Brevet FR2757178A1 — publié le 19980619

La présente invention concerne l'utilisation d'un vecteur exprimant l'ADN polymérase p comme ADN-médicament dans le cadre de la thérapie moléculaire du cancer et de maladies virales telles que le SIDA. Pour ces maladies, il existe essentiellement deux types de thérapies géniques qui sont l'immunothérapie et l'introduction de gènes "suicide" par des vecteurs viraux dans les cellules cibles. L'immunothérapie génique est l'utilisation de lymphocytes inflitrant les tumeurs (TIL), fortement tumoricides. Lorsqu'ils sont transformés, ils véhiculent vers la tumeur des gènes d'interleukines (IL2, IL4, IL6, interféron y) qui activeront localement la réponse immunitaire, permettant à la fois une limitation des effets secondaires sur l'organisme et une amplification de leur effet antitumoral. L'approche visant à transférer un "ADN médicament" ou gène thérapeutique dans une cellule tumorale a déjà été proposée (Culver et al., 1994) dans le cadre de l'utilisation de gènes tels que le gène HSV ti- de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain HSV-1 (Moolten et al., 1990 Culver et al., 1992) ou VZV tk s'il s'agit du virus de la Varicelle (Huber et al., 1991), les gènes bactériens gpt codant la xanthine/guanine phosphorybosiltransférase (Mroz et al., 1993) ou codA codant la cytosine désaminase (Mullen et al., 1992). Les produits de ces gènes "suicide" convertissent en produits très toxiques pour la cellule des agents à l'origine non toxiques comme le ganciclovir (GCV) dans le cas de HSV-TK, la 6-méthoxypurine (ara-M) avec VZV-TK, la 5-fluorocytosine (5-FC) avec CodA et la 6-thioxanthine (6-TX) avec GPT. Les gènes des thymidines kinases (TK) virales ont notamment été utilisés pour détruire plusieurs types de cellules cancéreuses (Moolten et al., 1990 ; Huber et al., 1991; Vile et al., 1993) rendant ces cellules sensibles à des analogues puriques ou pyrimidiques comme l'acyclovir (ACV), le ganciclovir (GCV) ou la bromovinyldésoxyuridine (BVDU). Ces analogues nucléosidiques sont transformés par les TK virales en formes diphosphorylées qui sont ensuite triphosphorylées par des enzymes cellulaires endogènes avant incorporation dans l'ADN tumoral par les ADN polymérases. L'incorporation de ces terminateurs de chaînes (absence de 3' OH) bloque la réplication de l'ADN et entraîne la mort cellulaire. La présente invention propose de mettre en oeuvre un gène suicide d'un type nouveau dont la fonction consiste à faciliter l'incorporation d'un analogue nucléotidique dans l'ADN de la cellule cible après phosphorylation de la prodrogue nucléosidique éventuellement par un gène suicide "classique". L'incorporation de nucléotides dans l'ADN est naturellement réalisée dans les cellules eucaryotes par les ADN polymérases. Parmi les ADN polymérases de mammifères, 1'ADN polymérase ss présente quelques particularités. L'ADN polymérase ss est un polypeptide de 39 kD et est une enzyme hautement conservée chez les eucaryotes supérieurs (Kornberg et al., 1992). Sa fonction primaire serait la réparation de l'ADN endommagé (Sobol et al., 1996) mais elle a aussi un rôle dans la réplication de l'ADN natif (Jenkins et al. 1992 ; Sweasy et al., 1992). L'ADN polymérase ss est exprimée à niveau constant au cours du cycle cellulaire (Zmudzka et al, 1988) et l'exposition de la cellule à des agents xénobiotiques comme les rayonnements induit son expression (Srivastava et al., 1995 ; Fornace et al., 1989). Elle se distingue des autres polymérases par sa petite taille et son caractère infidèle lors de la réplication de l'ADN, infidélité liée à l'absence d'activités exonucléasiques correctrices associées (Kunkel et al., 1986). In vitro il a été montré que 1'ADN polymérase ss incorpore le ddCMP (didésoxycytidine triphosphorylée), un inhibiteur de la synthèse de l'ADN, avec une efficacité comparable à celle observée pour l'incorporation de l'antagoniste naturel dCMP ou désoxycytidine monophosphate (Copeland et al. 1992). Des résultats très similaires ont été publiés avec l'AZT (Copeland et al., 1992 ; Parker et al., 1991). In vivo, 1'AZT-MP (azidothymidine monophosphorylé) est en effet incorporé dans l'ADN cellulaire (Sommadossi et al., 1989) et il a été suggéré que l'ADN polymérase ss joue un rôle dans ce processus (Parker et al., 1991). Ainsi, la présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'un vecteur exprimant l'ADN polymérase p ou un analogue de l'ADN polymérase p afin d'assurer l'intégration dans l'ADN d'une cellule d'analogues nucléotidiques à activité anti-virale ou anti-tumorale, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer ou d'une maladie virale telle que le SIDA. Par "analogue de l'ADN polymérase p", on entend toute séquence nucléotidique présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence nucléotidique de l'ADN polymérase ss de mammifère et remplissant les mêmes fonctions. La présente invention consiste donc à induire une surproduction intracellulaire d'une enzyme normalement faiblement présente dans la cellule, à savoir l'ADN polymérase ss, afin d'amplifier son caractère infidèle et mutagène et ainsi forcer l'intégration dans l'ADN d'analogues nucléotidiques. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour l'ADN polymérase p ou un analogue de l'ADN polymérase ss. Le vecteur est destiné à exprimer l'ADN polymérase p dans des cellules tumorales ou des cellules infectées par un virus tel que le virus du SIDA. Il est donc avantageux de placcr ledit gène sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans les cellules cibles. Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, le vecteur d'expression conforme à la présente invention comporte une séquence de ciblage et/ou d'expression spécifique de tissus dans lesquels on souhaite voir s'exprimer l'ADN polymérase ss (ou un analogue), tels que les tumeurs ou les tissus infectés par les virus ; à titre d'exemple, on peut citer les cellules souches hématopoïétiques en vue de l'éradication des lymphocytes CD4+ infectés par le virus HIV. Le vecteur d'expression selon la présente invention peut être tout vecteur couramment utilisé en thérapie génique et particulièrement un vecteur viral dérivé d'un virus choisi parmi les adénovirus, les virus adénoassociés, les rétrovirus (dont le HIV), les virus de l'herpès, les poxvirus, les parvovirus, les plasmovirus, les Semliki Forest virus et les Sindbis virus. Comme indiqué plus haut, 1'ADN polymérase ss permet l'incorporation d'analogues nucléotidique dans l'ADN. Or, certains analogues de nucléosides sont connus comme présentant une activité anti-virale quand ils sont phosphoryles, c'est-à-dire à l'état de nucléotides. C'est le cas notamment de l'AZT et de la ddC. Ces analogues de nucléosides sont normalement atoxiques pour les cellules. Cependant, après phosphorylation et en présence de l'ADN polymérase ss (ou analogue), ils sont incorporés dans l'ADN et en bloquent la réplication. La phosphorylation en question peut notamment être réalisée par des thymidine et/ou thymidilate kinases. Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, I'utilisation d'un vecteur exprimant l'ADN polymérase ss (ou analogue) conformément à la présente invention peut être potentialisée par l'expression, au sein des mêmes cellules ou tissus cibles, du gène de la thymidine et/ou thymidilate kinase. Les cellules au sein desquelles s'expriment l'ADN polymérase p et la thymidine et/ou la thymidilate kinase sont donc rendues plus sensibles aux analogues nucléosidiques tels que l'AZT ou la ddC qui, in situ, sont phosphorylés avant d'être incorporés dans l'ADN. Le gène de la thymidine et/ou thymidilate kinase peut être inséré sur le même vecteur que celui exprimant l'ADN polymérase p ou sur un autre vecteur. Dans ce dernier cas, la cellule cible subira une cotransfection pour permettre l'expression de chacun des gènes concernés. Dans tous les cas, le gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sera placé sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans les cellules cibles à atteindre. La présente invention a également pour objet les cellules transformées par un vecteur d'expression conforme à l'invention comportant un gène codant pour l'ADN polymérase ss (ou analogue) et éventuellement comportant également un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase ainsi que les cellules transformées par un vecteur d'expression conforme à l'invention comportant les deux susdits gènes. Par ailleurs, il est à souligner que les vecteurs conformes à la présente invention peuvent être utilisés comme