptée. Dans cette Figure 4, les chiffres encerclés 1, 2, 3 correspondent à des sous-clones produits de déletions. Les chiffres donnés entre parenthèses après les enzymes correspondent au numéro de base nucléotidique identifiant le site de coupure. Il apparaîtt donc que F1 est une macro-séquence comprenant 5261 paires de base et ayant un taux en bases GC de 42,2 % molaire. La séquence complète de F1 est donnée par SEQ ID NO: 1: dans la liste de séquence annexée. F1 comprend: - 488 paires de base sur l'extrémité 3' de l'ADNr 25 S, - la région d'espacement intergénique I (IGRI), - I'ADNr 5 S - et la région d'espacement intergénique 2 (IGR2). Comme, cela ressort des Figures 2 et 3, I'IGR2 (ou NTS = séquence non transcrite) comprend deux séquences sources itératives Foa et Fo3. Tandis que l'IGR1 renferme les deux séquences-sources itératives Fyl et Fy2. 1.3.1. Fca La séquence-source itérative Fca à une longueur de 1256 paires de base. (base 2256 à base 3512). Foc est représentée schématiquement sur la Figure 5. La Figure 6 et la SEQ ID NO: 2: de la liste de séquences annexée, donnent le séquençage complet de Foc. Foa est constitué de 8 sous-sequences répétées désignées par Kre-0 à Kre7 respectivement. Les 7 premières sous-séquences répétées Kre-0 à Kre-6 ont une longueur variant entre 164 et 165 paires de base. La dernière sous-séquence Kre-7 comporte 103 paires de bases (voir Figures 5 et 6). Le fragment d'ADN correspondant à Fu. à une teneur en bases GC de 35 % molaire. 1.3.2. FS L'autre séquence-source itérative d'un fragment F susceptible d'entrer dans la constitution d'une sonde selon l'invention, est compris dans l'IGR2 et désigné par la référénce FO3. Le séquençage de F13 est représenté sur la Figure 7A et sur la SEQ ID: NO: 3: de la liste de séquences annexée. La séquence-source F13 comprend 9 sous-séquences répétées comprises entre la base 4823 et la base 4903. Ces sous- séquences ont une longueur variable entre 8 et 10 bases. Elles contiennent un noyau commun de 6 bases constituant un motif commun (référencé sur la Fig. 7A par Com 1), répété soit directement (les uns à la suite des autres) soit en étant séparés par des espacements de quelques bases nucléotidiques. 1.3.3. Fyl et Fy2 Ces deux séquences-sources itératives Fyl et Fy2 sont localisées dans l'IGR,. Fyl comprend 9 sous-séquences répétées de longueur variant entre 6 et 16 bases, ces sous- sequences s'étalant de la base 923 à la base 1011 (Figure 7B). Fy2 s'étend de la base 1012 à la base 1151 et comporte 9 sous-séquences de longueur variant entre 10 et 17 bases (Figure 7C). Les sous-séquences de Fy2 sont des copies très proches les unes des autres. Deux noyaux aux motifs communs de 6 et 7 bases peuvent être isolés respectivement dans Fyl et Fy2. Les motifs communs de Fy1 et Fy2 sont identifiés par Com 2 et Com 3 sur les Figures 7B et 7C respectivement. A l'instar de Com 1 de Fy, Com 2 et Com 3 sont répétés soit directement (les uns à la suite des autres) soit en étant séparés par des espacements de quelques bases nucléotidiques. EXEMPLE 2: ETUDE DE L'HOMOLOGIE ENTRE LES HUIT SOUS-SEQUENCES DE Fot L'homologie des sous-séquences Kre-0 à Kre-7 a été étudié en comportant les sous- séquences après alignement optimal. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau I qui suit *TABLEAU I POl;RCE\NT.4GE DE B.4SES QOU "4LLUIE.,T" OU QCUI CORRESPONDENT ENTRE LES 8 SOUS- SEOQ UECESKre-O A.4 Kre-7 % de bases correspondantes (no. des bases différentes) Séquence Kre-O Kre- 1 Kre-2 Kre-3 Kre4 Kre-5 Kre-6 Kre-7* s kre-0 100_ _ Kre-1 71 (47) 100 Kre-2 77(39) 95(9) 100 Kre-3 77(39) 95(9) 100 100 Kre-4 77(39) 95(9) 100 100 100 Kre-5 67(56) 90(17) 93(11) 93(11) 93(11) 100 Kre-6 71(47) 96(6) 94(10) 94(10) 94(10) 91(12) 100 Kre-7* 66(35) 88(12) 96(4) 96(4) 96(4) 97(3) 90(10) 100 s * Les 103 bases de Kre-7 ont été comparées avec les 103 premières bases de Kre-n = 0 à 6. EXEMPLE 3: HYBRIDATION DE CHROMOSOMES DE CANADIDA KRUSEI ET DE CANDIDA 4LBIC.N'S AVEC DES SONDES COMPRENANT LES FRAGMENTS F ou Foc ET Fo ou Fy 1, Fy2 Cet exemple vise à démontrer que la localisation des fragments F1, Fca, F[3 Fy1 et Fy2 constituant la sonde selon l'invention est seulement sur les chromosomes contenant des cistrons d'ARNr. 3.1. Les souches mises en oeuvre sont LMCK31 pour Candida krusei et la souche 3153A pour Candida albicans. 3.2. Les fragments Fl, Foa, F3 Fyl et Fy2 mis en oeuvre sont ceux isolés dans les Exemples 1 et 2. 3.3. La technique mise en oeuvre est celle d'électrophorèse transversale à champ pulsé. Des plaques d'agarose contenant l'ADN chromosomique sont préparées à partir de suspensions de culture de souche C. krusei LMCK 31 et C. albicans 31 53A. Les cellules sont converties en sphéroplastes par la méthode de shareman et al, selon laquelle on met en oeuvre la ZYMOLYASE 20 T. Les sphéroplastes sont tout d'abord lavés deux fois dans une solution de sorbitol molaire puis remis en suspension à raison de 109 cellules/ml. Les sphéroplastes sont mélangées avec un volume = d'agarose seaplaque GT à 1 % (FMC bioproducts, Rockland ME) et immédiatement versé dans un moule. Les plaques sont traitées avec du SARCOSYL à 1% et avec une protéinase K titrant mg/ml et enfin incubé à 50 pendant 60 heures. Les plaques sont ensuite lavées dans une solution tampon TE (10 niM tris-HCL), ph 8, lmM EDTA) et stockée dans ce milieu à 4 C. Les ADN chromosomiques sont séparés par électrophorèse sur gel à champ pulsé dans un dispositif Gene line (BECKMAN, FULLERTON, CA) en utilisant de l'agarose LE 0,65 % (FMC bioproducts, Rockland me) ainsi qu'un tampon tris - acétate 0,04 M tris acétate, 0,001 M EDTA pH8). L'électrophorèse est menée selon les cinq étapes telles que décrites ci-après: 65 V pendant 6 heures avec une durée de commutation d'une minute; 65 V pendant 12 heures avec une durée de commutation de 2 mn; 65 V pendant 16 heures avec une durée de commutation de 4 mn; 65 V pendant heures avec une durée de commutation de 7 mn et 65 V pendant 18 heures avec une durée de commutation de 10 mn. Les gels sont ensuite révélés avec du bromure d'ethidium, photographiés puis transférés sur une membrane de nylon ZETABIND. L'hybridation et le lavage sont réalisés selon la méthodologie de CHURCH et GILBERT. Les bandes chromosomiques sont sondées avec les différentes sondes marquées radioactivement: Fl, Fcr et FJ3 Fyl1 et Fy2, selon la méthode d'hybridation sur membrane. 3.4. Résultats La Figure 8A montre les gels d'électrophorèse à champ pulsé qui montre que l'on a séparé chromosomes majeurs pour Candida krusei et 7 chromosomes majeurs pour Candida albicans. La Figure 8 B montre que les sondes Fl, Fa et Fo3, Fyl et Fy2 hybrident uniquement avec les trois plus gros chromosomes 1, 2, 3 de Candida krusei. Les sondes n'hybrident avec aucun des 7 chromosomes de Candida albicans. Ce qui démontre la spécificité inter- espèces desdites sondes. La Figure 8 a montre également un minichromosome m (pour Candida krusei). La Figure 8 montre une hybridation sur membrane dans laquelle les sondes ont été mises en contact avec des chromosomes pendant 4 jours. Le code P sur les Figures 8A à 8B correspond à la zone de dépôt de l'échantillon. EXEMPLE 4: TEST DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION ENTRE ESPECES La Figure 