Brevet FR2755380A1 — publié le 19980507

La présente invention est relative à un procédé et à un dispositif de fabrication d'une plaque de puits, notamment pour échantillons de produits chimiques ou biologiques et, plus particulièrement, à une telle plaque réalisée à partir d'une feuille en un matériau thermoformé à l'état plastique. On connaît de telles plaques de puits pour pratiquer des essais ou des cultures biologiques, réalisées à partir d'une feuille de matière plastique organique (du polycarbonate par exemple) thermoformée. Les échantillons contenus dans les puits doivent souvent être observés au microscope à travers le fond des puits, notamment lorsque ces échantillons contiennent des cellules vivantes qui se rassemblent par gravité au fond de ces puits. Les plaques réalisées en matière plastique organique ne conviennent alors généralement pas du fait de propriétés optiques défavorables telles que biréfringence, fluorescence de la matière, surface sans "fini" optique, etc... Pour pallier cet inconvénient, on connaît une plaque dite "de microtitration" réalisée en matière plastique moulée par injection, cette plaque comportant une distribution bidimensionnelle d'alvéoles sans fond. On colle une plaque de polycarbonate de qualité optique contre l'ensemble des alvéoles de manière à constituer le fond de chacune d'elles de manière à former ainsi des puits. Une telle plaque autorise évidemment des observations au microscope à travers les fonds des puits mais elle présente l'inconvénient d'exiger un collage de la plaque de polycarbonate à l'aide d'un produit adhésif susceptible de polluer les cultures à venir. Cette opération de collage grève en outre le prix de revient de fabrication de la plaque. La présente invention a pour but de réaliser une plaque de puits qui ne présente aucun de ces inconvénients et qui, par conséquent, autorise des observations au microscope tout en étant de fabrication peu coûteuse. On atteint ce but de l'invention ainsi que d'autres qui apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, avec un procédé de fabrication d'une plaque de puits du type décrit en préambule de la présente description, ce procédé étant remarquable en ce que a) on réalise un moule percé d'une pluralité de trous distribués conformément à une distribution de puits à former dans ladite feuille, b) on dispose ladite feuille sur ledit moule et on porte la feuille à une température où elle est à l'état plastique, et c) on établit entre les deux faces de la feuille une différence de pression de gaz de manière que la matière de ladite feuille, au droit des trous du moule, soit aspirée dans ces trous pour prendre la forme de puits à fonds écartés de tout contact avec d'autres surfaces. Comme on le verra dans la suite, ce procédé permet aux deux surfaces en regard du fond d'un puits de conserver un état de surface ou "fini" de qualité optique compatible avec une observation à travers ce fond, ce fini optique restant intact du fait que pendant le moulage, tout contact entre le fond du puits et d'autres surfaces susceptibles d'altérer son état de surface, est évité. Pour la mise en oeuvre de ce procédé, l'invention fournit un dispositif comprenant a) un moule présentant une face prévue pour recevoir une feuille du matériau thermoformable, ledit moule étant percé, perpendiculairement à cette face, d'une pluralité de trous, b) une enceinte délimitant avec ledit moule un espace, c) des moyens pour chauffer la feuille et la porter à l'état plastique, et d) un générateur de gaz en dépression sélectivement connectable audit espace pour thermoformer des puits dans ladite feuille, par aspiration dans lesdits trous de la matière de ladite feuille située au droit desdits trous. Le procédé suivant l'invention permet de réaliser une plaque de puits comprenant une distribution de puits thermoformés dans une feuille en un matériau thermoplastique, cette plaque étant remarquable en ce que deux faces de la paroi des puits formés dans la feuille présentent un fini optique. Le matériau thermoplastique utilisé est de préférence un verre minéral. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre et à l'examen du dessin annexé dans lequel - la figure 1 est un schéma d'un premier mode de réalisation d'un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, - la figure 2 est une vue perspective d'une partie d'une plaque de puits obtenue à l'aide du dispositif de la figure 1, - la figure 3 est une vue en coupe de la plaque suivant l'invention, montée sur un cadre adapté à cette plaque, et - la figure 4 est un schéma d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif pour mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention. On se réfère à la figure 1 du dessin annexé où l'on a représenté en coupe, une enceinte 1 délimitant un espace 2 pouvant être mis en communication avec un générateur de dépression (non représenté) par l'intermédiaire d'un conduit 3. L'enceinte est fermée par un moule 4 prenant la forme générale d'une plaque plane percée de trous cylindriques 51, 52 ... 