Brevet FR2751876A1 — publié le 19980206

La présente invention se rapporte à des composés utiles dans le domaine de l'immunologie et en particulier pour le traitement des réactions d'hypersensibilité responsables des allergies et des divers phénomènes d'intolérance. La défense immunologique contre les agents infectieux, les toxines ou les néoplasies passe par la reconnaissance de la nature étrangère d'un antigène (ou allergène) et l'activation de médiateurs cellulaires ou humoraux, visant à éliminer l'antigène étranger. Toutefois, ce mécanisme peut parfois être indésirable, lorsqu'il est trop intense, ou s'exerce à l'encontre d'antigènes de l'environnement qui ne sont pas intrinsèquement nocifs ; c'est également le cas lors de transplantation d'organe ou de greffes tissulaires. Les réactions immunologiques à la base de l'allergie ont été classées en 4 types: - Type I: Les mastocytes se lient aux anticorps IgE par leur récepteur Fc la fixation de l'antigène déclenche la dégranulation des mastocytes et la libération de médiateurs (histamine, SRS-A, ECF-A). - Type Il : Les anticorps (IgG ou IgM) spécifiques réagissent avec l'antigène, à la surface des cellules cibles ; ceci entraîne une cytolyse, soit par action directe des cellules K, soit par activation du complément. - Type III: Les anticorps (IgG ou IgM) forment, avec l'antigène et le complément, des complexes immuns qui se déposent dans les tissus et entraînent la production de facteurs chimiotactiques pour les polynucléaires neutrophiles ; il en résulte une inflammation locale. - Type IV: Les lymphocytes T sensibilisés à l'antigène réagissent avec celui-ci et libèrent des lymphokines. Les lymphokines induisent une réaction inflammatoire et provoquent l'afflux des macrophages. Les lymphocytes sont donc des cellules-clés, dans l'immunité à médiation cellulaire ou humorale, notamment par la sécrétion d'anticorps. Les affections allergiques peuvent être l'expression d'un ou plusieurs types de réactions immunologiques. Ces réactions peuvent également être à la base de réactions d'intolérance aux produits d'hygiène et de soins, observées chez les peaux dites "hyperréactives". Ces phénomènes sont dus à des facteurs génétiques intrinsèques et à une hypersensibilité acquise provoquée par l'environnement. De manière inattendue, la demanderesse a maintenant trouvé que ces phénomènes d'hypersensibilité pouvaients être combattus par des oligosaccharides comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou de dérivés de tels oligosaccharides substitués par un résidu hydrophobe. La présente invention a pour objet l'utilisation d'oligosaccharides comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou de leurs dérivés, pour la préparation de compositions immunomodulatrices, et en particulier de compositions destinées au traitement ou à la prévention des réactions d'hypersensibilité. Des oligosaccharides particulièrement appropriés pourront être choisis dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. Par substituants hydrophobes, on entend notamment les alkyles en C1-C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en C1-C18, les acides carboxyliques en Cl-Clg linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en C1-C18, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en Cl-Cl8. Les dérivés d'oligosaccharides adaptés à la mise en oeuvre de l'invention peuvent notamment appartenir à l'une des catégories citées ci-après, dans lesquelles l'oligosaccharide répond à la formule générale suivante galactose-n ( ou p) - (Hex)p dans laquelle n représente la position 1, 2, 3, 4 ou 6, Hex représente un pentose ou un hexose en liaison Q ou B, p est un nombre compris entre 1 et 5 a) - des glycosides répondant aux formules: (I) oligosaccharide 1-O-R, dans lequel R est un résidu alkyle de 1 à 18 atomes de carbone, linéaire ou branché, (Il) oligosaccharide 1-O-R-O-1-oligosaccharide dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 10, b) - une osylamine acylée selon l'une des formules suivantes, dans lesquelles l'oligosaccharide est de préférence le lactose, le mélibiose ou le stachiose - des osylamines acylées répondant à l'une des formules suivantes (III) oligosaccharide 1-NH-CO-R, dans laquelle R est un résidu alkyle de 2 à 18 atomes de carbone, contenant 0, 1 ou 2 double liaisons, . (il) oligosaccharide 1-NH-CO-R-CO-NH-1-oligosaccharide, dans laquelle R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 8, c) - une alkylamine acylée par un acide