Brevet FR2751346A1 — publié le 19980123

PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'etre greffés chez 1 homme en réduisant sensiblement les risques de rejet de greffes. La transplantation d' organes animaux chez l'homme, ou xénotransplantation, est une technique considérée actuellement comme une alternative possible, permettant de pallier le manque crucial de donneur en allogreffe. Des avancées spectaculaires dans ce domaine ont été réalisées depuis quelques années, et le porc comme animal donneur s'impose à la communauté scientifique et médicale. Les raisons de ce choix, par opposition au choix de primates comme donneurs d'organes sont multiples: le risque de transmission de virus pathogènes pour l'homme est bien moindre à partir du porc (Allan, 1996), l'élevage et le temps de reproduction des primates, à l'opposé du porc, rend leur utilisation difficile, et une barrière d'ordre éthique non négligeable existe pour l'utilisation de singes à des fins de médecine humaine. L'obstacle majeur à l'utilisation de greffons de porc chez l'homme est avant tout immunologique: l'homme possède des anticorps naturels (appelés xénoanticorps naturels-XAN-) dirigés contre des molécules exprimées par les cellules porcines. Lorsqu'un organe de porc est greffé chez l'homme (et chez les primates supérieurs qui possèdent aussi ces anticorps), ces anticorps réagissent avec l'endothélium vasculaire entraînant un rejet suraigu de 1' organe. Il s'agit en fait de la perte, induite par les XAN et le complément, de l'intégrité de l'endothélium vasculaire entraînant un oedème, une infiltration cellulaire et une destruction de l'organe (Bach et al., 1995). Les antigènes porcins reconnus par les XAN ont été analysés: il s'agit majoritairement d'une structure glucidique constituée de galactose branché en configuration a1,3 sur le N-acétyllactosamine (épitope cc- galactosyl) présent sur les glycolipides et les glycoprotéines de membrane (Sandrin et al., 1993). Les travaux réalisés par l'équipe de D. White (Cambridge) ont permis de résoudre partiellement ce problème de rejet hyperaigu: en bloquant l'activation du complément humain à la surface des cellules de l'endothélium porcin (Carrington et al, 1995), ils sont parvenus à réaliser des greffes de coeur de porc chez le macaque, dont la survie semble similaire à la survie d'une allogreffe (greffe d'un organe de la même espèce) réalisée dans les mêmes conditions, dans la mesure où le dépôt de XAN n'est pas trop massif. Techniquement, cela a été réalisé par insertion, par transgenèse germinale, d'une molécule régulatrice du complément humain, le DAF (pour decay accelerating factor, ou CD55), dans le génome de porc. Cette molécule, spécifique d'espèce, empêche la C3 convertase humaine d'enclencher la réaction en chaîne d'activation du complément à la surface des cellules porcines. Cette molécule semble toutefois " dépassée " lorsque la quantité de complément fixée est trop importante. Dans ce cas, un rejet survient quand même. La présence des épitopes a-galactosyl, le xénoantigène majeur sur les cellules porcines, est due à l'action d'une enzyme golgienne, UDP-Gal:Galal- 4GlcNacal,3-galactosyltransférase (encore désignée enzyme al ,3 GT). L'enzyme al,3GT participe à la fixation de galactose, en configuration a1,3, sur le galactose du N-acétyllactosamine des glycoprotéines et glycolipides membranaires, ce qui crée un épitope xénoantigénique appelé a-galactosyl constitué de l'ensemble Galal,3Gal-N-acétyllactosamine. L'inactivation du gène codant pour cette enzyme chez le porc pourrait bloquer la synthèse des épitopes a-galactosyl et induirait la non reconnaissance des cellules de porc par les XAN humains. Cette inactivation, utilisée conjointement à l'expression de DAF humain chez le porc, pourrait représenter un bénéfice décisif pour la réussite de la xénogreffe d'organes de porc chez l'homme. Cependant, l'inactivation d'un gène par recombinaison homologue ("gene knock out") est une technique dont l'utilisation est actuellement restreinte à la souris, car sa mise en oeuvre nécessite la disponibilité de cellules souches embryonnaires, dites cellules ES. Ces cellules, malgré d'intenses recherches, n'ont jamais pu être obtenues chez une autre espèce que la souris. L'inactivation de l'al,3GT chez le porc ne peut donc pas être réalisée par cette technique. A part les molécules xénoantigéniques et les molécules participant à la biosynthèse de ces dernières, il existe d'autres molécules dont l'inhibition pourrait être utile en xénotransplantation, en particulier les molécules dont l'activité biologique concourt au rejet de greffe, sans que ces molécules ne soient des xénoantigènes ou ne participent à la synthèse de xénoantigènes. Il s 'agit notamment de l'ensemble des molécules à caractère inflammatoire produites par l'endothélium du greffon, en particulier lors d'une xénogreffe cytokines (IL-1, IL-6), facteurs chémotactiques (IL-8, IP-10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GFM-CSF, G-CSF), molécules d'adhésion (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-1), facteurs de transcription (c-fos, NFkB, Gem), régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), facteurs d'immunocompétence (CMH I, CMII II). Il s'agit aussi des récepteurs, exprimés par l'endothélium du greffon, à des molécules provenant du receveur et ayant une activité biologique concourant au rejet de greffe : récepteur au C5a, récepteur au TNFa, récepteur à l'INFy, récepteurs aux cellules NK. La présente invention a pour but de fournir des organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'être greffés chez des patients nécessitant une greffe d'organes, avec diminution du risque de phénomène de rejet du greffon, voire complète annulation de ce risque. La présente invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles d'être utilisées pour la transformation génétique d'animaux en vue d'obtenir les susdits organes. L'invention a également pour but de fournir des mammifères non humains transgéniques à partir desquels sont susceptibles d'être prélevés les susdits organes. La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps antimolécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xénoantigéniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient. Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont avantageusement celles codant pour des anticorps dirigés contre - tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope ce-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galol ,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionné, - toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme x1,3GT présente dans les cellules de porc, - toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-1, IL-6, IL-8, IP10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GM-CSF, G-CSF), les molécules d'adhésion (ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, c-sis, GPlba, vWF, ligand LAM-1) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), les facteurs dtimmunocompétence (CMH I, CMII II), - les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFaR, ou les récepteurs aux cellules NK. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, telles que décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention, notamment selon les méthodes décrites ci-dessous, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre les susdites molécules, ces séquences nucléotidiques étant ellesmêmes susceptibles d'être utilisées pour la préparation de cellules transgéniques, ou d'organes transgéniques tels que définis ci-dessus selon l'invention. Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues par sélection des susdits anticorps anti-molécules à savoir des anticorps dirigés contre les molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, cette sélection étant effectuée à l'aide desdites molécules utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, et séquençage des séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés. Lesdits anticorps anti-molécules sont eux-mêmes avantageusement obtenus à partir de tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir de cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'une desdites molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, ledit hybridome étant sélectionné par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant ladite molécule initialement mise en oeuvre pour l'immunisation des animaux. L'ADN des hybridomes ainsi sélectionné est ensuite cloné, selon les techniques bien connues de l'homme de métier, dans des hôtes cellulaires susceptibles de produire lesdits anticorps monoclonaux, les séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés, étant ensuite séquencées. Lesdits anticorps anti-molécules peuvent également être obtenus par criblage d'une banque d'anticorps (telle que la banque décrite dans l'article de Nissim et al., 1994) avec lesdites molécules, ladite banque d'anticorps étant construite à partir de séquences d'ADN d'immunoglobulines humaines ou murines, ou issues d'une autre espèce, dans un hôte cellulaire (notamment dans des phages) susceptibles d'exprimer les anticorps codés par lesdites séquences d'ADN d' immunoglobulines. Avantageusement, les anticorps susmentionnés, à partir desquels sont déduites les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont des anticorps simple brin (encore désignés anticorps ScFv). Ces anticorps ScFv sont avantageusement obtenus à partir d'une banque d'anticorps telle que décrite ci-dessus, dans laquelle les séquences d'ADN codant pour ces anticorps sont traitées, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Nissim et al., 1994, de manière à obtenir des anticorps simple brin, notamment par jonction de tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne lourde d'immunoglobuline avec tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline. Ces anticorps ScFv peuvent également etre obtenus par clonage de l'ADN complémentaire (ADNc) issu d'hybridomes, tels que décrits ci-dessus, codant pour une immunoglobuline dirigée contre une desdites molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, suivi d'un traitement, tel que décrit cidessus, de manière à obtenir des anticorps simple brin par jonction de tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lourde de l'immunoglobuline avec tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne légère de cette immunoglobuline. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées pour la préparation de cellules ou organes transgéniques susmentionnés, sont celles codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans les cellules de mammifères non humains. Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles codant pour des anticorps dirigés contre l'une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyltransférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement contre l'une au moins des isoformes de 1'o:1,3GT présente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes cc-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée. A ce titre, I'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'cci ,3GT lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'une des méthodes décrites ci-dessus effectuées à l'aide d'une ou plusieurs isoformes de 1'cx1,3GT, en tant que molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe. L'invention concerne plus particulièrement les anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'oci ,3GT présentes chez le porc, et notamment contre l'une au moins des isoformes représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isoforme 1), SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à I' isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à I' isoforme 4), ces isoformes 1 à 4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dégénérescence du code génétique. L'invention vise plus particulièrement les anticorps tels que décrits cidessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de 1'oL1,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO6etSEQ ID NO 8. Avantageusement les anticorps anti- 1,3 GT susmentionnés de l'invention sont des anticorps simple brin dont les séquences en acides aminés sont telles qu'elles contiennent les parties CDR1, CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde desdits anticorps anti-ce1,3GT reliés par une séquence liante (linker) d'environ 6 à environ 36 acides aminés, à tout ou partie de la chaîne légère VX3 des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés. Un linker particulièrement préféré est celui constitué de trois répétitions successives de la séquence en acides suivante Gly - Gly- Gly- Gly- Ser Des anticorps particuliers selon l'invention sont ceux représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (anticorps désigné ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaitre l'une au moins des isoformes de l'oci ,3GT. L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un anticorps anti-cc1,3GT tel que décrit ci-dessus, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFvl), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFvl, ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de 1'oc1,3GT. Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17 susmentionnées sont avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps représentés par SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 18 respectivement, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 2 de 1'a1,3 GT (à savoir du polypeptide représenté par SEQ ID NO 4) utilisée en tant que molécule cible reconnue par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de phages, avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994, ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus par immunisation d'un animal avec ladite isoforme n" 2 de 1'oe1,3GT. L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus selon l'invention, notamment l'une au moins des séquences SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 ou SEQ ID NO 17, et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps anti-molécules, et plus particulièrement des anticorps anti-al,3GT susmentionnés. L'invention concerne également tout hôte cellulaire (telle qu'une cellule eucaryote) contenant l'un au moins des vecteurs tels que décrits ci-dessus, selon l'invention. L'invention concerne également tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, comprenant dans leur génome au moins une séquence nucléotidique décrite ci-dessus, codant pour des anticorps anti-molécules tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour des anticorps anti-oc1,3GT susmentionnés. L'invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, tels que décrits ci-dessus, comprenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou au moins une séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, desdites séquences nucléotidiques. Avantageusement, les mammifères transgéniques non humains, selon l'invention sont tels qu'obtenus par introduction, notamment par microinjection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules tel que défini cidessus, et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis cidessus, et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme. L'invention a également pour objet tout mammifère transgénique non humain défini ci-dessus, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus. A titre d'illustration, les mammifères transgéniques non humains, selon l'invention, peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans l'article de DePamphilis M.L., et al., 1988. Parmi les mammifères transgéniques non humains susceptibles d'être obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer la souris, le rat, le porc ou le lapin. L'invention a plus particulièrement pour objet les porcs transgéniques contenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis cidessus. L'invention concerne également les cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains tels que décrits ci-dessus. L'invention a également pour objet les organes de mammifères non humains, et plus particulièrement les organes de porc, notamment les reins, le foie, le pancréas ou le coeur, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, lesdits organes étant tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'invention. L'invention concerne également tout polypeptide comprenant la séquence d' acides aminés telle que représentée par SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3 de l'oci,3GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l'oc 1,3 GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'oci,3GT, ou comprenant toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes. L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leur séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'ocl ,3GT. L'invention concerne également tout vecteur, notamment plasmide, comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour les séquences représentées par SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, ou par une séquence dérivée ou fragment ce ces dernières, tels que définis ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires à l'expression des isoformes de l'oci,3GT codées par lesdites séquences nucléotidiques. L'invention vise également tout hôte cellulaire transformé par un vecteur tel que décrit ci-dessus, ainsi que tout procédé de préparation des isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'oci ,3GT par mise en culture dudit hôte cellulaire dans un milieu de culture approprié, et séparation desdites isoformes des autres constituants du milieu de culture. L'invention a plus particulièrement pour objet toutes séquences nucléotidiques avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps dirigés contre les isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'oci,3GT, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 3 et/ou 4 de 1'ci1,3 GT (à savoir des polypeptides représentés par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8, respectivement) utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de phages, avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994, ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquée ci-dessus par immunisation d'un animal avec ladite isoforme 3 ou ladite isoforme 4 de l'ocl,3GT. L'invention a également pour objet toute méthode, notamment chirurgicale, de traitement de patients nécessitant une greffe de cellules ou d'organes, par implantation desdites cellules transgéniques selon l'invention dans des tissus appropriés dudit patient, ou par suppression de l'organe défectueux du patient et remplacement de cet organe défectueux par un organe de mammifère non humain transgénique selon l'invention. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention des différentes isoformes de 1'c 1,3GT de porc, ainsi que de la transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-oe1,3GT selon l'invention, et de procédures d'obtention d'animaux transgéniques selon l'invention. I - Obtention des différents isoformes de l'a1,3 GT 1) Procédures expérimentales a) Cellules et tissus Les organes porcins ont été obtenus à partir de porcs d'environ 200 à 300 kg. L'isolement enzymatique et la culture des cellules endothéliales aortiques de porc (PAEC) ont été réalisés selon la méthode décrite dans l'article de Warren, 1990. Les PAEC sont stimulées avec 100 U/ml de TNF(x humain (Genzyme, Cambridge, USA) en présence ou non delO jug/ml de cycloheximide. b) Oligonucléotides Les oligonucléotides suivants ont été utilisés - oligonucléotide 1 5' -AGGAAGAGTGGTTCTGTC-3' hybridant - oligonucléotide 6 5' -GAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCGATGTTATTTCTAACCA AATT-3' hybridant aux nucléotides 1105 à 1123 de la séquence SEQ ID NO 1, et additionné en phase à un oligonucléotide codant pour un peptide FLAG (Kodak, New Haven, USA) un codon stop et un site Xhol. c) clonage et construction Un clone d'ADNc ocl,3GT de 2 Kb (pCDNA-ccGT) a été isolé d'une banque d'ADNc construite dans le vecteur pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, Pays Bas) par hybridation de transfert en utilisant une sonde PCR amplifiée avec les amorces 1 et 2 (dérivées de la séquence publiée dans l'article de Sandrin et al., 1994. Ce clone correspond à celui de l'isoforme n" 2. Les isoformes 1, 3 et 4 de l'al,3GT porcine ont été isolées par amplification par PCR d'une région comprenant les exons 4 à 7 avec les amorces 1 et 2, en utilisant 1'ARN rétro-transcript des PAEC. Les fragments amplifiés sont traités par la polymérase de Klenow, pour obtenir des extrémités franches, et clonés dans le site SmaI du plasmide pUC18. Trois clones contenant des fragments de 300, 237 et 201 pb ont été obtenus et utilisés en tant que matrice pour introduire, par amplification PCR secondaire, un site EcoRI à l'extrémité 5' (avec l'oligo 3) et un site SpeI dans l'exon 7 (avec l'oligo 4). L'introduction de ce site SpeI ne modifie pas la séquence en acides aminés. Les produits de PCR ont été ligués dans un plasmide pKS digéré par EcoRI-SpeI. La partie 3' restante de la séquence codante a été amplifiée par PCR à partir du clone pCDNA-ocGT avec les amorces 5 et 6, traitée pour obtenir des extrémités franches et clonée dans le site EcoRV d'un plasmide pKS. A partir de ce plasmide recombinant, un fragment SpeI portant la région codante du nucléotide 262 à 1125, en phase avec une séquence FLAG (contenue dans l'oligonucléotide 6), a été isolée et clonée dans les sites SpeI des plasmides pKS contenant les régions 5' variables. Les construits résultant ont été contrôlés par séquençage, et les fragments EcoRI, contenant les séquences codantes entières ont été sousclonés dans le vecteur d'expression encaryotique pCDAAS-néo conduisant l'expression du transgène sous contrôle du promoteur du CMV. L'isoforme 2 de l'aGT porcine a été isolée de la même manière, en utilisant le clone pcDNA-oe GT comme matrice initiale. d) transfection de cellules Des cellules HeLa cultivées en RPMI - 10 % FCS ont été traitées par la trypsine, resuspendues à raison de 5.106 cellules/ml dans un milieu glacé et mélangées avec 20 ,ug/ml d'ADN plasmidique portant le transgène et un gène de résistance à la néomycine. Les cellules ont été traitées par électroporation à 250 V, 350 ,uF, laissées dans la glace pendant 10 mn et ensemencées à raison de 2000 cellules/cm2. Après 24 h, 500 yg/ml G418 ont été additionnés et les cellules ont été cultivées pendant deux semaines. Les clones ont été isolés et cultivés en présence de G418. e) immunofluorescence Les clones de cellules HeLa exprimant une des quatre isoformes de l' Banderaea simplicifolia (Sigma, St Louis, USA), dilution au 1.100 dans du PBS. Les lamelles ont été lavées 4 fois dans du PBS avant montage. Pour la localisation subcellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 3 % et perméabilisées par trois incubations séquentielles de 5 mn avec 50 %, 100 % et 50 % d'acétone glacée. Après trois lavages avec du PBS/Tween-20 0,5 %, les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-FLAG M2 (1:200 ; Kodak, New Haven, USA), puis incubées pendant une heure avec un anticorps secondaire d'âne anti-souris marqué au FITC (1: 500 ; Jackson, Baltimore, USA). Les préparations ont été montées dans un fluide FA (Difco, Grayson, USA) et visualisées avec un microscope à épifluorescence Nikon. f) Analyses par transfert d'ADN (Northern blot) L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules cultivées et d'organes décrits par Zipfel et al.., 1989. Dix yg d'ARN total ont été fractionnés sur un gel d'agarose/formaldéhyde, transférés sur une membrane Hybond N (Amersham, Little Chalfont, UK) par action capillaire dans 20 X SSC pendant 16 h et immobilisés par réticulation aux UV. Les filtres ont été pré-hybridés pendant 6 h dans une solution contenant 50 % de formamide, 5 X SSPE (0,18 M NaC1, 10 mM phosphate de sodium, pH7,7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's, 0,5 % SDS, et 100 ,ug/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. L'ARN lié aux membranes a été hybridé avec des sondes d'ADNc marquées au P32 correspondant à la région codante de l'isoforme 1 de 1'au,3 GT, à la p-actine porcine ou à l'ARN 28S. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit à 420C dans une solution de pré-hybridation contenant 106 cpm/ml d'une sonde. Les filtres ont été lavés deux fois dans 2 X SSPE, 0,5 % de SDS à température ambiante pendant 15 mn, et trois fois dans 0,5 X SSPE, 0,5 % SDS à 65 "C pendant 15 mn. L'hybridation a été visualisée et les signaux quantifiés avec un dispositif phosphorimage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA). g) test de protection à la RNase Les tests de protection à la RNase ont été réalisés selon la méthode décrite par Melton et al., 1984. Deux sondes d'ARN, complémentaires des exons 5 et 6, et des exons. 4 et 7, ont été préparées de la manière suivante : deux fragments EcoRI-SpeI, correspondant aux nucléotides 7 à 266 du clone aG Tiso 1, et aux nucléotides - 7 à 174 du clone aGT iso4 (Fig. 1) ont été sous-clonés dans les sites EcoRI-SpeI des plasmides pKS. En utilisant l'ARN polymérase T7, les sondes d'ARN antisens ont été synthétisées et du 32P dUTP a été incorporé. L'ADN plasmidique matrice a été digéré avec l'ADNase I, et 500 000 cpm de chaque sonde ont été hybridés pendant 16 h à 10 ,ug d'ARN total d'organes porcins ou de cellules dans 30 ,ul de tampon d'hybridation contenant 80 % de formamide, à 50 "C. Les échantillons de contrôle contiennent 10 ,ug d'ARN de levure. Les mélanges d'hybridation été dilués à 400 ,ul avant l'addition de 5 ,ug/ml de RNase A et 10 U/ml de RNase T1. Après 1 h à 30 "C, 50 %g de protéinase K et de SDS à 0,5 % ont été ajoutés. Le mélange a ensuite été extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Les produits de digestion ont été analysés sur des gels de polyacrylamide à 6 %. Les gels ont été exposés pendant 16 h contre des films Kodak AR à - 80"C. 2) Résultats a) Clonage de quatre isoformes de l'oci,3GT Comme décrit précédemment, une banque d'expression d'ADNc porcin construite en utilisant 1'ARN LLC-PK1 (Guerif et al, 1995), a été criblée en utilisant une sonde correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante. Un clone d'ADNc, pcDNA-aGT, avec la région codante correspondant à une oc1,3GT porcine déjà décrite (Sandrin et al, 1994), a été isolé. Cette al,3 GT correspond à 1' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4 et codée par la séquence SEQ ID NO 3. Ce clone pcDNA-aGT contient une région 3' non traduite longue de 770 pb, une région codante de 1080 pb contenant les homologues porcins de ce qui a été défini dans le cas de la souris comme étant les exons.. 4, et 6 à 9 (Joziasse et al., 1992) et une région 5' non traduite de 150 pb. En utilisant des amorces adjacentes aux exons. 4 et 7, l'amplification PCR de l'ADN des PAEC a été réalisée. Des produits d'amplification d'environ 200 pb à 300 pb ont été trouvés, suggérant l'existence de transcrits supplémentaires. Trois produits différents ont été clonés, l'un deux étant identique à la séquence décrite par Strahan et al, 1995 (et désignée ici comme étant l'isoforme 1, Fig. 1, à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO 2 codée par la séquence SEQ ID NO 1). En comparaison avec I' isoforme 2 susmentionnée (provenant du clone pcDNA-ccGT), il contient un segment supplémentaire de 36 pb après le nucléotide 80. Un autre produit, l'isoforme 3, à savoir I' isoforme représentée par SEQ ID NO6 codée par la séquence SEQ ID NOS, ne comporte pas un segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide 179, et le dernier produit, l'isoforme 4, à savoir l'isoforme représentée par SEQ ID NO 8, et codée par la séquence SEQ ID NO7, ne comporte pas le segment de 36 pb du nucléotide 81 au nucléotide 116, et le segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide 179 (Fig. 1). La traduction des ARNm correspondant à chacun des transcripts identifiés, prédit la synthèse de quatre formes du polypeptide cc1,3GT, de 372, 360, 351 et 339 acides aminés qui diffèrent seulement dans la longueur de leurs régions "stem" (tiges) respectives. La situation décrite ici est comparable à celle décrite dans le cas de la souris (Joziasse et al., 1992), puisque quatre ARNm différents ont été trouvés, contenant les exons 5 et 6, ou contenant seulement l'exon 5 ou l'exon 6, ou ne contenant ni l'exon 5 ni l'exon 6. Les segments porcins de 36 pb et 63 pb correspondent bien aux exons 5 et 6 murins, à l'exception du fait que, dans la souris, l'exon 6 est long de 66 pb au lieu de 63 pb chez le porc (Fig. 1). b) Activité oc1,3GT des isoformes La présence ou l'absence des exons 5 et 6 détermine quatre variations de longueur dans la région stem de l'oci,3GT. Cette région, localisée à l'intérieur de l'appareil de Golgi, lie le signal d'ancrage transmembranaire au domaine luminal catalytiquement actif. Afin de vérifier si les quatre isoformes définies par l'épissage alternatif des exons 5 et 6 sont catalytiquement actifs, des cellules HeLa humaines ont été transformées avec des plasmides recombinants exprimant chacune des quatre isoformes de l'ocl ,3GT porcine sous le contrôle du promoteur CMV. Le produit de cette enzyme sur les surfaces des cellules a été analysé par immunofluorescence, en utilisant la lectine IB-4 réagissant spécifiquement avec les résidus Gala. L'épitope Gala pouvait être détecté à la surface des cellules HeLa traduites avec les quatre isoformes de l'enzyme, comme le montre la liaison à la lectine IB-4 (Fig. 2), indiquant que ces isoenzymes possèdent toutes une activité a-galactosyltransférase. Les niveaux d'expression des ARNm de l'oci,3GT dans les clones HeLa-al,3GT de porc, ont été contrôlés par Northern blot, et sont légèrement supérieurs dans les clones contenant les isoformes 1 et 2, et légèrement inférieurs pour le clone contenant les isoformes 