Brevet FR2759692A1 — publié le 19980821

La présente invention se rapporte à de l'argile associée à des ions cérium (m) en tant que produit industriel nouveau. Ce produit, en combinaison avec un ou plusieurs excipients, de préférence de l'eau distillée et stérile, peut être utilisé comme désinfectant, par exemple pour nettoyer du matériel de laboratoire ou du matériel chirurgical. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'argile associée à des ions cérium et un produit tel qu'obtenu par ledit procédé. L'invention concerne aussi un médicament à base d'argile et d'ions cérium (III) et une composition pharmaceutique comprenant ledit médicament. Une telle composition peut être utilisée dans la prévention et le traitement des infections des brûlures cutanées. L'invention a donc encore pour objet l'utilisation de ces compositions pharmaceutiques à base d'argile et d'ions de cérium (fui) pour fabriquer un médicament destiné à prévenir et traiter les infections des brûlures cutanées, un médicament ayant une activité bactériostatique ou un médicament ayant la faculté d'éliminer des bactéries après leur fixation sur les argiles. Les propriétés antibactériologiques des ions cérium (III) sont reconnues (cf. Monafo, Tandon, Ayvazian, Tuchschmidt, Skinner, Deitz, Cerium nitrate: a new topical antiseptic for extensive burns, Surgery, 80 (1976) 465-473). Une crème à base de sulphadiazine d'argent et de nitrate de cérium a été testée (cf. Wassermann, Schlotterer, Lebreton, Levy and Guelfi, Use of topically applied silver sulphadiazine plus cerium nitrate in major burns, Bums, 15 (1989) 257-260). Enfin, une crème appelée FlammacériumB, à base de sulphadiazine d'argent et de nitrate de cérium, est commercialisée. Cependant, ces compositions de l'art antérieur, d'une part, ne permettent pas d'offrir une concentration élevée en ions cérium (ici) (en effet, la concentration en ions cérium (ici) de la crème Flammacérium(D est seulement de 7 mg/g de crème soit une concentration de 5 milliéquivalents par 100 g de crème), ce qui pourrait nuire à leur efficacité, et d'autre part, lorsqu'elles sont utilisées pour traiter des brûlures, elles ne sont pas faciles à éliminer de la peau du patient. L'invention remédie au problème de la trop faible concentration en ions cérium (ici) des produits de l'art antérieur en offrant des produits nouveaux à base d'argile et de sels de cérium (III); ces produits présentent une concentration en ions cérium (III) relativement élevée. Le terme argile signifie une argile ou un mélange d'argiles. L'argile utilisée est une argile présentant une certaine capacité d'échange ionique. L'argile pour un produit selon l'invention peut être en particulier une kaolinite (leur capacité d'échange de cations est de 2 à 20 milliéquivalents par 100 g d'argile sèche), une attapulgite (capacité d'échange de cations d'environ 20 milliéquivalents par 100 g d'argile sèche), une sépiolite (capacité d'échange de cation d'environ 20 à 30 milliéquivalents par 100 g d'argile sèche), une beidellite (capacité d'échange de cations d'environ 100 à 120 milliéquivalents par 100 g d'argile sèche), une montmorillonite (capacité d'échange de 100 à 130 milliéquivalents de cations par 100 g d'argile sèche) ou un mélange de ces dernières (données extraites de Calliere, Henin, Rautureau, Minéralogie des argiles, 2e édition). De préférence, l'argile utilisée pour un produit selon l'invention comprendra au moins une montmorillonite ou une beidellite (les montmorillonites et beidellites appartiennent pour les spécialistes de minéralogie à la famille plus générale des smectites), avec éventuellement une attapulgite et/ou une sépiolite. L'invention concerne donc tout d'abord un produit industriel nouveau comprenant de l'argile associée à des ions cérium (fil). L'invention concerne aussi l'utilisation dudit produit en combinaison avec un ou plusieurs excipients, de préférence de l'eau distillée et stérile, ou une solution stérile d'électrolytes, pour la désinfection du matériel de laboratoire ou chirurgical. Par ailleurs, l'invention offre également à titre de médicament destiné à prévenir et traiter les infections des brûlures cutanées un des produits tels que décrits précédemment; ce médicament présente une concentration en ions cérium (ici) relativement élevée et a en outre l'avantage de s'éliminer très facilement. Comme précédemment, le terme argile signifie une argile ou un mélange d'argiles. Un tel médicament selon l'invention amène de plus un certain confort d'utilisation inconnu dans l'art antérieur. En effet, il est difficile d'éliminer des crèmes appliquées sur la peau de grands brûlés. Par contre, on peut éliminer un médicament selon l'invention par simple lavage à l'eau, ce qui permet d'épargner les tissus fragiles de la peau brûlée. La présente invention concerne en particulier un produit constitué par de l'argile associée à (ou dopée par) des ions cérium (III) en tant que produit industriel nouveau. Sans vouloir se limiter quant à la structure chimique des produits de l'invention, la demanderesse pense que ces produits constituent un complexe ionique dans lequel certains cations de l'argile sont échangés par des cations cérium (fui). Les produits selon l'invention peuvent être obtenus par mise en suspension d'argile dans une solution contenant des ions cérium (III) et agitation du mélange pendant au moins une heure à température ambiante. Les solutions contenant les ions cérium (III) peuvent comporter par exemple de 0,001 à 0,1 mol/l sous forme de sel de cérium (III), de préférence du nitrate, ou du chlorure de cérium (III), ou d'un mélange de ces sels; cependant, d'autres sels adéquats de cérium (m) peuvent être utilisés par l'homme du métier. L'invention a donc pour objet les produits tels qu'obtenus par ce procédé d'échange ionique. De préférence, l'argile de l'invention sera une kaolinite, une attapulgite, une sépiolite, une beidellite, une montmorillonite telle la diosmectite, ou un mélange de ces argiles, et, plus préférentiellement, une montmorillonite, une beideillite, une sépiolite, une attapulgite ou un mélange de ces argiles; on préférera tout particulièrement utiliser une montmorillonite, une beidellite ou un mélange de ces argiles pour obtenir un produit selon l'invention. La présente invention concerne également un médicament à base d'argile et d'ions cérium (ici). Elle concerne tout particulièrement un médicament à base de diosmectite associée à des ions cérium (ici), ce médicament étant de préférence préparé à partir du nitrate ou du chlorure de cérium, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de cérium (fui), ou encore un mélange de ces sels. De préférence, la concentration en ions cérium (ici) sera choisie supérieure à 7 mg par gramme d'argile (soit 5 milliéquivalents par 100 g d'argile), c'està-dire supérieure à la concentration de la crème commerciale Flammacérium. On préférera tout particulièrement les médicaments dont la concentration en ions cérium (HI) sera supérieure à 35 mg par gramme d'argile. Par ailleurs, la présente invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques contenant ledit médicament. Ces compositions pharmaceutiques peuvent également comprendre, si besoin est, d'autres principes actifs tels que des antibiotiques, d'autres ions métalliques incorporés ou non à l'argile et des composés efficaces pour le traitement des brûlures tels l'amino-4 N-(pyrimidinyl-2) benzène sulfonamide argentique (dont la DCI est sulfadiazine argentique). Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également comprendre des excipients inertes. Enfin, l'invention se rapporte également à l'utilisation de compositions contenant ledit médicament pour fabriquer un médicament destiné à prévenir et traiter les infections des brûlures cutanées, un médicament ayant une activité bactériostatique ou un médicament ayant la faculté d'éliminer des bactéries après leur fixation sur les argiles. Pour ce dernier, l'argile dopée au cérium (m) fixe les bactéries avant d'être éliminée par simple lavage (à l'eau stérile par exemple). A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence. Les exemples qui suivent sont présentés pour illustrer la réalisation de l'invention et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Partie expérimentale: hoççdé de. préparati.on.; Afin d'obtenir une argile dopée au cérium (ici) selon l'invention, on peut procéder de la façon suivante: 1. On prépare d'abord une solution de nitrate de cérium à 0,0285 molli (pesée de 24,74 g de nitrate de cérium hexahydraté (Aldrich, USA; MM = 434) que l'on dissout dans 2 1 d'eau distillée); 2. On pèse 100 g de diosmectite (Beaufour-Ipsen, France); 3. Dans un bécher de 5 1 en polypropylène, on met en suspension la diosmectite dans la solution de nitrate de cérium (III); 4. On agite la suspension durant une heure à l'aide d'un agitateur magnétique; 5. On filtre la suspension sur Büchner pour recueillir l'argile dopée au cérium (III); 6. On sèche l'argile pendant 24 heures à température ambiante; 7. On pulvérise l'argile au mortier et on la tamise; 8. Et enfin on détermine par spectrofluorimétrie la teneur en cérium (fui) de la diosmectite ainsi préparée : elle a ainsi une concentration de 43 mg de cérium (III) par gramme de diosmectite. Pour déterminer cette concentration, un dosage du cérium (ici) est réalisé sur un échantillon de la solution de départ et sur un échantillon de la solution après filtration de l'argile dopée. Par différence, on calcule la quantité de cérium (IllI) fixée sur l'argile et on en déduit la concentration en ions cérium (m) de l'argile ainsi préparée. Etudes d'adsorption: Pour connaître la concentration en cérium (III) de l'argile, on prélève à intervalles réguliers un échantillon de la solution qu'on centrifuge et on procède à l'analyse fluorimétrique de 200 ,ul de la solution surnageante diluée. A température ambiante, le cérium (III) est rapidement adsorbé par la diosmectite. La cinétique d'adsorption dépend de la concentration de la solution d'ions cérium utilisée. La quantité de cérium (ici) liée à l'argile est fonction de la quantité de diosmectite impliquée. En moyenne, 51 + 10 mg de cérium (m) sont absorbés par gramme de diosmectite. Le pH n'a pas d'influence sur l'adsorption dans le domaine étudié de 2,3 à 7,4. Enfin, aucune influence de la température sur la cinétique d'adsorptioon n'a pu être démontrée entre +4 "C et +22 "C. Etudes de libération des ions cérium ("n Pour étudier la libération d'ions cérium par l'argile dans des conditions proches de la réalité thérapeutique, on met en suspension 0,1 g de diosmectite dopée au cérium dans 5 ml d'une solution aqueuse d'électrolyte choisi. On agite pendant une heure à température ambiante et on détermine après centrifugation la quantité de cérium libérée à des intervalles donnés. Comme pour l'adsorption, la libération de cérium (m) est très rapide en milieu NaCl 0,9% (moins de 2 minutes). En outre, aucune influence du pH n'a été détectée entre 2,3 et 7,4. En ce qui concerne la force ionique, plus celle-ci est élevée, plus la libération d'ions cérium (m) est forte. Enfin, la quantité de cérium (ici) libérée est fonction de la quantité d'argile mise en jeu. Par exemple, 19 + 2% (n = 3) de cérium sont libérés de 100 mg de diosmectite dopée, tandis que 30 + 1% (n = 3) sont libérés de 8 mg de diosmectite dopée. Ceci provient sans doute d'une aggrégation des particules d'argile en suspension à haute concentration; ce qui diminue le nombre de sites d'échange de cations. Propriétés microbiologiques d'une argile dopée au cérium (III): Matériel et méthodes Argile dopée au cérium (1ll): Cette étude a été réalisée avec une argile stérile dopée au cérium. Cette argile a été préparée à partir d'une diosmectite (Laboratoires Beaufour) et de nitrate de cérium (III) hexahydraté (Aldrich) selon la méthode indiquée précédemment. Sa teneur en cérium (ici) a été contrôlée par fluorimétrie : elle contient 43 mg de cérium (III) par gramme de diosmectite. Pour toute cette étude, la diosmectite utilisée contient une concentration en poids de 43 mg/g de cérium (ho). Souches bactériennes: Deux souches ont été choisies : Pseudomonas aemginosa CIP 103467 et Staphylococcus aureus CIP 53154. Activité bactériostatique du cérium (111): Des solutions de nitrate de cérium à 10,5 - 13,3 - 19,9 et 26,6 mg/ml ont été préparées extratemporanément dans de l'eau distillée. De même, des suspensions de l'argile dopée à tester (obtenue selon le procédé de préparation décrit précédemment) ont été préparées (7,5 - 10 - 15 et 20%). Ces suspensions correspondent respectivement à des concentrations de 3,4-4,3 - 6,4 et 8,6 mg/ml en cérium (ici). Pour chacune des deux souches, une suspension de germes titrant de 1 à 3.108 bactéries par ml a été initialement préparée (68% de transmission au spectrophotomètre à 620 nm) puis 100 111 de cette suspension-mère ont été ensemencés dans 100 ml de milieu Müller Hinton (MH). Pour l'étude de bactériostase en milieu liquide, on a préparé des tubes contenant chaque fois 1 ml de solution de nitrate de cérium ou 1 ml de suspension d'argile dopée au cérium (1 ml d'eau distillée stérile pour le témoin) et 9 ml de milieu de MH précédemment ensemencé. Chaque tube est incubé 24 heures à 37 "C. Après incubation, les tubes sont ensemencés en spirale à l'aide d'un ensemenceur Spiral SystemB ) afin de réaliser un dénombrement des bactéries. Le nombre des bactéries est lu après les 24 h d'incubation à 37 "C. Pour les solutions de nitrate de cérium (III), quatre essais ont été réalisés pour chaque concentration; pour les suspensions d'argile dopée, trois essais ont été réalisés pour chaque concentration. Etude de l'adhésion des deux souches bactériennes sur l'argile: Pour cette étude, deux techniques de séparation des bactéries libres sont utilisées pour évaluer la quantité de bactéries adhérant au support argileux: a) une méthode par filtration sur papier pour séparer les bactéries en suspension des bactéries fixées sur l'argile; b) une méthode par centrifugation. a) Séparation par filtration: Une suspension témoin (sans argile) titrant de 1 à 3.108 bactéries par ml est préparée à partir d'une suspension-mère. Des suspensions d'argile à des concentrations volumiques de 0,5 - 1 - 2 et 5% sont préparées dans du diluant simple (DS, solution contenant 1 g/I de peptone de caséine et 8,5 g/I de NaCI) à partir de la diosmectite brute stérile, pour ne pas être gêné par l'activité microbiologique du cérium de l'argile dopée. Un volume de suspension-mère bactérienne, identique à celui ajouté au témoin, est ajouté dans chaque suspension d'argile. Elles contiennent donc aussi 1 à 3.108 bactéries par ml. Après un temps de contact de 10 minutes, une filtration sur papier filtre est effectuée pour séparer les bactéries libres de la suspension d'argile. Le filtre est rincé 3 fois par 10 ml de DS puis remis en suspension dans 30 ml de DS. Un dénombrement en masse est réalisé à partir du filtre rincé et passé aux ultrasons pour détacher les bactéries. b) Séparation par centrifugatlon: Les suspensions d'argile sont préparées de la même façon que précédemment (0,5 - 1 - 2 et 5%) et contiennent 1 à 3.108 bactéries par ml. Chaque suspension a été placée dans un tube de centrifugation au polypropylène. Après 10 minutes de repos, les solutions sont centrifugées à une vitesse de 500 tours/mn pendant 10 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot contenant l'argile lavé 3 fois par remise en suspension dans 10 ml de DS et centrifugation pendant 10 minutes à 500 tours/mn. Le culot lavé est remis en suspension dans 10 ml de DS. Les bactéries contenues dans ces suspensions ont été dénombrées à partir d'un ensemencement réalisé à l'aide d'un ensemenceur Spiral System(D après icubation durant 24hà37 C. Une suspension témoin contenant 0 % d'argile en suspension est également préparée. Elle est centrifugée 10 minutes à une vitesse de 500 tours/mn. Les bactéries ont été dénombrées sur le surnagent afin de déterminer la quantité de bactéries de l'inoculum et de vérifier l'absence de sédimentation des bactériers libres. Résultats Activité bactériostatique du cérium (1ll): L'étude de l'activité microbiologique du cérium réalisée en milieu liquide montre que le cation Ce3+ présente une activité bactériostatique. La concentration minimale inhibitrice est de 0,43 mg/ml (soit 1,33 mg/ml de nitrate de cérium (III) hexahydraté) pour les deux souches (tableau I). Populations bactériennes viables (log UFC / ml) Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Nitrate de cérium t0 t24h t0 t24h hexahydraté (mg/ml) 0 4,57 # 0,20 > 6 4,60 # 0,37 > 6 1,05 4,57i0,20 > 6 4,60 # 0,37 > 6 1,33 4,57 i 0,20 3,71 # 0,70 4,60 # 0,37 4,20 # 0,78 1,99 4,57 i 0,20 2,09 i 0,23 4,60 i 0,37 3,38 i 0,45 2,66 4,57 i 0,20 1,62 + 0,31 4,60 i 0,37 2,51 i 0,19 UrC = umtes tormant colonie Tableau I : Activité bactériostatique du nitrate de cérium sur Pseudomonas aeruginosa CIP 103467 et Staphylococcus aureus CIP 53154 (n = 4) Le même résultat est retrouvé avec l'argile dopée. La bactériostase est observée sur les deux souches pour une suspension d'argile de 10 mg/ml, i. e. une concentration de cérium de 0,43 mg/ml (tableau 11). Populations bactériennes viables (log UFC I ml) Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Argile dopée au cérium b t24h t0 t24h (mg/ml) 0 4,65 # 0,12 > 6 4,84+0,08 > 6 7,5 4,65 + 0,12 > 6 4,84 i 0,08 > 6 10 4,65 + 0,12 4,59 + 0,44 4,84 + 0,08 4,43 + 0,50 15 4,65 # 0,12 3,49 # 0,35 4,84 # 0,08 3,72 + 0,15 20 4,65 + 0,12 1,91 i 0,60 4,84 + 0,08 2,47 + 0,54 Tableau Il : Activité bactériostatique de l'argile dopée au cérium (43 mg de Ce3+ par g) sur Pseudomonas aeruginosa CIP 103467 et Staphylococcus aureus CIP 53154 (n = 3). Adhésion bactérienne sur l'argile: a) Séparation par filtration: Le nombre de bactéries retrouvées sur le filtre, c'est-à-dire fixées sur l'argile, augmente avec la concentration d'argile (cf. tableaux ffi et IV). Nombre de bactéries Pourcentage de retenues sur le filtre bactéries retenues sur (log UFC / ml) le filtre Témoin (O %) 8,07 # 0,14 15 # 7 Argile 0,5 % 8,94 # 0,07 104 + 20 * Argile 1 % 8,96 # 0,14 110 # 12 * Argile 2 % 8,93::::0,09 101+8* Ar Argile 5 % 9,01 # 0,03 111 # 12 * * = différence significative par rapport au témoin (p Tableau III : Nombre de bactéries retenues sur le filtre en fonction de la concentration volumique en argile pour la souche St. aureus (n =3) Nombre de bactéries Pourcentage de retenues sur le filtre bactéries retenues sur (log UFC / ml) le filtre Témoin (O %) 8,30 + 0,09 13 # 3 Argile 0,5 % 8,92 + 0,07 54 i 12 * Argile 1 % 9,09 + 0,00 81 # 15 * Argile 2 % 9,16 # 0,07 83 # 13 * Argile 5 % 9,16 i 0,05 96 # 7 * * = différence significative par rapport au témoin (p Tableau IV : Nombre de bactéries retenues sur le filtre en fonction de la concentration volumique en argile pour la souche de P. aeru gin osa (n=3). b) Séparation par centrifugation: Pour les deux souches, le nombre