9A montre le gel d'électrophorèse de l'ADN de souches de différentes espèces de levures, digéré par l'enzyme EcoRI. La Figure 9B montre l'hybridation selon Southern correspondante lorsque les sondes Fl, Foc et F,3, Fy1 et Fy2 sont utilisées, en étant marquées à la peroxydase. Le protocole experimental est le même que celui décrit décrit dans l'Exemple I supra ainsi que dans l'Exemple 3 du WO-95/11991. Les sondes hybrident uniquement avec l'ADN de C. krusei (CBS 573T, bande n 10) et pas avec l'ADN des autres levures testées. Ceci démontre la spécificité interespèce desdites séquences. Dans les essais correspondant aux Fig. 9A et 9B, les microorganismes considérés sont les suivants S Standard: Phage lambda digéré par HindIII 1: C. tropicalis CBS 94T 2: C. parapsilosis CBS 604T 3 C. guilliermondii CBS 6021T 4 C. husitaniae CBS 6936T 5: C. kefyr CBS 607T 6 C. albicans serotype B 7: C. albicans serotype A 8: C. Albicans ATCC 2091 9: C. valida CBS 638T 10: C Krusei CBS 573 T 11: Y. lipolytica CBS 6124 T S: Standard: Phase lambda digéré par HindII EXE1MPLE 5: TEST DE TYPAGE INFRA-SPECIFIQUE POUR DIFFERENTES SOUCHES DE C. Krusei La Figure 10A montre le gel d'electrophorèse de l'ADN de plusieurs souches de l'espèce C Krusei, digéré pour l'enzyme EcoRI. La Figure 10B montre l'hybridation selon Southern correspondante lorsque les sondes Fl, Foc et FIB, Fyl et Fy2 sont utilisées, marquées à la peroxydase. Le protocole experimentale est le même que celui décrit dans l'Exemple I supra. (ou Exemple 3 du wo 95/11991). Les sondes hybrident avec toutes les souches de C. krusei testées, ce qui illustre leur intérêt pour la détection et l'identification de cette espèce. En outre, ces sondes révèlent un polymorphisme de la taille des fragments de restriction selon les sondes. Ceci illustre l'intérêt de ces sondes pour différencier les sondes entre-elles au niveau infraspécifique et donc pour le typage des souches dans le cadre d'études épidermiologiques ou le traçage des souches en milieu industriel. Toujours à titre d'exemple les souches référencées K62-K64 dont les profils d'hybridation sont identiques, proviennent d'un même patient. EXEMPLE 6: TEST D'IDENTIFICATION ET TYPAGE DE SOUCHES DE C. KRUSEI PAR REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR) DE LA REGION Foa (ou CKRS-1) La Figure 11 montre le résultat de l'amplification sélective (selon la méthode PCR) de la région Fa (CKRS-1) à l'aide des amorces Arnol: CGTAGGATACTAACCACAGC et Arno 2: GGCCAACACATACATACCTT dont les séquences sont choisies dans le fragment F1 de C. lkrusei (positions 2138-2167 et 3989-3970). Les conditions d'amplification sont celles décrites par Carlotti et al. 1994: Systematic and Applied Microbiology 17, 380-386. La procédure d'amplification par PCR est la suivante: 50 Pl de la solution d'ADN à tester (ADN de C. krusei et ADNs d'autres espèces de levures) contenant environ 10 à 100 pg sont ajoutés à 50 pl du mélange réactionnel contenant la Taq polymérase dans un tube eppendorf et placé sur un thermocycleur. La dénaturation initiale dure 3 minutes à 92 C. Elle est suivie de 30 cycles constitués de: I minute à 92 C, 1 minute à 60 C, 2 minutes à 72 C. L'extension finale dure 10 minutes à 72 C. Les différentes souches testées dans cet exemple sont désignés par les références R, 12 à 26 sur la Figure 11. La légende de ces références est donné ci-après R: Raoul 12: C. krusei CBS 573T 13: C. krusei LMCK 31 14: controle Négatif : S. cerevisiae CBS 1171 16: C. albicans ATCC 2091 17: C. nornegensis LM Q243 18: C. glabrata CBS 138T 19: Y. lipolytica CBS 6124T : C. kefyr CBS 607T 21: C. hlsitaniae CBS 