Brevet FR2748492A1 — publié le 19971114

PROCEDE DE BIOSYNTHESE PERMETTANT LA PREPARATION DE COBALAMINES La présente invention concerne un procédé de biosynthése permettant la préparation de cobalamines. Elle concerne plus précisément un procédé d'amplification de la production de cobalamines et plus particulièrement du coenzyme B12 par les techniques d'ADN recombinant et/ou par ajout d'un nouveau précurseur de cobalamines. La présente invention concerne enfin un procédé de préparation de souches recombinantes utiles dans le procédé de préparation de cobalamines selon la présente invention. La vitamine B12 fait partie d'une classe de molécules appelées cobalamines dont la structure est présentée notamment dans WO9l/l 1518. Les cobalamines sont synthétisées presqu'exclusivement par des bactéries selon un processus complexe également décrit dans WO9î/1 1518. Au niveau industriel, en raison de la grande complexité des mécanismes de biosynthèse, la production de cobalamines et en particulier de la vitamine B12 est principalement réalisée par des cultures en grand volume de bactéries Pseudomonas denitrificans, Propionobacteriurn shermanii et Propionobacterium freudenreichii. II est largement connu que les cobalamines sont synthétisées par certains microorganismes à partir des substrats suivants l'acide aminolaevulinique, la Sadénosyl-L-méthionine, le cobalt, la glutamine, le Rl-amino-2-propanol et le 5,6diméthylbenzimid azole. Parmi les précurseurs précédemment cités, le 5,6-diméthylbenzimidazole est synthétisé par les microorganismes producteurs de cobalamines. Deux voies de biosynthèse semblent exister pour le 5,6-diméthylbenzimidazole l'une est caractéristique des microorganismes aérobies et fait intervenir l'oxygène moléculaire, L'autre est utilisée par les microorganismes anaérobies. Seul un gène intervenant dans la voie anaérobie a été isolé, il s'agit du gène cobT de Salmonella thyphimurium (Trzebiatowski et al., 1994). Aucun gène de synthèse du 5,6-diméthylbenzimidazole n'a à ce jour été identifié chez les microorganismes aérobies. La quantité du 5,6- diméthylbenzimidazole synthétisé par les microorganismes est souvent limitante. Par conséquent, le 5,6-diméthylbenzimidazole est préparé chimiquement et ajouté dans les milieux de production. La suppression de cet apport dans les milieux présenterait donc un avantage certain. Jusqu'à présent, aucun procédé de préparation industriel des cobalamines ne mentionne l'addition de précurseurs autres que le cobalt et le 5,6diméthylbenzimidazole. Certaines souches ne produisant de cobalamines que sur des milieux contenant du Ri-amino-2.propanol ont été récemment décrites (Crouzet et al., 1990, Grabau et al., 1992). Le Rl-amino-2-propanol pourrait donc être utilisé pour améliorer la production de cobalamines. Cependant, son usage pour une fermentation industrielle éventuelle est délicat et coûteux, car d'une part le Rl-amino-2-propanol est un produit irritant et volatile, et d'autre part, il peut inhiber la croissance du microorganisme. fl serait donc particulièrement avantageux de trouver un autre précurseur du résidu Rl-amino-2-propanol des cobalamines ne présentant pas ces inconvénients. A cet égard, il est décrit une voie de biosynthèse du Rl-amino-2propanol à partir de la Thréonine via l'aminoacétone chez certains microorganismes. Mais, la L-thréonine ne permet cependant pas la complémentation des souches citées précédemment. Plus généralement, pour améliorer la production des cobalamines il peut être avantageux d'augmenter la quantité de leurs précurseurs dans le milieu, en particulier s'ils sont limitants. Cette approche peut être réalisée soit en ajoutant directement le précurseur limitant ou un de ses dérivés ou analogues dans le milieu, soit en amplifiant la synthèse in situ de ce précurseur dans la souche productrice en utilisant les techniques de