Brevet FR2755146A1 — publié le 19980430

PROCÉDÉ DE PONTAGE SÉLECTIF ET IRRÉVERSIBLE D'OLIGONUCLÉOTIDES PLATINÉS SUR DE L'ARN ET SES APPLICATIONS. La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et se rapporte plus particulièiement à l'identification et la méthode d'utilisation de molécules capables de se fixer sur des séquences spécifiques d'acides nucléiques, principalement pour des applications médicales et de recherche. Les oligonucléotides constituent une classe de molécules particulièrement intéressante du fait de leur aptitude à former par hybridation des complexes spécifiques avec des séquences d'acides nucléiques complémentaires. Ces complexes peuvent se présenter sous la forme de duplexes résultant de l'hybridation d'oligonucléotides avec des séquences d'ADN simples brins -ou avec des séquences d'ARN, comme de l'ARNm, ou encore sous forme de triplexes, par hybridation avec des molécules d'ADN doubles brins (1-6). La fixation d'oligonucléotides sur l'ARNm conduit à l'inhibition de la traduction dudit ARNm selon deux processus généraux, d'une part la dégradation de cet ARNm par la RNase H , d'autre part le blocage stérique de la machinerie cellulaire (1-9). Ce bloquage ne peut se faire qu'à l'aide d'oligonucléotides chimiquement modifiés n'induisant pas la coupure de l'ARNm par la RNase H. L'utilisation d'oligonucléotides chimiquement modifiés permet aussi d'améliorer leur incorporation par la cellule et leur résistance aux nucléases (10). . La contrainte majeure de l'utilisation de ces oligonucléotides modifiés réside dans le fait que les complexes d'hybridation entre 1'ARN et l'oligonucléotide doivent être suffisamment stables pour ne pas être dissociés par la machinerie cellulaire. Ainsi, lorsque les oligonucléotides antisens sont dirigés vers la région codante, ils sont séparés de leur cible par les ribosomes de la traduction (11-15). Cette dissociation peut être évitée en associant aux oligonucléotides des réactifs capables de réagir spontanément, ou après irradiation, avec l'ARN cible (3-6, 10, 14). La Demande de Brevet Français publiée sous le N" 2 540 122 décrit à titre de nouveaux composés chimiques, une séquence d'oligonucléotides liée à un agent intetcalant. Ces composés chimiques se lient de façon sélective å toute séquence complémentaire nucléotidique et la présence d'un agent intercalant, qui possède une forte affinité pour les plateaux de bases, permet de stabiliser l'hybride formé qui cependant peut être dissocié-. En outre, la présence des agents intercalants dotés de propriétés distinctes des nucléotides permet leur détection. Les agents intercalants proposés dans la Demande de Brevet mentionnée ci-dessus sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques, il s'agit en général de composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine ou l'ellipticine et leurs dérivés. Parmi ceuxci, le psoralène (ou furocoumarine) et ses dérivés, désignés ci-après par agent intercalant photoactivable, outre leur capacité à s' intercaler entre les plateaux de bases des deux brins d'ADN, présentent la propriété de former des liaisons covalentes entre la double liaison 3-4 du cycle pyrone ou 4'-5' du cycle furane, avec la double liaison 5,6 des bases pyrimidiques, en particulier la thymine, sous irradiation à environ 360 nm. Ainsi l'agent intercalant photoactivable couplé à un oligonucléotide par l'intermédiaire d'un bras carboné adéquat, comme décrit dans la Demande de Brevet Français n" 2 540 122, s'intercalera entre les plateaux de bases formés par l'oligonucléotide et toute séquence d'acide nucléique complémentaire; l'irradiation à 360 nm des hybrides obtenus permettra de créer des liaisons covalentes entre l'agent intercalant ainsi activé et la séquence d'acide nucléique complémentaire de manière à créer un hybride ponté stable. On connaît également la Demande de Brevet Internationale publiée sous le nO WO 90/12020 qui propose de coupler la furocoumarine à un oligonucléotide par l'intermédiaire d'un sucre ribose ou déoxyribose. Les Demandes de Brevet Européenne nO 316 016, Internationale nO WO 89/06702 et Allemande nO 3928900 décrivent l'utilisation de conjugués de psoralène et d'oligonucléotides pour bloquer l'expression génétique. La demande de Brevet Français nO 2 568 254, décrit l'application de composés oligonucléotides liés à un agent intercalant pour le blocage sélectif d'une séquence d'acide nucléique, et plus particulièrement l'application de ces composés au blocage sélectif in vivo de l'expression d'un gène ou d'une séquence impliquée dans l'initiation, la propagation ou la terminaison de la réplication d'un acide nucléique, de la transcription d'un ou plusieurs gènes et/ou de leur traduction. Toutefois, ces méthodes chimiques présentent des inconvénients, car, l'induction de pontages par des agents chimique s'accompagne souvent de réctions non spécifiques, et l'activation photochimique est difficile à mettre en oeuvre in vivo. Le but de la présente invention est précisément de palier aux inconvénients des méthodes décrites dans l'art antérieur en offrant un procédé permettant de fixer de façon irréversible et spécifique un oligonucléotide sur une séquence d'ARN qui lui est complémentaire. Ce but est atteint en utilisant des oligonucléotides modifiés par le transplatine (transdiamminedichloroplatine (Il) ) ou ses analogues fonctionnellement équivalent, ci-après désignés oligonucléotides platinés, qui présentent la propriété de former des adduits intrabrins stables tant