Brevet FR2751002A1 — publié le 19980116

BIOCAPTEURS, LEUR PROCEDE DE REALISATION ET METHODES D'ANALYSE LES METTANT EN OEUVRE Cette invention concerne un biocapteur. Plus particulièrement, elle concerne le procédé de réalisation d'un biocapteur perfectionné et son utilisation dans des dispositifs d'analyse. DOMAINE DE L'INVENTION Les connaissances récentes acquises dans différents domaines (chimie, biochimie, microbiologie, biologie moléculaire et électronique) ont permis de les adapter aux sciences appliquées (diagnostic médical, pharmacie, agro-alimentaire et environnement). Regroupées sous le terme de biotechnologies, certaines de ces applications présentent un intérêt industriel justifiant l'importance des recherches suscitées. Parmi les disciplines des biotechnologies, le génie enzymatique présente un intérêt particulier en utilisant le potentiel catalytique des enzymes appliqué à la synthèse, la dégradation ou la détection spécifique d'un certain nombre de substances. Les enzymes, généralement de nature protéique, sont des catalyseurs spécifiques. Ils n'interviennent que dans une seule ou que dans un petit nombre de réactions. Cette spécificité d'action a permis de développer l'utilisation des enzymes dans le domaine des analyses quantitatives. Ainsi, des composants, appelés biocapteurs, ont pu être mis au point pour mesurer un paramètre physique ou chimique au cours d'une réaction enzymatique. La réalisation d'un biocapteur implique généralement l'immobilisation sur un support, par exemple par liaison covalente, d'un enzyme afin de le rendre plus stable et réutilisable. Ce support est ensuite fixé sur un capteur électrochimique. Un biocapteur de ce type constitue un outil d'analyse quantitative permettant le développement d'une multiplicité de dosages, créant de nouvelles conditions d'expérimentation et de nouveaux marchés, notamment dans le domaine de l'environnement. Depuis la réalisation du premier biocapteur, les progrès de la recherche ont permis d'améliorer continuellement ces composants pour augmenter leur fiabilité, les adapter à des besoins très précis etc.. Dans le domaine de la mesure des alcools, plusieurs biocapteurs ont été conçus. ART ANTERIEUR Le brevet européen N" 0.357.027 décrit l'immobilisation de l'alcool oxydase sur une membrane placée ensuite sur une électrode à oxygène ou de préférence sur une électrode à eau oxygénée. II ne fait pas référence aux performances et aux conditions d'utilisation du biocapteur ainsi obtenu. Le brevet européen N" 0.214.336 décrit l'utilisation de l'alcool oxydase soluble ou immobilisée. La limite de détection de ce biocapteur est de 100 ppm. II est utilisé pour le dosage du méthanol et de méthanol dans le cyclohéxane et dans le gas-oil dans des conditions de laboratoire. Le brevet européen N" 458.288 décrit l'utilisation de l'alcool oxydase immobilisée dans une colonne et inhibée de manière réversible par l'azide. La limite de détection de ce biocapteur est inférieure à 1 % d'éthanol. II est utilisé dans les domaines de l'agro-alimentaire, des tests cliniques et de l'environnement. Outre méthanol, il peut doser le méthanol et le propanol. Le brevet européen N" 368.474 décrit le procédé de fabrication d'un biocapteur à base d'alcool déshydrogénase nécessitant l'addition de NAD+. Sa limite de détection est 160 ppm. Ce biocapteur présente donc des performances limitées tout en étant relativement coûteux du fait de l'addition de NAD+ à chaque dosage. Le brevet européen N" 326.081 est basé sur l'immobilisation des enzymes par la méthode de l'irradiation, par exemple par les rayons ultraviolets. Les performances du biocapteur ainsi obtenu ne sont pas évoquées. Le brevet européen N" 416.419 décrit un biocapteur dont la méthode d'immobilisation a déjà été décrite plusieurs fois dans l'art antérieur. L'alcool oxydase immobilisée dans une colonne peut, par le procédé décrit, présenter une stabilité relativement grande (1 mois). Ce biocapteur n'est utilisé que dans la journée. Il est conservé la nuit. L'étude approfondie des documents de l'art antérieur montre un certain progrès dans la conception et les conditions d'utilisation des biocapteurs (particulièrement de ceux destinés à doser les alcools). Toutefois les biocapteurs à alcool de l'art antérieur souffrent encore d'un certain nombre d'inconvénients limitant leurs champs d'application. En particulier, la plupart ne peut être utilisée en continu, et leur durée de vie, dépendant de leur stabilité, et leur sensibilité sont généralement faibles. Pour ces raisons, les biocapteurs destinés à la mesure des alcools ne sont encore utilisés que pour l'analyse de laboratoire. L'invention décrite dans cette demande permet de réaliser un biocapteur remédiant à cet ensemble d'inconvénients. La présente invention a pour objet la réalisation d'un biocapteur de durée de vie prolongée destiné à l'analyse de certains paramètres chimiques, tels que les alcools, capable de mesurer de faibles concentrations de ces paramètres dans l'échantillon à doser. La présente invention a également pour objet la réalisation d'un tel biocapteur - pour une utilisation en continu dans l'industrie, dans un dispositif de mesure le mettant en oeuvre, - pour permettre la suppression du traitement de l'échantillon précédant la mesure. DESCRIPTION DE L'INVENTION L'invention concerne un biocapteur, son procédé de réalisation et la méthode d'analyse le mettant en oeuvre pour mesurer des paramètres chimiques, notamment certains paramètres de l'eau. Ce biocapteur est suffisamment stable et performant pour être utilisé en continu dans l'industrie et pouvoir effectuer plusieurs milliers d'analyses avec le même film enzymatique. Le principe général de fonctionnement du biocapteur est le suivant 1. l'enzyme est choisi en fonction du paramètre à mesurer; 2. le biocapteur, constituant la partie sensible d'un appareil d'analyse plus complexe, est mis au contact de l'échantillon à doser et par conséquent du paramètre à évaluer; 3. l'enzyme catalyse une réaction connue; 4. la disparition ou la production d'un produit déterminé lors de cette réaction génère un signal, généralement électrique, détecté par un capteur approprié; 5. ce signal, d'une intensité proportionnelle à la quantité du paramètre à évaluer présent initialement dans l'échantillon, est converti en données exploitables par l'utilisateur. La caractéristique de grande stabilité du biocapteur selon l'invention lui est conférée à la fois par sa conception nouvelle, dépendante de son procédé de réalisation, sa méthode de stockage et sa mesure. Le procédé de fabrication de ce biocapteur implique des étapes nouvelles par rapport aux procédés de l'art antérieur. Le biocapteur selon l'invention est constitué de deux éléments principaux - un complexe, appelé par la suite film enzymatique , constitué d'un ensemble fait d'enzymes et de membranes; - un transducteur pour détecter le signal, généralement électrique, d'intensité proportionnelle à l'importance de la réaction de transformation du paramètre à doser ou de l'un de ses produits intermédiaires sous l'action dudit enzyme. Le film enzymatique est d'abord constitué par un support. On préfère particulièrement utiliser un film préactivé ou préfonctionnalisé, tel que le film ULTRABIND, présentant des groupements réactifs. Ce support est ensuite recouvert d'un mélange contenant, entre autres, I'enzyme induisant la réaction chimique permettant de doser un substrat donné. Ce mélange est alors immobilisé par un procédé connu sur le film péactivé, par exemple en favorisant la formation de liaisons covalentes entre le support et l'enzyme. A cette fin, on ajoute au mélange disposé sur le support une certaine quantité d'un agent pontant les groupements fonctionnels (NH2, OH, COOH ou SH) des protéines et dont l'excès est ensuite neutralisé par un tampon. On peut par exemple utiliser le glutaraldéhyde comme agent pontant. II est neutralisé par un tampon contenant un élément porteur de groupements NH2, la lysine par exemple. Le support porteur de l'enzyme déjà immobilisé est mis en sandwich entre deux membranes de dialyse. Le complexe ainsi formé est alors placé sur le transducteur capable de détecter le signal généré par la transformation d'un composant de l'échantillon à doser sous l'action de l'enzyme immobilisé ou bien il est plongé dans une solution de conservation. Dans une réalisation particulière du biocapteur selon l'invention, le composé mesuré pour évaluer la quantité d'un paramètre donné est l'oxygène. Cette quantité est proportionnelle à la quantité d'oxygène dégagée ou consommée au cours d'une réaction de transformation dudit paramètre. Dans le but de catalyser la réaction libérant ou consommant l'oxygène et de mesurer avec précision l'importance de cette libération ou de cette consommation, on utilise une électrode de Clark, connue dans la technique pour sa capacité à mesurer la quantité d'oxygène présent, sur la partie sensible de laquelle on dépose un film enzymatique. Dans une mise en oeuvre préférée de l'invention, on réalise un biocapteur à alcool. Dans ce but, on dépose sur le film préactivé un mélange fait d'alcool oxydase, d'une protéine telle que la sérum albumine bovine et d'une petite quantité de catalase. Le mélange est fixé par un moyen connu favorisant la formation de liaisons covalentes. Le support porteur du mélange est ensuite mis en sandwich entre deux membranes de dialyse pour former le complexe enzymatique du biocapteur. Celui-ci est enfin placé sur un transducteur adéquat, ou dans une solution de conservation. Par exemple, on peut ainsi déterminer la concentration du méthanol présent dans une solution. Pour cela, on réalise un biocapteur fait d'un film enzymatique porteur d'alcool oxydase et d'une électrode de Clark (connue pour sa capacité à mesurer ampérométriquement la concentration d'oxygène). Ce biocapteur est mis au contact de la solution à doser. L'alcool oxydase provoque, en présence d'oxygène, la transformation du méthanol en méthanal, la production d'eau oxygénée et la disparition d'oxygène. L'électrode de Clark en mesurant la concentration d'oxygène détecte sa diminution, laquelle est proportionnelle à la quantité de méthanol initialement présente dans la solution dosée. La combinaison film d'alcool oxydase/capteur à oxygène constitue un biocapteur à alcool. Le principe de la réaction et de la mesure est alors le suivant - pour le méthanol - pour méthanol AOD : alcool oxydase Selon une autre mise en oeuvre de la présente invention, on peut envisager de fixer sur le même film un petit nombre d'enzymes catalysant des réactions couplées (la seconde réaction utilisant le produit de la première, la troisième utilisant le produit de la seconde etc.). Dans ce cas, le même principe général peut être utilisé non plus pour mesurer I'importance d'une réaction directe sur le paramètre à évaluer mais pour déterminer quantitativement la production ou la disparition d'un composé par la réaction d'un produit intermédiaire de ce paramètre catalysée par l'enzyme ou les enzymes du biocapteur. D'autres réalisations de biocapteurs selon l'invention permettent d'évaluer d'autres paramètres. Par exemple, il est possible de doser l'urée. Pour ce dosage, aux moins deux différents types de biocapteurs sont utilisés - un premier biocapteur est constitué par un film enzymatique fabriqué selon le procédé décrit ci-dessus immobilisant l'uréase et un capteur à NH3. La réaction utilisée est alors l'hydrolyse de l'urée. - un second biocapteur est constitué par un capteur à oxygène et un film immobilisant trois enzymes (la deuxième réaction utilise le produit de la première et la troisième utilise celui de la seconde). Les trois enzymes sont dans ce cas : I'uréase, la glutamine synthase et la pyruvate oxydase ou bien l'uréase, la phosphoénol pyruvate carboxylase et la pyruvate oxydase. De la même manière, on réalise un biocapteur selon l'invention pour le dosage du saccharose. Dans ce cas, le capteur électrochimique utilisé est une électrode à oxygène et le film enzymatique immobilise trois enzymes : I'invertase, la mutarotase et la glucose oxydase. Lorsqu'ils ne sont pas utilisés, les films enzymatiques des biocapteurs doivent être conservés en solution. Les mesures effectuées par les biocapteurs selon l'invention imposent certaines conditions opératoires. Le principe de dosage étant basé sur l'utilisation d'un enzyme, on travaille dans un milieu tamponné avec une force ionique constante et à température également constante. Ces paramètres sont déterminés de manière connue en fonction des enzymes utilisées dépendant eux-mêmes des substances à doser. Dans le cas de l'alcool oxydase, on travaille en milieu tamponné entre pH 7,0 et pH 8. L'enzyme formant une partie du biocapteur est régénéré après chaque mesure. Dans ce but, une solution de régénération contenant un tampon permettant d'ajuster le pH entre 7 et 8, un chélateur, tel que l'EDTA et un antibiotique à large spectre, du type chloramphénicol ou amoxicilline, est réalisée. Maintenus dans certaines concentrations, les composants de cette solution assurent la stabilité au fonctionnement d'un biocapteur à méthanol ou à éthanol pendant au moins un mois à raison d'un dosage toutes les 20 minutes. Le biocapteur selon l'invention présente des propriétés telles, particulièrement pour ce qui concerne sa stabilité, qu'il est parfaitement adapté à une mise en oeuvre dans un automate. II se distingue ainsi des biocapteurs réalisés jusqu'alors et utilisés uniquement pour effectuer des mesures dans les conditions de laboratoire. Sa mise en place dans un dispositif d'analyse industriel permet d'effectuer des mesures en continu. Le dispositif mettant en oeuvre un biocapteur selon l'invention, équipé du capteur approprié, effectue la mesure de différents paramètres tels que le méthanol, I'éthanol, I'urée ou le saccharose. Cette liste peut être étendue à d'autres paramètres. Au cours de la mesure d'un paramètre, au moins une réaction chimique est catalysée par un enzyme déterminé. Cette réaction génère un signal, généralement électrique, identifié par le capteur et transmis à une unité de traitement le transformant en données généralement directement exploitables par l'utilisateur. Une unité électronique gère la prise et la préparation de l'échantillon, la mesure et l'affichage, les alarmes etc.. La cellule de mesure est divisée en deux compartiments (C1) et (C2). Le premier sert à la préparation de l'échantillon alors que le second sert à la mesure. Le compartiment de préparation (C1) contiens - un mélangeur (M), - un système de chauffage (E) par exemple une cartouche chauffante et de mesure de température pour maintenir l'échantillon à température constante, - un siphon et un trop plein (S) pour avoir un volume répétitif d'échantillons, - des électrovannes d'admission d'échantillons (V1) et de vidange (V5). Le compartiment de mesure (C2) contient le capteur électrochimique (O) et présente un dispositif de vidange (D). A cette liste s'ajoutent tous les éléments structurels usuels permettant à ces différentes parties des compartiments d'assurer leur fonction et de communiquer les unes avec autres - une vanne d'eau de rinçage (V2) - une vanne de solution de régénération (V3) - une vanne de mesure (V4) - une pompe de conditionnement (P1) - une pompe d'étalonnage automatique (P2). Le cycle de mesure de ce dispositif se décompose en deux phases: - une phase de régénération du biocapteur, - une phase de mesure. Pour la précision et la reproductibilité des mesures, chaque phase comprend une étape de préparation et une étape de mesure. L'étape de préparation comprend - le rinçage du compartiment de préparation (C1), - I'admission de l'échantillon ou de la solution de régénération, - le chauffage et la régulation de la température, - le conditionnement. - I'attente de la stabilisation de l'échantillon conditionné ou de la solution de régénération, L'étape de mesure comprend - I'ouverture de l'électrovanne de mesure (V4 > , - la mesure et le calcul de la concentration. II apparaît de la description ci-dessus que de nombreux biocapteurs selon l'invention peuvent être réalisés. L'adaptation du procédé de réalisation selon l'invention à chacun de ces biocapteurs est connue de la technique. Les capteurs électrochimiques, les enzymes (spécifiques des substances à doser ou de leurs produits intermédiaires) et le nombre de ces enzymes sont déterminés par les paramètres à évaluer. Ces biocapteurs présentent tous les mêmes avantages et permettent ainsi de résoudre les problèmes soulevés par les techniques antérieures - disparition du besoin de prétraitement de l'échantillon : le capteur à oxygène qui mesure la variation de concentration d'un substrat permet le dosage dans un milieu réactionnel coloré ou trouble. Ainsi, un prétraitement (précipitation, centrifugation, filtration, décoloration) n'est plus nécessaire. - spécificité du dosage : I'enzyme ou les enzymes et les capteurs sont choisis en fonction des paramètres à doser. Les enzymes étant par nature très spécifiques, ils reconnaissent la substance particulière sur laquelle leur action se dirige, même en présence de nombreuses autres substances parfois proches chimiquement. - stabilité de l'enzyme et par conséquent du biocapteur : I'enzyme étant immobilisé sur le capteur, celui-ci est lavé, I'enzyme régénéré demeure sur le film et est alors réutilisable. On effectue plusieurs milliers de dosages avec le même film enzymatique et donc ia même quantité d'enzyme, ceci représentant une économie substantielle. - performances du biocapteur : elles se distinguent particulièrement de celles obtenues avec les biocapteurs de l'art antérieur. La gamme de mesure du méthanol se situe entre 0 et 10 ppm, la précision de ces mesures est de + ou - 0,2 ppm, la sensibilité est inférieure à 0,2 ppm, la limite de détection est égale à 0,5 ppm et la mesure en continu est effectuée toutes les 20 minutes dans un nouvel échantillon. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente le montage du film enzymatique selon l'invention sur un transducteur. La figure 2 est un graphique représentant l'évolution de l'activité enzymatique et donc de la stabilité de l'enzyme dans le temps. La figure 3 repésente l'évolution de l'intensité de courant captée par le transducteur du biocapteur en fonction de la concentration de méthanol de l'échantillon dosé. La figure 4 est un schéma fonctionnel d'un dispositif utilisant un biocapteur selon l'invention capable d'effectuer des mesures en continu. La figure 5 est une courbe représentant la dispersion des résultats obtenus par dosages répétitifs en continu d'une solution de concentration connue en méthanol. EXEMPLES DE REALISATION Exemple 1 Un biocapteur selon l'invention est réalisé pour le dosage des alcools. Les étapes correspondant à une telle analyse sont les suivantes - fabrication du film enzymatique, - stockage de ce film, - mesure du paramètre dans un échantillon. Pour fabriquer le film enzymatique, on choisit d'abord un support (1) adapté pour recevoir l'enzyme à immobiliser. On préfère particulièrement un film préactivé ou préfonctionnalisé tel que le film ULTRABIND de GELMAN. On découpe un cercle de 1 cm de diamètre dans ce film. Parallèlement à cette opération, on réalise un mélange comportant - 1 à 10 Ul de solution d'alcool oxydase (de Pichia pastoris (EC 1.1.3.13), - 5 à 30,ul de solution de sérum albumine bovine (SAB) à 30% (w/v), - 2 à 10 Ul de catalase. 1 Ul est définie comme étant la quantité d'enzyme capable de produire une micromole de produit par minute. Ce mélange est déposé sur la face mate du film préactivé découpé. Selon une méthode connue, on dépose sur le mélange placé sur le film une solution de glutaraldéhyde 0,1 à 6% (w/v) que l'on laisse agir de 2 à 1 5 minutes. Cette solution favorise la formation de liaisons covalentes assurant ainsi l'immobilisation de l'enzyme sur le film. L'excès de solution de glutaraldéhyde est neutralisé par un tampon phosphate 0,1 M de pH 7,0 contenant de 1 à 100 mM de lysine. Le film porteur de l'enzyme est laissé pendant 5 minutes dans 1 ml de cette solution puis est rincé trois fois. II est ensuite mis en sandwich entre deux membranes de dialyse (2) sur un cap (3) et posé sur un film de polypropylène (4). Le film enzymatique selon l'invention est ainsi réalisé. Il est ensuite soit vissé sur une électrode à oxygène pour effectuer des dosages, le film de polypropylène étant placé côté transducteur, soit plongé dans une solution de conservation. II présente les caractéristiques suivantes - lo (intensité de courant fournie par l'électrode d'oxygène), dépendante de la température et de la teneur en oxygène de la solution de régénération, est comprise entre 8 et 14 SuA, - la proportionnalité entre la différence d'intensité de courant (lo Im) et la concentration de méthanol, si elle est comprise entre 1 et 10 ppm est représentée sur la figure 3. Afin d'assurer sa conservation pendant plusieurs mois à une température de 4"C et son transport, ce film est placé dans une solution dite solution de conservation . Pour effectuer des dosages, par exemple pour déterminer la quantité de méthanol présent dans un échantillon tel qu'une eau résiduaire, le film enzymatique est vissé sur une électrode à oxygène, une électrode de Clark par exemple. Le biocapteur est ensuite placé dans un automate assurant les fonctions de celui décrit précédemment. Le principe de dosage étant basé sur l'utilisation d'un enzyme, il est recommandé de travailler dans un milieu tamponné, avec une force ionique constante et une température également constante et comprise entre 10 et 45"C. Dans le cas de l'alcool oxydase, le milieu doit être tamponné à pH neutre avec tout tampon comme par exemple un tampon à base de Tris (5 mM) contenant en outre un chélateur, tel que l'EDTA (1.25mM) et un antibiotique à large spectre du type chloramphénicol ou amoxicilline. Le pH de cette solution est ajusté à 7,0 à l'aide d'acide sulfurique par exemple. Ces réactifs sont contenus dans la solution de conditionnement renouvelable tous les mois au moment du changement du film enzymatique. Un cycle de mesure se décompose en deux phases : la régénération du biocapteur et la mesure du paramètre. La régénération du biocapteur se déroulant dans la cellule de préparation de l'automate comprend les étapes suivantes - le rinçage du compartiment de préparation, - I'admission de la solution de régénération, - le chauffage et la régulation de la température pour travailler dans des conditions opératoires optimales, - I'ajout d'un nouveau volume de solution de conditionnement, - la stabilisation de la solution de conditionnement en la laissant reposer. La mesure et le calcul de la concetration s'effectuent dans le compartiment de mesure. La mesure du paramètre à doser suit le même déroulement - préparation de l'échantillon dans le compartiment de préparation par rinçage du compartiment, admission de l'échantillon, chauffage à température souhaitée et régulation de cette température, conditionnement par ajout d'un volume de solution de régénération permettant de tamponner l'échantillon, stabilisation de l'échantillon, - mesure du paramètre dans la cellule de mesure par ouverture de l'électrovanne de mesure, mesure et calcul de la concentration du paramètre. En outre, pour chacun de ces cycles, une prise d'essai de la solution de régénération est aspirée par une pompe de sorte que la concentration des réactifs dans cette solution soit maintenue à sa valeur initiale. A chaque concentration d'oxygène correspond un courant électrique délivré par l'électrode à oxygène. Après la régénération, I'électrode à oxygène affiche une intensité de courant lo. Après la mesure, elle affiche une intensité de courant Im. La différence entre lo et Im est proportionnelle à la concentration d'alcool si celle-ci est comprise dans la plage de lecture du biocapteur. Si elle est supérieure à celle pouvant être détectée par le biocapteur, on dilue l'échantillon à doser dans des proportions connues pour introduire dans l'automate une solution dont la concentration en alcool est mesurable par le biocapteur. Un étalonnage régulier permet de faire la correspondance entre la concentration en alcool et le signal mesuré par l'électrode grâce à une solution de référence. Ce mode opératoire décrit dans cet exemple peut être utilisé pour doser des alcools tels que le méthanol, l'éthanol etc.. Les enzymes sélectionnés dépendant des paramètres à doser, on choisit l'alcool oxydase de Pichia pastoris ou de Candida boidini pour le dosage du méthanol ou de méthanol. Dans les conditions exposées ci-dessus, le film enzymatique est stable pendant au moins un mois à raison d'un dosage toutes les 20 minutes. Les variations d'activité du film enzymatique représentées sur la figure 2 s'expliquent par la balance d'activité des deux enzymes immobilisés c'est à dire l'alcool oxydase et la catalase. Toutefois, si l'on étalonne le biocapteur une fois toutes les 24 heures, on obtient des réponses dont le pourcentage d'erreurs ne dépasse pas 5%. Comme le montre la figure 5 lorsque l'on utilise la solution détalonnage, dont la concentration en méthanol est de 8,5 ppm, et que l'on effectue des dosages de cette solution en continu, à raison d'un dosage toutes les 20 minutes pendant 3 jours avec une seule calibration, la valeur moyenne des résultats obtenus correspond bien à la concentration de départ avec un écart type de seulement 0,2 ppm. Exemple 2 On peut envisager le dosage d'autres paramètres en adaptant le biocapteur selon l'invention par des procédés connus de la technique. Ainsi, on peut doser l'urée avec un biocapteur selon l'invention. Ce dosage peut s'effectuer selon trois méthodes différentes. La première méthode utilise un biocapteur constitué par l'uréase et une électrode à ammoniac. La réaction utilisée est l'hydrolyse de l'urée catalysée par l'uréase immobilisée Uréase Urée+ Wo C10 > CQ + 2NH, La seconde méthode utilise un capteur à oxygène et un film enzymatique immobilisant et emprisonnant trois enzymes, I'uréase, la glutamine synthétase et la pyruvate oxydase, catalysant des réactions couplées Urease Urée+ QO > + 2tH3 Glutamine synthase ATP +NH3 + GLut > P i+GLutamine+ ADP Pyruv2te oxydase Pi +Pyruvate+02 acte Acétyl-Pi +C02+ Q La troisième méthode utilise un capteur à dioxyde de carbone et un film enzymatique retenant trois enzymes l'uréase, la phosphoénol pyruvate carboxylase et la pyruvate oxydase. Les réactions utilisées sont les suivantes Uréase Urée+ QO ql + 2Nt L 3 , Phosphoénol pyruvate CO2 +PEP ir > Oxaloacétate vP i carboxylase I Pyruvate oxydase Pi +Pyruvate+Q Acétyl-Pi +CQ+ + Les conditions et la réalisation des mesures sont similaires à celles décrites ci-dessus. Exemple 3 Un biocapteur selon l'invention, adapté par des techniques connues, peut également être utilisé pour doser certains glucides tels que le saccharose. Dans ce cas, le capteur utilisé est une électrode à oxygène et le film enzymatique immobilise trois enzymes I'invertase, la mutarotase, et la glucose oxydase. Les réactions utilisées sont les suivantes Invertase Saccharose + L-O * D glucose + Fructose Mutarotase aGlucose REVENDICATIONS 1. Biocapteur pour le dosage de paramètres chimiques comprenant un film enzymatique et un transducteur adapté à la détection quantitative de l'un des éléments mis en jeu dans la réaction catalysée par l'enzyme du film caractérisé en ce que ce film est constitué - d'un support, réalisé de préférence dans une membrane synthétique présentant des groupements réactifs, sur lequel l'enzyme est immobilisé, généralement par liaisons covalentes, - d'un enzyme sélectionné en fonction du paramètre à mesurer, - de deux membranes de dialyse entre lesquelles le support porteur de l'enzyme est mis en sandwich. 2. Biocapteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que son film enzymatique immobilise au moins deux enzymes différents. 3. Biocapteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme immobilisé est une alcool oxydase et le transducteur est une électrode à oxygène. 4. Biocapteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme immobilisé est l'uréase et le transducteur une électrode à ammoniac. 5. Biocapteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que les enzymes immobilisés sont l'uréase, la glutamine synthétase et la pyruvate oxydase et le transducteur est une électrode à oxygène. 6. Biocapteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que les enzymes immobilisés sont l'uréase, la phosphoénol pyruvate carboxylase et la pyruvate oxydase et le transducteur est une électrode à dioxyde de carbone. 7. Biocapteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que les enzymes immobilisés sont l'invertase, la mutarotase et la glucose oxydase et le transducteur est une électrode à oxygène. 8. Procédé de fabrication d'un biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par les étapes suivantes - réalisation d'un mélange comprenant un aliquote d'au moins un enzyme sélectionné en fonction du paramètre à doser, un aliquote de sérum albumine bovine ou de gélatine, un aliquote de catalase, - dépôt du mélange sur un support présentant des groupements réactifs, - consolidation de l'immobilisation de l'enzyme ou des enzymes sur ce support par action d'un agent pontant, tel que le glutaraldéhyde, - neutralisation de l'excès d'agent pontant par un tampon, - mise en sandwich du support porteur de l'enzyme ou des enzymes entre deux membranes de dialyse. 9. Procédé de fabrication d'un biocapteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que le mélange comprend - 1 à 10 Ul de solution d'alcool oxydase - 5 à 30 jil de solution de sérum albumine bovine à 30% (w/v) - 2 à 10 Ul de catalase. 10. Méthode d'analyse mettant en oeuvre un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que chacun de ses cycles se décompose en - une phase de régénération du biocapteur et - une phase de mesure proprement dite, chacune de ces phases comprenant une étape de préparation comportant le rinçage de la cellule, l'admission de la solution à doser, le chauffage et la régulation de la température, l'admissioon de la solution de régénération, la stabilisation de l'échantillon et une étape de mesure comportant la mesure proprement dite de la concentration, la transmission du signal correspondant et le traitement des résultats.