génétique et en particulier la technologie de l'ADN recombinant. La connaissance des voies de biosynthèse des cobalamines et de leurs précurseurs est à cet effet une étape clé pour améliorer la production des cobalamines. Ainsi, la plupart des étapes de la voie de biosynthèse de la vitamine B12 ont été récemment caractérisées chez Pseudomonas denitrificans (Blanche et al., 1995). Pas moins de 22 gènes cob impliqués dans la biosynthèse des cobalamines ont été isolés et la fonction de la plupart des polypeptides codés par ces gènes a été identifiée. D'autres gènes probablement impliqués dans la biosynthèse des cobalamines ou de leurs précurseurs ont été isolés chez d'autres microorganismes. Parfois la fonction de ces gènes n'est pas connue. Seule la détermination précise de leur rôle ou de leur effet permettrait de leur trouver une application. Ainsi chez une bactérie photosynthétique facultative, Rhodobacter capsulatus, un fragment d'ADN portant au moins un gène nécessaire à la formation de l'appareil photosynthétique a été séquencé récemment (Pollich et al., 1993, Pollich et al., 1995a). n a été suggéré que 5 des 8 gènes isolés sont des gènes de biosynthèse de cobalamines à cause de leur forte homologie avec 5 des 22 gènes cob de P. denitrificans décrits précédemment. Par contre aucune fonction précise n'a pu être directement assignée aux 3 gènes restants, les gènes bluB, bluE et bluF. Les gènes bluB, bluE et bluF incluant leurs séquences promotrices, ont été séquencés et décrits dans Pollich et al., 1995a. Selon la présente invention, on a découvert un nouveau précurseur de cobalamine. La présente invention a en effet permis d'obtenir une amélioration de production de cobalamine avec des milieux contenant de la O-phospho-L-thréonine. Ce précurseur de cobalamines, non décrit jusqu'à ce jour, a un rôle comparable à celui d'un autre précurseur déjà connu, le Rl-amino-2-propanol. Cependant, la O-phospho L-thréonine possède l'avantage par rapport au Rl-amino-2-propanol de ne pas être toxique et d'être un produit facilement manipulable. De plus, son efficacité pour l'amélioration de la production de cobalamines peut être plus de 1000 fois supérieure à celle du Rl-amino-2-propanol. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un fragment d'ADN de Rhodobacter capsulatus pour améliorer la production de cobalamines ou pour obtenir ou augmenter la synthèse in situ de O-phospho-L-thréonine ou de 5,6diméthylbenzimidazole d'une cellule donnée. La présente invention a permis d'obtenir une amélioration de la production de cobalammes avec des milieux ne contenant pas de Rl-amino-2-propanol ou de Ophospho-L-thréonine en utilisant un fragment d'ADN portant notamment les gènes bluE et bluF de La présente invention a permis enfin d'obtenir une amélioration de la production de cobalamines sur des milieux ne contenant pas de 5,6diméthylbenzimidazole en introduisant un fragment d'ADN portant notamment le gène bluB de Rhodobacter capsulatus La présente invention a pour objet, un procédé de biosynthèse de cobalamines par fermentation d'un microorganisme procaryote producteur de cobalamine, caractérisé en ce que: - on utilise un microorganisme transformé par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O phospho-Lthréonine et l'on cultive ledit microorganisme dans des conditions permettant l'expression dudit enzyme et la production de cobalamine ; et/ou - on ajoute dans le milieu de culture dudit microorganisme de la O phospho-Lthréonine, ou - on utilise un microorganisme aérobie transformé par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme implique dans une voie de biosynthèse du 5,6 dimethylbenzimidazole et l'on cultive ledit microorganisme en aérobiose, dans des conditions permettant l'expression dudit enzyme et la production de cobalamine. Le microorganisme peut contenir de façon endogène un gène