Brevet FR2749308A1 — publié le 19971205

La présente invention a pour objet un procédé, des sondes et des kits pour déterminer le génotype HLA DQ bêta (DQB) d'un individu. Les procédés, sondes et kits de l'invention se rapportent plus particulièrement à la détection des gènes polymorphes HLA DQB i. Ces procédé, sondes et kits de l'invention sont notamment applicables au typage HLA en transplantation, au diagnostic médical, à la médecine légale, mais la présence ou l'absence d'allèles EA DQBI peut également servir comme indicateur de la sensibilité à certaines maladies, telles que le diabète insulino-dépendant. Le système HLA (antigène des lymphocytes humains) est codé par le complexe d'histocompatibilité majeur chez l'homme. Il constitue une contrainte très importante au cours des transplantations d'organes entre les individus en effectuant une distinction entre le soi et le non soi. Les antigènes du système WA ont donc été utilisés dans des procédés de typage pour déterminer les caractéristiques entre donneur et receveur lors de transplantations d'organes, ainsi que la prédisposition d'un individu à certaines maladies. D'un point de vue génétique, le système HLA est bien caractérisé et consiste en un ensemble de loci plus ou moins polymorphes situés dans un intervalle d'environ 2 centimorgans sur le bras court du chromosome 6. Trois loci dans ce système (HLA-A, B et C) codent pour une classe d'allo-antigènes exprimés de façon co-dominante (Classe I). Une autre région (HLA-D) qui contient en fait plusieurs gènes code pour une seconde classe d'allo-antigènes exprimés de façon co-dominante avec un degré important de polymorphisme (Classe II). Plusieurs autres loci qui contrôlent notamment les composants C 2, C 4 et le facteur Bf de la cascade du complément appartiennent également au système HLA (Classe III). Le succès des greffes d'organes dépend dans une grande mesure de l'identité HLA (Classes I et II) entre receveur et donneur. En conséquence, le typage fILA doit être le plus exact possible. Ce besoin concerne principalement les transplantations de reins et les greffes de moelle osseuse. Dans le cadre de la greffe de moelle osseuse, l'identité parfaite au niveau des antigènes HLA Classe II représente un facteur déterminant pour le succès de la greffe, c'est à dire pour éviter un rejet du greffon ou le développement d'une maladie greffon-contre-hôte. Le polymorphisme des produits d'expression des gènes de la région HLA-D était défini habituellement par des techniques sérologiques basées sur l'analyse par des allo-antisera des produits des gènes HLA exprimés à la surface des cellules. Cependant, même dans les meilleures conditions, un grand nombre d'allèles existants ne sont pas détectables par ces techniques sérologiques. Les polymorphismes au niveau du locus HLA DQBI ont été détectés en utilisant des réactifs de typage sérologique qui définissent les spécificités DQ wl, 2, 3 et 4 (WHO Nomenclature Committee, 1990). La spécificité DQ wl a été ensuite subdivisée en sous-types sérologiques DQ wS et 6, et DQ w3 a été subdivisée en DQ w7, 8 et 9. Cependant, avec les techniques de sérotypage utilisées en routine, seulement les spécificités DQ wl, DQ w2 et DQ w3 peuvent être distinguées. Grâce à la biologie moléculaire, on sait maintenant qu'il existe un plus grand nombre de gènes HLA qu'on ne le supposait auparavant et, surtout, beaucoup plus d'allèles différents. Cette diversité est maintenant caractérisée au niveau des séquences d'ADN des différents gènes et allèles. Les structures, séquences et polymorphismes connus dans la région HLA-D ont été répertoriés par TROWSDALE et ai, 1985. Immunol. Rev. 85 : 5-43. L'analyse génotypique est une nouvelle approche permettant d'analyser la diversité du système HLA Classe II, et en particulier HLADQ, directement au niveau des gènes. L'analyse génotypique est basée sur le principe de l'hybridation moléculaire et la première approche qui fut proposée est la technique dite "RFLP" qui consiste à fragmenter l'ADN par utilisation d'enzymes de restriction et à analyser la taille des fragments obtenus ; voir par exemple le brevet US 4 582 788. L'approche RFLP est utilisable pour l'identification de 7 spécificités DQ. Cependant, l'analyse par RFLP ne permet de reconnaître que certaines des différences alléliques indétectables par la sérologie, et les possibilités offertes par cette technique sont limitées. En effet, un allèle est identifiable seulement si la mutation qui le caractérise est située dans le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction utilisée et ainsi un grand nombre d'allèles ne sont pas reconnus par cette analyse. De plus, l'analyse RFLP met rarement en évidence une modification dans une séquence codante et ne fournit pas d'informations sur la nature exacte de la modification. Enfin, cette technique est longue et difficile à mettre en oeuvre. Une autre technique d'analyse génotypique de HLA Classe II a été proposée, qui est la méthode dite "de typage par oligonucléotides" : grâce à la connaissance des séquences d'ADN des gènes HLA Classe II et en particulier des gènes DQ B, on utilise comme traceurs pour l'analyse du polymorphisme des oligonucléotides qui s'hybrident spécifiquement en un site donné de la séquence du gène. Ces oligonucléotides sont choisis de façon que leur hybridation ou leur absence d'hybridation fournisse le plus grand nombre possible d'informations et permette l'identification des différents allèles, sur la base de leurs différences de séquence. Toute différence de séquence, même celles portant sur un seul nucléotide, doit pouvoir être détectée. La technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la publication d'ANGELINI et ai Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol. 83 : 44894493 (1986), qu'à l'ARN (voir C. UCLA, J. J. VAN ROOD, J. GORSKI, B. MACH (1987) J. Clin. Invest. 80, 1155). Les méthodes d'amplification d'acides nucléiques, telles que la PCR, ont facilité l'analyse de l'ADN HLA Classe II d'un individu. La première application de typage par oligonucléotides pour le HLA Classe II a été présentée par ANGELINI et al dans la publication précédemment citée, avec utilisation de la technique dite "SOUTHERN" selon laquelle l'ADN cible est déposé sur une membrane de nylon et la détection est effectuée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique marquée. La technique a ensuite été appliquée à la détection d'allèles HLA Classe II non identifiables par sérologie de routine (Voir J.M. TIERCY, J. GORSKI, M. JEANNET et B. MACH (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 198 et J.M. TIERCY, J. GORSKI, H. BETUEL, A.C. FREIDEL, L. GEBUHRER, M. JEANNET et B. MACH (1989) Human Immunol. 24, 1). Une autre application directe au typage HLA Classe II est celle décrite dans la demande de brevet PCT WO 89/11547 utilisant la technique dite "Dot Blot". La méthode dite "Reverse Dot", qui consiste à fixer sur une membrane de papier ou de nitrocellulose, une sonde nucléotidique et à effectuer la détection d'une hybridation avec une cible marquée, a été appliquée au typage HLA DQ A et à la détection des mutations de la bêta-thalassémie méditerranéenne (R.K.SAIKI et ai Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol : 86, p. 6230-6234 ; (1989)). Le typage cellulaire nécessite la détection de mutations ponctuelles dans le génome et implique la mise au point de sondes suffisamment sensibles pour détecter et différencier des séquences homologues à un nucléotide près. On utilise pour cela des sondes de courte taille, généralement de moins de 30 nucléotides, qui confèrent au test une grande spécificité, tout en conservant une bonne sensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides de courte taille permet de disposer d'un grand éventail de sélectivité. Par ailleurs, il est souhaitable de mettre au point un procédé de typage qui non seulement présente une grande spécificité et une bonne sensibilité, mais qui de plus soit simple à mettre en oeuvre, d'exécution rapide, peu onéreux et facilement automatisable. La présente invention concerne un procédé, ainsi que des sondes et des kits pour le typage HLA DQB 1 qui répondent à ces exigences. Le procédé de l'invention peut être utilisé pour typer des échantillons hétérozygotes d'origines diverses, incluant des matrices d'ADNc, et peut être utilisé pour détecter des variants alléliques qui ne peuvent pas être distingués par les méthodes sérologiques conventionnelles. Les sondes de l'invention qui seront définies ci-après, peuvent être utilisées sous la forme de sondes de détection (marquées avec un agent traceur usuel) dans les techniques de type Southern, ou, de préférence, sous la forme de sondes de capture (technique Sandwich ou Reverse Dot Blot) immobilisées sur un support solide. Le système de typage de la présente invention utilise de préférence le protocole dit "sandwich", tel que décrit à l'origine par DUNN A.R, HASSEL J. A. (Cell, 12, 23, 1977) et qui consiste à utiliser une première sonde nucléotidique, appelée sonde de capture, fixée sur un support solide, et spécifique du gène cible de l'échantillon, ainsi qu'une deuxième sonde, marquée, appelée sonde de détection, complémentaire d'une autre région de la cible et permettant la détection d'une hybridation par révélation à l'aide du marqueur. Dans le système de la présente invention, le marqueur est par exemple une enzyme telle que la peroxydase de raifort, étant entendu que tout autre marqueur approprié peut être utilisé. Le procédé de l'invention est fondé sur la sélection de sondes oligonucléotidiques dont la longueur et la composition ont été choisies non seulement pour leur conférer la spécificité et la sensibilité nécessaires, mais aussi de façon à permettre leur utilisation à une température déterminée. Ainsi, le système de typage de la présente invention présente notamment l'avantage de permettre d'opérer à une température unique de 37"C + 20C. Il est toutefois évident que, même dans le cas de sondes destinées à détecter, à une température donnée, des mutations ponctuelles, il est possible d'envisager l'utilisation de sondes dont la longueur peut varier dans une certaine mesure, grâce notamment à l'emploi de solutions tampons favorisant plus ou moins la stabilité des complexes d'hybridation. Les sondes de l'invention sont donc définies par une séquence dont la longueur pourra généralement être considérée comme maximum, en particulier si on souhaite travailler à une température avoisinant 37"C, mais différente de 37"C (ce qui est souvent le cas en pratique compte tenu des erreurs d'étalonnage de la température), avec en outre l'indication d'une séquence optimum pour une température de 37"C. Il est évident pour les spécialistes qu'à chaque sonde oligonucléotidique particulière correspond une sonde complémentaire qui, bien entendu, est capable de jouer le même rôle en tant que sonde de capture ou de détection. L'invention s'étend donc aux sondes ayant une séquence complémentaire de celle des sondes décrites ci-après, et aux procédés utilisant ces complémentaires. L'invention a pour objet des sondes ayant une séquence nucléotidique choisie pour répondre aux exigences précitées. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des sondes nouvelles, dont l'utilisation combinée permet d'effectuer la discrimination entre différents alléles et même d'identifier si nécessaire les différentes spécificités HLA DQ connues à ce jour (Nomenclature for factors of the HLA system, 1995, Bodmer Julia G et al. Tissue Antigens 1995, 46, 1-18). Les sondes nucléotidiques de l'invention sont choisies notamment parmi celles qui sont représentées ci-après (la séquence lue de gauche à droite va de l'extrémité 5' à l'extrémité 3'). Les lettres représentent les nucléotides (ou bases) selon la nomenclature habituelle. La séquence soulignée représente la séquence optimale dans les conditions opératoires préconisées selon l'invention. Les sondes contiennent donc au minimum la séquence soulignée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies parmi les bases non soulignées, c'est-à-dire, selon les cas (et en respectant bien entendu la continuité de la séquence), soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 5', soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 3', soit encore une base supplémentaire à l'extrémité 5' et une base supplémentaire à l'extrémité 3' On sait en effet qu'il est possible de modifier la longueur des sondes utilisées en fonction des conditions opératoires qui permettent de faire varier les forces de liaison d'hybridation, telles que les températures d'hybridation et de lavage, et la nature des tampons d'hybridation et/ou de lavage. L'introduction dans les sondes de bases modifiées (par exemple inosine) peut jouer un rôle analogue. Les sondes de l'invention sont notamment choisies parmi les suivantes (pour chaque sonde, on a indiqué les spécificités reconnues) TG CGT TAT GTG ACC AGA (26B), qui reconnaît les spécificités DQBI 06011, 06012, 0301, 0304, GTG CGT CTT GTG ACC AGA (26C) : spécificités DQB1 0602, 0302, 03032 GT CTT GTA ACC AGA CAC AT (26D): spécificités DQBI 0603, 0604, 0607, 0608, CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT (26F): spécificités DRQBI 06051, 06052, 0606 et 0609, CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT (26E): spécificités 0201,0202, GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G (23A) : spécificité DQB1 0401, G TAC CGG GCA GTG ACG C (49A): spécificité DQB1 0501, G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G (55A): spécificités DQB1 0301, 0302, 03032, 0304, 0305, G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G (55'A): spécificités DQB1 0301, 0302, 03032, 0304, 0305, G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T (70A) : spécificités DQB1 0602, 0603, 0608, G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T (70'A): spécificités DQBI 0602, 0603, 0608, TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C (70B) : spécificités DQB1 0401,0402. Bien entendu, la distinction entre certaines spécificités pourra etre effectuée, si désiré, à l'aide d'autres sondes utilisées comme sondes supplémentaires, comme le montre aisément l'examen des tableaux 1 et 2 annexés. Les nouvelles sondes de l'invention comprennent aussi les sondes HRP I et HRP 2 qui seront définies ci-après. Dans les séquences des sondes oligonucléotidiques décrites ci-dessus, I symbolise l'inosine. L'inosine est un nucléotide non naturel utilisé dans certaines sondes de l'invention, pour augmenter le pouvoir discriminant d'une sonde en déstabilisant davantage les hybrides que forme cette sonde avec des séquences d'acide nucléique non strictement identiques à celle de la cible recherchée dans l'échantillon avec cette sonde. Dans la description de la présente demande, les appellations arbitraires comprenant un nombre suivi d'une lettre, telles que 23A, 26A, 26B, etc., ou des lettres suivies d'un chiffre (telles que HRP 1), désignent globalement toutes les sondes ainsi définies (celles comprenant uniquement la séquence soulignée et celles comprenant en outre une ou deux bases supplémentaires non soulignées), sauf dans la partie expérimentale ci-après et dans les tableaux annexés où ces appellations désignent uniquement les sondes ayant la séquence optimale soulignée. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour déterminer au moins partiellement le typage DQB 1 d'un acide nucléique présent dans un échantillon, dans lequel on effectue des essais d'hybridation, selon les méthodes connues, dudit acide nucléique de l'échantillon avec des sondes oligonucléotidiques, et dans lequel on retient comme essais positifs les essais pour lesquels on observe effectivement une hybridation à une température unique égale à 37+2 C, lesdites sondes oligonucléotidiques comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe consistant en TG CGT TAT GTG ACC AGA (26B), GTG CGT CTT GTG ACC AGA (26C), GT CTT GTA ACC AGA CAC AT (26D), CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT (26F), CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT (26E), GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G (23 A), G TAC CGG GCA GTG ACG C (49A), G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G (55A), G GAG GGI ACC CIG GCl GAG T (70A), TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C (70B), ou leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes contiennent au minimum la séquence soulignée et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées. L'invention concerne également un procédé tel que défini précédemment, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec au moins une des sondes suivantes ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG (26A), spécificités DQBI reconnues: 0501, 0502, 05031, 05032, 0603, 0604, 0607, 0608, GG CCT GTT GCC GAG TAC T (57A), spécificités DQBI reconnues: 0501, 0604, 06051, 0606, 0608, 0609, CGG CCT AGC GCC GAG TAC T (57B), spécificités DQB1 reconnues: 0502, 0504, CGG CCT GAT GCC GAG TAC (57C); spécificités DQBI reconnues: 05032, 0602, 0603, 0607, et éventuellement GC GAC GTG GAG GTG TAC CG (45A), spécificités DQBI reconnues: 0301, 0304, A GAG GAG GAC GTG CGC TT (37A), spécificités DQB1 reconnues: 06011, 06012, ou leurs complémentaires. Bien entendu, les essais retenus comme positifs sont encore ceux indiqués précédemment. Dans le procédé de l'invention, les conditions d'hybridation utilisées sont évidemment des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produise, à la température unique choisie, que si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde. Ces conditions peuvent être déterminées par de simples expériences de routine. La cible est bien entendu l'acide nucléique présent dans l'échantillon et contenant des régions polymorphes de gènes HLA DQ d'un individu. Les spécialistes comprendront aisément que les diverses sondes utilisables dans le procédé de l'invention peuvent être, selon les techniques choisies, soit des sondes marquées, soit des sondes couplées à un ligand destiné à faciliter leur fixation sur un support solide, soit encore des sondes déjà fixées sur un support solide. En particulier, les sondes peuvent être soit immobilisées, soit immobilisables, selon les méthodes connues, sur des supports solides, et sont alors utilisables comme sondes de capture. Selon un mode de réalisation particulier, on effectue les essais d'hybridation en utilisant les sondes indiquées ci-dessus comme sondes de capture, c'est-à-dire fixées à un support solide. Pour révéler la présence éventuelle d'acide nucléique, fixé sur le support solide par hybridation avec une sonde de capture donnée, on peut utiliser une sonde de détection marquée capable de s'hybrider avec une région de la cible autre que celle reconnue par ladite sonde de capture. On peut utiliser notamment des sondes de détection choisies parmi les suivantes (la partie soulignée correspond comme précédemment à la séquence minimale) GG ACG GAG CGC GTG CG (HRP1), C ATC TAT AAC CGA GA (HRP2), CGC TTC GAC AGC GAC GTG G (HRP3). L'examen du tableau I annexé permet de déterminer aisément lesquelles, parmi ces sondes de détection, sont utilisables avec une sonde de capture donnée. Selon le procédé de l'invention, l'identification d'un allèle peut être déduite à partir d'un modèle de liaison d'un ensemble de sondes, chaque sonde individuelle de l'ensemble étant spécifique de différentes parties du gène HLA DQ. Grâce au choix de plusieurs sondes, le procédé de typage par oligonucléotides de la présente invention permet d'identifier si désiré tous les alléles DQB 1 Au cas où de nouveaux alléles seraient découverts, ceux-ci seraient alors répertoriés dans un registre de séquence HLA Classe II, permettant d'actualiser la collection de sondes spécifiques à l'aide de sondes supplémentaires, et donc d'adapter la méthodologie à la détection de tout nouvel allèle. Pour rationaliser le typage HLA Classe II complet, on peut effectuer tout d'abord une première étape de typage DQB, lequel permet, avec un nombre déterminé de sondes, d'identifier les principales spécificités HLA DQB. Cette étape est souvent suffisante pour un grand nombre d'applications cliniques. Toutefois, la présente invention permet également une deuxième étape du typage DQB qui, avec un nombre plus important de sondes, permet de reconnaître toutes les spécificités HLA DQB connues à ce jour. L'analyse des spécificités HLA DQB par la technique de typage par oligonucléotides de la présente invention peut être appliquée dans les laboratoires d'histocompatibilité pour le typage DQB de routine, en remplacement de la sérologie, notamment pour effectuer le typage DQB de patients en liste d'attente pour une greffe rénale ou le typage de donneurs de reins potentiels, le typage DQB de patients leucémiques, pour lesquels une greffe de moelle osseuse est envisagée, ainsi que le typage des membres de leur famille ou des donneurs potentiels non apparentés, les typages DQB à grande échelle pour la constitution de registres de donneurs de moelle volontaires, ou pour déterminer des associations entre des maladies et le système HLA, par exemple dans le cas du diabète insulino-dépendant, pour des applications en médecine prédictive ou encore pour des recherches de paternité et autres identifications judiciaires. Tout type de tissu contenant de l'acide nucléique FILA DQB peut être utilisé comme échantillon dans le procédé de l'invention. Il est aussi possible d'utiliser des fragments d'acides nucléiques (ADN ou ARN) obtenus après coupure chimique, enzymatique ou analogue de l'acide nucléique présent dans un échantillon. Cependant, en pratique, une étape préalable d'amplification de l'ADN ou de l'ARN doit être effectuée. L'invention a également pour objet un kit pour le typage HLA DQB1 d'un individu, ledit kit comprenant l'une au moins des sondes suivantes : 26B, 26C, 26D, 26F, 26E, 23A, 49A, 55A, 70A, 70B, HRP1 et HRP2, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi 26A, 57B, 57C, 37A, 45A, 57A et HRP3. L'invention concerne en particulier un kit comprenant les sondes (notamment sondes de capture) suivantes : 26B, 26C, 26D, 26E, 26F, 23A, 49A, 55A, 70A, 70B , 26A, 57B, 57C, 37A et éventuellement l'une au moins des sondes 45A et 57A. Ce kit peut contenir en outre une ou plusieurs sondes de détection choisies parmi HRPI, HRP2 et HRP3. Les informations recueillies grâce à l'emploi de ces sondes sont ensuite utilisées pour déterminer le typage en fonction d'un plan de typage établi, tenant compte des sondes utilisées et de la connaissance des types HLA DQB et/ou sous types associés répertoriés. Ce travail est simplifié par l'utilisation d'un plan de typage, c'est à dire un tableau donnant directement les types et/ou sous types en fonction des réponses positives (hybridations) observées. Pour l'ensemble des sondes de la présente invention un tel tableau est représenté dans le tableau 3 annexé. Les sondes utilisées dans la présente invention sont des oligonucléotides spécifiques d'une séquence (OSS) qui, dans des conditions appropriées, peuvent se lier spécifiquement à leur séquence complémentaire. Si une sonde particulière peut être utilisée pour identifier uniquement un allèle, la sonde est alors appelée OSA c'est à dire oligonucléotide spécifique d'un allèle. Comme déjà remarqué précédemment, il est possible qu'une seule sonde ne soit pas capable d'identifier à elle seule un allèle spécifique DQ B. On donne ci-après quelques définitions de termes utilisés dans la présente demande: "Génotypique" fait réfërence aux caractéristiques du génome d'un individu par opposition au "phénotype" qui est une caractéristique d'un individu telle qu'elle ressort de l'analyse des produits d'expression des gènes, notamment les protéines. "Alléle" désigne les différentes formes alternatives d'un meme gène qui présente des différences au niveau de la séquence nucléique. Ces différences se manifestent au niveau de l'ADN, de l'ARN et de leur traduction en protéines. "Polymorphisme" caractérise la diversité introduite dans une population par l'existence d'allèles différents pour un même gène. "Oligonucléotide" tel qu'utilisé ici désigne des amorces, des sondes ou des fragments d'acide nucléique devant être détectés... Les oligonucléotides peuvent être préparés par toute méthode appropriée connue. Dans la présente description et dans la partie expérimentale qui suit, il est fait référence aux tableaux 1 à 4 annexés. il convient d'attirer l'attention sur le fait qu'une même appellation de sonde (telle que 26A, HRP3, etc.) peut désigner non seulement une séquence permettant de définir plusieurs sondes avec indication d'une séquence minimum soulignée (comme c'est le cas dans la description ci-dessus), mais aussi une séquence correspondant à la séquence minimum soulignée (comme c'est le cas dans les exemples ci-après et dans les tableaux 1 à 4 annexés). On a représenté dans le tableau 1 annexé les alignements de l'ADN des différents allèles du gène DQB dans le but de définir les positions des mutations correspondant à des mutations d'acides aminés (désignés à l'aide du code à une lettre) représentées dans le tableau 2, par rapport à la séquence consensus choisie, qui est DQBI*0501. Les mutations de l'ADN peuvent être des mutations non silencieuses, c'est à dire des mutations dont la traduction conduit à un changement d'acide aminé. Dans le cas de typage des différents allèles, on utilise le plus souvent les mutations sur l'ADN correspondant aux mutations non silencieuses, qui sont évidemment les plus importantes, mais il est possible de détecter une mutation de type silencieux, par exemple dans le but de différencier deux allèles très proches. Dans les tableaux 1 et 2, on a représenté les alignements en nucléotides et acides aminés du gène DQB I pour tous les alléles connus et publiés dans la littérature connue à ce jour. Le tableau 3 annexé résume la correspondance entre les sondes et les spécificités reconnues : lorsque sur une ligne, une case est noircie, cela signifie que la spécificité mentionnée à cette ligne est reconnue par la sonde de la colonne correspondante. Le tableau 4 annexé reprend la correspondance entre sonde et spécificités HLA DQB 1 avec en outre l'indication des mutations silencieuses ou des acides aminés variants. Les exemples suivants illustrent l'invention. Erentple 1: On a préparé diverses sondes liées à un ligand favorisant leur fixation sur un support solide. Le ligand utilisé est un composé disponible dans le commerce, dénommé Aminolink 2, et commercialisé par la société Applied Biosystems sous la référence 400808. Le couplage du ligand à un oligonucléotide est effectué selon le protocole général suivant Un oligonucléotide est synthétisé sur un appareil automatique 381 A de la société Applied Biosystems en utilisant la chimie des phosphoramidites selon le protocole du constructeur. Le ligand phosphoramidite dissous dans de l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,2M est placé en position X du synthétiseur et l'addition du ligand se fait par l'extrémité 5' de l'oligonucléotide selon le protocole standard de la synthèse automatique lorsque la synthèse de l'oligonucléotide est achevée. Après déprotection une nuit à 550C dans une solution d'ammoniaque à 33 %, suivie d'une précipitation dans de l'éthanol à -20 C, l'oligonucléotide modifié (lié au ligand) est séché sous vide et repris dans 1 ml d'eau. L'oligonucléotide modifié à son extrémité 5' est purifié par chromatographie liquide haute performance en phase inverse sur une colonne de Brownlee RP 18 (iOmm-25cm). Conditions: débit 4,6 ml/min Gradient 10 % à 35 % de tampon A en 30 min. 35 % à 100 % de tampon B en 3 min. Tampon A : 0,1 molaire Triéthylammoniumacétate (TEAA), pH 7 Tampon B . 50 % Tampon A + 50 % CH3CN. Eveniple 2 : Prépar Exemple 3: Amplification de l'ADN cible. L'amplification est réalisée par PCR en utilisant les amorces suivantes - amorce 1 : 5'C ATG TGC TAC TTC ACC AAC GG 3' - amorce 2: 5' CTG GTA GTT GTG TCT GCA CAC 3' Ces amorces sont désignées dans le tableau 1 par les appellations DQBAMP-A et DQBAMP-B. Exemple 4: Dans les puits d'une plaque de microtitration (Nunc 43454) sont déposés 100 l d'une solution d'un oligonucléotide de capture d'une spécificité DQ donnée (à raison d'un oligonucléotide de capture par puits) à une concentration de 10 à 400 nM dans du PBS 3 x (0,45 M NaCI, 0,15 M phosphate de sodium, pH 7). On utilise donc autant de puits que de sondes de capture nécessaires pour le typage. Les plaques sont incubées pendant 2 heures à 37 C ou pendant 15 à 22 heures à température ambiante. Dans tous les cas un contrôle positif est ajouté afin de vérifier l'étape d'amplification et celle de détection. La sonde de capture qui est utilisée comme contrôle positif (désignée par C+) est présente sur tous les alléles connus à ce jour. Sa séquence est la suivante S'GAGTACTGG AACAGCCAGAAGGA3'. Une sonde de capture est utilisée comme contrôle négatif (désignée par C-) et a la séquence suivante. 5' TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC 3' La plaque est lavée trois fois avec 300 Ill de PBS Tween (0,15 M NaCl, 0,05M phosphate de sodium, pH 7 ; 0,5 % Tween 20 (Merck 822184). Le produit d'amplification est dénaturé dans 10 l de NaOH 2N pendant 5 min à température ambiante. 10 pl d'acide acétique 2N puis 2,3 ml de tampon d'hybridation (PEG : Phosphate de sodium 0,1M, pH 7, NaCI 0,5M, Tween 20 0,65 %, ADN de sperme de saumon (Sigma D 9156) 0,14 mg/ml, PEG 4000 (Merck 807490 2 %) et 0,25 ml d'une sonde de détection marquée (conjugué oligonucléotideperoxydase) sont additionnés successivement à cette solution. La solution finale est répartie dans chaque puits à raison de 0,1 ml par puits. Les plaques sont incubées pendant 60 min. à 370C. Les plaques sont lavées trois fois avec 300 ol de PBS Tween. 100 ol de substrat orthophénylènediamine (OPD) (Cambridge Medical Biotechnology ref. 456) dans un tampon OPD (0,05 M acide citrique, 0,1 M Na2HP04, pH 4,9) à la concentration de 4 mg/ml, auquel est additionné extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30 volumes dilué au 1/1000, sont ajoutés par puits. Après 20 min. de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 Ill d'H2S04 IN et la lecture est effectuée à 492 nm. exemple 5: 10 ADN sont amplifiés selon la technique PCR. On effectue ensuite le typage. Le protocole de typage est généralement conforme à celui décrit ci-dessus. On effectue les hybridations selon la méthode sandwich. Le protocole de typage utilise les sondes de capture indiquées ci-après et, selon les cas, les sondes de détection HRPI, HRP2 ou HRP3. La méthode décrite permet de typer les 10 ADN testés. Quelques résultats de typage sont donnés ci-après à titre d'illustration. Cas n" 1 Sondes DO x 1000 (492 nm) 26A 15 49A 12 57B 38 57C 12 37A 12 26B 100 26C 1309 26D 10 26F 18 70A 32 26E 55A 316 70B 12 23A 13 **** signifie : saturation Résultat : Le patient est DQB1*0201 ou 0202/0302 ou 0303 Cas n 2 Sondes DO x 1000 (492 nm) 26A 887 49A 12 57B 459 57C 11 37A 57 26B 80 26C 10 26D 14 26F 10 70A 14 26E 11 55A 11 70B 688 23A 302 Résultat : Le patient est DQB1*0502/0401 Tableau 1 I . . . . . .-f;i. , I ! I i i i I i ii o i i i i i i i i i $ i ! 7 i i i g Wi i iiii ~ fil i- ii 'o 20 30 III AGA GAC Ta i GAG GAT TTC GTG TAC CAG TTT AAG i TGC TAC | ACG GAG CGC GTG CGT. GTG A AGA CAC ATC TAT AAC CGA DQBI*0S02 -.------- 26A DQBI*0S031 w. s s S . O i i; É)GGÉÈ T o - ;I1 DQI'O5OII i a ~~~~ iX i 26B ZIZI C A --T -. T DQBi '0602 A 26C --T a -A--I----- DQAI'0003 A --T a -A -. DQBI'O6O4 A - --T a --A DQSI'O6O.'I A -. T DQ9I'o6O. z z zz -. z |6 6 > 2 a 0 Z F F e > A Lw T le e s~ A -. 26D--T a -A - DQBI'06O A -. -- -T a -A -. 26A Xi i -. 2 B ~r i 0 Z | g E i " é i | i!iiiiiiiiiiiiii DQBI'030I -. C A - 26B -T TA DQBl'0302 - A- -Ta - - T -. - - 26C 21 ! i i ! ! i i i i .5 .: i I i i I I i i i I i i e; ; - A i I ; i i i T i -. .-- - DQBIO2 i i i i-. i, i i i i: i i i i i, i L! 1 t E i i Z ! i i i i ! . . i i i i i i, i " " W ! EJ . é g i i . ! i E i i é é R R R R R oe eo Fo o, > o, Fo o XoO o 2 2 R e R F F P F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F iF g m m m m m m m m m m m m m m g g g g g g g g Tableau 1 - suite - 5 1 : 57A 5 O G GAG TAC y COC | OAC GTO 000 aTO C CaO , OTO AC CCG CAG CCT OTT Oc C T TOc AAC AOC CAO AAO O GTC ao i i: t t t i i i I t i . !: i i i I i l; i I DQBI.o3031 -- - -T -G AC DOS! *03032 - T --- 5?C DQBI*06OII G-. - -T --G - -AC - DQBI t i i i i i i i i i i i: J Iol 5 , F ~ i . t i t C AC | i - i | A t DOSIO2 C- -. -C - - A DOS!*0504 C- - - -G 57A - DOB!w)603 -C --C --G 57c --- DOB!*050 i ... i i t --- -- t t i t i I i DOI*05O9 . . G - 5?A DQSI*0201 AT -A -T z z g i CC ; 4 ! i w 9 y ti ; tt DOS!*0202 AT i CC i i --- ! i t t é DOB!*0304 CA -- - - 5A - --. c 5A DOBI*030I A 0 n -~~~~~ le v w w w v ; s DOBI*0302 ! ! i i } t i I t i i i DOBI*03032 -CA - T --- c : -. DOBI*0303 C T -- c -- C- C - -. iiiii C- - i S 0 i i é T- é é é é é é é é ' C- ' -- é -- é -- T E s T- E s -T- -AC s - - - -T - - - A- s S iD i ; ; i i i 2 LS i ;; ; i i, i bl; i i i S y O y 7 y l S F F ' ''. F 7 Y Y Y Y Y Y Y Y Y t } i i i i 9, 8 . i i W s g Ie e E e e, S é é ~ e e. ~ e e, e c i ii i iii i i i i i i i i i i i i t g ! . i i . i i i i i i i i t ! i iW i ! i i i i Wi i i : i } i 5 QY i &verbar; i i i t i i i i i t) i ; i Z i i ! i i i O E . Q 'J ' y tJ 9 9 jm . . F 1 . i i e i s ! ' ' > &verbar; f 0 &verbar; &verbar; 2 , , ! I ! ! ! ! ! F F F F F F F 3 F g g F F F F P i P 33 iF 35 8 8 g 8 g 8 8 g 8 8 8 8 8 8 g 8 g g g m ID m m m m Tableau 1 - suite - i i i i ii i ! 1 i i i i i i i i i i i i i i i y I 70 CGG i TTC i I BAMP-B I I I; ! y i t 5 OTO TOC AOA CAC AAC TAC OAO GTG 5 TAC t ! i CTG i AGG AGA OTO r i I 5 i i E E r i i i i i 5 V A - DOBI*03032 -- DOSI*0304 DOBI*06O11 A i A . i T T 5 i - DOBI*06O12 A A A i 5CA T 5 i DOBI*0602 A i O T T 5 i t) t) Ú tl) t; DOBI0603 A i C T 5, T U U ú t - DOBI0604 A A 70A CA T G - DOBî.O603I A A GA T - - DOBI*05032 A A GA T DOBI*0606 i A ! 5 DOBIC? A A 5 5 5 5CA T Fe Fe CQBI0608 A O T DQBI*06O9 A A 7OA CA T DOBI*O2OI A i i i i i 5 - C T i i i i w 9 zzT 9 y 3 -- DOBI*02O2 - A AAA O - - C T A a AC C T C C - - - -- - - - O i i A CA i i i 5 i AC 5 i i r i 1 y y y 4 y y y Y i r A A CA T 5 i --- i i ! 5 AC 5 T ! i i i i F ! 5 5 é A A OA T ! 5 5 5 C T -A a AC i 1, l, b b i A A OA T C C T -A a ' AC -. C zzT S zz DQBI*03O3 - A A OA T - -C- C T -A a - AC C T - C- C- - DQBO4O - - CC -A - -- C T -A a AC C T - C- C i CC 5 5 i T í i i i 5 5 zT z5 i; Fe - 5 5; . i S i i i5 5 . . E ú ú ú u tl t) t; Q tl} F z i i i 5 5 . . ! i;; i i; I {; Z ! 5 Z Z 5 s 5 3 i E t0, i ! 5 i i 5 ≈ 5 5 i a O; i Z i i 5 i i i i i i i e 2 Fa i i 5 s X t ZC Fo;; 5; ! i i E i ! i i t i &verbar; ~ 5 S Y Y y y 9 9 y i y 9 y i ! 9 y y y y YX YX i i 5 E i ! Z i s s 5 i F > F 1 F F F i 1 1 F- i i F F ss F F- I y s i 5 S r O o o ' t czi o i ! 8 i i 5 i S m! ! i ! m ! ! X ! i i i &verbar; i i ! ! i i i i i i i i i R i i 5 ; é i i i i i i i i i i i i i i + i S z Ns z ^ 2 S 8 o o Z S o F F F F F i: vS F F S S F S S " pjpjp Rjp ^ z g 8 8 g g m m g 8 8 8 8 g g g g g g g g g g g g g Tableau 2 , rl.l > - . wwl- . 0 > w a o DaS105O2 gL...............I, Do905o3 OO6105o4 Y 0091000 - - P L - - - A M - 209 - - - -v - 37A0 --- : ,,,, A M z zzzzz 00910002 F - - - - M 0cj7LET2ffiÉJY A , .............. 009ro8o4 M - - 1.&num;DO{LL' -- - A 0091000S c A 009oW5 - - 2CÊL11 - ... - A 0091'OS06 - - -. - A !Z r M - A .,.... M - A 0091OO M 2SF - - - A j~,, M ! ... .. I E F ~ A M r 0091'0202 M - -Y-. $ - A EF ia M - -.- . LT-.T) : A -- I li M 1 t, s i . . . j 00S1004 A M 'lito di M v A . . . 4, i M t; . 0091-0402 F J j tJ X zz., v A ,O S &commat; F 'lU 7 j J ' ' ' ZS > iSS ' SSS > SSSSSSSS O s s eO eO eO Oe Oe eO Oe > 0 0 0 2 2 0" z t XmmXx eme mXX&commat;emmm OQQQOooooooOosooosooovooo u O O cJ O O O O O o o o o o o o o o o o o o o o O Tableau 2 - suite - a.--.................... R À V T P a G R j P k - É J v W N S a K E V L E G A R A S V O R V -C)-tCt)-tC (L 49ÀJ : - - z z II z: : I 1 ) 1 00a1o5o3 67C -- tu 57 - - - z -I-1J-l-l-l-l-l-l DI--ED 00e1oeoi O - - R T - E L - T N 00B1osoi -.-. o O I - - R T - E L - T > .,, JJ 70A7T - E L - T F w. ~~ - .. : T- -EL-T F 00B1O%4 --...-:- R T E L - T G 0061oeo5 - RT- EL - T G 00B1Ooo5 .- R T - E L - T 0061'Osoo 57A : : - il 570 I R T - A - - > - R T . 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F i ini w b,o.,;oojjcsc 1. . ; u i o jl i IL J Hi i . . ij. o J g oR g g 0 0 g 0 0 0 0 g g 0i g g 0 g g g g 0o g g Tableau 3 2 2 2 2 21 7171 223445555 0 0 36666667595777 AABCDEFAAAAABCAB DQB1'0501 oasl tos0 I DQB1'05031 DQB1'05032 ~~ DQB1'0504 DQB 1'06011 I I~ DOB 1'06012 DQB1'0602 I II~ 1 DQB1'0603 L1~~1 I 1 DQB1'0604 LZ I~~ IZI IUUt I VOVY I DQB1'0201 -= I I oas1'0202 > QB 1'0301 L > QB1'0302 C I~~~I DQB1'03032 DQB1'0304 ~ ~~ DQB1*0305 oasl0401 I DQB1 *0401 l DOBI *0402 Tableau 4 Oligosondes Acides aminés Séquences nucléotidiques 5' > 3' Spécificités variants 23A sil21L23 ACC GAG CTC GTG CGG GG DQB1*0401 26A H30 C AGA CAC ATC TAT AAC DQB1*0501+0502+05031+05032+0603+0604+0607+0608 26B sil25Y26 CGT TAT GTG ACC AGA DQB1*06011+06012+0301+0304 26C sil25L26 G CGT CTT GTG ACC AGA DQB1*0602+0302+03032 26D L26sil27 CTT GTA ACC AGA CAC DQB1*0603+0604+0607+0608 26E L26S28S30 T CTT GTG AGC AGA AGC DQB1*0201+0202 26F sil25L26sil27Y30 T CTT GTA ACC AGA TAC DQB1*06051+06052+0606+0609 37A D37 AG GAG GAC GTG CGC DQB1*06011+06012 45A E45 GAC GTG GAG GTG TAC DQB1*0301+0304 49A A49 AC CGG GCA GTG AC DOB1*0501 55A L53P55 CG CCG CTG GGI CCG CCT G DQB1*0301+0302+03032+0304+0305 57A V57 CCT GTT GCC GAG TA DQB1*0501+0604+06051+0606+0608+0609 57B S57 G CCT AGC GCC GAG TA DQB1*0502+0504 57C D57 G CCT GAT GCC GAG T DQB1*05032+0602+0603+0607 70A T71E74 AG GGI ACC CIG GCI GA DQB1*0602+0603+0608 70B T77sil78 G GTG GAC ACC GTA TGC AG DQB1*0401+0402 C+ - GAG TAC TGG AAC AGC CAG AAG GA C- - TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC HRP1 - ACG GAG CGC GTG HRP2 - ATC TAT AAC CGA GA HRP3 - CGC TTC GAC AGC GAC GTG G C+ : contrôle positif C- : contrôle négatif sil : mutation silencieuse Les acides aminés variants sont indiqués par le code à une lettre suivi de leur positionnement REVENDICATIONS 1. Sonde nucléotidique choisie parmi les suivantes - TGCGTTATGTGACCAGA, - GTG CGT CTT GTG ACC AGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT, - GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G, - G TAC CGG GCA GTG ACG C, - G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G. - G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G, - G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T, - G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T, - TCGGTG TCACACCGTATGCAA C, - GGACG GAG CGC GTG CG, - CATCTATAACCGAGA, et leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes ont au minimum la séquence soulignée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées. 2. Sonde selon la revendication 1, choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, et leurs complémentaires - TGCGTTATGTGACCAGA, - GTG CGT CTT GTG ACC AGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT, - GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G, - GTACCGGGCAGTGACGC, - G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G. - G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G. - G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T, - GGAGGGGACCCGGGCGGAGT, - TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C. 3. Sondes selon la revendication 1, choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, et leurs complémentaires - GG ACG GAG CGC GTG CG, - C ATC TAT AAC CGA GA. 4. Sondes selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont la séquence correspond à la séquence soulignée, et leurs complémentaires. 5. Sonde selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lesdites sondes sont soit marquées, soit couplées à un ligand destiné à faciliter leur fixation sur un support solide, soit fixées sur un support solide. 6. Procédé pour déterminer au moins partiellement le typage HLADQB1 d'un acide nucléique cible présent dans un échantillon, dans lequel on effectue des essais d'hybridation, selon les méthodes connues, dudit acide nucléique de l'échantillon avec des sondes oligonucléotidiques, et dans lequel on retient comme essais positifs les essais pour lesquels on observe effectivement une hybridation à une température unique égale à 37+2 C, lesdites sondes oligonucléotidiques comprenant au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - TG CGT TAT GTG ACC AGA, - GTGCGTCTTGTGACCAGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGTCTTGTGAGCAGAAGCAT, - GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G, - G TAC CGG GCA GTG ACG C, - G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G, - G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T, - TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C, ou leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes contiennent au minimum la séquence soulignée et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG, - GG CCT GTT GCC GAG TAC T, - CGG CCT AGC GCC GAG TAC T, - CGG CCT GAT GCC GAG TAC, ou leurs complémentaires. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de la cible nucléique de l'échantillon avec au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - GC GAC.GTG GAG .GTG.TAC CG, - A GAG GAG GAC GTG CGC TT, ou leurs complémentaires. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel on utilise lesdites sondes comme sondes de capture. 10. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel on révèle la présence éventuelle d'acide nucléique, fixé sur un support solide par hybridation par une sonde de capture, à l'aide d'une sonde de détection marquée capable de s'hybrider avec une région de la cible autre que celle reconnue par ladite sonde de capture. 11. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel les sondes de détection sont choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes, ou leurs complémentaires - GG ACG GAG CGC GTG CG, - C ATC TAT AAC CGA GA, - CGC TTC GAC AGC GAC GTG G. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé par le fait que lesdites sondes sont définies comme dans la revendication 4. 13. Kit pour le typage HLA DQB 1, comprenant au moins une sonde choisie parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - TG CGT TAT GTG ACC AGA, - GTG CGT CTT GTG ACC AGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT, - GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G, - G TAC CGG GCA GTG ACG C, - GACG CCGCTGGGI CCGCCTG. - G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G. - GGAGGGi ACCCIGGCIGAGT, - G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T, - TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C, - GG ACG GAG CGC GTG CG, - CATCTATAACCGAGA, ou leurs complémentaires, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG, - GGCCTGTTGCCGAGTACT, - CGG CCT AGC GCC GAG TAC T, - CGG CCT GAT GCC GAG TAC, - A GAG GAG GAC GTG CGC TT, - GC GAC GTG GAG GTG TAC CG, - CGC TTC GAC AGC GAC GTG G, ou leurs complémentaires. 14. Kit selon la revendication précédente, comprenant les sondes définies par les séquences suivantes - TGCGTTATGTGACCAGA, - GTG CGT CTT GTG ACC AGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT, - GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G, - G TAC CGG GCA GTG ACG C, - G ACG CCG CTG GGl CCG CCT G. - G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G, - G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T, - G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T, - TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C, ou leurs complémentaires, et pouvant contenir en outre une ou plusieurs sondes choisies parmi celles qui sont définies par les séquences suivantes - ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG, - GG CCT GTT GCC GAG TAC T, - CGG CCT AGC GCC GAG TAC T, - CGGCCTGATGCCGAGTAC, - A GAG GAG GAC GTG CGC TT, - GC GAC GTG GAG GTG TAC CG, ou leurs complémentaires. 15. Kit selon la revendication 13, comprenant les sondes définies par les séquences suivantes - TG CGT TAT GTG ACC AGA, - GTGCGTCTTGTGACCAGA, - GT CTT GTA ACC AGA CAC AT, - CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT, - CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT, - GGACCGAGCTC GTGCGGGGTG, - GTACCGGGCAGTGACGC, - GACGCCGCTGGGICCGCCTG, - G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T, - TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C, - ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG, - CGG CCT AGC GCC GAG TAC T, - CGG CCT GAT GCC GAG TAC, - A GAG GAG GAC GTG CGC TT, ou leurs complémentaires, et éventuellement - GC GAC GTG GAG GTG TAC CG, - GG CCT GTT GCC GAG TAC T, ou leurs complémentaires. 16. Kit selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, dans lequel lesdites sondes sont utilisables comme sondes de capture. 17. Kit selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, contenant en outre au moins une sonde de détection marquée choisie parmi les suivantes - GG ACG GAG CGC GTG CG, - C ATC TAT AAC CGA GA, - CGC TTC GAC AGC GAC GTG G. 18. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, dans lequel lesdites sondes sont définies comme dans la revendication 4.