Brevet FR2753203A1 — publié le 19980313

DESCRIFIION Indication du domaine technique La présente invention concerne l'établissement d'une lignée de cellules issues d'un lymphome cutané du chien caractérisée en ce que cette lignée pousse de façon continue et produit des particules virales associées à une activité enzymatique de transcriptase inverse. Indication de l'état de l'art Dans la majorité des espèces animales et chez l'homme, de nombreux rétrovirus endogènes ou exogènes ont été isolés et associés à de nombreuses pathologies. Malgré les efforts en ce sens, aucun rétrovirus n'a pu être isolé chez le chien. Cependant, l'activité transcriptase inverse a été recemment mise en évidence dans un cas d'immunodépression [Modiano, JF et al., J. Comp. Path. 1995, 112: 165-183] Dans un cas de leucémie canine, des particules rétrovirales ont été mises en évidence en microscopie électronique [Safran, N. Perk, K, Eyal, O. Res. Vet. Sci. ,1992, 52 : 250-255]. Ces divers travaux n'ont pas permis d'isoler et d'identifier la nature de ce rétrovirus. En effet, dans chaque cas, les auteurs n'ont pas réussi à établir une lignée cellulaire continue. Historique de l'invention Nous avons étudié un chien de 13 ans atteint d'un lymphome cutanéo-muqueux avec infiltration sanguine. Cette forme particulière est couramment appelée syndrome de Sézary. Cette leucémie est caractérisée par la présence de grands lymphocytes à cytoplasme granuleux et d'immunophénotype CD8+, infiltrant simultanément la peau et les ganglions. Une lignée cellulaire continue a pu être obtenue dans notre laboratoire à partir d'un ganglion tumoral. L'étude ultrastructurale de cette lignée a révélé la présence de particules rétro-virales de type A dans le cytoplasme des cellules tumorales et de type C libérées dans le milieu extérieur. Ces particules rétrovirales appartiennent à la famille des oncovirus. Exposé de l'invention I- Etablissement de la lignée DCL 01 1- Culture à long terme de DCL 01 Le ganglion mandibulaire prélevé stérilement est disséqué dans une boîte de Pétri, puis broyé sur une grille métallique. Les lymphocytes libérés sont récupérés dans du milieu de culture et lavés trois fois dans du RPMI 1640. Les lymphocytes ainsi isolés sont incubés à une concentration finale de 1 million/ml dans du RPMI 1640 supplémenté de 20% de sérum de veau foetal décomplémenté, de 1 mM de pyruvate de sodium, de 2 mM de L- glutamine, de 0,2 mI de pimaricine, de 100 UI de pénicilline et 100 mg de streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37 dans une étuve contenant 5% de C02. Le milieu de culture est renouvelé tous les deux jours. Après 3 semaines de culture, des grappes de cellules lymphoïdes sont libérées dans le surnageant, à partir desquelles peut être effectué le repiquage de la culture. Après deux mois de culture, une lignés continue est obtenue et les cellules sont congelées à raison de 107 cellules par ml dans du sérum de veau foetal contenant 10% de diméthylsulfoxide (DMSO). Après plusieurs passages, les cellules sont dédoublées tous les jours et réensemencées à raison de 5.106 par ml. Le pourcentage de SVF utilisé dans le milieu de culture est rapidement diminué à 10%, puis 5%. La croissance cellulaire reste toujours meilleure en plaque 24 puits. Cependant, après plusieurs passages, les cellules peuvent se multiplier correctement en flacon Falcon. 