6936T 22: C. guilliermondii CBS 6021T 23: C. parapsilosis CBS 604T 24: C. rugosa SIPH : C. valida CBS 638T 26: C. inconspicua CBS 180T Du fait de la spécificité de la région (CKRS-1) cible et des amorces choisies, seuls les ADNs des souches de C. krusei (réf 12, 13) ont donné un signal d'amplification positif (Figure 11). Les ADNs des autres espèces de levures testées n'ont pas été amplifiés. En outre, les différences de la taille des fragments amplifiés chez les deux souches de C. krusei testées traduisent le polymorphisme de la région Fa(CKRS-1). Cet exemple illustre bien l'intérêt de tests d'amplification par PCR de la région Fca(CKRS-1) pour l'identification des souches de C. krusei et pour leur typage simultané. Cette méthodologie présente l'avantage d'être très rapide et utilisable directement sur les prélèvements biologiques (crachats, sang, selles, LCR) ou alimentaires. EXEMPLE 7: TEST DE DETECTION, D'IDENTIFICATION-TYPAGE DES LEVURES DE L'ESPECE Geotrichumn candidum 7.1. L'isolement et le clonage du Fragment Fio comprenant F6 compris dans la sonde A2027 développée pour Geotrichum candidum, ont été réalisés conformément au protocole décrit à l'exemple I supra. La Figure 12 donne la carte de restriction du fragment FO10 comprenant la séquence- source itérative F6 (GCRS- 1). Abréviations: EV = EcoRV, SII = SacII, EI = EcoRI. 7.2. Test de détection/identification La Figure 13 montre les résultats d'hybridation, selon la méthode de Southern, de l'ADN de souches des espèces Geotrichum candidum et Geotrichum fermentans (digérés par MspI) avec la sonde A2027 spécifique de Geotrichumn candidum. Les fragments de restriction par MspI de l'ADN des souches étudiées ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,8 % puis transférés sur membrane en nylon. La membrane a été sondée avec environ 100 ng de la sonde A2027. Cette membrane n'hybride qu'avec l'ADN des souches de Geotrichum candidum et révèle un polymorphisme de la taille des fragments de restriction. La sonde A2027 a été développée selon le modèle de la sonde F = F1, Fax, Fo3, Fyl, Fy2. La sonde A2027 est constituée d'une partie F0lo dont Fô de l'IGR2 d'une souche de Geotrichunm candidum. La sonde A2027 hybride uniquement avec l'ADN des souches de Geotrichumni candidum (Fig. 13). Elle n'hybride pas avec l'ADN des souches de Geotrichumfermentans, bien que ces deux espèces soient proches. Cet exemple montre bien la spécificité de cette sonde selon l'invention. De plus, cette sonde révèle également un polymorphisme de la taille des fragments de restriction selon les souches de Geotrichumn candidum. Ceci permet de les différencier entre-elles et donc de les typer. Cet exemple illustre la validité du modèle présenté de sonde d'identification-typage pour les levures d'intérêt médical et/ou d'intérêt industriel. Les souches référencées sur la Figure 13, N 27 à 37 correspondant à: S = Standard G.fermn7entans CBS 50.57 G.fernmentans CBS 25.29 G. candidumn F G. candidurn A G. candidum B G. candidurn LMGC3 G. fermentans G. candidurn 149.26 G. candidum LMGC8 G. candidunm LMGC7 G. candidumn CBS 557.83 Standard LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: Université Claude Bernard Lyon I (B) RUE: 43, Boulevard du 11 Novembre 1918 (C) VILLE: Villeurbanne (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69622 Cedex (ii) TITRE DE L' INVENTION: Sonde et procédé notamment pour la détection et/ou l'identification inter/infraspécifique de levures, de même que les outils génétiques correspondants SEQ ID NO: 1: F1 5261 pb SEQ ID NO: 2: Fa (CKRS1) 1257 pb (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 