que les oligonucléotides platinés sont des simples brins, et qui se réarrangent en adduits interbrins lorsque les oligonucléotides platinés sont appariés avec une séquence d'acide nucléique complémentaire. Ainsi, de manière remarquable, le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins est déclenché par la formation de la double hélice de l'hybride (16). Les travaux déjà réalisés avec des oligonucléotides platinés ont permis de montrer que l'hybridation d'oligodésoxyribonucléotides platinés contenant un seul pontage intrabrin entre deux résidus de guanine séparés par une base quelconque N, désigné intrabrin (G1, G3) ou intrabrin-1,3, avec des brins d'ADN ou d'ARN s'accompagne d'un réarrangement des pontages intrabrins en pontages interbrins. Comme indiqué précédemment, le procédé expérimental comprend deux étapes majeures, d'une part la formation des pontages intrabins au sein de l'oligonucléotide simple brin, et d'autre part, le réarrangement des pontages intrabrins en pontages interbrins dans les duplexes. La réaction entre le transplatine et les oligonucléotides contenant la séquence d(GNG) conduit aux adduits interbrins de formule générale : 1,3trans(Pt(NH3)2[d( GNG )]) (24). Dans des conditions physiologiques, ces adduits sont cinétiquement inertes tant que les oligonucléotides sont simples brins (16-18, 24). Comme montré sur la figure 1, l'appariement des oligonucléotides platinés avec leur brin complémentaire favorise le réarrangement des adduits intrabrins-1,3 en adduits interbrins (16). Le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins présente l'inconvénient de se produire lentement dans le cas d'hybrides avec des séquences d'ADN (X1/2 de l'ordre de 1 à 14 heures à 370C) et très lentement dans le cas d'hybrides avec des séquences d'ARN (T112 de l'ordre de 15 à 50 heures), ce qui limite considérablement les possibilités d'utilisation de ce phénomène notamment dans le domaine thérapeutique pour la mise en oeuvre de stratégies thérapeutiques antisens. Les inventeurs sont maintenant parvenus à un procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucléotide sur un ARN, caractérisé en ce que lk'on met en contact un oligonucléotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucléotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin Bien entendu, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec un mélange d'oligonucléotides platinés identiques ou différents et/ou un mélange d'ARN cibles identiques ou différents dont la taille est supérieure ou égale à celle de l'oligonucléotide platiné. Grâce au procédé de l'invention, le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins est réalisé en quelques minutes avec un acide nucléique cible qui est un ARN, par la seule mise en contact de 1'oligonucléotide platiné et dudit ARN cible sans réaction additionnelle telle qu'une irradiation. Un autre avantage du procédé de l'invention est d'exclure les réactions non spécifiques car le pontage entre l'oligonucléotide et sa cible n'est réalisé que lors de l'appariement. Selon une forme de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, l'oligonucléotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN et contient un adduit intrabrin au niveau d'un site de séquence 5'G N G, dans laquelle N représente un résidu de nucléotide quelconque, G représente un résidu guanine et 5' indique le sens de l'enchaînement des nucléotides dans l'oligonucléotide. Les travaux de recherche des Inventeurs ont permis de déterminer des aspects conformationnels de l'oligonucléotide assurant au procédé de l'invention une efficacité remarquable. Ainsi, un oligonucléotide platiné avantageusement mis en oeuvre dans ce procédé comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN dont la portion de séquence correspondant à l'adduit intrabrin de séquence 5'G N G de l'oligonucléotide platiné, est une séquence 5' X A (Y), dans laquelle - A représente un résidu adénine, - Y peut être absent, et dans ce cas X est choisi parmi les résidus uracile, cytosine, adénine, guanine, - Y s'il est présent, est un nucléotide quelconque, et dans ce cas X est un résidu uracile. Des séquences 5'X A (Y) toutes particulièrement préférées sont les suivantes : 5'UA, 5'CA, 5'UAC, 5'UAU. Le procédé de l'invention consiste donc schématiquement, à faire réagir, dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, un oligonucléotide platiné contenant un adduit intrabrin, répondant par exemple à la formule 1 N2 N3 N4 N5 N6 G N G N7 N8 Ng N10 N11 3' (I) dans laquelle : N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, Ng, Ng, N10, Nll, N représentent des résidus de nucléotides ou de désoxynucléotides naturels et/ou modifiés, G représentant un une guanine ou désoxyguanine naturelle ou modifiée, et le sigle "^" couvrant le triplet G N G représente le pontage intrabrin (G1,G3), avec une séquence d'ARN répondant par exemple à l'une des formules suivantes 3'- - - N1'N2'N3'N4'N5'N6' A U N7'N8'N9'N10'N11'- - - 5' (I ou 3'- - - N1'N2'N3'N4'N5'N6' A C N7'N8'N9'N10'N11'- - - 5' (I dans lesquelles # N1', N2', N3', N4', N5', N6', N7', N8', N9', N10' et N11, représentent les bases complémentaires respectivement des bases N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, Ng, N10 et N11 de l'oligonucléotide de formule (I), A représente une base adénine, U une base uracile et C une base cytosine, et les tirets représentes les autres bases de 1'ARN cible, pour obtenir un complexe d'hybridation contenant un adduit interbrin répondant à l'une des deux formules suivantes : 5'N1 N2 N3 N4 N5 N6 G N G N7 N8 N9 N10 N11 3' 3'- - - N1'N2'N3'N4'N5'N6' A U N7'N8'N9'N10'N11'- - -5' ou 5 ' N1 N2 N3 NA N5 N6 G N G N7 No Nq N1 n N11 3 3 - - 1'N2'N3'N4'N5'N6' A C N7'N8'N9'N10'N11'- - -5' dans lesquelles N1, N2, N3, N4, Ng, N6, N7, N8, Ng, Nlo, N11, N1', N2', N3', N4', N5', N6', N7', N8', N9', N10', N11' G, N, C et A ont les mêmes significations que dans les formules (I), (II) et (III), et le sigle "Z" représente le pontage interbrin entre le triplet 5'G N G de l'oligonucléotide platiné et le doublet non complémentaire 3'A C ou 3'A U qui lui fait face. La taille de l'oligonucléotide platiné contenant l'adduit intrabrin mis en oeuvre dans le procédé l'invention peut avoir une taille variable, et avantageusement il est constitué d'un enchaînement d'au moins 10 nucléotides. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec une séquence d'ARN de plus grande taille que l'oligonucléotide platiné ou encore avec un mélange d'ARN. L'oligonucléotide platiné contenant l'adduit intrabrin peut être constitué d'un enchaînement de ribonucléotides ou de désoxyribonucléotides naturels et/ou modifiés. Parmi les nucléotides modifiés, on peut citer les 2' -0-alkyl-nucléotides, les nucléotides méthylphosphonates, et de façon avantageuse, tous les nucléotides modifiés et les combinaisons de nucléotides capables de conférer à l'oligonucléotide qu'ils composent une résistance aux enzymes susceptibles de dégrader ledit oligonucléotide in vive. Le procédé de l'invention peut être appliqués, de manière non exhaustive - A la purification d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de l'oligonucléotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à purifier; - A la détection d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de l'oligonucléotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à détecter, et l'oligonucléotide platiné est avantageusement marqué par tout moyen approprié; - Au blocage sélectif d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de l'oligonucléotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à bloquer spécifiquement. Une telle application est tout particulièrement adaptée pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène par inhibition de la traduction de son ARNm, ou encore pour bloquer sélectivement la réplication et/ou le développement de virus, de bactéries ou de parasites. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif une quantité adéquate d'oligonucléotides platinés mis en oeuvre dans le procédé de l'invention susceptibles de se fixer rapidement sur au moins une séquence spécifique d'ARN de façon à former des complexes d'hybridation pontés de façon irréversible par le biais d'adduits interbrins. L'invention concerne enfin des oligonucléotides platinés contenant un adduit intrabrin, pour leur utilisation à titre de produit antisens permettant de bloquer rapidement, sélectivement et de façon irréversible la traduction d'un ARNm spécifique contenant une séquence substantiellement complémentaire de celle dudit oligonucléotide platiné. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs, et concernant la préparation d'oligonucléotides platinés ainsi que leur utilisation pour préparer des complexes d'hybridation spécifiques stabilisé de façon irréversible par covalence. I - Matériels et méthodes. 1) Matériels. Les oligodésoxynucléotides, les oligoribonucléotides et les oligoribonucléotides-2 '-O-méthyle utilisés dans les exemples ci-après sont d'origine commerciale et ont été purifiés par chromatographie sur colonne échangeuse d'anions (colonne monoQ de Pharmacia) comme décrit dans la littérature (16, 17). Le réactifs utilisés listés ci-dessous ont été acquis dans le commerce - T4 polynucléotide kinase et ribonucléase T1 (Boehringer Mannheim) - - AMV reverse transcriptase, RNase H, lysat de réticulocytes de lapin, luciférase ARNm, rNTP et dNTP (N étant un nucléotide) et acides aminés (Promega). - Produits radioactifs (Amersham). - Composés chimiques (Merck). - transplatine (Johnson-Mattey, UK). 2) Platination des oliqonucléotides. La réaction entre les oligonucléotides et le transplatine a été réalisée comme décrit dans la littérature (16-18) . Les oligonucléotides simples brins (c = 30 ,uM) contenant une séquence centrale unique G N G ont été incubés avec 1 équivalent de transplatine dans 10 mM de NaClO4 à pH 3,1 ajusté HNO3 (Ultrapure) à 370C pendant 24 heures. Le mélange réactionnel a été ensuite traité avec de 10 rnM de thio-urée pendant 10 minutes à 370C afin d'éliminer les adduits monofonctionnels (16,17). Les oligonucléotides contenant un seul pontage intrabrin-1,3 ont été purifiés sur une colonne monoQ avec un gradient de NaCl de 0,2 à 0,7 M. 3) Réarrangement du pontage. Les oligonucléotides platinés ont été mélangés avec les brin complémentaires à OOC puis incubés dans diverses conditions. A intervalles de temps réguliers, des aliquotes ont été prélevés et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes. La disparition des pontages intrabrins-1,3 en fonction du temps a été évaluée en quantifiant avec un appareil "Molecular Dynamics PhosphoImager" (Image Quant Software version 3.3 de gestion de données) la fraction de produit n'ayant pas réagi. Les hybrides contenant un pontage interbrin ont été purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 20% en conditions dénaturantes, puis mélangés avec 2 g d'ARNt et incubés à 90"C dans 10 mM de NaOH pendant 10 minutes. Les produits de la réaction ont été résolus sur un gel de séquençage de polyacrylamide à 24%. 4) Courbes de fusion. Les courbes de fusion des hybrides ont été enregistrées en mesurant l'absorbance à 260 nm en fonction de la température, à l'aide d'un spectrophotomètre Kontron Uvikon 810. L'augmentation de la température était de 10C par minute. Les températures de fusion (Tm) ont été obtenues à partir du point milieu des tracés sigmoïdes de l'absorbance en fonction de la température, avec une précision de +0,5 C. 5) Transcription inverse. Les mélanges d'ARNm Ha-ras coiffé (0,4 pmole), obtenus par transcription in vitro d'une construction plasmidique contenant la séquence entière Ha-ras (19), et des oligonucléotides (3 et 20 équivalents molaires respectivement pour les oligonucléotides complémentaires et non complémentaires sont incubés dans un tampon de transcription inverse (1 fois) pendant 10 minutes à 420C. Après addition d'une amorce marquée à son extrémité 5' (3 pmoles) complémentaire de la séquence de l'ARNm située entre les nucléotides en positions +209 et +226 par rapport au codon d'initiation AUG. Les mélanges sont ensuite incubés pendant 10 minutes, puis, les dNTPs, à raison de 1,5 simples de chaque, et 2 U de reverse transcriptase AMV sont ajoutés. Les mélanges, d'un volume final de 10 Fl sont incubés 70 minutes à 420C. Les transcrits sont précipités deux fois avec de l'éthanol avant d'être chargés sur un gel dénaturant de polyacrylamide à 8%. Les tailles des transcrits complets et tronqués ont été contrôlées en comparant leurs migrations avec celles de marqueurs de séquences préparés par la méthode didéoxy de Sanger. 6) Traduction in vitro. Les expériences de traduction ont été effectuées en présence d'un lysat de réticulocytes de lapin comme décrit dans la littérature (20, 21). Les oligonucléotides ont été incubés 10 minutes à 37"C dans 50 mM de NaCl, 5 mM de tampon phosphate, à pH 7,5 avec 0,4 pmole d'ARNm Ha-ras coiffé et 0,1 pmole d'ARNm de luciférase comme contrôle. Le mélange d'acides aminés, contenant de la méthionine marquée au S35, à raison de 50 MM de chaque en volume final, puis 17 ,ul d'un lysat de réticulocytes de lapin ont été ajoutés. Les volumes des solutions ont été ajustés à 25 ptl et les mélanges ont été incubés pendant 30 minutes à 370C. Des aliquotes ont été prélevés et dénaturés par chauffage en présence de SDS et de B-mercaptoéthanol, puis chargés sur un gel de polyacrylamide 10% SDS 0,1%. 7) Tests de prolifération des cellules HBL 100. Les oligonucléotides ont été incubés dans une plaque 24 puits avec des cellules HBLlOOrasl (75. 103 cellules par puits) dans 500 ,ul de milieu de culture complet (Milieu d'Eagle modifié supplémenté avec 7% sérum de veau foetal inactivé, 50 U/ml de pénicilline, 50 U/ml de streptomycine et 4 mM de glutamine) à 370C en atmosphère humide, 5% CO2. Après 24 heures d'incubation, les cellules sont tripsinisées et comptées. Les pourcentages d'inhibition sont déterminés par la formule : (nt - ni) (nt - nO) x 100, dans laquelle, nt est le nombre de cellules non traitées après 24 heures d'incubation, ni est le nombre de cellules traitées et nO est le nombre de cellules comptées au début de l'expérience. 8) RT-PCR. L'ARN total a été extrait des cellules comme décrit dans la littérature (22, 23). Les cellules traitées et non traitées (1-2. 106) ont été incubées pendant 5 minutes à 4 C dans 500 Rl d'un tampon de lyse (0,15 M NaCl 10 mM Tris.HCl ; pH 7,5 ; 1,5 mM MgCl2 ; 0,65% NP-40). Après centrifugation, les surnagants ont été mélangés avec 500 Fl d'un tampon Urée/SDS (7 M urée ; 10 mM Tris.HCl ; pH 7,5 10 mM EDTA ; 1% SDS). Les échantillons ont été centrifugés et l'ARN total a été précipité avec de l'éthanol. L'ARN (2 Fg) a été soumis à une transcription inverse et les ADNc résultant ont été co-amplifiés par PCR conformément aux r-ecommandations du fabriquant (Perkin Elmer Cetus) en utilisant les paires d'amorces spécifiques de Ha-ras suivantes - pour les fragments de 72 pb d(CTGTTGGACATCCTGGATAC) et d(CCCGGTGCGCATGTACTG) - pour les fragments de 183 pb d(TGAGGAGCGATGACGGAATA) et d(GTATCCAGGATGTCCAACAG) - pour la ss2-microglobuline : d(AAGATGAGTATGCCTGCCGT) et d(ATGCTGCTTACATGTCTCGAT). Le nombre de cycles a été de 25 : 50 secondes à 94"C, 50 secondes à 570C, 20 secondes à 720C). Après précipitation avec de l'éthanol, les produits de la réaction ont été séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 10% et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. La quantification de l'intensité des bandes a été effectuée avec un système Videocopy (Bioprobe systems) en utilisant un logiciel Densylab (Microvision Instruments) pour le traitement des données. II - Résultats. 1) Réaction de Pontage interbrin. La figure 1 est une représentation schématique du procédé expérimental avec des oligonucléotides représentés par leur séquence centrale. Sur cette figure, la localisation du pontage interbrin correspond à des duplexes de type ADN-ADN (16). L'étude de ce réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins a conduit les inventeurs à conférer un rôle majeur à la conformation des hybrides sur la vitesse du réarrangement. Cette étude a donc été poursuivie - d'une part, en utilisant des oligonucléotides platinés modifiés, par exemple en remplacant les déoxyribonucléotides par des résidus 2'-O-méthylribonucléotides, et - en modifiant le brin d'ARN cible complémentaire, par exemple en remplacant le triplet de bases opposé à l'induit intrabrin par un triplet ne répondant pas à la loi d'appariement ou par un doublet de bases. Les ARN correspondant à ces deux modifications ont été désignés dans ce qui suit, respectivement, ARN ou ARN(-l) Les brins platinés comprenant 18 nucléotides et présentant un pontage intrabrin-1,3 unique localisé au milieu de la séquence ont été incubés avec des brins d'ARN ou d'ARN(-l) complémentaires, contenant respectivement de 18 ou 17 nucléotides, marqués à leur extrémité 5'. Des aliquotes ont été prélevés à intervalles de temps réguliers et analysés par électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes. La figure 2 présente les résultats du réarrangement d'adduits intrabrins-1,3 dans les cas, de la gauche vers la droite - d'hybrides platinés contenant un mismatch (ou misappariement) entre ADN et ARN, - d'hybrides platinés, comprenant un mismatch, entre 2'-OMe-ARN et ARN, - d'hybrides platinés entre ADN et ARN(-1), - d'hybrides platinés entre 2'-OMe-ARN et ARN(-l) Les autoradiogrammes du gel de polyacrylamide 20% dénaturant de la figure 2 ont été obtenus à partir des brins d'ARN marqués à leur extrémité 5 ci-dessous 5'-A A G G A G A U A U A G A G G A G A-3' (ARN) 5'-A A G G A G A AU A G A G G A G A-3' (ARN(-l) avec l'oligodéoxyribonucléotide platiné de formule 5'-T C T C C T C T G T G T C T C C T T-3' (bandes ADN) ou ltoligo-2'-O-méthyl-ribonucléotide platiné de formule 5'-U C U C C U C U G U G U C U C C U U-3' (bandes 2'-O-Me) Les échantillon (2 ,uM) ont été incubés à 37 C dans - 150 ml de NaClO4 ; 5 mM de tampon phosphate ; pH 7,5 0,2 mM EDTA. Les temps d'incubations sont indiqués en minutes au-dessus des bandes. Les bandes U représentent les ARN simples brins marqués à leur extrémité 5' : à gauche ltARN et à droite l'ARN(-l). Comme le montre, la figure 2, pour chaque échantillon, l'intensité de la bande correspondant à l'ARN simple brin diminue et une nouvelle bande apparaît. Cette nouvelle bande migre plus doucement que le matériel de départ et correspond à un produit contenant un pontage intrabrin. Après 15 minutes d'incubation - environ 10% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides ADN/ADN platinés comportant un mismatch, - 50% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides 2'-OMe-ARN/ARN platinés comportant un mismatch, et - pratiquement 100% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides ADN/ARN(-1) platinés, comme dans le cas des hybrides 2'-OMe ARN/ARN(-1) platinés. Dans les mêmes conditions expérimentales, le pourcentage d'adduits interbrins dans l'hybride ADN/ARN sans mismatch (la séquence centrale étant d(GTG). r(CAC)) est inférieur à 5%). Les trois types de modification testés (mismatch, doublet, oligo-2'-O-Me-nucléotide) favorisent la formation d'adduits interbrins. Le réarrangement le plus rapide apparaît avec l'hybride platiné 2'-OMe-ARN/ARN(-l). En outre, aucun clivage des adduits interbrins n'a été observé après incubation des échantillons purifiés pendant 48 heures à 370C dans 100 ou 500 mM Nacl. Une étude systématique des facteurs susceptibles d'interférer avec le pontage dans les hybrides platinés 2t-OMe-ARN/ARN(-l) a été effectué. La vitesse de pontage n'a pas été modifiée dans NaCl ou NaClO4, même à des fortes concentrations comprises entre 50 et 500 mM, ou par addition de Mg++ ou Mn++ jusqu'à 10 mM. Le pontage est indépendant du nucléotide N (A, U ou C) situé entre les deux résidus de guanines (G) chélatées; de même, il est indépendant de la nature des bases adjacentes du site de l'adduit interbrin, mais dépend de la nature du doublet du brin d'ARN opposé audit adduit. Des vitesses de réarrangement similaires ont été obtenus lorsque le doublet 5'-UA a été remplacé par le double 5t CA. Le remplacement par les doublets 5'-AA ou 5' GA diminue la vitesse de formation du pontage interbrin de 20 fois et le remplacement par les doublets 5'-AU ou 5'-AC diminue cette vitesse d'au moins 1000 fois. 2) Stabilité thermique des hybrides. L'inefficacité des doub 4 hybrides 2'-OMe-ARN/ARN de 18 ou 17 nucléotides comme représentés à la figure 2, avec des séquences centrales GTG.CAC, GTG.CAC platinée, GTG.AU et GTG.AU platinée, ont été suivies par absorption u.v. Les quatre échantillons fondent coopérativement et les valeurs des Tm sont 67,50C, 480C, 470C et 430C dans 10 mM NaC1O4, 3 mM Tris-HCl, dH 7,5. Les deux modifications, adduit intrabin-1,3 et doublet, abaissent le Tm d'environ 200C mais dès que l'hybride contient une modification, la seconde modification n'engendre qu'une faible déstabilisation. Dans 100 mM NaC104 ou NaCl, le Tm des quatre échantillons a augmenté de 13 à 150C. Le remplacement du brin d'ADN platiné par un brin 2'-OMe-ARN platiné dans les hybrides présente l'avantage d'augmenter la vitesse de réaction de pontage interbrin et la stabilité thermique d'environ 13"C. En outre, la meilleure résistance d'olîgo-2 ' -Ométhyl-ribonucléotides aux nucléases constitue un avantage remarquable dans la perspective d'uns stratégie antisens (25-27). 3) Identification de l'adduit interbrin. Deux type d'expériences ont été réalisées pour identifier les bases impliquées dans les pontages interbrins résultant du réarrangement des adduîts intrabrins-1,3. Les hybrides pontés marqués au p32 soit à l'extrémité 5' du brin supérieur (brin portant l'adduit intrabrin-1,3 initial) ou du brin inférieur, ont été élués des bandes de plus lentes migrations comme celles apparaissant à figure 2. Dans une première série d'expériences, les hybrides ont été soumis à une hydrolyse alcaline légère pour obtenir une coupure de l'ARN et les fragments résultant ont été analysés sur gel d'électrophorèse dans des conditions dénaturantes. La figure 3 en annexe se rapporte à l'identification du ribonucléotide ponté dans l'hybride ADN/ARN(-1) contenant un adduit interbrin. L'autoradiogramme de la figure 3 représente l'analyse sur gel de polyacrylamide 24% dénaturant - des produits résultant de l'hydrolyse alcaline (lignes OH) - de l'ARN(-l) libre marqué à son extrémité 5' (lignes -Pt), - de l'ARN(-l) ponté au brin d'ADN (ligne +Pt). La ligne 0 représente le brin d'ARN(-l) marqué à son extrémité 5' non traité. Dans la piste T1, le profil des bandes reflète le clivage au niveau des résidus G induit par une digestion partielle du brin d'ARN(-l) marqué à son extrémité 5 par la RNase T1 (28). Les résultats présentés à la figure 3 concernent les hybrides possédant la séquence centrale d(GTP).r(UA). Les fragments précédant (en position 5') le résidu ponté sont détectés et d'en conclure que le résidu ponté est le résidu A opposé au pontage initial intrabrin. Des résultats similaires ont été obtenus avec les hybrides ayant les séquences centrales suivantes d (GTG) . r (UAU), 2'-OMe(GTG).rUAU ou 2'-OMe(GTG).rUA. Les résidus pontés dans le brin supérieur ont été déduits par la méthode d'empreinte de Maxam-Gilbert avec du diméthylsulfate comme décrit dans la littérature (16-18). Les expériences ont été réalisées sur les deux hybrides ayant les séquences centrales, d(GTG) .r(UA) et d(GTG).r(UAU). Dans les deux cas, le résidu ponté était le résidu 5'G du pontage intrabrin initial. 4) Mécanisme du réarranaement. Bien que le mécanisme de la réaction d'isomérisation du pontage ne soit pas encore totalement compris, les vitesses de réaction de pontage dans les hybrides platinés ADN/ARN(-1) et 2'-OMe-ARN/ARN indiquent qu'il s'agit d'une attaque nucléophile sur le résidu de platine par une base du brin opposé (16) et éliminent la possibilité d'une réaction via un intermédiaire d'association avec un solvant comme cela est généralement observé dans la réaction entre les dérivés du platine (II) et l'ADN (24). Une différence majeure entre les résultats rapportés dans le cadre de la présente invention et ceux concernant les duplexes platinés ADN/ADN réside dans la nature de la base attaquant le résidu de platine. Dans le cas de duplexes platinés ADN/ADN, les pontages interbrins s'établissent essentiellement entre le résidu 5'G de l'adduit intrabrin initial et le résidu complémentaire C (16). Les expériences d'empreinte réalisées dans le cadre de la présente invention ont permis de conclure que dans les hybrides platinés, les pontages interbrins s'établissent essentiellement entre l'atome d'azote en position 7 du résidu 5'G (brin supérieur) et le résidu A du triplet UAU ou du doublet UA du brin d'ARN. Le remplacement du doublet UA par le doublet UG abaissant le taux de pontage interbrin, il semble plus probable que le résidu de platine soit fixé à l'atome d'azote en position 1 qu'à l'atome d'azote en position 7 du résidu A. Les études réalisées sur la réactivité des complexes du platine (II) avec les nucléosides (guanosine, adénosine ou cytosine) indique un ordre de réactivité : G > A - C (24, 29). Ceci laisse supposer que les différences des vitesses de pontage dans les hybrides platinés ADN/ADN, ADN/ARN(-1) et 2'-O-Me-ARN/ARN sont dues aux positions relatives du nucléotide attaquant le résidu de platine plus qu'à la nature chimique du nucléotide. Ces positions relatives sont déterminées par la conformation locale de la double hélice, laquelle, peut en outre interférer avec la vitesse de la réaction en raison de contributions d'entropie et/ou d'enthalpie sur la déstabilisation de l'état fondamental et/ou sur la stabilisation de l'état de transition. 5) Ssécificité de la réaction de lDontaqe. Afin de démontrer que la réaction de pontage n'induit pas de fixation non spécifique entre l'oligonucléotide platiné et sa cible, l'ARNm Ha-ras coiffé, comprenant 820 nucléotides, a été incubé pendant 10 minutes avec un oligo-2'-O-méthyl-ribonucléotide de 17 nucléotides, dénommé Ras 1, complémentaire de la séquence située entre les positions +130 et +145 par rapport à la base A du codon d'initiation AUG de l'ARNm Ha-ras. Cette séquence de 16 nucléotides comporte en son centre le doublet 5'CA et les 14 résidus de nucléotide à partir de l'extrémité 3 sont en boucle comme suggéré dans le modèle de structure secondaire de l'ARNm Ha-ras généré informatiquement (30). La localisation de la fixation irréversible de 1'oligonucléotide a été révélée par extension d'amorces avec la transcriptase inverse AMV. La figure 4 se rapporte à l'analyse de la spécificité de séquence de la réaction de pontage - lignes -Pt : transcription inverse en présence d'oligonucléotides non platinés; - lignes +Pt - transcription inverse en présence d'oligonucléotides platinés; - ligne Ras 1 - correspond à l'oligo-2'-Ométhyl-ribonucléotide de séquence 5'-C C C A U C A A G U G A C C A C C-3', complémentaire de la séquence 5'-G G U G G U C A U U G A U G G G-3', situé entre les positions +130 et +145, par rapport au codon d'initiation AUG, de la région codante de Ha-ras; - lignes Scr : correspond à l'oligo-2'-O-méthylribonucléotide non complémentaire de séquence 5'-C C A C A C U G C G A A C C U A C-3'. Comme montré sur cette figure 4, la réaction de polymérisatioq est totalement arrêtée par l'oligonucléotide ponté. En fait, deux arrêts sont détectés, le plus important au niveau du pontage et le plus faible au niveau de l'extrémité 5' de l'oligonucléotide. La spécificité de la fixation a été prouvée par des expériences de compétition. L'oligonucléotide platiné a été incubé pendant 10 minutes avec un mélange d'ARNm de Ha-ras et d'ARNm de luciférase (30 fois en excès) puis la transcriptase inverse a été ajoutée. Les résultats avec ou sans ARNm de luciférase sont identiques. Au contraire, le même oligonucléotide non platiné apparaît comme un faible inhibiteur de la transcriptase inverse. Un faible arrêt est détecté au niveau de la séquence ciblée ce qui est en accord avec d'autres résultats (31). Des oligonucléotides platinés et non platinés non complémentaires, désignés Scr, n'affectent pas la synthèse d'ADNc. La spécificité de la réaction de pontage a été ensuite testée en observant 1' efficacité des oligonucléotides pontés sur l'inhibition de la synthèse de protéine dans un système acellulaire. L'expérience a été effectuée sur de l'ARNm Ha-ras coiffé après réaction avec l'oligo2'-O-méthyl-ribonucléotide Ras 1. I1 a tout d'abord été vérifié que les cinétiques de la réaction de pontage n'étaient pas modifiées par l'addition d'un lysat de réticulocytes de lapin et qu'il n'y avait pas de dégradation de l'ARNm Ha-ras même après l'addition de RNase H. Dans une seconde expérience, l'oligonucléotide platiné a été mélangé aux ARNm de Ha-ras et de luciférase, l'ensemble a été mis à incuber 10 minutes à 37OC! puis les acides aminés et le lysat de réticulocytes de lapin ont été ajoutés. Les produits de traduction ont été analysés par SDS-PAGE. La figure 5 concerne l'inhibition in vitro de la traduction de l'ARNm Ha-ras coiffé par un oligo-2'-O-méthylribonucléotide non-platiné (ligne -Pt) ou platiné (ligne +Pt). Les lignes Ras 1 et Scr se réfèrent aux oligonucléotides testés dans les expériences de transcription inverse. Les ratios oligonucléotide/ARNm Haras sont indiqués en haut de la figure. L'efficacité de la traduction est exprimée en pourcentage de protéine Ha-ras traduite par rapport à celui de la luciférase (témoin interne). Le rapport des intensités de bandes de Ha-ras et de luciférase a été fixé à 100% de traduction lorsqu'aucun oligonucléotide n'était présent (ligne O). On observe que l'oligonucléotide Ras 1 platiné inhibe totalement la traduction de l'ARNm de Ha-ras, mais n'affecte pas la traduction de l'ARNm de luciférase. Le même oligonucléotide non platiné et les oligonucléotides cr platinés ou non n'ont pas d'effet sur la traduction de l'ARNm Ha-ras. Ces résultats confirment que les oligo-2'-Oalkyl-ribonucléotides dirigés contre la région codante des ARNm n'arrêtent pas les ribosomes de traduction si ils ne sont pas fixés de manière covalente à 1'ARN (14, 15). Les expériences de traduction et de transcription inverse ont été répétées avec un autre oligonucléotide platiné reconnaissant la région codante de l'ARNm de Ha-ras située entre les positions +4 et +19 par rapport au codon d'initiation AUG. Des résultats similaires ont été obtenus et d'en conclure que in vitro, les oligonucléotides platinés se fixent spécifiquement à leurs cibles et ne sont.pas déplacés par les ribosomes au cours de latraduction. 6) Inhibition de la prolifération de cellules Hsllooras 1. La capacité de l'oligonucléotide Ras 1 d'inhiber la traduction a également été testée en utilisant le système cellulaire HBLlOOras 1 largement décrit. Ce clone a été obtenu à partir de la lignée cellulaire humaine HBL100 qui a été transformée avec le gène Ha-ras muté sur le douzième codon (32). Dans les cellules transfectées, les protéines p21 de Ras oncogènes piégées dans leur forme activée liée au GTP pour une longue durée, adressent aux cellules de nombreux signaux stimulant la croissance. Ainsi, la privation sélective des protéine Ha-ras dans les cellules HBLl0Oras 1 conduit à inhiber la division cellulaire. Plusieurs expériences ont montré que la prolifération des cellules HBLlOOras 1 était spécifiquement inhibée par des oligonucléotides antisens ciblé vers le messager Ha-ras, probablement par un mécanisme dépendant de la RNase H (22, 23). La figure 6 représente l'inhibitionX de la prolifération des cellules HBLl00rasl en fonction de la concentration en oligonucléotide - oligonucléotide Ras 1 non platiné (e), - oligonucléotides Ras 1 platiné (I), - Scr non complémentaire non platiné (o), - Scr non complémentaire platinés (o). Chaque point correspond à une valeur moyenne (erreur Comme montré par la figure 6, le traitement des cellules HBLlOOras 1 avec l'oligonucléotide platiné Rasl induit une inhibition dose-dépendante de la prolifération cellulaire au delà de O à 4 pLM (50% d'inhibition à la concentration d'environ 0,4 pM) . Le- même oligonucléotide non platiné présente un léger effet cytostatique sur les cellules, mais l'inhibition de la croissance n'excède pas 30% à 4 M, alors que l'oligonucléotide Scr platiné ou non ne présente aucun effet. Dans chaque test, il a été observé une forte viabilité des cellules ( > 95%) en utilisant la méthode d'exclusion par le bleu de trypan. Afin de renforcer la preuve du pontage de l'oligonucléotide platiné Ras 1 sur l'ARNm Ha-ras, le niveau de messager intact dans les cellules a été déterminé par des expériences de RT-PCR sur l9ARN total. L'amplification d'ARN après transcription inverse en présence, soit d'une paire d'amorces qui s'hybrident à des séquences flanquant la cible Ha-ras, soit d'une paire d'amorces qui s'hybrident à des séquences du côté 3 de la cible, a permis d'obtenir des fragments d'ADN respectivement de 183 et 72 pb. La figure 7 se rapporte à l'expression de l'ARNm de Ha-ras et de ss2-microglobuline dans les cellules HBLl00ras 1 exposées 24 heures à l'oligonucléotide ras 1 non platiné (ligne 3) ou platiné (lignes 2 et 5). Les lignes 1 à 4 concernent les cellules non traitées. La localisation des fragment de Ha-ras de 72 pb et 183 pb obtenus par\RT-PCR, par rapport à la portion d'ARNm susceptible d'être pontée avec Ras 1 platiné, est schématiquement indiqué au-dessus des lignes. Comme les intensités relatives des bandes des lignes 4 et 5 de la figure 7 correspondant aux fragment Haras de 72 pb et aux fragment de ss2-microglobuline (contrôle interne) provenant respectivement de cellules non traitées et de cellules traités par l'oligonucléotide Ras 1 platiné, sont identiques, il est possible d'en déduire que l'oligonucléotide Ras 1 platiné n'a pas d'effet sur la quantité d'ARNm Ha-ras. Au contraire, la comparaison des intensités relatives des bandes des lignes 1 et 2 de la figure 7 correspondant aux fragments Ha-ras de 183 pb et aux fragment de 2-microglobuline provenant respectivement de cellules non traitées et de cellules traitées avec l'oligonucléotide platiné Ras 1, montrent que la synthèse des fragments de 183 pb de Ha-ras est fortement diminuée (70%). Il convient d'en conclure que l'oligonucléotide platiné Ras 1 est ponté à une large population d'ARNm de Haras. Il a été vérifié que l'oligonucléotide Rasl non platiné (ligne 3 de la figure 5), les oligonucléotides Scr platinés ou non platinés n'affecte pas le niveau de messager intact de Ha-ras. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1) Uhlmann, E., & Peyman, A. (1990) Chemin. Rev., 90, 543-583. 2) Wagner, R. W (1994) Nature, 372, 333-335. 3) Stein, C. A., & Cohen, J.S. (1988)\ Cancer Res., 48, 2659-2668. 4) Hélène, C., & Toulmé, J.J. (1990) Biochim. Biophys. Acta, 1049, 99-125. 5) Thuong, N. T., & Hélène, C. (1993) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32, 666-690. 6) Pantopoulos, K., Johansson, H. E., & Hentze, M. W. (1994) Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 48, 181238. 7) Stein, C. A., & Cheng, Y.-C. (1993) Science, 261, 14004-1012. 8) Gura, T. (1995) Science, 270, 575-577. 9) Woolf, T. D. (1995) Antisense Res. Dev., 5, 227-232. 10) Miller, P. S. (1996) Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 52, 261-291. 11. Melton, D. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 144-148. 12) Maher, J., & Dolnick, B. J. 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REVENDICATIONS 1) Procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucléotide sur un ARN, caractérisé en ce que l'on met en contact un oligonucléotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucléotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'oligonucléotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN et contient un adduit intrabrin au niveau d'un site de séquence 5'G N G, dans laquelle N représente un résidu de nucléotide quelconque, G représente un résidu guanine et 5' indique le sens de l'enchaînement des nucléotides dans 1 'oligonucléotide. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'oligonucléotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN dont la portion de séquence correspondant à l'adduit intrabrin de séquence 5'G N G de l'oligonucléotide platiné, est une séquence 5' X A (Y), dans laquelle - A représente un résidu adénine, - Y peut être absent, et dans ce cas X est choisi parmi les résidus uracile, cytosine, adénine, guanine, - Y s'il est présent, est un nucléotide quelconque, et dans ce cas X est un résidu uracile. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que 1'oligonucléotide platiné contenant l'adduit intrabrin est constitué d'un enchaînement d'au moins 10 nucléotides. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'oligonucléotide platiné contenant l'adduit intrabrin est constitué d'un enchaînement de ribonucléotides ou de désoxyribonucléotides naturels et/ou modifiés. 6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'oligonucléotide platiné contenant l'adduit intrabrin est un oligo-2'-0-alkyl-ribonucléotide. 7) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la purification d'un ARN contenant une séquence spécifique capable de s'hybrider avec 1 'oligonucléotide platiné. 8) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la détection d'une séquence d'ARN spécifique capable de s'hybrider avec 1 'oligonucléotide platiné éventuellement marqué. 9) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour le blocage sélectif d'une séquence d'ARN spécifique capable de s'hybrider avec 1 'oligonucléotide platiné. 10) Application selon la revendication 9 pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène par inhibition de la traduction de son ARNm. 11) Procédé selon la revendication 9 pour bloquer sélectivement la réplication et/ou le développement de virus, de bactéries ou de parasites. 12) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif une quantité adéquate d'oligonucléotides platinés contenant un adduit intrabrin, susceptibles de se fixer rapidement sur au moins une séquence spécifique d'ARN de façon à former des complexes d'hybridation pontés de façon irréversibleipar le biais d'adduits interbrins. 13) Oligonucléotide platiné pour son utilisation à titre de produit antisens permettant de bloquer rapidement, sélectivement et de façon irréversible la traduction d'un ARNm contenant une séquence substantiellement complémentaire de celle dudit oligonucléotide platiné.