2 et 3, par rapport au niveau trouvé dans les PAEC. c) Localisation subcellulaire des isoformes oci ,3GT La localisation Golgienne de l'oci,3GT est due à la présence dans l'exon 4 d'un domaine signal d'ancrage. Les variations de longueur dans la région stem, c'est-à-dire la présence ou l'absence des exons 5 et 6 peuvent également influencer la rétention dans le Golgi (Dahdal et al., 1993) ou exposent un site de clivage sensible aux protéases sur certaines isoformes (Weinstein et al., 1987 Lammers and Jamieson, 1989, Shaper et al., 1986 ; Yadav and Brew, 1991). Afin de vérifier si ces variations de la région stem de l'oci ,3GT pourraient modifier la localisation dans le Golgi, la localisation cellulaire des différentes isoformes a été analysée. Les quatre vecteurs d'expression basés sur le CMV décrits ci-dessus, expriment les isoformes al,3 GT avec un marqueur FLAG fusionné à l'extrémité C-terminale ce qui permet de détecter la protéine par immunofluorescence indirecte dans les cellules HeLa transfectées avec un anticorps anti-FLAG. Comme observé par microscopie à fluorescence, les quatre isoformes sont localisées de façon similaire et forment une structure juxtanucléaire compacte correspondant à celle de l'appareil de Golgi (Roth et Berger, 1982). De façon surprenante, alors que 100 % des cellules expriment l'enzyme, comme cela a été mis en évidence par coloration uniforme obtenue avec la lectine IB4, l'enzyme n'est pas détectable sur la totalité de ces cellules en utilisant l'anticorps anti-FLAG. Cela peut être due à une expression irrégulière de l'enzyme associée à une sensibilité limitée de l'anticorps, ou à la réorganisation de l'appareil de Golgi durant le cycle cellulaire. d) Expression des isoformes de l'oci,3GT L'épitope Galal,3Gal, résultant de l'activité de l'oci,3GT, n'est pas exprimé de façon homogène dans les tissus de porc (Oriol et al., 1993). Dans le but d'étudier ces variations au niveau enzymatique, le niveau des transcripts a 1,3GT a été étudié par Northern blot, et la distribution des isoformes a été étudiée par test de protection à la RNase. L'analyse par Northern blot montre l'expression dans tous les tissus étudiés, mais avec une différence frappante entre les tissus. Les reins contiennent environ 50 % de ce que l'on trouve dans la rate, le thymus 40 % et le coeur et les ovaires, 20 à 25 %. Les poumons et le foie contiennent moins de 10 % de ce qui a été trouvé dans la rate. La stimulation des cellules endothéliales avec les cytokines inflammatoires induit une augmentation de la régulation ou la synthèse de beaucoup de gènes, dont les molécules d'adhésion, à savoir les molécules liées à l'inflammation et la coagulation. Une augmentation de la régulation de l'oci,3GT n'a jamais été décrite dans les cellules endothéliales. En utilisant des PAEC stimulées pendant 6 heures avec 100 U/ml de TNFoc humain, une augmentation de deux fois le niveau global d'ARNm codant pour l'ocl,3GT a été observée. L'incubation des PAEC en présence de cycloheximide augmente également le niveau d'ARNm codant pour 1'cx1,3GT probablement par stabilisation du messager. De façon surprenante, la stimulation par TNFo + cycloheximide ne conduit pas à une augmentation du niveau de l'ARNm codant pour l'oci,3GT, mais plutôt à une légère diminution.. Cet effet est peut-être relié à la découverte du fait que la cycloheximide facilite l'apoptose due au TNFoc conduisant à une diminution de la régulation de certains antigènes (Malorni et al., 1993). L'expression des isoformes de l'oci,3GT a été analysée par test de protection à 1'ARNase dans les tissus de porc. Deux sondes antisens radiomarquées ont été utilisées pour analyser les quatre espèces d'ARN identifiées. Le transcript de l'ARNm de l'isoforme 1 hybride avec un fragment de 273 pb sur la sonde 1 correspondant à une séquence délimitée par les nucléotides 7 à 266 sur le transcript (les numéros des nucléotides correspondent à la séquence représentée sur la figure 1, isoforme 1). L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 2 conduit à un fragment de 87 pb délimité par les nucléotides - 7 à 80, et un fragment plus grand de 150 pb délimité par les nucléotides 117 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 3 conduit à un fragment de 123 pb délimité par les nucléotides - 7 à 116 et un plus petit fragment de 87 pb délimité par les nucléotides 180 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec I'ARNm de l'isoforme 4 de 1'oc1,3 GT conduit à deux fragments de 87 pb délimités par les nucléotides - 7 à 80 et par les nucléotides 180 à 266. La deuxième sonde, sonde 4, est un fragment d'ARNm de 174 pb correspondant à l'isoforme 4. Il est entièrement protégé par l'ARNm codant pour l'isoforme 4, et conduit à deux fragments de 87 pb avec les isoformes 1, 2 et 3. Les fragments de sonde protégés par les ARNm codant pour les isoformes 1, 2 et 3 sont ceux de 273, 150 et 123 pb, respectivement, la sonde 4 protégée par l'ARNm codant pour l'isoforme 4 conduit à une bande de 174 pb. La répartition des produits de transcription diffère d'un tissu à un autre : dans le rein, I' isoforme 3 seule est exprimée, alors que dans les ovaires, seule l'isoforme 4 est exprimée. Dans le coeur, les poumons et la rate, on trouve les isoformes 1 et 2, alors que les isoformes 2 et 4 sont trouvées dans le foie. Les cellules endothéliales expriment les isoformes 1, 2 et 4. Dans les thymus, on peut observer les 4 isoformes. II - Transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-oc 1,3 GT selon l'invention 1) Matériels et méthodes a) Banques d'ADNc, cellules et plasmides La banque d'ADNc provient de cellules épithéliales porcines LLC-PK1. Elle est construite dans le vecteur pCDNA- 1. Les souches bactériennes utilisées sont: E. coli-TGl sup E, E. coli-XL-l, SURE, M15, MC 1061/P3, et DH5cc. Le plasmide d'expression procaryote pQE-30 vient de Qiagen. Le plasmide d'expression eucaryote pCDAAS-9, contient un gène de résistance à la néomycine et entraîne la transcription d'ADNc qu'il porte sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus. La banque d'immunoglobulines humaines ScFv est construite dans le plasmide pHEN-l et a été utilisée comme décrit dans l'article de Nissim et al., 1994. La préparation des phages recombinants est également décrite b) Système d'expression recombinante et purification Le système de production et de purification de l'oci ,3GT recombinante provient de Qiagen. La transcription a été induite par culture des E.coli-M1S transformées par l'ADNc de l'enzyme avec 2mM IPTG, pour 5 heures. La protéine recombinante dans le lysat cellulaire a été alors purifiée sur une colonne échangeuse d'ions, en conditions dénaturantes. La protéine purifiée a été dialysée en PBS et stockée à -20 C jusqu'à son utilisation. c) ELISA Des plaques de microtitration (Nunc) ont été glacées une nuit à 4"C avec 5 t/ml de protéine al,3GT purifiée, en tampon carbonate à pH 9,5. Elles ont ensuite été saturées 2h à 37"C en 2% lait écrémé, puis incubées 2h, 37"C avec une suspension de phages recombinants exprimant un fragment ScFv d'anticorps provenant de la banque ScFv. Après lavage, les plaques ont été incubées lh, 37"C avec un anticorps anti-phage M13 marqué à la peroxydase (Pharmacia), dilué 1/500. La révélation a été effectuée par réaction de la peroxydase avec de la diaminobenzidine en présence d'eau oxygénée. d) Transfection et cellules porcines Des cellules de porc LLC-PK1 ont été transfectées avec des plasmides pCDAAS portant l'ADNc de clones anti-al,3 GT positifs. La transfection a été réalisée par électroporation d'un mélange de 500.000 cellules et de 20 ,ug d'ADN plasmidique, à 250V et 350if. Les clones ont été sélectionnés par culture de 15 jours en présence de 1500 ,u/ml de néomycine (G418), isolés à l'aide d'anneaux de clonage et cultivés séparément en présence de G418 jusqu'à l'analyse. e) Immunofluorescence et cytofluorométrie: Les cellules ont été marquées par I' isolectine B4 de Bandeiraea simplicifolia marquée à la fluorescéine (IB-4-FITC, Sigma), lectine spécifique des structures a-galactose: les cellules ont été lavées à 40C en PBS-2%BSA, incubées à 4"C pendant 30 mn. avec 20 jug/ml IB-4-FITC, relavées 3 fois et analysées par cytofluorométrie en utilisant un FACS-can (Becton Dickinson). f) Séquence: Les réactions de séquence ont été effectuées avec la D-taq (Amersham), en utilisant comme amorces deux oligonucléotides situés dans la partie 5' du segment VX3. Oligo 1, permettant la lecture de la partie 5' de I' ADNc 5' TTCTGAGGCTGTCTCCTT-3'. Oligo 2, permettant la lecture de la partie 3' de 1 'ADNc 5' -ATCGTCTGAGCTGACTCA-3'. g) Ciblage moléculaire des ScFv anti-al,3-GT dans le Golgi Dans le but de faire exprimer les anticorps ScFv dans le même compartiment cellulaire que l'al,3 GT, c'est-à-dire dans le Golgi, des séquences signal et de rétention golgienne ont été ajoutées aux clones ScFv, en N-terminal et en C-terminal, respectivement. Les séquences signal et de rétention choisies ont été adaptées à partir des données rapportées par Richardson et al., 1995. Elles ont été introduites par amplification PCR des clones ScFv de départ, à l'aide d'amorces contenant l'ADNc de ces séquences, et des sites de restriction pour le clonage. La séquence de ces amorces est la suivante - amorce encodant la séquence signal 5' -TTTGAATTCATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCAGGT GCAGCTGGTGCAG-3'. - amorce encodant la séquence de rétention golgienne: 5' -TTTCTCGAGTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTACCTAGGA CGGTGCAGCTT-3'. 