SEQ ID NO: 3: r (b) 81 pb SEQ ID NO 4: FY1 (a1) 89pb (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDWAEà:: 5: Fy2 (a2) 140 pb (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE: (A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 96 03835 (B) DATE DE DEPOT: 22-MAR-1996 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (F1) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 5261 paires de bases (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAATTCGGTA AGCGTTGGAT TGTTCACCCA CTAATAGGGA ACGTGAGCTG GGTTTAGACC 60 GTCGTGAGAC AGGTTAGTTT TACCCTACTG ATGAATGTTG TCGCAATAGT AATTGAACTT 120 AGTACGAGAG GAACCGTTCA TTCAGATAAT TGGTTTTTGC GGCTGTCTGA GCAGACACTG 180 CCGCGACGCT ACCATCTGCT GGATAATGGC TGAACGCCTC TAAGTCAGAA TCCATGCTAG 240 AACGCGACGA TTACCTGCCC TCGCACATTT GAGAAGGATA CGAATAAGGC CCTGTGGCCG 300 CAGAACCGTA GCAGGCCGGC AGCGGTGCGC ATGGCGGAAA GGCCGTGTGT GCTTGCCGGC 360 GGATGGCAAT GTCAGGATGC GCTCAGATAA ATCCTATGCA TACGACTTAG ATGTACAACG 420 GGGTATTGTA AGCAGTAGAG TAGCCTTGTT GTTACGATCT GCTGAGATTA AGCCTCTGTT 480 GTCCGATTTG TTGCTTCGGC GGCGAAGGAG CGGTCCGTAG AGACGGGCTG 'rTGTITCGGG 540 AGTGTGGGGA GTGTGGGGGG ACTTAGGAGC GGGGGTAGTG TGGGGGAGTG TGGGGACTTG 600 GGAGCGGGNG TAGTAGGTGG TACTGATGGT ACGGGGAGGA GCCTACCCTr TT'TGTCGIT 660 TTGGCAAAGA CATTGCAGGA TTACAAAGT GATITACGAT ATGAACTAGG ACTATG'ITGT 720 GTGGAGGGGG TGGGGCTGTA GAGAGGATGG AITTGACGGG CATGACGGGG ACGGCTTGGA 780 GGCCGCCCAT GTCGTATGCC CCGGGGTAGG GTATAGGCCG OGAGGGOCCA GTTGGGAAAA 840 TAGCGAAGAG GGGGGGAGGA GGCTAAGAAG GCGGTGGGGG AGGGGGTAGG TTGATAAGTA 900 GGGGGTGTAG GAGCGTGGGT GGAGTGGGAG TGGGAGTGGG TGGTACAGAG TGGGTGGTAC 960 AGAGTGGGTG GTACAGAGTA CAGAGTGGGG AGAGTACAGA GTGGGAGTGG TAGGAGGAAG 1020 AGACAGTACA CAGTAGGAGG AAGAGAGTGG TAGGAAGAGA GTGGTAGGAG GAAGAGCGGC 1080 AGGAGGAAGA GAGTGGTAGG AGGAAGAGTG GTAGGAGGAA GAGTGGTAGG AAGAGAGTGG 1140 TAGGAGGAAG ATGGAATCCT AGACCTTGTA AAITCAGACA AAACTCGGTC AAAAACTAGA 1200 CAATGGGGGC AGTGCGGGAT TTCGACAAC AAAAACAAAG GGAGGTAAAC AAAGGCAAAC 1260 AAAGGTAAAC ACAAGAAAAA CAGGCAGCAC AGGCAGNAAA AAGATTGCAG CACCTGAGTT 1320 TCGCATATGG TCTCCCACTA CACTACTCGG TCAGGCTCTT AGCAGCT'rAA CTACAGTTGA 1380 TCGGACGGTA AACGGTGCTT TCTGCTAGAT ATGGCCGCAA CCGAAAGTAT AGAACGGGCG 1440 GCGTATGGGA GGTfGATrT TGGGCGGGCA GATTTCGACG GGTCGATAAA TCTCGACGGG 1500 ACGCATGTTT GCAGGGCCAT AGCAGACGAA CCAGAGCAGC TGAACAGGCG AGTCAACCAC 1560 CGTTGGAAAG AGCGCCGAGA AGTATCTAGT CCCCCCCATC GGTGTGGCCA TAGGACGCAA 1620 TCGGCAACAT GGCCAAAATC AAAAAACAAA AATMCCCACT TTTACAAAAT ATATATAATT 1680 TACAAAAAAT AGGTCTGGCA AAAATGCAAT =ITGGAAAAA AATCGAGTAA AAAGTAAATA 1740 TTATGGGCGG AACGGATAGC CGTCGACGCG ACGATGGTGA AAACCGTGGT TGGAAAGCCG 1800 ATATCGGGCC TGGGCGGAGA AAACGGCGAA AAGACAACTC CGAACACGAC AT T CGGCAA 1860 TGTTGCTGTr TCGGCAAAGT CCGAGGCGAA GTCCGAGGCG TAACTCCGAT GGGCGGAGAT 1920 AAAGTGCGCA CGTGACTGGT GCGAGGGGTG GGGCGTTCTG GAGCGACGCA AAAAAAAAAA 1980 CACGCACAAA AAAAATGGAC GTCGAGAAAA AAAAAM TTAC ACGAGCGAGC ACTAAGGTGG 2040 GAATGGACGT CCCCAGAAAT GTCTTCCACT TTGCCACCAC T'TITCTT GCACACTTCT 2100 GCTGTATGTC TGTCTGCACC ACCTCTTCCA CAACCAAGCA CACCACAGGT AGGATACTAA 2160 CCACAGCAGG GCTGTCTCTG CAGCCAACCA CCCAGCAGTT TCTTTTGATT TTGATTT 2220 TGATTTTNNT GAITTTTATT TTGACTGATr TTGCTTTTCC CTTGTGTAAA AGTCTCGTCG 2280 ACATTGCAGC TGGATGCAAT GGGCGTTTCT GAACACCAAT CCACTTAGTT GGGTTGATTT 2340 TTCTTACTGT CTGATGAAGA TATGATTGTT 1TTTAAAATT CCATTTTTTT TGATT=TATA 2400 TAACTTCACT GTGGGGTGGT TTCCCTTGGC CTGCAAGCTC ATACACATTA CAGTTCCATC 2460 CATTGCACGT TTCTAAACAC TACTCCACTT AGTTGGGCTG TTTATTTCCA CATGCTGATG 2520 AAATGGTTGC TGTITTTCAG AATTTCAGTT TT=TGAT ATATAACTTC ACTTTGGAGA 2580 TGATTTCCCT TGGACTTTAC AATCACACAC ATTACAGTTC CATCCATTGC ACGTITCTAA 2640 ACACTACTCC ACTTAGTTGG GCTAT=TATT TCCACATGCT GATGAAATGG