Brevet FR2751224A1 — publié le 19980123

FORMULE DE VACCIN POLYNUCLEOTIDIQUE CONTRE LES PATHOLOGIES RESPIRATOIRES ET DE REPRODUCTION DES PORCS La présente invention est relative à une formule de vaccin permettant notamment la vaccination des porcs contre les pathologies respiratoires et de reproduction. Elle est également relative à une méthode de vaccination correspondante. Au cours des dernières décennies, les méthodes de production porcines ont fondamentalement changé. L'élevage intensif en espace clos s'est généralisé avec comme corollaire le développement dramatique des pathologies respiratoires. L'ensemble des symptomes de pathologie respiratoire porcine est en général regroupé sous l'appelation complexe de maladie respiratoire des porcs et implique une grande variété d'agents pathogènes, comprenant aussi bien des virus que des bactéries et des mycoplasmes. Les principaux agents intervenant dans les troubles respiratoires sont Actinobacillus pleuropneumoniae, le virus de l'infertilité et du syndrôme respiratoire (PRRS) encore appelé virus de la maladie mystérieuse, le virus de la maladie d'Aujeszky (PRV) et le virus de la grippe porcine. D'autres virus entraînent des troubles de la reproduction se traduisant par des avortements, des momifications de foetus et de l'infertilité. Les principaux virus sont PRRS, le parvovirus et le virus de la peste porcine classique (HCV). Secondairement ,les virus PRV grippe porcine et A. pleuropneumoniae peuvent aussi entraîner de tels troubles. Des mortalités peuvent intervenir avec A. pleuropneumoniae, HCV et PRV. En outre, les interactions entre les microorganismes sont très importants dans le complexe respiratoire porcin. En effet, la plupart des pathogènes bactériens sont des hôtes habituels des zones nasopharyngées et des amygdales chez le jeune animal. Ces pathogènes, qui proviennent de la truie, sont souvent inhalés par les jeunes porcs durant leurs premières heures de vie, avant que l'immunité colostrale soit devenue efficace. Les organismes résidant dans le tractus respiratoire supérieur peuvent envahir le tractus inférieur lorsque les mécanismes de défense respiratoires de l'hôte sont mis à mal par un agent précurseur tel que Actinobacillus pleuropneumoniae ou par des virus. L'invasion pulmonaire peut être très rapide en particulier dans le cas de pathogènes précurseurs tels que Actiflobacillus pleuropneumoniae qui produisent des cytotoxines puissantes capables d'endommager les cils des cellules épithéliales respiratoires et les macrophages alvéolaires. Des infections virales importantes, telles que influenza, infections à coronavirus respiratoires et virus d'Aujeszky, peuvent jouer un rôle dans la pathogénie du complexe respiratoire, au côté de bactéries à tropisme respiratoire et de mycoplasmes. Enfin certains agents ont une incidence à la fois en respiratoire et en reproduction. Des interactions peuvent aussi se produire sur le plan de la pathologie de la reproduction. I1 paraît donc nécessaire de tenter de mettre au point une prévention efficace contre les principaux agents pathogènes intervenant dans les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs. Les associations développées jusqu'à présent étaient réalisées à partir de vaccins inactivés ou de vaccins vivants et éventuellement de mélanges de tels vaccins. Leur mise en oeuvre pose des problèmes de compatibilité entre valences et de stabilité. I1 faut en effet assurer à la fois la compatibilité entre les différentes valences de vaccin, que ce soit au plan des différents antigènes utilisés au plan des formulations elles-mêmes, notamment dans le cas où l'on combine à la fois des vaccins inactivés et des vaccins vivants. I1 se pose également le problème de la conservation de tels vaccins combiné et aussi de leur innocuité notamment en présence d'adjuvant. Ces vaccins sont en général assez coûteux. Les demandes de brevet WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A94 21797 et WO-A-95 20660 ont fait usage de la technique récemment développée des vaccins polynucléotidiques. On sait que ces vaccins utilisent un plasmide apte à exprimer dans les cellules de l'hôte l'antigène inséré dans le plasmide. Toutes les voies d'administration ont été proposées (intrapéritonéal, intraveineuse, intramusculaire, transcutanée, intradermique, mucosale, etc.). Différents moyens de vaccination peuvent également être utilisés, tels que ADN déposé à la surface de particules d'or et projeté de façon à pénétrer dans la peau de l'animal (Tang et al, . Nature 356, 152-154, 1992) et les injecteurs par jet liquide permettant de transfecter à la fois dans la peau, le muscle, les tissus graisseux et les tissus mammaires (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992). Les vaccins polynucléotidiques peuvent utiliser aussi bien des ADN nus que des ADN formulés par exemple au sein de liposomes de lipides cationiques. M-F Le Potier et al., (Second International Symposium on the Eradication of Aujeszky's Disease (pseudo rabies) Virus August 6th to 8th 1995 Copenhagen, Denmark) et M. Monteil et al. (Les Journées d'Animation Scientifique du Département de Pathologie Animale, INRA-ENV, Ecole Nationale Vétérinaire de LYON, 13-14 déc 1994) ont tenté de vacciner les porcs contre le virus de la maladie d'Aujeszky à l'aide d'un plasmide permettant l'expression du gène gD sous le contrôle d'un promoteur fort, le promoteur majeur tardif de l'adénovirus de type 2. Malgré une réponse en anticorps de bon niveau, aucune protection n'a pu être mise en évidence. Or, des résultats satisfaisants en matière de protection ont été enregistrés après inoculation aux porcs d'un adénovirus recombinant dans lequel a été inséré le gène gD et le même promoteur, prouvant que la glycoprotéine gD serait suffisante pour induire une protection chez le porc. L'art antérieur ne donne aucun résultat de protection chez le porc par la méthode de la vaccination polynucléotidique. L'invention se propose de fournir une formule de vaccin multivalent permettant d'assurer une vaccination des porcs contre un certain nombre d'agents pathogènes intervenant notamment dans la pathologie respiratoire et/ou dans la pathologie de la reproduction. Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin associant différentes valences tout en présentant tous les critères requis de compatibilité et de stabilité des valences entre elles. Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin permettant d'associer différentes valences dans un même véhicule. Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin qui soit de mise en oeuvre aisée et peu coûteuse. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin et une méthode de vaccination des porcs qui permette d'obtenir une protection, y compris une protection multivalente, avec un niveau élevé d'efficacité et de longue durée, ainsi qu'une bonne innocuité et une absence de résidus. La présente invention a donc pour objet une formule de vaccin notamment contre la pathologie respiratoire et/ou de reproduction des porcs, comprenant au moins 3 valences de vaccin polynucléotidique comprenant chacune un plasmide intégrant, de manière à l'exprimer in vivo dans les cellules hôtes, un gène d'une valence de pathogène porcin, ces valences étant choisies parmi celles du groupe consistant en virus de la maladie d'Aujeszky (virus PRV ou pseudorage), virus de la grippe porcine (virus influenza porcin, SIV), virus de la maladie mystérieuse du porc (virus PRRS), virus de la parvovirose (virus PPV), virus de la peste porcine classique (virus HCV ou Hog Cholera virus) et bactérie responsable de l'actinobacillose (A. pleuropneumoniae), les plasmides comprenant, pour chaque valence, un ou plusieurs des gènes choisis parmi le groupe consistant en gB et gD pour le virus de la maladie d'Aujeszky, HA, NP, N pour le virus de la grippe porcine, ORF5 (E), ORF3, ORF6 (M) pour le virus PRRS, VP2 pour le virus de la parvovirose, El, E2 pour le virus de la peste porcine classique et apxl, apxII et apxIII pour A. pleuropneumoniae. Par valence, dans la présente invention, on entend au moins un antigène assurant une protection contre le virus du pathogène considéré, la valence pouvant contenir, à titre de sous-valence, un ou plusieurs gènes naturels modifiés d'une ou plusieurs souches du pathogène considéré. Par gène d'agent pathogène, on entend non seulement le gène complet, mais aussi les séquences nucléotidiques différentes, y compris fragments, conservant la capacité à induire une réponse protectrice. La notion de gène recouvre les séquences nucléotidiques équivalentes à celles décrites précisément dans les exemples, c'est-à-dire les séquences différentes mais codant pour la même protéine. Elle recouvre aussi les séquences nucléotidiques d'autres souches du pathogène considéré, assurant une protection croisée ou une protection spécifique de souche ou de groupe de souche. Elle recouvre encore les séquences nucléotidiques qui ont été modifiées pour faciliter l'expression in vivo par l'animal hôte mais codant pour la même protéine. De manière préférée, la formule de vaccin selon l'invention comprendra les valences Aujeszky et grippe porcine auxquelles on pourra adjoindre d'autres valences, de préférence choisies parmi les valences PRRS et A. pleuropneumoniae (actinobacillose). On pourra leur adjoindre éventuellement d'autres valences choisies parmi les valences parvovirose et peste porcine classique. I1 va de soi que toutes les combinaisons de valences sont possibles. Toutefois, dans le cadre de l'invention, on considère les valences Aujeszky et grippe porcine, puis PRRS et A. pleuropneumoniae comme préférées. Dans l'optique d'une vaccination dirigée plus spécifiquement contre la pathologie respiratoire des porcs, on préférera sélectionner les valences parmi Aujeszky, grippe porcine, PRRS et actinobacillose. Dans l'optique d'un vaccination dirigée spécifiquement contre la pathologie de la reproduction, on préférera choisir les valences parmi PRRS, parvovirose, peste porcine classique et Aujeszky. En ce qui concerne, la valence Aujeszky, on peut mettre en oeuvre l'un ou l'autre des gènes gB et gD. Préférentiellement, on utilise les deux gènes, ceux-ci étant dans ce cas montés dans des plasmides différents ou dans un seul et même plasmide. En ce qui concerne la valence grippe porcine, on préfère mettre en oeuvre les gènes HA et NP. On peut utiliser l'un ou l'autre de ces deux gènes ou les deux gènes simultanément, montés dans des plasmides différents ou dans un seul et même plasmide. De préférence, on associera dans le même vaccin les séquences HA de plus d'une souche de virus influenza, en particulier des différentes souches rencontrées sur le terrain. En revanche, NP assure une protection croisée et l'on pourra donc se contenter de la séquence d'une seule souche du virus. En ce qui concerne la valence PRRS, on préfère utiliser les gènes E et ORF3 ou encore M. On peut utiliser ces gènes seuls ou en combinaison ; dans le cas d'une combinaison, on peut monter les gènes dans des plasmides séparés ou dans des plasmides combinant 2 ou 3 de ces gènes. On pourra avantageusement associer dans le même vaccin des gènes provenant d'au moins deux souches, notamment d'une souche européenne et d'une souche américaine. En ce qui concerne la valence peste porcine classique, on peut utiliser l'un ou l'autre des gènes El et E2 ou également des gènes El et E2 combinés, dans deux plasmides différents ou éventuellement dans un seul et même plasmide. En ce qui concerne la valence actinobacillose, on peut utiliser l'un des trois gènes cités plus haut ou une combinaison de 2 ou 3 de ces gènes, montés dans des plasmides différents ou des plasmides mixtes, afin d'assurer une protection contre les différents sérotypes de A. pleuropneumoniae. Pour les antigènes apxI, II et III, on peut prévoir de modifier les séquences codantes pour obtenir les antigènes détoxifiés, en particulier comme dans les exemples. La formule de vaccin selon l'invention pourra se présenter sous un volume de dose compris de manière générale entre 0,1 et 10 ml, et en particulier entre 1 et 5 ml notamment pour les vaccinations par voie intramusculaire. La dose sera générallement comprise entre 10 ng et 1 mg, de préférence entre 100 ng et 500 Fg et préférentiellement entre 1 Fg et 250 Fg par type de plasmide. On utilisera de préférence des plasmides nus simplement placés dans le véhicule de vaccination qui sera en général de l'eau physiologique (Nacl 0,9 %), de l'eau ultrapure, du tampon TE, etc. On peut bien entendu utiliser toutes les formes de vaccin polynucléotidiques décrites dans l'art antérieur. Chaque plasmide comprend un promoteur apte à assurer l'expression du gène inséré sous sa dépendance dans les cellules hôtes. Il s'agira en général d'un promoteur eucaryote fort et en particulier d'un promoteur précoce du cytomégalovirus CMV-IE, d'origine humaine ou murine, ou encore éventuellement d'une autre origine telle que rat, cochon, cobaye. De manière plus générale, le promoteur pourra être soit d'origine virale, soit d'origine cellulaire. Comme promoteur viral, on peut citer le promoteur précoce ou tardif du virus SV40 ou le promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous. I1 peut aussi s'agir d'un promoteur du virus dont provient le gène, par exemple le promoteur propre au gène. Comme promoteur cellulaire, on peut citer le promoteur d'un gène du cytosquelette, par exemple le promoteur de la desmine (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122 ; et ZHENLIN et al., Gene, 1989, 78, 243-254), ou encore le promoteur de l'actine. Lorsque plusieurs gènes sont présents dans le même plasmide, ceux-ci peuvent être présentés dans la même unité de transcription ou dans deux unités différentes. La combinaison des différentes valences du vaccin selon l'invention peut être effectuée, de préférence, par le mélange de plasmides polynucléotidiques exprimant le ou les antigène(s) de chaque valence, mais on peut également prévoir de faire exprimer des antigènes de plusieurs valences par un même plasmide. L'invention a encore pour objet des formules de vaccin monovalent comprenant un ou plusieurs plasmides codant pour un ou plusieurs gènes de l'un des virus choisis parmi le groupe consistant en PRV, PRRS, PPV, HCV et A. pleuropneumoniae, les gènes étant ceux décrits plus haut. En dehors de leur caractère monovalent, ces formules peuvent reprendre les caractéristiques énoncées plus haut en ce qui concerne le choix des gènes, leurs combinaisons, la composition des plasmides, les volumes de dose, les doses, etc. Les formules de vaccin monovalent peuvent être utilisées (i) pour la préparation d'une formule de vaccin polyvalent tel que décrit plus haut, (ii) à titre individuel contre la pathologie propre, (iii) associées à un vaccin d'un autre type (entier vivant ou inactivé, recombinant, sous-unité) contre une autre pathologie, ou (iv) comme rappel d'un vaccin comme décrit ci-après. La présente invention a en effet encore pour objet l'utilisation d'un ou de plusieurs plasmides selon l'invention pour la fabrication d'un vaccin destiné à vacciner les porcs primo-vaccinés au moyen d'un premier vaccin classique du type de ceux de la technique antérieure, à savoir notamment choisi dans le groupe consistant en vaccin entier vivant, vaccin entier inactivé, vaccin de sous-unité, vaccin recombinant, ce premier vaccin (monovalent ou multivalent) présentant (c'est-àdire contenant ou pouvant exprimer) le ou les antigène(s) codé(s) par le ou les plasmides ou antigène(s) assurant une protection croisée. De manière remarquable, le vaccin polynucléotidique a un effet de rappel puissant se traduisant par une amplification de la réponse immunitaire et l'installation d'une immunité de longue durée. De manière générale, les vaccins de primo-vaccination pourront être choisis parmi les vaccins commerciaux disponibles auprès des différents producteurs de vaccins vétérinaires. L'invention a aussi pour objet un kit de vaccination regroupant un vaccin de primo-vaccination' tel que décrit cidessus et une formule de vaccin selon l'invention pour le rappel. Elle a aussi trait à une formule de vaccin selon l'invention accompagnée d'une notice indiquant l'usage de cette formule comme rappel d'une primo-vaccination telle que décrite ci-avant. La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination des porcs contre la pathologie respiratoire et/ou la pathologie de la reproduction des porcs, comprenant l'administration d'une dose efficace d'une formule de vaccin telle que décrit plus haut. Cette méthode de vaccination comprend l'administration d'une ou de plusieurs doses de la formule de vaccin, ces doses pouvant être administrées successivement dans un court laps de temps et/ou successivement à des moments éloignés l'un de l'autre. Les formules de vaccin selon l'invention pourront être administrées dans le cadre de cette méthode de vaccination, par les différentes voies d'administration proposées dans l'art antérieur pour la vaccination polynucléotidique et au moyen des techniques d'administration connues. On pourra notamment utiliser la vaccination par voie intradermique à l'aide d'un injecteur par jet liquide, de préférence par jets multiples, et en particulier un injecteur utilisant une tête d'injection munie de plusieurs trous ou buses, notamment comprenant de 5 à 6 trous ou buses, tel que l'appareil Pigjet fabriqué et distribué par la société Endoscoptic, Laons, France. Le volume de dose pour un tel appareil sera réduit de préférence entre 0,1 et 0,9 ml, en particulier entre 0,2 et 0,6 ml et avantageusement entre 0,4 et 0,5 ml, le volume pouvant être appliqué en une ou plusieurs, de préférence 2, applications. L'invention a encore pour objet la méthode de vaccination consistant à faire une primo-vaccination telle que décrite cidessus et un rappel avec une formule de vaccin selon l'invention. Dans une forme de mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, on administre dans un premier temps, à l'animal, une dose efficace du vaccin de type classique, notamment inactivé, vivant, atténué ou recombinant, ou encore un vaccin de sous-unité de façon à assurer une primovaccination, et, après un délai de préférence de 2 à 6 semaines, on assure l'administration du vaccin polyvalent ou monovalent selon l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détails à laide de modes de réalisation de l'invention pris en référence aux dessins annexés. Liste des figures Figure NO 1 : Plasmide pVR1012 Figure N 2 : Séquence du gène PRV gB (souche NIA3) Figure N 3 : Construction du plasmide pAB090 Figure N 4 : Séquence du gène PRV gD (souche NIA3) Figure N 5 : Construction du plasmide pPB098 Figure N 6 : Séquence du gène Grippe porcine HA (souche H1 N1) Figure N 7 : Construction du plasmide pPB143 Figure N 8 : Séquence du gène Grippe porcine NP (souche Hi H1N1) Figure N 9 : Construction du plasmide pPB142 Figure N 10 : Séquence du gène Grippe porcine HA (souche H3N2) Figure N 11 : Construction du plasmide pPB144 Figure N 12 : Séquence du gène Grippe porcine NP (souche H3N2) Figure N 13 : Construction du plasmide pPB132 Figure NO 14 : Plasmide pAB025 Figure NO 15 : Plasmide pAB001 Figure NO 16 : Plasmide pAB091 Figure NO 17 : Plasmide pAB092 Figure N 18 : Plasmide pAB004 Figure NO 19 : Plasmide pAB069 Figure NO 20: Plasmide pAB061 Figure NO 21: Plasmide pPB162 Figure N 22 : Plasmide pPB163 Figure NO 23 : Plasmide pPB174' Figure NO 24 : Plasmide pPB189 Figure NO 25 : Plasmide pPB190 Liste des séquences SEQ ID N SEQ ID N 1: Séquence du gène PRV gB (souche NIA3) SEQ ID NO 2 : Oligonucléotide AB166 SEQ ID NO 3 : Oligonucléotide AB167 SEQ ID NO 4 : Oligonucléotide AB168 SEQ ID N 5: Oligonucléotide AB169 SEQ ID N 6 : Séquence du gène PRV gD (souche NIA3) SEQ ID NO 7 : Oligonucléotide PB101 SEQ ID N 8 : Oligonucléotide PB102 SEQ ID N 9: Oligonucléotide PB107 SEQ ID N 10: Oligonucléotide PB108 SEQ ID N 11 : Séquence du gène grippe porcine HA (souche H1N1) SEQ ID NO 12 : Oligonucléotide PB097 SEQ ID N 13 : Oligonucléotide PB098 SEQ ID N 14 : Séquence du gène grippe porcine NP (souche Hi H1N1) SEQ ID NO 15 : Oligonucléotide PB095 SEQ ID N 16 : Oligonucléotide PB096 SEQ ID N 17 : Séquence du gène grippe porcine HA (souche H3N2) SEQ ID N 18 : Séquence du gène grippe porcine NP (souche H3N2) SEQ ID NO 19 : Oligonucléotide AB055 SEQ ID NO 20 : Oligonucléotide AB056 SEQ ID N 21 : Oligonucléotide AB001 SEQ ID NO 22 : Oligonucléotide AB002 SEQ ID NO 23 : Oligonucléotide AB170 SEQ ID N 24 : Oligonucléotide AB171 SEQ ID NO 25 : Oligonucléotide AB172 SEQ ID NO 26 : Oligonucléotide AB173 SEQ ID N 27 : Oligonucléotide AB007 SEQ ID NO 28 : Oligonucléotide AB010 SEQ ID NO 29 : Oligonucléotide AB126 SEQ ID NO 30 : Oligonucléotide AB127 SEQ ID N 31 : Oligonucléotide AB118 SEQ ID N 32 : Oligonucléotide AB119 SEQ ID N 33 : Oligonucléotide PB174 SEQ ID N 34 : Oligoncléotide PB189 SEQ ID N 35 : Oligonucléotide PB190 SEQ ID N 36 : Oligonucléotide PB175 SEQ ID N 37 : Oligonucléotide PB176 SEQ ID N 38 : Oligonucléotide PB191 SEQ ID N 39 : Oligonucléotide PB192 SEQ ID N 40 : Oligonucléotide PB177 SEQ ID N 41: Oligonucléotide PB278 SEQ ID N 42 : Oligonucléotide PB279 SEQ ID N 43 : Oligonucléotide PB280 SEQ ID N 44 : Oligonucléotide PB307 SEQ ID N 45 : Oligonucléotide PB303 SEQ ID N 46 : Oligonucléotide PB306 SEQ ID N 47 : Oligonucléotide PB304 SEQ ID N 48 : Oligonucléotide PB305 EXEMPLES Exemple 1 : Culture des virus Les virus sont cultivés sur le système cellulaire approprié jusqu'à obtention d'un effet cytopathique. Les systèmes cellulaires à utiliser pour chaque virus sont bien connus de l'homme du métier. Brièvement, des cellules sensibles au virus utilisé, cultivées en milieu minimum essentiel de Eagle (milieu "MEM) ou un autre milieu approprié, sont inoculées avec la souche virale étudiée en utilisant une multiplicité d'infection de 1. Les cellules infectées sont alors incubées à 370C pendant le temps nécessaire à l'apparition d'un effet cytopathique complet (en moyenne 36 heures). Exemple 2 : Culture des bactéries et extraction de l'ADN bactérien Les souches d 'Actinobacillus pleuropneumoniae ont été cultivées comme décrit par A. Rycroft et al. (J. Gen. Microbiol. 1991. 137. 561-568). L'ADN de haut poids moléculaire (ADN chromosomique) a été préparé selon les techniques standards décrites par J. Sambrook et al. (Moiecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Exemple 3 : Extraction des ADNs génomiques viraux: Après culture, le surnageant et les cellules lysées sont récoltées et la totalité de la suspension virale est centrifugée à 1000 g pendant 10 minutes à + 40C pour éliminer les débris cellulaires. Les particules virales sont alors récoltées par ultracentrifugation à 400000 g pendant 1 heure à + 40C. Le culot est repris dans un volume minimum de tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8,0). Cette suspension virale concentrée est traitée par la protéinase K (100,ug/ml final) en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS) (0,5% final) pendant 2 heures à 370C. L'ADN viral est ensuite extrait avec un mélange de phénol/chloroforme, puis précipité avec 2 volumes d'éthanol absolu. Après une nuit à - 200C, I'ADN est centrifugé à 10000 g pendant 15 minutes à + 40C. Le culot d'ADN est séché, puis repris dans un volume minimum d'eau ultrapure stérile. Il peut alors être digéré par des enzymes de restriction. Exemple 4 : Isolement des ARNs génomiques viraux Les virus à ARN ont été purifiés selon les techniques bien connues de l'homme du métier. L'ARN viral génomique de chaque virus a été ensuite isolé en utilisant la technique d'extraction "thiocyanate de guanidium/phénolchloroforme" décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). Exemple 5 : Techniques de biologie moléculaire Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par J. Sambrook et a!. (Moiecu/ar Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (bol0101 Inc. La Jolla, CA). Exemple 6 Technique de RT-PCR Des oligonucléotides spécifiques (comportant à leurs extrémités 5' des sites de restriction pour faciliter le clonage des fragments amplifiés) ont été synthétisés de telle façon qu'ils couvrent entièrement les régions codantes des gènes devant être amplifiés (voir exemples spécifiques). La réaction de transcription inverse (RT) et l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont été effectuées selon les techniques standards (J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Chaque réaction de RT-PCR a été faite avec un couple d'amplimers spécifiques et en prenant comme matrice l'ARN génomique viral extrait. L'ADN complémentaire amplifié a été extrait au phénol/chloroforme/aîcool isoamylique (25:24:1) avant d'être digéré par les enzymes de restriction. Exemple 7 : plasmide pVR1012 Le plasmide pVR1012 (Figure NO 1) a été obtenu auprès de Vical Inc. San Diego, CA, USA. Sa construction a été décrite dans J. Hartikka et ai. (Human Gene Therapy. 1996. 7. 1205-1217). Exemple 8 : Construction du plasmide pABO9O (gène PRV gB) Le plasmide pPR2.15 (M. Rivière et al. J. Virol. 1992. 66. 3424-3434) a été digéré avec Apal et Nael pour libérer un fragment Apal-Nael de 2665 pb (fragment A) contenant le gène codant pour la glycoprotéine gB du virus de la maladie d'Aujeszky (Souche NIA3) (Figure N 2 et SEQ ID N 1). Par hybridation des 2 oligonucléotides suivants: AB166 (33 mer) (SEQ ID N 2) 5'GATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC 3' AB167 (33 mer) (SEQ ID N 3) 5'ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 3' un fragment de 33 pb contenant la séquence du gène gD, du codon initial ATG jusqu'au site Apal a été reconstitué, avec création d'un site Pstl en 5' (fragment B). Par hybridation des 2 oligonucléotides suivants: AB168 (45 mer) (SEQ ID NO 4) 5'GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTAGG 3' AB169 (49 mer) (SEQ ID N 5) 5'GATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTGGTAGTGCC 3' un fragment de 45 pb contenant la séquence du gène gD, du site Nael au codon stop TAG a été reconstitué, avec création d'un site BamHI en 3' (fragment C). Les fragments A, B et C ont été ligaturés ensemble dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par Pstl et BamHI, pour donner le plasmide pAB090 (7603 pb) (Figure N 3). Exemple 9 : Construction du plasmide pPB098 (gène PRV gD) Le plasmide pPR29 (M. Rivière et al. J. Virol. 1992. 66. 3424-3434) a été digéré par Sall et Bg/ll pour libérer un fragment Sall-Bgill de 711 pb (fragment A) contenant la partie 3' du gène codant pour la glycoprotéine gD du virus de la maladie d'Aujeszky (Souche NIA3) (Figure N 4 et SEQ ID N 6). Le plasmide pPR29 a été digéré par Eco47III et Sa/l pour libérer un fragment Eco47111-Sall de 498 pb contenant la partie 5' du gène codant pour la glycoprotéine gD du virus de la maladie d'Aujeszky (Souche NIA3) (fragment B). Par hybridation des 2 oligonucléotides suivants: PB101 (15 mer) (SEQ ID N 7) 5'GATGCTGCTCGCAGC 3' PB102 (19 mer) (SEQ ID N 8) 5'GCTGCGAGCAGCATCTGCA 3' un fragment de 15 pb contenant la séquence 5' du gène gD, du codon initial ATG jusqu'au site Eco47III a été reconstitué, avec création d'un site Pstl en 5' (fragment C). Après purification, les fragments A, B et C ont été ligaturés ensemble dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par Pstl et Bill, pour donner le plasmide pPB098 (6076 pb) (Figure N 5). Exemple 10 : Construction du plasmide pPB143 (gène Grippe porcine HA souche H1N1) Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe porcine (souche SIV H1N1 "SW"), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: PB107 (32 mer) (SEQ ID N 9) 5'GTTCTGCAGCACCCGGGAGCAAAAGCAGGGGA 3' PB108 (33 mer) (SEQ ID N 10) 5'ATTGCGGCCGCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la protéine HA du SIV H1N1 (Figure N 6 et SEQ ID N 11) sous la forme d'un fragment PCR de 1803 pb. Après purification, ce fragment a été ligaturé avec le vecteur PCRII-direct (Invitrogen Référence K2000-01), pour donner le vecteur pPB137 (5755 pb). Le vecteur pPB137 a été digéré par EcoRV et Notl pour libérer un fragment EcoRV-Notl de 1820 pb contenant le gène HA. Ce fragment a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par EcoRV et Notl, pour donner le plasmide pPB143 (6726 pb) (Figure N 7). Exemple 11 : Construction du plasmide pPB142 (gène Grippe porcine NP souche H1N1) Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe porcine (souche SIV Hi Ni "SW"), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: PB097 (36 mer) (SEQ ID N 12) 5'CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098 (33 mer) (SEQ ID N 13) 5 'TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la protéine NP du SIV H1N1 (Figure N 8 et SEQ ID N 14) sous la forme d'un fragment Sall-Notl. Après purification le produit de RT-PCR de 1566 pb a été ligaturé avec le vecteur PCRII-direct (Invitrogen Référence K2000-01), pour donner le vecteur pPB127 (5519 pb). Le vecteur pPB127 a été digéré par Sa/l et Notl pour libérer un fragment Sall Notl de 1560 pb contenant le gène NP. Ce fragment a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par Sa/l et Notl, pour donner le plasmide pPB142 (6451 pb) (Figure N 9). Exemple 12 : Construction du plasmide pPB144 (gène Grippe porcine HA souche H3N2) Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe porcine (souche SIV H3N2 Côtes du Nord 1987), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: PB095 (31 mer) (SEQ ID N 15) 5'GTTCTGCAGGCAGGGGATAATTCTATCAACC 3' PB096 (36 mer) (SEQ ID NO 16) 5'TTGCGGCCGCAAGGGTGTTTTTAATTACTAATATAC 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la protéine HA du SIV H3N2 (Figure N 10 et SEQ ID N 17) sous la forme d'un fragment Pstl-Notl. Après purification, le produit de RT-PCR de 1765 pb a été ligaturé avec le vecteur PCRII-direct (Invitrogen Référence K2000-01) pour donner le vecteur pPB120 (5716 pb). Le vecteur pPB120 a été digéré par Notl pour libérer un fragment Notl-Notl de 1797 pb contenant le gène HA. Ce fragment a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par Notl, pour donner le plasmide pPB144 (6712 pb) contenant le gène HA H3N2 dans l'orientation correcte par rapport au promoteur (Figure N 11). Exemple 13 : Construction du plasmide pPB132 (gène Grippe porcine NP souche H3N2) Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec 'ARN génomique du virus de la grippe porcine (souche SIV H3N2 Côtes du Nord 1987), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: PB097 (36 mer) (SEQ ID N 12) 5'CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098 (33 mer) (SEQ ID N 13) 5 ' TTG CGGCCGCTGTAGAAACAAGG GTATTTTTCT 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la protéine NP du SIV H3N2 (Figure N 12 et SEQ ID N 18) sous la forme d'un fragment Sall-Notl. Après purification le produit de RT-PCR de 1564 pb a été ligaturé avec le vecteur PCRII-direct (Invitrogen Référence K2000-01) pour donner le vecteur pPB123 (5485 pb). Le vecteur pPB123 a été digéré par Sall et Notl pour libérer un fragment Sall Notl de 1588 pb contenant le gène NP. Ce fragment a ensuite été ligaturé dans le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré par Sall et Notl, pour donner le plasmide pPB132 (6449 pb) (Figure N 13). Exemple 14 : Construction du plasmide pAB025 (gène PRRSV ORF5) souche Lelystad. Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus PRRSV (Souche Lelystad) (J. Meulenberg et ai. Virology. 1993. 19. 62-72), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB055 (34 mer) (SEQ ID N 19) 5 ' ACG CGTCGACAATATGAGATGTTCTCACAAATTG 3' AB056 (33 mer) (SEQ ID N 20) 5'CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAGC 3' en vue d'isoler précisément le gène "ORF5" codant pour la glycoprotéine d'enveloppe E (gp25) du virus PRRS souche Lelystad. Après purification, le produit de RT-PCR de 630 pb a été digéré par Sall et BamHI pour isoler un fragment Sall-BamHI de 617 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sall et BamHI, pour donner le plasmide pAB025 (5486 pb) (Figure N 14). Exemple 15 : Construction du plasmide pAB001 PRRSV ORF5 souche USA Une réaction de RT-PCR selon la techique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec 'ARN génomique du virus PRRSV (Souche ATCC-VR2332) (M. Murtaugh et al. Arch Virol. 1995. 140. 