Brevet FR2754822A1 — publié le 19980424

La présente invention concerne le domaine thérapeutique. Elle concerne plus particuliérement de nouvelles molécules thérapeutiques et leur utilisation pour le traitement de pathologies cardio-vasculaires. La resténose post-angioplastie est un désordre hyperprolifératif localisé qui se développe consécutivement à une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Ainsi, le traitement d'une lésion athéroscléreuse par angioplastie résulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure mécanique de la paroi artérielle. La prolifération des cellules musculaires lisses (CML) dans la paroi vasculaire est un événement clé dans le développement de l'athérosclérose, dans la resténose après angioplastie ainsi que dans l'échec des pontages coronariens. Les CML sont normalement quiescentes dans la paroi vasculaire mais, à la suite d'une lésion détruisant l'endothélium vasculaire, elles se retrouvent au contact des facteurs de croissance sanguins. Contrairement aux cardiomyocites et aux cellules du muscle squelettique, les CML peuvent, en réponse à divers facteurs de croissance, se dédifférencier et réenclencher de nouveau leur cycle prolifératif. Ces modifications phénotypiques des CML résultent de profonds changements au niveau de l'expression de nombreux gènes. A titre d'exemple l'expression de gènes précoces, impliqués dans la prolifération cellulaire tels que c-fos ou c-myc, se voit remarquablement augmentée alors que l'expression d'autres gènes de structure comme que l'alpha-actine muscle lisse spécifique ainsi que certains isoformes de la myosine subit une régulation négative. Bien qu il soit clairement établi que la différenciation terminale des cellules musculaires squelettiques est régulée par des facteurs transcriptionnels dits myogéniques tels que Myo-D, très peu de facteurs impliqués dans la differenciation réversible des CML sont connus à ce jour. Des études récentes ont révélé l'existence de facteurs transcriptionnels possédant une homéo-boite dans différents tissus du système cardio-vasculaire. De tels facteurs, reconnaissent grâce à leur homéo-boite, des séquences d ADN spécifiques dans les régions promotrices de leur gènes cible et interviennent ainsi dans la régulation de la différenciation, de la prolifération ou de la migration cellulaire. L'un de ces facteurs gax (Growth-Arrest-Specific Homeobox) est exprimé dans différents tissus cardio-vasculaires dont les CML de la paroi vasculaire. Le gène gax a été nitialement identifié à partir d'une banque d'ADNc d'aorte de rat. Il code pour une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax humain a également été clone et sequence (REF). Il code pour une proteine de 302 acide amines. Le gène gax possède certaines propriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la transition GO/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduits dans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est donc réprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Une autre caracteristique du gène gax réside dans sa spécificité d'expression. En effet, chez le rat adulte, le gène gax est essentiellement exprimé dans le système cardiovasculaire (aorte, coeur). La présence d'ARNm de gax n'a pas été mise en évidence par northern blot dans le foie, le cerveau, l'estomac et le muscle squelettique. Par ailleurs, le gène gax appartient à la famille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnels qui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des régions spécifiques de l'ADN (ou homéoboîtes) (revue: Gehring et al. Cell, 78 : 211-223, 1994). L'homéodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acides aminés 185 et 245. De manière intéressante, les gènes homéotiques identifiés à ce jour sont impliqués dans le contrôle de la différenciation/croissance cellulaire au cours de l'embryogénèse ce qui renforce le potentiel thérapeutique du gène gax (revue : Lawrence et Morata Cell 78 : 181189, 1994; Krumlauf, Cell 78:191-201, 1994). L'une des caractéristique de GAX est qu il subit une régulation négative dès que les CML prolifèrent que ce soit in vitro en réponse à des facteurs de croissance ou in vivo à la suite d'une lésion de l'endothélium de la paroi vasculaire. Cette répression est réversible car lorsque les CML sont rendues quiescentes par déprivation en sérum, in vitro, l'expression de GAX reprend. Des travaux de notre laboratoire ont récemment montré que la surexpression de GAX dans des CML par un vecteur adénoviral bloque leur prolifération FR 95/04234(ST95022). La resténose post-angioplastie consécutive à la blessure mécanique représente le facteur d échec le plus fréquent (50% des cas dans certaines études). La prolifération des CML étant un élément clé de ce phénomène, GAX, connaissant son rôle régulateur de la prolifération, apparait comme un gène thérapeutique de choix pour le traitement préventif de la paroi vasculaire après angioplastie FR 95/04234(ST95022). Toutefois, le mécanisme d action de GAX demeure, cependant, très peu documenté. II demeure à identifier des séquences d ADN cibles de l'homéo-boite de GAX. De plus une étude de la fonction des différents domaines de GAX n a pas, à ce jour, été réalisée. L'identification de partenaires fonctionnels de GAX constitue enfin une facette importante qui permettra de définir la cascade moléculaire dont dépend GAX ou dont il est à la source. La présente invention a précisément pour intérêt d'apporter des informations sur ces points. Au cours de ce travail nous avons adopté différentes approches analytiques pour identifier des molécules interagissant avec GAX, pour déterminer le domaine de GAX nécessaire à cette interaction et pour étudier l'importance des différents domaines dans la fonction de GAX. Pour ce faire, nous avons utilisé le système double hybride afin de caractériser des protéines interagissant avec GAX à partir d'une banque de poumon humain. Cette approche nous a permis d identifier différentes molécules dont une, I'antigène Ki, particulièrement intéressante. L'antigène Ki est une protéine d'environ 32 KDa. Elle a été identifié pour la première fois comme un autoantigène nucléaire reconnu par des sera entant de patients atteints de lupus érythémateux (Nikaido et al. 1989, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79, 209-214). Des travaux récents ont montré que Ki est surexprimée dans des cellules en prolifération ou transformées par un oncogène (Nikaido et al. 1989, Exp. Cell Res. 1989,182,284-289). Des expériences de coimmunoprécipitation ( Takeushi et al. abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) ont montré que Ki existe sous forme d'un complexe avec PCNA un marqueur de prolifération (Almendral et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84,1575-1579).. Nous avons, également, étudié la fonction de GAX dans des expériences de transfection transitoire de cellules de mammifères en utilisant GAX fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN hétérologue et un système de gène reporter permettant de renseigner sur l'activité transcriptionnelle de GAX après délétion de différentes régions de la molécule. Nous avons ainsi montré que GAX agit essentiellement comme un répresseur de la transcription. Cette activité de répression est liée plus particulièrement aux 32 premiers acides aminés de GAX. De plus, ce domaine répresseur est localisé dans la région (1-222) de GAX requise pour l'interaction avec Ki dans la levure. Nous essayons actuellement de montrer si Ki peut affecter l'activité transcriptionnelle de GAX dans un système de transfection transitoire. Nous développerons ci-après les applications potentielles du caractère répresseur de GAX et de son interaction avec Ki. Un premier aspect de l'invention concerne donc des fragments de la proteine GAX doues de propriétés biologiques. Un autre aspect de l'invention concerne des domaines de GAX impliques dans l'activite biologique de GAX. I1 peut s'agir notamment de domaines impliques dans l'interaction de GAX avec d'autres molécules ou de domaines responsables d'une activite biologique. L'invention concerne également des molécules chimeriques comprenant un domaine fonctionnel de GAX. Elle concerne également l'utilisation de GAX pour reprimer l'expression de gènes, ainsi que l'utilisation de composes inhibant l'interaction de GAX avec certains partenaires cellulaires pour moduler l'activite de GAX. Elle concerne également une methode pour le criblage et/ou l'identification de partenaires cellulaires de GAX. Comme indique ci-avant, le gène gax possède des propriétés particulièrement avantageuses pour des applications de thérapie génique des désordres hyperprolifératifs, notamment de la resténose ou d'autres pathologies associees a une proliferation des CML. Il a été démontré dans la demande FR95/04234 (ST95022) que le transfert du gène gax in vivo permet de reduire considerablement la proliferation des CML, et ainsi, d'inhiber la reduction du diametre luminal. Il a également ete montre dans la demande FR 95/12871 (ST95057) que le gène gax, exprime dans des cellules tumorales, permettait de s'opposer au processus de transformation cellulaire. Ces differents elements demontrent le potentiel du gène gax pour des approches therapeutiques. La presente demande decrit maintenant l'identification de domaines fonctionnels de GAX, la construction de derives de GAX presentant une activite biologique, l'identification de partenaires de la proteine GAX et la mise au point de methodes permettant la recherche d'autres partenaires et l'identification de composes capables d'interagir sur l'activite de ces partenaires. Plus precisement, la demanderesse a maintenant montre que la proteine GAX etait douee d'activite represseur de la transcription. Elle a également montre que cette activite etait portee par certaines regions de la proteine GAX, en particulier la region N-terminale. Sachant, de plus, que Ki intéragit avec PCNA (Takeushi et al. abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) et que celui ci est un cofacteur indispensable à l'ADN polymérase pour la réplication de l'ADN (Fukuda et al. 1995, J. Biol. Chem. 270, 22527-22534), il est envisageable que GAX puisse également etre impliquée dans des complexes réplicatifs dans la cellules. Les resultats presentes dans les exemples montrent en outre que les domaines fonctionnels de GAX sont également impliques dans l'interaction de GAX avec une proteine cellulaire, Ki. Un premier objet de l'invention concerne plus particulierement un polypeptide caracterise en ce qu'il s'agit en tout ou partie d'un fragment de la proteine GAX possedant une activite de represseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication de l'ADN. Plus preferentiellement, le polypeptide selon l'invention comprend au moins les résidus 1 a 32 de la proteine GAX humaine. Selon une autre mode de realisation, le polypeptide selon l'invention comprend au moins les résidus 104 a 230 de la proteine GAX humaine. A titre d'exemples particuliers de polypeptides selon l'invention, on peut citer les polypeptides comprenant les fragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la proteine GAX humaine. Les exemples presentes plus loin montrent que de tels polypeptides sont capables d'inhiber la transcription de gènes et conservent donc les propriétés de represseur transcriptionnel de GAX. Plus préférentiellement, ce polypeptide comprend, outre un fragment de la proteine GAX conforme à la présente invention, un fragment d'origine differente. On entend par fragment d'origine differente un fragment polypeptidique non-issu de la proteine GAX. Il peut s'agir d'un fragment synthetique, artificiel, d'un fragment de proteine, etc. Ce fragment d'origine differente peut avoir differentes fonctions. n peut par exemple constituer un marqueur permettant de detecter le polypeptide et eventuellement de le tracer in vivo. Un tel marqueur peut etre par exemple un epitope reconnu par un anticorps monoclonal. A cet egard, differentes sequences de marquage, dites sequences Tag, ont ete decrites dans la litterature et sont habituellement utilisees. On peut mentionner la sequence tag-myc. Ce fragment peut également etre un fragment ayant la propriété de stabiliser le polypeptide. Il peut s'agir a cet effet de tout ou partie d'une proteine ayant une demivie plasmatique elevee. Enfin, il peut également s'agir d'un element de ciblage, permettant au polypeptide d'atteindre plus rapidement et/ou plus specifiquement des compartiments cellulaires particuliers. Avantageusement, il s'agit d'un signal de localisation nucleaire (NLS), le polypeptide exercant principalement son activite dans le noyau des cellules. Differents signaux NLS ont ete decrits dans la litterature comme par exemple celui de l'antigène T du virus SV40, celui de p53 etc.. Le fragment d'origine differente peut en outre conferer au polypeptide une fonction biologique supplementaire ou favoriser l'activite du domaine represseur. A titre d'exemple tout particulierement avantageux, on peut citer un domaine proteique capable de lier l'ADN de maniere specifique. Ce type de molécule chimerique permet ainsi de lier l'ADN en des regions particulieres et d'inhiber la transcription de gènes localises au niveau de ces regions. A titre d'exemple specifiques on peut citer le domaine de liaison a l'ADN de la proteine GAL4 de levure. De telles constructions sont decrites dans les exemples. Elles peuvent etre utilisees pour reguler l'expression de gènes chez la levure ou de gènes places sous le controle d'un signal d'expression comprenant le site de liaison de la proteine GAL4. D'autres domaines proteiques de liaison a l'ADN peuvent etre par exemple Lex A, le domaine de liaison à l'ADN d'un récepteur nucléaire comme le récepteur aux oestrogènes ou tout autre membre de cette famille, etc... Il peut également s'agir d'un peptide permettant d'une part la sécrétion de tout ou partie de GAX, ainsi que son ciblage vers des recepteurs membranaires permettant son internalisation et augmentant ainsi la diffusibilité et le domaine d'activité de GAX par un effet de type "Bystander" A ce titre on peut plus particulièrement utiliser tout ou partie de la transferrine ou des fragment de molecule de la matrice extracellulaire pouvant reconnaitre des intégrines à la surface des CML. Les polypeptides selon l'invention sont particulièrement intéressants sur le plan thérapeutique et celui de la recherche appliquée. L'activité thérapeutique des polypeptides revendiqués est liée plus particulièrement à leur aptitude à réprimer la transcription ou à affecter la réplication de l'ADN, par analogie avec la protéine GAX et donc à leur pouvoir à réguler l'expression d'autres protéines. Dans cette perspective, la présente invention vise également l'utilisation de la protéine GAX ou d'un fragment tel que revendiqué pour réprimer la transcription de gène et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN. En raison de cette analogie de comportement avec la protéine GAX, ces fragments peuvent avantageusement lui être substitué dans sa fonction de répresseur de transcription. Par ailleurs, compte-tenu du fait qu'ils ne comprennent de la protéine GAX que tout ou partie de son domaine impliquée dans la répression de transcription, on peut penser qu'ils seront moins sensibles aux différentes altérations auxquelles est sujette la protéine GAX. Ces polypeptides en tant que tels ou des dérivés peuvent donc manifester un caractère répresseur de la transcription accrue comparativement à celui de la protéine GAX naturelle. On peut également envisager de les utiliser afin d'identifier de nouveaux partenaires de la protéine GAX. A cet égard la présente invention a également pour objet un procede pour le criblage et/ou l'identification de polypeptides interagissant avec la proteine GAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'invention. Plus préférentiellement ce polypeptide est choisi parmi les fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX. A ce titre, la demanderesse a montré de manière inatttendue qu'un domaine de la protéine GAX pouvait interagir de manière spécifique avec une autre protéine cellulaire, la protéine Ki. Comme explicité précédemment, Ki est un auto antigène qui apparaît lors de maladies auto-immune comme le lupus érythémateux. Elle est décrite comme une molécule nucléaire dont l'expression augmente au cours de la prolifération cellulaire ainsi que dans des fibroblastes transformés par un oncogène. Nous avons pu montrer que, dans la levure, la partie N-terminale de GAX est nécessaire pour l'interaction avec Ki. La protéine recombinante Ki reconnaît spécifiquement GAX transféré sur un filtre de nitrocellulose à partir d'un gel de polyacrylamide dénaturant. La présente invention vise également précisément un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec la protéine Ki. Plus préférentiellement, il s'agit du fragment 1 à 32 ou 104 à 223 de la protéine GAX. Un autre objet de la presente invention concerne tout acide nucleique codant pour un polypeptide tel que defini ci-avant. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Cet acide nucléique peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent par ailleurs etre incorporés dans des vecteurs, tels que des vecteurs plasmidiques. Avantageusement, l'acide nucleique selon l'invention est un ADNc. Les acides nucleiques de l'invention peuvent etre utilises pour la production de sondes ou de molécules antisens permettant, par hybridation, de detecter des la presence ou l'expression d'acides nucleiques codant pour des polypeptides portant un domaine represseur selon l'invention, ou d'inhiber l'expression de tels polypeptides. S'agissant de sondes, celles-ci comportent preferentiellement plus de 10 bases et, avantageusement, de 10 a 300 bases. Les acides nucleiques de l'invention peuvent etre utilises pour l'expression et/ou la production de polypeptides in vitro, in vivo ou ex vivo, dans des approches de therapie genique ou cellulaire. A cet effet, la présente invention concerne des cassettes d'expression contenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus, sous contrôle d'un promoteur permettant son expression. Differents promoteurs peuvent etre utilises dans le cadre de l'invention. Il s'agit de sequences permettant l'expression d'un acide nucleique dans une cellule mammifere. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant I'expression d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, alpha-actine, tubuline, DHFR etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, Aplat, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, alphalpha-actine du muscle lisse, etc), des promoteurs cellules spécifiques de type cellules en division comme les cellules cancéreuses ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de glucocorticoïdes, etc) ou dits inductibles. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes ElA et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leur aptitude à réprimer la transcription, d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) I'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage et (iii) la stabilité extra- et intracellulaires. Dans un merde de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé(e) dans un vecteur d'expression. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique. L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection. A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'AI ^ transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, l'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-avant. Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant. En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers de l'oesophage, les cancers du larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du nasopharynx EBV positifs, etc. Par ailleurs, la présente invention s'étend en outre à toute utilisation de composes inhibant l'activite de la proteine Ki pour inhiber la proliferation de cellules musculaires lisses. La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Figure 1: Analyse par northern blotting de 1' expression de la protéine Ki a partir des mARNs extraits de différents tissus. Figure 2 : Localisation nucléaire de Kimyc dans des cellules transfectées par la méthode d'immunofiuorescence. Figures 3 : Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX A) bleu de coomassie B) Far Westren Blotting Figure 4 : A) Représentation de la construction du gène Reporter exprimant la chloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d'un promoteur artificiel. B) . Dosage de l'activité enzymatique CAT dans des extraits cellulaires après transfection avec des vecteurs d'expression incorporant respectivement ER, GAL VP16 et ER-GAL VP16. Figure 5: Comparaison de constructions de différents mutants de délétion de GAX par rapport à la protéine GAX en entier 1-302. Figures 6: Dosage de l'activité enzymatique CAT avec différentes chimères GAL-GAX A) Sans activateur ER B) en présence d'activateur ER MATERIEZ et METHODES A) MATERIEL 1! Souche de levure utilisée: La souche YCM79 du genre S.cerevisiae (MA Ta, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2- 801, trpl-901, leu2-3,112, casll, gal4-542, gal80-538, metl6::URA3-pGAL1z'10- LacZ, HIS3::GAL7BLE) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de poumon par le système deux hybrides, Elle est cultivée sur les milieux de culture suivants:. Milieu YPD complet: -Extrait de levures (1 0gel (Difco) -Bactopeptone (20g/l) (Difco) -Glucose (20g/l) (Merck) Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco). Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco) - Glucose (20g/l) (Merck) Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20gel d'agar (Difco). Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu, il est nécessaire d'y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sont dépendantes à 50mg/ml. 2) Souches de bactéries utilisées: La souche TG1 d'Escherichia coli de génotype supE, hsdD5, thi, D(lac-proAB), F'[tra D36 pro A+B lacis lacZDM15] a été employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides recombinants utilisés. Pour la production de protéines rec centrifugées à nouveau à 3300 rpm pendant 10 mn. Elles sont remises en solution dans 1 ml de CaC12 0,1 M contenant 17,5 % de glycérol. Elles sont aliquotées et conservées à-80"C. 3) Plasmides mis en oeuvre: Les plasmides mis en oeuvre sont: Les vecteurs de la série pGBT et pAS, (Clontech),des plasmides navettes qui possèdent une origine de réplication bactérienne et de levure leur permettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ces plasmides contiennent un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Ils contiennent également le gène TRIP 1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype frpl afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ces vecteurs portent le gène de résistance à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries les possédant sur un milieu contenant de l'ampicilline. Les vecteurs de la série pGAD, (Clontech) des vecteurs qui permettent l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine d'interêt ou codée par l'ADNc provenant d'une banque de poumon, inséré au niveau d'un site EcoRI XhoI. Les vecteurs de la série pET29 (Novagen) des vecteurs qui permettent l'expression de protéines recombinantes chez coli en fusion avec le tagS. Les vecteurs de la série pGEX (Pharmacia) des vecteurs qui permettent l'expression de protéines recombinantes chez coli en fusion avec La Glutathione S-Transférase (GST). Les vecteurs de la série Bluescript (Strata gène) des vecteurs permettant d'effectuer les clonages de meme que la série des pIC (ref) et pMTL(ref) Le plasmide pGEX-2T-hGAX est le plasmide mis en oeuvre pour la transformation des E. Coli BL-21. Le plasmide pGEX-2T-hGAX nous a été aimablement donné par le Docteur K.Walsh de St. Elizabeth's Medical Center à Boston. Le plasmide pGEX-2T de base (Pharmacia) permet de produire la protéine GAX fusionnée à la Glutathion-S Transférase (GST), protéine qui a une forte affinité pour le Glutathion. La fusion GST-GAX facilitera la purification de GAX par affinité sur des billes d'agarose couplées au Gluthation. De plus, il existe un site de coupure par la thrombine qui permet ultérieurement de scinder la chimère entre GST et GAX. L ADNc hGAX est inséré sous le contrôle du promoteur hybride tac et de I opérateur lac. Le répresseur lacI en se fixant sur I opérateur lac, empêche l'ARN polymérase d'avancer. Cette répression est levée par un analogue du lactose, I'isopropyl-R-D-thiogalactoside (IPTG) qui s'associe avec lacI. Le complexe lacI-IPTG ne peut plus se fixer sur l'opérateur lac, l'ARN polymérase n'a donc plus d'obstacle. 4) Protéine Ki Production et purification Nous avons cloné le gène de la protéine Ki fusionné à un épitope myc dans le plasmide pET-29 (Novagen) à partir du plasmide pGAD contenu dans la levure. Le plasmide pET-29 produit la protéine fusionnée à l'épitope appelé S-Tag qui permet la purification de KI par affinité sur des billes d'agarose couplées à la S-protéine . La chimère SmycKI est sous le contrôle du promoteur T7 et de I opérateur lac. Les BL21 sont transformées par lp, plasmide pET-29- mycKI. Comme pour la protéine GST GAX, elles sont mises ci .ure jusqu une D.O. de 0,7 à 600 nm. Puis, l'expression de SmycKI est induite par 0, mM d'IPTG et par la T7 ARN polymérase produite par les BL-21. Les bactéries sont soniquées. Le surnageant est ensuite purifié par la méthode suivante. La purification de SmycKI se fait par affinité sur des billes d'agarose couplées à la S-protéine. La méthode est la même que pour GST-GAX excepté que la résine est lavée dans une solution contenant 20 mM de Tris pH7,5, 0,15 M de NaCI et 0,1% de Triton X-100. L'élution et la dialyse sont les mêmes que pour GST-GAX. B) METIIODES Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. et coll., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et coll. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. 1). Le système double-hybride Ce système est une méthode de clonage par interaction in vivo chez Saccharomyces cerevisiae dont le principe est fondé sur la structure modulaire du facteur transcriptionnel de levure GAL4 (7). L'activateur de transcription GAL4 a deux domaines indépendants ayant des fonctions différentes. Le domaine de liaison à l'ADN (GALDB pour GAL DNA Binding) permet à GAL4 de se fixer sur une séquence spécifique d'ADN au niveau de la région promotrice d'un gène. GA14 se trouve alors stériquement proche de la machinerie transcriptionnelle et grâce à son domaine transactivateur (GALTA), il augmente la fréquence avec laquelle la transcription est initiée sur le gène adjacent, probablement par des interactions avec l'ARN polymérase ou des protéines associées. Le principe du système double-hybride consiste à fusionner séparément GALDB et GALTA à deux protéines X et Y différentes qui, lorsqu'elles interagissent, reconstituent un complexe transcriptionnel actif. 2). Criblage des levures par la technique PCR (Polvmerase Chain Rection? Le criblage a été fait directement sur les levures. Chaque colonie de levures est mise en solution dans 10 Cll d'eau contenant 0,08% de Tween 20. Le Tween est un détergent non ionique qui permet d'augmenter la lyse des levures lors de la première étape de chauffage à 95"C. Pour les étapes ultérieures, le Tween 20 agit comme un agent protecteur de la Taq ADN polymérase. La suspension de levures est complétée à un volume final de 20 ,ul contenant les quantités ou les concentrations finales suivantes 10 picomoles d'amorce 1, 10 picomoles d'amorce 2, 1 unité de Taq ADN polymérase, 75 mM de Tris pH9, 20 mM de (NH4)2S04, 0,01% de Tween 20, 2,5 mM de MgC12 et 125 ,uM de chacun des 4 désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP et dCTP). A l'issue de la PCR, une fraction du mélange est analysée sur un gel d'agarose. On peut ainsi savoir, pour un couple donné d'amorces et pour chaque clone de levure, s'il s'agit d'une séquence d'ADN déjà identifiée. 