tel que caractérisé ci-dessus. Dans ce cas, le procédé selon l'invention permet la surexpression de l'enzyme. Mais ledit microorganisme peut être également exempt de ce type de gène de manière endogène. Par "fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine ou du 5,6 diméthylbenzimidazole", on entend que l'expression dudit fragment d'ADN se traduit par une synthèse de la Ophospho-Ltthreonine ou du 5,6-diméthylbenmmidazole dans la cellule, suivie éventuellement d'une libération dans le milieu de culture. La culture peut se faire en batch ou bien en continu, et la purification des cobalamines peut se faire par les méthodes déjà utilisées au niveau industriel (Florent, 1986). Dans un mode de réalisation on utilise un microorganisme transformé par un fragment d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine comprenant les gènes bluE et bluF de Rhodobacter capsulatus ou un fragment homologue ou s'hybridant avec lesdits gènes bluE et bluF et ayant la même fonction de coder pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine que lesdits gènes. Dans un autre mode de réalisation, on utilise un microorganisme transformé par un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse du 5,6-diméthylbenzimidazole comprenant le gène bluB de Rhodobacter capsulatus, ou un fragment homologue ou s'hybridant avec ledit gène bluB et ayant la même fonction de coder pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse du 5,6diméthybenzimidazole que ledit gène. L'invention implique l'utilisation d'un fragment d'ADN d'origine naturelle synthétique ou recombinante et homologue. Par fragment, on entend un fragment résultant de la dégénérescence du code génétique ou un fragment présentant une homologie de séquence d'au moins 25 % et qui code pour des polypeptides de même fonction. De façon appropriée, on utilise un microorganisme cultivé en aérobiose et ledit fragment d'ADN code pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse en aérobiose du 5,6diméthylbehzimidazoîe. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de souches recombinantes de microorganisme procaryote producteur de cobalamine, caractérisé en ce qu'on transforme ledit microorganisme par les techniques de génie génétique par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine ou du 5,6 diméthylbenzimidazole tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet les souches recombinantes obtenues par le procédé de préparation de souches selon la présente invention. La présente invention implique l'utilisation dans les procédés selon l'invention d'un ADN recombinant contenant au moins une séquence d'ADN codant pour undit polypeptide et dans lequel la ou lesdites séquences sont placées sous le contrôle de signaux d' expression. A cet égard, on peut en particulier positionner en 5' de la séquence d'ADN des régions promotrices. De telles régions peuvent être homologues ou hétérologues de la séquence d'ADN. En particulier, des promoteurs bactériens forts, tels que le promoteur de l'opéron tryptophane Ptrp ou de l'opéron lactose Plac de E.coli, le promoteur gauche ou droit du bactériophage lambda, les promoteurs forts de phages de bactériens, telles que les corynébactéries, les promoteurs fonctionnels chez les bactéries gram-négatives, tel que le promoteur Par de E.coli, le promoteur PxylS des gènes du catabolisme du xylène du plasmide TOL, le promoteur de l'amylase de Bacilles subtilis Pamy, pourront être utilisés. On peut citer également les promoteurs dérivés de gènes glycolytiques de levure, tels que les promoteurs des gènes codant pour le phosphoglycérate kinase, la glycéraldéhyde - 3 - phosphate déshydrogénase, la lactase ou l'énolase, qui pourront être utilisés lorsque l'ADN recombinant sera introduit dans un hôte eucaryote. Un site de fixation des ribosomes sera également positionné en 5' de la séquence d'ADN et il