TTGCTGTiTT 2700 TCAGAA=TTC AGTT'ITTTG A=TTTATATA ACTTCACTTT GGAGATGATT TCCCTTGGAC 2760 TTTACAATCA CACACATTAC AGTTCCATCC ATTGCACGTT TCTAAACACT ACTCCACTTA 2820 GTTGGGCTAT TTATTTCCAC ATGCTGATGA AATGGTTGCT GTTITTCAGA ATTTCAGTT 2880 TTTTGAT= ATATAACTTC ACTITGGAGA TGAT=TCCCT TGGACTTTAC AATCACACAC 2940 ATTACAGTTC CATCCATTGC ACGT'TCTAA ACACTACTCC ACTTAGTTGG GCTATTAT7 3000 TCCACATGCT GATGAAATGG TTGCTGTI T TCAGAATITC AGfTfrTTTG ATITTATATA 3060 AC'TCACTTT GGAGATGATT TCCCTTGGAC T=TACAATCA CACACATTAC AGTTCCATCC 3120 ATTGCACGTT TCTAAACACT ACTCCACTTA GTTGGGCTGT TTATTTCCAC AGGTTGATGA 3180 AATGGTTGCT GTTITTCAGA ATTTCAGTT TACAATITC AACTAGTITC ACTIGGAGA 3240 TGATTTCCCT TGGCATGGAA GCTCACACAC ATTACAGTTC CATCCATTGC ACGTTTCTAA 3300 ACACTACTCC ACTTAGTTGG GCTGTTTATT TCCACAGGTT GATGAAATGG TTGCTGITI' 3360 TCAGAATTTC AG'TrITri'G ATTTATATA ACTTCACTTT GGAGATGATT TCCCTrGGAC 3420 =TACAATCA CACACATTAC AGTTCCATCA ATTACACGTT TCTAAACACT ACTCCACTTA 3480 GTTGGGCTAT TTATTCCAC AGGTTGATGA AGTGTCAAG TTTTACAATT TTGGTTGCTG 3540 AAGGTTCGGC AATITCACTGT TGTATAAMTG AACGACAGAC ACTTCAATCA GCACTGTGCT 3600 TCCCTTTTAT GTATTCTCCA ACGTAGTATC TTGACAAAGT ATATATATGA CTGCCACTTT 3660 GATTATT1TG ATAGCTITGT A=ITGACCAC TAATITTGTA TTTGACCACC AATTTGAAAA 3720 TGCCAATACC AAT T GCATT TGCCAGGGAA TTCAATACC AA T GCATT GCCAGGGAAT 3780 TTCAATACCA A=ITCCAGGA ATTTCAATAC TAATTACCAC CATITCCAGG AATTAATTTC 3840 GTCGAAAAAT TAAAAAAGNC GTCGAGAAAT TrrTGG-TTG =TTGCAAAC AAAATATCAC 3900 ACACAACACT GAATACACGG AAGTTCTGTT GGACACAGAG CCCCACACAC ACAACGTACA 3960 TGCAATTGGA AGGTATGTAT GTGTTGGCCA GGAGCAGGCG CAACTGTGCC GTGCTGCITG 4020 TGCATAATAC AGCGGCGTAC CGACAGAAAT AGAGCCCCCC AAAATGAT GGAAAAATAG 4080 TGGACAGITG GACT1=GCAA GTTGGACGCA GTGGAATAGA CAACCAAACA CCCCGATTAA 4140 CAAGCCGATG GCCGATTGAC CCAATGCCAA TCAGTATGGA TCGATAACTG TCCAACTGAA 4200 CGAGTAACAA GAAGATGTT TCCAAATGTC AGAATTTCAA ATCGGATGTT CCACTGATGG 4260 TCTGGGCG/T GCAGTCTGGG CTCCAGGTGT GTCAACTGGA CATTGCCAAG CGTGCACCGA 4320 TGTTGCAAGA CGATTACCAC GGCAACAAAC CGGTGTITAC GACAAGAACA CTGGCAGATG 4380 CATCGAATAC TGATITGGTG CAAfMTCAAG GTTTGGGAGT TTGTATAAT GTGTGTATAT 4440 TATGATGCGA CAACATGCGC CGGTGTGTAA ATAGTGTATT GCAACCTGTA AATAAACTAA 4500 ATCGACAAGG AATTrGGTGGA ATTAGACGTA AAATAGTGTT GGCGAAAATA CGTTTITTGT 4560 T'TCTGGGGGA CCTATGACGA TACTTTGG ACGCACATGT GGAGCGGCAT GAAATTAGTG 4620 TGTGGCCGAG 'TTGGGAGGA TATTCCCCAG GCGGTTGCCA AGATAT=TGA AATAATCTGA 4680 A=TTCAAAAA TGTCGGTGCT C = CGAAAT GCCATGTCCA GAGGAT T GA AATT TTGGA 4740 TGGAGCTGTG TTGGCTGGGT TGATGTTAAG GGAATGATAT ATCTGCGCTT TTCAATGTAT 4800 TATG='TCAG ATTTTGAG ATITTGAAT C=TGAAI= TTTGAAATCT TTGAATTTT 4860 TTGAATCT=I TGAATITITr GAAATCT=TT GAATTrfrTT CAAAGTCTAT AAATGTTATT 4920 GTG1TTTGG TTTATITTA GCTTITGCAA AATGTTATT CATTATACAG ITCAAAATAA 4980 TTAATTGCC TATATGTTT ACAATATAAT ATATTTATr TCAGATTTCA AAATAATTTT 5040 TTCCATTAAA CGTTTATAAT ACAATTr ACTTCAGATT TCAGGATATA CTATTCATTC 5100 CCACAC=ITA AAATATATTA TTCAA=TFCA CACACCAAAG TGTACTA=TI AACTTCACAT 5160 TTCAAAATAA AATATTTGAC AATACCTAAA TATGGCATT TTA'TTCGGA =TCGTTAGA 5220 TAT'CTTAG TTATACAATC CCAAACATGC TATTCGAATT C 5261 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (Fa) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1257 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: TITCCCTTGT GTAAAAGTCT CGTCGACATT GCAGCTGGAT GCAATGGGCG TTTCTGAACA 60 CCAATCCACT TAGTTGGGTTr GATTTTTCTT ACTGTCTGAT GAAGATATGA TTGTITTTTA 120 AAATTCCATr TTTITTGATT TTATATAACT TCACTGTGGG GTGGTCCC ITTGGCCTGCA 180 AGCTCATACA CATTACAGTT CCATCCATTG CACGTTTCTA AACACTACTC CACTTAGTTG 240 GGCTGOTAT 7TCCACATGC TGATGAAATG GTTGCTGTIT TTCAGAATTT CAGT1TI-TG 300 ATTTTATATA ACTTCACTTT GGAGATGATT TCCCTTGGAC TTTACAATCA CACACATTAC 360 AGTTCCATCC ATTGCACGTT