3) Préparation des ADN plasmidiques. Les grandes quantités d'ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapide d'ADN de Proméga. Les petites quantités d'ADN sont préparées de la manière suivante: les bactéries contenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2ml de milieu LB dans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000 rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100H1 de la solution I (50mM de glucose, 25mM de tampon Tris HC1 pH8, 10mM EDTA pH8), lysées par 200,u1 de la solution II (0.2M de NaOH, 1% de SDS). La solution de lyse est ensuite neutralisée par 150CL1 de la solution III (3M d'acétate de potassium, 11.5% (v/v) d'acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu'à obtenir un précipité floconneux, 150CL1 d'un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% de chloroforme saturés en eau) sont ajoutés, et l'ensemble est agité 30 secondes. La phase aqueuse contenant l'ADN est récupérée après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm. L'ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d'isopropanol puis centrifugé 5 minutes à 14000 rpm et séché à l'air pour enfin être repris dans 20111 de TE RNAse (solution de Tris-HCl 10mM et d'EDTA lmM avec 50Rglml de RNAse). 4) Synthese et Amplification enzvmatique d'ADN ou PCR (Polvmerase Chain Rection). Les réactions de PCR sont effectuées dans un volume final de 100cri en présence de la matrice d'ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgC12 lmM, KC1 5 mM, gélatine 0,01%), de 0,5 pg de chacun des oligonucléotides et de 2,5 Ul d'Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide (5%). Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour limiter l'évaporation de l'échantillon. L'appareil utilisé est le "Crocodile II" d'Appli gène. Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90"C, une température d'hybridation des oligonucléotides à la matrice inférieure de 5 à 10 degrés à la température de séparation des oligonucléotides et une température d'élongation par l'enzyme à 72"C. Les fragments obtenus par PCR, servant pour des clonages sont systématiquement resequencé une fois cloné, de manière à vérifier l'absence d'éventuelle mutation apparue lors de l'amplification. Les oligodéoxynucléotides sont synthétisés chimiquement selon la méthode des phosphoramidites en utilisant des groupements protecteurs B-cyanoéthyles (Sinha 1984). Après synthèse, les groupements protecteurs sont éliminés par traitement à l'ammoniaque et deux précipitations au butanol permettent de purifier et de concentrer les oligodéoxynucléotides (Sawadogo, 1991). La concentration en ADN est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. 5! Ligatures Toutes les réactions de ligature sont effectuées à +140C pendant une nuit dans un volume final de 10 ,ul en présence de 100 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 g d'insert, 40 UI d'enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et un tampon de ligature (Tris-HC1 50 mM pH 7,8; MgC12 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 mM). Le témoin négatif est constitué par la ligature du vecteur en l'absence d'insert. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué le cas échéant avant ligature par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. 6) Transformation des bactéries La transformation des bactéries par un plasmide est effectuée selon le protocole suivant: La totalité du volume de ligature (10,ut) est utilisée pour transformer les bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode de Chung et al, (PNAS,1988 86, 2172-2175). Les bactéries TG1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37"C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100 g/l de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgC12, 10 mM de MgSO4) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 40C pendant 30 à 60 minutes, 200C11 de bactéries sont mises au contact des produits de ligature pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 2001l1 de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37"C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline. 7) Séparation et extraction des ADN La séparation des ADN est réalisée en fonction de leur taille par électrophorèse. Pour ce faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer: -gel d'agarose à 1% (Gibco BRL) dans un tampon TBE (Tris base 90mM; Borate 90rnM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d'ADN (supérieurs à 500pdb) -gel d'agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBE pour la séparation de petits fragments (infèrieurs à 500 pdb). Toute migration sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans un tampon TBE et en présence d'un marqueur de poids moléculaire (1Kb ladder, Gibco BRL). L'ADN eat mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200gel de Ficoll, 0,5gel de bleu de bromophénol, 50mM d'EDTA) avant d'être déposé sur gel. Après migration à 100 Volts et coloration au bromure d'éthydium (concentration 0.5Fg/ml de gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV. L'extraction de l'ADN de la bande d'un gel d'agarose est réalisée par électroélution comme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d'ADN est découpé au scalpel et mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à 500,u1 de TBE. L'ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse ou il subit un champ électrique de 100 Volts. L'ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié par deux extractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puis précipité en présence d'acétate de sodium 0,3M et de 2,5 volume d'éthanol absolu. Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d'ADN est séché puis repris dans 20,u11'eau. 8) Séquençage fluorescent des ADN plasmidiques. Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4 didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L'incorporation de l'un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taq polymérase de l'ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d'ADN de tailles différentes, tous terminés en 3' par un des 4 didéoxyribonucléotides. Un g d'un plasmide et 4 picomoles d'un primer sont ajoutés à 9,5R1 d'un "préfix" fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prisme Le volume final doit être de 20,u1 pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape de dénaturation à 96"C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation à 50"C pendant 15 secondes et une étape d'élongation à 60"C pendant 4 minutes. Les fragments d'ADN, obtenus après amplification, sont purifiés sur colonne d'exclusion (Chromaspin-30 de Clontech); et sont ensuite séchés au Speed Vac. L'ensemble est repris par 5p1 d'un mélange formé de 24,u1 d'EDTA (50mM) et 120,ul de formamide désionisée. Après dénaturation à 96"C pendant 3 minutes, 3 à 5ll1 sont déposés sur un gel d'électrophorèse. Les différents fragments d'ADN sont séparés suivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l'Appareil 370 DNA sequencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescences vont etre détectées. 9) Préparation de plasmides de la banque de poumon (Clontech). La banque de fusion d'ADNc de poumon est vendue sous forme de bactéries. Cette banque provient du clonage, au niveau du site EcoRI-XhoI du plasmide pGAD424 (Materiel et Methodes), d'ADNc correspondant aux ARN totaux de cellules de poumon humaines. Après vérification du titre de la banque, 2,u1 de bactéries de la banque de fusion de poumon, mises au préalablement dans 8 ml de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm2 contenant un milieu LB+ampicilline. Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuber dans un shaker à 37"C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique de la Maxiprep. La concentration en ADN sera determinée à 260nm. 10) Transformation de la levure par un plasmide. Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans Iml d'eau stérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remis en suspension dans 1 ml d'eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération est répétée une nouvelle fois afin d'éliminer toute trace du milieu de culture. Les levures sont ensuite reprises par 1 ml de la solution I de transformation (LiAc 0. 1M, Tris-HC1 pH 7,5 10mM, EDTA ImM). puis centrifugées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Le culot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 50,u1 de cette suspension de levures sont mis en présence de 50,ug d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 g d'ADN plasmidique. 300l d'une solution II de transformation (LiAc 0.1M, Tris-HC1 pH 7,5 10mM, EDTA lmM dans du PEG4000 40%) sont ensuite ajoutés, puis l'ensemble est mis à incuber à 28"C pendant 30 minutes. Un choc thermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à 40"C pendant 15 minutes puis l'ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mn afin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 2001 d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises à cultiver pendant 72 heures à 28"C. Dans le cas particulier de la tranformation de la levure par la banque d'ADNc de poumon, on procède comme suit: La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-GAX exprimant la proteine GAX sous forme fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de GAL4. Elle est cultivée dans 250ml de milieu minimum YPG à 28"C sous agitation jusqu'à une densité de 107 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250ml d'eau. Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire est repris dans 100ml d'eau et à nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28"C sous agitation. Après centrifugation les cellules sont à nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 ,ul de la banque d'ADNc de poumon et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28"C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42"C pendant 20 minutes. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite, en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d'eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. Ainsi le PEG toxique pour les cellules a été éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Met et les bases Ura et Ade et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28"C. Les 100 Cll de cette suspension restants servent à vérifier l'efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 10-2, 10-3 et de cette suspension ont été réalisées. La culture de nuit est centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l'eau stérile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d'eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10ml dans de l'eau stérile, sont utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cm2 contenant un milieu YNB+Lys+Met+His+Ade, et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 ,ul restants sont utilisés pour effectuer les mêmes opérations que lors de la détermination du taux de transformation, afin de déterminer le taux d'amplification du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture. 11) Preparation de L'ADN (génomique et plasmidique de levure La valeur d'une anse moyenne d'un clone de levure est mise dans 200C11 d'une solution TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI 100mM, Tris pH8 10mM, EDTA lmM), en présence de 3g de billes de verre de 450 ,um de diamètre et de 200CL1 de phénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est séché et repris dans 20p1 de TE-RNAse. Cette solution d'ADN, qui correspond à un mélange d'ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer des bactéries. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de miniprep. 12) Test d'activité de la beta-galartesidase. Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Grâce au phénomène d'adsorption on obtiendra une image fidèle de l'emplacement des clônes. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité beta-galactosidase. Après décongelation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablement imbibé de 1,5ml de solution PBS (Na2HP04 60mM, NaH2P04 40mM, KC1 10rnM, MgSO4 lmM, pH7) et de 10 à 30R1 de X-Gal (5bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) à 50mg/ml dans du N,Ndiméthylformamide. La boite est ensuite placée dans une étuve à 37"C couvercle fermé pour éviter le dessèchement . Le temps d'apparition de la couleur bleue peut être trés variable, de quelques minutes à plusieurs heures. Ce test doit toujours se faire en présence d'un témoin positif dont l'interaction est connue et vire rapidement au bleu. 13! Construction des vecteurs d'expression et du gène reporter a) Vecteurs d'expression Le cDNA du recepteur aux oestrogènes (ER) est obtenu par transcription inverse (RT) à l'aide d'un kit commercial (first strand cDNA synthesis Kit de Pharmacia), à partir d'ARN total extrait d'utérus de souris, suivie d'une amplification par PCR. Nous avons utilisé un couple d'amorces spécifiques s'hybridant, en 5' avec les 20 premiers nucleotides de ER et introduisant un site EcoR Ijuste en amont du premier codon (5'gagcgaattcATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID N06, les nucleotides en italique représentent le site EcoR I et en capitales soulignées le premier codon), du côté 3' I'amorce retour débute au codon stop de ER et introduisant également un site EcoR I (5'- gagcgaattc ACTGATCGTGTTGGGGAAGC SEQ ID N"7, les nucleotides en italique représentent le site EcoR I et en capitales soulignées le codon stop). Le fragment PCR obtenu a été purifié, digéré par EcoRI puis cloné au même site dans le vecteur d'expression pCDNA 3 (Invitrogen). Ce vecteur est appelé pCMV-ER. Les différents mutants de délétions de GAX fusionnés au domaine de liaisons à l'ADN de GAL4 (pCMV-GALDB/GAX, voir exemple 9) ont également été clonés dans le vecteur pCDNA 3. b) Gène reporter Le gène reporter a été construit selon la stratégie décrite par Martinez et al (Martinez et al. 199 1,Mol. Ceil. Biol. 11,2937-2945) excépté que le vecteur de clonage utilisé est le pG5CAT (Clontech, CAT = Chloramphenicol Acetyl Transférase). Nous avons synthétisé un oligonucléotide double brin ( ci dessous) contenant deux sites spécifiques (en caractères gras) l'un reconnu par le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (Gal- 17mer, Carey et al. 1989, J. Mol. Biol. 209,423-432) et l'autre est une séquence consensus du "Estrogen Responsive ~liement" (ERE, Beato M. 1989, Cell 56,335344) qui lie le recepteur aux oestrogènes. Cet oligonucléotide adaptateur possède en 5' un site XhoI protrusif et en 3' un site XbaI qui ont permis le clonage dans les sites Xho I et Xba I de pG5CAT. SEQ ID N"8 tcgagAGGTcATATTGAcCTaagcttCGSGTCSGAGTACTGTCCTCCGACTSCcatatgt cTCCAGTATAACTGGAttcgaaGCCCAGCCTCATGACAGGAGGCTGACGgtatacagatc xhcl ERE Gal-l 7mer ha Le principe de ce gène reporter (pEREGlCAT, Fig 4, exemple 11)) repose sur le fait que ER est un activateur transcriptionnel possédant, dans le cas du ER murin, une activité constitutive qui augmente en réponse à son ligand naturel, I'oestradiol 17-ss. Ce système a été utilisé par Matinez et al pour étudier la synergie entre ER et un second facteur transcriptionnel, NF1, dont le domaine activateur de la transcription a été fusionné au domaine de liaison à 1' ADN de la protéine de levure GAL4 (GALDB). Ce reporter permettait, ainsi, de rendre compte du taux de transcription du uniquement à l'un ou l'autre des facteurs transcriptionnels ou de leur coopération ssans interférence due à des molécules endogènes. Ce système nous permettra donc d'étudier l'activité transcriptionnelle de toute ou partie de la protéine GAX fusionnée au GALDB (Fig. 5,6 et exemples 12,13). Nous avons construit un plasmide exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur CMV (pCMV-Luc). Cette construction a été obtenue après clonage d'un fragment de PCR (flanqué en 5' et en 3' d'un site BamHI) contenant le promoteur CMV du vecteur pCDNA3 (Invitrogen), dans le site BglII du vecteur pGL3-Basic (Promega). Ce plasmide servira de standard interne dans toutes les expériences de transfection transitoire qui suivent. 14) Exnériences de cotransfection transitoire Nous avons réalisé toutes les études dans les fibroblastes embryonnaire murins NH- 3T3 (ATCC). Ces cellules ont été entretenues en routine dans du DMEM (GIBCO) supplémenté avec 100 U/ml de pénicilline (GIBCO), 100 ,ug/ml de streptomycine (GBCO), 2 mM L-glutamine (GBCO) et 10% de sérum de veau foetal (SVF,GIBCO). Ce milieu sera désigné par l'abbréviation DMEM-GPS/SVF. Pour les expériences de transfection transitoire les NIH-3T3 sont ensemencées à une densité de 100000 cellules par puit d'une plaque de culture de 24 pui C 7siia pCMV-Luc 50 ng 50 ng 50 ng 50 ng pEREGICAT* 650 ng 650 ng 650 ng 650 ng pCMV-ER - - 150 ng 150ng pCMV-GALDB/GAX - - 150 ng 150 ng pCDNA3** 300 ng Lipofectamine*** 8 mu 8 llg 8 Zg 8 H20 qsp 50 l 50 1 50 Cil 50 i Tableau 3 *Les différents mélanges, numérotés de 1 à 4, sont conçus pour étudier respectivement, I'activité basale du promoteur EREG1CAT, l'activité de ER ou de GADB/GAX seuls et enfin l'effet simultané de ER et de GALDB/GAX. ** pCDNA3 est utilisé pour compléter chaque mélange à 10 g total *** La lipofectamine à 2 g/ l (gibco) est utilisée à un rapport de 8/1 (lipofectamie/ADN). Les cellules sont mises en contact avec les différents mélanges de transfection pendant 4 heures à 37 C dans les conditions standard de culture. Le DMEM-GPS, avec le mélange de transfection, est ensuite remplacé par 1 ml de DMEM-GPS/SVF puis les cellules sont maintenues en culture pendant 24 heures. Chaque transfection est effectuée sur au minimum 4 puits. A la fin de la période de 24 heures, les cellules sont lavées avec 0,5 ml de Dulbecco's PBS (GIBCO) puis récoltées dans 0,5 ml d'une solution de trypsine 0,2% dans du PBS (GIBCO). La trypsine est neutralisée par 10 l de SVF. Cette suspension cellulaire est centrifligée pendant 2 min à 10000 g, le surnageant est retiré puis les cellules sont resuspendues dans 150 1ll de Tris-HCl 0,25 M à pH 7,8. 50 ,ul de cette suspension sont utilisés pour doser la l'activité luciférase selon le Kit "luciferase Assay System" (Promega) et à l'aide du luminomètre LUMAT LB 9501 (EG & G Berthold). Les protéines cytosoliques des cellules dans les 150 1 restants sont extraites par 5 cycles de congelations/décongélation (azote liquide/3 7 C). Ces dextraits, normalisés par rapport à l'activité luciférase, sont ensuite utilisés pour doser l'activité CAT selon la méthode précédemment décrite par Gorman et al (Gorman et al. 1982, Mol. Cell. Biol. 5,1044-1051). 