2- Cinétique de croissance de DCL 01 La numération des cellules est déterminée à l'aide du test d'exclusion au bleu trypan (10 ml de la suspension sont dilués dans 90 ml de bleu trypan dilué au 1/4). Les cellules sont ainsi numérées tous les jours pendant une semaine. La courbe de croissance est représentée sur la figure 1. Greffe des cellules à des souris SCID et Nude Le pouvoir de prolifération et d'infiltration des cellules tumorales a pu être apprécié par injection en sous cutané ou en intra-péritonéale de 40.106 cellules à des souris SCID. Neuf jours après la greffe, de nombreux nodules cutanés apparaissent et correspondent aux différents points d'inoculation. Une ascite est également présente chez la souris dont la greffe est réalisée par voie intrapéritonéale. Les souris sont alors sacrifiées et différents organes d'aspect pathologiques sont prélevés. Une suspension cellulaire est réalisée à partir des nodules cutanés et péritonéaux ainsi qu'à partir de la rate. De nouvelles lignées ont pu être obtenues à partir de ces différents prélèvements. 3- Infection de lymphocytes avec le surnageant de DCL 01 Une infection des lymphocytes du sang periphérique a été obtenue avec du surnageant de culture de DCL 01. Les cellules normales infectées ont pu être immortalisées et maintenues en culture durant 3 mois. L'injection des cellules productrices du virus provoque chez la souris une réponse anticorps nette avec présence d'anticorps spécifiques des bandes du rétrovirus. II - Caractérisation de la lignée DCLO1 1- Cytologie : microscopie optique Les cellules d'origine, à savoir avant mise en culture, présentent un noyau à chromatine fine à aspect peigné et parfois légèrement plicaturé, non nucléolé. I1 existe des renforcements chromatiniens irréguliers. Les cytoplasmes sont étendus clairs et présentent de grosses granulations azurophiles. Après plusieurs passages en culture, les cellules perdent leurs granulations. Leur cytoplasme devient hyperbasophile et présente quelques fois des vacuolisations. Ces différentes modifications sont des critères de malignité. 2- Etude ultrastructurale : microscopie électronique L'étude ultrastructurale de la lignée a permis de mettre en évidence de nombreuses particules rétrovirales de type A, majoritairement dans le réticulum endoplasmique, mais également en position périnucléaire. De très nombreux ribosomes sont répartis dans tout le cytoplasme et sont le signe d'une importante synthèse protéique. Après 30 passages, de rares bourgeons sont apparus sur la membrane des cellules tumorales. Après 4 jours de traitement à l'aide du DMSO, les cellules présentent de nombreux bourgeons et libèrent des virions matures. Le core est central et est séparé de l'enveloppe par un espace clair aux électrons. La morphologie des particules rétro-virales matures sont typiques de particules de type C mesurant de 100 à 120 nm. 3- Analyse du caryotype Le caryotype des cellules lymphoblastoïdes a été obtenu par les techniques cytogénétiques standards : après synchronisation 17 heures en présence de FRDU et de thymidine, puis blocage des mitoses par de la colchicine, le culot cellulaire est étalé sur lame sèche et dénaturé par la chaleur (bande RHG). Le nombre de chromosomes varie de 72 à 96 pour la même lignée. L'analyse du caryotype permet de confirmer l'origine canine de la lignée. On a pu noter la présence de nombreux chromosomes minutes caractéristiques de la malignité de la lignée DCL 01 4- Etude immunophénotypique : cytométrie en flux Avant mise en culture, les cellules tumorales sont CD3+, CD8+, CD5+ et CD45+. Une étude immunophénotypique en cytométrie en flux de la lignée a montré une perte des antigènes membranaires (CD8-, CD5- et CD45-) avec une faible expression de l'antigène CD3 (chaîne e intracytoplasmique). Les anticorps utilisés sont spécifiques de l'espèce canine, à l'exception du CD3 qui est un anticorps polyclonal humain présentant une réactivité croisée entre l'homme et le chien. Compte tenu de cette dédifférenciation, les cellules sont préalablement stimulées par des agents connus pour induire la différenciation des cellules souches ou pour permettre la réexpression des antigènes. Les cellules sont incubées pendant 3 jours avec 0,5% de DMSO et/ou 20 nmol de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Les cellules stimulées réexpriment les antigènes de membrane CD45, CD8 et