pourra être homologue ou hétérologue, tel le site de fixation des ribosomes du gène çII du bactériophage lambda. Des signaux nécessaires à la terminaison de la transcription pourront être placés en 3' de la séquence d'ADN. L'ADN recombinant utilisé dans les procédés selon la présente invention peut ensuite entre introduit directement dans une cellule hôte compatible avec les signaux d'expression choisis ou etre cloné sur un vecteur plasmidique pour permettre d'introduire de manière stable la séquence d'ADN en question dans la cellule hôte. L'invention implique de façon connue l'utilisation des plasmides contenant une séquence d'ADN codant pour undit polypeptide. De façon connue, ces plasmides contiennent aussi un système de réplication fonctionnel et un marqueur de sélection. Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. On préfère dans le cadre de l'invention utiliser des vecteurs de type RK2, c'est-à-dire de vecteurs ayant une origine de réplication RK2. On peut citer à titre d'exemple particulier, le vecteur RK2 (Saurugger et al., 1986), le vecteur pXL435 (Cameron et al., 1989), le vecteur pRK290 (US 4,590,163 ; Ditta et al., 1985) et le vecteur pXL1635 (WO 91/16439). Un vecteur particulièrement avantageux est le vecteur pXL1635. D'autres vecteurs sont décrits dans la demande WO 91/16439. Selon une variante de réalisation, on utilise un microorganisme transformé par un fragment d'ADN comprenant un fragment BamHI de 6,8 kb du plasmide pER1 (figure 1), décrit dans les exemples ci-après et qui code pour la synthèse des deux précurseurs, O-phospho-L-thréonine et 5,6-diméthylbenzimidazole. Dans un mode de réalisation plus particulièrement approprié pour l'expression d'un polypeptide impliqué dans la synthèse de la O-phospho-L-thréonine, on utilise un fragment d'ADN comprenant le fragment EcoRI/ClaI de 2,1 kb du plasmide pER2 (figure 2), décrit dans les exemples qui vont suivre. Dans un autre mode de réalisation, plus particulièrement approprié pour l'expression d'un polypeptide impliqué dans la synthèse du 5,6-diméthylbenzimidazole, on utilise un fragment d'ADN comprenant le fragment BarriHi de 6,8 kb du plasmide pER1, décrit dans les exemples qui vont suivre. Les microorganismes procaryotes hôtes qui peuvent être utilisés selon l'invention, sont plus particulièrement les bactéries du genre E coli, Pseudomonas denitrificans, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, ou Rhizobium nnelitoti ou encore Rhodobacter capsulatus. D'autres bactéries sont décrites dans WO91/11518. Toutefois, avantageusement on utilisera une bactérie P. denitrificans ou A. radiobacter. D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. Les exemples 1 et 2 décrivent comment il est possible d'obtenir une production de cobalamines en ajoutant de la O-phospho-L-thréonine dans le milieu de culture d'une souche de Pseudomonas denitrificans ou de Rhodobacter capsulatus. L'exemple 2 montre comment la O-phospho-L-thréonine peut remplacer avantageusement le R1amino-2-propanol dans les milieux de production, puisque des concentrations au moins 1000 fois plus importanes de Rl-amino-2-propanol sont nécessaires pour obtenir une production de cobalamines. L'exemple 2 montre aussi que la région du chromosome des capsulatus portant les gènes bluE et bluF est impliquée dans la synthèse de la Ophospho-lrthréonine. L'exemple 3 décrit la construction de plasmides portant les gènes bluE et bluF à partir d'un fragment d'ADN de Rhodobacter capsulatus. Cet exemple 3 montre surtout comment ces plasmides, une fois introduits dans des souches pour lesquelles la production de cobalamines est dépendante de l'addition de R1-amino-2-propanol ou de O-phospho-L-thréonine, permettent d'obtenir une production de cobalamines sur des milieux ne contenant pas de R1-amino-2-propanol ou de O-phospho-L-thréonine. L'exemple 4 montre que la région du chromosome de Rhodobacter capsulatus portant le gène bluB est impliquée dans la synthèse du 5,6 diméthylbenzimidazole. Liste des figures: Figure 1: carte de restriction du plasmide pER1 Figure 2 : carte de restriction du plasmide pER2 Figure 3 : carte de restriction du plasmide pER3 Les figures 1 à 3 représentent les plasmides pER1, pER2 et pER3 respectivement. 