aldonique obtenu par oxydation d'un oligosaccharide . (V) oligosaccharide -CO-NH-R, dans laquelle R a la même signification que dans la formule (III), . (VI) oligosaccharide CO-NH-R-NH-CO- oligosaccharide, où R a la même signification que dans la formule (III), d) - soit un produit de réduction des bases de Schiff formé par des oligosaccharides avec des mono- ou diamines aliphatiques, et répondant à l'une des formules suivantes . (VII) Gal- (Hex)n -X-HN-R, . (VIII) Gal - (Hex)n - X-HN-R-NH-X- (Hex)n - Gal, dans lesquelles Hex est un hexose ou un pentose, n =0,1 ou 2, x = 1-NH2-hexitol, et R a la même signification que dans (III). Selon un mode particulièrement avantageux, l'oligosaccharide ou son dérivé tel que défini ci-dessus sera utilisé pour la préparation d'une composition contenant en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie topique externe. En effet, la demanderesse a trouvé que les réactions impliquées dans les troubles associés à l'hypersensibilité, peuvent être corrélés à la fixation, sur un récepteur spécifique des lymphocytes, de peptides résultant de la dégradation de l'élastine, notamment des peptides d'élastine. L'activation de ces récepteurs déclenche la libération d'enzymes lytiques, de 1,-glucuronidase, d'élastases et de radicaux libres comme l'ion superoxyde, ou le péroxyde d'hydrogène qui génère des radicaux hydroxyl. Ces produits peuvent entraîner la dégradation des macromolécules de la matrice extracellulaire, la fibronectine, le collagène et le hyaluronane. La fixation des peptides de I'élastine stimule également la prolifération des lymphocytes. Ces phénomènes jouent un rôle important dans les réactions immuno-allergiques à l'origine de l'atopie, notamment des dermatites atopiques ou des réactions d'anaphylaxie, de l'urticaire et des dermatites allergiques de contact. Les sujets présentant des peaux dites "sensibles" ou hyperréactives sont de plus en plus nombreux dans la population. Une telle peau rougit ou picote facilement, son seuil de réactivité est abaissé par rapport aux autres peaux. Le sujet ressent un inconfort cutané, associé à un érythème, et une fine desquamation peut survenir. Tous ces symptômes seront améliorés ou même supprimés par l'emploi des compositions contenant des oligosaccharides selon l'invention ; le mélibiose, le lactose, ou leurs dérivés, suppriment partiellement ou totalement la prolifération cellulaire en particulier des lymphocytes préalablement stimulés ; ils peuvent également inhiber la potentialisation et la libération d'enzymes lytiques. Les compositions seront de préférence formulées dans des véhicules ne comportant pas de parfum ni d'agents allergisants. Les compositions pourront être sous forme de solutions, gels, lotions, crèmes, émulsions E/H ou H/E, ou d'émulsions multiples ou sous forme liposomée. Elles seront adaptées par l'homme du métier, en utilisant de préférence des agents adoucissants ou des tensioactifs doux. Les compositions sont particulièrement adaptées au traitement ou à la prévention des réactions d'intolérance et/ou d'allergie de la peau et/ou des muqueuses. En particulier, les compositions selon l'invention sont destinées à empêcher ou à diminuer la formation de radicaux libres. Les oligosaccharides ou leurs dérivés pourront être associés à d'autres agents permettant de protéger et/ou hydrater la peau tels que l'acide hyaluronique, la vitamine E, l'extrait glycolique de G. biloba, le sorbitol, les glycosaminoglycannes, l'alginate, etc ; il peuvent également être associés à des huiles végétales pour nourrir la peau et/ou à des actifs adoucissants et apaisants comme par exemple les extraits de vigne rouge, d'althéa, d'avoine, de tilleul, de camomille, de mélilot, de ruscus, procyanidols, a-bisabolol, huile de coco, acide 18 K glycyrrhétinique. Selon un autre aspect de l'invention, les oligosaccharides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus sont utilisés pour la préparation d'une composition qui contient en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie parentérale ou entérale. Les compositions préparées selon l'invention sont particulièrement utiles pour le traitement ou la prévention des réactions d'hypersensibilité médiée par les lymphocytes. Elles sont en particulier destinées au traitement ou à la prévention des symptômes d'une affection choisie parmi l'atopie, les érythèmes polymorphes, xérodermites, lupus érythémateux, pemphigus, dermatites, psoriasis et eczémas. Les oligosaccharides présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, et leurs dérivés, substitués par un résidu hydrophobe peuvent être utilisés comme adjuvants limitant les réactions d'hypersensibilité susceptibles d'être provoquées par un autre principe actif. L'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique des peaux hyperréactives, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique, une composition contenant au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, dans un véhicule cosmétologiquement acceptable. Des composés particulièrement préférés pour la mise en oeuvre de cette méthode sont le mélibiose, le lactose et leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans ces exemples, on se réfèrera aux figures suivantes Fig. 1: Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'activité de stimulation de la prolifération des lymphocytes par la k-élastine. Les concentrations de lactose et de mélibiose sont de I zg/ml, 10 llg/ml, 100 llg/ml, 1 mg/ml et 2 mg/ml. Fig.2: Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'expression de l'activité élastasique par les lymphocytes, stimulés par 2 ssg/ml de k-élastine. Activité dans le milieu de culture. Fig.3 : Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'expression de l'activité cathépsine G de lymphocytes stimulés par 2 yg/ml de k-élastine. Activité dans le milieu de culture. Exemple 1 1 - Methodes Séparation des lvmphocvtes Les lymphocytes utilisés pour ces expériences ont été obtenus à partir de sang circulant humain et également d'amygdales humaines après amygdalectomie. L'isolement des lymphocytes phériphériques est effectué comme suit : 5 ml de sang ont été déposés (dans les tubes de centrifugation de 15 ml) sur Ficoll-paque plus (Pharmacia) avec précaution afin de séparer les deux phases, puis centrifugés à 2000 rpm (soit 600 g) pendant 40 min. à température ambiante (20 C). La couche contenant les lymphocytes et les monocytes est récupérée et mélangée avec 10 ml de milieu RPMI, centrifugée à 1 500 rpm (soit 400 g) pendant 10 min. à 20 C. Le sédiment est remis en suspension dans 0,5 ml de RPMI, puis 4,5 ml supplémentaires de RPMI sont ajoutés et on effectue une nouvelle centrifugation à 1 500 rpm (soit 400 g) pendant 10 min. à 20 C. Le sédiment final est repris dans 10 ml de RPMI et les cellules sont comptées. Les monocytes et les macrophages sont éliminés par adhésion sur une surface plastique (incubation à 37 C pendant 2 heures dans un incubateur CO2/O2). Séparation des polynucléaires (PMN) Après la première centrifugation à 2 000 rpm (soit 600 g), le résidu contenant les globules rouges et les PMN sont remis en suspension dans de l'alcool polyvinylique (PVA) à 1% dans du DPBS (tampon salin phosphate modifié de Dulbecco), (deux volumes par volume de sédiment), puis laissés sédimentés 20 min. à température ambiante. Le surnageant est alors centrifugé pendant 5 min. à 400 g à 4" C, le sédiment est lavé avec du DPBS afin d'éliminer le PVA par agitation douce, sans activer les PMN, suivi par 5 min. de centrifugation à 400 g à 4" C. Le surnageant est éliminé. Les globules rouges sont lysés par choc osmotique puis un excès de DPBS est ajouté afin de rétablir l'équilibre osmotique. Après centrifugation 5 min. à 400 g à 4" C, le sédiment, contenant les PMN est repris dans un faible volume de RPMI. Les cellules sont comptées et peuvent être lysées pour libérer les enzymes lytiques (élastase, cathepsine) par addition de 0,1% Triton X-100 dans NaC1 1 M à 0 C pendant 20 min., suivie par une centrifugation 20 min. à 0 C. Le surnageant contient les enzymes. Préparation des lymphocytes à partir d'amygdales humaines Des amygdales fraichement opérées sont coupées en petits morceaux en conditions stériles, dans 10 ml de RPMI. La suspension tissulaire est filtrée sur un filtre grossier afin d'éliminer les plus gros débris tissulaires. La suspension est mise dans un tube à essai et laissée sédimenter 15 min. à température ambiante. Le surnageant est mis sur Ficoll-paque plus et centrifugé comme décrit pour des lymphocytes dérivés du sang. Les monocytes sont éliminés comme décrit pour les lymphocytes dérivés du sang. Le sédiment contenant les lymphocytes est remis en suspension et les cellules sont comptées après deux centrifugations comme décrit. Les lymphocytes obtenus à partir d'amygdales sont environ 50% du type T et à 50% du type B. Les lymphocytes d'origine sanguine sont environ à 80% de type T et à 20% de type B. Culture des lvmphocvtes