Brevet FR2749082A1 — publié le 19971128

La présente invention concerne des particules superparamagnétiques, monodisperses, leur procédé de préparation ainsi que leurs utilisations notamment en biologie dans l'isolement de molécules biologiques. L'état de la technique révèle des particules superparamagnétiques et monodisperses. A titre d'illustration, les documents EP-O 106 873 et EP-O 446 260 décrivent des particules superparamagnétiques et monodisperses comprenant un noyau poreux à base de copolymère polystyrène/divinylbenzène sur lesquels sont fixés des grains d'oxyde de fer magnétique, et une couche externe fonctionnalisée susceptible d'interagir avec des sondes d'acides nucléiques. Selon le procédé de préparation des particules décrites dans ces documents, les oxydes de fer magnétiques sont incorporés par précipitation ce qui limite la proportion de charge magnétique incorporée, et ne permet d'obtenir la charge magnétique qu'en une monocouche. Selon l'invention, on apporte des particules qui sont superparamagnétiques, qui ont une charge magnétique distribuée de manière très homogène, dont la proportion peut varier entre 1 à 80 %, en particulier de 25 à 80 % en poids par rapport au(x) polymère(s) constituant les particules. La présente invention permet d'atteindre des proportions de charge magnétique incorporée élevées, en particulier car le procédé employé permet de répartir la charge magnétique sous forme de multicouches. La charge magnétique se présente sous la forme de nanoparticules qui sont incorporées dans les particules de manière substantiellement irréversible, c'est-à-dire sans perte par relargage, quels que soient les traitements ultérieurs qui leur sont appliqués, notamment dans l'échantillon, à savoir rinçages, variations de températures, de pH... Les propriétés des particules de l'invention résultent de leur structure et composition particulières et plus précisément à la présence d'un polymère thermosensible constitutif au moins pour supporter le matériau magnétique. Selon l'article de A. KONDO, (A. KONDO, H. KAMURA, et K. HIGASHITANI (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, 99-105) on connaît un procédé d'obtention de particules magnétiques, comprenant un noyau à base d'un premier polymère consistant en un polystyrène et dans lequel est distribué un matériau magnétique, et une couche hydrophile recouvrant le noyau, à base d'un polymère thermosensible consistant en du poly(N-isoproprylacrylamide). Le procédé décrit comprend les étapes suivantes - selon une première étape pour l'obtention du noyau magnétique, on met en contact le matériau magnétique avec du styrène en présence d'un amorceur de polymérisation, puis - selon une seconde étape pour l'obtention de la couche hydrophile, on met en contact le noyau obtenu avec du N-isopropylacrylamide et de l'acide méthacrylique, en présence de l'amorceur de polymérisation précédent. Sur les particules ainsi obtenues, on fixe de la sérumalbumine bovine pour ensuite procéder à l'isolement d'anticorps dirigés contre la sérum albumine bovine, présents dans un échantillon. L'inconvénient de ces particules survient à l'étape de leur séparation : ces particules incorporent une faible proportion de charge magnétique et sont en outre de tailles très variables, limitant considérablement l'efficacité d'un champ magnétique appliqué pour séparer les particules. Ainsi pour assurer une séparation aussi efficiente que possible de ces particules dans l'échantillon, les auteurs ont recours à une thermoflocculation selon laquelle on augmente la température de l'échantillon, qui intervient pour compléter l'action d'un champ magnétique. La nécessité d'une technique de séparation complémentaire résulte des particules obtenues qui présentent les inconvénients suivants - proportions de charge magnétique incorporée faibles, - répartition non homogène de la charge magnétique, et - obtention de particules non monodisperses. Les particules de l'invention sont destinées à l'isolement de molécules biologiques, essentiellement par l'application d'un champ magnétique, indépendamment de toutes variations de température, pH, force ionique. Les particules superparamagnétiques et monodisperses de l'invention ont une taille prédéterminée comprise entre 0,1 et 10 pm et comprennent - un noyau à base d'un premier polymère, - une couche interne dite couche magnétique, recouvrant le noyau, à base d'un second polymère et dans laquelle est distribué un matériau magnétique, et - une couche externe, dite couche d'encapsulation, éventuellement fonctionnalisée, recouvrant