1. Souches et plasmides Les souches AH2 et BB1 de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a) ont été construites à partir de la souche 37b4 0:)SM 938). La souche G2650 de Pseudomonas denitrificans a été construite à partir de la souche SBL 27 Rif par insertion du transposon Tn5 (Crouzet et al., 1990). La souche SBL 27 Rif dérive de la souche MB 580 (Brevet US, 3 018 225). Le plasmide pBBWl a été construit à partir d'un fragment d'ADN de Rhodobacter capsulatus (Pollich et al., 1995a). 2. Techniques moleculaires Les techniques générales de manipulation de l'ADN utilise comme référence le manuel de laboratoire (Sambrook et coll., 1989). Les enzymes sont utilisés comme le recommande le fabricant et proviennent des laboratoires New England Biolabs et de Boehringer Mannheim. Les techniques utilisées concernent essentiellement les étapes suivantes: - digestion par des enzymes de restriction; - ligature de molécules d'ADN par la ligase du bactériophage T4. 3. Techniques de transformation La transformation des souches d'E.coli est réalisée par électroporation (Dower et coll., 1988). 4. Techniques de conjugaison Les conjugaisons entre la souche S17-1 d'E.coli et les différentes souches de sont denitrificans sont réalisées selon un protocole adapté de celui décrit par Simon et ses collaborateurs (Simon et coll., 1986). La transformation des souches de Pseud5vmonas peut etre réalisée par toute autre technique du génie génétique. 5. Préparation des milieuxde production de cobalamines Le milieu utilisé pour la production de cobalamines par les souches de P. denitrificans est le milieu PS4 décrit par Cameron et coll., 1989. Le milieu utilisé pour la production de cobalamines par les souches de Rhodobacter capsulatus est le milieu RA décrit par Pollich, 1995b. 6. Dosage des cobalamines produites La quantité de cobalamines produite est mesurée soit par dosage microbiologique soit par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). - Dosage microbiologique : La quantité de cobalamines produite est mesurée par une méthode semiquantitative utiisant la souche indicatrice 113-3 d'E.coli, auxotrophe pour la vitamine B12 (divis et Mingioli, 1950). Cette souche indicatrice est un mutant metE d'E.coli qui ne possède donc plus qu'une seule homocystéine méthyltransférase (EC 2.1.1.13) qui est B12-dépendante. Sur milieu minimums elle ne requiert que la présence de vitamine B12 pour pousser. Lorsque cette souche est incluse dans une surcouche de milieu minimum M9 (Miller, 1972) gélosé (auquel il ne manque que la vitamine B12 pour permettre la croissance de la souche), il est possible de doser la vitamine B12. En effet, si l'on dépose à la surface de la surcouche un échantillon d'une solution contenant de la vitamine B12, une auréole de croissance est visible à l'endroit du dépôt après 16 h d'incubation à 370C. La vitamine B12 contenue dans l'échantillon diffuse et permet la croissance des bactéries incluses dans l'agar. Le diamètre de l'auréole de croissance est proportionnel à la concentration de B12 dans l'échantillon. Les échantillons sont obtenus par lyse des cellules selon le protocole suivant: 0,1 ml d'une solution de (Tris-HCI pH=8 100 mM, EDTA 20 mM, saccharose 200g/l) contenant 24 mg/ml de lysozyme (Boehringer Mannheim) sont mélangés à 0,5 ml de culture cellulaire à doser. Après 30 min d'incubation à 370C, 60 l d'une solution de sodium dodécyl sulfate à 30 g/l sont rajoutés et le mélange est vortexé quelques secondes. 