2) RESULTATS a) Clonage de l'oci,3GT de porc Un fragment de 313bp correspondant à l'extrémité 5' de l'ADNc de l'a 1,3GT de porc a été amplifié par RT-PCR à partir d'ARN de cellules endothéliales aortiques de porc. Ce fragment a servi de sonde pour le clonage de l'ADNc entier dans une banque de cellules épithéliales de porc exprimée en E. Coli MC1061 P3, dans le plasmide pCDNA-1. Le clone isolé mesure environ 2Kb, comporte une partie 5' non codante de 147 pb suivie d'une phase ouverte de lecture de 1104 pb et d'une partie 3' non codante d'environ 750 pb. Il correspond à l'isoforme de l'enzyme dont l'exon 5 est absent (à savoir 1' isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4). L'ADNc porcin isolé est fonctionnel car il confère une activité al,3GT à des cellules Cos, naturellement dépourvues de cette activité, après transfection. Cette activité peut être démontrée par l'acquisition d'une réactivité avec l'isolectine B4 de Bande ira ea simplicifolia, marquant spécifiquement les résidus a-galactosylés. b) Expression protéique de l'oci,3GT recombinante. La partie codante de l'oci,3GT a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquencé pour s assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-a 1,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à 1' IPTG, et purifiée. c) Production d'anticorps ScFv anti-al,3GT La banque d'immunoglobulines (Ig) humaines est constituée par 50 séquences de parties variables de chaînes lourdes d'Ig en configuration germinale, associées à un peptide contenant de 4 à 12 acides aminés aléatoires, codant par la partie CDR3 de la chaîne lourde, et insérées dans le phagemide pHEN1-VR3, en fusion avec la partie plasmidique codant pour la protéine g3p de l'enveloppe phagique. Les phages pouvant être dérivés de ces plasmides expriment donc un fragment (ScFv) d'Ig fonctionnel en fusion avec une protéine d'enveloppe, et se comportent, au niveau de leur propriétés de reconnaissance d'un antigène, comme l'Ig dont ils expriment la séquence. Les phages dérivés de cette banque d'Ig ont fait l'objet de 4 tris successifs par "panning" sur la protéine recombinante purifiée, comme décrit dans Nissim et al., 1994 d) Test ELISA de la positivité des anticorps ScFv anti-al,3GT. Quatre-vingt-seize colonies individuelles de bactéries E. Coli-TGl supE contenant chacune un clone pHENl-ScFv ont été isolées, de manière aléatoire, après les 4 cycles d'enrichissement à l'encontre de la protéine al,3GT. Ces colonies ont été cultivées une nuit dans 200,ul de milieu LB, en plaque de microtitration. Le surnageant, contenant des phages exposant sur leur enveloppe 1 à 3 molécules de fragment ScFv d'anticorps, a été testé par ELISA pour mesurer la réactivité relative des différents clones à l'encontre de l'oci,3GT. Sur les 96 clones testés, 15 montraient une réactivité supérieure à trois fois le niveau du contrôle (Figure 2). Les six clones les plus positifs ont été réamplifiés et des phages purifiés ont été préparés à partir de 500 ml de surnageant de bactéries TG-1. Les phage purifiés, et concentrés par précipitation et resuspension en PBS ont un titre supérieur à 1010 cfu/ml. Cette préparation de phages concentrés a été re-testée en ELISA. Les résultats, montrés à la figure 2, reproduisent l'ordre de réactivité observé dans la Fig. 2. e) Séquence de i' ADNc des fragments d'anticorps ScFv anti-alX3GT Les clones ScFv anti-al,3GT sélectionnés ont été séquencés pour s'assurer de la non introduction d'erreurs lors du sous-clonage par PCR et pour déterminer les associations chaîne lourde génomique-peptide aléatoire (de 4 à 12 acides aminés)-chaîne légère VR3 qui produisent un anticorps réactif à l'encontre de l'oci ,3GT. Sur les six séquences analysées, deux sont identiques (n" 2 et 6), et deux ne diffèrent que par deux acides aminés dans la partie CDR3 (n" 1 et 5). La séquence n" 3 présente un codon ambre (codon reconnu comme un stop traductionnel dans un système eucaryote, mais considéré comme une glutamine dans la souche E. coli-TG1 supE utilisée pour le clonage) à la jonction CD3-peptide linker reliant les chaînes lourdes à la chaîne légère VX3. Un codon stop à cette position est une conséquence prévisible de l'association aléatoire des fragments d'ADNc qui se produit lors de la fabrication de la banque ScFv. Le remplacement du nucléotide T en position 313 par un C permet d'obtenir un codon correspondant à une glutamine en position 105 (voir SEQ ID NO 13). Les chaînes lourdes (désignées séquences VH) sélectionnées ainsi que la séquence des régions CDR3 sont décrites dans le tableau 1; la séquence de clone ScFvl correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 9, la séquence du clone ScFv2 et celle du clone ScFv6 correspondent à la séquence représentée par SEQ ID NO 11, la séquence du clone ScFv3 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 13, la séquence du clone ScFv4 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 15 et la séquence du clone ScFv5 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 17. Tableau 1 Clone g) Evaluation de l'efficacité de l'immunisation intracellulaire Les ADNc codant pour les anticorps anti-al,3GT n" 1 à 6, natifs ou possédant les séquences signal et de localisation golgienne, ont été sous-clonés dans le vecteur d'expression eucaryote pCDAAS, sous le contrôle du promoteur de CMV. Pour tester la conséquence de l'expression des ScFv anti-al,3GT sur la diminution de l'expression de l'épitope a-galactosyl sur la membrane des cellules de porc, des cellules LLC-PK1 ont été transfectées avec les différents plasmides pCDAAS-ScFv, et des clones ont été isolés. La présence de l'épitope xénoantigénique a-galactosyl a été évaluée en immunofluorescence avec la lectine IB4-FITC (spécifique du galactose branché en configuration o), en comparaison avec les mêmes cellules, non transfectées. Les résultats montrent que l'anticorps ScFv n" 2 (à savoir celui représenté par SEQ ID NO 12) encodant la séquence VH DP-5, associée une partie CD3 artificielle composée des acides aminés PEIDQ, reliée à la séquence VX3, sans adjonction de séquences signal et de rétention golgienne, lorsqu'il est exprimé dans une cellule de porc, entraîne jusqu'à 95% de diminution de l'expression du galactose branché en configuration oc. En effet, la fluorescence moyenne des cellules LLC-PK1 est de 465 unités lorsque le marquage est réalisé avec 20 yg/ml IB-4 FITC, et elle tombe à 49 unités pour le clone LLC-PK1-ScFv6. En conclusion, dans le contexte de la xénotransplantation, la possibilité d'inhiber dans une cellule de porc l'expression de l'oc i, 3GT en utilisant cette technique, conduit à des applications très claires : la disponibilité de porcs transgéniques n'exprimant pas ou peu d'épitopes oc-galactosyl, conséquence de l'inhibition de l'oci,3GT, et exprimant un inhibiteur du complément humain, comme cela existe déjà, permet d'effectuer des xénogreffes en évitant la réaction des cellules du greffon avec les anticorps et avec le complément du receveur humain. Les résultats qui sont présentés ci-dessus, montrent que des cellules d'origine porcine exprimant un anticorps ScFv anti-oe1,3GT peuvent être obtenues, et que cette expression résulte en une diminution importante du niveau de xénoépitopes exprimés III - Anticorps monoclonaux anti-ol1,3GT La partie codante de l'oci,3GT, isoforme n" 2 a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquencé pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-ocl ,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG. Après purification, 1'a1,3GT a été dialysée en PBS et injectée à une souris BALB/C à raison de 3 injections de 40 llg chacune tous les 15 jours. Les lymphocytes spléniques ont été collectés et fusionnés avec l'hybridome de souris SP2-O. La sélection des hybridomes sécrétant une immunoglobuline reconnaissant 1'cc1,3GT s'est effectuée par test ELISA: des plaques de microtitration ont été glacées avec 10microg/ml de protéine ce1,3GT recombinante, 16h à 4"C à pH 9.5, puis saturées 2h, 37"C avec PBS-BSA1%, Tween 20 0.5%. Les surnageants de hybridomes ont été incubés lh, 37 C et les anticorps immunoabsorbés révélés à l'aide d'un anti-Ig marqué à la peroxydase. Les hybridomes fournissant une densité optique au moins trois fois supérieure au bruit de fond ont été retenus. IV - Clonage d'anticorps ScFv (Single chain Fv) à partir d'hybridomes Le clonage de fragments d'immunoglobulines sous forme de fragments ScFv est décrit dans Clackson et al. (1991)). En bref, de l'ARN est préparé à partir de 5x108 cellules d'hybridome, et l'ARN messager est sélectionné sur oligo(dT)-cellulose. Un premier brin d'ADNc est synthétisé comme suit : 10,ug d'ARNm sont incubés avec 20 pmoles des oligos VHlFOR ou VKlFOR (Clackson et al., 1991), 250 M de chaque dNTP, 10 m M DTT, 100 m M Tris.HCl (pH8.3), 10 mM MgCl2, et 140 mM KCl, 10 min. à 70"C, puis 1h à 42 C en présence de 50 unités de Transcriptase Reverse. L'amplification par PCR des fragments VH et VL est réalisée en mélangeant 2 ,ul de réaction RT avec 25 pmoles des amorces VHlFOR ou VKlFOR, et VHlBACK ou VKlBACK (Clackson et al.., 1991), 250 M de chaque dNTP, 67 mM Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH4)2SO4, 10 mM MgC12, et 2 unités de Taq polymérase, pour 30 cycles d'amplification. Les fragments obtenus sont alors purifiés et 1 ,ug de chaque sont mélangés avec 300 ng de linker (gly4Ser)3, et amplifiés par 7 cycles de PCR destinés à relier les fragments. Les fragments VH et VL reliés sont alors amplifiés en 20 cycles avec les oligos VHlBACK et VK4FOR. Les fragments obtenus sont alors ré-amplifiés avec les oligos VHlBACK-BamH1 et VK4FOR-BamH1, digérés par BamH1 et clonés dans le vecteur d'expression eucaryote PCDAAS, sous le contrôle du promoteur CMV. V -Voies d'action intracellulaire des anticorps anti-al,3GT Le mécanisme moléculaire par lequel un anticorps exprimé dans une cellule interfère avec la fonction d'une molécule portant le site antigénique contre lequel cet anticorps est exprimé n'est pas élucidé. Cependant, plusieurs explications ont été proposées. Dans le cas de l'inhibition de la reverse transcriptase de HIV (Maciejewski et al., 1995), l'anticorps anti-RT n'est pas neutralisant dans un test in vitro. Les auteurs proposent que le complexe antigène/anticorps formé dans la cellule puisse bloquer stériquement le mouvement de l'enzyme le long de la molécule d'ARN, ou bien puisse