la couche magnétique, à base d'un troisième polymère et susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, au moins le second polymère étant thermosensible et présentant une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 15 et 650C, et de préférence entre 25 et 50 Oc. Avantageusement, le second polymère est obtenu par polymérisation de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, tel que le Nisopropylacrylamide (NIPAM), (2) au moins un agent de réticulation, tel que le N,N-méthylène bisacrylamide, et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1), tel que chlorure de 2-aminoéthyl-méthacrylate. Un second polymère préféré est le PNIPAM [poly-(N-isopropylacrylamide)]. Le premier polymère peut être identique au second polymère ou différent du second polymère, dans ce dernier cas le premier polymère sera de préférence un polymère à caractère hydrophobe, et en particulier un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle. Le troisième polymère est un polymère compatible avec le second polymère et est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le PNIPAM. Lorsque ce troisième polymère est fonctionnalisé, il porte un ou plusieurs groupes fonctionnels choisis parmi les fonctions carboxylique, aldéhydique, thiol et amine. Un second objet de l'invention est un procédé d'obtention de particules telles que définies précédemment, qui comprend les étapes suivantes - selon une étape (a) dite étape d'obtention du premier polymère, on obtient par polymérisation du ou des monomères appropriés, le premier polymère, - selon une étape (b) dite étape d'obtention du second polymère, on obtient un sol du second polymère, par polymérisation en phase aqueuse de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, (2) au moins un agent de réticulation et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1), - selon une étape (c) dite d'adsorption du matériau magnétique, on met en contact le matériau magnétique avec les premier et second polymères, à une température inférieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (d) dite d'obtention de la couche magnétique, on porte le mélange réactionnel obtenu selon (c) à une température supérieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (e) dite d'encapsulation, on met en contact, en phase aqueuse, le mélange obtenu selon (d) avec le ou les monomères appropriés pour l'obtention par polymérisation du troisième polymère. Les étapes (a) et (b) sont, selon une variante du procédé, effectuées simultanément, en particulier mais de manière non limitative quand le premier polymère est identique au second polymère. Pour l'étape (b) et éventuellement l'étape (a) les réactifs de polymérisation sont de préférence sélectionnés comme suit - le monomère (1) est de préférence choisi parmi les N-alkylacrylamides et les N,N-dialkylacrylamides, en particulier parmi le N-isopropylacrylamide, le Néthylméthacrylamide, N-n-propylacrylamide, le N-npropylméthacrylamide, N-isopropylméthacrylamide, le Ncyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le Nméthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-npropylacrylamide, le monomère (1) étant de préférence le N-isopropylacrylamide (NIPAM), - le ou les monomères fonctionnels (3) sont choisis parmi les dérivés acryliques et méthacryliques, le chlorure de 2-aminoéthyl-méthacrylate (AEM), les dérivés de N-vinyl-pyridine, les dérivés de trialkylammonium et les dérivés de chlorure d'isothiouronium, et éventuellement - l'agent de réticulation (2) est hydrosoluble et est choisi parmi le N,N-méthylène bisacrylamide (MBA), l'éthylène glycol diméthacrylate. Pour l'étape (c), l'adsorption du matériau magnétique sur le second polymère résulte d'interactions électrostatiques entre des particules de charges opposées. Le milieu réactionnel pour l'adsorption est une phase aqueuse dont les paramètres force ionique et pH sont contrôlés. L'invention concerne en outre les applications des particules définies ci-dessus. Ainsi les particules sont notamment utilisables pour capturer puis séparer, dans un échantillon liquide, au moins une molécule biologique, notamment choisie parmi les protéines, les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les polypeptides, les enzymes, les haptènes, les acides nucléiques et les fragments d'acides nucléiques. La ou les molécules biologiques sont fixées sur les particules par adsorption ou par liaison covalente, directement ou indirectement, et dans ce dernier cas, par l'intermédiaire d'un ligand par exemple. Des exemples d'utilisations particulières