Brevet FR2752425A1 — publié le 19980220

La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis. L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de souches de mycobactéries apparte nant au complexe M. tuberculosis ainsi qu'une méthode pour un diagnostic différentiel de souches du complexe M. tuberculosis, notamment pour différencier la présence du BCG de celle des autres membres du complexe dans un échantillon. Approximativement, 1,7 milliard de personnes soit 1/3 de la population mondiale sont infectées par M. tuberculosis (Sudre et al., 1992). En 1990, le nombre de cas de tuberculose estimé était de 8 millions, dont 2,9 millions de morts (Sudre et al., 1992). Ces dernières années, le nombre de cas de tuberculose aux Etats-unis et en Europe a augmenté de 3 à 6 % par an, principalement dans des populations à haut risque telles que les patients souffrant de sida, les alcooliques chroniques, les sans-abris et les toxicomanes (Barnes et al., 1991). Compte tenu des difficultés à combattre les infections par mycobactéries, il existe un besoin urgent de pouvoir disposer d'une méthode rapide spécifique et sensible, permettant de diagnostiquer ces infections. Aussi, la détection précoce de M. tuberculosis dans des échantillons cliniques prend-elle une importance croisusante dans le contrôle de la tuberculose tant pour le traitement clinique de patients infectés que pour l'identification d'individus à risque exposés. La détection par PCR (Polymerase Chain Reaction) d'ADN spécifique d'espèces de mycobactéries est probablement l'une des nouvelles approches les plus prometteuses pour un diagnostic rapide, spécifique et sensible (Saiki et al., 1985 ; Brisson-Noël et al., 1989; Cousins et al., 1992 ; Eisenach et al., 1990 ; Forbes et al., 1993 ; Fries et al., 1991 ; Hermans et al., 1990; Jonas et al., 1993 ; Kolk et al., 1992 ; Pierre et al., 1991 ; Saboor et al., 1992 ; Shankar et al.,1991 Sjôbring et al., 1990). Les différentes études réalisées jusqu'à ce jour ont toutefois abouti à des résultats différents en ce qui concerne la spécificité et la sensibilité. Parmi les raisons de cette diversité, on peut notamment citer des différences méthodologiques concernant la préparation des échantillons, le protocole suivi pour l'amplification ou les méthodes de détection des produits de PCR. Plusieurs de ces études sont relatives à la détection par PCR du complexe M. tuberculosis à partir de 1'ADN cible IS6110 (Clarridge et al., 1993 ; Eisenach et al., 1990) ; Forbes et al., 1993) ; Noordhoeck et al., 1994), le gène codant pour l'antigène 65 kDa (Brisson Noël et al., 1991 ; Telenti et al., 1993), le gène codant pour l'antigène 38 kDa (Folgueira et al., 1993 ; Sjobring et al., 1990) ou 1'ARN ribosomique 16S (Kox et al., 1995). Toutefois, tous ces tests de diagnostic identi fient le complexe M. tuberculosis dans son ensemble. Le complexe M. tuberculosis comprend M. tuberculosis, M. bovis, M. microti et M. africanum. Ces quatre espèces ont de fortes homologies dans leur ADN (85 à 100 %) (Imeada, 1985) et possèdent plusieurs gènes totalement identiques. Cette homologie a limité l'utili ~sation de séquences d'ADN pour différencier les souches. I1 serait pourtant d'un intérêt particulier de pouvoir différencier les souches de M. tuberculosis de celles du bacille de Calmette-Guérin (BCG) M. bois, ces dernières étant souvent utilisées comme vaccins vivants pour une immunoprotection contre la tuberculose. De façon éviden te, il y a donc un intérêt à distinguer entre des mycobactéries susceptibles d'être pathogènes et des souches BCG vaccinantes. Cette distinction est particulièrement importante dans le cas d'individus immunodéprimés, tels que les sujets infectés par le VIH. Les analyses du polymorphisme en longueur des fragments de restriction (RFLP ou Restriction Fragment Length Polymorphism) basées sur l'insertion de l'élément IS6110 ont été utilisées pour différencier différentes souches de M tuberculosis. On a montré que cet élément d'insertion permettait d'obtenir des profils de RLFP spécifiques de souches du fait d'une variabilité dans sa localisation et dans le nombre de copies existant dans les génomes de différentes souches. IS6110 a été mis en évidence chez M tuberculosis et chez M. bovis mais pas chez les autres mycobactéries testées (Cave et al., 1991). En général, plusieurs copies de cet élément d'insertion peuvent être mises en évidence chez M. tuberculosis, alors qu'une seule copie est trouvée chez M. bovis BCG (Cave et al., 1991). Toutefois, certaines souches de M. tuberculosis sont dépourvues de IS6110 (van Soolingen et al., 1994) et des souches de M. bovis possédant un nombre important de copies sont communes chez certaines populations (van Soolingen et al., 1994). S'ajoute à ces limitations le fait que l'identification des souches de M. tuberculosis à partir de IS6110 nécessite des analyses par Southern Blot et ne peut pas facilement être réalisée par des méthodes de PCR en routine. Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence une nouvelle séquence d'ADN cible pour amplification enzymatique. Cette séquence fait partie d'un opéron codant pour un système régulateur à deux composants spécifique de M. leprae et des bactéries membres du complexe M. tuberculosis. Les systèmes à deux composants sont des systèmes régulateurs appartenant à une grande famille, impliquant deux protéines qui coopèrent en traduisant des signaux externes par des modifications au niveau de l'expression génétique (Parkinson et Kofoid, 1992. Selon un modèle général proposé, un composant localisé dans la membrane agirait comme un capteur des changements environnementaux et transmettrait l'information à un composant régulateur de la réponse dans le cytoplasme, qui à son tour modulerait la transcription des gènes cibles. La communication entre les deux composants est généralement réalisée par une cascade de phosphorylations. Les auteurs de la présente invention ont à présent cloné et caractérisé un système à deux composants mycobactériens. Ce système apparaît être spécifique des membres du complexe M. tuberculosis et de M. leprae. De façon inattendue par rapport aux autres systèmes à deux composants, les gènes de ce système mycobactérien sont séparés par des séquences d'ADN (séquences intercistroni ques ou séquences répétées) uniquement présentes parmi les souches de mycobactéries du complexe M. tuberculosis et chez M. leprae. Les auteurs de la présente invention ont par ailleurs montré que chez les souches du complexe M. tuberculosis, cette région intercistronique correspondait à un nombre de répétitions exactes ou tronquées d'une séquence de 77 paires de bases, SEQ ID N 1, qui pouvait varier selon les souches. La séquence tronquée ( SEQ ID N' 2) est composée de 53 paires de bases et contient une courte délétion interne en phase des nucléotides n 40 à 66, qui sont substitués par un codon GAG. Les auteurs de l'invention ont également montré que, de façon surprenante, la séquence tronquée (SEQ ID N 2) était caractéristique des membres du complexe M. tuberculosis différents du BCG. Chez M. leprae, la région intercistronique correspondante est constituée par un variant de 52 paires de bases déjà décrit par ailleurs et dont la séquence est indiquée ci-après 5' atg aca ccc gcg cag gcg atg atg cag agc gaa gtg acg aga ggg aat gtg a 3'. Compte tenu de leurs caractéristiques, ces séquences répétées offrent un intérêt particulier pour identifier et différencier entre elles des souches du complexe M. tuberculosis par des techniques d'amplification enzymatique, telles que la PCR ou autres méthodes similaires. Plus particulièrement, elles permettent d'établir un diagnostic différentiel entre la présence du BCG et celle d'autres membres du complexe dans un échantillon biologique. Ce diagnostic différen tiel, dont le principe est basé sur la détection spéci fique de la séquence SEQ ID N 2, constitue un aspect préféré de l'invention. I1 est avantageusement mis en oeuvre pour distinguer une infection par le BCG d'une infection par d'autres membres virulents du complexe chez des individus immunodéprimés, tels que notamment les sujets infectés par le VIH. L'invention a donc pour objet un fragment d'acides nucléiques spécifique de mycobactéries apparte nant au complexe M. tuberculosis, comprenant un enchai nement de nucléotides choisi parmi la séquence SEQ ID No 1, la séquence SEQ ID No 2, leurs séquences complémentai res ou les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider à l'une des séquences précédentes dans des ~conditions de stringence adéquates. Elle vise également l'utilisation desdites séquences pour la fabrication de sondes nucléotidiques pour la détection in vitro de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis et d'amorces oligonucléo tidiques pour l'amplification enzymatique de séquences spécifiques des souches membres du complexe M. tuberculo sis. L'invention a également pour objet une méthode permettant de différencier les souches du complexe M. tuberculosis entre elles, particulièrement de différencier le BCG des mycobactéries pathogènes de ce complexe. Elle fournit également des moyens pour différencier des sous-groupes parmi les souches consti tuant le complexe M. tuberculosis. Par ailleurs, elle peut permettre de diffé rencier M. leprae des espèces et des souches appartenant au complexe M. tuberculosis dans un échantillon biologi que. Dans le cadre de la présente invention, on considère que les conditions de "stringence adéquates" dans lesquelles deux séquences nucléotidiques peuvent s'hybrider sont les conditions définies par le protocole recommandé par Boehringer Mannheim, à savoir : des températures de préhybridation, d'hybridation et de lavage de 68"C et un tampon de préhybridation et d'hybridation à base de 5 x SSC (Sambrook et al., 1989). L'invention a pour objet un fragment d'acides nucléiques spécifique de mycobactéries du complexe M. tuberculosis localisé dans la région intercistronique du système senX3-regX3. Comme il sera expliqué dans les exemples, la séquence SEQ D Nol correspond à une entité de 77 paires de bases répétée en un nombre différent de copies selon les souches de mycobactéries étudiées. Cette séquence répétée possède un cadre de lecture ouvert (ORF ou Open Reading Frame) pouvant coder pour un peptide de 25 acides aminés. L'invention vise ainsi un fragment d'acides nucléiques spécifique du complexe M. tuberculosis, comprenant un enchainement de nucléotides choisi parmi la séquence SEQ ID No 1, sa séquence complémentaire ou les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider à l'une des séquences précédentes dans des conditions de stringence adéquates. Selon un autre aspect, l'invention vise un fragment d'acides nucléiques spécifique de membres du complexe M. tuberculosis différents du BCG, notamment les espèces virulentes M. tuberculosis, M. africanum ou M. bovis, comprenant un enchainement de nucléotides choisi parmi la séquence SEQ ID No 2, sa séquence complémentaire ou les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider à l'une des séquences précédentes dans des conditions de stringence adéquates. Comme cela est en effet illustré par les exemples, les souches de BCG sont différentiables de toutes les autres souches du complexe M. tuberculosis à cause de l'absence de la séquence SEQ ID n 2 dans la région intergénique senX3-regX3 chez le BCG (voir tableau 3, groupes 4, 6, 8). Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. I1 peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN. Elles peuvent par exemple, être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant des modifications chimiques ou enzymatiques de séquences obtenues par criblage de banques de séquences, au moyen de sondes élaborées sur la base des séquences SEQ ID No 1 ou 2. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculai re, connues de l'homme de l'art. Les séquences nucléotidiques de l'invention permettent la réalisation de sondes ou d'amorces nucléo tidiques, capables de s'hybrider spécifiquement avec celles-ci, leurs séquences d'ARN correspondantes ou les gènes correspondants. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de séquences d'acides nucléi ques spécifiques de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis. Préférentiellement, les sondes de l'invention comportent au moins 24 nucléotides consécutifs bien que des sondes plus courtes puissent également convenir. Au maximum celles-ci comportent la région intergénique senX3-regX3 complète de M. tuberculosis (IPL), à savoir deux séquences SEQ ID N 1 successives suivies d'une séquence SEQ ID N 2. Ce fragment d'ADN comporte 218 paires de bases. Parmi les sondes nucléotidiques préférées spécifiques des membres du complexe M. tuberculosis, figurent notamment la séquence SEQ ID N 1 dans son intégralité ou sa séquence complémentaire. Selon un autre aspect, l'invention vise des sondes nucléotidiques pour la détection et la mise en évidence de séquences d'acides nucléiques spécifiques de membres du complexe M. tuberculosis différents du BCG, notamment les espèces virulentes M. tuberculosis, M. africanum ou M. bovis, ainsi que pour le diagnostic différentiel de la présence du BCG dans un échantillon biologique contenant des mycobactéries du complexe M. tuberculosis. De telles sondes nucléotidiques sont obtenues à partir d'une région de la séquence SEQ ID No 2 encaodorant le codon GAG à la position 40-42 ou de son brin complémentaire. Préférentiellement, cette région a une longueur de 21 paires de bases, et comporte 9 nucléotides en amont et en aval du codon GAG spécifique de la séquence SEQ ID N 2. Avantageusement, ces sondes comprennent la séquence SEQ ID No 2 dans son intégralité ou sa séquence complémentaire. Les sondes de l'invention hydrident selon les conditions d'hybridation appropriées, correspondant aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier. Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier (marquage fluorescent, radioactif, chimiolumi nescent, enzymatique, etc). Selon un mode de réalisation préféré, les sondes sont marquées à la digoxigénine. La digoxigénine (DIG) est un haptène stéroide couplé au dUTP pour marquer 1'ADN utilisé comme sonde. Cette technologie est commer cialisée par Boehringer Mannheim. Après l'hydridation avec la sonde et lavage, la détection se réalise suite à une émission d'un signal chemoluminescent grâce au substrat disodium 3-(4-methoxyspiro(l,2-dioxethane-3,2'- (5'-chloro)tricyclo decan)-4-yl)phenylphosphate (CSPD). Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisa tion d'amorces oligonucléotidiques pour des réactions de séquençage ou d'amplification enzymatique. Les techniques d'amplification enzymatique sont principalement illustrées par la PCR. D'autres mé thodes similaires peuvent toutefois être utilisées comme par exemple la LCR (Ligase Chain Reaction), la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), la Qssréplicase, la SDA (Strent Displacement Amplification) et toute autre variante comprise dans les connaissances technologiques de l'homme du métier. Ces techniques d'amplification d'acides nucléiques utilisent des molécu les d'amorces oligonucléotidiques pour initier la réaction d'élongation de la séquence cible. La longueur exacte de ces amorces pourra varier selon les cas. Par exemple, en fonction de la complexité de la séquence de la matrice, une amorce polynucléotidique contient typiquement de 15 à 25 nucléotides ou davantage. Dans certains cas, toutefois, elle peut en contenir moins. Préférentiellement, les amorces nucléotidiques de l'invention comprennent au moins 19 nucléotides. Elles sont constituées par des amorces choisies sur des séquences adjacentes à la région intergénique senX3- regX3, dans les régions 3' de senX3 et 5' de regX3. Selon une variante préférée, on utilise le couple d'amorces appelées C5 et C3, à savoir 5'GCGCGA GAGCCCGAACTGC3' et 5 'GCGCAGCAGAAACGTCAGC3 'correspondant respectivement à l'extrémité 3' du gène senX3 et l'extrémité 5' du gène regX3. Ces amorces s'hydrident respectivement 56 paires de bases en amont de la région intercistonique et 62 paires de bases en aval de celleci. Les séquences nucléotidiques et les sondes en résultant peuvent être clonées dans des vecteurs de clonage et/ou d'expression selon des techniques de biologie moléculaire classiques, impliquant notamment l'utilisation d'enzymes de restriction et de sites de coupure spécifiques. Un vecteur de clonage préféré dans la présente invention est représenté par le plasmide pRegXMtl déposé à la CNCM sous le numéro I-1766 dont la construction est décrite plus en détail dans les exemples ci-après. Un autre vecteur de clonage selon l'invention est représenté par le plasmide pRegX3Bcl déposé à la CNCM sous le numéro I-1765. Ces plasmides ont été chacun introduits dans la bactérie E. coli XLl-blue. Les vecteurs I-1765 et I-1766 contiennent chacun les gènes complets senX3-regX3 avec les régions intercistroniques de BCG et de M. tuberculosis respecti vement. Les séquences nucléotidiques selon l'inven tion peuvent par ailleurs être exprimées dans des systèmes apropriés, pour la production et l'étude des actvités biologiques des peptides correspondants. Dans ce cas, celles-ci seront placées sous le contrôle de signaux permettant leur expression dans un hôte cellulai re. Un système efficace de production d'une pro téine ou d'un peptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes, CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription. I1 doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation. Les méthodes de diagnostic ou de détection in vitro dans lesquelles les sondes nucléotidiques obtenues à partir des séquences de l'invention sont mises en oeuvre, font également partie de la présente invention. Plus particulièrement, l'invention vise une méthode de détection de souches de mycobactéries apparte nant au complexe M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes: (i) mise en contact de l'échantillon biologi que avec un couple d'amorces dans des conditions permet tant une hybridation desdites amorces aux acides nucléi ques spécifiques de souches de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis (ii) amplification desdits acides nucléiques; (iii) mise en contact d'une sonde nucléotidi que selon l'invention avec ledit échantillon biologique dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre ladite sonde et les séquences d'acides nucléiques amplifiés (iv) détection des complexes d'hybridation formés. Selon une première variante, la méthode selon l'invention permet de détecter la présence d'un membre quelconque du complexe M. tuberculosis dans un échantil lon biologique. Dans ce cas, les complexes de l'étape (iii) définie ci-dessus sont formés avec une sonde nucléotidique spécifique de la séquence SEQ ID N 1 ou de son brin complémentaire. Selon une seconde variante avantageuse, la méthode de l'invention permet de spécifiquement détecter la présence des membres du complexe M. tuberculosis autres que le BCG. Selon cette variante, les complexes de l'étape (iii) qui sont détectés sont formés avec une sonde nucléotidique spécifique de la séquence SEQ ID N 2 ou de son brin complémentaire, consistant préférentiel lement en une séquence courte composée de deux fois 9 paires de bases encadrant le codon GAG aux positions 40 à 42 spécifique de la séquence SEQ ID N 2. Selon une troisième variante particulièrement avantageuse, la méthode de l'invention permet un diagnos tic différentiel du BCG et des autres membres du complexe. Dans ce cas, la méthode consiste dans un premier temps en une mise en évidence d'acides nucléiques spécifiques de tous les membres du complexe M. tuberculo sis par détection selon l'étape (iv) des complexes d'hybridation formés avec une première sonde nucléoti dique spécifique de la séquence SEQ ID N 1 ou de son brin complémentaire, puis à rechercher parmi les acides nucléiques amplifiés capables de former des complexes avec ladite première sonde, ceux qui peuvent également former des complexes avec une seconde sonde nucléotidique spécifique de SEQ ID N 2 ou de son brin complémentaire. Les séquences d'acides nucléiques amplifiés hydridant uniquement avec la première sonde correspondent à des séquences d'acides nucléiques spécifiques du BCG, alors que les séquences hydridant avec chacune des deux sondes correspondent à des séquences des autres membres du complexe M. tuberculosis. Cette méthode de diagnostic différentiel offre un intérêt évident par rapport aux méthodes de détection classiques, car elle permet de différencier une infection par du BCG (issue éventuellement d'une vaccina tion), de celle par une mycobactérie virulente du complexe M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis ou -M. africanum, et éventuellement M. microti). Cette distinction est particulièrement importante chez des individus immunodéprimés, notamment des sujets infectés par le VIH. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention fournit une méthode d'identification de groupes de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis, caractérisée en ce que - on met en contact 1'ADN desdites souches préalablement extrait avec un couple d'amorces telles que définies précédemment, dans des conditions permettant une hybridation spécifique desdites amorces à leurs séquences correspondantes sur 1'ADN desdites souches et l'obtention de produits d'amplification, et - on mesure la longueur des produits d'ampli fication obtenus, par exemple par électrophorèse en gel d'agarose. Avantageusement, on utilise dans cette méthode les amorces 5'GCGCGAGAGCCCGAACTGC3' et 5'GCGCAG CAGAAACGTCAGC3'. L'invention concerne également une trousse pour l'identification in vitro de souches de mycobacté ries appartenant au complexe M. tuberculosis dans un prélèvement biologique comprenant - un couple d'amorces selon l'invention, comme définies précédemment - les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification des séquences d'acides nucléiques spécifiques de souches appartenant au complexe M. tuberculosis à l'aide desdites amorces, - éventuellement des moyens pour révéler les fragments amplifiés, préférentiellement une sonde nucléo tidique de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont illustrés par les exemples dans la suite ,de la description ainsi que par les figures dont les légendes sont indiquées ci-après. Figure 1 : Analyse par "Southern blot" de 1'ADN de BCG (IPP). A). Le fragment de 259 paires de bases comprenant une partie du gène regX3 a été utilisé comme sonde pour détecter le gène dans différents fragments de restriction dans 1'ADN chromosomique du BCG(IPP) . Les enzymes de restrictions utilisés sont indiqués en haut de la figure. B). Carte de restriction partielle du locus des gènes senX3 et regX3 du BCG (IPP). Les sites de restrictions sont indiqués par rapport aux gènes senX3 et regX3, ainsi que la sonde utilisée. Figure 2 : Séquence nucléotidique des gènes senX3 et regX3 du BCG (IPP) et séquences protéiques dérivés. Les flèches indiquent des séquences palindromi ques. La séquence Shin-Dalgarno putative est soulignée en pointillés (SD). La séquence transmembranaire prédite de SenX3 est doublement soulignée. Les régions de SenX3 conservées chez d'autres senseurs sont soulignées et annotées : H, région contenant l'histidine modifiée; N, région riche en asparagine; F, région riche en phénylala nine; G1 et G2, régions riches en glycine. Les petites flèches verticales indiquent les résidus prédits pour être phosphorylés. La séquence annotée PgmY indique la fin du gène codant la phosphoglycerate mutase. Figure 3 : Profil d'hydrophobicité de SenX3. Les valeurs positives indiquent des régions hydrophobes et les valeurs négatives indiquent les régions hydrophi les. Les flèches indiquent les codons d'initiation possibles et les deux lignes horizontales indiquent les régions transmembranaires prédites. Les chiffres au haut de la figure indiquent les numéros des acides aminés. Figure 4 : Comparaison de la région intercistronque entre le BCG (IPP) et M. tuberculosis (IPL). Les gènes senX3 et regX3 sont indiqués par les flèches. Les séquences nucléotidiques sont indiquées ainsi que les séquences protéiques déduites. Figure 5 : Analyse par Southern blot d'ADN de M. tuberculosis et de BCG. L'ADN chromosomique de M. tuberculosis (IPL) (à droite) et de BCG (IPP) (à gauche) a été digéré par PstI, soumis à électrophorèse en agarose et analyse par hybridation avec la sonde intergénique senX3-regX3 de M. tuberculosis (IPL). Figure 6 : Analyse par électrophorèse en agarose (2,5%) des produits obtenus par PCR réalisée sur différentes souches mycobactériennes. Pistes 1 à 3 groupe 1, respectivement M. microti, M. tuberculosis V808, M. tuberculosis V761; pistes 4 et 5, groupe 2, respectivement M. tuberculosis V729, M. bovis 60; pistes 6 à 8, groupe 3, respectivement M. bovis 63, M. bovis 78 et M. bovis AN5; pistes 9 et 10, groupe 4, respective ment M. tuberculosis H37Ra (IPL) et M. tuberculosis H37Rv (IPP); pistes 11 et 12, groupe 5, respectivement M. tuberculosis (IPL), M. bovis 76; pistes 13 et 14, groupe 6, respectivement M. bovis (BCGite 29) et M. bovis BCG (IPP); piste 15, groupe 7, M. tuberculosis N 19. Figure 7 : Analyse par Southern blot des fragments obtenus dans la figure 6. La sonde utilisée est la région intercistronique senX3-regX3 de M. tuberculo sis(IPL). EXEMPLES EXEMPLE 1 : Carte génomique et clonage des gènes senX3-regX3 de M. bovis BCG (IPP), codant pour le système à deux composants mycobactérien. Wren et al. (1992) ont amplifié un fragment de 259 paires de base provenant du gène de M. tuberculo sis (IPL) qu'ils ont appelé regX3. Les auteurs de la présente invention ont amplifié la séquence correspondante à partir de M. bovis BCG (souche vaccinale 1173P2, obtenue à la collection WHQ 5' -AGCGCCCCAGCTCCAGCCGACC-3'. L'amplification a été réalisée en utilisant ces amorces et une polymérase Deep Vent (New England Biolabs). Le produit d'amplification de 259 paires de base résultant a ensuite été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose puis sous-cloné dans le site SmaI du vecteur pBluescript KS+ (Stratagene) selon des protocoles standards (Sambrook et al., 1989). Cet insert a ensuite été retiré du plasmide recombinant par digestion avec BamHI et EcoRI puis marqué avec du dCTP[a 32p] par "random priming" (marquage au hasard) en utili sant le kit de "random priming" commercialisé par Boehringer selon les conditions recommandées par le fabricant. L'ADN génomique de M. bovis BCG (IPP), mis en culture dans du milieu de Sauton (Sauton, 1912) à 37oC dans des flacons pour culture stationnaire de tissus, a été extrait comme décrit auparavant (Kremer et al., 1995a) et digéré par différentes enzymes de restriction. Cet ADN a ensuite été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose et à une analyse par Southern Blot selon les méthodes standards (Sambrook et al., 1989). Le sondage de l'empreinte avec de 1'ADN marqué au [32P] a montré qu'une digestion par KpnI avec soit BamHI, EcoRI ou PstI, produisait des paires de bandes hybridantes, avec une bande marquée de façon plus intense que l'autre dans chacune des paires (fig. Ia). Ces bandes ont été attri buées aux séquences 5' et 3' respectivement, du site KpnI asymétrique unique de la sonde. Ceci a permis de locali ser les sites 5' et 3' BamHI, EcoRI et PstI du site KpnI (fig. Ib). Les digestions avec uniquement PstI ont donné une seule bande d'hybridation. Comme cela pouvait être prévu, la digestion avec KnpI a donné deux bandes et la digestion avec BamHI et EcoRI a conduit à l'obtention d'une seule bande d'environ 3,5 kb. L'ADN génomique du BCG a été digéré avec BamHI et EcoRI, et des fragments d'ADN de 3 à 4 kb ont été isolés après une électrophorèse sur gel d'agarose. Ces fragments ont été insérés dans pBluescript SK (Stratagene) restreint par BamHI et EcoRI. 900 clones recombinants ont été criblés avec la sonde marquée au [32p] par la technique standard dite de "colony blot hybridization" (Sambrook et al., 1989). Trois d'entre eux étaient positifs et se sont avérés contenir le même insert d'ADN de 3,2 kb BamHI/EcoRI par analyse de restriction. Un clone hybridant a été isolé pour des études ultérieures et a été dénommé pRegX3Bcl (I-1765). EXEMPLE 2. : Séquence des gènes de M. bovis BCG (IPP) codant pour le système à deux composants Les fragments SalI de 1,0, 1,5 et 0,7 kb ont été isolés de 1'insert de 3,2 kb de pRegX3Bcl (I-1765), et sous- clonés dans pBluescript SK-. La séquence de l'insert de 3,2 kb, ainsi que celle des sous-clones SalI a été déterminée sur les deux brins par la méthode de "primer walking". La séquence nucléotidique de 3208 pb de M. bovis BCG (IPP) (Fig. 2) a démontré la fréquence de C + G caractéristique des mycobactéries (66,6 %). Deux principaux cadres de lecture ouverts (ORF, Open Reading Frame) désignés par regX3 et senX3, ont été identifiés (Fig. Ib et 2). Le gène regX3 démarre par un triplet ATG à la position 1679 et se termine par un triplet TAG à la position 2360. Il contient la séquence de la sonde marquée au 32P et code pour une protéine dont la séquence en acides aminés déduite est de 227 résidus pour une masse moléculaire calculée de 24 881 Da. La limite en amont de l'oRF senX3 n'est pas certaine parce que cinq codons d'initiation potentiels en phase (ATG ou GTG) ont été trouvés sur une courte distance (de 296 à 446) (Fig. 2 et 3). Toutefois, seul le GTG à la position 296 est précédé à 9 nucléotides en amont, par une séquence homologue à la séquence de Shine-Dalgarno de Escherichia coli (4 des 6 résidus sont identiques à AGGAGG). Donc, ce codon GTG pourrait être la limite en 5' de 1'ORF senX3 qui se termine avec le codon stop TGA à la position 1526. Cet ORF est donc présumé coder pour une protéine de 44769 Da composée de 410 résidus d'acides aminés. Le gène senX3 est précédé à 273 nucléotides en amont par la partie 3' d'un ORF codant un homologue des phosphoglycérate mutases. Une séquence susceptible de former une structure en épingle à cheveux est localisée entre les positions 178 et 194. Cette séquence pourrait fonctionner comme une séquence terminatrice de transcription de l'QRF en amont. Une recherche sur banque de donnée MycDB a révélé que les gènes senX3 et regX3 sont aussi présents chez M. leprae. Les produits qu'ils codent sont similai res respectivement à 82,7 % et 94,9 % aux protéines senX3 et RegX3 de M. bovis (IPP). L'ORF senX3 de M. leprae s'avère être initié par un codon GTG et est précédé par un ORF codant pour un homologue de phosphoglycérate mutase, similaire à celui qui a été trouvé chez M. bovis BCG (IPP). EXEMPLE 3 : Clonage et séquençage des gènes senX3-regX3 de M. tuberculosis (IPL). Les gènes senX3 et regX3 de M. tuberculosis (IPL) ont été clonés par PCR à partir d'ADN chromosomique de M. tuberculosis 22962067, un isolat clinique de la collection de mycobactéries de l'Institut Pasteur de Lille. L'ADN de M. tuberculosis (IPL) a été extrait par la méthode décrite précédemment pour l'extraction d'ADN chromosomique du BCG (Kremer et al., 1995a). Le fragment de 2,2 kb contenant les gènes senX3 et regX3 de M. tuberculosis (IPL) a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes, homologues aux séquences adjacen tes des gènes senX3 et RegX3 de M. bovis BCG (IPP): 5' TGGCGTAGTGTGTGACTTGTC-3' et 5 '-GACCAGACAGTCGCCAAGGTT-3'. Le fragment amplifié a été cloné dans le site SmaI de pBluescript SK- (version II) pour produire un plasmide dénommé pRegX3Mtl (I-1766). Le fragment total de 2,2 kb a ensuite été séquencé en utilisant la même stratégie que celle décrite dans l'exemple 2 pour les gènes senX3 et regX3 du BCG (IPP). La séquence d'ADN des ORF senX3 et regX3 de M. tuberculosis ( IPL) ainsi que la région 5' en amont de senX3 et la région 3' en aval de RegX3 étaient identiques à celles du BCG (IPP). Toutefois, la région intercistronique entre senX3 et RegX3 démontrait des dif férences intéressantes qui sont étudiées dans l'exemple ci-après. EXEMPLE 4 : Analyse de la région intercistro nique senX3-regX3. La région intercistronique entre senX3 et RegX3 contient une parfaite duplication de 77 paires de bases en tandem chez le BCG (IPP) (fig. 4). Chaque séquence répétée contient un court ORF qui a la capacité de coder pour un peptide de 25 acides aminés. Le codon d'initiation ATG que l'on peut déduire de la première répétition chevauche le codon stop TGA de senX3. Cette séquence répétée se termine par deux codons stop en phase, qui chevauchent le codon d'initiation ATG déduit de la répétition suivante. L'ORF de la seconde répétition se termine aussi par un double codon stop TGA, qui chevauche le codon start ATG de regX3. La région intercistronique de M. tuberculosis (IPL) est plus longue et contient une troisième séquence répétée qui toutefois n'est pas complète. Elle contient une courte délétion interne en phase des nucléotides 40 à 66 qui sont remplacés par GAG. L'ORF de cette troisième répétition se termine aussi par un double codon stop chevauchant le codon ATG de regX3. La séquence de la région intercistronique de M. leprae est plus courte que celle du BCG (IPP). Elle contient 52 paires de bases. L'existence de ces structures en répétition dans la région intercistronique senX3-regX3 a conduit les inventeurs à rechercher si elles étaient présentes dans d'autres régions de M. tuberculosis (IPL) ou dans le chromosome de M. bovis BCG (IPP) par analyse par Southern Blot. La région intercistronique senX3-regX3 de M. tuberculosis (IPL) a été obtenue par digestion enzyma tique de pRegX3Mt2 avec EcoRI et BamHI. Le fragment d'ADN de 491 paires de bases résultant a été ensuite digéré avec BsrI-AluI pour produire un fragment d'ADN de 218 paires de bases qui correspond au fragment intergénique senX3-regX3 de M. tuberculosis (IPL). Ce fragment d'ADN a ensuite été marqué au hasard avec de la digoxigénine dUTP (kit cat. NO 1093657) selon les recommandations du fabricant (Boehringer Mannheim). pRegX3Mt2 a été produit par une première amplification par PCR d'un fragment d'ADN chromosomique de 471 paires de bases de M. tubercu losis 22962067 (IPL) en utilisant les oligonucléotides suivants : 5'AAACACGTCGCGGCTAATCA 3' et 5'CCTCAAAGCCCCTCCTTGCGC 3' et le fragment amplifié résultant a ensuite été cloné dans le site SmaI de pBluescript KS-. L'ADN chromosomique de M. tuberculosis (IPL) a ensuite été totalement digéré avec PstI et soumis à une --électrophorèse sur gel d'agarose et analysé par Southern blot selon les procédures habituelles (Sambrook et al., 1989). La sonde marquée a ensuite été utilisée pour une hybridation comme indiqué ci-après. La sonde a d'abord été dénaturée par ébulli tion pendant 5 minutes, et la membrane a été incubée avec la sonde pendant la nuit à 68oC, après une préhybridation pendant deux heures à 68oC. Le tampon utilisé pour la préhybridation et l'hybridation était du 5xSSC (Sambrook et al., 1989), 0,1% de N-laurylsarcosine (p/v) ; 0,02 % de SDS (p/v) ; 1 % de réactif bloquant (Boehringer Mannheim). La membrane a ensuite été lavée deux fois pendant cinq minutes dans du 2xSSC (Sambrook et al., 1989) et 0,1 % de SDS à température ambiante et deux fois pendant 15 minutes dans du 0,1xSSC, 0,1 % SDS à 68oC. Les sondes hybridées ont ensuite été immunodétectées avec des fragments Fab antidigoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline et un substrat CSPD chimioluminescent (Boehrin ger Mannheim). Comme on peut le voir sur la figure 5, différentes copies de la région intercistronique senX3 regX3 sont présentes chez M. tuberculosis (IPL), ainsi que chez M. bovis BCG (IPP). EXEMPLE 5 : Amplification par PCR de la région intercistronique senX3-regX3 de différentes souches de mycobactéries. Etant donné que la région intercistronique séparant les gènes senX3 et regX3 présente des variations de longueur entre M. bovis BCG (IPP), M. tuberculosis (IPL) et M. leprae, les auteurs de la présente invention ont analysé la région correspondante chez d'autres souches de M. bovis (y compris des souches non BCG) et de M. tuberculosis. Ils ont également analysé d'autres ,espèces de mycobactéries : (i) les autres membres du complexe M. tuberculosis : M. africanum et M. microti et (ii) les mycobactéries autres que celles du complexe M. tuberculosis. Les souches analysées sont indiquées dans les tableaux 1 et 2. Leur ADN chromosomique a été préparé comme indiqué ci-après. Les mycobactéries ont été récupé rées par centrifugation (3000 tours/min ; 30 minutes), à partir de 100 ml de culture et mises en incubation pendant 1 heure à 37oC dans 10 ml de tampon phosphate (saccharose 0,4 M, EDTA 10 mM, Tris-HCl (pH 8,) 10 mM, 4 mg/ml de lysozyme). Les protoplastes obtenus ont été récupérés par centrifugation (3000 tours/min ; 20 minutes) puis lysés en les mettant à incuber pendant 1 heure à 60oC dans 6 ml de tampon L (NaCl 10 mM, SDS 6 %, Tris-HCl (pH 8) 10 mM, 500 Vg/ml de protéinase K). Après addition de 1,5 ml de NaCl 5 M, le mélange a été centri fugé (14 000 tours/min., 20 minutes). Le surnageant a été soumis à une extraction au phénol-chloroforme et 1'ADN a été précipité à l'isopropanol. Le culot remis en suspension a ensuite été traité par la RNAse, extrait avec du phénol-chloroforme et du chloroforme puis préci pité avec de l'éthanol. Le culot a été ensuite séché à l'air et remis en suspension dans 100 ul de tampon TE (10 mM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 7,6). Les amorces pour analyse par PCR ont été choisies à partir de la séquence d'ADN des gènes senx3 et RegX3 de M. bovis BCG (IPP) et M. tuberculosis (IPL). Une amorce (C5) hybridait à l'extrémité 3' du gène senX3 et avait la séquence 5'-3' suivante 5'GCGCGAGAGCCCGAACTGC3'. L'autre amorce (C3) hybridait à l'extrémité 5' du gène RegX3 et avait la séquence 5'-3' suivante : 5 ' -GCGCAGCAGAAACGTCAGC-3'. Avec ces deux amorces, le produit de PCR comprend 56 paires de bases additionnelles à l'extrémité 5' de la région intergénique et 62 paires de bases additionnelles à son extrémité 3' par rapport à la région intercistronique. Le produit de PCR a une longueur de 369 paires de bases pour M. tuberculosis 22962067 (IPL) et 276 paires de bases pour M. bovis BCG (IPP). Les amplifications par PCR ont été réalisées dans un termocycleur (Perkin Elmer) par incubation de 1 ul d'ADN chromosomique avec le mélange réactionnel suivant : oligonucléotides C5 et C3 (1 Vg/lpl de chaque), dTNP (2 pl) 25 mM, TMAC1 (chlorure de tétraméthylammo nium) (2 ul) 5 mM, tampon enzymatique 10 x (10 ul), ADN polymérase Vent (1 U/0,5 l), eau (82 ul). L'amplification a été réalisée sur 30 cycles à 94oC pendant une minute, 65oC pendant une minute et 72oC pendant une minute. 10 til de produit de PCR ont ensuite été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 2,5 % et visualisés avec du bromure d'éthidium. Les contrôles négatifs contenant tous les réactifs de PCR excepté la matrice d'ADN, ont été traités en parallèle avec les échantillons. La longueur du produit de PCR a été estimée par comparaison avec l'échelle d'ADN de 1 kb. Aucun produit de PCR n'a été détecté pour les 11 souches de mycobactéries non tuberculosis testées. (voir tableau 2). Trois souches de Streptomyces (S. cacaoi, S. R61 et S. R39), ainsi que E. coli TG1 ont également donné des résultats négatifs en PCR. En revanche, des produits de PCR ont été obtenus avec tous les membres du complexe M. tuberculosis. La spécificité des produits de PCR a été confirmée dans tous les cas par analyse par Southern Blot en utilisant en tant que sonde la région intergénique senX3-regX3 de M. tuberculosis (IPL) marquée à la digoxigénine, comme décrit à l'exemple 4. La longueur des fragments amplifiés est indiquée dans le tableau 3. Huit groupes différents avec des longueurs d'amplicon différentes ont été obtenus. sur les 35 isolats cliniques de M. tuberculosis testés, 34 ont donné des fragments de PCR de 329 paires de bases qui ne pouvaient être distingués de celui obtenu avec la souche référence M. tuberculosis 22962067 (IPL) (groupe 5). Une souche de M. tuberculosis (No 19) a donné un produit de PCR de 254 paires de bases (groupe 8). M. tuberculosis S200 appartient aussi au groupe 5. Des souches de M. tuberculosis provenant du Vietnam et ne contenant pas la séquence IS6110 (V. 808, V. 761 et V.729) étaient différentes du groupe majeur M. tuberculosis (groupe 5). La longueur de leur produit de PCR dépassait de 500 paires de bases (un produit de +/ 500 paires de base et deux de 560). Les souches de laboratoire de M. tuberculosis H37Ra et H37Rv avaient des produits de PCR légèrement plus grands que ceux obtenus dans le groupe 5 des souches de M. tuberculosis et ces deux souches sont classées parmi le groupe 4. Ces deux souches sont particulières en ce qui concerne la pathogé nicité incertaine pour H37Rv et la perte de pathogénicité de H37Ra. Par ailleurs, aucun cas clinique de M. tubercu losis n'était présent dans les groupes 4, 6, 8; ces trois groupes sont donc spécifiques pour les souches non virulentes. Les souches BCG (souches vaccinales et isolats de cas cliniques de BCGites) ont été divisées en trois groupes (N 4, 6 et 8). Les produits de PCR obtenus à partir de ces souches avaient une longueur de 353 paires de base, 276 et 199, respectivement. La variabilité la plus importante au niveau de la longueur des fragments de PCR était rencontrée pour les souches de M. bovis non BCG. Six souches ont été testées. Trois d'entre elles, y compris la souche réfé rence AN5, ont donné des produits de PCR de 406 paires de bases (groupe 3). Les trois autres souches ont été ~regroupées dans les groupes 2, 5 et 7 correspondant à des fragments de PCR d'environ 500 et de 329 ou 254 paires de bases respectivement. Tableau 1 : Complexe M. tuberculosis Espèces Souches Sources M .tuberculosis référence (22962067) -TPL* - H37Ra - IPP** - H37Rv - IPP (Marchal) - 5200 - CHR de Lille*** - 35 isolats cliniques - CHR de Lille (différents profils de IS6110 RFLP) - 3 isolats cliniques du Viet- - IPP (Marchal) nam V808, V761, V729 M. bovis - BCG (souches vaccinales): - IPP BCG IPP - IPL BCG Moreau - IPL BCG Japonicus - IPP BCG Pragues - IPP BCG Montréal - IPP BCG Russe - IPP BCG Glaxo - cas de BCGites 4 isolats cliniques (28, 29 - IPL 30, 31) - CHR de Lille - non BCG: référence ANS - IPP (Marchal) 1 isolat clinique (1) - CHR de Lille 2 isolats de chèvres (60, 63) - Université de Zara 2 2 isolats de vaches (76, 78) goza (Martin) - - Université de Zara M. africanum - isolat clinique goza (Martin) M. micron - référence ATCC 19422 - CHR de Lille - IPP (Marchal) * Institut Pasteur de Lille ** Institut Pasteur de Paris *** Centre Hospitalier Régional de Lille Tableau 2: Mycobactéries atypiques Espèces et Souches Sources M. avium - isolats cliniques (IPL) M. chelonae - isolats cliniques (IPL) M. flavescens - isolats cliniques (IPL) M. fortuitum - isolats cliniques (IPL) M. kansasii - isolats cliniques (CHR de Lille) M. marinum - isolats cliniques (IPL) M. scrofulaceum - isolats cliniques (IPL) M. smegmatis - IPL M. terae - isolats cliniques (IPL) M. xenopi - isolats cliniques (IPL) Tableau 3 : Amplification par PCR de la région intergénique senX3-regX3 et séquençage Longueur estimée du Composition Souches de Mycobactéries produit obtenu lors de la de la région intergénique PCR senX3-regX3 1 - M. microti 77 77 77 77 77 53 - M. tuberculosis:- V.808 560 pb # - V. 761 2 - M. tuberculosis V. 729 # 500 pb - M. bovis 60 (chèvre) 3 - M bovis:- 63 (chèvre) 77 77 77 53 - 78 (vache) 406 pb # - AN5 4 - M. tuberculosis H37Rv (IPP) 77 77 77 - M. tuberculosis H37Ra (IPL) 353 pb # - BCG: - BCG Japonicus - BCGite 28 - - BCGite 30 5 - - M africanum - M. bovis 76 (vache) 77 77 53 - M. tubarculosis: 329 pb # - référence de l'IPL - S200 - 34 isolats cliniques. 6 - BCG: - référence de l'IPP 77 77 - BCG Moreau 276 pb # - BCG Russe - BCG Glaxo - BCGite 29 - BCGite 31 7 - M. bovis 1 254 pb 77 53 - M. tuberculosis n 19): un # des des 35 isolats cliniques du CHR de Lille testés 8 - BCG: - BCG Pragues 199 pb 77 - BCG Montréal # Les fragments d'ADN amplifiés comprennent la région intercistronique senX3-regX3 ainsi que 56 paires de bases en amont de celle-ci et 62 paires de bases en aval. Les flèches 77 et 53 désignent les éléments répétés trouvés dans chaque groupe. Les souches pour lesquelles la région intercistronique a été séquencée sont soulignées. LISTES DES SEOUENCES SEQ ID N 1 : 77 paires de bases atg acc tgc gcc gac gac gat gca gag cgt agc gat gag gtg ggg gca cca ccc gct tgc ggg gga gag tgg cgc tg SEQ ID N 2 : 53 paires de bases atg acc tgc gcc gac gac gat gca gag cgt agc gat gag gag gag tgg cgc tg BIBLIOGRAPHIE Barnes, P.F., A.B. Bloch, P.T. Davidson, and D.E. Snider. 1991. Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N. Engl. J. Med. 324: 1644-1650. Brisson-Noel, A., D. Lecossier, X. Nassif, B. Giquel, V. Levy-Frebault, and A.J. Hance. 1989. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplificalioll of mycobacteria DNA in clinical samples. Lancet ii: 1069-1072. Brisson-Noel, A., C. itznar, C. Chureau, S. Nguyen, C. Pierre, M. Eartoli, R. Bonete, G. Pialoux, B. Gicquel, and G. Garrigue. 1991. 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Fragment d'acides nucléiques spécifique de membres du complexe M. tuberculosis différents du BCG comprenant un enchainement de nucléotides choisi parmi la séquence SEQ ID No 2, sa séquence complémentaire ou les séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider à l'une des séquences précédentes dans des conditions de stringence adéquates. 4. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 1. 5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pRegX3Bcl ou PRegX3Mtl respectivement déposés à la CNCM sous les numéros I-1765 et I-1766. 6. Sonde nucléotidique ou amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement avec l'une quelconque des séquences selon la revendication 1, les séquences d'ARN correspondantes ou les gènes correspondants. 7. Sonde nucléotidique selon la revendication 6, comprenant 24 nucléotides consécutifs choisis parmi les séquences d'acides nucléiques selon la revendication 1. 8. Sonde nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID Nol ou son brin complémentaire. 9. Sonde nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend deux séquences SEQ ID N" 1 successives, suivies d'une séquence SEQ ID NO 2. 10. Sonde nucléotidique pour la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques de membres du complexe M. tuberculosis différents du BCG, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence correspondant à la région de la séquence SEQ ID N" 2 encadrant le codon GAG aux positions 40 à 42 ou de son brin complémentaire. 11. Sonde nucléotidique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence composée de 9 paires de bases en amont et 9 paires de bases en aval du codon GAG aux positions 40 à 42 spécifique de la séquence SEQ ID N" 2. 12. Sonde nucléotidique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'il s'agit de la séquence SEQ ID NO 2 ou de son brin complémentaire. 13. Sonde nucléotidique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est marquée par la digoxigénine. 14. Amorces nucléotidiques pour l'amplification d'une séquence nucléotidique spécifique de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis, comprenant des séquences nucléotidiques correspondant aux séquences adjacentes à la région intergénique senX3regX3, dans les régions 3' de senX3 et 5' de regX3. 15. Amorces selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles comprennent 19 nucléotides. 16. Amorces selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'il s'agit du couple d'amorces 5 'GCGCGAGAGCCCGAACTGC3' et 5'GCGCAGCAGAAACGTCAGC3'. 17. Utilisation d'une séquence selon la revendication 1, pour la réalisation de sondes nucléoti diques de diagnostic ou d'amorces nucléotidiques utilisa bles dans une méthode d'amplification enzymatique. 18. Utilisation d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 6 à 13 comme outil de détection ou de diagnostic in vitro de souches de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis. 19. Méthode de détection de souches de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes (i) mise en contact de l'échantillon biologi que avec un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 6, 14 à 16 dans des conditions permettant une hybridation desdites amorces aux acides nucléiques spécifiques de souches de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis (ii) amplification desdits acides nucléiques; (iii) mise en contact d'une sonde nucléotidi que selon l'une quelconque des revendications 6 à 13 avec ledit échantillon biologique dans des conditions permet tant la formation de complexes d'hybridation entre ladite ,sonde et les séquences d'acides nucléiques amplifiés (iv) détection des complexes d'hybridation formés. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'étape (iii) est réalisée avec une sonde nucléotidique selon la revendication 8. 21. Méthode de détection de la présence de membres du complexe M. tuberculosis autres que le BCG dans un échantillon biologique selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'étape (iii) est réalisée avec une sonde nucléotidique selon la revendication 10. 22. Méthode de détection et de diagnostic différentiel du BCG et des autres membres du complexe M. tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'on réalise une méthode de détection selon la revendication 20 et en ce que l'on recherche parmi les acides nucléiques amplifiés capables de former des complexe d'hybridation, ceux qui sont également capables de former des complexes d'hybridation avec une sonde nucléotidique selon la revendication 10. 23. Méthode selon la revendication 21 ou la revendication 22 pour différencier une infection par le BCG d'une infection par une mycobactérie virulente du complexe M. tuberculosis chez un sujet immunodéprimé. 24. Méthode selon la revendication 23, caractérisée en ce que le sujet immunodéprimé est un sujet infecté par le VIH. 25. Méthode pour l'identification de groupes de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis, caractérisée en ce que - on met en contact 1'ADN desdites souches préalablement extrait avec un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 6, 14 à 16, dans des conditions permettant une hybridation spécifique des ,amorces à l'une des séquences selon la revendication 1 et l'obtention de produits d'amplification, et - on mesure la longueur des produits d'ampli fication obtenus. 26. Méthode selon la revendication 25, caractérisée en ce que l'on utilise le couple d'amorces selon la revendication 16. 27. Trousse pour l'identification in vitro de souches de mycobactéries appartenant au complexe M. tuberculosis dans un prélèvement biologique comprenant: - un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 6, 14 à 16 - les réactifs nécessaires pour permettre l'amplification des séquences d'acides nucléiques spécifiques de souches appartenant au complexe M. tuberculosis à l'aide desdites amorces, - éventuellement des moyens pour révéler les fragments amplifiés.