Les lymphocytes isolés comme décrit ci-dessus sont cultivés dans des plaques à 24 puits Costar, 500 il de suspension de cellules/puits (5.105 cellules/ml soit 2,5.105 cellules/puits) dans du milieu RPMI 1640 (Eurobio) complété par 10% de sérum de veau foetal (ATGC), 2 mM de glutamine (Gibco), de la pénicilline et de la streptomycine (500 U/ml, 0,25 mg/ml), et phytohémagglutinine (SIGMA) 5 llg/ml. Après 4 jours d'incubation dans les conditions de culture de cellules (37"C, incubateur C02/O2) la suspension cellulaire est récupérée avec une pipette, centrifugée à 400 g pendant 10 min. à 20 C et le sédiment cellulaire est repris dans 0,5 ml de RPMI (sans SVF), dispersé par agitation puis après addition de 10 ml de RPMI sans SVF, centrifugé à nouveau à 400 g pendant 10 min. à 20 C. Après encore deux lavages comme décrit ci-dessus, le sédiment est repris dans 10 ml de RPMI, sans SVF et les cellules sont à nouveau mises en culture dans une plaque de Costar à 24 puits. Action des peptides de l'élastine Une solution stérile de K élastine (75 kD, Solabia) est ajoutée, à la concentration indiquée (par exemple 2 crg/ml) aux cellules remises en culture dans le milieu sans SVF pendant 2,5 heures à 37 C. Après incubation, les plaques sont agitées doucement, les cellules récupérées par pipettage et comptées. La suspension est centrifugée 10 min. à 4" C à 1 500 rpm (soit 400 g), le surnageant est distribué dans des tubes Eppendorf 1 ml à raison de 500 pl par tube et conservé à -40" C s'il n'est pas utilisé immédiatement pour les dosages enzymatiques. Le sédiment cellulaire est remis en suspension dans du tampon d'extraction (Triton X-100 0,1%, NaCl 1 M, NaN3 0,02%, Brij 35 0,01%, pH 8). 1 ml pour 106 cellules, agité 15 min. à 1 600 g à 0 C et le surnageant obtenu par centrifugation comme décrit cidessus est réparti dans des tubes Eppendorf et conservé à -40" C pour les dosages enzymatiques. Détermination de l'activité enzvmatiaue de type élastase leucocvtaire Le substrat synthétique utilisé pour doser l'activité enzymatique de type élastase est le Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val- pNA. 50 il de milieu de culture ou 20 jil de lysat cellulaire sont mélangés avec le tampon (tris-HCl 100 mM, CaCl2 0,05%, NaN3 0,02%, Brij 35 0,01%, pH 8) jusqu'à 190 ,ul, puis par 10 yl de solution de substrat 85 mM (dans N-méthylpyrrolidone) pour un volume total de 200 pl. La densité optique est lue immédiatement à 410 nm puis après 4, 24, 48 et 72 heures d'incubation à 37 C. L'activité élastasique est exprimée en nM de substrat hydrolysé par 106 cellules et par heure. Détermination de l'activité enzvmatique de la Cathepsine G 25 mg du substrat, Me O-Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA dans 1 ml de Nméthylpyrrolidone (40 nM) sont utilisés dans les mêmes conditions que cidessus. 2 - Résultats A) Effet des peptides de l'élastine sur la prolifération des lymphocytes Les passages de calcium produits par l'addition des peptides de l'élastine aux globules blancs du sang peuvent être considérés comme une indication du signal intracellulaire déclenchant un ensemble de fonctions cellulaires. L'une de celles-ci est l'entrée des cellules en prolifération. On a montré que cela était le cas pour des fibroblastes de derme humain en présence de peptides de l'élastine (Ghuysen-ltard et al, C.R. Acad. Sci., 1992, 315: 473-478). Les résultats rapportés sur le tableau 1 montrent qu'une stimulation analogue de la prolifération des lymphocytes a été observée. Tableau 1 Concentration Nombre d'expériences Pourcentage de stimulation, en K élastine moyenne + SD 2 llg/ml 6 62,67+37,90 10 llg/ml 13 35,76+29,50 Une stimulation maximale est observée à 2 Fg/ml de peptides d'élastine et une stimulation un peu plus faible avec 10 Fg/ml de peptides d'élastine. B) Libération d'activité protéolytique par les peptides d'élastine Quand des PMN ou des lymphocytes sont incubés dans des conditions de culture en présence de 2 cig/ml de K élastine, une augmentation graduelle de l'activité élastase et cathepsine peut être déterminée dans les extraits cellulaires et les lysats cellulaires. Cette augmentation est beaucoup plus marquée dans les cellules dérivées de sujets âgés athérosclérotiques. On n'observe pas une telle augmentation en l'absence de K élastine. L'addition des peptides d'élastine augmente l'activité protéolytique à la fois dans le milieu de culture (enzyme relarguée) et dans l'extrait cellulaire (enzyme liée à la cellule) pour l'élastase comme pour la cathepsine G, bien que cet effet soit beaucoup plus prononcé pour la libération d'activité enzymatique dans le surnageant de culture. C) Effet des peptides de l'élastine sur la survie cellulaire Cette expérience est réalisée dans des conditions de culture comme décrit ci-dessus, en présence de phytohémaglutinine (PHA). 