TCTAAACACT ACTCCACTTA GTTGGGCTAT TTATTTCCAC 420 ATGCTGATGA AATGGTTGCT GrITICAGA ATICAGTTr TTTTGATTI'r ATATAACTTC 480 ACTTTGGAGA TGATTTCCCT TGGACTTTAC AATCACACAC ATTACAGTTC CATCCATTGC 540 ACGTTTCTAA ACACTACTCC ACrTTAGITGG GCTATrATT TCCACATGCT GATGAAATGG 600 TTGCTG=TI TCAGAAITTC AGTIT'frG ATT=TATATA ACTTCACTT GGAGATGATT 660 TCCCTTGGAC =TACAATCA CACACATTAC AGTTCCATCC ATT'GCACGTT TCTAAACACT 720 ACTCCACTTA GTTGGGCTAT TTATTITCCAC ATGCTGATGA AATGGTTGCT GTTITTCAGA 780 ATTTCAGT TT=TGAT=TT ATATAACTTC ACTTTGGAGA TGATTTCCCT TGGACTTTAC 840 AATCACACAC ATTACAGTTC CATCCATTGC ACGTTCTAA ACACTACTCC ACTTAGTGG 900 GCTGTTTATT TCCACAGGTT GATGAAATGG TTGCTGT=TT TCAGAATTTC AG7TTTACA 960 ATTTCAACTA G TTCACTTT GGAGATGATT TCCCTTGGCA TGGAAGCTCA CACACATTAC 1020 AGTTCCATCC ATTGCACGTT TCTAAACACT ACTCCACTTA GT'ITGGGCTGT TTATTCCAC 1080 AGGTTGATGA AATGGTTGCT GT1TTTCAGA A7fCAGTIT TTTTGATTTT ATATAACT'TC 1140 ACTTGGAGA TGATTTCCCT TGGACTTTAC AATCACACAC ATTACAGTITC CATCAATTAC 1200 ACGTTTCTAA ACACTACTCC ACTTAGTTGG GCTATTTATT TCCACAGG'TT GATGAAG 1257 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (F2) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 81 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TTIGAATCT TTGAAMTTTTT TGAAATCTTT TGAATTTIT GAATCTTTTG AATT1TGA 60 AATCTIT=GA ATITTTCA A 81 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (Fy1) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 89 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGTGGGAGTG GGAGTGGGTG GTACAGAGTG GGTGGTACAG AGTGGGTGGT ACAGAGTACA 60 GAGTGGGGAG AGTACAGAGT GGGAGTGGT 89 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (Fy2) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 140 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: AGGAGGAAGA GACAGTACAC AGTAGGAGGA AGAGAGTGGT AGGAAGAGAG TGGTAGGAGG 60 AAGAGCGGCA GGAGGAAGAG AGTGGTAGGA GGAAGAGTGG TAGGAGGAAG AGTGGTAGGA 120 AGAGAGTGGT AGGAGGAAGA 140 REVENDICATIONS: 1 - Sonde, notamment, de détection spécifique et/ou infraspécifique de levures, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants: - au moins une partie: * d'au moins un fragment F d'acide nucléique ADN et/ou ARN recopié, construit et/ou isolé à partir d'au moins une séquence-source d'ADN ribosomal (ADNr): -> ne codant pas pour la synthèse d'ARN ribosomal (ARNr), --> localisée dans la région d'espacement intergénique (IGR) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sous-unité 25 S d'ARNr, et l'ADNr codant pour la sous-unité 18 S d'ARNr, -> et itérative comprenant au moins deux sous-séquences répétées, le degré d'homologie entre ces sous- séquences étant supérieur ou égal à 50 %, de préférence 55 %, et plus préférentiellement encore à 60 %; * et/ou d'au moins un analogue Fa de ce fragment, résultant de la dégénérescence du code génétique; * et/ou d'au moins un fragment Fc d'ADNc complémentaire du fragment F, - au moins une partie des produits de transcription primaire du fragment F et/ou Fa et/ou Fc. - et une association des outils énumérés ci-dessus. 2 - Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquencesource de F est localisée dans la région d'espacement intergénique 2 (IGR2) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sousunité 5S d'ARNr et l'ADNr codant pour la sous-unité 18 S d'ARNr. 3 - Sonde selon la revendication I ou 2, caractérisée en ce que la séquence- source itérative de F correspond à une séquence Fa et comprend au moins trois sous- séquences répétées comportant chacune au moins 80, de préférence au moins 120 et plus préférentiellement encore entre 150 et 300 bases nucléotidiques. 