modifier sa structure secondaire. Dans le cas de l'inhibition de la chaîne a du récepteur à l'IL-2 (Richardson et al., 1995), un processus de dégradation du complexe antigène/anticorps a été proposé. Ce processus semble non lysosomial, car la méthionine méthyl ester (un inhibiteur lysosomial) n' entraîne pas d'accumulation du complexe. La dégradation ne se produit pas non plus dans le compartiment Golgien car la brefeidin A (qui détruit le Golgi) est sans effet. La dégradation se produit donc précocement, sans doute au niveau du réticulum endoplasmique. Dans plusieurs cas où la localisation intracellulaire de la molécule cible conditionne sa fonction, il est possible que l'anticorps intracellulaire retienne cette molécule dans un compartiment qui lui est étranger. Richardson et al. ont en effet montré que l'expression d'un anticorps anti-RT, retenu dans le réticulum endoplasmique par incorporation d'une séquence de rétention KDEL, retient la RT dans ce compartiment. Dans le cas de l'inhibition de l'oci,3GT par des anticorps ScFv, on peut supposer que : 1) soit les anticorps modulent l'activité de l'enzyme (par exemple en modifiant sa structure), 2) soit ils la retiennent dans un compartiment intracellulaire autre que le trans-Golgi (compartiment dans lequel le branchement de galactose en a1,3 sur le galactose du N-acélyllactosamine est effectué), 3) soit ils entraînent la dégradation du complexe antigène/anticorps par un mécanisme non élucidé. Il pourrait s'agir par exemple d'une ubiquitination suivie d'une dégradation par le complexe protéasome. VI - Construction d'animaux transgéniques avec les ScFv proposés L'obtention d'animaux transgéniques pour un ScFv anti-al,3GT présente des intérêts en recherche et en clinique. Pour la recherche, la transgenèse chez le rat convient particulièrement car ses organes peuvent être greffés chez le singe, où ils subissent un rejet semblable au rejet de xénogreffe dans le modèle porc-primate Pour l'utilisation thérapeutique de greffons, le porc est l'animal de choix. a) Transgenèse chez le rat Les embryons au stade unicellulaire sont obtenus à l'issue d'un protocole de super-ovulation appliqué à des rates de souche CD âgées de 28 à 38 jours (Amstrong et Opavoky, 1988). Ce protocole permet d'obtenir de façon régulière une moyenne de 40 à 50 embryons par femelle. La construction portant l'ADNc codant pour l'anticorps anti-al,3GT (deux exemples de constructions pouvant être utilisées sont montrés sur les figures 4 et 5) est injectée à raison de quelques milliers de copies par embryon. Les embryons traités sont alors réimplantés dans la matrice. Les rats issus de ces embryons sont ensuite testés pour sélectionner les animaux ayant effectivement incorporé dans leur génome 1' ADN transgénique. Ces tests sont effectués au niveau de i'ADN et de l'ARN, que l'on peut détecter par hybridation avec une sonde ADN correspondant au transgène, et au niveau protéique. La détection de la protéine ScFv peut être effectuée par réaction avec un anticorps anti Fab humain, ou par un anticorps anti-épitope, si l'ADNc ScFv est en fusion avec un ADNc codant pour un peptide portant cet épitope. b) Transgenèse chez le porc Des embryons fécondés au stade pronucléaire sont obtenus par laparotomie à partir des oviductes de truies matures âgées de 7 à 10 mois, 50 heures après l'induction de la superovulation et 20 à 26 heures après l'insémination. Le Pronucleus, dans lequel est injecté l'ADN, est visualisé par une centrifugation de l'ovocyte à 15000 g pendant 3 minutes. Les résultats après réimplantation d'ovocytes traités de cette manière montrent que 10 % d'entre eux se développent et donnent un animal, et que 15 % d'entre eux ont incorporé l'ADN transgénique, soit 1,5 % des ovocytes traités. Parmi ces animaux positifs quant à l'intégration d'ADN, 67 % expriment effectivement la protéine correspondant au transgène (White et al., 1994; Cozzi et White, 1995). Légendes des figures - Figure 1: Analyse des séquences des transcripts des isoformes de I'oci,3GT de porc, et alignement sur une carte de transcript primaire murine. Les ADNc des isoformes 1, 3 et 4 ont été clonés à partir d'ARNm rétrotranscripts et amplifiés par PCR provenant de PAEC et I' ADNc correspondant à I' isoforme 2 a été cloné à partir d'une banque LLC-pK1, comme décrit ci-dessus. La séquence nucléotidique a été déterminée par utilisation de Séquenase (USB), et comparée par contrôle avec les séquences correspondant aux isoformes 1 et 2 décrites par Strahan et al., 1995 et Sandrin et al., 1994. Les numéros en gras sur le côté gauche de la figure correspondant aux isoformes 1 à 4. Les premières bases des exons 5, 6 et 7 sont numérotées sur la séquence correspondant à l'isoforme 1. Les chiffres représentés en italique indiquent le nombre de bases manquantes dans l'exon épissé correspondant. La carte primaire de transcription de la souris avec ses 9 exons, telle que décrite par Joziasse et al., 1992, est comparée avec les séquences des isoformes 1 à 4. La queue cytoplasmique (encadré noir) et la région transmembranaire (encadré avec lignes verticales) sont codées par l'exon 4. Les régions d'origine (encadré grise) comprend les exons 5 et 6. Les exons 5 et 6 sont épissés alternativement chez la souris et le porc. Le domaine catalytique est codé par les exons 7, 8 et 9. - Figure 2: Réactivité mesurée par ELISA de préparations non purifiées de phages correspondant à 15 clones reconnaissant la protéine al,3GT: Quatre vingt seize colonies individuelles de bactéries TG1 contenant un clone pHEN-l-ScFv, présélectionnées par une procédure d'enrichissement décrite dans Nissim et al., 1994, ont été cultivées et leur surnageant (contenant les phages exprimant l'anticorps) testé en ELISA comme décrit dans Matériels et Méthodes ci-dessus. Les 15 surnageants positifs (numérotés 1 à 15) sont représentés en abcisse sur la figure. Le contrôle négatif (-) est constitué d'un blanc et le contrôle positif (+) par la mesure de la densité optique obtenue par la réaction d'un phage M13 (Pharmacia) sur une IgG de souris anti-phage M13 (Pharmacia) déposée sur la plaque. Les valeurs de densité optique (DO) sont indiquées en ordonnée. - Figure 3 Réactivité mesurée par ELISA de phages purifiés correspondant à 6 clones reconnaissant la protéine a1,3GT: Les six clones les plus positifs dans l'ELISA ci-dessus (Fig.2) ont été amplifiés en vue de la préparation de phages purifiés. Les phages purifiés et concentrés ont été re-testés en ELISA, de manière similaire à ce qui est décrit dans la figure 2. Ces phages ont été testés à une dilution de 1 à 1/8. Les dilutions effectuées sont représentées en abcisse, et la densité optique (DO) mesurée est indiquée en ordonnée. la courbe corespondant au contrôle positif passe par des points représentés par des croix, celle correspondant au phage contenant ScFvl (M13-ScFvl) passe par des points représentés par un point noir au centre de carrés blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv2 (M13-ScFv2) passe par des points représentés par des losanges noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv3 (M13-ScFv3) passe par des points représentés par des points représentés par un point blanc au centre de carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv4 (M13 ScFv4) passe par des points représentés par des losanges blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv5 (M13-ScFv5) passe par des points représentés par des carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv6 (M13-ScFv6) passe par des points représentés par des carrés blancs, le blanc étant représenté par un rond noir. - Figure 4 Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du promoteur du CMH-1 de souris H-2Kb, permettant l'insertion du transgène (ADNc ScFv 0,7Kb) entre la partie promotrice proprement dite (promoteur H-2kb ; 4Kb) et une série d' introns/exons (5,5 Kb) appartenant au gène H-2Kb, cette série étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. Ces introns contiennent des séquences régulatrices permettant d'obtenir une bonne activité du promoteur, et donc une bonne expression du transgène. Le promoteur H-2Kb permet une expression constitutive et ubiquitaire de l'ADNc dont il contrôle l'expression (Kimura et al., 1986; Byrne et al., 1995). - Figure 5 Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du minigène DAF (Cozzi et al., 1996), dont l'efficacité a déjà été démontrée en transgenèse chez le porc. De manière analogue à la construction H-2Kb, ce minigène place l'ADNc ScFv (0,7 Kb) sous le contrôle du promoteur du DAF, lui-même contrôlé par des séquences introniques (l'ensemble constitué par le promoteur DAF, les exons et les introns représentant 4,6 Kb), l'ADNc ScFv étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. REFERENCES Allan, J.S. Xenotransplantation at a crossroads: prevention versus progress. Nature Medicine 2, 18-21 (1996). Amstrong, D. T., and M. A. Opavoky. 1988. 