5 ml d'aliquots de suspension de lymphocytes (2,5 106 cellules dans 5 ml) obtenus à partir d'amygdales humaines sont distribués dans des tubes à essai et des concentrations croissantes de K-élastine (BPM, PM Tableau 2 Concentration de peptides d'élastine Pourcentage de perte cellulaire Fg/ml déterminé par exclusion du bleu de trypan 0 5,3 1 5,0 2 2,5 10 17,4 100 19,6 500 28,9 1000 39,3 2000 39,1 I1 apparaît que des peptides d'élastine exercent une activité cytotoxique à des concentrations élevées (mille fois supérieur à la concentration stimulant la prolifération cellulaire et le relargage des enzymes lytiques). Exemple 2: Effet du lactose et du mélibiose sur les réactions médiées par le récepteur de l'élastine des lymphocytes 1) Inhibition de la prolifération cellulaire Comme représenté sur la figure l, des concentrations croissantes de lactose et de mélibiose suppriment progressivement l'effet de stimulation de croissance des peptides de l'élastine, suivi par une inhibition nette de la prolifération aux concentrations les plus fortes testées (1 et 2 mg/ml), équivalent à 5,84 10-3 mM). La plus forte inhibition de la prolifération est de l'ordre de 16 à 30% pour le lactose et de 26 à 58% pour le mélibiose. 2) Effet du lactose et du mélibiose sur le relarguage d'enzyme protéolytique déclenché par le récepteur de 1'élastine Comme montré précédemment, on observe une augmentation de 40 à 120% de l'activité des enzymes protéolytiques dans le milieu de culture de même que dans le lysat cellulaire des lymphocytes humains cultivés en présence de 2 zg/ml de k-élastine. La stimulation de la libération d'une activité enzymatique lytique est inhibée efficacement par le mélibiose à partir de 1 llg/ml. Cette inhibition peut être démontrée aussi bien pour les activités élastases que pour la cathepsine G. Le lactose présente également une efficacité mais moins forte que celle du mélibiose (Figures 2 et 3). Exemple 3: Mise en évidence du récepteur de l'élastine sur les sous-populations de lymphocytes humains Méthodes Anticorps utilisés - ler anticorps : anticorps anti récepteur de 67 kD d'élastine/laminine (bovin) (type: IgM) produit chez la souris (Elastin Products Company). - 2e anticorps: anticorps anti IgG + IgM (H + L) de souris produit chez la chèvre, marqué par la rhodamine (TRITC) (Jackson Immunoresearch Laboratories) (pour la microscopie à fluorescence). - 2e anticorps : anticorps anti IgM (F(ab')2 de souris produit chez la chèvre, marqué par la r-phycoérythrine (Chemicon)) (pour la cytométrie de flux). PROTOCOLE: a) Microscopie à fluorescence Des lymphocytes humains sont isolés à partir des amygdales (comme décrit dans l'exemple 1) et mis en culture en présence de 5 ,ug/ml de phytohemagglutinine (pour les activer) et pour certaines cultures avec 2 yg/ml de kappa-élastine de haut poids moléculaire (75 kD) dans un milieu de RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Après 48 à 120 heures d'incubation à 37 C, les lymphocytes sont lavés trois fois avec le milieu RPMI contenant 2% de SVF puis centrifugés (400 g, 10 minutes à 4" C). Ensuite, on compte les cellules et on ajuste la densité cellulaire à 107 cellules/ml avec le milieu RPMI contenant 2% de SVF. Puis, un volume (100 pl) de suspension cellulaire des lymphocytes humains (environ 106 cellules) est incubé avec 10 Ill de solution du premier anticorps (diluée au 1:100) pendant 30 minutes dans un bain de glace. On ajoute 1,5 ml de RPMI froid à 2% FCS, puis, les cellules sont lavées dans une centrifugeuse réfrigérée à 4" C (à 400 g pendant 10 minutes). On ajoute au culot la solution du deuxième anticorps (conjugué au TRITC) (dilué au RPMI froid au 1:200). Après agitation douce de la suspension, on l'incube à 4" C pendant 30 minutes. Ensuite, on ajoute 1,5 ml de RPMI froid à 2% de SVF et on la centrifuge à 400 g à 4" C pendant 10 minutes. A l'issue de ce dernier lavage, les lymphocytes sont resuspendus dans le milieu résiduel après avoir enlevé le surnageant par décantation. Puis, des frottis sont pratiqués sur des lames et séchés à l'air. Après fixation par l'éthanol absolu pendant 5 minutes, les lames sont