1451-1460), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB001 (30 mer) (SEQ ID N 21) 5'AACTGCAGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG 3' AB002 (30 mer) (SEQ ID N 22) 5'CGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC 3' en vue d'isoler précisément le gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe E ("gp25") du virus PRRS souche ATCC-VR2332. Après purification, le produit de RT-PCR de 620 pb a été digéré par Pstl et BamHI pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 606 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Pstl et BamHI, pour donner le plasmide pAB001 (5463 pb) (Figure N 15). Exemple 16 : Construction du plasmide pABO9l (gène PPRSV ORF3) souche Lelystad. Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus PRRSV (Souche Lelystad) (J. Meulenberg et ai. Virology. 1993. 19. 62-72), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB170 (32 mer) (SEQ ID NO 23) 5'AAACTGCAGCAATGGCTCATCAGTGTGCACGC 3' AB171 (30 mer) (SEQ ID N 24) 5 ' CG CG GATCCTTATCGTGATGTACTGGG GAG 3' en vue d'isoler précisément le gène "ORF3" codant pour la glycoprotéine d'enveloppe "gp45" du virus PRRS souche Lelystad. Après purification, le produit de RT-PCR de 818 pb-a été digéré par Pstl et BamHI pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 802 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Pstl et BamHI, pour donner le plasmide pABO91 (5660 pb) (Figure N 16). Exemple 17 : Construction du plasmide pAB092 (gène PPRSV ORF3 souche USA. Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus PRRSV (Souche ATCC-VR2332) (M. Murtaugh et ai. Arch Virol. 1995. 140. 1451-1460), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB172 (32 mer) (SEQ ID N 25) 5, AAACTGCAG CAATGGTTAATAG CTGTACATTC 3' AB173 (32 mer) (SEQ ID N 26) 5'CGCGGATCCCTATCGCCGTACGGCACTGAGGG 3' en vue d'isoler précisément le gène "ORF3" codant pour la glycoprotéine d'enveoppe "gp45" du virus PRRS souche ATCC-VR2332. Après purification, le produit de RT-PCR de 785 pb a été digéré par Pstl et BamHI pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 769 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Pstl et BamHI, pour donner le plasmide pAB092 (5627 pb) (Figure NO 17). Exemple 18 : Construction du plasmide pAB004 (gène Parvovirus porcin VP2). Une réaction RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du parvovirus porcin (Souche NADL2) (J. Vasudevacharya et ai. Virology. 1990. 178. 611-616), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB007 (33 mer) (SEQ ID N 27) 5 ' AAAACTGCAGAATGAGTG AAAATGTG GAACAAC 3' ABO10 (33 mer) (SEQ ID N 28) 5' CG CGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG 3' pour amplifier un fragment de 1757 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 du parvovirus porcin. Après purification le produit de RT-PCR a été digéré par Pstl et BamHI pour donner un fragment Pstl-BamHI de 1740 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Pstl et BamHI, pour donner le plasmide pAB004 (6601 pb) (Figure N 18). Exemple 19 : Construction du plasmide pAB069 (gène Peste porcine HCV El). Une réaction RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la peste porcine (Hog Cholera Virus) (HCV) (Souche Alfort) (G. Meyers et ai., Virology. 1989. 171. 18-27), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB126 (36 mer) (SEQ ID N 29) 5'ACGCGTCGACATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTTGGC 3' AB127 (34 mer) (SEQ ID N 30) 5'CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTTGTGCCCCGGTC 3' pour isoler la séquence codant pour la protéine El du virus HCV sous la forme d'un fragment RT-PCR de 1363 pb. Après purification, ce fragment a été digéré par Sall et BamHI pour donner un fragment Sall-BamHI de 1349 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec San et BamHI, pour donner le plasmide pAB069 (6218 pb) (Figure N 19). Exemple 20 : Construction du plasmide pABO6l (gène Peste porcine HCV E2). Une réaction RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la peste porcine (Hog Cholera Virus) (HCV) (Souche Alfort) (G. Meyers et ai., Virology. 1989. 171. 18-27), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB118 (36 mer) (SEQ ID N 31) 5'ACGCGTCGACATGTCAACTACTGCGTTTCTCATTTG 3' AB119 (33 mer) (SEQ ID N 32) 5'CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCTG 3' pour isoler la séquence codant pour la protéine E2 du virus HCV sous la forme d'un fragment RT-PCR de 1246 pb. Après purification, ce fragment a été digéré par Salol et BamHI pour donner un fragment Sall-BamHI de 1232 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Salol et BamHI, pour donner le plasmide pAB061 (6101 pb) (Figure N 20). Exemple 21 : Construction du plasmide pPB162 (gène Actinobacillus pleuropneumoniae apxl délété). Le gène apxl d'Actinobacillus pleuropneumoniae a été cloné de façon à déléter la région en acides aminés riche en glycine (impliquée dans la fixation de l'ion calcium) comprise entre les acides aminés 719 et 846. Une réaction de PCR a été réalisée avec I'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 1) (J. Frey et a/., Infect. Immun. 1991. 59. 30263032), préparé selon la technique décrite dans les exemples 2 et 3, et avec les oligonucléotides suivants: PB174 (32 mer) (SEQ ID N 33) 5'TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGACAACATG 3' PB189 (29 mer) (SEQ ID NO 34) 5 'TTG AATTCTTCTTCAACAGAATGTAATTC 3' pour amplifier la partie 5' du gène apxl codant pour la protéine hémolysine I d' Actinobacillus pleuropneumoniae, sous la forme d'un fragment Sall-EcoRI. Après purification, le produit de PCR de 2193 pb a été digéré par Sa/l et EcoRI pour isoler un fragment Sall-EcoRI de 2183 pb (fragment A). Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 1) (J. Frey et ai., Infect. Immun. 1991. 59. 30263032) et avec les oligonucléotides suivants: PB190 (31 mer) (SEQ ID N 35) 5'TTGAATTCTATCG CTACAGTAAGGAGTACG G 3' PB175 (31 mer) (SEQ ID N 36) 5'TTGGATCCGCTATTTATCATCTAAAAATAAC 3' pour amplifier la partie 3' du gène apxl codant pour la protéine hémolysine I Actinobacillus pleuropneumoniae, sous la forme d'un fragment EcoRI-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 576 pb a été digéré par EcoRI et BamHI pour isoler un fragment EcoRI-BamHI de 566 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/l et BamHI, pour donner le plasmide pPB162 (7619 pb) (Figure N 21). Exemple 22 : Construction du plasmide pPB163 (gène Actinobacillus pleuropneumoniae apxll délété). Le gène apxll d'Actinobacillus pleuropneumoniae a été cloné de façon à déléter la région en acides aminés riche en glycine (impliquée dans la fixation de l'ion calcium) comprise entre les acides aminés 716 et 813. Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 9) (M. Smits et a/., Infection and lmmunity. 1991. 59. 4497-4504), préparé selon la technique décrite dans les exemples 2 et 3, et avec les oligonucléotides suivants: PB176 (31 mer) (SEQ ID N 37) 5'TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC 3' PB191 (30 mer) ISEQ ID NO 38) 5 'TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG 3' pour amplifier la partie 5' du gène apxll codant pour la protéine hémolysine Il d' Actinobacillus pleuropneumoniae, sous la forme d'un fragment Sall-EcoRI. Après purification, le produit de PCR de 2190 pb a été digéré par Sall et EcoRI pour isoler un fragment Sall-EcoRI de 2180 pb (fragment A). Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actînobaclllus pleuropneumoniae (Sérotype 9) (M. Smits et al., Infection and Immunity. 1991. 59. 4497-4504) et avec les oligonucléotides suivants: PB192 (29 mer) (SEQ ID N 39) 5'TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC 3' PB177 (30 mer) (SEQ ID N 40) 5'TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTTG 3' pour amplifier la partie 3' du gène apxII codant pour la protéine hémolysine Il d' Actinobacillus pleuropneumoniae, sous la forme d'un fragment EcoRI-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 473 pb a été digéré par EcoRI et BamHI pour isoler un fragment EcoRI-BamHI de 463 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/l et BamHI, pour donner le plasmide pPB163 (7513 pb) (Figure N 22). Exemple 23 : Construction des plasmides pPB174', pPB189 et pPBl9O (gène Actinobacillus pleuropneumoniae apxIII d élété). Premier exemple de délétion dans Axill (plasmide pPB174'): Le gène apxIII d'Actinobacillus pleuropneumoniae a été cloné de facon à déléter la région en acides aminés riche en glycine (impliquée dans la fixation de l'ion calcium) comprise entre les acides aminés 733 et 860. Une réaction de PCR a été réalisée avec 'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits 1992. NO d'accès séquence Genbank = X68815), préparé selon la technique décrite dans les exemples 2 et 3, et avec les oligonucléotides suivants: PB278 (30 mer) (SEQ ID N 41) 5'TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3' PB279 (29 mer) (SEQ ID N 42) 5'TTTATCGATTCTTCTACTGAATGTAATTC 3' pour amplifier la partie 5' du gène apxill (codant pour la protéine hémolysine III d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Sall-Clal. Après purification, le produit de PCR de 2216 pb a été digéré par Sall et Ctal pour isoler un fragment Saîl-Clal de 2205 pb (fragment A). Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits. 1992. NO d'accès séquence Genbank = X68815) et avec les oligonucléotides suivants: PB280 (33 mer) (SEQ ID N 43) 5'TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG 3' PB307 (32 mer) (SEQ ID N 44) 5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' pour amplifier la partie 3' du gène apxill (codant pour la protéine hémolysine III d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Clal-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 596 pb a été digéré par C/aI et BamHI pour isoler un fragment Clal-BamHI de 583 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sall et BamHI, pour donner le plasmide pPBî74' (7658 pb) (Figure N 23). Deuxième exemple de délétion dans Apxill (plasmide pPB189) Le gène apxill d'Actinobacillus pleuropneumoniae a été cloné de façon à déléter la région en acides aminés riche en glycine (impliquée dans la fixation de l'ion calcium) comprise entre les acides aminés 705 et 886. Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits. 1992. NO d'accès séquence Genbank = X68815), préparé selon la technique décrite dans les exemples 2 et 3, et avec les oligonucléotides suivants: PB278 (30 mer) (SEQ ID N 41) 5 'TTTGTCGACATG AGTACTTG GTCAAG CATG 3' PB303 (32 mer) (SEQ ID N 45) 5'TTTATCGATTTCTTCACGTTTACCAACAGCAG 3' pour amplifier la partie 5' du gène apxlll (codant pour la protéine hémolysine lil d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Sall-Clal. Après purification, le produit de PCR de 2133 pb a été digéré par Sall et C/aI pour isoler un fragment Sall-Clal de 2122 pb (fragment A). Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits. 1992. NO d'accès séquence Genbank = X68815) et avec les oligonucléotides suivants: PB306 (31 mer) (SEQ ID N 46) 5 'TTTATCGATTCTGATTTTTCCTTCGATCGTC 3' PB307 (32 mer) (SEQ ID N 44) 5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' pour amplifier la partie 3' du gène apxIII (codant pour la protéine hémolysine III d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Clal-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 518 pb a été digéré par C/al et BamHI pour isoler un fragment Clal-BamHI de 506 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sall et BamHI, pour donner le plasmide pPB189 (7496 pb) (Figure N 24). Troisième exemple de délétion dans Apxlll (plasmide pPB190) : Le gène apxill d'Actinobacillus pleuropneumoniae a été cloné de façon à déléter la région en acides aminés riche en glycine (impliquée dans la fixation de l'ion calcium) comprise entre les acides aminés 718 et 876. Une réaction de PCR a été réalisée avec I'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits. 1992. N d'accès séquence Genbank = X68815), préparé selon la tecnique décrite dans les exemples 2 et 3, et avec les oligonucléotides suivants: PB278 (30 mer) (SEQ ID N 41) 5 'TTTGTCGACATGAGTACTTG GTCAAG CATG 3' PB304 (33 mer) (SEQ ID N 47) 5'TTTATCGATACCTGATTGCGTTAATTCATAATC 3' pour amplifier la partie 5' du gène apxIII (codant pour la protéine hémolysine III d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Sall-Clal. Après purification, le produit de PCR de 2172 pb a été digéré par Sall et Clal pour isoler un fragment Sall-Clal de 2161 pb (fragment A). Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique d'Actinobacillus pleuropneumoniae (Sérotype 8) (M. Smits. 