Brevet FR2753628A1 — publié le 19980327

La présente invention concerne un procédé d'élaboration d'un produit destiné à prévenir et à soigner des maladies de la peau, telles que des éruptions cutanées ou des manifestations allergiques à des compositions cosmétiques. L'invention concerne également ledit produit et une utilisation de ce dernier. Les travaux de Susuma Tonegawa, Prix Nobel de médecine en 1987, ont mis en évidence la fonction immunologique de certaines cellules de l'épiderme, les cellules de Langerhans, vis-à-vis des agressions localisées dans la couche épidermique de la peau. Les cellules de Langerhans, qui appartiennent à une famille de cellules dites dendritiques lymphoïdes, sont essentiellement situées dans les couches moyennes de l'épiderme. Malgré leur faible densité, elles ont un rôle d'intormation et de surveillance sur l'ensemble de l'épiderme, grâce à leur nature dendritique et à leur capacité migratoire, notamment. Les cellules de Langerhans sont capables à la fois de phagocyter les corps étrangers ou les allergènes ayant pénétré dans l'épiderme et de transmettre des antigènes à des cellules immuno-compétentes particulières, les cellules dites cellules T. L'activation et la protection des cellules de Langerhans permettent donc de stimuler le processus de défense intrinsèque de l'épiderme. Or, on sait que ces cellules sont directement exposées aux rayonnements ultraviolets résultant d'une exposition au soleil. Des études récentes ont montré que ces rayonnements provoquent à plus ou moins grande échelle, d'une part, une diminution des marqueurs de membrane et donc une altération de la capacité de présentation d'antigènes aux cellules immuno-compétentes et, d'autre part, une disparition des dendrites caractérisant les cellules de Langerhans. En cas d'exposition prolongée au soleil, les rayonnements ultraviolets inhibent les cellules de Langerhans et ces dernières voient leur nombre diminuer. On a cherché à élaborer des produits susceptibles de protéger et d'activer les cellules de Langerhans en prévision des rayonnements ultraviolets qui agissent fréquemment sur l'épiderme. On connaît ainsi de tels produits qui sont élaborés à partir d'extraits de membranes de levures, et qui sont constitués de polysaccharides d'origine végétale. On peut par exemple citer des produits appartenant à la famille des ss- 1, 3 glucanes, reconnus par les récepteurs membranaires des cellules de Langerhans, et qui permettent auxdites cellules de maintenir dans une certaine mesure leur activité macrophage et de protéger les cellules immuno-compétentes de l'épiderme. Un inconvénient majeur des produits précités réside dans leur pénétration souvent insuffisante dans l'épiderme, laquelle est due à la taille importante des molécules de polysaccharides constituant lesdits produits. Le but de la présente invention est de proposer un procédé d'élaboration d'un produit destiné à prévenir et à soigner des maladies de la peau, qui soit tel que ledit produit puisse pénétrer de manière satisfaisante dans l'épiderme et donc présenter une bonne activité. A cet effet, le procédé d'élaboration d'un tel produit est tel qu'il consiste à utiliser un extrait naturel d'alginate de sodium et à soumettre ledit extrait à au moins un traitement de dépolymérisation. Selon une autre caractéristique de l'invention, I'on soumet ledit extrait à un traitement de dépolymérisation enzymatique au moyen d'une alginate lyase. De préférence et ultérieurement audit traitement enzymatique, l'on soumet ledit extrait dépolymérisé à une hydrolyse en milieu acide. Selon une autre caractéristique de l'invention, ledit produit comprend des enchaînements d'oligo-alginates et d'acides uroniques. Selon une variante de réalisation, ledit produit comprend également des extraits naturels d'algues du type chlore lia. Selon une autre caractéristique de l'invention, ledit produit est prévu pour protéger des rayonnements ultraviolets les cellules de Langerhans de l'épiderme. Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante de plusieurs exemples de réalisation. Selon une première variante de réalisation, le produit selon l'invention est constitué d'oligosaccharides du type comprenant, d'une part, des oligo-alginates et, d'autre part, des acides présentant une structure analogue à celle des acides alphahydroxylés, tels que des acides uroniques. Ledit produit est élaboré à partir d'un extrait d'algues à base de polysaccharides qui sont constitués d'un alginate de sodium, selon le procédé suivant. On soumet dans un premier temps ledit extrait d'alginate de sodium à une réaction de dépolymérisation enzymatique. On utilise à cet effet une enzyme du type mannuronate lyase, de préférence une alginate lyase. Cette enzyme, obtenue par fermentation bactérienne, permet de dépolymériser par ss-élimination les blocs alternés de la molécule d'alginate de sodium, qui sont constitués d'enchaînements d' -L- guluronate de sodium et de ss-D-mannuronate de sodium liés en 1, 4. De plus, I'enzyme précitée permet de réduire très rapidement la viscosité de la solution d'alginate de sodium au terme de ladite étape de dépolymérisation. De préférence, on soumet ensuite l'extrait d'alginate dépolymérisé à une hydrolyse partielle en milieu acide, de manière à obtenir un produit caractérisé par un degré de polymérisation encore réduit par rapport à celui dudit extrait dépolymérisé. On notera que cette hydrolyse est grandement facilitée par la mise en oeuvre de ladite première étape, de par la viscosité réduite de l'extrait d'alginate traité par ladite enzyme et grâce à la dépolymérisation préalable desdits blocs caractérisant l'alginate de sodium. Par ailleurs, il est à noter que ladite enzyme permet de limiter la gélification de l'acide alginique suite à l'acidification, ce qui permet de conférer une bonne activité au produit obtenu. A titre simplement indicatif, on trouvera ci-dessous deux exemples de préparation du produit selon l'invention. Exemple 1: L'extrait d'algue constitué d'alginate de sodium est d'abord solubilisé pendant une heure à une concentration de 5 %. L'extrait d'alginate solubilisé est ensuite soumis à une dépolymérisation enzymatique à une température de 25 C et pendant quatre heures, au moyen d'une alginate lyase connue sous la dénomination AL 951. De plus, le ratio massique enzyme/alginate est de 0,01 % et le pH du milieu est de 7,5. Les masses moléculaires moyennes en nombre dudit extrait solubilisé sont déterminées pendant et après ladite dépolymérisation enzymatique, par la méthode dite du "dosage des doubles liaisons conjuguées" (voir annexe I). On en déduit le degré de polymérisation moyen en nombre dudit extrait aux deux moments précités. Dans cet exemple de réalisation, ledit degré de polymérisation de l'extrait d'alginate est de 96 suite au traitement enzymatique. On hydrolyse ensuite partiellement et en milieu acide l'extrait dépolymérisé, I'hydrolyse étant conduite pendant quatre heures à un pH de 1,5 et à 940 C. A cet effet, on ajoute de l'acide sulfurique audit extrait, le ratio acide/alginate étant de 30 % en poids sec. La réaction est stoppée par refroidissement jusqu'à ce que la température du milieu atteigne 200 C, ce qui est le cas au bout d'une heure. On détermine alors la masse moléculaire moyenne en nombre de l'extrait hydrolysé par la méthode de SOMOGYI-NELSON dite du "dosage des sucres réducteurs" (voir annexe II), et l'on en déduit le degré de polymérisation moyen en nombre du produit finalement obtenu. Dans cet exemple de réalisation, ledit degré de polymérisation du produit selon l'invention est de 12. ExemPle 2: De même que précédemment, I'extrait d'alginate de sodium est d'abord solubilisé pendant une heure à une concentration de 5 %. L'extrait solubilisé est ensuite soumis à une dépolymérisation enzymatique à une température de 25 C et pendant vingt-trois heures, au moyen de ladite alginate lyase. De plus, le ratio massique enzyme/alginate est de 0,1 % et le pH du milieu est maintenu à 7,5. Suite au traitement enzymatique, le degré de polymérisation moyen en nombre est déterminé comme indiqué dans l'exemple 1. Dans cet exemple de réalisation, ledit degré de polymérisation de l'extrait traité par l'alginate lyase est de 9. On soumet ensuite ledit extrait traité à une hydrolyse acide dans les mêmes conditions qu'à l'exemple précédent, et l'on détermine de la même manière le degré de polymérisation moyen en nombre du produit finalement obtenu. Dans cet exemple de réalisation, le produit selon l'invention est caractérisé par un degré de polymérisation égal à 4. On notera que les degrés de polymérisation réduits qui ont été obtenus dans lesdits exemples de réalisation favorisent la pénétration cutanée du produit selon l'invention. On notera encore que l'hydrolyse en milieu acide constitue une étape facultative du procédé selon l'invention. En effet, I'on pourrait se contenter de procéder à la seule dépolymérisation enzymatique, du moment que le degré de polymérisation du produit obtenu suite au traitement à l'alginate lyase serait tel que la pénétration dudit produit dans la peau serait satisfaisante. A titre indicatif la valeur maximale admissible du degré de polymérisation du produit selon l'invention est environ de 20. Selon une seconde variante de réalisation, le produit selon l'invention est constitué d'un premier produit, qui est obtenu conformément à ladite première variante de réalisation, et d'un second produit, qui est élaboré à partir d'extraits naturels d'algues microscopiques du type chlorella selon le procédé suivant. Ce procédé consiste essentiellement à effectuer un broyage en milieu alcalin desdites algues, à acidifier le jus d'extraction obtenu, à éliminer les débris cellulaires par microfiltration tangentielle sur un filtre dont le seuil de rétention est de 0,22 llm, et à concentrer les éléments organiques restants, jusqu'à obtention d'un extrait comprenant 5 % de matières actives, qui constitue ledit second produit. Le mélange desdits premier et second produits s'effectue dans un solvant neutre, par exemple de l'eau, en utilisant des concentrations de 5 % pour chacun d'eux. Afin de mettre en évidence l'effet immuno-modulateur de chaque produit selon l'invention sur l'épiderme, on a procédé à des expériences consistant, après avoir soumis des explants de peau à une irradiation aux rayons ultraviolets de classe A (U. V. A.), à visualiser et à compter les cellules de Langerhans présentes dans l'épiderme, à l'aide d'un microscope à fluorescence. On trouvera ci-dessous un compte-rendu détaillant le mode opératoire et les résultats se rapportant à ces expériences, ceci pour trois produits différents correspondant à la première variante de réalisation de l'invention. Chacun desdits produits est caractérisé par une même fraction volumique d'oligosaccharides égale à 0,25 %, et les pH desdits produits sont respectivement de 2, 4 et 7. Ces produits seront respectivement désignés sous le nom d'ALGpH2, ALGpH4 et ALGpH7 dans la suite de la description. Des échantillons d'explants de peau d'un sujet sain, obtenus suite à une intervention de chirurgie plastique, sont placés en survie dans un milieu de culture approprié. Quatre séries d'explants sont préparées: - la première série (témoin) est telle que chaque explant la constituant ne reçoit pas le produit selon l'invention et n'est pas soumis à une irradiation U. V. A. - la deuxième série (témoin irradié) est telle que chaque explant la constituant ne reçoit pas le produit selon l'invention mais est soumis à une irradiation U. V. A. - la troisième série (traité et non irradié) est telle que chaque explant la constituant reçoit le produit selon l'invention mais n'est pas soumis à une irradiation U. V. A. - la quatrième série (traité et irradié) est telle que chaque explant la constituant reçoit le produit selon l'invention et est soumis à une irradiation U. V. A. Les quatre séries d'explants sont congelées par immersion dans de l'isopentane qui est refroidi à -55" C dans de l'azote liquide. On effectue par la suite plusieurs coupes frontales à l'intérieur d'un cryostat à une température de -16" C, ce qui a pour effet de stopper l'activité immunitaire des cellules de Langerhans. On procède ensuite à l'incubation d'un anticorps primaire et d'un anticorps secondaire dans chaque explant, lesquels anticorps permettent de révéler, par la technique d'immunofluorescence, I'activité des cellules de Langerhans. En effet, les cellules de Langerhans ne sont actives que si elles jouent leur rôle antigénique en bloquant les anticorps, ladite action antigénique étant observable au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire est prévu pour reconnaître les cellules de Langerhans et l'anticorps secondaire, couplé à des molécules fluorescentes de tétraméthylrhodamine-isothiocyanate (TRITC), est prévu pour colorer lesdites cellules. On observe les échantillons coupés et incubés au microscope à fluorescence, afin de pouvoir visualiser et dénombrer les cellules de Langerhans caractérisant chaque échantillon. Les échantillons ont été photographiés et étudiés pour chaque série d'explants, de manière à pouvoir évaluer le nombre moyen de cellules de Langerhans par unité de longueur d'épiderme pour l'ensemble des échantillons observés. On a également fait figurer pour chaque série étudiée l'erreur standard moyenne (SEM), laquelle est obtenue en divisant l'écart-type mesuré par la racine carrée du nombre d'échantillons de la série concernée. Le nombre total d'échantillons étant important, deux catégories de mesures ont été effectuées, la première catégorie étant destinée à déterminer l'effet immuno-modulateur des produits ALGpH2 et ALGpH7, alors que la seconde catégorie est destinée à déterminer l'effet immuno-modulateur du troisième produit ALGpH4 selon l'invention. L'effet immuno-modulateur de chaque produit a été chiffré au moyen de la relation suivante: où E. I. représente la valeur en pourcentage dudit effet immunomodulateur, AN(témoin-témoin irradié) représente le nombre de cellules de Langerhans de la série "témoin" diminué de celui de la série "témoin irradié", et AN(traité-traité irradié) représente le nombre de cellules de Langerhans de la série "traité" diminué de celui de la série "traité irradié". La valeur trouvée pour E. I. permet de définir de manière qualitative et standardisée l'effet immuno-modulateur du produit testé. En particulier, - Si 70 % - Si E. 1. > 100 % alors le produit a un effet immuno-modulateur absolu. Les tableaux I et II ci-dessous rendent compte de ces mesures. Tableau I Nombre moyen Variation et taux de cellules de de variation du Série Langerhans par nombre de Effet immuno d'échantillons cm d'épiderme cellules de modulateur + SEM Langerhans par cm d'épiderme ~ aprés irradiation témoin 305 f 22 -220 cellules témoin irradié 85 + 13 -72, 1 % traité par ALGpH2 276 + 55 et non irradié +113 cellules traité par ALGpH2 389 + 56 +40,9 % 151.4 % et irradié traité par ALGpH7 262 + 23 et non irradié -8 cellules traité par ALGpH7 254 31 -3,1 % 96 % et non irradié -8 cellules traité par ALGpH7 254 + 31 -3,1 % 96 % et irradié Tableau II Nombre moyen Variation et taux de cellules de de variation du Effet immuno Série Langerhans par nombre de modulateur d'échantillons cm d'épiderme cellules de + SEM Langerhans par cm d'épiderme aprés irradiation témoin 151f14 -93 cellules mrearerf témoin irradié 58 + 7 -61,6 % traité par ALGpH4 303 + 18 et non irradié +23 cellules traité par ALGpH4 326 +20 +7,6 % 124.7 % et irradié Il apparaît à la lecture des tableaux I et II que les produits ALGpH2 et ALGpH4 selon l'invention ont un effet immuno-modulateur absolu, c'est-à-dire qu'ils protègent totalement les cellules de Langerhans contenues dans l'épiderme, suite à l'irradiation de ce dernier aux rayons ultraviolets. II apparaît également que le produit selon l'invention ALGpH7 a un effet immuno-modulateur très important, en sorte qu'il permet d'obtenir une protection quasi-totale des cellules de Langerhans vis-à-vis des rayonnements ultraviolets. Des expériences similaires ont été menées pour le produit correspondant au second mode de réalisation de l'invention. Ces expériences ont également permis d'établir l'effet immuno-modulateur dudit produit, qui protège de manière satisfaisante les cellules de Langerhans. Par conséquent, I'activité macrophage desdites cellules est préservée grâce au produit selon l'invention et la protection de l'épiderme vis-à-vis des agressions extérieures est améliorée. On notera que l'exposition de l'épiderme aux rayonnements ultraviolets constitue un simple test permettant de valider l'activité immuno-modulatrice du produit selon l'invention. On pourrait également utiliser à cet effet un test de dosage d'interleukines l-a, par exemple. ANNEXE I. Détermination du degré de polymérisation moyen en nombre d'un extrait d'alginate de sodium dépolymérisé par un traitement à l'alginate lyase par dosage des doubles liaisons conjuguées: L'alginate lyase est une enzyme qui dépolymérise l'extrait d'alginate de sodium en générant des doubles liaisons conjuguées et des fonctions hémi-acétaliques réductrices. Ces doubles liaisons conjuguées présentant un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 235 nm, on procède à leur dosage par spectrophotométrie ultraviolette, de manière à pouvoir quantifier le nombre de moles d'oligo-alginates produites dans le volume de solution. On prélève une quantité donnée de milieu réactionnel à des moments différents de la réaction enzymatique, et l'on procède à l'ajustement du pH de la solution prélevée afin de ralentir ladite réaction. Dans cet exemple de réalisation, chaque prélèvement de milieu réactionnel est caractérisé, d'une part, par une masse de 10 g et un pH ajusté à 4 avec de l'acide chlorhydrique de concentration 1 N. De plus, ladite solution prélevée est diluée pour que sa densité optique soit inférieure à 1. On mesure la densité optique (DO) de ladite solution pour un rayonnement de 235 nm, ce qui permet de doser la concentration Cliaisons (mol. 1-1) des doubles liaisons conjuguées, grâce à la relation: DO (i) Cliaisons = Cliaisons= E où E (50501. mol-l. cm-l) représente le coefficient d'extinction moléculaire des oligo-alginates insaturés. En tenant compte des dilutions pratiquées, il est possible de mesurer la concentration en doubles liaisons conjuguées dans le milieu réactionnel de départ. De plus, connaissant la concentration pondérale d'alginate Calginate dans la solution (en g. I-I), on obtient la masse molaire moyenne en nombre Mn (g. mode1) des échantillons prélevés au moyen de la relation Calginate (ii) Mn = Mn= Cliaisons On en déduit le degré de polymérisation moyen en nombre DPn au moyen de la relation suivante: où Mg désigne la masse molaire d'une unité constitutive de la molécule d'alginate de sodium (Mo = 216 g. mol-1). II. Détermination du degré de polymérisation moven en nombre d'un extrait d'alginate de sodium dépolymérisé au moyen d'une hydrolyse en milieu acide. par la méthode du dosage des sucres réducteurs (méthode dite de SOMOGYI-NELSON): L'hydrolyse acide de l'alginate génère une fonction hémi-acétalique réductrice et une fonction hydroxyle. On procède au dosage de ladite fonction réductrice au moyen des solutions suivantes: Solution A: Carbonate de sodium anhydre: 25g. Tartrate de sodium et de potassium: 25g. Hydrogénocarbonate de sodium: 20g. Sulfate de sodium anhydre: 200g. On dissout ces quatre composés dans 1 I d'eau ultra-pure. Solution B: Sulfate de cuivre monohydraté: 30 g. Acide sulfurique concentré: 4 gouttes. On dissout l'ensemble dans 200 ml d'eau ultra-pure. Solution C: Obtenue par l'adjonction de 25 volumes de la solution A à un volume de la solution B. Solution D: Molybdate ammoniacal: 25 g. Acide sulfurique concentré: 39 g. Arséniate de sodium: 3 g. On dissout l'ensemble dans 500 ml d'eau ultra-pure. Le principe de cette méthode repose sur le fait que ladite fonction hémiacétalique est oxydée par le cuivre et génère de l'oxyde cuivreux, lequel réagit avec le complexe arsénio-molybdique pour produire un oxyde de molybdate. Le mode opératoire suivi est décrit ci-dessous: On ajoute 1 ml de la solution C à I ml de la solution à doser dans un tube à essai, et l'on chauffe pendant 20 min au bain-marie le mélange obtenu. On refroidit ensuite rapidement ledit mélange en versant de l'eau courante sur ledit tube. Puis on ajoute successivement audit mélange I ml de solution D et 12 ml d'eau ultra-pure. L'oxyde de molybdate produit présentant une absorption maximale pour un rayonnement de longueur d'onde égale à 660 nm, on mesure la densité optique de la solution obtenue à cette longueur d'onde. Les calculs permettant de déterminer la masse molaire moyenne en nombre et d'en déduire le degré de polymérisation moyen en nombre de l'alginate hydrolysé sont les mêmes que ceux qui ont été exposés au Paragraphe I. REVENDICATIONS 1) Procédé d'élaboration d'un produit destiné à prévenir et à soigner des maladies de la peau, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser un extrait naturel d'alginate de sodium et à soumettre ledit extrait à au moins un traitement de dépolymérisation. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet ledit extrait à un traitement de dépolymérisation enzymatique au moyen d'une alginate lyase. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, ultérieurement audit traitement enzymatique, I'on soumet ledit extrait dépolymérisé à une hydrolyse en milieu acide. 4) Produit destiné à prévenir et à soigner des maladies de la peau, ledit produit étant obtenu par un procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend des enchaînements d'oligo-alginates et d'acides uroniques. 5) Produit selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend également des extraits naturels d'algues du type chlorella. 6) Produit selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il est prévu pour protéger des rayonnements ultraviolets les cellules de Langerhans de l'épiderme.