10 pi du lysat cellulaire obtenu, ou éventuellement une dilution au 1/50, sont déposés à la surface de la surcouche. -Dosage par CLHP: Les méthodes utilisées pour le dosage des cobalamines par chromatographie liquide à haute performance sont celles décrites par Blanche et coll., 1990. EXEMPLE 1: Effet de la O-phospho-L-thréonine sur la production de cobalamines par une souche de Pseudomonas denitrificans. La souche G2650 de Pseudomonas denitrificans est cultivée dans 25 ml de milieu PS4 contenant 2 g/ml de tétracycline, en Erlenmeyer de 100 ml. Après 24 h de fermentation à 30 C sous agitation (250 rpm), 0,16 ou 0,32 ou 1,5 mi d'une solution de O-phospho-L-thréonine à 10 g4, ce qui correspond à une concentration finale de 66, 132 et respectivement 600 mg/l, sont éventuellement ajoutés dans le milieu. Les quantités de cobalamines produites dans chacune de ces conditions sont dosées par C1kP au bout de 148 h de fermentation. Les résultats (tableau 1) montrent que la souche G2650 ne produit pas de vitamine B12 en milieu PS4. Par contre, la présence de O-phospho-L-thréonine dans le milieu, permet la production de B12 par cette même souche. La quantité de vitamine B12 produite est alors d'autant plus importante que la quantité de O-phospho-L-thréonine rajoutée est importante. TABLEAU 1 O-phospho-L-thréonine routée dans le milieu 0 66 132 600 600 (mDR) ~ (ajoutée à t=0) B12 (mg/l) produite O 1,8 2,5 4,2 3,8 EXEMPLE 2: Effets comparés de la O-phospho-L-thréonine et du R1-amino-2- propanol sur la production de cobalamines par une souche Rhodobacter La souche AH2 de Rhodobacter capsulatus est cultivée en Erlenmeyer de 100 ml dans 70 ml de milieu RA en présence de 10 llg/ml de kanamycine et de différentes concentrations de O-phospho-L-thréonine et de Rl-amino-2-propanol. Après 24 à 48 h de fermentation à 300C sous agitation (100 rpm), la quantité de cobalamines produites dans les différentes conditions est mesurée par dosage microbiologique. Les résultats sont montrés Tableau 2, dans lequel "-" signifie absence de halo de croissance de la souche indicatrice et "+", présence d'un halo de croissance d'un diamètre d'autant plus important qu'il y a de "+". Ces résultats montrent que la souche AH2 de K capsulatus, cultivée en milieu RA ne produit pas de vitamine B12. Par contre, en présence de O-phospho-L-thréonine ou de R1-amino-2-propanol, cette souche est capable de produire de la vitamine B12. Les résultats montrent aussi qu'il faut rajouter de l'ordre 6.103 fois plus de R1-amino-2-propanol pour avoir le même résultat qu'avec la Ophospho-L-thréonine. TABLEAU 2 Concentration de O-phospho-L 10 nM 25 nM 50 nM 100 nM 250 nM -thréonine dans lemiiieu Production de B12 - + ++ +++ ++++ Concentration de R1-amino-2-propanol 6 M 30 M 150 M 1,2mM dans le milieu Production de B12 ~ + EXEMPLE 3: Effet de la présence d'un fragment d'ADN dérivant du plasmide pBBW1 dans la souche G2650, non productrice de cobalamines. 3.1. Contruction du plasmide pERI (figure 1) Le plasmide pERI de 17,4 kb a été construit par clonage au site BamHI du vecteur pXL435 (Cameron et coll., 1989) du fragment d'ADN BamHI de 6,8 kb purifié à partir du plasmide pBBWl (Pollich et Klug, 1995). 3.2. Introduction du plasmide pER1 dans la souche G2650 de P. denitrificans Le plasmide pER1 a dans un premier temps été introduit par électroporation dans la souche S17-1 d'E.coli et, dans un deuxième temps, a été introduit dans la souche G2650 de P denitrificans par corgugaison avec la souche S17-1 d'E.coli contenant le plasmide pERI. Les transconjugants résistant à 50 pg/ml de rifampicine et à 100 g/ml de lividomycine ont été sélectionnés. 9 clones analysés contenaient le plasmide pER1. De la même faucon, une souche témoin G2650 contenant le vecteur pXL435 seul a été construite. 