5i, etc... d'axes perpendiculaires à sa surface. Ces trous peuvent aussi être coniques et présenter alors une conicité de 5 à 20 . Ils peuvent être de section circulaire ou polygonale, par exemple carrée, arrondie aux arêtes. Les trous sont de préférence de géométrie identique et agencés suivant une distribution bidimensionnelle régulière dense, en lignes et en colonnes. Pour réaliser une plaque de puits suivant l'invention, on place l'enceinte 1 dans un four, après avoir posé sur le moule 4 une feuille d'un matériau thermoplastique tel qu'un verre minéral ou un matériau organique tel qu'un polycarbonate. L'état de surface de la feuille doit être compatible avec celui, de qualité optique, recherché pour les parois des fonds des puits à réaliser. Le four est porté à une température où le verre atteint une viscosité compatible avec une opération de thermoformage. On établit alors une dépression dans l'espace 2, par rapport à la pression de gaz régnant dans le four, et notamment au niveau de la surface de la plaque opposée à celle qui fait face à l'espace 2. Sous l'effet de la différence des pressions de gaz, la plaque de verre se déforme dans les plages de cette plaque qui ferment les trous 5i. . Ces plages sont aspirées vers l'espace 2 et prennent alors progressivement une forme sensiblement hémisphérique. Suivant une caractéristique importante de la présente invention, la température de la plaque, la durée de l'application de la dépression dans l'enceinte 1 et la valeur de cette dépression sont ajustées de manière qu'au cours de leur déformation progressive, les plages aspirées de la plaque restent constamment à l'écart des surfaces des trous et de toute autre surface en général. On assure ainsi la fabrication d'une plaque 6 de puits 71,72,...7i, etc... telle que représentée en coupe à la figure 1, les deux faces de la paroi de chaque puits présentant un fini optique parfait du fait de l'absence de tout contact entre ces surfaces et les surfaces du moule pendant l'opération de thermoformage sous vide de ces puits. On comprend que le fini optique ainsi obtenu est très favorable à une observation de cultures biologiques, par exemple, à travers les fonds des puits où ces cultures sont pratiquées. Il en est particulièrement ainsi quand le matériau utilisé pour réaliser la plaque est un matériau de qualité optique, tel qu'un verre organique ou minéral. Pour des cultures biologiques, le choix d'un verre minéral est particulièrement approprié, du fait de son inertie chimique. On remarquera encore que la plaque de puits 6 suivant l'invention présente des puits dont la paroi est plus mince au fond des puits qu'au débouché de ceux-ci, du fait du procédé de thermoformage sous vide utilisé pour réaliser ces puits. Le procédé de fabrication suivant l'invention permet ainsi de réaliser des plaques de puits à fond d'épaisseur faible, inférieure à 0,2 mm par exemple, compatible avec des observations au microscope à très courte distance focale tel que par exemple les microscopes confocaux. On a représenté à la figure 3 l'objectif 20 d'un tel microscope, en position d'observation du fond d'un puits, à travers une goutte 21 d'un liquide adaptateur d'indice. On va maintenant décrire, à titre d'exemple illustratif et non limitatif, un mode de réalisation de la plaque de puits suivant l'invention telle qu'elle apparaît aux figures 2 et 3. Celle-ci est réalisée à partir d'une feuille plane en verre référencé 0211 dans les catalogues de la société Corning Incorporated, cette plaque couvrant une surface de 80 mm x 116 mm et comprenant 96, 384 ou 1536 puits agencés en 8, 16 ou 32 rangées adjacentes de 12, 24 ou 48 puits, respectivement. La plaque peut avoir aussi les dimensions standard d'une lame de microscope (26 x 76 mm) et comporter alors, par exemple 60 ou 250 puits. Le pas des puits est compatible avec les moyens usuels de distribution multicanaux à pipettes. Pour thermoformer de telles plaques, on a réalisé un moule 4 en alliage réfractaire référencé NS 30 dans les catalogues de la société UGINE (AFNOR Z12CN25-20), ce moule étant percé de trous de 2 mm de profondeur et de 2 mm de diamètre, ces trous étant séparés par des parois d'épaisseur 0,25 mm au minimum et présentant avantageusement un angle de dépouille de 5 à 20"C. De tels trous peuvent être obtenus par usinage mécanique ou chimique. On répand sur la surface du moule qui reçoit la feuille de verre une suspension alcoolique d'hydroxyde de calcium en poudre, de granulométrie inférieure à 1'Fun, additionnée d'un agent dispersif tel que l'agent DISPERBYK 190 de la société BYK Chemie (Allemagne). Cette suspension facilite la séparation de la plaque de puits et du moule, après thermoformage de cette plaque. Etant appliquée sur la surface supérieure du moule, cette suspension n'affecte pas l'état de surface du fond des puits. La feuille de verre plan étant montée sur le moule 4 et l'ensemble plaque/moule/enceinte étant placé dans un four, on porte celui-ci à une température de 675-6950 C environ, on maintient cette température pendant 5 à 7 minutes environ, en appliquant dans l'espace 2 une dépression de 0,75 bar. La feuille plane de verre de départ ayant une épaisseur de 0,3 mm, les fonds des puits présentent, comme on l'a vu plus haut, une épaisseur plus faible, en l'occurrence 0,160 mm environ. Une telle épaisseur est très compatible avec la focale des objectifs des microscopes, notamment confocaux, qui atteint couramment 0,2 mm. Les puits étant formés et la température de la plaque telle que la rigidité de la plaque soit suffisante (soit à 550-6000C environ), on détache la plaque du moule en établissant une légère surpression dans l'espace 2, avant que le refroidissement du moule ne soit susceptible d'emprisonner et d'endommager la plaque. La figure 2 représente une fraction de la surface de la plaque obtenue, telle qu'on peut la visualiser à l'aide d'un microscope à balayage mécanique. La forme généralement hémisphérique des puits 7i, 7i+i, etc... apparaît sur cette figure, qui montre aussi que les débouchés des puits se raccordent les uns aux autres par des surfaces à courbure progressive, dépourvues de discontinuités. Cette géométrie est avantageuse d'au moins deux points de vue. Elle évite l'emprisonnement de bulles d'air dans des discontinuités de la surface lorsque des cultures en milieu liquide sont distribuées dans les puits. Elle favorise aussi le rassemblement par gravité au fond des puits de cellules vivantes, comme on le verra plus loin. Deux procédés sont utilisables en effet pour distribuer des cultures en milieu liquide ou, plus généralement, tout liquide, dans les différents puits. Le premier consiste à utiliser des micropipettes classiques, isolées ou en batteries. Le deuxième consiste à déposer sur la plaque une goutte qui couvre simultanément plusieurs puits adjacents. Par gravité, ce liquide s'étale sur la plaque en remplissant éventuellement d'autres puits adjacents. Si les liquides contiennent des cellules végétales ou animales, on constate que celles-ci se distribuent par gravité entre les puits et se regroupent avantageusement au fond de ceux-ci. On peut appliquer à la surface de la plaque, autour des débouchés des puits, un produit hydrophobe tel qu'un silane par exemple. Un tel traitement de cette surface contribue au remplissage des puits, en empêchant que du liquide ne demeure entre eux. Il évite par ailleurs toute communication de liquide entre deux puits adjacents après le remplissage de ces puits, ce qui autorise un maniement sans précaution particulière d'une plaque de 250 ou 1536 puits de 2 mm de diamètre par exemple, une telle plaque pouvant même être retournée pour des cultures en gouttes pendantes, par exemple. La plaque 6 de puits suivant l'invention peut être posée sur un support quelconque par l'intermédiaire d'un cadre évidé 8 présentant un rebord 8' sur lequel s'appuie la périphérie de la plaque 6, comme représenté à la figure 3. La plaque 6 peut éventuellement être collée ou soudée à ce cadre 8, au niveau du rebord 8'. Le cadre 8 est de hauteur supérieure à l'épaisseur de la plaque 6 de manière à protéger le fond des puits de tout frottement avec un support sur lequel le cadre est posé. Celui-ci facilite en outre les manutentions, manuelles ou automatiques, de la plaque suivant l'invention. On a représenté à la figure 4 un autre mode de réalisation du dispositif pour la mise en oeuvre du procédé suivant 1 invention, adapté à une production en continu, avantageuse du point de vue économique. Le dispositif comprend un réservoir (non représenté) de verre fondu débitant par une fente 9 une feuille ou nappe de verre 19 de viscosité ajustée. Cette