1992. NO d'accès séquence Genbank = X68815) et avec les oligonucléotides suivants: PB305 (31 mer) (SEQ ID NO 48) 5'TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC 3' PB307 (32 mer) (SEQ ID N 44) 5 ' TTG GATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAG GTTACC 3' pour amplifier la partie 3' du gène apxlll (codant pour la protéine hémolysine III d' Actinobacillus pleuropneumoniae) sous la forme d'un fragment Clal-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 548 pb a été digéré par Clal et BamHI pour isoler un fragment Clal-BamHI de 536 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Sall et BamHI, pour donner le plasmide pPB190 (7565 pb) (Figure N 25). Exemple 24: Préparation et purification des plasmides Pour la préparation des plasmides destinés à la vaccination des animaux, on peut utiliser toute technique permettant d'obtenir une suspension de plasmides purifiés majoritairement sous forme superenroulée. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art. On peut citer en particulier la technique de lyse alcaline suivie de deux ultracentrifugations successives sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium telle que décrite dans J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). On peut se référer également aux demandes de brevet PCT WO 95/21250 et PCT WO 96/02658 qui décrivent des méthodes pour produire à l'échelle industrielle des plasmides utilisables pour la vaccination. Pour les besoins de la fabrication des vaccins (voir exemple 17), les plasmides purifiés sont resuspendus de manière à obtenir des solutions à haute concentration ( > 2 mg/ml) compatibles avec le stockage. Pour ce faire, les plasmides sont resuspendus soit en eau ultrapure, soit en tampon TE (Tris-HCI 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). Exemple 25 : Fabrication des vaccins associés Les divers plasmides nécessaires à la fabrication d'un vaccin associé sont mélangés à partir de leurs solutions concentrées (exemple 16). Les mélanges sont réalisés de telle manière que la concentration finale de chaque plasmide corresponde à la dose efficace de chaque plasmide. Les solutions utilisables pour ajuster la concentration finale du vaccin peuvent être soit une solution NACI à 0,9 % , soit du tampon PBS. Des formulations particulières telles que les liposomes, les lipides cationiques, peuvent aussi être mises en oeuvre pour la fabrication des vaccins. Exemple 26 : Vaccination des porcs Les porcs sont vaccinés avec des doses de 100 ug, 250 ug ou 500 ug par plasmide. Les injections peuvent être réalisées à l'aiguille par voie intramusculaire. Dans ce cas, les doses vaccinales sont administrées sous un volume de 2 ml. Les injections peuvent être réalisées par voie intradermique en utilisant un appareil d'injection à jet liquide (sans aiguille) délivrant une dose de 0,2 ml en 5 points (0,04 ml par point d'injection) (par exemple, appareil "PIGJET"). Dans ce cas, les doses vaccinales sont administrées sous des volumes de 0,2 ou 0,4 ml, ce qui correspond respectivement à une ou à deux administrations. Lorsque deux administrations successives sont pratiquées au moyen de l'appareil PIGJET, ces administrations sont réalisées de manière décalée, de façon à ce que les deux zones d'injection soient séparées l'une de l'autre par une distance d'environ 1 à 2 centimètres. REVENDICATIONS 1. Formule de vaccin porcin contre la pathologie respiratoire et/ou de reproduction des porcs, comprenant au moins 3 valences de vaccin polynucléotidique comprenant chacune un plasmide intégrant, de manière à exprimer in vivo dans les cellules hôtes, un gène d'une valence de pathogène porcin, ces valences étant choisies parmi deux groupes consistant en virus de la maladie d'Aujeszky, virus de la grippe porcine, virus de la maladie mystérieuse du porc, virus de la parvovirose, virus de la peste porcine classique et bactérie responsable de l'actinobacillose, les plasmides comprenant, pour chaque valence, un ou plusieurs des gènes choisis parmi le groupe consistant en gB et gD pour le virus de la maladie d'Aujeszky, HA, NP, N pour le virus de la grippe porcine, E, ORF3, M pour le virus de la maladie mystérieuse, vP2 pour le virus de la parvovirose, El, E2 pour le virus de la pestivirose et apxI, apxII et apxIII pour l'actinobacillose. 2. Formule de vaccin selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les valences Aujeszky et grippe porcine. 3. Formule de vaccin selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus l'une au moins des valences choisies parmi maladie mystérieuse et actinobacillose. 4. Formule de vaccin selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend la valence peste porcine classique. 5. Formule de vaccin selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en plus au moins une valence choisie parmi le groupe des valences maladie mystérieuse, parvovirose et peste porcine classique. 6. Formule de vaccin selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend le gène HA et/ou NP du virus de la grippe porcine. 7. Formule de vaccin selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend le gène E et/ou ORF3 du virus de la maladie mystérieuse. 8. Formule de vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend gB et gD d'Aujesky. 9. Formule de vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle se présente sous un volume de dose compris entre 0,1 et 10 ml, de préférence entre 1 et 5 ml. 10. Formule de vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est adaptée à une administration intradermique par jet liquide, de préférence par jets multiples, sous un volume de dose compris entre 0,1 et 0,9 ml, en particulier entre 0,2 et 0,6 ml, de préférence entre 0,4 et 0,5 ml. 11. Formule de vaccin selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10 ng et 1 mg, de préférence entre 100 ng et 500 Fg, plus préférentiellement encore entre 1 Fg et 250 Rg par type de plasmide. 12. Utilisation d'une formule de vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la fabrication d'un vaccin destiné à vacciner les porcins primo-vaccinés au moyen d'un premier vaccin choisi dans le groupe consistant en vaccin entier vivant, vaccin entier inactivé, vaccin de sous-unité, vaccin recombinant, ce premier vaccin présentant l'antigène codé par le vaccin polynucléotidique ou un antigène assurant une protection croisée. 13. Kit de vaccination regroupant une formule de vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, et un vaccin choisi dans le groupe consistant en vaccin entier vivant, vaccin entier inactivé, vaccin de sous-unité, vaccin recombinant, ce premier vaccin présentant l'antigène codé par le vaccin polynucléotidique ou un antigène assurant une protection croisée, pour une administration de ce dernier en primo-vaccination et pour un rappel avec la formule de vaccin.