DQ. La lignée cellulaire ainsi traitée présente un phénotype similaire aux cellules d'origine. III Analyse des protéines dans le surnageant de culture de DCL 01: 1- Electrophorèse en gel de polyacrylamide: Les surnageants de culture et du milieu de culture (milieu utilisé pour l'établissement de la lignée) sont préalablement concentrés dans une membrane de dialyse. Le dosage des protéines est effectué selon la technique de Lowry. Il apparaît une quantité supérieure de protéines dans le surnageant de culture (146 mg/ml) en comparaison avec le milieu de culture (120 mg/ml). Les solutions d'échantillons sont déposées à la surface du gel de concentration (à 4%) à raison de 150 et 200 mg de protéines par cm de gel. Cette migration s'effectue à ampérage constant, pendant 1 heure à 20 mA pour le gel de concentration puis 2 heures à 40 mA pour le gel de séparation à 10%. Une fois l'électrophorèse terminée, un transfert électrophorétique des protéines est réalisé sur une feuille de nitrocellulose. Les protéines sont ensuite colorées au rouge Ponceau. La feuille de nitrocellulose, préalablement saturée en PBS-lait, est découpée en petites bandelettes pour la réalisation des immunoblots. 2- Mise en évidence par la technique d'immunoblot des antigènes du surnageant reconnus par des anticorps présents chez des chiens malades: Chaque bandelette est placée dans une rigole . Les différents sérums (chien malade et chien témoin) dilués au 1/100 dans du PBS-Tween-lait, sont mis à incuber pendant 2 heures sous agitation. Après trois lavages en PBS-Tween, les bandelettes sont mises en contact pendant 1 heure 1/2 avec l'anti-immunoglobuline canine couplée à la peroxydase. La réaction est révélée par incubation des bandelettes, à la température du laboratoire, pendant 15 minutes avec le substrat. Les résultats de l'immunoblot figurent sur la figure 2. Compte tenu du fort taux de protéines dans le surnageant, il apparaît après marquage de très nombreuses bandes dont certaines sont très denses. Il est donc difficile par cette technique d'identifier des bandes discrètes ou masquées par de plus grandes bandes. Cependant trois bandes sont clairement marquées par le sérum du chien leucémique et ne sont pas reconnues par le sérum témoin. Les poids moléculaires des trois protéines identifiées sont de ,49 kDa et 32 kDa. On peut donc purifier ces antigènes viraux protéiques de 49000 et 32000 daltons utilisables dans l'élaboration de vaccins. Présence d'une activité transcriptase inverse. Une activité Reverse Transcriptase (RT) dépendante du manganèse a été retrouvée dans le surnageant de culture de DCL 01 selon la technique utilisée par Gross. S., Traktnan P. et Baltimore D. g Virol. 1981, 38 : 239-248] modifiée. REVENDICATIONS 1) Lignée de cellules lymphocytaires T de chien caracterisée en ce qu'elle pousse de façon continue et qu'elle produit des particules virales de type C. 2) Sélection d'une lignée de cellules lymphocytaires T de chien caractérisée en ce qu'elle présente dans le surnageant une activité transcriptase inverse. 3) Utilisation de cette lignée selon les revendications 1 et 2 pour isoler et purifier un rétrovirus spécifique du chien. 4) Utilisation de cette lignée selon les revendications 1 et 2 pour préparer des réactifs d'analyse pour détecter des infections rétrovirales chez le chien et les animaux domestiques. 5) Lignée lymphocytaire T selon les revendications 1 et 2 pour purifier des antigènes viraux protéiques de 49000 et 32000 daltons utilisables dans l'élaboration de vaccins. 6) Utilisation de cette lignée selon les revendications 1 et 2 pour préparer des vecteurs rétroviraux. 7) Utilisation de cette lignée selon les revendications 1 et 2 pour immortaliser des lymphocytes de chien. 8) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la lignée produit des particules virales en présence de Dimethyl Sulfoxyde (DMSO).