réhydratées par immersion dans plusieurs bains de PBS et montées en glycérol tamponné (9 volumes de glycérol et 1 volume de PBS). Ce procédé de post-fixation augmente la brillance de l'immunofluorescence. Pour identifier les cellules marquées, des champs microscopiques sont examinés alternativement sous éclairage ultraviolet et en lumière visible. b) Fluorimétrie A l'issue du dernier lavage, les lymphocytes sont suspendus dans 1 ml de PBS et les cellules sont analysées par cytofluorimétrie. Les populations cellulaires caractérisées sont les suivantes - lymphocytes T totaux (CD3+) - lymphocytes T "helpers" (CD4+) - lymphocytes T suppresseurs (CD8+) - lymphocytes B (CD20+) - lymphocytes T activés (CD25+) - lymphocytes T mémoires (CDA+/CD45RO+) - granulocytes (CD15+) Description des marqueurs utilisés CD 3 Le complexe CD 3 est exprimé par toutes les cellules T humaines matures. Il a des poids moléculaires entre 16 et 28 kD composé de 5 chaînes (y, a, s, 5 > 4, ) associées avec le récepteur des cellules T d'une façon non- covalente. Il est impliqué dans la transmission des signaux d'activations. CD 4 Le CD 4 (T4) reconnaît les molécules de CHM de classe II pendant l'interaction des cellules CD4+ avec les cellules présentant l'antigène ou des cellules cibles. C'est une glycoprotéine de 59 kD appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Il se trouve sur la sous-population "helper/inducer" des lymphocytes T (45% des lymphocytes du sang périphérique). CD 8 La molécule CD 8 (T8, 30/32 kD) est une glycoprotéine composée de deux chaînes peptidiques. Il se trouve sur la sous-population cytotoxique/suppresseur des lymphocytes T (20-35% des lymphocytes du sang périphérique). I1 est aussi présent sur les cellules NK et sur 30% des cellules "nulles" du sang périphérique. CD 15 L'antigène CD 15 (3FAL, X-haptène, SSEA) est un lacto-Nfucopentose III (200-185 kD). Au moins 5 antigènes majeurs de CD 15 sont présents sur la surface des cellules polynucléaires (environ 90% des granulocytes humains circulant) et sur une partie des monocytes circulants (30-60%). Cet antigène est absent de la surface des lymphocytes normaux. CD 20 L'antigène CD20 est une phosphoprotéine de 35/37kD. I1 est présent sur toutes les cellules B normales du sang périphérique, de l'amygdale et de la moëlle osseuse. CD25 La molécule de CD25 correspond au récepteur de basse affinité de l'interleukine-2. C'est une glycoprotéine de 55 kD exprimée par les lymphocytes activés (T et B) mais aussi par les macrophages activés. CD45RO C'est une glycoprotéine transmembranaire de 180 kD (l'isoforme de bas poids moléculaire de l'antigène commun des leucocytes) (LCA). Il est présent sur la surface des lymphocytes T, des thymocytes, des granulocytes, des monocytes (mais il est absent de la surface des macrophages) et sur une petite population des lymphocytes B. Les lymphocytes T exprimant le CD45RO sont des lymphocytes T mémoires (ou primed T cells) (45% des lymphocytes T du sang périphérique). Les cellules CD4+/CD45RO+ produisent les signaux "helper". Ce sont des producteurs précoces de IL-2 et IFNn. Pour le marquage avec les anticorps anti CDx (produits Sigma, excepté l'anticorps anti CD25, de Serotec), on prend 100 yI de la suspension lymphocytaire (marquée déjà ou non) avec l'anticorps anti récepteur de l'élastine 67 kD à une densité cellulaire de 107 cellules/ml. On ajoute 10 ml de l'anticorps anti CDx et on incube 30 minutes à 20 C (excepté avec l'anticorps anti CD25: l'incubation s'effectue à 0 C). Ensuite, on ajoute 2 ml de PBS. Après deux lavages (deux centrifugations à 400 g pendant 10 minutes à 20 C), on prend le culot cellulaire, on y ajoute 0,5 ml de PBS et on analyse la suspension par cytofluorimétrie. On effectue également le marquage des cellules par des anticorps monoclonaux spécifiques de différents récepteurs des lymphocytes. RESULTATS a) Microscopie à fluorescence Mise en évidence du récepteur de l'élastine sur des Ivmphocvtes activés Une partie des lymphocytes analysés, - ceux qui expriment le récepteur de l'élastine/laminine de 67 kD - montrent une immunofluorescence spécifique dans les conditions expérimentales décrites ci-dessus (cellules positives). Le pourcentage de cellules positives au 4è iour de culture est évalué par microscopie à fluorescence: - les cellules cultivées en présence de 2 Fg/ml de kappa-élastine 28,52 + 12,60 - les cellules cultivées sans kappa-élastine 28,09 + 10,91 % Il n'y a pas de différence significative entre les