des particules de l'invention sont les suivantes - utilisation comme traceur après concentration magnétique sur une phase solide dans ce cas, la particule est comptée après balayage de la surface par une pointe de microscope de force atomique ou après observation microscopique directe, ou avec une caméra ; les particules magnétiques peuvent être détectées du fait de leur charge métallique et mesurées avec un magnétomètre ou tout système de type lecteur de carte de crédit ; pour faciliter la concentration des particules sur la surface, un aimant permanent ou un électroaimant peut être disposé au-dessous ou au-dessus de la surface utilisée pour la détection ; la concentration magnétique sera préférentiellement effectuée si l'on utilise un nombre limité de particules, par exemple la quantité suffisante pour recouvrir une à dix fois la surface si le processus est statique et une quantité éventuellement plus importante si la concentration est dynamique par circulation contrôlée de liquide sur la surface réactive - utilisations des particules couplées à un ligand biologique approprié dans un protocole réactionnel d'agglutination ; la taille des particules peut être suivie directement dans le milieu ou après attraction magnétique - utilisation des particules pour vectoriser des réactifs dans un dispositif de type capillaire, un jeu d'électroaimants permettant le déplacement des particules - utilisation des particules pour créer des voies préférentielles et/ou obstruer des canaux de distribution de liquide - utilisation des particules pour transporter jusqu'à leurs cibles des substances thérapeutiques le principe actif est adsorbé ou transitoirement couplé par covalence sur la surface de la particule, un champ magnétique approprié est appliqué pour entraîner le déplacement de l'ensemble particule-substance thérapeutique. Un autre objet de l'invention est un procédé pour isoler, dans un échantillon liquide, au moins une molécule biologique, selon lequel - on dispose de particules selon l'invention, - on met en contact ledit échantillon avec lesdites particules, par incubation, - on applique un champ magnétique au mélange obtenu, - on sépare les particules de l'échantillon. Bien entendu, la séparation des particules qui fait l'objet de ce dernier procédé est différente de la séparation des molécules biologiques comprise dans la notion d'isolement. I1 s'agit dans le premier cas de séparer de l'échantillon liquide, les particules sur lesquelles est fixée la ou les molécules biologiques, par action d'un champ magnétique. Enfin un dernier objet de l'invention est un réactif pour l'isolement de molécules biologiques comprenant une dispersion en milieu aqueux de particules telles que définies précédemment. Avant de décrire plus en détails la présente invention, certains termes employés dans la description sont définis. Par particules superparamagnétiques, on entend des particules contenant des particules d'un matériau magnétique, garantissant, après suppression du champ magnétique, l'absence de toute aimantation rémanente. Par particules monodisperses, on comprend des particules ayant sensiblement la même taille, et plus précisément dont la taille varie de 5 % au plus par rapport à une taille moyenne donnée et choisie. L'expression "isoler une molécule biologique" selon l'invention, comprend la séparation, la détection, d'une molécule biologique, l'enrichissement d'une fraction en une molécule biologique, selon une méthode d'isolement spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou quantitative, de manière directe ou indirecte par exemple par l'intermédiaire d'un ligand fixé sur les particules. EXEMPLE 1 : PREPARATION DU PREMIER ET DU SECOND POLYMERES 1) Le Premier et le second polvmères sont différents, le premier est un polystyrène. le second est le PNIPAM Les préparations détaillées ci-après ont utilisées la polymérisation radicalaire en milieu hétérogène, à partir des réactifs de départ suivants - pour le premier polymère : le monomère est le styrène (St) (Janssen), - pour le second polymère le monomère (1) est le N-isopropylacrylamide (NIPAM) (Kodak), l'agent de réticulation est le N-N méthylène bisacrylamide (MBA) (Aldrich), le monomère (3) fonctionnel est le chlorure de 2aminoéthyl méthacrylate (AEM) (Kodak), l'amorceur de polymérisation est le chlorure de 2,2'-azobis amidino propane (V50) (Wako), et du NaCl a été utilisé pour ajuster la force ionique. 