Brevet FR2750887A1 — publié le 19980116

La présente invention a trait à un procédé d'élimination des agents transmissibles nonconventionnels (ATNC), également appelés prions, des solutions protéiques, purifiées ou non. L'élimination des prions dans les produits d'origine biologique pose des problèmes très difficiles et aujourd'hui très mal résolus, à quelques exceptions près. Les méthodes d'inactivation aujourd'hui identifiées, telles que le traitement par la soude, par liteau de Javel ou le chauffage à des températures supérieures à 1300C, sont inapplicables à la plupart des substances biologiques qui sont trop fragiles pour supporter de telles conditions physico-chimiques. Les méthodes de séparation en vue d'éliminer les prions peuvent être théoriquement les mêmes que celles appliquées pour les protéines en général, c'est-àdire la filtration, l'adsorption sélective, la chromatographie, l'ultracentrifugation, mais elles se heurtent à une très grande difficulté. Ces méthodes aujourd'hui ne sont pas appliquées quand il s'agit d'éliminer des virus traditionnels, car il reste toujours une partie de l'infectivité, ne serait-ce que minime, mais suffisante pour transmettre la maladie après injection du produit. On leur préfère, à juste titre, les méthodes d'inactivation. Le caractère transmissible des prions est aussi puissant que celui de la plupart des virus et on ne dispose pas aujourd'hui de méthodes de chromatographie connues pour éliminer avec certitude les dernières traces pouvant contaminer une solution protéique complexe. Des méthodes de filtration ont été proposées dans ce but et ont montré leur efficacité quand il s' agit de débarrasser des solutions de protéines de poids moléculaire inférieur à 100 kilodaltons. Au-delà , ces méthodes de tamisage se heurtent à la difficulté suivante : la taille des pores choisie pour arrêter les prions, arrête aussi les grosses protéines, soit parce que la protéine a un diamètre moyen hydraté supérieur à celui du pore, soit parce que des phénomènes d'adsorption compliquent la filtration de la protéine. Ces problèmes sont rencontrés en particulier dans la purification des sérums d'animaux utilisés dans les méthodes de culture cellulaire en vue de la préparation de vaccins ou de médicaments. Devant les risques théoriquement possibles de transmission de prions à l'occasion d'injection de produits dérivés de culture cellulaire, l'invention propose un procédé qui, de manière surprenante, peut séparer complètement les prions du sérum animal, sans éliminer de manière significative les éléments protéiques du sérum, indispensables pour la multiplication des cellules en culture. L'invention a donc pour objectif de fournir un procédé de purification des sérums permettant d'éliminer les prions, s'ils sont présents, du sérum, sans altérer, de façon notable, les propriétés intéressantes des sérums. L'invention a également pour objectif de fournir un tel procédé susceptible d'être utilisé pour éliminer les prions dans des solutions protéiques non purifiées susceptibles d'être contaminées par les prions, sans altérer, de façon notable, les propriétés recherchées des protéines de la solution. Un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé permettant l'élimination des prions de solutions protéiques purifiées d'origine sérique et, également, d'origine non-sérique. Par solutions protéiques purifiées on entend notamment les préparations d'immunoglobulines d'origine sérique et les préparations de facteurs intervenant dans la coagulation. Un autre objectif de l'invention est de fournir de tels procédés qui soient susceptibles d'être utilisés de façon industrielle. L'invention a pour objet un procédé pour éliminer les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) d'une solution protéique, caractérisé en ce que l'on traite la solution par chromatographie d'adsorption électrostatique et hydrophobe simultanée, et en ce que l'on recueille le filtrat. Le gel utilisé dans le procédé selon l'invention possède des groupements fonctionnels, tels que des réticulats de diéthylaminopolystyrène, de diéthylaminopolyphényl ou toute autre association de radicaux porteurs d'une charge positive et de molécules hydrophobes, liés à une matrice inerte (par exemple silice, cellulose, sepharose, acrylamide). De préférence on utilise du DEA Sphérosil/LS z disponible auprès de la société américaine BIOSEPRA (USA, dont le siège français est situé 35 Avenue Jean Jaurès - 92390 VILLENEUVE LA GARENNE). Dans un mode de mise en oeuvre préféré on peut associer, au traitement chromatographique selon l'invention, une étape préalable de filtration sur membrane 0,2 Hm et/ou une étape de chromatographie sur support échangeur d'anions. Le traitement chromatographique selon l'invention peut comporter une seule ou plusieurs étapes, notamment deux étapes, de chromatographie d'adsorption électrostatique et hydrophobe simultanée. On conçoit que le procédé selon l'invention peut être associé à divers procédés de purification, chromatographiques ou non, des solutions protéiques, du fait qu'il permet de retenir de façon assez sélective ou, le cas échéant, très sélective, les prions alors que les autres protéines ne sont généralement pas retenues. De préférence la valeur du pH est choisie pour éviter la perte par fixation irréversible des protéines d' intérêt. Les solutions peuvent être équilibrées par des tampons classiques, par exemple des tampons phosphate de sodium, de préférence additionnés de NaCl. Selon un perfectionnement de l'invention on peut traiter le gel chromatographique, par exemple la colonne de gel utilisée par lavage par une solution de soude NaOH, par exemple tous les cinq cycles. Ce lavage s'ajoute au lavage habituel des colonnes par exemple par des solutions de HCl ou mélange éthanol/HCl. Les colonnes lavées peuvent être stockées, par exemple en éthanol 70 %. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. Exemple 1 : Préparation d'un échantillon contaminé de sérum animal. En vue de démontrer les qualités du procédé selon l'invention, il est nécessaire de réaliser un échantillon contaminé de sérum animal (sérum de veau dans les exemples choisis, mais ceci est applicable de la même manière à d'autres espèces ou à d'autres solutions protéiques). La source de prions utilisées est un broyat de cerveaux de souris mâles C 57 BL/6 infectées par l'agent de la tremblante expérimentale de la souris (souche C 506/M3 au 7ème passage fournie par les Docteurs D.C. GAJDUSEK et P. BROWN du NIH à Bethesda, USA, dont le titre infectieux est environ 108 LD50 par gramme de cerveau) et arrivées au stade terminal de la maladie 1 ml de broyat de cerveau est soniqué et mélangé avec 20 ml de sérum. Exemple 2 : Traitement de l'échantillon contaminé. Une colonne de DEAE Spherodex et une colonne de DEA Spherosil, contenant chacune 50 ml de support, sont associées en série et équilibrées par un tampon de phosphate de sodium 0,02 M, à pH 6,8, additionné de NaCl 2 g/l. 10 ml de sérum de veau, additionné de NaCl 2 g/l et contaminé par la souche Scrapie selon l'exemple 1, sont ajustés à pH 6,8 filtrés sur membrane 0,2 Hm et injectés sur les deux colonnes en série. Le débit est ajusté à 100 ml/h pour une section de colonne égale à 5 cm2, soit une vitesse linéaire de 20 cm/h. Le filtrat, correspondant au pic d'adsorption UV à 280 nm, est collecté et filtré stérilement sur membrane de porosité 0,2 Hm et des échantillons sont prélevés et stockés à -700C pour contrôles biologiques. Après chaque cycle de purification, la séquence suivante de lavages est appliquée par passage de 5 volumes des solutions suivantes 1. HCl 0,1 N 2. Ethanol 70 % - HCl 0,1 N Le stockage de la colonne est assuré en éthanol 70 %. Il est recommandé d'appliquer un lavage par une solution de soude NaOH 0,1 N tous les 5 cycles. Exemple 3 : Vérification de l'absence de contamination de la colonne. Après un premier cycle de purification conforme à l'exemple 2 et après 15 h de stockage des colonnes en éthanol 70 %, un nouveau cycle de purification est réalisé avec 10 ml de sérum de veau non contaminé. Le filtrat est également récolté et des échantillons sont prélevés pour titrages biologiques. Ces échantillons sont analysés pour montrer l'absence de particules transmissibles de prions pouvant venir du cycle de purification