Brevet FR2747691A1 — publié le 19971024

La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale et l'utilisation des gènes ainsi mis en évidence pour le traitement de certains dysfonctionnements géniques, notamment les cancers. La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors du processus d'apoptose induit par le gène suppresseur p53. Une analyse globale des événements moléculaires intervenant au cours du cycle cellulaire lors du développement et de l'apoptose -cellulaire est nécessaire pour mieux comprendre l'importance du gène p53 dans le processus de suppression tumorale ou, au contraire, de cancérisation. La transformation d'une cellule normale en cellule tumorale est un processus qui se déroule en plusieurs étapes et qui nécessite une suite d'événements moléculaires. Au niveau physiologique, ces événements se traduiront par une indépendance de la cellule tumorale vis à vis des signaux extérieurs ainsi que par une dérégulation interne menant à une croissance incontrôlée. Deux groupes de gène sont responsables de cette transformation dite "maligne", d'une part, les oncogènes, de l'autre, les gènes suppresseurs ou anti-oncogènes. Les oncogènes, en raison de leur dérégulation dans le cancer (résultant le plus souvent d'une mutation ou d'une translocalisation) induiront un signal positif qui favorisera la croissance néoplasique. Au contraire, les gènes suppresseurs, du fait de leur délétion, de l'absence de leur expression par mutation du promoteur, par exemple, ou encore de mutations qui modifieront la structure et la fonction de la protéine, seront incapables dans le cancer de fournir le signal qui lui, normalement, devrait freiner cette croissance anormale. En conséquence, le dysfonctionnement des gènes suppresseurs contribue à la transformation néoplasique. L'objet de la présente invention est l'isolement de gènes ayant normalement une action dans la suppression tumorale et dont il sera alors possible de surveiller et de traiter les éventuels dysfonctionnements. En particulier, I'isolement de ces gènes permet d'avoir recours à une thérapie génique de remplacement ou bien à la synthèse d'agents pharmacologiques, protéiques ou non protéiques, qui, directement ou indirectement, par leur action sur les promoteurs, induiront l'activation et l'expression de ces gènes, ou encore la synthèse d'agents pharmacologiques qui permettront de mimer l'effet physiologique de ces gènes suppresseurs. L'objectif final est, soit d'inhiber la croissance tumorale, ou mieux, d'induire le processus apoptotique de ces cellules tumorales, c'est-àdire de conduire les cellules tumorales à se "suicider". La présente invention concerne la mise en évidence de gènes qui sont impliqués dans cette apoptose. En effet, chaque cellule possède en elle un programme de mort physiologique. Il s'agit également d'un processus physiologique qui est impliqué dans le développement afin de maintenir l'homéostasie du corps et de -ne pas voir des proliférations cellulaires anormales s'établir, même si, au demeurant, elles n'ont pas de caractère malin. L'un des gènes suppresseurs les plus importants impliqués dans l'apoptose est le gène p53. Dans sa fonction normale, ce gène contrôle la croissance cellulaire et le processus d'apoptose ; en particulier, c'est ce gène qui bloque la croissance cellulaire et qui doit induire le processus apoptotique afin d'éviter le développement d'un cancer. On a ainsi mis en évidence que des souris nullizygotes pour le p53 étaient beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs. On a également mis en évidence le fait que, dans les cancers, le gène p53 était très souvent altéré et conduisait à la production de protéines incapables de véhiculer le message d'apoptose. C'est cette particularité qui a été mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention. En effet, la présente invention repose sur la constatation qu'il n'est pas possible, ou du moins qu'il parait très difficile, de mettre en place une thérapie de substitution directe lors d'un dysfonctionnement du gène p53. En effet, le p53 muté comme il l'est dans le cancer va annuler l'effet physiologique du p53 normal. Il a donc fallu renoncer, du moins dans un premier temps, à une thérapie de substitution agissant directement au niveau de p53. La présente invention s'est donc attachée à étudier les gènes situés en aval de p53 afin de "bipasser" la difficulté évoquée précédemment. C'est pourquoi la présente invention concerne un gène humain impliqué dans la cascade de suppression induite par p53 ainsi que l'utilisation des séquences de ce gène, tant au niveau du diagnostic qu'au niveau de la thérapie, de même que pour la réalisation de modèles destinés à tester des produits anti-cancéreux ainsi que leur application à titre d'agent antiviral. La présente invention concerne tout d'abord une séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant (a) une séquence selon l'lND.sEQ 11 correspondant au gène TSAP 3 humain ou HUMSIAH (Human Homologue of the Drosophila seven in absentia gene), ou un gène équivalent qui comporte (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec (a) ou (b), ou (d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente, et leur application-notamment dans la suppression du cancer ainsi que dans le suivi thérapeutique. Il convient de rappeler que la présente invention couvre aussi bien la séquence nucléotidique correspondant au gène entier que des fragments de ce gène, notamment lorsqu'ils codent pour une protéine équivalente comme cela sera décrit ci-après. Les séquences nucléotidiques peuvent être aussi bien de l'ADN que de l'ARN ou des séquences dans lesquelles certains des nucléotides sont non naturels, soit pour améliorer leurs propriété pharmacologiques, soit pour permettre leur identification. Les séquences mentionnées en (b) sont essentiellement les séquences complémentaires totales ou partielles (notamment pour les cas évoqués précédemment). Ainsi, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques présentant une forte homologie avec le gène mentionné précédemment, de préférence une homologie supérieure à 80% sur les parties essentielles dudit gène, soit en général au moins 50% de la séquence, de préférence l'homologie sera sur ces parties supérieure à 90%. Enfin, lorsque ledit gène code pour une protéine, la présente invention concerne également les séquences codant pour la même protéine, compte tenu de la dégénérescence du code génétique, mais également pour les protéines équivalentes, c'est-à-dire produisant les mêmes effets, notamment les protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles. Ledit gène est dénommé TSAP 3 ou "Tumor Suppressor Activated Pathway" ou HUNISIAH. Les séquences nucléotidiques correspondant aux gènes TSAP 3 humain ou HUMSIAH sont des séquences exprimées lors du processus d'apoptose alors que lorsqu'ils ne sont pas exprimés le processus d'oncogénèse se poursuit. Il est donc intéressant - de détecter toute anomalie dans le gène correspondant, laquelle peut conduire à une plus grande susceptibilité à l'oncogénèse, et - de pouvoir prévoir une thérapie de remplacement. Le gène TSAP 3 murin a été décrit dans le brevet Français ne 95 15146. Dans-la présente description, le gène TSAP 3 est le gène humain, il sera également dénommé HUNISIAH. Il faut d'ailleurs rappeler que ce gène peut intervenir dans d'autres processus que les processus oncogènes ; en effet, p53 est en quelque sorte le gardien de l'intégrité du génome, dans ces conditions les gènes TSAP sont sans doute également impliqués dans cette fonction de contrôle, c'est donc l'ensemble des altérations possibles du génome qui peuvent être redevables de la détection et de la thérapie précédente. La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant le gène TSAP 3 avec les éléments qui permettent son expression in vivo. Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs particuliers, viraux ou non viraux, par exemple des adénovirus, rétrovirus, virus herpès ou poxvirus. La plupart du temps ces vecteurs sont utilisés sous forme défectifs qui serviront de véhicules d'expression de TSAP avec ou sans intégration. Les vecteurs peuvent être également synthétiques, c'est-à-dire mimer des séquences virales, ou bien être constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression tissus ou organes spécifiques, en effet, il n'est pas possible d'envisager d'activer un phénomène d'apoptose incontrôlé. La présente invention concerne donc l'ensemble des vecteurs décrits précédemment. La présente invention concerne également les cellules transformées par un vecteur d'expression tel que décrit précédemment ainsi que la protéine pouvant être obtenue par culture de cellules transformées. Les systèmes d'expression pour produire des protéines peuvent être aussi bien des systèmes eucaryotes tels que les vecteurs précédents que des systèmes procaryotes dans des cellules de bactéries. L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication de plusieurs gènes dans l'apoptose ainsi la surexpression de l'un des gènes par thérapie génique peut, pour certains d'entre eux, ne conduire à l'apoptose que les cellules dans lesquelles s'expriment déjà d'autres gènes déréglés, c'est-à-dire des cellules malignes. La présente invention concerne également, à titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques précédentes lorsqu'elle est induite lors de l'apoptose cellulaire, notamment le gène TSAP 3. Il est, par exemple, possible de prévoir d'autres approches que la thérapie génique, notamment l'utilisation de séquences nucléotidiques en stratégie sens ou antisens, agissant en amont, favorisant l'expression de TSAP. On peut également prévoir une stratégie de remplacement directe par apport de protéines correspondant à TSAP. Enfin, il est possible de prévoir l'utilisation de molécules non protéiques dont l'activité sera d'activer TSAP 3 ou de mimer l'action de son produit d'expression. Ces produits peuvent être aisément testés sur les cellules modifiées qui sont décrites dans les exemples en introduisant les produits à tester dans la culture cellulaire et en détectant l'apparition du phénomène apoptotique. Dans les stratégies à ADN, ARN ou protéique les produits sont bien entendu élaborés en fonction des séquences qui sont décrites. La présente invention concerne en particulier l'utilisation des médicaments précédents en tant qu'agent anti-cancéreux. Mais, le produit du gène TSAP 3 humain est également utile comme agent antiviral, comme cela apparaîtra à la lecture de l'exemple. La présente invention concerne donc également l'utilisation des médicaments précédents comme agent antiviral. La présente invention concerne également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer, tout ou partie des séquences selon l'invention à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification mais également à titre d'agent de diagnostic pour la détermination de la prédisposition au cancer un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'invention ou les anticorps correspondants, éventuellement après culture. Les méthodes de diagnostic sont connues, il peut s'agir, par exemple, de techniques de microséquencage des parties variables après isolement et amplification éventuelle ou des méthodes de détection type RFLP ou d'amplification simple notamment. Les techniques différentielles peuvent, en particulier, permettre de mettre en évidence l'écart entre le TSAP normal et normal. L'invention concerne également des modèles mettant en oeuvre les séquences précédentes. Le gène TSAP 3 humain peut être isolé, notamment, en utilisant la méthode PCR ou d'autres méthodes d'amplification en mettant à profit la structure du gène. Il est également possible de synthétiser ce gène par morceau, si nécessaire. La figure la représente l'lND Ses 11 correspondant à la structure du gène TSAP 3 humain ou HUMSIAH. La figure lb est une comparaison entre le produit des gènes sina de différentes espèces, humain (HUMSIAH), murin (MMSIAH 1B) et de drosophile (DROSINA). EXEMPLE 1 En utilisant le fragment d'ADNc murin (TSAP 3), décrit dans le brevet Français n 95 15146, obtenu par analyse différentielle d'ARNm on a constitué une sonde pour isoler un fragment de 1,1 kb d'une librairie d'ADNc humain qui ensuite a été expansé jusqu'à la région codante entière par une RACE-PC R. La figure lb montre l'ADNc et la séquence d'acides aminés du gène humain sina (TSAP 3). Cette séquence code une protéine de 282 amino-acides avec un motif digité au zinc C3HC4. Cette protéine présente également des analogies avec des protéines capables de se fixer sur l'A RN. La séquence en aminoacides est très conservée entre la Drosophile, la souris et le gène humain (figure lob). La distribution tissulaire indique que le sina humain est exprimé de façon ubiquitaire et code pour un ARNm de 2,3 kb et, dans le placenta, il existe un transcrit additionnel de 2,5 kb. En analysant des YAC du CEPH et des librairies BAC par PCR, en utilisant des amorces sina humains spécifiques, on a pu isoler 8 YAC (3501000 kb) et 2 BAC (100 et 125 kb). La fluorescence par hybridation in situ (FISH) utilisant les clones YAC et BAC montre que le seven in absentia est localisé sur le chromosome 16q12-13, c'est-à-dire dans une région contenant les gènes suppresseurs de tumeurs candidat dans différents cancers, notamment cancer du sein (1), tumeur de Wilm's (2-4), syndrome de Laurence-Moon Bard et-Biedl (5), syndrome de Beckwith-Wiederman (6). Comme cela a été indiqué dans la demande de brevet Français n" 95 15146, on a trouvé que des transfectances stables de cellules M1 murines avec le mutant p53 sensible à la température montraient l'activation de seven in absentia après induction de l'apoptose à 32"C. Etant donné que le TSAP 3 murin a été isolé dans un modèle d'apoptose induit par le gène p53, il était logique d'approfondir l'analyse du gène TSAP3 (HUMSIAH) dans un modèle d'apoptose physiologique humain. Ce modèle est décrit dans l'intestin où les cellules migrent du fond de la crypte vers la région apicale des vilosités où elles meurent par apoptose avant d'être larguées dans le lumen. Ces cellules en apoptose sont spécifiquement marquées par la technique TUNEL D'autre part, ces mêmes cellules sont positives par hybridation in situ pour le gène TSAP 3 (HUMSIAH) dans l'apoptose physiologique chez l'humain. Enfin, afin d'investiguer l'implication du gène TSAP 3 humain dans la suppression des tumeurs, on a utilisé un modèle basé sur l'ensemble des gènes plutôt que sur un seul gène. Ce modèle repose sur les propriétés biologiques du parvovirus H-i. Des recherches très complètes dans ce domaine ont montré sur les 20 dernières années que le parvovirus tue préférentiellement les cellules tumorales alors qu'il épargne leur contrepartie normale. De façon à élaborer un modèle, on a fait l'hypothèse suivante s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-1, les cellules qui étaient résistantes, cette résistance pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Ceci a pu