nappe est reprise par un tambour cylindrique 10 monté à rotation autour d'un arbre 11 fixe et entraîné par des moyens (non représentés) à une vitesse prédéterminée. Le tambour 10 est solidaire d'un noyau cylindrique 12 interne au tambour. La surface de ce noyau est légèrement écartée de la surface interne du tambour 10, en appui sur des nervures axiales telles que 131, 132, etc... formées par exemple sur le noyau 12. De son côté, l'arbre fixe 11 est creusé d'une chambre périphérique 14 qui communique, par l'intermédiaire d'un canal radial 15 et d'un canal axial 16 avec un générateur de dépression (non représenté). Quand le tambour 10 tourne, la chambre 14 communique à chaque instant par l'un de plusieurs canaux radiaux, tels que 171, 172, 173, etc... avec l'une de plusieurs chambres annulaires telles que 181, 182, etc... présentes entre le tambour 10 et le noyau 12, au niveau des nervures 13i. Le tambour 10 joue le rôle de moule pour la nappe de verre 19 qui enveloppe ce tambour. A cet effet, le tambour est percé de trous 5'i tout comme le moule 4 de la figure 1. Le générateur de dépression étant branché sur le conduit 16, la nappe 19 de verre qui descend continuellement de la fente 9 est happée par aspiration par la surface du tambour, cette nappe enveloppant ensuite ce tambour sur environ un quart de sa surface. La nappe 19 est soumise à une dépression au niveau de sa face en contact avec ce tambour, grâce au conduit 17i qui transmet, à un instant donné, une dépression à la chambre annulaire rotative 181,182 correspondante. On comprend que les trous S,i percés dans le tambour 10 jouent alors le rôles des trous 5i du moule de la figure 1, dans la formation de puits dans la nappe ou feuille de verre 19, en écartant la surface de ces puits de tout contact pendant leur formation, comme on l'a vu plus haut en liaison avec la figure 1. Les débits de verre sortant de la trémie 9, la vitesse de rotation du tambour, la température et l'épaisseur de la nappe 19 ainsi que la dépression appliquée à cette nappe sont ajustées pour que l'on obtienne des puits sensiblement hémisphériques analogues à ceux représentés sur la figure 1. La feuille ou nappe ainsi déformée quitte le tambour 10 pour être ensuite découpée à chaud puis refroidie par des moyens non représentés, pour former des sections 6i, 6i+1, etc... propres à constituer chacune une plaque de puits suivant l'invention. Il est clair que le dispositif de la figure 4 assure une production continue de plaques mieux adaptée que le dispositif de la figure 1 à de forts volumes de production. Pour une telle production, la température du verre peut être située dans le domaine 740-760"C et le temps de contact entre la feuille de verre et le tambour être de l'ordre de 5 à 20 secondes seulement. La température du tambour est entretenue, par des moyens non représentés, à 550-6000C environ. Il apparaît maintenant que l'invention permet bien d'atteindre le but fixé, à savoir assurer la fabrication à coût réduit de plages de puits autorisant une observation au microscope du contenu des puits, à travers le fond de ceux-ci. Outre les avantages déjà mentionnés de la plaque suivant l'invention, celle-ci présente celui de pouvoir compter un nombre variable de puits, qui peut être très grand, le procédé de fabrication décrit convenant à des puits de faible volume, compris par exemple entre 0,2 et 10 ul. Avec un grand nombre de puits, il est possible de traiter simultanément un grand nombre d'échantillons, par exemple 100.000 échantillons/jour, comme cela est courant aujourd'hui. En outre, les puits de la plaque suivant l'invention, du fait de leur géométrie et de leurs raccordements sans discontinuités, se prêtent à la formation dans chaque puits d'un ménisque convexe du liquide contenu. Quand celui-ci supporte des cellules vivantes, celles-ci bénéficient ainsi d'une surface d'échange maximale avec l'oxygène de l'air, ce qui est favorable à leur développement. En outre, la pollution des échantillons contenus dans les puits par des polluants portés par la surface interne de ces puits, de même que la dissipation par les parois des solvants éventuellement contenus dans les puits, sont d'autant plus importantes que le puits est de faible volume. L'utilisation suivant l'invention de verre à forte inertie chimique pour constituer des plaques de tels puits à faible volume est alors particulièrement avantageuse pour minimiser ce problème. Comme on l'a vu plus haut, la présente invention permet de réaliser des plaques de puits à fonds sensiblement hémisphérique. Dans le cas de synthèses de molécules sur billes, disposées dans de tels puits, cette forme permet avantageusement de réduire les volumes de réactif enrobant les billes. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemple. C'est ainsi que la plaque suivant l'invention pourrait être utilisée pour réaliser des essais sur des échantillons de produits chimiques et non pas seulement de produits ou matériaux biologiques. En outre, bien que le verre minéral soit préféré pour réaliser cette plaque en raison de son inertie chimique évoquée ci-dessus, d'autres matériaux thermoplastiques minéraux ou organiques, par exemple, pourraient être utilisés. Outre les matériaux transparents et de qualité optique, des matériaux autres pourraient être utilisés si aucune observation à travers le fond des puits n'est prévue. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'une plaque de puits, conçue pour contenir notamment des échantillons de produits chimiques ou biologiques, par thermoformage d'une feuille d'un matériau à l'état plastique, caractérisé en ce que a) on réalise un moule (4;10) percé d'une pluralité de trous distribués conformément à une distribution de puits à former dans ladite feuille, b) on dispose ladite feuille sur ledit moule (4;10) et on porte la feuille à une température où elle est à l'état plastique, et c) on établit entre les deux faces de la feuille une différence de pression de gaz de manière que la matière de ladite feuille, au droit des trous du moule, soit aspirée dans ces trous pour prendre la forme de puits à à fonds écartés de tout contact avec d'autres surfaces. 2. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend a) un moule (4;10) présentant une face prévue pour recevoir une feuille du matériau thermoformable, ledit moule étant percé, perpendiculairement à cette face, d'une pluralité de trous (5i;5'i), b) une enceinte (1;12) délimitant avec ledit moule (4;10) un espace (2;18i), c) des moyens pour chauffer la feuille et la porter à l'état plastique, et d) un générateur de gaz en dépression sélectivement connectable audit espace (2; 18) pour thermoformer des puits (7i) dans ladite feuille, par aspiration dans lesdits trous de la matière de ladite feuille située au droit desdits trous. 3. Dispositif conforme à la revendication 2, caractérisé en ce que la forme des trous (5i,5'i) percés dans le moule (4;10) est choisie parmi : une forme cylindrique, tronconique, à section circulaire ou polygonale. 4. Dispositif conforme à l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que les trous (5i;5'i) sont distribués bidimensionnellement de manière régulière. 5. Dispositif conforme à l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la surface du moule (4) qui reçoit ladite feuille est généralement plane et reçoit une feuille individualisée. 6. Dispositif conforme à l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour établir une surpression dans l'espace (2) propre à détacher une plaque moulée de son moule (4). 7. Dispositif conforme à l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la surface du moule (10) qui reçoit ladite feuille est cylindrique, en ce que cette surface tourne continûment autour de son axe pour recevoir une nappe de matériau à l'état plastique (19) débitée en continu par une source (9), sur une partie de sa surface, la feuille quittant cette surface pour délivrer une feuille continue portant des puits. 8. Dispositif conforme à la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour découper la feuille délivrée en continu par la surface du moule (10), de manière à former des plaques de puits. 9. Plaque de puits obtenue par la mise en oeuvre du procédé conforme à la revendication 1, comprenant une distribution de puits thermoformés dans une feuille en un matériau thermoplastique, caractérisée en ce que les deux faces de la paroi des puits (7t) formées dans la feuille présentent un état de surface de qualité optique. 10. Plaque conforme à la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est constituée de verre minéral. 11. Plaque conforme à l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisée en ce que son épaisseur croît du fond au débouché des puits. 12. Plaque conforme à la revendication 11, caractérisée en ce que son épaisseur au fond des puits est inférieure à 0,2 mm. 13. Plaque conforme à l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle porte, autour du débouché des puits, un revêtement hydrophobe. 14. Plaque conforme à l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend une distribution bidimensionnelle régulière de puits.