de bactéries fixées sur l'argile augmente avec la concentration volumique en argile dopée au cérium (m) (tableau V). S. aureus P. aeruginosa Pourcentage de bactéries Pourcentage de bactéries fixées par l'argile fixées par l argile Témoin (O %) 0 0 Argile 0,5 % 15 # 1 * 34 # 4 * Argile 1 % 25 # 6 * 46 # 6 * Ar lie 2% 41::::9* 56 # 4 * Argile 5 % 62 # 6 * 77 # 11 * * = différence significative par rapport au témoin (p Tableau V : Pourcentage de bactéries fixées sur l'argile (par rapport à l'inoculum) en fonction de la concentration volumique en argile pour les deux souches (n=3). Conclusion L'argile dopée au cérium (m) utilisée dans toute cette étude contient 43 mg de cérium par gramme de diosmectite. Cette concentration est très supérieure à celle contenue dans la préparation Flammacérium actuellement disponible. Les études de libération des ions cérium (m) décrites ci-dessus ont en outre permis de montrer que le cérium fixé dans la diosmectite restait disponible et pouvait être libéré par échange cationique. L'argile dopée au cérium (m) libère in vitro une quantité de cérium suffisante pour obtenir une activité microbiologique sur deux souches bactériennes responsables de surinfection de la peau brûlée: Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. De plus, la diosmectite est également capable de fixer des bactéries telles que les souches Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. pour les éliminer ensuite par simple lavage à l'eau. Revendications 1. Produit comprenant de l'argile associée à des ions cérium (III). 2. Produit selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'argile est une kaolinite, une attapulgite, une sépiolite, une beidellite, une montmorillonite ou un mélange de ces argiles. 3. Produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'argile comprend au moins une montmorillonite ou une beidellite. 4. Produit selon la revendication 3 caractérisé en ce que la montmorillonite comprend au moins la diosmectite. 5. Produit selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'argile comprend au moins une attapulgite ou une sépiolite. 6. Produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il contient au moins 7 mg d'ions cérium (ici) et de préférence au moins 35 mg d'ions cérium (HI) par gramme d'argile. 7. Procédé de préparation d'argile associée à des ions cérium caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) l'on met en suspension dans de l'eau de l'argile et un sel de cérium (m), de préférence du nitrate ou du chlorure de cérium (ho), ou un mélange de ces sels, la suspension étant agitée avec un agitateur quelconque; b) l'on filtre et recueille l'argile ainsi obtenue. 8. Produit tel qu'obtenu par un procédé selon la revendication 7. 9. A titre de médicament, un produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou selon la revendication 8. 10. Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un médicament selon la revendication 9. 11. Utilisation d'un produit selon l'une des revendications 1 à 6 ou selon la revendication 8 pour fabriquer un médicament ayant une activité bactériostatique. 12. Utilisation d'un produit selon l'une des revendications 1 à 6 ou selon la revendication 8 pour fabriquer un médicament ayant la faculté d'éliminer des bactéries après leur fixation sur les argiles. 13. Utilisation d'un produit selon l'une des revendications 1 à 6 ou selon la revendication 8 pour fabriquer un médicament destiné à prévenir et traiter les infections des brûlures cutanées. 14. Utilisation d'un produit selon l'une des revendications 1 à 6 ou selon la revendication 8 en combinaison avec un ou plusieurs excipients, de préférence de l'eau distillée et stérile, ou une solution stérile d'électrolytes, pour la désinfection du matériel de laboratoire ou chirurgical.