Brevet FR2748028A1 — publié le 19971031

Peptides dérivés du facteur von Willebrand et leur utilisation comme anticoagulant La présente invention concerne de nouveaux peptides dérivés du facteur von Willebrand. Le facteur von Willebrand et le facteur VIII jouent tous deux un rôle essentiel mais distinct dans la coagulation sanguine. Le facteur von Willebrand (vWF) est la molécule qui protège et transporte le facteur antihémophilique A (FVIII) dans la circulation sanguine, tandis que le facteur VIII favorise l'activation du facteur X (FX) par le facteur IX activé en présence de phospholipides et d'ions calcium. On sait que l'interaction entre le FVIII et le vWF est nécessaire pour la stabilisation du FVIII in vitro (Kaufman et al., Journal of Biological Chemistry (1988) 263. 6352-6362 ; Weiss et al., Journal of Clinical Investigation (1977) 60. 390-404) et la survie du FVIII in vivo ( Weiss et al., Journal of Clinical Investigation (1977) fiQ, 390-404 ; Tuddenham et al., British Journal of Haematology, (1982) 52. 259-267). Bien que les mécanismes moléculaires qui régissent la fixation du FVIII sur le vWF ne soient que partiellement élucidés, le domaine du vWF qui se lie au FVIII a été identifié récemment. On sait maintenant qu'un fragment trypsique de 272 résidus d'acides aminés correspondant à la partie N-terminale du vWF mature est capable de fixer le FVIII (Foster et al., Journal of Biochemical Chemistry, (1987) 262. 8443-8446 ; Takahashi et al., (1987) oed7Q, 1679-1682) (voir IDS n" 1). Plus précisément, un domaine homologue D' correspondant aux 103 premiers acides aminés N-terminaux du vWF mature a été identifié comme portant les mutations rencontrées chez les malades présentant un vWF incapable de fixer le FVIII (Mazurier (1992) Thrombosis and Haemostasis, , 391-396). L'interaction FVIII/vWF étant un facteur déterminant pour l'activité procoagulante du FVlll, une approche possible pour la préparation de nouveaux produits anticoagulants consiste à inhiber cette interaction. La plupart des traitements anticoagulants connus nécessitent une surveillance biologique régulière pour éviter les risques d'hémorragie car les produits utilisés ont un effet direct sur la thrombine ou le facteur Xa. L'invention vise à fournir de nouveaux produits anticoagulants présentant un risque mineur d'hémorragie. Les produits selon l'invention sont des peptides dérivés de la partie N-terminale du vWF mature capables de fixer le FVIII, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'inhiber l'interaction entre le vWF et le FVIII. Les peptides selon l'invention sont, selon un mode de réalisation particulier, caractérisés par les séquences d'acides aminés substantiellement telles que représentées sur les IDS n" 2 à 4. Ils correspondent respectivement aux séquences d'acides aminés 16-40, 46-70 et 76-95 de la partie N-terminale du vWF mature représenté à l'IDS n 1. L'invention a également pour objet des peptides analogues aux peptides représentés sur les IDS n" 2 à 4. Par "peptides analogues" on entend des peptides dont la séquence se distingue de celles représentées aux IDS n" 2 à 4 par une addition, substitution et/ou délétion d'un ou plusieurs acides aminés et/ou qui présentent à l'extrémité N ou C-terminale un fragment additionnel visant notamment à protéger les peptides contre les peptidases, tout en conservant leur aptitude à inhiber l'interaction entre le FVIII et le vWF. Le terme peptide analogue" couvre également les peptides dont la séquence se distingue de celles représentées aux IDS n" 2 à 4 par une modification des groupements NH2 et COOH terminaux et/ou de tout groupement fonctionnel porté par la chaîne latérale d'un acide aminé et/ou la modification d'une liaison peptidique par une liaison d'une autre nature, l'aptitude à inhiber l'interaction entre le FVIII et le vWF étant bien sûr conservée. A tout peptide analogue" correspond bien sûr une séquence analogue". Ainsi, le peptide dont la séquence comporte une substitution de T en A à la position 26, comptée à partir de l'extrémité N-terminale du vWF mature (ce qui correspond à la position 1 1 sur l'IDS n" 2) ou encore le peptide dont la séquence porte une substitution de R en à la position 89 comptée à partir de l'extrémité N-terminale du vWF mature (ce qui correspond à la position 14 sur l'IDS n 4) représentent de tels peptides analogues. L'invention concerne également la séquence d'ADN permettant l'expression desdits peptides, notamment in situ. L'expression de ces peptides in situ peut nécessiter l'utilisation de vecteurs d'expression tels que des vecteurs viraux par exemple, il est également possible d'utiliser des ADN nus tels que cela est maintenant connu. Les peptides selon l'invention ou les séquences d'ADN ci-dessus peuvent essentiellement être utilisés comme médicament, en particulier comme anticoagulant. Leur utilisation comme anticoagulant est particulièrement avantageuse puisque, n'ayant pas d'effet direct sur la thrombine ou le facteur Xa, ils présentent un risque mineur d'hémorragie, même en cas de surdosage. Ainsi, la surveillance biologique régulière nécessitée par la plupart des traitements anticoagulants pourrait être assouplie. Les peptides selon l'invention peuvent également être utilisés dans le traitement du déficit constitutionnel en protéine C. Les malades souffrant de ce déficit sont habituellement traités par traitement substitutif avec la protéine C associé à un traitement anticoagulant anti-vitamine K. Cependant, la stabilisation du traitement anti-vitamine K est très problématique chez les enfants ; par ailleurs, les anti-vitamine K peuvent présenter un risque d'ostéoporose car ils affectent les protéines de la matrice osseuse. Un traitement anticoagulant par les peptides selon l'invention pourrait pallier les effets négatifs des anti-vitamine K. L'exemple suivant illustre un mode de réalisation de l'invention, sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE Préparation des peptides Pour obtenir les peptides selon l'invention, on a préparé 19 pentadécapeptides se chevauchant de 5 acides aminés et recouvrant la séquence des 100 acides aminés N-terminaux du vWF mature. Les pentadécapeptides ont été synthétisés par Cambridge Research Biochemicals (Cheshire, UK) par la méthode de synthèse multiple et simultanée de peptides (Houghten et al. (1985) PUNAS 82. 5131-5135). Les peptides ainsi préparés ont un taux de pureté de 70 à 80 % déterminé par analyse HPLC à phase inverse sur une colonne Vydac C-18 (Alltech Associates, Inc., I11). Les peptides sont dissous dans un tampon TBS, pH 9, et leur concentration est calculée en poids par volume. Détermination de l'effet inhibiteur de la fixation FVIII/vWF Pour déterminer l'effet inhibiteur des peptides sur la fixation du FVIII au vWF on a insolubilisé du vWF plasmatique (indirectement, en incubant du plasma avec des anticorps anti-vWF) sur une microplaque. On ajoute dans les puits de la microplaque un mélange préincubé de FVIII et de peptides. La quantité de FVIII qui se fixe au vWF plasmatique est ensuite mesurée en utilisant un dosage fonctionnel classique de l'activité coagulante du FVIII, fondé sur une détection chromogénique du FXa généré après addition de FIXa, de FX, de phospholipides et de calcium. Une plaque de microtitration (NUNC, 96 puits) est coatée par un anticorps polyclonal de lapin anti-vWF à 6 sg/ml en tampon carbonate 0,05 M, pH 9,6 (100 FI/puits). Après une nuit d'incubation à 4"C, la plaque est lavée par du TBS (tampon du Kit Stachrom dilué au 1/10). 100 > 1 de plasma normal dilué au 1/20 en tampon de lavage contenant 3 % de sérum albumine humaine sont incubés sur la plaque une nuit à 4"C. La plaque est lavée par du CaC12 0,35 M deux fois 1 heure à température ambiante. Les peptides sont reconstitués par du DTT 1 mM (1 mg dans 60 > 1, soit 10 mM), chauffés 5 minutes à 100 C, puis dilués dans le tampon de lavage contenant 10 mM de CaCI2 et un peu de Tween. Le FVIII recombinant (PR3155) est dilué dans le même tampon que les peptides puis le FVIII recombinant et les différentes dilutions de peptides sont mélangés volume à volume et incubés 30 minutes à température ambiante. Le mélange est ensuite déposé sur plaque et incubé 1 heure 30 à 37"C. Après lavage, le FVIII fixé dans les puits est dosé par le kit Stachrom de la façon suivante: On met dans chaque puits 60 ctl de tampon de lavage, 40 crl de FIXa (4 minutes d'incubation), 40 crl de FX (8 minutes d'incubation), 40 ctl de substrat chromogénique puis on lit en cinétique pendant 2 minutes à 405 nm. La moyenne des valeurs de variation de densité optique (mDO/minute) obtenues dans trois puits où a été additionné le FVIII recombinant préalablement dilué dans du tampon sans peptide sert de référence 100 % (O % d'inhibition). Il apparaît que les peptides dont les séquences sont représentées aux IDS n 2 à 4, inhibent à au moins 20 % l'interaction vWF/FVIII à la concentration de 25 ssM, le pourcentage augmentant avec la concentration en peptides. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES (B) RUE: 3, Avenue des Tropiques - BP 35 (C) VILLE: LES ULIS CEDEX (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 91958 (ii) TITRE DE L'INVENTION: PEPTIDES DERIVES DU FACTEUR VON WILLEBRAND ET LEUR UTILISATION COMME ANTICOAGULANT (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1., Version #1.3 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 272 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp 1 5 1 15 Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gin Asn Tyr 2 25 3 Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 4 45 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys se 55 6 Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys 65 7 75 8 Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 9 95 Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr île Gly Met Ala His Tyr iee ies 110 Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gîn Tyr 115 120 125 Val Leu Val Gîn Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 13 135 14e Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys 145 150 155 16 Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 17 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 18 185 19 Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gîn Thr 21 215 Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln 225 23 235 24 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gîn Cys Ala Asp Thr Arg 26 265 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn 1 5 1 15 Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly 2 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu 1 5 1 15 Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly 20 25 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg 1 5 10 15 Lys Trp Asn Cys ze REVENDICATIONS 1) Peptides dérivés de la partie N-terminale du vWF mature capables de fixer le FVIII, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'inhiber l'interaction entre le vWF et le FvIII. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés est la séquence complète substantiellement telle que représentée sur L'IDES n 2 ou une séquence analogue. 3) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés est la séquence complète substantiellement telle que représentée sur l'IDS n" 3 ou une séquence analogue. 4) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés est la séquence complète substantiellement telle que représentée sur l'IDS n 4 ou une séquence analogue. 5) Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence analogue comporte une substitution de T en A à la position 1 1 dans 1'IDS n" 2. 6) Peptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence analogue comporte une substitution de R en Qà la position 14 dans l'IDS n" 4. 7) Peptide selon l'une des revendications 1 à 6, pour utilisation en tant que médicament. 8) Peptide selon l'une des revendications 1 à 6, pour utilisation comme anticoagulant. 9) Peptide selon l'une des revendications 1 à 6, pour traiter le déficit constitutionnel en protéine C. 10) Séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 1 à 9. 11) Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 9 ou d'une séquence selon la revendication 10 à titre de médicament.