être démontré pour les cellules KS sélectionnées à partir des cellules érythro-leucémiques K562 humaines. Tandis que les cellules parentales K562 sont sensibles à l'effet cytopathique du parvovirus H-l, les cellules KS, elles, sont résistantes. Ces cellules résistantes réexpriment le type sauvage de p53 et ont un phénotype supprimé à la fois in vitro et in -vivo. - Pour confirmer ces observations sur d'autres cellules, on a sélectionné, à partir d'un monoclone d'une leucémie monocytaire U937 humaine, les cellules filles US3 et US4. Ces clones sont résistant à l'effet cytopathique des parvovirus H-l et montrent une réversion du phénotype malin in vivo. L'analyse de marqueurs de surface pour 20 cellules, indique qu'il n'y a pas de déplacement dans le stade de différentiation entre U937 et les clones US indiquant que la suppression du phénotype malin n'est pas dûe à une différentiation terminale. Ni les cellules K562 ni les cellules U937 n'expriment p53. Par contraste aux cellules KS qui réexpriment p53, les cellules US3 et US4 ne réexpriment.p53. Toutefois, on a pu mettre en évidence le fait que les cellules US3 et US4 montraient l'activation de WAF-1 par rapport aux cellules parentales malignes U937. Une telle activation de WAF-1 dans une voie indépendante de p53 alternative a été récemment décrite et les résultats actuels montrent que les clones US3 et US4 utilisent, semble-t-il, cette voie alternative WAF-1. Le gène sina est activé par le type sauvage p53 inductible dans les cellules M1 de même que dans les cellules KS qui réexpriment le type sauvage p53. Tandis que les cellules parentales U937 expriment très légèrement l'ARNm de sina, il est activé dans les clones filles US3 et US4 qui ont une réversion de leur phénotype malin et qui réexpriment p2lwaf1. De façon intéressante, sina est activé dans les cellules qui deviennent apoptotiques, comme cela est montré par un double marquage utilisant une sonde sina pour hybridation in situ combinée avec un essai TUNEL Ceci permet de démontrer que le gène sina humain qui est très conservé dans la phylogénie joue un rôle dans l'apoptose et la suppression tumorale. De façon encore plus importante, sina se situe au croisement des voies de p53 et de WAF-l. En outre, en utilisant le modèle de U937 et US3 et US4, on a pu montrer un lien fonctionnel pour les molécules suppresseurs en utilisant un modèle biologique global qui permet la comparaison à des niveaux moléculaires entre les cellules malignes parentales et les cellules filles directement dérivées. Ces expériences indiquent qu'il n'est pas nécessaire de transférer les gènes suppresseurs de tumeur humains spécifiques de façon à leur conférer le phénotype suppresseur, mais que la réversion tumorale est sous le contrôle d'un système de régulation qui est toujours présent dans le matériel génétique des cellules tumorales bien qu'il soit nécessaire de le réactiver. BIBLIOGRAPHIE 1. BIECHE I. and LIDEREAU R., Genes Chromosomes and Cancer 14, 227-251 (1995). 2. WANG-WUU S., SOUKUP S., BOVE K., GOTWALS B. and LAMPKIN B., Cancer Research 50, 2786-2793 (1990). 3. 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REVENDICATIONS 1) Séquence nucléotidique correspondant à un gène comportant (a) une séquence selon l'IND.SEQ 11 représenté à la figure 1 correspondant au gène TSAP 3 ou un gène équivalent qui comporte (b) une séquence s'hybridant avec l'une des séquences selon (a), (c) une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec (a) ou (b), ou -(d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon (a), (b) ou (c) ou pour une protéine équivalente. 2) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'expression cellulaire du gène est induite lors de l'apoptose cellulaire. 3) Séquence selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'apoptose cellulaire est induite par p53. 4) Vecteur d'expression cellulaire d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 3. 5) Cellule transformée par un vecteur d'expression selon la revendication 4. 6) Protéine pouvant être obtenue par culture de cellule transformée selon la revendication 5 et codée par la séquence selon l'une des revendications 1 à 3. 7) A titre de médicament, un vecteur selon la revendication 4 ou la protéine selon la revendication 6. 8) A titre de médicament, un composé assurant l'expression cellulaire d'au moins une des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 1 à 3 ou de leurs produits. 9) A titre d'agent de diagnostic notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers, tout ou partie des séquences selon l'une des revendications 1 à 3 à utiliser comme sonde nucléotidique ou comme amorce d'amplification. 10) A titre d'agent de diagnostic notamment pour la détermination de la prédisposition et le suivi des cancers un antigène correspondant à tout ou partie des protéines codées par la séquence selon l'une des revendications 1 à 3 ou les anticorps correspondants. 11) A titre d'agent antiviral un médicament selon l'une des revendications 7 ou 8..