1.1) Polvmérisation en réacteur fermé (batch) Tous les monomères précités sont introduits dans le réacteur avant le début de la réaction de polymérisation avec les autres réactifs et sans ajout ultérieur. Cette méthode s'avère très efficace pour la copolymérisation d'un mélange de monomères hydrophobes et hydrophiles, car le monomère hydrophobe (St) forme principalement le noyau et le monomère hydrophile (NIPAM) forme la couche recouvrant le noyau, si la polymérisation a lieu dans la phase aqueuse. La synthèse est effectuée dans un réacteur de 250 ml sous agitation constante à 200 tours/minutes et sous atmosphère inerte d'azote. L'eau utilisée, bouillie et dégazée sous azote pendant deux heures, est introduite dans le réacteur thermostaté à 700C et laissée sous un léger courant d'azote pendant 15 minutes, afin d'éliminer toutes traces d'oxygène. Les monomères (St, NIPAM) sont introduits et dégazés pendant encore 15 minutes avant d'ajouter l'amorceur V50. Formulation du mélange réactionnel Réactifs Masse Eau 200 ml St 18 g NIPAM 2,06 g V50 0,2053 g Caractéristiques de la dispersion colloïdale obtenue: (a) diamètre à 200C 376 nm (b) diamètre à 500C 330 nm (c) diamètre par MET 326 nm (d) densité de charge 10 mmol/g (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 200C (b) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière & 500C (c) diamètre mesuré en microscopie électronique à transmission (d) densité de charge exprimée en mmole(amine)/g de polymère. 1.2) Polvmérisation sur semence Cette méthode consiste à introduire le ou les monomères (1) et/ou (3) dans un réacteur contenant la dispersion colloïdale 1.1) déjà constituée et parfaitement caractérisée, en présence du réticulant MBA. Le ou les monomères (1) et/ou (3) peuvent être additionnés sur la semence, en une seule étape ou en semicontinu. La réaction de polymérisation est faite dans un réacteur de 100 ml, à une température de 700C, sous une agitation de 200 tours/minutes. La durée de la réaction de polymérisation est de 19 heures. Formulation du mélange réactionnel identifié sous la référence (PS131/132) : Réactifs Masse (g) Polymère selon 1.1 1,26 NIPAM 0,77 MBA 0,06 AEM 0,06 v50 0,018 Caractéristiques du sol obtenu: (a) diamètre à 200C 610 nm (b) diamètre à 500C 450 nm (c) diamètre par MET 305 nm (d) densité de charge 19 mmol/g (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 200C. (b) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 500C. (c) diamètre mesuré en Microscopie électronique. (d) densité de charge exprimée en mmole(amine)/g de polymère. 2) Les premier et second polymères sont identiques et sont le PNIPAM Les réactifs de départ sont ceux qui ont été choisis dans 1) pour le second polymère. 2.1) Polymérisation en batch (ou procédé en réacteur fermé) Le monomère (1) (NIPAM), le monomere (3) fonctionnel (AEM) et l'agent de réticulation (MBA) sont introduits ensemble en une seule étape avant que la polymérisation ne soit amorcée par addition de l'amorceur (V50). La durée de polymérisation est de 30 min. Formulation du polymère obtenu identifié sous la référence PNIPAM42 Volume total d'eau 250ml bouillie et dégazée NIPAM 48,51 mmoles MBA 3 mmoles AEM 0,48 mmoles V50 0,30 mmoles Température 700C Les caractéristiques du polymère obtenu après polymérisation sont reportées dans le tableau suivant diamètre(a) DDL 200C à 200C 292 nm diamètre(b) taille DDL à 400C 164 nm diamètre(c) MET 129 nm concentration en AEM(d) 14,1 Mmole/g de polymère LCST(e) 31,50C CCC(f) à 200C 1,00 mole/l (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 200C (b) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 400C (c) diamètre mesuré en Microscopie électronique (d) densité de charge exprimée en mmole(amine primaire)/ g de polymère (e) température critique inférieure de solubilité (LCST) déterminée par mesure de turbidité en fonction de la température (f) concentration critique de coagulation (CCC) à 200C. 2.2) Polymérisation en semi-continu Le monomère (3) est introduit en deux étapes, à 3 min et à 6 min respectivement, dans le réacteur renfermant déjà le monomère (1), l'agent de réticulation (2) MBA et l'amorceur V50, en cours de polymérisation. Cet ajout peut être effectué à une vitesse d'injection constante (polymérisation par ajout continu) ou bien suivant un ajout bien contrôlé à des intervalles réguliers (polymérisation en semi-continu). Le but de cette méthode de polymérisation est d'augmenter l'incorporation de monomère(s) (3) fonctionnel(s) sans augmenter le pourcentage de polymère hydrosoluble dans le milieu réactionnel. Formulation du polymère obtenu identifié sous la référence PNIPAM45 Volume total d'eau 250ml bouillie et dégazée NIPAM 48,51 mmoles MBA 3 mmoles AEM 0,48 mmoles V50 0,30 mmoles Température 700C Ajouts entre 3 et 6 min Les caractéristique du polymère PNIPAM45 5 obtenu après polymérisation sont reportées dans le tableau suivant diamètre(a) DDL 200C à 200C 823 nm diamètre(b) taille DDL à 400C 530 nm diamètre(c) MET 327 nm concentration en AEM(d) 10,0 Mmole/g de polymère LCST(e) 32 0C CCC(f) à 200C 1,00 mole/l (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 200C (b) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 400C (c) diamètre mesuré en Microscopie électronique (d) densité de charge exprimée en mmole(amine primaire)/ g de polymère (e) température critique inférieure de solubilité (LCST) déterminée par mesure de turbidité en fonction de la température (f) concentration critique de coagulation (CCC) à 200C. 2.3) Polvmérisation sur semence Cette méthode consiste à introduire le ou les monomère(s) (1) et/ou (3) dans un milieu réactionnel contenant un sol de polymère préalablement préparé selon 2.1 et parfaitement caractérisé. Formulation du mélange réactionnel Un volume de 40 ml de semence 2.1 à une concentration de 4,5 g pour 100 ml est utilisé. Les réactifs ont été ajoutés dilués dans un volume de 5 ml d'eau. Les pourcentages molaires de NIPAM, de MBA et de V50 ajoutés dans la deuxième étape sont identiques à ceux de la semence selon 2.1. En revanche, la concentration en monomère (3) fonctionnel est contrôlée (augmentée ou diminuée suivant la densité de charge voulue) ; dans le cas présent 10% de AEM sont ajoutés par rapport au monomère (1) NIPAM. Les caractéristiques du polymère identifié sous la référence PNIPAM94) qui a été obtenu suivant le mode opératoire décrit dans 2.1, sont reportées dans le tableau suivant diamètre(a) DDL 200C à 200C 504 nm diamètre(b) taille DDL à 400C 290 nm diamètre(c) MET 176 nm concentration en AEM(d) 22,4 pmole/g de polymère LCST(e) 32 0C CCC(f) à 200C 1,10 mole/l (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 20 C (b) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière à 400C (c) diamètre mesuré en Microscopie électronique (d) densité de charge exprimée en mmole(amine primaire)/ g de polymère (e) température critique inférieure de solubilité (LCST) déterminée par mesure de turbidité en fonction de la température (f) concentration critique de coagulation (CCC) à 200C. EXEMPLE 2 : SYNTHESE ET CARACTERISATION DE8 FERROFLUIDES IONIQUES DESTINES A ETRE INCORPORES DANS LA COUCHE DU SECOND POLYMERE Le mode opératoire a été élaboré selon les résultats énoncés dans le brevet US-4 329 241. Les propriétés physiques des ferrofluides préparés selon ce document sont rassemblées dans le tableau récapitulatif suivant Propriétés Valeurs Méthodes diamètres (nm) 15 + 3 FMA (microscopie à force atomique) et 7 + 1 MET (microscopie électronique à transmission) dispersité 9,5 + 2 aimantation (mesure de la magnétisation) 11 t 1 RX (rayons X) épaisseur de la couche non 0,1 aimantation magnétique (nm) aimantation 422 kA/m aimantation spécifique densité de 1,5 conductimétrie charge (C/m2) pH 7-8 pH-métrie conductivité 1 mS conductimétrie La méthode de synthèse par précipitation des oxydes de fer permet, d'après les résultats des différentes méthodes de caractérisation, d'obtenir un ferrofluide anionique, stable entre pH 6 et pH 8, d'une taille de l'ordre d'une dizaine de nm et superparamagnétique. Les analyses ont été effectuées pour différents ferrofluides, obtenus avec le même mode opératoire : les résultats obtenus sont reproductibles d'un ferrofluide à l'autre. Les particules de ferrofluide étant chargées négativement, il est donc possible de réaliser l'adsorption de ces particules sur un polymère de charge opposée (chargé positivement) via les interactions électrostatiques. EXEMPLE 3 : ADSORPTION DE LA CHARGE MAGNETIQUE SUR LA COUCHE DE SECOND POLYMERE Le second polymère et la charge magnétique (Exemple 2) ont des charges de signe opposé, ce qui favorise une forte adsorption, principalement par interactions électrostatiques, de la charge magnétique sur le polymère. La charge magnétique est placée en excès par rapport à la concentration de polymère (Exemple 1), et l'adsorption est réalisée dans des conditions telles que le taux de recouvrement de la surface du second polymère est supérieur à 30 %. Dans un flacon de 200 ml, 6,4 ml du sol de polymère obtenu à l'Exemple 1 (1.2; concentration = 94,5 g/l) sont progressivement ajoutés à 29 ml de ferrofluide obtenu à l'Exemple 2 (concentration = 23 g/l). Après adsorption de la ferrite pendant 15 minutes, l'excès de ferrofluide est éliminé en plaçant le flacon sur un aimant afin de séparer les particules de polymère recouvertes de ferrite. Le surnageant est éliminé, dosé et remplacé par un même volume d'eau bouillie et dégazée. Le flacon renfermant le polymère recouvert de ferrite est à nouveau placé sur l'aimant afin de vérifier qu'il ne reste plus de ferrite en solution (surnageant limpide). Le tableau présenté ci-dessus présente la quantité de ferrite adsorbée sur les particules de latex chevelu de l'exemple 1.1 Code Quantité adsorbée % massique adsorbé en g/g de latex ENC10 6,63 45 ENCîl 6,67 46 ENC13 4,70 40 ENC12 5,30 37 ENC16 5,00 40 EXEMPLE 4: ENCAPSULATION DES PARTICULES Le procédé d'encapsulation de la charge magnétique après l'étape d'adsorption consiste à polymériser en milieu aqueux un ou plusieurs monomères avec un agent de réticulation copolymérisable, en présence d'une suspension de polymère magnétique saturée (Exemple 3). Les monomères choisis peuvent être fonctionnels, et dans ce cas, présenter ainsi un intérêt pour le greffage ou l'adsorption des molécules biologiques. Cette méthode permet d'obtenir un polymère magnétique dont l'interface peut facilement être modifiée suivant les utilisations une surface hydrophobe pour l'adsorption de protéine ou hydrophile fonctionnelle pour un greffage chimique, par exemple. Le procédé d'encapsulation décrit dans cet exemple repose sur l'utilisation d'un amorceur et d'un mélange de monomères et d'agent de réticulation. 40 ml de polymère recouvert de ferrite (Exemple 3) sont introduits dans un réacteur thermostaté à 700C. Les monomères sont ensuite introduits dans un volume de 4 ml d'eau bouillie et dégazée. Le temps de polymérisation est de trois heures à compter de l'introduction de l'amorceur. Les monomères utilisés sont indiqués dans les tableaux suivants: 4.1) Réactifs Quantités NIPAM 0,15 g MBA 0,0075 g Persulfate de potassium (KPS) 0,0056 g Les particules magnétiques obtenues ont pour références: Ni10, ENC11 et ENC13. 4.2) Réactifs Ouantités NIPAM 0,15 g MBA 0,015 g Persulfate de potassium (KPS) 0,0056 g Les particules magnétiques obtenues ont pour références: ENC12 et ENC16. Ces particules ont été caractérisées. Ces résultats sont présentés dans les tableaux suivants a) Diamètre des particules magnétiques obtenues code D(a) nm Dn(b) nm Dw(b) nm IP(C) ENC10 500 380 388 1,02 ENC11 810 385 388 1,006 ENC13 1500 352 363 1,030 ENC12 750 366 369 1,007 ENC16 1000 ND ND ND (a) diamètre mesuré par diffusion dynamique de la lumière (b) diamètre mesuré par microscopie électronique à transmission (c) indice de polydispersité ND non déterminé b) Pourcentage massique de ferrite encapsulée dans le polymère et le temps de séparation code % masse ferrite % masse ferrite tps de séparation aimantation complexométrie min(*) ENC10 35 43 PROBE, Magnetic separation unit catalog&num;1639, San Diego. Les colloïdes obtenus sont stables, monodisperses et présentent un temps de séparation sous l'action d'un champ magnétique inférieur à 30 min, et plus particulièrement inférieur à 5 min (ENCl6). Les tailles obtenues sont reproductibles d'une synthèse à l'autre, sont comprises entre 0,1 et 10 ssm et la distribution en taille au sein d'une même préparation est très étroite (IP REVENDICATIONS 1. Particules superparamagnétiques, monodisperses, ayant une taille prédéterminée comprise entre 0,1 et 10 Mm, comprenant - un noyau à base d'un premier polymère, - une couche interne dite couche magnétique, recouvrant le noyau, à base d'un second polymère et dans laquelle est distribué un matériau magnétique, et - une couche externe, dite couche d'encapsulation, éventuellement fonctionnalisée, recouvrant la couche magnétique, à base d'un troisième polymère et susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, caractérisées en ce que au moins le second polymère est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 15 et 65 OC et de préférence entre 25 et 500C. 2. Particules selon la revendication 1, caractérisées en ce que le second polymère est obtenu par polymérisation de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, (2) au moins un agent de réticulation et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1). 3. Particules selon la revendication 2, caractérisées en ce que le second polymère est le PNIPAM obtenu par polymérisation de (1) N-isopropylacrylamide, (2) de N,N-méthylène bisacrylamide et (3) chlorure de 2aminoéthyl-méthacrylate. 4. Particules selon la revendication 2 ou 3, caractérisées en ce que le premier polymère est identique au second polymère. 5. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que le premier polymère est différent du second polymère et est un polymère à caractère hydrophobe, tel qu'un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle. 6. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que le troisième polymère est un polymère compatible avec le second polymère et est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le PNIPAM. 7. Particules selon la revendication 6, caractérisées en ce que le troisième polymère est fonctionnalisé et porte un groupe fonctionnel choisi parmi les fonctions carboxylique, aldéhydique, thiol et amine. 8. Particules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles sont de forme essentiellement sphérique. 9. Procédé d'obtention de particules telles que définies selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que - selon une étape (a) dite étape d'obtention du premier polymère, on obtient par polymérisation du ou des monomères appropriés, le premier polymère, - selon une étape (b) dite étape d'obtention du second polymère, on obtient un sol du second polymère, par polymérisation en phase aqueuse de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, (2) au moins un agent de réticulation et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1), - selon une étape (c) dite d'adsorption du matériau magnétique, on met en contact le matériau magnétique avec les premier et second polymères, à une température inférieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (d) dite d'obtention de la couche magnétique, on porte le mélange réactionnel obtenu selon (c) à une température supérieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (e) dite d'encapsulation, on met en contact, en phase aqueuse, le mélange obtenu selon (d) avec le ou les monomères appropriés pour l'obtention par polymérisation du troisième polymère. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on effectue simultanément les étapes (a) et (b). 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce le premier polymère est identique au second polymère. 12. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le premier polymère est différent du second polymère et est un polymère à caractère hydrophobe, tel qu'un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que pour l'étape (b) et éventuellement l'étape (a), le monomère (1) est choisi parmi les N-alkylacrylamides et les N,Ndialkylacrylamides. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le monomère (1) est choisi parmi le N-isopropylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, N-npropylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, Nisopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide, le monomère (1) étant de préférence le N-isopropylacrylamide (NIPAM). 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que pour l'étape (b) et éventuellement l'étape (a), le ou les monomères fonctionnels (3) sont choisis parmi les dérivés acryliques et méthacryliques, le chlorure de 2-aminoéthylméthacrylate (AEM), les dérivés de N-vinyl-pyridine, les dérivés de trialkylammonium et les dérivés de chlorure d'isothiouronium. 16. Procédé selon les revendications 9 ou 10 et 11, caractérisé en ce que pour étape (b) et éventuellement l'étape (a), l'agent de réticulation (2) est hydrosoluble et est choisi parmi le N,N-méthylène bisacrylamide (MBA), l'éthylène glycol diméthacrylate. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que le troisième polymère est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le PNIPAM. 18. Utilisation de particules telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour isoler au moins une molécule biologique, notamment choisie parmi les protéines, les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les polypeptides, les enzymes, les haptènes, les acides nucléiques et les fragments d'acides nucléiques. 19. Utilisation selon la revendication 18, selon laquelle on fixe sur les particules, par adsorption ou par liaison covalente, directement ou indirectement, la ou les molécules biologiques. 20. Procédé pour isoler, dans un échantillon liquide, au moins une molécule biologique, selon lequel - on dispose de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, - on met en contact ledit échantillon avec lesdites particules, par incubation, - on applique un champ magnétique au mélange obtenu, - on sépare les particules de l'échantillon. 21. Réactif pour l'isolement de molécules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend une dispersion en milieu aqueux de particules telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.