3.3. Production de cobalamines par la souche G2650 contenant le plasmide pER1. Les clones G2650 contenant le plasmide pERI ainsi que 2 clones contenant le plasmide pXL435 ont été cultivés dans le milieu PS4 en présence de rifampicine, tétracycline et de lividomycine. Après 140 h de fermentation à 30 C sous agitation (250 rpm), la quantité de cobalamines produites a été mesurée par dosage microbiologique et par CLHP. Les résultats sont présentés dans le Tableau 3. TABLEAU 3 B12 dosage B12 CLHP mierobiolo ue m 1 ++ 3 2 ++ 3,5 3 ++ 3,4 Souches G2650 4 ++ 3,2 contenant le 5 ++ 2,9 plasmide pER1 6 tt 3,9 7 ++ 3,6 8 ++ 3,3 9 4+ 3,9 Souches G 2650 1 - O contenant le 2 ~ plasmide pXL435 Souche G2650 O Alors que ni la souche G2650 ni cette souche contenant le plasmide pXLA35 ne produisent de vitamine B12 en milieu PS4, cette meme souche contenant le plasmide pER1 est capable de produire de la B12 à une concentration de l'ordre de 3,5 mg/l. La souche G2650 contenant le plasmide pXL435, c'est-à-dire uniquement le vecteur de clonage qui a servi à la construction du plasmide pERl, ne produit pas de B12 : c'est donc la présence du fragment d'ADN de 6,8 kb dérivant du plasmide pBBW1 qui est responsable de la production de B12. Ce fragment d'ADN BarnHI de 6,8 kb purifié à partir du plasmide pBBW1 confire donc à la souche G2650 de P. denitrificans la capacité de produire de la vitamine B12 en milieu PS4. 3.4. Sous clonages Les régions du fragment d'ADN BamHI de 6,8 kb contenant les gènes bluE et bluF ont été sous clonées dans le vecteur de clonage pXL435, donnant naissance aux plasmides appelés pER2 et pER3, grâce à des constructions intermédiaires. Le plasmide pER2 de 12,9 kb (figure 2) contient le fragment EcoRI/ClaI de 2,1 kb purifié à partir du plasmide pBBW1 et cloné dans le vecteur pXL435. Ce fragment d'ADN a préalablement été cloné aux sites EcoRI/ClaI du plasmide pBluescript II SK+ (Stratagene) puis a été purifié à partir de ce plasmide recombinant sous fo souche G2650 contenant le plasmide pER2 sont capables de produire de la vitamine B12 en milieu PS4. TABLEAU 4 B12 dosage B12 en microbiologique CLHP (mg/l) Souche G2650 - 0 Souches G2650 1 - 0 contenant le plasmide 2 - 0 pXL435 3 - 0 2 ++ 5,3 Souches G2650 3 ++ 7,9 contenant le plasmide 4 ++ 3,5 pER2 5 ++ 5,2 6 ++ 6,8 7 ++ 7,2 1 - 0 2 - 0 Souches G2650 3 - 0 contenant le plasmide 4 - 0 pER3 5 - 0 6 - 0 7 - 0 8 - 0 EXEMPLE 4 : Le gène bluB est impliqué dans la biosynthèse du 5,6diméthylbenzimidazole (DBI), un précurseur connu de la B 12. La souche BB1 de Rhodobacter capsulatus est une souche mutante qui a été obtenue par insertion d'un interposon dans le gène bluB : c'est une souche bluB (Pollich et coll., 1995). La souche BB1 est cultivée dans 70 ml de milieu RA en Erlenmeyer de 100 ml en présence de 10 g/ml de kanamycine et de différentes concentrations de DBI. Les quantités de cobalamines produites par cette souche dans les différentes conditions sont mesurées par dosage microbiologique après 24 à 48 h de fermentation à 300C sous agitation (100 rpm). Les résultats, résumés dans le Tableau 5, montrent que la souche mutante BB1, non productrice de B12 en milieu RA seul, synthétise cette molécule lorsqu'au moins 14 nM de DBI sont présents dans le milieu. Le gène bluB est donc impliqué dans de la biosynthèse du 5,6diméthylbenzimidazole. TABLEAU 5 concentration de DBI dans 0 7 14 35 70 140 350 le milieu nM production de B12 - - + ++ +++ ++++ +++++ REFERENCES 1. Davis B.D. et E. Mingioli (1950), J. Bactenol. 