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Biol. 9, 1041-1048 LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: INSERM (B) RUE: 101, rue de Tolbiac (C) VILLE: Paris (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75654 Cedex 13 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1128 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1128 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48 Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15 CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGC CCA 96 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30 GAA GGT TCT TTG TTC TGG ATA TAC CAG TCA AAA AAC CCA GAA GTT GGC 144 Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly 35 40 45 AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG TTT AAC AAT GGG 192 Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly 50 55 60 ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC AAC GAA AAG GAA 240 Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu 65 70 75 80 CAA AGA ARA GAA GAC AAC AGA GGA GAG CTT CCA CTA GTG GAC TGG TTT 288 Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe 85 90 95 AAT CCT GAG AAA CGC CCA GAG GTC GTG ACC ATA ACC AGA TGG AAG GCT 336 Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala 100 105 110 CCA GTG GTA TGG GAA GGC ACT TAC AAC AGA GCC GTC TTA GAT AAT TAT 384 Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr 115 120 125 TAT GCC AAA CAG ARA ATT ACC GTG GGC TTG ACG GTT CTT GCT GTC GGA 432 Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly 130 135 140 AGA TAC ATT GAG CAT TAC TTG GAG GAG TTC TTA ATA TCT GCA AAT ACA 480 Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr 145 150 155 160 TAC TTC ATG GTT GGC CAC ARA GTC ATC TTT TAC ATC ATG GTG GAT GAT 528 Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp 165 170 175 ATC TCC AGG ATG CCT TTG ATA GAG CTG GGT CCT CTG CGC TCC TTT ARA 576 Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys 180 185 190 GTG TTT GAG ATC AAG TCC GAG AAG AGG TGG CAA GAC ATC AGC ATG ATG 624 Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met 195 200 205 CGC ATG AAG ACC ATC GGG GAG CAC ATC CTG GCC CAC ATC CAG CAC GAG 672 Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu 210 215 220 GTG GAC TTC CTC TTC TGC ATG GAC GTG GAT CAG GTC TTC CAA AAC AAC 720 Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn 225 230 235 240 TTT GGG GTG GAG ACC CTG GGC CAG TCG GTG GCT CAG CTA CAG GCC TGG 768 Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp 245 250 255 TGG TAC AAG GCA CAT CCT GAC GAG TTC ACC TAC GAG AGG CGG AAG GAG 816 Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu 260 265 270 TCC GCA GCC TAC ATT CCG TTT GGC CAG GGG GAT TTT TAT TAC CAC GCA 864 Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala 275 280 285 GCC ATT TTT GGG GGA ACA CCC ACT CAG GTT CTA AAC ATC ACT CAG GAG 912 Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu 290 295 300 TGC TTC AAG GGA ATC CTC CAG GAC AAG GAA AAT GAC ATA GAA GCC GAG 960 Cys Phe Lys Gly Ile Leu Gln Asp Lys Glu Asn Asp Ile Glu Ala Glu 305 310 315 320 TGG CAT GAT GAA AGC CAT CTA AAC AAG TAT TTC CTT CTC AAC ARA CCC 1008 Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro 325 330 335 ACT AAA ATC TTA TCC CCA GAA TAC TGC TGG GAT TAT CAT ATA GGC ATG 1056 Thr Lys Ile Leu Ser Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Met 340 345 350 TCT GTG GAT ATT AGG ATT GTC AAG ATA GCT TGG CAG ARA AAA GAG TAT 1104 Ser Val Asp Ile Arg Ile Val Lys Ile Ala Trp Gln Lys Lys Glu Tyr 355 360 365 AAT TTG GTT AGA AAT AAC ATC TG 1128 Asn Leu Val Arg Asn Asn Ile 370 375 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 375 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Ser Pro 20 25 30 Glu Gly Ser Leu Phe Trp Ile Tyr Gln Ser Lys Asn Pro Glu Val Gly 35 40 45 Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp Phe Asn Asn Gly 50 55 60 Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly Asn Glu Lys Glu 65 70 75 80 Gln Arg Lys Glu Asp Asn Arg Gly Glu Leu Pro Leu Val Asp Trp Phe 85 90 95 Asn Pro Glu Lys Arg Pro Glu Val Val Thr Ile Thr Arg Trp Lys Ala 100 105 110 Pro Val Val Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Val Leu Asp Asn Tyr 115 120 125 Tyr Ala Lys Gln Lys Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Val Gly 130 135 140 Arg Tyr Ile Glu His Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Ile Ser Ala Asn Thr 145 150 155 160 Tyr Phe Met Val Gly His Lys Val Ile Phe Tyr Ile Met Val Asp Asp 165 170 175 Ile Ser Arg Met Pro Leu Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys 180 185 190 Val Phe Glu Ile Lys Ser Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met 195 200 205 Arg Met Lys Thr Ile Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu 210 215 220 Val Asp Phe Leu Phe Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asn Asn 225 230 235 240 Phe Gly Val Glu Thr Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp 245 250 255 Trp Tyr Lys Ala His Pro Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu 260 265 270 Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala 275 280 285 Ala Ile Phe Gly Gly Thr Pro Thr Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu 290 295 300 C (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1092 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..1092 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AAT TCG AAA ATA ATG AAT GTC AAA GGA AGA GTG GTT CTG TCA ATG CTG 48 Asn Ser Lys Ile Met Asn Val Lys Gly Arg Val Val Leu Ser Met Leu 1 5 10 15 CTT GTC TCA ACT GTA ATG GTT GTG TTT TGG GAA TAC ATC AAC AGA AAC 96 Leu Val Ser Thr Val Met Val Val Phe Trp Glu Tyr Ile Asn Arg Asn 20 25 30 CCA GAA GTT GGC AGC AGT GCT CAG AGG GGC TGG TGG TTT CCG AGC TGG 144 Pro Glu Val Gly Ser Ser Ala Gln Arg Gly Trp Trp Phe Pro Ser Trp 35 40 45 TTT AAC AAT GGG ACT CAC AGT TAC CAC GAA GAA GAA GAC GCT ATA GGC 192 Phe Asn Asn Gly Thr His Ser Tyr His Glu Glu Glu Asp Ala Ile Gly 50 55 60 ARC GAA AAG GAA CAA AGA AAA GAA 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Gly Gln Thr 130 135 140 GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC 480 Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 145 150 155 160 TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT 528 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 165 170 175 AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC 576 Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 180 185 190 TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT 624 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 195 200 205 GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG 672 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val 210 215 220 GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 708 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 236 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Met Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 130 135 140 Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 145 150 155 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 165 170 175 Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 180 185 190 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr île Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 195 200 205 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val 210 215 220 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 711 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..711 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GTT TCC GGA TAC ACC CTC ACT GAA TTA 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 TCC ATG CAC TGG GTG CGA CAG GCT CCT GGA AAA GGG CTT GAG TGG ATG 144 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 GGA GGT TTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATC TAC GCA CAG AAG TTC 192 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 CAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GAG GAC ACA TCT ACA GAC ACA GCC TAC 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA AGA CCT GAG ATT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG 336 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA 384 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 432 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 130 135 140 ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA 480 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 145 150 155 160 AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 528 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 165 170 175 GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 576 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 180 185 190 AGC TCA GGA AAC (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala l 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 130 135 140 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 145 150 155 160 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 165 170 175 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 180 185 190 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 195 200 205 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 210 215 220 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 717 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..717 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ACT AGC TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 GCT ATG AAT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG 144 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 GGA TGG ATC AAC ACC AAC ACT GGG AAC CCA ACG TAT GCC CAG GGC TTC 192 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 ACA GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT 240 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 CTG CAG ATC TGC AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA AGA TCT AAT GAT CCT GCT GAT CAG TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 336 Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 384 Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 432 Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 130 135 140 GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 480 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 145 150 155 160 TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 528 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 165 170 175 ATC TAT GGT ARA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 576 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190 GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 624 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 195 200 205 GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 672 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 210 215 220 AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 717 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 239 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asn Asp Pro Ala Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 130 135 140 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 145 150 155 160 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 165 170 175 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 195 200 205 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 210 215 220 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 235 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 762 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..762 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CGA TTC ATG GAA AGG CAC TGG ATC TTT CTC TTC CAG GTG CAG CTG GTG 48 Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val 1 5 10 15 CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC 96 Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30 TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT AGC ATG AAC TGG GTC 144 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val 35 40 45 CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT 192 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser 50 55 60 AGT AGT AGT ACC ATA TAC TAC GCA GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC 240 Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80 ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC 288 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 85 90 95 CTG AGA GAC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA GCT TGG AGG 336 Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg 100 105 110 ACG GAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC 384 Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly 115 120 125 GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT 432 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr 130 135 140 CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA 480 Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr 145 150 155 160 TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG 528 Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT ARA AAC AAC CGG 576 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg 180 185 190 CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA 624 Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr 195 200 205 GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT 672 Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA 720 Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly 225 230 235 240 GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC GAA AAG GAC GAG CTG 762 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 245 250 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 254 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: Arg Phe Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Phe Gln Val Gln Leu Val 1 5 10 15 Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 20 25 30 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val 35 40 45 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 85 90 95 Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ala Trp Arg 100 105 110 Thr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr 130 135 140 Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr 145 150 155 160 Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg 180 185 190 Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr 195 200 205 Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 210 215 220 Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 245 250 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 687 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..687 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 48 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15 ACT AGC TAT GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT 96 Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 20 25 30 GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA 144 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 35 40 45 CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC 192 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 50 55 60 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCC GTG 240 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80 TAT TAC TGT GCA AGA AGT GGG GTG TAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC 288 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 85 90 95 ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 336 Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG 384 Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 115 120 125 GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT 432 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 130 135 140 TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 480 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 145 150 155 160 ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT 528 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 165 170 175 GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG 576 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 180 185 190 GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT ARC TCC CGG GAC AGC AGT GGT 624 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 195 200 205 AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT AGC 672 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser 210 215 220 GAA AAG GAC GAG CTG 687 Glu Lys Asp Glu Leu 225 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 229 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15 Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 20 25 30 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 35 40 45 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 50 55 60 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 85 90 95 Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu 115 120 125 Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr 130 135 140 Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 145 150 155 160 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly île Pro Asp Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln 180 185 190 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly 195 200 205 Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser 210 215 220 Glu Lys Asp Glu Leu 225 REVENDICATIONS 1. Utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xénoantigéniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient. 2. Utilisation selon la revendication 1, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre - tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope ce-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Gaia 1,3 Gal-N-acétyllacto samine susmentionné, - toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme oe1,3GT présente dans les cellules de porc, - toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-I, IL-6, IL-S, DP- 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs p15E, GM-CSF, G-CSF), les molécules d'adhésion (ELAM-I, VCAM-l, ICAM-l, c-sis, Galba, vWF, ligand LAM-I) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAF1), les facteurs d'immunocompétence (CMII I, CMII Il), - les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFotR ou les récepteurs aux cellules NK. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre l'une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyl transférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement de l'enzyme a-1,3GT présente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes a-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée. 4. Anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'a-1,3GT, et plus particulièrement dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'a-1,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isoforme 1), SEQ ID NO 4 (correspondant à l'îsoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à 4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dégénérescence du code génétique. 5. Anticorps selon la revendication 4, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de l'a-1,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8. 6. Anticorps selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFvl), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (ScFvS), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'o-1,3GT. 7. Séquences nucléotidiques codant pour un anticorps selon l'une des revendications 4 à 6, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFvl), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFvS), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFvl, ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFvS, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de 1't1,3GT. 8. Vecteur contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques selon la revendication 7 et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps selon l'une des revendications 4 à 6. 9. Hôte cellulaire contenant l'un au moins des vecteurs selon la revendication 8. 10. Mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, comprenant dans son génome au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, et plus particulièrement au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 7. 11. Mammifère transgénique non humain selon la revendication 10, tel qu'obtenu par introduction, notamment par microinjection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe, et plus particulièrement de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme. 12. Cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains selon la revendication 10 ou la revendication 11. 13. Organes de mammifères non humains, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon la revendication 10 ou la revendication 11. 14. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés telle que représentée par la SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3 de 1'a1,3-GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l'o 1 ,3-GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'o- 1,3GT, ou toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes. 15. Séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment par les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder puis un anticorps susceptible de reconnaître l'un au moins des isoformes de l'cel,3 GT.