vecteurs de clonage. En effet, I'insertion d'un lieur multisite (polylinker) dans le gène codant pour l'ADN polymérase ss (ou un analogue) sans modifier le cadre de lecture, luimême inséré dans un vecteur tel que pUT-pol p ou pZllTk ss, permet de cloner un gène d'intérêt. Les cellules recombinantes transfectées par ce type de vecteur sont aisément sélectionnables puisque devenues résistantes aux analogues nucléosidiques tels que l'AZT ou la ddC, suite à l'inactivation du gène de l'ADN polymérase ss (ou analogue). Enfin, la présente invention a pour objet un produit contenant un vecteur d'expression selon l'invention comportant un gène codant pour l'ADN polymérase ss (ou analogue) et un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase ou deux vecteurs d'expression comportant chacun l'un des gènes en question et au moins un agent anti-viral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Préférentiellement, l'agent anti-viral est l'AZT ou la ddC. Il convient également de noter que la mise en oeuvre des vecteurs d'expression et/ou des cellules transformées par ces vecteurs d'expression, conformément à la présente invention dans le cadre du traitement de cancers ou de maladies virales telles que le SIDA, peut être associée à tout autre traitement classique tel que la chimiothérapie ou la radiothérapie. La Figure 1 représente la construction du vecteur pUT-pol ss à partir du vecteur pUT 687. La Figure 2 représente le pourcentage de survie des cellules d'E coli SC 18-12 transformées par le vecteur pUT-pol p à différentes températures, en présence d'AZT. La Figure 3 représente la construction du vecteur pZHTk ss à partir du vecteur pZEOSGO. La Figure 4 illustre la comparaison, en pourcentage de survie, des cellules B16 transfectées par le vecteur pUT-pol p ou par un vecteur contrôle pUT 526 A en présence de ddC. La Figure 5 illustre la comparaison, en pourcentage de survie, des cellules B16 transfectées par le vecteur pUT-pol ss ou non par le vecteur pUTpol ss en présence d'AZT. La Figure 6 illustre la comparaison, en pourcentage de survie, des cellules B16 transfectées par un vecteur exprimant l'ADN polymérase ss, par un vecteur exprimant les activités thymidine et thymidilate kinases ou par un vecteur exprimant les deux. La présente invention ne se limite pas à la susditc description mais en englobe au contraire toutes les variantes ; de plus, elle sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-dessous qui ne sont donnés qu'à titre purement illustratif. EXEMPLE 1 Construction d'un vecteur plasmidique surexprimant I'ADN polymérase p. Matériel L'AZT (Retrovir IV, zidovudine, Azidothymidine) ct le Ganciclovir (Cymevan) proviennent respectivement des laboratoires Wellcome, Paris et Syntex, Puteaux. S.A. La Zéocine est produite par la société CAYLA, Ioulouse. Les informations concernant les souches bactériennes d' E. coli utilisées sont rassemblées dans le tableau suivant Souches Génotypes Sources MC 1061 D(ara leu) aral) galU galK hsdS O. Fayet (IBCG, Université de rpsl.j(lac IOPZYA)X74 ArecA Toulouse III) SC 18-12 lonll, sulA 1, trpE65, uvrA 155, Witkin (Waksman Institute, fadas :TnlO, recAl 78, polA12 State University, New Jersey) Milieux de cultures: - Milieu complet LB (par litre) : tryptone 10 g, extrait de levure 5 g, NaCI 10 g, agar 15 g, H20 qsp 1 1. - Milieu minimum M9CA (par litre) : Na2HPO4 2H20 8,5 g, KH2PO4 3 g, NaCI 0,5 g, NH4CI I g, glucose 0,4 %, hydrolysat de caséine 0,2 %, agar 1,5 g, H2O qsp 11. - Milieu NA (par litre) : Bacto Nutrient Agar de Difco, Bacto Beef Extract 3 g, Bacto Peptone 5 g, NaCI 10 g, agar 15 g, H2O qsp 11. Transformation Les cellules compétentes sont préparées d'après la méthode de Kushner. 25 ml de LB stérile sont ensemencés par la souche, et à DO600 = 0,4 centrifugés 15 minutes à 5 000 rpm, à 4 C. Les cellules sont reprises dans 2,5 ml de CaCl2 0,1 M / MOPS 10 mM / Glucose 0,5 % froid laissé 30 minutes à 0 C. 100 crl de cellules compétentes sont incubées avec l'ADN plasmidique (volume inférieur à 10 \Ll, 10 à 50 ng pour un plasmide ccc) 30 minutes dans la glace puis 5 minutes à 42"C sans agitation. Du milieu LB est alors ajouté à température ambiante (qsp 1 ml) et les cellules sont mises à 37"C (MC 1061) ou à 30 C (SC 18-12 thermosensibles) sous agitation (New Brunswick 300 rpm) pendant lh30 pour l'expression phénotypique puis étalées sur milieux sélectifs Amp (LB + Ampicilline 100 pour le vecteur pUT, ou Zéo (LB + Zéocine 20 g/ml) pour le vecteur pTG. Clonage Les fragments d'ADN issus des digestions enzymatiques appropriées sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à bas point de fusion Sea Plaque (FMC) à 0,7 % dans du tampon TAE (Tris-acétate 0,004 M / EDTA 0,001 M). Les bandes choisies sont découpées, liquéfiées dans du TE 1X ajusté à 0,5 M NaCI et le tout est chauffé 10 minutes à 70"C. Les solutions d'ADN sont alors purifiées par extraction au phénol-CHISAM puis précipitées avec un volume d'isopropanol + 1 cil de glycogène. Les culots sont alors séchés et repris dans un volume minimum d'eau stérile (10 cri). Les fragments d'ADN requis sont mélangés et incubés dans un tampon de ligation (Tris-llCl 66 mM, Mg Cl2 5 mM, Poly Ethylène Glycol 1 mM, ATP 1 mM, pH 7,5) avec une unité de ligase de phage T4 (20 il final) à 16 C durant une nuit. Le produit de ligation est ensuite utilisé pour transformer la souche adéquate. La sélection adaptée est soit la résistance à l'ampicilline 100 Fg/ml, soit à la Zéocine 20 Fg/ml, en fonction du plasmide. Extraction de 1'ADN tlasmidicue: Les plasmides sont préparés selon la méthode de Birboim et Doly (Birboim & coll., 1979) par lyse alcaline des bactéries à partir de stries sur boîtes ou de cultures de 25 ml. L'ADN plasmidique des transformants est extrait et vérifié par analyse de restriction. Conditions standard de PCR: La réaction de Polymerase Chai n Reaction se réalise dans des microtubes de 500 cil contenant 5 Crl de Tampon, MgC12 à 150 crM, mélange des 4 dNTP (250 pM chacun), 10 ng d'ADN matrice et 500 ng de chaque oligonucléotide amorce dans un volume réactionnel de 100 il, sur lequel 2 à 3 gouttes d'huile sont ajoutées dans le but d'éviter toute évaporation. Après 7 minutes de prédénaturation à 95 C, 2,5 unités d'enzyme Tfl Polymérase (EPICENTRE) sont ajoutées Hot-Start . L'amplification est obtenue à la suite de 25 cycles de dénaturation (94"C, 1 min), hybridation (55"C, 1 min) et extension par la polymérase (72"C, 1,5 min). Les amorces utilisées sont constituées de deux parties : une partie s'hybridant avec une extrémité du gène à cloner et une partie non hybridante qui comporte un site de restriction compatible avec le site de clonage dans le vecteur d'expression. Purification du produit de la PCR par électrophorèse en gel d'agarose 0,7 % à bas point de fusion Sea Plaque (TEBU) et contrôlé par digestion enzymatique. Les extrémités sont clivées et ligaturées à l'intérieur des sites complémentaires du plasmide d'expression (Enzymes Biolabs et Boehringer). Gène de la Polymérase Bêta de rat: Le cDNA de l'ADN Polymérase de rat purifiée a généreusement été donné par le Dr. Wilson (Galveston, Texas, USA). La séquence de ce gène a été obtenue par la banque de donnée Européennc EMBL Vecteur Un vecteur a été construit dans lequel le cDNA du gène de la polymérase de rat a été cloné après amplification par la technique de PCR. pUT-Pol B Le plasmide pUT-Pol ss résulte du remplacement du gène de la thymidine kinase d'E. coli (fragment Ncol - Avril) par la polymérase ss (fragment NcoI - Nhel) en fusion avec le gène de résistance à la Zéocine dans le plasmide pUT 687. Le gène de la polymérase ss est placé sous le contrôle de deux promoteurs forts et constitutifs en tandem, le promoteur bactérien EM7 et le promoteur eucaryote du gène de la TK de HSV avec son enhancer, vecteur dit "navette" utilisable chez E. coli et en cellules eucaryotes (Figure 1). Amorce 5': Ajout de 2 bases CA permettant au gène de la polymérase p de rat d'être introduit en phase ouverte de lecture. Ces 2 bases vont créer un codon GCA codant pour une Alanine. Le site Nco I apporte à la construction le site d'initiation de la traduction ATG. Amorce 3': perte du site unique de restriction Avr Il du plasmide lors de la ligation Avr II / Nhe I. Perte également du codon "Stop" du gène de la polymérase Bpour permettre la fusion de ce gène avec le gène de résistance à la Zéocine, une contre sélection des clones à l'AZT va permettre de sélectionner les clones ayant perdu la thymidine kinase de E. coli. Résumé de la construction du vecteur pUT-pol ss: Vecteur Construit pUT - Pol ss Vecteur Parental pUT 687 Thymidine Kinase E coli:: Zéo Zéocine Apport de résistance (si la fusion est correcte) Ampicilline Gène cloné cDNA Polymérase ss de rat Amorce PCR 5'TATTCC ATGGCA CTC GTG GAACTCGCAAACTTT 3' Site de restriction Nco I: CC ATG G apporté GGTACC Amorce PCR 3' 5' TTAAGCTAGCTCACTCCTGTC CITGGGCTC 3' Site de restriction Nhe I: GCTAGC apporté CGA TCG Ligation en 5' Nco I / Nco I en 3' nhe I / Avr Il Détermination de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice): Les cellules sont étalées sur milieu LB solide toute la nuit. Elles sont reprises dans 1 ml de milieu LB à 20 % glycérol final et stockées à - 70 C. 5 iil d'une suspension de 0,5 ml de milieu M9CA, sont inoculés avec une quantité estimée constante de cellules congelées prélevées à l'anse de platine de façon à obtenir une DO600 = 0,1-0,2, et déposée sur du milieu M9CA contenant des concentrations croissantes de drogue. Après une nuit à 37oC, la concentration létale est notée pour les différentes souches. Tests de survie Le test de survive permet de mettre en évidence la sensibilisation de la souche à la drogue par l'ADN polymérase ss Les bactéries E. coli B/R SC 18-12 sont incubées durant la nuit dans 25 ml de milieu NA liquide avec ampicillinc 35 Fg/ml, à 30"C sous agitation (New Brunswick 300rpm), diluées de façon à obtenir une DO600 = 0,1-0,2 dans 20 ml de milieu NA, et replacées en culture dans les mêmes conditions que précédemment jusqu'à l'obtention d'une DO600 = 0,4, elles sont ensuite diluées 105 fois dans du milieu M9CA liquide, 100 zI sont étalés sur des boîtes M9CA à différentes concentrations en drogue, mises à incuber 1 à 2 jours à 37"C ou à 30"C. Le nombre de colonies est compté sur chacune des boites, et le pourcentage de survie est déterminé par rapport à la valeur maximale de la boîte témoin sans drogue. Parallèlement, la souche d'E coli SC 18-12 mutante RecA polA12 a été transformée par le vecteur pUT-Pol ss. L'ADN polymérase I est thermosensible à 37"C, mais fonctionne à 30"C. La surexpression de l'ADN polymérase p, à une température non permissive de 37"C, restaure la viabilité, comme attendu. Les plasmides de ces bactéries ont été extraits, digérés par Eco Pl, et les profils électrophorétiques vérifiés. Avec les sondes utilisées pour le clonage, nous avons également effectué un contrôle par PCR et le gène de l'ADN polymérase B est bien porté par les plasmides extraits des bactéries étudiées. Une autre souche bactérienne MC 1061 a également été transformée par le vecteur pUT-Pol B, dans le but d'observer une modification de la Concentration Minimale Inhibitrice à l'AZT et au Ganciclovir par l'ADN polymérase p. 1 - Souche MC 1061 / DUT-Dol B Vis-à-vis de l'AZT: Les "spots" obtenus sur les boîtes pour les bactéries MC 1061-pUT Pol ss montrent que vis-à-vis de l'AZT, la valcur de la CMI passe de 0,03 cig/ml pour la souche témoin parentale à 0,001 yg/ml (facteur 30), sans la présence du gène suicide de thymidine kinase-HSV1. L'AZT est toxique pour les bactéries. Les résultats sont rassemblés dans Ic tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Concentrations Minimales Inhibitrices ( g/ml): AZT Azidothynlidine MC 1061-TK+ 0,03 non transformée MC 1061-TK+ o,oeî pUT- Pol ss 2 - Souches SC 18-12 / sUT-nol R Vis-à-vis de l'AZT (Figure 2): L'expérience à 37 C montre un effet de dose/réponse pour l'AZT comme attendu. La CMI chute avec la souche SC 18-12/pUT-Pol ss d'un facteur 3 à 30 C et d'un facteur 30 à 37 C par rapport à la souche parentale à 30 C. Ceci nous confirme la fonctionnalité de notre vecteur et montre que l'effet a suicide" de l'ADN polymérase p en cellules bactériennes existe. EXEMPLE 2 Des cellules animales CHO ou B16 surexprimant Pol ss deviennent sensibles à la ddC et à l'AZT. Milieux de cultures: Le matériel provient de chez BIOWHI5AKER. Etuve HERAEUX à 37 C, CO2 5%. CHO : les cellules d'Ovaire d'hamster Chinois (Lignée fournie par J. Tessié-IBCG-Toulouse) sont cultivées dans un milieu ct-MENI-HEPES sans L Glutamine, supplémenté par du sérum foetal de veau (SVF 10 %), L-glutamine, pénicilline / streptomycinc (PS 50 g/ml). B16 : les cellules de mélanome murin (Lignée B16b16 fournie par S. Cros-I.P.B.S.-Toulouse) sont cultivées dans un milieu RPMI 1640, supplémenté par du sérum de cheval (SH 10 %), pénicillinc / streptomycine (PS 50 cig/ml). Transfection des cellules CR0 I B16 La technique utilisée pour les 2 types de cellules est identique , seuls quelques paramètres sont différents. Un nombre de cellules à confluence (CHO = 2.105/B16 = 4.105) est passé dans 2 ml de milieu supplémenté. A 24 heures les cellules à subconfluence sont lavées au PBS, et placées dans 1 ml de milieu sans sérum contenant 10 ul de polybrène Aldrich (1 -/-) et 10 g d'ADN. A 30 heures pour les CR0 et à 40 heures pour les B16, les cellules subissent un choc DMSO (1 ml DMSO 30 % pendant 3-4 minutes), 2 rinçages avec du milieu sans sérum, incubation 72 heures, ajout de la sélection à la Zéocine (CHO 100 llg/ml, B16: 10 g/ml). Récupération des clones Environ 15 jours pour les CHO (3 à 4 semaines pour les B16) après lavage au PBS, les clones sont récupérés par grattage avec la micropipette dans 5 u1 de milieu, et déposés individuellement ou en "Pool" dans une boîte d'un diamètre de 35 mm contenant 2 ml de milieu supplémenté avec Zéocine (100 ou 10 g/ml). Détermination de la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice): Les cellules à confluence sont décollées par de la trypsine après rinçage au PBS (Phosphate Buffer Saline / Biowittaker) et reprises dans 1 ml de milieu approprié avec sérum et antibiotiques. On ajoute l ml de milieu supplémenté dans chaque puits (plaque Nunc à 24 puits), 2 000 cellules pour les CR0 ou B 16, et les différentes prodrogues de concentrations croissantes On fait une première lecture des CMI après 5 jours pour les CHO et 7 jours pour les B16 , le milieu est remplacé par un milieu sans drogue et l'on détermine à 10 et à 14 jours respectivement la véritable CMI. Etudes dc toxicité de l'ADN Dolymérase B surexpriméc en cellules eucarvotes CîlO et B16: L'ADN polymérase fi est une enzyme eucaryote constitutive, dite de house-keeping . Une surexpression constitutive de cette polymérase ne devrait pas présenter une toxicité trop importantc pour les cellules transfectées. Les deux types cellulaires (CHO et B16) ont été transformés par les vecteurs. Dans les deux cas le plasmide introduit ne pourra pas se répliquer et devra s'intégrer aléatoirement dans le génome cellulaire. Pour ces raisons un pool de 5 clones de CHO a aussi été testé pour avoir une confirmation globale et précise sur ce type de cellule. Le vecteur pUT-Polp, montre que la surexpression de l'ADN polymérase p seule, n'est certainement pas toxique pour la cell 5' TWfCAGTGACCGGCGCCTAGT 3' 5' GGGAGCCCAAGGACAGGAGTGAATGATTCGAACTTT 3' Le fragment PCR après coupure Bbrpl-BstBI a été inséré dans un vecteur pZEOSG0 ouvert par Spel-BstBI puis traité par la polymérase de Klenow à l'extrémité Spel. pZEOSG0 dérive de pZEOSV1 (Cayla, VECT 2001). La fonctionnalité de la construction a éte vérifiée en utilisant des souches bactériennes E coli, 1 - soit en transformant la souche SC 18-12 pour l'expression de pol p, 2 - soit en transformant une souche SC 18-12 tk- déficiente pour l'activité thymidine kinase pour l'expression thymidine kinase de HSV TK. Le mutant tk- a été obtenu en étalant des bactéries SC 18-12 sur un milieu contenant de 1 'AZT. Seules les cellules déficientes en activité TK poussent sur un tel milieu puisque 1'AZT n'est alors pas phosphorylé et n'est donc pas incorporable dans l'ADN, 3 - soit en transformant la souche TD205, mutant thermosensible pour l'activité thymidilate kinase, pour l'activité thymidilate kinase de HSV TK. Le tableau 3 ci-dessous montre que les sensibilités des souches utilisées à la zéocine, à l'AZT ou à une température non permissive sont annihilées après transformation par le plasmide portant le gène hybride HSVtk::Sh et le cDNA de pol p. Tableau 3 Survie (%) E coli 37 C 42 C Zéocine AZT 25 Fg/ml 10 g/ml SC 18-12 100 5 5 ND SC 18-12/pZHTkss 90 50 97 ND SC 18-12 tk- ND ND ND 100 SC 18-12 tk-/pZHk- ND NU) NU) 2 TD205 100 11 ND ND TD205/pZHTkss 100 78 ND ND EXEMPLE 4 Sensibilité des cellules de mélanomes murins transfectées par pUTpolss au ddC. Des cellules cancéreuses hautement métastasiques de mélanomes murins, les cellules B16, ont été transfectées par la méthode du DMSO/polybrène par le vecteur pUT-pol ss. Des extraits de cellules recombinantes ont été réalisés puis analysés par Western blot contre des anticorps anti-polp. Cette expérience a montré la surexpression de pol p dans les cellules transfectées. Nous avons aussi montré lors de tests de réplication d'ADN que ces extraits permettaient une incorporation in vitro de ddC triphosphorylée au sein du substrat nucléotidique riche en G 3'CATACGAGAACCAACAT 5' 5' GGTGGTGGTGGGCCGGTGAATTGGCACTGCCGTCGTATGCTCTTGGTTGTA 3' Ce résultat montre la spécificité de pol ss dans l'incorporation de la ddC dans l'ADN, entraînant le bloquage de la réplication de ce dernier. La figure 4 montre la toxicité de la ddC sur des cellules B16 transfectées par pUT-pol p par rapport à des cellules transfectées par un vecteur contrôle pUT526 ne contenant pas polp mais seulement le gène de sélection Sh. La survie cellulaire a été mesurée en colorant les cellules traitées au Giemsa afin de comptabiliser celles ayant survécu à la mise en présence des drogues. EXEMPLE 5 Des cellules de mélanomes murins transfectées par pUTpol B sont sensibles à AZT. Des expériences similaires aux précédentes ont éte menées en utilisant l'AZT. La figure 5 montre l'effet toxique de l'AZT sur des cellules transfectées par pUT-pol ss. EXEMPLE 6 Des cellules dc mélanomes murins exprimant lISV TK::Sh ct Pol p sont plus sensibles à l'AZ'l' que des cellules exprimant HSV TK::Sh ou Pol p séparément. Des cellules B16 ont été transfectées avec le vecteur pZHTkss coexprimant Pol ss et une protéine HSV TK::Sh fusionnant, - HSV TK exprimant les activités thymidine (TK) et thymidilate kinases (TMK) du virus de l'herpès HSV-1, c'est-à-dire capable de mono- puis diphosphoryler la thymidine et aussi une large gamme d'analogues nucléosidiques, - la protéine Sh conférant la résistance à la zéocine. la a figure 6 indique que ces cellules sont plus sensibles à l'AZT que des cellules exprimant Pol ss::Sh ou I1SV TK::Sh séparément. REFERENCES CITEF-S 1. Culver, K. W., Van Gilder, J., Link, C. J., Carlstrom, T., Buroker, T., Yuh, W., Koch, K., Schabold, K., Doornbas, S. and Wetjen, B. Gene therapy for the trcatment of malignant brain tumors with in vivo tumor transduction with the herpes simplex thymidine kinase gene/ganciclovir system. Hum. Gene Ther., 5: 343-379,1994. 2. Moolten, E. L. and Wells, J.M. Curability of tumors bearing herpes thymidine kinase genes transferred by retroviral vectors. J. Natl. Cancer Inst., 82:297-300, 1990. 3. Culver, K. W., Ram, Z. Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E. H. and Blaese, R. M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 256:1550-1552, 1992. 4. Huber, B. E., Richards, C. A. and Krenitsky, T. A. Retroviralmediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: an innovative approach for cancer therapy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 8039- 8043, 1991. 5. Mroz, P. J. and Moolten, F. L Retrovirally transduced Escherichia coli gpt genes combine selectability with chemosensitivity capable of mediating tumor eradication. Hum. Hene Ther, 4 : 589-95,1993. 6. Mullen, C. A., Kilstrup, M. and Blaese, R. M. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine : a negative selection system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 33-7,1992. 7. Vile, R. G. and Hart, I. A. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer Res. 53:386S386A,1993. 8. Kornberg, A. and Baker, T. Eukaryotic DNA polymerases. In : DNA replication, 2nd ed., pp. 197-225. New York: Freeman, W. Il., 1992. 9. Sobol, R. W., Horton, J. K., Kühn, R., Gu, H., Singhal, R. K., Prasad, R., Rajewsky, K. and Wilson, S. II. Requirement of mammalian DNA polymerase-ss in base-excision repair. Naturc, 379:183-186, 1996. 10. Jenkins, T. M., Saxena, J. K., Kumar, A., Wilson, S. H. and Ackerman, E J. DNA polymerase p and DNA synthesis in Xenopus oocytes and in a nuclear extract. Science, 258 : 475-478,1992. 11. Ssveasy, J. B. and Loeb, L. Mammalian DNA polymerase p can substitute for DNA polymerase I during DNA replication in Escherichîa coli. J. Biol. Chem., 267:1407-1410,1992. 12. Zmudzka, B. Z., Fornace, A., Colins, J. and Wilson, S. H. Characterisation of DNA polymerase ss mRNA : ccll-cycle and growth responsc in cultured human cells. Nucleic Acids Res., 16 : 9589-9596, 1988. 13. Srivastava, D. K., Rawson, T. Y. Showalter, S. D. and Wilson, S. H. Phorbol ester abrogates up-regulation of DNA polymerase p by DNAalkylating agents in Chinese Hamster Ovary cells. J. Biol. Chem., 270 : 16402- 16408, 1995. 14. Fornace, A. J., Zmudzka, B., Hollander, M. C. and Wilson, S. H. Induction of p-polymerase mRNA by DNA damaging agents in Chinese Hamster Ovary cells. Mol. Cell. Biol. 9:851-853,1989. 15. Kunkel, T. A. Frameshift mutagenesis by eucaryotic DNA polymerases in vitro. J. Biol. Chem., 261:13581-13587,1986. 16. Copeland, W. C., Chen, M. S. and Wang, T. S. F. Human DNA polymerases Q and p are able to incorporate anti-HIV deoxynucleotides into DNA. J. Biol. Chem., 267:21459-21464, 1992. 17. Parker, W. B., White, E L, Shaddix, S. C., Ross, L J., Buckheit, R. W., Germany, J. M. Secrist, J. A., Vince, R. and Shannon, W. M. Mechanisms of inhibition of human immunodeficiency virus type I reverse transcriptase and human DNA polymerases Q, p and y by the 5'-triphosphates of carbovir, 3'-azido-3'deoxythymidine, 2',3'-dideoxyguanosine, and 3'-deoxythymidine. J. Biol. Chem., 266: 17541762,1991. 1 8. Sommadossi, J. P., Carlisle, R. and Zhou, Z. Cellular pharmacology of 3'-azido-3'-deoxythymidine with evidence of incorporation into DNA of human bone marrow cells. Mol. Pharmacol., 36 : 9-14, 1989. REVENDICATIONS 1/ Utilisation d'un vecteur exprimant l'ADN polymérase P ou un analogue de l'ADN polymérase ss afin d'assurer l'intégration dans l'ADN d'une cellule d'analogues nucléotidiques à activité anti-virale ou anti-tumorale, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer ou d'une maladie virale telle que le SIDA 2/ Utilisation d'un vecteur selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit vecteur comporte un gène codant pour l'ADN polymérase ss ou pour un analogue de l'ADN polymérase ss sous Ic contrôle d'un système d'expression efficace dans ladite cellule. 3/ Utilisation d'un vecteur selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit vecteur comporte également un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans ladite cellule. 4/ Utilisation d'un vecteur la revendication 1 ou 2, en association avec un vecteur exprimant la thymidine et/ou thymidilate kinase. 5/ Utilisation d'un vecteur selon la revendication 4, caractérisée en ce que le vecteur exprimant la thymidine et/ou thymidilate kinase comporte un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans ladite cellule. 6/ Vecteur d'expression comprenant un gène codant pour la polymérase ss ou un analogue de la polymérase ss sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans une cellule cible. 7/ Vecteur d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 8/ Vecteur d'expression selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral dérivé d'un virus sélectionné parmi les adénovirus, les virus adéno-associés, les rétrovirus (dont le FIV), les virus dc l'herpès, les poxvirus, les parvovirus, les plasmovirus, les Semlikî Forest virus et les Sindbis virus. 9/ Vecteur d'expression selon l'une des revendications G à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence dc ciblage et/ou d'expression spécifiquc de tissus. 10/ Vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur viral pUT pol p ou du vecteur pZll tk pol fr 11/ Vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte cn outre un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans une cellule cible. 12/ Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 11. 13/ Cellule transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 11, ct par un vecteur d'expression comportant un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans une cellule cible. 14/ Vecteur de clonage, caractérisé cn ce qu'il comporte un gène codant pour I'ADN polymérase ss ou un analogue de l'ADN polymérase ss dans lequel a été inséré un lieur multisite. 15/ Produit contenant un vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 11 et au moins un agent anti-viral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. 16/ Produit contenant un vecteur d'expression selon l'une des revendications 6 à 10, contenant en outre un vecteur d'expression comportant un gène codant pour la thymidine et/ou thymidilate kinase sous le contrôle d'un système d'expression efficace dans une cellule cible. 17/ Produit selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'agent anti-viral est l'AZT ou la ddC.