précédent. Exemple 4 : Autre mode de mise en oeuvre du traitement. La même expérience que celle décrite à l'exemple 2 est réalisée à pH 5,0 au lieu de 6,8. Les deux colonnes de DEAE Spherodex et de DEA Spherosil sont équilibrées par un tampon phosphate de sodium 0,02 M à pH 5,0 additionné de NaCl 2 g/l. Le sérum est additionné de NaCl 2 g/l, ajusté lui aussi à pH 5,0 par addition d'HCl et filtré sur membrane de porosité 0,2 Hm. La suite de l'expérience est identique à l'exemple 2. En fin de purification, le sérum récolté est ajusté à pH neutre par addition de NaOH N, avant d'être échantillonné et stocké pour contrôles biologiques. Exemple 5 : Autre mode de mise en oeuvre du traitement. Dans ce cas, le passage sur DEAE Spherodex se fait dans un premier temps et on réalise le passage sur DEA Spherosil dans un deuxième temps. Le passage sur DEAE Spherodex se fait à pH 6,8 après filtration 0,2 Hm, selon les conditions de l'exemple 2 (sans la colonne DEA Spherosil). La fraction récoltée est alors ajustée à pH 5,0 et injectée sur la colonne DEA Spherosil dans les conditions de l'exemple 4 (sans la colonne DEAE Spherodex). En fin de purification, le sérum récolté est ajusté à pH neutre par addition de NaOH N, avant d'être échantillonné et stocké pour contrôles biologiques. Exemple 6 : Autre mode de mise en oeuvre du traitement. Cet exemple est une variante de l'exemple 5, dans lequel les conditions de passage sur la première colonne de DEAE Spherodex sont différentes. Le sérum contaminé est dialysé contre du tampon phosphate sodique 0,02 M, pH 6,8 (sans addition de NaCl). La même quantité de sérum ainsi traitée est filtrée sur membrane de porosité 0,2 Hm et injectée sur une colonne identique de DEAE Spherodex équilibrée en phosphate sodique 0,02 M, pH 6,8 (sans addition de NaCl). Dans ces conditions, une partie importante des protéines se fixe sur le support, une autre partie ne se fixe pas et est récoltée dans une première fraction (filtrat). La fraction fixée est éluée par injection de tampon additionné de NaCl à 10 g/l. La deuxième fraction correspondant à l'éluat est récoltée. L'ensemble des deux fractions (filtrat et éluat) est mélangé pour être filtré sur membrane de porosité 0,2 pm et appliqué sur la colonne de DEA Spherosil équilibrée à pH 6,8, comme dans l'exemple 2. Le filtrat final récolté est échantillonné et stocké pour contrôles biologiques. Exemple 7 : Autre mode de mise en oeuvre du traitement. Cet exemple est semblable à l'exemple 6, sauf que le mélange recueilli à la sortie de la colonne DEAE Spherodex est ajusté à pH 5,0 et que la chromatographie sur la deuxième colonne de DEAE Spherosil est effectuée en tampon phosphate 0,02 M, pH 5,00 additionné de NaCl 5 g/1. Les contrôles biologiques classiques sont effectués selon les méthodes connues sur les fractions recueillies dans les exemples 1 à 7 pour montrer que - le sérum animal ainsi traité ne contient plus d'éléments capables de transmettre la tremblante aux souris; - le sérum animal ainsi traité conserve ses propriétés de stimulation de la multiplication cellulaire et peut être utilisé à la place du sérum animal disponible aujourd'hui. REVENDICATIONS 1. Procédé pour éliminer les agents transmissibles non conventionnels (ATNC) d'une solution protéique, caractérisé en ce que l'on traite la solution par chromatographie d'adsorption électrostatique et hydrophobe simultanées, et en ce que l'on recueille le filtrat. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gel utilisé possède des groupements fonctionnels, tels que des réticulats de diéthylaminopolystyrène, de diéthylaminopolyphényl ou toute autre association de radicaux porteurs d'une charge positive et de molécules hydrophobes, liés à une matrice inerte. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gel utilisé est du DEA-Sphérosil/LS . 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on associe, au traitement chromatographique selon l'invention, une étape préalable de filtration sur membrane 0,2 Hm et/ou une étape de chromatographie sur support échangeur d'anions. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le support échangeur d'anions est du DEAE Spherodex.