4 - Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence-source itérative de F comprend au moins une sous-séquence de longueur tronquée par rapport aux autres sous-séquences, cette sousséquence tronquée étant de préférence terminale. - Sonde selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence- source itérative de F correspond à une séquence F,3 et comprend au moins trois sous- séquences répétées comportant chacune au moins 4, de préférence au moins 6 et, plus préférentiellement encore entre 7 et 25 bases nucléotidiques; chaque sous-séquence comprenant au moins un motif commun (Com 1) à toutes les sous-séquences et ayant une longueur inférieure ou égale à celle de la sous-séquence à laquelle il appartient. 6 - Sonde selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquencesource de F: À est localisée dans la région d'espacement intergénique 1 (IGRi) non transcrite (NTS) et comprise entre l'ADNr codant pour la sous-unité 5S d'ARNr et l'ADNr codant pour la sous-unité 25 S d'ARNr À et correspond à au moins une séquence Fy et comprend au moins trois sous-séquences répétées comportant chacune au moins 4, de préférence au moins 5 et, plus préférentiellement encore entre 5 et 40 bases nucléotidiques, chaque sous-séquence comprenant au moins un motif commun (Com 2 ou 3) à toutes les sous-séquences et ayant une longueur inférieure ou égale à celle de la sous-séquence à laquelle il appartient. un cas de figure particulièrement préféré étant celui dans lequel F correspond à au moins deux séquences Fy: Fy1 et FY2 ayant respectivement avantageusement de 5 à 20 et de 9 à 25 bases nucléotidiques. 7 - Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe des séquences annexées suivantes: SEQ ID NO: 1:; SEQ ID NO: 2:; SEQ ID NO: 3:; SEQ ID NO: 4:; SEQ ID NO: 5:; les SEQ ID NO: 2: à: 5: étant particulièrement préférés. 8 - Sonde selon au moins l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que: Foa correspond à SEQ ID NO: 2: F3 correspond à SEQ ID NO: 3: Fyl correspond à SEQ ID NO: 4: Fy2 correspond à SEQ ID NO: 5: 9 - Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée: - en ce qu'elle comprend au moins une partie d'au moins l'un des fragments Fat, Fp3, FyI, Fy2, le fragment Fca étant particulièrement préféré. - en ce qu'elle est appliquée: > à la détection/identification spécifique et infraspécifique de levures, D ou comme marqueur épidémiologique, D ou encore conmme traceur de souche, D ou bien enfin dans le cadre d'une stratégie thérapeutique visant des affections à levures. 10 - Procédé de détection et d'identification de levures caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications I à 6, 8 et 9. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que - on extrait l'ADN total génomique des souches à étudier, - on soumet éventuellement cet ADN total à une digestion enzymatique à l'aide d'au moins une enzyme de restriction, - on dénature l'ADN total éventuellement digéré, - on met en présence l'ADN total ainsi dénaturé, avac la sonde elle- même préalablement dénaturée et dotée d'au moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation, - on élimine l'ADN et la sonde non hybridée, - et on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur. 12 - Amorce oligonucléotidique, utilisable notamment pour la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), caractérisée en ce qu'elle est constituée par la sonde selon l'une quelconque des revendications I à 8. 13 - Application de la sonde selon l'une quelconque des revendications I à 6, 8 et 9, pour la détection, l'identification inter-espèces et/ou la différenciation infraspécifique des levures notamment des espèces Candida krusei ou Geotrichum candidum.