15) Interaction in vitro entre les proteines Ki et GAX Elle est réalisée par la méthode du Far-Western Blotting. Alors que le Western Blotting consiste en une séparation électrophorétique de protéines sur un gel dénaturant suivi d'un électrotransfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose et d'une immunodétection directe ou indirecte, le Far Western Blotting est un Western Blotting auquel se rajoute une étape d interaction protéine-protéine entre une cible immobilisée sur la membrane de nitrocellulose et un facteur en solution. a) Electrophorèse Les échantillons sont chauffés 10 minutes à 95"C dans un tampon de dénaturation pour protéines contenant 50 mM de Tris pH6,8, 2% de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate), 10% de glycérol, 300 mM de b-mercaptoéthanol et 0,1% de bleu de bromophénol. 10 ml des échantillons sont déposés sur un gel Tris-Glycine 14% Acrylamide (Tris-Glycine Gels, Novex). La migration se fait pendant 1 heure à un voltage constant de 120 V dans un tampon de séparation pour protéines ( 35 mM de SDS, 1,92 M de Glycine et 85 mM de Tris pH8,3). Le poids moléculaire des protéines sera déterminé par la migration en parallèle d un standard de poids moléculaire coloré et transférable (MultiMarkTM Multi-Colored Standard, Novex). Ce gel est fait en double pour pouvoir en parallèle colorer I un des deux au bleu de Coomasie (Méthanol 30%, eau 60%, Acide acétique 10%, Bleu de Coomasie 0,1%). La coloration est de 1 heure. La décoloration s effectue, pendant plusieurs heures, en changeant plusieurs fois la solution décolorante (Méthanol 30%, Acide acétique 10%, eau 60%). La limite de détection de cette méthode est de 50 ng de protéines. Ce gel coloré nous permet donc de visualiser toutes les protéines déposées. L'autre gel est utilisé pour le "Far Western Blotting". b)Transfert semi-sec sur une membrane de nitrocellulose La membrane de nitrocellulose (Hybond C de Amersham) et le gel sont pris entre 3 épaisseurs de papier Whatman préalablement immergé dans le tampon de transfert (Glycine 150 mM, Tris 25 mM, Méthanol 20%, eau qsp 1 litre, pH8,3) Le transfert s effectue pendant 40 minutes à 2,5 mA/cm2 de gel (appareil MilliblotTM-Graphite Electroblotter II, Millipore). c) Interaction protéine-protéine La membrane est saturée pendant 30 minutes sous agitation et à température ambiante dans du PBS contenant 5% (p/v) de lait ecrémé en poudre (Gloria) et 0,2% (v/v) de Tween 20. Ensuite, elle est immergée pendant 1 heure sous agitation et à température ambiante dans 5 ml de PBS contenant 5% (p/v) de lait ecrémé en poudre (Gloria), 0,2% (v/v) de Tween 20 et 75 ,ug de KI. L'incubation terminée, la membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans du PBS contenant 0,2% (v/v) de Tween 20. Afin de viualiser 1 interaction entre GST-GAX immobilisé sur la membrane de nitrocellulose et mycKi celui ci est révéler comme pour GST-GAX à I aide d un anticorps monoclonal de souris dirigé contre I épitope myc (Santa Cruz) et d'un anticorps polyclonal de lapin couplé, à la peroxidase, dirigé contre les IgG de souris (Nordic Immunology). EXEMPLES EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur Permettant l'expression d'une protéine de fusion entre GAX et le domaine de liaison à I'ADN de GAL4 Le criblage d'une banque utilisant le système double hybride nécessite que la protéine GAX soit fusionnée au domaine de liaison à l'ADN de la protéine transactivatrice GAL4. L'expression de cette protéine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBT10 (cf matériels et méthodes), dans lequel nous avons introduit, dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à l'ADN de GAL4 (GAL4DB), un fragment codant pour tout ou partie de la proteine GAX. Un fragment particulier comprend le fragment EcoR1-Sall issu de phGAX, qui est inséré au niveau du site EcoR1-Sall de pGBT10 pour donner le plasmide pCM199. La construction a été séquencée ce qui permet de vérifier que la proteine GAX est bien dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant au GAL4DB. EXEMPLE 2: Criblage de la Banaue de fusion de poumon. Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec la protéine GAX ou des domaines de celle-ci. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs URA3, BLE et LacZ dans la souche YCM79. Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de poumon humain. Comme cette banque nous a été fournie sous forme de bactéries, l'ADN plasmidique de la banque a tout d'abord été purifié. 2.1) Préparation de l'ADN plasmidique d'une banque de fusion.. L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de poumon a été extrait suivant le protocole ClontechQ (voir matériels et méthodes, 10). Lors de cette préparation il était important de préserver la représentativité de la banque, c'est à dire, conserver le nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 7.106 plasmides. Afin de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cette préparation. le lot d'ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de trois fois la représentativité de la banque soit 25.106 colonies. 2.2) Transformation par banque de poumon et sélection par le test d'activité betagalactosidase. Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-GAX. Pour préserver cette probabilité il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour cela nous avons choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de cellules transformées par g d'ADN. De plus comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré utiliser une levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-GAX. Cette souche de levure a été transformée par 100g d'ADN plasmidique de la banque de fusion. Cette quantité d'ADN nous a permis d'obtenir après estimation (voir matériels et méthodes) 4,2 i07 cellules transformées, ce qui correspond à un nombre supérieur au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque. D'après ce résultat nous pouvons penser que la quasi totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Met+His+Ade. A l'issu de cette sélection 190 clones avec un phénotype Ura+ et bGal+ ont été obtenus. EXEMPLE 3: Identification des inserts des plasmides selectionnes : Mise en evidence d'une interaction avec Ki Les plasmides sont extraits de la levure, introduits dans la bacterie puis préparés comme décrit dans le materiel et methode. Le séquençage a été réalisé à partir de l'oligonucléotide CTATTCGATGATGAAGATACCCC SEQ ID N91 complémentaire de la région de GAL4TA à proximité du site d'insertion de la banque de cDNA de poumon, à 52 pdb du site EcoRI. La comparaison des séquences avec les séquences contenues dans les banques de données GENBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré qu'un des plasmides ainsi identifiés comporte un ArTo identique au facteur Ki, identifié chez des patients atteints de lupus comme autoann gène. Ce plasmide est baptisé pCM282. Ce plasmide, quand il est cotransformé dans la levure avec pCM199, est bien capable d'activer les gènes rapporteurs de celle-ci comme le montre le Tableau 1 ci-dessous. Ce Tableau montre en outre que l'activation est specifique, ce qui indique que Ki est capable d'interagir de maniere specifique avec GAX. Vecteurs Activite beta-gal pCM199 + pGAD424 O pCM199 + pCM282 + pGBTlO + pCM282 0 pGBTlO + pGAD424 O Tableau 1 EXEMPLE 4: Construction de vecteurs permettant l'exDression dans la levure d'une protéine de fusion entre différents délétants de GAX et le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 Cet exemple decrit la construction de vecteurs codant pour differents variants de la proteine Gax, utilisables pour determiner la structure fonction de cette proteine et notamment, mettre en evidence les domaines actifs et les domaines responsables de l'interaction avec la proteine Ki. La deletion des 153 aminoacides C-terminaux est obtenue en digérant le plasmide pCMl99 par Eagl-Sall, puis le petit fragment est éliminé, les extrémités sont rendues blunt par traitement à la klenow et religuées. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pCM238. fi code pour une proteine comportant les résidus 1-104 de GAX. La digestion totale par Bgl2 et Sall de pCMI99 puis la religation du vecteur apres traitement à la klenow permet de conserver les 32 premiers aminoacides de GAX. Le plasmide ainsi obtenu est appellé pCM244. Il code pour une proteine comportant les résidus 1-32 de GAX. La digestion totale par Bgl2 et Sall de pCMl99 permet d'isoler un fragment d'environ 270pb et 572pb. Le premier fragment est cloné dans pGBTll au site Bamhl-Sall pour obtenir le plasmide pCM245 qui permet la fusion des 79 aminoacides C-ter avec le GAL4DB. Le second fragment est cloné dans pGBT10 au site Bamhl pour obtenir le plasmide pCM246 qui permet la fusion des aminoacides 33 à 222 avec le GAL4DB. Le plasmide pCM280 est obtenu en digérant pCM246 par Dra3 et pstl. Apres traitement a la T4 polymerase le plasmide est refermé sur lui même. Il code pour une proteine comportant les résidus 33-63 de GAX. Le plasmide pCM199 est digéré par Ndel et Pstl. L'insert est cloné dans le plasmide pASl pour donné le plasmides pCM301. Ce plasmide permet l'expression de la protéine GAX délétée de ces 33 premiers aminoacides fusionnée au GAL4DB. I1 code pour une proteine comportant les résidus 36-302 de GAX. La structure de la proteine de fusion exprimee par ces differents vecteurs est representee sur la figure 1. EXEMPLE 5: Localisation de la zone d'interaction de GAX avec Kl. La souche de levure yCM79 est transformée par les différents vecteurs décrits dans les exemples I et 4 en même temps que pCM282 ou que pGAD424. L'activité Betagal est révélée comme décrit dans le materiel et methodes. Les resultats obtenus sont presentes dans le Tableau 2 ci-dessous. Vecteurs Activite beta-gal pCM199 + pGAD424 0 pCM199+ pCM282 + pCM238 + pGAD424 O pCM238 + pCM282 O pCM244 + pGAD424 O pCM244 + pCM282 0 pCM245 + pGAD424 O pCM245 + pCM282 0 pCM246 + pGAD424 O pCM246 + pCM282 0 pCM280 + pGAD424 + pCM280 + pCM282 pGBT10 + pCM282 0 pCM397 + pCM282 + Tableau 2 Ces resultats permettent de révéler la région de GAX qui interagit avec le facteur Ki (Tableau 2). En fait les regions là 32 et 104 à 223 semblent importantes pour l'interaction avec Ki. EXEMPLE 6 : Profil d'expression de l'ARNm dans différents tissus et localisation nucléaire de la protéi) exprimée transitoirement: Afin d'identifier des partenaires de GAX nous avons transformer notre souche de levure 2 hybride, possédant déjà le plasmide permettant l'expression de la fusion GAL GAX (1-302) comme appât, par une banque d'ADNc de poumon fusionnée au GAL4 TA, disponible au laboratoire (exemple 2). Nous avons pu obtenir avant amplification plus de 41 millions de clones indépendants et seulement 190 clones dans lesquels les trois gènes de sélection (i.e. le gène URA3, le gène LacZ et le gène BLE) sont exprimés. 9 ADNc codant pour des protéines différentes ont pu être identifies parmi ces 190 clones. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés a celui codant pour l'antigène Ki. Le gène Ki semble ubiquitaire comme le suggère l'analyse par northern blotting (Figure 1) de son expression a partir des mRNA extrait de différents tissus (human Multiple Tissu Northern Blots, Clontech) révélant un mRNA d'environ 3 kb . On peut noter la présence d'une forme de mRNA subissant une maturation différente (1,4 kb) dans le coeur et les muscles squelettiques. Nous avons construit un vecteur d'expression codant pour le gène Ki auquel nous avons fusionné un épitope myc puis nous avons montré par immunofluorescence indirecte que Kimyc a une localisation nucléaire dans des cellules transfectées par cette chimère (Figure 2). EXEMPLE 7: Expression et purification de la proteine Ki fusionnée au tae S et taa mvc. Les oligos suivants sont hybridés ensemble, phosphorilés puis ligués avec pET29B préalablement digéré par Nco 1. CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC (SEQ ID N"2) et CATGGATCCACGTGCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATAAGC TT (SEQ ID N"3) Le plasmide obtenu est nommé pCM320. Le gène codant pour la protéine Ki est amplifié par pcr avec les oligos CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG (SEQ ID N"4) et GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC (SEQ ID N"5). Le fragment obtenu est digéré par Bamhl Xhol puis introduit, aprés ligation, aux sites bamH1-Xhol du plasmide pBCks pour donner le plasmide pCM305. Ce dernier est ensuite digéré par Bamhl Xhol. L'insert ainsi libéré est ligué au site Bamhl et Xhol de pCM320 pour donner le plasmide pCM321. L'expression et la purification de la protéine recombinante sont réalisées suivant les indications du fournisseur (Novagen) à partir de pCM321 EXEMPLE 8: Expression et purification de la proteine GAX fusionné à la GST Des colonies de BL-21 transformées par le plasmide pGEX-2T-h-GAX sont mises en préculture dans 30 ml de LB avec ampicilline (50 Clg/ml) à 37"C toute la nuit. 5 ml de cette préculture sont remis en culture dans 500 ml de LB avec ampicilline à 37"C jusqu à une densité optique de 0,7 à 600 nm. L'expression de GST-GAX est induite par 0,1 mM d'IPTG pendant 2 heures à 30"C. La culture est centrifugée à 6000 rpm pendant 10 mn. Les culots de bactéries sont remis en solution dans 10 ml de PBS froid puis répartis dans 10 tubes eppendorf. Les protéines bactériennes sont extraites par sonication pendant 10 minutes avec des cycles de 12 secondes et des pauses de 24 secondes suivi d'une centrifugation de 15000 rpm pendant 15 minutes. Les surnageants sont regroupés et constituent la fraction soluble qui sera utilisée pour la purification. Les culots restant représentent la fraction insoluble. La purification de GAX se fait par affinité de la GST sur des billes d'agarose couplées au Glutathion. Le surnageant obtenu après sonication des bactéries est incubé avec la résine pendant une heure sur un agitateur rotatif à température ambiante. Ensuite, la résine sur laquelle la protéine s'est liée est centrifugée à 1000 rpm pendant 10 minutes. Le surnageant éliminé, la résine est lavée 3 fois par 50 ml de PBS contenant 1% de Triton X-100 pendant 20 minutes sur I agitateur rotatif. GST-GAX peut être élué de la résine par de la guanidine thiocyanate. L élution se fait par 1,5 fois le volume de résine de 2M de guanidine thiocyanate, de 20 mM de Tris pH7,5, de 0,15 M de NaCI et de 0,1% de Triton X-100 sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes. L'éluat est dialysé contre du PBS toute la nuit pour éliminer la guanidine thiocyanate. La protéine est conservée dans du PBS à 40C. Un cocktail d inhibiteurs de protéases à quantité égale (Leupeptine lmglml, Pepstatine lmg/ml, Aprotinine lmg/ml, Benzamidine 500 mM) est ajouté au 1/200 ème à la préparation protéique. EXEMPLE 9: Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX Pour étudier l'interaction de GAX et de Ki in vitro, nous avons produits deux protéines recombinantes chimériques dans Escherichia Coli. GST-GAX a été purifiée sur une résine couplée au glutathion grâce au site catalytique de la glutathione Stransférase (GST); SmycKi portant un épitope myc et l'épitope S permettant la purification sur une résine couplée à la protéine S. Les quantités indiquées d'albumine bovine, de la protéine GST ou de GST-GAX après digestion par la thrombine (site créé entre GST et GAX),, ainsi que des quantités croissantes de GST-GAX, ont été séparées sur un gel dénaturant de polyacrylamide puis colorées au bleu de coomassie (Figure 3 A). Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose à partir d'un gel identique à celui en A. La membrane a été incubée successivement en présence de SmycKi, dans une solution contenant un anticorps monoclonal de souris dirigé contre l'épitope myc (Santa Cruz) et finalement dans une solution pour la détection de l'anticorps anti-myc. Nos résultats montrent clairement que Ki reconnaît spécifiquement GST-GAX et de manière dose dépendente, alors qu'aucune réaction n'est observée avec l'albumine bovine ou GST. Noter qu'après digestion par la thrombine Ki interagit toujours avec GAX (Figure 3 B). EXEMPLE 10 : Construction de vecteurs permettant l'expression dans les cellules de mammifére d'une protéine de fusion entre différents délétants de GAX et le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 10.1. Construction de vecteurs plasmidiques Les plasmides pCM199 et pCM301 sont digérés par HindIII. Les inserts sont clonés dans la correcte orientation dans pCDNA3 (invitrogen) au site HindIII pour donner respectivement les plasmides pCM291 et pCM327, permettant l'expression des fusions dans des cellules de mammifère. Les plasmides pCM238, pCM244, pCM301, pCM246, et pCM280 sont digérés par Hindffi et NaeI. Les inserts sont clonés dans la correcte orientation dans pCDNA3 (invitrogen) au site HindIII-EcoRV pour donner respectivement les plasmides pCM292, pCM326, pCM327, pCM294 et pCM295, permettant l'expression des fusions dans des cellules de mammifére. 10.2. Construction de vecteurs viraux Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et I'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence nucléique de l'invention (CfFR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El wnd préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de ladénovirus Ad5. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques de l'invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectifs, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n" WO 94/26914 et W095/02697 ou dans Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intéret, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d' rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine Moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine Moloney sarcoma virus"), le HaSV ("Harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("Rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant une séquence nucléique nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques. 10.3 - Vecteurs chimiques Les acides nucleiques ou les vecteurs d'expression plasmidiques decrits les exemples précédents peuvent etre administres tels quels in vivo ou ex vivo. Il a en effet ete montre que les acides nucleiques nus pouvaient transfecter les cellules. Cependant, pour ameliorer l'efficacite de transfert, on prefere utiliser dans le cadre de l'invention un vecteur de transfert. Il peut s'agir d'un vecteur viral (exemple 9.2.) ou d'un agent de transfection synthetique. Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098) polyéthylène imine (W096/02655) et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants. EXEMPLE 11 : Mise au point d'une méthode permettant l'étude de l'activité transcriptionnelle de GAX Nous avons utilisé un système de transfection transitoire pour étudier l'activité transcriptionnelle propre aux fusions GALDB-GAX ainsi que leur effet sur des activateurs transcriptionnels comme le récepteur aux oestrogènes (ER) ou le domaine d'activation acide de la protéine VP16 du virus Herpes simplex fusionné à GALDB. *Afin de quantifier l'activité transcriptionnelle de chacun ou de la combinaison de plusieurs facteurs, nous avons construit un gène cible (Reporter) exprimant la chloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d'un promoteur artificiel. Ce promoteur contient une boite TATA, provenant du gène E lB de l'adénovirus Ad2 (E1B TATA), en amont du site d'initiation de la transcription du gène CAT (Figure 4 A). Une protéine TBP du complexe TFIID, reconnaît la boite TATA et positionne le complexe de preinitiation (TFIID + TFII A,B,E,F) lequel recrute l'ARN polymérase de type II (PolII) qui va initier la transcription du gène CAT. En amont de ce promoteur basal nous avons inséré un site de liaison GALDB (17mer) qui sera reconnu par les chimères GALDB-GAX ou GALDB-VP16. Nous avons également cloné en amont du 17 mer un élément de réponse aux oestrogènes (ERE) sur lequel ER se lie pour activer la transcription. Ce reporter nous permettra d'étudier les différentes combinaisons schématisées, une activation ou une repression de la transcription se traduira par une modification de la quantité de CAT dans une cellule. Le dosage de l'activité enzymatique CAT dans les extraits cellulaires après transfection est utilisée pour mesurer l'effet transcriptionnel. ER et GAL4-VP 16 sont des activateurs transcriptionnels très forts. L'activité CAT est augmentée de plus de 100 fois par ER et environ 85 fois par GAL4-VP16. La coexpression de ER et GAL4-VP16 résulte en une activité CAT de plus de 300 fois celle du reporter non activé et supérieure à la somme des deux activateurs exprimés individuellement. Ceci suggère que ER et GAL4-VP16, malgré l'encombrement sterique, peuvent occuper et activer le même promoteur (Figure 4 B). EXEMPLE 12 : Etude de l'activité transcriptionnelie des fusions GAH > B-GAX et identification d'un domaine represseur de la transcription Le gène GAX code pour une protéine de 302 acides aminés chez l'homme. La structure primaire de cette protéine présente différents domaines dont la fonction reste inconnue. GAX appartient à une famille de gènes dite à homeoboite (HOMEOBOX). l'Homeobox est nécessaire à la reconnaissance et à la liaison de ces protéines sur des séquences d'ADN spécifiques présentes sur le promoteur des gènes cibles dont ils contrôlent l'expression. A ce jour aucune séquence d'ADN reconnue par GAX n'a été identifiée. GAX possède une région riche en résidus Histidine (HIS) dans sa partie Nterminale dont la fonction est inconnue. Pour comprendre la fonction de GAX nous avons délété différentes régions du gène GAX humain pour produire des protéines tronquées aussi bien dans leur partie Nterminale que C-terminale, les nombres indiquent la position du premier et du dernier acide aminé de chaque mutant de délétion par rapport à GAX entier 1-302 (Figure 5). Ne connaissant pas de séquence d'ADN reconnue naturellement par GAX, nous avons créés des chimères entre les différents mutants de délétion et un domaine de liaison à l'ADN heterologue (fusionné à leur partie N-terminale) provenant du facteur transcriptionnel de levure GAL4 (GALDB). Des vecteurs d'expression ont été construits pour exprimer transitoirement les différentes chimères dans des cellules de mammifère en culture Les différentes chimères GAL-GAX ont été exprimées seules ou en présence de ER pour étudier leur effet respectivement sur la transcription basale ou sur l'activité transcriptionnelle de ER. GAX entier, dans le contexte de la fusion GAL-GAX1-302, diminue de plus de 8 fois l'activité CAT par rapport au reporter non activé. Cette répression est faiblement affectée lorsque les 36 acides aminés N-terminaux de GAX sont absents (GAL GAX33-302) mais elle est totalement levée lorsqu'une délétion supplémentaire supprime la partie C-terminale de GAX (GAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminés suffisent dans le contexte de GAL-GAX1-32 pour diminuer l'activité CAT (Figure 6 A). La coexpression de GAL-GAX1-302 et de ER résulte en une activité CAT plus 25 fois inférieure à celle obtenue avec ER seul. Cette répression comme en A est due au 32 premiers acides aminés de GAX (comparer GAL-GAX1-302, GAL-GAX33-302 et GAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminés N-terminaux (GAL-GAX1-32) diminuent l'activité de ER seulement de 2 fois (comparer GAL-GAX1-32, GAL-GAX1-104) et nécessitent au minimum la présence des résidus 33 à 222 pour une activité maximale (Figure 6 B). Ces résultats montrent que GAX réprime la transcription du gène reporter utilisé. Cette répression est essentiellement due à un peptide N-terminal (1 à 32) dont l'activité optimale nécessite la présence de la région 33 à 222 de GAX. En utilisant les différentes délétions de GAX fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de GAL4, nous avons pu identifier dans la levure ( par le système double hybride, Exemple 5) les régions de GAX importantes pour l'interaction avec Ki. Il s'agit de la partie N-terminal jusqu'au résidu 222. Cette région comprend, comme nous l'avons montré plus haut, le domaine répresseur de GAX. LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON (C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE SERINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 50 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGCTGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC 50 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 53 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTCT GCTCCATAAG CTT 53 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GAGCGAATTC ATGACCATGA CCCTTCACAC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 60 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N"8: TCGAGAGGTC ATATTGACCT AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCCTCCGAC TGCCATATGT CTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG ACGGTATACAGATC REVENDICATIONS 1. Polypeptide caracterise en ce qu'il s'agit en tout ou partie d'un fragment de la proteine GAX possedant une activite de represseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication de l'ADN. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caracterise en ce qu'il comprend au moins les résidus 1 à 32 de la proteine GAX humaine. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caracterise en ce qu'il comprend au moins les résidus 140 à 230 de la proteine GAX humaine. 4. Polypeptide caracterise en ce qu'il comprend au moins un fragment choisi parmi les fragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la proteine GAX humaine. 5. Polypeptide caracterise en ce qu'il s'agit d'un fragment de la proteine GAX capable d'interagir avec la proteine Ki. 6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit du fragment 1 à 32 ou 104 à 223 de la protéine GAX. 7. Polypeptide caracterise en ce qu'il comprend outre un fragment de la proteine GAX possedant une activite de represseur de la transcription, au moins un fragment d'origine differente. 8. Polypeptide selon la revendication 7 caractérisé en ce que ce fragment d'origine différente est doté d'une activité biologique, est un marqueur ou un élélment de ciblage. 9. Acide nucleique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8. 10. Acide nucleique selon la revendication 9 caracterise en ce qu'il s'agit d'un ADNc. 11. Cassette d'expression comprenant un acide nucleique selon la revendication 9 ou 10 sous contrôle d'un promoteur. 12. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou 10 ou une cassette d'expression selon la revendication 11. 13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en qu'il s'agit d'un vecteur viral. 14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en qu'il s'agit d'un adénovirus. 15. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en qu'il s'agit d'un rétrovirus. 16. Utilisation de la proteine GAX ou d'un polypeptide selon la revendication 1 à 8 pour reprimer la transcription de gènes et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN. 17. Utilisation de composés inhibant l'activite de la proteine Ki pour l'obtention d'un médicament destiné inhiber la proliferation de cellules musculaires lisses. 18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptide selon l'une des revendications l à 8 ou un vecteur selon l'une des revendications 12 à 15. 19. Procédé pour le criblage et/ou l'identification de polypeptides interagissant avec la proteine GAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'une des revendications I à 8. 20.Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide choisi parmi les fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX