Brevet FR2750435A1 — publié le 19980102

PROCÉDÉ DE FORMATION DE COMPLEXES D'HYBRIDATION HYBRIDATION DONT LA STABILITÉ DÉPEND PEU DE LA COMPOSITION EN BASE DES DEUX MOLÉCULES D'ACIDES NUCLÉIQUES HYBRIDÉES. La présente invention concerne un procédé de formation de complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en base des deux molécules d'acides nucléiques hybridés. L'invention se rapporte également à la mise en oeuvre de ce procédé pour l'analyse de séquences d'acide nucléique. L'invention a aussi pour objet des complexes d'hybridation formés de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaires, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases desdites deux molécules d'acide nucléique hybridées. La loi d'appariement A-T (ou A-U) et G-C confère aux acides nucléiques la propriété de former des complexes d'hybridation spécifiques entre des séquences complémentaires. Cette propriété connue de longue date permet d'utiliser un fragment d'acide nucléique, ou oligonucléotide, comme sonde, pour mettre en évidence la présence d'une séquence nucléique complémentaire. L'analyse de fragments d'ADN après séparation sur gel E. Southern, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503-517) est aujourd'hui largement répandue tant dans le domaine de la recherche fondamentale que dans celui de l'analyse médicale (Caskey, Science, 1987, 236, 1223-1228 Landegrer et al., Science, 1988, 242, 229-237 ; Arnheim et al., Ann Rev. Biochem., 1992, 61, 131-156). Plusieurs techniques d'analyse des acides nucléiques basées sur leur propriété d'hybridation avec des sondes ont été développées notamment pour le séquençage d'ADN ou d'ARN inconnus, la détection de séquences associées à une pathologie, la recherche de mutations ponctuelles dans des séquences (S. Ikata et al., Nuclei. Acids Res., 1987, 15, 797-811 ; J. A. Matthews, L. J. Krieka, Analytical Biochemistry, 1988, 169, 1-25). Plus récemment, il a été proposé de nouveaux procédés d'analyse et de séquençage de fragments d'ADN, basés sur l'hybridation avec une série d'oligonucléotides immobilisés sur un support solide (E. Southern, Brevet Européen No. 0 373 203 ; K. R. Khrapko et al., FEBS Letters, 1989, 256, 118-122 ; R. Drmanac et al., Genomics, 1989, 4, 114-128 ; R. Drmanac et al., DNA and Cell Biology, 1990, 9,527-534 ; K. R. Khrapko et al., J. DNA Sequencing Mapp., 1991, 1, 375-388 ; R. Drmanac et al., Science, 1993, 260, 1649-1652; R. J. Lipshutz, J. Biomol. Struct. Dyn., 1993, 11, 637-653 U. Maskos, E. Southern, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 4663-4669 ; A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994, 91, 5022-5026 ; J. C. Williams, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 1365-1367 E. M. Southern, Nucleic Acids Res., 1994, 22, 1368-1373). Ces nouveaux procédés consistent à détecter les signaux émis par les hybrides formés de l'appariement d'un ADN marqué avec une série d'oligonucléotides de même longueur et de séquences différentes immobilisés sur une membrane ou une surface en verre, puis à reconstruire la séquence du fragment d'ADN selon un processus algorithmique. L'analyse des complexes d'hybridation obtenus par les procédés cidessus est fondée sur la plus grande stabilité des hybrides sans mésappariement par rapport à celle des hybrides comportant un ou plusieurs mésappariements. La discrimination entre un hybride parfait et un hybride avec mésappariement peut être réalisée par exemple en élevant la température du milieu, ce qui provoque une dissociation des complexes avec mésappariement avant celle des complexes sans mésappariement. Mais l'emploi d'oligonucléotides naturels dans les techniques précédentes, utilisant en même temps un grand nombre de ces oligonucléotides sondes, se heurte à une difficulté fondamentale liée à la différence de stabilité des hybrides en fonction de la composition en base des oligonucléotides immobilisés. Il est en effet connu que la paire de base G-C, caractérisée par trois liaisons hydrogène, est plus stable que les paires A-T ou A-U qui ne possèdent que deux liaisons hydrogène. En conséquence, les hybrides parfaits formés par des séquences riches en paires A-T sont susceptibles de présenter une stabilité voisine, voir même inférieure, à celle d'hybrides imparfaits comportant un mésappariement et formés avec des séquences de même longueur mais riches en paires G-C. Ce phénomène conduit à des signaux faux positifs ou faux négatifs selon les conditions de température d'hybridation et de lavage mises en oeuvre. L'utilisation d'oligonucléotides composés des nucléosides naturels dA, dG, dC, T ou dU, constitue donc un obstacle majeur au développement de ces nouvelles techniques d'analyse de séquences d'acide nucléique. Le risque de défaillance dans la discrimination entre hybrides parfaits et imparfaits, implique en outre une vérification systématique pour un grand nombre d'oligonucléotides dans des conditions de température et de milieu définis. Afin de pallier cet inconvénient, il a été proposé dans l'art antérieur, un procédé d'hybridation utilisant le chlorure de tétraméthylammonium visant à atténuer la différence de stabilité des hybrides en fonction de leur composition en base (W. B. Melchoir, P. H. von Hippel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1973, 70, 298-302 ; U. Maskos, E. M. Southern, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 4663-4669), mais les résultats ainsi obtenus ont été contredits avec d'autres séquences nucléotidiques (P. V. Riccelli, A. S. Benight, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 3785-3788). Il a également été proposé de faire varier la densité des oligonucléotides immobilisés sur gel de polyacrylamide en fonction de leur composition en base (K. R. Khrapko et al., J. DNA Sequencing Mapp., 1991, 1, 375-388) . Mais cette stratégie complique considérablement le système dès lors que celui-ci est appliqué avec un grand nombre d'oligonucléotides immobilisés. Il a aussi été envisagé d'utiliser des bases modifiées telles que la 5-CldU et la 2-NH2dA, cependant, une grande variation de stabilité des hybrides a été observée (J. D. Heisel, H. Lehrach, FEBS Lett., 1990, 274, 103-106). Une autre approche utilisant des oligomères construits avec des désoxyribonucléosides et des ribonucléosides pour déstabiliser les hybrides des séquences riches en bases G et C a aussi décrite (Jùrg D. Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1996, vol. 24. No. 3), mais la quantité des hybrides formés avec ces oligonucléotides diminue très rapidement lorsque le nombre d'alternance augmente. De plus la dissociation thermique de ces hybrides s"étendent sur une zone de température très large ce qui rend très aléatoires la distinction entre les hybrides parfaits et les hybrides avec mes appariement. La présente invention a donc pour but de fournir un procédé permettant de former des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléiques hybridés. Ce but est atteint grâce à un procédé consistant à mettre en contact une première molécule d'acide nucléique avec une seconde molécule d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, caractérisé en ce que l'un au moins des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et/ou de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée et en ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. La nomenclature utilisée, dans ce qui suit, pour désigner par une lettre les quatre types de base entrant dans la composition des acides désoxyribonucléiques, sera la suivante - la désoxycytidine sera représentée indifféremment par C ou dC, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante, - la désoxyguanosine sera représentée indifféramment par G ou dG, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante, - la thymidine et la désoxyuridine seront représenté respectivement par T ou dU, marqué d'une pour désigner la base modifiée correspondante, - la désoxyadénosine sera représentée indifféramment par A ou dA, marqué d'une "*" pour désigner la base modifiée correspondante. Pour réduire la différence de stabilité des hybrides, dûe à la différence de composition en base, l'invention propose de remplacer l'un au moins des nucléosides naturels choisis parmi la désoxycytidine (dC), la désoxyguanosine (dG), la thymidine (T) et la désoxyadénosine (dA), par des nucléosides modifiés mais respectant la loi d'appariement, désignés respectivement dC*, dG*, dU* et dA*, afin de disposer de séquences d'acides nucléiques capables de former des complexes d'hybridation dans lesquels - les paires de bases C*-G et/ou G*-C ont une stabilité équivalente à celle des paires A-T, et/ou - les paires de bases A*-T et/ou A-T* ont une stabilité supérieure à celle des paires A-T et voisine de celle des paires C-G naturelles, ou encore - les paires de bases C*-G et/ou G*-C ont une stabilité équivalente à celle des paires A*-T et/ou A-T*; dans ce mode de réalisation, on abaisse la stabilité des paires C*-G et/ou G*-C par rapport à celle des paires G-C naturelles et on augmente la stabilité des paires A*-T et/ou A-T* par rapport à celle des paires A-T naturelles. Ainsi, le procédé selon l'invention comprend plusieurs formes de mise en oeuvre et notamment les quatre qui suivent. Une première forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention est caractérisée en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. Dans cette forme de mise en oeuvre, un au moins, même type de base (A, G, C ou T), entrant dans la composition de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. On peut ainsi envisager - que l'un seulement des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un seulement des deux types de paire de bases (A-T, G-C) entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. - que deux des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée. Une deuxième forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention est caractérisée en ce que deux au moins des quatres types de base entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées. Le procédé de l'invention peut être avantageusement utilisé pour l'analyse de séquences d'acides nucléiques, notamment pour le séquençage ou la détection de mutation. Un tel procédé consiste à réaliser un complexe d'hybridation, conformément à la méthode décrite précédemment, dans lequel la première molécule d'acide nucléique constitue ou comprend la séquence à analyser et la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. Un procédé d'analyse d'acides nucléiques selon l'invention est caractérisé en ce que l'on met en contact les acides nucléiques à analyser, éventuellement préalablement marqués, avec une quantité adéquate d'au moins une sonde nucléique, puis en ce que l'on analyse par tout moyen approprié les complexes d'hybridation éventuellement formés, notamment afin d'identifier la pésence de mesappariement. Parmi les méthodes d'analyse entrant dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment les méthodes de détection par luminescence, fluorescence, par colorimétrie et par radioactivité. Avantageusement, ladite sonde nucléique est un oligonucléotide comprenant de 4 à 30 nucléosides. Une première forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon l'invention consiste - à préparer la première molécule d'acide nucléique par un processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre un nucléoside modifié de façon à remplacer l'un des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, - à mettre en contact ladite première molécule d'acide nucléique avec la seconde molécule d'acide nucléique qui est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, de façon à former un complexe d'hybridation dans lequel l'un des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. - à analyser le complexe d'hybridation par tout moyen approprie. Une deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon l'invention consiste - à préparer la première molécule d'acide nucléique par un processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre deux nucléosides modifiés de façon à remplacer deux des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par deux bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, - à mettre en contact ladite première molécule d'acide nucléique avec la seconde molécule d'acide nucléique qui est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, de façon à former un complexe d'hybridation dans lequel deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée. - à analyser le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. Une forme de mise en oeuvre particulière du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique selon l'invention est caractérisée en ce que la sonde nucléique a été préparée par un processus chimique ou biologique mettant en oeuvre au moins un type de nucléosides modifiés de façon à obtenir une sonde dont la séquence comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. On vise plus particulièrement, dans cette forme de mise en oeuvre, des sondes nucléiques dans lesquelles deux des quatre types de base entrant dans leur composition sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent. On peut ainsi envisager les combinaisons suivantes - les nucléosides dC et dG sont remplacés respectivement par des nucléosides dC* et dG*, - les nucléosides dA et T sont remplacés respectivement par des nucléosides dA* et dU*, - les nucléosides dC et T sont remplacés respectivement par des nucléosides dC* et dU* définis précédemment, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment, - les nucléosides dG et T sont remplacés respectivement par des nucléosides dG* et dU*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment, - les nucléosides dA et dG sont remplacés respectivement par des nucléosides dA* et dG*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment, - les nucléosides dA et dC sont remplacés respectivement par des nucléosides dA* et dC*, dans ce cas, la première molécule d'acide nucléique est préparée conformément à la deuxième forme de réalisation du procédé d'analyse de séquences d'acide nucléique décrit précédemment. Parmi, les combinaisons de modifications envisagées ci-dessus, on préfère plus particulièrement, celles conduisant à des oligodésoxynucléotides dans lesquels - Tous les nucléosides dC et dG sont remplacés respectivement par les nucléosides dC* et dG*. Les sondes nucléiques constituées par ces oligodésoxynucléotides modifiés sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires non modifiées. En effet, cette double modification des oligodésoxynucléotides permet de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base G*-C et C*-G présentent une stabilité équivalente à celle des paires de base A-T ou A-U non modifiées. - Tous les nucléosides dA et T sont remplacés respectivement par les nucléosides dA* et dU*. Les sondes nucléiques constituées par ces oligodésoxynucléotides modifiées sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires non modifiées. Effet, cette double modification des oligodésoxynucléotides permet de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base A*-T et A-U* présentent une stabilité voisine de celle des paires de bases G-C non modifiées. Les autres sondes nucléiques doublement modifiés au niveau de l'un seulement des nucléosides de chaque paire de base sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont le même nucléoside de chaque paire de bases a également été remplacé par un nucléoside modifié, afin de former des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases. Dans ce dernier cas, comme dans celui où seulement un nucléotide d'un type de paire de bases est modifié, il convient de soumettre l'acide nucléique complémentaire à une étape préalable de modification permettant de remplacer le même nucléoside de la paire de bases considérée afin que l'un ou l'autre des deux nucléosides de ladite paire de bases dans le complexe d'hybridation soit modifié de façon à ce que la stabilité de l'hybride dépende peu de la composition en base. Cette étape de modification préalable des acides nucléiques intervient dans le cas où I'oligodésoxynucléotide constituant la sonde nucléique ne comprend que - l'un seulement des quatre nucléosides modifiés dC*, dG*, dU* ou dA*, ou - deux de ces quatre nucléosides modifiés, dès lors que ces deux-ci n'appartiennent pas à la même paire de base comme - dC* et dU* ou dA*, - dG* et dU* ou dA*, - dU* et dC* et dG*, - dA* et dC* et dG*. Le remplacement de nucléosides naturels présents dans les acides nucléiques cibles, au cours de cette étape préalable de modification peut être réalisé par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec un ou plusieurs nucléosides modifiés. Selon une forme de réalisation avantageuse des procédés d'analyse définis ci-dessus, ceux-ci sont mis en oeuvre avec des sondes nucléiques fixées sur un support, tels que des membranes ou des fils de cellulose, ou de polymères synthétiques ou encore des surfaces de verre. Les oligodésoxynucléotides constituant les sondes nucléiques peuvent être alors synthétisés directement à sur le support. Les sondes nucléiques mises en oeuvre dans les procédés d'analyse de séquences d'acide nucléiques précédents peuvent être en outre substituées à l'une au moins de leurs extrémités 5' et/ou 3' notamment - par des agents intercalants tels que les dérivés de l'acridine afin d'augmenter la stabilité des hybrides, - par la biotine pour former des complexes avec des dérivés de la streptavidine, - par des groupements fonctionnels pour préparer des conjugués ou pour les immobiliser sur des supports solides comme par exemple : -(CH2)n-COOH, - ( CH2 ) n-NH2, - (CH2 ) SH, - (CH2 ) n-CHOH-CH20H, -(CHz)no-Po32 , - (CH2 ) n-P02 -S où n est compris entre 1 et 20. Ces oligodésoxynucléotides substitués peuvent être préparés conformément aux méthodes décrites dans la littérature (Nguyen, T. Thuong, U. Asseline, Oligonucleotides and analogues : A practical approach, F. Eckstein ed., I. R. L. Press, Oxford, 1991, 283-306 U. Asseline et al., Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254). Des modifications chimiques des nucléosides dC, dG, T et dA entrant dans le champ de la présente invention seront décrites ci-après. Un premier type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à Cg, un groupe allyle ou propargyle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, et X est un atome de d'azote ou un groupe -CH-, ladite désoxycytidine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la cytidine naturelle qu'elle remplace. Parmi les désoxycytidineS modifiées de formule (I) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la N-4-méthyl-2'-désoxycytidine (d4MeC), la N-4-éthyl-2 '-désoxycytidine (d4EtC), la N-4-propyl-2'- désoxycytidine (d4ProC), la N-4-allyl-2 ' -désoxycytidine (d4Allylc) la N-4-propargyl-2'-désoxycytidine (d4PropargylC), la 1-ss-D-arabinofuranosyl-cytosine (dAraC), la 6-azadésoxycytidine (dENC). Les acide nucléiques comportant des dC* à la place des dC sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxycytides naturelles dC ont également été remplacées par des nucléosides modifiés dC*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base C*-G présentent une stabilité voisine de celle des paires de base A-T non modifiées. Les désoxycytidines naturelles peuvent être remplacées par des dC* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucléosides dC*. Un deuxième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C, un groupe allyle ou propargyle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un atome de brome, et X est un atome d'azote ou un groupe -CH-, ladite désoxyguanosine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la désoxyguanosine naturelle qu'elle remplace. Parmi les désoxyguanosines modifiées de formule (II) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la N-2-méthyldésoxyguanosine (d2MeG), la N-2propyldésoxyguanosine (d2PrOG), la N-2-isopropyldésoxyguanosine (d2IsoProG), la N-2-éthyldésoxyguanosine (d2EtG), la 7-déazadésoxyguanosine (d7CG), la 8-bromodésoxyguanosine (d8BrG). Les acide nucléiques comportant des dG* à la place des dG sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxyguanosines naturelles dG ont également été remplacées par des nucléosides modifiés dG*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de bases G*-C présentent une stabilité voisine de celle des paires de base A-T non modifiées. Les désoxyguanosines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dG* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucléosides dG*. Un troisième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyuridine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un groupe de formule - C -- CH, ou - C -- C - CH3, ladite désoxyuridine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la thymidine naturelle qu'elle remplace. Parmi les désoxyuridines modifiées de formule (III) ci-dessus, on peut citer les composés suivants : la 5-éthynyldésoxyuridine (dSEthYnYlu), la 5propynyldésoxynridine (d5PropYnylu) Les acide nucléiques comportant des dU* à la place des T sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les thymidines naturelles T ont également été remplacées par des nucléosides modifiés dU*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de bases U*-A présentent une stabilité voisine de celle des paires de base G-C non modifiées. Les thymidines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dU* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucléosides dU*. Un quatrième type de base pouvant entrer dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe NH2, X est choisi parmi un atome d'azote, les groupes de formule : C - Br, C - Cl, C - C - CH, C - C 3 C - CH3, ladite désoxyadénosine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la désoxyadénosine naturelle qu'elle remplace. Parmi les désoxyuridines modifiées de formule (IV) ci-dessus, on peut citer les composés suivants I'am : l'amino-2-désoxyadénosine (d2NH2A), la 7- déaza-7-bromodésoxyadénosine, la 7-déaza-7-propynyldésoxyadénosine, l'amino-2-7-déaza-7-bromodésoxy- adénosine, l'amino-2-7-déaza-7-propynyl-désoxyadénosine. Les acide nucléiques comportant des dA* à la place des dA sont utiles pour former des complexes d'hybridation avec des séquences d'acide nucléique complémentaires dont les désoxyadénosine naturelles dA ont également été remplacées par des nucléosides modifiés dA*, afin de former des complexes d'hybridation dont toutes les paires de base A*-U ou A*-T présentent une stabilité voisine de celle des paires de base G-C non modifiées. Les désoxyadénosines naturelles présentes dans la séquence d'acide nucléique cible peuvent être remplacées par des dA* définies ci-dessus, par toutes méthodes connues de l'Homme du métier, telle qu'une réaction de polymérisation enzymatique mise en oeuvre avec des nucléosides dA*. Avantageusement, dans le procédé de l'invention les première et seconde molécules d'acide nucléique sont de type désoxyribonucléique. Selon une forme de réalisation particulièrement intéressante, des procédés de formation d'un complexe d'hybridation et d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'invention la mise en contact des première et seconde molécules d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, est effectuée en présence de chlorure de tétraméthylammonium ou d'un dérivé de celui-ci fonctionnellement équivalent, tel que les halogénures de triméthylalkylammonium. En effet, ce milieu permet d'ajuster la stabilisation des paires comprenant ou non des bases modifiées. L'invention concerne aussi un complexe d'hybridation formé de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaires, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridées, caractérisé en ce que l'un au moins des types de paire de base entrant dans la composition dudit complexe comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. Selon une première forme de réalisation préférée, le complexe d'hybridation de l'invention est caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. Dans cette forme de réalisation, l'invention envisage plus particulèrement les cas où - le complexe d'hybridation est caractérisé en ce que l'un des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée; - le complexe d'hybridation est caractérisé en ce que deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent des bases modifiées. Selon une seconde forme de réalisation préférée, le complexe d'hybridation de l'invention est caractérisé en ce que deux des quatres types de bases entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. Avantageusement, la première ou la seconde molécule d'acide nucléique formant le complexe d'hybridation de l'invention, est une sonde oligonucléotidique. Les modifications chimiques des nucléosides dC, dG, T et dA entrant plus particulièrement dans la composition desdites première et/ou seconde molécule d'acide nucléique des complexes de l'invention sont celles décrites précédemment pour la désoxycytidine modifiée, la désoxyguanosine modifiée, la désoxyuridine modifiée, la désoxyadénosine modifiée. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs, et concernant la préparation de nucléosides modifiés, leur utiliation pour préparer des acides nucléiques modifiés et la mise en oeuvre de ceux-ci pour préparer des complexes d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases. I - Préparation de nucléosides modifiés. 1) Schémas généraux. Les 3'phosphoramidites des nucléosides modifiés sont accessibles dans le commerce, comme par exemple . 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O-(2-cyanoéthylN,N-diisopropylamidophosphite)-l-ss-D-arabinofuranosyl- cytosine (Glen Research), . 5' -O-diméthoxytrityl-3 '-O- (2-cyanoéthyl- N,N-diisopropylamidophosphite)-5-propynyl-2 désoxyuridine (Glen Research), . 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O-(2-cyanoéthylN,N-diisopropylamidophosphite)-7-déaza-2 désoxyguanosine (Glen Research), . 5' -O-diméthoxytrityl-3 '-O- (2-cyanoéthyl- N,N-diisopropylamidophosphite)-8-bromo-2'désoxyguanosine (Glen Research). Les autres phosphoramidites de nucléosides modifiés peuvent aussi être préparés au laboratoire à partir d'autres nucléosides modifiés selon les techniques décrites dans la littérature (N. D. Sinha et al., Nucleic Acid Res., 1984, 12, 4539-4557 ; J. Nielsen et al. Nucleic Acid Res., 1986, 14, 7391-7403). La synthèse de la 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite)-N-4-alkyl2'-désoxycytidine est réalisée à partir de la 2'désoxyuridine commerciale (Aldrich). Elle consiste à protéger les hydroxyles 5' et 3' de la 2'désoxyuridine respectivement par action du chlorure de diméthoxytrityle et du chlorure de tertbutyldiméthylsilyle. La conversion de la 2'désoxyuridine en N-4-alkyl-2'-désoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 2'-désoxyuridine protégée par traitement avec de l'oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement avec les amines primaires correspondantes. Après déprotection de l'hydroxyle 3' par action du fluorure de tétrabutylammonium, la phosphitylation de la position 3' est réalisée en utilisant la 2-cyanoéthyl-N,Ndiisopropylamidochlorophosphite. La synthèse de la 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite)-6-aza-2'désoxycytidine est réalisée par exemple à partir de la 6-aza-uridine commerciale (Sigma), qui est désoxygénée en position 2' puis convertie en 6-aza-2'désoxycytidine. La protection sélective des hydroxyles en 5' et 3' de la 6-aza-uridine est réalisée par action du chlorure de tétraisopropyldisiloxane. Après activation de l'hydroxyle en 2' avec le chlorure de phénoxythiocarbonyle, la désoxygénation est réalisée avec le tributyle étain en présence de là, a azoisobutyronitrite (M. J. Robins and J. S. Wilson, Am. Chem. Soc., 1981, 103, 932-933). La conversion de la 6aza-désoxyuridine en 6-azadésoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 6-aza-désoxyuridine par traitement avec de l'oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement à l'amoniac gazeux (M. Perbostand and Y. S. Sanghvi, J. Chem. Soc. Perkin. Trans., 1, 1994, 20512052) . Le groupement amino exocyclique est ensuite protégé par benzoylation. Après déprotection des hydroxyles 5' et 3', I'hydroxyle 5' est protégé par tritylation et la phosphitylation de la position 3' est réalisée en utilisant le 2-cyanoéthyl-N,Ndiisopropylamidochlorophosphite. La synthèse du 5' -O-diméthoxytrityl-3 '-O- (2- cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophosphite)-N-2-alkyl-2'- désoxyguanosine a été réalisée par un procédé en 8 étapes (T. Steinbrecher, C. Wameling, F. Oesh and A. Seider, Angew. Chem. Int. Engl. 1993, 32, 404-406). La première étape consiste en une protection du carbonyle en position 6 selon la réaction de Mitsunobu en employant le p-nitrophényle-éthanol. La désamination de la position 2 par traitement avec du nitrite de sodium conduit au composé hydroxylé. Les hydroxyles 5' et 3' sont ensuite protégés respectivement avec les groupes diméthoxytrityle et acétyle. L'hydroxyle en position 2 est ensuite transformé en ester de l'acide trifluorométhane sulfonique. Le traitement de ce dernier avec une amine (méthylamine, éthylamine ...) conduit au composé N-2-alkyl-2 '-désoxyguanosine correspondant. Après déprotection de l'hydroxyle en 3', la phosphitylation de ce dernier avec la 2-cyanoéthyl-N,N diisopropylamidochlorophosphite sonduit au phosphoramidite cherché. 2) Exemples exsérimentaux. Exemple 1 : Préparation de la 5'-O diméthoxytrityl-3 '-O- (2 -cyanoéthyl-N, N-diisopropylamido phosphite)-N-4-éthyl-2'-désoxycytidine. a) Préparation de la 5'-O-diméthoxvtritvl2'-désoxvuridine. A 5g (0,0219 mole) de 2'désoxyuridine préalablement séchés par coévaporation avec de la pyridine anhydre (3 fois) puis mis en solution dans 80 ml de pyridine anhydre, on ajoute 8,2 g (0,024 mole) de chlorure de deméthoxytrityle à OOC. L'avancement de la réaction est contrôlé par CCM. Après 2 heures de réaction a température ambiante, la CCM du mélange montre que la réaction est achevée. L'excès de chlorure de diméthoxytrityle est détruit par addition de 2 ml de méthanol. Le mélange est concentré sous vide, repris au dichlorométhane et lavé avec une solution de bicarbonate de sodium à 5 % (2 fois) puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et le solvant chassé sous vide. Le résidu est purifié par précipitation à l'hexane. Un précipité blanc apparaît. Ce composé est récupéré par filtration et séché au dessiccateur. Rendement = 77 % (9 g) .CCM Merck silica gel 60F 254. Rf = 0,40 [éluant : CH2C12 / MeOH (95 : 5, v/v)] =Syst A. Rf = 0,77 [éluant : CH2C12 / MeOH (90 : 10, v/v)]=Syst B. b) Préparation de la 5'-O-diméthoxvtritvl3'-O-(tert-butyldiméthylsilsyl)-2'-désoxyuridine, 9 g de 5'-O-diméthoxytrityl-2'-désoxyuridine (0,016 mole) et 3,26 g d'imidazole (0,048 mole) sont séchés par coévaporation avec de la pyridine anhydre (3 fois) et mis en solution dans 100 ml de pyridine anhydre. 3,13 g de tert-butyldiméthylchlorosilane (0,02 mole) sont ajoutés. La réaction est suivie par CCM. Après 12 heures de réaction, à température ambiante, le mélange est repris avec du dichlorométhane. La phase organique est lavée avec une solution de bicarbonate de sodium à 5 % (2 fois) puis séchée sur sulfate de sodium. La milieu est concentré et précipité à froid dans de l'hexane. Le précipité obtenu est filtré sous le vide de la trompe à eau et séché au dessiccateur. Rendement = 71 % (7,7 g). CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,57 syst A, Rf = 0,86 syst B. c) PréDaration de la 5'-O-diméthoxvtritvl 3 '-O- (tert-butvldiméthvlsilsvl) -N-4-éthvl-2 désoxycytidine. A 3,1 g de triazole (0,047 mole) préalablement séchés 3 fois par coévaporation avec de l'acétonitrile anhydre, solubilisé dans 50 ml d'acétonitrile, on ajoute à OOC 0,98 ml de POC13 (0,01 mole) et 7,3 ml de triéthylamine (0,052 mole). Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation pendant 30 minutes à OOC. Puis 2 g de 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O(tert-butyldiméthylsilsyl)-2'-désoxyuridine (0,0031 mole) préalablement séché par coévaporation avec de l'acétonitrile anhydre et solubilisé dans 10 ml d'acétonitrile sont ajoutés dans le milieu réactionnel. Le mélange réactionnel est ensuite amené à température ambiante et mis sous agitation magnétique pendant 4 heures. Sur le dérivé triazole brut obtenu (Rf=0,55 syst A, Rf=0,91 syst B), on ajoute 9,6 ml d'une solution d'éthylamine (16 M dans lacétonitrile, 0,15 mole). La réaction est contrôlée par CCM et on observe la disparition totale du composé de départ au bout de 2 heures. Le milieu est ensuite concentré sous pression réduite, repris par du dichlorométhane et lavé à l'eau. Après séchage sur sulfate de sodium, le solvant est chassé et une purification sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2Cl2 / MeOH / Et3N (98:1:1, v/v) à (97:2:1] permet d'isoler 1,7 g du produit recherché. Rendement = 81 %. CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,26 syst A. Rf = 0,70 syst B. d) Préparation de la 5'-O-diméthoxvtrityl-N- 4-éthvl-2 ' -désoxvcvtidine. 1,7 g de 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O-(tert- butyldiméthylsilsyl)-N-4-éthyl-2'-désoxycytidine (0,0025 mole) est traité par 5 ml d'une solution 1 M de fluorure de tétrabutylammonium dans le tétrahydrofurane (0,005 mole) à température-ambiante. La réaction contrôlée par CCM est complète après 2 heures. Le milieu est concentré sous pression réduite puis repris avec du dichlorométhane et lavé avec une solution de bicarbonate de sodium et concentrée sous pression réduite. Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2Cl2 / MeOH (98:2, v/v) à (95:2:5, v/v]. Rendement = 78 % (1,1 g).CCX Merck silicagel 60F 254, Rf=0,55 syst B. e) Présaration de la 5'-O-diméthoxvtritvl 3'-O-(2-cyanoéthyl-N,N-diisoDronylamidoshosshite)-N-4- éthvl-2'-désoxvcvtidine. La 5 '-O-diméthoxytrityl-N-4-éthyl-2 '-désoxy- cytidine est séchée par 3 coévaporations successives avec de l'acétonitrile anhydre puis laissée une nuit au dessiccateur. A 200 mg (0,35 mmole) de 5'-Odiméthoxytrityl-N-4-éthyl-2'-désoxy-cytidine solubilisé dans 4 ml de dichlorométhane (anhydre et passé sur alumine basique), on ajoute sous agitation et atmosphère inerte 0,24 ml de diisopropyléthylamine distillée (1,43 mole), puis goutte à goutte 0,12 ml (0,53 mmole) de 2cyanoéthyl-N, N-diisopropylamidochlorophosphite. Au bout d'une heure, la réaction est achevée. On ajoute alors au mélange réactionnel 20 ml d'acétate d'éthyle et on lave avec une solution de bicarbonate de sodium à 10 % puis avec une solution de Nacl saturée. Après extraction, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée. On purifie le résidu sur colonne de gel de silice dans le système [éluant : CH2Cl2 / AcOEt / Et3N, (60:30:10, v/v)]. Puis le composé est précipité dans l'hexane à -700C et récupéré par filtration rapide et séché au dessiccateur. Rendement = 48 % (130 mg) . CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,35 et 0,33 syst A. Ref = 0,68 et 0,61 syst C. Exemples 2 à 5 En opérant comme dans l'étape (c) de l'exemple 1 et en remplaçant l'éthylamine par la méthylamine, la propylamine, l'allylamîne et la propargylamine, on obtient respectivement les 5'-OdiméthOxytrityl-3'-O-{tert-butyldiméthylsilsyl)-N-4- méthyl-2'-désoxycytidine (composé 2c) , diméthOxytrityl-3'-O-(tert-butyldiméthylsilsyl)-N-4- propyl-2'-désoxycytidine (composé 3c), , diméthOxytrityl-3'-O-(tert-butyldiméthylsilsyl)-N-4- allyl-2'-désoxycytidine (composé 4c) , diméthOxytrityl-3'-O-(tert-butyldiméthylsilsyl)-N-4- propargyl-2'-désoxycytidine (composé 5c), dont les caractéristiques sont résumées dans le tableau I cidessous. Tableau I Composés Rendement % Rf syst A Rf syst B 2c 49 0,22 0,68 3c 61 0,23 0,72 4c 69 5c 70 Puis en opérant comme dans 1étape (d) de l'exemple 1 en partant des composés ci-dessus 2c, 3c, 4c et 5c, on obtient les composés correspondants 2d, 3d, 4d et 5d dont les caractéristiques sont résumées dans le tableau II ci-dessous. Tableau II Composés Rendement % Rf syst B 2d 78 0,53 3d 84 0,59 4d 90 0,63 5d 72 I 0,64 Enfin les phosphoramidites 2e, 3e, 4e et 5e de formules (V) suivantes sont obtenus à partir des composé ci-dessus 2d, 3d, 4d et 5d en opérant comme à l'étape (e) de exemple 1. Les caractéristiques de ces composés sont résumées dans le tableau III ci-dessous où sont indiquées également les significations de R. Tableau III Composés Rendement % Rf syst A Rf s sot C 2e 46 0,36 0,52 R = -CH3 0,32 0,43 3e 47 0,39 0,73 R = -nC3H7 0,34 0,68 4e 42 0,35 0,72 R = -CH2-CH=CH2 0,30 1 0,67 5e 49 0,35 0,75 R = -CH2C - CH 0,31 0,69 {éluant : CH2C12 / AcOEt / Et3N, (45:45:10, v/v)] =syst C. Exemple 6 : Préparation de la 5'-O diméthOxytrityl-3'-O-(2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido- phosphite)-6-aza-désoxycytidine. Ce composé a été obtenu en 6 étapes à partir de la 6-aza-uridine. La synthèse de la 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O(2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamido-phosphite)-6-aza- désoxycytidine est réalisée par exemple à partir de la 6-aza-uridine commerciale, qui est désoxygénée en position 2' puis convertie en 6-aza-2'-désoxycytidine. La protection sélective des hydroxyles 5' et 3' de la 6aza-uridine est réalisée par action du tétraisopropyldisiloxanne. Après activation de l'hydroxyle 2' avec le chlorure de phénoxythiocarbonyle, la désoxygénation est réalisée avec le tributyle étain en présence de lla, azoisobutyronitrite (M. J. Robins and J. S. Wilson, J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 932933). La conversion de la 6-azadésoxyuridine en 6azadésoxycytidine est réalisée dans une première étape par activation de la position C4 de la 6azadésoxyuridine par traitement avec de l'oxychlorure de phosphore en présence de triazole suivi d'un traitement à l'ammoniac gazeux (M. Perbostand and Y. S. Sanghvi, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 1994, 2051-2052) . Le groupement amino exocyclique est ensuite protégé par benzoylation. Après déprotection des hydroxyles 5' et 3' par traitement avec le fluorure de tétrabutylam-moniume dans le tétrahydro-furane, l'hydroxyle 5' est protégé parle groupe diméthoxytrityle et la phosphitylation de la position 3' est réalisée en utilisant le 2cyanoéthyl-N, N-diisopropyla-mi-dochlorophosphi-te comme dans l'exemple 1 étape (e). CCM Merck silicagel 60F 254, Rf = 0,37 et 0,43 syst A. Exemple 7 à 10 : Préparation de la 5'-O diméthoxytrityl-3 '-O- (2 -cyanoéthyl-N, N-diisopropylamido- phosphite)-N-2-alkyl-2'-désoxyguanosine La synthèse de 5'-O-diméthoxytrityl-3'-O (2-cyanoéthyl-N,N-diisopropylamidophos-phite)-N-2-alkyl2'-désoxyguanosine a été réalisée par exemple en 8 étapes selon T. Steinbrecher, C. Wameling, F. Oesh et A. Seider (Angew. Chem. Int; Engl. 1993, 32 , 404-406). Elle consiste dans une première étape en la protection du carbonyle en position 6 de la désoxyguanosine selon la réaction de Mitsunobu en employant le p-nitrophényléthanol. La désamination de la position 2 par traitement avec du nitrite de sodium conduit au composé hydroxylé. Les hydroxyles 5' et 3' sont ensuite protégés respectivement avec les groupes diméthoxytri-tyle et acétyle. L'hydroxyle en position 2 est ensuite transformé en ester de l'acide trifluorométhane sulfonique. Le traitement de ce dernier avec une amine (méthylamine, éthylamine, propylamine, isopropylamine, ...) conduit au composé N-2-alkyl-2'-désoxyguanosine correspondant. Après déprotection de l'hydroxyle 3', la phosphitylation de ce dernier avec le 2-cyanoéthyl-N, N-diisopropylamidochlorophosphite comme dans 1 'exemple 1, étape (e) conduit au phosphoramididite cherché de formule (VI) dans laquelle R = Méthyle (composé de l'exemple 7), R = Ethyle (composé de l'exemple 8), R = Propyl (composé de l'exemple 9), R = Isopropyl (composé de l'exemple 10), II - Préparation des oliaonucléotides modifiés. Les oligonucléotides comprenant des bases modifiées, et désignés oligonucléotides modifiés, peuvent être préparées en solution ou sur un support solide selon les procédés classiques de synthèse d'oligonucléoides utilisant la méthode aux phosphotriester (J. Stawinski et al., Nucleic Acids Res., 1977, 4, 356-371) la chimie des phosphoramidites (S. L. Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862) ou la chimies des H-phosphonates (P. J. Garegg et al., Tetrahedron Lett. 1986, 27, 40554058).Les oligonucléotides modifiés peuvent être commodément fabriqués sur support solide. L'assemblage des bases est effectué sur un synthétiseur d'oligonucléotides sur support CPG (Controlled Pore Glass) fonctionnalisé avec un nucléoside selon la méthode au phosphoramidites décrite par Beaucage et Caruthers. Les synthèses sont réalisées à l'échelle d'une micromole en utilisant dix équivalents de phosphoramidites commerciaux et de phosphoramidite(s) modifié(s) préparés comme indiqués aux exemples 1 à 10, par cycle. La durée du cycle est voisine de 10 minutes avec un temps de couplage de 1,5 minutes pour les phosphoramidites de nucléosides naturels. Le temps de couplage du phosphoramidite de nucléosides modifiés a été prolongé d'une minute. A la fin de la synthèse, une étape de détrytilation supplémentaire est réalisée pour libérer la fonction alcool primaire terminale. La déprotection est réalisée avec une solution d'ammoniaque concentrée à 500C pendant une nuit. Une extraction à l'acétate d'éthyle permet d'éliminer les composés organiques solubles. Après extraction, la solution aqueuse est récupérée et concentrée puis les produits sont purifiés en HPLC. Le tableau IV ci-dessous donne le temps de rétention (TR) de quelques oligonycléotides préparés. Tableau IV Exemples TR en minutes TR en minutes (syst a) (syst b) 11 d(GGA CGA CGA) 25,6 12,3 12 d(CGA 4MeCGA CGA) 25,2 12,16 13 d(CGA 4EtCGA CGA) 26,8 12,9 14 d(CGA 4ProCGA CGA) 25,2 13,03 15 d(CGA 4AllylcGA CGA) 25,4 12,81 16 d(CGA 4PloparsylCGA CGA) 25,2 12,78 Dans le système (a) , les analyses des oligomères par échange d'ions sont réalisées sur un appareil FPLC Pharmacia Fine Chemicals (GP 250 /P 3500) avec une colonne DEAE Waters (Protein-PakTM, DEAE 8HR (10 mm X 100 mm). Les gradients utilisés sont des gradients en sel (NaCl) : 2 minutes à 0 % en B; de O à 30 % en B en 40 minutes; débit : 1 ml/min. A : 25 mM tris, 10 % CH3CN, pH = 8; B :tampon A + 1,5 M NaCl. Dans le système (b), les analyses en phase inverses sont réalisées sur un appareil Waters 625 LC System équipé d'un détecteur à photoiode Waters 990 avec une colonne Merck, LichroCart (125 mm X 4 mm) remplies avec Lichrospher 100 RP-18 (5 Fm). Les éluants sont des mélanges eau/acétonitrile à 0,1 M d'acétate de triéthylammonium (TEAA), pH=7. A contient 5 % en CH3CN et B 80 % en CH3CN. On réalise des gradients en CH3CN de 0 % à 20 % en B en 20 minutes. Les débits de ces éluants sont de lml/minutes. La présence et les proportions des nucléosides dans les séquences ont été vérifiées par hydrolyse enzymatique par action de l'endonucléase P1, puis dans une deuxième étape par l'action de la phosphatase alcaline (PA), selon le protocole suivant A 1 DO d'oligonucléotide sont ajoutés 50 1 d'une solution de tampon CH3COO-Na+ (0,03 M) pH = 5,33 et de ZnSO4 (0,1 M) et 10 Al d'une solution de nucléase P1. La réaction est laissée au bain-marie pendant 2 heures à 370C. Le pH de l'hydrolysat est ensuite ajusté à pH 9 avec une solution Tris 1M. Puis 10 p1 de phosphatase alcaline sont ajoués au mélange et incubé pendant 2 heures à 37 C. On détruit ensuite l'enzyme par chauffage en faisant bouillir la solution pendant 1 à 2 minutes. Les différents composés formés sont ensuite identifiés et quantifiés par phase inverse avec le gradient suivant : 0 % en B pendant 5 minutes; de O % à 9 % en B en 15 minutes. A : 0,1 M TEAA, 2 % CH3CN; B 0,1 M TEAA, 80 % CH3CN. Débit = 1 ml/min. A titre d'exemple, l'hydrolyse enzymatique de l'oligonucléotide No. 13 conduite selon le schéma suivant d5[CpGpAp4EtCpGpApCpGpA]3' iP1 dC + pdG + pdA +pd4EtC + pdG + pdA pdC + pdG + pdA iPA 2 dC + 3dG + 3 dA (=+3dI) + d4EtC a abouti à : 2 dC + 3dG + 3 dA + d4EtC, dont le tableau V ci-dessous donne les temps de rétention (TR) de chaque nucléoside (temps de rétention en phase inverse sur colonne C18). Tableau V Nucléosides | TR (minutes) dC 2,68 dI 5,93 dG 7,20 d4EtC 9,75 La masse des oligucléotides No. 11 à 16 a été vérifiée par spectrométrie de masse par la technique MALDI (Matrix-Assisited Laser Desorption; appareil Lasermat de Finnigan), en utilisant le dT12 comme référence et 1 1 d'un mélange constitué. 10 l d'une solution 0,5 M de 2,4,6-trihydroxy acétophénone dans l'éthanol, 5 F1 d'une solution aqueuse 0,1 M de diammonium-L-tartarate et de 1 1 d'une solution aqueuse (10 DO/ml) de l'échantillon à analyser sont déposés sur une cible et les solvants sont éliminés par évaporation. Selon le même mode opératoire que précédemment, les oligonucléotides figurant dans le tableau VI ci-après ont été préparés en utilisant des phosphoramidites de désoxynucléosides naturels et des phosphoramidites de nucléosides modifiés préparés au laboratoire ou obtenus dans le commerce. Tableau VI 4Me 1 5' C G A C G A C G A 3' 4Et 2 5' C G A C G A C G A 3' 4Pro 3 5' C G A C G A c G A 3' 4Allyl 4 5' C G A C G A C G A 3' 4Prop argyl 5 5' C G A C G A C G A 3' ara 6 5' C G A C G A C G A 3' 4Me 4Me 7 5' C G A C G A C G A 3' 4Et 4Et 8 5' C G A C G A C G A 3' Pro Pro 9 5' C G A C G A C G A 3' ara ara 10 5' C G A C G A C G A 3' 4Et 4Et 4Et 11 5' A C A A C A A C A 3' 4Me 4Me 4Me 12 5' T T T C G T C G T C G T T 3' 4Me 4Me 4Me 13 5' C G A C G A C G A 3' 4Et 4Et 4Et 14 5' T T T C G T C G T Tableau VI (suite) 4Me 4Me 4Me 20 5' C G G C G G C G G 3' 7C 21 5' C G A C G A C G A 3' 22 5' C G A C I A C G A 3' 2Et 23 5' C G A C G A C G A 3' 2Pro 24 5' C G A C G A C G A 3' 2iPro 25 5' C G A C G A C G A 3' 2iBut 26 yryl 5' C G A C G A C G A 3 III - Préparation de 1'ADN à analyser. Les fragments d'acide nucléique à analyser constitués de nucléosides naturels et de nucléosideEs) modifiées peuvent être obtenus par la technique d'amplification génétique PCR utilisant un mélange de triphosphates de nucléosides naturels et de nucléoside(s) modifié (s). Ces composés peuvent être également obtenus en préparant dans une première étape des fragments d'ADN naturel monocaténaire par la technique de PCR asymétrique puis en recopiant dans une seconde étape le fragment d'ADN naturel monocaténaire en séquence complémentaire constitué de nucléosides naturels et de nucléoside(s) modifié(s) en utilisant un mélange de triphosphate de désoxynucléosides naturels et de nucléoside(s) modifié(s) et d'ADN polymérase. Les désoxynucléosides . modifiés 5' triphosphates peuvent être préparés à partir des désoxynucléosides modifiés en deux étapes comme pour les désosxynucléosides triphosphates naturels. La première étape concerne la préparation des désoxynucléosides modifiés 5' monosphates par réaction des nucléosides modifiés avec 1'oxychlorure de phosphore dans du trialkyphosphate (M. Yoshikawa, T. Kato and T. Takenishi, Tetrahedron Lett., 1967, 5065-5068). La deuxiéme étape concerne l'activation du 5' -phosphate par réaction avec le carbonyldiimidazole puis couplage de l'intermédiaire activé avec le sel de tributylammonium du pyrophosphate selon D.E. Hoard et D.G. Ott (J. Amer. Chem. Soc. 1965, 87, 1785-1788). Dans le cas des dérivés de la N-4alkyldésoxycytidine, les triphosphates peuvent être obtenus à partir de la désoxycytidine triphosphate par transamination en présence d'alkylamine et de bisulfite (P. S. Miller and C. D. Cushman, 1992 Bioconjugate Chem., 3, 74-79). IV - Propriété d'hybridation des olicronucléotides modifiés comportant une désoxycytidine modifiée (dC*) avec des séquences d'ADN naurel. Les études d'hybridation ont été réalisées avec un spectromètre d'absorption KONTRON UVIKON cell changer 941 à 260 nm. Les mesures de la température de demi transition Tm de la série des nonanucléotides naturels et modifiés avec des tridécadésoxynucléotides naturels ont été effectuées avec des solutions à 2.10-6 M en oligonucléotides dans un tampon cacodylate de sodium 10-2 M à pH 7 et contenant de 1'EDTA 2. 10-4 M et du chlorure de sodium 1 M. La montée en température s'effectue de OOC à 60"C à raison de 0,50C par minute. Ces conditions seront identiques pour les exemples des figures 1 à 12 ainsi que pour la figure 13 en partie. Les figures 1 et 2 indiquent les Tm des à doubles brins formés entre des tridécadésoxynucléotides naturels et des nonadésoxynucléotides naturels d'une part et des nonadésoxynucléotides comportant une désoxycytidine modifiée dC* d'autre part. Les valeurs de Tm de la figure 1 montrent que pour les doubles brins constitués de nucléotides naturels, la stabilité des hybrides varie fortement avec la composition en base. Ainsi le remplacement de la paire A-T en position 4 du double brin 1 (Tm = 46,1 C) par une paire G-C conduit à une augmentation du Tm de + 5,2"C (double brin 2, Tm = 51,3 C); par contre le remplacement de cette même paire A-T par une paire G-C* (en particulier pour C* = N-éthyl-dC) permet d'obtenir des hybrides ayant une stabilité équivalente [C* = N-4éthyldésoxycytidine, duplex 4 (Tm = 47,2 C)] à celle du duplex 1. Cette proprieté d'hybridation de la paire GC4Et est maintenue lorsque celle-ci est introduite à la place de la paire A-T en positions 4 et 7 du double brin 9 (figure 2; duplex 9, Tm = 41,1'C; duplex 11, Tm = 41,7"C). Comme attendu, le remplacement de la paire A-T par la paire G-C (figure 2) en positions 4 et 7 conduit à une augmentation du Tm de l'ordre de 10 C. Pour montrer que la formation des duplex comportant la paire G-C* est spécifique, les études d'hybridation des nonamères modifiés 3,AGCAGC*AGC5, avec les séquences d 'ADN 5 dTTTCGTC~TCGTT3 5 dTTTCGTCCTCGTT3', 5'dTTTCGTCTTCGTT3, ont été également réalisées. Les résultats donnés par les figures 3, 4 et 5 montrent que la déstabilisation dûe aux mésappariements A-C* (duplex 15 à 20 de la figure 3), C C* (duplex 22 à 27 de la figure 4) et T-C* (duplex 29 à 34 de la figure 5) (pour dC* = N-4-méthyldésoxycytidine, N-4-éthyldésoxycytidine et l-b-D-arabinofuranosylcytosine) est équivalente à celle des mésappariements A-C (duplex 14), C-C (duplex 21) et T-C (duplex 28). V - Propriété d'hybridation de doubles brins constitués des Daires de bases A-T et G-C4alkYleZ Les études ont été réalisées sur deux types de séquences. Dans le premier type de séquence les cytosines qui sont toutes situées sur le même brin sont remplacées par la N-éthyldésoxycytosine. Les résultats de la figure 6 montrent que le remplacement de 3 paires A-T du duplex 35 (Tm = 20 C) par trois paires G-C4Et conduit au duplex 37 possédant un Tm peu différent (duplex 37, Tm = 27,4 C) par contre la substitution des mêmes paires A-T du duplex 35 par les paires G-C produit comme attendu à une augmentation de l'ordre de 21 C. D'autre part la formation du double brin 37 est spécifique, car on observe une diminution de Tm de plus de 17"C lorsqu'il y a un mésappariement TC4Et (duplex 38) ou CC4Et (duplex 39) ou AC4Et (duplex 40). Dans le deuxième type de séquence les cytosines situées sur les deux brins sont remplacées par la N-4-méthylcytosine (duplex 42, figure 7) ou la N-4éthylcytosine (duplex 43). Les résultats donnés par la figure 7 montrent que lorsque les 9 paires A-T du duplex 41 (Tm = 18,7 C) sont remplacées par 9 paires G-C (duplex 2, Tm = 51,3 C) la variation de Tm est très importante (+32,6 C); dans les mêmes conditions, l'utilisation de la paire de base G-C* telle que G-C4Et permet d'obtenir par exemple le duplex 43 dont la stabilité est peu différente de celle du duplex 41. Ces résultats permettent les remarques suivantes - Lorsque les séquences nonadésoxynucléotides par exemple sont immobilisées sur le même support solide, il n'est pas possible de former en même temps des hybrides spécifiques tels que les duplex 2 et 41 sans formation des hybrides avec mésappariement tels que les duplex 14, 21 et 28 qui possèdent des Tm plus élevés que celui du duplex 41. - l'utilisation des duplexes constitués des paires de bases A-T et G-CNEt permet d'obtenir des hybrides spécifiques tels que les duplex 41 et 43, en effet le duplex 44 par exemple qui dérive du duplex 43 avec cependant un mésappariement TCNEt est très peu stable (Tm VI - Propriété d'hybridation de double brin comportant des paires de bases A-U5Propynyle et/ou GC4Et. Les propriétés d'hybridation des duplex 46 et 47 constitués respectivement de 9 paires A-U5Propynyle et 9 paires G-C4Et ont été étudiées et comparées avec celles des duplex non modifiés correspondants 41 et 45 (figure 8). Les résultats obtenus montrent que le duplex 46 qui comporte 9 paires de bases A-U5Propynyle possède un Tm équivalent (duplex 46, Tm = 31,2 C) à celui du duplex 47 (Tm = 33,3 C) comportant 9 paires GCN4Et, par contre les duplex 41 et 45 de même longueur et constitués respectivement des paires de bases A-T et G-C donnent des Tm très différents (duplex 41, Tm = 18,7 C; duplex 45, Tm = 63,4"C). D'autre part, on remarque que les Tm des duplex modifiés 46 et 47 sont situés entre ceux des duplex naturels 41 et 47. On remarque aussi que l'appariement de la paire A-U5PropYnyle est spécifique (duplex 48, Tm = 26,1"C) car un mésappariement C-U5Propynyle (duplex 49) ou G-U5Propynyle (duplex 50) ou T-U5Propynyle (duplex 51) conduit à une déstabilisation importante. VII - ProDriété d'hybridation des olicronucléotides dont les désoxvauanosines sont partiellement remplacées par les désoxvauanosines modifiées. La figure 9 donne les Tm des doubles brins formés entre un tridécadésoxynucléotides et des nonadésoxynucléotides comportant une désoxyguanosine modifiée dG*. Les résultats obtenus montrent que le remplacement d'une paire de base naturelle C-G par une paire de base C-G* a un effet sur la stabilité thermique des complexes d'hybridation. Parmis les désoxyguanosines modifiées utilisées, les dérivés subtitués sur le groupe amino en position 2 permettent de moduler la stabilité des hybrides. Ainsi la stabilité des duplex contenant la paire de bases C~G2alkyle diminue lorsque l'encombrement stérique du subtituant augmente (duplex 55, 56, 57, 58). De plus le duplex 58 comportant la paire C-G2iPr a une stabilité thermique voisine de celle du duplex 52 renfermant la paire T-A à la même position. D'autre part l'appariement des paires de bases C-G* étudiées est spécifique (sauf pour C-I); en effet un mésappariement A-G* (figure 10) ou T-G* (figure 11) ou G-G* (figure 12) conduit à une déstabilisation importante comme dans le cas de mésappariement A-G ou T G ou G-G. Les résultats obtenus dans cet exemple et dans les exemples IV et V montrent qu'il est possible d'utiliser des oligonucléotides modifiés constitués de T, de dA, de dC4Et et de dG2alkuie pour former avec des séquences d'acides nucléiques naturels complémentaires des hybrides dont la stabilité dépend peu de la composition en bases. VIII - Formation de double brin par l'utilisation des paires de bases AUSPropynyîe et/ou G-C en présence de chlorure de tétraméthvlammonium. La stabilité thermique des duplex 41, 45 et 46 comportant 9 paires de bases et constitués respectivement des paires de bases A-T, G-C et A-U5Propynyle a été étudiée dans un milieu renfermant 1 M NaCl ou du chlorure de tétraméthylammonium TMACl de concentration variable. Les résultats données dans la figure 13 montrent que pour un milieu donné le Tm du duplex 41 constitué de 9 paires de base A-T est inférieur à celui du duplex 45 formé avec 9 paires G-C. Par contre en présence de 3,5 M TMACl la stabilité thermique du duplex 46 (Tm = 50,9 C) formé avec 9 paires de bases A~U5Propynyle est équivalente à celle du duplex 45 vTm = 51,8 C). Dans la figure 13, les Tm marqués d'une "*" correspondent à des conditions expérimentales identiques à celles des expériences précédentes rapportées dans les figures 1 à 12, les Tm marquée de "**" correspondent aux conditions expérimentales suivantes : 2. 10-6 M en oligonucléotides dans le tampon tris HCl 50. 10-3 M à pH 8 et contenant de 1'EDTA 2.10-3 M et du chlorure de tétraméthylammonium de concentration variable (2 ; 3 ; 3,5 et 4,4 M). On observe aussi que l'appariement de la paire AUSPropynyle est spécifique dans une solution de 3,5 M TMACl (duplex 48, Tm = 42,6"C) car les mésappariement C-U5Propynyle (duplex 49, Tm = 18,8"C) ou G-U5Propynyle (duplex 50, Tm = 25.7"C) ou T-U5Propynyle (duplex 51, Tm = 25,7 C) conduit à une déstabilisation importante. Ces résultats permettent d'utiliser des paires de base G-C et A-U5Propynyle pour former des duplex dont la stabilité est d'une part élevée et d'autre part dépend peu de la composition en bases. Ces exemples, qui ne sont pas limitatifs, montrent d'une part que les oligonucléotides comportant au moins une base modifiée selon l'invention forment des hybrides spécifiques avec les séquences nucléiques complémentaires, et d'autre part que la stabilité des hybrides formés dépend peu de la composition en base de chaque brin des hybrides. En outre, le procédé de l'invention permet de mieux discriminer les hybrides parfaits des hybrides avec mésappariement, lorsque plusieurs sondes nucléiques sont utilisées en même temps et dans des conditions de température et de milieu déterminées REVENDICATIONS 1) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridées, consistant à mettre en contact une première molécule d'acide nucléique avec une seconde molécule d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, caractérisé en ce que l'un au moins des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et/ou de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée et en ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'un des quatre types de bases entrant dans ia séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. 4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que deux des quatre types de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. 5) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux au moins des quatres types de base entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un au moins des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées. 6) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5, dans lequel la première molécule d'acide nucléique constitue ou comprend la séquence à analyser et la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. 7) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon la revendication 3, dans lequel - la première molécule d'acide nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre un nucléoside modifié de façon à remplacer l'un desdits quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, et - la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. 8) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique caractérisé en ce que l'on réalise un complexe d'hybridation conformément au procédé selon la revendication 4, dans lequel - la première molécule d'acide nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique de copie de tout ou partie de la séquence à analyser, ledit processus mettant en oeuvre deux nucléosides modifiés de façon à remplacer deux des quatre types de bases entrant dans la composition de ladite séquence par deux bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des base naturelles qu'elles remplacent, et - la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde nucléique utile pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle, puis en ce que l'on analyse le complexe d'hybridation par tout moyen approprié. 9) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon 1' l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la sonde nucléique a été préparée par tout processus chimique ou biologique mettant en oeuvre au moins un type de nucléosides modifiés de façon à obtenir une sonde dont la séquence comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. 10) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sonde nucléique est un oligonucléotide comprenant de 4 à 30 nucléosides. 11) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à Cg, un groupe allyle ou propargyle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, et X est un atome d'azote ou un groupe -CH-, ladite désoxycytidine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la désoxycytidine naturelle qu'elle remplace. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la cytidine modifiée de formule (I) est choisie parmi : la N-4-méthyl-2'-désoxycytidine, la N-4-éthyl-2'-désoxycytidine, la N-4-propyl-2t- désoxycytidine, la N-4-allyl-2'-désoxycytidine, la N-4propargyl-2'-désoxycytidine, la l--D-arabinofuranosyl- cytosine, la 6-azadésoxycytidine. 13) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C5t un groupe allyle ou propargyle, R1 représente un atome d'hydrogène ou un atome de brome, et X est un atome de d'azote ou un groupe -CH-, ladite guanosine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la désoxyguanosine naturelle qu'elle remplace. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la guanosine modifiée de formule (II) est choisie parmi : la N-2-méthyldésoxyguanosine, la N-2-propyldésoxyguanosine, la N-2-isopropyîdésoxy- guanosine, la N-2-éthyldésoxyguanosine, la 7déazadésoxyguanosine, la 8-bromo-désoxyguanosine. 15) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyuridine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un groupe de formule - C E CH, ou - C C - CH3, ladite désoxyuridine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la thymidine naturelle qu'elle remplace. 16) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la désoxyuridine modifiée de formule (III) est choisie parmi : la 5éthynyldésoxyuridine, la 5-propynyldésoxyuridine. 17) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que l'un des types de base entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée répondant à la formule suivante dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe NH2, X est choisi parmi un atome d'azote, les groupes de formule : C - Br, C - Cl, C - C e CH, C - C e C - CH3, ladite désoxyadénosine modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la désoxyadénosine naturelle qu'elle remplace. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la désoxyadénosine modifiée de formule (III) est choisie parmi : l'amino-2désoxyadénosine, la 7-déaza-7-bromodésoxyadénosine, la 7-déaza-7-propynyldésoxyadénosine, l'amino-2-7-déaza-7bromodésoxyadénosine, l'amino-2-7-déaza-7-propynyldésoxyadénosine. 19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les première et seconde molécules d'acide nucléique sont de type désoxyribonucléique. 20) Procédé d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 19 pour le séquençage ou la détection de mutation ponctuelle. 21) Procédé de formation d'un complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'analyse de la séquence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 6 à 20, caractérisé en ce que la mise en contact des première et seconde molécules d'acide nucléique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, est effectuée en présence de chlorure de tétraméthylammonium ou d'halogénure de triméthylammonium. 22) Complexe d'hybridation formé de deux molécules d'acide nucléique complémentaires, ou sensiblement complémentaire, dont la stabilité dépend peu de la composition en bases des deux molécules d'acide nucléique hybridées, caractérisé en ce que l'un au moins des types de paire de base entrant dans la composition dudit complexe comprend au moins une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'ensemble des paires de bases entrant dans la composition dudit complexe présente une stabilité voisine. 23) Complexe d'hybridation selon la revendication 22, caractérisé en ce que le même type de base entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace. 24) Complexe d'hybridation selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'un des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique est une base modifiée possédant des propriétés d'appariement voisines de celles de la base naturelle qu'elle remplace, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne une base modifiée. 25) Complexe d'hybridation selon la revendication 23, caractérisé en ce que deux des quatre types de bases entrant dans la séquence de la première et de la seconde molécule d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que les deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprennent une base modifiée. 26) Complexe d'hybridation selon la revendication 22, caractérisé en ce que deux des quatres types de base entrant dans l'une seulement des première et seconde molécules d'acide nucléique sont des bases modifiées possédant des propriétés d'appariement voisines de celles des bases naturelles qu'elles remplacent, de façon à ce que l'un des deux types de paire de bases entrant dans la composition du complexe comprenne des bases modifiées. 27) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que la première ou la seconde molécule d'acide nucléique est une sonde oligonucléotidique. 28) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxycytidine modifiée définie à l'une des revendications 11 et 12. 29) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyguanosine modifiée définie à l'une des revendications 13 et 14. 30) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite première et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyuridine modifiée définie à lune des revendications 15 et 16. 31) Complexe d'hybridation selon l'une quelconque des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que l'un des types de bases entrant dans la composition de ladite premier et/ou seconde molécule d'acide nucléique est une désoxyadénosine modifiée définie à l'une des revendications 17 et 18.