Brevet FR2750133A1 — publié le 19971226

Procédé de purification de phospholipides par chromatographie de partage centrifuge. La présente invention concerne le domaine des procédés de séparation et de purification. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de purification de phospholipides, en particulier de phosphatidylcholines présentant une teneur élevée en acide gras à longue chaîne (C20 à C22) tels que principalement l'acide arachidonique (AA, C20:4 oye6), l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 oye3) ou l'acide eicosapentaénoïque (EPA, C20:5 cl3), à partir d'extraits lipidiques d'origine naturelle. L'importance nutritionnelle des acides gras polyinsaturés a été mise en évidence depuis une dizaine d'années. Des études ont notamment montré que l'acide arachidonique, l'acide docosahexaénoïque et l'acide eicosapentaénoïque étaient des constituants des membranes cellulaires et jouaient chez l'enfant un rôle essentiel dans le développement neuronal et sensoriel ( voir T. Desci, B. Koletsko, Acta Paediatr. suppl., n" 395, pp 31-37, 1994). I1 a également été montré que, chez le nouveau né, il existait une corrélation positive entre le taux de DRA érythrocytaire et la maturation de l'vacuité visuelle (voir M. Makrides, K. Simmer, M. Goggin; R.A. Gibson, Pediatric Res., nO 33, pp 425 - 427, 1993). D'autres travaux ont prouvé que la constitution de la rétine chez l'embryon humain s'accompagnait de concentrations élevées de phosphatidylcholine et de DHA (voir Leger et al.,OCL, n" 2, pp 45-51, 1995). Ces acides gras polyinsaturés à longue chaîne sont essentiellement trouvés dans les produits d'origine marine, tant végétale (algues), qu'animale (poissons, céphalopodes...). Ils sont ainsi par exemple présents en proportions importantes dans la peau des calmars ainsi que dans certaines algues. Toutefois, on notera que ces composés peuvent aussi être trouvés dans d'autres produits d'origine non marine tels que le jaune d'oeuf (au sujet de ce dernier produit, les quantités d'acides gras polyinsaturés dépendent du régime alimentaire des poules) ou encore certains champignons. Dans tous ces produits, ces acides gras polyinsaturés à longue chaîne se présentent sous forme d'esters phospholipidiques comme notamment les phosphatidylcholines (également appelées lécithines) à greffage AA, EPA ou DHA. Compte-tenu de l'intérêt grandissant pour ce type de composé, intérêt manifesté notamment par les secteurs pharmaceutiques, cosmétiques et diététiques, il est souhaitable de disposer d'un procédé permettant de purifier ces phospholipides, à partir d'extraits de produits tels que notamment ceux mentionnés ci-dessus. I1 est bien connu d'obtenir la fraction lipidique totale de produits d'origine naturelle et, à partir de cette fraction, d'isoler la fraction contenant seulement les phospholipides et incluant entre autres les phosphatidylcholines. A partir de cette fraction contenant l'ensemble des phospholipides, il est possible de séparer et de purifier chaque classe de phospholipides par des procédés classiques de chromatographie et notamment par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Toutefois, ces méthodes classiques, bien que permettant d'aboutir en général à des produits purs présentent de nombreux inconvénients. En premier lieu, de tels procédés ne peuvent être mis en oeuvre à l'échelle industrielle qu'au prix de l'utilisation de quantités importantes de solvants, ce qui rend leur intérêt économique limité. Ce problème est accru par le fait que ces techniques ne permettent de traiter que des quantités limitées d'extraits et présentent donc une productivité faible. Enfin, on notera que de telles méthodes impliquent l'emploi de supports solides coûteux et qu'il faut traiter après utilisation. Le principal objectif de la présente invention est de fournir un procédé de purification de phospholipides présentant une forte teneur en acides gras polyinsaturés tels que notamment AA, EPA ou DHA ne montrant pas les inconvénients susmentionnés. Plus précisément, un des objectifs de l'invention est de proposer un tel procédé qui puisse facilement être modulé en fonction de la nature du greffage en acides gras des phospholipides à purifier. Encore un objectif de l'invention est de décrire un tel procédé qui puisse être mis en oeuvre en l'absence de solvant chloré et sans support solide. Encore un objectif de l'invention est de divulguer un tel procédé présentant un intérêt économique accru par rapport aux techniques classiques de chromatographie. Ces différents objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé de purification d'un phospholipide présentant une teneur élevée en acides gras insaturés à longue chaîne à partir d'un extrait de phospholipides totaux provenant d'un produit d'origine naturelle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à soumettre ledit extrait de phospholipides totaux à une chromatographie de partage centrifuge mettant en oeuvre un système solvant formé d'un premier solvant choisi dans le groupe constitué par l'heptane et l'isooctane, d'un deuxième solvant constitué par l'acétate d'éthyle et d'un troisième solvant constitué par 1' acétonitrile. Préférentiellement, le phospholipide à purifier est une phosphatidylcholine. La chromatographie de partage centrifuge est une technique de séparation basée sur la séparation de solutés en fonction de leur coefficient de partage entre les phases immiscibles d'un système de solvants. Cette technique met donc en oeuvre deux phases liquides : une phase liquide stationnaire dans laquelle percole une phase liquide mobile et présente par conséquent l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation de supports solides. Une telle technique présente également l'avantage, par rapport aux technologies classiques de chromatographie, de permettre la séparation de quantités plus importantes d'extraits. Enfin, on notera que la chromatographie de partage centrifuge induit une consommation plus réduite en solvants en regard d'autres techniques chromatographiques, d'où son intérêt économique accru. On notera qu'il avait déjà été envisagé d'utiliser la chromatographie de partage centrifuge pour purifier des taxoïdes (désacétyl- 10 baccatine III et taxotère). Une telle technique est décrite dans la demande de brevet FR2703049. Toutefois, ces taxoÏdes sont des molécules de nature chimique fort différentes des phosphatidylcholines à greffage en acides gras polyinsaturés auxquels s'intéresse la présente invention. Le système solvant proposé par FR2703049, à savoir: heptane - acétate d'éthyle - méthanol - eau, ne peut pas être mis en oeuvre pour séparer ce type de composés car, compte-tenu de polarité et du fort pouvoir tensio-actif des phosphatidylcholines, il y a création d'un émulsion stable incompatible avec la séparation des constituants. L'invention propose donc des combinaisons de solvants adaptées à la séparation et à la purification des phospholipides et en particulier des phosphatidylcholines, et qui, à la connaissance des Déposants n' avait jamais été décrites dans la littérature. Comme précisé ci-dessus, l'un des solvants du système diphasique de solvants préconisé par l'invention pourra être constitué indifféremment soit par de l'isooctane, soit par de l'heptane. Toutefois, préférentiellement, ce solvant sera de l'heptane, ce composé présentant l'avantage d'être moins coûteux. Selon une première variante de l'invention, lorsque l'on choisit de purifier une phosphatidylcholine présentant un greffage majoritaire en acide arachidonique (AA), ledit système solvant sera mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 19 à 21 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol, préférentiellement: heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 20 % vol, acétonitrile 30 % vol. Selon une deuxième variante de l'invention, lorsque l'on choisit de purifier une phosphatidylcholine présentant un greffage majoritaire en acide docosahexaénoïque (DHA), ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes: heptane 38 % vol, acétate d'éthyle 22 à 25 % vol, acétonitrile 37 à 40 % vol, préférentiellement : heptane 38 % vol, acétate d'éthyle 24 % vol, acétonitrile 38 % vol. Enfin, selon une troisième variante de l'invention, lorsque l'on choisit de purifier une phosphatidylcholine présentant un greffage majoritaire en acide eicosapentaénoïque (EPA), ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 40 % vol, acétate d'éthyle 29 à 31 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol, préférentiellement : heptane 40 % vol, acétate d'éthyle 30 % vol, acétonitrile 30 % vol. Egalement préférentiellement, ledit produit à partir duquel est obtenu la fraction de phospholipides est un produit à haute teneur en AGPI à longue chaîne (C20- C22)tel qu'un produit d'origine marine. I1 pourra s'agir notamment d'algues, de poissons, ou de céphalopodes. Selon une autre variante préférentielle, ledit produit est du jaune d'oeuf. Comme précisé ci-dessus, ce produit peut en effet présenter une teneur élevée en lécithines greffées avec des acides gras polyinsaturés en C20 ou C22. L'invention couvre également le phospholipide purifié présentant une teneur élevée en acide gras polyinsaturé à longue chaîne obtenu selon le procédé décrit cidessus. L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente, seront plus facilement compris grâce à la description qui va suivre de cinq exemples non limitatifs de réalisation, en référence à la figure 1 qui représente le spectre HPTLC d'une fraction de phosphatidylcholine obtenue à partir d'un extrait des phospholipides totaux de la microalgue Porphyridium cruentum, en mettant en oeuvre le procédé selon l'invention. Exemple 1: Le premier exemple de mise en oeuvre de l'invention a consisté, à partir d'une fraction contenant les phospholipides extraits de microalgue rouge (Porphyridium cruentum), à purifier la phosphatidylcholine (à taux de greffage important en acide arachidonique) de cette fraction. Dans un premier temps, on a donc isolé la fraction phospholipidique d'extraits de microalgues rouges. Dans ce but, la pâte de microalgues obtenue par centrifugation a été traitée à l'eau bouillante selon la procédure décrite par Bergé et al (voir Phytochem., vol. 39, n" 5, pp 1017-1021, 1995). Les lipides totaux ont été obtenus selon la méthode de Bligh et Dyer (voir Can. J. Biochem. Phys., vol. 37, pp 911-917). Les phospholipides ont été extraits directement de la pâte obtenue par un procédé classique inspiré par Singleton et al. (voir J. Am. Oil Chem. Soc., n" 42, pages 53-56, 1965) consistant à mettre à profit la différence de solubilité dans l'acétone des phospholipides et des autres lipides. Une analyse chromatographique sur gel de silice à montré que les phospholipides représentaient 20 % en poids des lipides totaux. Une chromatographie HPTLC a ensuite été effectuée sur la fraction de phospholipides totaux obtenue pour déterminer la composition de celle-ci dans chacune des différentes classes de phospholipides (lysophosphatidylcholine (lysoPC), phosphatidylcholine (PC), phosphatidyléthanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycérol (PG), phosphatidylsérine (PS)). Les résultats de ces analyses sont montrés au tableau 1 suivant. Classes de phospholipides % des phospholipides phosphatidylcholine (PC) | 49,2 iysophosphatidyîcholine (lysoPC) | 13,0 phosphatidylglycérol (PG) | 15,0 phosphatidylétbanolamine(PE) 7,1 phosphotidylinositol (PI) 8,2 phosphatidylsérine (PS) | 7,5 Tableau 1 Selon le tableau 1, on peut facilement constater que le phospholipide prépondérant est la phosphatidylcholine (PC) qui représente 49,2 % des phospholipides totaux. La composition en acides gras des différents phospholipides (en pourcent) a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats de ces analyses figurent dans le tableau 2 suivant. Acide gras PC PE PI PG PS saturés 22,4 20,1 25,1 1 29,2 28,0 mono- 15,2 15,1 17,8 22,1 18,1 insaturés AA 38,9 - - - EPA 6,0 18,9 1,8 13,2 15,0 DHA - - - - Tableau 2 Ces analyses confirment que la phosphatidylcholine de Porphyridium cruentum renferme une proportion élevée d'acides gras polyinsaturés, à savoir 45,9 % du total des acides gras. Parmi ceux-ci 1'AA est amplement majoritaire (38,9 % des acides gras totaux). Dans un second temps, le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur la fraction de phospholipides totaux, grâce à un appareil de chromatographie de partage centrifuge KROMATON II (commercialisé par la société SEAB, Villejuif, France). Cet appareil présente l'avantage de pouvoir fonctionner en mode expérimental et en mode semi-préparatif. A ce titre, il est équipé d'une première colonne d'un volume de 75 ml (constituée par un tube de 2,5 mm de diamètre intérieur et de 15 m de longueur) et d'une deuxième colonne d'un volume de 1 litre (constituée par un tube de 2,5 mm de diamètre intérieur et de 203 m de longueur). Selon l'invention, on a utilisé un sytème solvant constitué de trois solvants, à savoir l'heptane, l'acétate d'éthyle et l'acétonitrile. Compte-tenu du fait que, comme l'ont montré les analyses mentionnées cidessus, l'acide gras polyinsaturé majoritaire dans les phospholipides de la microalgue Porphyridium cruentum est 1'AA (voir tableau 2, ci-dessus) les proportions volumiques utilisées ont été les suivantes : heptane : 50 % ; acétate d'éthyle : 20 % ; acétonitrile 30%. Les essais ont été effectués en dissolvant 0,32 g à 0,64 g de la fraction phospholipidique dans 5 ml de phase mobile et en injectant ce mélange dans la colonne analytique de 75 ml de l'appareil cité ci-dessus. La vitesse de rotation maximale a été fixée à 600 tr / mn. Le débit de la phase mobile a été fixé à 5 ml / mn avec, dans un premier temps, une phase mobile supérieure. Puis, après élution d'un volume de colonne (75 ml), la phase mobile est devenue la phase inférieure (fonctionnement en "dual mode"). La fraction PC a été éluée dans cette phase. La fractionnement a été réalisé toutes les 4 mn. Après évaporation des solvants sous azote, les fractions purifiées ont été reprises dans un mélange benzène : éthanol (4 volumes pour 1 volume) et congelées à - 18 OC. La fraction obtenue contenant la PC a été chromatographiée (HPTLC). Le spectre obtenu est représenté à la figure 1 qui permet de constater que le procédé selon l'invention a permis d'obtenir une PC très pure tout en récupérant la quasi-totalité (95 %) de la phosphatidylcholine initialement présente dans l'ensemble des phospholipides. Exemple 2 Le deuxième exemple de mise en oeuvre de l'invention a consisté, à partir d'une fraction contenant les phospholipides extraits de peaux de calmars (Illex argentinus), à purifier la phosphatidylcholine (à taux de greffage important en acide doeosahexaénoique) de cette fraction. Dans un premier temps, on a donc isolé la fraction phospholipidique d'extraits bruts de peaux de calmars. Dans ce but, les peaux de calmars ont été coupées en petits morceaux et broyées à + 4 OC. Les phospholipides ont été extraits comme précédemment décrit.Une analyse chromatographique sur gel de silice à montré que les phospholipides représentaient 97,7 % en poids des lipides totaux. Une chromatographie HPTLC a ensuite été effectuée sur la fraction de phospholipides totaux obtenue pour déterminer la composition de celle-ci dans chacune des différentes classes de phospholipides (phosphatidylcholine (PC), phosphatidyléthanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI), sphingomyéline (SM), phosphatidylsérine (PS)). Ces analyses confirment que la phosphatidylcholine de peau de calmar renferme une proportion élevée d'acides gras polyinsaturés, à savoir 45,7 % du total des acides gras. Parmi ceux-ci le DHA est amplement majoritaire (86,9 % des acides gras polyinsaturés). Le procédé a donc été mis en oeuvre avec un sytème solvant constitué de trois solvants, à savoir l'heptane, l'acétate d'éthyle et l'acétonitrile dans les proportions volumiques suivantes: heptane : 38 % ; acétate d'éthyle: 24 % ; acétonitrile: 38 %. La fraction obtenue contenant la PC a été chromatographiée (HPTLC). L'analyse du spectre obtenu a permis de constater que l'on obtient une PC très pure tout en récupérant la quasi-totalité (95 %) de la phosphatidylcholine initialement présente dans l'ensemble des phospholipides. Exemple 3 Cet exemple de réalisation a consisté à reproduire les conditions opératoires de l'exemple 2 à partir de peaux de calmars tout en remplaçant, dans le jeu de solvant utilisé, l'heptane par l'isooctane. Des résultats identiques à ceux de l'exemple 2 ont été obtenus. Exemple 4 Le quatrième exemple de mise en oeuvre de l'invention a consisté, à partir d'une fraction contenant les phospholipides extraits de jaune d'oeuf à purifier la phosphatidylcholine de cette fraction. Dans un premier temps, on a isolé la fraction phospholipidique à partir d'extraits bruts de ce jaune d'oeuf. Une chromatographie HPTLC a ensuite été effectuée sur la fraction de phospholipides totaux obtenues pour déterminer la composition de celle-ci dans chacune des différentes classes de phospholipides et afin de déterminer quel était le profil en acide gras de chaque classe de phospholipides. Les résultats ont montré que la PC de jaune d'oeuf étudiée renferme une forte proportion d'acide eicosapentaénique (EPA). Le procédé selon l'invention a donc été mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane : 40 % ; acétate d'éthyle: 30 % ; acétonitrile: 30 %. La chromatographie de partage centrifuge a été effectuée de la même façon que dans l'exemple 2. La fraction éluée a été chromatographiée (HPTLC) après évaporation des solvants et son analyse a permis de constater que 95 % de la fraction phosphatidylcholine avait été récupérée sous forme très pure. Exemple 5 Le cinquième exemple de mise en oeuvre de l'invention a consisté, à partir d'une fraction contenant les phospholipides extraits de peaux de calmars (Illex argentinus) comme décrit à l'exemple 2 mentionné ci-dessus, à purifier la phosphatidylcholine (à taux de greffage important en acide docosahexaénoYque) de cette fraction. Cet exemple de réalisation a été réalisé en mode semi-préparatif en utilisant la colonne de 1 litre de l'appareil de chromatographie de partage centrifuge décrit ci-dessus (KROMATON II (commercialisé par la société SEAB, Villejuif, France)). Les essais ont été effectués en dissolvant 3 g de la fraction phospholipidique dans 5 ml de phase mobile et en injectant ce mélange dans la colonne analytique de 1 1. La vitesse de rotation maximale a été fixée à 600 tr / mn. Le débit de la phase mobile a été fixé à 5 ml / mn. On a ainsi pu récupérer 2,8 g de PC très pure tout en récupérant la quasi-totalité (95 %) de la phosphatidylcholine initialement présente dans l'ensemble des phospholipides. Les présents exemples de réalisation de l'invention n'ont pas pour objet de réduire la portée de l'invention. I1 pourra donc y être apporté des nombreuses modifications sans sortir de son cadre tel que défini par les revendications annexées. En particulier, on notera que le procédé selon l'invention pourra bien sûr être mis en oeuvre sur d'autres produits que ceux mentionnés dans ces exemples. REVENDICATIONS 1. Procédé de purification d'un phospholipide présentant une teneur élévée en acide gras polyinsaturés à longue chaine à partir d'un extrait de phospholipides totaux provenant d'un produit d'origine naturelle, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à soumettre ledit extrait de phospholipides totaux à une chromatographie de partage centrifuge mettant en oeuvre un système solvant formé d'un premier solvant choisi dans le groupe constitué par l'heptane et l'isooctane, d'un deuxième solvant constitué par l'acétate d'éthyle et d'un troisième solvant constitué par l'acétonitrile. 2. Procédé de purification selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit phospholipide est une phosphatidylcholine. 3. Procédé de purification selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit premier solvant est l'heptane. 4. Procédé de purification selon la revendication 2 caractérisé en ce que ladite phosphatidylcholine présente un greffage majoritaire en acide arachidonique (AA) et en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes: heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 19 à 21 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol. 5. Procédé de purification selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 50 % vol, acétate d'éthyle 20 % vol, acétonitrile 30 % vol. 6. Procédé de purification selon la revendication 2 caractérisé en ce que ladite phosphatidylcholine présente un greffage majoritaire en acide docosahexaénoïque (DHA) et en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes: heptane 38 % vol, acétate d'éthyle 22 à 25 % vol, acétonitrile 37 à 40 % vol. 7. Procédé de purification selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 38 % vol, acétate d'éthyle 24 % vol, acétonitrile 38 % vol. 8. Procédé de purification selon la revendication 2 caractérisé en ce que ladite phosphatidylcholine présente un greffage majoritaire en acide eicosapentaénoïque (EPA) et en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes: heptane 40 % vol, acétate d'éthyle 29 à 31 % vol, acétonitrile 29 à 31 % vol. 9. Procédé de purification selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit système solvant est mis en oeuvre dans les proportions volumiques suivantes : heptane 40 % vol, acétate d'éthyle 30 % vol, acétonitrile 30 % vol. 10. Procédé de purification selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que ledit produit est un produit à forte teneur en acide gras polyinsaturé à longue chaine. 1 1. Procédé de purification selon la revendication 10 caractérisé en ce que ledit produit est un produit d'origine marine. 12. Procédé de purification selon la revendication 10 caractérisé en ce que ledit produit est du jaune d'oeuf. 13. Phospholipide purifié présentant une teneur élévée en acide gras polyinsaturé à longue chaine caractérisé en ce qu'il a été obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 12.