60 60:17-28 2. Dower W. J., J.F. Miller et C. W. Ragsdale (1988) Nucl. Acids Res. 16 6127-6145 RefM9 3. Sambrook J., E.F. Fritsch et T. Maniatis (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, second edition 4. Simon R., M. O'Connell, M. Labes et A. Pühler (1986) Meth. In Enzymology 118 : 640-659 5. Blanche F., D. Thibaut, M. Couder, et J.C. Muller (1990), Anal. Biochem., 189: 24-29 6. Blanche F., B. Cameron, J. Crouzet, L. Debussche, D. Thibaut, M. Vuilhorgne, F.J. Leeper, et A. R. Battersby (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34:383-411 7. Cameron B., K. Briggs, S. Pridmore, G. Brefort, et J. Crouzet (1989) J. Bacteriol., 171: 547-557 8. Crouzet J., L. Cauchois, F. Blanche, L. Debussche, D. Thibaut, M.C. Rouyez, S. Rigault, J.F. Mayaux, et B. Cameron (1990) J. Bacteriol., 172 5968-5979 9. Grabau C., et J. R. Roth (1992) J. Bacteriol., 174 : 2138-2144 10. Pollich M., S. Jock, et G. Klug (1993) Mol. Microbiol., 10 : 749-757 11. Pollich M., et G. Klug (1995a) J. Bacteriol., 177 : 44814487 12. Pollich M. (1995b) Dissertation, Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg 13. Florent J., (1986), Vitamines, Biotechnology, vol. 4, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, In H. -J. Rehm and G. Reed (ed.), 115-158 14. Ditta G., Schmidhauser T., Yakobson E., Lu P., Liang X. W., Finlay D.R., Guiney D., et Helinski D., (1985), Plasmid, 13: 149-154. 15. Miller J. H., (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. 16. Saurugger P.N., Hrabak O., Schwab H., et Lafferty R.N., (1986). J. Biotechnol. 4 : 333-343 REVENDICATIONS, 1. Procédé de biosynthèse de cobalamines par fermentation d'un microorganisme procaryote producteur de cobalamine, caractérisé en ce que: - on utilise un microorganisme transformé par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-Lthréonine et l'on cultive ledit microorganisme dans des conditions permettant l'expression dudit enzyme et la production de cobalamine ; et/ou - on ajoute dans le milieu de culture dudit microorganisme de la O-phospho-Lthréonine ; ou - on utilise un microorganisme aérobie transformé par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme implique dans une voie de biosynthèse du 5,6 diméthylbenzimidazole et l'on cultive ledit microorganisme en aérobiose, dans des conditions permettant l'expression dudit enzyme et la production de cobalamine. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise un microorganisme transformé par un fragment d'ADN codant pour un polypeptide impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine comprenant les gènes bluE et kIuLde Riiodobacter capsulatus, ou un fragment homologue et/ou s'hybridant avec lesdits gènes bluE et bluF et ayant la fonction de coder pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la O-phospho-L-thréonine. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on utilise un microorganisme transformé par un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse du 5,6-dimethylbenzimidazole comprenant le gène bluB de Rhodobacter capsulatus, ou un fragment homologue et/ou s'hybridant avec ledit gène bluB et ayant la même fonction de coder pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse du 5,6-dimethybenzimidazole que ledit gène. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN comprend un fragment BamHI de 6,8 kb du plasmide pER1. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit fragment d'ADN comprend le fragment EcoRI/ClaI de 2,1 kb du plasmide pER2. 6. Procédé de préparation de la vitamine B12 selon l'une des revendications 1 à5. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit microorganisme est une souche de Pseudomonas denitrificans ou de Agrobacterium radiobacter. 8. Procédé de préparation de souches recombinantes de microorganisme procaryote producteur de cobalamine, caractérisé en ce qu'on transforme ledit microorganisme par les techniques de génie génétique par au moins un fragment d'ADN codant pour un enzyme impliqué dans une voie de biosynthèse de la Ophospho-L > thréonine ou du 5,6 diméthylbenzimidazole tel que défini dans les revendications 1 à 5. 9. Microorganisme recombinant obtenu par le procédé selon la revendication 8. 10. Microorganisme selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche de Pseudomonas denitrificans ou Agrobacterium radiobacter.