deux séries, l'activation par le PHA est un stimulus suffisant pour faire exprimer le récepteur de l'élastine. Le pourcentage de cellules positives au 5e jour de culture: - les cellules cultivées en présence de 2 ,ug/ml de kappa-élastine : 77,2% + 6,7%. Effet du lavage des cellules avec lactose ou mélibiose: - les cellules cultivées en présence de 2 llg/ml de kappa-élastine + lavées à la fin de la culture cellulaire avec une solution de 1 mg/ml de lactose: 26,6% # 6,7% (p Avant lavage, 77,2% des cellules sont positives - les cellules cultivées 5 jours en présence de 2 pg/ml de kappa-élastine + lavées à la fin de la culture cellulaire avec une solution de 1 mg/ml de mélibiose: 18,3 % # 9,7% (p Les cellules fluorescentes incubées uniquement avec le deuxième anticorps (témoins négatifs) et pas avec le premier anticorps ne montrent pas de fluorescence. Il apparaît donc que le mélibiose est plus efficace que le lactose pour désorber la sous-unité 67 kD du récepteur de l'élastine des lymphocytes : le lactose désorbe 66% du récepteur et le mélibiose 76% dans les conditions expérimentales utilisées. b) Cytofluorimétrie Tableau 3 Pourcentage des lymphocytes humains exprimant le récepteur de I'élastine aux différents jours de culture JO: au jour de la séparation des lymphocytes; J2, J3, J5 : au deuxième; troisième; cinquième jour après la séparation des lymphocytes. % des cellules positives Jour sans nbre avec 2 llg/ml P kappa-élastine d'expériences de kappa-élastine JO 1.12 + 0.2 % 6 1.15 + 0.1 % J2 22.33+5.2.% 5 23.02+3.2% J3 29.70+0.8 % 7 32.40 + 3.5 % 0.178 J5 59.91#4.9% 10 66.42 + 1.9 % 0.006 Il ressort de cette expérience que l'incubation des cellules avec le PHA comme stimulant induit progressivement l'expression du récepteur de l'élastine. Cette induction est encore stimulée en présence de peptides d'élastine. Toutefois, cette stimulation ne devient significative qu'à partir du Sème jour de culture. Dans ces conditions environ deux tiers des lymphocytes ( > 66%) expriment le récepteur de l'élastine à leur surface. - Résultats des doubles marquages Tableau 4 Expérience de double marquage des lymphocytes pour déterminer la nature des sous populations exprimant le récepteur de l'élastine % des cellules exprimant le récepteur (67 kD) de l'élastine + le marqueur CDx sans kappa élastine avec kappa élastine R67kD+ 59.9 66.4 CD4+R67kD+ 26.5 45.7 CD8+R67kD+ 11.9 16.1 CD15+R67kD+ 0.0 0.0 CD20+R67kD+ 36.7 36.3 CD25+R67kD+ 39.6 46.9 CD45RO+R67kD+ 26.6 41.1 CDx+R67kD = cellules marquées simultanément par l'anticorps anti CDx et avec anticorps anti sousunité du récepteur de l'élastine de 67 kD. Remarque : La somme des pourcentages ne donne pas 100% puisque une cellule peut exprimer simultanément plusieurs récepteurs. Dans cette expérience, la nature de la sous classe de lymphocytes exprimant le récepteur de l'élastine en présence et en absence de peptides d'élastine, a été déterminée par double marquage. I1 apparaît que la plupart des sous classes lymphocytaires examinées expriment le récepteur de l'élastine, à l'exception des cellules CD15+ qui restent négatives. Or ce marqueur CD15 correspond aux PMN et à une partie de monocytes. Cette expression n'est stimulée d'une façon importante par la présence de peptides d'élastine que sur les lymphocytes CD4+ et CD45RO+ qui en présence de peptides d'élastine ont fortement augmenté l'expression du récepteur de l'élastine. I1 s'agit là d'une sous population de cellules considérée comme des cellules helpers et à mémoire. Le couplage du récepteur de l'élastine par rétroaction positive à sa propre synthèse après son activation serait donc spécifique de ces cellules. Exemple 4: Protection contre l'effet cytotoxique de la kappa élastine de faible poids moléculaire sur les lymphocytes 1) Isolement des lymphocytes Isolement des lymphocytes selon la méthode décrite dans l'exemple 1. On dilue la suspension cellulaire avec le RPMI contenant 5 mM de glutamine et 10% de SVF de façon à ce que la concentration soit 106 cellules/2ml. 2) Culture cellulaire (Jo) On met les lymphocytes en culture dans des plaques Costar de 24 puits (500 > 1 suspension cellulaire/puit à concentration de 106 cellules/2ml) dans le milieu RPMI 1640 complémenté. La distribution des cellules est la suivante - 10 ml de suspension cellulaire sans K-élastine; - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 Fg/ml K-élastine, et 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine (contrôles avec kappa-élastine, sans lactose et mélibiose); - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine + 1 mg/ml mélibiose - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine + 1 mg/ml lactose - 10 ml de suspension cellulaire avec 1 mg/ml mélibiose - 10 ml de suspension cellulaire avec 1 mg/ml lactose 3) Comptage des cellules en présence de bleu de trypan pour déterminer le pourcentage de cellules mortes Au cinquième jour de culture (J4), on récupère la suspension cellulaire, on compte les cellules sur cellule de Malassez en présence de 0.1% de bleu de trypan (Sigma) (seules les cellules mortes sont colorées en bleu avec le bleu de trypan). On compte tout de suite après avoir ajouté le colorant à cause de la toxicité du bleu trypan. RESULTATS TRAITEMENT nombre de cellules/ml % des cellules mortes (bleu de trypan) sans kappa-élastine 5.8+0.6 9.2 + 0.4 avec 2 lg/ml kappaélastine (control) 10.23 + 3.5 6.6. + 1.3 avec 2 mg/ml kappaélastine 3.6 + 1.0 41.3 + 3.1 avec 1 mg/ml lactose 7.7+1.5 14.5+1.9 avec 1 mg/ml mélibiose 7.26 + 1.3 15.4 + 1.6 avec 2mg/ml kappaélastine + 1 mg/ml lactose 8.8. + 0.7 10.6 + 2.3 avec 2 mg/ml kappaélastine + 1 mg/ml mélibiose 8.8. + 1.6 10.5 + 0.9 Le tableau montre le pourcentage de cellules mortes en présente de peptides d'élastine et la protection contre la mort cellulaire par le lactose et le mélibiose. Cette protection est proche de 100% : la surmortalité (comparée au contrôl sans k-élastine) est de 32,1% avec 2mg/ml de peptides d'élastine. En présence de lactose ou de mélibiose cette surmortalité est de 1,3% (96% de protection). REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou d'un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, pour la préparation d'un médicament immunomodulateur. 2. Utilisation d'au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou d'un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, pour la préparation d'une composition destinée au traitement ou à la prévention des réactions d'hypersensibilité. 3. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'oligosaccharide est choisi dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. 4. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications l à 3, caractérisée en ce qu'on utilise un dérivé susbstitué par un résidu hydrophobe choisi parmi : les alkyles en C1-C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en C1-C18, les acides carboxyliques en Cl-C18 linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en C1-C18, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en CrCis. 5. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications l à 4, caractérisée en ce que la composition contient en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie topique externe. 6. Utilisation selon l'une des revendications I à 4, caractérisée en ce que la composition contient en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie parentérale ou entérale. 7. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications 1à 6, pour la préparation d'une composition destinée au traitement ou à la prévention des réactions d'hypersensibilité médiée par les lymphocytes. 8. Utilisation d'un oligosaccharide selon l'une des revendications l à 7, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement ou à la prévention des réactions d'intolérance et/ou d'allergie, de la peau et/ou des muqueuses. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition est destinée à empêcher ou à diminuer la formation de radicaux libres. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement ou à la prévention des symptômes d'une affection choisie parmi l'atopie, le psoriasis, les érythèmes polymorphes, xérodermites, lupus érythémateux, pemphigus, dermatites et eczémas. 11. Compostion dermato-cosmétique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un principe actif en association avec un adjuvant limitant les réactions d'hypersensibilité au principe actif, et en ce que l'adjuvant est un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe. 12. Méthode de traitement cosmétique des peaux hyperréactives, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique, une composition contenant au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, dans un véhicule cosmétologiquement acceptable. 13. Méthode de traitement cosmétique selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'oligosaccharide est choisi dans le groupe constitué du mélibiose, et de ses dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe.